EA010785B1

EA010785B1 - Связывающие молекулы, способные нейтрализовать вирус бешенства, и их применение

Info

Publication number: EA010785B1
Application number: EA200602210A
Authority: EA
Inventors: Александер Бертольд Хендрик Баккер; Виллем Эгберт Мариссен; Роберт Арьен Кремер; Корнелис Адриан Де Крэйф
Original assignee: Круселл Холланд Б.В.
Priority date: 2004-05-27
Filing date: 2005-05-26
Publication date: 2008-10-30
Also published as: KR101456770B1; IL201970A; HRP20140419T1; EP1749029A2; CU23719A3; CN102139106B; WO2005118644A2; JP4768730B2; CN102139106A; IL225849A0; IL179586A0; WO2005118644A3; RS51847B; PL2314621T3; PT1749029E; NZ580607A; EP2314620B1; IL179586A; ATE501171T1; AU2005250163A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, которые специфически связываются с вирусом бешенства и обладают способностью нейтрализовать этот вирус. Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим указанные связывающие молекулы, к композициям, содержащим указанные связывающие молекулы, и к способам идентификации или продуцирования указанных связывающих молекул. Указанные связывающие молекулы могут быть использованы в целях диагностики, профилактики и/или лечения состояния, вызываемого вирусом бешенства. Предпочтительно они могут быть использованы для пост-контактной профилактики бешенства.

Description

Настоящее изобретение относится к области медицины. В частности, настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, нейтрализующим вирус бешенства. Связывающие молекулы могут быть использованы для пост-контактной профилактики, направленной на предупреждение бешенства.

Предшествующий уровень техники

Бешенство представляет собой вирусное заболевание, которое широко распространено почти во всем мире и поражает, главным образом, диких и домашних животных, а также человека, и которое, в конечном счете, приводит к истощению и к развитию почти неизлечимого летального энцефалита. По оценкам специалистов, ежегодно от энцефалита умирает более чем 70000 человек, а миллионы других людей, подвергшихся контакту с инфекционным агентом, нуждаются в лечении.

Вирус бешенства представляет собой одноцепочечный РНК-вирус с оболочкой, имеющий форму пули, и относится к семейству рабдовирусов и к роду лиссавирусов. Геном вируса бешенства кодирует пять вирусных белков: РНК-зависимую РНК-полимеразу (Ь); нуклеопротеин (Ν); фосфорилированный белок (Р); матриксный белок (М), локализованный на внутренней стороне оболочки вирусного белка; и гликопротеин (С), локализованный на внешней поверхности вируса.

С-белок (62-67 кДа) представляет собой гликопротеин типа I, состоящий из 505 аминокислот, и имеет 2-4 потенциальных сайта Ν-гликозилирования, из которых только один или два сайта являются гликозилированными в зависимости от штамма вируса. С-белок образует выступы, которые покрывают внешнюю поверхность оболочки вириона и, как известно, индуцирует вирус-нейтрализующие антитела.

Бешенство можно лечить или предотвращать путем пассивной и активной иммунизации. Постконтактная профилактика бешенства включает быструю местную обработку ран, а также пассивную иммунизацию (иммуноглобулином против вируса бешенства) и активную иммунизацию (вакцинами).

В настоящее время иммуноглобулины против вируса бешенства (К1С) получают из образцов сыворотки человека, иммунизованного вирусом бешенства (НШС), или лошади, иммунизованной вирусом бешенства (ЕШС). Недостаток иммуноглобулинов ЕР1С. а также НР1С заключается в том, что эти иммуноглобулины, особенно НК1С, не могут быть получены в достаточных количествах и являются слишком дорогостоящими. Кроме того, использование ЕШС может приводить к негативным реакциям, таким как анафилактический шок. Другой проблемой, связанной с использованием НШС, является риск заражения известными или неизвестными патогенами. Для решения этой проблемы при проведении постконтактной профилактики было предложено использовать моноклональные антитела, способные нейтрализовать вирус бешенства. Мышиные моноклональные антитела, нейтрализующие вирус бешенства, известны специалистам (см. 8с1шшас11сг с1 а1., 1989). Однако использование таких мышиных антител ίη νίνο ограничено проблемами, связанными с введением мышиных антител человеку, а именно, с их коротким временем полужизни в сыворотке и их неспособностью запускать эффекторные функции у человека, а также с продуцированием у человека нежелательного явно выраженного иммунного ответа против мышиного антитела (реакции антимышиное антитело против человека (НАВА)).

Недавно человеческие моноклональные антитела, нейтрализующие вирус бешенства, были описаны в литературе (см. ΩίοΙζδΟιοΙά с1 а1., 1990, Сйатрюп с1 а1., 2000, & Нап1оп с1 а1., 2001). Для того чтобы человеческие моноклональные антитела против вируса бешенства, такие как НШС, были эффективными для пост-контактной профилактики, необходимо использовать смесь моноклональных антител. Для предупреждения ускользания резистентных вариантов вируса от иммунологического надзора каждое антитело в такой смеси должно связываться с другим эпитопом или сайтом на данном вирусе.

В настоящее время существует острая необходимость в получении новых моноклональных антител, нейтрализующих человеческие вирусы бешенства и способных обеспечивать повышение эффективности пост-контактной профилактики, а в частности, антител, обладающих различными специфичностями в распознавании эпитопов. Настоящее изобретение относится к применению таких моноклональных антител, которые могут быть использованы в смеси для пост-контактной профилактики, проводимой для предупреждения инфекций, вызываемых вирусами бешенства широкого ряда и вариантами этого вируса, резистентными к нейтрализации.

Описание графического материала

На фиг. 1 проиллюстрировано сравнение аминокислотных последовательностей штамма вируса бешенства СУ8-11 и ускользающего вируса Е57. Вирус-инфицированные клетки собирали через 2 дня после инфицирования и выделяли полноразмерную РНК. Затем генерировали кДНК, которую использовали для ДНК-секвенирования. Показаны области, содержащие мутации, отмеченные жирным шрифтом. На фиг. 1А проиллюстрировано сравнение нуклеотидных последовательностей. Цифры над аминокислотами указывают на положения аминокислот гликопротеина вируса бешенства, включая сигнальный пептид. На фиг. 1В проиллюстрировано сравнение аминокислотных последовательностей. В верхней части схематически показан гликопротеин вируса бешенства. Черный квадрат обозначает сигнальный пептид, а серый квадрат обозначает трансмембранный домен. Последовательности на фиг. 1 также представлены в 8ЕО ΙΌ N0:130-141.

На фиг. 2 проиллюстрировано сравнение аминокислотных последовательностей штамма вируса бешенства СУ8-11 и ускользающего вируса Е4В. Вирус-инфицированные клетки собирали черей 2 дня

- 1 010785 после инфицирования и выделяли полноразмерную РНК. Затем генерировали кДНК и эту кДНК использовали для ДНК-секвенирования. Показаны области, содержащие мутации, которые отмечены жирным шрифтом. На фиг. 2А проиллюстрировано сравнение нуклеотидных последовательностей. Цифры над аминокислотами указывают на положения аминокислот гликопротеина вируса бешенства, включая сигнальный пептид. На фиг. 2В показано сравнение аминокислотных последовательностей. В верхней части схематически показан гликопротеин вируса бешенства. Черный квадрат обозначает сигнальный пептид, а серый квадрат обозначает трансмембранный домен. Последовательности на фиг. 2 также представлены 8ЕО ГО N0:142-151.

На фиг. 3 представлен вектор ΡΌν-СОб.

На фиг. 4 проиллюстрирован конкурентный ЕЬ18А-анализ зсЕу-фрагмент антитела против вируса бешенства и биотинилированного антитела против вируса бешенства, называемого СК-57. ЕЫ8Апланшеты, сенсибилизированные очищенным О-белком вируса бешенства, инкубировали с соответствующим 8сЕу, а затем добавляли СК-57Ью (0,5 мкг/мл). Затем проводили мониторинг связывания с СК57Ью в отсутствии и в присутствии 8сЕу.

На фиг. 5 проиллюстрирован конкурентный ЕЫ8А-анализ зсЕу-фрагмента антитела против вируса бешенства и биотинилированного антитела против вируса бешенства, называемого СК-57. ЕЫ8Апланшеты, сенсибилизированные очищенным О-белком вируса бешенства, инкубировали с СК-57 (1 мкг/мл), а затем добавляли избыток зсЕу. Затем проводили мониторинг связывания с зсЕу в отсутствии и в присутствии СК-57.

На фиг. б проиллюстрирован конкурентный ЕЫ8А-анализ 1дО против 0-белка вируса бешенства и антитела против вируса бешенства, называемого СК-57. 0-белок (штамм ЕКА) инкубировали с немеченными 1дО (показанными на Х-оси). Затем добавляли биотинилированный СК57 (СК-57Ью) и оставляли для связывания с О-белком, после чего планшеты визуализировали с использованием конъюгата стрептавидин-ПХ. ЕЬ18А-сигналы выражали как процент от связывания лишь с одним СК-57Ью.

На фиг. 7 проиллюстрирован конкурентный ЕА8С-анализ 1дО против 0-белка, вируса бешенства и антитела против вируса бешенства, называемого СК-57. Клетки РЕК. Сб, экспрессирующие 0-белок (штамм ЕКА) инкубировали с немеченными 1дО (показанными на Х-оси). Затем добавляли биотинилированный СК57 (СК-57Ью) и оставляли для связывания с О-белком, после чего планшеты визуализировали с использованием конъюгата стрептавидин-ПХ. ЕЬ18А-сигналы выражали как процент от связывания лишь с одним СК-57Ью.

На фиг. 8 проиллюстрировано сравнение аминокислотных последовательностей штамма вируса бешенства θν§-11 и ускользающего вируса Е98. Инфицированные вирусом клетки собирали через 2 дня после инфицирования и выделяли полноразмерную РНК. Затем генерировали кДНК и эту кДНК использовали для ДНК-секвенирования. Показаны области, содержащие мутации, которые отмечены жирным шрифтом. На фиг. 8А проиллюстрировано сравнение нуклеотидных последовательностей. Цифры над нуклеотидами указывают на мутированные нуклеотиды (отмеченные жирным шрифтом) открытой рамки считывания гликопротеина вируса бешенства без сигнальной пептидной последовательности. Цифры над аминокислотами указывают на мутированные аминокислоты (отмеченные жирным шрифтом) гликопротеина вируса бешенства без сигнальной пептидной последовательности.

На фиг. 9 представлено филогенетическое дерево, состоящее из 123 уличных вирусов бешенства (последовательности О-гликопротеина 123 вирусов бешенства, 2-параметрический метод Кимура, 500 бутстрепов). Жирным шрифтом обозначены вирусы, имеющие Ν>Ό мутации, наблюдавшиеся у ускользающих вирусов Е98.

На фиг. 10 показаны нейтрализующие эпитопы на глигопротеине вирусов бешенства. На схематически представленном гликопротеине вирусов бешенства обозначены антигенные сайты, включая новый эпитоп СК57. Сигнальный пептид (19 аминокислот) и трансмембранный домен показаны черными квадратами. Отмечены дисульфидные мостики. Аминокислоты пронумерованы, начиная от зрелого белка, а последовательность сигнального пептида обозначена отрицательными числами.

Описание изобретения

Ниже даны определения терминов, используемых в настоящем изобретении.

Определения.

Связывающая молекула.

Используемый здесь термин связывающая молекула означает интактный иммуноглобулин, включая моноклональные антитела, такие как химерные, гуманизованные или человеческие моноклональные антитела, либо фрагмент иммуноглобулина, содержащий антигенсвязывающий и/или вариабельный домен и конкурирующий с интактным иммуноглобулином за специфическое связывание с его партнером по связыванию, например с вирусом бешенства или его фрагментом, таким как, например, О-белок. Независимо от своей структуры, антигенсвязывающий фрагмент связывается с тем же самым антигеном, который распознается интактным иммуноглобулином. Антигенсвязывающий фрагмент может включать пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере из 2 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 15 смежных аминокислот

- 2 010785 ных остатков, по меньшей мере из 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 30 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 35 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 60 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 200 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 250 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности связывающей молекулы.

Используемый здесь термин связывающая молекула включает иммуноглобулины всех известных классов и подклассов. Связывающие молекулы в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей могут быть подразделены на пять главных классов интактных антител: 1дА, 1дБ, 1дЕ, 1дС и 1дМ, а некоторые из них могут быть подразделены на подклассы (изотипы), например 1дА1, 1дА2, 1§С1, 1§С2, 1дС3 и 1§С4.

Антигенсвязывающие фрагменты включают, 1п(сг айа, фрагменты Рай, Р(ай'), Р(ай')₂, Ρν, бЛЬ. Рб; фрагменты гипервариабельных областей (комплементарность-определяющих областей, СБВ), одноцепочечные антитела (κοΡν), бивалентные одноцепочечные антитела, одноцепочечные фаговые антитела, диантитела, триантитела, тетраантитела, (поли)пептиды, которые содержат по меньшей мере один фрагмент иммуноглобулина, который является достаточным для антиген-специфического связывания с (полипептидом и т.п. Вышеуказанные фрагменты могут быть продуцированы методом синтеза или путем ферментативного или химического гидролиза интактных иммуноглобулинов, либо они могут быть генетически сконструированы методами рекомбинантных ДНК. Такие методы продуцирования хорошо известны специалистам и описаны в литературе, например в руководстве Апййобу: А Ьайога(огу Мапиа1, Ебйеб йу: Е. Наг1оте апб Ό. Ьапе (1988), Со1б 8рппд Нагйог Ьайога(огу, Со1б 8рппд Нагйог, Иете Уогк, которое вводится в настоящее описание посредством ссылки. Связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент может иметь один или несколько связывающих сайтов. Если присутствует более чем один связывающий сайт, то эти связывающие сайты могут быть идентичны друг другу, либо они могут быть различными.

Связывающая молекула может быть оголенной или неконъюгированной связывающей молекулой, и может быть также частью иммуноконъюгата. Оголенная или неконъюгированная связывающая молекула представляет собой связывающую молекулу, которая является неконъюгированной, функционально присоединенной или как-либо иначе физически или функционально ассоциированной с эффекторной молекулой или меткой, такой как, 1п(ег айа, токсическое вещество, радиоактивное вещество, липосома или фермент. При этом следует отметить, что понятие оголенные или неконъюгированные связывающие молекулы не исключает связывающие молекулы, которые были стабилизированы, полимеризованы, гуманизованы или были подвергнуты какой-либо иной модификации, но которые, при этом, не являются связанными с эффекторной молекулой или меткой. В соответствии с этим в объем настоящего изобретения входят все посттрансляционно модифицированные оголенные или неконъюгированные связывающие молекулы, включая молекулы, полученные путем модификации, сделанной в культуре клеток, продуцирующих природную связывающую молекулу, модификации, сделанной в клетках, продуцирующих рекомбинантную связывающую молекулу; и модификации, внесенной человеком после получения исходной связывающей молекулы. Очевидно, что термин оголенная или неконъюгированная связывающая молекула не исключает способность связывающей молекулы образовывать функциональные комплексы с эффекторными клетками и/или с молекулами после ее введения в организм, поскольку некоторые такие взаимодействия являются необходимыми для достижения биологического эффекта. Поэтому определение оголенная или неконъюгированная связывающая молекула подразумевает отсутствие ассоциированной эффекторной группы или метки ш уйго, но не ш νί\Ό.

Гипервариабельные области (комплемент-определяющие области, СБВ).

Используемый здесь термин гипервариабельные области означает последовательности в вариабельных областях связывающих молекул, таких как иммуноглобулины, где указанные последовательности, обычно, вносят значительный вклад в формирование антигенсвязывающего сайта, который является комплементарным по форме и распределению заряда на эпитопе, распознаваемом на данном антигене. СОВ-области могут быть специфичными к линейным эпитопам, дискретным эпитопам или к конформационным эпитопам белков или фрагментом белка, либо к эпитопам, присутствующим на белке в его нативной конформации или, в некоторых случаях, присутствующим на белках, денатурированных, например, посредством солюбилизации в ДСН. Эпитопы могут также состоять из посттрансляционных модификаций белков.

Функциональный вариант.

Используемый здесь термин функциональный вариант означает связывающую молекулу, содержащую нуклеотидную и/или аминокислотную последовательность, которая имеет модификацию в одном

- 3 010785 или нескольких положениях нуклеотидов и/или аминокислот по сравнению с нуклеотидными и/или аминокислотными последовательностями родительской связывающей молекулы, и которая, при этом, обладает способностью конкурировать с родительской связывающей молекулой за связывание с партнером по связыванию, например, с вирусом бешенства или с его фрагментом. Другими словами, модификации в аминокислотной и/или нуклеотидной последовательности родительской связывающей молекулы не оказывают значительного влияния на связывающие свойства или не изменяют свойства связывающей молекулы, кодируемой нуклеотидной последовательностью или содержащей аминокислотную последовательность, то есть указанная связывающая молекула обладает способностью распознавать свою мишень и связываться с ней. Функциональный вариант может иметь модификации в консервативной последовательности, включая нуклеотидные и аминокислотные замены, добавления и делеции. Такие модификации могут быть введены стандартными методами, известными специалистам, такими как сайтнаправленный мутагенез и неспецифический ПЦР-опосредованный мутагенез, и могут включать природные, а также не-природные нуклеотиды и аминокислоты.

Консервативными аминокислотными заменами являются замены, в которых аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим аналогичные структурные или химические свойства. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, известны специалистам. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), с кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), с незаряженными полярными боковыми цепями (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), с неполярными боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), с β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин), и с ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан), Для специалистов в данной области очевидно, что могут быть также использованы и другие классификации семейств аминокислотных остатков, не указанные выше. Кроме того, вариант может иметь неконсервативные аминокислотные замены, например замену аминокислоты аминокислотным остатком, имеющим другие структурные или химические свойства. Аналогичные небольшие изменения могут также включать аминокислотные делеции или инсерции или и то, и другое. Критерии по определению аминокислотных остатков, которые могут быть заменены, встроены или делетированы без нарушения иммунологической активности, можно найти с помощью компьютерных программ, хорошо известных специалистам.

Мутацией в нуклеотидной последовательности может быть одна модификация, внесенная в локус (точковая мутация), такая как транзиционная или трансверсионная мутация, или, альтернативно, в одном локусе может быть введено, делетировано или заменено несколько нуклеотидов. Кроме того, одна или несколько модификаций могут быть введены в любое число локусов в нуклеотидной последовательности. Такие мутации могут быть созданы любым подходящим методом, известным специалистам.

Хозяин.

Используемый здесь термин хозяин означает организм или клетку, в которые был введен вектор, такой как клонирующий вектор или экспрессионный вектор. Указанные организм или клетка могут быть прокариотическими или эукариотическими. При этом следует отметить, что этот термин означает не только конкретно рассматриваемые организм или клетку, но также и их потомство. Поскольку некоторые модификации могут передаваться последующим поколениям вследствие мутации или влияния окружающей среды, то такое потомство, фактически, не может быть идентичным родительскому организму или родительской клетке, но, тем не менее, оно входит в объем используемого здесь термина хозяин.

Человеческие молекулы.

Термин человеческий, если он применяется к определенным здесь связывающим молекулам, относится к молекулам, которые либо непосредственно происходят от человеческой последовательности, либо получены на основе человеческой последовательности. Если связывающая молекула происходит от человеческой последовательности или получена на ее основе, а затем модифицирована, то в данном описании она будет рассматриваться как человеческая. Другими словами, термин человеческий, если он применяется к определенным здесь связывающим молекулам, включает связывающие молекулы, имеющие вариабельные и константные области, происходящие от вариабельных или константных областей последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, присутствующих или не присутствующих у человека или в человеческих лимфоцитах, либо присутствующих в модифицированной форме. Таким образом, человеческие связывающие молекулы могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые генными последовательностями иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, и могут содержать замены и/или делеции (например, мутации, введенные, например, путем неспецифического или сайт-специфического мутагенеза ίη νίίτο или путем соматической мутации ίη νίνο). Термин основанный на используется здесь в случае, когда последовательность нуклеиновой кислоты может быть точно или с небольшими мутациями скопирована с матрицы, например, методом ПЦР с вероятностью ошибки, или создана искусственно с точным соответствием данной матрице или с небольшими модификациями. Полусинтетические молекулы, полученные на основе человеческих последовательностей, также рассматриваются здесь как человеческие последовательности.

- 4 010785

Моноклональное антитело.

Используемый здесь термин моноклональное антитело означает препарат, состоящий из молекул антитела с мономолекулярным составом, т.е. имеющий первичную структуру, например, одну аминокислотную последовательность. Моноклональное антитело обладает одной специфичностью связывания и аффинностью к конкретному эпитопу. В соответствии с этим, термин человеческое моноклональное антитело означает антитело, которое обладает одной специфичностью связывания и имеет вариабельные и константные области, происходящие от последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии или полученные на их основе, либо происходящие от полностью синтезированных последовательностей. Метод получения моноклонального антитела не имеет решающего значения.

Молекула нуклеиновой кислоты.

Термин молекула нуклеиновой кислоты, используемый в настоящем изобретении, означает полимерную форму, состоящую из нуклеотидов, и включает смысловую и антисмысловую цепь РНК, кДНК и геномной ДНК, и их синтетические формы и смешанные полимеры. Термин нуклеотид означает рибонуклеотид, дезоксинуклеотид или модифицированную форму нуклеотидов любого типа. Этот термин также включает одноцепочечную и двухцепочечную форму ДНК. Кроме того, полинуклеотид может включать природные или модифицированные нуклеотиды или те и другие нуклеотиды, связанные друг с другом природными и/или не-природными нуклеотидными связями. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть модифицированы химически или биохимически, либо они могут содержать неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания, как может быть легко определено специалистом. Такими модификациями являются, например, метки, метилирование, замена одного или нескольких природных нуклеотидов их аналогами, межнуклеотидные модификации, такие как введение незаряженных связей (например, метилфосфонатов, фосфотриэфиров, фосфорамидитов, карбаматов и т.п.), заряженных связей (например, фосфортиоатов, фосфордитиоатов и т.п.), боковых групп (например, полипептидов), интеркалирующих агентов (например, акридина, псоралена и т.п.), хелатообразующих агентов, алкилирующих агентов и модифицированных связей (например, α-аномерных нуклеиновых кислот и т.п.).

Вышеуказанный термин также включает любые топологические конформации, такие как одноцепочечные, двухцепочечные, частично дуплексные и триплексные конформации, а также конформации типа шпильки, кольцевые конформации и конформации типа висячий замок. Этот термин также включает синтетические молекулы, которые имитируют способность полинуклеотидов связываться с определенной последовательностью посредством образования водородных связей и других химических взаимодействий. Такие молекулы известны специалистам и включают, например, молекулы, в остове которых пептидные связи заменены фосфатными связями. Термин последовательность нуклеиновой кислоты включает ее комплемент, если это не оговорено особо. Так, например, следует отметить, что термин молекула нуклеиновой кислоты, имеющая конкретную последовательность включает комплементарную ей цепь, а также комплементарную последовательность.

Комплементарная цепь может быть также использована, например, в терапии антисмысловыми последовательностями, в зондах для гибридизации и в ПЦР-праймерах.

Фармацевтически приемлемый наполнитель.

Термин фармацевтически приемлемый наполнитель означает любую последовательность-вставку, объединенную с активной молекулой, такой как лекарственное средство, агент или связывающая молекула, необходимые для приготовления подходящей или удобной для применения лекарственной формы. Фармацевтически приемлемый наполнитель представляет собой наполнитель, который является нетоксичным, или имеет, по крайней мере, допустимую токсичность, приемлемую для его введения пациенту в используемых дозах и концентрациях, и который совместим с другими ингредиентами композиции, содержащей указанное лекарственное средство, агент или связывающую молекулу.

Пост-контактная профилактика.

Пост-контактная профилактика (РЕР) показана для индивидуумов, которые имели контакт с животным, возможно, инфицированным вирусом бешенства. Таким контактом может быть укус (т.е. любое повреждение кожи зубами), включая укусы животного и какие-либо другие контакты. Другие контакты, т.е. контакты не через уксус, включают контакт реципиентов в лабораториях или в больничных палатах с большими количествами вирусов бешенства, передающихся воздушно-капельным путем, а также при операции на роговице, хирургически трансплантированной реципиенту от пациентов, умерших от бешенства. Заражением не через укус также считается заражение через открытые раны, ссадины, слизистые оболочки или, теоретически, царапины, слюну или другие потенциально инфекционные материалы (такие как нервная ткань) от животных, страдающих бешенством. Другие непосредственные контакты, такие как общение с животными, зараженными вирусом бешенства, и контакты с кровью, мочой или фекалиями животных, зараженных вирусом бешенства, не рассматриваются как контакт и не являются показаниями для профилактики. РЕР должна быть проведена как можно быстрее, а лучше сразу после контакта. Если таких контактов не было, то в пост-контактной профилактике нет необходимости. Во всех схемах пост-контактной профилактики, за исключением предварительно иммунизованных индивидуумов, должна быть одновременно проведена активная и пассивная иммунизация.

- 5 010785

Специфическое связывание.

Термин специфическое связывание, используемый здесь по отношению к взаимодействию связывающей молекулы, например антитела, с его партнером по связыванию, например с антигеном, означает, что такое взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры, например антигенной детерминанты или эпитопа, на партнере по связыванию. Другими словами, антитело преимущественно связывается со своим партнером по связыванию или распознает этого партнера по связыванию, даже если этот партнер присутствует в смеси с другими молекулами или организмами. Такое связывание может быть опосредовано ковалентными или нековалентными взаимодействиями или их комбинациями. Другими словами, термин специфическое связывание означает иммуноспецифическое связывание с антигеном или с его фрагментом, но не с другими антигенами. Связывающая молекула, которая иммуноспецифически связывается с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами с более низкой аффинностью, определяемой, например, посредством радиоиммуноанализа (РИА), твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ18А), В1АСОКЕ или других анализов, известных специалистам. Связывающие молекулы или их фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с антигеном, могут перекрестно реагировать с родственными антигенами. Предпочтительно связывающие молекулы или их фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с антигеном, не способны перекрестно реагировать с другими антигенами.

Терапевтически эффективное количество.

Термин терапевтически эффективное количество означает количество определенной здесь связывающей молекулы, которое является эффективным для пост-контактной профилактики бешенства.

Вектор.

Термин вектор означает молекулу нуклеиновой кислоты, в которую может быть встроена вторая молекула нуклеиновой кислоты в целях ее введения хозяину, в котором она может реплицироваться, а в некоторых случаях экспрессироваться. Другими словами, вектор способен переносить молекулу нуклеиновой кислоты, к которой он был присоединен. Используемый здесь термин вектор также включает клонирующие и экспрессирующие векторы. Векторами являются, но не ограничиваются ими, плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) и дрожжевые искусственные хромосомы (УАС), а также векторы, происходящие от бактериофагов или вирусов растений или вирусов животных (включая человека). Векторы включают ориджин репликации, распознаваемый предполагаемым хозяином, а в случае экспрессионных векторов, он может также включать промотор и другие регуляторные области, распознаваемые хозяином. Вектор, содержащий вторую молекулу нуклеиновой кислоты, вводят в клетку, например, посредством трансформации, трансфекции или посредством использования механизмов проникновения бактерий или вирусов. Известны и другие способы введения нуклеиновой кислоты в клетки, такие как электропорация или бомбардировка частицами, часто применяемые для введения в растительные клетки, и т.п. Способ введения нуклеиновой кислоты в клетки зависит, среди прочих, от других факторов, от типа клеток и т. п. Способ введения не является решающим фактором для осуществления настоящего изобретения. Некоторые векторы способны автономно реплицироваться в хозяине, в который они были введены (например, векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, могут реплицироваться в бактериях). Другие векторы могут интегрироваться в геном хозяина после их введения данному хозяину и, таким образом, могут реплицироваться вместе с геномом клетки-хозяина.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, способным специфически связываться с вирусом бешенства и нейтрализовать этот вирус. Кроме того, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим, по меньшей мере, связывающую область указанных связывающих молекул. Настоящее изобретение также относится к использованию связывающих молекул согласно изобретению для пост-контактной профилактики инфекций у индивидуума с риском развития у него состояния, индуцированного вирусом бешенства.

Подробное описание изобретения

В своем первом аспекте настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, способным специфически связываться с вирусом бешенства. Предпочтительно связывающие молекулы согласно изобретению также обладают активностью, нейтрализующей вирус бешенства. Предпочтительно связывающими молекулами согласно изобретению являются человеческие связывающие молекулы. Альтернативно, такими молекулами могут быть также связывающие молекулы, происходящие от других животных. Вирус бешенства принадлежит к роду лиссавирусов. В целом, род лиссавирусов включает одиннадцать генотипов: вирус бешенства (генотип 1), вирус летучих мышей Лагос (генотип 2), вирус Мокола (генотип 3), вирус Дюбеняге (генотип 4), европейский лиссавирус летучих мышей 1 (генотип 5), европейский лиссавирус летучих мышей 2 (генотип 6) , австралийский лиссавирус летучих мышей (генотип 7), вирус Араван (генотип 8), вирус Хюянь (генотип 9), вирус реки Иркут (генотип 10) и западнокавказский вирус (генотип 11). Помимо связывания с вирусом бешенства, связывающие молекулы согласно изобретению также могут обладать способностью связываться с лиссавирусами других генотипов. Предпочтительные связывающие молекулы могут также нейтрализовать лиссавирусы других генотипов. Кроме того, связывающие молекулы согласно изобретению даже могут обладать способностью связы

- 6 010785 ваться с вирусами и/или нейтрализовать вирусы, принадлежащие к семейству рабдовирусов, но не являющиеся лиссавирусами. Это семейство включает род циторабдовирусов, эфемеровирусов, лиссавирусов, нуклеорабдовирусов, рабдовирусов и везикуловирусов.

Связывающие молекулы могут специфически связываться с вирусом бешенства в его природной форме и в его инактивированной/атеннюированной форме. Инактивация вируса бешенства может быть осуществлена путем обработки иИсг ака β-пропиолактоном (ВРЬ) (\М1Ше & Скарре1, 1982), нагревания при 56°С в течение более чем 30 мин, гамма-облучения, обработки ацетилэтиленимином или этиленимином, или обработки аскорбиновой кислотой и сульфатом меди в течение 72 ч (Мабкизибаиа с1 а1., 2004). Общие методы инактивации вирусов хорошо известны специалистам, например, к11ег ака, пастеризация (влажное нагревание), сухая термообработка, обработка горячим паром, обработка соединением с низким рН, обработка органическим растворителем/детергентом, нанофильтрация; при этом может быть также проведено УФ-облучение. Предпочтительно инактивацию осуществляют путем обработки βпропиолактоном (ВРЬ). Методы анализа, проводимые для того, чтобы установить, является ли вирус бешенства инфекционным или частично или полностью инактивированным, хорошо известны специалистам, и эти и другие методы можно найти в лабораторных руководствах по работе с вирусами бешенства Р.-Х. Мезки, М.М. Кар1ап & Н. Корго\\'зк| (1996), 4к1 ебйюи, Скар1ет 36, νοτ16 Неакк Ог^аш/акоп, Сеиеуа.

Связывающие молекулы могут также специфически связываться с одним или несколькими фрагментами вируса бешенства, такими как, 1п1ег ака, препарат, состоящий из одного или нескольких белков и/или (поли)пептидов, происходящих от вируса бешенства, или клеток, трансфецированных белком и/или (поли)пептидом вируса бешенства. Для применения методов лечения и/или профилактики, таких как методы пост-контактной профилактики инфекций, вызываемых вирусом бешенства, предпочтительно, чтобы связывающие молекулы обладали способностью специфически связываться с доступными поверхностными белками вируса бешенства, такими как М-белок (см. Атеуата е! а1., 2003) или С-белок. Для применения в целях диагностики предпочтительно, чтобы человеческие связывающие молекулы обладали способностью специфически связываться с белками, не присутствующими на поверхности вируса бешенства. Аминокислотная последовательность поверхностных и внутренних белков различных известных штаммов вируса бешенства может быть найдена в базе данных ЕМВЬ и/или в других базах данных.

При этом предпочтительно, чтобы фрагмент содержал, по меньшей мере, антигенную детерминанту, распознаваемую человеческими связывающими молекулами согласно изобретению. Используемый здесь термин антигенная детерминанта означает молекулу, такую как (поли)пептид, (глико)протеин вируса бешенства или их аналоги или фрагменты, способные связываться с человеческой связывающей молекулой согласно изобретению с достаточно высокой аффинностью с образованием детектируемого комплекса антиген - связывающая молекула.

Связывающими молекулами согласно изобретению могут быть интактные молекулы иммуноглобулина, такие как поликлональные или моноклональные антитела, а в частности, человеческие моноклональные антитела, либо связывающими молекулами могут быть антигенсвязывающие фрагменты, включая, но не ограничиваясь ими, фрагменты Рак, Р(ак'), Р(ак')₂, Ρν, бАк, Рб; фрагменты гипервариабельных областей (СЭВ), одноцепочечные антитела (3εΡν), двухвалентные одноцепочечные антитела, одноцепочечные фаговые антитела, диантитела, триантитела, тетраантитела и (поли)пептиды, содержащие по меньшей мере один фрагмент иммуноглобулина, который является достаточным для антигенспецифического связывания с вирусом бешенства или с его фрагментом. Связывающие молекулы согласно изобретению могут быть использованы в неизолированной или в изолированной форме. Кроме того, связывающие молекулы согласно изобретению могут быть использованы отдельно или в смеси, содержащей по меньшей мере одну человеческую связывающую молекулу (или ее вариант или фрагмент). Другими словами, связывающие молекулы могут быть использованы в комбинации, например, в виде фармацевтической композиции, содержащей две или более связывающих молекулы, их варианты или фрагменты. Так, например, в целях достижения желаемого профилактического, терапевтического или диагностического эффекта, связывающие молекулы, обладающие активностью, нейтрализующей вирус бешенства, могут быть объединены для использования в монотерапии.

РНК-вирусы, такие как вирус бешенства, для своей репликации используют свою собственную РНК-полимеразу. Такие РНК-полимеразы имеют тенденцию к внесению ошибки в процессе синтеза. При инфицировании вирусом это приводит к образованию так называемых псевдовидов. Каждый из таких псевдовидов имеет уникальный РНК-геном, что может приводить к различиям в аминокислотном составе вирусных белков. Если такие мутации присутствуют в структурных вирусных белках, то этот вирус может ускользать от иммунологического надзора иммунной системы хозяина, что обусловлено изменениями в Т-клеточных или В-клеточных эпитопах. Если индивидуумы подвергаются лечению смесью из двух связывающих молекул, таких как человеческие моноклональные антитела, то вероятность этого события становится более высокой, чем в случае, когда индивидуумы подвергаются лечению смесью поликлональных антител (НВ1С). Поэтому для лечения бешенства, прежде всего, необходимо, чтобы в

- 7 010785 смеси из двух человеческих моноклональных антител эти два антитела распознавали неперекрывающиеся, неконкурирующие эпитопы на их антигене-мишени, т.е. на гликопротеине вируса бешенства. Таким образом, минимизируется вероятность ускользания вирусов бешенства от иммунного надзора. Следовательно, предпочтительно, чтобы связывающие молекулы согласно изобретению обладали способностью реагировать с различными неперекрывающимися, неконкурирующими эпитопами вируса бешенства, такими как эпитопы на С-белке вируса бешенства. Смесь связывающих молекул может также содержать по меньшей мере одно другое терапевтическое средство, такое как лекарственное средство, подходящее для пост-контактной профилактики бешенства.

Обычно связывающие молекулы согласно изобретению могут связываться со своими партнерами по связыванию, т.е. с вирусом бешенства или с его фрагментами, такими как белки вируса бешенства, с константой аффинности (К_а-величиной), составляющей менее чем 0,2х10^-4 М; 1,0х10^-5 М; 1,0х10^-6 М; 1,0х10^-7 М; предпочтительно менее чем 1,0х10^-8 М; более предпочтительно менее чем 1,0х10^-9 М; более предпочтительно менее чем 1,0х10^-10 М; еще более предпочтительно менее чем 1,0х 10^-11 М; а в частности менее чем 1,0х10^-12 М. Константы аффинности могут варьироваться для антител различных изотипов. Так, например, аффинность связывания для изотипа 1дМ составляет по меньшей мере примерно 1,0х10^-7М. Константы аффинности могут быть, например, измерены с помощью поверхностного плазмонного резонанса, т.е. оптического явления, позволяющего проанализировать биоспецифические взаимодействия в реальном времени путем детекции изменения концентраций белка в биосенсорной матрице, например, с использованием системы В1АС0ВЕ (Рйагтас1а Вюкеиког АВ, Иррка1а, 8^ебеи).

Связывающие молекулы согласно изобретению могут связываться с вирусом бешенства в очищенной/изолированной или в неочищенной/неизолированной форме. Связывающие молекулы могут связываться с вирусом бешенства в растворимой форме, например в образце, либо они могут связываться с вирусом бешенства, связанным с носителем или субстратом или присоединенным к такому носителю или субстрату, например, к микротитрационным планшетам, мембранам, сферам и т.п. Носители или субстраты могут быть изготовлены из стекла, пластика (например, полистирола), полисахаридов, найлона, нитроцеллюлозы, тефлона и т.п. Поверхность таких носителей может быть твердой или пористой и имеет любую подходящую форму. Альтернативно, связывающие молекулы могут также связываться с фрагментами вируса бешенства, такими как белки или (поли)пептиды вируса бешенства. В одном из вариантов изобретения связывающие молекулы обладают способностью специфически связываться с Сбелком вируса бешенства или с его фрагментом. Белки или (поли)пептиды вируса бешенства могут присутствовать либо в растворимой форме, либо они могут связываться с вирусом бешенства, связанным с носителем или субстратом или присоединенным к такому носителю или субстрату, описанному выше. В другом варианте изобретения клетки, трансфецированные С-белком, могут быть использованы в качестве партнера по связыванию со связывающими молекулами.

В предпочтительном варианте изобретения связывающие молекулы согласно изобретению нейтрализуют инфекционность вируса бешенства. Это может быть достигнуто путем предотвращения связывания вируса бешенства со своими рецепторами на клетках-хозяевах, такими как, 1и1ег айа, мышиный рецептор нейротропина р75, адгезивная молекула нервных клеток (СЭ56) и ацетилхолиновый рецептор, или путем ингибирования высвобождения РНК в цитоплазму данной клетки или предотвращения транскрипции или трансляции РНК. В конкретном варианте изобретения связывающие молекулы согласно изобретению предотвращают инфицирование клеток-хозяев вирусом бешенства по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на

80%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на

50%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на

30%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 20% или по меньшей мере на 10% по сравнению с инфицированием клеток-хозяев вирусом бешенства в отсутствии указанных связывающих молекул. Нейтрализация может быть определена, например, как описано в лабораторных руководствах по работе с вирусами бешенства Р.-Х. Ме§1ш, М.М. Кар1ап & Н. Корго\\ък| (1996), 41Н ебйюи, Сйар1ег 36, νοτΙά Неайй Огдашхайоп. Сеиеуа. Кроме того, человеческие связывающие молекулы согласно изобретению могут представлять собой комплемент-фиксирующие связывающие молекулы, способствующие лизису вирусов бешенства с оболочкой. Человеческие связывающие молекулы согласно изобретению могут также действовать как опсонины и могут усиливать фагоцитоз вируса бешенства либо путем стимуляции его поглощения посредством Рс- или С3й-рецепторов, либо путем агглютинации вируса бешенства, что облегчает фагоцитоз.

В предпочтительном варианте изобретения связывающие молекулы согласно изобретению содержат, по меньшей мере, область СЭКЗ, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0:1, 8ЕО ГО N0:2, 8ЕО ГО N0:3, 8ЕО ГО N0:4, 8ЕО ГО N0:5, 8ЕО ГО N0:6, 8ЕО ГО N0:7, 8ЕО ГО N0:8, 8ЕО ГО N0:9, 8ЕО ГО N0:10, 8ЕО ГО N0:11, 8ЕО ГО N0:12, 8ЕО ГО N0:13, 8ЕО ГО N0:14, 8ЕО ГО N0:15, 8ЕО ГО N0:16, 8ЕО ГО N0:17, 8ЕО ГО N0:18, 8ЕО ГО N0:19, 8ЕО ГО N0:20, 8ЕО ГО N0:21, 8ЕО ГО N0:22, 8ЕО ГО N0:23 и 8ЕО ГО N0:24. В одном из вариантов изобретения область СГОР3 представляет собой область СГОР3 тяжелой цепи.

- 8 010785

В еще одном варианте изобретения связывающие молекулы согласно изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую, в основном, аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:26, 8Е0 ΙΌ N0:27, 8Е0 ΙΌ N0:28, 8Е0 ΙΌ N0:29, 8Е0 ΙΌ N0:30, 8ЕО ΙΌ N0:31, 8ЕО ΙΌ N0:32, 8ЕО ΙΌ N0:33, 8ЕО ΙΌ N0:34, 8ЕО ΙΌ N0:35, 8ЕО ΙΌ N0:36, 8ЕО ΙΌ N0:37, 8ЕО ΙΌ N0:38, 8ЕО ΙΌ N0:39, 8ЕО ΙΌ N0:40, 8ЕО ΙΌ N0:41, 8ЕО ΙΌ N0:42, 8ЕО ΙΌ N0:43, 8ЕО ΙΌ N0:44, 8ЕО ΙΌ N0:45, 8ЕО ΙΌ N0:46, 8ЕО ΙΌ N0:47, 8ЕО ΙΌ N0:48 и 8ЕО ΙΌ N0:49. В предпочтительном варианте изобретения связывающие молекулы согласно изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую, в основном, аминокислотную последовательность, содержащую аминокислоты 1-119 8Е0 ΙΌ N0:335.

В другом варианте изобретения связывающие молекулы согласно изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:26 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:50; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:27 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:51; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:28 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:52; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:29 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:53; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:30 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:54; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:31 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:55; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:32 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:56; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:33 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:57; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:34 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:58; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:35 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:59; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:36 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:60; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:37 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:61; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:38 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:62; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:39 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:63; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:40 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:64; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:41 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:65; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:42 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:66; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:43 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:67; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:44 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:68; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:45 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:69; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:46 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:70; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:47 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:71; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:48 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:72; вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:49 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:73. В предпочтительном варианте изобретения человеческие связывающие молекулы согласно изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, содержащую аминокислоты 1-119 8Е0 ΙΌ N0:335, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, содержащую аминокислоты 1-107 8Е0 ΙΌ N0:337.

- 9 010785

В предпочтительном варианте изобретения связывающие молекулы, обладающие активностью, нейтрализующей вирус бешенства согласно изобретению, вводят в 1дС-формате, а предпочтительно в 1дС1-формате.

Другой аспект настоящего изобретения включает функциональные варианты определенных здесь связывающих молекул. Молекулы рассматриваются как функциональные варианты связывающей молекулы согласно изобретению, если такие варианты обладают способностью конкурировать с родительскими связывающими молекулами за специфическое связывание с вирусом бешенства или с его фрагментом. Другими словами, они считаются функциональными вариантами, если они обладают способностью связываться с вирусом бешенства или с его фрагментом. Такие функциональные варианты также должны обладать активностью, нейтрализующей вирус бешенства. Функциональными вариантами являются, но не ограничиваются ими, производные, которые, по существу, аналогичны исходной структурной последовательности, но которые содержат, например, ίη νίίτο или ίη νίνο модификации, химические и/или биохимические модификации, отсутствующие в родительской связывающей молекуле. Такими модификациями являются, ίηίοΓ айа, ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное связывание с флавином, ковалентное связывание с гемом, ковалентное связывание с нуклеотидом или нуклеотидным производным, ковалентное связывание с липидом или с липидным производным, ковалентное связывание с фосфотидилинозитом, перекрестное связывание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистина, образование пироглутамата, формилирование, γ-карбоксилирование, гликозилирование, образование СР1-якоря, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, ПЭГилирование, протеолитическое отщепление, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, сульфирование и опосредуемое переносом РНК присоединение аминокислот к белкам, такое как аргинилирование, убихитинизация и т. п.

Альтернативно, функциональными вариантами могут быть определенные в настоящем изобретении связывающие молекулы, включающие аминокислотную последовательность, содержащую замены, инсерции, делеции или их комбинации из одной или более аминокислот, по сравнению с аминокислотными последовательностями родительских связывающих молекул. Кроме того, функциональные варианты могут иметь усечения аминокислотной последовательности у любого из амино- или карбоксиконцов, или у обоих концов. Функциональные варианты согласно изобретению могут иметь одинаковые или различные, более высокие или более низкие аффинности связывания по сравнению с аффинностью связывания родительской связывающей молекулы, но при этом они обладают способностью связываться с вирусом бешенства или с его фрагментом и обладают способностью нейтрализовать вирус бешенства. Так, например, функциональные варианты согласно изобретению могут иметь более высокие или более низкие аффинности связывания с вирусом бешенства или с его фрагментом по сравнению с родительскими связывающими молекулами либо они могут обладать более высокой или более низкой активностью, нейтрализующей вирус бешенства. При этом предпочтительно, чтобы аминокислотные последовательности вариабельных областей, включая, но не ограничиваясь ими, каркасные области, гипервариабельные области, а в частности, области ί.ΌΒ3. были модифицированы. В общих чертах вариабельные области легкой и тяжелой цепей содержат три гипервариабельных области, включающие три СЭВ, и более консервативные области, так называемые каркасные области (РВ). Гипервариабельные области содержат аминокислотные остатки от СОВ и аминокислотные остатки от гипервариабельных петель. Функциональные варианты, входящие в объем настоящего изобретения, имеют последовательность по меньшей мере примерно на 50-99%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60-99%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 70-99%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80-99%, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 90-99%, а в частности по меньшей мере примерно на 95-99% и конкретно по меньшей мере примерно на 97-99% гомологичную аминокислотной последовательности родительских связывающих молекул, определенных в настоящем изобретении. Для оптимального сопоставления сравниваемых аминокислотных последовательностей и для определения аналогичных или идентичных аминокислотных остатков могут быть применены компьютерные алгоритмы, такие как ίηίοΓ айа, Сар или Ββδίίίί, известные специалистам в данной области.

В другом варианте изобретения функциональные варианты могут быть получены в том случае, если родительская связывающая молекула содержит в своей последовательности сайт гликозилирования, который будет обеспечивать гликозилирование связывающей молекулы после ее экспрессии в эукариотических клетках, а следовательно, эти функциональные варианты могут блокировать связывание с антигеном. Продуцированный таким образом функциональный вариант больше не будет содержать сайт гликозилирования, но будет сохранять способность связываться с вирусом бешенства и будет обладать нейтрализующей активностью.

Функциональные варианты могут быть получены путем модификации родительских связывающих молекул или их частей общими методами молекулярной биологии, известными специалистам, включая, но не ограничиваясь ими, ПЦР с вероятностью ошибки, олигонуклеотид-направленный мутагенез и сайтнаправленный мутагенез. Кроме того, функциональные варианты могут обладать комплементфиксирующей активностью, способностью стимулировать лизис вирусов бешенства с оболочкой и/или

- 10 010785 действовать как опсонины и усиливать фагоцитоз вируса бешенства либо путем стимуляции его поглощения посредством Ес- или С3Ь-рецепторов, либо путем агглютинации вируса бешенства, которая способствует фагоцитозу.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение включает иммуноконъюгаты, т.е. молекулы, содержащие по меньшей мере одну связывающую молекулу или ее функциональный вариант, определенные в настоящем изобретении и дополнительно содержащие по меньшей мере одну метку, такую как ш!ег аНа, детектируемую молекулу/детектируемый агент. В настоящем изобретении также рассматриваются смеси иммуноконъюгатов согласно изобретению или смеси по меньшей мере одного иммуноконъюгата согласно изобретению, и другой молекулы, такой как терапевтическое средство, или другой связывающей молекулы или иммуноконъюгата. В другом варианте изобретения иммуноконъюгаты согласно изобретению могут содержать одну или более меток. Эти метки могут быть одинаковыми, либо они могут отличаться друг от друга и могут быть нековалентно связаны/конъюгированы со связывающими молекулами. Такая метка(и) может(могут) быть также непосредственно связана(ы)/конъюгирована(ы) со связывающими молекулами посредством ковалентного связывания, включая, но не ограничиваясь им, образование дисульфидных связей, образование водородных связей, электростатическое связывание, рекомбинантное присоединение и конформационное связывание. Альтернативно, указанная(ые) метка(и) может(могут) быть связана(ы)/конъюгирована(ы) со связывающими молекулами посредством одного или нескольких линкерных соединений. Методы конъюгирования меток со связывающими молекулами хорошо известны специалистам.

Метками иммуноконъюгатов согласно изобретению могут быть терапевтические средства, а более предпочтительно детектируемые молекулы/агенты. Иммуноконъюгаты, содержащие детектируемый агент, могут быть использованы в диагностических целях, например, для установления факта инфицирования данного индивидуума вирусом бешенства, или для мониторинга развития или прогрессирования инфекции, вызванной вирусом бешенства, в процессе проведения клинических испытаний, например, для определения эффективности данного курса лечения. Однако эти иммуноконъюгаты могут быть также использованы в других методах детекции и/или в аналитических и/или диагностических целях. Детектируемыми молекулами/агентами являются, но не ограничиваются ими, ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, биолюминесцентные вещества, радиоактивные вещества, позитрон-излучающие металлы и ионы нерадиоактивных металлов, обладающих парамагнитными свойствами.

Выбор меток, используемых для мечения связывающих молекул в целях детекции и/или в аналитических и/или диагностических целях, зависит от конкретных методов детекции/анализа/диагностики и/или от применяемых методов, таких как ш!ег аНа, иммуногистохимическое окрашивание образцов (ткани), проточная цитометрическая детекция, сканирующая лазерная цитометрическая детекция, флуоресцентные иммуноанализы, твердофазные иммуноферментые анализы (ЕЬ18А), радиоиммуноанализы (РИА), биоанализы (например, анализы на нейтрализацию), Вестерн-блот-анализ и т. п. Для осуществления иммуногистохимического окрашивания образцов ткани предпочтительными метками являются ферменты, которые катализируют продуцирование и локальное осаждение детектируемого продукта. Ферменты, обычно конъюгированные со связывающими молекулами для облегчения иммуногистохимической визуализации, хорошо известны специалистам, и такими ферментами являются, но не ограничиваются ими, ацетихолинэстераза, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкозо-оксидаза, пероксидаза хрена и уреаза. Типичные субстраты для продуцирования и осаждения визуально детектируемых продуктов также хорошо известны специалистам. Кроме того, иммуноконъюгаты согласно изобретению могут быть помечены с использованием коллоидального золота, либо они могут быть помечены радиоизотопами, такими как ³³Р, ³²Р, ³⁵§, ³Н и ¹²⁵1.

Связывающие молекулы согласно изобретению могут быть присоединены к радионуклидам непосредственно или опосредованно через хелатообразующий агент методами, хорошо известными специалистам.

Если связывающие молекулы согласно изобретению используются для проточной цитометрической детекции, сканирующей лазерной цитометрической детекции или флуоресцентных иммуноанализов, то они могут быть помечены соответствующими флуорофорами. Флуорофоры широкого спектра, применяемые для флуоресцентного мечения связывающих молекул согласно изобретению, известны специалистам. Если связывающие молекулы согласно изобретению применяются для вторичной детекции с использованием меченого авидина, стрептавидина, каптавидина или нейтравидина, то такие связывающие молекулы могут быть помечены биотином с образованием подходящих комплексов, содержащих простетическую группу.

Если иммуноконъюгаты согласно изобретению применяются в диагностических целях ίη νίνο, то такие связывающие молекулы могут быть сделаны детектируемыми путем конъюгирования, например, с контрастными агентами для магнитно-резонансной томографии (МРТ), такими как комплекс гадолинийдиэтилентриаминпентауксусная кислота; с контрастными агентами для ультразвуковой диагностики или с контрастными агентами для рентгенографии либо путем мечения радиоизотопами.

Кроме того, связывающие молекулы, их функциональные варианты или иммуноконъюгаты соглас

- 11 010785 но изобретению могут быть также присоединены к твердым носителям, которые являются особенно подходящими для проведения ίη νίίΓΟ иммуноанализов или для очистки вируса бешенства или его фрагмента. Твердые носители могут быть пористыми или непористыми, планарными или непланарными, и такими носителями являются, но не ограничиваются ими, стекло, целлюлоза, полиакриламид, найлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен. Например, человеческие связывающие молекулы могут быть соответствующим образом конъюгированы с материалом для фильтрации, таким как ΝΗ8активированная сефароза или С№г-активированная сефароза, для проведения иммуноаффинной хроматографии. Они могут быть также соответствующим образом присоединены к парамагнитным микросферам, обычно, посредством взаимодействия биотин-стрептавидин. Микросферы могут быть использованы для выделения вируса бешенства или его фрагмента из образца, содержащего вирус бешенства или его фрагмент. В другом варианте человеческие связывающие молекулы согласно изобретению могут быть соответствующим образом присоединены к поверхности микротитрационного планшета для ЕЫ8А.

Связывающие молекулы согласно изобретению или их функциональные варианты могут быть присоединены к маркерным последовательностям, таким как пептид, для облегчения очистки. Примерами являются, но не ограничиваются ими, гексагистидиновая метка, гемаглютининовая (НА) метка, тусметка или Вад-метка.

Альтернативно, антитело может быть конъюгировано со вторым антителом с образованием гетероконъюгата антитела. В другом аспекте изобретения человеческие связывающие молекулы согласно изобретению могут быть конъюгированы/связаны с одном или несколькими антигенами. Предпочтительными антигенами являются антигены, распознаваемые иммунной системой индивидуума, которому вводят конъюгат связывающая молекула - антиген. Антигены могут быть идентичными, но могут также отличаться друг от друга. Методы конъюгирования, применяемые для связывания антигенов и связывающих молекул, хорошо известны специалистам, и такими методами являются, но не ограничиваются ими, использование перекрестно-сшивающих агентов. Человеческие связывающие молекулы будут связываться с вирусом бешенства, а антигены, связанные с человеческими связывающими молекулами, будут инициировать мощную Т-клеточную атаку на указанный конъюгат, что, в конечном счете, будет приводить к деструкции вируса бешенства.

Помимо химического продуцирования иммуноконъюгатов путем прямого или опосредованного конъюгирования, например, посредством линкера, иммуноконъюгаты могут быть продуцированы в виде гибридных белков, содержащих человеческие связывающие молекулы согласно изобретению и подходящую метку. Гибридные белки могут быть продуцированы методами, известными специалистам, такими как, например, рекомбинантный метод конструирования молекул нуклеиновой кислоты, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие человеческие связывающие молекулы в одной рамке считывания с нуклеотидными последовательностями, кодирующими подходящую(ие) метку(и), с последующей экспрессией указанных молекул нуклеиновой кислоты.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей, по меньшей мере, связывающую молекулу или ее функциональный вариант согласно изобретению. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы в качестве промежуточных соединений для клонирования, например, в процессе аффинного созревания, как описано выше. В предпочтительном варианте изобретения молекулы нуклеиновой кислоты являются выделенными или очищенными.

Для специалиста в данной области очевидно, что функциональные варианты этих молекул нуклеиновой кислоты также являются частью настоящего изобретения. Функциональные варианты представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, которые могут быть непосредственно транслированы в соответствии со стандартным генетическим кодом, в результате чего образуется аминокислотная последовательность, идентичная последовательности, транслируемой из родительских молекул нуклеиновой кислоты.

Предпочтительно молекулы нуклеиновой кислоты кодируют связывающие молекулы, содержащие область СЭКЗ, а предпочтительно область СЭКЗ тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:1, 8ЕЦ ΙΌ N0:2, 8ЕЦ ΙΌ N0:3, 8ЕЦ ΙΌ N0:4, 8ЕЦ ΙΌ N0:5, 8ЕЦ ΙΌ N0:6, 8ЕЦ ΙΌ N0:7, 8ЕЦ ΙΌ N0:8, 8ЕЦ ΙΌ N0:9, 8ЕЦ ΙΌ N0:10, 8ЕЦ ΙΌ N0:11, 8ЕЦ ΙΌ N0:12, 8ЕЦ ΙΌ N0:13, 8ЕЦ ΙΌ N0:14, 8ЕЦ ΙΌ N0:15, 8ЕЦ ΙΌ N0:16, 8ЕЦ ΙΌ N0:17, 8ЕЦ ΙΌ N0:18, 8ЕЦ ΙΌ N0:19, 8ЕЦ ΙΌ N0:20, 8ЕЦ ΙΌ N0:21, 8ЕЦ ΙΌ N0:22, 8ЕЦ ΙΌ N0:23 и 8ЕЦ ΙΌ N0:24.

Еще более предпочтительно молекулы нуклеиновой кислоты кодируют человеческие связывающие молекулы, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, включающую, в основном, аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0:26, 8ЕЦ ΙΌ N0:27, 8ЕЦ ΙΌ N0:28, 8ЕЦ ΙΌ N0:29, 8ЕЦ ΙΌ N0:30, 8ЕЦ ΙΌ N0:31, 8ЕЦ ΙΌ N0:32, 8ЕЦ ΙΌ N0:33, 8ЕЦ ΙΌ N0:34, 8ЕЦ ΙΌ N0:35, 8ЕЦ ΙΌ N0:36, 8ЕЦ ΙΌ N0:37, 8ЕЦ ΙΌ N0:38, 8ЕЦ ΙΌ N0:39, 8ЕЦ ΙΌ N0:40, 8ЕЦ ΙΌ N0:41, 8ЕЦ ΙΌ N0:42, 8ЕЦ ΙΌ N0:43, 8ЕЦ ΙΌ N0:44, 8ЕЦ ΙΌ N0:45, 8ЕЦ ΙΌ N0:46, 8ЕЦ ΙΌ N0:47, 8ЕЦ ΙΌ N0:48 и 8ЕЦ ΙΌ N0:49. В особенно предпочтительном варианте изобретения молекулы нуклеиновой кислоты кодируют связывающие молекулы, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, вклю

- 12 010785 чающую, в основном, аминокислотную последовательность, содержащую аминокислоты 1-119 8Е0 Ш N0:335.

В еще одном варианте изобретения молекулы нуклеиновой кислоты кодируют связывающие молекулы, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:26 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:50; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:27 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:51; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:28 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:52; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:29 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:53; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:30 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:54; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:31 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:55; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:32 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:56; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:33 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:57; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:34 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:58; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:35 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:59; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:36 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:60; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:37 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:61; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:38 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:62; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:39 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:63; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:40 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:64; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:41 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:65; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:42 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:66; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:43 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:67; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:44 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:68; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:45 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:69; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:46 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:70; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:47 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:71; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:48 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:72; либо они кодируют вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:49 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:73. В предпочтительном варианте изобретения молекулы нуклеиновой кислоты кодируют человеческие связывающие молекулы, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, содержащую аминокислоты 1-119 8Е0 Ш N0:335 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, содержащую аминокислоты 1-107 8Е0 Ш N0:337.

В конкретном варианте изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельную

- 13 010785 область тяжелой цепи связывающих молекул согласно изобретению, содержат, в основном, нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0:74, 8Е0 ГО N0:75, 8Е0 ГО N0:76, 8ЕО ГО N0:77, 8ЕО ГО N0:78, 8ЕО ГО N0:79, 8ЕО ГО N0:80, 8ЕО ГО N0:81, 8ЕО ГО N0:82, 8ЕО ГО N0:83, 8ЕО ГО N0:84, 8ЕО ГО N0:85, 8ЕО ГО N0:86, 8ЕО ГО N0:87, 8ЕО ГО N0:88, 8ЕО ГО N0:89, 8ЕО ГО N0:90, 8ЕО ГО N0:91, 8ЕО ГО N0:92, 8ЕО ГО N0:93, 8ЕО ГО N0:94, 8ЕО ГО N0:95, 8ЕО ГО N0:96 и 8Е0 ГО N0:97. Предпочтительно молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи связывающих молекул согласно изобретению, содержат, в основном, нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотиды 1-357 8Е0 ГО N0:334.

В еще одном конкретном варианте изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельную область легкой цепи связывающих молекул согласно изобретению, содержат, в основном, нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0:98, 8Е0 ГО N0:99, 8ЕО ГО N0:100, 8ЕО ГО N0:101, 8ЕО ГО N0:102, 8ЕО ГО N0:103, 8ЕО ГО N0:104, 8ЕО ГО N0:105, 8ЕО ГО N0:106, 8ЕО ГО N0:107, 8ЕО ГО N0:108, 8ЕО ГО N0:109, 8ЕО ГО N0:110, 8ЕО ГО N0:111, 8ЕО ГО N0:112, 8 ЕС) ГО N0:113, 8ЕС) ГО N0:114, 8ЕС) ГО N0:115, 8ЕС) ГО N0:116, 8 ЕС) ГО N0:117, 8ЕС) ГО N0:118, 8Е0 ГО N0:119, 8Е0 ГО N0:120 и 8Е0 ГО N0:121. Предпочтительно молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельную область легкой цепи человеческих связывающих молекул согласно изобретению, содержат, в основном, нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотиды 1-321 8ЕС) ГО N0:336.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к векторам, т.е. к конструкциям нуклеиновой кислоты, содержащим одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Векторы могут быть получены из плазмид, таких как йИег айа, Е, К1, КР1, Со1, рВК322, Т0Ь, Τι и т.п.; космид; фагов, таких как лямбда, лямбдоид, М13, Ми, Р1, Р22, 0|_;. Т-фаги четные, Т-фаги нечетные, Т2, Т4, Т7 и т.п.; вирусов растений, таких как т1ег айа, вирус мозаики люцерны, бромовирус, капилловирус, карлавирус, кармовирус, кауливирус, клостервирус, комовирус, криптовирус, кукумовирус, димантовирус, фабавирус, фидживирус, фуровирус, геминивирус, хордейвирус, иларвирус, лютеовирус, махловирус, марафивирус, некровирус, неповирус, фиторепвирус, растительный рабдовирус, потексвирус, потивирус, собемовирус, теньювирус, тобамовирус, тобравирус, вирус пятнистого увядания томатов, томбусвирус, тимовирус и т.п.; или вирусов животных, такие как, 1п1сг айа, аденовирус, аренавирус, бакуловирус, бирнавирус, буньявирус, кальцивирус, кардиовирус, коронавирус, кортиковирус, цистовирус, вирус Эпштейна-Барра, энтеровирус, филовирус, флавивирус, вирус ящура, гепаднавирус, вирус гепатита, герпесвирус, вирус иммунодефицита, вирус гриппа, иновирус, иридовирус, ортомиксовирус, паповавирусы, парамиксовирус, парвовирус, пикорнавирус, полиовирус, полиднавирус, поксвирус, реовирус, ретровирусы, рабдавирус, риновирусы, вирус лесов семлики, тетравирус, тогавирус, торовирус, вирус коровьей оспы, вирус везикулярного стоматита и т. п. Векторы могут быть использованы для клонирования и/или экспрессии человеческих связывающих молекул согласно изобретению и могут быть даже использованы для генотерапии. В объем настоящего изобретения входят также векторы, содержащие одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению, функционально присоединенных к одной или к нескольким регулирующим экспрессию молекулам нуклеиновой кислоты. Выбор вектора зависит от применяемых рекомбинантных методов и от используемого хозяина. Введение векторов в клеткихозяева может быть осуществлено, йИсг айа, путем трансфекции с использованием фосфата кальция; инфицирования вирусом; трансфекции, опосредованной ОЕАЕ-декстраном; трансфекции, опосредованной липофектамином; или электропорации. Векторы могут реплицироваться автономно, либо они могут реплицироваться вместе с хромосомой, в которую они были интегрированы. Указанные векторы предпочтительно содержат один или несколько селективных маркеров. Выбор маркеров может зависеть от выбранных клеток-хозяев, хотя, как известно специалистам, он не играет решающей роли для осуществления изобретения. Такими маркерами являются, но не ограничиваются ими, канамицин, неомицин, пуромицин, гигромицин, зеоцин, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (Ηδν-ΤΚ) и ген дигидрофолатредуктазы мыши (йЫг). Векторы, содержащие одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих описанные выше человеческие связывающие молекулы, функционально присоединенные к одной или нескольким молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим белки или пептиды, которые могут быть использованы для выделения связывающих молекул, также входят в объем настоящего изобретения. Такими белками или пептидами являются, но не ограничиваются ими, глутатион-8-транфераза, мальтозосвязывающий белок, металлсвязывающий полигистидин, белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра, люцифераза и β-галактозидаза.

Другим объектом настоящего изобретения являются хозяева, содержащие одну или несколько копий вышеупомянутых векторов. Указанные хозяева предпочтительно представляют собой клеткихозяева. Клетками-хозяевами являются, но не ограничиваются ими, клетки млекопитающих, растений, грибов или бактерий. Бактериальными клетками являются, но не ограничиваются ими, клетки грамположительных бактерий, таких как некоторые виды бактерий рода ВасШиз, 81гср1отусс5 и 81арНу1ососси8, или клетки грамотрицательных бактерий, таких как некоторые виды бактерий рода ЕзсйейсЫа, таких как Е.сой и Рзеийотопаз. Из грибковых клеток предпочтительно использовать дрожжевые клетки. Экс- 14 010785 прессия в дрожжах может быть достигнута с использованием таких дрожжевых штаммов, как 1п1ег ака, Р1ск1а разЮпз, 8асскаготусез ееге\из1ае и Наизеии1а ро1утогрка. Кроме того, в качестве клеток-хозяев могут быть использованы клетки насекомых, такие как клетки ОгозоркПа и 8£9. Помимо этого, клеткамихозяевами могут быть клетки растений.

Трансформированные (трансгенные) растения или клетки растений получают известными методами, например путем Адгокас1епит-опосредованного переноса генов, трансформации листовых дисков, трансформации протопластов посредством индуцированного полиэтиленгликолем переноса ДНК, электропорации, обработки ультразвуком, микроинжекции или биобаллистического переноса генов. Кроме того, подходящей экспрессионной системой может быть бакуловирусная система. В настоящем изобретении предпочтительными экспрессионными системами являются системы на основе клеток млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки СО8, клетки ВНК или клетки меланомы Боуэса. Клетки млекопитающих экспрессируют белки с посттрансляционными модификациями, которые имеют наибольшее сходство с природными молекулами млекопитающих. Поскольку в настоящем изобретении рассматриваются молекулы, которые могут быть введены человеку, то особенно предпочтительной должна быть экспрессионная система, которая полностью происходит от человека. Поэтому еще более предпочтительными клетками-хозяевами являются человеческие клетки. Примерами человеческих клеток являются, т!ег ака, клетки НеЬа, 911, АТ1080, А549, 293 и НЕК293Т. Предпочтительными клетками млекопитающих являются клетки сетчатки глаза человека, такие как клетки 911 или клеточная линия, депонированная в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС), САМВ, 8а11зкшу, ХУШзкие 8Р4 О1С, в Великобритании 29 февраля 1996 г. под регистрационным номером 96022940 и имеющаяся в продаже под торговым знаком РЕВ.С6® (РЕВ.С6 - зарегистрированный торговый знак фирмы СгисеП Но11аиб В.У.). В описании настоящей заявки РЕВ.С6 означает клетки, депонированные под номером 96022940, или их предшественники, предшествующие или последующие пассажи, а также потомки предшественников депонированных клеток и любые их производные.

В предпочтительных вариантах изобретения человеческие клетки-продуценты содержат, по меньшей мере, функциональную часть последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующую область Е1 аденовируса в экспрессируемом формате. В еще более предпочтительных вариантах изобретения указанные клетки-хозяева происходят от человеческой сетчатки и были подвергнуты иммортализации нуклеиновыми кислотами, содержащими последовательности Е1 аденовируса, и указанная клеточная линия депонирована в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС), САМВ, 8акзкшу, ХУШзкке 8Р4 О1С в Великобритании 29 февраля 1996 г. под регистрационным номером 96022940 и является коммерчески доступной под торговым знаком РЕВ.С6®. Продуцирование рекомбинантных белков в клеткаххозяевах может быть осуществлено методами, хорошо известными специалистам. Применение клеток, являющихся коммерчески доступными под торговым знаком РЕВ.С6® и используемых в качестве основы для продуцирования представляющих интерес белков, было описано в заявке \¥О 00/63403, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Способ продуцирования связывающей молекулы или ее функционального варианта согласно изобретению является дополнительной частью настоящего изобретения. Такой способ включает стадии а) культивирования хозяина согласно изобретению в условиях, благоприятствующих экспрессии связывающей молекулы или ее функционального варианта, и к) необязательно, выделения экспрессированной связывающей молекулы или ее функционального варианта. Экспрессированные связывающие молекулы или их функциональные варианты могут быть выделены из бесклеточного экстракта, но предпочтительно их выделяют из культуральной среды. Методы выделения белков, таких как связывающие молекулы, из бесклеточных экстрактов или культуральной среды хорошо известны специалистам. Связывающие молекулы или их функциональные варианты, которые могут быть получены вышеописанным способом, также являются частью настоящего изобретения.

Альтернативно помимо экспрессии в хозяине, таком как клетки-хозяева, связывающие молекулы или их функциональные варианты согласно изобретению могут быть продуцированы путем синтеза на стандартных пептидных синтезаторах или в бесклеточных системах трансляции с использованием РНК, происходящей от молекул ДНК согласно изобретению. Связывающая молекула или ее функциональные варианты, продуцируемые вышеописанными методами синтеза или в бесклеточных системах трансляции, также являются частью настоящего изобретения.

В другом варианте изобретения связывающие молекулы или их функциональные варианты согласно изобретению могут быть продуцированы трансгенными млекопитающими, не являющимися человеком, такими как, например, трансгенные мыши или кролики, у которых экспрессируются человеческие гены иммуноглобулина. Предпочтительно трансгенные млекопитающие, не являющиеся человеком, имеют геном, содержащий трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, кодирующие все человеческие связывающие молекулы, описанные выше, или их часть. Трансгенные млекопитающие, не являющиеся человеком, могут быть иммунизованы очищенным или обогащенным препаратом вируса бешенства или его фрагмента. Протоколы иммунизации млекопитающих, не являющихся человеком, хорошо известны специалистам. См. руководство Изтд АпНЬоб1ез: А БаЬогаЮгу

- 15 010785

Мапиа1, Ебйеб Ьу: Е. Нат1оте апб Ό. Ьапе (1988), Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б 8ртшд НагЬог, №\ν Уогк, апб Сиггеп! Рто1осо15 ίη 1штипо1о§у, Ебйеб Ьу: ЕЕ. СоЬдап, А.М. КтшзЬеек, Ό.Η. МатдиНек, Е.М. 8ЬеуасЬ, ^. 81гоЬег (2001), 1оЬп \УПеу & 8оп§ 1пс., №\ν Уогк, описание которого вводится в настоящее изобретение посредством ссылки.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации связывающих молекул, таких как человеческие моноклональные антитела или их фрагменты согласно изобретению, или молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению, способных специфически связываться с вирусом бешенства, где указанный способ включает стадии а) контактирования набора связывающих молекул на поверхности реплицируемых генных упаковок с вирусом бешенства или с его фрагментом в условиях, способствующих такому связыванию, Ь) по меньшей мере одного раунда отбора на связывание реплицируемых генных упаковок с вирусом бешенства или с его фрагментом, и с) выделения и очистки реплицируемых генных упаковок, связывающихся с вирусом бешенства или с его фрагментом.

Стадия отбора может быть проведена в присутствии вируса бешенства. Вирус бешенства может быть изолированным или неизолированным, например, он может присутствовать в сыворотке или в крови инфицированного индивидуума. В другом варианте изобретения указанный вирус бешенства является инактивированным. Альтернативно, стадия отбора может быть проведена в присутствии фрагмента вируса бешенства, такого как внеклеточная часть вируса бешенства, одного или нескольких (полипептидов, происходящих от вируса бешенства, таких как С-белок, гибридных белков, содержащих указанные белки или (поли)пептиды и т.п. В другом варианте изобретения в процедурах отбора используются клетки, трансфецированные С-белком вируса бешенства.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения связывающей молекулы или молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, где указанный способ включает стадии а) осуществления вышеописанного способа идентификации связывающих молекул, таких как человеческие моноклональные антитела или их фрагменты согласно изобретению, или молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и Ь) выделения связывающей молекулы и/или нуклеиновой кислоты, кодирующей такую связывающую молекулу, из очищенных реплицируемых генных упаковок. После получения нового моноклонального антитела или его идентификации вышеупомянутым способом идентификации связывающих молекул или молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих указанные связывающие молекулы. ДНК, кодирующая 5сЕу или ЕаЬ, может быть выделена из бактерий или реплицируемых генных упаковок и использована в соответствии со стандартными методами молекулярной биологии для получения конструкций, кодирующих двухвалентные 5сЕу или полноразмерные человеческие иммуноглобулины с нужной специфичностью (например, 1дС, 1дА или 1дМ). Эти конструкции могут быть трансфецированы в подходящие клеточные линии, после чего могут быть продуцированы полностью человеческие моноклональные антитела (см., Ни15 е1 а1., 1999; Вое1 е1 а1., 2000).

Используемая здесь реплицируемая генная упаковка может быть прокариотической или эукариотической и включает клетки, споры, бактерии, вирусы (бактерио)фаги и полисомы. Предпочтительной реплицируемой генной упаковкой является фаг. Человеческие связывающие молекулы, такие как, например, одноцепочечные Εν, представлены на указанной реплицируемой генной упаковке, т.е. они присоединены к группе или к молекуле, локализованной на внешней поверхности реплицируемой генной упаковки. Реплицируемая генная упаковка представляет собой скринируемую единицу, содержащую скринируемую человеческую связывающую молекулу, присоединенную к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную связывающую молекулу. Молекула нуклеиновой кислоты должна реплицироваться либо ш νί\Ό (например, в качестве вектора), либо ш νίύΌ (например, посредством ПЦР, транскрипции и трансляции). Репликация ш νί\Ό может осуществляться автономно (как в клетках) либо с помощью факторов хозяина (как в случае вирусов), либо с помощью вируса хозяина или вируса-помощника (как в случае фагмиды). Реплицируемые генные упаковки, представляющие набор человеческих связывающих молекул, образуются при введении молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих представляемые экзогенные связывающие молекулы, в геномы реплицируемых генных упаковок, в результате чего продуцируются гибридные белки, содержащие эндогенные белки, которые обычно экспрессируются на внешней поверхности реплицируемых генных упаковок. Экспрессия гибридных белков, их транспорт на внешнюю поверхность и сборка приводят к представлению экзогенных связывающих молекул на внешней поверхности указанных реплицируемых генных упаковок. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к человеческой связывающей молекуле, которая способна связываться с вирусом бешенства или с его фрагментом и которая может быть получена описанным выше методом идентификации.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации связывающей молекулы, предположительно обладающей активностью, нейтрализующей вирус бешенства, где указанный способ включает стадии (а) контактирования набора связывающих молекул на поверхности реплицируемых генных упаковок с вирусом бешенства в условиях, способствующих связыванию, (Ь) очистки и отделения связывающих молекул, которые связываются с вирусом бешенства, от связывающих молекул, которые не связываются с вирусом бешенства, (с) выделения по меньшей мере одной из собранных связывающих молекул, (б) подтверждения нейтрализующей активности связывающей молекулы против вируса бешенства, где указанный способ отличается тем, что вирус бешенства в стадии (а)

- 16 010785 является инактивированным. Инактивированный вирус бешенства может быть очищен, а затем инактивирован. Очистка может быть проведена хорошо известными методами, обычно используемыми для очистки вирусов, такими как, например, центрифугирование через глицериновую подушку. Перед использованием инактивированный вирус бешенства в стадии (а) может быть иммобилизован на подходящем носителе. Альтернативно вирус бешенства в стадии (а) может обладать некоторой активностью. В другом альтернативном варианте изобретения в стадии (а) используется фрагмент вируса бешенства, такой как полипептид вируса бешенства, например О-белок. В еще одном варианте изобретения клетки, трансфецированные О-белком вируса бешенства, используются для отбора связывающей молекулы, предположительно обладающей активностью, нейтрализующей вирус бешенства. Как указывается в настоящем описании, если в указанном способе отбора используются клетки, экспрессирующие О-белок вируса бешенства, то число отобранных нейтрализующих антител выше, чем число антител, полученных методом отбора, в котором используются только очищенный О-белок вируса бешенства и/или инактивированный вирус бешенства.

В другом варианте изобретения способ идентификации связывающей молекулы, предположительно обладающей описанной выше активностью, нейтрализующей вирус бешенства, также включает стадию выделения и сбора, и необязательно, очистки человеческих связывающих молекул, содержащих ген вариабельной области 3-30 тяжелой цепи зародышевой линии. Специалист в данной области может идентифицировать специфический ген зародышевой линии известными методами, такими как, например, секвенирование нуклеотидов. Стадия выделения и сбора связывающих молекул, содержащих ген вариабельной области 3-30 тяжелой цепи зародышевой линии, может быть проведена до или после проведения стадии (с). Как указывается ниже, большинство человеческих моноклональных антител, нейтрализующих вирус бешенства и описанных в настоящем изобретении, содержат указанный специфический ген У_н зародышевой линии.

Методы фагового представления, применяемые для идентификации и получения (нейтрализации) связывающих молекул, например антител, являются в настоящее время хорошо разработанными методами, известными специалистам. Эти методы описаны, например, в патенте США № 5696108; Вийон & ВагЬак, 1994; бе КгшГ с1 а1., 1995Ь; и Рйаде Э1кр1ау: А ЬаЬота1оту Мапиа1. Ебйеб Ьу: СЕ ВагЬак, Ό.Κ.. Виг1оп. ЕК. 8сой & О.Е 8йуеттап (2001), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота1огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, Иете Уогк. Все эти работы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Для конструирования библиотек фагового представления наборы генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человеческого моноклонального антитела, например одноцепочечного Ενфрагмента (ксЕу) или ЕаЬ-фрагмента, были экспрессированы на поверхности бактериофага, а предпочтительно нитчатого бактериофага, и частиц (см. бе КгшГ е1 а1., 1995Ь). Крупные библиотеки фагов, экспрессирующих фрагмент антитела, обычно содержат более чем 1,0х10⁹ специфичных антител и могут быть собраны из У-областей иммуноглобулина, экспрессированных в В-лимфоцитах иммунизованных или неиммунизованных индивидуумов. В конкретном варианте изобретения фаговую библиотеку человеческих связывающих молекул, а предпочтительно фаговую библиотеку ксЕу, получают из РНК, выделенной из клеток, взятых у индивидуума, которому была введена вакцина против вируса бешенства, или у индивидуума, подвергавшегося воздействию вируса бешенства. РНК может быть выделена ί п(ег аба из костного мозга или периферической крови, а предпочтительно из лимфоцитов периферической крови. Индивидуумом может быть животное, которому была введена вакцина против вируса бешенства, или животное, подвергавшееся воздействию вируса бешенства, но предпочтительным индивидуумом является человек, которому была введена вакцина против вируса бешенства, или человек, подвергавшийся воздействию вируса бешенства. Предпочтительным индивидуумом является вакцинированный индивидуум. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к набору человеческих связывающих молекул на поверхности реплицируемых генных упаковок, таких как фаговая библиотека ксЕу.

Альтернативно, библиотеки фагового представления могут быть сконструированы из вариабельных областей иммуноглобулина, которые были частично собраны ίη уйто для встраивания различных дополнительных антител в данную библиотеку (полусинтетические библиотеки). Так, например, ίη У11го сконструированные вариабельные области содержат фрагменты синтетически продуцированных, рандомизированных или частично рандомизированных ДНК в областях молекул, которые имеют важное значение для специфичности антител, например, в СЭЯ-областях. Представленные на фаге антитела против вируса бешенства могут быть выбраны из этих библиотек путем иммобилизации антигенов-мишеней, например антигенов вируса бешенства, на твердой фазе, с последующей обработкой этих антигенов-мишеней фаговой библиотекой, что будет приводить к связыванию фагов, экспрессирующих фрагменты антитела, специфичные к антигену(ам), иммобилизованному(ым) на твердой фазе. Несвязанные фаги удаляют путем промывки, а связанные фаги элюируют с твердой фазы для инфицирования бактерий ЕксйейсЫа сой (Е.сой), а затем размножают. Для достаточного обогащения фагами, специфически связывающимися с антигеном(ами)-мишенью(ями), обычно требуется проведение множества раундов отбора и размножения. Если это необходимо, то перед обработкой фаговой библиотеки антигенами-мишенями эта фаговая библиотека может быть сначала подвергнута субтрактивному отбору путем обработки фаговой библиотеки антигенами, не являющимися мишенями и связанными с твердой фазой. Фаги могут быть также

- 17 010785 отобраны на связывание с комплексными антигенами, такими как комплексные смеси белков или (поли)пептидов вирусов бешенства, с клетками-хозяевами, экспрессирующими один или несколько белков или (поли)пептидов вируса бешенства, или с самим (инактивированным) вирусом бешенства. Антигенспецифические антитела, представленные в фаге, могут быть выбраны из указанной библиотеки путем инкубирования твердой фазы, на которой иммобилизован препарат инактивированного вируса бешенства, с фаговой библиотекой антител, что позволяет, например, 5сЕν- или ЕаЬ-части фага связываться с белками/полипептидами препарата вируса бешенства. После инкубирования и нескольких промывок, проводимых для удаления несвязанных и слабо присоединенных фагов, фаги, которые своей 5сЕν- или ЕаЬ-частью связываются с данным препаратом, элюируют и используют в целях инфицирования Екс11епс1иа со11 для усиления новой специфичности. Обычно для выделения представляющих интерес фагов из большого избыточного числа несвязывающихся фагов требуется один или несколько раундов отбора. Альтернативно, известные белки или (поли)пептиды вирусов бешенства могут быть экспрессированы в клетках-хозяевах, и эти клетки могут быть использованы для отбора фаговых антител, специфичных для данных белков или (поли)пептидов. Метод фагового представления с использованием этих клеток-хозяев может быть экстраполирован или усовершенствован путем истощения нерелевантных связывающих веществ в процессе скрининга путем добавления избыточного количества клеток-хозяев, не содержащих молекул-мишеней или содержащих молекулы, не являющиеся мишенями, которые аналогичны, но не идентичны этим мишеням, что приводит к значительному повышению вероятности обнаружения релевантных связывающих молекул (этот способ называется способом МАЬкбас!®. МАЬкбас!® представляет собой зарегистрированный торговый знак фирмы Сгисе11 Но11апб В.У., см. также патент США № 6265150, который вводится в настоящее описание посредством ссылки).

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к композициям, содержащим по меньшей мере одну связывающую молекулу, или по меньшей мере один ее функциональный вариант или фрагмент, или по меньшей мере один иммуноконъюгат согласно изобретению, или их комбинацию. Указанные композиции могут также содержать, ш!ег аНа, стабилизирующие молекулы, такие как альбумин, или полиэтиленгликоль, или соли. Предпочтительными солями являются соли, которые сохраняют нужную биологическую активность человеческих связывающих молекул и не вызывают каких-либо нежелательных токсических эффектов. Если это необходимо, то человеческие связывающие молекулы согласно изобретению могут иметь покрытие из соответствующего материала либо могут быть включены в этот материал для защиты от действия кислот или другой природной или неприродной среды, которая может инактивировать связывающие молекулы.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к композициям, содержащим по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в настоящем изобретении. Эти композиции могут включать водные растворы, такие как водные растворы, содержащие соли (например, №1С1 или соли, описанные выше), детергенты (например, ДСН) и/или другие подходящие компоненты.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одну связывающую молекулу согласно изобретению, или по меньшей мере один ее функциональный вариант или фрагмент, или по меньшей мере один иммуноконъюгат согласно изобретению, или по меньшей мере одну композицию согласно изобретению, или их комбинации. Фармацевтическая композиция согласно изобретению также содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.

В предпочтительном варианте изобретения фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере одну дополнительную связывающую молекулу, т.е. такой фармацевтической композицией может быть коктейль/смесь из связывающих молекул. Фармацевтическая композиция может содержать по меньшей мере две связывающих молекулы согласно изобретению или по меньшей мере одну связывающую молекулу согласно изобретению и по меньшей мере одну дополнительную связывающую молекулу, направленную против вируса бешенства. Указанная дополнительная связывающая молекула предпочтительно содержит область ί.ΌΕ3. включающую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ΙΌ N0:25. Связывающая молекула, содержащая область СОК3, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:25, может представлять собой химерное или гуманизованное моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, а предпочтительно человеческое моноклональное антитело или его функциональный фрагмент. В одном из вариантов изобретения связывающая молекула содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:273. В другом варианте изобретения связывающая молекула содержит вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ΙΌ N0:275. В еще одном варианте изобретения связывающая молекула содержит тяжелую и легкую цепь, включающую аминокислотные последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0:123 и 8ЕЦ ΙΌ N0:125 соответственно. Связывающие молекулы в указанной фармацевтической композиции должны быть способны реагировать с различными неконкурирующими эпитопами вируса бешенства. Эти эпитопы могут присутствовать на С-белке вируса бешенства и могут представлять собой различные неперекрывающиеся эпитопы. Связывающие молекулы должны иметь высокую аффинность и широкую специфичность. Предпочтительно эти молекулы нейтрализуют как можно большее количество фиксированных и уличных штаммов вируса бешенства. Еще бо

- 18 010785 лее предпочтительно эти молекулы также обладают нейтрализующей активностью, направленной на другие генотипы вирусов, принадлежащих к роду лиссавирусов, или даже на другие вирусы, принадлежащие к семейству рабдовирусов, но при этом они не способны перекрестно реагировать с другими вирусами или с белками нормальных клеток. Предпочтительно связывающая молекула обладает способностью нейтрализовать варианты вируса, ускользающие от другой связывающей молекулы, присутствующей в данном коктейле.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере две связывающие молекулы, нейтрализующие вирус бешенства, а предпочтительно (человеческие) связывающие молекулы согласно изобретению, где указанная композиция отличается тем, что в ней связывающие молекулы способны реагировать с различными неконкурирующими эпитопами вируса бешенства. В одном из вариантов изобретения фармацевтическая композиция содержит первую связывающую молекулу, которая нейтрализует вирус бешенства и обладает способностью реагировать с эпитопом, локализованным в антигенном сайте I С-белка вируса бешенства, и вторую связывающую молекулу, которая нейтрализует вирус бешенства и обладает способностью реагировать с зпитопом, локализованным в антигенном сайте III С-белка вируса бешенства. Антигенная структура гликопротеина вируса бешенства была впервые определена ΕπΓοη с1 а1. (1983). Антигенные сайты вирусов и их соответствующие тАЬ-резистентные варианты были идентифицированы с использованием панели мышиных тАЬ. После этого указанные антигенные сайты были картированы путем идентификации аминокислотных мутаций в гликопротеине тАЬ-резистентных вариантов (см. 8е1Г с1 а1., 1985; Рте1аиб с1 а1., 1988 и Βοηιη;·ιη5οιΐΓ с1 а1., 1991). Большинство тАЬ, нейтрализующих вирус бешенства, направлены против антигенного сайта II (см. Βοηιη;·ιη5οιΐΓ с1 а1., 1991), который представляет собой дискретный конформационный эпитоп, содержащий аминокислоты 34-42 и аминокислоты 198-200 (см. Ргскшб с1 а1., 1988). Антигенным сайтом III является непрерывный конформационный эпитоп, состоящий из аминокислот 330-338 и имеющий два заряженных остатка, К330 и В333, которые влияют на патогенность вируса (см. 8е1Г с1 а1., 1985; ί’οιιΐοη с1 а1., 1998 и Οίοίζδοίιοίά с1 а1., 1983). Конформационный антигенный сайт I был определен с использованием только одного тАЬ, 509-6, и локализован в положении аминокислоты 231 (см. Βα·ιιη;·ιη5οιΐΓ е1 а1., 1991; и Байи е1 а1., 1983). Антигенный сайт IV, как известно, имеет перекрывающиеся линейные эпитопы (см. Τοτάο, 1996; Βιιηδοίιοίαι е1 а1., 1989; Блю е1 а1., 1997 и N1 е1 а1., 1995). В работе Βα'ΐιη;·ιη5οιΐΓ е1 а1. (1991) также описано присутствие небольшого сайта, локализованного в положении 342-343, который, несмотря на его непосредственную близость, отличается от антигенного сайта III. Выравнивание эпитопа для СВ-57 с известными линейными и конформационными вируснейтрализующими эпитопами на гликопротеине вируса бешенства (фиг. 10) показало, что эпитоп для СВ-57 локализован в той же области, что и конформационный антигенный сайт I, определенный с помощью одного тАЬ 509-6. Исходя из нуклеотидных и аминокислотных последовательностей гликопротеина ускользающих вирусов СВ04-098, было выявлено, что эпитоп, распознаваемый этим антителом, локализован в той же области, что и непрерывный конформационный антигенный сайт III.

В предпочтительном варианте изобретения фармацевтическая композиция содержит первую связывающую молекулу, нейтрализующую вирус бешенства и включающую, по меньшей мере, область СЭВ3, а предпочтительно область СЭВ3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:25, и вторую связывающую молекулу, нейтрализующую вирус бешенства и включающую, по меньшей мере, область СЭВ3, а предпочтительно область СЭВ3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:4, 8ЕЦ ГО N0:10, 8ЕЦ ГО N0:14, 8ЕС ГО N0:15, 8ЕЦ ГО N0:16 и 8ЕЦ ГО N0:22. Более предпочтительно указанная вторая связывающая молекула, нейтрализующая вирус бешенства, содержит, по меньшей мере, область СЭВ3, а предпочтительно область СЭВ3 тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:14. Предпочтительно первая связывающая молекула, нейтрализующая вирус бешенства, содержит тяжелую и легкую цепи, включающие аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО N0:123 и 8ЕЦ ГО N0:125 соответственно, а вторая связывающая молекула, нейтрализующая вирус бешенства, содержит тяжелую и легкую цепи, включающие аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО N0:335 и 8ЕЦ ГО N0:337 соответственно. Предпочтительно тяжелая и легкая цепи первой связывающей молекулы, нейтрализующей вирус бешенства, кодируются последовательностями 8ЕЦ ГО N0:122 и 8ЕЦ ГО N0:124 соответственно, а тяжелая и легкая цепи второй связывающей молекулы, нейтрализующей вирус бешенства, кодируются последовательностями 8ЕЦ ГО N0:334 и 8ЕЦ ГО N0:336 соответственно.

Получение фармацевтической композиции, содержащей две связывающих молекулы, где рI этих связывающих молекул является дивергентным, связано с проблемой, возникающей при выборе подходящего буфера, оптимально стабилизирующего обе связывающих молекулы. При доведении рН буфера для данной композиции до значения, повышающего стабильность одной связывающей молекулы, может снижаться стабильность другой связывающей молекулы. Снижение стабильности или даже нестабильность связывающей молекулы может приводить к осаждению, агрегации или к спонтанной деградации, и, тем самым, к потере функциональности данной связывающей молекулы. Поэтому в другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере две связывающих молекулы, предпочтительно человеческих связывающих молекулы, где указанная компо

- 19 010785 зиция отличается тем, что в ней указанные связывающие молекулы имеют изоэлектрические точки (р1), которые отличаются друг от друга примерно менее чем на 1,5; 1,4; 1,3; 1,2; 1,1; 1,0; 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; а предпочтительно менее чем (включительно) на 0,25 единиц р1. р1 могут быть измерены экспериментально, например, путем изоэлектрического фокусирования, или они могут быть вычислены исходя из аминокислотной последовательности связывающих молекул. В одном из вариантов изобретения указанными связывающими молекулами являются связывающие молекулы согласно изобретению, а указанной фармацевтической композицией является фармацевтическая композиция согласно изобретению.

Предпочтительными связывающими молекулами являются моноклональные антитела, например человеческие моноклональные антитела, такие как антитела 1дС1. Предпочтительно связывающие молекулы обладают способностью связываться с инфекционным агентом и/или нейтрализовать такой инфекционный агент, например вирус, бактерию, дрожжи, грибки или паразиты. В одном из вариантов изобретения связывающие молекулы обладают способностью связываться с лиссавирусом, например с вирусом бешенства, и/или нейтрализовать этот вирус. В конкретном варианте изобретения обе связывающие молекулы имеют вычисленную р1, составляющую в пределах от 8,0 до 9,5, предпочтительно от 8,1 до 9,2, а более предпочтительно от 8,2 до 8,5. Предпочтительно указанные связывающие молекулы имеют область СИКЗ тяжелой цепи, состоящую из последовательностей 8ЕО ΙΌ N0:14 и 8ЕО ΙΌ N0:25 соответственно.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к коктейлю из двух или более человеческих связывающих молекул или связывающих молекул другого животного, включая, но не ограничиваясь ими, антитела, где по меньшей мере одна связывающая молекула происходит от фаговой библиотеки антител или получена методом представления на другой реплицируемой упаковке, и по меньшей мере одна связывающая молекула может быть получена с помощью гибридомной технологии. При применении различных методов выбор связывающих молекул, имеющих совместимые р1, также имеет очень важное значение для получения композиции, в которой каждая связывающая молекула является достаточно стабильной для хранения, обработки и последующего применения.

В другом варианте изобретения связывающие молекулы, присутствующие в фармацевтической композиции согласно изобретению, усиливают нейтрализующую активность друг друга, т.е. при их объединении они действуют синергически. Другими словами, фармацевтические композиции могут обладать синергической активностью, нейтрализующей вирус бешенства и даже лиссавирусы. Используемый здесь термин синергический означает, что комбинированный эффект связывающих молекул при их объединении превышает аддитивные эффекты, продуцируемые при их использовании по отдельности. Количества и отношения компонентов фармацевтических композиций согласно изобретению должны быть определены, исходя из их индивидуальной активности, и протестированы с помощью ίη уйго анализов на нейтрализацию или с использованием животных-моделей, таких как хомячки.

Кроме того, фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать по меньшей мере одно другое терапевтическое, профилактическое и/или диагностическое средство. Указанными другими терапевтическими и/или профилактическими средствами могут быть противовирусные средства, такие как рибавирин или интерферон-α.

Связывающие молекулы или фармацевтические композиции согласно изобретению перед их введением человеку могут быть протестированы в подходящих системах животных-моделей. Такими системами животных-моделей являются, но не ограничиваются ими, мыши, крысы, хомячки, обезьяны и т. п.

Обычно фармацевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях их приготовления и хранения. Человеческие связывающие молекулы, их варианты или фрагменты, иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновой кислоты или композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в виде порошка для разведения в соответствующем фармацевтически приемлемом наполнителе до или во время доставки. В случае использования стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций предпочтительными методами получения таких порошков являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация), которая позволяет получить порошок, состоящий из активного ингредиента плюс любой дополнительный желательный ингредиент, из раствора, предварительно отфильтрованного в стерильных условиях.

Альтернативно, связывающие молекулы, их варианты или фрагменты, иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновой кислоты или композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в растворе, и в этот раствор до или во время доставки может быть добавлен и/или подмешан соответствующий фармацевтически приемлемый носитель с получением унифицированной лекарственной формы для инъекций. Предпочтительно, чтобы фармацевтически приемлемый наполнитель, используемый в настоящем изобретении, был подходящим для получения высокой концентрации лекарственного средства, мог сохранять нужную текучесть и, если необходимо, мог обеспечивать замедленную абсорбцию.

Выбор оптимального способа введения фармацевтических композиций зависит от нескольких факторов, включая физико-химические свойства активных молекул в данных композициях, срочность клинической ситуации и отношение концентрация активных молекул в плазме желательный терапевтический эффект. Так, например, если это необходимо, то человеческие связывающие молекулы согласно изобретению могут быть получены с использованием носителей, которые будут защищать эти молекулы

- 20 010785 от быстрого высвобождения, т.е. могут быть получены препараты с регулируемым высвобождением, включая имплантаты, чрескожные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. При этом могут быть использованы, ш!ег ака, биологически разлагаемые, биологически совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Кроме того, может оказаться необходимым покрытие человеческих связывающих молекул материалом или соединением или совместное введение этих молекул с указанным материалом или соединением, которое предупреждает инактивацию человеческих связывающих молекул. Так, например, человеческие связывающие молекулы могут быть введены индивидууму в соответствующем носителе, таком как липосомы или разбавитель.

Способы введения могут быть, в общих чертах, подразделены на две основных категории, такие как пероральное и парентеральное введение. Предпочтительным способом введения человеческих связывающих молекул и фармацевтических композиций согласно изобретению является введение в рану, а также внутримышечно в ягодичную область. Способ получения человеческих связывающих молекул и фармацевтических композиций зависит от способов введения.

В другом аспекте изобретения связывающие молекулы, функциональные варианты, иммуноконъюгаты, композиции или фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть использованы в качестве лекарственного средства. Поэтому способ лечения и/или предупреждения инфекции, вызываемых лиссавирусом, в котором используются человеческие связывающие молекулы, функциональные варианты, иммуноконъюгаты, композиции или фармацевтические композиции согласно изобретению, входят в другой аспект настоящего изобретения. Лиссавирусом может быть вирус любого известного генотипа, а предпочтительно таким вирусом является вирус бешенства. Вышеупомянутые молекулы или композиции могут быть использованы для пост-контактной профилактики бешенства.

Вышеупомянутые молекулы или композиции могут быть использованы в комбинации с другими молекулами, подходящими для диагностики, профилактики и/или лечения инфекции, вызываемой вирусом бешенства. Эти молекулы или композиции могут быть использованы 1и уНго, ех νί\Ό или 1и νί\Ό. Так, например, человеческие связывающие молекулы, функциональные варианты, иммуноконъюгаты или фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены вместе с вакциной против вируса бешенства. Альтернативно, такая вакцина может быть также введена до или после введения молекул или композиций согласно изобретению. Введение молекул или композиций согласно изобретению вместе с вакциной является подходящим способом проведения пост-контактной профилактики. Вакцинами на основе вируса бешенства являются, но не ограничиваются ими, очищенная вакцина на основе клеток куриного эмбриона (РСЕС) (ВакАνеή), вакцина на основе человеческих диплоидных клеток (НОСУ; вакцина Iтονаx) или абсорбированная вакцина на основе вируса бешенства (ВУА).

Молекулы обычно включают композиции и фармацевтические композиции согласно изобретению в терапевтически или диагностически эффективном количестве. Схемы введения доз могут быть скорректированы для получения желаемого оптимального ответа (например, терапевтического ответа). Подходящий диапазон доз может составлять, например, 0,1-100 МЕ/кг массы тела, предпочтительно 1,0-50 МЕ/кг массы тела, а более предпочтительно 10-30 МЕ/кг массы тела, например 20 МЕ/кг массы тела.

Предпочтительно связывающие молекулы или фармацевтические композиции согласно изобретению вводят в виде разовой ударной дозы. Молекулы и фармацевтические композиции согласно изобретению являются предпочтительно стерильными. Методы стерилизации этих молекул и композиций хорошо известны специалистам. Схема введения доз для пост-контактной профилактики предусматривает внутримышечное введение пяти доз антирабической вакцины в дельтовидную мышцу через 0, 3, 7, 14 и 28 дней после патогенного контакта индивидуумов, которые ранее не были иммунизованы против вируса бешенства. Человеческие связывающие молекулы и фармацевтические композиции согласно изобретению должны быть введены в рану или в область возле раны на день 0 или как можно быстрее после контакта с инфекционным агентом, а остальной объем может быть введен внутримышечно в место, локализованное на некотором расстоянии от места введения вакцины. Невакцинированным индивидуумам может быть рекомендовано введение человеческих связывающих молекул против вируса бешенства, однако, для специалиста в данной области очевидно, что такие человеческие антирабические связывающие молекулы могут быть также введены вакцинированным индивидуумам, нуждающимся в таком лечении.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к использованию связывающих молекул или их функциональных вариантов, иммуноконъюгатов согласно изобретению, молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению, композиций или фармацевтических композиций согласно изобретению в целях получения лекарственного средства для диагностики, профилактики и/или лечения состояний, вызываемых лиссавирусами. Лиссавирусом может быть вирус любого известного генотипа, а предпочтительно вирус бешенства. Вышеупомянутые молекулы предпочтительно используются в целях получения лекарственного средства для пост-контактной профилактики бешенства.

Кроме того, частью настоящего изобретения также являются наборы, содержащие по меньшей мере одну связывающую молекулу согласно изобретению; по меньшей мере один ее функциональный вариант согласно изобретению; по меньшей мере один иммуноконъюгат согласно изобретению; по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению; по меньшей мере одну композицию соглас

- 21 010785 но изобретению; по меньшей мере одну фармацевтическую композицию согласно изобретению; по меньшей мере один вектор согласно изобретению; по меньшей мере одного хозяина согласно изобретению или их комбинации. Вышеописанные компоненты наборов согласно изобретению могут быть, но необязательно, упакованы в подходящие емкости с этикетками, и эти наборы могут быть использованы для диагностики, профилактики и/или лечения указанных состояний. Вышеупомянутые компоненты могут находиться в упаковках, содержащих дозу на один прием или дозы для многократного приема, таких как, например, герметично запаянные ампулы, сосуды, бутыли, шприцы и тест-пробирки, содержащие водный, предпочтительно стерильный, раствор или лиофилизованный, а предпочтительно стерильный, препарат для разведения. Эти упаковки могут быть сделаны из различных материалов, таких как стекло или пластик, и могут иметь стерильное входное отверстие (например, данная упаковка может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или сосуд, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций). Такой набор может также содержать дополнительное количество упаковок, включающих фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может также включать и другие материалы, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и культуральную среду для одного или нескольких подходящих хозяев. К набору могут прилагаться инструкции, которые обычно вкладываются в коммерчески доступные упаковки для терапевтических, профилактических или диагностических продуктов и которые содержат информацию, такую как, например, показания, способ применения, дозы, приготовление, введение, противопоказания и/или предупреждение, относящиеся к применению таких терапевтических, профилактических или диагностических продуктов.

В настоящее время НШС-продукты используются для постконтактной профилактики бешенства. Доза НШС для взрослого индивидуума, составляющая 1500 МЕ (индивидуума массой 75 кг, 20 МЕ/кг), существует только в объеме 10 мл. Более концентрированные НШС-продукты получить невозможно, поскольку имеющаяся в настоящее время 10 мл доза содержит 1-1,5 г всех ЦС. А поэтому современные НШС-продукты имеют два недостатка. Во-первых, в большинстве случаев оказывается анатомически нецелесообразно вводить рекомендованную полную дозу в рану или в место возле этой раны, возникшей в результате укуса, и, во-вторых, введение существующего препарата с дозой НШС в указанном объеме является болезненной процедурой. Настоящее изобретение предлагает решение этой проблемы и позволяет получить фармацевтическую композицию, содержащую полную дозу для взрослого индивидуума в объеме 2 мл или менее, если это необходимо. Такая фармацевтическая композиция может содержать, например, две связывающих молекулы, а предпочтительно СЕ57 и СЕ04-098, способные нейтрализовать вирус бешенства. Указанная фармацевтическая композиция также содержит фармацевтически приемлемый наполнитель и имеет объем примерно 2 мл. Можно также получить и больший объем, но это менее желательно из-за боли, возникающей при инъекциях больших объемов. Может быть также получен объем менее 2 мл. Фармацевтическая композиция содержит полную дозу для взрослого индивидуума (МЕ), необходимую для успешного проведения постконтактной профилактики. В одном из вариантов изобретения фармацевтическую композицию хранят в 10-мл сосуде, таком как, например, готовый к применению 10-мл сосуд (из стекла типа Ι) с пробкой. В одном из вариантов в случае, если у данного индивидуума имеется рана с большой площадью поверхности, фармацевтическая композиция, содержащаяся в 10-мл сосуде, может быть разведена с получением большего объема. Настоящее изобретение также относится к набору, включающему по меньшей мере одну упаковку (такую как сосуд), содержащую фармацевтическую композицию. Этот набор может дополнительно включать вторую упаковку, в которой находится разбавитель, подходящий для разведения фармацевтической композиции с получением большего объема. Подходящими разбавителями являются, но не ограничиваются ими, фармацевтически приемлемый наполнитель, подходящий для данной фармацевтической композиции, и физиологический раствор. Кроме того, указанный набор может содержать инструкции по разведению фармацевтической композиции и/или инструкции по введению указанной фармацевтической композиции, независимо от того, является ли она разведенной или нет.

Настоящее изобретение также относится к способу обнаружения вируса бешенства в образце, где указанный способ включает стадии а) контактирования образца с диагностически эффективным количеством связывающей молекулы, ее функционального варианта или иммуноконъюгата согласно изобретению и Ь) установления факта специфического связывания связывающей молекулы, ее функционального варианта или иммуноконъюгата с молекулой образца. Указанным образцом может быть биологический образец, включая, но не ограничиваясь ими, кровь, сыворотка, ткань или другой биологический материал, взятый от (предположительно) инфицированных индивидуумов. Указанными (предположительно) инфицированными индивидуумами может быть человек, а также животные, которые, как подозревается, являются носителями вируса бешенства и которые могут быть обследованы на присутствие у них вируса бешенства с использованием человеческих связывающих молекул, функциональных вариантов или иммуноконъюгатов согласно изобретению. Для облегчения детекции указанный образец может быть сначала подвергнут модификации. Термин модификация означает, иИсг а11а, обработку данного образца, содержащего и/или предположительно содержащего вирус бешенства, таким образом, чтобы такая обра

- 22 010785 ботка приводила к дезинтеграции вируса бешенства на антигенные компоненты, такие как белки, (полипептиды или другие антигенные фрагменты. Предпочтительно связывающие молекулы, функциональные варианты или иммуноконъюгаты согласно изобретению подвергают контакту с образцом в условиях, способствующих образованию иммунного комплекса между человеческими связывающими молекулами и вирусом бешенства или их антигенными компонентами, которые могут присутствовать в образце. Затем образование иммунного комплекса, которое, если оно происходит, указывает на присутствие вируса бешенства в образце, детектируют и оценивают подходящими способами. Такими способами являются, ш!ет айа, иммуноанализы на гомогенное и гетерогенное связывание, такие как радиоммуноанализы (РИА), ЕЬ18А, иммунофлуоресцентный анализ, иммуногистохимический анализ, ЕЛС8, В1АСОКЕ и Вестерн-блот-анализ.

Кроме того, связывающие молекулы согласно изобретению могут быть использованы для идентификации эпитопов белков вируса бешенства, таких как С-белок. Эпитопы могут быть линейными, а также структурными и/или конформационными. В одном из вариантов изобретения связывание связывающих молекул согласно изобретению с набором перекрывающихся пептидов, таких как 15-мерные пептиды белка вируса бешенства, такого как С-белок вируса бешенства, может быть проанализировано с помощью анализа РЕР8СЛИ (см, ш!ет айа, XV О 84/03564, XVО 93/09872, 81оо181та е! а1., 1996). Связывание человеческих связывающих молекул с каждым пептидом может быть протестировано в твердофазном иммуноферментном анализе (ЕЬ18Л) на основе РЕР8СЛИ. В другом варианте изобретения рандомизированная пептидная библиотека, содержащая пептиды белков вируса бешенства, может быть скринирована на пептиды, способные связываться с человеческими связывающими молекулами согласно изобретению. В вышеуказанных анализах использование человеческих связывающих молекул, нейтрализующих вирус бешенства, позволяет идентифицировать один или несколько нейтрализующих эпитопов. Идентифицированные пептиды/эпитопы могут быть использованы в качестве вакцин и для диагностики бешенства.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга связывающей молекулы или функционального варианта связывающей молекулы на специфическое связывание с другим, а предпочтительно неперекрывающимся эпитопом вируса бешенства, связанным со связывающей молекулой или ее функциональным вариантом согласно изобретению, где указанный способ включает стадии а) контактирования скринируемой связывающей молекулы или ее функционального варианта, т.е. связывающей молекулы или функционального варианта согласно изобретению, с вирусом бешенства или его фрагментом (таким как, например, С-белок вируса бешенства), Ь) определения способности скринируемой связывающей молекулы или ее функционального варианта конкурировать со связывающей молекулой или с ее функциональным вариантом согласно изобретению за специфическое связывание с вирусом бешенства или его фрагментом. Если какой-либо конкуренции не наблюдается, то данные связывающие молекулы или их функциональные варианты скринируют на связывание с другим эпитопом. В конкретном варианте вышеупомянутого способа скрининга человеческие связывающие молекулы или их функциональные варианты могут быть скринированы в целях идентификации человеческих связывающих молекул или их функциональных вариантов, способных связываться с эпитопом, не являющимся эпитопом, распознаваемым связывающей молекулой, содержащей область СИКЗ, включающую аминокислотную последовательность 8ЕС ΙΌ N0:25. Предпочтительными эпитопами являются неперекрыывающиеся или неконкурирующие эпитопы. Для специалиста в данной области очевидно, что вышеупомянутый способ скрининга может быть использован для идентификации связывающих молекул или их функциональных вариантов, способных связываться с одним и тем же эпитопом. В дополнительной стадии можно определить, обладают ли скринированные связывающие молекулы, не способные конкурировать за специфическое связывание с вирусом бешенства или с его фрагментом, нейтрализующей активностью. Можно также определить, обладают ли скринированные связывающие молекулы, способные конкурировать за специфическое связывание с вирусом бешенства или с его фрагментом, нейтрализующей активностью. Связывающие молекулы или их функциональные варианты, нейтрализующие вирус бешенства и обнаруженные описанным способом скрининга, составляют другую часть настоящего изобретения. В данном способе скрининга специфическое связывание с одним и тем же эпитопом также рассматривается как специфическое связывание по существу или в основном с тем же эпитопом, с которым связываются человеческие связывающие молекулы согласно изобретению. Способность блокировать вирус бешенства или конкурировать с человеческими связывающими молекулами согласно изобретению за связывание с вирусом бешенства обычно указывает на то, что скринируемая связывающая молекула связывается с эпитопом или с сайтом связывания на вирусе бешенства, который структурно перекрывается с сайтом связывания, иммуноспецифически распознаваемым связывающими молекулами согласно изобретению. Альтернативно, такая способность может свидетельствовать о том, что скринируемая связывающая молекула связывается с эпитопом или с сайтом связывания, расположенным в достаточной близости от сайта связывания, иммуноспецифически распознаваемого связывающими молекулами согласно изобретению, и, тем самым, стерически или каким-либо иным способом ингибирует связывание связывающих молекул согласно изобретению с вирусом бешенства или его фрагментом.

В общих чертах, конкурентное ингибирование измеряют с помощью анализа, в котором антиген

- 23 010785 ную композицию, т.е. композицию, содержащую вирус бешенства или его фрагмент (такой как О-белки), смешивают с эталонными связывающими молекулами и со скринируемыми связывающими молекулами. В одном из вариантов изобретения эталонной связывающей молекулой может быть одна из человеческих связывающих молекул согласно изобретению, а скринируемой связывающей молекулой может быть другая человеческая связывающая молекула согласно изобретению. В другом варианте изобретения эталонной связывающей молекулой может быть связывающая молекула, содержащая область СОКЗ, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:25, а скринируемой связывающей молекулой может быть одна из человеческих связывающих молекул согласно изобретению. В еще одном варианте изобретения эталонной связывающей молекулой может быть одна из человеческих связывающих молекул согласно изобретению, а скринируемой связывающей молекулой может быть связывающая молекула, содержащая область СОК3, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:25. Обычно скринируемые связывающие молекулы присутствуют в избытке. Для проведения таких простых исследований на конкурентное связывание подходящими являются протоколы анализов на основе ЕЫ8А. В некоторых вариантах изобретения эталонные связывающие молекулы могут быть предварительно смешаны с различными количествами скринируемых связывающих молекул (например, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 или 1:100) перед обработкой антигенной композицией. В других вариантах изобретения эталонные связывающие молекулы и различные количества скринируемых связывающих молекул могут быть просто смешаны во время обработки антигенной композицией. В любом случае использование вторых антител определенного вида или изотипа позволяет детектировать только связанные эталонные связывающие молекулы, уровень связывания которых будет снижаться благодаря присутствию скринируемой связывающей молекулы, распознающей, по существу, такой же эпитоп. При проведении исследования на конкуренцию за связывание между эталонной связывающей молекулой и любой скринируемой связывающей молекулой (независимо от ее вида или изотипа), эталонная связывающая молекула может быть сначала помечена детектируемой меткой, такой как биотиновая, ферментная, радиоактивная или другая метка, которая позволяет проводить последующую идентификацию. В этих случаях проводят предварительное смешивание или инкубирование меченых эталонных связывающих молекул со скринируемыми связывающими молекулами в различных отношениях (например, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 или 1:100), а затем (необязательно, через подходящий промежуток времени) проводят оценку реактивности меченых эталонных связывающих молекул, и полученные величины сравнивают с контрольной величиной, полученной при инкубировании в отсутствии каких-либо потенциально конкурирующих связывающих молекул. Таким анализом может быть любой один из ряда иммунологических анализов, основанных на гибридизации антител, а эталонные связывающие молекулы должны быть детектированы посредством обнаружения их метки, например, с использованием стрептавидина, в случае использования биотинилированных эталонных связывающих молекул, или использования хромогенного субстрата, конъюгированного с ферментативной меткой (например, 3-, 3'-, 5-, 5'-тетраметилбензидиновый (ТМВ) субстрат, конъюгированный с ферментом пероксидазой), или посредством простой детекции радиоактивной метки. Скринируемая связывающая молекула, которая связывается с тем же эпитопом, что и эталонная связывающая молекула, обладает способностью эффективно конкурировать за связывание и, таким образом, будет значительно снижать уровень связывания с эталонной связывающей молекулой, о чем будет свидетельствовать снижение количества связанной метки. Связывающие молекулы, связывающиеся с другими неконкурирующими эпитопами, не обнаруживают такого снижения уровня связывания. Реактивность (меченой) эталонной связывающей молекулы в отсутствии полностью иррелевантной связывающей молекулы должна иметь высокую контрольную величину. Если при инкубировании меченой эталонной связывающей молекулы с немеченными эталонными связывающими молекулами точно такого же типа наблюдается конкуренция, и эта конкуренция приводит к снижению уровня связывания меченой эталонной связывающей молекулы, то должна быть получена низкая контрольная величина. В тест-анализе значительное снижение реактивности эталонной связывающей молекулы в присутствии скринируемой связывающей молекулы указывает на то, что эта связывающая молекула распознает тот же самый эпитоп, т.е. эпитоп, который перекрестно реагирует с меченой эталонной связывающей молекулой. Если такого снижения не наблюдается, указанная связывающая молекула может связываться с другим неконкурирующим эпитопом.

Связывающими молекулами, идентифицированными с помощью таких анализов на конкуренцию за специфическое связывание между скринируемыми связывающими молекулами и эталонной связывающей молекулой (конкурентными связывающими молекулами), являются, но не ограничиваются ими, антитела, фрагменты антител и другие связывающие агенты, которые связываются с эпитопом или со связывающим сайтом, связанным с эталонной связывающей молекулой, а также антитела, фрагменты антител и другие связывающие агенты, которые связываются с эпитопом или со связывающим сайтом, находящимся в достаточной близости от эпитопа, связанного с эталонной связывающей молекулой. Предпочтительно конкурентные связывающие молекулы согласно изобретению, если они присутствуют в избытке, будут по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, а наиболее предпочтительно по меньшей мере на 75-90% или более ингибировать специфическое связывание эталонной связывающей молекулы с выбранной мишенью. Такую

- 24 010785 идентификацию одной или нескольких конкурентных связывающих молекул, которые связываются примерно по существу или в основном с таким же или с точно с таким же эпитопом, как и эпитоп для связывающих молекул согласно изобретению, осуществляют прямым методом. Поскольку идентификацию конкурирующих связывающих молекул осуществляют путем сравнения с эталонной связывающей молекулой, то очевидно, что для идентификации конкурентной связывающей молекулы, которая связывается с таким же или по существу с таким же эпитопом, как и эпитоп для эталонной связывающей молекулы, фактически не требуется определения эпитопа, с которым связываются эталонная связывающая молекула и конкурентная связывающая молекула. Альтернативно, связывающими молекулами, связывающимися с различными неконкурирующими эпитопами, идентифицированными в этих анализах на конкуренцию, могут быть также, но не ограничиваются ими, антитела, фрагменты антител и другие связывающие агенты.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации связывающей молекулы, предположительно обладающей активностью, нейтрализующей инфекционный агент, вызывающий заболевание у индивидуума, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающую молекулу, предположительно, обладающую активностью, нейтрализующей инфекционный агент, вызывающий заболевание у индивидуума, где указанный способ включает стадии а) контактирования набора связывающих молекул на поверхности реплицируемых генных упаковок, по меньшей мере, с клеткой, экспрессирующей на своей поверхности, белок инфекционного агента, вызывающего заболевание у индивидуума в условиях, способствующих связыванию, (Ь) сбора и отделения связывающих молекул, которые связываются с клеткой, экспрессирующей на своей поверхности белок инфекционного агента, вызывающего заболевание у индивидуума, от связывающих молекул, которые не связываются с указанной клеткой, (с) выделения по меньшей мере одной выделенной связывающей молекулы, (ά) подтверждения нейтрализующей активности выделенной связывающей молекулы против инфекционного агента, вызывающего заболевание у данного индивидуума. Клетка, экспрессирующая на своей поверхности белок инфекционного агента, вызывающего заболевание у индивидуума, может быть трансфецирована данным белком. Специалисту в данной области очевидно, что в этом способе могут быть также с успехом использованы антигены инфекционного агента, не являющиеся белками. В конкретном варианте изобретения указанной клеткой является клетка РЕК..С6®. Однако для экспрессии белков могут быть также использованы и другие (Е1-иммортализованные) клеточные линии, такие как клетки ВНК, СНО, N80, НЕК293 или 911. В конкретном варианте изобретения указанной связывающей молекулой является человеческая связывающая молекула. Указанным инфекционным агентом может быть вирус, бактерия, дрожжи, грибок или паразит. В одном из вариантов изобретения указанным белком является белок, обычно экспрессируемый на поверхности инфекционного агента или содержащий по меньшей мере часть белка, доступного на поверхности клетки. В конкретном варианте изобретения набор связывающих молекул на поверхности реплицируемых генных упаковок подвергают субтрактивному отбору/негативному отбору с помощью клеток, используемых для экспрессии белка инфекционного агента, т.е. клеток, идентичных клеткам, используемым в стадии (а), при условии, что они не экспрессируют белок инфекционного агента на своей поверхности. Клетками, используемыми для субтрактивного отбора/негативного отбора, могут быть нетрансфецированные клетки. Альтернативно, эти клетки могут быть трансфецированы белком или его (внеклеточной) частью, который(ая) по своей последовательности или структуре является подобным(ой) и/или в высокой степени гомологичным(ой) соответствующему белку инфекционного агента и/или который(ая) происходят от инфекционного агента, принадлежащего к тому же семейству или даже роду.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к определенной здесь связывающей молекуле, обладающей нейтрализующей активностью против вируса бешенства и отличающейся тем, что эта человеческая связывающая молекула содержит, по меньшей мере, область СОКЗ тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:25, а также отличающейся тем, что эта человеческая связывающая молекула обладает нейтрализующей активностью против вируса бешенства и составляющей по меньшей мере 2500 МЕ/мг белка. Более предпочтительно указанная человеческая связывающая молекула обладает нейтрализующей активностью против вируса бешенства и составляющей по меньшей мере 2800 МЕ/мг белка, по меньшей мере 3000 МЕ/мг белка, по меньшей мере 3200 МЕ/мг белка, по меньшей мере 3400 МЕ/мг белка, по меньшей мере 3600 МЕ/мг белка, по меньшей мере 3800 МЕ/мг белка, по меньшей мере 4000 МЕ/мг белка, по меньшей мере 4200 МЕ/мг белка, по меньшей мере 4400 МЕ/мг белка, по меньшей мере 4600 МЕ/мг белка, по меньшей мере 4800 МЕ/мг белка, по меньшей мере 5000 МЕ/мг белка, по меньшей мере 5200 МЕ/мг белка, по меньшей мере 5400 МЕ/мг белка. Нейтрализующую активность связывающей молекулы измеряют с помощью анализа на нейтрализацию ίη уйго (модифицированного ΒΕΕΙΤ-анализа (экспресс-теста на подавление флуоресценции). Этот анализ подробно описан ниже в разделе Примеры.

В одном из вариантов изобретения связывающая молекула содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающая аминокислотную последовательность, содержащую 8Е0 ΙΌ N0:273. В другом варианте связывающая молекула содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающая аминокислотную последовательность, содержащую 8Е0 ΙΌ N0:123. Вариабельная область легкой цепи связы

- 25 010785 вающей молекулы может содержать аминокислотную последовательность, включающую 8ЕЦ ΙΌ N0:125.

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающие молекулы, описанные выше, также является частью настоящего изобретения. Указанная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность, включающую последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:122. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты может также содержать нуклеотидную последовательность, включающую 8ЕЦ ΙΌ N0:124. Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему указанные молекулы нуклеиновой кислоты, и к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор. Предпочтительной клеткой-хозяином является клетка млекопитающего, такая как человеческая клетка. Примерами клеток, подходящих для продуцирования человеческих связывающих молекул, являются, ш!ег айа, клетки НеЬа, 911, АТ1080, А549, 293 и НЕК293Т. Предпочтительными клетками млекопитающих являются клетки сетчатки глаза человека, такие как клетки 911, или клеточная линия, депонированная в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС), САМЕ, ЗайкЬшу, ^1ЙкЫге 8Р4 01С, в Великобритании, 29 февраля 1996 г., под регистрационным номером 96022940 и имеющаяся в продаже под торговым знаком РЕЕ.С6® (РЕЕ.С6 - зарегистрированный торговый знак фирмы Сгисе11 Но11апб В.У.). В описании настоящей заявки РЕЕ.С6 означает клетки, депонированные под номером 96022940, или их предшественники, предшествующие или последующие пассажи, а также потомки предшественников депонированных клеток и их любые производные.

Примеры

Для иллюстрации настоящего изобретения приводятся нижеследующие примеры. Эти примеры не ограничивают объем настоящего изобретения.

Пример 1. Распознавание эпитопа человеческими антирабическими антителами СЕ-57 и СЕ-1В.

Для того чтобы определить, распознают ли человеческие моноклональные антитела, обозначаемые СЕ-57 и СЕ-1В, неперекрывающиеся, неконкурирующие эпитопы, были генерированы вирусы, ускользающие от человеческих моноклональных антител, обозначаемых СЕ-57 и СЕ-1В. Антитела СЕ-57 и СЕ-1В были генерированы, в основном, как описано в литературе (см. 1опек е! а1., 2003), посредством введения генов, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей соответствующего антитела, в вектор, экспрессирующий один человеческий !дС 1 и обозначенный рсОНА3002(№о). Полученные векторы рд8057С11 и рд80!ВС11 были использованы для временной экспрессии в клетках, происходящих от клеточной линии, депонированной в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС), САМЕ, ЗайкЬшу, ^1ЙкЫге ЗР4 01С, в Великобритании, 29 февраля 1996 г., под регистрационным номером 96022940, и имеющейся в продаже под торговым знаком РЕЕ.С6®. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности тяжелой и легкой цепей указанных антител представлены в 8ЕЦ ΙΌ N0:122-129 соответственно. Серийные разведения (0,5 мл) штамма СУ8-11 вируса бешенства (разведения в пределах 10^-1-10^-8) инкубировали с постоянным количеством (~4МЕ/мл) антитела СЕ-57 или СЕ-1В (0,5 мл) в течение 1 ч при 37°С/5% СО₂, а затем добавляли в лунки, содержащие клетки мышиной нейробластомы (клетки МКА) или клетки В8Е (клеточная линия, подобная клеточной линии почек детеныша хомячка). После 3-дневого отбора в присутствии человеческого моноклонального антитела СЕ-57 или СЕ-1В среду (1 мл), предположительно содержащую ускользающие вирусы, собирали и перед использованием хранили при 4°С. Затем клетки фиксировали в ацетоне в течение 20 мин при 4°С и окрашивали в течение ночи при 37°С/5% СО₂ конъюгатом антирабическое антитело - ^ΕΠΌ (Сеп!осог). Число фокусов на лунку оценивали по иммунофлуоресценции и среду в лунках, содержащих 1-6 фокусов, отбирали для амплификации вируса. Все ускользающие вирусы Е57 были генерированы из одного единственного фокуса, за исключением вируса Е57В1 (из 3 фокусов). Ускользающие вирусы Е1В были выделены из 1 фокуса (Е1ВЕ3), 3 фокусов (Е1В2В), 4 фокусов (Е1В2С), 5 фокусов (Е1В2Е, 2Е) или 6 фокусов (Е1В2Э) соответственно. Каждый ускользающий вирус был сначала амплифицирован в лабораторном масштабе на клетках В8Е или МЫА в зависимости от их роста. Эти небольшие партии вирусов были затем использованы для дополнительной крупномасштабной амплификации вирусов на клетках М^ЫА или В8Е. Затем амплифицированный вирус подвергали титрованию на клетках М^А для определения титра каждой партии ускользающих вирусов, а также для оптимального разведения ускользающего вируса (дающего 80-100%-ное инфицирование через 24 ч) в целях его применения в анализе на нейтрализацию вируса.

Модифицированный анализ ЕЕНТ (экспресс-тест на подавление флуоресценции) осуществляли для оценки перекрестной защиты от Е57 (вирусов, ускользающих от СЕ-57) и Е1В (вирусов, ускользающих от СЕ-1В), обеспечиваемой антителами СЕ-1В и СЕ-57 соответственно. Поэтому антитела СЕ-57 или СЕ1В разводили путем серийного трехкратного разведения, начиная с разведения 1:5. К каждому разведению добавляли вирус бешенства (штамм СУЗ-11) при концентрации, дающей 80-100% инфицирование. Смесь вирусаЛдС инкубировали в течение 1 ч при 37°С/5% СО₂, а затем добавляли к клеткам МИА. Через 24 ч после инфицирования (при 34°С/5% СО₂) клетки фиксировали в ацетоне в течение 20 мин при 4°С и окрашивали в течение минимум 3 ч конъюгатом антирабическое антитело - N-^40' (Сеп!осог). Затем лунки анализировали на инфицирование вирусом бешенства под флуоресцентным микроскопом для определения 50% разведения в конечной точке. Таким разведением является разведение, при кото

- 26 010785 ром в данном анализе вирусная инфекция блокируется на 50%. Для вычисления активности в каждый модифицированный анализ КРИТ включали международный стандарт (иммуноглобулин вируса бешенства, лот К3, стандартный материал, взятый из Лаборатории по стандартам и тестированию ЭМРО/ СВЕК/ΡΌΛ). 50% разведение этого стандартна в конечной точке соответствует активности 2 МЕ/мл. После этого была протестирована нейтрализующая активность человеческих моноклональных антител СК57 и СК-ДВ, взятых отдельно, а затем была протестирована комбинация этих антител.

Нейтрализация вирусов ЕДВ антителами СК-ДВ или СК-57 больше не наблюдалась (см. таб. 1), что позволяет предположить, что оба этих антитела связываются с гликопротеином вируса бешенства и индуцируют аминокислотные замены в аналогичных областях этого гликопротеина.

Нейтрализация вирусов Е57 антителом СК-57 больше не происходила, тогда как 4 из 6 вирусов Е57 еще нейтрализовались антителом СК-ДВ, хотя и с меньшей активностью (см. табл. 1). Смесь антител СК57 и СК-ДВ (в отношении 1:1 МЕ/мг) давала аналогичные результаты, наблюдаемые при действии лишь одного из антител (данные не приводятся).

Для идентификации возможных мутаций в гликопротеине вируса бешенства определяли нуклеотидную последовательность открытой рамки считывания (ОРС) гликопротеина каждого из ускользающих вирусов ЕДВ и Е57. Вирусную РНК каждого из ускользающих вирусов и вируса СУ8-11 выделяли из вирус-инфицированных клеток ΜΝΑ и трансформировали в кДНК с помощью стандартной ОТ-ПЦР. Затем кДНК использовали в целях секвенирования нуклеотидов ОРС гликопротеина вируса бешенства для идентификации мутаций.

Оба ускользающих вируса Е57 и ЕДВ обнаруживали мутации в одной и той же области гликопротеина (см. фиг. 1 и 2 соответственно; см. все последовательности, описанные на фиг. 1 и 2, 8ЕО ΙΌ N0:130-151). Это указывает на то, что оба антитела распознают перекрывающиеся эпитопы. Из всего вышесказанного можно сделать вывод, что комбинация СК-57 или СК-ДВ в смеси не предотвращает ускользание вариантов, резистентных к нейтрализации, а поэтому эта комбинация не является идеальным иммуноглобулиновым препаратом для пост-контактной профилактики бешенства.

Пример 2. Конструирование библиотеки фагового представления 8θΡν с использованием лимфоцитов периферической крови, взятых у доноров, вакцинированных вирусом бешенства.

У человека, вакцинированного четырьмя инъекциями вируса бешенства, через одну неделю после последней бустер-инъекции брали из вены 50 мл крови. Из этих проб крови выделяли лимфоциты периферической крови (ЛПК) путем фракционирования этих клеток в градиенте плотности фиколла. Сыворотку крови сохраняли и замораживали при -20°С. Позитивный анализ на присутствие антирабических антител в сыворотке проводили методом РАС8-окрашивания на клетках 293Т, трансфецированных гликопротеином вируса бешенства. Из полученных ЛПК получали полноразмерную РНК путем отделения органической фазы (ТКЕОЬ™) и последующей преципитации этанолом. Полученную РНК растворяли в ЭЕРС-обработанной сверхчистой воде и определяли концентрацию путем измерения 0Ό при 260 нм. Затем РНК разводили до концентрации 100 нг/мкл. После этого 1 мкг РНК превращали в кДНК следующим образом. К 10 мкл полноразмерной РНК добавляли 13 мкл ПЕРС-обработанной сверхчистой воды и 1 мкл рандомизировнных гексамеров (500 нг/мкл) и полученную смесь нагревали при 65°С в течение 5 мин и быстро охлаждали в воде со льдом. Затем к этой смеси добавляли 8 мкл 5х буфера для первой цепи, 2 мкл άΝΤΡ (10 мМ каждого), 2 мкл ΌΤΤ (0,1 М), 2 мкл ингибитора РНКазы (40 Ед/мкл) и 2 мкл обратной транскриптазы Зирегаспр!™ III ММЬУ (200 Ед/мкл), инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем инкубировали в течение 1 ч при 50°С. После этого реакцию прекращали путем термоинактивации, т.е. путем инкубирования смеси в течение 15 мин при 75°С.

Полученные кДНК-продукты разводили до конечного объема 200 мкл ПЕРС-обработанной сверхчистой водой. 0Ό при 260 нм 50-кратно разведенного раствора (в 10 мМ трис-буфера) данного разведения полученных кДНК-продуктов составляла 0,1.

Для каждого донора 5-10 мкл разведенных кДНК-продуктов использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации последовательностей тяжелой цепи γ и легкой цепи к или λ иммуноглобулина с применением специфических олигонуклеотидных праймеров (см. табл. 2-7). ПЦР-смеси содержали помимо разведенных кДНК-продуктов 25 пмоль смыслового праймера и 25 пмоль антисмыслового праймера в конечном объеме 50 мкл 20 мМ Трис-НС1 (рН 8,4), 50 мМ КС1, 2,5 мМ МдС1₂, 250 мкМ άΝΤΡ и 1,25 единиц полимеразы Тад. В нагретой термоячейке с крышкой, имеющей температуру 96°С, полученные смеси быстро расплавляли в течение 2 мин, а затем проводили 30 циклов в режиме: 30 с при 96°С, 30 с при 60°С и 60 с при 72°С.

В первом раунде амплификации каждый из семнадцати смысловых праймеров для вариабельной области легкой цепи (одиннадцать для легкой цепи λ) (см. табл. 2) и шесть праймеров для легкой цепи к (см. табл. 3) объединяли с антисмысловым праймером, распознающим константную область С-к, обозначенную НиСк 5'-АСАСТСТССССТСТТСААССТСТТ-3' (см. 8ЕО ΙΌ N0:152) или константную область С-λ, обозначенную НиО,2 5'-ТСААСАТТСТСТАССССССАСТС-3' (см. 8ЕС) ΙΌ N0:153) и НиО,7 5'АСАССАТТСТССАССССССАСТС-3' (см. 8ЕО ΙΌ N0:154) (перед использованием антисмысловые праймеры НиС/.2 и НиС/.7 смешивали в эквимолярных количествах), и получали 4x17 продуктов разме- 27 010785 ром приблизительно 600 пар нуклеотидов. Эти продукты очищали на 2% агарозном геле и выделяли из геля на гель-экстракционных колонках Ц1адеп. 1/10 каждого выделенного продукта использовали в идентичной ПЦР-реакции, описанной выше, с применением тех же самых семнадцати смысловых праймеров, а затем каждый смысловой праймер легкой цепи λ объединяли с одним из трех антисмысловых праймеров, специфичных к области 1-λ, а каждый смысловой праймер легкой цепи κ объединяли с одним из пяти антисмысловых праймеров, специфичных к области 1-κ. Праймеры, используемые во второй амплификации, удлиняли с помощью рестрикционных сайтов (см. табл. 4) для осуществления прямого клонирования в вектор фагового представления РОУ-С06 (см. фиг. 3 и 8ЕЦ Ш N0:155). В результате этого получали 4x63 продукта размером приблизительно 350 пар нуклеотидов, которые объединяли в один пул из 10 фракций. Это число фракций выбирали так, чтобы сохранялось природное распределение различных семейств легких цепей в библиотеке, и чтобы это число было не выше или ниже их встречаемости в природном распределении. Число аллелей в семействе использовали для определения процента представленности этих семейств в библиотеке (см. табл. 5). В следующей стадии 2,5 мкг объединенной фракции и 100 мкг вектора РОУ-С06 гидролизовали ферментами 8аП и и выделяли из геля. Затем осуществляли лигирование в течение ночи при 16°С, как описано ниже. К 500 нг вектора РЭУ-С06 добавляли 70 нг объединенной фракции в полном объеме (50 мкл) смеси для лигирования, содержащей 50 мМ ТрисНС1 (рН 7,5), 10 мМ МдС1₂, 10 мМ ΌΤΤ, 1 мМ АТР, 25 мкг/мл В8А и 2,5 мкл ДНК-лигазы Т4 (400 ед/мкл). Эту процедуру проводили для каждой объединенной фракции. Лигированные смеси очищали фенолом/хлороформом, а затем экстрагировали хлороформом и осаждали этанолом методами, хорошо известными специалистам. Полученную ДНК растворяли в 50 мкл сверхчистой воды и 2x2,5 мкл аликвот лигированной смеси подвергали электропорации в 40 мкл ТС1-компетентной бактерии Е.сой в соответствии с протоколом производителя (81га1адепе). Трансформанты культивировали в течение ночи при 37°С всего в 30 чашках (три чашки на объединенную фракцию; размер чашки: 240 мм-240 мм), содержащих агар 2ТУ, в который были добавлены 50 мкг/мл ампициллина и 4,5% глюкозы. (Суб)библиотеку вариабельных областей легкой цепи получали путем соскоба трансформантов с чашек с агаром. Эту (суб)библиотеку использовали непосредственно для получения плазмидной ДНК с применением набора Ц1адеп™ 01АЕП1ег МАХ1 ргер.

Для каждого донора последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина амплифицировали из тех же самых кДНК-препаратов в соответствии с аналогичной ПЦР-процедурой в два раунда и с использованием тех самых параметров реакции, которые были описаны выше для областей легкой цепи, за исключением того, что были использованы праймеры, описанные в табл. 6 и 7. Первую амплификацию осуществляли с использованием набора из девяти смысловых прямых праймеров (см. табл. 6; включая все семейства вариабельных областей тяжелой цепи), каждый из которых был объединен с антисмысловым праймером, специфичным для константной области 1дС и обозначенным НиС1дС: 5'-СТС САС СТТ ССТ СТТ ССТ ССС СТТ -3' (8ЕЦ Ш N0:156), с получением 4x9 продуктов размером приблизительно 650 пар нуклеотидов. Эти продукты очищали на 2% агарозном геле и выделяли из геля на гель-экстракционных колонках Ц1адеп. 1/10 каждого выделенного продукта использовали в идентичной ПЦР-реакции, описанной выше, с применением тех же самых девяти смысловых праймеров, а затем каждый смысловой праймер для тяжелой цепи объединяли с одним из четырех антисмысловых праймеров, специфичных к 1Нобласти. Праймеры, используемые во втором раунде, удлиняли с помощью рестрикционных сайтов (см. табл. 7) для осуществления прямого клонирования в вектор, содержащий (суб)библиотеку легкой цепи. В результате для каждого донора получали 36 продуктов размером приблизительно 350 пар нуклеотидов. Продукты для каждого донора на один используемый (УН) смысловой праймер объединяли в девять фракций. Полученные продукты очищали на колонках для ПЦР-очистки Ц1адеп. Затем фракции гидролизовали ферментами δίΐΐ и Х1ю1 и лигировали в вектор, содержащий (суб)библиотеку легкой цепи, который затем разрезали теми же самыми рестриктирующими ферментами с применением той же самой процедуры лигирования и объемов, описанных выше для (суб)библиотеки легкой цепи. Альтернативно, фракции гидролизовали ферментами №о1 и Х1о1 и лигировали в вектор для легкой цепи, который затем разрезали теми же самыми рестриктирующими ферментами с применением той же самой процедуры лигирования и объемов, описанных выше для (суб)библиотеки легкой цепи. Очистку лигированной смеси и последующую трансформацию полученной конечной библиотеки также осуществляли, как описано выше для(суб)библиотеки легкой цепи, и на этой стадии лигированные смеси для каждого донора объединяли в УН-пул. Трансформанты культивировали в 27 чашках (три чашки на объединенную фракцию; размер чашки: 240 - 240 мм), содержащих агар 2ТУ, в который были добавлены 50 мкг/мл ампициллина и 4,5% глюкозы. Все бактерии собирали в культуральной среде 2ТУ, содержащей 50 мкг/мл ампициллина и 4,5% глюкозы, смешивали с глицерином до объема 15% (об./об.) и замораживали в 1,5 мл аликвотах при -80°С. Спасение и отбор каждой библиотеки проводили, как описано ниже.

Пример 3. Отбор фагов, несущих одноцепочечные Εν-фрагменты, специфически распознающие гликопротеин вируса бешенства.

Фрагменты антитела отбирали с использованием библиотек фагового представления антител в соответствии с общей технологией фагового представления и технологией МаЬкйас!®, по существу, опи

- 28 010785 санными в патенте США № 6265150 и в заявке \¥0 98/15833 (которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Используемыми фаговыми библиотеками антител были две различные полусинтетические фаговые библиотеки 5сΕν (ДК1994 и \УТ2000) и иммунные фаговые библиотеки 5сΕν (КАВ-03С01 и КАВ-04-С01), полученные, как описано выше в примере 2. Первая полусинтетическая фаговая библиотека 5сΕν (ДК1994) была описана бе КгшГ с1 а1. (19951), а вторая библиотека (\УТ2000) была сконструирована, как, по существу, описано бе КгшГ е1 а1. (19951). Вкратце, эта библиотека была получена в полусинтетическом формате, что позволяет вводить изменения в гены У-области тяжелой и легкой цепей с использованием вырожденных олигонуклеотидов, которые вводят изменения в СПК-области. Были использованы гены только УН3 тяжелой цепи в комбинации с генами легкой цепи к и λ. СПК1 и СПК3 тяжелой цепи и СПК3 легкой цепи были реконструированы путем синтеза ПЦР-методом, аналогичным методу, описанному бе КгшГ е1 а1. (19951). Сконструированные таким образом гены У-области последовательно клонировали в 5сБν-формате в фагмидный вектор и амплифицировали с получением фаговой библиотеки, описанной выше. Кроме того, в настоящем изобретении были использованы методы и фагипомощники, описанные в заявке XV0 02/103012 (которая вводится в настоящее описание посредством ссылки). Для идентификации фаговых антител, распознающих гликопротеин вируса бешенства, проводили эксперименты по отбору фага с использованием целого вируса бешенства (штамма вируса бешенства Питмана-Мура), инактивированного путем обработки β-пропиолактоном; очищенного гликопротеина вируса бешенства (штамма ЕКА вируса бешенства) и/или трансфеципрованных клеток, экспрессирующих С-белок вируса бешенства (штамма ЕКА вируса бешенства).

С-белок выделяли из штамма ЕКА вируса бешенства, как описано ниже. К вирусному раствору добавляли 1/10 объема 10%-ного октил-в-глюкопиранозида и смесь слегка размешивали. После 30минутного инкубирования при 4°С образец вируса центрифугировали (36000 об./мин, 4°С) на роторе 8ν51. Супернатант собирали и диализовали против 0,1М Триса/ЕПТА в течение ночи при 4°С. Затем гликопротеин собирали из камеры для диализа, разделяли на аликвоты и перед его использованием хранили при -80°С. Концентрацию белка определяли по 0Ό при 280 нм и целостность С-белка анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

Целый инактивированный вирус бешенства или С-белок вируса бешенства разводили в забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8), 2-3 мл этого раствора добавляли в пробирки Мах18огр Nиηс-Iттиηо Ти1ез (№тс) и инкубировали в течение ночи при 4°С на вращающемся диске. Аликвоту фаговой библиотеки (500 мкл, приблизительно 10¹³ к.о.е., амплифицированную с использованием фагапомощника СТ (см. ν0 02/103012)) блокировали в блокирующем буфере (2% РгойГаг в РВ8) в течение 12 ч при комнатной температуре. Блокированную фаговую библиотеку добавляли в пробирку Iттиηоΐи1е (предварительно инкубированную с 5сΕν СК-57 или без 5сΕν СК-57 для блокирования эпитопа, распознаваемого антителом СК-57), инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре и промывали промывочным буфером (0,1% твином-20 (8е1Уа) в РВ8) для удаления несвязанных фагов. Затем связанные фаги элюировали из антигена путем инкубирования в течение 10 мин при комнатной температуре с 1 мл 50 мМ глицина-НС1, рН 2,2. После этого элюированные фаги смешивали с 0,5 мл 1М трис-НС1, рН 7,5 для нейтрализации рН. Эту смесь использовали для инфицирования 5 мл культуры ХШ-ВШе Е.со1, которую выращивали при 37°С до достижения 0Ό при 600 нм, равной 0,3. Затем фаги использовали для инфицирования бактерий ХЬ1-В1ие в течение 30 мин при 37°С. После этого смесь центрифугировали 10 мин при 3200хд при комнатной температуре и бактериальный осадок ресуспендировали в 0,5 мл среды с 2-триптоновым дрожжевым экстрактом (2ТУ). Полученную бактериальную суспензию распределяли по двум планшетам с агаром 2ТУ, в которые были добавлены тетрациклин, ампициллин и глюкоза. После инкубирования планшетов в течение ночи при 37°С колонии соскабливали с этих планшетов и использовали для получения обогащенной фаговой библиотеки, как описано, по существу, бе КгшГ е1 а1. (1995а) и в ν0 02/103012. Вкратце, соскобленные бактерии использовали для инокуляции среды 2ТУ, содержащей тетрациклин, ампициллин и глюкозу, и культивировали при температуре 37°С до достижения 0Ό при 600 нм, равной ~0,3. Затем добавляли фаги-помощники СТ и культуру оставляли для инфицирования бактерий, после чего среду заменяли средой 2ТУ, содержащей ампициллин, тетрациклин и канамицин. Инкубирование продолжали в течение ночи при 30°С. На следующий день бактерии удаляли из среды 2ТУ путем центрифугирования, после чего фаги, присутствующие в этой среде, осаждали полиэтиленгликолем (ПЭГ) 6000/№-1С1. И наконец, эти фаги растворяли в 2 мл РВ8, содержащем 1% альбумин бычьей сыворотки (В8А), стерилизовали фильтрацией и использовали в следующем раунде отбора.

Отбор фагов также осуществляли с использованием клеток, трансфецированных гликопротеином вируса бешенства.

Используемыми клетками были клетки, полученные из клеточной линии, депонированной в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС), САМК, 8а1з11гу, УбЫиге 8Р4 01С. в Великобритании, 29 февраля 1996 г., под регистрационным номером 96022940, и имеющейся в продаже под торговым знаком РЕК.С6®. В настоящей заявке эти клетки были названы клетками РЕК.С6®. Затем блокированную фаговую библиотеку (2 мл) сначала добавляли к 1 х 10⁷ субтрактивных клеток (в ПМЕМ/10% ЕВ8) и инкубировали в течение 1 ч при 4°С на вращающемся диске. Субтрактивными клетками были клетки

- 29 010785

РЕК.С6®, которые экспрессировали на своей поверхности эктодомен гликопротеина везикулярного стоматита (νδν), присоединенный к трансмембранному и цитоплазматическому домену вируса бешенства. В соответствии с процедурой стадии субтрактивного отбора из фаговой библиотеки удаляли фаги, распознающие либо гликопротеин У8У, либо антигены, специфичные к клеткам РЕК.С6®. Смесь фагов/клеток центрифугировали (5 мин при 4°С при 500/д) для удаления связанных с клетками фагов, и супернатант добавляли в новую пробирку, содержащую 3 мл 1/10⁷ субтрактивных клеток. Стадию субтрактивного отбора повторяли два раза с соответствующим супернатантом. Затем фаги, подвергнутые субтрактивному отбору, инкубировали в течение 1,5 ч при 4°С на вращающемся диске с трансфецированными клетками, экспрессирующими гликопротеин вируса бешенства (клетками РЕК.С6® (3/10⁶ клеток)). Перед этим трансфецированные клетки предварительно инкубировали с зсЕу СК-57 или без зсЕу СК-57 для блокирования эпитопа, распознаваемого СК-57. После инкубирования клетки пять раз промывали 1 мл ЭМЕМ/10% ЕВ8 (для каждой промывки клетки ресуспендировали и переносили в новую пробирку), фаги элюировали и обрабатывали, как описано выше.

Обычно перед выделением отдельных представленных на фаге (фаговых) антител проводили два раунда отбора. После второго раунда отбора отдельные колонии Е.сой использовали для получения моноклональных фаговых антител. В основном, отдельные колонии культивировали до достижения логарифмической фазы роста в 96-луночном планшете и инфицировали фагами-помощниками VС8М13, после чего эти колонии оставляли на ночь для продуцирования фаговых антител. Продуцированные фаговые антитела осаждали смесью ПЭГ/№1С1 и стерилизовали фильтрацией, а затем тестировали в ЕЬ18А на связывание с целым инактивированным вирусом бешенства и очищенным О-белком вируса бешенства. В результате отбора получали широкую панель фаговых антител, что продемонстрировало их связывание как с целым инактивированным вирусом бешенства, так и с О-белком вируса бешенства (см. нижеследующий пример). Две стратегии отбора проводили с использованием вышеописанных иммунных библиотек. В первой стратегии после двух раундов отбора, проводимых с использованием инактивированного вируса или очищенного О-белка первого и второго раунда отбора, было отобрано 736 фаговых антител. Во второй стратегии после двух раундов отбора, проводимых с использованием экспрессированного на клеточной поверхности рекомбинантного О-белка первого раунда отбора и инактивированного вируса или очищенного О-белка второго раунда отбора, было отобрано 736 фаговых антител. Число уникальных фаговых антител, полученных в первой стратегии, составляло 97, а число уникальных фаговых антител, полученных во второй стратегии, составляло 70. 97 уникальных клонов фаговых антител, идентифицированных в первой стратегии, вырабатывали 18 нейтрализующих антител, а 70 уникальных клонов фаговых антител, идентифицированных во второй стратегии, вырабатывали 33 нейтрализующих антитела. Это явно свидетельствовало о том, что отбор, проводимый с использованием в качестве антигена клеток, трансфецированных гликопротеином вируса бешенства, т.е. рекомбинантным О-белком, экспрессированным на клеточной поверхности, выявил большее количество нейтрализующих антител по сравнению с количеством антител, выявленных при отборе, в котором использовали только очищенный О-белок и/или инактивированный вирус.

Пример 4. Подтверждение одноцепочечных фаговых антител, специфичных к гликопротеину вируса бешенства.

Выбранные одноцепочечные фаговые антитела, полученные в вышеописанных методах скрининга, были подтверждены в ЕЫ8А на их специфичность, т.е. на способность связываться с О-белком вируса бешенства, очищенным, как описано выше. Кроме того, одноцепочечные фаговые антитела также тестировали на связывание с 5% ЕВ8. Для этих целей О-белок вируса бешенства или 5% ЕВ8-препарат наносили на ЕЫ8А-планшеты Махкогр™. После нанесения планшеты блокировали в РВ8/1% РгоШаг в течение 1 ч при комнатной температуре. Отобранные одноцепочечные фаговые антитела инкубировали в течение 15 мин в равном объеме в РВ8/1% РгойЕаг, в результате чего получали блокированные фаговые антитела. Затем планшеты опустошали и блокированные фаговые антитела добавляли в лунки. Инкубирование проводили в течение 1 ч, после чего планшеты промывали в РВ8, содержащем 0,1% твин-20, и связанные фаговые антитела детектировали (путем измерения 0Ό при 492 нм) с использованием антиМ13 антитела, конъюгированного с пероксидазой. В качестве контроля эту процедуру проводили одновременно без использования одноцепочечного фагового антитела и с использованием одноцепочечного фагового антитела против СЭ8 (8С02-007), в качестве негативного контроля или одноцепочечного фагового антитела против гликопротеина вируса бешенства (зсЕу 8057) в качестве позитивного контроля. Как показано в табл. 8, отобранные фаговые антитела, обозначенные 8С04-001, 8С04-004, 8С04-008, 8С04-010, 8С04-018, 8С04-021, 8С04-026, 8С04-031, 8С04-038, 8С04-040, 8С04-060, 8С04-073, 8С04-097, 8С04-098, 8С04-103, 8С04-104, 8С04-108, 8С04-120, 8С04-125, 8С04-126, 8С04-140, 8С04-144, 8С04-146 и 8С04-164, обнаруживали значимый уровень связывания с иммобилизованным очищенным О-белком вируса бешенства, но не обнаруживали какого-либо связывания с ЕВ8. Идентичные результаты были получены в ЕЫ8А с использованием целого инактивированного вируса бешенства, полученного как описано выше (данные не приводятся).

Пример 5. Характеризация зсЕу, специфичного к вирусу бешенства.

- 30 010785

Из отобранных клонов специфического одноцепочечного фагового антитела (ксЕу) получали плазмидную ДНК и ее нуклеотидные последовательности определяли стандартными методами. Нуклеотидные последовательности κοΕν (включая рестрикционные сайты для клонирования), обозначенные 8С04001, 8С04-004, 8С04-008, 8С04-010, 8С04-018, 8С04-021, 8С04-026, 8С04-031, 8С04-038, 8С04-040, 8С04-060, 8С04-073, 8С04-097, 8С04-098, 8С04-103, 8С04-104, 8С04-108, 8С04-120, 8С04-125, 8С04-126,

8С04-140, 8С04-144, 8С04-146 и 8С04-164, представлены в 8Е6 ΙΌ N0:157, 8 ЕС) ГО

N0:161, 8 ЕС) ГО N0:163, 8ЕС) ГО N0:165, 8ЕС) ГО N0:167, 8ЕС) ГО N0:169, 8 ЕС) ГО

N0:173, 8 ЕС) ГО N0:175, 8ЕС) ГО N0:177, 8ЕС) ГО N0:179, 8ЕС) ГО N0:181, 8 ЕС) ГО

N0:185, 8 ЕС) ГО N0:187, 8ЕС) ГО N0:189, 8ЕС) ГО N0:191, 8ЕС) ГО N0:193, 8 ЕС) ГО

N0:159, 8ЕС)

N0:171, 8ЕС)

N0:183, 8ЕС)

N0:195, 8ЕС)

ГО ГО го го

N0:197, 8ЕЦ ГО N0:199, 8ЕЦ ГО N0:201 и 8ЕЦ ГО N0:203 соответственно. Аминокислотные последовательности δοΕν, обозначенные 8С04-001, 8С04-004, 8С04-008, 8С04-010, 8С04-018, 8С04-021, 8С04-026,

8С04-031, 8С04-038, 8С04-040, 8С04-060, 8С04-073, 8С04-097, 8С04-098, 8С04-103, 8С04-104, 8С04-108, 8С04-120, 8С04-125, 8С04-126, 8С04-140, 8С04-144, 8С04-146 и 8С04-164, представлены в 8 ЕС) ГО

N0:158, 8 ЕС) ГО N0:160, 8ЕС) ГО N0:162, 8ЕС) ГО N0:164, 8ЕС) ГО N0:166, 8 ЕС) ГО N0:168, 8ЕС) ГО

N0:170, 8 ЕС) ГО N0:172, 8ЕС) ГО N0:174, 8ЕС) ГО N0:176, 8ЕС) ГО N0:178, 8 ЕС) ГО N0:180, 8ЕС) ГО

N0:182, 8 ЕС) ГО N0:184, 8ЕС) ГО N0:186, 8ЕС) ГО N0:188, 8ЕС) ГО N0:190, 8 ЕС) ГО N0:192, 8ЕС) ГО

N0:194, 8ЕС) ГО N0:196, 8ЕС) ГО N0:198, 8ЕС) ГО N0:200, 8ЕС) ГО N0:202 и 8ЕС) ГО N0:204 соответст венно.

В табл. 9 проиллюстрирована идентичность генов УН и УЪ (см. ТотНщоп Ι.Μ., УПНапъ 8.С., 1дпаΙονίΙοΗ 0., СогЬеН 8.1., \Уш1ег 6. У-ВА8Е 8ес.|иепсе П1тес1оту. СатЬпйде Ипйей Ктдйот: МКС Сеп1ге Гог Рго1еш Епдтссппд (1997)) и состав СЭК3 тяжелой цепи 5сЕт. специфически связывающегося с 6-белком вируса бешенства.

Пример 6. 1п νίΙΐΌ нейтрализация вируса бешенства фрагментом κοΕν, специфичным к вирусу бешенства (модифицированный КЕЕ1Т).

Для определения способности отобранных 5сЕу блокировать инфицирование вирусом бешенства проводили анализы на нейтрализацию ш νίΙΐΌ (модифицированный анализ КЕЕ1Т). 8сΕν-препараты разводили серийными трехкратными разведениями, начиная с разведения 1:5. В каждое разведение добавляли вирус бешенства (штамм СУ8-11) при концентрации, обеспечивающей 80-100% инфицирование. Смесь вирусаАсЕу инкубировали в течение 1 ч при 37°С/5% СО₂, а затем добавляли к клеткам МЫА. Через 24 ч после инфицирования (при 34°С/5% СО₂) клетки фиксировали в ацетоне в течение 20 мин при 4°С и окрашивали в течение минимум 3 ч конъюгатом антирабическое антитело -Ы-ЕГТС (СеШосог). Затем лунки анализировали на инфицирование вирусом бешенства под флуоресцентным микроскопом для определения 50% разведения в конечной точке. Таким разведением является разведение, при котором вирусная инфекция блокируется на 50% в данном анализе (см. пример 1). Были идентифицированы несколько ксЕу, которые обладали активностью, нейтрализующей вирус бешенства (см. табл. 10).

Кроме того, проводили исследования с помощью вышеописанного анализа на нейтрализацию ш νί1го (модифицированного КЕЕ1Т) для того, чтобы определить, обладают ли отобранные 5сЕу способностью нейтрализовать ускользающие вирусы Е57, полученные, как описано в примере 1 (Е57А2, Е57А3, Е57В1, Е57В2, Е57В3 и Е57С3). Было идентифицировано несколько ксЕу, корые обнаруживали активность, нейтрализующую ускользающие вирусы Е57 (см. табл. 11А и 11В).

Пример 7. ЕЬ18А-анализ на конкурентное связывание 5сЕу с 6-белком вируса бешенства.

Для идентификации антител, которые связываются с неперекрывающимися неконкурирующими эпитопами, проводили ЕЫ8А-анализ на конкурентное связывание с гликопротеином вируса бешенства. Планшеты Nиηс-Iттиηο™ МахЦогр Е96 (Шпс) сенсибилизировали в течение ночи при 4°С при разведении 1:1000 очищенного гликопротеина вируса бешенства (1 мг/мл; штамма ЕКА вируса бешенства) в РВ8 (50 мкл). Несвязанный белок отмывали, а затем лунки блокировали 100 мкл РВ8/1% РтойГат в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем блокирующий раствор удаляли и добавляли 50 мкл антирабических неочищенных 5сЕу в РВ8/1% Рго11Гаг (2х разведенных). Лунки пять раз промывали 100 мкл смеси РВ8/0,05% твин-20. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл биотинилированного конкурирующего антитела 1д6 против вируса бешенства, СК.-57Ью, инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре и лунки пять раз промывали 100 мкл смеси РВ8/0,05% твин-20. Для детекции связывания СК.-57Ью в лунки добавляли 50 мкл 1:2000 разведения антитела, конъюгированного со стрептавидином-ПХ (ВесЮп Эюкшкоп) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки снова промывали, как описано выше, а затем проводили ЕЬ18А-анализ, в котором окраску проявляли путем добавления 100 мкл реагента 0РЭ (81дта). Реакцию прекращали добавлением 50 мкл 1 М Н₂80₄, а затем измеряли 0Ό при 492 нм.

Сигнал, полученный с использованием только одного СК.-57Ью, мог снижаться до фоновых уровней при совместном инкубировании с 5сЕу 8057, т.е. с 5сЕу-формой СК.-57 (для нуклеотидной и аминокислотной последовательности 8057 см. 8ЕЦ ГО N0:205 и 8ЕЦ ГО N0:206 соответственно) или с ксЕу 801В, т.е. с ксЕу-формой СК.-1В (для нуклеотидной и аминокислотной последовательности 801В см. 8ЕЦ ГО N0:312 и 8ЕЦ ГО N0:313 соответственно). Это свидетельствует о том, что ксЕу 8057 и 801В конкури

- 31 010785 руют с СВ-57йю за взаимодействие с гликопротеином вируса бешенства путем связывания с тем же самым эпитопом или с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом СВ-57йю соответственно. В противоположность этому, иррелевантный κοΡν, обозначенный 8С02-007, т.е. 8θΡν, связывающийся с СЭ8, не конкурировал за связывание. Антирабические 8θΡν, обозначенные 8С04-004, 8С04-010, 8С04-024, 8С04-060, 8С04-073, 8С04-097, 8С04-098, 8С04-103, 8С04-104, 8С04-120, 8С04-125, 8С04-127, 8С04-140, 8С04-144 и 8С04-146, также не конкурировали с СВ-57йю, что указывает на то, что эти 5сЕу связываются с эпитопом, отличающимся от эпитопа, распознаваемого СВ-57 (см. фиг. 4).

Аналогичные результаты были получены в следующем эксперименте. Сначала антирабическое антитело СВ-57 добавляли в лунки, сенсибилизированные 6-белком вируса бешенства. Затем добавляли конкурирующие 5сЕу. В этом эксперименте антирабические 5сЕу были детектированы с использованием конъюгированного с ПХ антитела против У8У благодаря присутствию У8У-метки в аминокислотных последовательностях 5сЕу (см. фиг. 5).

Пример 8. Конструирование полноразмерных молекул человеческого иммуноглобулина (человеческих моноклональных антител против вируса бешенства) из выбранных одноцепочечных антирабических Ρν.

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей ^Ρν, обозначенные 8С04-001, 8С04-008, 8С04-018, 8С04-040 и 8С04-126, подвергали ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов для введения рестрикционных сайтов и/или последовательностей для экспрессии в 1д6-экспрессирующих векторах р8уи-С03-НСу1 (см. 8Е6 ГО N0:277) и р8уп-С04-С/. (см. 8Е6 ГО N0:278) соответственно. У_Н- и У_ь-гены амплифицировали с использованием олигонуклеотидов, представленных в табл. 12 и 13 соответственно, и эти ПЦР-продукты клонировали в векторы р8уп-С03-НСу1 и р8уп-С04-С/. соответственно.

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей ^Ρν, обозначенные 8С04-004, 8С04-010, 8С04-021, 8С04-026, 8С04-031, 8С04-038, 8С04-060, 8С04-073, 8С04-097, 8С04-098, 8С04-103, 8С04-104, 8С04-108, 8С04-120, 8С04-125, 8С04-140, 8С04-144, 8С04-146 и 8С04-164, подвергали ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов для введения рестрикционных сайтов и/или последовательностей для экспрессии в 1д6-экспрессирующих векторах р8уп-С03-НСу1 и р8уп-С05-Ск (см. 8Е6 ГО N0:279) соответственно. У_Н- и Уь-гены амплифицировали с использованием олигонуклеотидов, представленных в табл. 12 и 13 соответственно, и эти ПЦР-продукты клонировали в векторы р8уп-С03-НСу1 и р8уп-С05Ск соответственно. Олигонуклеотиды были сконструированы так, чтобы они корректировали любые отклонения от последовательности зародышевой линии, которые были внесены в процессе конструирования библиотеки в результате ограниченного набора олигонуклеотидов, используемых для амплификации генов большого репертуара антител. Нуклеотидные последовательности для всех конструкций подтверждали стандартными методами, известными специалистам.

Полученные экспрессионные конструкции рдб104-001С03, рд6104-008С03, рдб 104-018С03, рд6104-040С03 и рд6104-126С03, кодирующие тяжелые цепи человеческого антирабического 1д61 в комбинации с релевантной конструкцией р8уи-С04-У/, кодирующей соответствующую легкую цепь, подвергали временной экспрессии в клетках 293Т, и получали супернатанты, содержащие антитела 1д61. Экспрессионные конструкции рд6104-004С03, рд6104-010С03, рд6104-021С03, рд6104-026С03, рд6104-031С03, р§6104-038С03, р§6104-060С03, р§6104-073С03, р§6104-097С03, р§6104-098С03, рд6104-103 С03, р§6104-104С03, р§6104-108С03, р§6104-120С03, р§6104-125С03, р§6104-140С03, рд6104-144С03, р§6104-146С03 и рд6104-164С03, кодирующие тяжелые цепи человеческого антирабического 1дС1 в комбинации с релевантной конструкцией р8уп-С05-Ук, кодирующей соответствующую легкую цепь, подвергали временной экспрессии в клетках 293Т и получали супернатанты, содержащие антитела 1§61.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей антител, обозначенных СВ04-001, СВ04-004, СВ04-008, СВ04-010, СВ04-018, СВ04-021, СВ04-026, СВ04-031, СВ04-038, СВ04-040, СВ04-060, СВ04-073, СВ04-097, СВ04-098, СВ04-103, СВ04-104, СВ04-108, СВ04-120, СВ04125, СВ04-126, СВ04-140, СВ04-144, СВ04-146 и СВ04-164, определяли стандартными методами. Затем рекомбинантные человеческие моноклональные антитела очищали на колонке с белком А, с последующей заменой буфера на обессоливающей колонке, в соответствии со стандартными методами очистки, применяемыми обычно для очистки иммуноглобулинов (см., например, заявку XV0 00/63403, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки).

Кроме того, для СВ04-098 генерировали один вектор, экспрессирующий человеческий 1дС1 и обозначенный рд6104-098С10, как описано выше для векторов рд8057С11 и рд80!ВС11, кодирующих СВ57 или СВ-1В соответственно (см. пример 1). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей антитела СВ04-098, кодируемого вектором рд6104-098С10, представлены в 8Е6 ГО N0:334-337 соответственно. Векторы рд8057С11 (см. пример 1) и рд6104-098С10 были использованы для стабильной экспрессии СВ-57 и СВ04-098 соответственно, в клетках, происходящих от клеточной линии, депонированной в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС), САМВ, 8аШйшу, νίΐΐбчге 8Р4 016, в Великобритании, 29 февраля 1996 г., под регистрационным номером 96022940, и имеющейся в продаже под торговым знаком РЕВ.С6®. Стабильно продуцированные СВ-57 и СВ04-098 имели

- 32 010785 вычисленную изоэлектрическую точку, составляющую 8,22 и 8,46 соответственно. Экспериментально вычисленные изоэлектрические точки для СВ-57 составляли 8,1-8,3, а для СВ04-098 они составляли 9,09,2. Рекомбинантные человеческие моноклональные антитела очищали, как описано выше. Если это не указано особо, антитела СВ04-001, СВ04-004, СВ04-008, СВ04-010, СВ04-018, СВ04-021, СВ04-026, СВ04-031, СВ04-038, СВ04-040, СВ04-060, СВ04-073, СВ04-097, СВ04-098, СВ04-103, СВ04-104, СВ04108, СВ04-120, СВ04-125, СВ04-126, СВ04-140, СВ04-144, СВ04-146 и СВ04-164 получали с использованием рекомбинантных человеческих моноклональных антител, временно экспрессированных двумя векторными системами, описанными выше, а СВ57 получали с использованием рекомбинантных человеческих моноклональных антител, временно экспрессированных одной векторной системой, описанной выше в примере 1.

Пример 9. ЕЫБА-анализ на конкурентное связывание 1дС1 с С-белком вируса бешенства.

Для того чтобы определить, связываются ли человеческие моноклональные 1дС против С-белка вируса бешенства с неперекрывающимися неконкурирующими эпитопами, осуществляли эксперименты на конкурентное связывание. Лунки с С-белком вируса бешенства инкубировали с возрастающими концентрациями (0-50 мкг/мл) немеченного 1дС против С-белка вируса бешенства в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл другого биотинилированного 1дС против вируса бешенства (1 мкг/мл), инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре и сразу пять раз промывали 100 мкл РВ8/0,05% твин-20. Затем лунки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с 50 мкл 1:2000 разведения антитела, конъюгированного со стрептавидином-ПХ (ВесЮи Пккшзои), после чего их промывали и проявляли, как описано выше. Снижение интенсивности сигнала по мере возрастания концентрации немеченного 1дС показало, что два антитела конкурируют друг с другом и распознают одни и те же эпитопы или перекрывающиеся эпитопы.

Альтернативно, лунки, сенсибилизированные С-белком вируса бешенства (штамма ЕВА), инкубировали с 50 мкг/мл немеченного 1дС против С-белка вируса бешенства в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл биотинилированного СВ57 (0,5-5 мкг/мл; при субнасыщенных уровнях). Последующие стадии проводили, как описано выше. Полученные сигналы были сравнимы с сигналом, полученным только для биотинилированного СВ57 (см. фиг. 6; конкурентное антитело отсутствовало). Исходя из фиг. 6, можно сделать вывод, что интенсивность сигнала не будет уменьшаться в присутствии антитела, обозначенного СВ02-428, которое служило в качестве негативного контроля. В противоположность этому конкуренция с немеченным СВ57 (позитивный контроль) или СВ1В приводила к снижению интенсивности сигнала до фоновых уровней. Исходя из фиг. 6, можно также сделать вывод, что не ни один из 1дС против С-белка вируса бешенства не обнаруживал заметной конкуренции с СВ-57, что соответствовало данным, полученным для конкурентного связывания зсΡν, как описано в примере 7.

Кроме того, проводили эксперименты на конкурентное связывание для клеток РЕВ.С6, трансфецированных С-белком вируса бешенства (штамма ЕВА), с помощью проточной цитометрии. Трансфецированные клетки инкубировали с 20 мкл немеченного 1дС против С-белка вируса бешенства (50 мкг/мл) в течение 20 мин при 4°С. После промывки клеток РВ8, содержащем 1% В8А, в каждую лунку добавляли 20 мкл биотинилированного СВ57 (0,5-5 мкг/мл; при субнасыщенных уровнях), инкубировали в течение 5 мин при 4°С и сразу два раза промывали 100 мкл РВ8, содержащего 1% В8А. Затем лунки инкубировали в течение 15 мин при 4°С с 20 мкл 1:200 разведения антитела, конъюгированного со стрептавидиномФЭ (Са11ад), после чего лунки промывали и проявляли, как описано выше. Сигнал, полученный для биотинилированного СВ57, не должен значительно снижаться в присутствии антитела СВ02-428, используемого в качестве негативного контроля (см. фиг. 7). В противоположность этому конкуренция с немеченным СВ57 (позитивный контроль) или СВ-1В приводила к снижению интенсивности сигнала до фоновых уровней. Ни один из 1дС против С-белка вируса бешенства не обнаруживал заметной конкуренции с СВ-57, за исключением СВ04-126, который снижал интенсивность сигнала приблизительно на 30% (см. фиг. 7). Этот иммуноглобулин не обнаруживал конкуренции в ЕЫБА-анализе (см. фиг. 6). Это может быть обусловлено отличием пути представления гликопротеина антителу в РАС8-экспериментах от пути его представления в ЕЫ8А-экспериментах. Связывание СВ04-126, вероятно, в большей степени зависит от конформации гликопротеина, что должно приводить к эффектам конкуренции, наблюдаемым для СВ04-126 в конкурентном РАС8-анализе, но не в конкурентном ЕЫ8А-анализе. Кроме того, СВ04008 и СВ04-010 снижали интенсивность сигнала примерно на 50% (см. фиг. 7) в конкурентном РАС8анализе, что указывает на то, что они могут конкурировать с СВ57. Однако эти данные для СВ04-010 не подтверждались данными, полученными для зсΡν, и данными, полученными в конкурентном ЕЬ18Аанализе. Для других 1дС РАС8-данные соответствовали ЕЫ8А-данным как для зсΡν, так и для 1дС.

Пример 10. Аддитивные/синергические эффекты антирабических 1дС в анализе 1и νίΙΐΌ на нейтрализацию вируса бешенства (модифицированный анализ ВРР1Т).

Для того чтобы определить, обладают ли 1дС против С-белка вируса бешенства аддитивным или синергическим действием в анализе на нейтрализацию вируса бешенства, были протестированы различные комбинации 1дС. Сначала определяли активность (в МЕ/мг) каждого отдельного антитела в модифи

- 33 010785 цированном анализе КЕНТ (см. пример 1). Затем получали комбинации антител, исходя из равных количеств МЕ/мг, и тестировали в модифицированном анализе КЕЕ1Т. Активность каждой комбинации антител может быть определена и подвергнута сравнению с ожидаемой активностью. Если активность данной комбинации антител равна сумме активностей каждого индивидуального антитела, присутствующего в данной комбинации, то эти антитела имеют аддитивный эффект. Если активность комбинации антител превышает аддитивную активность, то эти антитела обладают синергическим действием, направленным на нейтрализацию вируса бешенства.

Альтернативно, аддитивные или синергические эффекты могут быть определены в последующем эксперименте. Во-первых, активность протестированных антител, например, СК-57 и СК04-098, определяли в стандартном КЕЕ1Т (см. лабораторные руководства по работе с вирусами бешенства, Е.-Х. Ме§1ш, М.М. Кар1ап & Н. КоргсшЧй (1996), 4111 еййюи, С11ар1ег 36, \Уог1й Неа11й ϋΓβαηίζαΙίοη. Сеиеуа). Затем антитела смешивали в отношении 1:1 в расчете на МЕ/мл. Эта смесь антител, наряду с отдельными антителами в той же самой концентрации, тестировали в шести независимых КЕЕ1Т-экспериментах, для определения конечной точки для концентрации, дающей 50%-ную нейтрализацию. Затем индекс комбинации (С1) для смеси антител определяли по формуле (С1)=(С1/Сх1)+(С2/Сх2)+(С1С2/Сх1Сх2), как описано Скоп е! а1., (1984). С1 и С2 означают количество (мкг) моноклонального антитела 1 и моноклонального антитела 2, которое дает 50%-ную нейтрализацию, при их использовании в комбинации, а Сх1 и Сх2 означают количество (мкг) моноклонального антитела 1 и моноклонального антитела 2, которое дает 50%-ную нейтрализацию, при их использовании по отдельности. С1=1 указывает на аддитивный эффект, С1<1 указывает на синергический эффект, а С1>1 указывает на антагонистический эффект моноклональных антител.

Пример 11. Идентификация эпитопов, распознаваемых рекомбинантными человеческими антителами против вируса бешенства, с помощью РЕР§СЛХ-ЕЫ§Л.

15-Мерные линейные и петлевые/циклические пептиды синтезировали из внеклеточного домена Сбелка штамма ЕКА вируса бешенства (см., 8Е0 ΙΌ N0:207 для полноразмерной аминокислотной последовательности С-гликопротеина штамма ЕКА вируса бешенств; внеклеточный домен состоит из аминокислот 20-458; белковый идиотип (1й) гликопротеина штамма ЕКА вируса бешенства в базе данных ЕМВЬ обозначен 102293) и скринировали с использованием мини-РЕР8СА№карт, имеющих формат кредитных карт (455 пептидов/карту), как было описано ранее (81оо1йта е! а1., 1996; \У0 93/09872). Все пептиды были ацетилированы у аминоконца. Во всех петлевых пептидах аминокислоты в положениях 2 и 14 были заменены цистеинами (ацетил-ХСХХХХХХХХХХХСХ-миникарта). Если в полученном пептиде помимо цистеинов в положениях 2 и 14 присутствовали другие цистеины, то эти другие цистеины были заменены аланинами. Петлевые пептиды синтезировали стандартными химическими Етосметодами, а затем деблокировали с использованием акцепторов трифторуксусной кислоты. Затем эти деблокированные пептиды на указанных картах подвергали реакции с 0,5 мМ раствором 1,3бис(бромметил)бензола в бикарбонате аммония (20 мМ, рН 7,9/ацетонитрил (1:1 (об./об.)). Карты осторожно встряхивали в растворе в течение 30-60 мин так, чтобы они были полностью покрыты раствором. И, наконец, эти карты интенсивно промывали избытком Н₂О и обрабатывали ультразвуком в буфере для разрушения, содержащем 1% ДСН/0,1% β-меркаптоэтанола в РВ8 (рН 1,2), при 70°С в течение 30 мин, а затем обрабатывали ультразвуком в Н₂0 в течение еще 45 мин. Человеческие моноклональные антитела получали, как описано выше. Связывание этих антител с линейным пептидом и с петлевым пептидом тестировали в твердофазном иммуноферментном анализе на основе РЕР8САN (ЕЬ18А). Полипропиленовые карты 455-луночного формата типа кредитных карт, содержащие ковалентно связанные пептиды, инкубировали с антителами (10 мкг/мл; разведенные в блокирующем растворе, содержащем 5% лошадиную сыворотку (об./об.) и 5% овальбумин (мас./об.) (4°С, в течение ночи). После промывки пептиды инкубировали с античеловеческим антителом, конъюгированным с пероксидазой (разведение 1/1000) (1 ч, 25°С), а затем после промывки добавляли 2,2'-азино-ди-3-этилбензтиазолинсульфонат, являющийся субстратом для пероксидазы (АВТ8), и 2 мкл/мл 3% Н₂0₂. Контроль (для линейных и петлевых пептидов) инкубировали только с античеловеческим антителом, конъюгированным с пероксидазой. Через 1 ч регистрировали развитие окраски. Развитие окраски в ЕЫ8А количественно оценивали с помощью ПЗСкамеры и системы для обработки изображений. Это устройство состояло из ПЗС-камеры, линзы с фокусным расстоянием 55 мм (8оиу ССЭ У1йео Сатега ХС-77КК, №кои Ысго-шкког, 55 тт £/2.8 1еи§), фотоприставки (8оиу Сатега айарЮг ЭС-77КК) и пакета программ для обработки изображения (1таде Ргоссеккшд 8оП\уаге раскаде Орйтак, уегаюи 6.5) (Мей1а СуЬетейск, 8йуег 8ргшд, МЭ 20910, И8А). Визуализацию Орбит проводили на компьютере Реи1шт II.

Человеческие моноклональные антитела против С-белка вируса бешенства тестировали на связывание с 15-мерными линейными и петлевыми/циклическими пептидами, синтезированными, как описано выше. Считается, что пептид релевантно связывается с антителом, если величина 0Ό равна средней величине 0Ό для всех пептидов или в два раза выше этой величины (на одно антитело). См. табл. 14, где представлены результаты связывания человеческих моноклональных антител, обозначенных СК57, СКЙВ и СК04-010, с линейными пептидами внеклеточного домена С-гликопротеина штамма ЕКА вируса бе- 34 010785 шенства. Области, обнаруживающие значительный уровень связывания с соответствующими антителами, обозначены серым цветом (см. табл. 14).

Антитело СЕ57 связывалось с линейными пептидами, имеющими аминокислотные последователь-

ности, выбранные из	группы,	состоящей	из 8ЕКСАСКЕКЕССУЪС	(8Ер	ΙΌ	N0:314),
ЬКСАСКЕКЕССУЕСЬ	(8Ер	ΙΌ	N0:315),	КСАСКЕКЬССУЕСЬЕ	(8Ер	ΙΌ	N0:316),
САСКЕКЬССУЕСЕЕБ	(8Ер	ΙΌ	N0:317),	АСКЕКЬССУБСЕЕЕМ	(8Ер	ΙΌ	N0:318),
СКЬКЕССУЕСЕЕЬМП	(8Ер	ΙΌ	N0:319),	КЬКЕССУЕСЕЕЬМПС	(8Ер	ΙΌ	N0:320),

ЬКЬССУЪСЬКЬМПСТ (8 ЕС) ΙΌ N0:321) И КЕССАНС.ЕЛПХЛАУ (8 ЕС) ΙΌ N0:322) (см. табл. 14). Пептиды, имеющие аминокислотные последовательности СЛСКЕКЬССУЕСЕКЬ (8Е0 ΙΌ N0:317) и АСКЕКЕССУЕСЬЕЕМ (8Е0 ΙΌ N0:318), имеют величину 0Ό, которая в два раза ниже средней величины. Тем не менее, эти пептиды заявлены в настоящем изобретении, поскольку они находятся в непосредственной близости от области антигенных пептидов, распознаваемых антителом СЕ57. Наибольший уровень связывания наблюдается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность КЕСС1УЕС1Е1и.\ШС,Т\\' (8ЕС) ΙΌ N0:322).

Антитело СЕ04-010- связывается с линейными пептидами, имеющими аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из СЕС1<ЛУТ[ЕМ<ТЕМЕ (8Е0 ΙΌ N0:323), ЕСКАУТПАКТЕМЕ.А (8ЕС) ΙΌ N0:324), бКЛУТПАКТЕМЕЛ!) (8ЕО ΙΌ N0:325), КАУТПАКТЕМЕЛОА (8ЕО ΙΌ N0:326), ЛУПЕУКУЕМЕЛОАН (8 ЕС) ΙΌ N0:327), УΠЕNКТ^МЕА^АНΥ (8 ЕС) ΙΌ N0:328), ТШМКТЬМЕАВАНУК (8ЕС) ΙΌ N0:329), IЕNКТ^МЕА^АНΥК8 (8 ЕС) ΙΌ N0:330) и ЕМКТЬМЕАВАНУК8У (8Е0 ΙΌ N0:331). Пептиды, имеющие аминокислотные последовательности АУТШМКТЬМЕАПАН (8 ЕС) ΙΌ N0:327) и УПЕМКТЬМЕАПАНУ (8 ЕС) ΙΌ N0:328), имеют величину 0Ό, которая в два раза ниже средней величины. Тем не менее, эти пептиды также заявлены в настоящем изобретении, поскольку они находятся в непосредственной близости от области антигенных пептидов, распознаваемых антителом СЕ04-010. Наибольший уровень связывания наблюдается с пептидами, имеющими аминокислотные последовательности ТIЕNКТ^МЕА^АНΥК (8Е0 ΙΌ N0:329), IЕNКТ^МЕА^АНУК8 (8ЕС) ΙΌ N0:330) и ЕNКТ^МЕА^АНΥК8У (8ЕС) ΙΌ N0:331).

СЮБ и антитела, обозначаемые СЕ04-040, СЕ04-098 и СЕ04-103 (данные не приводятся), не распознают область линейных антигенных пептидов.

Все вышеуказанные пептиды и их части являются хорошими кандидатами на нейтрализующие эпитопы вируса бешенства и должны быть взяты за основу для приготовления вакцины и для вырабатывания нейтрализующих антител для лечения и/или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом бешенства.

Области 8ЕКСАСКЕКССУЕСУЕСЕЕЬМПСТ\ (8ЕС) ΙΌ N0:332) и СЕСКАУПЕМКТЕМЕАПАНУК8У (8Е0 ΙΌ N0:333) представляют особый интерес как гликопротеиновые области, обладающие высокой реактивностью в ΡЕΡ8САN.

Исходя из вышеуказанных данных ΡЕΡ8САN, можно также сделать вывод, что человеческие моноклональные антитела, обозначаемые СЕ57 и СЕ04-010, связываются с различными областями С-белка вируса бешенства, что указывает на то, что они распознают неконкурирующие эпитопы.

Пример 12. Определение нейтрализующей активности ЦС против С-белка вируса бешенства с помощью анализа на нейтрализацию ίη νίίτο (модифицированного ШИТ).

Нейтрализующую активность каждого из продуцированных человеческих моноклональных антител определяли в модифицированном ШНТ, как описано в примере 1. Шестнадцать ЦС нейтрализовали штамм СУ8-11 вируса бешенства с активностью, превышающей 1000 МЕ/мг, и лишь только два ЦС обнаруживали активность менее чем 2 МЕ/мг (см. табл. 15). Восемь из указанных шестнадцати антител обладали большей активностью, чем временно продуцируемое СЕ-57, что позволяло предположить, что они являются более эффективными для пост-контактной профилактики инфекций, вызываемых вирусом бешенства, чем СЕ-57. Активность временно продуцируемого СЕ-57 составляла приблизительно 3800 МЕ/мг белка (см. табл. 1 и 15), тогда как активность стабильно продуцируемого СЕ-57 составляла 5400 МЕ/мг белка (данные не приводятся). Интересно отметить, что большинство идентифицированных нейтрализующих человеческих моноклональных антител содержат ген вариабельной области 3-30 зародышевой линии (см. табл. 9).

Исходя из аффинности антител против вируса бешенства (данные не приводятся) и 100% разведения в конечной точке антител в модифицированном анализе ЕЕЕГГ (данные не приводятся), для последующего исследования была выбрана панель из шести уникальных ^С, т.е. СЕ04-010, СЕ04-040, СЕ04098, СЕ04-103, СЕ04-104 и СЕ04-144. В этой панели особый интерес представляет антитело СЕ04-098, поскольку оно обладает наибольшей активностью, т.е. активностью, составляющей 7300 МЕ/мг белка (см. табл. 15). Аналогичная активность была также обнаружена у стабильно продуцируемого СЕ04-098 (данные не приводятся).

Пример 13. Нейтрализация ίη νίίτο ускользающих вирусов Е57 антирабическими ЦС.

Для дополнительной характеризации новых человеческих моноклональных антирабических антител была протестирована нейтрализующая активность ЦС, направленная против ускользающих вирусов Е57, с помощью модифицированного ЕЕЕИ, описанного выше. Большинство ЦС против вируса бешен

- 35 010785 ства обладали хорошей нейтрализующей активностью против всех шести ускользающих вирусов Е57 (см. табл. 16). В противоположность этому СЯ04-008, СЯ04-018 и СЯ04-126 не обладали нейтрализующей активностью против ускользающих вирусов Е57, 6/6, 2/6 и 3/6 соответственно. Считается, что нейтрализация отсутствует, если при разведении антитела 1:100 в конечной точке не достигается 50%-ная нейтрализация. Антитела СЯ04-021, СЯ04-108, СЯ04-120, СЯ04-125 и СЯ04-164 обнаруживали значимое снижение нейтрализующей активности против ряда ускользающих вирусов. Это позволяет предположить, что эти антитела прямо или опосредованно реагировали с эпитопом, присутствующим в гликопротеине ускользающего вируса Е57. Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод, что несколько 1дО против вируса бешенства могут быть совместимыми с СЯ-57 в смеси антирабических антител для постконтактной профилактики. В частности, панель из шести уникальных 1дО, идентифицированных выше, т.е. антител СЯ04-010, СЯ04-040, СЯ04-098, СЯ04-103, СЯ04-104 и СЯ04-144, обнаруживала хорошую нейтрализующую активность против ускользающих вирусов Е57, что позволяет предположить, что эпитоп(ы), распознаваемый(е) этими антителами, не был(были) подвержен(ы) аминокислотным мутациям, индуцированным антителом СЯ-57. Очевидно, что наиболее перспективным является антитело СЯ04098, поскольку его активность против каждого из ускользающих вирусов составляет более чем 3000 МЕ/мг.

Пример 14. Распознавание эпитопа антирабическими антителами СЯ-57 и СЯ04-098.

Для подтверждения того, что человеческие моноклональные антитела, обозначенные СЯ-57 и СЯ04-098, распознают неперекрывающиеся, неконкурирующие эпитопы, для человеческого моноклонального антитела, обозначенного СЯ04-098, были генерированы ускользающие вирусы, в основном, как описано в случае ускользающих вирусов для СЯ57 (см. пример 1). Короче говоря, ряд фокусов на лунку оценивали по иммунофлуоресценции, и для амплификации вируса была выбрана среда в лунках, содержащая предпочтительно один фокус. Все ускользающие вирусы Е98 были генерированы из одного единственного фокуса, за исключением Е98-2 (из 2 фокусов) и Е98-4 (из 4 фокусов). Вирус был определен как ускользающий вариант, если индекс нейтрализации составлял <2,5 1од. Индекс нейтрализации определяли путем вычитания числа инфекционных вирусных частиц/мл, продуцированных в клеточных культурах В8Я, инфицированных вирусом в присутствии моноклонального антитела (~4 МЕ/мл), из числа инфекционных вирусных частиц/мл, продуцированных в клеточных культурах В8Я или ΜΝΑ, содержащих лишь один вирус ([1од бляшкообразующих единиц/мл вируса в отсутствии моноклонального антитела - 1од бляшкообразующих единиц/мл вируса в присутствии моноклонального антитела]). Индекс нейтрализации, составляющий менее 2,5 1од, рассматривается как показатель ускользания вируса.

Для дополнительного подтверждения того факта, что СЯ04-098 связывается с неперекрывающимся, неконкурирующим эпитопом, отличающимся от эпитопа, с которым связывается СЯ-57, СЯ-57 тестировали на нейтрализацию ускользающих вирусов Е98 в модифицированном анализе ЯЕЕ1Т, описанном выше. Как показано в табл. 17, СЯ-57 обладает хорошей нейтрализующей активностью против всех пяти ускользающих вирусов Е98. Кроме того, антитела СЯ04-010 и СЯ04-144 были протестированы на нейтрализующую активность против ускользающих вирусов Е98.

Оба эти антитела не оказывали нейтрализующего действия на ускользающие вирусы Е98 (данные не приводятся), что позволяет предположить, что эпитоп, распознаваемый обоими антителами, прямо или опосредованно подвергался аминокислотной мутации, индуцированной антителом СЯ04-098. Антитела СЯ04-018 и СЯ04-126 были протестированы на нейтрализующую активность только против одного из ускользающих вирусов Е98, т.е. Е98-4. Антитело СЯ04-018 было способно нейтрализовать ускользающий вирус, а антитело СЯ04-126 обладало лишь слабой способностью нейтрализовать указанный ускользающий вирус. Это позволяет предположить, что эпитоп, распознаваемый антителом СЯ04-018, не был подвержен мутации, индуцированной антителом СЯ04-098. Кроме того, антитела СЯ04-010, СЯ04-038, СЯ04-040, СЯ04-073, СЯ04-103, СЯ04-104, СЯ04-108, СЯ04-120, СЯ04-125 и СЯ04-164 не оказывали нейтрализующего действия на Е98-4, что дает основание предполагать, что они распознают такие же эпитопы, как и антитело СЯ04-098 (данные не приводятся).

Для идентификации возможных мутаций в гликопротеине каждого из ускользающих вирусов бешенства Е98 определяли нуклеотидную последовательность открытой рамки считывания (ОРС) этого гликопротеина, как было описано выше для ускользающих вирусов Е57 и Е1В. Все ускользающие вирусы Е98 обнаруживали мутацию Ν^Ό в положении аминокислоты 336 гликопротеина вируса бешенства (см. фиг. 8). Эта область гликопротеина была определена как антигенный сайт III, содержащий аминокислоты 330-338 (в соответствии с нумерацией без сигнального пептида). В противоположность этому, антитело СЯ-57 распознавало эпитоп, локализованный в положениях аминокислот 226-231 (в соответствии с нумерацией без сигнального пептида) и перекрывающийся с антигенным сайтом I. Помимо мутации Ν336Ό ускользающий вирус Е98, обозначенный Е98-5, обнаруживал мутацию Н^О в положении аминокислоты 354 (замена кодона САТ на САО) гликопротеина вируса бешенства (данные не приводятся).

Кроме того, РЕР8СА№анализ на связывание антитела СЯ57 с пептидами, имеющими мутированный эпитоп СЯ57 (как наблюдалось в ускользающем вирусе Е57), указывал на отсутствие взаимодей

- 36 010785 ствия с СК57 (данные не приводятся). Интересно отметить, что СК04-098 сохранял способность связываться с мутированным гликопротеином (содержащим мутацию Ν336Ό), экспрессированным на клетках РЕК.С6®, как было измерено с помощью проточной цитометрии (данные не приводятся), хотя в этом случае вирусы, содержащие эту мутацию, больше не нейтрализовались.

Кроме того, были проведены исследования по картированию эпитопов и исследования по оценке аффинности антитела с помощью анализа методом поверхностного плазмонного резонанаса с использованием аналитической системы В1Асоге3000™. Очищенный гликопротеин вируса бешенства (штамма ЕКА) иммобилизовали в качестве лиганда на исследуемом 4-канальном (Ес) сенсорном чипе СМ5 (В1асоге АВ, 8етебеп) посредством связывания с амином. Оценку проводили при 25°С с использованием НВ8-ЕР (В1асоге АВ, 8\гебеп) в качестве подвижного буфера. 50 мкл каждого антитела инъецировали при постоянной скорости потока 20 мкл/мин. Затем подвижный буфер вводили в течение 750 с с последующей регенерацией чипа СМ5 с использованием 5 мкл 2М №ЮН. 5 мкл 45 мМ НС1 и 5 мкл 2 мМ №1ОН. Резонансные сигналы выражали в резонансных единицах (РЕ) в зависимости от времени и оценивали возрастание и снижение РЕ, которое рассматривали как показатель ассоциации и диссоциации, соответственно, и которое использовали для определения класса антител. Фактические величины ΚΌ для СК57 и СК04-098, определенные в анализе методом поверхностного плазмонного резонанса, составляли 2,4 нМ и 4,5 нМ соответственно. Исследования по картированию эпитопов также подтвердили, что СК57 и СК04-098 связываются с различными эпитопами на гликопротеине вируса бешенства. Инъекция СК57 давала ответный сигнал в 58 РЕ (данные не приводятся). После инъекции СК04-098 наблюдалось дополнительное увеличение уровня ответного сигнала (24 РЕ), что позволяет предположить, что сайты связывания для СК04-098 были не заняты (данные не приводятся). Аналогичные результаты наблюдались в случае введения антител в обратном порядке, что указывает на то, что каждое антитело продуцировало аналогичные уровни сигнала (РЕ), независимо от порядка введения инъекции (данные не приводятся). Эти результаты также продемонстрировали, что СК57 и СК04-098 могут связываться одновременно и могут распознавать различные эпитопы на гликопротеине вируса бешенства.

В целом, вышеуказанные данные дополнительно подтверждают, что антитела СК-57 и СК04-098 распознают отдельные неперекрывающиеся эпитопы, т.е. эпитопы в антигенном сайте I и III соответственно. Эти данные четко коррелируют с данными конкурентных ЕЫБА/ЕАСБ-анализов, что указывает на то, что СК-57 и СК04-098 не конкурируют за связывание с С-белком штамма ЕКА, а антитело СК04098 обладает хорошей нейтрализующей активностью против всех ускользающих вирусов Е57. На основании этих результатов и того факта, что ίη νίΙΐΌ обработка вируса бешенства комбинацией СК57 и СК04-098 (отбор в присутствии 4 МЕ/мл любого антитела) не допускала ускользания вируса (данные не приводятся), можно сделать вывод, что антитела СК-57 и СК04-098 распознают неперекрывающиеся, неконкурирующие эпитопы, а поэтому они могут быть с успехом использованы в смеси антирабических антител для проведения пост-контактной профилактики.

Пример 15. Оценка консервативности эпитопа, распознаваемого антителами СК57 и СК04-098.

Для оценки консервативности эпитопа минимальную связывающую область СК-57 (аминокислоты КЕССУЪ в 8ЕО Ю NО:332, область гликопротеина вируса бешенства, распознаваемую антителом СК57, определяли посредством РЕР8СА№анализа и методом аланинового сканирования) сопоставляли путем выравнивания с нуклеотидными последовательностями 229 изолятов вируса бешенства генотипа 1 (см. табл. 18). Набор образцов содержал человеческие изоляты, изоляты летучих мышей и изоляты, выделенные у собак или домашних животных, которые с наибольшей вероятностью могут быть укушены бешеными собаками. Анализ на встречаемость аминокислот в каждом положении минимальной связывающей области выявил, что играющие важную роль остатки, составляющие данный эпитоп, были в высокой степени консервативными. Лизин в положении 1 является консервативным у 99,6% изолятов, а консервативная замена К>К наблюдалась только в одном из 229 изолятов. Остатки в положениях 2 и 3 (Ь и С) были полностью консервативными. Очевидно, что центральный цистеиновый остаток участвует в образовании складчатой структуры гликопротеина и является консервативным для всех лиссавирусов (см. Вабгапе & Тогбо, 2001). Глицин в положении 4 является консервативным у 98,7% изолятов, а мутации с заменами заряженных аминокислот (С>К в 1/229; С>Е в 2/229) наблюдались у 3 из 229 изолятов. 5положение также является консервативным, за исключением одного изолята, в котором наблюдается консервативная замена У>Е В шестом положении остатка, который не играет решающей роли, как было определено путем аланин-заместительного сканирования, значительная гетерогенность наблюдалась в изолятах уличного вируса: Ь в 70,7%; Р в 26,7% и 8 в 2,6% штаммов соответственно. В целом, предполагается, что приблизительно 99% вирусов бешенства, которые могут встречаться в природе, распознаются антителом СК-57.

123 из указанных здесь 229 вирусных изолятов были проанализированы на присутствие мутаций в эпитопе для СК-57 и СК04-098. Ни один из 123 уличных вирусов не содержал мутации в обоих эпитопах. Мутация Ν>Ό, наблюдаемая в ускользающих вирусах Е98, присутствовала только у пяти вирусных изолятов. Эти вирусы отличаются по своему географическому происхождению и были выделены у африканских животных (см. фиг. 9 для филогенетического дерева; пять вирусных изолятов, т.е.

- 37 010785

АР325483, АР325482, АР325481, АР325480 и АР325485, показаны жирным шрифтом). Филогенетический анализ последовательностей гликопротеина выявил, что вирусы бешенства с мутированными эпитопами для СВ57 являются лишь отдаленно родственными вирусам бешенства, несущим мутированный эпитоп для СВ04-098. Поэтому вероятность присутствия вируса бешенства, резистентного к нейтрализации смесью антител СВ-57 и СВ04-098, фактически отсутствует.

Таблица 1 Нейтрализующая активность СВ-57 и СВ-ДВ против вирусов дикого типа и ускользающих вирусов

Вирус	Активность СК-57 (МЕ/мг)	Активность СЕ-ЗВ (МЕ/мг)	Вирус	Активность СК-57 (МЕ/мг)	Активность СК-ЗВ (МЕ/мг)
СТЗ-11	3797	605	СУЗ-11	3797	605

Е57А2	0	<0.2	ЕЛВ2В	0.004	0.6
Е57АЗ	0	419	ЕДВ2С	<0.004	2
Е57В1	0	93	ЕОВ2В	<0.004	3
Е57В2	0	<0.3	ЕОВ2Е	<0.2	<0.3
Е57ВЗ	0	419	ЕОВ2Е	<0.06	3
Е57СЗ	0	31	ЕОВЗЕ	<0.04	0.06

Таблица 2

Праймеры (смысловые) для человеческой вариабельной области цепи λ

Название праймера	Нуклеотидная последовательность праймера	ЗЕО Ю ΝΟ
НиУА1А	5'-САСтстетбстелст САбССАСС-3'	ЗЕО Ю N0:208
ΗιινλΙΒ	5'-САБТСТБТБУТБАСБ СА6ССБСС-3'	ЗЕО Ю N0:209
НиУА1С	5'-САСТСТ6ТС6Т0АС6 САБССССС-3'	ЗЕО Ю N0:210
НиУА2	5' -САКТСТБСССТБАСТ САБССТ-3'	ЗЕО 10 N0:211
НиУАЗА	5'-ТССТАТБИ6СТБАСТ ОАБССАСС-3'	ЗЕО Ιϋ N0:212
НиУЛЗВ	5' -ТСТТСТ6АССТЗАСТ САООАССС-3^Г	ЗЕО 10 »0:213
НиУЛ4	5 ^г-САССТТАТАСТОАСТ СААССССС-З'	ЗЕО 10 N0:214
НиУА5	5' -САББСТБТБСТБАСТ САБСС6ТС-3'	ЗЕО I» N0:215
НиУАб	5'-ААТТТТАТБСТБАСТ СА6ССССА-3'	ЗЕО 10 N0:216
НиУЛ7/8	5^г-сабкстбтббтсасу САББА6СС-3'	ЗЕО 10 »0:217
НиУХЭ	5’-СНБССТБТБСТБАСТ СА0ССМСС-3'	ЗЕО 10 N0:218

- 38 010785

Таблица 3

Праймеры (смысловые) для человеческой вариабельной области цепи к

Название праймера	Нуклеотидная последовательность праймера	ЗЕО Ю N0
ΗιινκΙΒ	5' -ВАСАТССАВИТЕАССС АВТСТСС-3'	8Е0 Ю НО:219
Ηιινκ2	5 ' -ЕАТЕТТЕТВАТЕАСТ САВТСТСС-3'	ЗЕО 10 N0:220
Ηιινκ3	5'-еаааттетеитеаск САЕТСТСС-3'	8Εζ) 10 N0:221
НиУк4	5'-ЕАТАТТЕТЕАТЕАСС САСАСТСС-3'	ΞΕζ> 10 N0:222
НиУк5	5'-6АААС6АСАСТСАС6 САВТСТСС-3'	8Е0 Ю N0:223
НиУкб	5' -ЕАААТТВТВСТЕАСТС А6ТСТСС-3'	8Е(2 Ю N0:224

Таблица 4 Праймеры (смысловые) для человеческой вариабельной области цепи к, удлиненные за счет рестрикционных 8аИ-сайтов, праймеры (антисмысловые) для человеческой 1-области цепи к, удлиненные за счет рестрикционных №И-сайтов, праймеры (смысловые) для человеческой вариабельной области цепи λ, удлиненные за счет рестрикционных ЗаИ-сайтов, праймеры (антисмысловые) для человеческой 1-области цепи λ, удлиненные за счет рестрикционных №1!-сайтов

Название праймера	Нуклеотидная последовательность праймера	ЗЕО 10 N0
НиУк1В-8а11	5' -ТЕАВСАСАСАЕБТСВ АСВВАСАТССАВНТЙАСС САЕТСТСС-3'	ЗЕО Ю N0:225
НиУк2-За11	5'-ТЕАЕСАСАСАЕЕТСЕ АСВЕАТ6ТТСТВАТ6АСТ САЕТСТСС-3'	ЗЕО Ю N0:226
НиУкЗВ-ЗаИ	5'-ТЙАЙСАСАСАЕЕТСЕ АСЕЕАААТТЕТЕИТЕАСА САЕТСТСС-3'	8Е0 10 N0:227
НиУк4В-За11	5' - ТЕАВСАСАСАЙЕТСС АС66АТАТТЕТЕАТВАСС САСАСТСС-3'	8Е0 10 N0:228
НиУк5-8а11	5'-ТЕАВСАСАСАВЕТСЕАСЕ ВАААСЕАСАСТСАСВСАВТСТ СС-3'	8Е0 Ю N0:229
НиУкб-ЗаИ	5 ' -ТЕАЕСАСАСАЕЕТСВ АСЕСАААТТВТССТСАСТ САЕТСТСС-3'	8Е0 10 НО:230
НгЫк1-НоЪ1	5'-ЕАВТСАТТСТСВАСТТЕС ЕВССЕСАСЕТТТЕАТТТССАС СТТЕЕТССС-3'	8Е0 10 НО:231
НиЛс2-ИоЪ1	5'-ЕАЕТСАТТСТСЕАСТ	ЗЕО 10 N0:232

- 39 010785

	ТСС&ЗССбСАССТТТЙАТ СТССА6СТТЙ6ТССС-3'
Ни№3“ЫоЪ1	5'-ВАСТСАТТСТСЕАСТТЕС вессесасетттеататссас ТТТССТССС-3'	ЗЕЙ 10 N0:233
НиДк4-ЫоЫ	5'-ЕАЕТСАТТСТСЕАСТ тссеессесасетттеат стссАссттеетссс-з'	ЗЕЙ Ю N0:234
Ηΐ2·Τκ5-Νοΐ:Ι	5 ' -ЕАВТСАТТСТССАСТТЕС СЕССВСАСЕТТТААТСТССАЕ ТСЕТСТССС-3'.	ЗЕЙ 10 N0:235
НиУА1А-8а11	5' -ТЕАЕСАСАСАССТССАСЕ САВТСТЕТЕСТЕАСТСАВССА СС-3'	ЗЕЙ 10 N0:236
НиУА1В-За11	5' -ТЕАЕСАСАСАСЕТСЕАСО САСТСТЕТЕХТЕАСССАЕССЕ СС-3'	8ЕЙ 10 N0:237
НиУМС-За11	5' -ТСАССАСАСАВЕТСЕАСС САЕТСТЕТСЕТЕАСЕСАСССС СС-3'	ЗЕЙ ТО N0:238
НиУЛ2-За11	5 ' -ТЕАЕСАСАСАЕСТССАСЕ САНТСТЕСССТСАСТСАЕССТ- 3'	ЗЕЙ 10 N0:239
НиУАЗА-ЗаИ	5' -ТЕАЕСАСАСАЕЕТСЕАСЕ ТССТАТЕИЕСГСАСТСАЕССА СС-3'	ЗЕЙ Ю N0:240
Ни7АЗВ-8а11	5' -ТЕАЕСАСАСАЕЕТСЕАСЕ ТСТТСТЕАССТЕАСТСАЕЕАС СС-3’	ЗЕЙ 10 N0:241
НиУХ4-8а1Х	5' -ТЕАЕСАСАСАЕЕТСЕАСЕ САСЕТТАТАСТЕАСТСААССЕ	ЗЕЙ Ю N0:242

	СС-3'
Ни\7Х5-5а11	5'-ТЕАЕСАСАСАЕЕТСЕАСЕ САСЕСТЕТВСТЕАСТСАЕССС ТС-3'	ЗЕЙ 10 N0:243
НиУА6-За11	5' -ТЕАОСАСАСАЕВТСЕАСЕ ААТТТТАТОСТЕАСТСАОССС СА-3'	ЗЕЙ 10 N0:244
НиУА7/8-За11	5' -ТЕАЕСАСАСАЕЕТСЕАСЕ САЕНС ТЕТЕСТ ЕАСУСАЕЕАЕ СС-3'	ЗЕО 10 N0:245
НиУА9-За11	5' -ТЕАЕСАСАСАЕЕТСЕАСЕ СИЕССТЕТССТСАСТСАСССМ СС-3'	ЗЕЙ Ю N0:246
ΗνιΟΧΙ-ΝίΛΙ	5' -ЕАЕТСАТТСТСЕАСТТЕС СЕССЕСАССТАСЕАСЕЕТЕАС СТТЕЕТССС-3'	8ЕЙ 10 N0:247
НиЛАг/З-ИоЫ	5' —ЕАВТСАТТСТСЕАСТТЕС ЕЕССЕСАССТАЕЕАСЕЕТСАС СТТЕЕТССС-3'	БЕО 10 N0:248 У
Ηϋ0λ4/5-ΝΟ1;Ι	5' -ЕАЕТСАТТСТСЕАСТТЕС ЕЕССЕСАСХТААААСЕЕТЕАЕ СТЕЕЕТССС-3'	ЗЕЙ ТО N0:249

- 40 010785

Таблица 5

Распределение различных продуктов легкой цепи по 10 фракциям

Продукты легкой цепи	Число аллелей
Ук1В/Дк1-5	19
Ук2/Лс1-5	9
УкЗВ/Лк1-5	7
Ук4В/Ок1-5	1
Ук5/Дк1-5	1
Укб/Лс1-5	3
νλΐΑ/σιι-з	5
νλΐΒ/σιι-з
УХ1С/Л1-3

νλ2/σιι-3	5
νΧ3Α/σ11“3	9
тазв/л1-з
νλ4/σιι-3	3
νλ5/σιι-3	Г
νλβ/σιι-3	1
УК7/8/Л1~3	3
νχ9/σιι-3	3

Номер фракции	Аллели/фракция
1 и 2	9.5
3	9
4	7
5	5
6	5

7	5
8	9
9	5
10	б

Таблица 6 Праймеры (смысловые) для человеческой вариабельной области тяжелой цепи !§С

Название праймера	Нуклеотидная последовательность праймера	5Е0 ТО N0
НиУН1В/7А	5' -САЗЯТССАССТСбТе САктстес-З'	8ЕО 10 N0:250
НиУН1С	5 ' -8А56ТССА6СТ6СТК САСТСТСС-3'	8Е0 10 N0:251
НиУН2В	5'-5А66Т6СА6СТС6ТС 5АСТСТ03-3'	8Е0 10 N0:252
НиУНЗВ	5' -ЗАССТССА6СТС6ТС 6АСТСТ66-3’	8Е0 ГО N0:253
НиУНЗС	5'-елсетссАбстеетс ОАбисУсе-з'	ΞΕΩ ГО N0:254
НиУН4В	5' -СА66ТОСАССТАСАБ САСТЕ6<56-3'	ΞΕΩ Ιϋ N0:255
НиУН4С	5 ' -СА55Т6САССТ6СА6 САстсеос-3'	5Εζ> 10 N0:256
НиУН5В	5'-бАНЕТбСАССТбСТб САОТСТСС-3'	8Е0 10 N0:257
НиУНбА	5' -САСЕТАСАССТ6СА6 САСТСАбб-З'	8ΕΩ ГО N0:258

- 41 010785

Таблица 7 Праймеры (смысловые) для человеческой вариабельной области тяжелой цепи 1дС, удлиненные за счет рестрикционных §Ш/№о1-сайтов, и праймеры (антисмысловые) для человеческой 1-области тяжелой цепи 1дС, удлиненные за счет рестрикционных Хйо1/В51Е11-сайтов

Название праймера	Нуклеотидная последовательность праймера	ЗЕО 10 N0
ΗΙΪ7Η1Β/7Λ-Ξ£1Ι	5¹ -ЙТССТСССААСТЙСЙ ЙСССАЙССйбССАТСЙСС сайптйсайстййтйсан тстсс-З'	ЗЕО 10 НО:259
НиТЛПС-ЗЕП	5’-СТССТСССААСТССС ССССАСССССССАТСеСС ЗАСетССАССТббТНСАС тстее-з*	ЗЕО 10 N0:260
НиУН2В-ЗЕ11	5'-ЙТССТСБСААСТбСС есссАессазссАТбссс САСНТСАССТТОААбйАб ТСТбй-3’	ЗЕО Ю N0:261
НиУНЗВ-ЗЕИ	5-етсстсесААСтосойсс САЙССбЙССАТССССЗАйвТС САССТССТСОАСТСТСС-З’	ЗЕО 10 N0:262
НиУНЗС-ЗЕП	5 ’ -СТССТС6СААСТСС6 есссАессссссАтессс САССТбСАССТССТ&ЗАЙ ИСТбЙ-З'	ЗЕО 10 N0:263
НиУН4В-ЗЕ11	5¹“6ТССТСОСААСТССС ССССАСССбЙССАТбйСС САббТбСАССТАСАбСАС Тбббб-3’	ЗЕО 10 N0:264
НиУН4С-3£И	5’-бТССТСбСААСТОСббСС САЙССсесСАТбССССАСЗТй	ЗЕО ГО N0:265
	САОСТЙСАйСАЙТСЗай-З
Ни7Н5В-5£11	5¹ -ЙТССТСЙСААСТЙСЙ ЙСССАЙССЙЙССАТЙЙСС ЙАабТЙСАССТЙЙТбСАЙ ТСТЙЙ-3’	ЗЕО ГО N0:266
НиУНбА-ЗЕП	5¹-СТССТСОСААСТСС5 ССССАСССССССАТСССС ОАсетАСАОстосАесАе ТСАСС-3¹	ЗЕО 10 N0:267
НийН1/2-ХЬо1	5 ' -ЙАОТСАТТСТСЙАСТСЙА ЙАСЙЙТЙАССАЙЙСТЙСС-З ’	ЗЕО ГО N0:268
НиЛНЗ-ХЬо1	5' -ЙАЙТСАТТСТСЙАСТ СЙАЙАСЙЙТЙАССАТТЙТ ССС-3'	ЗЕО » N0:269
НиЛН4/5-Х11О1	5 ' -ЙАСТСАТТСТСЙАСТ СЙАйАСбйТЙАССАСвбТ ТСС-3'	ЗЕО 10 N0:270
НиЛНб-ХЬо!	5 ' -ЙАЙТСАТТСТСЙАСТСЙА ЙАССЙТЙАСС6ТЙЙТССС-3'	-г ЗЕО 10 N0:271

- 42 010785

Таблица 8 Связывание одноцепочечных фаговых антител (ксЕ\') с С-белком вируса бешенства (штамма ЕЕА) и ЕВЗ, как было измерено с помощью ЕЫЗА

Название фагового	О-белок вируса бешенства	гвз
антитела	(00492 нм)	(Οϋ492 нм)
8С04-001	0.828	0.053
8С04-004	0.550	0.054
8С04-003	0.582	0.058
8С04-010	0.915	0.043
8С04-013	0.247	0.052
8С04-021	0.278	0.052
8С04-026	0.212	0.054
ЗС04-031	0.721	0.065
ЗС04-038	0.653	0.061
8С04-040	0.740	0.053
8С04-060	0.923	0.056
8С04-073	0.657	0.054

8(554-097	0.835	0.056
8С04-098	0.798	0.060
8С04-103	0.606	0.059
8С04-104	0.566	0.063
8С04-108	0.363	0.052
8С04-120	0.571	0.052
8С04-125	0.735	0.049
ЗС04-126	0.232	0.051
8С04-140	0.865	0.057
5С04-144	0.775	0.054
8С04-146	0.484	0.057
8С04-164	0.547	0.057
контроль (8057)	0.650	0.055
контроль (02-007)	0.063	0.052

- 43 010785

Таблица 9

Данные для одноцепочечных Ρν, способных связываться с С-белком вируса бешенства

Название зсЕАг (библ.)	ЗЕО Ю N0 нук. пос-ти	! ЗЕО Ю N0 аминокислотной пос-ти	НССКЗ (ЗЕО ТО N0:)	Ун- локус	у_ь-локус
ЗС04-001 (Ж1994)	157	158	61Υ6Ε1Γ0Υ (ЗЕО Ю N0:1)	3-20 (ОР32)	У13 (31 - У2-13)
ЗС04-004 (ИТ2000)	159	160	ΠΥΕΥΡΤΪΟΕΟΥ (ЗЕО Ю N0:2)	3-23 (ϋ₽47)	Ук1 (012/02 ϋΡΚ9)
ЗС04-008 (МВ-03601)	161	162	МЗГТСТУГОУ (5Е0 10 N0:3)	2-70 (ОР28)	У13 (ЗЬ - У2-14)
ВС04-010 (МВ-03601)	163	164	ОСЬОЫбТЮРГОУ (ЗЕО 10 N0:4)	3-30 (ϋΡ49)	Ук1 (111 - ОРКЗ)
ЗС04-018 (МВ-03601)	165	166	νΒνΤΤΜΓΝΙ (ЗЕО ГО N0:5)	4-04 (ϋΡ70)	VII (1с - У1-16)
ас04-021 (МВ-03601)	167	168	сзуиэпАЯ)! (ЗЕО ГО N0:6)	3-30 (ВР49)	Ук! (18)
зс04-026 (МВ-03601)	169	170	ΤΞΝΗΝΥΙιϋΚΓΟΡ (ЗЕО 10 N0:7)	5-51 (0Р73)	УИ1 (А19/03 0РК15)
ЯС04-031 (МВ-03601)	171	172	68УЪ6ПАП)1 ^Л (ЗЕО 10 N0:8)	3-30 (БР49)	Ук! (15 - 0РК5)
ЗС04-О38 (МВ-03601)	173	174	63УЬ6ОАИ51 (ЗЕО 10 N0:9)	3-30 (ϋΡ49)	Ук! (15 - ϋΡΚ5)
зс04-040 (МВ-03601)	175	176	сзктеоют (ЗЕО ίο N0:10)	3-30 (ϋΡ49)	У13 (ЗЬ - У2-14)

ЗС04-060 (МВ-0 4601)	177	178	ЕКЕКУЗОКЗбУЗУУ ΥΥΪΜΟν (ЗЕО Ю N0:11)	4-59 (0Ρ71)	Ук! (012/02 ϋΡΚ9)
ЗС04-073 (МВ-04601)	179	180	1Χ31Β1Τ6ΤΙΰ₽Γ6Υ (ЗЕО ГО N0:12)	3-30 (ϋΡ49)	Ук! (Ы2)
зс04-097 (МВ-04601)	181	182	ТАЗЫЪЖОСМОУ (ЗЕО Ю N0:13)	3-23 (ϋΡ47)	Ук1 (18)
ЗС04-098 (МВ-04601)	183	184	УАУАбТВРСУ (ЗЕО ГО N0:14)	3-30 (0Ρ49)	Ук! (АЗО)
ЗС04-103 (МВ-04601)	185	186	УАУАЙЕЗГОЗ (ЗЕО ГО N0:15)	3-30 (ϋΡ49)	Ук! (Ь5 - ПРК5)
ЗС04-104 (МВ-04601)	187	188	ΐνννΤΑΐηΑΓΟΙ (ЗЕО ГО N0:16)	3-30 (ϋΡ49)	Ук! (112)
ЗС04-108 (МВ-0 4601)	189	190	ГМГтаООАЕЫ (5Ё0 10 N0:17)	3-30 (ϋΡ49)	Ук! (11)
ЗС04-120 (МВ-04601)	191	192	66ΚΤ6ΕΓ0Υ (ЗЕО 10 N0:18)	3-30 (ΟΡ49)	Ук! (Ь8)
ЗС04-125 (МВ-04601)	193	194	ΙΆΤΑΟΤΟΕΌΥ (ЗЕО Ю N0:19)	3-30 (ϋΡ49)	Ук1 (Ь8)
ЗС04-126 (МВ-04601)	195	196	Μ^ΓΤβΤΥΡΟΥ (ЗЕО Ю N0:20)	2-70 (ϋΡ28)	νΐ3 (ЗЪ - У2-14)
ЗС04-140 (МВ-04601)	197	198	νΤΝΡΘΡΑΕΏΙ (ЗЕО Ю N0:21)	3-30 ЩР49)	Ук1 (14/18а)
ЗС04-144 (МВ-04601)	199	200	ССКТСЕГЭУ (ЗЕО Ю N0:22)	3-30 (ϋΡ49)	Ук1 (18)
ЗС04-146 (МВ-04601)	201	202	ΟσΚΤΟΕΕΟΥ (ЗЕО 10 N0:23)	3-30 (βΡ49)	Ук!!! (12 - ϋΡΚ21)
ЗС04-164 (МВ-04601)	203	204	СЗУ1£ПАГ01 (ЗЕО Ю N0:24)	3-30 (ϋΡ49)	Ук! (Ь19 - 0РК6)
3057	205	206	ΕΝ1ΒΝ36ΤΥΥΥΓ56 ΗΤϋΡ (ЗЕО ГО N0:25)	1-69 (ϋΡΙΟ)	У12 (2е - VI-3)
зсов	312	313	ВДН133ЕРИГОЗ (ЗЕО ГО N0:276)	2-05	У13 (ЗЬ - У2-14)

- 44 010785

Таблица 10

Данные анализа на нейтрализующую активность 5сΕν против вируса бешенства

Название зсГу	50% разведение в конечной точке	50% разведение в конечной точке \УНО-стандарта (2 МЕ/мл)	Акативностъ (1и/т1)
ЗС04-001	270	405	1.3
ЗС04-004	3645	405	18
ЗС04-008	>10935	405	>54
ЗС04-010	810	405	4
5С04-018	15	405	_0/1
ЗС04-021	270	405	1.3
ЗС04-026	45	270	0.3
ЗС04-031	90	270	0.7
ЗС04-038	270	270	2
ЗС04-040	45	270	0.3
ЗС04-060	30	270	0.2
ЗС04-073	405	27Ό	3
ЗС04-097	30	270	0.2
ЗС04-098	1215	270	9
ЗСО4-1ОЗ	45	270	0.3
ЗС04-104	135	270	1
ЗС04-108	135	270	1
5С04-120	810	270	6
ЗС04-125	405	270	3
ЗС04-126	10	270	0.1
ЗС04-140	135	270	1
ЗС04-144	810	270	6
ЗС04-146	405	270	3
ЗС04-164	45	270	0.3

- 45 010785

Таблица 11А Данные анализа, проводимого для определения нейтрализующей активности ксЕу против ускользающих вирусов Е57: Е57А2, Е57А3 и Е57В1

Название зсГу	Е57Л2	В57АЗ	Е57В1
	1*	2*	3*	1*	2*	3*	1*	2*	3*
ЗС04-001	10	90	0.2	10	90	0.2	30	45	к³
ЗС04-004	810	90	18,0	1215	90	27.0	810	45	3^,0
8С04-008	10	90	0.2	15	90	0.3	270	45	12.0
8С04-010	270	90	6.0	270	90	6,0	270	45	12.0
8С04-018	5	90	ол	15	90	0.3	15	45	0*7
8С04-021	10	90	0.2	30	90	0.7	10	90	0.2
8С04-026	<5	90	0.0	<5	45	0.0	<5	90	0.0
8С04-031	10	90	0*2	30	90	0.7	10	90	0.2
8004-036	90	90	2.0	90	90	2.0	45	90	1.0
8С04-040	15	90	0,3	5	90	0.1	5	90	0.1
5С04-060	5	90	0.1	5	90	0.1	<5	90	0.0
ЗС04-073	135	90	3.0	90	30	6.0	30	30	2.0
ЗС04-097	<5	90	0.0	<5	90	0.0	<5	90	0.0
8С04-098	810	90	18.0	270	30	18.0	270	30	18.0
8С04-103	<5	90	0.0	10	90	0.2	5	90	0.1
8С04-104	90	90	2.0	30	30	2.0 ’	30	30	2.0
8С04-108	15	90	0.3	<5	90	0.0	<5	90	0.0
8С04-120	45	90	1.0	30	30	2.0	10	30	0.7
5С04-125	135	90	3.0	135	30	9.0	90	30	6.0
ЗС04-126	<5	90	0.0	<5	45	0.0	<5	90	0.0
8С04-140	30	45	1.3	90	30	6.0	45	90	1.0
8С04-144	270	45	12.0	270	30	18.0	135	90	3.0
8С04-146	90	45	4.0	90	30	6.0	90	90	2.0
НС04-164	15	45	0.7	30	30	2.0	15	90	0.3

1* - 50% разведение в конечной точке

2* - 50% разведение в конечной точке ^НО-стандарта (2 МЕ/мл)

3* - активность (МЕ/мл)

- 46 010785

Таблица 11 В

Данные анализа, проводимого для определения нейтрализующей активности 5сЕу против ускользающих вирусов Е57: Е57В2, Е57В3 и Е57С3

Название зсГу	Е57В2	Е57ВЗ	Е57СЗ
	1*	2*	3*	1*	2*	3*	1*	2*	3*
ЗС04-001	30	45	1.3	90	270	0.7	5	90	0.1
5С04-004	5	45	0.2	2430	270	18.0	270	90	6.0
ЗС04-008	5	45	0.2	45	270	0.3	10	90	0.2
ЗС04-010	45	45	2.0	405	270	3.0	270	90	6.0
3004-018	15	45	0.7	15	270	0.1	30	90	0,7
ВС04-021	10	90	0.2	30	270	0.2	10	90	0.2
ЙС04-026	<5	45	0.0	<5	45	0.0	<5	30	0.0
8С04-031	10	90	0.2	30	270	0.2	30	90	0.7
8С04-038	30	90	0.7	90	270	0.7	90	90	2.0
8С04-040	5	90	0.1	15	135	0.2	10	90	0.2
ЗС04-060	<5	90	0.0	10	135	0.1	5	90	0.1
ЗС04-073	30	90	0.7	90	270	0.7	90	90	2.0
8С04-097	<5	90	0.0	<5	135	0.0	<5	90	0.0
5С04—098	90	90	2.0	810	270	6.0	270	90	6,0
ЗСО4-1ОЗ	<5	90	0.0	10	135	0.1	10	90	0.2
ЗС04-104	45	90	1.0	45	270	0.3	90	90	2.0
ВСО4-108	10	90	0-2	<5	135	0.0	15	90	0.3
5С04-120	15	90	0.3	45	270	0.3	30	90	0.7
8С04-125	90	90	2.0	270	270	2.0	270	90	6.0
5С04-126	<5	43	0.0	<5	45	0.0	<5	30	0.0
5С04-140	30	90	0.7	90	90	2.0	270	90	6.0
ЗС04-144	90	90	2.0	270	90	6.0	405	90	9.0
8004-146	30	90	0.7	90	90	2.0	90	90	2.0
ЗС04-164	15	90	0.3	-¹⁵-1 ⁹⁰	0.3	30	90	0.7

1* - 50% разведение в конечной точке

2* - 50% разведение в конечной точке VН0-стандарта (2 МЕ/мл)

3* - активность (МЕ/мл)

- 47 010785

Таблица 12

Олигонуклеотиды, используемые для ПЦР-амплификации Ун-генов

Название и нуклеотидная последовательность	Ун-ген	5Е0 Ю ΝΟ:
5Н-В: ассЕдЪсЪЪдааЕксЬссаЬддссдаддкдсадсЪ ддГддадЬсЕд	8С04-001	280
5Н-С: ассГд-ЬсГЪдааЪГскссаЪддсссадд-ЬдсадсЬ ддГддадЬсГдд	8С04-021 ЗС04-031 ЗС04-125 8С04-164	281
5Н-С-1опд: ассЪдФсЬ'ЕдааГГсЪссаЬддсссаддЪдсадсЪ ддЪддадЪсЪдддд	ЗС04-010 8С04-038 ЗС04-040 ЗС04-073 ЗС04-098 ЗС04-ЮЗ 8С04-104 ЗС04-108 ЗС04-120 8С04-140 8С04-144 ЗС04-146	282
5Н-Г: асС'ЬдФсЪФдааЫкзЪссаБддсссадд-Едсадс'Ь дсаддадГссддссс	ЗС04-018 8С04-060	283
5Н-Н: ассЬдГсЬСдааГСсЬссаГддссдаддЪдсадсГ ддСдсадЪсЪдд	ЗС04-026	284
5Η-Ι: ассФдЬс'Е'Ьдаа'ЫгсЬссаЬддссдаддГздсадс'Ь дсЕддад^сГдд	ЗС04-004 8С04-097	285

- 48 010785

5Н-М: ассЬдЬсЬЪдааЪЕсРссаРддсасаддЕдассРЪ дааддадрсрдд	ЗС04-008 ЗС04-126	286
ауЗН-А: дсссРРддЬдсЪадсдсЪддадасддРсассаддд ЪдсссРддсссс	5С04-001 8С04-004 ЗС04-008 5С04-010 ЗС04-026 ЗС04-040 ЗС04-073 8С04-098 8С04-120 ЗС04-125 ЗС04-126 ЗС04-144 ЗС04-146	287
вуЗН-С: дсссЬРддрдсЬадсдсРддадасддГсасддрдд ЪдсссБддсссс	ЗС04-097	288
зуЗН-С-1опд: дсссЪЪддГдсЪадсдсГддадасддРсасддрдд ЬдсасЪРдссссадасдГс	ЗС04-060	289
вуЗН-ϋ: дсссЪРддрдсЪадсдсСддасасддЕсассаЪдд РдсссЪддсссс	8С04-018 ЗС04-021 ЗС04-031 8С04-038 8С04-104 ЗС04-108 ЗС04-140 8С04-164	290
вуЗН-Е: дсссРРддГдсРадсдсРддасасддРсассаддд Ъдссссддсссс	8С04-103	291

- 49 010785

Таблица 13

Олигонуклеотиды, используемые для ПЦР-амплификации У|-генов

Название и нуклеотидная последовательность	Уъ-ген	ЗЕО И> N0:
ЗЬ-В: ГХЪГссГГадсддссдсдасЪаасо'еаддасддЕс адсЕЕддЬс	ЗС04-001	292
5К-В: ассЪдЪсЬсдадЬБЕ'ЬссакддсЪдасаЕссадаЕ дасссадЪс	ЗС04-031 ЗС04-060 ЗС04-073 5С04-098 ЗС04-103 ЗС04-104 ЗС04-108 ЗС04-164	293
5К-С: ассЪд1;е±сдад1:<:Ы:сса1:ддсЪдасаЕссада1: дасосадЬс1ссаЪсс£ссс	ЗС04-004	294
5К-С: ассХдЬсЬсдадЬЬЬГссаЬддсХдасаЬсдЬдаЬ дасссадЬсЪсс	ЗС04-026	295
5К-К: ассЪдЪсГсдадЪЪбСссаЬддсЪдссабссадаХ дасссад£с£сс	5С04-010	296
5К-М: ассЪдЕсЪсдадЪбЬЪссаЪддсЕдасаЪссадсЕ дасссадбс	ЭС04-021 ЗС04-097 ЗС04-120 ЗС04-125 ЗС04-144	297
5Κ-Ν: ассЕдбсЬсдадЪЬ'Ебссакддс'СдасабссадаЪ дасЪсадЕс	ЗС04-038	298

- 50 010785

5К-О: ассЪдЬсЪсдадЪЪЬЪссаЬддсЪдссаЬссадсЪ дасссадЬс	8С04-140	299
5К-0: ассЖдЪс-ксдадЬеЫзссаЖддсЪдадаЬсдЬдаЖ дасЪсадкс	8С04-146	300
51-Е: асс'ЬдксксдадЫзк'Ь.ссаЬддс^ЬсскасдЪдск дасксадссд	8С04-008	301
5Ι.-Ε: ассЪдЪс±сдадЬЬЪСссаЦддсЪсад±ссд1:дс± дасксадсс	8С04-018	302
511-6: ассЬдЬсЪсдадС-ееЕссаСддс^ЬссЕасдЬдс'Ь дасЪсадсс	8С04-040 5С04-126	303
зуЗК-Г: дсЪдддддсддссасддЖссдсеЖдаесЬссасск ЬддЬссс	8С04-004 8С04-010 8С04-021 8С04-031 8С04-098 8С04-104 ЗС04-125 ЗС04-140 8С04-144 8С04-164	304
ауЗК-1: дс1:дддддсддссасддСссдсЪЬдаСс1:ссадсс дЬдЬссс	8С04-038 8С04-097 8С04-103 8С04-108 8С04-146	305
зуЗК-Л	8С04-026	306

дсЬдддддсддссасддЬссдсЬЪдаЬсЪссадсЪ ЬддЪссс	8С04-060 ЗС04-073
ауЗК-К: дсПдддддсддсаасдд-ЬссдсккдаЪдГссасск ЪддЬссс	8С04-120	307
вуЗЬ-А: ссадсасддЬаадсеесадсасддесассСЬддЪд ссадЬЪсс	8С04-018 8С04-126	308
ауЗЬ-С: ссадсасддЬаадсЫ.садсасдсгЬсадсЛЬддед ссЬссдсс	8С04-040	309
ауЗЬ-ϋ: ссадсасддЪаадсЛЬсаасасддЪсадсСдддЪс сс	8С04-008	310
ау51>-А: асседЖсСсдад^ЪЬ'ЬссаСддсЖСссЬсодадсС дасссаддасссЬдсЪд	8С04-001	311

- 51 010785

Таблица 14

Связывание человеческих моноклональных антител СК57, СК-ДБ и СК04-010 (10 мкг/мл) с линейными пептидами внеклеточного домена С-гликопротеина штамма ЕКА вируса бешенства

Аминокислотная последовательность линейного пептида	СК57	СКОВ	СК04-010
КЕР1УТ1ЫЖЬ0₽И8	71	97	1
РР1УТ1ЫЖЬСРЯ8Р	42	105	39
РИТ1ЫЖИЗРИ5Р1	36	89	87
1УТ1ЫЖЬЙРИ8Р1О	44	97	104
УПЫЖЪбРЯЗРРШ	48	114	91
ПЬОКЬСРИЗРЮХН	76	96	88
1ЫЖБ6РИЗР1ШНН	54	104	69
ЫЖЬ(зРИ5₽1П1НН11	55	99	107
ЖЪСРИ2Р1В1ННЬЗ	62	103	93
КЬ6РИЗР1П1ННЬЗС	72	105	45
ьсризрюишьзср	69	112	19
ЗРЙ8Р1О1ННЪ8СРЫ	68	114	33
₽ЧЗР1В1ННЪ8СРШ	62	104	47
98ΡΙϋΙΗΗΤ.80ΡΗΝΒ	80	106	11
ЗР1П1ННЬ8СР№1ЬУ	74	85	1
РЮХННЬЗСИШЬУУ	46	93	90
Ι0ΙΗΗ150ΡΝΝΤννΕ	69	102	55
ΒΙΗΗΕ3ΟΡΝΝΣννΕϋ	38	96	78
ΙΗΗΙ,δΟΡΝΝΙ,ννΕΕΕ	37	85	113
ННЬЗСРШЮТЕОЕС	56	76	117

ϊΕδΟΡΉΝίννΕϋΕαΟ	65	119	111
оесишигУЕВЕест	69	117	127
5€ΡΝΝΐννΕΓΕβϋΤΝ	83	114	91
зржыллажастаъ	77	97	49
ΡΝΝΕννΕΌΕ6εΤΝΙι3	78	107	97
ЯКЫЛ7ЕПЕ<5СИП.80	72	99	97
Я1ЛГОЕПЕ6СПИ.8СГ	75	119	55
ЮТЕОЕ0СТНЪ8(ЗЕ8	76	103	52
17УЕОЕССТЫ115СРЗУ	73	107	91
^еоесстиъзсрзум	74	103	31
ЗОЕбСТЫЪЗеГЗЗМЕ	54	90	7
ОЕССИОЗСРЗУМБЬ	1	23	1
ВССТЫЬЗеЕЗУМЕЬК	51	114	129
6ΟΤΝ13ΟΕ3ΎΜΕ1Κν	55	114	118
СТИЕЗСЕЗУМЕЮТб	47	110	137
ΓΝΕ32Ι'5ΥΜΕΕΚν2Υ	43	106	161
МЬЗСЕЗУМЕЪКУСУ!	61	115	170
БЗСЕЗУМЕЬКУСУ1Ь	71	132	169
86Г8УМЕЬК7ОТ11А	79	132	161
5Γ5ΥΜΕΙ^νδΥΙΙΛΙ	65	111	141
ρδϊΜΕίκνεϊΐΐΑΐκ	89	112	192
5ΥΜΕΒΚν5ΥΙΙΑΙΚΜ	65	123	152
ΪΜΕΕΚναΥΙΙΛΙΚΜΝ	78	114	150
4Ε£ΚνεΥΙΙΛΙΚΜΝ(3	76	141	107
Еькусуилткмыср	87	132	76
[>ΚνεΥΙΙΛΙΚΜΝ5ΓΤ	78	112	118
Κν3ΥΙΙΛΙΚΜΗ0ΕΤΟ	78	118	68
УСУ1ЫТКМ№ГТСТ	77	93	1
ΞΥΙΙΛΙΚΜΝΟίΤαΤΘ	75	90	1
ϊΐΐΛίκΜΜΟΓΓΟτεν	47	107	107
ΙΙΑΙΚΜΜ6ΕΤσΤ6νν	79	103	104
ьыкмнсЕТСтетУт	68	130	159
ЫКМЫСРТСТетУТЕ	47	103	152
ΙΚΜΝβΕΤΟΤσννΤΕΑ	68	108	138
КМЫбРТСТбУУГЕАЕ	76	104	133
4Ν0ΡΤ0Τ6ννΤΕΑΒΝ	69	99	148
ίεηοτενντΕΚΕΝΥ	69	101	138
3ΕΤΟΤβννΤΕΑΕΝΥΤ	71	86	129
ΕίατενντΕΛΕΝΤΤΗ	83	125	154
ΓΟΤΟννΤΕΑΕΝΥΤΝΡ	92	112	129
ΙΐεννΤΕΑΕΝΪΤΝΡν	76	123	150
ΓεννΤΕΑΕΝΥΤΝΕνε	85	110	154
3ννΤΕΛΕΗΪΤΗΓνεϊ	86	111	110
ΤνΤΕΛΕΝΥΤΜΓναϊν	87	106	114
νΤΕΑΕΝΪΤΝΕνβΥνΤ	79	90	73
ГЕАЕНУТЫЕУбЮТТ	68	84	8
ΕΑΕΝΪΤΝΕνΟΥνΤΤΤ	69	117	142
ϋΕΜΥΤΝΓνεΥνΤΤΤΡ	66	106	110
ΕΜΥΤΝΕνβΥνΤΤΤΕΚ	44	112	183
ΝΥΤΝΕνθΥνΤΤΤΕΚΚ	49	114	174
ΪΤΝΓνθϊνΤΤΤΕΚΚΚ	51	104	138
ΓΝΓνεΥνΤΤΤΡΚΚΚΗ	71	125	165
ΗΕνΟΥνΤΤΤΓΚΒΚΗΓ	65	107	154
ΕνΟΥνΤΤΤΓΚΚΚΗΕΗ	70	111	152
теуутттгкнкнркр	75	113	155

- 52 010785

ВУТТТТЕКККНГКРТ	70	123	160
тттложнгкртр	85	106	160
ТТТТЕКККНГКРТРО	79	105	119
γττεκβκηεβρτρεα	80	108	137
ттаКНЕКРТРОАС	74	99	110
ГПОЖНГКРТРПАСК	96	111	108
ЕКНКНЕКРТРОАСВА	64	92	62
КККШГЙРТРПАСВАА	65	93	1
ΚΚΗΓΚΡΤΡϋΑΟΒΑΑΥ	64	107	99
ΚΗΙΉΡΤΡΟΑΟΗΑΑΥΝ	73	112	124
ΟΕΈΡΤΡϋΑΟΚΑΑΥΝΪϊ	46	113	118
ЕВРТРПАСКААУИИК	43	112	148
ИРТРПАСКААУМИКМ	77	101	129
РТРЕАСНААУНИКМА	99	125	143
ГРЕАСКААУНИКМАВ	92	132	160
РСАСКААУЫИКМАВП	61	124	147
ОАСКААУНИКМАСОР	84	113	136
ΛΟΗΑΑΥΝΚΚΜΑΕϋΡΒ	82	116	138
СКААУИИКМАСЕРНУ	87	118	137
ΚΑΑΥΝΒΚΜΑΘΟΡΒΪΕ	90	130	120
ίΙΑΥΝΗΚΜΑΒΟΡΗΥΕΕ	68	106	120
ϋΥΝΗΚΜΑ6ΏΡΚΥΕΕ3	96	94	77
ШИКМАВОРВУЕЕЗЬ	83	118	116
ЯИКМА60РВУЕЕ31Л	58	101	69
ΒΚΜΑΒϋΡΒΥΕΕΒΙΗΝ	69	101	1
КМАВОРВУЕЕЗЬНЫР	62	102	84
ΗΑΒϋΡΒΥΕΕδΕΗΝΡΥ	64	116	112
кеоркуЕЕзишрур	40	101	125
3ϋΡΚΥΕΕ3ΕΗΝΡΥΡΟ	36	98	123
ϋΡΚΥΕΕΕΕΗΝΡΥΡΟΥ	57	110	118
РВУЕЕЗЬНМРУРОУВ	73	115	129
КУЕЕЗЬНЫРУРОУКИ	69	112	125
УЕЕЗЬНЫРУРОУВНЬ	58	106	120
ЕЕЗЫШРУРОУВИХВ	76	123	141
ЕЗЫШРУРОУКИЬВТ	92	132	125
зьнируроуктжгу	78	111	137
ЬНЫРУРПУКНЪКТУК	79	106	142
ΗΝΡΥΡϋΥΒΗΕΒΤνΚΤ	86	108	146
ΜΡΥΡϋΥΚΗΙΛΤνΚΤΤ	85	102	151
РУРЮУВИЪВТТКТТК	65	93	103
ГРПУВИЪВТУКТТКЕ	72	97	97
РОУКИЪКТУКТТКЕЗ	76	85	27
ϋΥΕΗΙΛΤνΚΤΤΚΕβΙ,	54	111	105
ΪΚΗΙΚΤνΚΤΤΚΕΒΙ,ν	46	117	125
КИГНТУКТТКЕЗЪУ!	40	110	120
ΜΙΛΤνκΤΤΚΕδίνΐΙ	41	104	125
ЬКТУКТТКЕЗЬУНЗ	65	104	161
ΕΤνΚΓΤΚΕΒΕνίΙδΡ	82	120	150
ГУКТТКЕЗЪУИЗРЗ	76	116	150
иктткезьунзрзу	71	120	154
ΚΤΤΚΕ3Ι>νΐΙ3Ρ3νΑ	101	112	147
ΓΤΚΕδίΛΖΐΐδΡδνΜ	78	121	141
ТКЕЗЬУНЗРЗУАЛЕ	86	112	132
КЕЗЬУИЗРЗУАОЬО	86	117	111
ЕЗЬУИЗРЗУАЕЬОР	88	125	143

- 53 010785

8ЬУ11£₽5УАОЬОРУ	63	105	125
еуызрзуаоьбруо	85	107	93
7Ί 18Р5УАОЬОРУВК	59	98	50
ПЗРЗУЮЬОРУОВЗ	83	125	14
ГЗРЗУАОЬВРУОКЗЬ	50	119	91
ЗРЗУАОЬОРЭТЖЗЬН	59	114	118
РЗУАОИЭРУПКЗЬНЗ	44	114	118
ЗУАОЕПРУОКЗЬНЗН	49	106	129
(ГАИЫОРУОКЗЕНЗВУ	71	113	141
МЭЪОРУЦКЗЬНЗКУР	70	121	141
ОЬОРУБКЗЬНЗКУТР	111	152	127
ЬОРУОКЗЬНЗКУЕ’РЗ	99	142	106
ОРУГЖЗЪНЗКУГРЗБ	90	120	134
РУОВЗЬНЗВУР’РЗСК	86	120	130
ПЖЗЬНЗКУГРЗСКС	364	818	127
мгзънзвуррзсксз	98	142	141
КЗЬНЗНУРРЗБКСЗб	87	141	156
зьнзкуррзбксзет	69	111	141
ьнзкугрзжсзетл	78	114	129
НЗКУРРЗБКСЗБУАУ	97	118	111
зкуррзбксзетАУз	100	125	24
ЕЮТРЗБКСЗБУАУЗЗ	69	110	106
УГРЗСКСЗСТАУЗЗТ	74	114	142
ррзексзстауззту	64	134	146
РЗбКСЗБУАУЗЗТУС	56	112	132
ЗСКСЗБУАУЗЗТУСЗ	64	121	120
зксзсуауззтусзт	92	143	145
КСЗбУАУЗ ЗТУСЗТЫ	88	130	130
СЗбУАУЗЗТУСЗТИН	110	165	143
5ενΑν38ΤΪΟ3ΤΝΗϋ	79	110	115
зтауззтусзтыноу	79	114	108
«АУЗЗТУСЗТИНЮУТ	85	114	118
ЬУЗЗТУСЗТИНОУИ	71	105	102
735ТУСЗТМНОУТ1Н	78	107	121
ЗЗТУСЗТКНОУТ1НМ	76	107	121
ЗТУСЗТИНОУТ1ЙМР	86	99	119
ГУСЗТЫН0УТ1НМРЕ	96	107	74
ϊοβτνηουτιμμρεν	47	92	29
Ζ3ΤΝΗΟΥΤΙΗΜΡΕΜΡ	52	106	86
ЗТЫНОУПИМРЕЫРН	60	112	107
ТМНОУТХИМРЕЫРКЬ	69	129	119
ННОУТХИМРЕИРКЬе	71	119	130
ΒΟΥΤΙΗΜΡΕΝΡΚΕδΜ	82	125	123
ОУИИМРЕИРКЬБМЗ	93	127	123
УИНМРЕЫРВЬбМЗС	97	132	143
ПИМРЕЙРКЬСМЗСО	69 \| 106	134

- 54 010785

ΙΗΜΡΕΝΡΚΪ.6Μ860Ι	98	110	101
ЯМРЕМРКЪСМЗС01Р	88	113	120
ИРЕИРНЬСМЗСОГГТ	105	121	143
рЕыркьсмзсри’тн	83	111	104
Е№Р1ШЗМ5СП1ГТ№	71	118	111
ΝΡΚΕ6Μ3ΟϋΙΓΤΝ3Κ	90	113	138
РВШМЗСЙТГТЫЗКЗ	72	112	105
Е1ШМЗС01ГТНЗЕ0К	88	106	113
ИЭ13СО1ГТЫЗК6КК	76	110	114
ЗМЗСОИТЫЗКбККА	54	120	101
43СО1ГТ№КСККА5	46	110	106
ЗС01ЕТ№К6ККА5К	44	111	98
СОХГТИЗКСКНАЗКб	42	104	117
3ΙΓΤΝ5Ε6ΚΚΑ5Κ65	70	107	111
1ГТЫЗЕСКЕА8КОЗЕ	77	125	87
ΕΤΝ8ΚΘΚΒΑ3Κ63ΕΤ	83	111	119
ГйЗйСКВАЗКбЗЕТС	68	108	110
ЯЗНбККАЗКбЗЕТСб	92	100	119
5К0ККАЗК63ЕТС6Е	64	93	90
аСККАЗКСЗЕТССВТ	75	104	115
жвАЗксзЕтсет)	92	124	118
КНАЗКСЗЕТССПГОЕ	92	106	129
ЙАЗКСЗЕТССГГОЕЕ	86	110	134
ЬЗКСЗЕТСбЕТОЕЕб	97	108	103
ЗКбЗЕТСбЕТОЕНеЬ	92	102	76
кбЗЕтсет>Екеи	90	97	4'4
ЗЗЕТСбГТОЕКСЬУК	57	115	92
ЗЕТССГУОЕКСЬУКЗ	33	116	86
ВТСбЕТОЕЕСЬУКЗЪ	64	120	138
гссетоеесьукзък	47	120	125
сбпгоЕкеьукзьке	72	115	120
еГТОЕРСЕУКЗЬКСА	84	120	129
гамжеьукзьксАС	86	121	124
ТОЕКСЬУКЗЬКбАСК	50	108	110
ОЕЕбЬУКЗЪКСАСКЬ	90	119	54
ВКСЬУКЗЬКСАСКЬК	90	118	106
кСЬУКЗЬКСАСКЬКЬ	90	121	121
ЗЬУКЗЬКбАСКБКЬС	94	129	92
ЬУКЗЬКбАСКЬКЬСб	93	136	141
укзькеАСкькьсет	80	112	110
КЗЬКСАСКЬКЪССУЬ	129	113	110
зъкоАскькьсотьа	юЬ	111	124
ЬКСАСКЬКЬСЭТЬС1\|	вв	90	23
ксАСкькьсбУьбьн	Βιι	111	100
ОАСКЬКЬСбТЪбЪЕЬ	ВЦ;	134	129
ЬСКЕКЬСОТЬбЬКШ	ЙК	117	142

- 55 010785

жькьсстъськьмо	В·	111	147
къкьсетьськьмоо	Н·	120	114
ЬКЬССУЬСЬЙЬМПСТ	и№	145	148
КЬСбУЪбЪВЪМОСТИ	М	132	86
ьсетъбъкьиобтиу	83	138	129
зетьбьвъмосткУА	99	117	104
ЗУЬСЬМНЕСТНУАМ	89	148	117
УЬСЬКЕМОСТИУАМО	90	141	127
ьбькьмоетиУАМот	102	115	97
еькшобтиулмотз	104	138	120
ИОМОеТИУАМОТЗЫ	103	114	118
ΚΙΜϋ6ΤΗνΑΜ0Τ3ΝΕ	100	113	130
ЬМОбТНУАМОТЗЫЕТ	96	106	106
щхзтитамотзыЕтк	97	97	110
ОетНУАМСТЗЫЕТКН	69	114	92
бТИУАМОТЗИЕТКНС	58	113	82
ГНУАМОТЗЫЕТКНСР	78	118	107
ЙУАМОТЗЫЕТКИСРР	50	114	116
ТАМОТЗЫЕТКЙСРРО	86	104	151
АМС2Т5ЫЕТКИСРР1Х2	104	114	128
ЯйТЗЫЕТКИСРРООЬ	104	132	125
2Τ3ΝΕΤΚΗ0ΡΡΐΧ}Βν	92	120	155
ГЗМЕТКНСРРООЬУй	97	111	90
ЗНЕТКИСРРООЬУЫЬ	99	129	110
ЯЕТКИСРРЕОЬУЫЬЯ	90	128	107
ΞΤΚΗΟΡΡϋΟίνΝΕΗϋ	105	120	118
гкисррадьташор	85	125	125
кисррпоьтаъногк	89	113	121 .
ЯСРРООЬУМЬНОГКЗ .	101	119	99
СРРООБУНЬНОЕ-КЗО	93	137	127
рросшпшаогнзоЕ	107	120	56
ΡϋΟίνΝΠΗϋΓκδυΕί	35	106	63
ΟΟΕνΝΕΗΌΕΗΕΏΕΙΕ	54	117	97
^νΝΤΗΟΕΚδϋΕΙΕΗ	60	113	106
ЬУЫЬНОГКЗОЕ1ЕНЪ '	- 47	104	100
гаЬНПГК8ОЕ1ЕНЬУ	83	129	98
МЬНБЕКЗПЕРЕНЮТ	83	113	110
ΕΗϋΓΚ5ηΕΙΕΗΙ.ννΕ	93	115	121
ЙОГК8ОЕ1ЕНЮТЕЕ	69	107	150
0ГК.30Е1ЕНЬУУЕЕЬ	99	103	110
ΕΚ3ϋΕΙΕΗΕννΕΕΕν	86	114	116
ΕΙδϋΕΙΕΗΣννΕΕΕνΚ	100	138	104
5ОЕ1ЕНЬУУЕЕЬУКК	101	117	118
ОЕ1ЕНЬТЛ7ЕЕЬтаКК	94	123	143
ЕТЕНЬУУЕЕЬтаКВЕ	82	113	121
ТЕНЪУУЕЕЬУКККЕЕ	90	129	118

- 56 010785

ЕНЬУТЕЕЬУВККЕЕС	82	114	106
аЬУУЕЕЕУНКНЕЕСЪ	82	123	46
ЬУУЕЕЬУВККЕЕСЬО	64	100	79
УУЕЕЬУЕЖНЕЕСЬПА	62	108	97
теЕЬтаККЕЕСЪОАЪ	58	111	101
ЕЕЬУКККЕЕСЬОАЬЕ	69	112	123
ЕЬУКККЕЕСЬПАЬЕЗ	82	113	117
ЕУНКВЕЕСЬОАЬЕЗ!	86	130	124
УККЙЕЕСЫ)АЬЕ81М	58	181	151
ККНЕЕСиЭАЕЕЗ ΙΜΤ	73	110	137
ККЕЕСЬЮАЬЕЗХМТТ	102	113	97
КЕЕСБПА1.Е31МТТК	94	110	106
ЕЕСЬОАЪЕЗХМТТКЗ	82	120	133
ЕСЬОАЬЕЗХМТТКЗУ	91	112	125
СЬОАЬЕ81МТТК8У8	101	146	155
ЮАЪЕ81МТТКЗУЗГ	97	116	152
0АЬЕ81МТТКЗУ8ЕК	104	120	188
АЬЕ81МТТК8У5ГНК	97	132	137
ЕЕ31МТТКЗУ8РКВЪ	48	114	130
Е31МТТК8У8ЕКЯЬЗ	62	111	114
31МТТКЗУ8ИЖЬЗН	54	130	97
ГМТТКЗУЗГККЬЗНЬ	43	101	111
ИТТКЗУЗГКВЪЗНЬК	59	116	125
ТТКЗУЗЕККЬЗНЬКК	66	118	111
ТКЗУЗЕНВЬЗНЫЖЬ	83	125	123
КБУЗЭТЖЬЗНЬВКЬУ	108	124	129
ЗУЗГККЪЗНЬККЪУР	64	123	117
УЗГВИЪЗНЬВКЪУРС	90	111	105
ЗГНКЬЗНЬРЖЬиРСЕ	92	110	96
ЕКВЪЗНЬВКЬУРЕГЕ	90	108	111
ЙКЬЗНЬККЪУРбРСК	92	143	118
КЬЗНЬВКЬУРСЕбКА	93	123	148
ЬЗНЬКВЕУРСГСКАХ	96	139	150
ЗНЬККЪУРбГЕКАХТ	113	132	132
НЕРКЕνΡΕΕΕΚΑΥΤΙ	99	111	102
ьккьурегсжАУнг	83	118	82
ККЕУРЕГ5КАУТ1ЕЫ	47	115	86
кьурбгекАУтггык	47	114	123
ЕУРЕГЕКАУПГЖТ	54	112	139
νΡΕΓΕΚΑΥΤΙΓΝΚΤΕ	58	114	138
ΡΕΓΕΚΆΥΤΙΓΝΚΤΕΜ	78	113	157
3ΡΘΚΑΥΤΙΡΉΚΤΕΜΕ	78	123	цщ
ΕΕΚΑΪΤΙΪΉΚΤΕΜΕΑ	90	151	ВЯЙ
3ΚΆΪΤΙΓΝΚΤΕΜΕΑΟ	76	127	йй
ΚΑΥΤΙΕΝΚΤΕΜΕΑΠΑ	101	123	аий
ΑΥΤΙГЫКТЪМЕАОАН	86	121	Ия

- 57 010785

ΪΤΙΓΝΚΤΣΜΕΑΕΑΗΥ	104	147	к
ΤΙΓΝΚΤΣΜΕΑΒΑΗΥΚ	107	123	ч№
ΙΕΝΚΤΙΜΕΑ0ΑΗΥΚ3	100	118	цм
ΓΝΚΤΣΜΕΑ0ΆΗΥΚ5ν	111	141	НН
НКТЬМЕАОАНУКЗта	104	116	141
ΚΤΣΜΕΑϋΑΗΥΚ3νΐίΤ	91	98	123
ТЬМЕАЙАНУКЗУНТН	100	114	90
ЬМЕАЛАНУКБУНТЙЫ	73	107	97
ΜΕΑΟΑΗΥΚενΚΤΜΝΕ	€2	129	83
ΕΆΟΑΗΥΚενΚΤΗΝΕΙ	58	97	106
ΑΌΑΗΥΚενκΤΒΝΕΙΣ	56	100	100
ϋΑΗΥΚενΚΤΗΝΕΙΙΡ	59	121	112
ΑΗϊκενκτΗΝΕίΒΡδ	112	160	125
ΗΥκενκτκΝΕίίρεκ	80	130	123
γκενκτΗΝΕίι,ρεκβ	66	137	116
кзтатинЕ1ЬР8кес	115	125	114
ЗУКТЙЫЕХЬРЗКССЬ	106	138	118
тетИМЕ1ЬР8кеС1>Й	90	124	133
йтиыЕтьрзкеську	120	127	120
ТИНЕ1ЬРЗКССЬКУ6	97	146	127
ИЙЕ1ЬР8К6СЫГгеб	102	136	117
НЕ1ЬРЗКССЫ№(ЗК	104	130	163
Е1ЬРЗКССьетббЕС	104	112	128
1ЬРЗК6СЬКУОСКСН	79	113	107
ьрзкбсыетсжснр	77	119	100
РЗКбСЬВУббКСНРН	69	138	91
зкбсъкусекснрну	72	121	103
кесый/сжснрнта	68	130	115
есьнусснсирнтас	85	125	123
сы<теексн₽нтабу·	102	132	134
БНУОбКСНРНУЫСЗУГ	104	143	133
κνεΰκοΗΡΗνΝονϊτ	86	143	99
7&3ΚΟΗΡΗνΝ6νΡΓΝ	120	136	120
ЗбНСНРНУКСУРТЫб	86	119	119
5ΕΟΗΡ3νΝ6νΓΓΝΟΙ	117	113	117
ΕΟΗΡΗνΝΟνΕΕΝβΙΙ	98	141	143
ΟΗΡΗνΝΟνΤΤΝείΙΣ	97	150	151
НРНУМСТЕГЫбИЬС	104	138	164
ΡΗνΝ6νΓΕΉ6ΙΙΣ6Ρ	93	173	146
ΕΓΖΝ6νΡΓΝ6ΙΙΣ6₽0	97	123	114
табурткбиьброб	68	116	85
Μ6νρΤΝ6ΙΙΣ6Ρ06Ν	66	117	97
ΞνΕΤΝ6ΙΙΕ6Ρϋ6Νν	58	116	100
νΡΓΝβΙΙΣΘΡϋΟΝνΣ	55	132	108
ΡΡΝ6ΙΙΣ6₽Ο6ΝνΣΙ	92	143	105
гыбиьбробыуыр	61	139	130

- 58 010785

ЯСНЬСРВСЫУЫРЕ	102	146	141
3ΐ 1ье₽обыты рем	107	132	123
I ΙΒΟΡϋεΝνΜΡΕΜΟ	85	118	93
ГЪЗРОСЫТЫРЕМОЗ	125	134	119
Е6Р00ЫУЫРЕМ033	100	134	150
ЗРОСЫУЫРЕМОЗЗЬ	86	154	157
Р1Э(ЗЫУЫРЕМ038ЬЬ	87	129	139
оеыуыРЕмоззъьо ·	123	134	169
еыуыремоззььоо	96	120	168
МУЫРЕМОЗЗЕЕООН	72	120	150
УЫРЕМОЗЗЬЬООНМ	92	104	142
ЫРЕМОЗЗЫ-ОЙНМЕ	89	111	85
1РЕМ088ЫЮ0НМЕВ	89	128	129
РЕМО83ЫХХ2НМЕЬЬ	62	133	93
ЕМОЗЗЬЬООНМЕЬЬЕ	58	129	142
ИОЗЗЫ.ООНМЕЫ.Е5	65	113	117
083ЪЬ00НМЕЬЬЕ85	82	114	132
ЗЗЬЬМНМЕЬЬЕЗЗУ	90	128	132
ЗЫ<0<2НМЕЪЬЕ53У1	124	163	133
ЕЬ00НМЕЪЬЕ38У1Р	78	111	121
ЬООНМЕЬЬЕ88У1₽Ъ	106	134	128
ООНМЕЬЬЕЗЗУ1РЬУ	103	134	133
ЗНМЕЬЬЕЗЗУ1РХУН	98	146	139
НйЕЬЁЕЗЗУХРЕУНР	110	129	134
МЕЬЬЕ35У1РЬУНРЬ	90	125	152
⁵ ЕЫ.Е23У1 РЬУНРЬА	90	133	155
ЬЬЕЗЗУ1РЬУНР1ЛО	72	117	118
ЬЕ58У1РЬУНРЬАО₽	90	128	128
ΕΒΒνίΡΙΛΓΗΡΙΑϋΡΒ	104	138	143
ЗЗУ1РЪУНРЬАОРЗТ	73	104	93
ЗУ1РЬУНРЕАОРЗГУ	72	137	107
71РЬУНРЬА0РЗТУЕ	69	141	123
ХРЬУНРЕАОРЗТУГК	96	156	188
Р1.УНР1Л0Р8 ТУРКЕ	93	112	138
ЬУНРЬАОРЗТУГКЕЮ	164	174	188
(ТНРЬАОРЗТУГКОСТ	98	138	125
НР1А0РЗТУРКГ>60Е	74	141	117
ΡΙΛϋΡ3ΤνΡΚΟ30ΕΑ	99	125	90
ΙΑϋΡβτνΡΚϋβΕΕΑΕ	68	116	113
АОР5ТУЕКОЗОЕАЕО	147	152	110
ОРЗТУРКБеОЕАЕОР	98	147	137
РЗТУЕКОеОЕАЕСГУ	104	143	141
ЗТУПФБОЕЬЕОГУЕ	104	120	125
ΓνΡΚϋΟΟΕΑΕϋΡνΕν	107	124	96
иРКОСОЕАЕОГУЕУН	100	106	93
Е’КОСОЕАЕОЕ’УЕУНЬ	65	76	119

ЕФбОЕАЕОЕУЕУНЬР	72	93	76
МЗОЕАЕОЕУЕУНЕРП	85	123	91
ЗОЕАЕОКУЕУНЕРВУ	46	124	113
ОЕАЕВГУЕУНЬРОУН	68	136	123
ЕАЕОЕУЕУНЬРОУНЫ	76	117	114
ЬЕСГУЕУНЬРГ!УН№	123	138	123
ЕОГУЕУНЪРОУНКОУ	90	141	123
ОГУЕУНЬРОУНЫОУЙ	96	141	118
ЕУЕУНЕРОУННСУЗС	92	143	102
УЕУНЪРПУНИОУЗбУ	106	141	123
ЕУНЪРПУН№УЗБУО	91	150	139
таьрвунноуеоуоь	но	114	137
НЕРОУНЫОУЗбУПЬе	104	150	129
ЬРОУНЫОУЗСУОЬСЬ	104	154	154
РЦУЕШОУЙОУЕЬСЪР	106	129	115
оуныоузетоьеьрн	117	133	113
ТННОУЗСУОЬбЬРНЯ	100	119	38
ΗΝ0νδ6νϋΕεΐ.ΡΝ4(3	76	106	38
моузеувьбьрыибк	78	138	98
Ауегаде	91*9	119.5	130.9
зот	157.9	37Тб	169.8

- 59 010785

Таблица 15

Нейтрализующая активность !§С против С-белка вируса бешенства

Название 1дС	Ιϋ/шд
СН04-001	89
СК04-004	5
СН04-008	1176
СК04-010	3000
СК04-018	1604
СК04-021	1500
СК04-026	<2
СК04-031	272
СК04-038	2330
СК04-040	3041
СЙ04-060	89
СН04-073	6116
СК04-097	<1
СЙ04-098	7317
СЙ04-103	3303
СЙО4-1О4	4871
СЙ04-108	4871
СК04-120	4938
СК04-125	4718

СК04-126	2655
СЙ04-140	478
СК04-144	6250
СК04-146	N0
СЙ04-164	4724
СЙ57	3800
сйов	605

N0 = не определяли.

- 60 010785

Таблица 16

Нейтрализующая активность ^С против С-белка вируса бешенства, направленная на ускользающие вирусы Е57

Название 1д6	Е57А2 (МЕ/мг)	Е57АЗ (МЕ/мг)	Е57В1 (МЕ/мг)	Е57В2 (МЕ/мг)	Е57ВЗ (МЕ/мг)	Е57СЗ (МЕ/мг)
СК04-008	0*	0	0	0	0	0
СК04-010	8127	1355	5418	1355	2709	4064
СК04-018	1604	0	1604	0	59	535
СК04-021	450	2	150	8	50	50
СК04-038	9437	1573	9437	1049	6291	1573
СК04-040	8209	2736	24628	1368	5473	912
СК04-073	8256	1835	11008	1835	3669	1835
СК04-098	9878	3293	9878	3293	3293	3293
СК04-103	8917	2972	17835	2972	5945	2972
СК04-104	3288	2192	6576	2192	4384	1096
СК04-108	3288	731	4384	731	2192	731
СК04-120	1111	14	741	82	247	41
СВ04-125	708	39	236	79	157	79
СВ.О'4-126	88	0	18	0	18	0
СК04-144	5625	2813	11250	2813	5625	1875
СВ04-164	4252	472	4252	472	945	709

*0 означает отсутствие 50%-ной нейтрализации в конечной точке разведения при разведении антитела 1:100

Таблица 17

Нейтрализующая активность СК-57 против ускользающих вирусов Е98

	Е98-2 (МЕ/мг)	Е98-4 (МЕ/мг)	Е98-5 (МЕ/мг)	Е98-6 (МЕ/мг)	Е98-7 (МЕ/мг)
СК-57	2813	8438	4219	2813	8438
СК04-098	0*	0	0	0	0

*0 означает отсутствие 50%-ной нейтрализации в конечной точке разведения при разведении антитела 1:1000

Таблица 18

Встречаемость аминокислотных остатков в минимальной связывающей области эпитопа вируса бешенства генотипа 1 для антитела СК57

Дикого типа	К	Ь	С	с	V	Ь
	К (99.6%)*	Ъ (100%)	С (100%)	6 (98.7%)	V (99.6%)	ь (70.7%)
	К (0.4%)			Е (0.9%)	I (0.4%)	Р (26.7%)
				К (0.4%)		3 (2.6%)

* Процент встречаемости каждой аминокислоты в 229 изолятах вируса бешенства

Ссылки

Атеуата 8., Топит Н., ТакайакЫ Т., 8Ытига Υ., NакаЬа^а Т., Нопба Υ., Мйипе К., ИсЫуата Т. апб ΙΚπνηί А. (2003), Мопос1опа1 апбЬобу #3-9-16 гесодшхех опе оГ (Не (\\ό 15оГогт5 оГ гаЫез νίιυδ та(п.х рго(ет (На( ехрозез ίΙ< Ν-^ηηίπιΐδ оп (Не утоп зигГасе. МюгоЬю1. Iттиηо1. 47:639-651.

Вабгапе Н. апб Тогбо N. (2001), Но5( 5\\'ПсНтд т Ьу^ауиик НМогу Ггот (Не С1игор(ега (о (Не Сагшуога огбегз. I. У1го1. 75:8096-8104.

Вептапзоиг А., ЬеЬ1о18 Н., Сои1оп Р., ТиГГегеаи С., Саибт Υ., Р1атапб А., апб ЬаГау Р. (1991), Λπ(ίдешсНу оГгаЫез νίπ.15 §1усорго(ет. ί. Уио1. 65:4198-4203.

Вое1 Е., Уег1аап 8., РорреНег М.Т, ^е§1егбаа1 ΝΑ, Уап 8(лур ТА. апб ЬодепЬегд Т. (2000), Рипс

- 61 010785

Ιίοηαΐ Питан топос1опа1 апНЬоНДек оГ а11 Дко(урек сопк(гис(еН Дгот рНаде НДкр1ау НЬгагу-НепуеН ктд1е-сНат Ρν апДДЬоНу Ггадтеп(к. Д. 1ттипо1. Ме(НоНк 239:153-166.

ВипксНо(еп Н., боге М., С1ааккеп 1.Д., Иу(НеНаад Р.С., О|е(/ксНо1Н В., Уиппег У.Н., апН 0к(егНаик А.Ь. (1989), С11агас1епхаРоп оГ а пеу ν^^иκ-ηеиί^а1^ζ^ηд еркоре 1На( Непо(ек а кедиепкаД Не(егтДпап( оп (Не гаЫек уНик д1усорго(ет. Д. Сеп. УДго1. 70 (Р( 2):291-8.

Вийоп О.К. апН ВагЬак С.Р. (1994), Нитап апНЬоНДек Ггот сотЬта(опа1 НЬгапек. АНу. 1ттипо1. 57:191-280.

СНатртп Д.М., Кеап К.В., КирргесН( С.Е., №(ктк А.Ь., КоргоуккД Н., О|е(хксНо1Н В., апН Ноорег Ь.С. (2000), ТНе Неуе1ортеп( оГ топос1опа1 Нитап гаЬДек ут.1к-пеи(га1|/тд апНЬоНДек ак а киЬк(1(и(е Гог роо1еН Нитап Дттипе д1оЬи1т Дп (Не ргорНу1асНс (геа(теп( оГ гаЬДек νίπικ ехрокиге. Д. 1ттипо1. Ме(НоНк 235:81-90.

СНои Т.С. апН Та1а1ау Р. (1984), ОиапШаРуе апа1укДк оГ Ноке-еГГес( ге1а(ДопкНДрк: (Не сотЫпеН еГГес(к оГ тиШр1е Нгидк ог епхуте ДпНДЬ1(огк. АНу. Епхуте Кеди1. 22:27-55.

Сои1оп Р., Тегпаих Д.Р., Р1атапН А., апН ТиГГегеаи С. (1998), Ап ау|гп1еп( ти(ап( оГ гаЬДек νίπικ ίκ ипаЬ1е До ДпГес( тоДопеигопк Дп уДуо апН Дп уНго. Д. УДго1. 72:273-278.

Ье КгшГ Д., Тегк(арреп Ь., Вое1 Е. апН ЬодДепЬегд Т. (1995а), КарДН ке1ес(юп оГ се11 киЬрори1аНопкресДЕс Нитап топос1опа1 апНЬоНДек Дгот а ку п(Не(Дс рНаде ап(ДЬоНу НЬгагу. Ргос. №1(1. АсаН. 8сД. И8А 92:3938.

Ье КгшГ Д., Вое1 Е. апН Бод(епЬегд Т. (1995Ь), 8е1есНоп апН аррНсаНоп оГ Нитап ктд1е-сНат Ру апНЬоНу Ггадтеп(к Дгот а кетД-куп(НеНс рНаде ап(ДЬоНу НДкр1ау НЬгагу уД(Н НекДдпеН СЭК3 гедДопк. Д. Мо1. ВДо1. 248:97-105.

О|е(/ксНо1Н В., Уиппег У.Н., \УД1<(ог Т.Д., Ьорек АО., ЬаГоп М., 8тД(Н С.Ь., апН КоргоуккД Н. (1983), СНагас(епха(1оп оГ ап апНдепДс Не(егтДпап( оГ (Не д1усорго(ет (На( согге1а(ек уД(Н ра(Нодеп1с1(у оГ гаЬДек νίгик. Ргос. N(1. АсаН. 8сД. И8А 80:70-74.

О|е(/ксНо1Н В., Соге М., СакаН Р., ИекД Υ., КирргесН( С.Е., №(ктк А.Ь., апН КоргоуккД Н. (1990), ВДо1одДса1 сНагас(епха(юп оГ Нитап топос1опа1 апНЬоНДек (о гаЬДек уНик. Д. УНо1. 64:3087-3090.

Нап1оп С.А., ЬеМа((ок С.А., ЬеМа((ок С.С., Ме/доНа М., Ноорег О.С., КоргоуккД Н., №(ктк А., апН КирргесН( С.Е. (2001), ЕхрегДтеп(а1 и(Д1Д(у оГ гаЬДек у|гик пеийаП/тд Нитап топос1опа1 ап(ДЬоН1ек Дп рок(ехрокиге ргорНу1ах1к. Уассте 19:3834-3842.

Ни1к С., Неупеп 1.Д., Сиото Е., уап Нег ЬДпНеп Д., Вое1 Е., уап Не УДпке1 Д. апН ЬодДепЬегд Т. (1999), АпШитог Дттипе еГГес(ог тесНапДктк гесгиНеН Ьу рНаде Н1кр1ау-НегДуеН Ги11у Нитап 1дС1 апН 1дА1 топос1опа1 ап(ДЬоН1ек. Сапсег Кек. 59:5778-5784.

Допек Ό., Кгоок К, Апета К., уап МопНой В., Уооук А., уап Нег Кгаа(к 8., уап Нег Не1т Е., 8тД(к 8., 8сНои(еп Д., Вгоиуег К., ЬадегуегГ Р., уап Вегке1 Р., 0рк(е1(еп Ό4., ЬодДепЬегд Т. апН Вои( А. (2003), НДдН1еуе1 ехргекктп оГ гесотЬтап( 1дС Дп (Не Нитап се11 Нпе РЕК.С6. ВДо(есНпо1. Ргод. 19:163-168.

ЬаГоп М., \УД1<(ог Т.Д., апН МасГаг1ап К.1. (1983), АпНдепДс кД(ек оп (Не СУ8 гаЬДек гйик д1усорго(ет: апа1ук1к У1(Н топос1опа1 апНЬоНДек. Д. Сеп. УДго1. 64 (Р( 4):843-851.

Ьио Т.К., МДпато(о К, 1(о Н., Со(о Н., НДгада 8., 1(о К, 8ид1уата М., апН КНуо Т. (1997), А уДгикпеи(гаНхтд ерНоре оп (Не д1усорго(ет о Г гаЬДек гНик (На( соп(аДпк Тгр251 Дк а 1Дпеаг ерйоре. УНик Кек. 51:35-41.

МаННикиНапа 8.К, 8НаткипНаг К. апН 8ее(Нагатап 8. (2004), 1п уД(го тасНуаНоп оГ (Не гаЬДек уйик Ьу аксогЫс ас1Н. 1п(. Д. 1пГес(. Ык. 8:21-25.

N1 Υ., ТотДпада Υ., НопНа Υ., МогДто(о К., 8акато(о 8., апН КауаД А. (1995), Марртд апН сНагас(еп/аНоп оГ а кедпеп(1а1 ерНоре оп (Не гаЬДек уДгик д1усорго(ет уНДсН Дк гесодшхеН Ьу а пеийаНхтд топос1опа1 апНЬоНу, КС719. МДсгоЬю1. 1ттипо1. 39:693-702.

РгеНаиН С., Сои1оп Р., ЬаРау Р., ТНДегк С., апН Р1атапН А. (1988), АпНдепДс кД(е II оГ (Не гаЬДек у|гик д1усорго(ет:к(гис(иге апН го1е Дп у1га1 уДги1епсе. Д. Уйо1. 62:1-7.

8сНитасНег С.Ь., О|е(/ксНо1Н В., ЕгД1 Н.С., №и Н.8., КирргесН( С.Е., апН КоргоуккД Н. (1989), Ике оГ тоике апН-гаЫек топос1опа1 апНЬоНДек Дпрок(ехрокиге Неа(теп( оГгаЬДек. Д. СНп. !пуек(. 84:971-975.

8еДГ I., Сои1оп Р., КоШп Е., апН Р1атапН А. (1985) КаЫек уНи1епсе: еГГес( оп ра(НодепДс1с(у апН кесщепсе сНагас(епха(1оп оГ гаЬДек уНик ти(аНопк аГГесНпд апНдепДс кД(е III оГ(Не д1усорго(ет. Д. УДго1. 53:926934.

81оо(к(га Д.У., Риук У.С., ЫдДуое( С.Д., Ьапдеуе1Н Д.Р., Ме1оеп К.Н. 1996. 8(п.1с(ига1 акрес(к оГ апНЬоНу-ап(Ддеп Дп(егас(юп геуеа1еН (НгоидН кта11 гапНот рерННе НЬгапек. Мо1. Ь|уегк. 1:87-96.

ТогНо N. (1996), СНагас(егДк(1ск апН то1еси1аг Ыо1оду оГ гаЬДек уНик. Ш Мек1т Р-Х, Кар1ап М.М., КоргоуккД Н., еНйогк. ЬаЬога(огу ТесНпДдиек Дп гаЬДек, 4'¹' еННДоп Сепеуа, 8\\йхег1апН: Уог1Н Неа1(Н 0гдашха(1оп.

УНД(е Ь.А. апН СНарре11 У.А. (1982), !пас(|уа(юп оГ гаЬДек уДгик Дп геадеп(к икеН Гог (Не Г1иогексеп( гаЬДек апНЬоНу (ек(. Д. СНп. МДсгоЬт1. 16:253-256.

Claims

1. Способ идентификации связывающей молекулы, специфически связывающейся с вирусом бешенства, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающую молекулу, специфически связывающуюся с вирусом бешенства, где указанный способ включает стадии:

a) контактирования набора связывающих молекул на поверхности реплицируемых генных упаковок с вирусом бешенства или с клетками, экспрессирующими белок вируса бешенства, в условиях, способствующих связыванию, где указанный набор связывающих молекул получают из РНК, выделенной из клеток, взятых у индивидуума, вакцинированного против бешенства, или у индивидуума, имевшего контакт с вирусом бешенства;

b) по меньшей мере однократного отбора связывающих молекул, которые связываются с вирусом бешенства, и

c) отделения и сбора связывающих молекул, которые связываются с вирусом бешенства.

2. Способ идентификации связывающей молекулы, предположительно обладающей нейтрализующей активностью против вируса бешенства, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающую молекулу, предположительно обладающую нейтрализующей активностью против вируса бешенства, где указанный способ включает стадии:

а) контактирования набора связывающих молекул на поверхности реплицируемых генных упаковок с вирусом бешенства или с клетками, экспрессирующими белок вируса бешенства, в условиях, способствующих связыванию, где указанный набор связывающих молекул получают из РНК, выделенной из клеток, взятых у индивидуума, вакцинированного против бешенства, или у индивидуума, имевшего контакт с вирусом бешенства;

(b) отделения и сбора связывающих молекул, которые связываются с вирусом бешенства, от связывающих молекул, которые не связываются с вирусом;

(c) выделения по меньшей мере одной полученной связывающей молекулы и (б) подтверждения нейтрализующей активности выделенной связывающей молекулы против вируса бешенства.

3. Способ по п.2, дополнительно включающий стадию отделения и сбора связывающих молекул, содержащих ген вариабельной области тяжелой цепи 3-30 зародышевой линии.

4. Способ по любому из пп.1-3, где указанный вирус бешенства является инактивированным.

5. Способ по любому из пп.1-4, где указанный набор связывающих молекул на поверхности реплицируемых генных упаковок представляет собой библиотеку одноцепочечных Ρν.

6. Способ по любому из пп.1-5, где указанным индивидуумом является человек, вакцинированный против вируса бешенства.

7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанная реплицируемая генная упаковка выбрана из группы, состоящей из фаговой частицы, бактерии, дрожжей, грибков, спор микроорганизма и рибосомы.

8. Набор связывающих молекул человека на поверхности реплицируемых генных упаковок, отличающийся тем, что указанный набор получают из РНК, выделенной из клеток, взятых у индивидуума, вакцинированного против вируса бешенства или имевшего контакт с вирусом бешенства.

9. Набор по п.8, отличающийся тем, что указанный набор представляет собой библиотеку одноцепочечных Ρν.

10. Набор по п.8 или 9, отличающийся тем, что указанным индивидуумом является человек, вакцинированный против вируса бешенства.

11. Связывающая молекула, обладающая нейтрализующей активностью против вируса бешенства и отличающаяся тем, что содержит по крайней мере область СОЕ3, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:14.

12. Связывающая молекула по п.11, отличающаяся тем, что включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:39 или аминокислоты 1-119 последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:335.

13. Связывающая молекула по п.11 или 12, отличающаяся тем, что указанной связывающей молекулой является связывающая молекула человека.

14. Функциональный вариант связывающей молекулы по любому из пп.11-13, отличающийся тем, что указанный функциональный вариант обладает нейтрализующей активностью против вируса бешенства.

15. Иммуноконъюгат, содержащий связывающую молекулу по любому из пп.11-13 или ее функциональный вариант по п.14, где указанный иммуноконъюгат дополнительно содержит по меньшей мере один таг.

16. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающую молекулу по любому из пп.11-13 или ее функциональный вариант по п.14.

17. Вектор, содержащий по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты по п.16.

18. Клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере один вектор по п.17.

- 63 010785

19. Клетка-хозяин по п.18, которой является человеческая клетка.

20. Способ получения связывающей молекулы по любому из пп.11-13 или ее функционального варианта по п.14, где указанный способ включает стадии:

а) культивирования клетки-хозяина по п.18 или 19 в условиях, способствующих экспрессии указанной связывающей молекулы или ее функционального варианта, и, необязательно,

й) сбора экспрессированной связывающей молекулы или ее функционального варианта.

21. Фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу по любому из пп.11-13, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.

22. Фармацевтическая композиция по п.21, содержащая по меньшей мере одну дополнительную связывающую молекулу, где указанная дополнительная связывающая молекула содержит по крайней меньшей мере область СБВ3, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:25, и где указанные связывающие молекулы способны взаимодействовать с различными неконкурирующими эпитопами вируса бешенства.

23. Фармацевтическая композиция по п.22, отличающаяся тем, что указанная дополнительная связывающая молекула содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:273.

24. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере две связывающие молекулы, нейтрализующие вирус бешенства, которые способны взаимодействовать с различными неконкурирующими эпитопами вируса бешенства, где указанная фармацевтическая композиция отличается тем, что указанная первая связывающая молекула, нейтрализующая вирус бешенства, способна взаимодействовать с эпитопом, локализованным в антигенном сайте I С-белка вируса бешенства, а вторая связывающая молекула, нейтрализующая вирус бешенства, обладает способностью реагировать с эпитопом, локализованным в антигенном сайте III С-белка вируса бешенства.

25. Фармацевтическая композиция по п.24, отличающаяся тем, что указанная первая связывающая молекула, нейтрализующая вирус бешенства, содержит, по крайней мере, область СБВ3, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:25, а вторая связывающая молекула, нейтрализующая вирус бешенства, содержит, по меньшей мере, область СБВ3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 51Е0 ГО N0:4, 8ЕЦ ГО N0:10, 8ЕЦ ГО N0:14, 8ЕЦ ГО N0:15, ХЕ) ГО N0:16 и ХЕ) ГО N0:22.

26. Связывающая молекула по любому из пп.11-13, функциональный вариант по п.14, иммуноконъюгат по п.15 или фармацевтическая композиция по пп.21-25, используемые в качестве лекарственного средства.

27. Связывающая молекула по любому из пп.11-13, функциональный вариант по п.14, иммуноконъюгат по п.15 или фармацевтическая композиция по пп.21-25 или их комбинации, используемые для диагностики, профилактики и лечения состояния, вызываемого вирусом бешенства.

28. Применение связывающей молекулы по любому из пп.11-13, функционального варианта по п.14, иммуноконъюгата по п.15, фармацевтической композиции по пп.21-25 или их комбинации для получения лекарственного средства для диагностики, профилактики и лечения состояния, вызываемого вирусом бешенства.

29. Набор, содержащий по меньшей мере одну связывающую молекулу по любому из пп.11-13, по меньшей мере один функциональный вариант по п.14, по меньшей мере один иммуноконъюгат по п.15, по меньшей мере одну фармацевтическую композицию по пп.21-25 или их комбинацию.

30. Связывающая молекула, обладающая нейтрализующей активностью в отношении вируса бешенства, отличающаяся тем, что содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:39, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:63, или вариабельную область тяжелой или легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% гомологична указанным последовательностям, и где одна или несколько аминокислот последовательности 8ЕЦ ГО N0:39 и 8ЕЦ ГО N0:63 изменены, и которая может конкурировать за специфическое связывание с вирусом бешенства или его фрагментом со связывающей молекулой, содержащей 8ЕЦ ГО N0:39 и 8ЕЦ ГО N0:63, и обладает нейтрализующей активностью в отношении вируса бешенства.