JPH04500221A

JPH04500221A - インフルエンザウイルス感染症の診断および予防用合成ペプチド、およびその使用

Info

Publication number: JPH04500221A
Application number: JP2508519A
Authority: JP
Inventors: ジユド，アムリツト・ケー; ブツチヤー，ドリス・ジエイ
Original assignee: エス・アール・アイ・インターナシヨナル
Priority date: 1989-05-24
Filing date: 1990-05-21
Publication date: 1992-01-16
Also published as: WO1990014361A1; EP0426838A1; CA2033202A1; US5136019A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】インフルエンザウィルス感染症の診断および予防用合成ペプチド、およびその使用１１はＬえ！関連特許出願との関係本特許出願に関連する出願は、１９８７年５月１４日に出願された米国特許出願第０５０．６３３号である。該出願は、７９−１０４．６４−８０および１４９ −１６９部位のＭ蛋白質、およびインフルエンザの診断および治療へのその利用に関するものである。

発明の技術分野本発明はインフルエンザ用の抗体に関するものである。一層詳細にいえば本発明は、インフルエンザ抗体決定因子（ａｎｔｊｇｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）を提供する合成ペプチドシークエンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に関し、また、診断薬やワクチンの製造時における抗体としての該配列体の使用に関し、さらにまた、抗体等の形成に関し、さらにまた、インフルエンザウィルス感染症の診断、予防および治療の際の前記ペプチド、薬剤、抗体およびワクチンの使用に関するものである。

関連事項インフルエンザの重大性インフルエンザ感染症は重要であり、新型株の出現後に感染症が流行し、場合によって非常に広く流行することがあり得る。

監視用施設のネットワークが全世界にわたって設けられているが、その努力にもかかわらずインフルエンザに関する報告はまだかなり不足している。その原因の少なくとも一部として、中程度の設備しか備えていない前記の監視用施設の実験室で速やかに、かつ高い信転性を以て実施できる試験方法が未だ開発されていないことがあげられる。さらに、アマンタジンのごとき有効な薬剤は、特に中年層等の治療や予防にはあまり使用されていない、なぜならば、迅速診断法が一般に行われていないからである。

さらに、応答型ウィルスは絶えず別の採種として再び出現する傾向があり、このために前記の問題が一層複雑になる。前記のごとく新型株が出現するので、これらはその表面の抗原型決定因子の浮動またはシフトを表わしていると考えられ、そのために、該決定因子に基づくその免疫学的同定が一般に困難になる。既に知られているように、インフルエンザウィルスのマトリックス蛋白質の構造は、或株から別の株へと非常によく保たれている。

マトリックス蛋白質インフルエンザウィルスのマトリックス蛋白質（Ｍ−蛋白質）は、インフルエンザピリオン（ｖｉｒｉｏｎ）の主な内容蛋白質である。よく知られているように、これはウィルス蛋白質全体の約４６％を構成し、その分子量は約２７，０００であり、そしてこれはエンベロープのリビド複層の内面に沿って配列する。該エンベロープはウィルスのへマグルチニンおよびノイラミニダーゼサブユニットを含有する。そのペプチド鎖は２５２個のアミノ酸を含む、そのアミノ酸配列も既に報告されている。

若干の研究者によって、前記のマトリックス蛋白質の役割に関する研究がインフルエンザとの関連下に行われた。ウエブスタおよびヒンジヨウ〔「インフエクシツン、アンド、イムニティ」、第１７巻（３）第５６１頁−第５６６頁（１９７７年９月）〕は、自然状態のまま単離されたＭ−蛋白質はマウス中のウィルスクリアランス値を高める旨を述べている０発明者の１人であるブタチャおよびその共同研究者（ｒＪ、ｃｌｉｎ、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　Ｊ　、第１６巻（５）、第８】３頁−第８２０戸（１９８２年１１月）〕は、自然の状Ｖ？中離されたＭ −蛋白質を用いて酵素結合免疫収着体試験（ＥＬＩＳＡ）を行い、イーフルユンザウィルスに対する抗体を検出した。ズボナルジエブおよびゲンドン〔ｒＪ、Ｖｉｒｏｌ、　Ｊ　、第３３巻（２）、第５８３頁−第５８６頁（１９８０年２月）〕は、インフルエンザＡ型ウィルスのりボヌクレオ蛋白質のトランスクリブターゼの活性は、Ｍ−蛋白質の存在下では阻害される旨を述べている。イエ、２１、Ｒ，パル、Ｊ、−、フォクスおよびＲ，Ｒ，ワグナ−の論文（１９８７年）〔 “ファンクショナル、アンド、アンチジェニック、ドメインズ、オン、ザ、マトリックス（Ｍ）、プロティン、オン、インフルエンザＡ、ウィルス“、ｒＪ、Ｖｉｒｏｌ、　Ｊ第６１巻、第２３９頁−第２４６頁〕には、モノクロナル抗体は、阻害されたトランスフリブシランを元に戻す作用をすることが記載されている。

先に出願された特許出願には、Ｍ蛋白質の７９−１０４．６４−８０および１４９−１６９部位に相当する合成ポリペプチドの製法および使用法が開示されている。

Ｍｌ蛋白質性質を述べた文献は他にもあり、たとえばブタチャ（本発明の発明者）およびその共同研究者の論文には４、自然の状態で精製されたＭ蛋白質は、うさぎの抗体応答性を引き出す作用を有し、その力価は１　二４０，０００である旨が記載されている（　’Ｊ、ｌｍｌ１ｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｊ　、第９６巻、第７７頁−第８５頁（１９８７年）］、フファンワイク等の論文（ｒＪ、Ｖｉｒｏｌ、　Ｊ　、第４８巻、第２４８頁−第２５２頁（１９８４年）はＭ蛋白質構造中の多数の抗原型ドメインに関するものである。マクキリン等の論文（ ’Ｌａｎｅｅｔ」、第２巻（８６４１）　、第９１１頁−第９１４頁（１９８５年１０月２６日）〕には、インフルエンザＭ蛋白質に対するモノクロナル抗体、およびそのインフルエンザ診断への使用法が記載されている。さらにまた、アレン、Ｈｌ、Ｊ、マクコウレー、阿、ウォータフィールドおよびＭ、Ｊ、ゲシングの論文〔“インフルエンザ、ウィルス、ＲＮＡセグメント７、バズ、ザ、コーディング、キャパシティ、フォア、ツウ、ポリペプチド”、ｒＶｉｒｏｌｏｇｙ」、第１０７巻、第５４８頁−第５５１頁（１９８０年）〕：ベイラー、Ｎ、縁１、Ｙ、リー、Ｚ。

イエ−およびＲ，Ｒ，ワグナ−の論文〔“トランジェント、エクスブレフシラン、アンド、シーフェンス、オン、ザ、マトリックス（Ｍｌ）　、ジエン、オン、ＷＳＮ　、インフルエンザＡウィルス、イン、ア、ワタシニア、ベクター”、「Ｖｉｒｏｌ、　Ｊ第１６３Ｓ、第６１８頁−第６２１頁（１９８８年）〕；マークシン、Ｓｌ、■、ギアシ、Ｎ、スコロブ、Ａ、シロブ、Ｂ、シニチン、Ｄ、ブラウン、Ａ、クリモブおよびり、ナヤクの論文（１９８８年）〔“ヌクレオチド、シーフェンス、オン、ＲＮＡセグメント７、アンド、ザ、プレデイクテド、アミノ、シーフェンス、オン、Ｍｌ、アンド、Ｍ２、プロテインズ、オン、ＦＰν ／ウェイブリッジ（）１７Ｎ７）　、アンド、同＋１　（ＨＩＮＩ）、インフルエンザ、ウイルシズ”、「ウィルス、リサーチ」、第１０巻、第２６３頁−第２７２頁〕；オルチン、Ｊｌ、Ｃ，ビラヌエバ、し、マーセデス、ダビラ、Ｃ，ロベズーガリンデス、Ｎ、ビラヌエバおよびＥ、ドミンゴの論文〔１エボリユーシーン、オン、ヌクレオチド、シーフェンス、オン、インフルエンザ、ウィルス、ＲＮＡセグメント７、シュアリング、ドリフト、オン、ザ、Ｈ３Ｎ２、サブタイプ、ｒ　Ｇｅｎｅ　Ｊ第２３巻、第２３３頁−第２３９頁（１９８３年〕：年上：ズポナルジエブ、Ａ、Ｙ、およびｙ、ｚ、ゲンドンの論文（１９８０年）〔“ インフルエンス、オン、メンブレン（Ｍ）プロティン、オン、インフルエンザＡ１ウィルス、ピリオン、トランスクリブターゼ、アクチビチイ、イン、ビトロ、アンド、イフツ、サセプチビリチイ、ツウ、リマンタジン”、’Ｊ、Ｖｉｒｏ１．　Ｊ、第３３巻、第５８３頁−第５８６頁〕も参照されたい。

他の研究インフルエンザ、その診断および治療に関する研究は前記以外にも種々なされており、たとえばグラジエン等はインフルエンザ感染症の診断のための２つの免疫学的方法の比較の結果を報告している（　’Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．　Ｊ第２２巻（５）、第７５７頁−第７６０頁（１９８５年１１月）〕、ジャリド等は、インフルエンザ感染症の診断のためのモノクロナル抗体およびポリクロナル抗血清の比較の結果を報告している（　ｒＪ、ａＣｌｉｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇ　、第２２巻（５）、第８７７頁−第８７９頁（１９８５年１１月）〕。

インフルエンザ感染診断に関する研究はほかにもあり、たとえば、ジュルクメン、Ｌ等（１９８４年）（’Ｊ、ｖｉｒｏ１．Ｍｅｈｔｏｄｓ　Ｊ、第９巻（１）、第７頁−第１４頁）、ズロブ、Ｓ、Ａ、等（１９８５年）　（Ｚａ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｅｐｉｄｅｓｉｏｌ、１ｍｍｕｒ＋ｏｂｉｏ１．　Ｊ　（１）、第８１−５ページ（英文抄録）、ブタコバ等（１９８５年）（’Ａｃｔａ　Ｖｉｒｏｌ、　Ｊ　（Ｐｒａｈａ）、第２９巻（１）、第１９頁−第２４頁）、ブクリ〉Ｉスカイア、Ａ、Ｇ、　（１９８５年）（ｒＶｏｐｒｏ、Ｖｉｒｏｍｏｌ、　Ｊ　、　第３０巻（１）、第１６頁−第２１頁（６ｉ　ｒｅｆ、）、アネスタド、Ｇ、　（１９８５年）（Ｊ、Ｈｙｇ、　Ｊ　（ロンドン）、第９４巻（３）、第３４９頁−第３５６頁）、コピアコバ、丁、Ｎ、　（１９８５年）（ｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、ＥｐｉｄｅＩｌｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ−Ｊ　（４）、第４３頁−第４５頁）、ファン、ポリス、Ｌ、Ｐ、等（１９８５年）　（Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、　Ｊ　、第１６巻（４）、第３１５頁−第３２０頁；および（１９８４年）　、ｒＶｏｐｒｏ、Ｖｉｒｏｍｏｌ、」、第２９巻（４）、第４１７頁−第４１９頁）、ブタチャ等（１９８７年）（ｒＪ。

Ｉｍ’＋５ｕｎｏ１．Ｍｅｔｂｏｄｓ　Ｊ　、第９６巻、第７７頁−第８５頁）の論文があげられる。

さらに、本発明に多少関連する技術分野の論文として、たとえば、バエズ、ｈｌ、Ｐ、バリースおよびＥ、Ｄ、キルボーン（１９８０年）、“ジェーン、コンポジション、オン、ハイーイールデング、インフルエンザ、ワクチン、ストレインズ、オンテインド、パイ、リコンビネーシッン”　［’Ｊ、Ｉｎｆ、Ｄｆｓ、　Ｊ第１４１巻、第３６２頁−第３６５巻〕、ブタチャ、Ｄ、Ｊ、、１．Ｇ、カリトネンコブ、Ｊ、Ａ、ザコミルジン、Ｖ、Ｂ、グレゴリニブ、Ｓ、Ｍ、クリメンコおよびＪ、Ｆ、ディビス（１９８０年）、“インコーポレーション、オン、インフルエンザ、ウィルス、Ｍ−プロティン、インツウ、リポソームズ〔「Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　Ｊ第３６壱、第５８６頁−第５９０頁〕、ブタチャ、Ｄ。

Ｊｌ、Ｓ、Ｓ、Ｌ、リー、Ｊ、Ｍ、ケホエおよびＥ、Ｄ、キルボーン（１９７６年）、“クロマトグラフィツク、アイソレージ呵ン、オン、ザ、ヘマグルチニン、ポリペプチド、フロム、インフルエンザ、ウィルス、ワクチン、アンド、デターミネション、オン、ゼア、アミノ、ターミナル、シークエンシズ”　（ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

υＳＡＪ、第７３巻、第２３８頁−第２４２頁〕、バフラ−ホワイト、み、Ｊｌ、Ｃ−Ｍ、ナエブおよびＢＪ、マーフイ　（１９８６年）、“キャラタリゼーシゴン、オン、ア、ジエー・ン、コーディング、フォア、Ｍ−プロテインズ、ウィンチ、イズ、インポルブト、イン、ホスト、レインジ、リストリフシラン、オン、アン、アビアン、インフルエンザＡウィルス、イン、モンキーズ”　（ｒＪ、Ｖｉｒｏｌ、　Ｊ、第５７巻、第６９７頁−第７００更〕、チツウ、Ｐ、Ｙ、およびＧ、Ｄ、ファスマン（１９７８年）、“エンビリカル、プレディクシコンス、オン、プロティン、コンフォーメション”　（’Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍｇ、第４７巻、第２５１頁−第２７６更〕、エルカラダギ、Ｓｌ、Ｊ、Ａ、ザコミルジン、Ｃ，シマネ、［］、Ｊ、ブツチブタＶ、Ａ、　）ベジスロブおよび１、Ｇ、カリトネンコブ（１９８４年）、°°インタラクシ町ン、オン、インフルエンザ、ウィルス、プロテインズ、ウィズ、ブレーナ、パイレイヤー、リビド、メンブレンズ；キャラクタリゼーション、オン、ゼア、アブソーブシラン、アンド、インコーボレーシッン、インツウ、リビド、パイレイヤーズ”％　［’ Ｂｉｏｃｈｅ閣。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ」、第７７８巻、第２６９頁−第２７５更〕、エリクソン、Ｂ、Ｗ、およびＲ，Ｂ、メリフィールド（１９７６年）、〔「ザ、プロテインズｊ、第■巻、■、ニウラス編、アカデミツク、プレス、ニューヨーク、第２５５頁−第５２７更〕、ファグラエウス、Ａ、およびＲ，ノーバーブ（１９８７年）、′アンチアクチン、アンチボデイズ”、（ｒＣｕｒｒ、Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉ＋ａ＋＋＋ｕｎｏ１．　Ｊ　、第８２巻、第１頁−第１３頁〕、ガラガー、Ｈｌ、Ｄ、Ｊ、ブタチャ、Ｒ，ドルマシュキン、Ｊ、Ｆ、ディビス、Ｇ、ロセンおよびＥ、［１，キルボーン（１９８４年）、′アイソレーション、オン、イムノソーベンド、ニウラミニダーゼズ、オン、ヒユーマン、インフルエンザ、ウイルシダ、パイ、ア、コンビネータ９ン、オン、シネチック、アンド、バイオケミカル、フロシージャーズ２、（’Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．　Ｊ、第２０Ｓ、第８９頁−第９３頁〕、ブレボリアデス、Ａ、　（１９７７年）、“インフルエンザ、ウィルス−インデユースト、プロテインズ、イン、ニュークリアイ、アンド、シトブラズム、オン、インフェクテシド、セルズ”、（ｒＶｉｒｏｌｏｇＹＪ　、第７９巻、第４４９頁−第４５４更〕、ギアし、Ｒ，ｌ’ｌ、、Ｄ、Ｒ，）　’７　ヘル、Ｃ，Ｍ、ケイおよびり。

Ｌ、Ｊ、チレル（１９８２年）、′エビデンス、フォア、アン、インタラクシラン、ピッウィーン、ザ、゛メンブレン、プロティン、オン、ア、バラミキソウイルス、アンド、アクチン”、〔「Ｊ。

Ｖｉｒｃｌ、Ｊ　、第４２巻、第９６３三−第９６８更〕、ゴチュ、Ｆｌ、Ｊ、ロスバード、Ｋ、ホウランドおよびＡ、マクミカエル（１９８７年）、“シトトキシックＴリンホサイッ、リコグナイズ、ア、フラグメント、オン、インフルエンザ、ウィルス、マトリックス、プロティン、イン、アソシエーシテン、ウィズ、ＨＬＡ−２”、（ｒＮａｔｕｒｅ」、第３２６巻、第８８１頁−第８８２更〕、ブレボリアデス、Ａ、　（１９８０年）、“インタラクシラン、オン、インフルエンザＭプロティン、ウィズ、バイラル、リビド、アンド、ホスファチジルコリン、ベシクルズ、（ｒＪ、Ｖｉｒｏｌ、　Ｊ第３６巻、第４７０頁−第４７９更〕、ヘイ、Ａ、Ｊ、およびＪ、Ｊ、スケヘル（１９７５年）、“スタデイズ、オン、ザン、シンセシス、オン、インフルエンザ、ウィルス、プロテインズ１、〔「ネガテブ、ストランド、ウィルシダ」、Ｂ３縁、Ｊ、メイヒおよびＲ，Ｄ、パリ編、第２巻、第６３５頁−第６５５頁、アカデミツク、プレス、ニューヨーク、アンド、ロンドン〕、カトウ、Ａ１、Ｋ、ミズモトおよびＡ、インハラ　（１９８５年）、“ビューリフィケーシジン、アンド、エンザイマチック、ブロバテイズ、オン、アン、ＪＩＮＡポリマラーゼ−１１ＮＡコンブレンクス、フロム、インフルエンザ、ウィルス”　〔「ウィルス、リサーチＪ、第３巻、第１１５頁−第１２７更〕、カン、ガ、−０、Ｄ。

Ｊ、ブタチャ、Ａ、に、コウル、Ｇ、カリシュおよびＥ、Ｄ、キルボーン（１９Ｂ２年）、“ブチクシコン、オン、アンチボディズ、ツウ、インフルエンザ、ウィルス、Ｍ−プロティン、スルー、エンザイムーリンクド、イムノソーベンド、アッセイ　（ＥＬＩＳＡ）″、（’Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　」、第１６巻、第８１３頁−第８２０更〕、キ、ルボーン、Ｅ、Ｄ、　（１９７８年）、“ジェネチンク、ダイモルフイズム、イン、インフルエンザ、ウィルシズ：キャラクタリゼーシタン、オン、ステーブリ、アソシェーテフド、ヘマグルチニン、アンド、バイオロジカル、プロバチイズ、ｒ　ｒＰｒｏｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ」、第７５巻、第６２５８頁−第６２５８頁〕、カイト、Ｊｌ、およびＲ，Ｆ、ドウリトル（１９８２年）、“ア、シンプル、メソッド、フォア、デイスブレイング、ザ、バイトロバシック、キャラクタ−、オン、ア、プロティン”、［’Ｊ１Ｍｏ１．ＢｉｏＪ　Ｊ　、第１５７Ｓ、第１０５頁−第１３２更〕、ラム、Ｒ，Ａ、およびＣ，Ｊ、　ライ　（１９８１年）、 ”コンザベーシ舊ン、オン、ゼ、インフルエンザ、ウィルス、メンブレン、プロティン（Ｍｌ）アミノ、アシフド、シーフェンス、アンド、アン、オーブン、リーディング、フレーム、オン、ＲＮＡセグメント７、エンコーディング、ア、セカンド、プロティン（Ｍ２）　、イン、旧ＮＩ、アンド、Ｈ３Ｎ２、ストレインズ“、〔「ピロロジー」、第１１２巻、第７４６頁−第７５１更〕、ローリ、０、Ｈ９、Ｎ、　Ｊ、ローズブロー、Ａ、Ｌ、ファーおよびｌ？、Ｊ、ランダル（１９５１年）、′プロティン、メジュアメント、ウィズ、ザ、フォリン、フェノール、リエイジエント”　［ｒＪ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅ＊、　Ｊ　、第１９３巻、第２６５頁−第　２７５頁］、マエノ、Ｋ１、Ｓ、ヨシイ、？、）シダ、ｈ、イイヌマ、Ｙ、カワモトおよびＴ、マツモト　（１９７７年）、“イントラモレキュラー、デベローブメント、オン、メンブレン、プロティン、オン、インフルエンザ、ウィルス、”（ｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍ＠ｕｎｏ１．　Ｊ　、第２１巻、第４２７頁−第４３８更〕、ノビコツ、Ａ、Ｇ、およびＥ、ホルッマン（１９７６年）、（’Ｃｅ１ｌｓ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｒ＋ｅｌｌｅｓ」、第７３頁 −第８３頁、ホルト、ラインハート、アンド、ウィンストン、ニューヨーク）、オフスフオード、Ｊ、ｓ、およびＧ、Ｃ，シルト（１９７５年）、１イムノロジカル１．スタディズ、ウィズ、インフルエンザ、マトリックス、プロティン”、〔「ネガテブ、ストランド、ウィルシダＪ　、ＢＪ、Ｊ、マフィおよびＲ，Ｉｌ、パリ編、第２巻、第６１１頁−第６２０頁、アカデミツク、プレス、ニューヨーク、アンド、ロンドン〕、バニカリ、Ｄ、およびＥ、バオレチ（１９８２年）、“コンストラクション、オン、ボックスウイルシダ、アズ、クローニング、ベクターズ：インサーシ町ン、オン、ザ、チミジン、キナーゼ、ジエーン、フロム、ハーブス、シンプレックス、ウィルス、インツウ、ザ、ＤＮＡ　、オン、インフェクシャス、ワタシニア、ウィルス”、（’Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　Ｊ　、第７９巻、第４９２７頁−第４９３１頁）、パターラン、Ｓｏ、Ｊ、グロスおよびＪ、Ｓ、オフスフオード（１９Ｂ８年）、′ゼ、イントラセルラー、デイストリビューシテン、オン、インフルエンザ、ウィルス、マトリックス、プロティン、アンド、ヌクレオプロティン、イン、インフェクテッド、セルズ、アンド、ゼア、リレーシランシップ、ツウ、ヘマグルチニン、イン、ザ、プラズマ、メンブレン”、（ｒＪ、Ｇｅｎ、Ｖｆｒｏｌ、Ｊ　、第６９巻、第１８５９頁−第１８５９頁〕、ピープルズ、ガ、Ｅ、　（１９８８年）、“ ディファレンシャル、デタージエント、トリートメント、アラウズ、イムノフルオレセント、ローカリゼーション、オン、ザ、ユニ一キャフスル、ディシーズ、ウィルス、マトリックス、プロティン、ウィズイン、ザ、ヌクレアス、オン、インフェクテッド、セル”、［’Ｖｉｒｏ１．　Ｊ　、第１６２巻、第２５５頁− 第２５９更〕、バークス、Ｍ、Ｅ、、Ｄ、バニカリ、Ｓ、マーサおよびＥ、バオレフチ（１９８６年）、１インサージジン゛、アンド、デレーシラン、ミュータン゛ン、オン、ワクシニア１、ウイルズ、［’Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１　、第１５２巻、第２８５頁−第２９７頁］、バークス、Ｉ’１．　Ｅ、、Ａ、ビクシニ、Ｂ、Ｒ，リビンジャニフ、およびＥ、−オ［・−・チ（１９８５年）、′リコンビナント４ワクシナ、ウィルス：イムニゼーシラン、アゲンス１、マルチプル、バリン５．ンス”、（’５ｃｉｅｎｃｅ　Ｊ−第２２９巻、第９８１頁−第９８４頁〕、ロスバード、Ｊ、Ｂ、、ＬフェルテンデスおよヒＧ、スクール−り　（１９８４年）、′スｌ−レインースベシフインク、アン）′、：Ｊモン、Ｊ、ビ＋−−−ブス、オン、ゴノコツカル、ピリ″、〔ｒＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　Ｊ　、　ｆｆ１１６０巻、第２０８頁−第２２１頁〕、シュミット、Ｊ、Ｆ、Ｃ，およびＨ，Ｇ、スツネンバーグ（１９８８年）、′シーク〕ニンス、アンド、トランスクリフ゛ショナル、アナリパ、／ス、オン、ザ、ツクシ二”ア、ウィルス、ヒント■、１１フラグメント”、（ｒＪ、Ｖｉｒｏｌ　Ｊ　、Ｍ６２％、第１８８９頁−第１８８９頁〕、シュルゼ、１、Ｔ、　（１９７０Ｊ’、）　、“ザ、ストラフチャ、オン、インフルエンザ、ウィルスＩ１．ザ、２ｆリベプチズ、オン、ピリオン”、（’Ｖｉｒ。

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ローズマン　Ｂ、ディビスおよびＳ、マンューズ（１９８８年）、”ワクシニア、ウィルスーエンコーデソド、リボヌクレオチド、レグクターヤ°：シークユンス、コンザベーシラン、オン、ザ、ジェーン、フォア、ザ、スモール、サブユニット、アンド、イノツ、アンプリフィケーシラン、イン、ハイドロキュリアーレジスタンド、ミュ・−タン７”、（’Ｊ、Ｖｉｒｏ１ｇ　、第６２巻、第５１９頁−第５２７頁〕、スミス、Ｇ、　Ｌ、、Ｊ、Ｚ、　レビン、Ｐ、バ１ノスおよびＢ、モス（１９７８年）、“シンセシス、アンド、セルラー、ロケーション、オン、テン、インフルエンザ、ポリペプチド、インデイビデュアリ、エクスプレスト、パイ、リコンビナント、ワクシニア、ウイルシダ”、（ｒＶｉｒｏｌｏｇ３’Ｊ　、第１６０巻、第３３６頁−第３４５頁〕、ｌ・ウヘル、Ｄ、Ｒ，、Ｊ、Ｓ、ハ７グ、１．Ａ、マクロヒー、Ｇ、　Ａ、ルンドおよびり、　Ｌ、　Ｊチレル（３９８４年）、′ボ子ンシェーシラン、オプ、アンチアクチン、アンチボディ、プロダクシヨン、パイ、バラミキソウィルスＭプロティン”　（’Ａｂｓｔｒ、５ｉｘｔｈ　Ｘｎｔ、Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、５ｅｎｄａｉＪａｐａｎ」、第１７５頁」−ウェークフィールド、１１．およびＧ−Ｇ、ブラウンリー（１９８８年）、“ＲＮＡパインディング、アクチビナイ、オン、ゼ、インフルエンザ、ウィルス、マトリックス、プロティン”、［’Ｖｉｒｕｓ　ＲｅＳ、」（νＩＲＥＤＦ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｒ＋ｔ　２）　、第３５頁）、ボウラー、Ａ９、Ｄ−Ｅ。

ビドウエルおよびＡ、バートレット　（１９７６年）、′エンザイム、イムノアフセイス”、イン、ダイアグノスチフク、メディシン：セオリ、アンド、フラクチズ”、［’Ｂｕ１１．　Ｗ、Ｈ，０，Ｊ　、第５３巻、第５５頁−第６５頁］、ウィフク、Ｇ、および３．７　イールド（１９８０年）、１クローニング、オン、インフルエンザ、ＣＤＮＡ、インツウ、１１３：ザ、シーフェンス、オン、ゼ、ＲＮＡ　、セグメント、エンコーディング、ゼ、Ａ／ＰＲ／８／３４　、マトリックス、プロティン７、（’Ｎｕｃｊｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｊ　、第８巻、第１９６５頁〜第１９７４頁〕があげられる。

前記の従来の技術はインフルエンザウィルスの一般的理解のために有用であるが、これらの技術にはなお次のごとき欠点があることが指摘されていた。特に、精製されたＭ蛋白質のごとき精製物質を使用する場合には、その汚染や各ロンド毎の品質のばらつきが大きな問題となる。試験用製剤の不均質性のために、これは非特異性の反応性を示ｊ７、試験の確実性が失われる。

モノクロナル抗体は、理論的には炉力なものであるが、和合性＜ａｖｉｄｉｔｙ）が低く、かつ結合定数が小さく、したがって低価値である場合がある。

インフルエンザウィルスに対して効果的な唯一の抗ウィルス剤は、アマンタジンおよびそれに類似の構造のりマンタジンである。これらの薬剤はインフルエ〉′ ザに有効であるといわれているが、これはＡ型インフルエンザウィルスによる病気にのみ有効である。しかしながら、罹病率および死亡率が高く特効薬を叢も必要とする人々すなわち中高年の人々には、前記薬剤は耐容性が充分でない、腎臓清掃率の低い人々の場合には、試薬剤の体内蓄積によってけいれんが起ることがあり、さらにまた、中枢神経系への作用によって軽薄性、目まい、集中力紙下等の症状があられれることがある。該薬剤は予防剤として最も有効に作用し、Ｌまたかって、インフルエンザに実際に感染しなくても種々の副作用が起るおそれがある。さらに、該薬剤はＡ型インフルユンザにのみ有効であり、したがって、Ｂ型インフルエンザの場合には罹病率および死亡率が高いこともあり得る。トランスクリブターゼに作用する抗ウィルス剤はインフルエンザウィルスに特異的に作用するものであり、そして、インフルエンザウィルスの表面抗原に伴う抗原的シフトおよびドリフトはない。

発明の記述以前に発見されたポリペプチドよりも一層効果的な合成ポリペプチドが製造できることが今や見出された。この新規ポリペプチドはＡ型インフルエンザのＭ！白賞に対するブレフォームド抗体（ｐｒｅｆｏｒｌＩｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）と反応し得、Ａ型インフルエンザのＭ蛋白質の抗体応答性を刺戟でき、種々の種類のインフルエンザウィルスの感染症の判別診断の際に陰性Ｍ蛋白質のための代替物として潜在的に役立ち、そして、Ａ型インフルエンザのＭ蛋白質に対するモノクロナル抗体によってｔｌｍされるものである。該蛋白質の抗原的反応性は潜在的に強力であり、したがってこれは抗体生成用ワクチン荊（ｖａｃｃｉｎａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔｓ）として、広範囲にわたる種々のＡ型インフルエンザ感染症の予防および／または治療のために使用できる。また、これらのポリペプチドはインフルエンザウィルスに対する抗ウィルス剤として使用できる。

特に、５−２５のアミノ酸残基（好ましくは、Ａ型インフルエンザのＭ蛋白質の２１５−２３９区域内の１５−２５のアミノ酸残基に実賀的に対応する１５〜２５のアミノ酸残基）を有する本発明の合成ポリペプチドは、裏皮のインフルエンザ抗原反応性を有し、モノクロナル抗体によって認識されるものであることが見出された。

これらのペプチドの抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は−要人なるインフルエンザ抗原活性を示す。

さらにまた本発明は、これらのポリペプチドの塩、該ポリペプチドのカルボニルおよびアミノ末端基がアミド化およびアシル化された誘導体およびその塩、および、該ポリペプチドと高分子型担体との結合体にも関する。

さらにまた本発明は、前記ポリペプチド、およびそれに対応する塩、誘導体および結合体に標識を付けた物質に関し、さらにまた、放射線免疫試験（ＲＩＡ）や酵素結合免疫性収着剤試験（ＥＬｉＳＡ）のごとき標識を使用する試験方法における該標識付物質の使用に関する。

さらにまた本発明は、インフルエンザウィルスの存在を検知する方法、または鳥類または哺乳類特に人類の・インフルエンザ感染状態を診断する方法において、前記の合成ポリペプチドを使用することを特徴とする方法にち関する。該方法の −Ｂ欅によれば、愚者や実験動物から採取された試料と、本発明のペプチド、その塩またはその結合体（好ましくは、標識付の該’！！７１質とを、免疫反応条件下に接触させる操作が行われる。該愚者がインフルエンザに感染した患者である場合には、患者から採取したｔ！：籾はまたインフルエンザウィルスに対する抗体をも含有するであろう０本発明のペプチド（またはその塩または配合体）は広範囲にわたる種々の種類の前記抗体と、免疫学的反応を行うであろう、この免疫学的反応が起ったか否かの判定は、ＥＬＩＳＡ法、Ｅ’ＦＩＩＴ法、放射線標識や蛍光標識等を使用する方法のごとき常用判定法によって行うことができる。

本発明方法の第二番目の代表的な態様によれば、前記ペプチド、その塩または配合体（好ましくは、標識を付けた該物質）を、若干量の抗体を添加した試料中の抗原と競合させる操作を行い、競合せる抗体およびペプチドの相対的反応の結果に基づいて試験結果を判定する。

さらにまた本発明は、前記の合成ペプチド、その塩またはその配合体に対する抗体に関する。該抗体は、ポリペプチド（あるいは、薬学的に許容され得るその塩、あるいは該ポリペプチドの配合体または薬学的に許容され得るその塩）を免疫原として用いて、適当な宿主動物中で該抗体を発育させる操作を行うことによって、充分に発育できる。該抗体は、ＥＬＩＳＡ法、ＥＭＩＴ法、放射線免疫試験法（ＲＩＡ）のごとき、抗体を使用する試験方法において診断用試験として使用できる。この技術を用いて製造された純粋な合成ポリペプチド、その配合体または抗体は、Ｅ！、ＩＳＡ法、ＥＭＩＴ法または他の種々の免疫学的試験法においで検定用試薬とし、て使用できる。

さらｔ二また本発明は、鳥類や＠乳類特に人類にインフルエンザ免疫性を与える方法において、このような処置を必要とする愚者に対と７、治療学的に有効量の本発明の合成ポリペプチド（または薬学的に許容され得るその塩または配合体）、もしくは該ペプチドから製造されたワクチン１種またはそれ以上各投与することを特徴とする方法に関する。前記薬剤は任意的に、薬学的に許容され得る助剤、担体または希釈剤と混合して投与できる。

さらにまた本発明は、インフルエンザの治療法において、前記の合成ポリペプチドまたはその配合体もしくは塩に対する抗体を使用することに関する。該治療法において該抗体は、消極的免疫法（ｐａｓｓｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）における治療剤として役立つ。消極的免疫法は、宿主動物またはヒブリドーマ細胞線（ｈｙｂｒｉｄｏ＠ａ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ）から得られ、部分的に精製された免疫血清をインフルエンザ患者に注射して、怒染原であるインフルエンザウィルスに結合させて中和することからなる技術である。

本発明はまた、インフルエンザウィルスのポリメラーゼの活性およびインフルエンザウィルス中の［・ランスクリブターゼの活性を失わせるために、前記のペプチドまたは薬学的に許容され得るその塩を使用することにも関する。

発明の詳細な記述用語の定義本明細書および請求の範囲に記載された若干の用語の定義を述べる。

「アシル基」は、アルキル基を含むカルボニル基を意味し、たとえば式Ｒ−Ｃ（ −０）−の基を意味する。上式においてＲは炭素原子数１−８個のアルキル基を表わし、その例にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ヘキシル、オクチル等があげられる。本発明において一般に好ましいアシル基はアセチル基である。アシル基は、ポリペプチドの末端アミノ基をブロフクするために用いられる。

「抗体」は、イムノグロブリンと称される一連のグリコジル化蛋白質を意味する。これは、インフルエンザ抗原のごとき抗原類に特異的に結合し得る。

「抗原」は、抗体形成をなし得る蛋白質またはペプチド化合物を意味する。

「抗原決定因子」または「抗原法定位１」は、抗原の抗体認識の実際の場所を意味する。この用語の同義後は「エピトープＪである。

「担体」は抗原またはハブテンが結合または複合し得る高分子量物！（−１’Ｇに蛋白質）を意味する。この結合または複合によって抗体生成が促進される。もし所望ならば、担体の構造の中に標識を取付けることができる。

「複合体Ｊ　（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、担体に化学的に結合した抗原またはハブテンを意味する。複合体はまた、他の基も含有し得る。

ｒＥＬＩｓＡ法」は酵素結合免疫性収着体試験法を意味する。随性は、固体相に結合した抗体または抗原、および酵素−抗原複合体または酵素−抗体複合体を使用して、試料中に存在する抗原または抗体を検知し１、かつその量を測定することからなる試験法である。　ＥＬＩＳＡ法の説明は、「ベーシック、アンド、クリニカル、イムノロジー」第４版［Ｄ、Ｐ、サイト編、ランデ、メディカルバブリケ〜ジョン、米国カリフォルニア州、ロスアルトス（１９８２年）〕の第２２章に記載されている。

ｒＥ？ＩＩ丁法」は、酵素増殖免疫試験法であって、随性は、（１）酵素標識付ハブテン、（２）該ハブテンに特異性を示す抗体、（３）前処理用試薬、（４）緩衝剤を含む酵素基質、および（５）標準物質を使用して、試料中の未知物質の量を測定することからなる。　Ｅｌｆ丁法の説明は、［エンザイム、イムノア゛ンセイＪ　（Ｅ、Ｔ、マギオ編、ＣＲＣブレスｉｔ＋ｃ、、米国フロリダ州ポウカレートン（Ｘ９８０年）〕の特に第】４１頁−第１５０頁、第２３４頁−第２３５頁、第２４２頁−第２４３頁等に記載されている。

「エピトープ」は、分子中の、抗体によって特異的に認識された部分を意味する。これの同義語は決定因子である。

Ｆ蛍光免疫試験法」は、抗体を使用する試験法であって、随性では、測定すべき種（ｓｐｅｃｊｅｓ）を、抗体リガンド話体中で、蛍光性の種を標識として付Ｌ３た物質に結合させ、あるいは該物質でｒｌ換させ、あるいは該物質と競合させる操作を行う、この試験法の−・異体例では該錯体を分離し、蛍光性の種の存在の有無を調べ、被測定種の量を測定する。別の具体例では、非錯体状態の蛍光性の種の蛍光とは別の蛍光を出す錯体を使用する。

これによって、錯体を分離することなく錯体の形成が検知できる。蛍光免疫試験法の説明は、′ア、レビュウ、オン、フルオロイムノアツセイ、アンド、イムノフルオロトメリック、アッセイ”　、Ｄ、Ｓ、スミス等＜１９８１年）　［’Ａｎｎ、Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｊ、第１８巻、第２５３頁−第２７４頁（１９８１年）］に記載されている。

「ハブテン」は、より大きな分子と結合したときに抗体を形成し得る一般に低置 −７ｔの化合物を意味する。

１インフルエンザ」は、２インフルエンザウイルス感染によ、って起る病気を意味する。インフルエンザウィルスの例にはＡ型およびＢ型ウィルスがあげられる。これらのＡ型およびＢ型ウィルスは当該技術分野で認識されている。これらのうちの若干種は既に同定されており、「アメリカン、タイプ、カルチャー、コレクション」に現存し、そこから入手できる１代表的なものは「アメリカン、タイプ、カルチャー、コレクシヨン、カタログ、オン、ストレインズ、■」、第４版（１９８３年）　［Ｒ，ヘイ等号、アメリカン、タイプ、カルチャー、コレクシラン、米匡メリー・ランド州ロックビル］等２７２頁−第２７６頁に記載されている。

「標識」、「ラベル」は、分子中の検知可能基を意味する。

通知の標識のうちで、放射性標識は放射性免疫ＫＸ、験において有用であり、蛍光性標識は蛍光免疫試験において有用であり、酵素型標識はＥＬＩＳＡ法、Ｅｒ１ＩＴ法等において有用である。

「リガンド」は、抗体結合部位を有し、かつ、レセプタに結合し得る分子を意味する。

「低級アルキル基」は、炭素原子を１−４個有する直鎖状または分枝状の鎖式飽和担炭化素基を意味し、その例にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、第２ブチルおよび第３ブチル基があげられる。

「マトリックス蛋白質」すなわち「Ｍ蛋白質」は、インフルエンザウィルスおよびそれに関連したウィルスの蛋白質系構成成分を意味する。その詳細は本明細書中の“発明の背景”欄に記載されている。

「ベブチＶ４、「ポリペプチドｊは、加水分解よって２個またはそれ以上のアミノ酸を生成し得る比較的低分子量の化合物を意味する。

「薬学的に許容され得る塩」や「塩」は、母体であるポリペプチドの所望抗原的活性をそのまま保っている塩を意味する。

「薬学的に許容され得る塩」は特に、不所望の毒作用を有しないために経口または非経口的投与法によって投与するのに適した塩を意味する。前記の塩、および薬学的に許容され得る塩の例には、（ａ）無機酸の使用によって作られた酸付加塩（無機酸の例には塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸、硝酸等があげられる）、および有機酸の使用によって作られた塩（有機酸の例には酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタリンスルホン酸等があげられる）、ならびにΦ）−価または多価金属カチオンによって生成された塩（該金属の例にはナトリウム、カリウム、亜鉛、カルシウム、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム等があげられる）、または、Ｎ、　Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンまたはエチレンジアミンから生じた有機カチオンによって生成された塩、ならびに（Ｃ）前記の（ａ）および伽）の組合わせに相当する塩（たとえばタンニン酸亜鉛塩等）があげられる。

「放射免疫試験法」すなわちｒＲＩＡ　Ｊは抗体を基剤とする試験法である。この試験法では、被測定種を、抗体−リガント錯体中の放射性標識付物質と結合させ、あるいは後者の物質で置換し、あるいは結合を競合させる操作を行う、錯体を分離し、放射性の有無を調べることによって、被測定種の量を測定できる。

「レセプタｊは、抗原と特異的に結合する能力を有する抗体中の区域を意味する。

「実質的に相当（または対応）する」は、２つのアミノ酸シークエンスが互いに同じであるか、または、２個以下のアミノ酸ユニットが異なっているにすぎないことを意味する。或場所のアミノ酸が異なるか、または余分のアミノ酸が結合しているか、またはアミノ酸が存在しないときに、シーフェンスは異なっているとみなすことができる。好ましくは、これらのシーフェンスはせいぜい１個所だけで異なっており、一層好ましくは、これらのシーフェンスは互いに同一である。

「ワクチン」は、減毒または死滅した微生物（特にインフルエンザウィルス）もしくは合成ポリペプチドまたは複合体の懸濁液または溶液である。これは、インフルエンザウィルスに対する特異的抗体の生成を促進させることによつてインフルエンザを予防し、または軽減させ、もしくは治療するために投与されるものである。

本明細書では、アミノ酸を次の略号で表わす。

アラニン　Ａｌａアルギニン　Ａｒｇアスパラギン　Ａｓｖａアスパラギン酸　Ａｓｐシスティン　（ｙｓグルタミン　Ｇｌｎグルタミン酸　Ｇｌｕグリシン　Ｇｒｙヒスチジン　Ｈｉｓフェニルアラニン　Ｐｈｅトリプトファン　Ｔｙｐ前記の略号はＬ−アミノ酸を表す、ただしグリシンはアキラル（ａｃｈｉｒａｌ）アミノ酸である０本明細書では、すべてのペプチドのシーフェンスを一般慣用法に従って記載し、Ｎ−末端（すなわちアミノ末端）アミノ酸を左側に記載し、Ｃ−末端（すなわちカルボキシル末端）アミノ酸を右側に記載した。

好ましい態様の記述本発明は、インフルエンザ抗原の性質を有する合成ペプチドのシーフェンスに関する。

この合成体のシーフェンスは、Ａ型インフルエンザウイルスのマトリックス蛋白質の２］、５−２３９区域の１５−２５のアミノ酸のシーフェンスに実質的に対応する約５−２５　（特に１５−２５）のアミノ酸を有し、好ましくは、前記マトリックス蛋白質の２１５−２３６区域の１５−２２のアミノ酸のシーフェンスに実質的に対応する１５−２２のアミノ酸を有する。前記マトリックス蛋白質の２１５．、．２３９区域は次のシーフェンスを有する。

Ｍｅ　ｔ−Ａ　Ｉａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔ　ｌｅ−Ｇ　Ｉｙ−Ｔｈｒ−ｔ（１ｓ −Ｐｒｏ−Ｓｅｒ　５ｅｒ−５ｅｒ−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ− Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ａ　Ｉａ好ましい態様では、前記合成体のシーフェンスの長さは１５−２０のアミノ酸に相当し、２３１　区域を含む、一層好ましくは、その長さは１７−１８のアミノ酸に相当し、そして２２０−２３６区域に実質的に相当する。特に好ましい態様として、次のアミノ酸シークエンスがあげられる。

Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈ１ｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＯＨこれらの合成ポリペプチドの製法は、後記の“一般的製造技術”の欄に記載されている。

本発明はまた、これらのポリペプチドの塩、特に、薬学的に許容され得る塩にも関する。この場合のポリペプチドの例には、アミノ末端型アミノ酸がアシル基（特にアセチル基）の使用によってフ゛ロックされており、および／または、カルボキシル基末端型アミノ酸がアミド基に変換されているポリペプチドがあげられる０代表的な塩およびブロック化物質の製法は、後記の「一般的製造技術」の欄に記載されている。

本発明の一態欅によれば、ポリペプチドを高分子型担体と複合させる操作が行われる。適当な担体は、大形でありかつ代謝の遅い高分子型担体であって、その例には蛋白質、多糖類（たトエハラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロ〜スヒード等）、アミノ酸重合体（たとえばボ１！グルタミン酸、ポリリジン等）およびアミノ酸の共重合体があげられる。特りこ有用な蛋白質系基質は血清アルブミン、チオガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉ＠ｐｅｔ）のヘモシアニン、イムノグロブリン分子、チログロブリン、オバルブミン、および当業界で周知の種々の蛋白質である。

前記の蛍白質系担体はそれらの本来の形で使用でき、あるいは、その官能基金１をＬｙｓ残基のサクシニル化によって、あるいはＣｙｓ−チオールラクトンとの反応によって変えることもできる。また、アミノ官能基と２−・イミノチオランとの反応または３−（４−ジチオピリジル）プロプリオネートのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステスとの反応によって、担体（または合成ポリペプチド）中にスルフヒドリル基が導入できる。適当な担体には、合成ペプチドの結合のために、スペーサアーム（たとえばヘキサメチレンジアミンまたはそれと類領の寸法の種々の二官能性分子）を導入する目的で変性操作を行うことも可能である。これらの複合体はポリペプチド自体の場合と同様に、その片方または両方の末端アミノ酸を、所望に応じてアシル基またはアミド基に変換できる。このような複合体の製法は後で述べる。

本発明のペプチドおよび特にその複合体は、インフルエンザ抗原の性質を有する。したがってこれらは、その性質を利用する試験法に使用できる。

このペプチドおよびその複合体はインフルエンザ抗原の性質を有するから、これは治療のためにも使用できる。たとえば、このペプチドまたは複合体はインフルエンザに特異的な抗体の生成のために使用できる。この方法では、宿主動物にペプチドまたは複合体を投与して抗体を生成させ、これを其後に集める。

この方法は後記の「一般的製造技術」の欄に記載されている。

別の態様によれば、前記のペプチドまたは薬学的に許容され得るその塩が、トランスクリブターゼ活性の抑制のために使用できる。

一般的製造技術ポリペプチドシー・フェンスの化学合成前記ポリペプチドは、ペプチドの技術分野で公知の技術によって合成できる。このような公知技術は、たとえばメイエンホーファ、Ｊ、の論文（ｒＪ、Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、第２巻、第４６頁、アカデミツク、プレス５．−ニーヨーク　（１９７３年）〕（固体相ペプチド合成）、およびシュローダ、Ｅ１等編「ザ、ペプチドｊ第１巻（アカデミツク、プレス、１９６５年）（古典的な溶液相合成）に記載されている。

これらの方法では、生長中のペプチド鎖にアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸が逐次的に付加される。一般に、第１アミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基が適当な保ｆｆｌ！で保護される。保護されたアミノ酸またｌ！誘導体の形のアミノ酸と、シーフェンス中の次位のアミ、ノ酸〔好ましくは保護された相補的な蟇（アミノ基またはカルボキシル基を有するアミノ酸）とを、アミド結合を生成させるのに適した条件下に反応させる。

新たに付加された前記アミノ酸から保護基を除去し、次いで其次のアミノ酸を付加させる操作を行う。すべての所望アミノ酸が適切な順序で結合した後に、残存保護基（および固体の担体）を逐次的または同時に除去し、最終ポリペプチド生成物を得る。

また、よく知られているように、２以上のアミノ酸を同時に、生長中の連鎖に付加させることも可能である。

本発明の化合物の好適な製造方法は、固体相ペプチド合成操作を包含する。この方法の場合には、アミノ酸のα−アミ、ノ官能基を５、酸または塩基に敏感な基で保護する。適当な保護基はｔ−ブチルオキシカルボニルｉ　（ＢＯＣ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル基（ＦＭＣＣ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ）等である。

側鎖の活性部位もまた保護して、不所望の反応または結合が起るのを防止する。

アルギニンのために特に適当な側鎖保護基はニトロＬｐ−トルエンスルホニル基、４−メトキシベンゼンスルホニル基、Ｚ、　ＢＯＣ、アダマンチルオキシカルボニル基であり、リジンのために好ましい該保［はジクロロベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ＢＯＣであり、ＡｓｐおよびＧｌｕのために好ましい該保護基は０−ベンジル基、ｔ−ベンジル基であり、チロシンのために好ましい該保護基はベンジル基、０−ブロモベンジルオキシカルボニルＬ　２，６−ジクロロベンジル基、イソプロピル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、アセチル基であり、セリンおよびスレオニンのために好ましい該保護基はベンジル基、ｔ−ブチル基、テトラヒドロピラニル基であり、ヒスチジンのために好ましい該保護基はベンジル基、ｐ−トルエンスルホニルＬ　２．４−ジニトロフェニル基であり、Ｔｒｐのために好ましい該保護基はホルミル基である。

カルボキシル末端型アミノ酸を適当な固体担体（ｓｕｐｐｏｒｔ）に付加させる０反応体に不活性であり、反応体の反応条件下に不活性であり、かつ、使用される媒質に不溶性である担体が適当である。適当な固体担体の例にはクロロメチルポリスチレン−ビジニルベンゼン重合体等があげられる。クロロメチル米：、１スチレンと１％のジビニルベンゼン重合体からなるものが特に適当である。ペプチド中のカルボキシル末端型アミノ酸がアミド（−Ｃ−Ｃ＝Ｏ）　−ＮＨｚ　）に変換されるような特別な場合においては、特に有用な担体はベンズヒドリルアミノ−ポリスチレン−ジビニルベンセン重合体であって、これはビバイル、Ｐ４等の論文（１，９７１年）　（’Ｈｅ１ｖ、Ｃｈｉｓ、Ａｃｔａ、１　、第５４巻、第２７７２頁〕に記載されている。クロロメチルポリスチレン−ジビニルベンゼン型樹脂への付加は、次の方法によって実施できる。すなわち、α−Ｎ−保護アミノ酸、特にＢＯＣ−アミノ酸をそのセシウム塩、テトラメチルアンモニウム塩、４，５−ジアザビシクロ（５，４，０）ウンデク−５−エン塩またはその類似塩の形で、エタノール、アセトニトリル、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の中に入れ（特に好ましくは該セシウム塩をＤＭＦ中二中入二人、高温（たとえば約４０−６０°Ｃ１好ましくは約５０℃）において前記クロロメチル樹脂と約１２−４８時間（好ましくは約２４時間）反応させるのである。α− Ｎ−ＢＯＣ−アミノ酸はベンズヒドリルアミン樹脂に、Ｎ、Ｎ“−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（）ＩＢＴ）を仲介物とするカップリング反応によって付加できる。該反応はジクロロメタンまたはＤＭＦのごとき溶媒（好ましくはジクロロメタン）中で温度約１０−５０°Ｃ（好ましくは２５°Ｃ）において約２−２４時間（好ましくは約１２時間）実施できる。

α−Ｎ−保Ｗ？Ｉｉの除去は、たとえば、Ｉ・リフルオロ酢酸の塩化メチレン中溶液または他の強酸の溶液〔好ましくは、トリフルオロ酢酸の５０％溶液（溶媒はジクロロメタン）〕の存在下に大体室温程度の温度（−二おいて実施できる。

塩基ζ入子安定な保護基は、塩基（たとえばピペリジンのＤＭＦ中溶液）を用いる処理によって除去できる。好ましくは、各々の保護アミノ基は約２．５モル過剰に使用して導入操作を行い、カップリング反応はジクロロメタンまたはその類憤物（特に塩化メチレン）中で大体室温程度の温度において実施できる。一般にカップリング剤はＤＣＣのジクロロメタン中溶液であるが、Ｎ、Ｎ＝ンイソプロピルカルボジイミドまたは他のカルボジイミドも使用でき、しかしてこれらは単独で使用でき、あるいはＨＢＴ　、　Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、他のＮ〜ヒドロキシイミドまたはオキシムの存在下に使用できる。あるいは、保護されたアミノ酸活性エステル（た（！：　えばｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル等）または対称無水物が使用できる。

固体和合成の終了後に、ポリペプチドに別の保護基脱離（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）および中和サイクル操作を行い、次いでアシル化（好ましくは、無水酢酸を用いるアセチル化）を行い、Ｎ−アセチル（Ｎ−Ａｃ）ブロック化アミノ末端基を生成させることができる。あるいは、これは該樹脂から直接に除去できる。

カルボキシル末端基（−Ｃ（−０）−ＯＨ）をアミドとしてブロックすべき場合には、ペプチドはベンズヒドリアミノ−ポリスチレン樹脂上で合成でき、この場合にはアミド基が直接に生成する。あるいはペプチドは該樹脂からアミツリシスによって除去できる。該アミツリシスは、たとえばアンモニア／メタノールまたはアンモニア／エタノールを用いて約Ｏ〜５０°Ｃ（好ましくは約２５℃）の温度において約１２−４８時間（好ましくは約１８時間）実施できる０Ｍ離テアミノ末端基よびカルボキシル末端基を有するペプチドが所望される場合には、ペプチドは、アニソールのごときラジカルスカベンジャー（ｒａｄｉｃａｌ　５ｃａｖｅＢｅｒ）の存在下に無水の液状弗化水素で処理することによって前記樹脂から直接に除去できる。前記樹脂上に存在するかまたはアミツリジスによって該樹脂から除去されたアミノ−あまはカルボキシル−ブロック化（すなわちこれらの基が保護されている）ペプチドは、同様に、無水の液状弗化水素を用いる処理によって保護基を除去できる。α−Ｎ−官能基の保護が塩基に不安定な保ｐｉ５を用いて行われており、かつそれと共に、ｔ−ブチル基準の側鎖の保護が行われている場合には、最終的な樹脂除去を保護基除去工程は、トリフルオロ酢酸を用いて実施できる。

保護基（側鎖保護基を包含する）をポリペプチドから除去するための別の手段は、弗化水素／ピリジン錯体を用いる処理、あるいは、トリス（トリフルオロアセチル）硼素およびトリフルオロ酢酸を用いる処理、炭素またはポリビニルピロリドン上のパラジウムおよび水素による還元、または、液体アンモニア中のナトリウムを用いるかまたは液状部体水素とアニソールとを用いる還元であって、これは−１０°Ｃないし＋１０”Ｃ（好ましくは約Ｏ″Ｃ）において約１５分−１時間（好ましくは約３０分間）実施できる。後者の処理（１１Ｆ　／’アニソール）は、前記樹脂からの除去および保護基の除去を同時に行って退離Ｃ０ＺＨ末＠基を生成させるために（通常のベンジルエステル結合が形成されていた場合）、あるいはＣｏ−ＮＨｚ（アミド）末端基を生成させるために（ベンズヒドリルアミノ結合が形成されでいた場合）利用できる。ベンズヒドリルアミン樹脂上のアミド末端型ペプチドの場合には、樹脂の除去および保護基除去の諸工程は組合せて一段階で実施でき、しかしてこの場合には前記の液状１（Ｆ／アニソールを用いて処理を行うのである。充分に保護されたポリペプチドは、其後にクロマトグラフィ工程において精製できる。

塩の製造前記ペプチドの最終回収工程で使用される媒質のＰＨを、所望カウンタイオンに対応する酸または塩基で調節するという簡単な操作によって、該ペプチドは塩の形で得られる。

担体との複合前記ポリペプチドは、該ポリペプチド中の種々の種類の官能基を介して担体に結合できる。数基の例には、（ａ）α−またはε−アミノ基、（′ｂ）α−５β− またはＴ−カルボキシル基、（Ｃ）チオール基、および（■該ペプチド中の芳香環があげられる。

α−およびε−アミノ基は種々の方法によってカンプリングできる。たとえば、これは担体中に存在する活性化カルボキシル基と反応し得る。該活性化は、カルボジイミド特に水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）　［たとえばＮ−エチル−Ｎ’ −（３−ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミド）〕、イソオキサゾリウム塩、１−エトキシカルボニル−２−工ｌ・キシ−１，２−ジヒドロキノリン、活性エステル生成剤（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル等を生成するもの）、酸塩化物生成側（たとえばＰＣＩ　ｓ、ただしこねは非蛋白質系担体だけのためのものである）、混合無水物生成剤（たとえば無水酢酸）等を用いて実施できる。

はりジンのε−アミノ官能基）を其後に担体中の活性化力！シボキシル官能基に、水性緩衝液中で、または有機７′水性混合緩衝液（たとえばＤＭＦ　／水、ｐＨ８）の中で反応させる。非蛋白質系担体の場合には有機溶媒（たとえばＩ）ＭＦ）が使用できる。この種の技術のうらで特に有用な技術は、水性緩衝液中で蛋白質系坦体の活性体とペプチドとのカンブリングを同時に行い、あるいは、サクシニル化蛋白質系担体のｐ　ＮＯ２−フェニルエステルを生成させ、次い°ご水性緩衝液中でペプチドとカンブリングさせることである。

別の“ち法によれば、合成ペプチドのアミノ官能基が担体分子のアミノ官能基によって架橋できる。該架橋結合は、グルタルアルデヒドの水溶液または有機／水混合溶媒中溶液（ｐＨ約７）との反応を室温において行うことＬこよって形成でき、あるいは、二官能性架橋側（たとえばジメチルスベルイミＦ−ｔ・、フェニルジイソシアネート、フェニルジ・イソチオシアネート、ジンルオロジニトロベンゼンまたはシアン酸クロライド）との反応によって形成できる６前記ペプチドのα−１β−またはＴ−カルボキシル基は、前記方法の逆の方法によって担体上のアミンと反応させることができる０合成ペプチドのカルボキシル官能基は上述の技術によつて活性化できるであろう＃活性化されたカルボキシル官能基を其後に、適当な担体りのアミノ官能基に、前記の緩衝液（水溶液または有機／水混合溶媒中溶液）を前記条件下に使用することによって反応させることができる。

合成ポリペプチド鎖に存在するチオール基（−３ｌ＋）は、マレインイミド官能基の導入によって変性された担体と反応させることができる。該ＳＲ−官能基は前記マレインイミド官能基の二重結合基に特異的に結合し、ベグチドー担体話泳が生じる。前記ＳＨ−官能本は該ペプチドに、アミノ官能基（α−アミノ蟇、またはリジ゛）′の６−アミノ基）とシスティンチオ・−ルアセトンとの反応によって結合させることができる。

＜ブ千ドのＴｙｒおよび旧Ｓユニ・ノド中に存在する芳香環は、蛋白質系担体のＴｙｒおよびＨｉｓユニットの芳香環に、ビス−ジアゾ化芳香族化合物（たとえばビスージアゾ体ベンジジンまたはビス−ジアゾ化−０−アニシジド）の使用によって架橋できる。この反応は、前記の抗原および担体の水溶液または有機／水混合溶媒中溶液中で実施できる。このような技術の参考文献トＬ７で、Ｂ、Ｇ、１ルランガーの論文、“ヂ、プレバレーシラン、オン、アンチジェニック、ハプテン−キャリヤ、コンジュゲーツ・・・ア、サーベイ”、（’Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎ；！ｙｍｏｌｏｇｙ　Ｊ　、第７０巻、第８５頁（ｉ９８０年）〕があげられる。

標標識付ペプチド料の調製放射性標識付ポリペプチドは種六の方法によって調製できる。

たとえば、ポリペプチドの合成のとき二重、商業的に入手可能な炭素（ｌ′Ｃ）標識付アミノ酸が使用できる。同様に１Ｈ−アミノ酸はシュワイザ等の酸化マグネシウム法（ｒＨｅｌｖ、Ｃｌ１ｎ、Ａｃｔａ」第４２頁、第２６２２頁（１９５９年）〕によって製造できる。放射性化学物質に関する日常的な注意事項を除いて、前記の方法は通常の合成法と同様に実施できる。あるいは、最終性成物であるポリペプチドまたは複合体に放射性標識を、トリチウム交換によって取付けることも可能である。

酵素系標識は、複合体を生成させるための酵素系担体を使用することによって取付けることができ、あるいは、担体またはペプチドに、酵素学的活性基を結合させることによって取付けることができる。

合成ペプチドにおける抗体の生成宿主動物を用いて抗原に対する抗体を生成させる方法は、一般に当業界で公知である１代表的な生成方法によれば、宿主である哺乳類または鳥類に、合成ポリベブチドシークエンスが導入される。適当な宿主動物の例には猿、牛、うさぎ、ラット、マウス当があげられる。前記方法では一般に、完全なフロイント補助液で乳化された塩水中溶液の形で皮下に注射する操作が行われる。

約１箇月後に前記動物から採血し、抗体を集める。全血を２５°Ｃにおいて数時間放１して凝固させる。硫酸ア〉′モニウｉ、の水溶液を添加して濃度４０重量％の水溶液試料を作る。ＩｇＧ画分は沈澱する。沈澱を遠心分離操作によって集め、これを塩水溶液または緩衝液中に再び懸濁させ、所望濃度の懸濁液を作る。

精製された抗体画分は、診断用試験に使用するためにさらに変改できる。　ＥＬＩＳＡ試験に使用する場合には、該変改は、リボチーム、ラクトパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ当の酵素と結合させることを包含するものであり得る。抗体は蛍光性の物質または基で変改できる。好ましくは、この蛍光は抗体と抗原との結合の隙に弱まるかまたは増大するようにする。

抗体−抗原結合（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の程度を調べる試験方法は当業界で周知である。しかしながら、必須第一工程適当な免疫原性（ｉｍｓｔ＋ｎｏｇｅｎｉｃ）合成インフルエンザポリペプチドを髭遺し、動物に投与して、多量の高親和性抗体を得ることである。

トランスクリブターゼの試験（および抑制）既述のカトウ等の論文には、ＡｐＧ −プライムド（ｐｒｉＩＩｅｄ）ＲＮＡポリメラーゼの試験方法および試験条件が記載されているが、トランスクリブターゼの試験もそれと同様な条件下に実施できる。精製したＭ蛋白質を、濃度を種々変えて、かつ分散液の状態を種々変えて添加し、抑制率が最大となる最良条件を決定する。所定の抗原の位置にモノクロナル抗体を使用して抑制状態を元に戻すことは、抑制に関係するＭ蛋白質のセグメントの位１を知るための有用な手段でをる。この試験を合成ペプチドに対して行うことによって、それのトランスクリブターゼ抑制活性を知ることができる。

有用性および投与法本発明を医学的および獣医学的分野において利用する方法について述べる。有効量の本発明のポリペプチドまたは複合体または抗体、もしくはそれらを含有する薬用組成物を、治療の必要に応じて患者に投与する。前記のポリペプチド、複合体、抗体または組成物は、各々の場合に特有な最終用途に応じで、種々の投与方法のいｊ″れかによって投与でき、たとえば非経口的に（たとえば皮下、筋肉内または静脈内に）投与できる。また、経口投与も行い得るが、この場合には、安定の形の前記物質を投与するのが特に好ましい、個々の場合における量適の投与方法は、その使用目的、活性成分、患者等に応じて種々異なり、医師や獣医師等の医療担当者の判断によって決定できるであろう。

前記の薬剤は人、猿、犬、けっし類のごとき哺乳動物、およびそれ以外の動物（たとえば七面鳥、にわとり、あひる等の家きん類のごときＡ類）に投与できる。

このような用途に使用される組成物は一般に、注射用食塩水、鉱油等の薬用希釈剤を含有する。経口投与の場合には、錠剤（腸溶性被覆錠剤を包含する）か使用できる。獣医学的分野で使用する場合には、処理飼料を用いて経口投与を行い得る。前記化合物および組成物はまた、当業界で周知の徐放性製剤、デボット製剤、移植用製剤等の形で投与できる。前記のポリペプチド、ポリペプチド複合体および抗体の投与量は一般に１＝１０００ミクログラム／ｋｇ（体重）、好ましくは５−６００　ミクログラＪ−／ｋｇ（体重）である。

自動免疫の場合には、治療上の必要に応じて前記のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を投与して愚者の体内にインフルエンザ抗体を生成させる。受動免疫の場合には、宿主動物から得られた抗体含有血清を部分的に精製し、この精製血清を患者４こ投与して治療学的効果を発揮させる。

Ｍ蛋白質はインフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を抑制し、さらにまた、インフルエンザウィルス中でトランスクリブターゼの活性も抑制する作用を存することが見出された。このことから、Ｍ蛋白質はウィルスのレブリケーシランを調節または抑制し得るものであることがうかがえる〔イエ−２Ｚ１等（１９８７年）、ｒＪ、ν１ｒｏ１．　」第６１巻、第２３９頁−第２４６頁；ズポナルジェブ、Ａ、Ｙ、等（１９８０年）、「Ｊ、ν１ｒｏ１．　Ｊ　、第３３巻、第５８３頁−第５８６頁〕、また、Ｍ蛋白質上の特別な部位に導かれるモノクロナル抗体は、Ｍ蛋白質の前記活性を低下またはなくすることができるものであることにも注目されたい２本発明の合成ペプチドは前記のごとき特別な部位に相当し、そして複合体として、載接のモノクロナル抗体に対し非常に高い力価をあらほす。前記の説明から明らかなように〜前記ペプチドおよびその複合体ばＭ蛋白質の場合と同様な方法によってうイルスのレブリゲーシランを抑制し、すなわち、抗ウイルス成分として作用すると思われる。

本発明のポリペプチド、２ポリペプチド複合体、および前記ポリペプチドおよびポリペプチド複合体に対応する抗体はまた、インフルエンザの検知および診断のために有利に使用でき、特に、ＥＬＴＳＡ法や叶Ｈ法のごとき試験法におけるキヤリプレーシ＝！二／溶液のために有用な高純度物質を折伏し得るという利点を有する。

診断用試薬、標準物質またはキットに使用される酵素は、複合体形成の難易、ターンオーバ率、および検知すべき未知物質〔すなわちアナライ）　（ａｎａｌｙｔｅ）　］を生理学的流体に応じて種々変わるであろう０選ばれる酵素の例には、米国特許第３．８１７，８３７号明細書に記載のヒドロリスアーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼ、エステラーゼ等があげられる。

診断用試薬、標準物質またはキットに使用される前記抗体に標識を付ける方法および装置の説明は３．たとえば米国特許第４．３６６．２４１号明細書に記載されている。

実施例本発明を具体的に例示するために、次に実施例を示す、しかしながら、本発明の範囲は決して実施例記載の範囲内のみに限定されるものではないことが理解されるべきである。

例１次式のペプチドの製造Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−旧５−Ｐｒｏ−５ｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｇ］、ｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ・Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＯＨこのペプチドは、固体相技術を用いて、ベックマン９９０Ｃ型ペプチド合成装置において、商業的に入手し得るｔ−Ｂｏｃアミノ酸ボリスコＬ／ン樹脂およびｔ −ＢｏＣ保謬アミノ酸を使用して合成した。後者の酸の側鎖保護基は、ＡｓｐおよびＧｌｕのためのＯ−ベンジルエステル基、ＴｈｒおよびＳｅｔのためのＯ− ベン′ジｌレエーテル基、旧Ｓのためのｄｎｐ　、および、Ｌｙｓのためのオルトクロロベンジルオキシカルボニル基であった。すべてのカップリング反応は、樹脂上のアミノ酸のミリ当量値を基準として、３倍モル過剰量のｔ−Ｂｏｃアミノ酸およびジシクロヘキシルカルボジイミドベンゾＩ・リアゾール（）ＩＯＢＴ）を使用した．すべてのカップリング反応は、ニンヒドリン試験〔カイザー等’Ａｎａ１．Ｂｉｏｅｈｅｓ．　Ｊ第３４巻、第５９５頁（１９７０年）〕によって監視した，　ＢＯＣ保護基の除去のために、４０％ＴＦＡ／ＣＨｚＣ１ｇを使用した．メチオン力く存在する場合には、前記ＴＦＡ／Ｃ）ＩｚＣＨｚに２−メルカプトエタノ−）Ｌ−（０．１％）を添加した（メチオニ〉・は、保護されて６′１なし１人ノトフヒドリル側鎖を有するものを使用した）、この合成操イ乍の詳細をス与ジュールＩＬこ示す。

スカニＬと二」−一１樹脂上におけるペプチド合成操作合成操作の終了後に、低−高肝法（り上等（１９８２年）、’Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．　」第２３巻第２９３９頁、およびｒ　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ＋ｗ．Ｓｏｅ．　」等１０５頁、第６４４２頁（１９８３年）およびＳＮ”保護基除去反応を行ってペプチドを樹脂から除去した．前記反応はＨＦ−反応装置■型（ペニンシュララボ社）において行−、た、当該ペプチド樹脂を最初にＨＦ／ジメチルサルファイド／ｐ−クレゾール混合物（２５：　６５　：　１０）で、４°Ｃにおいて１時間処理した。ＩＦおよびジメチルサルファイドを完全に蒸発させた．次いで、追加量のＨＦを反応器に入れ、肝ｉｐークレゾールの比率を９：１にした．反応混合物を４°Ｃにおいて４５分間攪拌した．真後にＯＦを完全に蒸発さゼ、しかして該操作は真空下に、最初は４°Ｃにおいて、次いで室温において行った。低ＨＦ濃度の場合には、ＡｓｐおよびＧｉｕの側鎖のペン・ゾルエステル基が離脱し９、このとき、副反応であるアシル化反応は最小限に抑制される。高ＩＦ濃度の段階では、Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）のごとき酸性下に比較的安定な基が除去され、そしてペプチドは完全に前記樹脂から離脱１−だ、　ＩＰを用いる離脱操作の前に、旧５ＯＤＮＰ基は、１０００倍過剰量の２−メルカプトエタノールを用いる処理によって除去された１、前記ペプチドを種々の副生成物から分離するために、エーテルを用いて抽出操作を行った０次いで５％酢酸（またげ一層高濃度の酢酸；該濃度はペプチドの溶解度に応じて適宜変えることができる）を用いて抽出操作を行い、真後に、凍結乾燥操作を行った。これによって、ペプチドは該樹脂から単離された。

得られた粗製ペプチドに、セファデックスＬＨ−２０を用いてゲル１１過を行った。最終精製操作として、ＨＰＬｃ操作を、充填剤（Ｖｙｄａｃ＋１５−２０　ミクロンＣ１１）を入れた寸法５０ｃｍ／２０ｍ１のコラム（ｐｒｅｐａｒａｔｉＶｅ　ｃｏｌｕｍｎ）を用いて行った。ペプチドの純度は、分析用１１ＰＬｃおよびアミノ酸分析によって調べた。

水からの凍結乾燥を３回行、た後に１８次式の構造を有する純粋なペプチドが酢酸塩として得られた。

Ｈ−Ｇｌｙ−丁ｂｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ　５ｅｒ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−１，ｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＯＨ上記の“２２０−２３６°シークエンスＯポリペプチドを、以下では「ペプチド１」と称する。

例２次式の放射性樹脂付ペプチドの製造Ｈ−Ｇ　１ｙ−Ｔｈｒ−Ｈ４ｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−５ｅｒ−３ｅｒ−Ａ　１ａ− Ｇ　ｌｙ−Ｌｅｕ−１ｙｑ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ −ＯＨＨＩ３操作を、放射性標識付Ｂｏｅ−アミノ酸を使用して繰返した。該アミノ酸は、シェフ１′ザー等の方法［ｒＨｅｌｖ、ｃｈｉｍ。

Ａｅｔａ」（１９５９年）、第４２巻、第２６２２頁〕に従って調整した。これによって、放射性標識付の所望生成部が得られた。

例３複合体の製造例１および例２の方法で作られたペプチドを、担体型蛋白質と複合させた。咳担体牛の血清アルブミンおよび千ログロブリンを使用した。複合操作は既述の一般的方法に従い、かつ１、アクツシ等の論文〔ｒＢｉｏｅｈｅｓ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｅｔａ」、第６７０巻、第３００頁−第３０２頁（１９８１年））に記載の特別な技術を用いて行った。

活性試験例１の生成物、および該生成物とＢＳＡおよびチログロブリンとからなる錯体の活性を試験した。

第１番目の試験では、自然のままのＭ蛋白質に対応する一連のモノクロナル抗体を集め、合成ペプチドやその錯体との反応性について調べた。精製された１０− ２５ミクログラムのＭｌ白質をフロイントの完全補助液中に入れ、これでマウス（Ｂａｌｂ／ｃ＋ｅｉｃｅ）を免疫化した０Ｍ蛋白質を次の方法で精製した。すなわちＳＤＳゲルクロマトグラフィ操作を行い、次いで、エクスホースチブ透析（ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ　ｄｉａｌｙｓｉｓ）を、古くなった豚のインフルエンザワクチン（Ｘ−５３ａ組替えウィルス株；　Ａ／ＰＲ／８／３４ｉ’ｌ蛋白質を含有する；バエズ等、ｒ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　」第１０７巻第５４８頁−第５５１頁〕およびｆ留水を用いて行った。マウスに、６週間後ないし３箇月後にＭ蛋白質をさらに１０−２５ミクログラム投与して（静脈内投与）ブースト（ｂｏｏｓｔ）　Ｌ、ブーストの３日後に牌臓を除去し、ポリエチレングリコールを用いて該牌臓の細胞をＳＰ２１０−Ａｇ１４非分泌型骨髄腫細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１）と混合し、た、該骨髄種細胞はログフェーズ（ｌｏｇ　ｐｈａｓｅ）で生長中のものであった。

ヒブリドーマをＨＡＴ媒質中で選択し、ＥＬＩＳＡ法によって、Ｍ蛋白質で酸層されたマイクロタイタブレート上で放射能によるスクリーニングを行った０反応性ヒブリドーマのクローニングを、Ｔ−細胞フィーダーレイヤーを要する０、　５および１０１ｉ！胞／′ウエルで行った。ファンワイク等の論文（、ｒＪ、ν １ｒｏ１．」、＄４８巻、第２４Ｌ２５２頁（１９８４年）〕に記載され、そして２８９／４および９０４／６として同定された追加のヒブリドーマラインが、その発見者によって捷供されたが、これにクローニングを行つて２８９／４−０５および９０４／６−Ｄ−５を生成させた。これらの種々のヒブリドーマによって作られたモノクロナル抗体を集めた。

集められたモノクロナル抗体に第一番目の試験を行って、Ａ型インフルエンザウィルスの精製株１４種に対する作用を調べた。この試験は、カーノ等の論文〔ｒＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｊｅｒｏｂｉｏｌｏｑｙ　Ｊ、第１６巻、第８１３頁−第８２０頁（１９８２年）〕に記載の一般式ＥＬＩＳＡ試験法に従。て行った。この試験では、マイクロタイタープレートを精製ウィルスで被覆した（１００ｎｇ／ウニル）、０．５％ＢＳＡ　（ＰＢＳ−ツウイーン中）で後被覆を施し、次いでアサイド流体（ａｓｃｉｔｅｓ　ｆｌｕｉｃｌｓ）を３倍希釈度まで順次希釈し、に１００の初期希釈度から初めて、前記プレートを横切るようにじた。

羊のｒアンチマウス−アルカリ性ホスファターゼ複合体（シグマ）」を添加し、結合モノクロナル抗体をカンチテー　ト（ｑｕａｎｔｉｔａｔｅ）　シた。バラ −ニトロフェニルホスフェートを基質として使用した。終点滴定では、バックグラウンドの３倍多い吸収値を示す希釈度として測定された。これらの試験の結果を表１に示す。該試験によって、前記のモノクロナル抗体パネルは広範囲にわたるインフルエンザ株において広い認識を示すことが明らかになった。

例１−３で得られた３種の物質に試験を行い、モノクロナル抗体のパネルに対する活性を調べた。その結果は、第２表に記載のごとく非常にすぐれている。このペプチドは、ＢＳＡまたはテログロブリンに複合され、ＥＩＪＳＡ吸着体とし、で使用されたときに、多くのモノクロナル抗体に関し、精製Ｍ蛋白質の１万倍までの高い力価を示す、前記のベプチ）゛および複合体の強力なモノクロナル抗体認識作用と、特定の部位への特異的な結合作用と、収穫の部位はウィルスのレブリケーシランの阻止のための部位のなかに含まれるという知見とを総合して考慮すれば明らかなように、本発明の前記物質は抗ウィルス剤として有用であると思われる。

表ｍ制とインフルエンザウィルスＥＩＪＳＡ力価（ＸＩＯ−”）＊Ｘ−５３ａ　（Ａ／ＰＲ／８／３４Ｍ蛋白質遺伝子）。

零車ファンダイクおよびその共同研究者の論文（ｒ　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　Ｊ第４８巻、第１２４８頁（１９８４年）〕に記載のもの。

表ｍ致とインフルエンザウィルスＥＬＩＳＡ力価（ＸＩＯ−”）＊Ｘ−５３ａ　（Ａ／ＰＲ／８／３４Ｍ蛋白質遺伝子）。

１１＊フアンダイクおよび共同研究者の論文（ｒＪ、Ｖｉｒｏ１ｇ第４８巻、第１２４８頁（１９８４年）〕に記載のもの。

表ニー（ｉｌｌｌインフルエンザウィルスＥＬＩＳＡ力価（Ｘ　１０−３）＊　Ｘ−５３ａ　（Ａ／ＰＲ／８／３４Ｍ蛋白質遺伝子）＃寧傘ファンダイクおよび共同研究者の論文〔「Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　Ｊ第４８巻、第１２４８頁（１９８４年）〕に記載のもの。

表−一」− モノクロナル抗体と合成ペプチドとの反応性手続補正書平成　３年　２Ａ２１日

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ａ型インフルエンザウィルスのマトリックス蛋白質の２１５−２３９区域の１５−２５のアミノ酸シークエンスに実質的に対応する約１５−２５のアミノ酸の長さを有するポリペプチドから選択され、インフルエンザウィルス抗原反応性を有する合成ポリペプチド。
２．Ａ型インフルエンザウィルスのマトリックス蛋白質の２１５−２３５区域に実質的に対応する１５−２２のアミノ酸の長さの、請求の範囲第１項に記載の合成ポリペプチド。
３．１５−２０のアミノ酸の長さを有し、２３１部位を含む請求の範囲第２項に記載の合成ポリペプチド。
４．次式【配列があります】のアミノ酸シークエンスを有する請求の範囲第３項に記載の合成ポリペプチド。
５．請求の範囲第１項に記載のポリペプチドの塩。
６．さらに放射性標識を有する請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
７．カルボキシル末端型アミノ酸がアミド基に変換された請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
８．アミノ末端型アミノ酸がアシル基でブロックされた請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
９．高分子型担体と、それに結合した請求の範囲第１項に記載の合成ポリペプチドとを含有してなる複合体。
１０．前記ポリペプチド中のカルボキシル末端型アミノ酸がアミド基に変換されており、あるいは、アミノ末端型アミノ酸がアシル基でブロックされている請求の範囲第９項に記載の複合体。
１１．前記担体が蛋白質である請求の範囲第９項に記載の複合体。
１２．前記担体が標識を有するものである請求の範囲第９項に記載の複合体。
１３．前記標識が放射性標識である請求の範囲第１２項に記載の複合体。
１４．前記標識が蛍光性標識である請求の範囲第１２項に記載の複合体。
１５．前記標識が酵素型標識である請求の範囲第１２項に記載の複合体。
１６．請求の範囲第１項に記載のポリペプチドに対応する抗体。
１７．請求の範囲第９項に記載の複合体に対応する抗体。
１８．インフルエンザウィルスに特異的な抗体を生成させる方法において、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを宿主動物に投与して前記抗体を生成させ、該抗体を集めることを特徴とする方法。
１９．請求の範囲第１項に記載のポリペプチドに特異的な抗体を生成させる方法において、該ポリペプチドを宿主動物に投与して該抗体を生成させ、該抗体を集めることを特徴とする方法。
２０．インフルエンザウィルスに特異的な抗体を生成させる方法において、請求の範囲第９項に記載の複合体を宿主動物に投与して該抗体を生成させ、該抗体を集めることを特徴とする方法。
２１．試料中のインフルエンザウィルスの存在を検知する方法において、該試料と請求の範囲第１６項に記載の抗体とを免疫反応条件下に接触させ、次いで、該ウィルスと該抗体との免疫学的結合を検知することを特徴とする検知方法。
２２．試料中のインフルエンザウィルスの存在を検知する方法において、該試料と請求の範囲第１７項に記載の抗体とを免疫反応条件下に接触させ、次いで、該ウィルスと該抗体との免疫学的結合を検知することを特徴とする検知方法。
２３．試料中のインフルエンザウィルスに対応する検体の存在を検知する方法において、該試料と請求の範囲第１項に記載のポリペプチドとを免疫反応条件下に接触させ、次いで、該ペプチドと該抗体との免疫学的結合を検知することを特徴とする検知方法。
２４．試料中のインフルエンザウィルスに対応する抗体の存在を検知する方法において、該試料と請求の範囲第９項に記載の複合体とを免疫反応条件下に接触させ、次いで、該ペプチドと該抗体との免疫学的結合を検知することを特徴とする検知方法。
２５．治療が必要な患者のインフルエンザを治療する方法において、インフルエンザの治療のために治療学的に有効な量の、請求の範囲第１６項に記載の抗体を、該患者に投与することを特徴とする治療方法。
２６．治療が必要な患者のインフルエンザを治療する方法において、インフルエンザの治療のために治療学的に有効な量の、請求の範囲第１７項に記載の抗体を、該患者に投与することを特徴とする治療方法。
２７．哺乳類または鳥類に、インフルエンザに対する免疫性を与える方法において、インフルエンザに対する免疫性を与えるために治療学的に有効な量の、請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを、前記の哺乳類または鳥類に投与することを特徴とする方法。
２８．インフルエンザに対する免疫性を哺乳類または鳥類に与える方法において、インフルエンザに対する免疫性を与えるために治療学的に有効な量の、請求の範囲第９項に記載の複合体を、前記の哺乳類または鳥類に投与することを特徴とする方法。
２９．治療が必要な患者のインフルエンザを治療する方法において、インフルエンザの治療のために治療学的に有効な量の、請求の範囲第１項に記載のペプチドを該患者に投与することを特徴とする治療方法。