ES2426725T3

ES2426725T3 - Método para identificar moléculas de unión que pueden neutralizar el virus de la rabia

Info

Publication number: ES2426725T3
Application number: ES10180375T
Authority: ES
Inventors: Alexander Berthold Hendrik Bakker; Willem Egbert Marissen; Robert Arjen Kramer; Cornelis Adriaan De Kruif
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2004-05-27
Filing date: 2005-05-26
Publication date: 2013-10-24
Anticipated expiration: 2025-05-26
Also published as: KR20070044807A; US8148497B2; IL179586A; NZ580607A; HRP20110320T1; EP2314620B1; IL225849A0; US20080070799A1; JP2008508859A; US20070072177A1; CN102241769A; PT2314620E; IL179586A0; PL2314620T3; ES2468021T3; BRPI0511479C1; EA010785B1; CN102241769B; PT2314621E; US20080226652A1

Abstract

Método para identificar una molécula de unión que potencialmente tiene actividad neutralizante contra elvirus de la rabia o una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de unión que potencialmentetiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia, en donde el método comprende las etapas de: a) poner en contacto una colección de moléculas de unión en la superficie de paquetes genéticosreplicables con un virus de la rabia en condiciones que conducen a la unión, en donde la colecciónde moléculas de unión se prepara a partir de ARN aislado de células obtenidas de un sujetohumano que ha sido vacunado contra la rabia o que ha sido expuesto al virus de la rabia. b) separar y recuperar moléculas de unión que se unen al virus de la rabia de moléculas de uniónque no se unen, c) aislar al menos una molécula de unión recuperada, d) verificar si las moléculas de unión aisladas tienen actividad neutralizante contra el virus de la rabia,que comprende además la etapa de separar y recuperar moléculas de unión codificadas por un gen de lalínea germinal pesada variable 3-30.

Description

Método para identificar moléculas de unión que pueden neutralizar el virus de la rabia

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a la medicina. En particular, la invención se refiere a moléculas de unión que neutralizan el virus de la rabia. Las moléculas de unión son útiles en la profilaxis tras la exposición de la rabia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La rabia es una infección viral con distribución casi mundial que afecta principalmente a animales salvajes y domésticos pero que también implica a seres humanos, dando como resultado una encefalitis devastadora, letal de manera casi invariable. Anualmente, se estiman más de 70.000 víctimas mortales humanas, y millones de otras personas requieren tratamiento tras la exposición.

El virus de la rabia es un virus de ARN monocatenario, con envuelta, con forma de bala, clasificado en la familia de los Rhabdovirus y del género Lyssavirus. El genoma del virus de la rabia codifica para cinco proteínas virales: ARN polimerasa dependiente de ARN (L); una nucleoproteína (N); una proteína fosforilada (P); una proteína de matriz (M) ubicada en el lado interno de la envuelta proteica viral; y una glicoproteína de superficie externa (G).

La proteína G (62-67 KDa) es una glicoproteína de tipo I compuesta por 505 aminoácidos que tiene de dos a cuatro posibles sitios de N-glicosilación, de los cuales solamente uno o dos se glicosilan dependiendo de las cepas del virus. La proteína G forma los salientes que cubren la superficie externa de la envuelta del virión y se sabe que induce anticuerpos que neutralizan el virus.

La rabia puede tratarse o prevenirse mediante inmunizaciones tanto pasivas como activas. La profilaxis tras la exposición a la rabia incluye el cuidado inmediato de la herida local y la administración de inmunizaciones tanto pasivas (inmunoglobulinas anti-rabia) como activas (vacunas).

Actualmente, las inmunoglobulinas anti-rabia (RIG) se preparan a partir de las muestras de suero de o bien seres humanos inmunizados contra el virus de la rabia (HRIG) o bien caballos inmunizados contra el virus de la rabia (ERIG). Una desventaja de ERIG así como de HRIG es que no están disponibles en cantidades suficientes y, en el caso de HRIG, es demasiado cara. Además, el uso de ERIG puede conducir a reacciones adversas tales como choque anafiláctico. La posibilidad de contaminación por patógenos conocidos o desconocidos es un problema adicional asociado con HRIG. Para superar estas desventajas se ha sugerido usar anticuerpos monoclonales que pueden neutralizar el virus de la rabia en profilaxis tras la exposición. Los anticuerpos monoclonales murinos que neutralizan el virus de la rabia se conocen en la técnica (véase Schumacher et al., 1989). Sin embargo, el uso de anticuerpos murinos in vivo está limitado debido a problemas asociados con la administración de anticuerpos murinos a seres humanos, tales como vida media en suero corta, una incapacidad para provocar ciertas funciones efectoras humanas y producción de una respuesta inmunitaria drástica no deseada contra el anticuerpo murino en un ser humano (la reacción de “anticuerpo humano anti-ratón” (HAMA)).

Recientemente, se han descrito anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan el virus de la rabia (véase Dietzschold et al., 1990, Champion et al., 2000, y Hanlon et al., 2001). Para que los anticuerpos monoclonales humanos anti-rabia sean tan eficaces como HRIG en la profilaxis tras la exposición debe usarse una mezcla de anticuerpos monoclonales. En una mezcla de este tipo cada anticuerpo debe unirse a un epítopo o sitio diferente en el virus para prevenir el escape de variantes resistentes del virus.

Actualmente, todavía existe una necesidad significativa de nuevos anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan el virus de la rabia que tengan potencial profiláctico tras la exposición mejorado, particularmente anticuerpos que tengan diferentes especificidades de reconocimiento de epítopo. La presente invención proporciona tales anticuerpos monoclonales humanos que ofrecen la posibilidad de usarse en mezclas útiles en la profilaxis tras la exposición de una amplia variedad de virus de la rabia y variantes resistentes a la neutralización de los mismos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de la cepa CVS-11 del virus de la rabia y los virus de escape E57. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestran las regiones que contienen mutaciones y las mutaciones se indican en negrita. La figura 1A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. Los números por encima de los aminoácidos indican los números de aminoácidos de la glicoproteína del virus de la rabia incluyendo el péptido señal. La figura 1B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. En la parte superior se muestra la representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia. El recuadro negro indica el péptido señal, mientras que el recuadro gris indica el dominio transmembrana. Las secuencias en la figura 1 también están representadas por las SEQ ID No: 130-141.

La figura 2 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de la cepa CVS-11 del virus de la rabia y los

virus de escape EJB. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestran las regiones que contienen mutaciones y las mutaciones se indican en negrita. La figura 2A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. Los números por encima de los aminoácidos indican los números de aminoácidos de la glicoproteína del virus de la rabia incluyendo el péptido señal. La figura 2B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. En la parte superior se muestra la representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia. El recuadro negro indica el péptido señal, mientras que el recuadro gris indica el dominio transmembrana. Las secuencias en la figura 2 también están representadas por las SEQ ID No: 142-151.

La figura 3 muestra el vector PDV-C06.

La figura 4 muestra un ELISA de competición de scFv anti-virus de la rabia y anticuerpo biotilinado anti-virus de la rabia denominado CR-57. Las placas de ELISA recubiertas con proteína G purificada del virus de la rabia se incubaron con scFv respectivos antes de la adición de CR-57bio (0,5 !g/ml). Posteriormente, se monitorizó la unión de CR-57bio en ausencia y presencia de scFv.

La figura 5 muestra un ELISA de competición de scFv anti-virus de la rabia y anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Las placas de ELISA recubiertas con proteína G purificada del virus de la rabia se incubaron con CR-57 (1 !g/ml) antes de la adición de scFv en exceso. Posteriormente, se monitorizó la unión de svFv en ausencia y presencia de CR-57.

La figura 6 muestra un ensayo de ELISA de competición de IgG anti-proteína G del virus de la rabia y el anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Se incubó proteína G (cepa ERA) con IgG no marcadas (mostrado en el eje X). Se añadió CR57 biotinilado (CR57bio) y se permitió que se uniera a la proteína G antes de visualización por medio del estreptavidina-HRP. Las señales de ELISA se muestran como porcentaje de unión de CR57bio solo.

La figura 7 muestra un ensayo de FACS de competición de IgG anti-proteína G del virus de la rabia y el anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Se incubaron células PER.C6 que expresan proteína G (cepa ERA) con IgG no marcadas (mostrado en el eje X). Se añadió CR57 biotinilado (CR57bio) y se permitió que se uniera a las células que expresan la proteína G antes de visualización por medio de estreptavidina-PE. Las señales de FACS se muestran como porcentaje de unión de CR57bio solo.

La figura 8 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de virus de escape E98 y CVS-11. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestra la región que contiene una mutación puntual y la mutación se indica en negrita. La figura 8A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. El número por encima del nucleótido indica el nucleótido mutado (indicado en negrita) del marco de lectura abierto de la glicoproteína del virus de la rabia sin secuencia de péptido señal. La figura 8B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. El número por encima del aminoácido indica el aminoácido mutado (indicado en negrita) de la glicoproteína del virus de la rabia sin secuencia de péptido señal.

La figura 9 muestra un árbol filogenético de 123 virus naturales de la rabia (123 secuencias de glicoproteína G del virus de la rabia, método de Kimura con 2 parámetros de unión al vecino “neighbor joining”, 500 cebadores). La negrita indica los virus que alojan la mutación N>D tal como se observa en los virus de escape E98.

La figura 10 muestra epítopos neutralizantes sobre la glicoproteína de la rabia. Se muestra una representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia que representa los sitos antigénicos incluyendo el epítopo de CR57 novedoso. El péptido señal (19 aminoácidos) y el dominio transmembrana se indican mediante recuadros negros. Se indican los puentes disulfuro. La numeración de los aminoácidos es desde la proteína madura menos la secuencia del péptido señal.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

A continuación en el presente documento siguen definiciones de términos tal como se usan en la invención.

DEFINICIONES

Molécula de unión

Tal como se usa en el presente documento la expresión “molécula de unión” se refiere a una inmunoglobulina intacta incluyendo anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos, o a un dominio de unión a antígeno y/o variable que comprende un fragmento de una inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta para la unión específica a la pareja de unión de la inmunoglobulina, por ejemplo el virus de la rabia o un fragmento del mismo tal como por ejemplo la proteína G. Independientemente de la estructura el fragmento de unión a antígeno se une con el mismo antígeno que reconoce la inmunoglobulina intacta. Un fragmento de unión a antígeno puede comprender un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 2 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20

residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 30 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 35 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácido contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión.

La expresión “molécula de unión”, tal como se usa en el presente documento incluye todas las clases y subclases de inmunoglobulinas conocidas en la técnica. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las moléculas de unión pueden dividirse en cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Los fragmentos de unión a antígeno incluyen, entre otros, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios bivalentes, anticuerpos monocatenarios de fagos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al (poli)péptido, etc. Los fragmentos anteriores pueden producirse sintéticamente o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas o pueden obtenerse genéticamente mediante técnicas de ADN recombinante. Los métodos de producción se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Antibodies: A Laboratory Manual, editado por: E. Harlow y D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. Una molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes.

La molécula de unión puede ser una molécula de unión desnuda o no conjugada, pero también puede formar parte de un inmunoconjugado. Una molécula de unión desnuda o no conjugada pretende referirse a una molécula de unión que no está conjugada, operativamente unida o asociada física o funcionalmente de otro modo con un marcador o resto efector, tal como, entre otros, una sustancia tóxica, una sustancia radiactiva, un liposoma, una enzima. Se entenderá que moléculas de unión desnudas o no conjugadas no excluyen moléculas de unión que se han estabilizado, multimerizado, humanizado o manipulado de cualquier otra forma, distinto de mediante la unión de un marcador o resto efector. En consecuencia, en el presente documento están incluidas todas las moléculas de unión desnudas y no conjugadas modificadas tras la traducción, incluyendo cuando las modificaciones se realizan en el entorno de la célula que produce la molécula de unión natural, mediante una célula que produce la molécula de unión recombinante y se introducen manualmente tras la preparación de la molécula de unión inicial. Naturalmente, la expresión molécula de unión desnuda o no conjugada no excluye la capacidad de la molécula de unión para formar asociaciones funcionales con moléculas y/o células efectoras tras la administración al organismo, ya que algunas de tales interacciones son necesarias con el fin de ejercer un efecto biológico. Por tanto, la falta de marcador o grupo efector asociado se aplica en la definición a la molécula de unión desnuda o no conjugada in vitro, no in vivo.

Regiones determinantes de la complementariedad (CDR)

La expresión “regiones determinantes de la complementariedad” tal como se usa en el presente documento significa secuencias dentro de las regiones variables de las moléculas de unión, tales como las inmunoglobulinas, que habitualmente contribuyen en gran medida al sitio de unión al antígeno que es complementario en forma y distribución de carga al epítopo reconocido en el antígeno. Las regiones CDR pueden ser específicas para epítopos lineales, epítopos discontinuos o epítopos conformaciones de proteínas o fragmentos de proteínas, o bien tal como se presentan en la proteína en su conformación nativa, o bien en algunos casos, tal como se presentan en las proteínas cuando se desnaturalizan, por ejemplo, mediante solubilización en SDS. Los epítopos también pueden consistir en modificaciones postraduccionales de las proteínas.

Variante funcional

La expresión “variante funcional”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de unión que comprende un nucleótido y/o secuencia de aminoácidos que está alterada por uno o más nucleótidos y/o aminoácidos en comparación con las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos de la molécula de unión original y que todavía puede competir por la unión a la pareja de unión, por ejemplo el virus de la rabia o un fragmento del mismo, con la molécula de unión original. En otras palabras, las modificaciones en la secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de la molécula de unión original no afectan ni alteran significativamente las características de unión de la molécula de unión codificada por la secuencia de nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos, es decir, la molécula de unión todavía puede reconocer y unirse a su diana. La variante funcional puede tener modificaciones de secuencia conservativas incluyendo sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Estas modificaciones pueden introducirse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR aleatoria, y pueden comprender nucleótidos y aminoácidos naturales así como no naturales.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácido se sustituye con un residuo de aminoácido que tiene propiedades químicas o estructurales similares. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano). Resultará claro para el experto que también pueden emplearse otras clasificaciones de familias de residuos de aminoácidos aparte de la usada anteriormente. Además, una variante puede tener sustituciones de aminoácidos no conservativas, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene propiedades químicas o estructurales diferentes. Variaciones menores similares también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Puede encontrarse una orientación en la determinación de qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin suprimir la actividad inmunológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica.

Una mutación en una secuencia de nucleótidos puede ser una única alteración realizada en un locus (una mutación puntual), tal como mutaciones por transición o transversión, o alternativamente, pueden insertarse, delecionarse o cambiarse múltiples nucleótidos en un único locus. Además, pueden realizarse una o más alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de nucleótidos. Las mutaciones pueden realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica.

Huésped

El término “huésped”, tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a un microorganismo o una célula en el que se ha introducido un vector tal como un vector de clonación o un vector de expresión. El microorganismo o célula puede ser procariota o eucariota. Debe entenderse que este término pretende referirse no sólo al microorganismo o célula objeto particular, sino también a la progenie de tal microorganismo o célula. Puesto que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido o bien a mutación o bien a influencias medioambientales, puede que de hecho tal progenie no sea idéntica al microorganismo o célula original, pero todavía se incluye dentro del alcance de la expresión “huésped” tal como se usa en el presente documento.

Humano

El término “humano”, cuando se aplica a moléculas de unión tal como se definen en el presente documento, se refiere a moléculas que o bien se derivan directamente de un ser humano o bien están basadas en una secuencia humana. Cuando una molécula de unión se deriva de o está basada en una secuencia humana y posteriormente se modifica, todavía debe considerarse humana tal como se usa a lo largo de toda la memoria descriptiva. En otras palabras, el término humano, cuando se aplica a moléculas de unión pretende incluir moléculas de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana basadas en regiones variables o constantes ya se produzcan o no en un ser humano o linfocito humano o en forma modificada. Por tanto, las moléculas de unión humanas pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana, comprender sustituciones y/o deleciones (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante por ejemplo mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). “Basado en” tal como se usa en el presente documento se refiere a la situación en la que puede copiarse exactamente una secuencia de ácido nucleico a partir de un molde, o con mutaciones menores, tal como mediante métodos de PCR propensos a errores, u obtenerse sintéticamente apareando el molde exactamente o con modificaciones menores. Las moléculas semisintéticas basadas en secuencias humanas también se consideran humanas tal como se usa en el presente documento.

Anticuerpo monoclonal

La expresión “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única, es decir estructura primaria, es decir que tiene una secuencia de aminoácidos única. Un anticuerpo monoclonal presenta una especificidad y afinidad de unión únicas por un epítopo particular. En consecuencia, la expresión “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a un anticuerpo que presenta una especificidad de unión única que tiene regiones variables y constantes derivadas de o basadas en secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana o derivadas de secuencias completamente sintéticas. El método de preparación del anticuerpo monoclonal no es relevante.

Molécula de ácido nucleico

La expresión “molécula de ácido nucleico” tal como se usa en la presente invención se refiere a una forma polimérica de nucleótidos e incluye tanto cadenas sentido como antisentido de ARN, ADNc, ADN genómico, y formas sintéticas y polímeros mixtos de los anteriores. Un nucleótido se refiere a un ribonucleótido, desoxinucleótido

o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. La expresión también incluye formas mono y bicatenarias de ADN. Además, un polinucleótido puede incluir cualquiera o tanto nucleótidos que se producen de manera natural

como modificados unidos entre sí mediante enlaces de nucleótidos que se producen de manera natural y/o que no se producen de manera natural. Las moléculas de ácido nucleico pueden modificarse de manera química o bioquímica o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, tal como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de manera natural con un análogo, modificaciones entre nucleótidos tales como enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), moléculas de intercalación (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes, y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). La expresión anterior también pretende incluir cualquier conformación topológica, incluyendo conformaciones monocatenarias, bicatenarias, de dúplex parcial, triples, de horquilla, circulares y de candado. También se incluyen moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad para unirse a una secuencia designada a través de puentes de hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que los enlaces fosfato se sustituyen por enlaces peptídicos en la estructura principal de la molécula. Una referencia a una secuencia de ácido nucleico engloba a su complemento a menos que se especifique otra cosa. Por tanto, debe entenderse que una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular engloba a su cadena complementaria, con su secuencia complementaria. La cadena complementaria también es útil, por ejemplo, para terapia antisentido, sondas de hibridación y cebadores de PCR.

Excipiente farmacéuticamente aceptable

Por “excipiente farmacéuticamente aceptable” se quiere decir cualquier sustancia inerte que se combina con una molécula activa tal como un fármaco, agente, o molécula de unión para preparar una forma farmacéutica adecuada

o conveniente. El “excipiente farmacéuticamente aceptable” es un excipiente que no es tóxico, o al menos cuya toxicidad es aceptable para su uso deseado, para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y que es compatible con otros componentes de la formulación que comprende el fármaco, agente o molécula de unión.

Profilaxis tras la exposición

La “profilaxis tras la exposición” (PEP) se indica para personas posiblemente expuestas a un animal con rabia. Las posibles exposiciones incluyen exposición a mordedura (es decir, cualquier penetración de la piel por los dientes) incluyendo mordeduras de animales, y exposición sin mordedura. Las exposiciones sin mordedura incluyen exposición a grandes cantidades de virus de la rabia pulverizado en laboratorios o cuevas y receptores quirúrgicos de córneas trasplantadas de pacientes que murieron por la rabia. La contaminación de heridas abiertas, abrasiones, membranas mucosas, o teóricamente, arañazos, con saliva u otro material potencialmente infeccioso (tal como tejido nervioso) de un animal con rabia también constituye una exposición sin mordedura. Otro contacto por sí mismo, tal como acariciar a un animal con rabia y el contacto con sangre, orina o heces de un animal con rabia, no constituye una exposición y no es una indicación para profilaxis. PEP debe comenzar lo antes posible tras una exposición. Si no se ha producido exposición, no es necesaria la profilaxis tras la exposición. En todos los regímenes de profilaxis tras la exposición, excepto para personas previamente inmunizadas, deben usarse simultáneamente inmunizaciones activas y pasivas.

Unión específica

La expresión “unión específica”, tal como se usa en el presente documento, en referencia a la interacción de una molécula de unión, por ejemplo un anticuerpo, y su pareja de unión, por ejemplo un antígeno, significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular, por ejemplo un determinante antigénico o epítopo, en la pareja de unión. En otras palabras, el anticuerpo se une o reconoce preferiblemente la pareja de unión incluso cuando la pareja de unión está presente en una mezcla de otras moléculas o microorganismos. La unión puede estar mediada por interacciones covalentes o no covalentes o por una combinación de ambas. En otras palabras, la expresión “unión específica” significa unión inmunoespecífica a un antígeno o a un fragmento del mismo y unión no inmunoespecífica a otros antígenos. Una molécula de unión que se une inmunoespecíficamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con afinidad menor tal como se determina mediante, por ejemplo, radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), BIACORE, u otros ensayos conocidos en la técnica. Las moléculas de unión o fragmentos de las mismas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno pueden reaccionar de manera cruzada con antígenos relacionados. Preferiblemente, las moléculas de unión o fragmentos de las mismas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno no reaccionan de manera cruzada con otros antígenos.

Cantidad terapéuticamente eficaz

La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de la molécula de unión tal como se define en el presente documento que es eficaz para la profilaxis tras la exposición de la rabia.

Vector

El término “vector” indica una molécula de ácido nucleico en la que puede insertarse una segunda molécula de ácido

nucleico para su introducción en un huésped en el que se replicará, y en algunos casos se expresará. En otras palabras, un vector puede transportar una molécula de ácido nucleico a la que se ha unido. El término “vector”, tal como se usa en el presente documento contempla vectores de clonación así como de expresión. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levaduras (YAC) y vectores derivados de bacteriófagos o virus de plantas o animales (incluyendo del ser humano). Los vectores comprenden un origen de replicación reconocido por el huésped propuesto y en caso de los vectores de expresión, un promotor y otras regiones reguladoras reconocidas por el huésped. Un vector que contiene una segunda molécula de ácido nucleico se introduce en una célula por ejemplo mediante transformación, transfección, o haciendo uso de mecanismos de entrada bacterianos o virales. Se conocen otras formas de introducir ácido nucleico en las células, tales como electroporación o bombardeo con partículas a menudo usadas con células vegetales, y similares. El método de introducir ácido nucleico en las células depende entre otras cosas del tipo de células, etc. Esto no es crítico para la invención. Ciertos vectores pueden realizar replicación autónoma en un huésped en el que se introducen (por ejemplo, los vectores que tienen un origen de replicación bacteriano pueden replicarse en bacterias). Otros vectores pueden integrarse en el genoma de un huésped al introducirse en el huésped, y de ese modo se replican junto con el genoma del huésped.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un método para identificar moléculas de unión que pueden unirse específicamente a, y neutralizar, virus de la rabia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención engloba un método para identificar moléculas de unión que puede unirse específicamente al virus de la rabia que potencialmente tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia.Las moléculas de unión también tienen actividad neutralizante contra el virus de la rabia. Las moléculas de unión son moléculas de unión humanas. Alternativamente, también pueden ser moléculas de unión de otros animales. El virus de la rabia pertenece al género Lyssavirus. En total, al género Lyssavirus incluye once genotipos: virus de la rabia (genotipo 1), virus del murciélago de Lagos (genotipo 2), virus Mokola (genotipo 3), virus Duvenhage (genotipo 4), Lyssavirus del murciélago europeo 1 (genotipo 5), Lyssavirus del murciélago europeo 2 (genotipo 6), Lyssavirus del murciélago australiano (genotipo 7), virus Aravan (genotipo 8), virus Khujand (genotipo 9), virus Irkut (genotipo 10) y virus caucásico del oeste (genotipo 11). Además de unirse al virus de la rabia, las moléculas de unión también pueden ser capaces de unirse a otros genotipos del género Lyssavirus. Preferiblemente, las moléculas de unión también pueden ser capaces de neutralizar otros genotipos del género Lyssavirus. Además, las moléculas de unión pueden incluso ser capaces de unirse a y/o neutralizar virus, distintos de Lyssavirus, de la familia de Rhabdovirus. Esta familia incluye los géneros cytorhabdovirus, ephemerovirus, lyssavirus, nucleorhabdovirus, rhabdovirus y vesiculovirus.

Las moléculas de unión pueden ser capaces de unirse específicamente al virus de la rabia en su forma natural o en su forma inactivada/atenuada. La inactivación del virus de la rabia puede realizarse mediante tratamiento con, entre otros, beta-propiolactona (BPL) (White y Chappel, 1982), calentamiento a 56ºC durante más de 30 minutos, irradiación gamma, tratamiento con acetiletilenimina o etilenimina o tratamiento con ácido ascórbico y sulfato de cobre durante 72 horas (Madhusudana et al., 2004). También pueden usarse métodos de inactivación viral general conocidos por el experto tales como, entre otros, pasteurización (calentamiento en húmedo), tratamiento térmico en seco, tratamiento térmico por vapor, tratamiento con pH bajo, tratamiento con disolvente orgánico/detergente, nanofiltración; irradiación con luz UV. Preferiblemente, la inactivación se realiza mediante tratamiento con betapropiolactona (BPL). El experto en la técnica conoce bien métodos para someter a prueba si el virus de la rabia todavía es infectivo o está parcial o completamente inactivado y pueden encontrarse, entre otros, en Laboratory techniques in rabies, editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan y H. Koprowski (1996), 4ª edición, Capítulo 36, Organización Mundial de la Salud, Ginebra.

Las moléculas de unión también pueden ser capaces de unirse específicamente a uno o más fragmentos del virus de la rabia tales como, entre otros, una preparación de una o más proteínas y/o (poli)péptidos derivados del virus de la rabia o una célula transfectada con una proteína y/o (poli)péptido del virus de la rabia. Para los métodos de tratamiento y/o prevención tales como métodos para la profilaxis tras la exposición del virus de la rabia, las moléculas de unión preferiblemente pueden unirse específicamente a proteínas accesibles de superficie del virus de la rabia tales como la proteína M (véase Ameyama et al. 2003) o G. Para fines de diagnóstico, las moléculas de unión humanas también pueden ser capaces de unirse específicamente a proteínas no presentes sobre la superficie del virus de la rabia. La secuencia de aminoácidos de las proteínas de superficie accesibles e internas de diversas cepas conocidas del virus de la rabia puede encontrarse en la base de datos EMBL y/o en otras bases de datos.

Preferiblemente, el fragmento comprende al menos un determinante antigénico reconocido por las moléculas de unión humanas de la invención. Un “determinante antigénico” tal como se usa en el presente documento es un resto tal como un (poli)péptido, (glico)proteína, o análogo o fragmento de los mismos del virus de la rabia, que puede unirse a una molécula de unión humana de la invención con afinidad suficientemente alta para formar un complejo antígeno-molécula de unión detectable.

Las moléculas de unión pueden ser moléculas de inmunoglobulina intacta tales como anticuerpos monoclonales o

policlonales, en particular anticuerpos monoclonales humanos, o las moléculas de unión pueden ser fragmentos de unión a antígeno incluyendo, pero sin limitarse a, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios bivalentes, anticuerpos monocatenarios de fagos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al virus de la rabia o fragmento del mismo. Las moléculas de unión pueden usarse de forma aislada o no aislada. Además, las moléculas de unión pueden usarse solas o en una mezcla que comprende al menos una molécula de unión humana (o variante o fragmento del mismo). En otras palabras, las moléculas de unión pueden usarse en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica que comprende dos o más moléculas de unión, variantes o fragmentos de las mismas. Por ejemplo, las moléculas de unión que tienen actividad neutralizante contra el virus de la rabia pueden combinarse en una terapia única para lograr un efecto profiláctico, terapéutico o de diagnóstico deseado.

Los virus de ARN tales como el virus de la rabia hacen uso de su propia ARN polimerasa durante la replicación del virus. Estas ARN polimerasas tienden a ser propensas a cometer errores. Esto conduce a la formación de las denominadas cuasiespecies durante una infección viral. Cada cuasiespecie tiene un genoma de ARN único, que podría dar como resultado diferencias en la composición de aminoácidos de las proteínas virales. Si se producen tales mutaciones en las proteínas virales estructurales, el virus podría escapar potencialmente del sistema inmunitario del huésped debido a un cambio en los epítopos de las células T o B. La posibilidad de que esto ocurra es superior cuando los individuos se tratan con una mezcla de dos moléculas de unión, tales como anticuerpos monoclonales humanos, que cuando se tratan con una mezcla de anticuerpos policlonales (HRIG). Por tanto, un requisito previo para una mezcla de dos anticuerpos monoclonales humanos para el tratamiento de la rabia es que los dos anticuerpos reconozcan epítopos no solapantes, no competitivos en su antígeno diana, es decir, la glicoproteína del virus de la rabia. De este modo se minimiza la posibilidad de que se produzcan virus de escape de la rabia. Como consecuencia, las moléculas de unión pueden reaccionar preferiblemente con diferentes epítopos no solapantes, no competitivos del virus de la rabia, tales como epítopos en la proteína G del virus de la rabia. La mezcla de moléculas de unión puede comprender además al menos otro agente terapéutico tal como un medicamento adecuado para la profilaxis tras la exposición de la rabia.

Normalmente, las moléculas de unión según la invención pueden unirse a sus parejas de unión, es decir al virus de la rabia o a fragmentos del mismo tales como proteínas del virus de la rabia, con una constante de afinidad (valor de Kd) que es inferior a 0,2*10-4 M, 1,0*10-5 M, 1,0*10-6 M, 1,0*10-7 M, preferiblemente inferior a 1,0*10-8 M, más preferiblemente inferior a 1,0*10-9 M, más preferiblemente inferior a 1,0*10-10 M, incluso más preferiblemente inferior a 1,0*10-11 M, y en particular inferior a 1,0*10*-12 M. Las constantes de afinidad pueden variar para los isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, la unión con afinidad de un isotipo de IgM se refiere a una afinidad de unión de al menos aproximadamente 1,0*10-7 M. Las constantes de afinidad pueden medirse por ejemplo usando resonancia de plasmón superficial, es decir, un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo usando el sistema BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia).

Las moléculas de unión pueden unirse al virus de la rabia en forma purificada/aislada o no purificada/no aislada. Las moléculas de unión pueden unirse al virus de la rabia en forma soluble tal como por ejemplo en una muestra o pueden unirse al virus de la rabia unidas o asociadas a un portador o sustrato, por ejemplo, placas de microtitulación, membranas y perlas, etc. Los portadores o sustratos pueden estar compuestos por vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacáridos, nailon, nitrocelulosa, o teflón, etc. La superficie de tales soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente. Alternativamente, las moléculas de unión también pueden unirse a fragmentos del virus de la rabia tales como proteínas o (poli)péptidos del virus de la rabia. En una realización, las moléculas de unión pueden unirse específicamente a la proteína G del virus de la rabia o a un fragmento de la misma. Las proteínas o (poli)péptidos del virus de la rabia o bien pueden estar en forma soluble o bien pueden unirse al virus de la rabia unido o asociado a un portador o sustrato tal como se describió anteriormente. En otra realización, pueden usarse células transfectadas con la proteína G como pareja de unión para las moléculas de unión.

Las moléculas de unión de la invención neutralizan la infectividad del virus de la rabia. Esto puede lograrse evitando la unión del virus de la rabia a sus receptores en células huésped, tales como, entre otros, el receptor de neurotrofina p75 murino, la molécula de adhesión celular neuronal (CD56) y el receptor de acetilcolina, o la inhibición de la liberación del ARN en el citoplasma de la célula o evitando la transcripción o traducción del ARN. En una realización específica, las moléculas de unión evitan que el virus de la rabia infecte las células huésped en al menos el 99%, al menos el 95%, al menos el 90%, al menos el 85%, al menos el 80%, al menos el 75%, al menos el 70%, al menos el 60%, al menos el 50%, al menos el 45%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 35%, al menos el 30%, al menos el 25%, al menos el 20%, o al menos el 10% con respecto a la infección de las células huésped por el virus de la rabia en ausencia de dichas moléculas de unión. La neutralización puede medirse por ejemplo tal como se describe en Laboratory techniques in rabies, editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan y H. Koprowski (1996), 4ª edición, Capítulos 15-17, Organización Mundial de la Salud, Ginebra. Además, las moléculas de unión humanas pueden moléculas de unión de fijación al complemento que pueden ayudar en la lisis del virus de la rabia con envuelta. Las moléculas de unión humanas también podrían actuar como opsoninas y aumentar la fagocitosis del virus de la rabia o bien potenciando su captación a través de receptores de Fc o C3b o bien aglutinando el virus de

la rabia para hacer que se fagocite más fácilmente.

En una realización preferida, las moléculas de unión que tienen actividad neutralizante contra el virus de la rabia se administran en formato de IgG, preferiblemente en formato de IgG1.

Otro aspecto de la presente divulgación es proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifica para al menos una molécula de unión. Tales moléculas de ácido nucleico pueden usarse como productos intermedios para fines de clonación, por ejemplo en el proceso de maduración por afinidad descrito anteriormente. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico se aíslan o se purifican.

Otro aspecto de la divulgación es proporcionar vectores, es decir, constructos de ácido nucleico, que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico según la presente invención. Los vectores pueden derivarse de plásmidos tales como, entre otros, F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti, etc; cósmidos; fagos tales como lambda, lambdoide, M13, Mu, P1, P22, Qβ, T-even, T-odd, T2, T4, T7, etc; virus de plantas tales como, entre otros, el virus del mosaico de la alfalfa, bromovirus, capillovirus, carlavirus, carmovirus, caulivirus, clostervirus, comovirus, cryptovirus, cucumovirus, dianthovirus, fabavirus, fijivirus, furovirus, geminivirus, hordeivirus, ilarvirus, luteovirus, machlovirus, marafivirus, necrovirus, nepovirus, phytoreovirus, rhabdovirus de plantas, potexvirus, potyvirus, sobemovirus, tenuivirus, tobamovirus, tobravirus, virus del bronceado del tomate, tombusvirus, tymovirus, etc; o virus de animales tales como, entre otros, adenovirus, arenaviridae, baculoviridae, birnaviridae, bunyaviridae, calciviridae, cardiovirus, coronaviridae, corticoviridae, cystoviridae, virus Epstein-Barr, enterovirus, filoviridae, flaviviridae, virus de la glosopeda, hepadnaviridae, virus de la hepatitis, herpesviridae, virus de inmunodeficiencia, virus influenza, inoviridae, iridoviridae, orthomyxoviridae, papovavirus, paramyxoviridae, parvoviridae, picornaviridae, poliovirus, polydnaviridae, poxviridae, reoviridae, retrovirus, rhabdoviridae, rhinovirus, virus del bosque Semliki, tetraviridae, togaviridae, toroviridae, virus vaccinia, virus de la estomatitis vesicular, etc. Los vectores pueden usarse para la clonación y/o para la expresión de las moléculas de unión humanas y pueden incluso usarse para fines de terapia génica. También se divulgan vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico según la invención unidas operativamente a una o más moléculas de ácido nucleico que regulan la expresión. La elección del vector depende de los procedimientos recombinantes seguidos y del huésped usado. La introducción de vectores en células huésped puede realizarse, entre otros, mediante transfección con fosfato de calcio, infección con virus, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección con lipofectamina o electroporación. Los vectores pueden replicarse de manera autónoma o pueden replicarse junto con el cromosoma en el que se han integrado. Preferiblemente, los vectores contienen uno o más marcadores de selección. La elección de los marcadores puede depender de las células huésped de elección, aunque esto no es crítico para la invención tal como conocen bien los expertos en la técnica. Incluyen, pero no se limitan a, kanamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeocina, gen de timidina cinasa del virus del herpes simple (HSV-TK), el gen de la dihidrofolato reductasa de ratón (dhfr). La invención también cubre vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para las moléculas de unión humanas tal como se describió anteriormente unidas operativamente a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas o péptidos que pueden usarse para aislar las moléculas de unión. Estas proteínas o péptidos incluyen, pero no se limitan a, glutatión-S-transferasa, proteína de unión a maltosa, polihistidina de unión a metales, proteína fluorescente verde, luciferasa y beta-galactosidasa.

Un objeto adicional de la divulgación son huéspedes que contienen una o más copias de los vectores mencionados anteriormente. Preferiblemente, los huéspedes son células huésped. Las células huésped incluyen, pero no se limitan a, células de origen mamífero, vegetal, de insecto, fúngico o bacteriano. Las células bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células de bacterias Gram positivas tales como varias especies de los géneros Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus o células de bacterias Gram negativas tales como varias especies de los géneros Escherichia, tales como E. coli, y Pseudomonas. En el grupo de las células fúngicas, preferiblemente se usan células de levadura. La expresión en levaduras puede lograrse usando cepas de levadura tales como entre otras Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y Hansenula polymorpha. Además, pueden usarse como células huésped células de insecto tales como células de Drosophila y Sf9. Además de esto, las células huésped pueden ser células vegetales. Las plantas o células vegetales transformadas (transgénicas) se producen mediante métodos conocidos, por ejemplo, transferencia génica mediada por Agrobacterium, transformación de discos de las hojas, transformación de protoplastos mediante transferencia de ADN inducida por polietilenglicol, electroporación, sonicación, microinyección o transferencia génica balística. Adicionalmente, un sistema de expresión adecuado puede ser un sistema de baculovirus En la presente invención se prefieren sistemas de expresión que usan células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células BHK o células de melanoma de Bowes. Las células de mamífero proporcionan proteínas expresadas con modificaciones tras la traducción que son muy similares a las moléculas naturales de origen mamífero. Puesto que la presente invención trata de moléculas que pueden tener que administrarse a seres humanos, un sistema de expresión completamente humano sería particularmente preferido. Por tanto, incluso más preferiblemente, las células huésped son células humanas. Ejemplos de células humanas son, entre otras, células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 y HEK293T. Células de mamífero preferidas son células de retina humana tales como células 911 o la línea celular depositada en la Colección europea de cultivos celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6® (PER.C6 es una marca registrada de Crucell Holland B.V.). Para los fines de esta solicitud “PER.C6” se refiere a células depositadas con el número 96022940 o ancestros, pasos hacia delante o hacia atrás así como descendientes de ancestros de células depositadas, sí como derivados de cualquiera de los anteriores.

Las células productoras humanas pueden comprender al menos una parte funcional de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región E1 de adenovirus en formato que puede expresarse. Dichas células huésped se derivan de una retina humana y están inmortalizadas con ácidos nucleicos que comprenden secuencias E1 adenovirales, tales como la línea celular depositada en la Colección europea de cultivos celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6® (PER.C6 es una marca registrada de Crucell Holland B.V.). La producción de proteínas recombinantes en células huésped puede realizarse según métodos bien conocidos en la técnica. El uso de las células comercializadas con la marca PER.C6® como plataforma de producción para proteínas de interés se ha descrito en el documento WO 00/63403.

Un método de producción de una molécula de unión o una variante funcional según la invención es una parte adicional de la divulgación. El método comprende las etapas de a) cultivar un huésped en condiciones que conducen a la expresión de la molécula de unión o variante funcional de la misma, y b) opcionalmente recuperar la molécula de unión o variante funcional de la misma expresadas. Las moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas expresadas pueden recuperarse del extracto libre de células, pero preferiblemente se recuperan del medio de cultivo. El experto en la técnica conoce bien métodos para recuperar proteínas, tales como moléculas de unión, a partir de extractos libres de células o medio de cultivo.

Alternativamente, además de la expresión en huéspedes, tales como células huésped, las moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas pueden producirse de manera sintética mediante sintetizadores peptídicos convencionales o en sistemas de traducción libres de células usando ácido nucleico de ARN derivado de moléculas de ADN.

En otra realización, las moléculas de unión o variantes funcionales de las mismas pueden generarse mediante mamíferos no humanos transgénicos, tales como por ejemplo ratones o conejos transgénicos, que expresan genes de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, los mamíferos no humanos transgénicos tienen un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana que codifican para todas o una parte de las moléculas de unión humanas tal como se describió anteriormente. Los mamíferos no humanos transgénicos pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida del virus de la rabia o un fragmento del mismo. Los protocolos para inmunizar mamíferos no humanos están bien establecidos en la técnica. Véase Using Antibodies: A Laboratory Manual, editado por: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York y Current Protocols in Immunology, editado por: J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., Nueva York.

La presente invención proporciona un método de identificación de moléculas de unión tales como anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de los mismos o ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 1. La etapa de selección puede llevarse a cabo en la presencia de virus de la rabia. El virus de la rabia puede estar aislado o no aislado, por ejemplo, presente en el suero y/o de la sangre de un individuo infectado. En otra forma de realización el virus de la rabia está inactivado. Alternativamente, la etapa de selección se puede realizar en la presencia de un fragmento de virus de la rabia tales como una parte extracelular del virus de la rabia, uno o más (poli) péptidos derivados de virus de la rabia tales como la proteína G, proteínas de fusión que comprenden estas proteínas o (poli) péptidos, y similares. En otra realización, las células transfectadas con la proteína G del virus de la rabia se utilizan para los procedimientos de selección.

Una vez que un nuevo anticuerpo monoclonal se ha establecido o identificado con el método mencionado para la identificación de moléculas de unión o moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de unión, el ADN que codifica el scFv o Fab se puede aislar de la bacteria o paquetes genéticos replicables y se puede combinar con técnicas estándar de biología molecular para hacer construcciones que codifican scFv bivalentes o inmunoglobulinas humanos completos de una especificidad deseada (por ejemplo, IgG, IgA o IgM). Estas construcciones pueden ser transfectadas en líneas celulares adecuadas y anticuerpos monoclonales humanos completos pueden ser producidos (ver Hüls et al, 1999;. Boel et al, 2000).

Un paquete genético replicable, tal y como se usa en este documento, puede ser procariota o eucariota, e incluye células, esporas, bacterias, virus, (bacterió)fagos y polisomas. Un paquete genético replicable preferido es un fago. Las moléculas de unión humanas, tales como, por ejemplo, Fv de cadena sencilla, se muestran en el paquete genético replicable, es decir, están unidos a un grupo o una molécula situada en una superficie exterior del paquete genético replicable. El paquete genético replicable es una unidad detectable que comprende una molécula de unión humana a ser detectada ligada a una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de unión. La molécula de ácido nucleico debe ser replicable ya sea in vivo (por ejemplo, como un vector) o in vitro (por ejemplo, por PCR, transcripción y traducción). La replicación in vivo puede ser autónoma (como para una célula), con la ayuda de factores del huésped (como para un virus) o con la ayuda de huésped y virus auxiliar (como para un fagémido). Los paquetes genéticos replicables que muestran una colección de moléculas de unión humanas se forman mediante la introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas de unión exógenas a ser mostradas en los genomas de los paquetes genéticos replicables, para formar proteínas de fusión con proteínas endógenas que normalmente se expresan de la superficie exterior de la replicable paquetes genéticos. La expresión de las proteínas de fusión, el transporte a la superficie exterior y el ensamblaje resulta en una presentación de moléculas de unión exógenas desde la superficie exterior de los paquetes genéticos replicables. En un aspecto adicional, la invención se

refiere a una molécula de unión humana capaz de unirse al virus de la rabia o a un fragmento del mismo y siendo obtenible por el método de identificación como se describió anteriormente.

En aún un aspecto adicional, la invención se relaciona con un método de identificación de una molécula de unión que potencialmente tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia, en donde el método comprende las etapas de (a) poner en contacto una colección de moléculas de unión en la superficie de paquetes genéticos replicables con el virus de la rabia en condiciones que conducen a la unión, (b) separar y recuperar moléculas de unión que se unen al virus de la rabia de moléculas de unión que no se unen, (c) aislar al menos una molécula de unión recuperada, (d) verificar si la molécula de unión aislada tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia, caracterizado porque el virus de la rabia en la etapa a se inactiva. El virus de la rabia inactivado puede purificarse antes de ser inactivado. La purificación puede llevarse a cabo por medio de métodos de purificación bien conocidos adecuados para virus tales como, por ejemplo, centrifugación a través de un cojín de glicerol. El virus de la rabia inactivado en la etapa a se puede inmovilizar a un material adecuado antes de su uso. Alternativamente, el virus de la rabia en la etapa a puede estar aún activo. En otra forma de realización alternativa, un fragmento de un virus de la rabia, tal como un polipéptido de un virus de la rabia como la proteína G, se utiliza en la etapa a. En otra realización, las células transfectadas con la proteína G del virus de la rabia se utilizan para seleccionar molécula de unión que potencialmente puede tener actividad neutralizante contra el virus de la rabia. Como se indica en este documento, cuando las células que expresan la proteína G del virus de la rabia se incluyeron en el método de selección, el número de anticuerpos neutralizantes seleccionados fue mayor en comparación con los métodos de selección en el que sólo se utilizó proteína G del virus de la rabia purificada y/o virus de la rabia inactivado.

De acuerdo con la invención, el método de identificación de una molécula de unión que potencialmente tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia como se ha descrito anteriormente comprende además la etapa de separar y recuperar, y opcionalmente aislar, las moléculas de unión humanas que contienen un gen de la línea germinal pesada variable 3-30. Un experto en la técnica puede identificar el gen de la línea germinal específica por métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, la secuenciación de nucleótidos. El paso de separar y recuperar moléculas de unión que contienen un gen de la línea germinal pesada variable 3-30 se puede realizar antes o después de la etapa c. Como se indica debajo, la mayoría de anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan virus de la rabia que se han encontrado en la presente invención comprende este gen de VH de línea germinal específico.

Métodos de presentación en fagos para la identificación y obtención de moléculas de unión (neutralizantes), por ejemplo, anticuerpos, son por ahora métodos bien establecidos conocidos por el experto en la técnica. Están, por ejemplo, descritos en la patente en EE.UU. número 5.696.108; Burton y Barbas, 1994; de Kruif et al, 1995b; y Phage Display: A Laboratory Manual. Editado por: CF Barbas, RD Burton, JK Scott y GJ Silverman (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.

Para la construcción de bibliotecas de presentación en fagos, colecciones de genes de región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos monoclonales humanos se expresan en la superficie del bacteriófago, preferiblemente bacteriófago filamentoso, partículas, por ejemplo en formato Fv de cadena sencilla (scFv) o Fab (véase de Kruif et al., 1995b). Las bibliotecas grandes de de fagos que expresan fragmentos de anticuerpo contienen normalmente más de 1,0 * 109 especificidades de anticuerpos y pueden ser ensambladas a partir de las regiones V de inmunoglobulina expresadas en los linfocitos B de individuos inmunizados o no inmunizados. En una forma de realización específica de la invención, la librería de fagos de moléculas de unión humanas, preferiblemente de la biblioteca de fagos scFv, se prepara a partir de ARN aislado a partir de células obtenidas de un sujeto que ha sido vacunado contra la rabia o expuesto a un virus de la rabia. El ARN se puede aislar a partir de, entre otros, médula ósea o sangre periférica, preferiblemente linfocitos de sangre periférica. El sujeto puede ser un animal vacunado o expuesto al virus de la rabia, pero es preferiblemente un sujeto humano que ha sido vacunado o se ha expuesto al virus de la rabia. Preferiblemente, el ser humano ha sido vacunado. Una colección de moléculas de unión humanas en la superficie de paquetes genéticos replicables, tal como una biblioteca de fagos scFv, como se describió anteriormente es otro aspecto de la presente invención.

Alternativamente, las librerías de presentación de fagos pueden ser construidas a partir de regiones variables de inmunoglobulina que han sido parcialmente ensambladas in vitro para introducir la diversidad de anticuerpos adicional en la librería (librerías semi-sintéticas). Por ejemplo, regiones variables ensambladas in vitro contienen tramos de ADN producido sintéticamente, al azar o parcialmente al azar en aquellas regiones de las moléculas que son importantes para la especificidad del anticuerpo, por ejemplo, las regiones CDR. Fagos de anticuerpos específicos del virus de la rabia pueden ser seleccionados de las librerías mediante la inmovilización antígenos diana, tales como antígenos de virus de la rabia, en una fase sólida y, posteriormente, la exposición de los antígenos diana a una librería de fago para permitir la unión de los fagos que expresan fragmentos de anticuerpos específicos para el(los) antígeno(s) unido(s) a la fase sólida. Los fagos no unidos se eliminan mediante lavado y los fagos unidos se eluyen de la fase sólida para la infección de bacterias de Escherichia coli (E. coli) y la posterior propagación. Suelen ser necesarias múltiples rondas de selección y propagación para enriquecer suficientemente para fagos que se unen específicamente al (a los) antígeno(s) diana. Si se desea, antes de exponer la librería de fagos a los antígenos diana, la librería de fagos puede ser primero sustraída mediante la exposición de la librería de fagos a los antígenos que no son diana unidos a una fase sólida. Los fagos también se pueden seleccionar para unirse a antígenos complejos, tales como mezclas complejas de proteínas de virus de la rabia o (poli)péptidos, células

huésped que expresan una o más proteínas del virus de la rabia o (poli)péptidos del virus de la rabia, o el virus de la rabia (inactivado) en sí. Se pueden seleccionar de la librería anticuerpos de fagos específicos de antígenos mediante la incubación de una fase sólida, con una preparación de virus de la rabia inactivado unida a la misma, con la librería de anticuerpos de fago para permitir, por ejemplo, que la parte de scFv o Fab del fago se una a las proteínas/polipéptidos de la preparación de virus de la rabia. Después de la incubación y de varios lavados para eliminar los fagos sin unir y los poco adheridos, los fagos que se han unido con su parte scFv o Fab a la preparación se eluyen y se utilizan para infectar Escherichia coli para permitir la amplificación de la nueva especificidad. Por lo general, se requieren una o más rondas de selección para separar los fagos de interés del gran exceso de fagos que no se unen. Alternativamente, las proteínas o (poli)péptidos conocidos del virus de la rabia pueden ser expresados en células huésped y estas células se pueden utilizar para la selección de anticuerpos de fagos específicos para las proteínas o (poli)péptidos. Un método de presentación en fagos que utiliza estas células huésped puede ser ampliado y mejorado mediante la sustracción de moléculas de unión no relevantes durante el cribado por la adición de un exceso de células huésped que no comprenden moléculas diana o comprenden moléculas no diana que son similares, pero no idénticas, a la diana, y de ese modo mejorar fuertemente la probabilidad de encontrar moléculas de unión relevantes (Este proceso se conoce como el proceso de MAbstract®. MAbstract® es una marca registrada de Crucell Holland BV, véase también la Patente de EE.UU. Número 6.265.150).

Las moléculas de unión o composiciones farmacéuticas de la invención pueden someterse a prueba en sistemas de modelos animales adecuados antes de su uso en seres humanos. Tales sistemas de modelos animales incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, hámsteres, monos, etc.

Las moléculas o composiciones mencionadas anteriormente pueden emplearse junto con otras moléculas útiles en el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento del virus de la rabia. Pueden usarse in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, las moléculas de unión humanas, variantes funcionales, inmunoconjugados o composiciones farmacéuticas pueden administrarse conjuntamente con una vacuna frente a la rabia. Alternativamente, la vacuna también puede administrarse antes o después de la administración de las moléculas o composiciones. La administración de las moléculas o composiciones con una vacuna es adecuada para la profilaxis tras la exposición. Las vacunas de la rabia incluyen, pero no se limitan a, vacuna de células embrionarias de pollo purificadas (PCEC) (RabAvert), vacuna de células diploides humanas (HDCV; vacuna Imovax) o vacuna para la rabia adsorbida (RVA).

Las moléculas se formulan normalmente en las composiciones y composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad terapéuticamente eficaz o eficaz para diagnóstico. Pueden ajustarse los regímenes de dosificación para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Un intervalo de dosificación adecuado puede ser por ejemplo de 0,1-100 UI/kg de peso corporal, preferiblemente 1,0-50 UI/kg de peso corporal y más preferiblemente 10-30 UI/kg de peso corporal, tal como 20 UI/kg de peso corporal.

Preferiblemente, se administra un único bolo de las moléculas de unión o composiciones farmacéuticas. Las moléculas y composiciones farmacéuticas son preferiblemente estériles. En la técnica se conocen bien métodos para hacer que estas moléculas y composiciones sean estériles. El régimen de dosificación de profilaxis tras la exposición es la administración de cinco dosis de vacuna para la rabia por vía intramuscular en el músculo deltoides en los días 0, 3, 7, 14 y 28 tras la exposición en individuos no inmunizados previamente frente al virus de la rabia. Las moléculas de unión humanas o composiciones farmacéuticas deben administrarse en y alrededor de las heridas en el día 0 o de lo contrario lo antes posible tras la exposición, administrándose el resto del volumen por vía intramuscular en un sitio distante de la vacuna. Se aconseja a los individuos no vacunados que se administren moléculas de unión humanas anti-virus de la rabia, pero queda claro que también pueden administrarse moléculas de unión humanas anti-virus de la rabia al experto en la técnica que vacunó a los individuos que necesitaban tal tratamiento.

Las moléculas de unión pueden usarse para identificar epítopos de proteínas de virus de la rabia tales como la proteína G. Los epítopos pueden ser lineales, pero también estructurales y/o conformacionales. En una realización, la unión de moléculas de unión de la invención a una serie de péptidos solapantes, tales como péptidos de 15 meros, de una proteína de virus de la rabia tales como la proteína G de virus de la rabia puede analizarse por medio de análisis de PEPSCAN (véase entre otros los documentos WO 84/03564, WO 93/09872, Slootstra et al. 1996). Puede someterse a prueba la unión de moléculas de unión humanas a cada péptido en un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) basado en PEPSCAN. En otra realización, puede examinarse una biblioteca de péptidos al azar que comprende péptidos de proteínas de virus de la rabia para seleccionar péptidos que pueden unirse a las moléculas de unión humanas de la invención. En los ensayos anteriores, el uso de moléculas de unión humanas neutralizantes del virus de la rabia puede identificar uno o más epítopos neutralizantes. Los péptidos/epítopos encontrados pueden usarse como vacunas y para el diagnóstico de la rabia.

EJEMPLOS

Para ilustrar la invención, se proporcionan los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Reconocimiento de epítopo de anticuerpos humanos CR-57 y CR-JB anti-rabia

Para tratar si los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR-57 y CR-JB reconocen epítopos no solapantes, no competitivos, se generaron virus de escape de los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR-57 y CR-JB. CR-57 y CR-JB se generaron esencialmente tal como se describe (véase Jones et al., 2003), mediante introducción de las regiones codificantes de cadena ligera y pesada variable de los genes de anticuerpo correspondientes en un único vector de expresión de IgG1 humana denominado pcDNA3002(Neo). Se usaron los vectores resultantes pgSO57C11 y pgSOJBC1 para la expresión transitoria en células a partir de la línea celular depositada en la Colección europea de cultivos celulares(ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6®. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de estos anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 122 -129, respectivamente. Se incubaron diluciones en serie (0,5 ml) de la cepa CVS-11 del virus de la rabia (diluciones que oscilaban desde 10-1 -10-8) con una cantidad constante (~4 UI/ml) de anticuerpo CR-57 o CR-JB (0,5 ml) durante 1 hora a 37ºC/5% de CO2 antes de la adición a pocillos que contenían células de neuroblastoma de ratón (células MNA) o células BSR (línea celular similar a riñón de cría de hámster). Tras 3 días de selección en presencia de anticuerpo monoclonal humano o bien CR-57 o bien CR-JB, se recogió medio (1 ml) que contenía posibles virus de escape y se almacenó a 4ºC hasta su uso adicional. Posteriormente, se fijaron las células en acetona durante 20 minutos a 4ºC, y se tiñeron durante la noche a 37ºC/5% de CO2 con conjugado de anticuerpo anti-rabia con N-FITC (Centocor). Se puntuó el número de focos por pocillos mediante inmunofluorescencia y se eligió el medio de pocillos que contenían de uno a seis focos para la amplificación del virus. Todos los virus de escape E57 se generaron a partir de 1 único foco con la excepción de E57B1 (3 focos). Se aislaron los virus de escape EJB a partir de 1 foco (EJB3F), 3 focos (EJB2B), 4 focos (EJB2C), 5 focos (EJB2E, 2F), o 6 focos (EJB2D), respectivamente. Cada virus de escape se amplificó en cebador lugar a pequeña escala en células BSR o MNA dependiendo de sus características de crecimiento. Entonces se usaron estos pequeños lotes de virus para amplificar adicionalmente el virus a una gran escala en células MNA o BSR. Entonces se tituló el virus amplificado en células MNA para determinar el título de cada lote de virus de escape así como la dilución óptima del virus de escape (que proporciona un 80-100% de infección tras 24 horas) para su uso en un ensayo de neutralización de virus.

Se realizaron ensayos de RFFIT modificada (prueba de inhibición con foco fluorescente rápida) para examinar la protección cruzada de E57 (los virus de escape de CR-57) y EJB (los virus de escape de CR-JB) con CR-JB y CR57, respectivamente. Por tanto, se diluyó CR-57 o CR-JB mediante diluciones triples en serie comenzando con una dilución 1:5. Se añadió virus de la rabia (cepa CVS-11) a cada dilución a una concentración que proporciona un 80100% de infección. Se incubó una mezcla de virus/IgG durante 1 hora a 37ºC/ 5% de CO2 antes de la adición a células MNA. 24 horas tras la infección (a 34ºC/5% de CO2) se fijaron las células en acetona durante 20 minutos a 4ºC, y se tiñeron durante un mínimo de 3 horas con un conjugado de anticuerpo anti-virus de la rabia con N-FITC (Centocor). Entonces se analizaron los pocillos para detectar infección por virus de la rabia con un microscopio de fluorescencia para determinar la dilución de criterio de valoración del 50%. Esta es la dilución a la que la infección por virus se bloquea en un 50% en este ensayo. Para calcular la potencia, se incluyó un patrón internacional (lote de inmunoglobulina de la rabia R3, material de referencia del laboratorio de patrones y ensayos DMPQ/CBER/FDA) en cada RFFIT modificada. La dilución de criterio de valoración del 50% de este patrón corresponde a una potencia de 2 UI/ml. Se sometió a prueba la potencia neutralizante de los anticuerpos monoclonales humanos individuales CR57 y CR-JB así como la combinación de estos anticuerpos.

Los virus EJB ya no se neutralizaban por CR-JB o CR-57 (véase la tabla 1), lo que sugiere que ambos anticuerpos se unen a, e inducen cambios de aminoácido en, regiones similares de la glicoproteína del virus de la rabia. Los virus E57 ya no se neutralizaban por CR-57, mientras que 4 de cada 6 virus E57 todavía se neutralizaban por CR-JB, aunque con una potencia inferior (véase la tabla 1). Una mezcla de los anticuerpos CR-57 y CR-JB (en una razón de 1:1 UI/mg) dio resultados similares a los observados con los anticuerpos individuales (datos no mostrados).

Para identificar posibles mutaciones en la glicoproteína del virus de la rabia se determinó la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) de la glicoproteína de cada uno de los virus de escape EJB y E57. Se aisló ARN viral de cada uno de los virus de escape y CVS-11 a partir de células MNA infectadas por virus y se convirtió en ADNc mediante RT-PCR convencional. Posteriormente, se usó ADNc para la secuenciación de nucleótidos de ORF de la glicoproteína del virus de la rabia con el fin de identificar mutaciones.

Los virus de escape tanto E57 como EJB mostraron mutaciones en la misma región de la glicoproteína (véanse las figuras 1 y 2, respectivamente; véanse para todas las secuencias descritas en las figuras 1 y 2 SEQ ID NO: 130 151). Esto indica que ambos anticuerpos reconocen epítopos solapantes. A partir de lo anterior puede concluirse que la combinación de CR-57 y CRJB en un cóctel no previene el escape de variantes resistentes a la neutralización y por tanto no es una preparación de inmunoglobulinas ideal para la profilaxis tras la exposición a la rabia.

Ejemplo 2

Construcción de una biblioteca de presentación en fagos de ScFv usando linfocitos de sangre periférica de donantes vacunados contra la rabia.

A partir de cuatro sujetos humanos vacunados contra la rabia se extrajeron 50 ml de sangre a partir de una vena una semana tras el último refuerzo. Se aislaron linfocitos de sangre periférica (PBL) a partir de estas muestras de sangre usando fraccionamiento por densidad celular en Ficoll. Se guardó el suero sanguíneo y se congeló a -20ºC. Se

obtuvo un resultado positivo en la prueba para determinar la presencia de anticuerpos anti-rabia en los sueros usando una tinción de FACS con células 293T transfectadas con glicoproteína del virus de la rabia. Se preparó ARN total a partir de los PBL usando separación de fase orgánica (TRIZOL™) y posterior precipitación con etanol. Se disolvió el ARN obtenido en agua ultrapura tratada con DEPC y se determinó la concentración mediante medición de DO a 260 nm. Posteriormente, se diluyó el ARN hasta una concentración de 100 ng/!l. A continuación, se convirtió 1 !g de ARN en ADNc de la siguiente manera: a 10 !l de ARN total, se le añadieron 13 !l de agua ultrapura tratada con DEPC y 1 !l de hexámeros al azar (500 ng/!l) y se calentó la mezcla obtenida a 65ºC durante 5 minutos y se enfrió rápidamente en hielo húmedo. Después, se añadieron a la mezcla 8 !l de 5X tampón First-Strand, 2 !l de dNTP (10 mM cada uno), 2 !l de DTT (0,1 M), 2 !l de inhibidor de ARNasa (40 U/ml) y 2 !l de transcriptasa inversa de MMLV Superscript™III (200 U/ml), se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se incubó durante 1 hora a 50ºC. Se terminó la reacción mediante inactivación por calor, es decir, incubando la mezcla durante 15 minutos a 75ºC.

Se diluyeron los productos de ADNc obtenidos hasta un volumen final de 200 !l con agua ultrapura tratada con DEPC. La DO a 260 nm de una disolución diluida 50 veces (en tampón Tris 10 mM) de la dilución de los productos de ADNc obtenidos dio un valor de 0,1.

Para cada donante se usaron de 5 a 10 !l de los productos de ADNc diluidos como molde para la amplificación por PCR de las secuencias de cadena ligera lambda o kappa y la familia de cadena pesada de inmunoglobulina gamma usando cebadores oligonucleotídicos específicos (véanse las tablas 2-7). Las mezclas de reacción de PCR contenían, además de los productos de ADNc diluidos, 25 pmol de cebador sentido y 25 pmol de cebador antisentido en un volumen final de 50 !l de Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, dNTP 250 mM y 1,25 unidades de Taq polimerasa. En un ciclador térmico de tapa calentada que tenía una temperatura de 96ºC, se fundieron rápidamente las mezclas obtenidas durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos de: 30 segundos a 96ºC, 30 segundos a 60ºC y 60 segundos a 72ºC.

En una primera ronda de amplificación, se combinaron cada uno de diecisiete cebadores sentido de región variable de cadena ligera (once para la cadena ligera lambda (véase la tabla 2) y seis para la cadena ligera kappa (véase la tabla 3) con un cebador antisentido que reconocía la región constante de C-kappa denominado HuCk 5’-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3’ (véase SEQ ID NO: 152) o de C-lambda HuC∀2 5’-TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3’ (véase SEQ ID NO: 153) y HuC∀7 5’-AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3’ (véase SEQ ID NO: 154) (los cebadores antisentido HuC∀2 y HuC∀7 se mezclaron hasta equimolaridad antes de su uso), proporcionando 4 multiplicado por 17 productos de aproximadamente 600 pares de bases. Estos productos se purificaron en un gel de agarosa al 2% y se aislaron del gel usando columnas de extracción en gel de Qiagen. Se usó 1/10 de cada uno de los productos aislados en una reacción de PCR idéntica a la descrita anteriormente usando los mismos diecisiete cebadores sentido, mediante lo cual se combinó cada cebador sentido de cadena ligera lambda con uno de los tres cebadores antisentido específicos de región J-lambda y cada cebador sentido de cadena ligera kappa se combinó con uno de los cinco cebadores antisentido específicos de región J-kappa. Los cebadores usados en la segunda amplificación se extendieron con sitios de restricción (véase la tabla 4) para permitir la clonación directa en el vector de presentación en fagos PDV-C06 (véase la figura 3 y SEQ ID NO: 155). Esto dio como resultado 4 multiplicado por 63 productos de aproximadamente 350 pares de bases que se combinaron para dar un total de 10 fracciones. Se eligió este número de fracciones para mantener la distribución natural de las diferentes familias de cadenas ligeras dentro de la biblioteca y no representar en exceso o en defecto determinadas familias. Se usó el número de alelos dentro de una familia para determinar el porcentaje de representación dentro de una biblioteca (véase la tabla 5). En la siguiente etapa, se digirieron 2,5 !g de fracción combinada y 100 !g de vector PDV-C06 con SalI y NotI y se purificaron a partir de gel. Posteriormente, se realizó la ligación durante la noche a 16ºC de la siguiente manera. A 500 ng de vector PDV-C06 se le añadieron 70 ng de fracción combinada en un volumen total de 50 !l de mezcla de ligación que contenían Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, BSA 25 !g/ml y ADN ligasa de T4 2,5 !l (400 U/!l). Se siguió este procedimiento para cada fracción combinada. Se purificaron las mezclas de ligación mediante fenol/cloroformo, seguido por una extracción en cloroformo y precipitación en etanol, métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Se disolvió el ADN obtenido en 50 !l de agua ultrapura y se sometieron a electroporación dos alícuotas de 2,5 !l por mezcla de ligación en 40 !l de bacterias E. coli competentes para TG1 según el protocolo del fabricante (Stratagene). Se hicieron crecer los transformantes durante la noche a 37ºC en un total de 30 placas (tres placas por fracción combinada; tamaño de la placa: 240 mm x 240 mm) que contenían agar 2TY complementado con ampicilina 50 !g/ml y un 4,5% de glucosa. Se obtuvo una (sub)biblioteca de regiones de cadena ligera variables raspando los transformantes de las placas de agar. Esta (sub)biblioteca se usó directamente para la preparación de ADN de plásmido usando un kit de preparación QIAFilter MAXI de Qiagen™.

Para cada donante se amplificaron las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada a partir de las mismas preparaciones de ADNc en un procedimiento de PCR de dos rondas similar y parámetros de reacción idénticos a los descritos anteriormente para las regiones de cadena ligera con la condición de que se usaron los cebadores representados en las tablas 6 y 7. La primera amplificación se realizó usando un conjunto de nueve cebadores dirigidos sentido (véase la tabla 6; que cubre todas las familias de regiones variables de cadena pesada) cada uno combinado con un cebador antisentido de región constante específico de IgG denominado HuCIgG 5’-GTC CAC

CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3’ (SEQ ID NO: 156) proporcionando cuatro multiplicado por nueve productos de aproximadamente 650 pares de bases. Estos productos se purificaron en un gel de agarosa al 2% y se aislaron del gel usando columnas de extracción en gel de Qiagen. Se usaron 1/10 de cada uno de los productos aislados en una reacción de PCR idéntica a la descrita anteriormente usando los mismos nueve cebadores sentido, mediante lo cual se combinó cada cebador sentido de cadena pesada con uno de los cuatro cebadores antisentido específicos de región JH. Los cebadores usados en la segunda ronda se extendieron con sitios de restricción (véase la tabla 7) para permitir la clonación dirigida en el vector de (sub)biblioteca de cadena ligera. Esto dio como resultado por donante 36 productos de aproximadamente 350 pares de bases. Se combinaron estos productos para cada donante por cebador sentido (VH) usado en nueve fracciones. Se purificaron los productos obtenidos usando columnas de purificación de PCR de Qiagen. A continuación, se digirieron las fracciones con SfiI y XhoI y se ligaron en el vector de (sub)biblioteca de cadena ligera, que se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de ligación y volúmenes a los descritos anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera. Alternativamente, se digirieron las fracciones con NcoI y XhoI y se ligaron en el vector de cadena ligera, que se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de ligación y volúmenes a los descritos anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera. La ligación, purificación y posterior transformación de la biblioteca definitiva resultante también se realizaron tal como se describió anteriormente para la (sub)biblioteca de cadena ligera y en este punto se combinaron las mezclas de ligación de cada donante por combinación de VH. Se hicieron crecer los transformantes en 27 placas (tres placas por fracción combinada; tamaño de la placa: 240 mm x 240 mm) que contenían agar 2TY complementado con ampicilina 50 !g/ml y un 4,5% de glucosa. Se recogieron todas las bacterias en medio de cultivo 2TY que contenía ampicilina 50 !g/ml y un 4,5% de glucosa, se mezclaron con glicerol hasta el 15% (v/v) y se congelaron en alícuotas de 1,5 ml a -80ºC. Se realizaron el rescate y la selección de cada biblioteca tal como se describe a continuación.

Ejemplo 3

Selección de fagos que llevan fragmentos Fv monocatenarios que reconocen específicamente glicoproteína del virus de la rabia

Se seleccionaron fragmentos de anticuerpo usando bibliotecas de presentación en fagos de anticuerpo, tecnología de presentación en fagos general y tecnología MAbstract®, esencialmente tal como se describe en la patente estadounidense n.º 6.265.150 y en el documento WO98/15833. Las bibliotecas de fagos de anticuerpo usadas fueron dos bibliotecas de fagos scFv semisintéticas diferentes (JK1994 y WT2000) y las bibliotecas de fago scFv inmunitario (RAB-03-G01 y RAB-04-G01) preparadas tal como se describió en el ejemplo 2 anterior. La primera biblioteca de fagos scFv semisintética (JK1994) se ha descrito en de Kruif et al. (1995b), la segunda (WT2000) se construyó esencialmente tal como se describe en de Kruif et al. (1995b). En resumen, la biblioteca tiene un formato semisintético mediante lo cual se incorporó variación en los genes V de cadena ligera y pesada usando oligonucleótidos degenerados que incorporan variación dentro de las regiones CDR. Sólo se usaron genes de cadena pesada VH3, en combinación con genes de cadena ligera kappa y lambda. Se recrearon sintéticamente CDR1 y CDR3 de la cadena pesada y CDR3 de la cadena ligera en un enfoque basado en PCR similar al descrito en de Kruif et al. (1995b). Se clonaron secuencialmente los genes de región V así creados en un formato de scFv en un vector fagémido y se amplificaron para generar una biblioteca de fagos tal como se describió anteriormente. Además, se usaron los métodos y fagos cooperadores res descritos en el documento WO02/103012 (incorporado como referencia al presente documento) en la presente invención. Para identificar anticuerpos de fagos que reconocían la glicoproteína del virus de la rabia, se realizaron experimentos de selección de fagos usando virus de la rabia completo (cepa Pitman-Moore del virus de la rabia) inactivado mediante tratamiento con beta-propiolactona, glicoproteína del virus de la rabia purificada (cepa ERA del virus de la rabia), y/o células transfectadas que expresaban proteína G del virus de la rabia (cepa ERA del virus de la rabia).

La proteína G se purificó a partir de la cepa ERA del virus de la rabia de la siguiente manera. A una disolución de virus, se le añadió 1/10 en volumen de octil-beta-glucopiranósido al 10% y se mezcló suavemente. Tras una incubación de 30 minutos a 4ºC se centrifugó la muestra de virus (36.000 rpm, 4ºC) en un rotor SW51. Se recogió el sobrenadante y se dializó durante la noche a 4ºC frente a Tris/EDTA 0,1 M. Posteriormente, se recogió la glicoproteína de la cámara de diálisis, se dividió en alícuotas, y se almacenó a -80ºC hasta su uso adicional. Se determinó la concentración de proteína mediante DO a 280 nm y se analizó la integridad de la proteína G mediante SDS-PAGE.

Se diluyeron virus de la rabia inactivado completo o proteína G del virus de la rabia en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se añadieron 2-3 ml a tubos MaxiSorp Nunc-Inmuno (Nunc) y se incubaron durante la noche a 4ºC en un agitador rotativo. Se bloqueó una alícuota de una biblioteca de fagos (500 !l, aproximadamente 1013 ufc, amplificado usando fago cooperador CT (véase el documento WO 02/103012)) en tampón de bloqueo (2% de Protifar en PBS) durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Se añadió la biblioteca de fagos bloqueada al inmunotubo (preincubado o bien con o bien sin scFv de CR-57 para bloquear el epítopo reconocido por CR-57), se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente, y se lavó con tampón de lavado (0,1% de Tween-20 (Serva) en PBS) para eliminar fagos no unidos. Entonces se eluyeron los fagos unidos del antígeno mediante incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente con 1 ml de glicina-HCl 50 mM, pH 2,2. Posteriormente, se mezclaron los fagos eluidos con 0,5 ml de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 para neutralizar el pH. Se usó esta mezcla para infectar 5 ml de cultivo de E. coli XL1-Blue que se había hecho crecer a 37ºC hasta una DO a 600 nm de aproximadamente 0,3. Se

dejó que los fagos infectaran las bacterias XL1-Blue durante 30 minutos a 37ºC. Después se centrifugó la mezcla durante 10 minutos, a 3200*g a temperatura ambiente y se resuspendió el sedimento bacteriano en 0,5 ml de medio de extracto de levadura y 2-triptona (2TY). Se dividió la suspensión bacteriana obtenida en dos placas de agar 2TY complementadas con tetraciclina, ampicilina y glucosa. Tras la incubación durante la noche de las placa a 37ºC, se rasparon las colonias de las placas y se usaron para preparar una biblioteca de fagos enriquecida, esencialmente tal como se describe por De Kruif et al. (1995a) y el documento WO 02/103012. En resumen, se usaron bacterias raspadas para inocular medio 2TY que contenía ampicilina, tetraciclina y glucosa y se hicieron crecer a una temperatura de 37ºC hasta una DO a 600 nm de ∼0,3. Se añadieron fagos cooperadores CT y se dejó que infectaran las bacterias tras lo cual se cambió el medio a 2TY que contenía ampicilina, tetraciclina y kanamicina. Se continuó la incubación durante la noche a 30ºC. Al día siguiente, se retiraron las bacterias del medio 2TY mediante centrifugación tras lo cual se precipitaron los fagos en el medio usando polietilenglicol (PEG) 6000/NaCl. Finalmente, se disolvieron los fagos en 2 ml de PBS con un 1% de albúmina sérica bovina (BSA), se esterilizaron por filtración y se usaron para la siguiente ronda de selección.

También se realizaron selecciones de fagos con células transfectadas con glicoproteína del virus de la rabia. Las células usadas fueron células de la línea celular depositada en la Colección europea de cultivos celulares(ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6®. A continuación en el presente documento se denominan células PER.C6®. En este caso, en primer lugar se añadió la biblioteca de fagos bloqueada (2 ml) a 1*107 células sustractoras (en DMEM/10% de FBS) y se incubaron durante 1 hora a 4ºC en un agitador rotativo. Las células sustractoras fueron células PER.C6® que expresaban el ectodominio de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV) en su superficie fusionado con el dominio citoplásmico y transmembrana del virus de la rabia. Con esta etapa de sustracción se eliminaron de la biblioteca de fagos los fagos que reconocían o bien la glicoproteína de VSV o bien antígenos específicos para células PER.C6®. Se centrífugo la mezcla de fagos/células (5 minutos a 4ºC a 500xg) para eliminar fagos unidos a células, y se añadió el sobrenadante a un tubo nuevo que contenía 3 ml de 1*107 células sustractoras. Se repitió dos veces la etapa de sustracción con el sobrenadante respectivo. Posteriormente, se incubaron los fagos sustraídos durante 1,5 horas a 4ºC en un agitador rotativo con las células transfectadas que expresaban glicoproteína del virus de la rabia (células PER.C6® (3*106 células)). Antes de eso, se preincubaron las células transfectadas o bien con o bien sin scFv de CR-57 para bloquear el epítopo reconocido por CR-57. Tras la incubación se lavaron las células cinco veces con 1 ml de DMEM/10% de FBS (para cada lavado, se resuspendieron las células y se transfirieron a un nuevo tubo), se eluyeron los fagos y se procesaron tal como se describió anteriormente.

Normalmente, se realizaron dos rondas de selecciones antes del aislamiento de anticuerpos de fagos individuales. Tras la segunda ronda de selección, se usaron colonias de E. coli individuales para preparar anticuerpos de fagos monoclonales. Esencialmente, se hicieron crecer colonias individuales hasta la fase logarítmica en un formato de palcas de 96 pocillos y se infectaron con fagos cooperadores VCSM13 tras lo cual se permitió avanzar la producción de anticuerpos de fagos durante la noche. Los anticuerpos de fagos producidos se precipitaron mediante PBG/NaCl y se esterilizaron por filtración y se sometieron a prueba en ELISA para detectar la unión tanto a virus de la rabia inactivado completo como a proteína G de virus de la rabia purificada. A partir de la selección se obtuvo un gran panel de anticuerpos de fagos que demuestra la unión tanto a virus de la rabia inactivado completo como a proteína G de virus de la rabia (véase el ejemplo a continuación). Se siguieron dos estrategias de selección con las bibliotecas inmunitarias descritas anteriormente. En la primera estrategia se seleccionaron 736 anticuerpos de fagos tras dos rondas de selección usando en la primera y la segunda ronda de selección virus inactivado o proteína G purificada. En la segunda estrategia se seleccionaron 736 anticuerpos de fagos tras dos rondas de selección usando en la primera ronda de selección proteína G recombinante expresada en la superficie celular y en la segunda ronda de selección virus inactivado o proteína G purificada. El número de anticuerpos de fagos únicos obtenidos mediante la primera estrategia fue 97, mientras que la segunda estrategia proporcionó 70 únicos. Los 97 anticuerpos de fagos únicos encontrados por medio de la primera estrategia dieron lugar a 18 anticuerpos neutralizantes y los 70 clones únicos identificados por medio de la segunda estrategia proporcionaron 33 anticuerpos neutralizantes. Esto demuestra claramente que las selecciones que incluyeron células transfectadas con glicoproteína del virus de la rabia, es decir proteína G recombinante expresada en la superficie celular, como antígeno parecieron proporcionar más anticuerpos neutralizantes en comparación con selecciones usando sólo proteína G purificada y/o virus inactivado.

Ejemplo 4

Validación de los anticuerpos de fagos monocatenarios específicos para glicoproteína del virus de la rabia.

Los anticuerpos de fagos monocatenarios seleccionados que se obtuvieron a partir de las selecciones descritas anteriormente, se validaron en ELISA para determinar la especificidad, es decir la unión a proteína G de virus de la rabia purificada tal como se describió anteriormente. Adicionalmente, también se sometieron a prueba los anticuerpos de fagos monocatenarios para determinar la unión a FBS al 5%. Para ello, se recubrió la preparación de proteína G de virus de la rabia o FBS al 5% en placas de ELISA Maxisorp™. Tras el recubrimiento, se bloquearon las placas en PBS/1% de Protifar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se incubaron los anticuerpos de fagos monocatenarios seleccionados durante 15 minutos en un volumen igual de PBS/1% de Protifar para obtener anticuerpos de fagos bloqueados. Se vaciaron las placas, y se añadieron los anticuerpos de fagos bloqueados a los

pocillos. Se permitió que la incubación avanzara durante una hora, se lavaron las placas en PBS que contenía un 0,1% de Tween-20 y se detectaron los anticuerpos de fagos unidos (usando medición de DO a 492 nm) usando un anticuerpo anti-M 13 conjugado con peroxidasa. Como control, se realizó simultáneamente el procedimiento sin usar ningún anticuerpo de fago monocatenario, un anticuerpo de fago monocatenario de control negativo dirigido contra CD8 (SC02-007) o un anticuerpo de fago monocatenario de control positivo dirigido contra la glicoproteína del virus de la rabia (scFv SO57). Tal como se muestra en la tabla 8, los anticuerpos de fagos seleccionados denominados SC04-001, SC04-004, SC04-008, SC04-010, SC04-018, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04-040, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04-144, SC04-146 y SC04-164 presentaron unión significativa a la proteína G de virus de la rabia purificada inmovilizada, mientras que no se observó ninguna unión a FBS. Se obtuvieron resultados idénticos en ELISA usando el virus de la rabia inactivado completo tal como se describió anteriormente (datos no mostrados).

Ejemplo 5

Caracterización de scFv específicos del virus de la rabia

A partir de los clones de anticuerpos de fagos monocatenarios específicos seleccionados (scFv) se obtuvo ADN de plásmido y se determinaron secuencias de nucleótidos según técnicas convencionales.

La identidad de genes de VH y VL (véase Tomlinson IM, Williams SC, Ignatovitch O, Corbett SJ, Winter G. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Centre for Protein Engineering (1997)) y composiciones de CDR3 de cadena pesada de los scFv que se unen específicamente a la proteína G de virus de la rabia se representan en la tabla 9.

Ejemplo 6

Neutralización in vitro de virus de la rabia mediante scFv específicos de virus de la rabia (RFFIT modificada)

Con el fin de determinar si los scFv seleccionados podían bloquear la infección por virus de la rabia, se realizaron ensayos de neutralización in vitro (RFFIT modificada). Se diluyeron las preparaciones de scFv mediante diluciones triples en serie comenzando con una dilución 1:5. Se añadió virus de la rabia (cepa CVS-11) a cada dilución a una concentración que proporciona un 80-100% de infección. Se incubó una mezcla de virus/scFv durante 1 hora a 37ºC/5% de CO2 antes de la adición a células MNA. 24 horas tras la infección (a 34ºC/5% de CO2) se fijaron las células en acetona durante 20 minutos a 4ºC, y se tiñeron durante un mínimo de 3 horas con un conjugado de anticuerpo anti-rabia con N-FITC (Centocor). Entonces se analizaron las células para detectar infección por virus de la rabia con un microscopio de fluorescencia para determinar la dilución de criterio de valoración del 50%. Esta es la dilución a la que la infección por virus se bloquea en un 50% en este ensayo (véase el ejemplo 1). Se identificaron varios scFv que mostraron actividad neutralizante contra el virus de la rabia (véase la tabla 10).

Adicionalmente, se investigó por medio del ensayo de neutralización in vitro (RFFIT modificada) tal como se describió anteriormente, si los scFv seleccionados podían neutralizar los virus de escape E57 tal como se prepararon en el ejemplo 1 (E57A2, E57A3, E57B1, E57B2, E57B3 y E57C3). Se identificaron varios scFv que mostraron actividad neutralizante contra a los virus de escape E57 (véanse las tablas 11A y 11B).

Ejemplo 7

ELISA de competición de proteína G de virus de la rabia con scFv

Para identificar anticuerpos que se unían a epítopos no solapantes, no competitivos, se realizó un ELISA de competición con glicoproteína de la rabia. Se recubrieron placas Maxisorp F96 de Nunc-Inmuno™ (Nunc) durante la noche a 4ºC con una dilución 1:1000 de glicoproteína del virus de la rabia purificada (1 mg/ml; cepa ERA del virus de la rabia) en PBS (50 !l). Se eliminó mediante lavado la proteína no recubierta antes de bloquear los pocillos con 100 !l de PBS/1% de Protifar durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se descartó la disolución de bloqueo y se añadieron 50 !l de los scFv anti-virus de la rabia no purificados en PBS/1% de Protifar (diluido dos veces). Se lavaron los pocillos cinco veces con 100 !l de PBS/0,05% de Tween-20. Después, se añadieron 50 !l de IgG competidora biotinilada anti-virus de la rabia, CR-57bio, a cada pocillo, se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se lavaron los pocillos cinco veces con 100 !l de PBS/0,05% de Tween-20. Para detectar la unión de CR-57bio, se añadieron 50 !l de una dilución 1:2000 de estreptavidina-anticuerpo con HRP (Becton Dickinson) a los pocillos y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Volvieron a lavarse los pocillos como anteriormente y se desarrolló adicionalmente el ELISA mediante adición de 100 !l de reactivos OPD (Sigma). Se detuvo la reacción añadiendo 50 !l de H2SO4 1 M antes de medir la DO a 492 nm.

La señal obtenida con CR-57bio solo podía reducirse a niveles basales cuando se coincubaba con scFv SO57, es decir la forma de scFv de CR-57 (para las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de SO57 véanse SEQ ID NO: 205 y 206, respectivamente) o scFv SOJB, es decir la forma de scFv de CR-JB (para las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de SOJB véanse SEQ ID NO: 312 y 313, respectivamente). Esto indica que los scFv SO57 y SOJB compiten con la interacción de CR-57bio con la glicoproteína del virus de la rabia uniéndose al mismo epítopo o a un epítopo solapante al de CR-57bio, respectivamente. En cambio, un scFv irrelevante denominado

SC02-007, es decir un scFv que se une a CD8, no compitió por la unión. Los scFv anti-virus de la rabia denominados SC04-004, SC04-010, SC04-024, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-120, SC04-125, SC04-127, SC04-140, SC04-144 y SC04-146 tampoco compitieron con CR-57bio, lo que indica que estos scFv se unen a un epítopo diferente al epítopo reconocido por CR-57 (véase la figura 4).

Se obtuvieron resultados similares con el siguiente experimento. En primer lugar, se añadió el anticuerpo CR-57 frente al virus de la rabia a pocillos recubiertos con proteína G de virus de la rabia. A continuación, se añadieron los scFv de competición. En esta configuración los scFv anti-virus de la rabia se detectaron con anticuerpo anti-VSV conjugado con HRP en virtud de la presencia de una etiqueta de VSV en las secuencias de aminoácidos de scFv (véase la figura 5).

Ejemplo 8

Construcción de moléculas de inmunoglobulina completamente humanas (anticuerpos monoclonales humanos antivirus de la rabia) a partir de Fv monocatenarios seleccionados anti-virus de la rabia

Regiones variables de cadena ligera y pesada de los scFv denominados SC04-001, SC04-008, SC04-018, SC04040 y SC04-126 se amplificaron mediante PCR usando oligonucleótidos para añadir sitios de restricción y/o secuencias para la expresión en los vectores de expresión de IgG pSyn-C03-HC#1 (véase SEQ ID NO: 277) y pSynC04-C∀ (véase SEQ ID NO: 278), respectivamente. Se amplificaron los genes de VH y VL usando los oligonucleótidos mostrados en las tablas 12 y 13, respectivamente, y se clonaron los productos de PCR en los vectores pSyn-C03-HC#1 y pSyn-C04-C∀, respectivamente.

Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los scFv denominados SC04-004, SC04-010, SC04-021, SC04026, SC04-031, SC04-038, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04120, SC04-125, SC04-140, SC04-144, SC04-146 y SC04-164 también se amplificaron mediante PCR usando oligonucleótidos para añadir sitios de restricción y/o secuencias para la expresión en los vectores de expresión de IgG pSyn-C03-HC#1 y pSyn-C05-C∃ (véase SEQ ID NO: 279), respectivamente. Se amplificaron los genes de VH y VL usando los oligonucleótidos facilitados en las tablas 12 y 13, respectivamente, y se clonaron los productos de PCR en los vectores pSyn-C03-HC#1 y pSyn-C05-C∃, respectivamente. Los oligonucleótidos se diseñan de tal manera que corrigen cualquier desviación de la secuencia de la línea germinal que se haya introducido durante la construcción de la biblioteca, debido al conjunto limitado de oligonucleótidos que se han usado para amplificar el gran repertorio de genes de anticuerpos. Las secuencias de nucleótidos para todos los constructos se verificaron según técnicas convencionales conocidas por el experto en la técnica.

Los constructos de expresión resultantes pgG104-001C03, pgG104-008C03, pgG104-018C03, pgG104-040C03 y pgG104-126C03 que codifican para las cadenas pesadas de IgG1 humana anti-virus de la rabia en combinación con el constructo pSyn-C04-V∀ relevante que codifica para la correspondiente cadena ligera, se expresaron de manera transitoria en células 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contenían anticuerpos IgG1. Los constructos de expresión pgG104-004C03, pgG104-010C03, pgG104-021C03, pgG104-026C03, pgG104-031C03, pgG104038C03, pgG104-060C03, pgG104-073C03, pgG104-097C03, pgG104-098C03, pgG104-103C03, pgG104-104C03, pgG104-108C03, pgG104-120C03, pgG104-125C03, pgG104-140C03, pgG104-144C03, pgG104-146C03 y pgG104-164C03 que codifican para las cadenas pesadas de IgG1 humana anti-virus de la rabia en combinación con el constructo pSyn-C05-V∃ relevante que codifica para la correspondiente cadena ligera, se expresaron de manera transitoria en células 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contenían anticuerpos IgG1.

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos denominados CR04-001, CR04-004, CR04-008, CR04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04-038, CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 y CR04-164 se determinaron según técnicas convencionales. Posteriormente, se purificaron los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes en una columna de proteína A seguido por un intercambio de tampón en una columna de desalación usando métodos de purificación convencionales usados generalmente para inmunoglobulinas (véase por ejemplo el documento WO 00/63403).

Adicionalmente, para CR04-098, se generó un único vector de expresión de IgG1 humana denominado pgG104098C10 tal como se describió anteriormente para los vectores pgSO57C11 y pgSOJBC11 que codifican para CR-57 y CR-JB, respectivamente (véase el ejemplo 1). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de anticuerpo CR04-098 codificado por el vector pgG104-098C10 se muestran en SEQ ID NO: 334 337, respectivamente. Se usaron vectores pgSO57C11 (véase el ejemplo 1) y pgG104-098C10 para la expresión estable de CR-57 y CR04-098, respectivamente, en células a partir de la línea celular depositada en la colección europea de cultivos celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con la marca PER.C6®. Los CR-57 y CR04-098 producidos de manera estable tienen un punto isoeléctrico calculado de 8,22 y 8,46, respectivamente. Los puntos isoeléctricos observados de manera experimental son de entre 8,1-8,3 para CR-57 y 9,0-9,2 para CR04-098. Se purificaron los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes tal como se describió anteriormente. A menos que se indique lo contrario, para CR04-001, CR04-004, CR04-008, CR04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04038, CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04

125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 y CR04-164 se usaron anticuerpos monoclonales humanos recombinantes expresados de manera transitoria por el sistema de dos vectores tal como se describió anteriormente y para CR57 se usó anticuerpo monoclonal humano recombinante expresado de manera transitoria por el sistema de un vector tal como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 9

ELISA de competición de proteína G de virus de la rabia con IgG

Para tratar si las IgG monoclonales humanas anti-proteína G de virus de la rabia se unen a epítopos no solapantes, no competitivos, se realizaron experimentos de competición. Se incuban pocillos con proteína G de virus de la rabia recubierta con concentraciones crecientes (0-50 !g/ml) de IgG anti-proteína G de virus de la rabia sin marcar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, se añaden 50 !l de una IgG biotinilada diferente anti-virus de la rabia (1 !g/ml) a cada pocillo, se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se lava inmediatamente cinco veces con 100 !l de PBS/0,05% de Tween-20. Posteriormente, se incuban los pocillos durante 1 hora a temperatura ambiente con 50 !l de una dilución 1:2000 de estreptavidina-HRP (Becton Dickinson), se lavan y se revelan tal como se describió anteriormente. Una disminución en la señal con el aumento de la concentración de IgG sin marcar indica que los dos anticuerpos están compitiendo entre sí y reconocen el mismo epítopo o epítopos solapantes.

Alternativamente, se incubaron pocillos recubiertos con proteína G de virus de la rabia (cepa ERA) con 50 !g/ml de IgG anti-proteína G de virus de la rabia sin marcar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, se añadieron 50 !l de CR57 biotinilado (0,5-5 !g/ml; a niveles subsaturados) a cada pocillo. Las etapas adicionales se realizaron tal como anteriormente. Se compararon las señales obtenidas con la señal obtenida sólo con CR57 biotinilado (véase la figura 6; sin competidor). A partir de la figura 6 puede deducirse que la señal no podía reducirse con el anticuerpo denominado CR02-428 que sirvió como control negativo. En cambio, la competición con CR57 sin marcar (control positivo) o CR-JB redujo la señal a niveles basales. A partir de la figura 6 puede deducirse adicionalmente que ninguna de las IgG anti-proteína G de virus de la rabia compitió significativamente con CR-57, lo que concuerda con los datos de competición de scFv tal como se describieron en el ejemplo 7.

Además, se realizaron experimentos de competición con células PER.C6 transfectadas con proteína G de virus de la rabia (cepa ERA) por medio de citometría de flujo. Se incubaron células transfectadas con 20 !l de IgG anti-proteína G de virus de la rabia sin marcar (50 !g/ml) durante 20 minutos a 4ºC. Tras lavar las células con PBS que contenía un 1% de BSA, se añadieron 20 !l de CR57 biotinilado (0,5-5 !g/ml; a nivel de sustrato) a cada pocillo, se incubó durante 5 minutos a 4ºC, y se lavó inmediatamente dos veces con 100 !l de PBS que contenía un 1% de BSA. Posteriormente, se incubaron los pocillos durante 15 minutos a 4ºC con 20 !l de una dilución 1:200 de estreptavidina-PE (Caltag), se lavaron y se revelaron tal como se describió anteriormente. La señal obtenida con CR57 biotinilado no pudo reducirse significativamente con el anticuerpo CR02-428 de control negativo (véase la figura 7). En cambio, la competición con CR57 sin marcar (control positivo) o CR-JB redujo la señal hasta niveles basales. Ninguna de las IgG anti-proteína G de virus de la rabia compitió significativamente con CR-57, con la excepción de CR04-126 que redujo la señal hasta aproximadamente un 30% (véase la figura 7). Este último no compitió en ELISA (véase la figura 6). Esto puede estar provocado por la diferencia en la manera en que la glicoproteína se presenta al anticuerpo en experimentos de FACS en comparación con experimentos de ELISA. La unión de CR04-126 podía depender más de la conformación de la glicoproteína, dando como resultado el efecto competitivo observado con CR04-126 en el ensayo de competición basado en FACS y no en el ensayo de competición basado en ELISA. Adicionalmente, CR04-008 y CR04-010 redujeron la señal hasta aproximadamente un 50% (véase la figura 7) en el ensayo de competición basado en FACS lo que indica que podrían competir con CR57. Sin embargo, esto no se confirmó para CR04-010 mediante los datos de competición de scFv o el ensayo de competición basado en ELISA. Para las demás IgG, los datos de FACS correspondían con los datos de ELISA respectivos tanto de los scFv como de las IgG.

Ejemplo 10

Efectos sinérgicos aditivos de IgG anti-rabia en la neutralización in vitro de virus de la rabia (RFFIT modificada)

Con el fin de determinar si las IgG anti-proteína G de virus de la rabia tenían efectos aditivos o sinérgicos en la neutralización de virus de la rabia, se sometieron a prueba diferentes combinaciones de las IgG. En primer lugar, se determina la potencia (en UI/mg) de cada anticuerpo individual en una RFFIT modificada (véase el ejemplo 1). Después, se preparan combinaciones de anticuerpos basándose en cantidades iguales de UI/mg y se someten a prueba en la RFFIT modificada. Las potencias de cada combinación de anticuerpos pueden determinarse y compararse con las potencias esperadas. Si la potencia de la combinación de anticuerpos es igual a la suma de las potencias de cada anticuerpo individual presente en la combinación, los anticuerpos tienen un efecto aditivo. Si la potencia de la combinación de anticuerpos es superior, los anticuerpos tienen un efecto sinérgico en la neutralización de virus de la rabia.

Alternativamente, pueden determinarse efectos aditivos o sinérgicos mediante el siguiente experimento. En primer lugar, se determina la potencia de los anticuerpos que van a someterse a prueba, por ejemplo CR-57 y CR04-098, en una RFFIT convencional (véase Laboratory techniques in rabies, editado por: F-X Meslin, M.M. Kaplan y H.

Koprowski (1996), 4ª edición, capítulo 15, Organización Mundial de la Salud, Ginebra). Después, se mezclan los anticuerpos en una razón 1:1 basándose en UI/ml. Se somete a prueba esta mezcla de anticuerpos, junto con los anticuerpos individuales a la misma concentración, en seis experimentos de RFFIT independientes para determinar el criterio de valoración de neutralización al 50%. Posteriormente, se determina el índice de combinación (CI) para la mezcla de anticuerpos usando la fórmula CI = (C1/Cx1) + (C2/Cx2) + (C1C2/Cx1Cx2) tal como se describe por Chou et al. (1984). C1 y C2 son la cantidad (en !g) de anticuerpo monoclonal 1 y anticuerpo monoclonal 2 que conduce a una neutralización del 50% cuando se usan en combinación y Cx1 y Cx2 son las cantidades (en !g) de anticuerpo monoclonal 1 y anticuerpo monoclonal 2 que conducen a una neutralización del 50% cuando se usan solos. CI=1, indica un efecto aditivo, CI<1 indica un efecto sinérgico y CI>1 indica un efecto antagonista de los anticuerpos monoclonales.

Ejemplo 11

Identificación de epítopos reconocidos por anticuerpos humanos recombinantes anti-virus de la rabia mediante PEPSCAN-ELISA

Se sintetizaron péptidos en bucle/cíclicos y lineales de 15 meros a partir del dominio extracelular de la proteína G de la cepa ERA del virus de la rabia (véase SEQ ID NO: 207 para la secuencia de aminoácidos completa de la glicoproteína G de la cepa ERA del virus de la rabia, el domino extracelular consiste en los aminoácidos 20-458; la ID de proteína de la glicoproteína de la cepa ERA del virus de la rabia en la base de datos EMBL es J02293) y se examinaron usando tarjetas mini-PEPSCAN en formato de tarjeta de crédito (formatos/tarjeta de 455 péptidos) tal como se describió anteriormente (Slootstra et al., 1996; documento WO 93/09872). Se acetilaron todos los péptidos en el extremo amino-terminal. En todos los péptidos en bucle se sustituyeron la posición 2 y la posición 14 por una cisteína (acetil-XCXXXXXXXXXXXCX-minitarjeta). Si había presentes otras cisteínas además de las cisteínas en la posición 2 y la posición 14 en un péptido preparado, las otras cisteínas se sustituyeron por una alanina. Se sintetizaron los péptidos en bucle usando química de Fmoc convencional y se desprotegieron usando ácido trifluoroacético con eliminadores. Posteriormente, se hicieron reaccionar los péptidos desprotegidos en las tarjetas con una disolución 0,5 mM de 1,3-bis(bromometil)benceno en bicarbonato de amonio (20 mM, pH 7,9/acetonitril (1:1 (v/v)). Se agitaron suavemente las tarjetas en la disolución durante 30-60 minutos, mientras estaban completamente cubiertas en la disolución. Finalmente, se lavaron ampliamente las tarjetas con un exceso de H2O y se sonicaron en tampón de alteración que contenía un 1% de SDS/0,1% de beta-mercaptoetanol en PBS (pH 7,2) a 70ºC durante 30 minutos, seguido por sonicación en H2O durante otros 45 minutos.

Se prepararon los anticuerpos monoclonales humanos tal como se describió anteriormente. Se sometió a prueba la unión de estos anticuerpos a cada péptido lineal y en bucle en un inmunoensayo ligado a enzimas basado en PEPSCAN (ELISA). Se incubaron las tarjetas de polipropileno en formato de tarjeta de crédito de 455 pocillos, que contenían los péptidos covalentemente unidos, con los anticuerpos (10 !g/ml; diluidos en disolución de bloqueo, que contenía un 5% de suero de caballo (v/v) y un 5% de ovoalbúmina (p/v)) (4ºC, durante la noche). Tras el lavado, se incubaron los péptidos con anticuerpo anti-ser humano con peroxidasa (dilución 1/1000) (1 hora, 25ºC), y posteriormente, tras el lavado de la peroxidasa, se añadió sustrato sulfonato de 2,2’-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) y 2 !l/ml de H2O2 al 3%. Se incubaron controles (para lineal y en bucle) con anticuerpo anti-ser humano con peroxidasa únicamente. Tras 1 hora se midió el desarrollo del color. El desarrollo del color del ELISA se cuantificó con una cámara CCD y un sistema de procesamiento de imágenes. La configuración consistió en una cámara CCD y una lente de 55 mm (videocámara CCD de Sony XC-77RR, lente de Nikon micronikkor 55 mm f/2,8), un adaptador de cámara (adaptador de cámara de Sony DC-77RR) y el paquete de software de procesamiento de imágenes Optimas, versión 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, EE.UU.). Optimas se ejecutó en un sistema informático pentium II.

Se sometieron a prueba los anticuerpos monoclonales humanos anti-proteína G de virus de la rabia para determinar la unión a los péptidos en bucle/cíclicos y lineales de 15 meros sintetizados tal como se describió anteriormente. Se considera que un péptido se une de manera relevante a un anticuerpo cuando los valores de DO son iguales o superiores al doble del valor de DO promedio de todos los péptidos (por anticuerpo). Véase la tabla 14 para resultados de la unión de los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR57, CRJB y CR04-010 a los péptidos lineales del dominio extracelular de glicoproteína G de cepa ERA del virus de la rabia. Las regiones que muestran unión significativa a los anticuerpos respectivos están destacadas en gris (véase la tabla 14).

El anticuerpo CR57 se unió a los péptidos lineales que tenían una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SLKGACKLKLCGVLG (SEQ ID NO: 314), LKGACKLKLCGVLGL (SEQ ID NO: 315), KGACKLKLCGVLGLR (SEQ ID NO: 316), GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO: 317), ACKLKLCGVLGLRLM (SEQ ID NO: 318), CKLKLCGVLGLRLMD (SEQ ID NO: 319), KLKLCGVLGLRLMDG (SEQ ID NO: 320), LKLCGVLGLRLMDGT (SEQ ID NO: 321) y KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 322) (véase la tabla 14). Los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO: 317), ACKLKLCGVLGLRLM (SEQ ID NO: 318) tienen un valor de DO que es inferior al doble del valor promedio. No obstante, se reivindican estos péptidos porque están en la proximidad cercana a una región de péptidos antigénicos reconocidos por el anticuerpo CR57. La unión fue lo más prominente al péptido con la secuencia de aminoácidos KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 322).

El anticuerpo CR04-010 se unió a los péptidos lineales que tenían una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GFGKAYTIFNKTLME (SEQ ID NO: 323), FGKAYTIFNKTLMEA (SEQ ID NO: 324), GKAYTIFNKTLMEAD (SEQ ID NO: 325), KAYTIFNKTLMEADA (SEQ ID NO: 326), AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO: 327), YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO: 328), TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO: 329), IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO: 330) y FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 331). Los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO: 327), YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO: 328) tienen un valor de DO que es inferior al doble del valor promedio. No obstante, estos péptidos se reivindican porque están en la proximidad cercana a una región de péptidos antigénicos reconocidos por el anticuerpo CR04-010. La unión fue lo más prominente a los péptidos con la secuencia de aminoácidos TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO: 329), IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO: 330) y FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 331).

CRJB y los anticuerpos denominados CR04-040, CR04-098 y CR04-103 (datos no mostrados) no reconocieron una región de péptidos antigénicos lineales.

Cualquiera de los péptidos anteriores o partes de los mismos representa buenos candidatos de un epítopo neutralizante contra el virus de la rabia y podría formar la base para una vacuna o para preparar anticuerpos neutralizantes para tratar y/o prevenir una infección por virus de la rabia.

SLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 332) y GFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 333) son regiones particularmente interesantes de la glicoproteína basándose en su alta reactividad en PEPSCAN.

A partir de los datos de PEPSCAN anteriores puede deducirse adicionalmente que los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR57 y CR04-010 se unen a diferentes regiones de la proteína G del virus de la rabia lo que indica que reconocen epítopos no competitivos.

Ejemplo 12

Determinación de potencia neutralizante de IgG anti-proteína G de la rabia usando un ensayo de neutralización in vitro (RFFIT modificada).

Se determinó la potencia neutralizante de cada uno de los anticuerpos monoclonales humanos producidos en una RFFIT modificada tal como se describió en el ejemplo 1. Dieciséis IgG neutralizaron la cepa CVS-11 de la rabia con una potencia superior a 1000 UI/mg, mientras que sólo dos IgG tenían una potencia inferior a 2 UI/mg (véase la tabla 15). Ocho de los dieciséis anticuerpos funcionaron mejor que CR-57 producido de manera transitoria con respecto a la potencia, lo que sugiere una eficacia superior en la profilaxis tras la exposición de virus de la rabia que CR-57. La potencia de CR-57 producido de manera transitoria fue de aproximadamente 3800 UI/mg de proteína (véanse las tablas 1 y 15), mientras que CR-57 producido de manera estable presentó una potencia de 5400 UI/mg de proteína (datos no mostrados). De manera interesante, la mayoría de los anticuerpos neutralizantes monoclonales humanos identificados contenían un gen de línea germinal 3-30 pesado variable (véase la tabla 9).

Basándose en la afinidad de los anticuerpos por el virus de la rabia (datos no mostrados) y una dilución de criterio de valoración del 100% de los anticuerpos en un ensayo de RFFIT modificada (datos no mostrados), se eligió un panel de seis IgG únicas, es decir CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-103, CR04-104, y CR04-144, para un desarrollo posterior. Dentro de este panel, el anticuerpo CR04-098 fue particularmente interesante porque mostraba la mayor potencia, es decir aproximadamente 7300 UI/mg de proteína (véase la tabla 15). También se encontró una potencia similar para CR04-098 producido de manera estable (datos no mostrados).

Ejemplo 13

Neutralización in vitro de virus de escape E57 mediante IgG anti-virus de la rabia

Para caracterizar adicionalmente los anticuerpos monoclonales humanos anti-rabia novedosos, se sometió a prueba la actividad neutralizante de las IgG frente a virus de escape E57 en una RFFIT modificada tal como se describió anteriormente. La mayoría de las IgG anti-virus de la rabia tenían buena actividad neutralizante frente a los seis virus de escape E57 (véase la tabla 16). En cambio, CR04-008, CR04-018 y CR04-126 no neutralizaron 6/6, 2/6 y 3/6 virus de escape E57, respectivamente. Ausencia de neutralización significa que no se alcanzó el criterio de valoración del 50% a una dilución de anticuerpo de 1:100. CR04-021, CR04-108, CR04-120, CR04-125, y CR04-164 mostraron una disminución significativa en la actividad neutralizante frente a varios virus de escape. Esto sugiere que el epítopo de estos anticuerpos se ha incluido o bien directa o bien indirectamente en la glicoproteína de virus de escape E57. Basándose en lo anterior, varias IgG anti-virus de la rabia pueden ser compatibles con CR-57 en un cóctel anti-rabia para el tratamiento de profilaxis tras la exposición. En particular, el panel de seis IgG únicas tal como se definió anteriormente, es decir anticuerpos CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-103, CR04-104, y CR04-144, presentó buena potencia neutralizante frente a los virus de escape E57 lo que sugiere que ese/esos epítopo(s) reconocido(s) por esos anticuerpos no se veía(n) afectados por las mutaciones de aminoácidos inducidas por CR-57. El anticuerpo CR04-098 pareció el más prometedor ya que tenía una a potencia superior a 3000 UI/mg para cada uno de los virus de escape.

Ejemplo 14

Reconocimiento de epítopos de anticuerpos CR-57 y CR04-098 anti-rabia

Para confirmar que los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR-57 y CR04-098 reconocen epítopos no solapantes, no competitivos, se generaron virus de escape del anticuerpo monoclonal humano denominado CR04098 esencialmente tal como se describió para los virus de escape de CR57 (véase el ejemplo 1). En resumen, se puntuó el número de focos por pocillo mediante inmunofluorescencia y se eligió el medio de pocillos que contenían preferiblemente un foco para la amplificación del virus. Todos los virus de escape E98 se generaron a partir de 1 único foco con la excepción de E98-2 (2 focos) y E98-4 (4 focos). Un virus se definió como una variante de escape si el índice de neutralización era <2,5 log. El índice de neutralización se determinó restando el número de partículas de virus infecciosas/ml producido en cultivos de células BSR infectadas con virus más anticuerpo monoclonal (∼4 UI/ml) del número de partículas de virus infecciosas/ml producido en cultivos de células BSR o MNA infectadas con virus solo virus ([log de unidades formadoras de focos/ml de virus en ausencia de anticuerpo monoclonal menos log de uff/ml de virus en presencia de anticuerpo monoclonal]). Se consideró que un índice inferior a 2,5 log era evidencia de escape.

Para investigar adicionalmente que CR04-098 se une a un epítopo no solapante, no competitivo, diferente en comparación con CR-57, se sometió CR-57 a prueba frente a virus de escape E98 en un ensayo de RFFIT modificada tal como se describió anteriormente. Tal como se muestra en la tabla 17, CR-57 tenía buena actividad neutralizante frente a los cinco virus de escape E98. Adicionalmente, se sometieron los anticuerpos CR04-010 y CR04-144 a prueba para determinar la actividad neutralizante frente a los virus de escape E98. Ninguno de los anticuerpos neutralizó los virus de escape E98 (datos no mostrados) lo que sugiere que el epítopo reconocido por ambos anticuerpos se ve afectado o bien directa o bien indirectamente por la mutación de aminoácidos inducida por el anticuerpo CR04-098. Se sometieron los anticuerpos CR04-018 y CR04-126 a prueba para determinar la actividad neutralizante frente a sólo uno de los virus de escape E98, es decir E98-4. CR04-018 podría neutralizar el virus de escape, mientras que CR04-126 sólo tenía una débil potencia neutralizante frente al virus de escape. Esto sugiere que el epítopo reconocido por CR04-018 no se ve afectado por la mutación inducida por el anticuerpo CR04-098. Adicionalmente, los anticuerpos CR04-010, CR04-038, CR04-040, CR04-073, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-164 no neutralizaron E98-4 lo que sugiere que reconocen el mismo epítopo que CR04098 (datos no mostrados).

Para identificar posibles mutaciones en la glicoproteína de la rabia de cada uno de los virus de escape E98, se determinó la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) de la glicoproteína tal como se describió anteriormente para los virus de escape E57 y EJB. Todos los virus de escape E98 mostraron la mutación N a D en la posición de aminoácido 336 de la glicoproteína de la rabia (véase la figura 8). Esta región de la glicoproteína se ha definido como sitio antigénico III que consiste en los aminoácidos 330-338 (numeración sin péptido señal). En cambio, CR-57 reconoció un epítopo ubicado en los aminoácidos 226-231 (numeración sin péptido señal), que se solapa con el sitio antigénico I. Además de la mutación N336D el virus de escape E98 denominado E98-5 mostró la mutación H a Q en la posición de aminoácido 354 (cambio de codón de CAT a CAG) de la glicoproteína de la rabia (datos no mostrados).

Además, un análisis de Pepscan de la unión de CR57 a péptidos que alojan el epítopo de CR57 mutado (tal como se observa en los virus de escape E57) no mostró que se eliminará la interacción de CR57 (datos no mostrados). Sorprendentemente, CR04-098 todavía podía unirse a la glicoproteína mutada (que comprende la mutación N336D) expresada en células PER.C6®, según se mide mediante citometría de flujo (datos no mostrados), aunque los virus que contenían esta mutación ya no se neutralizaban.

Además, se realizaron estudios de mapeo de epítopo y estudios de clasificación de afinidad usando un análisis de resonancia de plasmón superficial usando un sistema analítico BIAcore3000™. Se inmovilizó la glicoproteína de la rabia purificada (cepa ERA) como ligando en un chip sensor de 4 canales de flujo CM5 de calidad para investigación (Fc) (Biacore AB, Suecia) usando acoplamiento con amina. La clasificación se realizó a 25ºC con HBS-EP (Biacore AB, Suecia) como tampón de ejecución. Se inyectaron 50 !l de cada anticuerpo a una velocidad de flujo constante de 20 !l/min. Después, se aplicó tampón de ejecución durante 750 segundos seguido por regeneración del chip CM5 con 5 !l de NaOH 2 M, 5 !l de HCl 45 mM y 5 !l de NaOH 2 mM. Se trazaron las señales de resonancia expresadas como unidades de resonancia (UR) como función del tiempo y se determinaron el aumento y la disminución de UR como una medida de la asociación y disociación, respectivamente, y se usaron para la clasificación de los anticuerpos. Los valores de KD reales para CR57 y CR04-098 según se determinaron mediante análisis de resonancia de plasmón superficial fueron de 2,4 nM y 4,5 nM, respectivamente. Los estudios de mapeo de epítopo confirmaron adicionalmente que CR57 y CR04-098 se unen a diferentes epítopos en la glicoproteína de la rabia. La inyección de CR57 dio como resultado una respuesta de 58 UR (datos no mostrados). Tras la inyección de CR04098 se obtuvo un aumento adicional del nivel de respuesta (24 UR), lo que sugiere que los sitios de unión para CR04-098 no estaban ocupados (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados similares cuando se aplicó el orden inverso lo que muestra que cada anticuerpo alcanzó niveles de UR similares independientemente del orden de inyección (datos no mostrados). Estos resultados demuestran adicionalmente que CR57 y CR04-098 pueden unirse simultáneamente y reconocer diferentes epítopos en la glicoproteína del virus de la rabia.

En general, los datos anteriores confirman adicionalmente que los anticuerpos CR-57 y CR04-098 reconocen epítopos no solapantes distintos epítopos, es decir epítopos en el sitio antigénico I y III, respectivamente. Los datos

concuerdan bien con los datos de competición de ELISA/FACS que indican que CR-57 y CR04-098 no compiten por la unión a la proteína G de la cepa ERA y la buena actividad neutralizante del anticuerpo CR04-098 frente a todos los virus de escape E57. Basándose en estos resultados y el hecho de que la exposición in vitro de virus de la rabia a la combinación de CR57 y CR04-098 (selección en presencia de 4 UI/ml de cualquier anticuerpo) no proporcionó virus de escape (datos no mostrados), se concluyó que los anticuerpos CR-57 y CR04-098 reconocen epítopos no solapantes, no competitivos, y pueden usarse ventajosamente en un cóctel de anticuerpos anti-virus de la rabia para el tratamiento de profilaxis tras la exposición.

Ejemplo 15

Evaluación de la conservación del epítopo reconocido por CR57 y CR04-098

Se alineó la región de unión mínima de CR-57 (aminoácidos KLCGVL dentro de SEQ ID NO: 332, la región de la glicoproteína de virus de la rabia reconocida por CR57 según se determina por medio de PEPSCAN y tecnología de exploración de alanina) con secuencias de nucleótidos de 229 aislados de virus de la rabia de genotipo 1 para evaluar la conservación del epítopo (véase la tabla 18). El conjunto de muestras contenía aislados humanos, aislados de murciélago y aislados de perros o de animales domésticos muy probablemente mordidos por perros con rabia. Un análisis de frecuencia de los aminoácidos en cada posición dentro de la región de unión mínima reveló que los residuos críticos que constituyen el epítopo estaban altamente conservados. La lisina en la posición uno se conservó en un 99,6% de los aislados, mientras que sólo en 1/229 aislados se observó una mutación K>R conservativa. Las posiciones dos y tres (L y C) se conservaron completamente. Se cree que el residuo de cisteína central participa estructuralmente en el plegamiento de la glicoproteína y se conserva en todos los lyssavirus (véase Badrane y Tordo, 2001). La glicina en la posición cuatro se conservó en un 98,7% de los aislados, mientras que en 3/229 aislados se observaron mutaciones hacia aminoácidos cargados (G>R en 1/229; G>E en 2/229). La quinta posición también se conservó con la excepción de un aislado en el que se observó una mutación V>I conservativa. En la sexta posición, que no es un residuo crítico según se determinó mediante exploración de sustitución con alanina, se observó una heterogeneidad significativa en los aislados naturales: L en el 70,7%, P en el 26,7% y S en el 2,6% de las cepas, respectivamente. En conjunto, se predice que aproximadamente el 99 por ciento de los virus de la rabia que pueden encontrarse se reconocen por el anticuerpo CR-57.

Se analizaron 123 de estos 229 aislados de virus para determinar la presencia de mutaciones tanto en el epítopo de CR-57 como en el CR04-098. Ninguno de estos 123 virus naturales contenía mutaciones en ambos epítopos. La mutación N>D según se observó en los virus de escape E98 sólo estaba presente en cinco aislados de virus. Estosvirus eran geográficamente distintos y se aislaron de animales en África (véase la figura 9 para un árbol filogenético; los cinco aislados de virus, es decir AF325483, AF325482, AF325481, AF325480 y AF325485, se indican en negrita). El análisis filogenético de secuencias de glicoproteína reveló que los virus de la rabia con epítopos de CR57 mutados sólo están relacionados de manera distante con virus de la rabia que llevan un epítopo de CR04-098 mutado. Por tanto, la probabilidad de encontrar un virus de la rabia resistente a la neutralización mediante un cóctel de CR-57 y CR04-098 es prácticamente inexistente.

Tabla 1: Potencia neutralizante de CR-57 y CR-JB frente a virus de tipo natural y de escape

Virus: Potencia CR-57 (UI/mg) Potencia CR-JB (UI/mg) Virus Potencia CR-57 (UI/mg) Potencia CR-JB (UI/mg)

CVS-11: 3797 605 CVS-11 3797 605

E57A2: 0 <0,2 EJB2B 0,004 0,6

E57A3: 0 419 EJB2C <0,004 2

E57B1: 0 93 EJB2D <0,004 3

E57B2: 0 <0,3 EJB2E <0,2 <0,3

E57B3: 0 419 EJB2F <0,06 3

E57C3: 0 31 EJB3F <0,04 0,06

Tabla 2: Cebadores de región variable de cadena lambda humana (sentido). Tabla 3: Cebadores de región variable de cadena kappa humana (sentido).

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuV∀1A: SEQ ID NO: 208

HuV∀1B: SEQ ID NO: 209

HuV∀1C: SEQ ID NO: 210

HuV∀2: SEQ ID NO: 211

HuV∀3A: SEQ ID NO: 212

HuV∀3: SEQ ID NO: 213

HuV∀4: SEQ ID NO: 214

HuV∀5: SEQ ID NO: 215

HuV∀6: SEQ ID NO: 216

HuV∀7/8: SEQ ID NO: 217

HuV∀9: SEQ ID NO: 218

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuV∃1B: SEQ ID NO: 219

HuV∃2: SEQ ID NO: 220

HuV∃3: SEQ ID NO: 221

HuV∃4: SEQ ID NO: 222

HuV∃5: SEQ ID NO: 223

HuV∃6: SEQ ID NO: 224

Tabla 4: Cebadores de región variable de cadena kappa humana extendidos con sitios de restricción SalI (sentido), cebadores de región J de cadena kappa humana extendidos con sitios de restricción NotI (antisentido), cebadores de región variable de cadena lambda humana extendidos con sitios de restricción SalI (sentido) y cebadores de región J de cadena lambda humana extendidos con sitios de restricción NotI (antisentido).

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuV∃B-SalI: SEQ ID NO: 225

HuV∃2-SalI: SEQ ID NO: 226

HuV∃3B-SalI: SEQ ID NO: 227

HuV∃4B-SalI: SEQ ID NO: 228

HuV∃5-SalI: SEQ ID NO: 229

HuV∃6-SalI: SEQ ID NO: 230

HuV∃1-NotI: SEQ ID NO: 231

HuJ∃2-NotI: SEQ ID NO: 232

HuJ∃3-NotI: SEQ ID NO: 233

HuV∃4-NotI: SEQ ID NO: 234

HuV∃5-NotI: SEQ ID NO: 235

HuV∀1A-SalI: SEQ ID NO: 236

HuV∀1B-SalI: SEQ ID NO: 237

HuV∀1C-SalI: SEQ ID NO: 238

HuV∀2-SalI: SEQ ID NO: 239

HuV∀3A-SalI: SEQ ID NO: 240

HuV∀3B-SalI: SEQ ID NO: 241

HuV∀4-SalI: SEQ ID NO: 242

HuV∀5-SalI: SEQ ID NO: 243

HuV∀6-SalI: SEQ ID NO: 244

HuV∀7/8-SalI: SEQ ID NO: 245

HuV∀9-SalI: SEQ ID NO: 246

HuJ∀-NotI: SEQ ID NO: 247

HuV∀2/3-NotI: SEQ ID NO: 248

HuJ∀4/5-NotI: SEQ ID NO: 249

Tabla 5: Distribución de los diferentes productos de cadena ligera a lo largo de las 10 fracciones.

Tabla 6: Cebadores de región variable de cadena pesada de IgG humana (sentido).

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuVH1B/7A: SEQ ID NO: 250

HuVH1C: SEQ ID NO: 251

HuVH2B: SEQ ID NO: 252

HuVH3B: SEQ ID NO: 253

HuVH3C: SEQ ID NO: 254

HuVH4B: SEQ ID NO: 255

HuVH4C: SEQ ID NO: 256

HuVH5B: SEQ ID NO: 257

HuVH6A: SEQ ID NO: 258

Tabla 7: Cebadores de región variable de cadena pesada de IgG humana extendidos con sitios de restricción SfiI/NcoI (sentido) y cebadores de región J de cadena pesada de IgG humana extendidos con sitios de restricción XhoI/BstEII (antisentido).

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

HuVH1B/7A-SfiI: SEQ ID NO: 259

HuVHIC-SfiI: SEQ ID NO: 260

HuVH2B-SfiI: SEQ ID NO: 261

HuVH3B-SfiI: SEQ ID NO: 262

HuVH3C-SfiI: SEQ ID NO: 263

HuVH4B-SfiI: SEQ ID NO: 264

HuVH4C-SfiI: SEQ ID NO: 265

HuVH5B-SfiI: SEQ ID NO: 266

HuVH6A.SfiI: SEQ ID NO: 267

HuJH1/2-XhoI: SEQ ID NO: 268

HuJH3-XhoI: SEQ ID NO: 269

HuJH4/5-XhoI: SEQ ID NO: 270

HuJH6-XhoI: SEQ ID NO: 271

Tabla 8: Unión de anticuerpos de fagos monocatenarios (scFv) a proteína G de virus de la rabia (cepa ERA) y a FBS según se mide mediante ELISA.

Nombre de anticuerpo de fagos: Proteína G de virus de la rabia (DO a 492 nm) FBS (DO a 492 nm)

SC04-001: 0,828 0,053

SC04-004: 0,550 0,054

SC04-008: 0,582 0,058

SC04-010: 0,915 0,043

SC04-018: 0,247 0,052

SC04-021: 0,278 0,052

SC04-026: 0,212 0,054

SC04-031: 0,721 0,065

SC04-038: 0,653 0,061

SC04-040: 0,740 0,053

SC04-060: 0,923 0,056

SC04-073: 0,657 0,054

SC04-097: 0,835 0,056

SC04-098: 0,798 0,060

SC04-103: 0,606 0,059

SC04-104: 0,566 0,063

SC04-108: 0,363 0,052

SC04-120: 0,571 0,052

SC04-125: 0,735 0,049

SC04-126: 0,232 0,051

SC04-140: 0,865 0,057

SC04-144: 0,775 0,054

SC04-146: 0,484 0,057

SC04-164: 0,547 0,057

Control (SO57): 0,650 0,055

Control (02-007): 0,063 0,052

Tabla 9: Datos de los Fv monocatenarios que pueden unirse a proteína G de virus de la rabia.

Nombre de scFv (bib.): SEQ ID NO de secuencia de nucl. SEQ ID NO de secuencia de aminoácidos HCDR3 (SEQ ID NO:) Locus de VH Locus de VL

sc04-001 (JK1994): 157 158 GLYGELFDY (SEQ ID NO: 1) 3-20 (DP32) V13 (31 -V213)

sc04-004 (WT2000): 159 160 DYLYPTTDFDY (SEQ ID NO: 2) 3-23 (DP47) VkI (012/02-DPK9)

sc04-008 (RAB03-G01): 161 162 MGFTGTYFDY (SEQ ID NO: 3) 2-70 (DP28) V13 (3h -V214)

sc04-010 (RAB03-G01): 163 164 3-30 (DP49) VkI (L11 -DPK3)

sc04-018 (RAB03-G01): 165 166 VSVTTGAFNI (SEQ ID NO: 5) 4-04 (DP70) V11 (1c -V116)

sc04-021 (RAB03-G01): 167 168 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO: 6) 3-30 (DP49) VkI (L8)

sc04-026 (RAB03-G01): 169 170 TSNWNYLDRFDP (SEQ ID NO: 7) 5-51 (DP73) VkII (A 19/03 -DPK15)

sc04-031 (RAB03-G01): 171 172 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO: 8) 3-30 (DP49) VkI (L5 -DPK5)

sc04-038 (RAB03-G01): 173 174 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO: 9) 3-30 (DP49) VkI (L5 -DPK5)

sc04-040 (RAB03-G01): 175 176 GSKVGDFDY (SEQ ID NO: 10) 3-30 (DP49) V13 (3h -V214)

sc04-060 (RAB04-G01): 177 178 4-59 (DP71) VkI (O12/02 -DPK9)

sc04-073 (RAB04-G01): 179 180 3-30 (DP49) VkI (L12)

sc04-097 (RAB04-G01): 181 182 TASNLGRGGMDV (SEQ ID NO: 13) 3-23 (DP47) VkI (L8)

sc04-098 (RAB04-G01): 183 184 VAVAGTHFDY (SEQ ID NO: 14) 3-30 (DP49) VkI (A30)

sc04-103 (RAB04-G01): 185 186 VAVAGESFDS (SEQ ID NO: 15) 3-30 (DP49) VkI (L5 -DPK5)

sc04-104 (RAB04-G01): 187 188 IVVVTALDAFDI (SEQ ID NO: 16) 3-30 (DP49) VkI (L12)

sc04-108 (RAB: 189 190 FMIVADDAFDI 3-30 (DP49) VkI (L1)

04-G01): (SEQ ID NO: 17)

sc04-120 04-G01): (RAB 191 192 GGKTGEFDY (SEQ ID NO: 18) 3-30 (DP49) VkI (L8)

sc04-125 04-G01): (RAB 193 194 IATAGTGFDY (SEQ ID NO: 19) 3-30 (DP49) VkI (L8)

sc04-126 04-G01): (RAB 195 196 MGFTGTYTDY (SEQ ID NO: 20) 2-70 (DP28) V13 (3h -V214)

sc04-140 04-G01): (RAB 197 198 VTNPGDAFDI (SEQ ID NO: 21) 3-30 (DP49) VkI (L4/18a)

sc04-144 04-G01): (RAB 199 200 GGKTGEFDY (SEQ ID NO: 22) 3-30 (DP49) VkI (L8)

sc04-146 04-G01): (RAB 201 202 GGKTGEFDY (SEQ ID NO: 23) 3-30 (DP49) VkIII (L2 -DPK21)

sc04-164 04-G01): (RAB 203 204 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO: 24) 3-30 (DP49) VkI (L19 -DPK6)

SO57: 205 206 1-69 (DP10) V12 (2e -VI3)

SOJB: 312 313 RQHISSFPWFDS (SEQ ID NO: 276) 2-05 V13 (3h -V214)

Tabla 10: Datos de ensayo para determinar la actividad neutralizante contra el virus de la rabia de scFv.

Nombre de scFv: Dilución de criterio de valoración del 50% Norma de la OMS de dilución de criterio de valoración del 50% (2 UI/ml) Potencia (UI/ml)

SC04-001: 270 405 1,3

SC04-004: 3645 405 18

SC04-008: >10935 405 >54

SC04-010: 810 405 4

SC04-018: 15 405 0,1

SC04-021: 270 405 1,3

SC04-026: 45 270 0,3

SC04-031: 90 270 0,7

SC04-038: 270 270 2

SC04-040: 45 270 0,3

SC04-060: 30 270 0,2

SC04-073: 405 270 3

SC04-097: 30 270 0,2

SC04-098: 1215 270 9

SC04-103: 45 270 0,3

SC04-104: 135 270 1

SC04-108: 135 270 1

SC04-120: 810 270 6

SC04-125: 405 270 3

SC04-126: 10 270 0,1

SC04-140: 135 270 1

SC04-144: 810 270 6

SC04-146: 405 270 3

SC04-164: 45 270 0,3

Tabla 11A: Datos de ensayo para medir la actividad neutralizante de scFv para virus de escape E57 E57A2, E57A3 y E57B1.

Nombre de scFv: E57A2 E57A3 E57B1

1*: 2* 3* 1* 2* 3* 1* 2* 3*

SC04-001: 10 90 0,2 10 90 0,2 30 45 1,3

SC04-004: 810 90 18,0 1215 90 27,0 810 45 36,0

SC04-008: 10 90 0,2 15 90 0,3 270 45 12,0

SC04-010: 270 90 6,0 270 90 6,0 270 45 12,0

SC04-018: 5 90 0,1 15 90 0,3 15 45 0,7

SC04-021: 10 90 0,2 30 90 0,7 10 90 0,2

SC04-026: <5 90 0,0 <5 45 0,0 <5 90 0,0

SC04-031: 10 90 0,2 30 90 0,7 10 90 0,2

SC04-038: 90 90 2,0 90 90 2,0 45 90 1,0

SC04-040: 15 90 0,3 5 90 0,1 5 90 0,1

SC04-060: 5 90 0,1 5 90 0,1 <5 90 0,0.

SC04-073: 135 90 3,0 90 30 6,0 30 30 2,0

SC04-097: <5 90 0,0 <5 90 0,0 <5 90 0,0

SC04-098: 810 90 18,0 270 30 18,0 270 30 18,0

SC04-103: <5 90 0,0 10 90 0,2 5 90 0,1

SC04-104: 90 90 2,0 30 30 2,0 30 30 2,0

SC04-108: 15 90 0,3 <5 90 0,0 <5 90 0,0

SC04-120: 45 90 1,0 30 30 2,0 10 30 0,7

SC04-125: 135 90 3,0 135 30 9,0 90 30 6,0

SC04-126: <5 90 0,0 <5 45 0,0 <5 90 0,0

SC04-140: 30 45 1,3 90 30 6,0 45 90 1,0

SC04-144: 270 45 12,0 270 30 18,0 135 90 3,0

SC04-146: 90 45 4,0 90 30 6,0 90 90 2,0

SC04-164: 15 45 0,7 30 30 2,0 15 90 0,3

1* es la dilución de criterio de valoración del 50% 2* es la norma de la OMS de dilución de criterio de valoración del 50% (2 UI/ml) 3* es la potencia (UI/ml)

Tabla 11 B: Data de ensayo para medir la actividad neutralizante de scFv para virus de escape E57 E57B2, E57B3 y E57C3.

Nombre de scFv: E57B2 E57B3 E57C3

1*: 2* 3* 1* 2* 3* 1* 2* 3*

SC04-001: 30 45 1,3 90 270 0,7 5 90 0,1

SC04-004: 5 45 0,2 2430 270 18,0 270 90 6,0

SC04-008: 5 45 0,2 45 270 0,3 10 90 0,2

SC04-010: 45 45 2,0 405 270 3,0 270 90 6,0

SC04-018: 15 45 0,7 15 270 0,1 30 90 0,7

SC04-021: 10 90 0,2 30 270 0,2 10 90 0,2

SC04-026: <5 45 0,0 <5 45 0,0 <5 30 0,0

SC04-031: 10 90 0,2 30 270 0,2 30 90 0,7

SC04-038: 30 90 0,7 90 270 0,7 90 90 2,0

SC04-040: 5 90 0,1 15 135 0,2 10 90 0,2

SC04-060: <5 90 0,0 10 135 0,1 5 90 0,1

SC04-073: 30 90 0,7 90 270 0,7 90 90 2,0

SC04-097: <5 90 0,0 <5 135 0,0 <5 90 0,0

SC04-098: 90 90 2,0 810 270 6,0 270 90 6,0

SC04-103: <5 90 0,0 10 135 0,1 10 90 0,2

SC04-104: 45 90 1,0 45 270 0,3 90 90 2,0

SC04-108: 10 90 0,2 <5 135 0,0 15 90 0,3

SC04-120: 15 90 0,3 45 270 0,3 30 90 0,7

SC04-125: 90 90 2,0 270 270 2,0 270 90 6,0

SC04-126: <5 45 0,0 <5 45 0,0 <5 30 0,0

SC04-140: 30 90 0,7 90 90 2,0 270 90 6,0

SC04-144: 90 90 2,0 270 90 6,0 405 90 9,0

SC04-146: 30 90 0,7 90 90 2,0 90 90 2,0

SC04-164: 15 90 0,3 15 90 0,3 30 90 0,7

Tabla 12: Oligonucleótidos usados para la amplificación mediante PCR de genes de VH.

Nombre y secuencia de nucleótidos: Gen de VH SEQ ID NO:

5H-B:: SC04-001 280

acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctggtggagtctg

5H-C: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagctggtggagtctgg: SC04-021 SC04-031 SC04-125 SC04-164 281

5H-C-largo: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagctggtggagtctgggg: SC04-010 SC04-038 SC04-040 SC04-073 SC04-098 SC04-103 SC04-104 SC04-108 SC04-120 SC04-140 SC04-144 SC04-146 282

5H-F: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagctgcaggagtccggccc: SC04-018 SC04-060 283

5H-H: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctggtgcagtctgg: SC04-026 284

5H-I: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctgctggagtctgg: SC04-004 SC04-097 285

5H-M: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgaccttgaaggagtctgg: SC04-008 SC04-126 286

sy3H-A: gcccttggtgctagcgctggagacggtcaccagggtgccctggcccc: SC04-001 SC04-004 SC04-008 SC04-010 SC04-026 SC04-040 SC04-073 SC04-098 SC04-120 SC04-125 SC04-126 SC04-144 SC04-146 287

sy3H-C: gcccttggtgctagcgctggagacggtcacggtggtgccctggcccc: SC04-097 288

sy3H-C-largo:: SC04-060 289

sy3H-D: gcccttggtgctagcgctggacacggtcaccatggtgccctggcccc: SC04-018 SC04-021 SC04-031 SC04-038 SC04-104 SC04-108 SC04-140 SC04-164 290

sy3H-E: gcccttggtgctagcgctggacacggtcaccagggtgccccggcccc: SC04-103 291

Tabla 13: Oligonucleótidos usados para la amplificación mediante PCR de genes de VL.

Nombre y secuencia de nucleótidos: Gen de VL SEQ ID NO:

3L-B: ttttccttagcggccgcgactcacctaggacggtcagcttggtc: SC04-001 292

5K-B: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagatgacccagtc: SC04-031 SC04-060 SC04-073 SC04-098 SC04-103 SC04-104 SC04-108 SC04-164 293

5K-C: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagatgacccagtctccatcct ccc: SC04-004 294

5K-G: acctgtctcgagttttccatggctgacatcgtgatgacccagtctcc: SC04-026 295

5K-K: acctgtctcgagttttccatggctgccatccagatgacccagtctcc: SC04-010 296

5K-M: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagctgacccagtc: SC04-021 SC04-097 SC04-120 SC04-125 SC04-144 297

5K-N: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagatgactcagtc: SC04-038 298

5K-O: acctgtctcgagttttccatggctgccatccagctgacccagtc: SC04-140 299

5K-Q: acctgtctcgagttttccatggctgagatcgtgatgactcagtc: SC04-146 300

5L-E: acctgtctcgagttttccatggcttcctacgtgctgactcagccg: SC04-008 301

5L-F: acctgtctcgagttttccatggctcagtccgtgctgactcagcc: SC04-018 302

5L-G: acctgtctcgagttttccatggcttcctacgtgctgactcagcc: SC04-040 303

SC04-126

sy3K-F: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccaccttggtccc: SC04-004 SC04-010 SC04-021 SC04-031 SC04-098 SC04-104 SC04-125 SC04-140 SC04-144 SC04-164 304

sy3K-I: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccagccgtgtccc: SC04-038 SC04-097 SC04-103 SC04-108 SC04-146 305

sy3K-J: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccagcttggtccc: SC04-026 SC04-060 SC04-073 306

sy3K-K: gctgggggcggccacggtccgcttgatgtccaccttggtccc: SC04-120 307

sy3L-A: ccagcacggtaagcttcagcacggtcaccttggtgccagttcc: SC04-018 SC04-126 308

sy3L-C: ccagcacggtaagcttcagcacggtcagcttggtgcctccgcc: SC04-040 309

sy3L-D: ccagcacggtaagcttcaacacggtcagctgggtccc: SC04-008 310

sy5L-A:: SC04-001 311

Tabla 14: Unión de los anticuerpos monoclonales humanos CR57, CRJB y CR04-010 (10 !g/ml) a péptidos lineales del dominio extracelular de glicoproteína G de la cepa ERA del virus de la rabia.

Secuencia de aminoácidos de péptido lineal: CR57 CRJB CR04-010

KFPIYTILDKLGPWS: 71 97 1

FPIYTILDKLGPWSP: 42 105 39

PIYTILDKLGPWSPI: 36 89 87

IYTILDKLGPWSPID: 44 97 104

YTILDKLGPWSPIDI: 48 114 91

TILDKLGPWSPIDIH: 76 96 88

ILDKLGPWSPIDIHH: 54 104 69

LDKLGPWSPIDIHHL: 55 99 107

DKLGPWSPIDIHHLS: 62 103 93

KLGPWSPIDIHHLSC: 72 105 45

LGPWSPIDIHHLSCP: 69 112 19

GPWSPIDIHHLSCPN: 68 114 33

PWSPIDIHHLSCPNN: 62 104 47

WSPIDIHHLSCPNNL: 80 106 11

SPIDIHHLSCPNNLV: 74 85 1

PIDIHHLSCPNNLVV: 46 93 90

IDIHHLSCPNNLVVE: 69 102 55

DIHHLSCPNNLVVED: 38 96 78

IHHLSCPNNLVVEDE: 37 85 113

HHLSCPNNLWEDEG: 56 76 117

HLSCPNNLVVEDEGC: 65 119 111

LSCPNNLVVEDEGCT: 69 117 127

SCPNNLVVEDEGCTN: 83 114 91

CPNNLVVEDEGCTNL: 77 97 49

PNNLVVEDEGCTNLS: 78 107 97

NNLVVEDEGCTNLSG: 72 99 97

NLVVEDEGCTNLSGF: 75 119 55

LVVEDEGCTNLSGFS: 76 103 52

VVEDEGCTNLSGFSY: 73 107 91

VEDEGCTNLSGFSYM: 74 103 31

EDEGCTNLSGFSYME: 54 90 7

DEGCTNLSGFSYMEL: 1 23 1

EGCTNLSGFSYMELK: 51 114 129

GCTNLSGFSYMELKV: 55 114 118

CTNLSGFSYMELKVG: 47 110 137

TNLSGFSYMELKVGY: 43 106 161

NLSGFSYMELKVGYI: 61 115 170

LSGFSYMELKVGYIL: 71 132 169

SGFSYMELKVGYILA: 79 132 161

GFSYMELKVGYILAI: 65 111 141

FSYMELKVGYILAIK: 89 112 192

SYMELKVGYILAIKM: 65 123 152

YMELKVGYILAIKMN: 78 114 150

MELKVGYILAIKMNG: 76 141 107

ELKVGYILAIKMNGF: 87 132 76

LKVGYILAIKMNGFT: 78 112 118

KVGYILAIKMNGFTC: 78 118 68

VGYILAIKMNGFTCT: 77 93 1

GYILAIKMNGFTCTG: 75 90 1

YILAIKMNGFTCTGV: 47 107 107

ILAIKMNGFTCTGVV: 79 103 104

LAIKMNGFTCTGVVT: 68 130 159

AIKMNGFTCTGVVTE: 47 103 152

IKMNGFTCTGVVTEA: 68 108 138

KMNGFTCTGVVTEAE: 76 104 133

MNGFTCTGVVTEAEN: 69 99 148

NGFTCTGVVTEAENY: 69 101 138

GFTCTGVVTEAENYT: 71 86 129

FTCTGVVTEAENYTN: 83 125 154

TCTGVVTEAENYTNF: 92 112 129

CTGVVTEAENYTNFV: 76 123 150

TGVVTEAENYTNFVG: 85 110 154

GVVTEAENYTNFVGY: 86 111 110

VVTEAENYTNFVGYV: 87 106 114

VTEAENYTNFVGYVT: 79 90 73

TEAENYTNFVGYVTT: 68 84 8

EAENYTNFVGYVTTT: 69 117 142

AENYTNFVGYVTTTF: 66 106 110

ENYTNFVGYVTTTFK: 44 112 183

NYTNFVGYVTTTFKR: 49 114 174

YTNFVGYVTTTFKRK: 51 104 138

TNFVGYVTTTFKRKH: 71 125 165

NFVGYVTTTFKRKHF: 65 107 154

FVGYVTTTFKRKHFR: 70 111 152

VGYVTTTFKRKHFRP: 75 113 155

GYVTTTFKRKHFRPT: 70 123 160

YVTTTFKRKHFRPTP: 85 106 160

VTTTFKRKHFRPTPD: 79 105 119

TTTFKRKHFRPTPDA: 80 108 137

TTFKRKHFRPTPDAC: 74 99 110

TFKRKHFRPTPDACR: 96 111 108

FKRKHFRPTPDACRA: 64 92 62

KRKHFRPTPDACRAA: 65 93 1

RKHFRPTPDACRAAY: 64 107 99

KHFRPTPDACRAAYN: 73 112 124

HFRPTPDACRAAYNW: 46 113 118

FRPTPDACRAAYNWK: 43 112 148

RPTPDACRAAYNWKM: 77 101 129

PTPDACRAAYNWKMA: 99 125 143

TPDACRAAYNWKMAG: 92 132 160

PDACRAAYNWKMAGD: 61 124 147

DACRAAYNWKMAGDP: 84 113 136

ACRAAYNWKMAGDPR: 82 116 138

CRAAYNWKMAGDPRY: 87 118 137

RAAYNWKMAGDPRYE: 90 130 120

AAYNWKMAGDPRYEE: 68 106 120

AYNWKMAGDPRYEES: 96 94 77

YNWKMAGDPRYEESL: 83 118 116

NWKMAGDPRYEESLH: 58 101 69

WKMAGDPRYEESLHN: 69 101 1

KMAGDPRYEESLHNP: 62 102 84

MAGDPRYEESLHNPY: 64 116 112

AGDPRYEESLHNPYP: 40 101 125

GDPRYEESLHNPYPD: 36 98 123

DPRYEESLHNPYPDY: 57 110 118

PRYEESLHNPYPDYR: 73 115 129

RYEESLHNPYPDYRW: 69 112 125

YEESLHNPYPDYRWL: 58 106 120

EESLHNPYPDYRWLR: 76 123 141

ESLHNPYPDYRWLRT: 92 132 125

SLHNPYPDYRWLRTV: 78 111 137

LHNPYPDYRWLRTVK: 79 106 142

HNPYPDYRWLRTVKT: 86 108 146

NPYPDYRWLRTVKTT: 85 102 151

PYPDYRWLRTVKTTK: 65 93 103

YPDYRWLRTVKTTKE: 72 97 97

PDYRWLRTVKTTKES: 76 85 27

DYRWLRTVKTTKESL: 54 111 105

YRWLRTVKTTKESLV: 46 117 125

RWLRTVKTTKESLVI: 40 110 120

WLRTVKTTKESLVII: 41 104 125

LRTVKTTKESLVIIS: 65 104 161

RTVKTTKESLVIISP: 82 120 150

TVKTTKESLVIISPS: 76 116 150

VKTTKESLVIISPSV: 71 120 154

KTTKESLVIISPSVA: 101 112 147

TTKESLVIISPSVAD: 78 121 141

TKESLVIISPSVADL: 86 112 132

KESLVIISPSVADLD: 86 117 111

ESLVIISPSVADLDP: 88 125 143

SLVIISPSVADLDPY: 68 105 125

LVIISPSVADLDPYD: 85 107 93

VIISPSVADLDPYDR: 59 98 50

IISPSVADLDPYDRS: 83 125 14

ISPSVADLDPYDRSL: 50 119 91

SPSVADLDPYDRSLH: 59 114 118

PSVADLDPYDRSLHS: 44 114 118

SVADLDPYDRSLHSR: 49 106 129

VADLDPYDRSLHSRV: 71 113 141

ADLDPYDRSLHSRVF: 70 121 141

DLDPYDRSLHSRVFP: 111 152 127

LDPYDRSLHSRVFPS: 99 142 106

DPYDRSLHSRVFPSG: 90 120 134

PYDRSLHSRVFPSGK: 86 120 130

YDRSLHSRVFPSGKC: 364 818 127

DRSLHSRVFPSGKCS: 98 142 141

RSLHSRVFPSGKCSG: 87 141 156

SLHSRVFPSGKCSGV: 69 111 141

LHSRVFPSGKCSGVA: 78 114 129

HSRVFPSGKCSGVAV: 97 118 111

SRVFPSGKCSGVAVS: 100 125 24

RVFPSGKCSGVAVSS: 69 110 106

VFPSGKCSGVAVSST: 74 114 142

FPSGKCSGVAVSSTY: 64 134 146

PSGKCSGVAVSSTYC: 56 112 132

SGKCSGVAVSSTYCS: 64 121 120

GKCSGVAVSSTYCST: 92 143 145

KCSGVAVSSTYCSTN: 88 130 130

CSGVAVSSTYCSTNH: 110 165 143

SGVAVSSTYCSTNHD: 79 110 115

GVAVSSTYCSTNHDY: 79 114 108

VAVSSTYCSTNHDYT: 85 114 118

AVSSTYCSTNHDYTI: 71 105 102

VSSTYCSTNHDYTIW: 78 107 121

SSTYCSTNHDYTIWM: 76 107 121

STYCSTNHDYTIWMP: 86 99 119

TYCSTNHDYTIWMPE: 96 107 74

YCSTNHDYTIWMPEN: 47 92 29

CSTNHDYTIWMPENP: 52 106 86

STNHDYTIWMPENPR: 60 112 107

TNHDYTIWMPENPRL: 69 129 119

NHDYTIWMPENPRLG: 71 119 130

HDYTIWMPENPRLGM: 82 125 123

DYTIWMPENPRLGMS: 93 127 123

YTIWMPENPRLGMSC: 97 132 143

TIWMPENPRLGMSCD: 69 106 134

IWMPENPRLGMSCDI: 98 110 101

WMPENPRLGMSCDIF: 88 113 120

MPENPRLGMSCDIFT: 105 121 143

PENPRLGMSCDIFTN: 83 111 104

ENPRLGMSCDIFTNS: 71 118 111

NPRLGMSCDIFTNSR: 90 113 138

PRLGMSCDIFTNSRG: 72 112 105

RLGMSCDIFTNSRGK: 88 106 113

LGMSCDIFTNSRGKR: 76 110 114

GMSCDIFTNSRGKRA: 54 120 101

MSCDIFTNSRGKRAS: 46 110 106

SCDIFTNSRGKRASK: 44 111 98

CDIFTNSRGKRASKG: 42 104 117

DIFTNSRGKRASKGS: 70 107 111

IFTNSRGKRASKGSE: 77 125 87

FTNSRGKRASKGSET: 83 111 119

TNSRGKRASKGSETC: 68 108 110

NSRGKRASKGSETCG: 92 100 119

SRGKRASKGSETCGF: 64 93 90

RGKRASKGSETCGFV: 75 104 115

GKRASKGSETCGFVD: 92 124 118

KRASKGSETCGFVDE: 92 106 129

RASKGSETCGFVDER: 86 110 134

ASKGSETCGFVDERG: 97 108 103

SKGSETCGFVDERGL: 92 102 76

KGSETCGFVDERGLY: 90 97 44

GSETCGFVDERGLYK: 57 115 92

SETCGFVDERGLYKS: 33 116 86

ETCGFVDERGLYKSL: 64 120 138

TCGFVDERGLYKSLK: 47 120 125

CGFVDERGLYKSLKG: 72 115 120

GFVDERGLYKSLKGA: 84 120 129

FVDERGLYKSLKGAC: 86 121 124

VDERGLYKSLKGACK: 50 108 110

DERGLYKSLKGACKL: 90 119 54

ERGLYKSLKGACKLK: 90 118 106

RGLYKSLKGACKLKL: 90 121 121

GLYKSLKGACKLKLC: 94 129 92

LYKSLKGACKLKLCG: 93 136 141

YKSLKGACKLKLCGV: 80 112 110

KSLKGACKLKLCGVL: 129 113 110

SLKGACKLKLCGVLG: 200 111 124

LKGACKLKLCGVLGL: 340 90 23

KGACKLKLCGVLGLR: 181 111 100

GACKLKLCGVLGLRL: 123 134 129

ACKLKLCGVLGLRLM: 148 117 142

CKLKLCGVLGLRLMD: 410 111 147

KLKLCGVLGLRLMDG: 273 120 114

LKLCGVLGLRLMDGT: 918 145 148

KLCGVLGLRLMDGTW: 3152 132 86

LCGVLGLRLMDGTWV: 83 138 129

CGVLGLRLMDGTWVA: 99 117 104

GVLGLRLMDGTWVAM: 89 148 117

VLGLRLMDGTWVAMQ: 90 141 127

LGLRLMDGTWVAMQT: 102 115 97

GLRLMDGTWVAMQTS: 104 138 120

LRLMDGTWVAMQTSN: 103 114 118

RLMDGTWVAMQTSNE: 100 113 130

LMDGTWVAMQTSNET: 96 106 106

MDGTWVAMQTSNETK: 97 97 110

DGTWVAMQTSNETKW: 69 114 92

GTWVAMQTSNETKWC: 58 113 82

TWVAMQTSNETKWCP: 78 118 107

WVAMQTSNETKWCPP: 50 114 116

VAMQTSNETKWCPPD: 86 104 151

AMQTSNETKWCPPDQ: 104 114 128

MQTSNETKWCPPDQL: 104 132 125

QTSNETKWCPPDQLV: 92 120 155

TSNETKWCPPDQLVN: 97 111 90

SNETKWCPPDQLVNL: 99 129 110

NETKWCPPDQLVNLH: 90 128 107

ETKWCPPDQLVNLHD: 105 120 118

TKWCPPDQLVNLHDF: 85 125 125

KWCPPDQLVNLHDFR: 89 113 121

WCPPDQLVNLHDFRS: 101 119 99

CPPDQLVNLHDFRSD: 93 137 127

PPDQLVNLHDFRSDE: 107 120 56

PDQLVNLHDFRSDEI: 35 106 63

DQLVNLHDFRSDEIE: 54 117 97

QLVNLHDFRSDEIEH: 60 113 106

LVNLHDFRSDEIEHL: 47 104 100

VNLHDFRSDEIEHLV: 83 129 98

NLHDFRSDEIEHLVV: 83 113 110

LHDFRSDEIEHLVVE: 93 115 121

HDFRSDEIEHLVVEE: 69 107 150

DFRSDEIEHLVVEEL: 99 103 110

FRSDEIEHLVVEELV: 86 114 116

RSDEIEHLVVEELVR: 100 138 104

SDEIEHLVVEELVRK: 101 117 118

DEIEHLVVEELVRKR: 94 123 143

EIEHLWEELVRKRE: 82 113 121

IEHLVVEELVRKREE: 90 129 118

EHLVVEELVRKREEC: 82 114 106

HLVVEELVRKREECL: 82 123 46

LVVEELVRKREECLD: 64 100 79

VVEELVRKREECLDA: 62 108 97

VEELVRKREECLDAL: 58 111 101

EELVRKREECLDALE: 69 112 123

ELVRKREECLDALES: 82 113 117

LVRKREECLDALESI: 86 130 124

VRKREECLDALESIM: 58 181 151

RKREECLDALESIMT: 73 110 137

KREECLDALESIMTT: 102 113 97

REECLDALESIMTTK: 94 110 106

EECLDALESIMTTKS: 82 120 133

ECLDALESIMTTKSV: 91 112 125

CLDALESIMTTKSVS: 101 146 155

LDALESIMTTKSVSF: 97 116 152

DALESIMTTKSVSFR: 104 120 188

ALESIMTTKSVSFRR: 97 132 137

LESIMTTKSVSFRRL: 48 114 130

ESIMTTKSVSFRRLS: 62 111 114

SIMTTKSVSFRRLSH: 54 130 97

IMTTKSVSFRRLSHL: 43 101 111

MTTKSVSFRRLSHLR: 59 116 125

TTKSVSFRRLSHLRK: 66 118 111

TKSVSFRRLSHLRKL: 83 125 123

KSVSFRRLSHLRKLV: 108 124 129

SVSFRRLSHLRKLVP: 64 123 117

VSFRRLSHLRKLVPG: 90 111 105

SFRRLSHLRKLVPGF: 92 110 96

FRRLSHLRKLVPGFG: 90 108 111

RRLSHLRKLVPGFGK: 92 143 118

RLSHLRKLVPGFGKA: 93 123 148

LSHLRKLVPGFGKAY: 96 139 150

SHLRKLVPGFGKAYT: 113 132 132

HLRKLVPGFGKAYTI: 99 111 102

LRKLVPGFGKAYTIF: 83 118 82

RKLVPGFGKAYTIFN: 47 115 86

KLVPGFGKAYTIFNK: 47 114 123

LVPGFGKAYTIFNKT: 54 112 139

VPGFGKAYTIFNKTL: 58 114 138

PGFGKAYTIFNKTLM: 78 113 157

GFGKAYTIFNKTLME: 78 123 320

FGKAYTIFNKTLMEA: 90 151 356

GKAYTIFNKTLMEAD: 76 127 418

KAYT1FNKTLMEADA: 101 123 554

AYTIFNKTLMEADAH: 86 121 197

YTIFNKTLMEADAHY: 104 147 161

TIFNKTLMEADAHYK: 107 123 1405

IFNKTLMEADAHYKS: 100 118 1828

FNKTLMEADAHYKSV: 111 141 2736

NKTLMEADAHYKSVR: 104 116 141

KTLMEADAHYKSVRT: 91 98 123

TLMEADAHYKSVRTW: 100 114 90

LMEADAHYKSVRTWN: 73 107 97

MEADAHYKSVRTWNE: 62 129 83

EADAHYKSVRTWNEI: 58 97 106

ADAHYKSVRTWNEIL: 56 100 100

DAHYKSVRTWNEILP: 59 121 112

AHYKSVRTWNEILPS: 112 160 125

HYKSVRTWNEILPSK: 80 130 123

YKSVRTWNEILPSKG: 66 137 116

KSVRTWNEILPSKGC: 115 125 114

SVRTWNEILPSKGCL: 106 138 118

VRTWNEILPSKGCLR: 90 124 133

RTWNEILPSKGCLRV: 120 127 120

TWNEILPSKGCLRVG: 97 146 127

WNEILPSKGCLRVGG: 102 136 117

NEILPSKGCLRVGGR: 104 130 163

EILPSKGCLRVGGRC: 104 112 128

ILPSKGCLRVGGRCH: 79 113 107

LPSKGCLRVGGRCHP: 77 119 100

PSKGCLRVGGRCHPH: 69 138 91

SKGCLRVGGRCHPHV: 72 121 103

KGCLRVGGRCHPHVN: 68 130 115

GCLRVGGRCHPHVNG: 85 125 123

CLRVGGRCHPHVNGV: 102 132 134

LRVGGRCHPHVNGVF: 104 143 133

RVGGRCHPHVNGVFF: 86 143 99

VGGRCHPHVNGVFFN: 120 136 120

GGRCHPHVNGVFFNG: 86 119 119

GRCHPHVNGVFFNGI: 117 113 117

RCHPHVNGVFFNGII: 98 141 143

CHPHVNGVFFNGIIL: 97 150 151

HPHVNGVFFNGIILG: 104 138 164

PHVNGVFFNGIILGP: 93 173 146

HVNGVFFNGIILGPD: 97 123 114

VNGVFFNGIILGPDG: 68 116 85

NGVFFNGIILGPDGN: 66 117 97

GVFFNGIILGPDGNV: 58 116 100

VFFNGIILGPDGNVL: 55 132 108

FFNGIILGPDGNVLI: 92 143 105

FNGIILGPDGNVLIP: 61 139 130

NGIILGPDGNVLIPE: 102 146 141

GIILGPDGNVLIPEM: 107 132 123

IILGPDGNVLIPEMQ: 85 118 93

ILGPDGNVLIPEMQS: 125 134 119

LGPDGNVLIPEMQSS: 100 134 150

GPDGNVLIPEMQSSL: 86 154 157

PDGNVLIPEMQSSLL: 87 129 139

DGNVLIPEMQSSLLQ: 123 134 169

GNVLIPEMQSSLLQQ: 96 120 168

NVLIPEMQSSLLQQH: 72 120 150

VLIPEMQSSLLQQHM: 92 104 142

LIPEMQSSLLQQHME: 89 111 85

IPEMQSSLLQQHMEL: 89 128 129

PEMQSSLLQQHMELL: 62 133 93

EMQSSLLQQHMELLE: 58 129 142

MQSSLLQQHMELLES: 65 113 117

QSSLLQQHMELLESS: 82 114 132

SSLLQQHMELLESSV: 90 128 132

SLLQQHMELLESSVI: 124 163 133

LLQQHMELLESSVIP: 78 111 121

LQQHMELLESSVIPL: 106 134 128

QQHMELLESSVIPLV: 103 134 133

QHMELLESSVIPLVH: 98 146 139

HMELLESSVIPLVHP: 110 129 134

MELLESSVIPLVHPL: 90 125 152

ELLESSVIPLVHPLA: 90 133 155

LLESSVIPLVHPLAD: 72 117 118

LESSVIPLVHPLADP: 90 128 128

ESSVIPLVHPLADPS: 104 138 143

SSVIPLVHPLADPST: 73 104 93

SVIPLVHPLADPSTV: 72 137 107

VIPLVHPLADPSTVF: 69 141 123

IPLVHPLADPSTVFK: 96 156 188

PLVHPLADPSTVFKD: 93 112 138

LVHPLADPSTVFKDG: 164 174 188

VHPLADPSTVFKDGD: 98 138 125

HPLADPSTVFKDGDE: 74 141 117

PLADPSTVFKDGDEA: 99 125 90

LADPSTVFKDGDEAE: 68 116 113

ADPSTVFKDGDEAED: 147 152 110

DPSTVFKDGDEAEDF: 98 147 137

PSTVFKDGDEAEDFV: 104 143 141

STVFKDGDEAEDFVE: 104 120 125

TVFKDGDEAEDFVEV: 107 124 96

VFKDGDEAEDFVEVH: 100 106 93

FKDGDEAEDFVEVHL: 65 76 119

KDGDEAEDFVEVHLP: 72 93 76

DGDEAEDFVEVHLPD: 85 123 91

GDEAEDFVEVHLPDV: 46 124 113

DEAEDFVEVHLPDVH: 68 136 123

EAEDFVEVHLPDVHN: 76 117 114

AEDFVEVHLPDVHNQ: 123 138 123

EDFVEVHLPDVHNQV: 90 141 123

DFVEVHLPDVHNQVS: 96 141 118

FVEVHLPDVHNQVSG: 92 143 102

VEVHLPDVHNQVSGV: 106 141 123

EVHLPDVHNQVSGVD: 91 150 139

VHLPDVHNQVSGVDL: 110 114 137

HLPDVHNQVSGVDLG: 104 150 129

LPDVHNQVSGVDLGL: 104 154 154

PDVHNQVSGVDLGLP: 106 129 115

DVHNQVSGVDLGLPN: 117 133 113

VHNQVSGVDLGLPNW: 100 119 38

HNQVSGVDLGLPNWG: 76 106 38

NQVSGVDLGLPNWGK: 78 138 98

Promedio: 91,9 119,5 130,9

D.E.: 157,9 37,6 169,8

Tabla 15: Potencias neutralizantes de IgG anti-proteína G de virus de la rabia.

Nombre de IgG: UI/mg

CR04-001: 89

CR04-004: 5

CR04-008: 1176

CR04-010: 3000

CR04-018: 1604

CR04-021: 1500

CR04-026: <2

CR04-031: 272

CR04-038: 2330

CR04-040: 3041

CR04-060: 89

CR04-073: 6116

CR04-097: <1

CR04-098: 7317

CR04-103: 3303

CR04-104: 4871

CR04-108: 4871

CR04-120: 4938

CR04-125: 4718

CR04-126: 2655

CR04-140: 478

CR04-144: 6250

CR04-146: ND

CR04-164: 4724

CR57: 3800

CRJB: 605

Tabla 16: Potencias neutralizantes de IgG anti-proteína G de virus de la rabia frente a virus de escape E57.

ND = no determinado

Nombre de IgG: E57A2 (UI/mg) E57A3 (UI/mg) E57B1 (UI/mg) E57B2 (UI/mg) E57B3 (UI/mg) E57C3 (UI/mg)

CR04-008: 0* 0 0 0 0 0

CR04-010: 8127 1355 5418 1355 2709 4064

CR04-018: 1604 0 1604 0 59 535

CR04-021: 450 2 150 8 50 50

CR04-038: 9437 1573 9437 1049 6291 1573

CR04-040: 8209 2736 24628 1368 5473 912

CR04-073: 8256 1835 11008 1835 3669 1835

CR04-098: 9878 3293 9878 3293 3293 3293

CR04-103: 8917 2972 17835 2972 5945 2972

CR04-104: 3288 2192 6576 2192 4384 1096

CR04-108: 3288 731 4384 731 2192 731

CR04-120: 1111 14 741 82 247 41

CR04-125: 708 39 236 79 157 79

CR04-126: 88 0 18 0 18 0

CR04-144: 5625 2813 11250 2813 5625 1875

CR04-164: 4252 472 4252 472 945 709

Tabla 17. Potencia neutralizante de CR-57 frente a virus de escape E98.

*: 0 indica ausencia de criterio de valoración del 50% a una dilución de 1:100 del anticuerpo

*: Cero indica ausencia de criterio de valoración del 50% a una dilución de 1:1000 del anticuerpo.

E98-2 (UI/mg): E98-4 (UI/mg) E98-5 (UI/mg) E98-6 (UI/mg) E98-7 (UI/mg)

CR-57: 2813 8438 4219 2813 8438

CR04-098: 0* 0 0 0 0

Tabla 18: Aparición de residuos de aminoácido en la región de unión mínima de CR57 dentro de virus de la rabia de 10 genotipo 1.

Tipo natural: K L C G V L

K (99,6%)*: L (100%) C (100%) G (98,7%) V (99,6%) L (70,7%)

R (0,4%): E (0,9%) I (0,4%) P (26,7%)

R (0,4%): S (2,6%)

* Se muestra el porcentaje de aparición de cada aminoácido se muestra dentro de 229 aislados de virus de la rabia.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para identificar una molécula de unión que potencialmente tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia o una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de unión que potencialmente tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia, en donde el método comprende las etapas de:

a) poner en contacto una colección de moléculas de unión en la superficie de paquetes genéticos replicables con un virus de la rabia en condiciones que conducen a la unión, en donde la colección de moléculas de unión se prepara a partir de ARN aislado de células obtenidas de un sujeto humano que ha sido vacunado contra la rabia o que ha sido expuesto al virus de la rabia.

b) separar y recuperar moléculas de unión que se unen al virus de la rabia de moléculas de unión que no se unen,

c) aislar al menos una molécula de unión recuperada,

d) verificar si las moléculas de unión aisladas tienen actividad neutralizante contra el virus de la rabia,

que comprende además la etapa de separar y recuperar moléculas de unión codificadas por un gen de la línea germinal pesada variable 3-30.
2.

Método según la reivindicación 1, en donde el virus de la rabia es inactivado.
3.

Método según la reivindicación 1 o 2, en donde la colección de moléculas de unión en la superficie de paquetes genéticos replicables es una librería de Fv de cadena única.
4.

Método según la reivindicación 1, 2 o 3, en donde el sujeto es un individuo humano que ha sido vacunado contra la rabia.
5.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado por que el paquete genético replicable se selecciona del grupo que consiste en una partícula de fago, una bacteria, una levadura, un hongo, una espora de un microorganismo y un ribosoma.