JPH09500358A - 免疫感染性クラスター・ウイルス感染のための治療的戦略 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 全身性リウマチ失調を患う患者により産生された自己抗体の特性を示し、かつ、免疫感染性クラスター・ウイルス上のエピトープと交差反応する抗体又はその断片の使用を含むヒトにおける免疫感染性クラスター・ウイルスの治療のための治療的戦略。追加の治療的戦略は、そのウイルス感染を治療するためのU1 RNA又はその断片の使用を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫感染性クラスター・ウイルス感染のための治療的戦略 発明の背景 本発明は、総じて、生物化学及び医学の分野に関する。特に、本発明は、免疫 感染性クラスター・ウイルス(immuroinfective cluster virus)感染の治療のた めの治療的戦略に関する。 全身性リウマチ失調(systemic rheumatic disorders(SRDs))における疾患発現 は、免疫感染性クラスター・ウイルス（1CVs）−例えば、ヒト免疫不全ウイルス １(human immunodeficiency virus 1(HIV-1))、単純ヘルペス・ウイルス１(herp es simplex virus 1(HSV-1))、及び他の免疫感染性アデノウイルス、ヒト白血病 レトロウイルス(human lymphotropic retroviruses(例えば、HTLV-1))、風疹ウ イルス(rubella virus)、サイトメガロウイルス(CMV)、並びにエプスタイン−バ ール・ウイルス（Epstein-Barr virus(EBV)）により引き起こされる感染に一般 的ないくつかの特徴をもつ。一般的な免疫異常は、リンホカイン調節異常、ポリ クロナールＢ−細胞活性化、自己抗体産生、アネルギー、特定抗原に対する減少 された応答、及び変更された比の CD4⁺ 対 CD8⁺ T リンパ球を含む。一般的な臨 床的類似点は、亜急性の、激化し、そして緩解する経過；炎症；筋骨格苦痛；及 びリンパ節障害を含む。 それ故、SRAsのためのウイルス原因を立証するための努力は、結論に達しない 結果を作り出してきた。〔R．Fox“Epstein-Barr Virus and Human Autoimmune Diseases：Possibilities and Pitfalls”J．Virol．Methods 21，19-27(1988) 〕。 SRD抗体とウイルスの間の交差反応についての蓄積されたデータは、単一失 調をもつ患者 からの血清が異なるファミリーのウイルスと反応するということを立証している 。〔Fox,前記：A．M．Krieg et al.“Expression of an Endogenous Retroviral Transcript らAssociated with Murine Lupus” Arthritis Rheum．32，322-32 9(1989)〕。２つの例は、全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus ery thematosus(SL E))であって、Ｕ１，Ｕ２，及びＵ４〜Ｕ６核内低分子リボ核タンパク質(small nuclear ribonucleoproteir(snRNP))粒子を特徴とするもの、〔M．R．Lerner et al.“Antibodies to Small Nuclear RNAs Complexed with Proteins are Produ ced by Patients with Systemic Lupus Erythematosus”Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 76，5494-5499（1979）；E.H.Schumacher“Primer on the Rhewmatic Dis eases”(Arthritis Found.，Atlanta)，9th Ed.(1988)〕、並びに硬皮症（scler oderma)であって、患者の40−50％が、セントロメアに対する抗体をもち、そし て他の25−30％がScl-70（硬皮症70-KDa抗原）／トポイソメラーゼＩに対する抗 体をもつもの〔Schumacher，前記〕である。 SLE血清中の抗体は、レトロウイル ス・ヒトＴ−細胞白血病ウイルスＩ型及びネズミ白血病ウイルス、並びに DNAウ イルス EBV及び CMVと交差反応することが発見された〔A．Kurata et al．“Pro duction of a Monoclonal Antibody to a Membrane Antigen of Human T-cell L eukaemia Virus（HTLV1/ATLV）-infected Cell Line from a Systemic Lupus Er ythematosus（SLE）Patient：Sero logical Analyses for HTLV1 Infections in SLE Patients” Clin.Exp．Immunol．62，65-74(1985)；M．Rucheton et al.“ Presence of Cireulzting Antibodies Against Gag-Gene MuLV Proteins in Pat ients with Autoimmune Connective Tissue Disorders” Virology 144，468-48 0(1985)；T．Okamoto et al.“Evid ence in Patieuts with Systemic Lupus Er ythematosus of the Presence of Antibodies Against RNA-Dependent DNA Polymerase of Bahoon Endogenous Vir us” Clin．Exp．Immunol. 54，747，755(1983)〕。硬皮症とSLE 血清の両方が 、インビトロにおいて同一のアデノウイルスの複製を阻害する。さらに、単一ウ イルス−例えば、EBV-に対する抗体が、 SLE、 Sjogren症候群、及びリウマチ様 関節炎を含むいくつかの失調において生じている〔R．I．Fox，et al.“Potenti Dis．Clin．North Am. 13，275-292(1987)；Fox，前記，G．J．Pruijin“Inhibi tion of Adenovirus DNA Replication in vitro by Autoimmune Sera” Eur．J ．Biochem ，154，363-370（1986）〕。 ウイルス関連を確立するための最近のアプローチは、主要核抗原とウイルス・ タンパク質との間のアミノ酸配列の相同性についてのサーチを含む。このアプロ ーチは、バクテリア／自己免疫のパラダイムであって、分子擬態が細胞及び組織 を傷つける抗−自己抗体を生成すると信じられている〔M．B．Oldstone et al. “Concepts in Viral Patho genesis”（Springer，N.Y.）Vol.2，195-202(1984 )〕。１つの例は、クレブシエラ（Klebsiella）ニトロゲナーゼ・レダクターゼ と、強直性脊椎炎（ankylosing spondylitis）についての増加した危険を担持す るHLA B27.1 との間の共通エピトープの同定である〔A．Calinet al.“Genetic Differences Between B27 Positive Patients with Ankylosing Spondylitis an d B27 Positive Healthy Controls” Arthritis Rheum．26，1460-1464(1983)； P．L．Sch cuimmbeck et al.“Autoantibodies to HLA B27 in the Sera of HLA B27 Patients with Ankylosing spondylitis and Reiter's Syndrome” J．Exp ．Med ．166，173-181(1987)；P．J．Bjorkman et al.“The Foreign Antigen Bi nding Site and T Cell Recognition Regions of Class 1 Histocompatibility Antigens “Nature 329，512-518(1987)；C．Eming et al.“Antibody Activity in Ankylosing Sp ondylities Sera to Two Sites on HLA B27．1 at the MHC Groove Region(With in Sequence 65-85)，and to a Klebsiella Preumoniae Nitrogenase Reductase Peptide(Within Sequence 181-199)” J．Exp．Med. 171，1635-1647(1990)〕 。最近のウイルス相同性は、２つの主要核抗原：Scl-70／トポイソメラーゼＩ〔 G．G．Maul et al.“Determination of an Epitope of the Diffuse Systemic S clerosis Marker Antigen DNA Topoisomerase I：Sequence Similarity with Re troviral p30 ^gag Protein Suggests a Possible Cause for Autoimmunity in S ystemic Sclerosis”Proc．Nalt．Acad．Sci．USA 86，8492-8496(1989)〕、及 び上記70-Kda抗原、U1 RNP粒子の成分〔C．C．Query et al.“A Common RNA Rec ognition Motif Identified within a Defined U1 RNA Binding Domain of the 70K U1 snRNP Protein”Cell 5L，211-220(1987)；H.H．Guldner et al.“Human Anti-P68 Autoantibodies Recognize a Common Epitope of U1 RNA Containing Small Nuclear Ribonucleoprotein end Influenza B virus” J．Exp.Med. 171 ，819-829(1990)〕において報告されている。面白いことに、この70-Kdaタンパ ク質内で異なる研究者により同定された２つの相同性は、それぞれ、異なるウイ ルス：Ｃ型レトロウイルス〔Query et al.，前記〕とインフルエンザＢウイルス 〔Guldner et al.，前記〕と会合する。 AIDS（後天性免疫不全症候群acquired immunodeficiency syndrome）は、HSV- 1，CMV及び EBVを含む他の免疫感染性ウイルスとの明らかなシナジーにおいてHI V-1 により引き起こされる〔J．M．Gimble et al.“Epitope Mapping with a Re combinant Human 68-Kda（U1）Ribonucleo protein Antigen Reveals Heterogen e ous Autoan tibody Profiles in Human Autoimmune Sera”J．Immunol．141，469-475(1988) ；J．Kamine et al.“Sp1-Dependent Activetion of a Synthetic Promoter by Human Immunodeficiency Virus Type 1Tat Protein” Proc．Natl．Acad Sci．U SA 88，8510-8514（1991）；M．A．Albrecht et al.“The Herpes Simplex Viru s Immediate-Early Protein，ICP4，Is Required to Potentiate Replication o f Human Immunodeficiency Virus in CD4 ⁺ Lymphocytes” J．Virol．63，1861 -1868(1989)〕。全４ウイルスにおけるキーの構造及び調節性タンパク質は、ヒ ト失調、混合結合組織疾患（Mixed connective tissue disease(MCTD)）におけ る抗体と反応する核要素と共通の配列をもつ〔A．Douvas et al.“Multiple ove rlepping Homologies Between Two Rheumatoid Antigens and Immuno suppressi ve Viruses”Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88，6328-6332(1991)〕。これらの核 要素の中の１は、前駆体mRNAをスプライスする（Ｕ２とU4-6 snRNPも含む）低分 子リボ核タンパク質複合体のセットに属するU1 snRNPである〔P．Bringmann et al.“Purification of the Individual snRNPs U1，U2，U5 and U4/U6 from HeL a Cells and Characterization of their Protein Constituents”EMBO J． 5,3 509-3516(1986)；S．M．Berget et al.“U1，U2，and U4/U6 Small Nuclear Rib onucleoproteins are Required for in Vitro Splicing but not Polyadenylati on”Cell 46，691-696(1986)〕。U1 snRNPにおいては、明確な RNAコアが、MCTD において抗原性である70Ｋを含む４つのポリペプチドと会合する〔R．Reuter et al.“Immunization of Mice with Purified U1 Small Nuclear Ribonucleoprot ein（RNP）In duces a Pattern of Antibody Specificities Characteristic of the Anti-Sm and Anti-RNP Autolmmune Responseof Patients with Lupus Eryt hematosus，as Measured by Monoclo nal Antibodies”Proc Natl．Acad．Sci．USA 83，8689-8693(1983)〕。このU1 RNAは、それ自体弱く抗原性であるが、上記ポリペプチドを潜在的に免疫沈降性 である複合体に結合させる〔A．S．Douvas et al.“Isolation and Characteriz ation of Nuclear Ribonucleoprotein Complexes Using Human Anti-Nuclear Ri bonucleoprotein Antibodies”J．Biol．Chem. 254，3608-3616(1979)〕。 この70Ｋタンパク質、免疫感染性ウイルスと広い相同性をもつ複合体内の唯一 のタンパク質は、HIV-１のエンベロープ配列と共通な25アミノ酸の６つの、そし てHSV-１と共通な８つの正しい相同性をもつ〔Douvas et al.,前記(1991)（引用 により本明細書中に取り込む）〕。 このHIV-１エンベロープ糖タンパク質複合体gp120/41は、タンパク質分解性解 裂によりgp160 前駆体から得られる〔J．M．MeClune et al.“Endoproteolytic Cleavage of gp160 is Required for the Activation of Human Immunodeficien cy Virus”Cell 53，55-67(1988)〕。その表面部分gp 120は、５つの構造ドメイ ンをもつ〔S.Modrow et al.“Computer-Assisted Analysis of Envelope Protei n Sequences of Seven Human Immunodeficiency Virus Isolates：Prediction o f Antigenic Epitopes in Conserved and Veriable Regions”J．Virol． 61，5 70-578（1987）〕。それにより上記ウイルスが CD4⁺ Ｔリンパ球に付着されるＶ ４ドメインは、動物においては有効な免疫原ではなく、そしてハイブリドーマ技 術により作られた抗体は、Ｔ細胞へのそのウイルスの結合と有効に競合するアビ ジチ−(avidity)を欠いている〔J．A．Habeshaw et al.“AIDS Patnogenesis：H IV Envelope and its Interaction with Cell Proteins” Immunol．Today 11， 418-425（1991）〕。反対に、Ｖ３ループは、有効な免疫原である〔Lamau et al .,前記；P．A．Broliden et al.“Identification of Human Neutralization-Inducing Regions of the Human Immunobeficiency Virus Typel Envelope Gly coproteins”Proc．Natl． Acad．Sci．USA 89，461-465（1992）〕。それは、細胞培養検定においてウイル スを阻害（中和）し、そして免疫保護ワクチンを開発するための努力の結果であ る抗体の産生においてウイルスを抑える〔J．Goudsmit et al.“Human Immunode ficiency Virus Type 1 Neutralization Epitope with Conserved Architecture Elicits Early Type-Specific Antibodies in Experimentally Infected Chimp anzees”Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85，4478-4482（1988）；M．Girard et a l.“Immunization of Chimpanzees Confers Protection Against Challenge wit h Human Immunodeficiency Virus”Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88，542-546( 1991)；S．D．Putney et al.“HTLV-III/LAV-Neut ralizing Antibodies to an E．coli-Produced Fragment of the Virus Envelope” Science 234，1392-1395 (1986)〕。しかしながら、インビトロにおいて中和する抗−Ｖ３抗体をもつにも かかわらず、AIDS犠牲者は、十分に理解されていない理由のためにその疾患に屈 服するが、不十分な力価の抗体を含むことができる〔M．Robert-Guroff et al． “HTLV-III-Neutralizing Antibodies in Patients with AIDS and AID-Related Complex”Nature 316，72-74(1985)〕。 多くのウイルスが、相互作用して、感染された個体内で免疫異常を作り出し、 そしてSRDsにおける自己抗体と交差反応性のエピトープを作り出す〔Douvas et al.,前記(1991)〕。それ故、これらの相同アミノ酸配列と反応する自己抗体に基 づく免疫感染性クラスター・ウイルス感染の治療のための新規の治療的戦略を開 発することが有利であろう。 発明の要約 本発明の第一態様に従って、ヒトにおいて免疫感染性クラスター・ウイルス感 染の治療方法であって、そのウイルスにより感染された患者に、全身性リウマチ 失調を患う患者により作られた自己抗体の特性を示す抗体をもつ少なくとも１の 個体から単離された血清又は血漿を投与することを含むような方法を提供する。 本発明の他の態様に従って、ヒトにおける免疫クラスター・ウイルス感染を治 療する方法であって、全身性リウマチ失調を患った患者により作られた自己抗体 と同一又は類似のエピトープに対して向けられる少なくとも１のモノクロナール 抗体又はその断片の使用を含むような方法を提供する。 本発明の他の態様に従って、ヒトにおいて免疫感染性クラスター・ウイルス感 染を治療する方法であって、その治療の必要な患者に、U1 RNA又はその断片を投 与することを含む方法を提供する。 本発明の他の態様に従って、ヒトにおいて免疫感染性クラスター・ウイルス感 染を治療する方法であって、その治療の必要な患者に RNAスプライシング阻害剤 を投与することを含む方法を提供する。 本発明のさらに他の態様に従って、ヒトにおいて免疫感染性クラスター・ウイ ルス感染を治療する方法であって、上記の治療剤のいずれかの組合せ物を投与す ることを含む方法を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、U1 snRNP 70Kと添え字付き相同性(superimposed homologies)をもつH IV-１表面タンパク質複合体gp120/41のコンピュータ支援モデルである。 図２は、70ＫのエピトープドメインとＵ１コンセンサス結合性配列に関連する U1 snRNP 70Kとgp120/41との間のアミノ酸配列の相同 性を示す。 図３は、 gp120のＶ３ループと70Ｋとの免疫学的比較である。 図４ＡとＢは、 HIV感染血清と比較した、非−HIV-1-感染血清とgp120/41抗原 との間の交差反応性の、 ELISAによる実験的分析を示す。 図５は、HIV-１自己免疫と対照血清のU1 snRNP 70Kに対するウェスタン・ブロ ット反応性を示す。 図６は、HSV-１感染細胞に対する抗-RNPと対照血清の ELISA反応性を示す。 図７ＡとＢは、合成ペプチドに対する抗−セントロメア、抗−Scl-70、抗−RN P 及び正常血清の ELISA反応性を示す。 図８ＡとＢは、U1 RNAとステム−ループＩのモデルを示す。 図９は、U1 snRNA転写物へのgp 160とgp120/41の結合を示す。 図10は、ウェスタン・ブロットによる、 AID陰性である高力価の抗−RNP 抗体 をもつ HIV感染患者内での HIV抗体の顕出について示す。 発明の詳細な説明SRDsをもつ患者からの血清の使用 免疫感染性クラスター・ウイルスは、ウイルスの感染性において、そしてそれ 故抗−ウイルス防御において重要であるエピトープとして認識される特定の配列 形態を含む。さらに、本明細書中先に述べた ICVエピトープと同一又は類似のエ ピトープを同時的に含む特定の正常ヒト・タンパク質も、潜在的な自己抗体の標 的である。これらの自己抗体は、全身性リウマチ失調又はSRDsとして知られる自 己免疫症候群のクラスターの中のいずれか一を患う患者内で高力価において生じ る。これらの自己免疫抗体は、ウイルス・エピトープ と交差反応する。 本出願において第１に重要な自己免疫症状は、全身性リウマチ失調（SRDs）と して分類され、そして表Ｉ中に列記される。これらの一次性失調に加えて、さら に表Ｉ中に列記された多数の関連症状がある。このSRDsは、細胞核内に局在化す る分子と主として反応する自己抗体の生産を特徴とする、これ故、これらの標的 分子は、一般的に、核抗原といわれ、そしていくつかの特定のタイプを有する（ 表Ｉ）。これらの抗体は、一般的に、抗−核抗体といわれる。但し、すべてがよ り特定の記述子をもつ。それぞれの核抗原が１以上のポリペプチド鎖から成り、 核酸を含むこともでき、そして多数のエピトープをもつということに注意するこ とが重要である。 表Ｉ中に列記された核タンパク質抗原は、非対称であり、明確なドメイン内に 濃縮された非常に親水性の配列をもつ。これらのドメインは、普通には、そのタ ンパク質のNH₂又はCOOH−末端において非対称に位置し、その反対の端に非極性 配列をもつ。この親水性ドメインは、３つのタイプ、すなわち、酸性／塩基性互 変性、純酸性及び純塩基性を有する。この酸性／塩基性互変性配列は、その酸性 アミノ酸残基、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸（それぞれ、記号ＤとＥ ）が、塩基性残基、アルギニン及び／又はリミン（それぞれ、記号ＲとＫ）によ り交換されることを特徴とする。このような酸性／塩基性互変性配列の非限定の 例示的な例は、 RDRDRDR〔配列番号１〕、RERERERERERE〔配列番号２〕及びそれ らの変種、例えば、RREERREE…〔配列番号３〕、RRERRE〔配列番号４〕等並びに KEKEKEK〔配列番号５〕の配列である。純酸性配列の非限定の例示的な例は、EE EEEE〔配列番号６〕、 EDDEEDEDE〔配列番号７〕及びDDDDDD〔配列番号８〕の配 列である。純塩基性配列の非限定の例示的な例は、RRRRRR〔配列番号９〕、 RKR KRKK〔配列番号10〕、及び KKKKKKK〔配列番号11〕の配列である。 先に示した例中における極端な親水性、又は酸性又は塩基性残基の変更の規則 的パターンをもつことを認識できることに加えて、本出願中に記載する抗体と反 応する配列も、“モティーフ(motifs)”といわれるパターンにおいて生じる。こ のモティーフは、認識が可能な特徴的な（例えば、グルタミン酸とアルギニンの 組成）をもつ配列である。このパターンは、認識可能であり、そして他の分子、 又は同一分子の他の部分において類似であるが必ずしも同一でない形態において 生じる。配列 RDRDRDR〔配列番号１〕は、３つの場所において、変化した長さに おいて、70Ｋ内で、そしてまたHIV-１のgp41内の類似の形態(ERDRDRD)〔配列番 号12〕内で生じた例である（表II参照）。他の例は、さらに70Ｋ内で RRERE〔配 列番号１４］及びEREEER〔配列番号15〕として生じる、 RERRR〔配列番号13〕モ ティーフである（Query et al.，前記）。さらなる例は、 EDDEE〔配列番号16〕 モティーフであって、同一タンパク質内で、DDDEED〔配列番号17〕、 DEEEDDE〔 配列番号18〕、EDEDDD〔配列番号19〕、及び他の形態としても生じるものを含む 、セントロメア・タンパク質CENP-B（表III参照）の酸性ドメイン内に見られる （W．C．Earnshaw et al．からの配列〔W．C．Earnshaw et al.“Molecular clo ning of cDNA for CENP-B，the major human centromere autoautigen.”J．Cel l．Biol．104：817-829(1987)〕。これらのモティーフの重要性は、それらが免 疫クラスター・ウイルスと自己抗原の両方により共有され（表IIとIII）、そし てSRDsにおいて生じる自己抗体のためのエピトープであるということである。 免疫感染性クラスター・ウイルスは、その免疫系を感染させることにおいて共 同的に(synergistically)作用することが知られている。多数の親水性ドメイン であってウイルスと核抗原の両方におい て存在するものが同定されている。表II（A．Douvas et al.〔Douvas et al．； 前記(1991)〕からのもの）は、70Ｋ核抗原とHIV-１のgp120/41との間の正しい相 同性並びに70Ｋと共同性ウイルスHSV-１、 CMV及び EBVとの間の類似性の発生を 示している。 70Ｋのアミノ酸配列と、HSV-１及び CMVの即時初期（immediateearly(I.E.)） と初期機能に対応するアミノ酸配列との間の相同体の数が特に重要である。これ らの機能は、共同的だけではなく、HIV-１における調節機能、例えば、ロング・ ターミナル・リピート(LTR)によりエンコードされたもの、の活性化について不 可欠であると信じられている〔J．M．Gimble et al.“Activation of the Human Immunodeficiency Virus Long Terminal Repeat by Herpes Simplex Virus Typ e 1 is Associated with Induction of a Nuclear Factor That Binds to the N F- _KB/Core Enhancer Sequence”J．Virol． 62，4104-4112（1988）；Kamine e t al．前記；Albrecht et al．前記〕。 多数の相同体が、HSV-１とHIV-１に属するものを含む ICVタンパク質と、硬皮 症における自己抗体と反応する、SRDsにおける他の主要抗原、セントロメア・タ ンパク質CENP-Bとの間に存在する〔Douvas et al.,前記(1991)〕。(A．Douvas〔 Douvas et al.,前記(1991)〕からの）表IIIは、セントロメア・タンパク質CENP- BとHIV-１のgp120/41との間の正しい相同体の発生並びにCENP-Bと共同性ウイル スHSV-1，CMV及び EBVとの間の類似性を示している。高力価の抗−セントロメア 抗体は、他の特異性と混合されていない約45％の硬皮症患者において生じる〔Sc humacher et al.,前記〕。HIV-１、HSV-１と CMVに対する相同性は、グルタミン 酸（ドメイン１）並びにアスパラギン酸及びグルタミン酸（ドメイン２）からほ とんど完全に成るCENP-B内の２つの非常に親水性のドメイン内でクラスターとな る 。これらのドメインについて普通でないのは、それらの長さである。両方が、硬 皮症自己抗体のためのエピトープを含む〔W．C．Earnshew et al.“Molecular C loning of CDNA for CENP-B，the Major Human Centromere Autoantigen”J．Ce ll Biol． 104，817-829(1987)〕。CENP-Bのドメイン１及び２と、そして硬皮症 抗原Scl-70及びMCTD抗原70Ｋ内の親水性ドメインと反応する自己抗体が、親水性 ドメインをもつ他のポリペプチドと反応するであろうと予想される。この予想は 、実施例１中に提示された ELISAにより支持される（図７Ａと７Ｂ）。これらの 図は、ポリ−グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン及びアルギニンの合成基質 に対するこれらの抗体の活性を示す。これらのデータは、 ICV感染における類似 配列に対する抗体の強い交差反応性、そしてこれらの抗体についての治療的用途 を予測する。この予測は、実施例２（及び図６）中に提示された ELISAのデータ により支持され、ここで、抗-RNP血清は、HSV-１感染細胞溶解物に対する高い反 応性を立証する。それ故、 SRD患者からの血清は、 ICV感染をもつ患者の治療に おいて有用である。HIV-１感染の治療 HIV-１の表面糖タンパク質複合体は、前駆体、 gp160のタンパク質解裂により 得られた２分子構造、gp120/41である。図１中に示すように、この gp120部分は 、HIV-１の表面上に突き出す、一方、gp41は、主にそのトランスメンブラン及び 細胞質成分である。図１は、現存化学データのコンピューターモデリングにより 構築されたこの複合体の２次元表現(rendition)である。図示するように、それ によりウイルスがＴ“ヘルパー”細胞に付着するところのCD４結合性部位は、 g p120の可変Ｖ４ドメインである。以下にさらに討議するようにＶ３ドメイン（図 ３参照）は、中和抗体の主な標的であり、一方、Ｖ４ループとCD４結合性部位は 、残念なことに、免疫学的 に静的であると証明されている。 図１中、HIV-１ PNA配列（KO3455）は、Gen Bankから得られ、そして VAX/VMS コンピューターを使用して gp120と41についてのアミノ酸配列に翻訳された。 g p120のジスルフィド結合は、酵素的解裂及びHPLCにより同定された〔C．L．Leon ard et al.“Assignment of Intrachain Disulfide Bonds and Characterizatio n of Potential Glycosylation Sites of the Type 1 Recombinant Human Immun odeficiency Virus Envelope Glycoprotein（gp120）Expressed in Chinese Ham ster Ovary Cells”J．Biol chem． 265，10373-10382(1990)〕。gp41内の残基 598-604間のジスルフィド結合は、 NMRにより同定された〔M．B．A．Oldstone e t al.“Mapping the Anatomy of the Immunodominant Domain of the Human Imm unodeficiency Virus gp41 Transmembrane Protein：Peptide Conformation Ana lysis Using Monoclonal Antibodies and Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy” J．Virol. 65，1727-1734(1991)〕。 gp41のトランスメンブラン部位（アミノ酸 684-700）及び膜会合部位（アミノ 酸 525-535）は、19の窓サイズ及びKyte/Doolittleのアルゴリズムを使用する疎 水性プロッティングにより同定された〔J．Kyte et al.“A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein” J．Mol．Biol. 157，1 05-132(1982)〕。 ｇ120/41の２次構造は、 Chou-Fasman法〔P．Y．Chou et al.“Empirical Pre dictions of Protein Conformation” Ann．Rev．Biochem 47，251-276(1978)〕 により、α−ヘリックス、β−シート、β−ターン、及びランダム・コイル構造 であると、シミュレートされた。らせん構造の測定のために、Ｐ（結合）が 1.0 よりも大きく 、そしてＰ_αがＰ_βよりも大きい条件は、使用されなかった。β−シートの測定 のためには、５残基の最小長さが必要である。 表面の確率及び柔軟性も、このモデルの構築において考慮された。計算パラメ ータを、誤りの設定(default setting)、表面確率について 5.0、そして柔軟性 について 1.040の限界において使用した。この塩基性の２次構造は、さまざまな 公開されたHIV-１配列中で類似していた〔J．Devereux et al.“A Comprehensiv e Set of Sequence Analysis Programs for the VAX”Nuc．Acid Res. 12，387- 395(1984)；E．A．Emini et al.“Induction of Hepatitis A Virus-Neutralizi ng Antibody by a Virus-Specific Synthetic Peptide”J．Virol． 55，836-83 9（1985）；P．A．Karplus et al.“Refind Structure of Glutathione Reducta se at 1・54Å Resolution” J．Mol．Biol． 195，701-729(1987)；Modrow et al.,前記〕。 ３次元モデル・シミュレーションは、ジスルフィド結合に及びヘリックス、シ ート、ターン、及びランダム・コイル構造のコンピュータ計算に基づいていた。 エンベロープ・タンパク質 gp160は、gp120：アミノ酸１-511とgp41：アミノ酸 512-856、に分けられた。４つの可能なモティーフ：アミノ酸 1-107（1-29、33- 107）、アミノ酸 108-211、アミノ酸 213-353、アミノ酸 358-511が、 gp120内 に示唆された。図１中、記号は、以下のような特徴に対応する： 図から分かるように、gp120/41複合体のアミノ酸配列は、正常タンパク質、70 Ｋに類似又は同一である（全 152アミノ酸にわたる）多数の部位をもつ（図１） 。図１中に暗バーにより示す（そして図２中により正確に定める）これらの類似 性は、HIV-１の主要中和ド メイン、（以下、図３中に詳細に討議する）Ｖ３ループのほとんどを含む。70Ｋ は、その機能がmRNA前駆体をプロセス（スプライス）することであるところの核 内低分子リボ核タンパク質粒子（small nuclear ribonucleo protein particle( snRNP))の成分である〔M．R．Lerner et al.“Are suRNPs Involved in Splicin g?”Nature 283，220-224(1980)；Hamm et al.，“In Vitro Assemblx of U1 sn RNPs” EMBOJ 6，3479-3485(1987)；D．L．Black et al.“U2 as Well as UI Sm all Nuclear，Ribonucleoprotein Are Involved In Premessenger RNA Splicing ”Cell 42，737-750（1985）〕。この粒子のコアは、 RNA分子、Ｕ１である。２ つの他のタンパク質、ＡとＣは、U1 snRNPの特定成分である〔Hamm et al.,前記 （1987）〕。他のポリペプチド成分であってＢ，Ｂ′，Ｄ，Ｅ，Ｆ及びＧを含む ものも、それらのコアとしてU2-U6 RNAsをもつsnRNPs内に見つかっている〔Hamm et al.,前記（1987）〕。 このU1 snRNPは、 SRD症候群：混合結合組織疾患（MCTD）、硬皮症及び全身性 紅斑性狼瘡(SLE)において生じる高力価の高アビジチー自己抗体の標的である〔W ．N．Kelly et al.“Textbook of Rheumatology”(Saunders，Philadelphia)(19 89)〕。抗−U1 snRNP抗体が、他の抗体特異性と混合されていないMCTD内でしば しば生じ、そして全く知られていない病因効果をもつということが重要である〔 Kelly et al.，前記：E．H．Schumacher et al.“Primer on the Rheumatic Dis eases”（Arthritis Foundation，Atlanta）9th Ed.(1988)〕。抗体プロフィー ルがしばしば混合される SLEにおいては、抗−Ｕ１抗体の存在は、より好ましい 予後と関連する〔Kelly et al.，前記：E．H．Schumacher et al.“Primer on t he Rheumatic Diseases”（Arthritis Foundation，Atlanta）9th Ed.（1988） 〕。 図２と３は、HIV-１を中和するために抗-RNP抗体を使用する提案 された戦略におけるコンセンサス結合性配列（consensus binding sequence(cbs ))の重要性を説明している。MCTDは、血清抗−U1 snRNP抗体の存在により定義さ れる症候群である〔Kelly et al.，前記；Schumacher et al.,前記〕。図２Ａ〔 配列番号20−51〕は、gp120/41に類似する70Ｋ（ボールド・タイプ）内の線状ア ミノ酸配列を示す、図１中に表された分析を拡大している。（１の例外があるが ）類似性は、≧50％のアミノ酸が同一である部位として定義される。全部の中で 、70Ｋ内の18部位、その長さの26％が、gp120/41に相同である。重要な発見は、 U1 RNAへの高いアフィニティー結合に必要かつ十分である８アミノ酸のコンセン サス結合配列（アミノ酸 322-329における開いた箱）が、 gp120内の類似配列、 GRAFVTIG〔配列番号52〕に適合するということである。この部位は、正しい配列 ではないが、U1 RNAに結合するタンパク質のファミリー内にある共通配列である 。 図２Ａ中に示すように、 cbsは、MCTD血清の 100％と反応する（下線を引いた ）70Ｋの主要なエピトープ・ドメイン13内に横たわる〔Guldner，et al.,“Epit ope Mapping with a Recombinant Human 68-KDz（U1）Ribonucleo protein Anti gen Reveals Hetero geneous Autoantibody Profiles in Human Autoimmune Ser a”J．Immunol． Vol．141．469-475（1988）；D．S．Gram et al.“Mapping of Multiple B Cell Epitopes on the 70-Kilodalton Autoantigen of the U1 Rib onucleo protein Complex”J．Immunol． 145，630-635(1990)〕。治療用途のた めの血清のスクリーニングは、それ故に、最高の力価をもつものを同定すること である。第二のドメイン、Ａは、抗−U1 snRNP血清の＞50％と反応する、重要な エピトープを同定する〔Cram et al．前記〕。図２中に示すように、このエピト ープも、 gp120中に相同配列をもつ。 図２Ｂは、70Ｋを含む、機能的スプライシング複合体内のU1 RNAと会合する７ つのタンパク質の cbsを示す〔配列番号53−59〕。黒長方形により囲んだ８アミ ノ酸は、U1 RNAへの結合に必要かつ、十分である〔R．J．Bandziulis et al.“R NA-Binding Proteins as Developmental Requlators” Genes Devel．3，431-43 7(1989)；B．M．Merrill et al.“Phenylalanines That Are Conserved Among S everal RNA-Binding Proteins From Part of a Nucleic Acid-Binding Pocket i n the A1 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein”J．Biol．Chem 263，33 07-3313(1988)；B．M．Merrill et al.“Photochemical Cross-Linking of The Escherichia coli Single-Stranded DNA-Binding Protein to Oligodeoxy nucle otide” J．Biol．Chem 259，10850-10856(1984)；A．Woppman et al.“Direct Cross-Linking of snRNP Protein F and 70K to snRNAs by Ultra-Violet Rodia tion In Situ”Nuc．Acad Res. 16，10985-11004(1988)；A．R．Krainer et al. “Functional Expression of Cloned Human Splicing Factor SF2：Homology to RNA-Binding Proteins，U1 70K，and Drosophia Splicing Regulators”Cell 6 6，383-394（1991）〕。hnRNP A2とB1の cbsは、同一である。これらの上に重ね 合わされる（superimposed）のは、フランキング・アミノ酸をもつ、Ｖ３（HIV- 1株III_B）のGRAFVTIG〔配列番号20〕の配列である。不変のＧ…Ｆ構造は、Ｖ３ 内及び７つのＶ１−結合タンパク質の全てであって、ほとんど不変のＡとＶによ り強化され、Ｆに隣接しているものの内に生じる。 V3 GRAFVTIG〔配列番号20〕 内も存在する上記８アミノ酸 cbs内の他の保存配列は、明らかである。 gp120の 免疫優勢Ｖ３ループ内のこの相同体の戦略的配置については、以下に記載する。 図２Ａも、70Ｋの親水性COOH−末端とgp41との間の広い相同性を 示している。これらは、反復 RDRDR〔配列番号60〕モティーフ、並びに70Ｋとgp 41のそれぞれ 513と 732の位置において開始する互変の塩基性及び酸性残基のブ ロックを包含する。このブロック中では、70Ｋアミノ酸の18の11は、gp41と同一 であり、そして３以上が、グルタミン酸とアスパラギン酸の保存的置換を提示す る。互変塩基性／酸性アミノ酸であって、 RDRDR〔配列番号60〕、 RERRE〔配列 番号61〕、ERKR〔配列番号62〕及びコンセンサス配列 ETPEEREERRR〔配列番号63 〕を含むものの立体配置は抗−U1 RNP抗体に対し抗原性である〔Douvas et al.,前記 (1991)；Cram et al.,前記；C．C．Query et al.“A Common RNA Recogniti on Motif Identified with in a Defined U1 RNA Binding Domain of the 70K V 1 snRNP Protein”Cell 57，89-101(1989)〕。興味深いことに、gp41内の配列EE EGGE〔配列番号64〕も、硬皮症失調、MCTDの臨床成分の中の１つにおける自己抗 体の主要な標的であるセントロメア・ポリペプチドCENP-B内で生じている。CENP -B内に２回生じている関連配列 EEEGE〔配列番号65〕も、HSV-１の polタンパク 質内で生じている〔Douvas et al.,前記(1991)〕。 cbs 及びドメインＡ相同体は共に図３に示している通りgp120 のＶ３ループの 中にある。図３はウイルスの感染力を中和せしめる抗体を生産するうえでのＶ３ ループの重要性を示している。他の研究者によるgp120/41全長の免疫学的分析は 、Ｖ３ループが中和性エピトープの主要部位であることを示している〔J.D．Lam anら“Variant-Specific Monoclonal and Group-Specific Polyclonal Human Im munodeficiency Virus Type 1 Neutralizing Antibodies Raised with Syntheti c Peptides from the gp120 Third Variable Domain”J．Virol． 66，1823-183 1（1992）〕；Girardら、前掲； Broliden ら、前掲； J.R．Ruscheら“Antibod ies that Inhibit Fusion of Human Immunodeficiency Virus-Infected Cells Bind a 24-Amino Acid Sequen ce of the Viral Envelope，gp120”Proc．Natl．Acad，Sci．USA 85，2198-230 2(1988)；P.J．Durda ら“HIV-1 Neutralizing Monoclonal Antibodies Induced by a Synthetic Peptide”AIDS Res．Res．Hum．Retro. 6，(1990)；M.A．Skin nerら“Characteristics of a Neutralizing Monoclonal Antibody to the HIV Envelope Glycoprotein” AIDS Res．Hum．Retro． 4，(1988)；K．Javaherian ら“Principal Neutralizing Domain of the Human Immunodeficiency Virus Ty pe 1 Envelope Protein”Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86，6768-6722（1989） 〕。インビトロで（又は霊長類においてインビボで）ウイルスを中和することの できる抗体は全てＶ３ループと反応する。これには、AIDS患者由来、モノクロー ナル技術により作られた、又はサルにおいて生産された抗体が含まれる。従って 、Ｖ３ループはウイルスにおいて最も有能な免疫原である。 図３〔SEQ ID NO：66-70〕は公開された研究をまとめた、Ｖ３ループの詳細な 免疫分析（アミノ酸303 と338 との間にジスルフィド結合を有する36個のアミノ 酸）を示す。中和性ドメインはアミノ酸配列のまわりで重箱実線として示してい る。70Ｋのcbs 及びドメインＡエピトープ両者の部分で重複しているRKSIRIQRGP GRAFV 成分（線分１）はAIDS患者由来のHIV-1 感染血清の中で認められる中和性 抗体のうちの＞80％の標的である〔Laman ら前掲〕。線分１−４は、シンシチウ ム形成阻害アッセイ(SFI)において最も有効に中和されることが認められた抗−g p120 モノクローナル抗体の標的配列を示している〔Laman ら前掲；Girardら、 前掲；Brolinden ら、前掲；Ruscheら、前掲〕。線分５及び５′で示す免疫原と してのＶ３ループの半分づつの利用は、GPGRAFVTIG〔SEQ ID NO：72〕配列が 中和性モノクローナル抗体のより有能な誘発因子であることを示している〔Durd a ら、前掲〕。線分６で示している配列は、チンパンジーに注射したとき、HIV- 1 の負荷に対する部分的防御を供する〔Skinner ら、前掲〕。更に、配列IRIQRG PGRAFVTIG(線分７)〔SEQID NO：73〕は gp120を注射したチンパンジーにおいて 生産される抗血清の主要エピトープである〔Javaherianら、前掲〕。 線分１〜７の重ね合わせは、中和性抗体の最も有能な焦点としての、cbs を含 むループRGPGRAFVTIG 〔SEQ ID NO：74〕のおおまかに11個のアミノ酸セグメン トループを特定せしめる。更に、線分１，３，５及び６（全て中和性エピトープ を代表している）は70ＫのドメインＡエピトープの上にある。残念ながら、AIDS においては、これらの抗体の力価は疾患を治癒するには弱すぎる。しかしながら 、70Ｋにおける相同性配列（図２）は、あるケースにおいては10⁷を超えるほど の力価を有するMCTDにおける自己抗体のイムノドミナント標的である。イムノド ミナントＶ３及び70エピトープのめざましい一致は、抗 U1snRNP抗体が HIV-1エ ピトープと、又はその逆で、交差反応するであろうことを強く予測せしめる。同 一の分析は、pg41相同体も重要でありうることを示唆する。これらの予測は以下 の図４及び５に示す実験データにより裏付けされる。 図４Ａ及び４ＢはELISA による、HIV 非感染血清とgp120/41抗原とのパネル間 での交差反応性の実験分析を示す。これらを、ウェスタンブロット分析によりセ ロポジティブについて予備スクリーンされた全部で12の HIV−感染ヒト血清の反 応性と比較した。ELISA は、飽和濃度の抗原をプラスチック製マイクロタイター プレート（Flow Laboratorie）に４℃で12hrかけて吸着させることにより実施し た。組換抗原gp120,Ｖ３及びgp41（それぞれパネルＡ，Ｂ及びＣ）はABT（Cambr idge），Sigma（St．Louis）及びdu Pont(Boston)か ら購入した。HIV-1 感染血清(HIV)を Organon Teknikaキットを用い、ウェスタ ンブロットによりセロポジティブについて予備スクリーンした。抗 RNP抗体(RNP )を有するMCTD患者由来の血清及びSiogren病の患者由来の血清を、抗−RNP 及び 抗−Ro/SSA抗体の存在について、標準化細胞抽出物に対する二重拡散アッセイを 用い、沈降素系の同定のための既知の陽性プロトタイプ血清を利用してスクリー ンした。甲状腺炎血清を臨床的甲状腺炎を有する患者から獲得した。Th-U及びTh -Tはそれぞれ未処置及び処置済を表わす。正常血清（NL）をボランティアから集 め、そしてイムノフルオレセンスによる抗核抗体について陰性であると決定され た。全ての血清をリン酸緩衝食塩水(PBS)pH7.5，0.1％の牛血清アルブミン(BSA) で１：100 に希釈した。西洋ワサビコンジュゲート化ヤギ抗−ヒトIgG（１：100 0の希釈）を第二抗体として採用し（Zymed Inc.）、そしてｏ−フェニルジアミ ン二塩酸塩(Sigma)を基質として使用した。光学密度（O.D．490nmでの任意単位 ）を自動 ELISAリーダーを用いて記録した。水平バーは各血清グループの平均を 示している。 図４ＡのパネルＡは、HIV 血清の gp120に対する反応性を、抗 RNP血清(RNP) 、正常（NL）及び Sjogren症候群を有するリウマチ様コントロールグループ患者 （SS）の gp120に対する反応性と対比している。RNP 及びSSの反応性は 0.137及 び 0.143であり、それに対して HIV及びNLはそれぞれ 0.673及び 0.033であった 。パネルＢにおける基質は38アミノ酸Ｖ３鎖である。この系列における最大の反 応性は RNPグループにおいて認められた(平均 0.285に対し、HIV については、0 .261、SS及びNLについてはそれぞれ0.160及び0.099)。gp120 に比してのＶ３に 対する HIV血清の2.6 分の１の低さの反応性は、Ｖ３における個々のエピトープ の数の少なさと一致する。しかしながら、gpに比してのＶ３に対する＞２倍高い RNPの反応 性は高度に有意であり、Ｖ３においては、70Ｋ（70Ｋにおいて全部で70個のアミ ノ酸）に対して２つの相同配列しかなく、それに対して gp120の残り（70Ｋにお いて全部で47個の非Ｖ３アミノ酸）においては６つの相同性があることによる。 このパターンはＶ３における高めの親和力のエピトープの抗−RNP 抗体による配 列特異的認識と一致する。図４Ａにおいて報告されている抗原特異的反応性は抗 体に基づき、他の血清成分に基づくものではないことが仮定される。この仮説の 証明として、我々が３種の抗−RNP 血清由来の精製 IgGを用い、及び抗Igではな く、西洋ワサビコンジュゲート抗 IgGを用い、何回かのアッセイを繰り返すこと で、これらの実験を何回も繰り返した。これらの実験は図４Ａに報告している通 り同一の特異性及び同等の親和力をもたらした。更に、血清の熱処理（56℃で30 分）は反応性を破解しなかった。SS血清は gp120及びＶ３反応性間で有意差を示 さなかった。 図２Ａにおける親水性相同体から予測の通り、gp41は RNPにとって、gp120 よ りも優れた基質であり（0.137に比して 0.266の平均）、一方、SSグループは有 意義な有効性を示さなかった（それぞれ 0.150及び 0.143の平均反応性）。しか しなから、gp41に比しての、Ｖ３に対する RNPの同等からやや高め反応性も驚く べきことであり、なぜならＶ３と70Ｋとの間の２つの相同体に比べ、gp41と70Ｋ （70Ｋにおける93個のアミノ酸）との間には11の相同体があるからである。これ らの相同体のうちの少なくとも９は親水性である〔Douvasら、前掲(1991)〕。図 ４Ｂは、図４Ａにおける分析を、２人の甲状腺炎患者（一人は処置前（Th-U）、 そして他の者は処置して一年以上経過(Th-T)）由来の血清にまで広げている。陽 性コントロール(HIV(＋))及び正常血清も示している。驚くべきことに、未処置 の甲状腺患者血清はHIV-gp-120，gp41及びＶ３ループと反応すること が明らかである。これは甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO)及びチログロブリンの両 方におけるCENP-B及び70Ｋのそれに類似する親水性配列を示すコンピューター補 助分析と一致する（表１）。 図５は、ウェスタンブロットにより、AIDS血清が RNP抗原の70Ｋ成分と特異的 に反応することを示す。図５において、部分精製した70Ｋを示差的遠心分離及び アフィニティーカラムクロマトグラフィー(抗−RNP IgG-Sepharose)によりラッ トの肝臓核から単離し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動（10％）及びウ ェスタンブロット分析を、それぞれ、A.S．Douvasら〔A.S．Douvas“Autoantibo dies Occurring in Two Different Rheumatic Diseases React with the Same N uclear Ribonucleoprotein Partic1e”Proc．Natl. Acad．Sci．USA 79，5401-5 405（1982）〕及びM.C．Crow ら〔M.C．Crow et al.“Human Peripheral Blood T Helper Cell-Induced B Cell Activation Results in B Cell Surface Expres sion of the CD23（BLAST-2）Antigen” Cell．Immunol. 121，99-112（1989） 〕に記載の通りにして行った。HIV−感染、抗−RNP 及び正常血清は上記の通り に獲得し、そしてウェスタンブロットのために１：250 で希釈した。ブロットは 二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲート化ヤギ抗−ヒト IgG(１：3000の希釈率)(Targo)を用いて発色させた。図５において、レーン１： 部分精製したU1snRNP 70Ｋ抗原のポリアクリルアミドゲル、70Ｋ及び60Ｋ分解生 成物を示す；レーン２−11：HIV-1 陽性ヒト血清と反応させたウェスタンブロッ トストリップ；レーン12−14：MCTD患者由来の抗−RNP 血清と反応させたウェス タンブロットストリップ；レーン15：第一抗体抜きで上記のように処理したスト リップ；及びレーン16−18：コントロールヒト血清と反応させたウェスタンブロ ットストリップ。試験した10のAIDS血清のうち、８が70Ｋと反応し、その一の血 清（レーン７）は一貫してMCTD患者由来の３つの抗−U1 RNP血清よりも強く反応 した（レーン12−14）。 ELISA とウェスタンブロットデーター（図４及び５）との組合せは、抗−U1 R NP血清とHIV-1 抗原との、及びAIDS血清とU1 RNP、そして特にU1 RNPの70Ｋ成分 との、交差反応性を実証する。定量的には、抗−U1 RNP血清が、HIV-1 ELISA に おいて、AIDS血清に対して反応性が弱いことは驚くべきことではなく、なぜなら HIV血清は非相同性エピトープ及び相同性エピトープと反応するからである。更 に、ELISA は血清の中和能の尺度ではない。中和指数は臨床試験において用いる ための予備スクリーニングドナー抗−RNP 血漿において測定されるであろう。 gp120/41と70Ｋとの間での構造相同性は当として抗−RNP 抗体と最終複合体と の交差反応性の基礎であることがこれらの研究から考察される。更に、Ｖ３に対 する抗−RNP 抗体の親和力は相互のエピトープの配列特異的認識に関与するよう である。Ｖ３ループは70Ｋに対して50％相同性であり、そして70Ｋの２つのイム ノドミナント領域セグメントを含む。Ｖ３の唯一の親水性セグメントはこの親和 性の基礎となることはできず、（前述の如く）gp41における親水相同性の数学的 な優性はＶ３に比しての長所を授けるものでないことを示す。GRAFVTIG〔SEQ ID NO：20〕配列は従って配列特異的相互作用において重要な役割を担っていなけ ればならない。 上記の分析は、高力価の抗−RNP 抗体（＞10⁷ の力価は異常ではない）が、感 染血清中で認められる抗体のそれに似たようにして HIV-1感染能を中和しうるこ とも示唆する。しかしながら、かかる相互作用の潜在的有用性がウイルス株特異 性によって制約されるであろうかの問題が生ずる。 表IVは HIV-1株IIIＢ及びMNの両者の、特定の自己免疫抗体含有血 清による中和を実証する。採用した中和（ウイルス阻害）アッセイはシンシチウ ム形成阻害試験である。このアッセイ系はP.L．Nara ら“Simple，Rapid，Quant itative，Syncytium-Forming Microassay for the Detection of Human Immunod eficiency Virus Neutralizlng Antibody”AIDS Res．Hum．Retro． 3：283-302 (1987)（引用することにより本明細書に組入れる）において詳しく記載されてい る。要約すると、ウイルス−シンシチア感受性細胞系CEM-SSを HIV-1のMN又はII IＢ株のいづれかで感染せしめ、そしてマイクロタイターウェル（ウェル当り50, 000細胞）の中で試験血清を伴って又は抜きでプレート培養する。感染は、大型 の凝集物又はシンシチアを形成する個別の細胞の融合をもたらす。形成されたシ ンシチア単位数(SFu)を顕微鏡で数える。阻害抗体抜きで形成された総数はVoで 表わす。試験抗体の存在下で形成された数はVnとする。試験抗体は１：８〜１： 64の希釈率で適用する。Vn／Voの比は抗体の阻害能力の尺度である。0.5のVn／V o値は50％の阻害、又は50％未満の SFuが観察されたことを示し、一方、１＋の 値は試験抗体により阻害がないことを示す。表IVにおいてわかる通り、抗−RNP 血清はIIIＢ及びMN株両者の有能なインヒビターであり、一方、この抗−動原体 血清はIIIＢに対してのみ有効であった。 正確な配列でなく、機能性単位が、抗体認識の強い決定基である。更に、Ｖ３ の主要中和性決定基中の保存残基は cbsにおける定常G-AF−パターンと一致した 。〔G.J．LaRosa ら“Conscrved Sequence and Structural Elements in the HI V-1 Principal Neutralizing Determinant” Science 249，932-935(1990);G.J ．LaRosa ら“Conserved Sequence and Structural Elements in the HIV-1 Pri ncipal Neutralizing Determinant：Corrections and Clarifications” Scienc e 251，811(1991)；G.J．LaRosa ら“Conserved Seq uence and Structural Elements in the HIV-1 Principal Neutralizing Determ inant：Further Clarifications”Science 253，1146（1991）〕。このデータ ー（図１及び２、並びに実施例４）は、RNA スプライシングがgp120/41複合体の 後・付加機能でありうることを示唆する。MCTD患者における抗−U1snRNP 抗体は RNA スプライシングの有能なインヒビターである〔M.R．Lemerら“Antibodies t o Small Nuclear RNAs Complexed with Proteins are Produced by Patients wi th Systemic Lupus Erythematosus”Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76，5495-549 9（1979）〕。更に、スプライシングの数多くの薬理学的インヒビター、例えば RNA自己スプライシングを阻害するものがある〔M．Hrabersら“Suppression of c-fos Precursor RNA Splicing by the Protein Kinase C Inhibitor H76〔1-( 5-isoquinolinesulphonyl)-2-methylpiperazine〕”Biochem J. 278，305-308(1 991)；U．Von Ahsenら“Antibiotic Inhibition of Group I Ribozyme Function ” Nature 353，368-370(1991)；H.F．Noller“Drugs and the RNA World”Natu re 353，302-303(1991)； een Nucleus and Cytoplasm”Nature 355,730-732(1992)〕。例示であり、限定 でない、本発明の実施において有用な RNAスプライシングインヒビターの例は、 Ｈ７〔１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラゾン〕、２−ア ミノプリン並びにアミノグリコシド抗生物質、例えば限定することなく、ゲンタ マイシン、カナマイシン及びネオマイシンである。HIV-1 のgp120/41に対するＵ１結合 抗原性 RNP粒子の RNA成分Ｕ₁ はＵ１のインビボ点滴によりgp120/41に結合で きうる。この手法は、実施例３及び４に記載の通り、二重の目的を有する。まず 、それは核のRNP 抗原についての結合活 性に基づき、gp120/41に対する抗−RNP 抗体の結合活性を高めるであろう〔A.S ．Douvas ら“Isolation and Characterization of Nuclear Ribonucleoprotein Complexes Using Human Anti-Nuclear Ribonucleoprotein Antibodies”J．Bio l．Chem. 254，3608-3616(1979)（引用することで本明細書に組入れる）〕。次 に、UV光を利用し、それは gp120のＶ３ループへのＵ１の不可逆的架橋を可能と するであろう。この処理はＶ３ループの機能を破綻するのみならず、以下に説明 の通り、隣のＶ４ループにおけるCD４結合部位もふさぐであろう。この手法の可 能性はU1-cbs相互作用のいくつかの公知の特性に基づく。Hammら由来の全Ｕ１分 子を図８Ａ〔SEQ ID NO：55〕に示す〔J．Hamm ら“Loop I of U1 Small Nuclea r RNA is the only Essential RNA Sequence for Binding of Specific U1 Smal l Nuclera Ribonucleoprotein Particle Proteins”Mol．Cell Biol． 8，4187- 4791(1988)〕。Ｕ１−結合分子のcbs(図２に示す)は図８Ｂに示すＵ１分子の特 定部、ステム−ループＩと反応する。 gp120/41のＶ３領域に対するU1 RNA及び誘導体の結合及び架橋は、Ｖ４におけ るCD４結合部位にかぶさり、且つふさぐものと期待される。この予測はＵ１と g p120との相対サイズに基づく。U1snRNP は電子顕微鏡により11〜15nm（長さ）× 11〜12nm（幅）の寸法を有することが見積られている〔B．Kastnerら“Electron Microscopy of U1 Small Nuclear Ribonucleoprotein Particles：Shape of th e Particle and Position of the 5 ′RNA Terminus”EMBO J． 8,227-286(1989 )〕。これらの寸法の半分のみが RNA骨格に基づくものと仮定すると、Ｕ１につ いては約６nmの寸法が見込まれ、それに比べて全球状 gp120については８〜10nm である〔D.J．Thomasら“gp160，the Envelope Glycoprotein of Human Immunod eficiency Virus Type 1，Is a Dimer of 125-Kilodalton Subunits Stabilized Through Interactions Between Their gp41 Domains”J．Virol. 65，3797-380 3（1991）〕。即ち、以上のデーターに基づき、Ｕ１はＶ３とＶ４との間のかな り短めの距離において広がっているであろうことが予測されうる（図１参照）。 同様に、Ｖ３に結合した抗−RNP 抗体はCD４結合部位をふさぐ傾向にある。二 価のIgG における抗原性結合部位間の距離は14〜15nmである。更に、抗−RNP 抗 体はgp120/41のみに結合することが予想されるが（図４及び５）、RNA 成分があ るとき、それらの抗体は結合するのみならず、多量複合体を架橋する。即ち、UI -gp120/41 の複合体は、gp120/41単独よりもインビボでより有効に中和される傾 向にある。 gp120/41の付加及び融合機能に及ぼすそのネガティブな作用に加えて、Ｕ１の 共有結合はgp120/41の任意の後・付加機能を中和するようである。gp120/41につ いての後・付加機能はインビトロ研究〔Habeshawら、前掲〕により強く裏付けさ れているが、その正確な機能はわかっていない。本明細書に示すデーターは、こ の機能が、ウイルス及びホスト細胞増殖にとって不可欠な RNAスプライシングに 関与することを示唆している。即ち、RNA スプライシングインヒビターは抗ウイ ルス剤として利用されうる。HIV-1 感染症のための治療的手法 ヒト対象体における HIV-1感染症を処置するために単独で、又は組合されて利 用されうる５通りの基本的な手法がある。第一に、自己免疫ヒト抗−RNP 抗体、 その他の特異性（例えは抗動原体）もしくは複合特異性のヒト自己抗体、又は工 学的に誘導された抗体であって RNP−相同性エピトープ又は RNP−関連メカニズ ム及び機能（例えばスプライシング）を標的とする抗体を包括する免疫治療が利 用できる。第二に、U1 RNA、そのフラグメント、又はＵ１とタンパ ク質との相互作用を擬態するもしくは向上させるようにデザインされた類似体の 利用を包括する治療が利用できる。第三に、ホストの構造体に対するgp120/41の 付加及び融合をさえぎる、架橋する及び何らかの方法で排除することを狙いとす るRNA 成分を、ウイルス感染力を低めるために利用できる。第四に、ホトレジス ト、レーザー光源等の利用により誘導されるUV光の利用、又はその他架橋手法を 包括する治療は、抗体及び／又はRNA 類似体とウイルスとの複合体の安定化を目 的とすることができる。第五に、ウイルス機能を妨げるRNA スプライシングの薬 理学的インヒビターの利用を包括する治療が利用できる。 免疫治療−SRD 自己抗体（これはプラズマフェレーシスによりスクリーン済ド ナーから獲得できるであろう）の利用に加えて、RNP エピトープに（融合タンパ ク質として開発された免疫原又は免疫原性ペプチド）対する全身又はネズミモノ クローナル抗体のいづれかを作ることが可能である〔C.S．Surowy ら“Direct， Sequence-Specific Binding of the Human U1-70K Ribonucleoprotein Antigen Potein to Loop I of U1 Small Nuclear RNA” Mol．Cell．Biol. 9，4179-4186 (1989)；Query ら、前掲(1989)；C.C．Queryら“A Specific 31-Nucleotide Dom ain of U1 RNA Directly Interacts with the 70K Small Nuclear Ribonucleopr otein Component”Mol．Cell Biol． 9，4872-4881(1989)；Reuterら、前掲(198 6)，（全て、引用することで本明細書に組入れる）〕。いくつかの有用な、ネズ ミモノクローナル抗体の改良手法は、ウイルス感染能を最大に損わしめる、治療 的相互作用の特異性を高める、並びに非自己抗体の導入により生ずるアナフィラ キシー及びその他の合併症を軽減する狙いを成就せしめる。 これらの改良には触媒性抗体の利用が含まれる。その潜在的な利 用には、限定することなく、以下のものが含まれる：Ｖ３ループに対する共有（ 不可逆性）結合形成の触媒；抗体による認識性を高める又は機能を損わしめる目 的のための、ポリヌクレオチド、特にＵ１のＶ３に対するリゲーション；gp120/ 41複合体のＶ３ループ又はその他の部分の加水分解；親水性エピトープと最大限 に反応するであろう求電子基の導入；並びにスプライシングインヒビターの輸送 〔K.M．Shoatら、“Catalytic Antibodies”Methods Enzymol. 203，327-351(19 91)；D．Hilvertら“Antibody Catalysis of Concerted，Carbon-Carbon Bond- Forming Reactions”Methods Enzymol. 203，352-369(1991)；S.K．Dowerら“Ph osphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Probes for the Combining Site of the Myeloma Protein M315”Biochem 18，3668-3674(1979)；K.D．Janda ら“B ait and Switch Strategy for Obtaining Catalytic Antibodies with Acyl-Tra nsfer Capabilities”J．Am．Chem. Soc．112，1274-1277(1990)(全て引用する ことで本明細書に組入れる)〕。触媒基は確立された手順、例えば選択的化学修 飾、部位特異的突然変異誘発又は遺伝子選別もしくはスクリーリングにより抗体 に導入することができる〔Shoat ら、前掲；Hilvert ら前掲（共に引用すること で本明細書に組入れる）〕。 その他の有用な改良は抗親和性Fv及び sFvの利用が含まれる。抗体の可変領域 （Ｖ_H ，Ｖ_L ）のみより成るヘテロダイマーはネズミアイソタイプに対するヒト の反応を最少限とするよう組換及びモノクローナル抗体技術により作られうる〔 J.S．Huston ら“Protein Engineering of Antibody Binding Sites：Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produce d in Escherichia coli”Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85，5879-5883(1988)；M .S．Tai ら“A Bifunctional Fusion Protein Contain ing Fc-Binding Fragment B of Staphyloccocal Protein A Amino Terminal to Antidigoxin Single-Chain Fv”Biochem 29，8024-8030（1990）〕。フラグメ ント（Fv）は向上した生体分布速度の利点を有する〔J.S．Huston ら“Protein Engineering of Single-Chain Fv Analogs and Fusion Proteins”Methods Enzy mol. 203，46-88(1991)〕。軽鎖及び可変領域は一本鎖としても生産され、そし て細菌宿主の中で発現される〔S．Johnsonら“Construction of single-Chain F v Derivatives of Monoclonal Antibodies and Their Production in Escherich ia coli ”Methods Enzymol. 203，88-98(1991)〕。高親和性抗原結合部位を操作 する能力に加えて、この技術は sFvを他のエフェクター機能と組合せることを可 能にする〔R．Glockshuberら“A Comparison of Strategies To Stabilize Immu noglobulin Fv-Fragments”Biochem. 29，1362-1367（1990）〕。 その他の有用な改良には、ネズミのヒトアイソトープとの変換が含まれる。ネ ズミアイソトープに対するアレルギー反応を最小とするには、キメラ抗体を作る 〔D．Gussow ら、“Humanization of Monoclonal Antibodies”Method Enzymol. 203 ，99-120(1991)〕。又はネズミ相補決定領域(CDR)のヒトフレームワーク配 列への挿入〔P.T．Jonesら“Replacing the Complementarity-Determining Regl ons in a Human Antibody with Those From a Mouse”Nature 321，522-525(198 6)；L．Riechmannら“Reshaping Human AntibodiesFor Therapy” Nature 332， 323-327(1988)〕が含まれる。しかしながら、アレルギー反応は HIV-1感染症を 有する患者を処置するうえでの重大な問題としてはあがっておらず、その理由は それらの特異的抗原に応答する能力の低さにある。 更なる有用な改良は表層gp120/41に対する共有付加のためのリガンドを伴う抗 体の利用を包括する。共有リガンド（光活性化架橋剤 を含む）は確立された技術、例えば前述の如くの化学修飾又は遺伝子操作を利用 して一体化できる。光化学架橋は以下の通りUV光を用いてインビボで実施できる 。U1 RNA、そのフラグメント及び類似体−Ｔ７又はSP6 RNA ポリメラーゼプロモ ーターのいづれかが５′末端にフランクしている且つ３′末端に制限エンドヌク レアーゼ部位がフランクしている組換U1 DNAを用いることにより、治療用途のた めにグラム量のＵ１を作ることが可能である〔Merrill ら、前掲(1988)；Hammら 、前掲(1988)；Surowyら、前掲；Query ら、前掲(1989)；Query ら、前掲(1989) ；J.R．Patton ら“Reconstitution of the U1 Small Nuclear Ribonucleoprote in Paricle” Mol．Cell．Biol. 7，4030-4037(1987)；C．Lutz-Freyermuthら“ Quantitative Determination that One of Two Potential RNA-Binding Domains of the A Protein Component of the U1 Small Nuclear Ribonucle oprotein C omplex Binds with High Affinity to Stem-LoopII of U1 RNA”Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 87，6393-6397(1990)；W.Boelens ら“Analysis of In Vitro Bin ding of U1-A Protein Mutants to U1snRNA”Nuc．Acid Res. 19，4611-4618（1 991）〕。 更に、制限酵素及び／又は部位特異的突然変異誘発の選択的利用により、分子 の望ましくない領域を排除することが可能である〔Merrillら、前掲(1984)；Ham mら、前掲(1988)；Surowyら、前掲；Query ら、前掲(1989)；Query ら、前掲(19 89)；Pattonら、前掲；Lutz-Freyermuth ら、前掲〕。 同様に、Ｖ３ループに存在するcbs に対するＵ１のループＩの高い親和力は、 サーキュレーションにおいて結合を形成させる。さらに、本明細書中上記のよう に、この親和力は、一部cbs 中のフェニルアラニン基によって、cbs とループＩ との間の迅速且つ特異的な架橋を促進する（実施例４を参照のこと）。架橋は、 UV光を使用す る方法及び／又は合成の際に RNAリガンド中に反応性化学基を導入する方法をは じめとする確立されている技法によって達成することができる。抗体と RNAの組合せ 抗 RNA抗体と RNAの両方を使用することによって得られる利点は本明細書中既 に既述した。これらは、RNA とタンパク質との複合体に対するヒト抗 RNA抗体の 高い結合活性、並びに不活化ウイルス表面基の大きな凝集体の架橋及び形成のし やすさが増大することに関係がある。さらに、この方法によって３種類の架橋標 的：RNA に対する抗体、gp120/41に対するRNA 及びgp120/41に対する抗体、が得 られる。UV架橋 上記の標的を不可逆的に架橋することによって感染性ウイルス表面基を不可逆 的に不活化することができる。化学的架橋の他、常用の254nm のUV光を比較的少 ない線量で使用することによっても不活化することができる（実施例４を参照の こと）〔上記 Merrillら(1988)、上記 Merrillら(1984)、上記 Woppmanら〕。 リンパ腫に対して承認されている処置法であるフォトフォレシスによって人体 に十分量の輻射線を供与することができ、強皮症患者の治療に用いられている。 常用の方法では架橋剤として薬物メトキサレンが用いられる。他の可能性として レーザー源由来の単色UV光を使用する方法がある〔J.W．Hockensmithら、「Lase r Cross-Linking of Nucleic Acids to Proteins」、J．Biol．Chem.，261，351 2-3518（1986）〕。（治療薬が浸出されている）血液のUV照射は生体外で行われ る。フォトフォレシスの通常の副作用については確立されている。RNA スプライシングインヒビター gp120/41複合体に関連して起こりうるスプライシング作用については先に記載 した。インビトロでのgp160/120/41に対するU1 RNAの結合は、そのような相互作 用が細胞内のウイルスとホスト細胞 RNAとの間で起こりうることを示唆している 。これら薬剤のデリバリーを最適化するための方策及びそれらとウイルス成分と の相互作用は先に記載したものと同様であり、デリバリーシステムとして抗体を 使用する方法や、架橋して相互作用を不可逆的にさせる方法が含まれる。ICV 感染を処置するための治療方策 自然抗原からの免疫原の調製 A.S．Douvas ら〔A.S．Douvas ら「Isolation and Characterization of Nucl ear Ribonucleoprotein Complexes Using Human Anti-Nuclear Ribonucleoprote in Antibodies」J．Biol．Chem.，254, 3608-3616（1979）〕及び上記Farnshaw らにより記載されているように、U1snRNA やCENP-Bをはじめとする自然抗原を動 物細胞から単離することができる。CENP-Bの酸性ドメインや70ＫのRDRDRDR 〔配 列番号１〕交互ドメインをはじめとする個々の抗原の親水性ドメインを単離する ために〔H．Theissen ら「Cloning of the Human cDNA for the U1 RNA-Associa ted 70K Protein」EMBO J．5，3209，3217(1986)〕、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR )によって対応するcDNAを生成させた後にそれらをE．Coli において発現させる ための重複発現ベクターpDIP19中に挿入する方法を採用することができる〔B. S inger ら「Phage T4 Expression Vector：Protection From Proteolysis」Gene 106，1-6(1991)〕。このようにして調製されたCENP-Bドメイン１はELISA によっ て抗セントロメア抗体と反応する。免疫治療のための抗体 HIV-1 感染（上記）に特異的な免疫治療の場合におけるように、 HIV-1，HSV-1，CMV，EB-V、その他関連ある相助ウイルスに対して相同性のある エピトープと反応するSRD 自己抗体をプラズマフォレシスによって得ることがで き、また個別に若しくは混合物として使用することができる。上記のように自然 抗原や組換え抗原を使用してモノクローナル抗体や組換え抗体を調製することが できる。親水性エピトープとの相互作用にとって特に重要な変性として、抗原結 合部位への電子親和性基の導入が挙げられる。 本発明は、付随の実施例を参照することによってさらによく理解されうるが、 これらは例示を目的としたものにすぎず、添付の請求の範囲において規定した本 発明の範囲をいかようにも限定するものではない。 実施例実施例１：ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸及びポリアルギニンに対する 抗セントロメア及び対照血清の交差反応性のELISA 比較 HIV-1，HSV-1及びCMV の相同部をCENP-Bの二つの極端に親水性のドメイン並び に70Ｋ及びSc１−70における親水性配列に密集させた。これらの親水性ドメイン と反応する自己抗体が他のポリペプチド中に存在する同様な親水性配列と交差反 応するであろうという予測は、第７Ａ図に示したELISA データによって裏付けら れた。第７Ａ図では、先に記載したように、間接免疫蛍光による血清陽性に対し て強皮症患者からの抗セントロメア血清（CN−１，２及び３）を予備スクリーニ ングした〔A.S．Douvas ら「Isolation and Characterization of Nuclear Ribo nucleoprotein Complexes Using Human Anti-Nuclear Ribonucleoprotein Antib odies」J．Biol．Chem.，254，3608-3616（1979）〕。正常の血清（NL−１及び ２）は抗核抗 体陰性であった。どの血清も１：1000の係数で希釈した。ポリアミノ酸(Sigma) を10mMトリス−HCl 緩衝液、0.15Ｍ NaCl、pH7.4 に１μｇ／μｌの濃度で溶解 した。実施例１について先に記載したELISA を実施した。記号P-Asp，P-Glu，P- Arg 及びP-Lys はそれぞれポリアミノ酸基質のアスパラギン酸、グルタミン酸、 アルギニン及びリジンを示す。３種類のセントロメア血清のすべて及び抗Sc１− 70血清の両方は、２種の正常の対照よりもポリ−Glu 、ポリ−Asp 及びポリ−Ly s に対して高い反応性を示したが、一つの対照はポリ−Arg と実質的に反応した 。この反応は、予測されたように、SRD 自己抗体のスペクトル中にある親水性抗 原に対する別種の反応が与えられた。第７Ｂ図は、P-Asp，P-Glu，P-Arg 及びP- Lys に対する４種の抗−U1snRNP 血清(RNP１〜４)の反応性を示すものである。 ４種すべての基質に対するRNP 血清の反応性は対照よりも高いが、これらの血清 は、第７Ａ図の抗セントロメア及び抗Sc１−70血清よりもアルギニンの方に選択 性を示す。これは、70Ｋにおける親水性モチーフ中のアルギニンが優勢であるこ とを示す（表２及び表３を参照のこと）。第７Ａ及びＢ図に示された反応の多様 性は、ウイルスの親水性エピトープが純粋に酸性であるか又は酸性と塩基性の混 合体であることができる場合には提案した治療法において有益である〔A．Douva s ら「Multiple Overlapping Homologies Between Two Rheumatoid Antigens an d Immunosuppressive Viruses」Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88，6328-6332（1 991）〕。それゆえ、SRD 血清を所望の反応性スペクトルに対してスクリーニン グすることができる。次いで、適当な混合物を選定して興味あるエピトープを標 的にすることができる。この方法は、個々のウイルス感染に対処するのみならず 、相乗性の複数ウイルスに対処する上でも効果的である。実施例２：HSV-1 感染細胞に対する抗RNP 及び対照血清の交差反応性のELISA 比 較 自然抗原と HSV-1との間に配列相同領域が存在するものとして、抗 RNP抗体を 含有する血清を、HSV-1 感染細胞との交差反応性について試験し、そして HSV-1 に対する反応性の高いものと低いもの(それぞれHSV(＋)及びHSV(−))に対してそ れぞれ予備選択された血清に対する反応性を比較した。NLとして名付けた血清は 実験室の不特定の人間から採取した。第６図は、ELISA によって感染ベロ細胞の 抽出物に対してアッセイした場合に抗U1 RNP血清とHSV-1 抗原との間の高い交差 反応性を示している。どの血清もリン酸緩衝化塩化ナトリウム(PBS)、pH7.5 、0 .1％ウシ血清アルブミン(BSA)に１：1000で希釈した。ELISA は、M.K．Crow ら 〔上記M.K．Crowら〕の方法に従い、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヒ トIgG(Tago）を第二抗体（希釈率１：3000）として、またｏ−フェニルジアミド 二塩酸塩(Sigma)を基質として使用し実施した。光学濃度はELISA 自動読取り装 置を用い 490nmで読み取った。感染されていないベロ細胞抽出物に対しては同様 の高い反応性は認められなかった。このことは、核自己抗原中のエピトープに対 して相同性であるウイルスが対応する自己抗体と交差反応する証拠である。実施例３：U1 RNA及びステム−ループ１ 第８Ａ図は、完全なＵ１分子を示し、また第８Ｂ図はＵ１のステム−ループ１ 領域を示すものである。数字は、70Ｋ結合親和性を評価するために用いられたヌ クレオチドの変異位置を示す。結合は配列特異的であり、ループ自体における15 塩基よりも少ない数を必要とする。この特性は、Ｕ１のフラグメント及び分子そ のままを治療剤として使用するという提案に基づくものである。この相互作用の 親和力は高いので、低いエネルギーレベルのUV光を使用して cbsを この頂点に非常に特異的に架橋させることができる〔上記Merrillら(1988)、上 記Merrillら(1984)、上記Woppmanら（本明細書では参照することによってこれら すべてを取り入れたこととする）〕。実施例４：UlsnRNA 転写体へのgp160 及びgp120/41の結合 gp120 が cbsを有する場合、一連の結合実験を、アガロースゲル電気泳動を用 いて、UV架橋を伴って及び伴わないでgp120/41及びＵ１により実施し、未反応Ｕ １から堅く結合された複合体を分離する（図９）。 図９は、制限エンドヌクレアーゼ RsaＩにより切断され、次にJ.V．Maizel et al.〔J.V．Maizel et al.“Enbanced Graphic Matrix Analysis of Nucleic Ac id and Protein Sequences”Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78，7665〜7669（198 1）〕により記載されるように転写され、1.8キロ塩基(kb)、0.9kb及び0.75kbの ３種のRNA 転写体を生成する。Ｔ７プロモーター及びU1 DNAを含む組換えプラス ミドpGEM-3Zf(＋)(Promega)を示す。支持体フラグメントの分析は、1.8kbの転写 体を生成する最長のもののみがＵ１配列を含むことを示す。gp120/41に一部加水 分解された高度に精製されたgp160は製造業者から得られた。約１μｇの RNA転 写体を合計量30μｌのTE緩衝液(pH8.0)（参照文献５３に記載されるようにトリ ス−EDTA）において３μｇのgp160/120/41と共に混合し、そして37℃で12分間イ ンキュベートした。照射されるべきサンプルを成形されたPara−フィルムに置き 、次にStratalinker 1800UV 架橋剤（Stratagene，CA）を用いて氷上で20mJ／mm² のUV光(254nm)にゆだねた。アガロースゲル電気泳動(1.5％)を、J．Shamroch et al．〔J．Shambrook et al．“Molecular Cloning”(Cold spring Harbor La boratory Press 2nd Ed.（1989）〕により記載されるようにして実施した。 図９のパネルＡは、照射を行なわないでのgp160/120/41による R NA転写体の滴定を示す。レーン１：１kbの DNAラダーマーカー；レーン２：1.8 ，0.9及び0.75kbの RNA転写体：レーン３〜６：それぞれ 0.5，1.0，2.5及び 3. 5μｌのgp160/120/41と共にインキュベートされたレーン２と同じ３種の転写体 。 図10のパネルＢは、RNA 及びgp160/120/41の混合物のUV照射を示す。レーン１ ：kbマーカー：レーン２及び３：それぞれ照射されていない及び照射されたRNA 転写体；レーン４：3.5μｌのgp160/120/41と共にインキュベートされ、次に上 記のように照射された転写体混合物。 gp120/41と共に複合体を形成したＵ１はより遅く移動し、そして従って、ゲル の上部に接近するように見える。図９Ａ、レーン２は組換えベクターの３種の R NA転写体を示し、この最良の転写体(1.8kb)のみがＵ１を含む。gp120/41前駆体g p160 によるこの調製物の滴定は、この転写体（レーン３〜６）の移動度の主な シフトをもたらしたが、しかし0.90及び0.75kbの転写体においてはそのシフトは 存在しなかった。その相互作用の特異性は図９Ｂにさらに例示されており、ここ でUV光が複合体を共有結合するために使用された。レーン２及び３の比較（それ ぞれUVを伴って及び伴わないで）は、UV光のみでは転写体を架橋せず、そして従 って転写体の移動性に影響を及ぼさないことを示す。レーン４は、gp160 の添加 及びUV光による照射の効果を示す。パネルＡのレーン５及び６におけるように、 長い転写体（及びこの転写体のみ）が gp160との共有複合体を形成する。gp160 がUV光を伴って及び伴わないでU1 RNA配列と共にインビトロで複合体を形成する 例示は、このアプローチを用いてのインビボでの技法の基礎を形成する。実施例５：抗−RNP 抗体の高力価を有するHIV-1 感染患者におけるAIDS耐性 免疫感染性クラスターウイルスの処置における抗−RNP 抗体の利用性の追加の 支持は硬化症の診断、循環性抗−RNP 抗体の高い力価及び1986年のころのHIV(＋ )に対する血清転換への暴露による個人（この後、“Mr．Ｍ”と称す）の評価に より提供される。 1982年、1981年９月10日付け血液バンク検体を、抗−RNP 抗体についての評価 のためにMr．Ｍから得た（データは下記に示される）。続いて、彼はひじょうに まれではあるが、追跡され、そして HIV-1に暴露されていることが示された。彼 の臨床事例は、彼の暴露の年代に関連して HIV疾患について論ぜられる。 （１）臨床事例 Mr．Ｍは、ゲイライフスタイルを有する41才の白人男性である。Mr．Ｍは12才 で、JRA(少年リウマチ株関節炎)及び硬化症の同時開始したものとして診断され た。彼は、Mayo Clinicで高い用量のASA(アスピリン)により処置された。JRA は 16才で明らかに活性が止まったが、しかし硬化症は特に手において変化し；彼の 現在の臨床経過の一部として続いている。 1981年９月、血清サンプルを採取した。サンプルを1982年８月に分析し、そし て高い力価の抗−RNP 抗体を含むことが見出された。 Mr．Ｍはほぼ1986年に HIVと接触があった。1986年７月での彼のチャートでの表 示は、拡散アデノパーシーの状態を示し、そして HIV試験が推薦されることを示 す。彼は HIVについて1987年６月に試験され、そして陽性であることが報告され ている。その試験は１年後にくり返され、そして彼はHIV(＋)であることが確認 された。 過去の病歴：ムンプス、はしか、水痘。 家族の病歴：５人の子孫（４人の兄弟）、すべて健康。母は多発性骨髄腫で死亡 した（1990）。父、祖父母は生存しており、すべて健康である。 社会的な歴史：ゲイライフスタイル。ミネソタで生長し、そして大学にかよう。 1978年カリフォルニアに移る。物質の乱用、しかし静脈用薬物の使用は否定する 。 （２）臨床経路 （ａ）結合組織疾患−Raynaud の手及び足に現れた硬化症、強指症、小口症、 制限的な肺疾患（肺機能試験による）及び食道／GI徴候及び症候（esoph．manom etry，1983）。また、1981年前のリンパ疾患を伴ってのSjogren's 症候群。 （ｉ）1981年検体ANA(＋)の実験分析（抗−RNP抗体に適合するパターンを伴っ ての免疫螢光による抗核抗体試験）。１：10の希釈度対 U1snRNP基質でのDD（二 重拡散）による1981年での抗−RNP(＋)。1981年での RIAによる抗−Scl-70（− ）。 （ii）それぞれIF（免疫螢光）による1992年の血液検体ANA(＋)及び抗70Ｋに ついてのウェスターンブロット（＋）の実験分析。 （ｂ）HIV 疾患−1986年に示されたARC(AIDS−関連合併症)に調和した拡散リ ンパ節疾患。HIV(＋)，1987；1988年に確認された。過去６年、AIDS−関連症候 群は報告されなかった。彼は、 1.5年間、 100mgのZDV，TID及び 100mgのAcyclo vir，TIDの予防薬を受けた。関連する実験は次の通りである： 1987，1988 1988年10月 HIV-1(+) WBC 7.0 CD4+T 細胞545(細胞/mm³)CD4/CD8 0.29 1987 WBC 6.1 1989 CD4+T 細胞504(細胞/mm³)(25％，WBC 8.4 低 nl ) CD4+T 細胞543(細胞/mm³)CD4/CD8 0.3 CD4/CD8 0.8(低nl) 合計リンパ計数、2015(nl);合計のT,1991 62％（nl） WBC 7.3 HSV Ｉ IgG-neg CD4+T 細胞565(細胞/mm³)CD4/CD8 0.27 HSV II IgG-neg p24コアag(-) CMV IgG-neg 1988年４月 WBC 6.8 CD4+T 細胞396(細胞/mm³) CD4/CD8 0.38(低い) 図10は、Mr．Ｍの1981及び1992年の血清検体及び対照のHIV(＋)及びHIV(−)血 清のウェスターンブロットを示す。図10に示されるウェスターンブロットは、Or ganon Teknika キットを用いて行なわれた。すべての血清は、供給者により示さ れるように１：50の希釈度で試験された。レーン１〜12、HIV(＋)血清が対照の ために含まれた。Organon Teknika からのレーン13〜15、高及び低 HIV血清及び 負の対照のために含まれた。レーン16及び17はそれぞれMr．Ｍの1981年及び1992 年の検体であった。レーン18〜20は負の対照である。 図10は、Mr．Ｍの1981年及び1992年度の検体の HIVウェスターン ブロットでの反応性を示す（レーン16及び17）。1981年度（上記）における高い 抗−RNP 反応性にもかかわらず、Mr．Ｍは HIV陰性であることがわかっており、 これはさらに、抗−RNP 血清が ELISAにより誤った陽性を付与するが、しかしウ ェスターンブロットによって付与しないことを示す。 （３）分析 Mr．Ｍは、日和見性感染、カポシカ肉腫又はリンパ腫疾患の欠乏に基づいてAI DS−フリーとして定義できる。彼は、少なくとも７年間、血清陽性であった。彼 のHIV(＋)状態の初めの 3.5年間の予防処置の欠乏は、進行性AIDSのためには比 較的良好でない予後徴候である。しかしながら、AIDSのための診断基準の欠乏の 他には、彼は気分は良好であると報告しており、但し、彼の硬化症に関連する硬 直及び苦痛を除く。実験試験は、次の危険評価と適合する： （ａ）予後徴候感性のための危険性：低い、 500以上のCD４＋Ｔ細胞計数に基 づく。 （ｂ）AIDSへの進行のための危険性の分析は、ゲイに関連して、血清陰性グル ープとして定義された相対的危険指数に基づかれる。このグループに等しい相対 的危険性は１の値を有する。この研究における最とも信頼できる予後因子は、CD ４（＋）Ｔ細胞計数であった。この基準に基づくMr．Ｍの相対的危険性は次の通 りである： CD４（＋）Ｔ細胞の数 1.0 合計リンパ球の％ 2.8 CD８（＋）Ｔ細胞の数 1.1 CD４／CD８ 3.6 p24 1.0 血清陰性 SRD患者はまた、異常なＴ細胞計数及びCD４／CD８比を有することが 示されるはずである。従って、Mr．Ｍの場合、％リン パ球及びCD４／CD８比に関連しての比較的高い危険性は、AIDS危険性の予後では ないかも知れない。 この分析、及び日和性病原体及び陰性ｐ24抗原についての負のスクリーニング 試験に基づけば、血清陽性の５年後、Mr．Ｍの場合は、防護された楽観主義の１ つである。過去７年間にわたっての彼の実験パラメーターの安定性は、特に初め の 3.5年間、処理されなかったので、励みになるものである。本発明の基本的な 新規特徴が示され、そして記載されて来たが、種々の形で削除、置換及び変更が 本発明の範囲内で行なわれ得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アーレスマン，グレン アメリカ合衆国，カリフォルニア 91101, アルタディナ，メドゥブルック ロード 1941

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトにおける免疫感染性クラスター・ウイルス感染の治療方法であって、 その免疫感染性クラスター・ウイルスに感染した患者に、全身性リウマチ失調を 患った患者により産生された自己抗体の特性を示す抗体をもつ少なくとも１の個 体から単離した血清又は血漿の薬理学的有効量を投与することを含んで成るよう な方法。 ２．全身性リウマチ失調が、混合結合組織失調疾患、硬皮症、全身性紅斑性狼 瘡、及び自己免疫甲状腺失調から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 ３．免疫感染性クラスター・ウイルスが、 HIV-1、免疫感染性アデノウイルス 、ヒト白血病レトロウイルス、風疹ウイルス、 CMV、及び EBVから成る群から選 ばれる、請求項１に記載の方法。 ４．ヒトにおける免疫感染性クラスター・ウイルス感染の治療方法であって、 その免疫感染性クラスター・ウイルスに感染した患者に、全身性リウマチ失調を 患った患者により産生された自己抗体の特性を示す抗体をもつ少なくとも１の個 体の血清又は血漿から単離した抗体断の薬理学的有効量を投与することを含んで 成るような方法。 ５．全身性リウマチ失調が、混合結合組織失調疾患、硬皮症、全身性紅斑性狼 瘡、及び自己免疫甲状腺失調から成る群から選ばれる、請求項４に記載の方法。 ６．免疫感染性クラスター・ウイルスが、 HIV-1、免疫感染性アデノウイルス 、ヒト白血病レトロウイルス、風疹ウイルス、 CMV、及び EBVから成る群から選 ばれる、請求項４に記載の方法。 ７．ヒトにおける免疫感染性クラスター・ウイルス感染の治療方法であって、 その免疫感染性クラスター・ウイルスに感染した患者 に、モノクロナール抗体又はモノクロナール抗体のコレクションの薬理学的有効 量を投与することを含んで成り、そのモノクロナール抗体が、全身性リウマチ失 調を患った患者により産生された自己抗体の特性を示す抗体をもつ少なくとも１ の個体により産生された自己免疫抗体により認識されるエピトープを認識するこ とを特徴とする方法。 ８．全身性リウマチ失調が、混合結合組織、硬皮症、全身性紅斑性狼瘡、及び 自己免疫甲状腺失調から成る群から選ばれる、請求項７に記載の方法。 ９．全身性リウマチ失調が、混合結合組織失調、硬皮症及び全身性紅斑性狼瘡 から成る群から選ばれる、請求項８に記載の方法。 10．モノクロナール抗体が、抗−U1 sn RNP モノクロナール抗体である、請求 項９に記載の方法。 11．抗−U1 sn RNP モノクロナール抗体が、抗−70Ｋモノクロナール抗体であ る、請求項10に記載の方法。 12．抗−70Ｋモノクロナール抗体が、親水性エピトープに対して向けられてい る、請求項11に記載の方法。 13．親水性エピトープが、 RDRDRDR〔配列番号１〕と RERRR〔配列番号13〕モ ティーフから成る群から選ばれる、請求項12に記載の方法。 14．免疫感染性クラスター・ウイルスが、 HIV-1ウイルスである、請求項12に 記載の方法。 15．抗−70Ｋ抗体が、 HIV-1ウイルスの gp120／41エンベロープ糖タンパク質 のＶ₃ 領域と交差反応する、請求項14に記載の方法。 16．抗−U1 sn RNP 抗体が、抗U1 RNA cbs抗体である、請求項10に記載の方法 。 17．免疫感染性クラスター・ウイルスが、 HIV-1ウイルスである 、請求項16に記載の方法。 18．全身性リウマチ失調が、硬皮症である、請求項９に記載の方法。 19．抗体が、抗−セントロメア抗体である、請求項18に記載の方法。 20．抗−セントロメア抗体が、抗CENP-B抗体である、請求項19に記載の方法。 21．抗−CENP-B抗体が、親水性エピトープに対して向けられている、請求項20 に記載の方法。 22．親水性エピトープが、EDDEE〔配列番号16〕モティーフである、請求項21 に記載の方法。 23．抗体が、抗−Scl-70抗体である、請求項18に記載の方法。 24．抗−Scl-70抗体が、親水性エピトープに対して向けられている、請求項23 に記載の方法。 25．全身性リウマチ失調が、自己免疫甲状腺失調である、請求項８に記載の方 法。 26．自己免疫甲状腺失調が、橋本甲状腺炎とグレーヴズ病から成る群から選ば れる、請求項25に記載の方法。 27．抗体が、抗−TPO 抗体である、請求項26に記載の方法。 28．抗−TPO 抗体が、親水性エピトープに対して向けられている、請求項27に 記載の方法。 29．抗体が、抗−サイログロブリン抗体である、請求項26に記載の方法。 30．抗−サイログロブリン抗体が、親水性エピトープに対して向けられている 、請求項29に記載の方法。 31．抗体が、紫外光により免疫感染性クラスター・ウイルスに架橋される、請 求項１に記載の方法。 32．モノクロナール抗体又はその断片であって、そのモノクロナール抗体又は 断片が、全身性リウマチ失調を患った患者により産生される自己抗体の特性を示 す抗体をもつ個体により産生された自己免疫抗体により認識されたエピトープを 認識し、そして免疫感染性クラスター・ウイルス上のエピトープと交差反応する 、ことを特徴とするモノクロナール抗体又はその断片。 33．全身性リウマチ失調が、混合結合組織疾患、硬皮症、全身性紅斑性狼瘡、 及び自己免疫甲状腺失調から成る群から選ばれる、請求項31に記載のモノクロナ ール抗体又はその断片。 34．全身性リウマチ失調が、混合結合組織失調、硬皮症及び全身性紅斑性狼瘡 から成る群から選ばれる、請求項32に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 35．モノクロナール抗体又はその断片が、抗−U1 sn RNP モノクロナール抗体 又はその断片である、請求項34に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 36．抗−U1 sn RNP モノクロナール抗体又はその断片が、抗−70Ｋモノクロナ ール抗体又はその断片である、請求項35に記載のモノクロナール抗体又はその断 片。 37．抗−70Ｋモノクロナール抗体又はその断片が、親水性エピトープに対して 向けられている、請求項36に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 38．親水性エピトープが、 RDRDRDR〔配列番号１〕配列及び RERRR〔配列番号 13〕モティーフから成る群から選ばれる、請求項37に記載のモノクロナール抗体 又はその断片。 39．免疫感染性クラスター・ウイルスが、 HIV-1ウイルスである、請求項37に 記載のモノクロナール抗体又はその断片。 40．抗−70Ｋモノクロナール抗体又はその断片が、 HIV-1ウイル スの gp120／41エンベロープ糖タンパク質のＶ₃ 領域と交差反応する、請求項39 に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 41．抗−U1 sn RNP モノクロナール抗体又はその断片が、抗−U1 RNA cbsモノ クロナール抗体又はその断片である、請求項35に記載のモノクロナール抗体又は その断片。 42．免疫感染性クラスター・ウイルスが HIV-1ウイルスである、請求項41に記 載のモノクロナール抗体又はその断片。 43．全身性リウマチ失調が、硬皮症である、請求項34に記載のモノクロナール 抗体又はその断片。 44．モノクロナール抗体又はその断片が、抗−セントロメア・モノクロナール 抗体又はその断片である、請求項43に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 45．抗−セントロメア・モノクロナール抗体又はその断片が、抗−CENP-Bモノ クロナール抗体又はその断片である、請求項44に記載のモノクロナール抗体又は その断片。 46．抗−CENP-Bモノクロナール抗体又はその断片が、親水性エピトープに対し て向けられている、請求項45に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 47．親水性エピトープが、 EDDEE〔配列番号16〕モティーフである、請求項46 に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 48．モノクロナール抗体又はその断片が、抗−Scl-70モノクロナール抗体又は その断片である、請求項43に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 49．抗−Scl-70モノクロナール抗体又はその断片が、親水性エピトープに対し て向けられている、請求項48に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 50．全身性リウマチ失調が、自己免疫甲状腺失調である、請求項 33に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 51．自己免疫甲状腺失調が、橋本甲状腺炎及びグレーヴズ病から成る群から選 ばれる、請求項50に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 52．モノクロナール抗体又はその断片が、抗−TPO モノクロナール抗体又はそ の断片である、請求項51に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 53．抗−TPO モノクロナール抗体又はその断片が、親水性エピトープに対して 向けられている、請求項52に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 54．モノクロナール抗体又はその断片が、抗−サイログロブリン・モノクロナ ール抗体又はその断片である、請求項51に記載のモノクロナール抗体又はその断 片。 55．抗−サイログロブリン・モノクロナール抗体又はその断片が、親水性エピ トープに対して向けられている、請求項54に記載のモノクロナール抗体又はその 断片。 56．モノクロナール抗体又はその断片が、触媒抗体又はその断片である、請求 項32に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 57．モノクロナール抗体又はその断片の少なくとも１が、共有結合リガンドを 含む、請求項33に記載のモノクロナール抗体又はその断片。 58．共有結合リガンドが、光活性化架橋を含んで成る、請求項57に記載のモノ クロナール抗体又はその断片。 59．U1 RNA又はその断片の薬理学的有効量を投与することをさらに含んで成る 請求項７に記載の方法。 60．ヒトにおける免疫感染性クラスター・ウイルス感染の治療方法であって、 その免疫感染性クラスター・ウイルスに感染した患者 に、U1 RNA又はその断片の薬理学的有効量を投与することを含んで成る方法。 61．U1 RNA又はその断片が、紫外光により免疫感染性ウイルスに架橋される、 請求項60に記載の方法。 62．少なくとも１の RNAスプライシング阻害剤の薬理学的有効量を投与するこ とをさらに含んで成る請求項７に記載の方法。 63．少なくとも１の RNAスプライシング阻害剤の薬理学的有効量を投与するこ とをさらに含んで成る請求項59に記載の方法。 64．ヒトにおける免疫感染性クラスター・ウイルス感染の治療方法であって、 少なくとも１の RNAスプライシング阻害剤の薬理学的有効量を投与することを含 んで成る方法。