PT2314620E

PT2314620E - Método de identificação de moléculas de ligação capazes de neutralizar o vírus da raiva

Info

Publication number: PT2314620E
Application number: PT101803757T
Authority: PT
Inventors: Alexander Berthold Hendrik Bakker; Willem Egbert Marissen; Robert Arjen Kramer; Cornelis Adriaan De Kruif
Original assignee: Crucell Holland Bv
Priority date: 2004-05-27
Filing date: 2005-05-26
Publication date: 2013-09-02
Also published as: CA2568162A1; PT2314621E; AU2005250163B2; ATE501171T1; IL201970A; CN102212132A; KR20070044807A; IL179586A0; HRP20110320T1; NZ550366A; RS51847B; PT1749029E; EP2314620B1; HK1094705A1; EP2314620A1; DK1749029T3; EA200602210A1; CA2568162C; JP2008508859A; PL2314621T3

Description

ΕΡ 2 314 620/PT DESCRIÇÃO "Método de identificação de moléculas de ligação capazes de neutralizar o vírus da raiva"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se à medicina. Em particular a invenção refere-se à identificação de moléculas de ligação que neutralizam o virus da raiva. As moléculas de ligação são úteis na profilaxia da raiva pós-exposição.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A raiva é uma infecção virai com distribuição quase mundial que afecta principalmente animais selvagens e domésticos mas também envolve seres humanos, resultando numa encefalite devastadora, quase invariavelmente fatal. Anualmente, estimam-se em mais de 70 000 as mortes humanas e milhões de outras pessoas requerem tratamento pós-exposição. 0 virus da raiva é um virus de ARN com forma de projéctil, envelopado, de cadeia simples classificado na família de rabdovírus e género Lyssavirus. 0 genoma do vírus da raiva codifica cinco proteínas virais: ARN-polimerase dependente de ARN (L) ; uma nucleoproteína (N) ; uma proteína fosforilada (P); uma proteína de matriz (M) localizada no lado interno do envelope da proteína virai; e uma glicoproteína (G) da superfície externa. A proteína G (62 a 67 kDa) é uma glicoproteína tipo I composta por 505 aminoácidos que tem dois a quatro locais de N-glicosilação potenciais, dos quais apenas um ou dois são glicosilados dependendo das estirpes virais. A proteína G forma as protrusões que cobrem a superfície externa do envelope do virião e sabe-se que induz anticorpos de neutralização virai. A raiva pode ser tratada ou prevenida tanto por imunização passiva como activa. A profilaxia da raiva na pós-exposição inclui o cuidado do ferimento local imediato e a administração das imunizações tanto passiva (imunoglobulinas anti-raiva) como activa (vacinas). 2

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Correntemente, as imunoglobulinas anti-raiva (RIG) são preparadas a partir de amostras séricas de seres humanos imunes ao vírus da raiva (HRIG) ou cavalos imunes ao vírus da raiva (ERIG) . Uma desvantagem dos ERIG assim como dos HRIG é que não estão disponíveis em quantidades suficientes e, no caso dos HRIG, são muito caros. Além disso, o uso de ERIG levaria a reacções adversas tais como choque anafiláctico. A possibilidade de contaminação por patogénios conhecidos ou desconhecidos é um problema adicional associado com os HRIG. Para superar estas desvantagens foi sugerido usar anticorpos monoclonais capazes de neutralizar o vírus da raiva em profilaxia na pós-exposição. Os anticorpos monoclonais de murino que neutralizam o vírus da raiva são conhecidos na técnica (ver Schumacher et ai., 1989) . Contudo, o uso de anticorpos de murino in vivo é limitada devido a problemas associados com a administração de anticorpos de murino aos seres humanos, tais como meia-vida sérica curta, uma incapacidade para deflagrar certas funções efectoras humanas e indução de uma resposta imune drástica não desejada contra o anticorpo de murino num ser humano (a reacção do "anticorpo anti-ratinho humano" (HAMA)).

Recentemente, foram descritos anticorpos monoclonais humanos que neutralizam o vírus da raiva (ver Dietzschold et al., 1990, Champion et al., 2000 e Hanlon et al., 2001). Para que os anticorpos monoclonais anti-raiva humanos sejam tão eficazes quanto os HRIG em profilaxia na pós-exposição, deve ser usada uma mistura de anticorpos monoclonais. Numa tal mistura cada anticorpo deve ligar-se a um epítopo ou local diferente no vírus para prevenir o escape de variantes resistentes do vírus.

Correntemente, existe ainda uma necessidade significativa de novos anticorpos monoclonais humanos que neutralizam o vírus da raiva tendo potencial profiláctico na pós-exposição melhorado, particularmente anticorpos tendo diferentes especificidades de reconhecimento de epítopos. A presente invenção proporciona tais anticorpos monoclonais humanos que oferecem o potencial para serem usados em misturas úteis em profilaxia na pós-exposição de uma ampla gama de vírus da raiva e suas variantes resistentes à neutralização. 3 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a comparação das sequências de aminoácidos da estirpe CVS-11 do vírus da raiva e vírus de escape E57. As células infectadas com vírus foram colhidas 2 dias após a infecção e o ARN total foi isolado. 0 ADNc foi gerado e usado para a sequenciação de ADN. São apresentadas as regiões contendo mutações e as mutações são indicadas a negrito. A Figura IA mostra a comparação das sequências de nucleótidos. Os números acima dos aminoácidos indicam números de aminoácidos da glicoproteína do vírus da raiva incluindo péptido de sinal. A Figura 1B mostra a comparação de sequências de aminoácidos. 0 desenho esquemático da glicoproteína do vírus da raiva é mostrado no topo. A caixa a preto indica o péptido de sinal, enquanto a caixa cinza indica o domínio transmembranar. As sequências na Figura 1 também estão representadas pelas SEQ ID NOs: 130 a 141. A Figura 2 mostra a comparação das sequências de aminoácidos da estirpe CVS-11 do vírus da raiva e vírus de escape EJB. As células infectadas com vírus foram colhidas 2 dias após a infecção e o ARN total foi isolado. O ADNc foi gerado e usado para a sequenciacão de ADN. As regiões contendo mutações são mostradas e as mutações são indicadas em negrito. A Figura 2A mostra a comparação das sequências de nucleótidos. Os números acima dos aminoácidos indicam os números de aminoácido da glicoproteína do vírus da raiva incluindo o péptido de sinal. A Figura 2B mostra a comparação de sequências de aminoácidos. O desenho esquemático da glicoproteína do vírus da raiva é mostrado no topo. A caixa preta indica o péptido de sinal, enquanto a caixa cinza indica o domínio transmembranar. As sequências na Figura 2 também são representadas pelas SEQ ID NOs: 142-151. A Figura 3 mostra o vector PDV-006. A Figura 4 mostra um ELISA de competição de scFv anti-vírus da raiva e o anticorpo anti-vírus da raiva biotinilado designado por CR-57. As placas de ELISA revestidas com a proteína G do vírus da raiva purificada foram incubadas com as respectivas scFv antes da adição de CR-57bio (0,5 μρ/ιηΐ).

Subsequentemente, a ligação de CR-57bio foi monitorada na ausência e presença de scFv. 4 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ A Figura 5 mostra um ELISA de competição da scFv anti-virus da raiva e do anticorpo anti-virus da raiva designado por CR-57. As placas de ELISA revestidas com proteína G do vírus da raiva purificada foram incubadas com CR-57 (1 pg/ml) antes da adição de scFv em excesso. Subseguentemente, a ligação de scFv foi monitorada na ausência e presença de CR-57. A Figura 6 mostra um ensaio de ELISA de competição de IgG anti-proteína G do vírus da raiva e do anticorpo anti-virus da raiva denominado CR-57. A proteína G (estirpe ERA) foi incubada com IgG não marcadas (mostradas no eixo X) . A CR57 biotinilada (CR57bio) foi adicionada e deixada ligar à proteína G antes da visualização por meio de estreptavidina-HRP. Os sinais de ELISA são mostrados como percentagem de ligação de CR57bio sozinho. A Figura 7 mostra um ensaio de FACS de competição de IgG anti-proteína G do vírus da raiva e o anticorpo anti-virus da raiva denominado de CR-57. Células PER.C6 que expressam proteína G (estirpe ERA) foram incubadas com IgG não marcadas (mostradas no eixo dos X). Adicionou-se CR57 biotinilado (CR57bio) e deixou-se ligar às células que expressam a proteína G antes da visualização por meio de estreptavidina-PE. Os sinais de FACS são mostrados como percentagem da ligação de CR57bio sozinho. A Figura 8 mostra a comparação das sequências de aminoácidos de CVS-11 e vírus de escape E98. As células infectadas com vírus foram colhidas 2 dias após a infecção e foi isolado o ARN total. 0 ADNc foi gerado e usado para a sequenciação de ADN. A região contendo uma mutação de ponto é mostrada e a mutação é indicada em negrito. A Figura 8A mostra a comparação das sequências de nucleótidos. 0 número acima do nucleótido indica o nucleótido mutado (indicado em negrito) do quadro de leitura aberto da glicoproteína do vírus da raiva sem a sequência de péptido de sinal. A Figura 8B mostra a comparação de sequências de aminoácidos. 0 número acima do aminoácido indica o aminoácido mutado (indicado em negrito) da glicoproteína do vírus da raiva sem a sequência de péptido de sinal. A Figura 9 mostra uma árvore filogenética de 123 vírus da raiva de rua (123 sequências de glicoproteína G do vírus da 5

ΕΡ 2 314 620/PT raiva, método "neighbor joining", modelo de Kimura de 2 parâmetros, 500 "bootstraps"). O negrito indica vírus que abrigam a mutação N>D como observado nos vírus de escape E98. A Figura 10 mostra a neutralização de epítopos na glicoproteína da raiva. É mostrado um desenho esquemático da glicoproteína do vírus da raiva representando os locais antigénicos incluindo o novo epítopo CR57. O péptido de sinal (19 aminoácidos) e o domínio transmembranar são indicados pelas caixas pretas. As pontes de dissulfureto são indicadas. A numeração de aminoácidos é da proteína madura menos a sequência de péptido de sinal.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Abaixo seguem as definições de termos como usados na invenção.

DEFINIÇÕES

Molécula de Ligação

Como aqui usado o termo "molécula de ligação" refere-se a uma imunoglobulina intacta incluindo anticorpos monoclonais, tais como anticorpos monoclonais quiméricos, humanizados ou humanos, ou a um domínio de ligação de antigénio e/ou variável que compreende o fragmento de uma imunoglobulina que compete com a imunoglobulina intacta quanto a ligação específica ao parceiro de ligação da imunoglobulina, por exemplo, o vírus da raiva ou um seu fragmento tal como por exemplo, a proteína G. Independente da estrutura, o fragmento de ligação de antigénio liga-se com o mesmo antigénio que é reconhecido pela imunoglobulina intacta. Um fragmento de ligação de antigénio pode compreender um péptido ou polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 2 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 30 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 35 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 60 resíduos de amino contíguos, pelo menos 70 resíduos de 6 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ aminoácidos contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 125 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos, ou pelo menos 250 resíduos de aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos da molécula de ligação. O termo "molécula de ligação", como aqui usado inclui todas as classes e subclasses de imunoglobulinas conhecidas na técnica. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, as moléculas de ligação podem ser divididas nas cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e diversos destes podem ser ainda divididos em subclasses (isotipos), por exemplo, IgAl, IgA2, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4.

Os fragmentos de ligação ao antigénio incluem, inter alia, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, fragmentos da região determinante de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única bivalentes, anticorpos em fagos de cadeia única, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, (poli)péptidos que contenham pelo menos um fragmento de uma imunoglobulina que seja suficiente para conferir ligação especifica ao antigénio ao (poli)péptido, etc. Os fragmentos acima podem ser produzidos sinteticamente ou pela clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas ou podem ser geneticamente manipulados por técnicas de ADN recombinante. Os métodos de produção são bem conhecidos na técnica e estão descritos, por exemplo, em Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow e D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. Uma molécula de ligação ou um seu fragmento de ligação ao antigénio podem ter um ou mais locais de ligação. Se existe mais do que um local de ligação, os locais de ligação podem ser idênticos entre si ou podem ser diferentes. A molécula de ligação pode ser uma molécula de ligação nua, ou não conjugada, mas também pode ser parte de um imunoconjugado. Uma molécula de ligação nua ou não conjugada pretende referir-se a uma molécula de ligação que não está conjugada, operativamente ligada ou de outro modo física ou 7 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ funcionalmente associada a uma porção efectora ou marca, tais como inter alia uma substância tóxica, uma substância radioactiva, um lipossoma, uma enzima. Será entendido que as moléculas de ligação nuas ou não conjugadas não excluem moléculas de ligação que foram estabilizadas, multimerizadas, humanizadas ou de qualquer outro modo manipuladas, outras que não pela ligação de uma porção efectora ou marca. Consequentemente, todas as moléculas de ligação nuas e não conjugadas modificadas pós-tradução são aqui incluídas, incluindo quando as modificações são feitas no ambiente natural da célula que produz a molécula de ligação, por uma célula que produz a molécula de ligação recombinante e são introduzidos, pela mão do homem depois da preparação da molécula de ligação inicial. Naturalmente, o termo molécula de ligação nua ou não conjugada não exclui a capacidade da molécula de ligação para formar associações funcionais com células efectoras e/ou moléculas depois da administração ao corpo, visto que algumas destas interacções são necessárias de modo a exercer um efeito biológico. A falta de grupo efector ou marca associados é portanto aplicada por definição à molécula de ligação nua ou não conjugada in vitro, não in vivo.

Regiões determinantes de complementaridade (CDR) 0 termo "regiões determinantes de complementaridade", como aqui usado, significa sequências dentro das regiões variáveis de moléculas de ligação, tais como imunoglobulinas, que usualmente contribuem num grau amplo para o local de ligação ao antigénio que é complementar na forma e distribuição de cargas ao epítopo reconhecido no antigénio. As regiões CDR podem ser específicas para epítopos lineares, epitopos descontínuos ou epítopos conformacionais de proteínas ou fragmentos de proteínas, como presente na proteína na sua conformação nativa ou, em alguns casos, como presente nas proteínas como desnaturadas, por exemplo, pela solubilização em SDS. Os epítopos também podem consistir em modificações pós-tradução de proteínas.

Variante Funcional 0 termo "variante funcional", como aqui usado, refere-se a uma molécula de ligação que compreende uma sequência de nucleótidos e/ou de aminoácidos que é alterada em um ou mais 8

ΕΡ 2 314 62Ο/PT nucleótidos e/ou aminoácidos comparativamente com as sequências de nucleótidos e/ou de aminoácidos da molécula de ligação precursora e que é ainda capaz de competir pela ligação ao parceiro de ligação, por exemplo, o virus da raiva ou um seu fragmento, com a molécula de ligação precursora. Por outras palavras, as modificações na sequência de aminoácidos e/ou de nucleótidos da molécula de ligação precursora não afecta nem altera significativamente as caracteristicas de ligação da molécula de ligação codificada pela sequência de nucleótidos ou contendo a sequência de aminoácidos, isto é, a molécula de ligação é ainda capaz de reconhecer e ligar o seu alvo. A variante funcional pode ter modificações de sequência conservativas incluindo substituições, adições e deleções de nucleótidos e de aminoácidos. Estas modificações podem ser introduzidas pelas técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagénese dirigida ao local e mutagénese mediada por PCR aleatória e podem compreender nucleótidos e aminoácidos naturais assim como não naturais.

As substituições de aminoácidos conservativas incluem aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo propriedades estruturais ou químicas similares. As famílias dos resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano). Será evidente para o técnico especialista que outras classificações de famílias de resíduos de aminoácidos do que aquela usada acima também podem ser utilizadas. Além disso, uma variante pode não ter substituições de aminoácidos conservativas, por exemplo, substituição de um aminoácido com um resíduo de aminoácido tendo propriedades estruturais ou químicas diferentes. Variações similares menores também podem incluir deleções ou inserções, ou ambos. Orientação na determinação de quais 9

ΕΡ 2 314 620/PT resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou eliminados sem abolir a actividade imunológica pode ser encontrada usando programas de computador bem conhecidos na técnica.

Uma mutação numa sequência de nucleótidos pode ser uma alteração única feita num local (uma mutação pontual), tal como mutações de transição ou transversão, ou alternativamente, nucleótidos múltiplos podem ser inseridos, eliminados ou trocados num único local. Além disso, uma ou mais alterações podem ser feitas em qualquer número de locais dentro de uma sequência de nucleótidos. As mutações podem ser realizadas por qualquer método adequado conhecido na técnica.

Hospedeiro

Pelo termo "hospedeiro", como aqui usado, pretende referir-se um organismo ou uma célula em que um vector tal como um vector de clonagem ou um vector de expressão foram introduzidos. O organismo ou célula pode ser procariótica ou eucariótica. Deve ser entendido que este termo se destina a referir não apenas ao organismo ou célula objectos, mas também à progénie de um tal organismo ou célula. Porque certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido à mutação ou influências ambientais, tal progénie pode, de facto, não ser idêntica ao organismo ou célula precursora, mas são ainda incluídos dentro do escopo do termo "hospedeiro" como aqui usado.

Humano 0 termo "humano", quando aplicado às moléculas de ligação como aqui definido, refere-se às moléculas que são directamente derivados de um ser humano ou com base numa sequência humana. Quando uma molécula de ligação é derivada de ou com base numa sequência humana e subsequentemente modificada, deve ser ainda considerada humana como usado por todo o relatório descritivo. Por outras palavras, no termo humano, quando aplicado às moléculas de ligação pretende-se incluir moléculas de ligação tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana com base nas regiões variáveis ou constantes ou que não ocorrem num ser humano ou linfócito ou na forma modificada. Assim, as moléculas de ligação humanas 10

ΕΡ 2 314 620/PT podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana, compreendendo substituições e/ou deleções (por exemplo, mutações introduzidas por exemplo pela mutagénese aleatória ou específica de local in vitro ou pela mutação somática in vivo) . "Com base em" como aqui usado refere-se à situação em que uma sequência de ácido nucleico pode ser exactamente copiada a partir de um padrão, ou com mutações menores, tais como pelos métodos de PCR propensos a erro, ou sinteticamente feitos emparelhando o padrão exactamente ou com modificações menores. As moléculas semi-sintéticas com base nas sequências humanas também são consideradas como sendo humanas como aqui usado.

Anticorpo monoclonal O termo "anticorpo monoclonal" como aqui usado refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única, isto é estrutura primária, isto é tendo uma única sequência de aminoácidos. Um anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade de ligação e afinidade para com um epítopo particular. Consequentemente, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a um anticorpo que apresenta uma única especificidade de ligação que tem regiões variáveis e constantes derivadas de, ou com base em, sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana ou derivadas de sequências completamente sintéticas. O método de preparação do anticorpo monoclonal não é relevante.

Molécula de ácido nucleico 0 termo "molécula de ácido nucleico" como usado na presente invenção refere-se a uma forma polimérica de nucleótidos e inclui cadeias tanto de sentido directo como anti-sentido de ARN, ADNc, ADN genómico e formas sintéticas e polímeros mistos dos anteriores. Um nucleótido refere-se a um ribonucleótido, desoxinucleótido ou uma forma modificada de cada tipo de nucleótido. O termo também inclui formas de cadeia simples e dupla de ADN. Além disso, um polinucleótido pode incluir cada um ou ambos os nucleótidos que ocorre naturalmente e modificados ligados juntos pelas ligações de nucleótido que ocorre naturalmente e/ou que não ocorrem naturalmente. As moléculas de ácido nucleico podem ser química ou bioquimicamente modificadas ou podem conter bases de 11

ΕΡ 2 314 620/PT nucleótidos não naturais ou derivatizadas, como será facilmente avaliado pelos peritos na especialidade. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleótidos que ocorrem naturalmente por um análogo, modificações internucleotidicas tais como ligações não carregadas (por exemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), porções pendentes (por exemplo, polipéptidos), intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), quelantes, alquilantes e ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.). No termo acima também se pretende incluir qualquer conformação topológica, incluindo conformações em cadeia simples, cadeia dupla, parcialmente em dúplex, tríplex, na forma de gancho de cabelo, circular e na forma de cadeado. São também incluídas moléculas sintéticas que imitam polinucleótidos na sua capacidade para se ligarem a uma determinada sequência por intermédio de ligações de hidrogénio e outras interacções químicas. Tais moléculas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, aquelas em que ligações peptídicas substituem ligações de fosfato na cadeia principal da molécula. Uma referência a uma sequência de ácido nucleico abrange o seu complemento a menos que de outro modo seja especificado. Assim, uma referência a uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência particular deve ser entendido abranger a sua cadeia complementar, com a sua sequência complementar. A cadeia complementar também é útil, por exemplo, para terapia anti-sentido, sondas de hibridação e iniciadores de PCR.

Excipiente farmaceuticamente aceitável

Por "excipiente farmaceuticamente aceitável" entenda-se qualquer substância inerte que seja combinada com uma molécula activa tal como um medicamento, agente ou molécula de ligação para preparar uma forma de dosagem adequada ou conveniente. O "excipiente farmaceuticamente aceitável" é um excipiente que não é tóxico, ou pelo menos do qual a toxicidade é aceitável para o seu uso pretendido, para os recebedores nas dosagens e concentrações utilizadas e é compatível com outros ingredientes da formulação que constituem o medicamento, agente ou molécula de ligação. 12

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Profilaxia pós-exposição A "profilaxia pós-exposição" (PEP) é indicada para pessoas possivelmente expostas a um animal com raiva. Exposições possíveis incluem exposição à mordedura (isto é qualquer penetração da pele pelos dentes) incluindo mordeduras de animal e exposição que não pela mordedura. As exposições que não pela mordedura incluem exposição a quantidades grandes de vírus da raiva aerossolizadas em laboratórios ou cavernas e receptores cirúrgicos de córneas transplantadas de pacientes que morreram de raiva. A contaminação de ferimentos abertos, abrasões, membranas mucosas, ou teoricamente, arranhões, com saliva ou outro material potencialmente infecciosos (tais como tecido neural) a partir de um animal com raiva também constitui uma exposição que não pela mordedura. Outro contacto por si só, tal como acariciar um animal com raiva e o contacto com sangue, urina ou fezes de um animal com raiva, não constitui uma exposição e não é uma indicação para profilaxia. A PEP deve começar tão logo quanto possível depois de uma exposição. Se nenhuma exposição ocorreu a profilaxia pós-exposição não é necessária. Em suma, os regimes de profilaxia pós-exposição, excepto para pessoas anteriormente imunizadas, as imunizações activas e passivas devem ser usadas concorrentemente.

Ligar Especificamente A expressão "ligar especificamente", como aqui usada, em referência à interacção de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo e o seu parceiro de ligação, por exemplo, um antigénio, significa que a interacção é dependente da presença de uma estrutura particular, por exemplo, um determinante ou epítopo antigénicos, no parceiro de ligação. Por outras palavras, o anticorpo preferencialmente liga ou reconhece o parceiro de ligação mesmo quando o parceiro de ligação está presente numa mistura de outras moléculas ou organismos. A ligação pode ser mediada por interacções covalentes ou não covalentes ou uma combinação de ambas. Ainda por outras palavras, a expressão "ligar especificamente" significa ligar imunoespecificamente a um antigénio ou um seu fragmento e não ligar imunoespecificamente a outros antigénios. Uma molécula de ligação que se "imunoliga" especificamente a um antigénio pode ligar-se a outros péptidos 13 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ ou polipéptidos com afinidade mais baixa como determinado, por exemplo, por radioimunoensaios (RIA), ensaios imunossorventes com enzima ligada (ELISA), BIACORE, ou outros ensaios conhecidos na técnica. As moléculas de ligação ou seus fragmentos que se "imunoligam" especificamente a um antigénio podem ser cruzadamente reactivas com antigénios relacionados. Preferivelmente, as moléculas de ligação ou seus fragmentos que se "imunoligam" especificamente a um antigénio não reagem cruzadamente com outros antigénios.

Quantidade terapeuticamente eficaz A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade da molécula de ligação, como aqui definido, que é eficaz para a profilaxia pós-exposição à raiva.

Vector 0 termo "vector" denota uma molécula de ácido nucleico em que uma segunda molécula de ácido nucleico pode ser inserida para introdução num hospedeiro onde a mesma será replicada e em alguns casos expressa. Por outras palavras, um vector é capaz de transportar uma molécula de ácido nucleico à qual foi ligado. Clonagem, assim como vectores de expressão, são considerados pelo termo "vector", como aqui usado. Vectores incluem, mas não são limitados a, plasmídeos, cosmídeos, cromossomas artificiais bacterianos (BAC) e cromossomas artificiais de levedura (YAC) e vectores derivados de bacteriófagos ou vírus vegetal ou animal (incluindo humano). Os vectores compreendem uma origem de replicação reconhecida pelo hospedeiro proposto e no caso de vectores de expressão, um promotor e outras regiões reguladoras reconhecidas pelo hospedeiro. Um vector contendo uma segunda molécula de ácido nucleico é introduzido numa célula, por exemplo pela transformação, transfecção, ou fazendo uso de mecanismos de entrada bacteriana ou virai. São conhecidos outros modos de introduzir ácido nucleico em células, tais como electroporação ou bombardeamento de partícula frequentemente usados com células vegetais e outros. 0 método de introdução de ácido nucleico em células depende entre outras coisas do tipo de células e assim por diante. Isto não é crítico para a invenção. Certos vectores são capazes de replicação autónoma num hospedeiro no qual são introduzidos (por exemplo, vectores 14

ΕΡ 2 314 620/PT tendo uma origem bacteriana de replicação podem replicar em bactérias). Outros vectores podem ser integrados no genoma de um hospedeiro na introdução no hospedeiro e deste modo são replicados junto com o genoma hospedeiro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um método de identificação de moléculas de ligação capazes de se ligar especificamente ao vírus da raiva e neutralizá-lo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção abrange um método de identificação de moléculas de ligação capazes de se ligar especificamente ao virus da raiva e potencialmente possuindo actividade de neutralização do vírus da raiva. As moléculas de ligação são moléculas de ligação humanas. Alternativamente, também podem ser moléculas de ligação de outros animais. 0 vírus da raiva é parte do género Lyssavirus. No total, o género Lyssavirus inclui onze genótipos: vírus da raiva (genótipo 1), vírus do morcego Lagos (genótipo 2), vírus Mokola (genótipo 3), vírus Duvenhage (genótipo 4), lissavirus do morcego europeu 1 (genótipo 5), lissavirus do morcego europeu 2 (genótipo 6), lissavirus do morcego australiano (genótipo 7) , vírus Aravan (genótipo 8), vírus Khujand (genótipo 9), vírus Irkut (genótipo 10) e vírus do Oeste Caucasiano (genótipo 11). Além da ligação ao vírus da raiva, as moléculas de ligação também podem ser capazes de ligação a outros genótipos do género Lyssavirus. Preferivelmente, as moléculas de ligação também podem ser capazes de neutralizar outros genótipos do género Lyssavirus. Além disso, as moléculas de ligação podem mesmo ser capazes de ligar-se a vírus, e/ou neutralizá-los, outros gue não os lissavirus, da família rabdovírus. Esta família inclui os géneros dos citorabdovírus, efemerovírus, lissavirus, nucleorabdovírus, rabdovírus e vesiculovírus.

As moléculas de ligação podem ser capazes de se ligar especificamente ao vírus da raiva na sua forma natural ou na sua forma inactivada/atenuada. A inactivação do vírus da raiva pode ser realizada pelo tratamento inter alia com beta-propiolactona (BPL) (White e Chappel, 1982), aguecendo a 56°C por mais do gue 30 minutos, irradiação gama, tratamento com acetiletilenimina ou etilenimina ou tratamento com ácido 15 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ ascórbico e sulfato de cobre por 72 horas (Madhusudana et al.r 2004). Também podem ser usados métodos de inactivação virai geral bem conhecidos pelo técnico especialista tais como inter alia pasteurização (calor húmido), tratamento térmico seco, tratamento térmico com vapor, tratamento com pH baixo, tratamento com solvente orgânico/detergente, nanofiltração; irradiação com luz UV. Preferivelmente, a inactivação é realizada pelo tratamento com beta-propiolactona (BPL). Os métodos para testar se o vírus da raiva ainda é ineficaz ou parcial ou completamente inactivado são bem conhecidos pelo perito na especialidade e podem entre outros ser encontrados em Laboratory techniques in rabies, Editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan e H. Koprowski (1996), 4a edição, Capítulo 36, World Health Organization, Genebra.

As moléculas de ligação também podem ser capazes de se ligar especif icamente a um ou mais fragmentos do vírus da raiva tais como inter alia uma preparação de uma ou mais proteínas e/ou (poli)péptidos derivados do vírus da raiva ou uma célula transfectada com uma proteína e/ou (poli)péptido do vírus da raiva. Para os métodos de tratamento e/ou prevenção tais como métodos para a profilaxia pós-exposição do vírus da raiva as moléculas de ligação são preferivelmente capazes de se ligar especificamente às proteínas acessíveis na superfície do vírus da raiva tais como as proteínas M (ver Ameyama et al. 2003) ou G. Para propósitos de diagnóstico as moléculas de ligação humanas também podem ser capazes de se ligar especificamente às proteínas não presentes na superfície do vírus da raiva. A sequência de aminoácidos da superfície acessível e as proteínas internas de várias estirpes conhecidas do vírus da raiva podem ser encontradas na base de dados EMBL e/ou outras bases de dados.

Preferivelmente, o fragmento pelo menos compreende um determinante antigénico reconhecido pelas moléculas de ligação humanas da invenção. Um "determinante antigénico" como aqui usado é uma porção, tal como um (poli)péptido, (glico)proteína do vírus da raiva, ou seus análogos ou fragmentos, que é capaz de ligação a uma molécula de ligação humana da invenção com afinidade suficientemente alta para formar um complexo antigénio-molécula de ligação detectável. 16

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As moléculas de ligação podem ser moléculas de imunoglobulina intactas tais como anticorpos policlonais ou monoclonais, em particular anticorpos monoclonais humanos, ou as moléculas de ligação podem ser antigénio-fragmentos de ligação incluindo, mas não limitado a, Fab, F(ab'), F(ab')2/·

Fv, dAb, Fd, fragmentos da região determinante de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única bivalentes, anticorpos em fagos de cadeia única, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e (poli)péptidos que contêm pelo menos um fragmento de uma imunoglobulina que seja suficiente para conferir ligação de antigénio especifica ao vírus da raiva ou seu fragmento. As moléculas de ligação podem ser usadas na forma não isolada ou isolada. Além disso, as moléculas de ligação podem ser usadas sozinhas ou numa mistura que compreende pelo menos uma molécula de ligação humana (ou sua variante ou fragmento). Por outras palavras, as moléculas de ligação podem ser usadas em combinação, por exemplo, como uma composição farmacêutica que compreenda duas ou mais moléculas de ligação, variantes ou seus fragmentos. Por exemplo, as moléculas de ligação tendo actividade neutralizadora do vírus da raiva podem ser combinadas numa única terapia para se obter um efeito profilático, terapêutico ou de diagnóstico desejado.

Os vírus de ARN tais como o vírus da raiva fazem uso da sua própria ARN-polimerase durante a replicação virai. Estas ARN-polimerases tendem a ser propensas a erro. Isto leva à formação das denominadas "quase espécie" durante uma infecção virai. Cada "quase espécie" tem um genoma de ARN único, que pode resultar em diferenças na composição de aminoácido de proteínas virais. Se tais mutações ocorrem nas proteínas virais estruturais, o vírus pode potencialmente escapar ao sistema imunitário do hospedeiro devido a uma mudança nos epítopos das célula T ou B. A probabilidade disto acontecer é maior quando os indivíduos são tratados com uma mistura de duas moléculas de ligação, tais como anticorpos monoclonais humanos, do que com uma mistura de anticorpo policlonal (HRIG) . Portanto, um pré-requisito para uma mistura de dois anticorpos monoclonais humanos para o tratamento da raiva é que os dois anticorpos reconheçam epítopos que não se sobrepõem, não competidores no seu antigénio alvo, isto é a glicoproteína do vírus da raiva. A possibilidade da ocorrência de vírus da raiva que escapam é deste modo minimizada. Como 17

ΕΡ 2 314 620/PT consequência, as moléculas de ligação preferivelmente são capazes de reagir com epítopos diferentes, que não se sobrepõem, não competidores, do vírus da raiva, tais como epítopos na proteína G do vírus da raiva. A mistura de moléculas de ligação pode ainda compreender pelo menos um outro agente terapêutico tal como um medicamento adequado para a profilaxia pós-exposição à raiva.

Tipicamente, as moléculas de ligação de acordo com a invenção podem-se ligar a seus parceiros de ligação, isto é, o vírus da raiva ou seus fragmentos tais como as proteínas do vírus da raiva, com uma constante de afinidade (valor Kd) que é inferior a 0,2*10“4 Μ, 1,0*1(Γ5 Μ, 1,0*1(Γ6 M, 1,0*10“7 M, preferivelmente inferior a 1,0*1CT8 M, mais preferivelmente inferior a 1,0*10-9 M, mais preferivelmente inferior a 1,0*10-1° M, ainda mais preferivelmente inferior a 1,0*10-11 M e em particular inferior a 1,0*1CT12 M. As constantes de afinidade podem variar para os isotipos de anticorpo. Por exemplo, a ligação de afinidade para um isótopo IgM refere-se a uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 1,0*10-7 M. As constantes de afinidade por exemplo, podem ser medidas usando a ressonância plasmónica de superfície, isto é um fenómeno óptico que permite a análise de interacções bioespecificas em tempo real pela detecção de alterações nas concentrações de proteína dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo usando o sistema BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia).

As moléculas de ligação podem-se ligar ao vírus da raiva nas formas purifiçada/isolada ou não purificada/não isolada. As moléculas de ligação podem-se ligar ao vírus da raiva na forma solúvel tal como por exemplo, numa amostra ou podem-se ligar ao virus da raiva ligado ou fixado num transportador ou substrato, por exemplo, placas microtituladoras, membranas e pérolas, etc. Os transportadores ou substratos podem ser de vidro, plástico (por exemplo, poliestireno), polissacáridos, nylon, nitrocelulose ou teflon, etc. A superfície de tais suportes pode ser sólida ou porosa e ter qualquer formato conveniente. Alternativamente, as moléculas de ligação também se podem ligar a fragmentos de virus da raiva tais como proteínas ou (poli)péptidos do vírus da raiva. Numa concretização as moléculas de ligação são capazes de se ligar especificamente à proteína G do vírus da raiva ou a um seu 18 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ fragmento. As proteínas ou (poli)péptidos do vírus da raiva podem estar na forma solúvel ou podem-se ligar ao vírus da raiva ligado ou fixado num transportador ou substrato como descrito acima. Numa outra concretização, células transfectadas com a proteína G podem ser usadas como parceiro de ligação para as moléculas de ligação.

As moléculas de ligação neutralizam a infecciosidade do vírus da raiva. Isto pode ser obtido impedindo a ligação do vírus da raiva aos seus receptores nas células hospedeiras, tais como inter alia o receptor de neurotrofina p75 de murino, a molécula de adesão de a células neurais (CD56) e o receptor de acetilcolina, ou a inibição da libertação de ARN no citoplasma da célula ou prevenção da transcrição ou tradução do ARN. Numa concretização específica, as moléculas de ligação impedem o vírus da raiva de infectar as células hospedeiras em pelo menos 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 45%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 35%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 20%, ou pelo menos 10% em relação à infecção de células hospedeiras pelo vírus da raiva na ausência das ditas moléculas de ligação. A neutralização por exemplo, pode ser medida como descrito em Laboratory techniques in rabies, Editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan e H. Koprowski (1996), 4a edição, Capítulos 15 a 17, World Health Organization, Genebra. Além disso, as moléculas de ligação humanas podem ser moléculas de ligação de fixação de complemento capazes de auxiliar na lise de vírus da raiva envelopado. As moléculas de ligação humanas também podem actuar como opsoninas e aumentar a fagocitose do vírus da raiva pela promoção da sua captação por intermédio de receptores Fc ou C3b ou pela aglutinação do vírus da raiva para torná-lo mais facilmente fagocitado.

Numa concretização preferida as moléculas de ligação tendo a actividade neutralizadora do vírus da raiva são administradas no formato IgG, preferivelmente no formato IgGl. É um outro aspecto da presente divulgação proporcionar uma molécula de ácido nucleico que codifique pelo menos uma molécula de ligação. Tais moléculas de ácido nucleico podem ser usadas como intermediários para propósitos de clonagem, por exemplo, no processo de maturação por afinidade descrito 19 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ acima. Numa concretização preferida, as moléculas de ácido nucleico são isoladas ou purificadas. É um outro aspecto da divulgação proporcionar vectores, isto é construções de ácido nucleico, que compreendam uma ou mais moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Os vectores podem ser derivados de plasmídeos tais como inter alia F, Rl, RPl, Col, pBR322, TOL, Ti, etc; cosmídeos; fagos tais como lambda, lambdoid, M13, Mu, Pl, P22, Qr, T-par, T-impar, T2, T4, T7, etc; vírus vegetais tais como inter alia o vírus do mosaico da alfafa, bromovírus, capilovírus, carlavírus, carmovírus, caulivírus, clostervírus, comovírus, criptovírus, cucumovírus, diantovírus, fabavírus, fijivírus, furovírus, geminivírus, hordeivírus, ilarvírus, luteovírus, maclovírus, marafivírus, necrovírus, nepovírus, fitorepvírus, rabdovírus vegetal, potexvírus, potivírus, sobemovírus, tenuivírus, tobamovírus, tobravírus, vírus que murcha o tomate manchado, tombusvírus, timovírus, etc; ou vírus de animais tais como inter alia adenovírus, arenaviridae, baculoviridae, birnaviridae, bunyaviridae, calciviridae, cardiovírus, coronaviridae, corticoviridae, cystoviridae, vírus de Epstein-Barr, enterovírus, filoviridae, flaviviridae, vírus da febre aftosa, hepadnaviridae, víruses da hepatite, herpesviridae, vírus da imunodeficiência, vírus da influenza, inoviridae, iridoviridae, orthomyxoviridae, papovavírus, paramyxoviridae, parvoviridae, picornaviridae, vírus da poliomielite, polidnaviridae, poxviridae, reoviridae, retrovírus, rabdoviridae, rinovírus, vírus da floresta de Semliki, tetraviridae, togaviridae, toroviridae, vírus vaccinia, vírus da estomatite vesicular, etc. Os vectores podem ser usados para clonar e/ou para a expressão das moléculas de ligação humanas da invenção e podem ser usados até para propósitos de terapia génica. Vectores que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucleico operativamente ligadas a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que regulam a expressão também são divulgados. A escolha do vector é dependente dos procedimentos recombinantes seguidos e do hospedeiro usado. A introdução de vectores em células hospedeiras pode ser efectuada inter alia pela transfecção com fosfato de cálcio, infecção virai, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção por lipofectamina ou electroporação. Os vectores podem ser de replicação autónoma ou pode replicar junto com o cromossoma no qual foram 20

ΕΡ 2 314 620/PT integrados. Preferivelmente, os vectores contêm um ou mais marcadores de selecção. A escolha dos marcadores pode depender das células hospedeiras de escolha, embora isto não seja critico para a invenção como é bem conhecido pelos peritos na especialidade. Incluem, mas não se lhes limitam, canamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeocina, gene da timidina-quinase do vírus do Herpes simples (HSV-TK), gene da di-hidrofolato-redutase de ratinho (dhfr). Vectores que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de ligação humanas, como descrito acima, operativamente ligadas a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas ou péptidos que podem ser usadas para isolar as moléculas de ligação também são abrangidas pela invenção. Estas proteínas ou péptidos incluem, mas não são limitados a, glutationa-S-transferase, proteína de ligação de maltose, poli-histidina de ligação metálica, proteína fluorescente verde, luciferase e beta-galactosidase.

Hospedeiros contendo uma ou mais cópias dos vectores mencionados acima são um objectivo adicional da divulgação. Preferivelmente, os hospedeiros são células hospedeiras. As células hospedeiras incluem, mas não são limitadas às células de mamífero, planta, insecto, de origem fúngica ou bacteriana. As células bacterianas incluem, mas não são limitadas às células de bactérias Gram-positivas tais como diversas espécies dos géneros Bacillus, Streptomyces e Staphilococcus ou células de bactérias Gram-negativas tais como diversas espécies dos géneros Escherichia, tais como E. coli e Pseudomonas. No grupo de células fúngicas são usadas preferivelmente células de levedura. A expressão em levedura pode ser obtida usando estirpes de levedura tais como inter alia Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae e Hansenula polimorpha. Além disso, as células de insecto tais como células de Drosófila e Sf9 podem ser usadas como células hospedeiras. Além do que, as células hospedeiras podem ser células vegetais. Plantas ou células vegetais transformadas (transgénicas) são produzidas por métodos conhecidos, por exemplo, transferência de genes mediada por Agrobacteria, transformação de discos de folhas, transformação de protoplastos pela transferência de ADN induzida pelo polietilenoglicol, electroporação, tratamento com ultra-sons, micro-injeção ou transferência balística de genes. Adicionalmente, um sistema de expressão adequada pode ser um 21

ΕΡ 2 314 620/PT sistema de baculovírus. Os sistemas de expressão usando células de mamífero tais como células de Ovário do Hamster Chinês (CHO), células COS, células BHK ou células de melanoma de Bowes são preferidas na presente invenção. As células de mamífero proporcionam proteínas expressas com modificações pós-tradução que são mais similares às moléculas naturais de origem mamífera. Visto que a presente invenção lida com moléculas que podem ter que ser administradas a seres humanos, um sistema de expressão completamente humano seria particularmente preferido. Portanto, ainda mais preferivelmente, as células hospedeiras são células humanas. Os exemplos de células humanas são inter alia células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 e HEK293T. As células de mamífero preferidas são células da retina humana tais como células 911 ou a linhagem de célula depositada na European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Grã-Bretanha em 29 de Fevereiro de 1996 sob número 96022940 e comercializada sob a marca PER.C6® (PER.C6 é uma marca registada da Crucell Holland B.V.). Para os propósitos deste pedido "PER.C6" refere-se às células depositadas sob número 96022940 ou ancestrais, as passagens a montante ou a jusante assim como descendentes de ancestrais de células depositadas, assim como derivadas de qualquer uma das precedentes.

As células produtoras humanas podem compreender pelo menos uma parte funcional de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região EI de adenovírus num formato expressável. As ditas células hospedeiras são derivadas de uma retina humana e imortalizadas com ácidos nucleicos que compreendem sequências EI adenovirais, tais como a linhagem de célula depositada na European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Grã-Bretanha em 29 de Fevereiro de 1996 sob número 96022940 e comercializada sob a marca PER.C6®. A produção de proteínas recombinantes nas células hospedeiras podem ser realizadas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. O uso das células comercializadas sob a marca PER.C6® como uma plataforma de produção para proteínas de interesse foi descrito em WO 00/63403.

Um método de produção de uma molécula de ligação ou uma variante funcional de acordo com a invenção é uma parte adicional da divulgação. O método compreende as etapas de a) cultura de um hospedeiro sob condições condutivas à 22

ΕΡ 2 314 620/PT expressão da molécula de ligação ou sua variante funcional e b) opcionalmente, recuperação da molécula de ligação ou sua variante funcional, expressas. As moléculas de ligação ou suas variantes funcionais expressas podem ser recuperadas do extracto isento de célula, mas preferivelmente são recuperadas do meio de cultura. Os métodos para recuperar proteínas, tais como moléculas de ligação, a partir de extractos isentos de células ou meio de cultura, são bem conhecidos do perito na especialidade.

Alternativamente, a seguir à expressão em hospedeiros, tais como células hospedeiras, as moléculas de ligação ou suas variantes funcionais podem ser produzidas sinteticamente por sintetizadores de péptidos convencionais ou em sistemas de tradução isentos de células usando ácido nucleico de ARN derivado de moléculas de ADN.

Numa outra concretização as moléculas de ligação ou suas variantes funcionais podem ser geradas pelos mamíferos não humanos transgénicos, tais como por exemplo, ratinho ou coelhos transgénicos, que expressam os genes da imunoglobulina humana. Preferivelmente, os mamíferos não humanos transgénicos têm um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve humana que codifica a totalidade ou uma porção das moléculas de ligação humanas como descrito acima. Os mamíferos não humanos transgénicos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de vírus da raiva ou um seu fragmento. Os protocolos para imunizar mamíferos não humanos são bem estabelecidos na técnica. Ver Using Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque e Current Protocols in Immunology, Editado por: J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., Nova Iorque. A presente invenção proporciona um método de identificação de moléculas de ligação tais como anticorpos monoclonais humanos ou seus fragmentos ou ácido nucleico tal como reivindicado na reivindicação 1. A etapa de selecção pode ser realizada na presença do vírus da raiva. O vírus da raiva pode ser isolado ou não isolado, e.g. presente em soro e/ou sangue de um indivíduo infectado. Em outra concretização o 23

ΕΡ 2 314 620/PT vírus da raiva está inactivado. Alternativamente, a etapa de selecção pode ser realizada na presença de um fragmento do vírus da raiva tal como uma parte extracelular do vírus da raiva, um ou mais (poli)péptidos derivados do vírus da raiva tais como a proteína G, proteínas de fusão compreendendo estas proteínas ou (poli)péptidos, e similares. Em outra concretização, células transfectadas com proteína G do vírus da raiva são utilizadas para procedimentos de selecção.

Uma vez estabelecido ou identificado um novo anticorpo monoclonal com o método acima mencionado de identificação de moléculas de ligação ou moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de ligação, o ADN que codifica o scFv ou o Fab pode ser isolado a partir das bactérias ou pacotes genéticos replicáveis e combinado com técnicas padrão de biologia molecular para preparar construções que codificam scFv bivalentes ou imunoglobulinas humanas completas com uma especificidade desejada (e.g. IgG, igA ou IgM) . Estas construções podem ser transfectadas em linhagens de células adequadas e podem ser produzidos anticorpos monoclonais humanos completos (veja-se Huls et al., 1999; Boel et al., 2000) .

Um pacote genético replicável, como aqui se utiliza, pode ser procariota ou eucariota e inclui células, esporos, bactérias, vírus, (bacterió)fagos e polissomas. Um pacote genético replicável preferido é um fago. As moléculas de ligação humanas, tais como, por exemplo, Fv de cadeia única, são apresentadas no pacote genético replicável, i.e. estão ligadas a um grupo ou uma molécula localizados na superfície exterior do pacote genético replicável. O pacote genético replicável é uma unidade pesquisável compreendendo uma molécula de ligação humana a pesquisar ligada a uma molécula de ácido nucleico que codifica a molécula de ligação. A molécula de ácido nucleico deverá ser replicável quer in vivo (e.g., sob a forma de um vector) quer in vitro (e.g., por PCR, transcrição e tradução). A replicação in vivo pode ser autónoma (como para uma célula), com o auxílio de factores do hospedeiro (como para um vírus) ou com o auxílio tanto do hospedeiro como do vírus auxiliar (como para um fagemidio). Os pacotes genéticos replicáveis que apresentam uma coleção de moléculas de ligação humanas são formados por introdução de moléculas de ácido nucleico que codificam moléculas de ligação 24 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ exógenas a apresentar nos genomas dos pacotes genéticos replicáveis para formar proteínas de fusão com proteínas endógenas que são normalmente expressas a partir da superfície externa dos pacotes genéticos replicáveis. A expressão das proteínas de fusão, o transporte para a superfície externa e a montagem resultam na apresentação de moléculas de ligação exógenas a partir da superfície externa dos pacotes genéticos replicáveis. Num aspecto adicional a invenção refere-se a uma molécula de ligação humana capaz de ligação ao vírus da raiva ou a um seu fragmento e que é obtenível pelo método de identificação como descrito acima.

Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a um método de identificação de uma molécula de ligação potencialmente possuindo actividade de neutralização contra o vírus da raiva, em que o método compreende as etapas de (a) contacto de uma colecção de moléculas de ligação sobre a superfície de pacotes genéticos replicáveis com o vírus da raiva sob condições condutivas a ligação, (b) separação e recuperação de moléculas de ligação que se ligam ao vírus da raiva, de moléculas de ligação que não se ligam, (c) isolamento de pelo menos uma molécula de ligação recuperada, (d) verificação se a molécula de ligação isolada possui actividade de neutralização contra o vírus da raiva, caracterizado por o vírus da raiva na etapa a estar inactivado. 0 vírus da raiva inactivado pode ser purificado antes de ser inactivado. A purificação pode ser realizada por meio de métodos de purificação bem conhecidos adequados para vírus tais como, por exemplo, centrifugação através de um leito de glicerol. 0 vírus da raiva inactivado na etapa a pode ser imobilizado num material adequado antes da utilização. Alternativamente, o vírus da raiva na etapa a pode ainda estar activo. Em outra concretização alternativa, utiliza-se na etapa a um fragmento de um vírus da raiva, tal como um polipéptido de um vírus da raiva tal como a proteína G. Em ainda outra concretização, são utilizadas células transfectadas com proteína G do vírus da raiva para a selecção da molécula de ligação potencialmente possuindo actividade de neutralização contra o vírus da raiva. Como aqui indicado, quando as células que expressam a proteína G do vírus da raiva foram incluídas no método de selecção, o número de anticorpos de neutralização seleccionados foi superior comparativamente com os métodos de selecção em que apenas se 25

ΕΡ 2 314 620/PT utilizou proteína G de vírus da raiva purificada e/ou vírus da raiva inactivado.

De acordo com a invenção, o método de identificação de uma molécula de ligação potencialmente possuindo actividade de neutralização contra o vírus da raiva como descrito acima compreende ainda a etapa de separação e recuperação, e opcionalmente isolamento, de moléculas de ligação humanas contendo um gene da linha germinativa 3-30 pesado variável. Um perito na especialidade pode identificar o gene da linha germinativa específico por métodos conhecidos na especialidade tais como, por exemplo, sequenciação de nucleótidos. A etapa de separação e recuperação de moléculas de ligação contendo um gene da linha germinativa 3-30 pesado variável pode ser realizada antes ou após a etapa c. Como se indica adiante, a maioria dos vírus da raiva que neutralizam anticorpos monoclonais humanos encontrados na presente invenção compreendem este gene da linha germinativa específico de VH.

Os métodos de apresentação em fagos para a identificação e obtenção (neutralização) de moléculas de ligação, e.g. anticorpos, são actualmente métodos bem estabelecidos conhecidos pelos peritos na especialidade. Estão e.g. descritos na Patente US 5,696,108; Burton and Barbas, 1994; de Kruif et al., 1995b; e Phage Display: A Laboratory Manual. Edited by: CF Barbas, DR Burton, JK Scott and GJ Silverman (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Para a construção de bibliotecas de apresentação em fagos, colecções de genes da região variável das cadeias pesada e leve de anticorpos monoclonais humanos são expressas na superfície de bacteriófagos, preferivelmente bacteriófagos filamentosos, partículas, por exemplo no formato Fv de cadeia única (scFv) ou Fab (veja-se de Kruif et al., 1995b). Grandes bibliotecas de fagos que expressam fragmentos de anticorpos contêm tipicamente mais do que 1,0*109 especificidades de anticorpos e podem ser montadas a partir das regiões V de imunoglobulinas expressas nos linfócitos B de indivíduos imunizados ou não imunizados. Numa concretização específica da invenção a biblioteca em fagos de moléculas de ligação humanas, preferivelmente uma biblioteca de scFv em fagos, é preparada a partir de ARN isolado de células obtidas de um 26

ΕΡ 2 314 62Ο/PT indivíduo que foi vacinado contra a raiva ou foi exposto a um vírus da raiva. 0 ARN pode ser isolado a partir de inter alia medula óssea ou sangue periférico, preferivelmente linfócitos de sangue periférico. 0 indivíduo pode ser um animal vacinado ou exposto ao vírus da raiva, mas é preferivelmente um indivíduo humano que foi vacinado ou foi exposto ao vírus da raiva. Preferivelmente, o indivíduo humano foi vacinado. Uma colecção de moléculas de ligação humanas sobre a superfície de pacotes genéticos replicáveis, tais como uma biblioteca de scFv em fagos, como descrito acima, constitui outro aspecto da presente invenção.

Alternativamente, as bibliotecas de apresentação em fagos podem ser construídas a partir de regiões variáveis de imunoglobulinas que foram parcialmente montadas in vitro para introduzir diversidade adicional de anticorpos na biblioteca (bibliotecas semi-sintéticas) . Por exemplo, as regiões variáveis montadas in vitro contêm trechos de ADN aleatórios ou parcialmente aleatórios, produzidos sinteticamente, nas regiões das moléculas que são importantes para a especificidade do anticorpo, e.g. regiões CDR. Os anticorpos em fagos específicos para o vírus da raiva podem ser seleccionados a partir das bibliotecas por imobilização de antigénios alvo tais como antigénios do vírus da raiva numa fase sólida e subsequente exposição dos antigénios alvo a uma biblioteca de fagos para permitir a ligação dos fagos que expressam fragmentos de anticorpos específicos para o(s) antigénio(s) ligado(s) à fase sólida. Os fagos não ligados são removidos por lavagem e os fagos ligados são eluídos a partir da fase sólida para infecção de bactérias Escherichia coli (E. coli) e subsequente propagação. São usualmente necessárias múltiplas operações de selecção e propagação para enriquecer suficientemente de fagos que se ligam especificamente ao(s) antigénio(s) alvo. Se pretendido, antes da exposição da biblioteca de fagos aos antigénios alvo, a biblioteca de fagos pode ser primeiro subtraída por exposição da biblioteca de fagos a antigénios não alvo ligados a uma fase sólida. Podem também ser seleccionados fagos para ligação a antigénios complexos tais como misturas complexas de proteínas ou (poli)péptidos do vírus da raiva, células hospedeiras que expressam uma ou mais proteínas do vírus da raiva ou (poli)péptidos de vírus da raiva, ou os próprios vírus da raiva (inactivados). Os anticorpos em fagos específicos dos 27

ΕΡ 2 314 620/PT antigénios podem ser seleccionados a partir da biblioteca por incubação de uma fase sólida com uma preparação de vírus da raiva inactivados a ela ligada, com a biblioteca de anticorpos em fagos para deixar, por exemplo, a parte scFv ou Fab do fago ligar-se às proteínas/polipéptidos da preparação de vírus da raiva. Após a incubação e várias lavagens para remover fagos não ligados e ligados fracamente, os fagos que se ligaram através da sua parte scFv ou Fab à preparação são eluídos e utilizados para infectar Escherichia coli para permitir a amplificação da nova especificidade. Geralmente são necessárias uma ou mais operações de selecção para separar os fagos de interesse do grande excesso de fagos que não se ligam. Alternativamente, as proteínas ou (poli)péptidos conhecidos do vírus da raiva podem ser expressos em células hospedeiras e estas células podem ser utilizadas para a selecção de anticorpos em fagos específicos para as proteínas ou (poli)péptidos. Um método de apresentação em fagos que utiliza estas células hospedeiras pode ser estendido e melhorado subtraindo ligantes não relevantes durante a pesquisa por adição de um excesso de células hospedeiras não compreendendo moléculas alvo ou compreendendo moléculas não alvo que são similares, mas não idênticas, ao alvo, e que desse modo aumentam fortemente a possibilidade de encontrar moléculas de ligação relevantes (Este processo é referido como o processo MAbstract®. MAbstract® é uma marca registada da Crucell Holland B.V., veja-se também a Patente US 6,265,150).

As moléculas de ligação ou composições farmacêuticas da invenção podem ser testadas em sistemas de modelos animais adequados antes de se usarem em seres humanos. Tais sistemas de modelos animais incluem, mas não são limitados a, ratinhos, ratos, hamsters, macacos, etc.

As moléculas ou composições mencionados acima podem ser utilizadas em conjunção com outras moléculas úteis no diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento do vírus da raiva. Estas podem ser usadas in vitro, ex vivo ou in vivo. Por exemplo, as moléculas de ligação humanas, variantes funcionais, imunoconjugados ou composições farmacêuticas podem ser co-administrados com uma vacina contra a raiva. Alternativamente, a vacina também pode ser administrada antes ou depois da administração das moléculas ou composições. A administração das moléculas ou composições com uma vacina é 28 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ adequada para a profilaxia na pós-exposição. As vacinas contra a raiva incluem, mas não são limitadas à vacina de célula de embrião de pintainho purificada (PCEC) (RabAvert), vacina de célula diplóide humana (HDCV; vacina Imovax) ou vacina contra a raiva adsorvida (RVA).

As moléculas são tipicamente formuladas nas composições e composições farmacêuticas da invenção numa quantidade eficaz terapeuticamente ou para diagnóstico. Os regimes podem ser ajustados para proporcionar a resposta óptima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Uma gama de dosagem adequada pode ser por exemplo, de 0,1 a 100 Ul/kg de peso corporal, preferivelmente de 1,0 a 50 Ul/kg de peso corporal e mais preferivelmente de 10 a 30 Ul/kg de peso corporal, tal como 20 Ul/kg de peso corporal.

Preferivelmente, administra-se um bolo único das moléculas de ligação ou composições farmacêuticas. As moléculas e composições farmacêuticas são preferivelmente estéreis. Os métodos para tornar estas moléculas e composições estéreis são bem conhecidos na técnica. O regime de dosagem de profilaxia na pós-exposição consiste na administração de cinco doses de vacina contra a raiva intramuscularmente no músculo deltoide nos dias 0, 3, 7, 14 e 28 dias depois da exposição em indivíduos não anteriormente imunizados contra o vírus da raiva. As moléculas de ligação humanas ou composições farmacêuticas devem ser administradas dentro e ao redor dos ferimentos no dia 0 ou de outro modo logo que possível depois da exposição, com o volume remanescente dado intramuscularmente num local distante da vacina. Aconselha-se que os indivíduos não vacinados sejam administrados com moléculas de ligação humanas anti-vírus da raiva, mas é evidente para o técnico especialista que os indivíduos vacinados com necessidade deste tratamento também podem ser administrados com as moléculas de ligação humanas anti-vírus da raiva.

As moléculas de ligação podem ser usadas para identificar epítopos de proteínas do vírus da raiva tais como a proteína G. Os epítopos podem ser lineares, mas também estruturais e/ou conformacionais. Numa concretização, a ligação de moléculas de ligação da invenção a uma série de péptidos que se sobrepõem, tais como péptidos 15-mero, de uma 29

ΕΡ 2 314 620/PT proteína do vírus da raiva tal como a proteína G do vírus da raiva pode ser analisada por meio da análise PEPSCAN (ver inter alia WO 84/03564, WO 93/09872, Slootstra et al. 1996). A ligação de moléculas de ligação humanas a cada péptido pode ser testada num imunoensaio com enzima ligada (ELISA) com base em PEPSCAN. Numa outra concretização, uma biblioteca de péptidos aleatória que compreende péptidos de proteínas do vírus da raiva pode ser triada quanto aos péptidos capazes de ligação às moléculas de ligação humanas da invenção. Nos ensaios acima o uso de moléculas de ligação humanas que neutralizam o vírus da raiva pode identificar um ou mais epítopos de neutralização. Os péptidos/epítopos encontrados podem ser usados como vacinas e para o diagnóstico da raiva.

EXEMPLOS

Para ilustrar a invenção, são proporcionados os seguintes exemplos.

Exemplo 1

Reconhecimento de epítopos de anticorpos anti-raiva humanos CR-5 7 e CR-JB

Para verificar se os anticorpos monoclonais humanos denominados CR-57 e CR-JB reconhecem epítopos que não se sobrepõem, não competidores, foram gerados vírus de escape dos anticorpos monoclonais humanos denominados CR-57 e CR-JB. Os CR-57 e CR-JB foram gerados essencialmente como descrito (ver Jones et al., 2003), por intermédio da introdução das regiões codificadoras de cadeia pesada e leve variáveis dos genes de anticorpo correspondentes num único vector de expressão de IgGl humano denominado pcDNA3002(Neo). Os vectores resultantes pgS057Cll e pgSOJBCll foram usados para expressão transiente em células da linhagem de células depositada na European Colection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Grã-Bretanha em 29 de Fevereiro de 1996 sob o número 96022940 e comercializada sob a marca PER.C6®. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos das cadeias pesadas e leves destes anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 122 a 129, respectivamente. Incubaram-se diluições em série (0,5 ml) da estirpe CVS-11 do vírus da raiva (diluições variando de 10_1 a 10-8) com uma quantidade constante (~4 Ul/ml) de anticorpo CR-57 ou CR-JB (0,5 ml) por 1 hora a 37°C/5% de CO2 antes da adição a poços contendo células de neuroblastoma de ratinho 30 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ (células ΜΝΑ) ou células BSR (linhagem de células semelhante à de Rim de Hamster Bebé) . Depois de 3 dias de selecção na presença de anticorpo monoclonal humano CR-57 ou CR-JB, o meio (1 ml) contendo vírus de escape potenciais foi colhido e armazenado a 4°C até uso posterior. Subsequentemente, as células foram fixadas em acetona por 20 minutos a 4°C e coradas durante a noite a 37°C/5% de CO2 com um conjugado de anticorpo N-FITC anti-raiva (Centocor). O número de focos por poço foram contados por imunofluorescência e o meio dos poços contendo de um a seis focos foi escolhido para a amplificação de vírus. Todos os vírus de escape E57 foram gerados a partir de 1 único foco com a excepção de E57B1 (3 focos). Os vírus de escape EJB foram isolados de 1 foco (EJB3F), 3 focos (EJB2B, 4 focos (EJB2C), 5 focos (EJB2E, 2F), ou 6 focos (EJB2D), respectivamente. Cada vírus de escape foi primeiro amplificado numa escala pequena em células BSR ou MNA dependendo das suas características de crescimento. Estes lotes virais pequenos foram depois usados para amplificar adicionalmente o vírus em grande escala em células MNA ou BSR. O vírus amplificado foi depois titulado em células MNA para determinar o título de cada lote virai de escape assim como a diluição óptima do vírus de escape (dando 80 a 100% de infecção depois de 24 horas) para uso num ensaio de neutralização virai.

Foram realizados ensaios de RFFIT modificados (teste de inibição de foco fluorescente rápido) para examinar a protecção cruzada de E57 (o vírus de escape de CR-57) e EJB (o vírus de escape de CR-JB) com CR-JB e CR-57, respectivamente. Portanto, diluiu-se CR-57 ou CR-JB por diluições triplas em série partindo com uma diluição de 1:5. O vírus da raiva (estirpe CVS-11) foi adicionado a cada diluição numa concentração que dá 80 a 100% de infecção. A mistura vírus/IgG foi incubada por 1 hora a 37°C/5% de C02 antes da adição a células MNA. 24 horas após a infecção (a 34°C/5% de C02) as células foram fixadas com acetona por 20 minutos a 4°C e coradas por no mínimo de 3 horas com um conjugado de anticorpo N-FITC anti-vírus da raiva (Centocor). Os poços foram depois analisados quanto a infecção pelo vírus da raiva sob um microscópio de fluorescência para determinar a diluição de ponto final em 50%. Esta é a diluição à qual a infecção virai é bloqueada em 50% neste ensaio. Para calcular a potência, foi incluído um padrão internacional (Rabies Immune Globulin Lot R3, Material de referência do laboratório da Standards and 31

ΕΡ 2 314 620/PT

Testing DMPQ/CBER/FDA) em cada RFFIT modificado. A diluição de ponto final em 50% deste padrão corresponde a uma potência de 2 Ul/ml. Foi testada a potência de neutralização dos anticorpos monoclonais humanos CR-57 e CR-JB individuais assim como da combinação destes anticorpos.

Os vírus EJB já não foram neutralizados por CR-JB ou CR-57 (ver a Tabela 1), sugerindo que ambos os anticorpos se ligaram a, e induziram mudanças de aminoácidos em, regiões similares da glicoproteína do vírus da raiva. Os vírus E57 já não foram neutralizados pelo CR-57, ao passo que 4 dos 6 vírus E57 foram ainda neutralizados por CR-JB, embora com uma potência mais baixa (ver a Tabela 1). Uma mistura dos anticorpos CR-57 e CR-JB (numa relação de Ul/mg de 1:1) deu resultados similares como observados com os anticorpos individuais (dados não mostrados).

Para identificar mutações possíveis na glicoproteína do vírus da raiva foi determinada a sequência de nucleótidos do quadro de leitura aberto (ORF) da glicoproteína de cada um dos vírus de escape EJB e E57. 0 ARN virai de cada um dos vírus de escape e CVS-11 foi isolado a partir de células MNA infectadas pelo vírus e convertido em ADNc por RT-PCR padrão. Subsequentemente, o ADNc foi usado para a sequenciação de nucleótidos das ORF da glicoproteína do vírus da raiva de modo a identificar mutações.

Ambos os vírus de escape E57 e EJB apresentaram mutações na mesma região da glicoproteína (ver as Figuras 1 e 2, respectivamente; ver quanto a todas as sequências descritas nas Figuras 1 e 2 SEQ ID NO:130 a 151). Isto indica que ambos os anticorpos reconhecem epítopos que se sobrepõem. A partir

do acima pode ser concluído que a combinação de CR-57 e CR-JB num cocktail não impede o escape de variantes resistentes à neutralização e não é portanto uma preparação de imunoglobulina ideal para a profilaxia pós-exposição da raiva.

Exemplo 2

Construção de uma biblioteca de apresentação em fagos ScFv usando linfócitos de sangue periférico de dadores vacinados contra a raiva.

Colheram-se 50 ml de sangue de quatro indivíduos humanos vacinados contra a raiva a partir de uma veia, uma semana 32 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ depois do último reforço. Os linfócitos de sangue periférico (PBL) foram isolados a partir destas amostras de sangue usando fraccionamento por densidade de células Ficoll. 0 soro do sangue foi recolhido e congelado a -20°C. A presença de anticorpos anti-raiva nos soros foi testada positiva usando uma coloração FACS nas células 293T transfectadas com glicoproteína do vírus da raiva. O ARN total foi preparado a partir de PBL usando separação de fase orgânica (TRIZOL®) e subsequente precipitação com etanol. O ARN obtido foi dissolvido em água ultrapura tratada com DEPC e a concentração foi determinada por medição da DO a 260 nm. Depois disso, o ARN foi diluído para uma concentração de 100 ng/μΐ. Em seguida, 1 pg de ARN foi convertido em ADNc como segue: A 10 μΐ de ARN total, foram adicionados 13 μΐ de água ultrapura tratada com DEPC e 1 μΐ de hexâmeros aleatórios (500 ng/μΐ) e a mistura obtida foi aquecida a 65°C por 5 minutos e rapidamente arrefecida em gelo húmido. Depois, foram adicionados à mistura 8 μΐ de tampão de First-Strand 5X, 2 μΐ de dNTP (10 mM de cada), 2 μΐ de DTT (0,1 M), 2 μΐ de inibidor de ARNase (40 U/μΙ) e 2 μΐ de transcriptase inversa MMLV Superscript III (200 U/μΙ), incubou-se à temperatura ambiente por 5 minutos e incubou-se por 1 hora a 50°C. A reacção foi terminada por inactivação térmica, isto é incubando a mistura por 15 minutos a 75°C.

Os produtos de ADNc obtidos foram diluídos até um volume final de 200 μΐ com água ultrapura tratada com DEPC. A DO a 260 nm de uma solução diluída 50 vezes (em tampão Tris 10 mM) da diluição dos produtos de ADNc obtidos deu um valor de 0,1.

Para cada dador usaram-se 5 a 10 μΐ dos produtos de ADNc diluídos como molde para a amplificação por PCR da família de sequências de cadeia pesada gama e cadeias leves capa ou lambda da imunoglobulina usando iniciadores oligonucleotídicos específicos (ver as Tabelas de 2 a 7) . As misturas da reacção PCR continham, além dos produtos de ADNc diluídos, 25 pmol de iniciador de sentido directo e 25 pmol de iniciador de anti-sentido num volume final de 50 μΐ de Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), 50 mM de KC1, 2,5 mM de MgCl2, 250 μΜ de dNTP e 1,25 unidades de polimerase Taq. Num aparelho de ciclos térmicos de tampa aquecida tendo uma temperatura de 96°C, as misturas obtidas 33

ΕΡ 2 314 620/PT foram rapidamente fundidas por 2 minutos, seguidas pelos 30 ciclos de: 30 segundos a 96°C, 30 segundos a 60°C e 60 segundos a 72°C.

Numa primeira operação de amplificação, cada um dos dezassete iniciadores de sentido directo da região variável de cadeia leve (onze para a cadeia leve lambda (ver a Tabela 2) e seis para a cadeia leve capa (ver a Tabela 3) foram combinados com um iniciador anti-sentido que reconhece a C-capa denominado HuCk 5'-ACACTCTCCCCTGTTGAAGC TCTT-3' (ver a SEQ ID NO:152) ou região constante C-lambda HuCX2 5'-TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3' (ver a SEQ ID NO:153) e HuCX7 5'-AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3' (ver a SEQ ID NO:154) (os iniciadores anti-sentido HuCX2 e HuCX7 foram misturados até a equimolaridade antes do uso), rendendo 4 vezes 17 produtos de cerca de 600 pares de bases. Estes produtos foram purificados num gel de agarose a 2% e isolados do gel usando colunas de extracção em gel Qiagen. Usou-se 1/10 de cada um dos produtos isolados numa reacção PCR idêntica como descrito acima usando os mesmos dezassete iniciadores de sentido directo, por meio do que cada iniciador de sentido directo da cadeia leve lambda foi combinado com um dos três iniciadores anti-sentido específicos da região Jlambda e cada iniciador de sentido directo da cadeia leve capa foi combinado com um dos cinco iniciadores anti-sentido específicos da região Jcapa. Os iniciadores usados na segunda amplificação foram estendidos com locais de restrição (ver a Tabela 4) para possibilitar a clonagem dirigida no vector fágico de apresentação PDV-006 (ver a Figura 3 e SEQ ID NO:155). Isto resultou em 4 vezes 63 produtos de aproximadamente 350 pares de bases que foram reunidos num total de 10 fracções. Este número de fracções foi escolhido para manter a distribuição natural das famílias de cadeias leves diferentes dentro da biblioteca e não sobre- ou infra-representar algumas famílias. O número de alelos dentro de uma família foi usado para determinar a percentagem de representação dentro de uma biblioteca (ver a Tabela 5) . Na etapa seguinte, 2,5 pg de fracção reunida e 100 pg de vector PDV-006 foram digeridos com Sall e Notl e purificados a partir do gel. Depois disso, foi realizada uma ligação durante a noite a 16 °C como segue. A 500 ng de vector PDV-006 foram adicionados 70 ng da fracção reunida num volume total de 50 μΐ de mistura de ligação contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 34 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 1 mM de ATP, 25 μg/ml de BSA e 2,5 μΐ de ADN-Ligase de T4 (400 U/μΙ) . Este procedimento foi seguido para cada fracção reunida. As misturas de ligação foram purificadas por fenol/clorofórmio, seguido por uma extracção com clorofórmio e precipitação com etanol, métodos bem conhecidos do técnico especialista. O ADN obtido foi dissolvido em 50 μΐ de água ultrapura e por mistura de ligação duas vezes aliquotas de 2,5 μΐ foram electroporados em 40 μΐ de bactérias E. coli competentes em TG1 de acordo com o protocolo do fabricante (Stratagene). Os transformantes foram cultivados durante a noite a 37°C num total de 30 placas (três placas por fracção reunida; dimensões da placa: 240 mm x 240 mm) contendo ágar 2TY suplementado com 50 μρ/ιηΐ de ampicilina e 4,5% de glicose. Obteve-se uma (sub)biblioteca de regiões variáveis de cadeia leve raspando os transformantes das placas de ágar. Esta (sub)biblioteca foi directamente usada para a preparação de ADN plasmídicos usando um kit de preparação QIAFilter MAXI prep da Qiagen .

Para cada dador as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina foram amplificadas a partir das mesmas preparações de ADNc num procedimento de PCR de duas operações similares e parâmetros de reacção idênticas como descrito acima para as regiões de cadeia leve com a condição de que os iniciadores representados nas Tabelas 6 e 7 foram usados. A primeira amplificação foi realizada usando um conjunto de nove iniciadores direccionados a sentido directo (ver a Tabela 6; que abrange todas as famílias de regiões variáveis de cadeia pesada) cada uma combinada com um iniciador anti-sentido da região constante especifica de IgG denominado HuCIgG 5'-GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3' (SEQ ID NO: 156) produzindo quatro vezes nove produtos de cerca de 650 pares de bases. Estes produtos foram purificados num gel de agarose a 2% e isolados a partir do gel usando colunas de extracção em gel Qiagen. 1/10 de cada um dos produtos isolados foi usado numa reacção de PCR idêntica como descrito acima usando os mesmos nove iniciadores de sentido directo, por meio do qual cada iniciador de sentido directo de cadeia pesada foi combinado com um dos quatro iniciadores anti-sentido específicos da região JH. Os iniciadores usados na segunda operação foram estendidos com locais de restrição (ver a Tabela 7) para possibilitar a clonagem dirigida no vector da (sub)biblioteca 35

ΕΡ 2 314 620/PT de cadeia leve. Isto resultou por dador em 36 produtos de aproximadamente 350 pares de bases. Estes produtos foram reunidos para cada dador por iniciador de sentido directo (VH) usado em nove fracções. Os produtos obtidos foram purificados usando colunas de Purificação por PCR Qiagen. Em seguida, as fracções foram digeridas com Sfll e Xhol e ligados no vector da (sub) biblioteca de cadeia leve, que foi cortado com as mesmas enzimas de restrição, usando o mesmo procedimento de ligação e volumes como descritos acima para a (sub)biblioteca de cadeia leve. Alternativamente, as fracções foram digeridas com Ncol e Xhol e ligadas no vector de cadeia leve, que foi cortado com as mesmas enzimas de restrição, usando o mesmo procedimento de ligação e volumes como descrito acima para a (sub)biblioteca de cadeia leve. A purificação de ligação e transformação subsequente da biblioteca definitiva resultante também foi realizada como descrito acima para a (sub)biblioteca de cadeia leve e neste ponto as misturas de ligação de cada dador foram combinadas por reunião de VH. Os transformantes foram cultivados em 27 placas (três placas por fracção reunida; dimensões de placa: 240 mm x 240 mm) contendo 2TY ágar suplementado com 50 pg/ml de ampicilina e 4,5% de glicose. Todas as bactérias foram colhidas em meio de cultura 2TY contendo 50 μρ/ιηΐ de ampicilina e 4, 5% de glicose, misturado com glicerol a 15% (v/v) e congelado em aliquotas de 1,5 ml a -80°C. O resgate e selecção de cada biblioteca foram realizados como descrito abaixo.

Exemplo 3

Selecção de fragmentos Fv de cadeia única que carregam fagos que reconhecem especificamente a glicoproteína do vírus da raiva

Fragmentos de anticorpo foram seleccionados usando bibliotecas de apresentação em fagos de anticorpo, a tecnologia da apresentação em fagos geral e a tecnologia MAbstract®, essencialmente como descritas na Patente US Número 6 265 150 e em WO 98/15833. As bibliotecas de fagos de anticorpo usadas foram duas bibliotecas de fagos de scFv semi-sintéticas diferentes (JK1994 e WT2000) e as bibliotecas de fagos de scFv imunes (RAB-03-G01 e RAB-04-G01) preparadas como descrito no Exemplo 2 acima. A primeira biblioteca de fagos de scFv semi-sintética (JK1994) foi descrita em de Kruif et ai. 36

ΕΡ 2 314 620/PT (1995b), a segunda (WT2000) foi construída essencialmente como descrito em de Kruif et al. (1995b). Em resumo, a biblioteca tem um formato semi-sintético por meio do qual a variação foi incorporada nos genes de V da cadeia pesada e leve usando oligonucleótidos degenerados que incorporam variação dentro das regiões de CDR. Apenas os genes da cadeia pesada VH3 foram usados, em combinação com os genes da cadeia leve capa e lambda. CDR1 e CDR3 da cadeia pesada e CDR3 da cadeia leve foram recriados sinteticamente num método com base em PCR similar como descrito em de Kruif et al. (1995b). Os genes da região V assim criados foram clonados sequencialmente no formato de scFv num vector fagemídeo e amplificados para gerar um biblioteca de fagos como descrito antes. Além disso, foram usados na presente invenção os métodos e fagos auxiliares como descritos em WO 02/103012. Para identificar anticorpos em fagos que reconhecem a glicoproteína do vírus da raiva, foram realizadas experiências de selecção de fagos usando o vírus da raiva integral (a estirpe Pitman-Moore do vírus da raiva) inactivado pelo tratamento com betapropiolactona, glicoproteína do vírus da raiva purificada (a estirpe ERA do vírus da raiva), e/ou células transfectadas que expressam a proteína G do virus da raiva (a estirpe ERA do vírus da raiva). A proteína G foi purificada a partir da estirpe ERA do vírus da raiva como segue. A uma solução de vírus, 1/10 volume de octil-beta-glicopiranósido a 10% foi adicionada e suavemente misturada. Numa incubação de 30 minutos a 4°C a amostra virai foi centrifugada (36.000 rpm, 4°C) num rotor SW51. O sobrenadante foi recolhido e dialisado durante a noite a 4°C contra Tris/EDTA 0,1 M. Subsequentemente, a glicoproteína foi recolhida da câmara de diálise, dividida em alíquotas e armazenada a -80°C até uso futuro. A concentração de proteína foi determinada pela DO 280 nm e a integridade da proteína G foi analisada pelo SDS-PAGE. O vírus da raiva integral inactivado ou a proteína G do vírus da raiva foram diluídos em solução salina tamponada com fosfato (PBS), 2 a 3 ml foram adicionados a Tubos MaxiSorp Nunc-Imuno (Nunc) e incubados durante a noite a 4°C numa roda rotativa. Uma alíquota de uma biblioteca de fagos (500 μΐ, aproximadamente 1013 cfu, amplificada usando o fago auxiliar CT (ver WO 02/103012)) foi bloqueada em tampão de bloqueio (2% 37

ΕΡ 2 314 62Ο/PT de Protifar em PBS) por 1 a 2 horas à temperatura ambiente. A biblioteca de fagos bloqueada foi adicionada ao imunotubo (pré-incubada com ou sem CR-57 scFv para bloquear o epítopo reconhecido por CR-57), incubada por 2 horas à temperatura ambiente e lavada com tampão de lavagem (0,1% de Tween-20 (Serva) em PBS) para remover os fagos não ligados. Os fagos ligados foram depois eluídos do antigénio pela incubação por 10 minutos à temperatura ambiente com 1 ml de Glicina-HCl 50 mM pH 2,2. Subsequentemente, os fagos eluídos foram misturados com 0,5 ml de Tris-HCl 1 M pH 7,5 para neutralizar o pH. Esta mistura foi usada para infectar 5 ml de uma cultura de E. coli XLl-Blue que foi cultivada a 37°C a uma DO 600 nm de aproximadamente 0,3. Os fagos foram deixados infectar as bactérias XLl-Blue por 30 minutos a 37°C. Depois, a mistura foi centrifugada por 10 minutos, a 3200*g à temperatura ambiente e a pelota bacteriana foi recolocada em suspensão em 0,5 ml de meio de extracto de levedura 2-tripton (2TY) . A suspensão bacteriana obtida foi dividida em duas placas de 2TY ágar placas suplementadas com tetraciclina, ampicilina e glicose. Depois da incubação durante a noite das placas a 37°C, as colónias foram raspadas das placas e usadas para preparar uma biblioteca de fagos enriquecida, essencialmente como descrito por De Kruif et al. (1995a) e WO 02/103012. Em resumo, as bactérias raspadas foram usadas para inocular meio 2TY contendo ampicilina, tetraciclina e glicose e cultivadas a uma temperatura de 37°C a uma DO 600 nm de -0,3. Os fagos auxiliares CT foram adicionados e deixados infectar as bactérias depois que o meio foi mudado para 2TY contendo ampicilina, tetraciclina e canamicina. A incubação foi continuada durante a noite a 30°C. No dia seguinte, as bactérias foram removidas do meio 2TY pela centrifugação depois que os fagos no meio foram precipitados usando polietileno glicol (PEG) 6000/NaCl. Finalmente, os fagos foram dissolvidos em 2 ml de PBS com 1% de albumina sérica bovina (BSA), esterilizados em filtro e usados para a operação seguinte de selecção.

As selecções de fagos também foram realizadas com células transfectadas da glicoproteína do vírus da raiva. As células usadas foram células da linhagem de células depositada na European Colection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Grã-bretanha em 29 de Fevereiro de 1996 sob o número 96022940 e comercializada sob a marca PER.C6®. Estas 38 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ são a seguir aludidas como células PER.C6®. Aqui, a biblioteca de fagos bloqueada (2 ml) foi primeiro adicionada a 1*107 de células subtractoras (em DMEM/10% FBS) e incubadas por 1 hora a 4°C numa roda rotativa. As células subtractoras foram células PER.C6® que expressaram o ectodominio da glicoproteína do Vírus da Estomatite Vesicular (VSV) na sua superfície fundida à transmembrana e ao domínio citoplasmático do vírus da raiva. Com esta etapa de subtracção, os fagos que reconhece a glicoproteína de VSV ou antigénios específicos para as células PER.C6® foram removidos da biblioteca de fagos. A mistura de fagos/células foi centrifugada (5 minutos a 4°C a 500xg) para remover os fagos ligados à célula e o sobrenadante foi adicionado a um novo tubo contendo 3 ml de 1*107 células subtractoras. A etapa de subtracção foi repetida duas vezes com o respectivo sobrenadante. Subsequentemente, os fagos subtraídos foram incubados por 1,5 hora a 4°C numa roda rotativa com as células transfectadas que expressam a glicoproteína do vírus da raiva (as células PER.C6® (3*106 células)). Antes disto, as células transfectadas foram pré incubadas com ou sem CR-57 scFv para bloquear o epítopo reconhecido pelo CR-57. Depois da incubação, as células foram lavadas cinco vezes com 1 ml de DMEM/10% de FBS (para cada lavagem, as células foram recolocadas em suspensão e transferidas a novo tubo), os fagos foram eluídos e processados como descrito acima.

Tipicamente, foram realizadas duas operações de selecção antes do isolamento de anticorpos em fagos individuais. Depois da segunda operação de selecção, colónias de E. coli individuais foram usadas para preparar anticorpos monoclonais em fagos. Essencialmente, as colónias individuais foram cultivadas até a fase log em formato de placa de 96 poços e infectadas com fagos auxiliares VCSM13 depois do que a produção de anticorpo em fagos foi deixada prosseguir durante a noite. Os anticorpos em fagos produzidos foram precipitados com PEG/NaCl e esterilizados em filtro e testados no ELISA quanto a ligação tanto ao vírus da raiva integral inactivado quanto à proteína G do vírus da raiva purificada. A partir da selecção foi obtido um painel grande de anticorpos em fagos que demonstrou ter ligação tanto ao vírus da raiva integral inactivado como à proteína G do vírus da raiva (ver exemplo abaixo). Duas estratégias de selecção foram seguidas com as bibliotecas imune descritas acima. Na primeira estratégia 39

ΕΡ 2 314 62Ο/PT foram seleccionados 736 anticorpos em fagos depois de duas operações de selecção usando na primeira e segunda operações de selecção virus inactivado ou proteína G purificada. Na segunda estratégia foram seleccionados 736 anticorpos em fagos depois de duas operações de selecção usando na primeira operação de selecção a proteína G recombinante expressa na superfície celular e na segunda operação de selecção vírus inactivado ou proteína G purificada. 0 número de anticorpos em fagos únicos obtidos pela primeira estratégia foi 97, enquanto a segunda estratégia produziu 70 destes únicos. Os 97 anticorpos em fagos únicos encontrados por meio da primeira estratégia deram origem a 18 anticorpos de neutralização e os 70 clones únicos identificados por meio da segunda estratégia produziram 33 anticorpos de neutralização. Isto claramente demonstra que as selecções que incluíram as células transfectadas da glicoproteína do vírus da raiva, isto é a proteína G recombinante expressa na superfície celular, como antigénio pareceu produzir mais anticorpos de neutralização comparado com as selecções usando apenas proteína G purificada e/ou vírus inactivado.

Exemplo 4

Validação dos anticorpos em fagos de cadeia única específicos da glicoproteína do vírus da raiva.

Os anticorpos em fagos de cadeia única seleccionados que foram obtidos nos cenários descritos acima, foram validados no ELISA quanto a especificidade, isto é ligação à proteína G do vírus da raiva, purificados como descrito acima. Adicionalmente, os anticorpos em fagos de cadeia única também foram testados quanto a ligação a FBS a 5%. Para este propósito, a proteína G do vírus da raiva ou a preparação de FBS a 5% foram revestidas em placas de ELISA Maxisorp®. Depois do revestimento, as placas foram bloqueadas em PBS/1% de Protifar por 1 hora à temperatura ambiente. Os anticorpos em fagos de cadeia única seleccionados foram incubados por 15 minutos num volume igual de PBS/1% de Protifar para obter anticorpos em fagos bloqueados. As placas foram esvaziadas e os anticorpos em fagos bloqueados foram adicionados aos poços. A incubação foi deixada continuar por uma hora, as placas foram lavadas em PBS contendo 0,1% de Tween-20 e os anticorpos em fagos ligados foram detectados (usando medição de DO a 40 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ 492 nm) usando um anticorpo anti-M13 conjugado à peroxidase. Como controlo, o procedimento foi realizado simultaneamente não usando nenhum anticorpo em fago de cadeia única, usando um anticorpo em fago de cadeia única de controlo negativo dirigido contra CD8 (SC02-007) ou um anticorpo em fago de cadeia única de controlo positivo dirigido contra a glicoproteína do vírus da raiva (scFv S057). Como mostrado na Tabela 8, os anticorpos em fagos seleccionados denominados 40 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ SC04-021, SC04-073, SC04-120, e SC04-164 SC04-001, SC04-026, SC04-097, SC04-125, SCO 4-0 0 4, SC04-031, SC04-098, SC04-126, SC04-008, SC04-038, SC04-103, SC04-140, SC04010, SC04040, SC04104, SC04144, SC04-018, SC04-060, SC04-108, SC04-146 apresentaram ligaçao à proteína G do vírus da raiva purificada imobilizada, enquanto nenhuma ligação ao FBS foi observada. Resultados idênticos foram obtidos no ELISA usando o vírus da raiva integral inactivado preparado como descrito acima (dados não mostrado).

Exemplo 5

Caracterização de scFv específicos do vírus da raiva A partir dos clones de anticorpos em fagos de cadeia única específicos seleccionados (scFv), foram obtidos o ADN plasmidico e foram determinadas as sequências de nucleótidos de acordo com técnicas padrão. A identidade dos genes de VH e VL (ver Tomlinson IM, Williams SC, Ignatovitch O, Corbett SJ, Winter G. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Centre for Protein Engineering (1997)) e as composições de CDR3 de cadeia pesada dos scFv que se ligam especificamente à proteína G do vírus da raiva são representadas na Tabela 9.

Exemplo 6

Neutralização in vitro do vírus da raiva pelos scFv específicos do vírus da raiva (RFFIT modificado)

De modo a determinar se os scFv seleccionados foram capazes de bloquear a infecção do vírus da raiva, ensaios de neutralização in vitro (RFFIT modificado) foram realizados. As preparações de scFv foram diluídas em diluições de três vezes em série partindo com uma diluição 1:5. O vírus da raiva (estirpe CVS-11) foi adicionado a cada diluição numa concentração que dá 80 a 100% de infecção. A mistura de vírus/scFv foi incubada por 1 hora a 37°C/5% de C02 antes da 41

ΕΡ 2 314 62Ο/PT adição às células MNA. 24 horas após a infecção (a 34°C/5% de CO2) as células foram fixadas com acetona por 20 minutos a 4°C e tingido no minimo de 3 horas com um anticorpo NFITC anti-raiva conjugado (Centocor). As células foram depois analisadas quanto à infecção pelo vírus da raiva sob um microscópio de fluorescência para determinar a diluição de ponto final em 50%. Isto é a diluição na qual a infecção virai é bloqueada em 50% neste ensaio (ver o Exemplo 1). Diversos scFv foram identificados que apresentaram actividade de neutralização contra o vírus da raiva (ver a Tabela 10).

Adicionalmente, foi investigado por meio do ensaio de neutralização in vitro (RFFIT modificado) como descrito acima, se os scFv seleccionados foram capazes de neutralizar o vírus de escape E57 como preparado no Exemplo 1 (E57A2, E57A3, E57B1, E57B2, E57B3 e E57C3). Diversas scFv foram identificadas que apresentaram actividade de neutralização contra os vírus de escape E57 (ver as Tabelas 11A e 11B) .

Exemplo 7 ELISA de competição da proteína G do vírus da raiva com scFv

Para identificar anticorpos que se ligam a epítopos que não se sobrepõem, não competidores, um ELISA de competição da glicoproteína da raiva foi realizado. As placas Nunc-Imuno Maxisorp F96 (Nunc) foram revestidas durante a noite a 4°C com uma diluição 1:1000 de glicoproteína do vírus da raiva purificada (1 mg/ml; a estirpe ERA do vírus da raiva) em PBS (50 μΐ) . A proteína não revestida foi retirada por lavagem antes de os poços serem bloqueados com 100 μΐ de PBS/1% de Protifar por 1 hora à temperatura ambiente. Subsequentemente, a solução de bloqueio foi descartada e foram adicionados 50 μΐ dos scFv anti-vírus da raiva não purificados em PBS/1% de Protifar (2x diluído). Os poços foram lavados cinco vezes com 100 μΐ de PBS/0,05% de Tween-20. Depois, 50 μΐ de IgG competidora anti-vírus da raiva biotinilada, CR-57bio, foram adicionados a cada poço , incubados por 5 minutos à temperatura ambiente e os poços foram lavados cinco vezes com 100 μΐ de PBS/0,05% de Tween-20. Para detectar a ligação de CR-57bio, 50 μΐ de uma diluição 1:2000 de estreptavidina-anticorpo HRP (Becton Dickinson) foi adicionado aos poços e incubados por 1 hora à temperatura ambiente. Os poços foram lavados mais uma vez como acima e o ELISA foi ainda 42

ΕΡ 2 314 620/PT desenvolvido pela adição de 100 μΐ de reagentes OPD (Sigma). A reacção foi interrompida pela adição de 50 μΐ de H2S04 1 M antes de medir a DO a 492 nm. O sinal obtido com CR-57bio sozinho pôde ser reduzido aos niveis de fundo quando co-incubados com scFv S057, isto é a forma scFv de CR-57 (para sequência de nucleótidos e aminoácido de 5057 ver as SEQ ID NOs: 205 e 206, respectivamente) ou scFv SOJB, isto é a forma scFv de CR-JB (para sequências de nucleótidos e aminoácido de SOJB ver as SEQ ID NOs: 312 e 313, respectivamente) . Isto indica que as scFv 5057 e SOJB competem com a interacção de CR-57bio para a glicoproteina do vírus da raiva pela ligação ao mesmo epítopo ou a um epítopo que se sobrepõem como CR-57bio, respectivamente. Ao contrário, um scFv irrelevante denominado SC02-007, isto é uma ligação de scFv a CD8, não competiu pela ligação. Os scFv anti-vírus da raiva denominados SC04-004, SC04010, SCO 4-0 2 4, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04103, SCO 4-10 4, SC04-120, SC04-125, SC04-127, SC04-140, SC04144 e SC04-146 também não competiram com CR-57bio, indicando que estas scFv se ligam a um epítopo diferente do epítopo reconhecido por CR-57 (ver a Figura 4).

Resultados similares foram obtidos com as experiências seguintes. Primeiro, o anticorpo CR-57 do vírus da raiva foi adicionado aos poços revestidos com a proteína G do vírus da raiva. Em seguida, os scFv competidores foram adicionados. Nesta configuração os scFv anti-vírus da raiva foram detectados com anti-VSV-HRP em virtude da presença de um marcador VSV nas sequências de aminoácidos de scFv (ver a Figura 5).

Exemplo 8

Construção de moléculas de imunoglobulina completamente humana (anticorpos anti-vírus da raiva monoclonais humanos) a partir dos Fv de cadeia única anti-vírus da raiva seleccionados

As regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos scFv denominadas SC04-001, SC04-008, SC04-018, SC04-040 e SC04-126 foram amplificadas por PCR usando oligonucleótidos para anexar locais de restrição e/ou sequências para expressão nos vectores de expressão de IgG pSyn-C03-HCYl (ver a SEQ ID NO:277) e pSynC04-CÀ (ver a SEQ ID NO:278), 43 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ respectivamente. Os genes de VH e VL foram amplificados usando os oligonucleótidos como mostrado na Tabela 12 e 13, respectivamente, e os produtos da PCR foram clonados nos vectores pSyn-C03-HCYl e pSyn-C04-CÀ, respectivamente.

As regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos scFv denominadas SC04-004, SC04-010, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SCO 403 8, SC04-060, S004-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04104, S004-108, SC04-120, SC04-125, SC04-140, SC04-144, SC04-146 e SC04-164 também foram amplificadas por PCR usando oligonucleótidos para anexar locais de restrição e/ou sequências para expressão nos vectores de expressão de IgG pSyn-C03-HCYl e pSyn-C05-CK (ver a SEQ ID NO:279), respectivamente. Os genes de VH e VL foram amplificados usando os oligonucleótidos como dados na Tabela 12 e 13, respectivamente, e os produtos da PCR foram clonados nos vectores pSyn-C03-HCYl e pSyn-C05-CK, respectivamente. Os oligonucleótidos são planejados de modo a corrigirem quaisquer desvios relativamente à sequência da linha germinativa que tenham sido introduzidos durante a construção da biblioteca, devido ao conjunto limitado de oligonucleótidos que foram usados para amplificar o grande repertório de genes de anticorpos. As sequências de nucleótidos para todas as construções foram verificadas de acordo com técnicas padrão conhecidas pelo técnico especialista.

As construções de expressão resultantes pgG104-001C03, pgGl0 4-0 0 8C03, pgG104-018C03, pgG104-040C03 e pgG104-126C03 que codificam as cadeias pesadas da IgGl anti-vírus da raiva humanas em combinação com a construção pSyn-C04-VX relevante que codifica a cadeia leve correspondente foram transitoriamente expressas em células 293T e foram obtidos os sobrenadantes contendo anticorpos IgGl. As construções de expressão pgGl04-004C03, pgGl04-010C03, pgG104-021C03, pgG104-026C03, pgGl0 4-031C03, pgGl04-038C03, pgGl04-060C03, pgG104- 073C03, pgGl0 4-0 9 7C03, pgGl04-098C03, pgG104-103C03, pgG104-104C03, pgGl0 4-10 8C03, pgG104-120C03, pgG104-125C03, pgG104-140C03, pgG104-144C03, pgG104-146C03 e pgG104-164C03 que codifica as cadeias pesadas de IgGl anti-vírus da raiva humanas em combinação com a construção pSyn-C05-VK relevante que codifica a cadeia leve correspondente foram transitoriamente expressas em células 293T e foram obtidos os sobrenadantes contendo anticorpos IgGl. 44

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As sequências de nucleótidos e de aminoácido das cadeias pesada e leve dos anticorpos denominadas CR04-001, CR04-004, CR04-008, 0R04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04-038, CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 e CR04-164 foram determinadas de acordo com técnicas padrão. Subsequentemente, os anticorpos monoclonais humanos recombinantes foram purificados numa coluna de proteína A seguida por uma troca de tampão numa coluna de dessalinização usando métodos de purificação padrão usados no geral para imunoglobulinas (ver por exemplo, WO 00/63403).

Adicionalmente, para CR04-098, um vector de expressão de IgGl humano único denominado pgG104-098C10 foi gerado como descrito acima para os vectores pgS057Cll e pgSOJBCll que codificam CR-57 e CR-JB, respectivamente (ver o Exemplo 1). As sequências de nucleótidos e de aminoácidos das cadeias pesada e leve de anticorpo CR04-098 codificadas pelo vector pgG104-098C10 são mostradas em SEQ ID NO:334 a 337, respectivamente. Os vectores pgS057Cll (ver o Exemplo 1) e pgG104-098C10 foram usados para a expressão estável de CR-57 e CR04-098, respectivamente, em células da linhagem de células depositada na European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR,

Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Grã-bretanha em 29 de Fevereiro de 1996 sob o número 96022940 e comercializada sob a marca PER.C6®. As CR-57 e CR04-098 estavelmente produzidas têm um ponto isoeléctrico calculado de 8,22 e 8,46, respectivamente. Os pontos isoeléctricos experimentalmente observados estão entre 8,1 e 8,3 para CR-57 e 9,0 e 9,2 para CR04-098. Os anticorpos monoclonais humanos recombinantes foram purificados como descrito acima. A menos que de outro modo estabelecido, para CR04-001, CR04-004, CR04-008, CR04-010, CR04-018, CR04- 021, CR04-026, CR04-031, CR04-038, CR04-040, CR04-060, CR04- 073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04- 120, CR04-125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 e CR04-164 foi feito uso de anticorpos monoclonais humanos recombinantes transitoriamente expressos pelo sistema de dois vectores como descrito acima e para CR57 foi feito uso de anticorpo monoclonal humano recombinante transitoriamente expresso pelo sistema de um vector como descrito no Exemplo 1. 45

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Exemplo 9

ELISA de competição da proteína G do vírus da raiva com IgG

Para averiguar se as IgG anti-proteína G de vírus da raiva monoclonais humanas se ligam a epítopos que não se sobrepõem, não competidores, são realizadas experiências de competição. Poços revestidos com a proteína G do vírus da raiva são incubados com concentrações crescentes (0 a 50 pg/ml) de IgG anti-proteína G do vírus da raiva não marcada por 1 hora à temperatura ambiente. Depois, 50 μΐ de uma IgG anti-vírus da raiva biotinilada diferente (1 pg/ml) são adicionados a cada poço, incubados por 5 minutos à temperatura ambiente e imediatamente lavados cinco vezes com 100 μΐ de PBS/0,05% de Tween20. Subsequentemente, os poços são incubados por 1 hora à temperatura ambiente com 50 μΐ de uma diluição de 1:2000 de estreptavidina-HRP (Becton Dickinson), lavados e desenvolvidos como descrito acima. Uma diminuição no sinal com concentração crescente de IgG não marcada indica que os dois anticorpos são competidores entre si e reconhecem o mesmo epítopo ou epítopos que se sobrepõem.

Alternativamente, poços revestidos com a proteína G do vírus da raiva (estirpe ERA) foram incubados com 50 μρ/ιηΐ de IgG anti-proteína G do vírus da raiva na marcada por 1 hora à temperatura ambiente. Depois, 50 μΐ de CR57 biotinilada (0,5 a 5 pg/ml; em níveis subsaturados) foram adicionados a cada poço. As etapas adicionais foram realizadas como descrito acima. Os sinais obtidos foram comparados com o sinal obtido apenas com CR57 biotinilada (ver a Figura 6; sem competidor). A partir da Figura 6 pode ser deduzido que o sinal não podia ser reduzido com o anticorpo denominado CR02-428 que serviu como um controlo negativo. Ao contrário, a competição com CR57 não marcado (controlo positivo) ou CR-JB reduziu o sinal para os níveis de fundo. A partir da Figura 6 pode ser deduzido ainda que nenhuma das IgG anti-proteína G do vírus da raiva competiu significativamente com CR-57, o que está de acordo com os dados de competição de scFv como descrito no Exemplo 7.

Além disso, foram realizadas experiências de competição com células PER.C6 transfectadas com proteína G do vírus da raiva (estirpe ERA) por meio de citometria de fluxo. As células transfectadas foram incubadas com 20 μΐ de IgG anti-proteína G do vírus da raiva não marcada (50 μρ/ιηΐ) por 46 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ

20 minutos a 4°C. Depois da lavagem das células com PBS contendo 1% de BSA, 20 μΐ de CR57 biotinilado (0,5 a 5 pg/ml; em níveis subsaturados) foram adicionados a cada poço, incubados por 5 minutos a 4°C e imediatamente lavados duas vezes com 100 μΐ de PBS contendo 1% de BSA. Subsequentemente, os poços foram incubados por 15 minutos a 4°C com 20 μΐ de uma diluição de 1:200 de estreptavidina-PE (Caltag), lavados e desenvolvidos como descrito acima. O sinal obtido com CR57 biotinilado não pôde ser reduzido significativamente com o anticorpo de controlo negativo CR02-428 (ver a Figura 7) . Ao contrário, a competição com CR57 não marcado (controlo positivo) ou CR-JB reduziu o sinal para os níveis de fundo. Nenhuma das IgG anti-proteína G do vírus da raiva competiu significativamente com CR-57, com a excepção de CR04-126 que reduziu o sinal para aproximadamente 30% (ver a Figura 7) . Este último não competiu no ELISA (ver a Figura 6). Isto pode ser causado pela diferença no modo como a glicoproteína é apresentada ao anticorpo em experiências de FACS comparativamente com as experiências de ELISA. A ligação de CR04-126 pode ser mais dependente da conformação da glicoproteína, resultando no efeito competitivo observado com CR04-126 no ensaio de competição com base em FACS e não no ensaio de competição com base no ELISA. Adicionalmente, CR04-008 e CR04-010 reduziram o sinal para aproximadamente 50% (ver a Figura 7) no ensaio de competição com base em FACS indicando que poderiam competir com CR57. Para CR04-010 isto não foi no entanto confirmado pelos dados de competição de scFv ou no ensaio de competição com base em ELISA. Para as outras IgG, os dados de FACS estavam de acordo com os respectivos dados de ELISA tanto dos scFv como das IgG.

Exemplo 10

Efeitos aditivos/sinérgicos das IgG anti-raiva na neutralização in vitro do vírus da raiva (RFFIT modificado)

De modo a determinar se as IgG anti-proteína G do vírus da raiva têm efeitos aditivos ou sinérgicos na neutralização do vírus da raiva, são testadas combinações diferentes das IgG. Primeiro, a potência (em Ul/mg) de cada anticorpo individual é determinada num RFFIT modificado (ver o Exemplo 1). Depois, as combinações de anticorpo são preparadas com base em quantidades iguais de Ul/mg e testadas no RFFIT modificado. As potências de cada combinação de anticorpos 47 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ podem ser determinadas e comparadas com as potências esperadas. Se a potência da combinação de anticorpos é igual à soma das potências de cada anticorpo individual presente na combinação, os anticorpos têm um efeito aditivo. Se a potência da combinação de anticorpos é mais alta, os anticorpos têm um efeito sinérgico na neutralização do vírus da raiva.

Alternativamente, efeitos aditivos ou sinérgicos podem ser determinados pela seguinte experiência. Primeiro, a potência dos anticorpos a testar, por exemplo, CR-57 e CR04-098, é determinada num RFFIT padrão (ver Laboratory techniques in rabies, Editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan e H. Koprowski (1996), 4a edição, Capítulo 15, World Health Organization, Genebra). Depois, os anticorpos são misturados numa razão de 1:1 com base nem Ul/ml. Esta mistura de anticorpos, juntamente com os anticorpos individuais na mesma concentração, é testada em seis experiências de RFFIT independentes para determinar o ponto final de neutralização a 50%. Subsequentemente, o índice de combinação (Cl) é determinado para a mistura de anticorpo usando a fórmula Cl = (Cl/Cxl) + (C2/Cx2) + (ClC2/CxlCx2) como descrito por Chou et al. (1984) . Cl e C2 são as quantidades (em pg) de anticorpo monoclonal 1 e anticorpo monoclonal 2 que levam a neutralização de 50% quando usados em combinação e Cxl e Cx2 são as quantidades (em pg) de anticorpo monoclonal 1 e anticorpo monoclonal 2 que levam a 50% de neutralização quando usados sozinhos. Cl = 1, indica um efeito aditivo, Cl < 1 indica um efeito sinérgico e Cl > 1 indica um efeito antagonístico dos anticorpos monoclonais.

Exemplo 11

Identificação de epítopos reconhecidos pelos anticorpos anti-vírus da raiva recombinantes humanos por PEPSCAN-ELISA Péptidos 15-mero lineares e em alça/cíclicos foram sintetizados a partir do domínio extracelular da proteína G da estirpe ERA do vírus da raiva (ver a SEQ ID NO: 207 para a sequência de aminoácidos completa da glicoproteína G do vírus da raiva da estirpe ERA, o domínio extracelular consiste nos aminoácidos 20 a 458; a id de proteína da glicoproteína do vírus da raiva da estirpe ERA na base de dados EMBL é J02293) e foram rastreados usando cartões mini-PEPSCAN no formato de cartão de crédito (formatos/cartão de 455 péptidos) como 48 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ descrito anteriormente (Slootstra et al.f 1996; WO 93/09872). Todos os péptidos foram acetilados no terminal amino. Em todos os péptidos em alça a posição 2 e posição 14 foram substituídas por uma cisteína (acetil-XCXXXXXXXXXXXCX-minicartão). Se outras cisteínas além das cisteínas na posição 2 e na posição 14 estavam presentes num péptido preparado, as outras cisteínas eram substituídas por uma alanina. Os péptidos em alça foram sintetizados usando a química de Fmoc padrão e desprotegidos usando ácido trifluórico com sequestrantes. Subsequentemente, os péptidos desprotegidos foram reagidos nos cartões com uma solução 0,5 mM de 1,3-bis(bromometil)benzeno em bicarbonato de amónio (20 mM, pH 7,9/ acetonitrilo (1:1 (v/v)). Os cartões foram suavemente agitados na solução por 30 a 60 minutos, enquanto completamente cobertos na solução. Finalmente, os cartões foram lavados extensivamente com excesso de H20 e tratados com ultra-sons em tampão de rompimento contendo 1% de SDS/0,1% de beta-mercaptoetanol em PBS (pH 7,2) a 70°C por 30 minutos, seguido por tratamento com ultra-sons em H20 por outros 45 minutos.

Os anticorpos monoclonais humanos foram preparados como descrito acima. A ligação destes anticorpos a cada péptido linear e em alça foi testada num imunoensaio com enzima ligada (ELISA) com base em PEPSCAN. Os cartões de polipropileno no formato de cartão de crédito de 455 poços, contendo os péptidos covalentemente ligados, foram incubados com os anticorpos (10 μρ/ιηΐ; diluídos em solução de bloqueio, que continha 5% de soro de cavalo (v/v) e 5% de ovalbumina (p/v) ) (4°C, durante a noite) . Depois da lavagem, os péptidos foram incubados com anticorpo anti-humano com peroxidase (diluição 1/1000) (1 hora, 25°C) e subsequentemente, depois da lavagem foram adicionados o substrato da peroxidase, o sulfonato de 2,2' -azino-di-3-etilbenztiazolina (ABTS) e 2 μΐ/ml de H202 a 3%. Os controlos (para linear e em alça) foram incubados apenas com anti-anticorpo humano com peroxidase. Depois de 1 hora o desenvolvimento de cor foi medido. O desenvolvimento de cor do ELISA foi quantificado com uma câmara CCD e um sistema de processamento de imagem. A configuração consistia em uma câmara CCD e uma lente de 55 mm (Sony CCD Video Camera XC-77RR, lentes Nikon micro-nikkor 55 mm f/2.8), um adaptador de câmara (Sony Camera adaptor DC-77RR) e o pacote Óptimas da 49

ΕΡ 2 314 620/PT

Image Processing Software, versão 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, E.U.A.). O Óptimas correu num sistema de computador pentium II.

Os anticorpos monoclonais anti-proteina G do vírus da raiva humanos foram testados quanto a ligação aos péptidos 15-mero lineares e em alça/ciclicos sintetizados como descrito acima. É considerado que um péptido se liga de forma relevante a um anticorpo quando os valores de DO são iguais ou superiores a duas vezes o valor de DO médio de todos os péptidos (por anticorpo) . Ver a Tabela 14 quanto aos resultados da ligação dos anticorpos monoclonais humanos denominados CR57, CRJB e CR04-010 aos péptidos lineares do domínio extracelular da glicoproteína G do vírus da raiva estirpe ERA. As regiões que apresentam ligação significativa aos respectivos anticorpos estão salientadas a cinzento (ver a Tabela 14). O anticorpo CR57 ligou-se aos péptidos lineares possuindo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em SLKGACKLKLCGVLG (SEQ ID NO:314), LKGACKLKLCGVLGL (SEQ ID NO:315), KGACKLKLCGVLGLR (SEQ ID NO:316), GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO:317), ACKLKLCGVLGLRLM (SEQ ID NO:318), CKLKLCGVLGLRLMD (SEQ ID NO:319), KLKLCGVLGLRLMDG (SEQ ID NO:320), LKLCGVLGLRLMDGT (SEQ ID NO:321) e KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO:322) (ver a Tabela 14) . Os péptidos possuindo as sequências de aminoácidos GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO:317), ACKLKLCVLGLRLM (SEQ ID NO:318) têm um valor de DO que é inferior a duas vezes o valor médio. Não obstante estes péptidos foram reivindicados, porque estão na proximidade imediata de uma região de péptidos antigénicos reconhecidos pelo anticorpo CR57. A ligação foi mais proeminente ao péptido com a sequência de aminoácidos KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO:322).

O anticorpo CR04-010 ligou-se aos péptidos lineares possuindo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em GFGKAYTIFNKTLME (SEQ ID NO:323), FGKAYTIFNKTLMEA

(SEQ ID NO:324), GKAYTIFNKTLMEAD (SEQ ID NO:325), KAYTIFNKTLMEADA

(SEQ ID NO:326), AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO:327), YTIFNKTLMEADAHY

(SEQ ID NO:328), TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO:329), IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO:330) e FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO:331). O péptidos possuindo as sequências de aminoácidos AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO:3 2 7) , YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO:328) têm um valor 50

ΕΡ 2 314 620/PT de DO que é inferior a duas vezes o valor médio. Não obstante estes péptidos foram reivindicados porque estão na proximidade imediata de uma região de péptidos antigénicos reconhecidos pelo anticorpo CR04-010. A ligação foi mais proeminente aos péptidos com a sequência de aminoácidos TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO:329) , IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO:330) e FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO:331). CRJB e os anticorpos denominados CR04-040, CR04-098 e CR04-103 (dados não mostrados) não reconheceram uma região de péptidos antigénicos lineares.

Qualquer um dos péptidos acima, ou suas partes, representam bons candidatos de um epitopo neutralizador de vírus da raiva e poderiam formar a base para uma vacina ou para criar anticorpos de neutralização para tratar e/ou prevenir uma infecção pelo vírus da raiva. SLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO:332) e GFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO:333) são regiões particularmente interessantes da glicoproteina com base na sua elevada reactividade no PEPSCAN. A partir dos dados de PEPSCAN acima pode ser deduzido ainda que os anticorpos monoclonais humanos denominados CR57 e CR04-010 se ligam a regiões diferentes da proteína G do vírus da raiva indicando que reconhecem epítopos não competidores.

Exemplo 12

Determinação da potência neutralizadora das IgG anti-proteína G da raiva usando um ensaio de neutralização in vitro (RFFIT modificado) . A potência neutralizadora de cada um dos anticorpos monoclonais humanos produzidos foi determinada num RFFIT modificado como descrito no Exemplo 1. Dezasseis IgG neutralizaram a estirpe CVS-11 da raiva com uma potência superior a 1000 Ul/mg, ao passo que apenas duas IgG tiveram uma potência inferior a 2 Ul/mg (ver as Tabela 15) . Oito dos dezasseis anticorpos superaram o CR-57 transitoriamente produzido com respeito à potência, sugerindo uma eficiência mais alta na profilaxia na pós-exposição ao vírus da raiva do que CR-57. A potência de CR-57 transitoriamente produzido foi aproximadamente 3800 Ul/mg de proteína (ver as Tabelas 1 e 51

ΕΡ 2 314 620/PT 15), ao passo que CR-57 estavelmente produzido apresentou uma potência de 5400 Ul/mg de proteína (dados não apresentados). De maneira interessante, a maioria dos anticorpos monoclonais humanos neutralizadores identificados continham um gene da linha germinativa 3-30 pesado variável (ver Tabela 9).

Com base na afinidade dos anticorpos quanto ao vírus da raiva (dados não mostrados) e na diluição no ponto final de 100% dos anticorpos num ensaio de RFFIT modificado (dados não mostrados), um painel de seis IgG únicas, isto é CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-103, CR04-104 e CR04-144, foram escolhidos para desenvolvimento adicional. Dentro deste painel, o anticorpo CR04-098 foi particularmente interessante visto que apresentou a potência mais alta, isto é aproximadamente 7300 Ul/mg de proteína (ver a Tabela 15) . Uma potência similar foi também encontrada para CR04-098 estavelmente produzido (dados não mostrados).

Exemplo 13

Neutralização in vitro de vírus de escape E57 pelas IgG anti-vírus da raiva

Para caracterizar ainda mais os novos anticorpos anti-raiva monoclonais humanos, a actividade de neutralização das IgG contra os vírus de escape E57 foi testada num RFFIT modificado como descrito acima. A maioria das IgG anti-vírus da raiva tiveram boa actividade de neutralização contra todos os seis vírus de escape E57 (ver a Tabela 16) . Ao contrário, CR04-008, CR04-018 e CR04-126 não neutralizaram 6/6, 2/6 e 3/6 vírus de escape E57, respectivamente. Nenhuma neutralização significa que nenhum ponto final de 50% foi atingido com uma diluição de anticorpo de 1:100. CR04-021, CR04-108, CR04-120, CR04-125 e CR04-164 apresentaram uma diminuição significativa na actividade de neutralização contra vários vírus de escape. Isto sugere que o epítopo destes anticorpos foi afectado directa ou indirectamente na glicoproteína do vírus de escape E57. Com base no descrito acima diversas IgG anti-vírus da raiva podem ser compatíveis com CR-57 num cocktail anti-raiva para a profilaxia no tratamento pós-exposição. Em particular, o painel de seis IgG únicas como identificadas acima, isto é os anticorpos CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-103, CR04-104 e CR04-144, apresentaram boa potência de neutralização contra os vírus de escape E57 sugerindo que o(s) epítopo(s) 52 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ reconhecido(s) por estes anticorpos não foi/foram afectado(s) pelas mutações de aminoácidos induzidas por CR-57. 0 anticorpo CR04-098 pareceu o mais promissor visto que ele teve uma potência superior a 3000 Ul/mg para cada um dos virus de escape.

Exemplo 14

Reconhecimento de epítopos dos anticorpos anti-raiva CR-57 e CR04-098

Para confirmar que os anticorpos monoclonais humanos denominados CR-57 e CR04-098 reconhecem epítopos não competidores, que não se sobrepõem, foram gerados vírus de escape do anticorpo monoclonal humano denominado CR04-098 essencialmente como descrito para os vírus de escape de CR57 (ver o Exemplo 1) . Em resumo, o número de focos por poço foi classificado por imunofluorescência e os meios de poços contendo preferivelmente um foco foram escolhidos para a amplificação de vírus. Todos os vírus de escape E98 foram gerados a partir de 1 único foco com a excepção de E98-2 (2 focos) e E98-4 (4 focos) . Um vírus era definido como uma variante de escape se o índice de neutralização era <2,5 log. O índice de neutralização foi determinado subtraindo o número de partículas virais infecciosas/ml produzidas em culturas de células BSR infectadas com vírus mais anticorpo monoclonal (~4 Ul/ml) do número de partículas virais infecciosas/ml produzidas em culturas de célula BSR ou MNA infectadas com o vírus sozinho ([log das unidades que formam focos/ml de vírus na ausência de anticorpo monoclonal menos log de uff/ml de vírus na presença de anticorpo monoclonal]). Um índice inferior a 2,5 log foi considerado como evidência de escape.

Para investigar ainda mais que CR04-098 se liga a um epítopo diferente, não competidor, que não se sobrepõe, comparado com CR-57, o CR-57 foi testado contra os vírus de escape E98 num ensaio RFFIT modificado como descrito acima. Como mostrado na Tabela 17, o CR-57 teve boa actividade de neutralização contra todos os cinco virus de escape E98. Adicionalmente, os anticorpos CR04-010 e CR04-144 foram testados quanto a actividade de neutralização contra os vírus de escape E98. nenhum dos anticorpos neutralizou os vírus de escape E98 (dados não mostrados) sugerindo que o epítopo reconhecido por ambos os anticorpos é directa ou 53 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ indirectamente afectado pela mutação de aminoácidos induzida pelo anticorpo CR04-098. Os anticorpos CR04-018 e CR04-126 foram testados quanto a actividade de neutralização contra apenas um dos vírus de escape E98, isto é E98-4. 0 CR04-018 foi capaz de neutralizar o vírus de escape, enquanto o CR04-126 apenas teve uma potência de neutralização fraca contra o vírus de escape. Isto sugere que o epítopo reconhecido pelo CR04-018 não é afectado pela mutação induzida pelo anticorpo CR04-098. Adicionalmente, os anticorpos CR04-010, CR04-038, CR04-040, CR04-073, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-164 não neutralizaram E98-4 sugerindo que reconhecem o mesmo epítopo que CR04-098 (dados não mostrados).

Para identificar mutações possíveis na glicoproteína da raiva de cada um dos vírus de escape E98, a sequência de nucleótidos do quadro de leitura aberto (ORF) da glicoproteína foi determinada como descrito antes para os vírus de escape E57 e EJB. Todos os vírus de escape E98 apresentaram a mutação N para D na posição de aminoácido 336 da glicoproteína da raiva (ver a Figura 8) . Esta região da glicoproteína foi definida como o local antigénico III compreendendo dos aminoácidos 330 a 338 (numeração sem péptido de sinal) . Ao contrário, CR-57 reconheceu um epítopo localizado nos aminoácidos 226 a 231 (numeração sem péptido de sinal), que se sobrepõem com o local antigénico I. Além da mutação N336D o vírus de escape E98 denominado E98-5 apresentou a mutação H para Q na posição de aminoácido 354 (mudança de codão de CAT para CAG) da glicoproteína da raiva (dados não mostrados).

Além disso, a análise Pepscan da ligação de CR57 aos péptidos que abrigam um epítopo de CR57 mutado (como observado no vírus de escape E57) mostraram que a interacção de CR57 foi abolida (dados não mostrados). Surpreendentemente, CR04-098 foi ainda capaz de ligação à glicoproteína mutada (que compreende a mutação N336D) expressa em células PER.C6®, como medido por citometria de fluxo (dados não mostrados), embora os vírus contendo esta mutação já não fossem neutralizados.

Além disso, estudos de mapeamento de epítopos e estudos de classificação de afinidade foram realizados usando a análise de ressonância plasmónica de superfície usando um sistema analítico BIAcore3000 . A glicoproteína da raiva purificada (estirpe ERA) foi imobilizada como ligando num chip 54

ΕΡ 2 314 62Ο/PT sensor de 4 canais de fluxo (Fc) CM5, qualidade para pesquisa investigação (Biacore AB, Suécia) usando acoplamento de aminas. A classificação foi realizada a 25°C com HBS-EP (Biacore AB, Suécia) como tampão de operação. 50 μΐ de cada anticorpo foram injectados a um caudal constante de 20 μΐ/min. Depois, o tampão de operação foi aplicado durante 750 segundos seguido por regeneração do chip CM5 com 5 μΐ de NaOH 2 M, 5 μΐ de HC1 45 mM e 5 μΐ de NaOH 2 mM. Os sinais de ressonância expressos em unidades de ressonância (RU) foram representados num gráfico em função do tempo e o aumento e a diminuição nas RU como uma medida da associação e da dissociação, respectivamente, foram determinados e usados para a classificação dos anticorpos. Os valores de KD reais para CR57 e CR04-098 determinados por análise de ressonância plasmónica de superfície foram de 2,4 nM e 4,5 nM, respect ivamente. Os estudos de mapeamento de epítopos confirmaram adicionalmente que CR57 e CR04-098 se ligam a epítopos diferentes na glicoproteina da raiva. A injecção de CR57 resultou numa resposta de 58 RU (dados não mostrados). Depois da injecção de CR04-098 foi obtido um aumento adicional no nível de resposta (24 RU), sugerindo que os locais de ligação para CR04-098 não foram ocupados (dados não mostrados). Resultados similares foram observados quando a ordem inversa foi aplicada mostrando que cada anticorpo atingiu níveis de RU similares independentemente da ordem de injecção (dados não mostrados). Estes resultados demonstram adicionalmente que CR57 e CR04-098 podem ligar-se simultaneamente e reconhecer epítopos diferentes na glicoproteina do vírus da raiva.

No global, os dados acima confirmam adicionalmente que os anticorpos CR-57 e CR04-098 reconhecem epítopos distintos que não se sobrepõem, isto é epítopos nos locais antigénicos I e III, respectivamente. Os dados estão em boa concordância com os dados de competição de ELISA/FACS indicando que CR-57 e CR04-098 não competem pela ligação a G ERA e a boa actividade de neutralização do anticorpo CR04-098 contra todos os vírus de escape E57. Com base nestes resultados e no fato de que a exposição in vitro de vírus da raiva à combinação de CR57 e CR04-098 (selecção na presença de 4 Ul/ml de cada anticorpo) não produziu vírus de escape (dados não mostrados), foi concluído que os anticorpos CR-57 e CR04-098 reconhecem epítopos não competidores, que não se sobrepõem, e podem ser 55 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ vantajosamente usados num cocktail de anticorpos anti-vírus da raiva para o tratamento de profilaxia na pós-exposição.

Exemplo 15

Avaliação da conservação do epítopo reconhecido por CR57 e CR04-098 A região de ligação mínima de CR-57 (aminoácidos KLCGVL dentro da SEQ ID NO:332, a região da glicoproteína de vírus da raiva reconhecida por CR57 como determinado por meio da tecnologia de PEPSCAN e varrimento de alaninas) foi alinhada com sequências de nucleótidos de 229 isolados do vírus da raiva genótipo 1 para avaliar a conservação do epítopo (ver a Tabela 18). 0 conjunto de amostras continha isolados humanos, isolados de morcego e isolados de animais caninos ou de animais domésticos mais provavelmente mordidos por animais caninos com raiva. A análise de frequência dos aminoácidos em cada posição dentro da região de ligação mínima revelou que os resíduos críticos que constituem o epítopo eram altamente conservados. A lisina na posição um foi conservada em 99,6% dos isolados, enquanto em apenas 1/229 isolados foi observada uma mutação K>R conservativa. As posições dois e três (L e C) foram completamente conservadas. Acredita-se que o resíduo de cisteína central esteja estruturalmente envolvido na dobragem da glicoproteína e seja conservado entre todos os lissavírus (ver Badrane e Tordo, 2001). A glicina na posição quatro foi conservada em 98,7% dos isolados, enquanto em 3/229 dos isolados foram observadas mutações no sentido de aminoácidos carregados (G>R em 1/229; G>E em 2/229). A quinta posição também foi conservada com a excepção de um isolado onde foi observada uma mutação V>I conservativa. Na sexta posição, que não é um resíduo crítico como determinado por um varrimento de substituição de alaninas, foi observada heterogeneidade significativa nos isolados de rua: L em 70,7 %, P em 26,7% e S em 2,6% das estirpes, respectivamente. Em conjunto, prevê-se que aproximadamente 99 por cento dos vírus da raiva que podem ser encontrados sejam reconhecidos pelo anticorpo CR-57. 123 destes 229 isolados virais foram analisados quanto à presença de mutações tanto no epítopo de CR-57 como no de CR04-098. Nenhum destes 123 vírus de rua continha mutações em ambos os epítopos. A mutação N>D como observada nos vírus de escape E98 estava presente em apenas cinco isolados virais. 56 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ

Estes vírus eram geograficamente distintos e foram isolados de animais de África (ver a Figura 9 quanto à árvore filogenética; os cinco isolados virais, isto é AF325483, AF325482, AF325481, AF325480 e AF325485, são indicados em negrito). A análise filogenética de sequências da glicoproteína revelou que os vírus da raiva com epítopos de CR57 mutados são apenas distantemente relacionados com os vírus da raiva portadores de um epítopo de CR04-098 mutado. Portanto, a probabilidade de encontrar um vírus da raiva resistente à neutralização por um cocktail de CR-57 e CR04-098 está virtualmente ausente.

Tabela 1: Potência de Neutralização de CR-57 e CR-JB contra virus do tipo selvagem e de escape.

Virus Potência CR-57 (UI/mg) Potência CR-JB (UI/mg) Virus Potência de CR-57 (Ul/mg) Potência de CR-JB (Ul/mg) CVS-11 3797 605 CVS-11 3797 605 E57A2 0 <0,2 EJB2B 0,004 0,6 E57A3 0 419 EJB2C <0,004 2 E57B 1 0 93 EJB2D <0,004 3 E57B2 0 <0,3 EJB2E <0,2 <0,3 E57B3 0 419 EJB2F <0,06 3 E57C3 0 31 EJB3F <0,04 0,06 57

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Tabela 2: Iniciadores da região variável da cadeia lambda humana (sentido directo).

Nome do Iniciador Sequência de nucleótidos do iniciador SEQ ID NO HuVXIA 5’-CAGTCTGTGCTGACT CAGCCACC-3’ SEQ ID NO:208 HuVXlB 5 ’-CAGTCTGTGYTG ACG CAGCCGCC-3 ’ SEQ ID NO:209 HuVXlC 5’-CAGTCTGTCGTGACG CAGCCGCC-3’ SEQ ID NO:210 HuVX2 5’-CARTCTGCCCTGACT CAGCCT-3’ SEQ ID NO:211 HuVX3A 5’-TCCTATGWGCTGACT CAGCCACC-3’ SEQ ID NO:212 HuVX3B 5 ’-TCTTCTGAGCTGACT CAGG ACCC-3 ’ SEQ ID NO:213 HuVX4 5 ’-CACGTT ATACTG ACT CAACCGCC-3’ SEQ ID NO:214 HuVX5 5’-CAGGCTGTGCTGACT CAGCCGTC-3’ SEQ ID NO:215 HuVX6 5’-AATTTTATGCTGACT CAGCCCCA-3’ SEQ ID NO:216 HuVX7/8 5’-CAGRCTGTGGTGACY CAGGAGCC-3’ SEQ ID NO:217 HuVX9 5’-CWGCCTGTGCTGACT CAGCCMCC-3’ SEQ ID NO:218 58

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Tabela 3: Iniciadores da região variável de cadeia capa humana (sentido directo).

Nome do Iniciador Sequência de nucleótidos do iniciador SEQ ID NO HuVkIB 5’- GACATCCAGWTGACCC AGTCTCC-3’ SEQ ID NO:219 HuVk2 5’-GATGTTGTGATGACT CAGTCTCC-3’ SEQ ID NO:220 HuVk3 5 ’-G AAATTGTGWTGACR CAGTCTCC-3’ SEQ ID NO:221 HuVk4 5 ’-G ATATTGTGATGACC C ACACTCC-3 ’ SEQ ID NO:222 HuVk5 5’GAAACGACACTCACG CAGTCTCC-3’ SEQ ID NO:223 HuVk6 5’-GAAATTGTGCTGACTC AGTCTCC-3’ SEQ ID NO:224 59 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ

Tabela 4: Iniciadores da região variável de cadeia capa humana estendida com locais de restrição Sall (sentido directo), iniciadores da região J da cadeia capa humana estendida com locais de restrição Notl (anti-sentido), iniciadores da região variável de cadeia lambda humana estendida com locais de restrição Sall (sentido directo) e iniciadores da região J da cadeia lambda humana estendida com locais de restrição Notl (anti-sentido).

Nome do iniciador Sequência de nucleótidos do iniciador SEQ ID NO HuVKlB-SalI 5 ’-TGAGCACACAGGTCG ACGGACATCCAGWTGACC CAGTCTCC-3’ SEQ ID NO:225 HuVK2-SalI 5 ’-TGAGCACAC AGGTCG ACGGATGTTGTGATGACT CAGTCTCC-3’ SEQ ID NO:226 HuVK3B-SalI 5’-TGAGCACACAGGTCG ACGGAAATTGTGWTGACR CAGTCTCC-3’ SEQ ID NO:227 HuVK4B-SalI 5’-TGAGCACACAGGTCG ACGGATATTGTGATGACC CACACTCC-3’ SEQ ID NO:228 HuVK5-SalI 5 ’-TGAGC AC AC AGGTCGACG GAAACGACACTCACGCAGTCT CC-3’ SEQ ID NO:229 HuVK6-SalI 5 ’ -TGAGC AC AC AGGTCG ACGGAAATTGTGCTGACT CAGTCTCC-3’ SEQ ID NO:230 HuJKl-Notl 5'-GAGTCATTCTCGACTTGC GGCCGCACGTTTGATTTCCAC CTTGGTCCC-3’ SEQ ID NO:231 HuJK2-NotI 5 ’-GAGTCATTCTCG ACT TGCGGCCGC A CGTTTG AT CTCC AGCTTGGTCCC-3 * SEQ ID NO:232 HuJK3-NotI 5’-GAGTCATTCTCGACTTGC GGCCGCACGTTTGATATCCAC TTTGGTCCC-3’ SEQ ID NO:233 60

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Nome do iniciador Sequência de nucleótidos do iniciador SEQ ID NO HuJK4-NotI 5 ’ -GAGTCATTCTCG ACT TGCGGCCGCACGTTTGAT CTCC ACCTTGGTCCC-3 ’ SEQ ID NO:234 HuJK5-NotI 5’-GAGTCATTCTCGACTTGC GGCCGCACGTTTAATCTCCAG TCGTGTCCC-3’ SEQ ID NO:235 HuVXIA-SalI 5 ’-TGAGCACACAGGTCGACG C AGTCTGTGCT G ACTC AGCC A CC-3’ SEQ ID NO:236 HuVXIB-SalI 5 ’-TGAGCACACAGGTCGACG CAGTCTGTGYTGACGCAGCCG CC-3’ SEQ ID NO:237 HuVXIC-SalI 5 ’ -TGAGC AC AC AGGTCG ACG CAGTCTGTCGTGACGCAGCCG CC-3’ SEQ ID NO:238 HuVX2-SalI 5 ’-TGAGCACACAGGTCGACG CARTCTGCCCTGACTCAGCCT-3’ SEQ ID NO:239 HuVX3A-SalI 5 ’ -TGAGCACAC AGGTCG ACG TCCTATGWGCTGACTCAGCCA CC-3’ SEQ ID NO:240 HuVX3B-SalI 5 ’ -TGAGCAC ACAGGTCG ACG TCTTCTGAGCTGACTCAGGAC CC-3’ SEQ ID NO:241 HuVX4-SalI 5 ’ -T GAGC AC AC AGGTCG ACG CACGTTATACTGACTCAACCG CC-3’ SEQ ID NO:242 HuVX5-SalI 5’-TGAGCACACAGGTCGACG CAGGCTGTGCTGACTCAGCCG TC-3’ SEQ ID NO:243 HuVX6-SalI 5 ’ -TGAGCAC ACAGGTCG ACG AATTTTATGCTGACTCAGCCC CA-3’ SEQ ID NO:244 HuVX7/8-SalI 5 ’ -TGAGCACACAGGTCGACG CAGRCTGTGGTGACYCAGGAG CC-3’ SEQ ID NO:245 61

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Nome do iniciador Sequência de nucleótidos do iniciador SEQ ID NO HuVX9-SalI 5 ’ -TG AGCAC AC AGGT CG ACG CWGCCTGTGCTGACTCAGCCM CC-3’ SEQ ID NO:246 HuJXl-Notl 5 ’ -GAGTC ATTCTCGACTTGC GGCCGCACCTAGGACGGTGAC CTTGGTCCC-3’ SEQ ID NO:247 HuJX2/3-NotI S ’ -GAGTC ATT CTCG ACTTGC GGCCGCACCTAGGACGGTCAG CTTGGTCCC-3’ SEQ ID NO:248 HuJX4/5-NotI 5 ’ -GAGTC ATTCTCGACTT GC GGCCGCACYTAAAACGGTGAG CTGGGTCCC-3’ SEQ ID NO:249

Tabela 5: Distribuição dos produtos de cadeia leve diferentes nas 10 fracções.

Produtos da cadeia leve Número de alelos Número de fracção Alelos/fracção VklB/Jkl-5 19 1 e 2 9,5 Vk2/Jkl-5 9 3 9 Vk3B/Jkl-5 7 4 7 Vk4B/Jkl-5 1 5 5 Vk5/Jkl-5 1 Vk6/Jkl-5 3 VXIA/Jll-3 5 6 5 VÀ1B/J11-3 VX1C/J11-3 VX2/J11-3 5 7 5 VÀ3A/Jll-3 9 8 9 VÀ3B/Jll-3 VX4/J11-3 3 9 5 VX5/J11-3 1 VX6/J11-3 1 VX7/8/Jll-3 3 10 6 VX9/J11-3 3 62

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Tabela 6: Iniciadores da região variável de cadeia pesada de IgG humana (sentido directo).

Nome do Iniciador Sequência de nucleótidos do iniciador SEQ ID NO HuVHlB/7A 5 ’-CAGRTGCAGCTGGTG CARTCTGG-3' SEQ ID NO:250 HuVHlC 5 ’ -S AGGTCC AGCTGGTR CAGTCTGG-3’ SEQ ID NO:251 HuVH2B 5 ’-SAGGTGCAGCTGGTG GAGTCTGG-3’ SEQ ID NO:252 HuVH3B 5 ’-SAGGTGCAGCTGGTG GAGTCTGG-3' SEQ ID NO:253 HuVH3C 5 ’ -G AGGTGCAGCTGGTG GAGWCYGG-3 ’ SEQ ID NO:254 HuVH4B 5 ’ -C AGGTGCAGCTAC AG CAGTGGGG-3’ SEQ ID NO:255 HuVH4C 5’-CAGSTGCAGCTGCAG GAGTCSGG-3’ SEQ ID NO:256 HuVH5B 5 ’-GARGTGC AGCTGGTG CAGTCTGG-3’ SEQ ID NO:257 HuVH6A 5 ’ -C AGGT AC AGCTGC AG CAGTCAGG-3’ SEQ ID NO:258 63

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Tabela 7: Iniciadores da região variável de cadeia pesada da IgG humana estendida com locais de restrição Sfil/Ncol (sentido directo) e iniciadores da região J da cadeia pesada de IgG humana estendida com locais de restrição Xhol/BstEII (anti-sentido).

Nome do Iniciador Sequência de nucleótidos do iniciador SEQ ID NO HuVHlB/7A-SfiI 5*-GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC CAGRTGCAGCTGGTGCAR TCTGG-3' SEQ ID NO:259 HuVHIC-Sfil S'-GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC SAGGTCCAGCTGGTRCAG TCTGG-3’ SEQ ID NO:260 HuVH2B-SfiI 5’-GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC CAGRTCACCTTGAAGGAG TCTGG-3' SEQ ID NO:261 HuVH3B-SfiI y-GTCCTCGCAACTGCGGCC CAGCCGGCCATGGCCSAGGTG CAGCTGGTGGAGTCTGG-3' SEQ ID NO:262 HuVH3C-Sfil 5*-GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC GAGGTGCAGCTGGTGGAG WCYGG-3' SEQ ID NO:263 HuVH4B-Sfil 5'-GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGC AGCTAC AGC AG TGGGG-3' SEQ ID NO:264 HuVH4C-Sfil 5'GTCCTCGCAACTGCGGCC CAGCCGGCCATGGCCCAGSTG CAGCTGC AGGAGTCSGG-3' SEQ ID NO:265 64

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Nome do Iniciador Sequência de nucleótidos do iniciador SEQ ID NO HuVH5B-Sfil 5'-GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC GARGTGCAGCTGGTGCAG TCTGG-3' SEQ ID NO:266 HuVH6A-SfiI 5'-GTCCTCGCAACTGCG GCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTACAGCTGCAGCAG TCAGG-3' SEQ ID NO:26 7 HuJH1/2-XhoI 5 ’ -GAGTC ATTCTCG ACTCG A GACGGTGACCAGGGTGCC-3 ’ SEQ ID NO:268 HuJH3-XhoI 5 ’-G AGTC ATTCTCGACT CGAGACGGTGACCATTGT CCC-3’ SEQ ID NO:269 HuJH4/5-XhoI 5’-GAGTCATTCTCGACT CGAGACGGTGACCAGGGT TCC-3’ SEQ ID NO:270 HuJH6-XhoI 5’-GAGTCATTCTCGACTCGA GACGGTGACCGTGGTCCC-3 ’ SEQ ID NO:271 65

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Tabela 8: Ligação de anticorpos em fagos de cadeia única (scFv) à proteina G do virus da raiva (estirpe ERA) e a FBS como medida pelo ELISA.

Nome do anticorpo em fago Proteina G do virus da raiva (D0492nm) FBS (D0492nm) SCO 4-0 01 0,828 0,053 SCO 4-0 0 4 0,550 0,054 SC04-008 0,582 0,058 SC04-010 0,915 0,043 SCO 4-018 0,247 0,052 SCO 4-0 21 0,278 0,052 SC04-026 0,212 0,054 SCO 4-0 31 0,721 0,065 SC04-038 0,653 0,061 SCO 4-0 40 0,740 0,053 SC04-060 0,923 0,056 SCO 4-0 73 0,657 0,054 SCO 4-0 9 7 0,835 0,056 SC04-098 0,798 0,060 SCO 4-103 0,606 0,059 SCO 4-10 4 0,566 0,063 SC04-108 0,363 0,052 SCO 4-12 0 0,571 0,052 SC04-125 0,735 0,049 SC04-126 0,232 0,051 SCO 4-140 0,865 0,057 SCO 4-144 0,775 0,054 SCO 4-146 0,484 0,057 SCO 4-16 4 0,547 0,057 controlo (S057) 0,650 0,055 controlo (02-007) 0,063 0,052 66

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Tabela 9: Dados dos Fv de cadeia única capazes de ligação à proteína G do vírus da raiva.

Nome scFv (bibl.) SEQ ID NO da sequência de nucleótidos SEQ ID NO da sequência de aminoácidos HCDR3 (SEQ ID NO:) locus -vH locus - vL sc04-001 (JK1994) 157 158 GLYGELFDY (SEQ ID NO:1) 3-20 (DP32) V13 (31 -V2-13) sc04-004 (WT2000) 159 160 DYLYPTTDFDY (SEQ ID NO:2) 3-23 (DP47) Vkl (012/02-DPK9) sc04-008 (RAB-03-G01) 161 162 MGFTGTYFDY (SEQ ID NO:3) 2-70 (DP28) V13 (3h -V2-14) sc04-010 (RAB-03-G01) 163 164 DGLDLTGTIQPFGY (SEQ ID NO:4) 3-30 (DP49) Vkl (Lll -DPK3) scO 4-018 (RAB-03-G01) 165 166 VSVTTGAFNI (SEQ ID NO:5) 4-04 (DP70) Vil (lc -Vl-16) SC04-021 (RAB-03-G01) 167 168 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO:6) 3-30 (DP49) Vkl (L8) sc04-026 (RAB-03-G01) 169 170 TSNWNYLDRFDP (SEQ ID NO:7) 5-51 (DP73) VklI (A 19/03 -DPK15) scO 4-031 (RAB-03-G01) 171 172 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO:8) 3-30 (DP49) Vkl (L5 -DPK5) sc04-038 (RAB-03-G01) 173 174 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO:9) 3-30 (DP49) Vkl (L5 -DPK5) sc04-040 (RAB-03-G01) 175 176 GSKVGDFDY (SEQ ID NO:10) 3-30 (DP49) V13 (3h -V2-14) sc04-060 (RAB-04-G01) 177 178 EKEKYSDRSGYSYY YYYMDV (SEQ ID NO:11) 4-59 (DP71) Vkl (012/02 - DPK9) scO 4-0 73 (RAB-04-G01) 179 180 DGLDLTGTIQPFGY (SEQ ID NO:12) 3-30 (DP49) Vkl (L12) sc04-097 (RAB-04-G01) 181 182 TASNLGRGGMDV (SEQ ID NO:13) 3-23 (DP4 7) Vkl (L8) sc04-098 (RAB-04-G01) 183 184 VAVAGTHFDY (SEQ ID NO:14) 3-30 (DP49) Vkl (A30) scO 4-103 (RAB-04-G01) 185 186 VAVAGESFDS (SEQ ID NO:15) 3-30 (DP49) Vkl (L5 -DPK5) scO 4-10 4 (RAB-04-G01) 187 188 IVWTALDAFDI (SEQ ID NO:16) 3-30 (DP49) Vkl (L12) scO 4-10 8 (RAB-04-G01) 189 190 FMIVADDAFDI (SEQ ID NO:17) 3-30 (DP49) Vkl (Ll) SC04-120 (RAB-04-G01) 191 192 GGKTGEFDY (SEQ ID NO:18) 3-30 (DP49) Vkl (L8) SC04-125 (RAB-04-G01) 193 194 IATAGTGFDY (SEQ ID NO:19) 3-30 (DP49) Vkl (L8) SC04-126 (RAB-04-G01) 195 196 MGFTGTYTDY (SEQ ID NO:20) 2-70 (DP28) V13 (3h -V2-14) sc04-140 (RAB-04-G01) 197 198 VTNPGDAFDI (SEQ ID NO:21) 3-30 (DP49) Vkl (L4/18a) sc04-144 (RAB-04-G01) 199 200 GGKTGEFDY (SEQ ID NO:22) 3-30 (DP49) Vkl (L 8) 67 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ

Nome scFv (bibl.) SEQ ID NO da sequência de nucleótidos SEQ ID NO da sequência de aminoácidos HCDR3 (SEQ ID NO:) locus -vH locus -VL sc04-146 (RAB-04-G01) 201 202 GGKTGEFDY (SEQ ID NO:23) 3-30 (DP49) VklII (L2 -DPK21) sc04-164 (RAB-04-G01) 203 204 GSVLGDAFDI (SEQ ID NO:24) 3-30 (DP49) Vkl (L19 -DPK6) S057 205 206 ENLDNSGTYYYFSG WFDP (SEQ ID NO:25) 1-69 (DP10) V12 (2e -Vl-3) SOJB 312 313 RQHISSFPWFDS (SEQ ID NO:276) 2-05 V13 (3h -V2-14)

Tabela 10: Dados de ensaio quanto a actividade neutralizadora do vírus da raiva de scFv.

Nome do scFv Diluição no ponto final de 50% Diluição no ponto final de 50%, padrão OMS (2 Ul/ml) Potência (UI/ml) SC04-001 270 405 1,3 SC04-004 3645 405 18 SC04-008 > 10935 405 >54 SC04-010 810 405 4 SC04-018 15 405 0,1 SC04-021 270 405 1,3 SC04-026 45 270 0,3 SC04-031 90 270 0,7 SC04-038 270 270 2 SC04-040 45 270 0,3 SC04-060 30 270 0,2 SC04-073 405 270 3 SC04-09 7 30 270 0,2 SC04-098 1215 270 9 SC04-103 45 270 0,3 SC04-104 135 270 1 SC04-108 135 270 1 SC04-120 810 270 6 SC04-125 405 270 3 SC04-126 10 270 0,1 SC04-140 135 270 1 SC04-144 810 270 6 SC04-146 405 270 3 SC04-164 45 270 0,3 68

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Tabela 11Α: Dados de ensaio para medir a actividade de neutralização de scFv para os virus de escape E57 E57A2, E57A3 e E57B1.

Nome do scFv E57A2 E57A3 E57B1 1* 2* 3* 1* 2* 3* 1* 2* 3* SC04-001 10 90 0,2 10 90 0,2 30 45 1,3 SC04-004 810 90 18, 0 1215 90 27, 0 810 45 36, 0 SC04-008 10 90 0,2 15 90 0,3 270 45 12, 0 SC04-010 270 90 6,0 270 90 6,0 270 45 12, 0 SC04-018 5 90 0,1 15 90 0,3 15 45 0,7 SCO 4-021 10 90 0,2 30 90 0,7 10 90 0,2 SC04-026 <5 90 0,0 <5 45 0,0 <5 90 0,0 SCO 4-031 10 90 0,2 30 90 0,7 10 90 0,2 SCO 4-03 8 90 90 2,0 90 90 2,0 45 90 1,0 SC04-040 15 90 0,3 5 90 0,1 5 90 0,1 SCO 4-06 0 5 90 0,1 5 90 0,1 <5 90 0,0, SC04-073 135 90 3,0 90 30 6,0 30 30 2,0 SCO 4-09 7 <5 90 0,0 <5 90 0,0 <5 90 0,0 SCO 4-09 8 810 90 18, 0 270 30 18, 0 270 30 18, 0 SC04-103 <5 90 0,0 10 90 0,2 5 90 0,1 SC04-104 90 90 2,0 30 30 2,0 30 30 2,0 SC04-108 15 90 0,3 <5 90 0,0 <5 90 0,0 SCO 4-12 0 45 90 1,0 30 30 2,0 10 30 0,7 SC04-125 135 90 3,0 135 30 9,0 90 30 6,0 SC04-126 <5 90 0,0 <5 45 0,0 <5 90 0,0 SCO 4-14 0 30 45 1,3 90 30 6,0 45 90 1,0 SCO 4-14 4 270 45 12,0 270 30 18, 0 135 90 3,0 SC04-146 90 45 4,0 90 30 6,0 90 90 2,0 SCO 4-16 4 15 45 0,7 30 30 2,0 15 90 0,3 1* é a diluição no ponto final de 50% 2* é a diluição no ponto final de 50%, padrão OMS (2 Ul/ml) 3* é a Potência (Ul/ml) 69

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Tabela 11Β: Dados de ensaio para medir a actividade de neutralização de scFv para os virus de escape E57, E57B2, E57B3 e E57C3.

Nome do scFv E57B2 E57B3 E57C3 1* 2* 3* 1* 2* 3* 1* 2* 3* SCO 4-0 01 30 45 1,3 90 270 0,7 5 90 0,1 SCO 4-0 0 4 5 45 0,2 2430 270 18, 0 270 90 6,0 SCO 4-0 0 8 5 45 0,2 45 270 0,3 10 90 0,2 SCO 4-010 45 45 2,0 405 270 3,0 270 90 6,0 SCO 4-018 15 45 0,7 15 270 0,1 30 90 0,7 SC04-021 10 90 0,2 30 270 0,2 10 90 0,2 SC04-026 <5 45 0,0 <5 45 0,0 <5 30 0,0 SCO 4-031 10 90 0,2 30 270 0,2 30 90 0,7 SCO 4-03 8 30 90 0,7 90 270 0,7 90 90 2,0 SC04-040 5 90 0,1 15 135 0,2 10 90 0,2 SC04-060 <5 90 0,0 10 135 0,1 5 90 0,1 SCO 4-0 73 30 90 0,7 90 270 0,7 90 90 2,0 SC04-097 <5 90 0,0 <5 135 0,0 <5 90 0,0 SC04-098 90 90 2,0 810 270 6,0 270 90 6,0 SCO 4-103 <5 90 0,0 10 135 0,1 10 90 0,2 SCO 4-10 4 45 90 1,0 45 270 0,3 90 90 2,0 SCO 4-10 8 10 90 0,2 <5 135 0,0 15 90 0,3 SC04-120 15 90 0,3 45 270 0,3 30 90 0,7 SC04-125 90 90 2,0 270 270 2,0 270 90 6,0 SC04-126 <5 45 0,0 <5 45 0,0 <5 30 0,0 SCO 4-14 0 30 90 0,7 90 90 2,0 270 90 6,0 SCO 4-14 4 90 90 2,0 270 90 6,0 405 90 9,0 SCO 4-146 30 90 0,7 90 90 2,0 90 90 2,0 SC04-164 15 90 0,3 15 90 0,3 30 90 0,7 1* é a diluição no ponto final de 50% 2* é a diluição no ponto final de 50%, padrão OMS (2 Ul/ml) 3* é a Potência (Ul/ml) 70

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Tabela 12: Oligonucleótidos usados para a amplificação por PCR de genes de VH.

Nome e sequência de nucleótidos Gene de VH SEQ ID NO: 5H-B: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctggtggagtctg SC04-001 280 5H-C: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagctggtggagtctgg SC04-021 SC04-031 SC04-125 SC04-164 281 5H-C-long: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagctggtggagtctgggg SC04-010 SC04-038 SC04-040 SC04-073 SC04-098 SC04-103 SC04-104 SC04-108 SC04-120 SC04-140 SC04-144 SC04-146 282 5H-F: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgcagctgcaggagtccggccc SC04-018 SC04-060 283 5H-H: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctggtgcagtctgg SC04-026 284 5H-I: acctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctgctggagtctgg SC04-004 SC04-097 285 5H-M: acctgtcttgaattctccatggcccaggtgaccttgaaggagtctgg SC04-008 SC04-126 286 sy3H-A: gcccttggtgctagcgctggagacggtcaccagggtgccctggcccc SC04-001 SC04-004 SC04-008 SC04-010 SC04-026 SC04-040 SC04-073 SC04-098 SC04-120 SC04-125 SC04-126 SC04-144 SC04-146 287 sy3H-C: gcccttggtgctagcgctggagacggtcacggtggtgccctggcccc SC04-097 288 71

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Nome e sequência de nucleótidos Gene de VH SEQ ID NO: sy3H-C-long: gcccttggtgctagcgctggagacggtcacggtggtgcccttgccccagacgtc SC04-060 289 sy3H-D: gcccttggtgctagcgctggacacggtcaccatggtgccctggcccc SC04-018 SC04-021 SC04-031 SC04-038 SC04-104 SC04-108 SC04-140 SC04-164 290 sy3H-E: gcccttggtgctagcgctggacacggtcaccagggtgccccggcccc SC04-103 291

Tabela 13: Oligonucleótidos usados para a amplificação por PCR de genes de VL.

Nome e sequência de nucleótidos Gene de VL SEQ ID NO: 3L-B: ttttccttagcggccgcgactcacctaggacggtcagcttggtc SC04-001 292 5K-B: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagatgacccagtc SC04-031 SC04-060 SC04-073 SC04-098 SC04-103 SC04-104 SC04-108 SC04-164 293 5K-C: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagatgacccagtctccatcctccc SC04-004 294 5K-G: acctgtctcgagttttccatggctgacatcgtgatgacccagtctcc SC04-026 295 5K-K: acctgtctcgagttttccatggctgccatccagatgacccagtctcc SC04-010 296 5K-M: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagctgacccagtc SC04-021 SC04-097 SC04-120 SC04-125 SC04-144 297 5K-N: acctgtctcgagttttccatggctgacatccagatgactcagtc SC04-038 298 72

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Nome e sequência de nucleótidos Gene de vL SEQ ID NO: 5K-0: acctgtctcgagttttccatggctgccatccagctgacccagtc SC04-140 299 5K-Q: acctgtctcgagttttccatggctgagatcgtgatgactcagtc SC04-146 300 5L-E: acctgtctcgagttttccatggcttcctacgtgctgactcagccg SC04-008 301 5L-F: acctgtctcgagttttccatggctcagtccgtgctgactcagcc SC04-018 302 5L-G: acctgtctcgagttttccatggcttcctacgtgctgactcagcc SC04-040 SC04-126 303 sy3K-F: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccaccttggtccc SC04-004 SC04-010 SC04-021 SC04-031 SC04-098 SC04-104 SC04-125 SC04-140 SC04-144 SC04-164 304 sy3K-I: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccagccgtgtccc SC04-038 SC04-097 SC04-103 SC04-108 SC04-146 305 sy3K-J: gctgggggcggccacggtccgcttgatctccagcttggtccc SC04-026 SC04-060 SC04-073 306 sy3K-K: gctgggggcggccacggtccgcttgatgtccaccttggtccc SC04-120 307 sy3L-A: ccagcacggtaagcttcagcacggtcaccttggtgccagttcc SC04-018 SC04-126 308 sy3L-C: ccagcacggtaagcttcagcacggtcagcttggtgcctccgcc SC04-040 309 sy3L-D: ccagcacggtaagcttcaacacggtcagctgggtccc SC04-008 310 sy5L-A: acctgtctcgagttttccatggcttcctccgagctgacccaggaccctgctg SC04-001 311 73 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ

Tabela 14: Ligação dos anticorpos monoclonais humanos CR57, CRJB e CR04-010 (10 ||g/ml) aos péptidos lineares do dominio extracelular de glicoproteina 6 da estirpe ERA do virus da raiva.

Sequência de aminoácidos de péptido linear CR57 CRJB CR04-010 KFPIYTILDKLGPWS 71 97 1 FPIYTILDKLGPWSP 42 105 39 PIYTILDKLGPWSPI 36 89 87 IYTILDKLGPWSPID 44 97 104 YTILDKLGPWSPIDI 48 114 91 TILDKLGPWSPIDIH 76 96 88 ILDKLGPWSPIDIHH 54 104 69 LDKLGPWSPIDIHHL 55 99 107 DKLGPWSPIDIHHLS 62 103 93 KLGPWSPIDIHHLSC 72 105 45 LGPWSPIDIHHLSCP 69 112 19 GPWSPIDIHHLSCPN 68 114 33 PWSPIDIHHLSCPNN 62 104 47 WSPIDIHHLSCPNNL 80 106 11 SPIDIHHLSCPNNLV 74 85 1 PIDIHHLSCPNNLVV 46 93 90 IDIHHLSCPNNLVVE 69 102 55 DIHHLSCPNNLVVED 38 96 78 IHHLSCPNNLVVEDE 37 85 113 HHLSCPNNLVVEDEG 56 76 117 HLSCPNNLVVEDEGC 65 119 111 LSCPNNLVVEDEGCT 69 117 127 SCPNNLVVEDEGCTN 83 114 91 CPNNLVVEDEGCTNL 77 97 49 PNNLVVEDEGCTNLS 78 107 97 NNLVVEDEGCTNLSG 72 99 97 NLVVEDEGCTNLSGF 75 119 55 LVVEDEGCTNLSGFS 76 103 52 VVEDEGCTNLSGFSY 73 107 91 VEDEGCTNLSGFSYM 74 103 31 EDEGCTNLSGFSYME 54 90 7 DEGCTNLSGFSYMEL 1 23 1 EGCTNLSGFSYMELK 51 114 129 GCTNLSGFSYMELKV 55 114 118 CTNLSGFSYMELKVG 47 110 137 TNLSGFSYMELKVGY 43 106 161 NLSGFSYMELKVGYI 61 115 170 74

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Sequência de aminoácidos de péptido linear CR57 CRJB CR04-010 LSGFSYMELKVGYIL 71 132 169 SGFSYMELKVGYILA 79 132 161 GFSYMELKVGYILAI 65 111 141 FSYMELKVGYILAIK 89 112 192 SYMELKVGYILAIKM 65 123 152 YMELKVGYILAIKMN 78 114 150 ME L KVGYILAIKMNG 76 141 107 ELKVGYILAIKMNGF 87 132 76 LKVGYILAIKMNGFT 78 112 118 KVGYILAIKMNGFTC 78 118 68 VGYILAIKMNGFTCT 77 93 1 GYILAIKMNGFTCTG 75 90 1 YILAIKMNGFTCTGV 47 107 107 ILAIKMNGFTCTGVV 79 103 104 LAIKMNGFTCTGVVT 68 130 159 AIKMNGFTCTGVVTE 47 103 152 IKMNGFTCTGVVTEA 68 108 138 KMN GF T C T GVVT E AE 76 104 133 MNGFTCTGVVTEAEN 69 99 148 NGFTCTGVVTEAENY 69 101 138 GFTCTGVVTEAENYT 71 86 129 FTCTGVVTEAENYTN 83 125 154 TCTGVVTEAENYTNF 92 112 129 CTGVVTEAENYTNFV 76 123 150 TGVVTEAENYTNFVG 85 110 154 GVVTEAENYTNFVGY 86 111 110 VVTEAENYTNFVGYV 87 106 114 VTEAENYTNFVGYVT 79 90 73 TEAENYTNFVGYVTT 68 84 8 EAENYTNFVGYVTTT 69 117 142 AENYTNFVGYVTTTF 66 106 110 ENYTNFVGYVTTTFK 44 112 183 NYTNFVGYVTTTFKR 49 114 174 YTNFVGYVTTTFKRK 51 104 138 TNFVGYVTTTFKRKH 71 125 165 NFVGYVTTTFKRKHF 65 107 154 FVGYVTTTFKRKHFR 70 111 152 VGYVTTTFKRKHFRP 75 113 155 GYVTTTFKRKHFRPT 70 123 160 YVTTTFKRKHFRPTP 85 106 160 VTTTFKRKHFRPTPD 79 105 119 TTTFKRKHFRPTPDA 80 108 137 75

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Sequência de aminoácidos de péptido linear CR57 CRJB CR04-010 TTFKRKHFRPTPDAC 74 99 110 TFKRKHFRPTPDACR 96 111 108 FKRKHFRPTPDACRA 64 92 62 KRKHFRPTPDACRAA 65 93 1 RKHFRPTPDACRAAY 64 107 99 KHFRPTPDACRAAYN 73 112 124 HFRPTPDACRAAYNW 46 113 118 F RP T P D AC RA A YN WK 43 112 148 RPTPDACRAAYNWKM 77 101 129 PTPDACRAAYNWKMA 99 125 143 TPDACRAAYNWKMAG 92 132 160 PDACRAAYNWKMAGD 61 124 147 DACRAAYNWKMAGDP 84 113 136 ACRAAYNWKMAGDPR 82 116 138 CRAAYNWKMAGDPRY 87 118 137 RAAYNWKMAGDPRYE 90 130 120 AAYNWKMAGDPRYEE 68 106 120 AYNWKMAGDPRYEES 96 94 77 YNWKMAGDPRYEESL 83 118 116 NWKMAGDPRYEESLH 58 101 69 WKMAGDPRYEESLHN 69 101 1 KMAGDPRYEESLHNP 62 102 84 MAGDPRYEESLHNPY 64 116 112 AGDPRYEESLHNPYP 40 101 125 GDPRYEESLHNPYPD 36 98 123 DPRYEESLHNPYPDY 57 110 118 PRYEESLHNPYPDYR 73 115 129 RYEESLHNPYPDYRW 69 112 125 YEESLHNPYPDYRWL 58 106 120 EESLHNPYPDYRWLR 76 123 141 ESLHNPYPDYRWLRT 92 132 125 S LHNPYPDYRWLRTV 78 111 137 LHNPYPDYRWLRTVK 79 106 142 HNPYPDYRWLRTVKT 86 108 146 NPYPDYRWLRTVKTT 85 102 151 PYPDYRWLRTVKTTK 65 93 103 YPDYRWLRTVKTTKE 72 97 97 PDYRWLRTVKTTKES 76 85 27 DYRWLRTVKTTKESL 54 111 105 YRWLRTVKTTKESLV 46 117 125 RWLRTVKTTKESLVI 40 110 120 WLRTVKTTKESLVII 41 104 125 76

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Sequência de aminoácidos de péptido linear CR57 CRJB CR04-010 LRTVKTTKESLVIIS 65 104 161 RTVKTTKESLVIISP 82 120 150 TVKTTKESLVIISPS 76 116 150 VKTTKESLVIISPSV 71 120 154 KTTKESLVIISPSVA 101 112 147 TTKESLVIISPSVAD 78 121 141 TKESLVIISPSVADL 86 112 132 KESLVIISPSVADLD 86 117 111 ESLVIISPSVADLDP 88 125 143 SLVIISPSVADLDPY 68 105 125 LVIISPSVADLDPYD 85 107 93 VIISPSVADLDPYDR 59 98 50 IISPSVADLDPYDRS 83 125 14 ISPSVADLDPYDRSL 50 119 91 SPSVADLDPYDRSLH 59 114 118 PSVADLDPYDRSLHS 44 114 118 SVADLDPYDRSLHSR 49 106 129 VADLDPYDRSLHSRV 71 113 141 ADLDPYDRSLHSRVF 70 121 141 DLDPYDRSLHSRVFP 111 152 127 LDPYDRSLHSRVFPS 99 142 106 DPYDRSLHSRVFPSG 90 120 134 PYDRSLHSRVFPSGK 86 120 130 YDRSLHSRVFPSGKC 364 818 127 DRSLHSRVFPSGKCS 98 142 141 RSLHSRVFPSGKCSG 87 141 156 SLHSRVFPSGKCSGV 69 111 141 LHSRVFPSGKCSGVA 78 114 129 HSRVFPSGKCSGVAV 97 118 111 SRVFPSGKCSGVAVS 100 125 24 RVFPSGKCSGVAVSS 69 110 106 VFPSGKCSGVAVSST 74 114 142 FPSGKCSGVAVSSTY 64 134 146 PSGKCSGVAVSSTYC 56 112 132 SGKCSGVAVSSTYCS 64 121 120 GKCSGVAVSSTYCST 92 143 145 KCSGVAVSSTYCSTN 88 130 130 CSGVAVSSTYCSTNH 110 165 143 SGVAVSSTYCSTNHD 79 110 115 GVAVSSTYCSTNHDY 79 114 108 VAVSSTYCSTNHDYT 85 114 118 AVSSTYCSTNHDYTI 71 105 102 77

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Sequência de aminoácidos de péptido linear CR57 CRJB CR04-010 VSSTYCSTNHDYTIW 78 107 121 SSTYCSTNHDYTIWM 76 107 121 STYCSTNHDYTIWMP 86 99 119 TYCSTNHDYTIWMPE 96 107 74 YCSTNHDYTIWMPEN 47 92 29 CSTNHDYTIWMPENP 52 106 86 STNHDYTIWMPENPR 60 112 107 TNHDYTIWMPENPRL 69 129 119 NHDYTIWMPENPRLG 71 119 130 HDYTIWMPENPRLGM 82 125 123 DYTIWMPENPRLGMS 93 127 123 YTIWMPENPRLGMSC 97 132 143 TIWMPENPRLGMSCD 69 106 134 IWMPENPRLGMSCDI 98 110 101 WMPENPRLGMSCDIF 88 113 120 MPENPRLGMSCDIFT 105 121 143 PENPRLGMSCDIFTN 83 111 104 ENPRLGMSCDIFTNS 71 118 111 NPRLGMSCDIFTNSR 90 113 138 PRLGMSCDIFTNSRG 72 112 105 RLGMSCDIFTNSRGK 88 106 113 LGMSCDIFTNSRGKR 76 110 114 GMSCDIFTNSRGKRA 54 120 101 MSCDIFTNSRGKRAS 46 110 106 SCDIFTNSRGKRASK 44 111 98 CDIFTNSRGKRASKG 42 104 117 DIFTNSRGKRASKGS 70 107 111 IFTNSRGKRASKGSE 77 125 87 FTNSRGKRASKGSET 83 111 119 TNSRGKRASKGSETC 68 108 110 NSRGKRASKGSETCG 92 100 119 SRGKRASKGSETCGF 64 93 90 RGKRASKGSETCGFV 75 104 115 GKRASKGSETCGFVD 92 124 118 KRASKGSETCGFVDE 92 106 129 RASKGSETCGFVDER 86 110 134 ASKGSETCGFVDERG 97 108 103 SKGSETCGFVDERGL 92 102 76 KGSETCGFVDERGLY 90 97 44 GSETCGFVDERGLYK 57 115 92 SETCGFVDERGLYKS 33 116 86 ETCGFVDERGLYKSL 64 120 138 78

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Sequência de aminoácidos de péptido linear CR57 CRJB CR04-010 TCGFVDERGLYKSLK 47 120 125 CGFVDERGLYKSLKG 72 115 120 GFVDERGLYKSLKGA 84 120 129 FVDERGLYKSLKGAC 86 121 124 VDERGLYKSLKGACK 50 108 110 DERGLYKSLKGACKL 90 119 54 ERGLYKSLKGACKLK 90 118 106 RGLYKSLKGACKLKL 90 121 121 GLYKSLKGACKLKLC 94 129 92 LYKSLKGACKLKLCG 93 136 141 YKSLKGACKLKLCGV 80 112 110 KSLKGACKLKLCGVL 129 113 110 SLKGACKLKLCGVLG 111 111 124 LKGACKLKLCGVLGL 111 90 23 KGACKLKLCGVLGLR 111 111 100 GACKLKLCGVLGLRL 111 134 129 ACKLKLCGVLGLRLM 111 117 142 CKLKLCGVLGLRLMD 111 111 147 KLKLCGVLGLRLMDG 111 120 114 LKLCGVLGLRLMDGT 111 145 148 KLCGVLGLRLMDGTW 1111 132 86 LCGVLGLRLMDGTWV 83 138 129 CGVLGLRLMDGTWVA 99 117 104 GVLGLRLMDGTWVAM 89 148 117 VLGLRLMDGTWVAMQ 90 141 127 LGLRLMDGTWVAMQT 102 115 97 GLRLMDGTWVAMQTS 104 138 120 LRLMDGTWVAMQT SN 103 114 118 RLMDGTWVAMQTSNE 100 113 130 LMDGTWVAMQTSNET 96 106 106 MDGTWVAMQTSNETK 97 97 110 DGTWVAMQTSNETKW 69 114 92 GTWVAMQT SNETKWC 58 113 82 TWVAMQTSNETKWCP 78 118 107 WVAMQTSNETKWCPP 50 114 116 VAMQTSNETKWCPPD 86 104 151 AMQTSNETKWCPPDQ 104 114 128 MQTSNETKWCPPDQL 104 132 125 QTSNETKWCPPDQLV 92 120 155 TSNETKWCPPDQLVN 97 111 90 SNETKWCPPDQLVNL 99 129 110 NETKWCPPDQLVNLH 90 128 107 79

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Sequência de aminoácidos de péptido linear CR57 CRJB CR04-010 ETKWCPPDQLVNLHD 105 120 118 TKWCPPDQLVNLHDF 85 125 125 KWCPPDQLVNLHDFR 89 113 121 WCPPDQLVNLHDFRS 101 119 99 CPPDQLVNLHDFRSD 93 137 127 PPDQLVNLHDFRSDE 107 120 56 PDQLVNLHDFRSDEI 35 106 63 DQLVNLHDFRSDEIE 54 117 97 QLVNLHDFRSDEIEH 60 113 106 LVNLHDFRSDEIEHL 47 104 100 VNLHDFRSDEIEHLV 83 129 98 NLHDFRSDEIEHLVV 83 113 110 LHDFRSDEIEHLVVE 93 115 121 HDFRSDEIEHLVVEE 69 107 150 DFRSDEIEHLVVEEL 99 103 110 FRSDEIEHLVVEELV 86 114 116 RSDEIEHLVVEELVR 100 138 104 SDEIEHLVVEELVRK 101 117 118 DEIEHLVVEELVRKR 94 123 143 EIEHLVVEELVRKRE 82 113 121 IEHLVVEELVRKREE 90 129 118 EHLVVEELVRKREEC 82 114 106 HLVVEELVRKREECL 82 123 46 LVVEELVRKREECLD 64 100 79 VVEELVRKREECLDA 62 108 97 VEELVRKREECLDAL 58 111 101 EELVRKREECLDALE 69 112 123 ELVRKREECLDALES 82 113 117 LVRKREECLDALESI 86 130 124 VRKREECLDALESIM 58 181 151 RKREECLDALESIMT 73 110 137 KREECLDALESIMTT 102 113 97 REECLDALESIMTTK 94 110 106 EECLDALESIMTTKS 82 120 133 ECLDALESIMTTKSV 91 112 125 CLDALESIMTTKSVS 101 146 155 LDALESIMTTKSVSF 97 116 152 DALESIMTTKSVSFR 104 120 188 ALESIMTTKSVSFRR 97 132 137 LESIMTTKSVSFRRL 48 114 130 ESIMTTKSVSFRRLS 62 111 114 SIMTTKSVSFRRLSH 54 130 97 80

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Sequência de aminoácidos de péptido linear CR57 CRJB CR04-010 IMTTKSVSFRRLSHL 43 101 111 MTTKSVSFRRLSHLR 59 116 125 TTKSVSFRRLSHLRK 66 118 111 TKSVSFRRLSHLRKL 83 125 123 KSVSFRRLSHLRKLV 108 124 129 SVSFRRLSHLRKLVP 64 123 117 VSFRRLSHLRKLVPG 90 111 105 SFRRLSHLRKLVPGF 92 110 96 FRRLSHLRKLVPGFG 90 108 111 RRLSHLRKLVPGFGK 92 143 118 RLSHLRKLVPGFGKA 93 123 148 LSHLRKLVPGFGKAY 96 139 150 SHLRKLVPGFGKAYT 113 132 132 HLRKLVPGFGKAYTI 99 111 102 LRKLVPGFGKAYTIF 83 118 82 RKLVPGFGKAYTIFN 47 115 86 KLVPGFGKAYTIFNK 47 114 123 LVPGFGKAYTIFNKT 54 112 139 VPGFGKAYTIFNKTL 58 114 138 PGFGKAYTIFNKTLM 78 113 157 GFGKAYTIFNKTLME 78 123 111 FGKAYTIFNKTLMEA 90 151 III GKAYTIFNKTLMEAD 76 127 111 KAYTIFNKTLMEADA 101 123 111 AYTIFNKTLMEADAH 86 121 111 YTIFNKTLMEADAHY 104 147 III TIFNKTLMEADAHYK 107 123 1111 IFNKTLMEADAHYKS 100 118 1111 FNKTLMEADAHYKSV 111 141 1111 NKTLMEADAHYKSVR 104 116 141 KTLMEADAHYKSVRT 91 98 123 TLMEADAHYKSVRTW 100 114 90 LMEADAHYKSVRTWN 73 107 97 MEADAHYKSVRTWNE 62 129 83 EADAHYKSVRTWNEI 58 97 106 ADAHYKSVRTWNEIL 56 100 100 DAHYKSVRTWNEILP 59 121 112 AHYKSVRTWNEILPS 112 160 125 HYKSVRTWNEILPSK 80 130 123 YKSVRTWNEILPSKG 66 137 116 KSVRTWNEILPSKGC 115 125 114 SVRTWNEILPSKGCL 106 138 118 81

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Sequência de aminoácidos de péptido linear CR57 CRJB CR04-010 VRTWNEILPSKGCLR 90 124 133 RTWNEILPSKGCLRV 120 127 120 TWNEILPSKGCLRVG 97 146 127 WNEILPSKGCLRVGG 102 136 117 NEILPSKGCLRVGGR 104 130 163 EILPSKGCLRVGGRC 104 112 128 ILPSKGCLRVGGRCH 79 113 107 LPSKGCLRVGGRCHP 77 119 100 PSKGCLRVGGRCHPH 69 138 91 SKGCLRVGGRCHPHV 72 121 103 KGCLRVGGRCHPHVN 68 130 115 GCLRVGGRCHPHVNG 85 125 123 CLRVGGRCHPHVNGV 102 132 134 LRVGGRCHPHVNGVF 104 143 133 RVGGRCHPHVNGVFF 86 143 99 VGGRCHPHVNGVFFN 120 136 120 GGRCHPHVNGVFFNG 86 119 119 GRCHPHVNGVFFNGI 117 113 117 RCHPHVNGVFFNGII 98 141 143 CHPHVNGVFFNGIIL 97 150 151 HPHVNGVFFNGIILG 104 138 164 PHVNGVFFNGIILGP 93 173 146 HVNGVFFNGIILGPD 97 123 114 VNGVFFNGIILGPDG 68 116 85 NGVFFNGIILGPDGN 66 117 97 GVFFNGIILGPDGNV 58 116 100 VFFNGIILGPDGNVL 55 132 108 FFNGIILGPDGNVLI 92 143 105 FNGIILGPDGNVLIP 61 139 130 NGIILGPDGNVLIPE 102 146 141 GIILGPDGNVLIPEM 107 132 123 IILGPDGNVLIPEMQ 85 118 93 ILGPDGNVLIPEMQS 125 134 119 LGPDGNVLIPEMQSS 100 134 150 GPDGNVLIPEMQSSL 86 154 157 PDGNVLIPEMQSSLL 87 129 139 DGNVLIPEMQSSLLQ 123 134 169 GNVLIPEMQSSLLQQ 96 120 168 NVLIPEMQSSLLQQH 72 120 150 VLIPEMQSSLLQQHM 92 104 142 LIPEMQSSLLQQHME 89 111 85 IPEMQSSLLQQHMEL 89 128 129 82

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Sequência de aminoácidos de péptido linear CR57 CRJB CR04-010 PEMQSSLLQQHMELL 62 133 93 EMQSSLLQQHMELLE 58 129 142 MQSSLLQQHMELLES 65 113 117 QSSLLQQHMELLESS 82 114 132 SSLLQQHMELLESSV 90 128 132 SLLQQHMELLESSVI 124 163 133 LLQQHMELLESSVIP 78 111 121 LQQHMELLESSVIPL 106 134 128 QQHMELLESSVIPLV 103 134 133 QHMELLESSVIPLVH 98 146 139 HMELLESSVIPLVHP 110 129 134 MELLESSVIPLVHPL 90 125 152 ELLESSVIPLVHPLA 90 133 155 LLESSVIPLVHPLAD 72 117 118 LESSVIPLVHPLADP 90 128 128 ESSVIPLVHPLADPS 104 138 143 SSVIPLVHPLADPST 73 104 93 SVIPLVHPLADPSTV 72 137 107 VIPLVHPLADPSTVF 69 141 123 IPLVHPLADPSTVFK 96 156 188 PLVHPLADPSTVFKD 93 112 138 LVHPLADPSTVFKDG 164 174 188 VHPLADPSTVFKDGD 98 138 125 HPLADPSTVFKDGDE 74 141 117 PLADPSTVFKDGDEA 99 125 90 LADPSTVFKDGDEAE 68 116 113 ADPSTVFKDGDEAED 147 152 110 DPSTVFKDGDEAEDF 98 147 137 PSTVFKDGDEAEDFV 104 143 141 STVFKDGDEAEDFVE 104 120 125 TVFKDGDEAEDFVEV 107 124 96 VFKDGDEAEDFVEVH 100 106 93 FKDGDEAEDFVEVHL 65 76 119 KDGDEAEDFVEVHLP 72 93 76 DGDEAEDFVEVHLPD 85 123 91 GDEAEDFVEVHLPDV 46 124 113 DEAEDFVEVHLPDVH 68 136 123 EAEDFVEVHLPDVHN 76 117 114 AEDFVEVHLPDVHNQ 123 138 123 EDFVEVHLPDVHNQV 90 141 123 DFVEVHLPDVHNQVS 96 141 118 FVEVHLPDVHNQVSG 92 143 102 83

ΕΡ 2 314 62Ο/PT

Sequência de aminoácidos de péptido linear CR57 CRJB CR04-010 VEVHLPDVHNQVSGV 106 141 123 EVHLPDVHNQVSGVD 91 150 139 VHLPDVHNQVSGVDL 110 114 137 HLPDVHNQVSGVDLG 104 150 129 LPDVHNQVSGVDLGL 104 154 154 PDVHNQVSGVDLGLP 106 129 115 DVHNQVSGVDLGLPN 117 133 113 VHNQVSGVDLGLPNW 100 119 38 HNQVSGVDLGLPNWG 76 106 38 NQVSGVDLGLPNWGK 78 138 98 Média 91,9 119,5 130,9 Desvio padrão 157, 9 37, 6 169,8

Tabela 15: Potências de neutralização de IgG anti-proteina G do virus da raiva.

Nome da IgG UI/mg CR04-001 89 CR04-004 5 CR04-008 1176 CR04-010 3000 CR04-018 1604 CR04-021 1500 CR04-026 <2 CR04-031 272 CR04-038 2330 CR04-040 3041 CR04-060 89 CR04-073 6116 CR04-097 < 1 CR04-098 7317 CR04-103 3303 CR04-104 4871 CR04-108 4871 CR04-120 4938 CR04-125 4718 CR04-126 2655 CR04-140 478 CR04-144 6250 CR0 4-146 ND CR04-164 4724 CR5 7 3800 CRJB 605 ND = não determinado 84 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ

Tabela 16: Potências de neutralização de IgG anti-proteina G do virus da raiva contra os virus de escape E57.

Nome da IgG E57A2 (Ul/mg) E57A3 (Ul/mg) E57B1 (Ul/mg) E57B2 (Ul/mg) E57B3 (Ul/mg) E57C3 (Ul/mg) CR04-008 0* 0 0 0 0 0 CR0 4-010 8127 1355 5418 1355 2709 4064 CR04-018 1604 0 1604 0 59 535 CR04-021 450 2 150 8 50 50 CR04-038 9437 1573 9437 1049 6291 1573 CR0 4-0 40 8209 2736 24628 1368 5473 912 CR0 4-0 73 8256 1835 11008 1835 3669 1835 CR04-098 9878 3293 9878 3293 3293 3293 CR04-103 8917 2972 17835 2972 5945 2972 CR04-104 3288 2192 6576 2192 4384 1096 CR04-108 3288 731 4384 731 2192 731 CR04-120 1111 14 741 82 247 41 CR04-125 708 39 236 79 157 79 CR04-126 88 0 18 0 18 0 CR0 4-144 5625 2813 11250 2813 5625 1875 CR04-164 4252 472 4252 472 945 709 * 0 indica nenhum ponto final de 50% a uma diluição de 1:100 do anticorpo

Tabela 17. Potência de neutralização de CR-57 contra os virus de escape E98. E98-2 (Ul/mg) E98-4 (Ul/mg) E98-5 (Ul/mg) E98-6 (Ul/mg) E98-7 (Ul/mg) CR-57 2813 8438 4219 2813 8438 CR04-098 0* 0 0 0 0 * Zero indica nenhum ponto final de 50% a uma diluição de 1:1000 do anticorpo. 85 ΕΡ 2 314 620/ΡΤ

Tabela 18: Ocorrência de resíduos de aminoácidos na região de ligação mínima de CR57 em vírus da raiva do genótipo 1.

Tipo selvagem K L c 6 V L K (99,6%)* L (100%) c (100%) G (98,7%) V (99,6%) L (70,7%) R (0,4%) E (0,9%) K0,4%) P (26,7%) R (0,4%) S (2,6%) * A percentagem de ocorrência de cada aminoácido é apresentada em 229 isolados do vírus da raiva.

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Lisboa, 2013-08-26

Claims

ΕΡ 2 314 62Ο/PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método de identificação de uma molécula de ligação potencialmente possuindo actividade de neutralização contra um vírus da raiva ou de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação potencialmente possuindo actividade de neutralização contra um vírus da raiva, em que o método compreende as etapas de: a) contacto de uma colecção de moléculas de ligação sobre a superfície de pacotes genéticos replicáveis com um vírus da raiva sob condições condutivas a ligação, em que a colecção de moléculas de ligação é preparada a partir de ARN isolado de células obtidas de um indivíduo humano que foi vacinado contra a raia ou que foi exposto ao vírus da raiva, b) separação e recuperação de moléculas de ligação que se ligam ao vírus da raiva das moléculas de ligação que não se ligam, c) isolamento de pelo menos uma molécula de ligação recuperada, d) verificação se a molécula de ligação isolada possui actividade de neutralização contra o vírus da raiva, compreendendo adicionalmente a etapa de separação e recuperação de moléculas de ligação codificadas por um gene da linha germinativa 3-30 pesada variável.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o vírus da raiva está inactivado.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a colecção de moléculas de ligação sobre a superfície de pacotes genéticos replicáveis é uma biblioteca de Fv de cadeia única.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que o indivíduo é um indivíduo humano que foi vacinado contra a raiva.
5. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, caracterizado por o pacote genético replicável ser ΕΡ 2 314 62Ο/PT 2/2 seleccionado do grupo que consiste em uma partícula fágica, uma bactéria, uma levedura, um fungo, um esporo de um microorganismo e um ribossoma. Lisboa, 2013-08-26