JPH04500221A - インフルエンザウイルス感染症の診断および予防用合成ペプチド、およびその使用 - Google Patents
インフルエンザウイルス感染症の診断および予防用合成ペプチド、およびその使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
インフルエンザウィルス感染症の診断および予防用合成ペプチド、およびその使
用
11はLえ!
関連特許出願との関係
本特許出願に関連する出願は、1987年5月14日に出願された米国特許出願
第050.633号である。該出願は、79−104.64−80および149
−169部位のM蛋白質、およびインフルエンザの診断および治療へのその利用
に関するものである。
発明の技術分野
本発明はインフルエンザ用の抗体に関するものである。一層詳細にいえば本発明
は、インフルエンザ抗体決定因子(antjgenic determinan
ts)を提供する合成ペプチドシークエンス(sequences)に関し、ま
た、診断薬やワクチンの製造時における抗体としての該配列体の使用に関し、さ
らにまた、抗体等の形成に関し、さらにまた、インフルエンザウィルス感染症の
診断、予防および治療の際の前記ペプチド、薬剤、抗体およびワクチンの使用に
関するものである。
関連事項
インフルエンザの重大性
インフルエンザ感染症は重要であり、新型株の出現後に感染症が流行し、場合に
よって非常に広く流行することがあり得る。
監視用施設のネットワークが全世界にわたって設けられているが、その努力にも
かかわらずインフルエンザに関する報告はまだかなり不足している。その原因の
少なくとも一部として、中程度の設備しか備えていない前記の監視用施設の実験
室で速やかに、かつ高い信転性を以て実施できる試験方法が未だ開発されていな
いことがあげられる。さらに、アマンタジンのごとき有効な薬剤は、特に中年層
等の治療や予防にはあまり使用されていない、なぜならば、迅速診断法が一般に
行われていないからである。
さらに、応答型ウィルスは絶えず別の採種として再び出現する傾向があり、この
ために前記の問題が一層複雑になる。前記のごとく新型株が出現するので、これ
らはその表面の抗原型決定因子の浮動またはシフトを表わしていると考えられ、
そのために、該決定因子に基づくその免疫学的同定が一般に困難になる。既に知
られているように、インフルエンザウィルスのマトリックス蛋白質の構造は、或
株から別の株へと非常によく保たれている。
マトリックス蛋白質
インフルエンザウィルスのマトリックス蛋白質(M−蛋白質)は、インフルエン
ザピリオン(virion)の主な内容蛋白質である。よく知られているように
、これはウィルス蛋白質全体の約46%を構成し、その分子量は約27,000
であり、そしてこれはエンベロープのリビド複層の内面に沿って配列する。該エ
ンベロープはウィルスのへマグルチニンおよびノイラミニダーゼサブユニットを
含有する。そのペプチド鎖は252個のアミノ酸を含む、そのアミノ酸配列も既
に報告されている。
若干の研究者によって、前記のマトリックス蛋白質の役割に関する研究がインフ
ルエンザとの関連下に行われた。ウエブスタおよびヒンジヨウ〔「インフエクシ
ツン、アンド、イムニティ」、第17巻(3)第561頁−第566頁(197
7年9月)〕は、自然状態のまま単離されたM−蛋白質はマウス中のウィルスク
リアランス値を高める旨を述べている0発明者の1人であるブタチャおよびその
共同研究者(rJ、clin、Mierobiol、 J 、第16巻(5)、
第8】3頁−第820戸(1982年11月)〕は、自然の状V?中離されたM
−蛋白質を用いて酵素結合免疫収着体試験(ELISA)を行い、イーフルユン
ザウィルスに対する抗体を検出した。ズボナルジエブおよびゲンドン〔rJ、V
irol、 J 、第33巻(2)、第583頁−第586頁(1980年2月
)〕は、インフルエンザA型ウィルスのりボヌクレオ蛋白質のトランスクリブタ
ーゼの活性は、M−蛋白質の存在下では阻害される旨を述べている。イエ、21
、R,パル、J、−、フォクスおよびR,R,ワグナ−の論文(1987年)〔
“ファンクショナル、アンド、アンチジェニック、ドメインズ、オン、ザ、マト
リックス(M)、プロティン、オン、インフルエンザA、ウィルス“、rJ、V
irol、 J第61巻、第239頁−第246頁〕には、モノクロナル抗体は
、阻害されたトランスフリブシランを元に戻す作用をすることが記載されている
。
先に出願された特許出願には、M蛋白質の79−104.64−80および14
9−169部位に相当する合成ポリペプチドの製法および使用法が開示されてい
る。
Ml蛋白質性質を述べた文献は他にもあり、たとえばブタチャ(本発明の発明者
)およびその共同研究者の論文には4、自然の状態で精製されたM蛋白質は、う
さぎの抗体応答性を引き出す作用を有し、その力価は1 二40,000である
旨が記載されている( ’J、lml1uno1.Methods J 、第9
6巻、第77頁−第85頁(1987年)]、フファンワイク等の論文(rJ、
Virol、 J 、第48巻、第248頁−第252頁(1984年)はM蛋
白質構造中の多数の抗原型ドメインに関するものである。マクキリン等の論文(
’Laneet」、第2巻(8641) 、第911頁−第914頁(1985
年10月26日)〕には、インフルエンザM蛋白質に対するモノクロナル抗体、
およびそのインフルエンザ診断への使用法が記載されている。さらにまた、アレ
ン、Hl、J、マクコウレー、阿、ウォータフィールドおよびM、J、ゲシング
の論文〔“インフルエンザ、ウィルス、RNAセグメント7、バズ、ザ、コーデ
ィング、キャパシティ、フォア、ツウ、ポリペプチド”、rVirology」
、第107巻、第548頁−第551頁(1980年)〕:ベイラー、N、縁1
、Y、リー、Z。
イエ−およびR,R,ワグナ−の論文〔“トランジェント、エクスブレフシラン
、アンド、シーフェンス、オン、ザ、マトリックス(Ml) 、ジエン、オン、
WSN 、インフルエンザAウィルス、イン、ア、ワタシニア、ベクター”、「
Virol、 J第163S、第618頁−第621頁(1988年)〕;マー
クシン、Sl、■、ギアシ、N、スコロブ、A、シロブ、B、シニチン、D、ブ
ラウン、A、クリモブおよびり、ナヤクの論文(1988年)〔“ヌクレオチド
、シーフェンス、オン、RNAセグメント7、アンド、ザ、プレデイクテド、ア
ミノ、シーフェンス、オン、Ml、アンド、M2、プロテインズ、オン、FPν
/ウェイブリッジ()17N7) 、アンド、同+1 (HINI)、インフル
エンザ、ウイルシズ”、「ウィルス、リサーチ」、第10巻、第263頁−第2
72頁〕;オルチン、Jl、C,ビラヌエバ、し、マーセデス、ダビラ、C,ロ
ベズーガリンデス、N、ビラヌエバおよびE、ドミンゴの論文〔1エボリユーシ
ーン、オン、ヌクレオチド、シーフェンス、オン、インフルエンザ、ウィルス、
RNAセグメント7、シュアリング、ドリフト、オン、ザ、H3N2、サブタイ
プ、r Gene J第23巻、第233頁−第239頁(1983年〕:年上
:ズポナルジエブ、A、Y、およびy、z、ゲンドンの論文(1980年)〔“
インフルエンス、オン、メンブレン(M)プロティン、オン、インフルエンザA
1ウィルス、ピリオン、トランスクリブターゼ、アクチビチイ、イン、ビトロ、
アンド、イフツ、サセプチビリチイ、ツウ、リマンタジン”、’J、Viro1
. J、第33巻、第583頁−第586頁〕も参照されたい。
他の研究
インフルエンザ、その診断および治療に関する研究は前記以外にも種々なされて
おり、たとえばグラジエン等はインフルエンザ感染症の診断のための2つの免疫
学的方法の比較の結果を報告している( ’J、Cl1n、Microbio1
. J第22巻(5)、第757頁−第760頁(1985年11月)〕、ジャ
リド等は、インフルエンザ感染症の診断のためのモノクロナル抗体およびポリク
ロナル抗血清の比較の結果を報告している( rJ、aClin、Microb
iolg 、第22巻(5)、第877頁−第879頁(1985年11月)〕
。
インフルエンザ感染診断に関する研究はほかにもあり、たとえば、ジュルクメン
、L等(1984年)(’J、viro1.Mehtods J、第9巻(1)
、第7頁−第14頁)、ズロブ、S、A、等(1985年) (Za。
Microbiol、Epidesiol、1mmur+obio1. J (
1)、第81−5ページ(英文抄録)、ブタコバ等(1985年)(’Acta
Virol、 J (Praha)、第29巻(1)、第19頁−第24頁)
、ブクリ〉Iスカイア、A、G、 (1985年)(rVopro、Virom
ol、 J 、 第30巻(1)、第16頁−第21頁(6i ref、)、ア
ネスタド、G、 (1985年)(J、Hyg、 J (ロンドン)、第94巻
(3)、第349頁−第356頁)、コピアコバ、丁、N、 (1985年)(
rMicrobiol、EpideIliol、Immunobiol−J (
4)、第43頁−第45頁)、ファン、ポリス、L、P、等(1985年) (
J、Med、Virol、 J 、第16巻(4)、第315頁−第320頁;
および(1984年) 、rVopro、Viromol、」、第29巻(4)
、第417頁−第419頁)、ブタチャ等(1987年)(rJ。
Im’+5uno1.Metbods J 、第96巻、第77頁−第85頁)
の論文があげられる。
さらに、本発明に多少関連する技術分野の論文として、たとえば、バエズ、hl
、P、バリースおよびE、D、キルボーン(1980年)、“ジェーン、コンポ
ジション、オン、ハイーイールデング、インフルエンザ、ワクチン、ストレイン
ズ、オンテインド、パイ、リコンビネーシッン” [’J、Inf、Dfs、
J第141巻、第362頁−第365巻〕、ブタチャ、D、J、、1.G、カリ
トネンコブ、J、A、ザコミルジン、V、B、グレゴリニブ、S、M、クリメン
コおよびJ、F、ディビス(1980年)、“インコーポレーション、オン、イ
ンフルエンザ、ウィルス、M−プロティン、インツウ、リポソームズ〔「J、V
irol、 J第36壱、第586頁−第590頁〕、ブタチャ、D。
Jl、S、S、L、リー、J、M、ケホエおよびE、D、キルボーン(1976
年)、“クロマトグラフィツク、アイソレージ呵ン、オン、ザ、ヘマグルチニン
、ポリペプチド、フロム、インフルエンザ、ウィルス、ワクチン、アンド、デタ
ーミネション、オン、ゼア、アミノ、ターミナル、シークエンシズ” (rPr
oc、Natl、Acad、Sci。
υSAJ、第73巻、第238頁−第242頁〕、バフラ−ホワイト、み、Jl
、C−M、ナエブおよびBJ、マーフイ (1986年)、“キャラタリゼーシ
ゴン、オン、ア、ジエー・ン、コーディング、フォア、M−プロテインズ、ウィ
ンチ、イズ、インポルブト、イン、ホスト、レインジ、リストリフシラン、オン
、アン、アビアン、インフルエンザAウィルス、イン、モンキーズ” (rJ、
Virol、 J、第57巻、第697頁−第700更〕、チツウ、P、Y、お
よびG、D、ファスマン(1978年)、“エンビリカル、プレディクシコンス
、オン、プロティン、コンフォーメション” (’Ann、Rev、Bioch
emg、第47巻、第251頁−第276更〕、エルカラダギ、Sl、J、A、
ザコミルジン、C,シマネ、[]、J、ブツチブタV、A、 )ベジスロブおよ
び1、G、カリトネンコブ(1984年)、°°インタラクシ町ン、オン、イン
フルエンザ、ウィルス、プロテインズ、ウィズ、ブレーナ、パイレイヤー、リビ
ド、メンブレンズ;キャラクタリゼーション、オン、ゼア、アブソーブシラン、
アンド、インコーボレーシッン、インツウ、リビド、パイレイヤーズ”% [’
Bioche閣。
Biophys、Acta」、第778巻、第269頁−第275更〕、エリク
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13頁〕、ガラガー、Hl、D、J、ブタチャ、R,ドルマシュキン、J、F、
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インフルエンザ、ウイルシダ、パイ、ア、コンビネータ9ン、オン、シネチック
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、第8巻、第1965頁〜第1974頁〕があげられる。
前記の従来の技術はインフルエンザウィルスの一般的理解のために有用であるが
、これらの技術にはなお次のごとき欠点があることが指摘されていた。特に、精
製されたM蛋白質のごとき精製物質を使用する場合には、その汚染や各ロンド毎
の品質のばらつきが大きな問題となる。試験用製剤の不均質性のために、これは
非特異性の反応性を示j7、試験の確実性が失われる。
モノクロナル抗体は、理論的には炉力なものであるが、和合性<avidity
)が低く、かつ結合定数が小さく、したがって低価値である場合がある。
インフルエンザウィルスに対して効果的な唯一の抗ウィルス剤は、アマンタジン
およびそれに類似の構造のりマンタジンである。これらの薬剤はインフルエ〉′
ザに有効であるといわれているが、これはA型インフルエンザウィルスによる病
気にのみ有効である。しかしながら、罹病率および死亡率が高く特効薬を叢も必
要とする人々すなわち中高年の人々には、前記薬剤は耐容性が充分でない、腎臓
清掃率の低い人々の場合には、試薬剤の体内蓄積によってけいれんが起ることが
あり、さらにまた、中枢神経系への作用によって軽薄性、目まい、集中力紙下等
の症状があられれることがある。該薬剤は予防剤として最も有効に作用し、Lま
たかって、インフルエンザに実際に感染しなくても種々の副作用が起るおそれが
ある。さらに、該薬剤はA型インフルユンザにのみ有効であり、したがって、B
型インフルエンザの場合には罹病率および死亡率が高いこともあり得る。トラン
スクリブターゼに作用する抗ウィルス剤はインフルエンザウィルスに特異的に作
用するものであり、そして、インフルエンザウィルスの表面抗原に伴う抗原的シ
フトおよびドリフトはない。
発明の記述
以前に発見されたポリペプチドよりも一層効果的な合成ポリペプチドが製造でき
ることが今や見出された。この新規ポリペプチドはA型インフルエンザのM!白
賞に対するブレフォームド抗体(preforlIed antibody)と
反応し得、A型インフルエンザのM蛋白質の抗体応答性を刺戟でき、種々の種類
のインフルエンザウィルスの感染症の判別診断の際に陰性M蛋白質のための代替
物として潜在的に役立ち、そして、A型インフルエンザのM蛋白質に対するモノ
クロナル抗体によってtlmされるものである。該蛋白質の抗原的反応性は潜在
的に強力であり、したがってこれは抗体生成用ワクチン荊(vaccinati
ng agents)として、広範囲にわたる種々のA型インフルエンザ感染症
の予防および/または治療のために使用できる。また、これらのポリペプチドは
インフルエンザウィルスに対する抗ウィルス剤として使用できる。
特に、5−25のアミノ酸残基(好ましくは、A型インフルエンザのM蛋白質の
215−239区域内の15−25のアミノ酸残基に実賀的に対応する15〜2
5のアミノ酸残基)を有する本発明の合成ポリペプチドは、裏皮のインフルエン
ザ抗原反応性を有し、モノクロナル抗体によって認識されるものであることが見
出された。
これらのペプチドの抱合体(conjugates)は−要人なるインフルエン
ザ抗原活性を示す。
さらにまた本発明は、これらのポリペプチドの塩、該ポリペプチドのカルボニル
およびアミノ末端基がアミド化およびアシル化された誘導体およびその塩、およ
び、該ポリペプチドと高分子型担体との結合体にも関する。
さらにまた本発明は、前記ポリペプチド、およびそれに対応する塩、誘導体およ
び結合体に標識を付けた物質に関し、さらにまた、放射線免疫試験(RIA)や
酵素結合免疫性収着剤試験(ELiSA)のごとき標識を使用する試験方法にお
ける該標識付物質の使用に関する。
さらにまた本発明は、インフルエンザウィルスの存在を検知する方法、または鳥
類または哺乳類特に人類の・インフルエンザ感染状態を診断する方法において、
前記の合成ポリペプチドを使用することを特徴とする方法にち関する。該方法の
−B欅によれば、愚者や実験動物から採取された試料と、本発明のペプチド、そ
の塩またはその結合体(好ましくは、標識付の該’!!71質とを、免疫反応条
件下に接触させる操作が行われる。該愚者がインフルエンザに感染した患者であ
る場合には、患者から採取したt!:籾はまたインフルエンザウィルスに対する
抗体をも含有するであろう0本発明のペプチド(またはその塩または配合体)は
広範囲にわたる種々の種類の前記抗体と、免疫学的反応を行うであろう、この免
疫学的反応が起ったか否かの判定は、ELISA法、E’FIIT法、放射線標
識や蛍光標識等を使用する方法のごとき常用判定法によって行うことができる。
本発明方法の第二番目の代表的な態様によれば、前記ペプチド、その塩または配
合体(好ましくは、標識を付けた該物質)を、若干量の抗体を添加した試料中の
抗原と競合させる操作を行い、競合せる抗体およびペプチドの相対的反応の結果
に基づいて試験結果を判定する。
さらにまた本発明は、前記の合成ペプチド、その塩またはその配合体に対する抗
体に関する。該抗体は、ポリペプチド(あるいは、薬学的に許容され得るその塩
、あるいは該ポリペプチドの配合体または薬学的に許容され得るその塩)を免疫
原として用いて、適当な宿主動物中で該抗体を発育させる操作を行うことによっ
て、充分に発育できる。該抗体は、ELISA法、EMIT法、放射線免疫試験
法(RIA)のごとき、抗体を使用する試験方法において診断用試験として使用
できる。この技術を用いて製造された純粋な合成ポリペプチド、その配合体また
は抗体は、E!、ISA法、EMIT法または他の種々の免疫学的試験法におい
で検定用試薬とし、て使用できる。
さらt二また本発明は、鳥類や@乳類特に人類にインフルエンザ免疫性を与える
方法において、このような処置を必要とする愚者に対と7、治療学的に有効量の
本発明の合成ポリペプチド(または薬学的に許容され得るその塩または配合体)
、もしくは該ペプチドから製造されたワクチン1種またはそれ以上各投与するこ
とを特徴とする方法に関する。前記薬剤は任意的に、薬学的に許容され得る助剤
、担体または希釈剤と混合して投与できる。
さらにまた本発明は、インフルエンザの治療法において、前記の合成ポリペプチ
ドまたはその配合体もしくは塩に対する抗体を使用することに関する。該治療法
において該抗体は、消極的免疫法(passive immunization
)における治療剤として役立つ。消極的免疫法は、宿主動物またはヒブリドーマ
細胞線(hybrido@a cell 1ines)から得られ、部分的に精
製された免疫血清をインフルエンザ患者に注射して、怒染原であるインフルエン
ザウィルスに結合させて中和することからなる技術である。
本発明はまた、インフルエンザウィルスのポリメラーゼの活性およびインフルエ
ンザウィルス中の[・ランスクリブターゼの活性を失わせるために、前記のペプ
チドまたは薬学的に許容され得るその塩を使用することにも関する。
発明の詳細な記述
用語の定義
本明細書および請求の範囲に記載された若干の用語の定義を述べる。
「アシル基」は、アルキル基を含むカルボニル基を意味し、たとえば式R−C(
−0)−の基を意味する。上式においてRは炭素原子数1−8個のアルキル基を
表わし、その例にはメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、ヘキシル、
オクチル等があげられる。本発明において一般に好ましいアシル基はアセチル基
である。アシル基は、ポリペプチドの末端アミノ基をブロフクするために用いら
れる。
「抗体」は、イムノグロブリンと称される一連のグリコジル化蛋白質を意味する
。これは、インフルエンザ抗原のごとき抗原類に特異的に結合し得る。
「抗原」は、抗体形成をなし得る蛋白質またはペプチド化合物を意味する。
「抗原決定因子」または「抗原法定位1」は、抗原の抗体認識の実際の場所を意
味する。この用語の同義後は「エピトープJである。
「担体」は抗原またはハブテンが結合または複合し得る高分子量物!(−1’G
に蛋白質)を意味する。この結合または複合によって抗体生成が促進される。も
し所望ならば、担体の構造の中に標識を取付けることができる。
「複合体J (conjugate)は、担体に化学的に結合した抗原またはハ
ブテンを意味する。複合体はまた、他の基も含有し得る。
rELIsA法」は酵素結合免疫性収着体試験法を意味する。随性は、固体相に
結合した抗体または抗原、および酵素−抗原複合体または酵素−抗体複合体を使
用して、試料中に存在する抗原または抗体を検知し1、かつその量を測定するこ
とからなる試験法である。 ELISA法の説明は、「ベーシック、アンド、ク
リニカル、イムノロジー」第4版[D、P、サイト編、ランデ、メディカルバブ
リケ〜ジョン、米国カリフォルニア州、ロスアルトス(1982年)〕の第22
章に記載されている。
rE?II丁法」は、酵素増殖免疫試験法であって、随性は、(1)酵素標識付
ハブテン、(2)該ハブテンに特異性を示す抗体、(3)前処理用試薬、(4)
緩衝剤を含む酵素基質、および(5)標準物質を使用して、試料中の未知物質の
量を測定することからなる。 Elf丁法の説明は、[エンザイム、イムノア゛
ンセイJ (E、T、マギオ編、CRCブレスit+c、、米国フロリダ州ポウ
カレートン(X980年)〕の特に第】41頁−第150頁、第234頁−第2
35頁、第242頁−第243頁等に記載されている。
「エピトープ」は、分子中の、抗体によって特異的に認識された部分を意味する
。これの同義語は決定因子である。
F蛍光免疫試験法」は、抗体を使用する試験法であって、随性では、測定すべき
種(specjes)を、抗体リガンド話体中で、蛍光性の種を標識として付L
3た物質に結合させ、あるいは該物質でrl換させ、あるいは該物質と競合させ
る操作を行う、この試験法の−・異体例では該錯体を分離し、蛍光性の種の存在
の有無を調べ、被測定種の量を測定する。別の具体例では、非錯体状態の蛍光性
の種の蛍光とは別の蛍光を出す錯体を使用する。
これによって、錯体を分離することなく錯体の形成が検知できる。蛍光免疫試験
法の説明は、′ア、レビュウ、オン、フルオロイムノアツセイ、アンド、イムノ
フルオロトメリック、アッセイ” 、D、S、スミス等<1981年) [’A
nn、Cl1n、Bioehem、 J、第18巻、第253頁−第274頁(
1981年)]に記載されている。
「ハブテン」は、より大きな分子と結合したときに抗体を形成し得る一般に低置
−7tの化合物を意味する。
1インフルエンザ」は、2インフルエンザウイルス感染によ、って起る病気を意
味する。インフルエンザウィルスの例にはA型およびB型ウィルスがあげられる
。これらのA型およびB型ウィルスは当該技術分野で認識されている。これらの
うちの若干種は既に同定されており、「アメリカン、タイプ、カルチャー、コレ
クション」に現存し、そこから入手できる1代表的なものは「アメリカン、タイ
プ、カルチャー、コレクシヨン、カタログ、オン、ストレインズ、■」、第4版
(1983年) [R,ヘイ等号、アメリカン、タイプ、カルチャー、コレクシ
ラン、米匡メリー・ランド州ロックビル]等272頁−第276頁に記載されて
いる。
「標識」、「ラベル」は、分子中の検知可能基を意味する。
通知の標識のうちで、放射性標識は放射性免疫KX、験において有用であり、蛍
光性標識は蛍光免疫試験において有用であり、酵素型標識はELISA法、Er
1IT法等において有用である。
「リガンド」は、抗体結合部位を有し、かつ、レセプタに結合し得る分子を意味
する。
「低級アルキル基」は、炭素原子を1−4個有する直鎖状または分枝状の鎖式飽
和担炭化素基を意味し、その例にはメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピ
ル、n−ブチル、イソブチル、第2ブチルおよび第3ブチル基があげられる。
「マトリックス蛋白質」すなわち「M蛋白質」は、インフルエンザウィルスおよ
びそれに関連したウィルスの蛋白質系構成成分を意味する。その詳細は本明細書
中の“発明の背景”欄に記載されている。
「ベブチV4、「ポリペプチドjは、加水分解よって2個またはそれ以上のアミ
ノ酸を生成し得る比較的低分子量の化合物を意味する。
「薬学的に許容され得る塩」や「塩」は、母体であるポリペプチドの所望抗原的
活性をそのまま保っている塩を意味する。
「薬学的に許容され得る塩」は特に、不所望の毒作用を有しないために経口また
は非経口的投与法によって投与するのに適した塩を意味する。前記の塩、および
薬学的に許容され得る塩の例には、(a)無機酸の使用によって作られた酸付加
塩(無機酸の例には塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸、硝酸等があげられる)、お
よび有機酸の使用によって作られた塩(有機酸の例には酢酸、シュウ酸、酒石酸
、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコ
ルビン酸、安息香酸、タンニン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタリン
スルホン酸等があげられる)、ならびにΦ)−価または多価金属カチオンによっ
て生成された塩(該金属の例にはナトリウム、カリウム、亜鉛、カルシウム、バ
リウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム等
があげられる)、または、N、 N’−ジベンジルエチレンジアミンまたはエチ
レンジアミンから生じた有機カチオンによって生成された塩、ならびに(C)前
記の(a)および伽)の組合わせに相当する塩(たとえばタンニン酸亜鉛塩等)
があげられる。
「放射免疫試験法」すなわちrRIA Jは抗体を基剤とする試験法である。こ
の試験法では、被測定種を、抗体−リガント錯体中の放射性標識付物質と結合さ
せ、あるいは後者の物質で置換し、あるいは結合を競合させる操作を行う、錯体
を分離し、放射性の有無を調べることによって、被測定種の量を測定できる。
「レセプタjは、抗原と特異的に結合する能力を有する抗体中の区域を意味する
。
「実質的に相当(または対応)する」は、2つのアミノ酸シークエンスが互いに
同じであるか、または、2個以下のアミノ酸ユニットが異なっているにすぎない
ことを意味する。或場所のアミノ酸が異なるか、または余分のアミノ酸が結合し
ているか、またはアミノ酸が存在しないときに、シーフェンスは異なっていると
みなすことができる。好ましくは、これらのシーフェンスはせいぜい1個所だけ
で異なっており、一層好ましくは、これらのシーフェンスは互いに同一である。
「ワクチン」は、減毒または死滅した微生物(特にインフルエンザウィルス)も
しくは合成ポリペプチドまたは複合体の懸濁液または溶液である。これは、イン
フルエンザウィルスに対する特異的抗体の生成を促進させることによつてインフ
ルエンザを予防し、または軽減させ、もしくは治療するために投与されるもので
ある。
本明細書では、アミノ酸を次の略号で表わす。
アラニン Ala
アルギニン Arg
アスパラギン Asva
アスパラギン酸 Asp
システィン (ys
グルタミン Gln
グルタミン酸 Glu
グリシン Gry
ヒスチジン His
フェニルアラニン Phe
トリプトファン Typ
前記の略号はL−アミノ酸を表す、ただしグリシンはアキラル(achiral
)アミノ酸である0本明細書では、すべてのペプチドのシーフェンスを一般慣用
法に従って記載し、N−末端(すなわちアミノ末端)アミノ酸を左側に記載し、
C−末端(すなわちカルボキシル末端)アミノ酸を右側に記載した。
好ましい態様の記述
本発明は、インフルエンザ抗原の性質を有する合成ペプチドのシーフェンスに関
する。
この合成体のシーフェンスは、A型インフルエンザウイルスのマトリックス蛋白
質の2]、5−239区域の15−25のアミノ酸のシーフェンスに実質的に対
応する約5−25 (特に15−25)のアミノ酸を有し、好ましくは、前記マ
トリックス蛋白質の215−236区域の15−22のアミノ酸のシーフェンス
に実質的に対応する15−22のアミノ酸を有する。前記マトリックス蛋白質の
215.、.239区域は次のシーフェンスを有する。
Me t−A Ia−Arg−Thr−T le−G Iy−Thr−t(1s
−Pro−Ser 5er−5er−A Ia −G Iy−Leu−Lys−
Asn−Asp−Leu−Leu−G Iu−Asn−Leu−Gl n−A
Ia好ましい態様では、前記合成体のシーフェンスの長さは15−20のアミノ
酸に相当し、231 区域を含む、一層好ましくは、その長さは17−18のア
ミノ酸に相当し、そして220−236区域に実質的に相当する。特に好ましい
態様として、次のアミノ酸シークエンスがあげられる。
H−Gly−Thr−H1s−Pro−5er−5er−5er−Ala−Gl
y−Leu−Lys−Asn−Asp−Leu−Leu−Glu−Asn−OH
これらの合成ポリペプチドの製法は、後記の“一般的製造技術”の欄に記載され
ている。
本発明はまた、これらのポリペプチドの塩、特に、薬学的に許容され得る塩にも
関する。この場合のポリペプチドの例には、アミノ末端型アミノ酸がアシル基(
特にアセチル基)の使用によってフ゛ロックされており、および/または、カル
ボキシル基末端型アミノ酸がアミド基に変換されているポリペプチドがあげられ
る0代表的な塩およびブロック化物質の製法は、後記の「一般的製造技術」の欄
に記載されている。
本発明の一態欅によれば、ポリペプチドを高分子型担体と複合させる操作が行わ
れる。適当な担体は、大形でありかつ代謝の遅い高分子型担体であって、その例
には蛋白質、多糖類(たトエハラテックス官能化セファロース、アガロース、セ
ルロ〜スヒード等)、アミノ酸重合体(たとえばボ1!グルタミン酸、ポリリジ
ン等)およびアミノ酸の共重合体があげられる。特りこ有用な蛋白質系基質は血
清アルブミン、チオガイ(Keyhole li@pet)のヘモシアニン、イ
ムノグロブリン分子、チログロブリン、オバルブミン、および当業界で周知の種
々の蛋白質である。
前記の蛍白質系担体はそれらの本来の形で使用でき、あるいは、その官能基金1
をLys残基のサクシニル化によって、あるいはCys−チオールラクトンとの
反応によって変えることもできる。また、アミノ官能基と2−・イミノチオラン
との反応または3−(4−ジチオピリジル)プロプリオネートのN−ヒドロキシ
サクシンイミドエステスとの反応によって、担体(または合成ポリペプチド)中
にスルフヒドリル基が導入できる。適当な担体には、合成ペプチドの結合のため
に、スペーサアーム(たとえばヘキサメチレンジアミンまたはそれと類領の寸法
の種々の二官能性分子)を導入する目的で変性操作を行うことも可能である。こ
れらの複合体はポリペプチド自体の場合と同様に、その片方または両方の末端ア
ミノ酸を、所望に応じてアシル基またはアミド基に変換できる。このような複合
体の製法は後で述べる。
本発明のペプチドおよび特にその複合体は、インフルエンザ抗原の性質を有する
。したがってこれらは、その性質を利用する試験法に使用できる。
このペプチドおよびその複合体はインフルエンザ抗原の性質を有するから、これ
は治療のためにも使用できる。たとえば、このペプチドまたは複合体はインフル
エンザに特異的な抗体の生成のために使用できる。この方法では、宿主動物にペ
プチドまたは複合体を投与して抗体を生成させ、これを其後に集める。
この方法は後記の「一般的製造技術」の欄に記載されている。
別の態様によれば、前記のペプチドまたは薬学的に許容され得るその塩が、トラ
ンスクリブターゼ活性の抑制のために使用できる。
一般的製造技術
ポリペプチドシー・フェンスの化学合成前記ポリペプチドは、ペプチドの技術分
野で公知の技術によって合成できる。このような公知技術は、たとえばメイエン
ホーファ、J、の論文(rJ、Hormonal Proteins and
Peptides」、第2巻、第46頁、アカデミツク、プレス5.−ニーヨー
ク (1973年)〕(固体相ペプチド合成)、およびシュローダ、E1等編「
ザ、ペプチドj第1巻(アカデミツク、プレス、1965年)(古典的な溶液相
合成)に記載されている。
これらの方法では、生長中のペプチド鎖にアミノ酸または適切に保護されたアミ
ノ酸が逐次的に付加される。一般に、第1アミノ酸のアミノ基またはカルボキシ
ル基が適当な保ffl!で保護される。保護されたアミノ酸またl!誘導体の形
のアミノ酸と、シーフェンス中の次位のアミ、ノ酸〔好ましくは保護された相補
的な蟇(アミノ基またはカルボキシル基を有するアミノ酸)とを、アミド結合を
生成させるのに適した条件下に反応させる。
新たに付加された前記アミノ酸から保護基を除去し、次いで其次のアミノ酸を付
加させる操作を行う。すべての所望アミノ酸が適切な順序で結合した後に、残存
保護基(および固体の担体)を逐次的または同時に除去し、最終ポリペプチド生
成物を得る。
また、よく知られているように、2以上のアミノ酸を同時に、生長中の連鎖に付
加させることも可能である。
本発明の化合物の好適な製造方法は、固体相ペプチド合成操作を包含する。この
方法の場合には、アミノ酸のα−アミ、ノ官能基を5、酸または塩基に敏感な基
で保護する。適当な保護基はt−ブチルオキシカルボニルi (BOC)、フル
オレニルメチルオキシカルボニル基(FMCC)、ベンジルオキシカルボニル基
(Z)等である。
側鎖の活性部位もまた保護して、不所望の反応または結合が起るのを防止する。
アルギニンのために特に適当な側鎖保護基はニトロLp−トルエンスルホニル基
、4−メトキシベンゼンスルホニル基、Z、 BOC、アダマンチルオキシカル
ボニル基であり、リジンのために好ましい該保[はジクロロベンジルオキシカル
ボニル基、t−BOCであり、AspおよびGluのために好ましい該保護基は
0−ベンジル基、t−ベンジル基であり、チロシンのために好ましい該保護基は
ベンジル基、0−ブロモベンジルオキシカルボニルL 2,6−ジクロロベンジ
ル基、イソプロピル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、アセチル基であ
り、セリンおよびスレオニンのために好ましい該保護基はベンジル基、t−ブチ
ル基、テトラヒドロピラニル基であり、ヒスチジンのために好ましい該保護基は
ベンジル基、p−トルエンスルホニルL 2.4−ジニトロフェニル基であり、
Trpのために好ましい該保護基はホルミル基である。
カルボキシル末端型アミノ酸を適当な固体担体(support)に付加させる
0反応体に不活性であり、反応体の反応条件下に不活性であり、かつ、使用され
る媒質に不溶性である担体が適当である。適当な固体担体の例にはクロロメチル
ポリスチレン−ビジニルベンゼン重合体等があげられる。クロロメチル米:、1
スチレンと1%のジビニルベンゼン重合体からなるものが特に適当である。ペプ
チド中のカルボキシル末端型アミノ酸がアミド(−C−C=O) −NHz )
に変換されるような特別な場合においては、特に有用な担体はベンズヒドリルア
ミノ−ポリスチレン−ジビニルベンセン重合体であって、これはビバイル、P4
等の論文(1,971年) (’He1v、Chis、Acta、1 、第54
巻、第2772頁〕に記載されている。クロロメチルポリスチレン−ジビニルベ
ンゼン型樹脂への付加は、次の方法によって実施できる。すなわち、α−N−保
護アミノ酸、特にBOC−アミノ酸をそのセシウム塩、テトラメチルアンモニウ
ム塩、4,5−ジアザビシクロ(5,4,0)ウンデク−5−エン塩またはその
類似塩の形で、エタノール、アセトニトリル、N、N−ジメチルホルムアミド(
DMF)等の中に入れ(特に好ましくは該セシウム塩をDMF中二中入二人、高
温(たとえば約40−60°C1好ましくは約50℃)において前記クロロメチ
ル樹脂と約12−48時間(好ましくは約24時間)反応させるのである。α−
N−BOC−アミノ酸はベンズヒドリルアミン樹脂に、N、N“−ジシクロへキ
シルカルボジイミド(DCC)/1−ヒドロキシベンゾトリアゾール()IBT
)を仲介物とするカップリング反応によって付加できる。該反応はジクロロメタ
ンまたはDMFのごとき溶媒(好ましくはジクロロメタン)中で温度約10−5
0°C(好ましくは25°C)において約2−24時間(好ましくは約12時間
)実施できる。
α−N−保W?Iiの除去は、たとえば、I・リフルオロ酢酸の塩化メチレン中
溶液または他の強酸の溶液〔好ましくは、トリフルオロ酢酸の50%溶液(溶媒
はジクロロメタン)〕の存在下に大体室温程度の温度(−二おいて実施できる。
塩基ζ入子安定な保護基は、塩基(たとえばピペリジンのDMF中溶液)を用い
る処理によって除去できる。好ましくは、各々の保護アミノ基は約2.5モル過
剰に使用して導入操作を行い、カップリング反応はジクロロメタンまたはその類
憤物(特に塩化メチレン)中で大体室温程度の温度において実施できる。一般に
カップリング剤はDCCのジクロロメタン中溶液であるが、N、N=ンイソプロ
ピルカルボジイミドまたは他のカルボジイミドも使用でき、しかしてこれらは単
独で使用でき、あるいはHBT 、 N−ヒドロキシサクシンイミド、他のN〜
ヒドロキシイミドまたはオキシムの存在下に使用できる。あるいは、保護された
アミノ酸活性エステル(た(!: えばp−ニトロフェニル、ペンタフルオロフ
ェニル等)または対称無水物が使用できる。
固体和合成の終了後に、ポリペプチドに別の保護基脱離(deprotecti
on)および中和サイクル操作を行い、次いでアシル化(好ましくは、無水酢酸
を用いるアセチル化)を行い、N−アセチル(N−Ac)ブロック化アミノ末端
基を生成させることができる。あるいは、これは該樹脂から直接に除去できる。
カルボキシル末端基(−C(−0)−OH)をアミドとしてブロックすべき場合
には、ペプチドはベンズヒドリアミノ−ポリスチレン樹脂上で合成でき、この場
合にはアミド基が直接に生成する。あるいはペプチドは該樹脂からアミツリシス
によって除去できる。該アミツリシスは、たとえばアンモニア/メタノールまた
はアンモニア/エタノールを用いて約O〜50°C(好ましくは約25℃)の温
度において約12−48時間(好ましくは約18時間)実施できる0M離テアミ
ノ末端基よびカルボキシル末端基を有するペプチドが所望される場合には、ペプ
チドは、アニソールのごときラジカルスカベンジャー(radical 5ca
veBer)の存在下に無水の液状弗化水素で処理することによって前記樹脂か
ら直接に除去できる。前記樹脂上に存在するかまたはアミツリジスによって該樹
脂から除去されたアミノ−あまはカルボキシル−ブロック化(すなわちこれらの
基が保護されている)ペプチドは、同様に、無水の液状弗化水素を用いる処理に
よって保護基を除去できる。α−N−官能基の保護が塩基に不安定な保pi5を
用いて行われており、かつそれと共に、t−ブチル基準の側鎖の保護が行われて
いる場合には、最終的な樹脂除去を保護基除去工程は、トリフルオロ酢酸を用い
て実施できる。
保護基(側鎖保護基を包含する)をポリペプチドから除去するための別の手段は
、弗化水素/ピリジン錯体を用いる処理、あるいは、トリス(トリフルオロアセ
チル)硼素およびトリフルオロ酢酸を用いる処理、炭素またはポリビニルピロリ
ドン上のパラジウムおよび水素による還元、または、液体アンモニア中のナトリ
ウムを用いるかまたは液状部体水素とアニソールとを用いる還元であって、これ
は−10°Cないし+10”C(好ましくは約O″C)において約15分−1時
間(好ましくは約30分間)実施できる。後者の処理(11F /’アニソール
)は、前記樹脂からの除去および保護基の除去を同時に行って退離C0ZH末@
基を生成させるために(通常のベンジルエステル結合が形成されていた場合)、
あるいはCo−NHz(アミド)末端基を生成させるために(ベンズヒドリルア
ミノ結合が形成されでいた場合)利用できる。ベンズヒドリルアミン樹脂上のア
ミド末端型ペプチドの場合には、樹脂の除去および保護基除去の諸工程は組合せ
て一段階で実施でき、しかしてこの場合には前記の液状1(F/アニソールを用
いて処理を行うのである。充分に保護されたポリペプチドは、其後にクロマトグ
ラフィ工程において精製できる。
塩の製造
前記ペプチドの最終回収工程で使用される媒質のPHを、所望カウンタイオンに
対応する酸または塩基で調節するという簡単な操作によって、該ペプチドは塩の
形で得られる。
担体との複合
前記ポリペプチドは、該ポリペプチド中の種々の種類の官能基を介して担体に結
合できる。数基の例には、(a)α−またはε−アミノ基、(′b)α−5β−
またはT−カルボキシル基、(C)チオール基、および(■該ペプチド中の芳香
環があげられる。
α−およびε−アミノ基は種々の方法によってカンプリングできる。たとえば、
これは担体中に存在する活性化カルボキシル基と反応し得る。該活性化は、カル
ボジイミド特に水溶性カルボジイミド(WSC) [たとえばN−エチル−N’
−(3−ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミド)〕、イソオキサゾリウム塩
、1−エトキシカルボニル−2−工l・キシ−1,2−ジヒドロキノリン、活性
エステル生成剤(N−ヒドロキシサクシンイミドエステル、1−ヒドロキシベン
ゾトリアゾールエステル、ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエ
ステル等を生成するもの)、酸塩化物生成側(たとえばPCI s、ただしこね
は非蛋白質系担体だけのためのものである)、混合無水物生成剤(たとえば無水
酢酸)等を用いて実施できる。
はりジンのε−アミノ官能基)を其後に担体中の活性化力!シボキシル官能基に
、水性緩衝液中で、または有機7′水性混合緩衝液(たとえばDMF /水、p
H8)の中で反応させる。非蛋白質系担体の場合には有機溶媒(たとえばI)M
F)が使用できる。この種の技術のうらで特に有用な技術は、水性緩衝液中で蛋
白質系坦体の活性体とペプチドとのカンブリングを同時に行い、あるいは、サク
シニル化蛋白質系担体のp NO2−フェニルエステルを生成させ、次い°ご水
性緩衝液中でペプチドとカンブリングさせることである。
別の“ち法によれば、合成ペプチドのアミノ官能基が担体分子のアミノ官能基に
よって架橋できる。該架橋結合は、グルタルアルデヒドの水溶液または有機/水
混合溶媒中溶液(pH約7)との反応を室温において行うことLこよって形成で
き、あるいは、二官能性架橋側(たとえばジメチルスベルイミF−t・、フェニ
ルジイソシアネート、フェニルジ・イソチオシアネート、ジンルオロジニトロベ
ンゼンまたはシアン酸クロライド)との反応によって形成できる6
前記ペプチドのα−1β−またはT−カルボキシル基は、前記方法の逆の方法に
よって担体上のアミンと反応させることができる0合成ペプチドのカルボキシル
官能基は上述の技術によつて活性化できるであろう#活性化されたカルボキシル
官能基を其後に、適当な担体りのアミノ官能基に、前記の緩衝液(水溶液または
有機/水混合溶媒中溶液)を前記条件下に使用することによって反応させること
ができる。
合成ポリペプチド鎖に存在するチオール基(−3l+)は、マレインイミド官能
基の導入によって変性された担体と反応させることができる。該SR−官能基は
前記マレインイミド官能基の二重結合基に特異的に結合し、ベグチドー担体話泳
が生じる。前記SH−官能本は該ペプチドに、アミノ官能基(α−アミノ蟇、ま
たはリジ゛)′の6−アミノ基)とシスティンチオ・−ルアセトンとの反応によ
って結合させることができる。
<ブ千ドのTyrおよび旧Sユニ・ノド中に存在する芳香環は、蛋白質系担体の
TyrおよびHisユニットの芳香環に、ビス−ジアゾ化芳香族化合物(たとえ
ばビスージアゾ体ベンジジンまたはビス−ジアゾ化−0−アニシジド)の使用に
よって架橋できる。この反応は、前記の抗原および担体の水溶液または有機/水
混合溶媒中溶液中で実施できる。このような技術の参考文献トL7で、B、G、
1ルランガーの論文、“ヂ、プレバレーシラン、オン、アンチジェニック、ハプ
テン−キャリヤ、コンジュゲーツ・・・ア、サーベイ”、(’Methods
of En;!ymology J 、第70巻、第85頁(i980年)〕が
あげられる。
標標識付ペプチド料の調製
放射性標識付ポリペプチドは種六の方法によって調製できる。
たとえば、ポリペプチドの合成のとき二重、商業的に入手可能な炭素(l′C)
標識付アミノ酸が使用できる。同様に1H−アミノ酸はシュワイザ等の酸化マグ
ネシウム法(rHelv、Cl1n、Acta」第42頁、第2622頁(19
59年)〕によって製造できる。放射性化学物質に関する日常的な注意事項を除
いて、前記の方法は通常の合成法と同様に実施できる。あるいは、最終性成物で
あるポリペプチドまたは複合体に放射性標識を、トリチウム交換によって取付け
ることも可能である。
酵素系標識は、複合体を生成させるための酵素系担体を使用することによって取
付けることができ、あるいは、担体またはペプチドに、酵素学的活性基を結合さ
せることによって取付けることができる。
合成ペプチドにおける抗体の生成
宿主動物を用いて抗原に対する抗体を生成させる方法は、一般に当業界で公知で
ある1代表的な生成方法によれば、宿主である哺乳類または鳥類に、合成ポリベ
ブチドシークエンスが導入される。適当な宿主動物の例には猿、牛、うさぎ、ラ
ット、マウス当があげられる。前記方法では一般に、完全なフロイント補助液で
乳化された塩水中溶液の形で皮下に注射する操作が行われる。
約1箇月後に前記動物から採血し、抗体を集める。全血を25°Cにおいて数時
間放1して凝固させる。硫酸ア〉′モニウi、の水溶液を添加して濃度40重量
%の水溶液試料を作る。IgG画分は沈澱する。沈澱を遠心分離操作によって集
め、これを塩水溶液または緩衝液中に再び懸濁させ、所望濃度の懸濁液を作る。
精製された抗体画分は、診断用試験に使用するためにさらに変改できる。 EL
ISA試験に使用する場合には、該変改は、リボチーム、ラクトパーオキシダー
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ当の酵素と結合させることを包含するものであり
得る。抗体は蛍光性の物質または基で変改できる。好ましくは、この蛍光は抗体
と抗原との結合の隙に弱まるかまたは増大するようにする。
抗体−抗原結合(interaction)の程度を調べる試験方法は当業界で
周知である。しかしながら、必須第一工程適当な免疫原性(imst+noge
nic)合成インフルエンザポリペプチドを髭遺し、動物に投与して、多量の高
親和性抗体を得ることである。
トランスクリブターゼの試験(および抑制)既述のカトウ等の論文には、ApG
−プライムド(priIIed)RNAポリメラーゼの試験方法および試験条件
が記載されているが、トランスクリブターゼの試験もそれと同様な条件下に実施
できる。精製したM蛋白質を、濃度を種々変えて、かつ分散液の状態を種々変え
て添加し、抑制率が最大となる最良条件を決定する。所定の抗原の位置にモノク
ロナル抗体を使用して抑制状態を元に戻すことは、抑制に関係するM蛋白質のセ
グメントの位1を知るための有用な手段でをる。この試験を合成ペプチドに対し
て行うことによって、それのトランスクリブターゼ抑制活性を知ることができる
。
有用性および投与法
本発明を医学的および獣医学的分野において利用する方法について述べる。有効
量の本発明のポリペプチドまたは複合体または抗体、もしくはそれらを含有する
薬用組成物を、治療の必要に応じて患者に投与する。前記のポリペプチド、複合
体、抗体または組成物は、各々の場合に特有な最終用途に応じで、種々の投与方
法のいj″れかによって投与でき、たとえば非経口的に(たとえば皮下、筋肉内
または静脈内に)投与できる。また、経口投与も行い得るが、この場合には、安
定の形の前記物質を投与するのが特に好ましい、個々の場合における量適の投与
方法は、その使用目的、活性成分、患者等に応じて種々異なり、医師や獣医師等
の医療担当者の判断によって決定できるであろう。
前記の薬剤は人、猿、犬、けっし類のごとき哺乳動物、およびそれ以外の動物(
たとえば七面鳥、にわとり、あひる等の家きん類のごときA類)に投与できる。
このような用途に使用される組成物は一般に、注射用食塩水、鉱油等の薬用希釈
剤を含有する。経口投与の場合には、錠剤(腸溶性被覆錠剤を包含する)か使用
できる。獣医学的分野で使用する場合には、処理飼料を用いて経口投与を行い得
る。前記化合物および組成物はまた、当業界で周知の徐放性製剤、デボット製剤
、移植用製剤等の形で投与できる。前記のポリペプチド、ポリペプチド複合体お
よび抗体の投与量は一般に1=1000ミクログラム/kg(体重)、好ましく
は5−600 ミクログラJ−/kg(体重)である。
自動免疫の場合には、治療上の必要に応じて前記のポリペプチドまたはポリペプ
チド複合体を投与して愚者の体内にインフルエンザ抗体を生成させる。受動免疫
の場合には、宿主動物から得られた抗体含有血清を部分的に精製し、この精製血
清を患者4こ投与して治療学的効果を発揮させる。
M蛋白質はインフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を抑制し、さらにまた、
インフルエンザウィルス中でトランスクリブターゼの活性も抑制する作用を存す
ることが見出された。このことから、M蛋白質はウィルスのレブリケーシランを
調節または抑制し得るものであることがうかがえる〔イエ−2Z1等(1987
年)、rJ、ν1ro1. 」第61巻、第239頁−第246頁;ズポナルジ
ェブ、A、Y、等(1980年)、「J、ν1ro1. J 、第33巻、第5
83頁−第586頁〕、また、M蛋白質上の特別な部位に導かれるモノクロナル
抗体は、M蛋白質の前記活性を低下またはなくすることができるものであること
にも注目されたい2本発明の合成ペプチドは前記のごとき特別な部位に相当し、
そして複合体として、載接のモノクロナル抗体に対し非常に高い力価をあらほす
。前記の説明から明らかなように〜前記ペプチドおよびその複合体ばM蛋白質の
場合と同様な方法によってうイルスのレブリゲーシランを抑制し、すなわち、抗
ウイルス成分として作用すると思われる。
本発明のポリペプチド、2ポリペプチド複合体、および前記ポリペプチドおよび
ポリペプチド複合体に対応する抗体はまた、インフルエンザの検知および診断の
ために有利に使用でき、特に、ELTSA法や叶H法のごとき試験法におけるキ
ヤリプレーシ=!二/溶液のために有用な高純度物質を折伏し得るという利点を
有する。
診断用試薬、標準物質またはキットに使用される酵素は、複合体形成の難易、タ
ーンオーバ率、および検知すべき未知物質〔すなわちアナライ) (analy
te) ]を生理学的流体に応じて種々変わるであろう0選ばれる酵素の例には
、米国特許第3.817,837号明細書に記載のヒドロリスアーゼ、ヌクレア
ーゼ、アミダーゼ、エステラーゼ等があげられる。
診断用試薬、標準物質またはキットに使用される前記抗体に標識を付ける方法お
よび装置の説明は3.たとえば米国特許第4.366.241号明細書に記載さ
れている。
実施例
本発明を具体的に例示するために、次に実施例を示す、しかしながら、本発明の
範囲は決して実施例記載の範囲内のみに限定されるものではないことが理解され
るべきである。
例1
次式のペプチドの製造
H−Gly−Thr−旧5−Pro−5er−5er−5er−Ala−G]、
y−Leu−Lys−Asn−Asp−Leu−Leu・Glu−Asn−OH
このペプチドは、固体相技術を用いて、ベックマン990C型ペプチド合成装置
において、商業的に入手し得るt−Bocアミノ酸ボリスコL/ン樹脂およびt
−BoC保謬アミノ酸を使用して合成した。後者の酸の側鎖保護基は、Aspお
よびGluのためのO−ベンジルエステル基、ThrおよびSetのためのO−
ベン′ジlレエーテル基、旧Sのためのdnp 、および、Lysのためのオル
トクロロベンジルオキシカルボニル基であった。すべてのカップリング反応は、
樹脂上のアミノ酸のミリ当量値を基準として、3倍モル過剰量のt−Bocアミ
ノ酸およびジシクロヘキシルカルボジイミド
ベンゾI・リアゾール()IOBT)を使用した.すべてのカップリング反応は
、ニンヒドリン試験〔カイザー等’Ana1.Bioehes. J第34巻、
第595頁(1970年)〕によって監視した, BOC保護基の除去のために
、40%TFA/CHzC1gを使用した.メチオン力く存在する場合には、前
記TFA/C)IzCHzに2−メルカプトエタノ−)L−(0.1%)を添加
した(メチオニ〉・は、保護されて6′1なし1人ノトフヒドリル側鎖を有する
ものを使用した)、この合成操イ乍の詳細をス与ジュールILこ示す。
スカニLと二」−一1
樹脂上におけるペプチド合成操作
合成操作の終了後に、低−高肝法(り上等(1982年)、’Tett.Let
t. 」第23巻第2939頁、およびr J.Am.Che+w.Soe.
」等105頁、第6442頁(1983年)およびSN”保護基除去反応を行っ
てペプチドを樹脂から除去した.前記反応はHF−反応装置■型(ペニンシュラ
ラボ社)において行−、た、当該ペプチド樹脂を最初にHF/ジメチルサルファ
イド/p−クレゾール混合物(25: 65 : 10)で、4°Cにおいて1
時間処理した。IFおよびジメチルサルファイドを完全に蒸発させた.次いで、
追加量のHFを反応器に入れ、肝ipークレゾールの比率を9:1にした.反応
混合物を4°Cにおいて45分間攪拌した.真後にOFを完全に蒸発さゼ、しか
して該操作は真空下に、最初は4°Cにおいて、次いで室温において行った。低
HF濃度の場合には、AspおよびGiuの側鎖のペン・ゾルエステル基が離脱
し9、このとき、副反応であるアシル化反応は最小限に抑制される。高IF濃度
の段階では、Arg (Tos)のごとき酸性下に比較的安定な基が除去され、
そしてペプチドは完全に前記樹脂から離脱1−だ、 IPを用いる離脱操作の前
に、旧5ODNP基は、1000倍過剰量の2−メルカプトエタノールを用いる
処理によって除去された1、前記ペプチドを種々の副生成物から分離するために
、エーテルを用いて抽出操作を行った0次いで5%酢酸(またげ一層高濃度の酢
酸;該濃度はペプチドの溶解度に応じて適宜変えることができる)を用いて抽出
操作を行い、真後に、凍結乾燥操作を行った。これによって、ペプチドは該樹脂
から単離された。
得られた粗製ペプチドに、セファデックスLH−20を用いてゲル11過を行っ
た。最終精製操作として、HPLc操作を、充填剤(Vydac+15−20
ミクロンC11)を入れた寸法50cm/20m1のコラム(preparat
iVe column)を用いて行った。ペプチドの純度は、分析用11PLc
およびアミノ酸分析によって調べた。
水からの凍結乾燥を3回行、た後に18次式の構造を有する純粋なペプチドが酢
酸塩として得られた。
H−Gly−丁br−His−Pro−5er 5er−3er−Ala−Gl
y−1,eu−Lys−Asn−Asp−Leu−Leu−Glu−Asn−O
H上記の“220−236°シークエンスOポリペプチドを、以下では「ペプチ
ド1」と称する。
例2
次式の放射性樹脂付ペプチドの製造
H−G 1y−Thr−H4s−Pro−3er−5er−3er−A 1a−
G ly−Leu−1yq−Asn−Asp−Leu−Leu−Glu−Asn
−OHHI3操作を、放射性標識付Boe−アミノ酸を使用して繰返した。該ア
ミノ酸は、シェフ1′ザー等の方法[rHelv、chim。
Aeta」(1959年)、第42巻、第2622頁〕に従って調整した。これ
によって、放射性標識付の所望生成部が得られた。
例3
複合体の製造
例1および例2の方法で作られたペプチドを、担体型蛋白質と複合させた。咳担
体牛の血清アルブミンおよび千ログロブリンを使用した。複合操作は既述の一般
的方法に従い、かつ1、アクツシ等の論文〔rBioehes、Biophys
、Aeta」、第670巻、第300頁−第302頁(1981年))に記載の
特別な技術を用いて行った。
活性試験
例1の生成物、および該生成物とBSAおよびチログロブリンとからなる錯体の
活性を試験した。
第1番目の試験では、自然のままのM蛋白質に対応する一連のモノクロナル抗体
を集め、合成ペプチドやその錯体との反応性について調べた。精製された10−
25ミクログラムのMl白質をフロイントの完全補助液中に入れ、これでマウス
(Balb/c+eice)を免疫化した0M蛋白質を次の方法で精製した。す
なわちSDSゲルクロマトグラフィ操作を行い、次いで、エクスホースチブ透析
(exhaustive dialysis)を、古くなった豚のインフルエン
ザワクチン(X−53a組替えウィルス株; A/PR/8/34i’l蛋白質
を含有する;バエズ等、r Virology 」第107巻第548頁−第5
51頁〕およびf留水を用いて行った。マウスに、6週間後ないし3箇月後にM
蛋白質をさらに10−25ミクログラム投与して(静脈内投与)ブースト(bo
ost) L、ブーストの3日後に牌臓を除去し、ポリエチレングリコールを用
いて該牌臓の細胞をSP210−Ag14非分泌型骨髄腫細胞(ATCCCRL
1581)と混合し、た、該骨髄種細胞はログフェーズ(log phase
)で生長中のものであった。
ヒブリドーマをHAT媒質中で選択し、ELISA法によって、M蛋白質で酸層
されたマイクロタイタブレート上で放射能によるスクリーニングを行った0反応
性ヒブリドーマのクローニングを、T−細胞フィーダーレイヤーを要する0、
5および101i!胞/′ウエルで行った。ファンワイク等の論文(、rJ、ν
1ro1.」、$48巻、第24L252頁(1984年)〕に記載され、そし
て289/4および904/6として同定された追加のヒブリドーマラインが、
その発見者によって捷供されたが、これにクローニングを行つて289/4−0
5および904/6−D−5を生成させた。これらの種々のヒブリドーマによっ
て作られたモノクロナル抗体を集めた。
集められたモノクロナル抗体に第一番目の試験を行って、A型インフルエンザウ
ィルスの精製株14種に対する作用を調べた。この試験は、カーノ等の論文〔r
J、 Cl1n、 Mjerobioloqy J、第16巻、第813頁−第
820頁(1982年)〕に記載の一般式ELISA試験法に従。て行った。こ
の試験では、マイクロタイタープレートを精製ウィルスで被覆した(100ng
/ウニル)、0.5%BSA (PBS−ツウイーン中)で後被覆を施し、次い
でアサイド流体(ascites fluicls)を3倍希釈度まで順次希釈
し、に100の初期希釈度から初めて、前記プレートを横切るようにじた。
羊のrアンチマウス−アルカリ性ホスファターゼ複合体(シグマ)」を添加し、
結合モノクロナル抗体をカンチテー ト(quantitate) シた。バラ
−ニトロフェニルホスフェートを基質として使用した。終点滴定では、バックグ
ラウンドの3倍多い吸収値を示す希釈度として測定された。これらの試験の結果
を表1に示す。該試験によって、前記のモノクロナル抗体パネルは広範囲にわた
るインフルエンザ株において広い認識を示すことが明らかになった。
例1−3で得られた3種の物質に試験を行い、モノクロナル抗体のパネルに対す
る活性を調べた。その結果は、第2表に記載のごとく非常にすぐれている。この
ペプチドは、BSAまたはテログロブリンに複合され、EIJSA吸着体とし、
で使用されたときに、多くのモノクロナル抗体に関し、精製M蛋白質の1万倍ま
での高い力価を示す、前記のベプチ)゛および複合体の強力なモノクロナル抗体
認識作用と、特定の部位への特異的な結合作用と、収穫の部位はウィルスのレブ
リケーシランの阻止のための部位のなかに含まれるという知見とを総合して考慮
すれば明らかなように、本発明の前記物質は抗ウィルス剤として有用であると思
われる。
表m制と
インフルエンザウィルス
EIJSA力価(XIO−”)
*X−53a (A/PR/8/34M蛋白質遺伝子)。
零車ファンダイクおよびその共同研究者の論文(r J、Virol、 J第4
8巻、第1248頁(1984年)〕に記載のもの。
表m致と
インフルエンザウィルス
ELISA力価(XIO−”)
*X−53a (A/PR/8/34M蛋白質遺伝子)。
11*フアンダイクおよび共同研究者の論文(rJ、Viro1g第48巻、第
1248頁(1984年)〕に記載のもの。
表ニー(illl
インフルエンザウィルス
ELISA力価(X 10−3)
* X−53a (A/PR/8/34M蛋白質遺伝子)#寧傘ファンダイクお
よび共同研究者の論文〔「J、Virol、 J第48巻、第1248頁(19
84年)〕に記載のもの。
表−一」−
モノクロナル抗体と合成ペ
プチドとの反応性
手続補正書
平成 3年 2A21日
Claims (29)
- 1.A型インフルエンザウィルスのマトリックス蛋白質の215−239区域の 15−25のアミノ酸シークエンスに実質的に対応する約15−25のアミノ酸 の長さを有するポリペプチドから選択され、インフルエンザウィルス抗原反応性 を有する合成ポリペプチド。
- 2.A型インフルエンザウィルスのマトリックス蛋白質の215−235区域に 実質的に対応する15−22のアミノ酸の長さの、請求の範囲第1項に記載の合 成ポリペプチド。
- 3.15−20のアミノ酸の長さを有し、231部位を含む請求の範囲第2項に 記載の合成ポリペプチド。
- 4.次式 【配列があります】 のアミノ酸シークエンスを有する請求の範囲第3項に記載の合成ポリペプチド。
- 5.請求の範囲第1項に記載のポリペプチドの塩。
- 6.さらに放射性標識を有する請求の範囲第1項に記載のポリペプチド。
- 7.カルボキシル末端型アミノ酸がアミド基に変換された請求の範囲第1項に記 載のポリペプチド。
- 8.アミノ末端型アミノ酸がアシル基でブロックされた請求の範囲第1項に記載 のポリペプチド。
- 9.高分子型担体と、それに結合した請求の範囲第1項に記載の合成ポリペプチ ドとを含有してなる複合体。
- 10.前記ポリペプチド中のカルボキシル末端型アミノ酸がアミド基に変換され ており、あるいは、アミノ末端型アミノ酸がアシル基でブロックされている請求 の範囲第9項に記載の複合体。
- 11.前記担体が蛋白質である請求の範囲第9項に記載の複合体。
- 12.前記担体が標識を有するものである請求の範囲第9項に記載の複合体。
- 13.前記標識が放射性標識である請求の範囲第12項に記載の複合体。
- 14.前記標識が蛍光性標識である請求の範囲第12項に記載の複合体。
- 15.前記標識が酵素型標識である請求の範囲第12項に記載の複合体。
- 16.請求の範囲第1項に記載のポリペプチドに対応する抗体。
- 17.請求の範囲第9項に記載の複合体に対応する抗体。
- 18.インフルエンザウィルスに特異的な抗体を生成させる方法において、請求 の範囲第1項に記載のポリペプチドを宿主動物に投与して前記抗体を生成させ、 該抗体を集めることを特徴とする方法。
- 19.請求の範囲第1項に記載のポリペプチドに特異的な抗体を生成させる方法 において、該ポリペプチドを宿主動物に投与して該抗体を生成させ、該抗体を集 めることを特徴とする方法。
- 20.インフルエンザウィルスに特異的な抗体を生成させる方法において、請求 の範囲第9項に記載の複合体を宿主動物に投与して該抗体を生成させ、該抗体を 集めることを特徴とする方法。
- 21.試料中のインフルエンザウィルスの存在を検知する方法において、該試料 と請求の範囲第16項に記載の抗体とを免疫反応条件下に接触させ、次いで、該 ウィルスと該抗体との免疫学的結合を検知することを特徴とする検知方法。
- 22.試料中のインフルエンザウィルスの存在を検知する方法において、該試料 と請求の範囲第17項に記載の抗体とを免疫反応条件下に接触させ、次いで、該 ウィルスと該抗体との免疫学的結合を検知することを特徴とする検知方法。
- 23.試料中のインフルエンザウィルスに対応する検体の存在を検知する方法に おいて、該試料と請求の範囲第1項に記載のポリペプチドとを免疫反応条件下に 接触させ、次いで、該ペプチドと該抗体との免疫学的結合を検知することを特徴 とする検知方法。
- 24.試料中のインフルエンザウィルスに対応する抗体の存在を検知する方法に おいて、該試料と請求の範囲第9項に記載の複合体とを免疫反応条件下に接触さ せ、次いで、該ペプチドと該抗体との免疫学的結合を検知することを特徴とする 検知方法。
- 25.治療が必要な患者のインフルエンザを治療する方法において、インフルエ ンザの治療のために治療学的に有効な量の、請求の範囲第16項に記載の抗体を 、該患者に投与することを特徴とする治療方法。
- 26.治療が必要な患者のインフルエンザを治療する方法において、インフルエ ンザの治療のために治療学的に有効な量の、請求の範囲第17項に記載の抗体を 、該患者に投与することを特徴とする治療方法。
- 27.哺乳類または鳥類に、インフルエンザに対する免疫性を与える方法におい て、インフルエンザに対する免疫性を与えるために治療学的に有効な量の、請求 の範囲第1項に記載のポリペプチドを、前記の哺乳類または鳥類に投与すること を特徴とする方法。
- 28.インフルエンザに対する免疫性を哺乳類または鳥類に与える方法において 、インフルエンザに対する免疫性を与えるために治療学的に有効な量の、請求の 範囲第9項に記載の複合体を、前記の哺乳類または鳥類に投与することを特徴と する方法。
- 29.治療が必要な患者のインフルエンザを治療する方法において、インフルエ ンザの治療のために治療学的に有効な量の、請求の範囲第1項に記載のペプチド を該患者に投与することを特徴とする治療方法。
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