MXPA04001609A - Anticuerpos recombinantes, y composiciones y metodos para elaborar y utilizar los mismos. - Google Patents

Anticuerpos recombinantes, y composiciones y metodos para elaborar y utilizar los mismos.

Info

Publication number
MXPA04001609A
MXPA04001609A MXPA04001609A MXPA04001609A MXPA04001609A MX PA04001609 A MXPA04001609 A MX PA04001609A MX PA04001609 A MXPA04001609 A MX PA04001609A MX PA04001609 A MXPA04001609 A MX PA04001609A MX PA04001609 A MXPA04001609 A MX PA04001609A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
ser
thr
val
pro
leu
Prior art date
Application number
MXPA04001609A
Other languages
English (en)
Inventor
Dietzschold Bernhard
Original Assignee
Univ Jefferson
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Jefferson filed Critical Univ Jefferson
Publication of MXPA04001609A publication Critical patent/MXPA04001609A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Se describen anticuerpos recombinantes; se describen las secuencias de acido nucleico y aminoacidos codificados de las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera de anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia monoclonales humanos, y su uso.

Description

ANTICUERPOS RECOMBINANTES. Y COMPOSICIONES Y METODOS PARA ELABORAR Y UTILIZAR LOS MISMOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/314,023 presentada el 21 de agosto de 2001 , que se incorpora a la presente por referencia.
CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a anticuerpos recombinantes que incluyen el ácido nucleico y secuencia de aminoácido de anticuerpos monoclonales neutralizadores del virus de la rabia de humano.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La rabia es una enfermedad neurológica aguda provocada por infección del sistema nervioso central con el virus de la rabia, un miembro del género Lyssavirus de la familia Rhabdovindae. De gran importancia histórica debido a su antigüedad y la naturaleza espantosa de la enfermedad, el virus de la rabia continua siendo una amenaza importante para la infección en humanos y veterinaria debido a los grandes depósitos en diversas especies de la vida salvaje. A través de gran parte del mundo, distintas variaciones del virus de la rabia son endémicas en particular en especies animales terrestres, con relativamente muy poco en común entre las mismas. Aunque varias islas, incluyendo el Reino Unidos, Australia, Japón y numerosas islas se encuentran libres de rabia terrestre, la rabia y los virus relacionados con la rabia asociados con murciélagos han sido identificados recientemente en el Reino Unido y Australia. El virus de la rabia es una partícula envuelta, característicamente en forma de bala con un promedio de 75 por 180 nanómetros. El virión consiste en un genóma de ARN de sentido negativo. de una sola cadena y cinco proteínas estructurales: las moléculas de nucleoproteína (N), la fosfoproteína (NS), la polimerasa (L), la proteína matriz ( ) y la glicoproteína viral (G). Las proteínas N y G ambas portan determinantes antigénicos que permiten la caracterización serotípica de diversas cepas del virus de rabia. Los determinantes N se conservan altamente entre diferentes aislados de virus y por lo tanto son objetivos muy útiles para la detección "inmunohistológlca de la infección del virus de la rabia utilizando anticuerpos específicos. Por otro lado, los determinantes antigénicos portados en la proteína G varían sustancialmente entre las cepas del virus de la rabia. Los anticuerpos neutralizantes del virus que surgen mediante la vacuna con el virus inactivado se dirigen contra G. White. Aunque es claro que las respuestas de la célula T a G, N, y NS, participan en respuestas inmunes al virus bajo condiciones experimentales, la evaluación de la inmunidad al virus de la rabia generalmente se limita a la serología, particularmente con respecto a anticuerpos neutralizantes del virus. En áreas del mundo en donde la rabia en humanos aún es común, el perro es el mayor receptor del virus que infecta al hombre. En donde la rabia canina se ha eliminado en gran medida por medio de las vacunas, los zorros, coyotes, zorrillos, mapaches, murciélagos y una variedad de diferentes mamíferos portan variantes del virus. En muchas áreas, los depósitos de la vida silvestre del virus continúan expandiéndose. Además, el virus de la rabia puede transmitirse de una especie de depósito a humanos u l otros hospederos de etapa final por animales que no se asocian normalmente con la rabia tal como gatos, conejos, etc. De manera casi invariable, cada vez que aparecen los síntomas clínicos fatales, la rabia puede prevenirse al incitar tratamiento de un individuo infectado con una combinación de inmunización pasiva y activa. La inmunización pasiva consiste en la administración de anticuerpos de neutralización del virus de la rabia preformados obtenidos de suero agrupado de individuos inmunes a la rabia (globulina inmune a rabia de humano; HRIG) o caballos hiper-inmunizados (globulina inmune a rabia de equinos; ERIG). Ambos tipos de reactivos presentan ciertos riesgos a los recipientes que incluyen especificidad de antígeno variable y de este modo potencia, para diferentes aislados del virus de la rabia.
HRIG se prepara a partir de suero de humano agrupado, por lo tanto existe la posibilidad de que las preparaciones de HRIG puedan ser contaminadas con patógenos de humano conocidos o no conocidos. Por otro lado, como una preparación de antígeno extraño, ERIG se ha relacionado con severas reacciones anafilácticas. Los monoclonales de ratón específicos para virus de rabia han sido contemplados para utilizarse en profilaxis postexposición pero, como ERIG, son antagónicamente extraños a los humanos. Esto puede dar como resultado su rápida depuración del sistema humano, como también el potencial para provocar una reacción anafiláctica. El uso de los anticuerpos monoclonales de humano se limitan ya que las líneas celulares del hibridoma de humano son duras de preparar, generalmente inestables, y no producen anticuerpos monoclonales de la especificidad apropiada en suficientes cantidades y en costos razonables. Los costos de producción de anticuerpos monoclonales los hacen deseables para encontrar alternativas más económicas para obtener anticuerpos monoclonales de hibridomas. Se establece bien que tanto las regiones Fab como Fab 2, que comprenden regiones variables y de bisagra de las cadenas pesada y ligera, no protegen contra la infección del virus de la rabia. La eficacia in vivo del anticuerpo depende de la secuencia total, es decir únicamente anticuerpos particulares presentan actividad anti-rabia. Es la región constante del anticuerpo la que es responsable de la inmunorreactividad. De este modo, son los atributos particulares de la región(es) constante los que se requieren para proteger contra el virus de la rabia. Las regiones variables empalmadas a una región constante de otro anticuerpo, que es un anticuerpo que no se elabora naturalmente contra el virus de la rabia, son no efectivas. Existe una necesidad de anticuerpos recombinantes útiles en el diagnóstico, prevención y tratamiento de infección de rabia, y composiciones farmacéuticas que comprendan y métodos para usar los mismos. Existe una necesidad de composiciones y métodos para producir dichos anticuerpos recombinantes. Existe una necesidad de anticuerpos recombinantes útiles en el diagnóstico, prevención y tratamiento de la infección de patógenos que se dirigen al tejido neuronal, y composiciones farmacéuticas que los comprenden y métodos para utilizar los mismos. Existe la necesidad de composiciones y métodos para producir anticuerpos monoclonales. Para proveer un mejor reactivo, los anticuerpos monoclonales de humano se han elaborado mediante fusión de células B de humano específicas del virus de la rabia transformadas por el virus Epstein-Barr (EBV)- con donadores heterohíbridos de ratón-humano. Los clones de ADNc que codifican para las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo de estas células se construyeron de manera que los anticuerpos se expresaran en sistemas de expresión heterólogos. Estas construcciones permiten a los anticuerpos de humanos de neutralización de rabia de la especificidad definida producirse en un sistema controlado, purificándose lejos de contaminantes nocivos posibles. La presente invención se refiere a estos anticuerpos de humanos de neutralización del virus de la rabia monoclonales, las secuencias de ácido nucleico de sus cadenas ligeras y pesadas y las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas. También se proveen en la presente invención, métodos para utilizar los anticuerpos monoclonales como un tratamiento profiláctico post-exposición terapéuticamente efectivo de individuos expuestos al virus de la rabia.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee anticuerpos recombinantes, y composiciones para y métodos para producir dichos anticuerpos. De acuerdo con algunos aspectos de la invención, la presente invención provee anticuerpos anti-rabia recombinantes, y composiciones para y métodos para producir dichos anticuerpos. De acuerdo con algunos aspectos de la invención, la presente invención provee anticuerpos recombinantes con una región constante específica que los hace particularmente efectivos en para combatir patógenos que atacan el sistema neural. La presente invención además se refiere a las secuencias de ADN aisladas, a vectores recombinantes que comprenden dichas secuencias, a células hospederos que comprenden dichos vectores y métodos para producir anticuerpos recombinantes utilizando dichas células hospedero.
La presente invención se refiere adicionalmente al uso de anticuerpos recombinantes en el diagnóstico, prevención y tratamiento de infecciones patógenas del tejido neuronal, particularmente rabia. La presente invención provee moléculas de ácido nucleico aisladas que tienen una secuencia de ácido nucleico de cadena pesada y de cadena ligera que codifica para una secuencia de aminoácido de cadena pesada y de cadena ligera. Las secuencias de aminoácido de cadena ligera y cadena pesada son aquellas de un anticuerpo de neutralización del virus de la rabia monoclonal que se une específicamente a una proteína del virus de la rabia. La presente invención que provee moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para el anticuerpo de neutralización del virus de la rabia monoclonal se derivan de las secuencias de ADNc de la SEQ.ID.NO:1 de cadena pesada y de la SEQ.ID.NO:2 de cadena ligera. La presente invención provee un anticuerpo de neutralización del virus de la rabia monoclonal de humano aislado que se codifica en clones de ADNc que codifican para las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo expresadas en sistemas de expresión heterólogos y purificadas lejos de los contaminantes nocivos. En una modalidad de la presente invención, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de neutralización del virus de la rabia monoclonal de humano aislado es esa de la SEQ.ID.NO:3 y SEQ.ID.NO:4, respectivamente.
La presente invención provee un gen fusionado que codifica para una cadena ligera de inmunoglobulina quimérica. La cadena ligera quimérica contiene una primera secuencia de ADN que codifica para una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo de neutralización del virus de la rabia monoclonal producido mediante una línea celular de heterohibridoma; y una segunda secuencia de ADN que codifica para una región constante de cadena ligera de humano. La presente invención provee un vector de expresión para expresar este gen fusionado. Es un objeto adicional proveer una célula hospedero para el vector de expresión. La presente invención provee un gen fusionado que codifica para una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica. La cadena pesada quimérica contiene una primera secuencia de ADN que codifica para una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo de neutralización del virus de la rabia monoclonal producido mediante una línea celular de heterohibridoma; y una segunda secuencia de ADN que codifica para una región constante de cadena pesada de humano. La presente invención provee un vector de expresión que expresa este gen fusionado. Es un objeto adicional proveer una célula hospedero para el vector de expresión. La presente invención provee un anticuerpo de neutralización del virus de la rabia monoclonal aislado derivado del gen fusionado que codifica para una cadena ligera de inmunoglobulina quimérica y el gen fusionado que codifica para una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica.
La presente invención provee un método para tratar a un individuo expuesto a un virus de la rabia al administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de neutralización del virus de la rabia monoclonal dé humano que se codifica en clones de ADNc que codifican para las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo expresadas en sistemas de expresión heterólogos y que se purifican lejos de contaminantes nocivos, evitando así la dispersión del virus de la rabia al sistema nervioso central.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a la glicoproteína de varias cepas del virus de la rabia. El tratamiento post-exposición con anticuerpo monoclonal, o una mezcla de una variedad de anticuerpos monoclonales, neutralizará el virus de la rabia en el sitio de entrada y evitará que el virus se disperse al sistema nervioso central (CNS). De este modo, para exposición transdérmica o mucosa al virus de la rabia, los anticuerpos monoclonales específicos de la rabia se instilan en el sitio de mordida, como también se administran sintéticamente. Ya que la réplica viral se restringe casi exclusivamente a células neuronales, la neutralización y depuración del virus mediante anticuerpos monoclonales de la presente invención antes de la entrada en el CNS es un profiláctico postexposición efectivo.
Un aspecto de la presente invención provee secuencias de anticuerpos monocionales contra el virus de la rabia. Aunque la mayoría de las regiones variables de MAb 57 son bien conocidas (Cheung et al., J. V7ro/.66:6714-6720, 1992, que se incorpora en la presente por referencia), la región constante no lo es. Todo el anticuerpo monoclonal, tanto las regiones variables como constantes, se han clonado y secuenciado. La presente invención provee la secuencia de nucleótido novedosa de la región constante MAb 57, nucleótidos 476-1431 , que incluye el dominio 1 constante (CH1 ) en la región de gozne. La secuencia puede se utilizada en anticuerpos recombinantes que incluyen anticuerpos anti-rabia o anticuerpos recombinantes dirigidos en otros patógenos que atacan el tejido neuronal, tal como encefalitis o herpes. La invención se refiere a anticuerpos recombinantes, a los genes de clones que los codifican, a los vectores que incorporan genes clonados y células hospedero que incluyen los vectores. La invención también provee métodos para elaborar y utilizar los anticuerpos monocionales. La presente invención provee anticuerpos recombinantes derivados de MAb 57. MAb 57 derivado de hibridomas son anticuerpos lgG2; anticuerpos recombinantes derivados de MAb 57 son anticuerpos lgG1. La invención se refiere a anticuerpos recombinantes derivados de Mab 57, a los genes de los clones que los codifican, la los vectores que incorporan genes clonados y células hospedero que incluyen los vectores. La invención también provee métodos para elaborar y utilizar los anticuerpos monocionales.
La presente invención también provee la secuencia total de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo MAb JA monoclonal anti-rabia. La invención se refiere a anticuerpos recombinantes derivados de Mab JA, a genes de clones que los codifican, a los vectores que incorporan genes clonados y células hospedero que incluyen los vectores. La invención también provee métodos para elaborar y utilizar los anticuerpos recombinantes. La presente invención también provee la secuencia total de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo MAb JB.1 monoclonal anti-rabia. La invención se refiere a anticuerpos recombinantes derivados de Mab JB.1 , a los genes de clones que los codifican, a los vectores que incorporan genes clonados y células hospedero que incluyen los vectores. La invención también provee métodos para elaborar y utilizar los anticuerpos recombinantes. De acuerdo con algunas modalidades, el anticuerpo recombinante de la invención es un anticuerpo de una sola cadena en donde el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se unen por medio de un grupo espaciador, preferiblemente un péptido. Más preferiblemente, es un anticuerpo de cadena individual en donde el dominio variable de cadena pesada se ubica en la terminal N del anticuerpo recombinante. El anticuerpo recombinante de cadena individual puede además comprender una molécula efectora y/o secuencias de señal facilitando el procesamiento del anticuerpo mediante la célula hospedero en donde se prepara.
Los anticuerpos recombinantes de la invención pueden utilizarse para identificar el virus de la raya tal como mediante coloración inmunofluorescente de células infectadas, mediante immunoblotting ya sea directamente o mediante inmunoprecipitación y blotting de proteína de inmunocomplejos, o mediante inmunoensayos tales como enlace, inhibición cruzada o inmunoensayo de radio o enzima de competencia. La invención además se refiere a un método para fabricar los anticuerpos recombinantes de la invención. Los anticuerpos recombinantes de la invención pueden prepararse mediante técnicas de ADN recombinante que comprenden cultivar un hospedero transformado bajo condiciones que permiten la expresión del mismo y aislar dicho anticuerpo. Más específicamente, la presente invención también se refiere a un procedimiento para la producción de un anticuerpo recombinante que comprende cultivar un hospedero que ha sido transformado con un vector híbrido que comprende un cassette de expresión que comprende un promotor y un ADN que codifica para dicho anticuerpo recombinante cuyo ADN se controla mediante dicho promotor, y aisla dicho cuerpo recombinante. La producción In vitrio provee preparaciones de anticuerpo relativamente puras y permite aumento a escala para dar grandes cantidades de los anticuerpos deseados. Las técnicas para cultivo de la célula bacteriana, cultivo de célula de levadura o de mamífero son conocidas en la técnica e incluyen cultivo de suspensión homogénea, por ejemplo, en un reactor emulsor de aire o en un reactor de agitación continua, o un cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, o microperlas de agarosa o cartuchos de cerámica. Las secuencias degeneradas se degeneran dentro de! significado del código genético en donde un número ilimitado de nucleótidos se reemplazan mediante otros nucleótidos sin dar como resultado un cambio de la secuencia de aminoácido originalmente codificada. Dichas secuencias degeneradas pueden ser útiles debido a su sitios de restricción diferentes y/o frecuencia de codones particulares que se prefieren por el hospedero específico, particularmente E. coli, para obtener una expresión óptima del anticuerpo recombinante. Además, la invención se refiere a un ADN recombinante que es un vector híbrido que comprende un inserto que codifica para el anticuerpo recombinante descrito en la presente, y, opcionalmente, un origen de réplica o una secuencia de réplica autónoma, o una o más secuencias del marcador dominante, secuencias de control de expresión, secuencias de señal y sitios de restricción adicionales. Los vectores típicamente realizan dos funciones en colaboración con células hospedero compatibles. Una función es facilitar la clonación del ácido nucleico que codifica para los dominios de inmunoglobulina, es decir, para producir cantidades útiles del ácido nucleico (vectores de clonación). La otra función es proveer réplica y expresión de las construcciones del gen recombinante en un hospedero adecuado, ya sea mediante mantenimiento como un elemento extracromosomal o mediante integración en el cromosoma hospedero (vectores de expresión). Un vector de clonación comprende las construcciones del gen recombinante como se describió anteriormente, un origen de réplica o una secuencia de réplica autónoma, secuencias del marcador dominante y, opcionalmente, secuencias de señal y sitios de restricción adicionales. Un vector de expresión adicionalmente comprende secuencias de control de expresión esenciales para la transcripción y traducción de genes recombinantes. Un origen de réplica o una secuencia de réplica autónoma se provee ya sea mediante construcción del vector para incluir un origen exógeno tal como derivado del virus 40 Simian (SV 40) u otra fuente viral, o mediante mecánicos cromosomales de la célula hospedero. Los marcadores permiten la selección de células hospedero que contienen el vector. Dichos marcadores de selección incluyen genes que confieren resistencia a metales pesados tales como cobre o a antibióticos tales como geneticina (G-418) o higromicina, o genes que complementan una lección genética de la célula hospedero tal como la ausencia de timidin cinasa, hipoxantin fosforil transferasa, dihidrofolato reductasa o similares. Las secuencias de señal pueden ser, por ejemplo, presecuencias o líderes secretorios que dirigen la secreción del anticuerpo recombinante, señales de empalme, o similares. Ejemplos para secuencias de señal que dirigen la secreción del anticuerpo recombinante son secuencias derivadas del gen ompA, el gen pelB (pectato liasa) o el gen phoA.
Como secuencias de control de expresión, el ADN del vector comprende un promotor, secuencias necesarias para la iniciación y finalización de la transcripción y para la estabilización del ARNm y, opcionalmente mejoradores y secuencias reguladoras adicionales. Una amplia variedad de secuencias promotoras pueden emplearse, dependiendo de la naturaleza de la célula hospedero. Los promotores que son fuertes y al mismo tiempo se regulan bien son los más útiles. Las secuencias para la iniciación de la traducción son por ejemplo las secuencias Shine-Dalgarno. Las secuencias necesarias para la iniciación y finalización de la transcripción y para la estabilización del ARNm se encuentran comúnmente disponibles de las regiones 5' y regiones 3' no codificadas, respectivamente de los ADNc virales o eucarióticos, por ejemplo el hospedero de expresión. Los mejoradores son secuencias de ADN estimuladoras de la transcripción de origen viral, por ejemplo, derivadas del virus Simian, del virus de polióma, del virus de bovino de papiloma o virus de sarcoma Moloney o de origen genómico, especialmente murino. Varios segmentos de ADN del ADN del vector se unen operativamente, es decir, se encuentran contiguos y se colocan en relación funcional entre sí. Ejemplos de vectores que son adecuados para la réplica y expresión en una cepa de E. coli son bacteriófagos, por ejemplo derivados de lambda, bacteriófagos, o plásmidos tales como en particular, plásmldo Co1 E1 y sus derivados, por ejemplo pMB9, pSF2124, pBR317 o pBR322 y plásmidos derivados de pBR322, tales como pUC9, pUCKO, pHRi 8 y pLc24. Vectores adecuados contienen un replicón completo, un gen marcador, una secuencia de reconocimiento para endonucleasas de restricción, de manera que el ADN extraño y, si es apropiado, la secuencia de control de expresión pueden insertarse en esos sitios, y opcionalmente secuencias de señal y mejoradores. Los promotores microbianos son, por ejemplo, el promotor PL hacia la izquierda fuerte del bacteriófago ? que se controla mediante un represor sensible a la temperatura. También son adecuados los promotores E.coli tales como el promotor lac (lactosa) que se regula mediante el represor lac y se induce mediante isopropil-beta-D-tiogalactosida, el promotor trp (triptofano) regulado por el represor trp e inducido por ejemplo, mediante inanición de triptofano, y el tac (promotor híbrido trp-lac), regulado por el represor lac. Los vectores que son adecuados para la réplica y expresión en levadura contienen un inicio de réplica en levadura y un marcador genético selectivo para levadura. Un grupo de dichos vectores incluye las secuencias ars así llamadas (secuencias de réplica autónoma) como origen de la réplica. Estos vectores se retienen extracromosomalmente dentro de la célula de levadura después de la transformación y se replican de manera autónoma. Además, los vectores que contienen toda o parte de 2 µ?? de ADN de plásmido de Saccharornyces cerevisiae se utilizan. Dichos vectores se integrarán mediante recombinación en 2 µ?t? de plásmidos ya existentes dentro de la célula, o se replicarán de manera autónoma. Las secuencias 2 µ?? son particularmente adecuadas cuando una alta frecuencia de transformación y números elevados de copias se logran. Las secuencias de control de expresión que son adecuadas para la expresión en levadura son, por ejemplo, los genes de levadura altamente expresados. De este modo, los promotores para el gen TRP1 , el gen ADHI o ADIlll, gen de fosfataso ácido (PH03 o PH05), gen de isocitocromo o un promotor implicado con la trayectoria glicolítica, tal como el promotor de la enolasa, gen de gliceraldehido-3-fosfato cinasa (PGK), hexocinasa, piruvato de descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvatocinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa, pueden utilizarse. Los vectores adecuados para réplica y expresión en células de mamífero se proveen preferiblemente con secuencias de promoción derivadas del ADN de origen viral, por ejemplo, del virus 40 Simian (SV40), virus de sarcoma Rous (RSV), adenovirus 2, virus de papiloma de bovino (BPV), mutante BK de papova-virus (BKV), o citomegalovirus de ratón o humano (CMV). Alternativamente, los vectores pueden comprender promotores de productos de expresión de mamífero, tales como actina, colágeno, miosina, etc., o el promotor nativo y secuencias de control que se relacionan normalmente con la secuencia del gel deseado, es decir, el promotor de cadena H de inmunoglobulina o cadena L. Algunos vectores preferidos son adecuados tanto para hospederos procarióticos como eucarióticos y se basan en sistemas de réplica virales. Particularmente preferidos son los vectores que comprenden promotores del virus Simian, por ejemplo pSVgpt o pSVneo, que comprenden además un mejorador, por ejemplo un mejorador normalmente relacionado con la secuencia del gen de inmunogiobulina, en particular el mejorador de cadena L o Ig H de ratón. El ADN recombinante que codifica para un anticuerpo recombinante de la invención puede prepararse, por ejemplo al cultivar una célula hospedero transformada y opcionalmente aislar el ADN preparado. Además, la invención se refiere a células hospedero transformadas con los ADN recombinantes descritos anteriormente, principalmente células hospedero que se transforman con un ADN que codifica para una cadena pesada y/o un ADN que codifica para la cadena ligera del anticuerpo recombinante deseado, en particular células hospedero transformadas con un ADN que codifica para el anticuerpo recombinante de cadena individual. Más específicamente, la invención se refiere a células hospedero que puede tansformarse con un vector híbrido que comprende un cassette de expresión que comprende un promotor y un ADN que codifica para un anticuerpo recombinante. Además, la invención pertenece a una célula hospedero que se ha transformado con un vector híbrido que comprende un cassette de expresión que comprende un promotor unido de manera operable a la primera secuencia de ADN que codifica para un péptido de señal unido al marco de lectura apropiado a una segunda secuencia de ADN que codifica para un anticuerpo recombinante. Ejemplos de hospederos adecuados son microorganismos que carecen de o son deficientes en enzimas de restricción o enzimas de modificación, taies como bacterias, en cepas particulares de Escherichia coli, por ejemplo E. coli X1776, E. coli Y1090, E. coli HB 101 , E. coli W31 0, E. coli HB 01/LM1035, E. coli JA 221 , E. coli DH5.alfa., E. coli K12, o cepa de E. coli CC118, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus y otros y levaduras, por ejemplo Sacchoromyces cerevisiae tal como S. cerevisiae GRF 18. Además, las células hospedero adecuadas son células de altos organismos, en particular líneas celulares de animal o humano continuas establecidas, por ejemplo, fibroblastos L132 de pulmón embriónico de humano, células de Bowes de melanoma maligno de humano, células HeLa, células del riñon transformadas por el virus SV40 de mono verde africano COS-7 o células de ovario de hámster chino (CHO) o células de origen linfoide, tal como linfoma, mieloma, hibridoma, trioma o células cuadroma, por ejemplo PAI, Sp2/0 o células X63-Ag8.653. La invención también se refiere a procedimientos para la preparación de células hospedero transformadas en donde las células hospedero receptoras adecuadas como se describe en la presente se transforman con un vector híbrido de conformidad con la invención, y las células transformadas se seleccionan. La transformación de microorganismos se lleva a cabo como se describe en la literatura, por ejemplo, para S. cerevisiae (A. Hinnen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978), para B. subtilis (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81 : 741 , 1961 ), para E. coli ( . Mandel et al., J. Mol. Biol. 53:159,1970). Por lo tanto, el procedimiento de transformación de las células E. coli incluye, por ejemplo, tratamiento previo Ca2+ de las células para permitir al absorción de ADN, e incubación con el vector híbrido. La selección subsecuente de las células transformadas puede lograrse por ejemplo, al transferir las células a un medio de crecimiento selectivo que permite la separación de las células transformadas de las células de origen dependiente de la naturaleza de la secuencia del marcador del ADN de vector. Preferiblemente, un medio de crecimiento se utiliza el cual no permite el crecimiento de las células que no contienen el vector. La transformación de la levadura comprende, por ejemplo, los pasos de remoción enzimática de la pared celular de levadura por medio de glucosidasas, tratamiento de los esferoplástos obtenidos con el vector en presencia de polietilenglicol y iones Ca2+, y regeneración de la pared celular al insertar los esferoplástos en agar. Preferiblemente, el agar de regeneración se prepara en una forma que permite la regeneración y selección de las células transformadas como se describió anteriormente. La transformación de las células de origen eucariótico superior, tal como líneas celulares de mamífero, preferiblemente se logra mediante transfección. La transfección se lleva a cabo mediante técnicas convencionales, tal como precipitación de fosfato de calcio, microinyección, fusión de protopiasíos, electroporación, es decir, introducción de ADN mediante un corto impulso eléctrico que incrementa temporalmente la impermeabilidad de la membrana celular, o en presencia de los compuestos de ayuda tal como dimetilaminoetildextrano, dimetilsulfóxido, glicerol o polietilenglicol, y similares. Después del procedimiento de transfección, las células transfectadas se identifican y seleccionan, por ejemplo, mediante cultivo en un medio selectivo elegido dependiendo de la naturaleza del marcador de selección, por ejemplo un medio de cultivo estándar tal como el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo, medio RPMI 1640 y similar, que contiene por ejemplo el antibiótico correspondiente. Los anticuerpos recombinantes de conformidad con la invención pueden utilizarse para la determinación cuantitativa y cualitativa de la presencia del virus de la rabia. En general, los anticuerpos recombinantes de conformidad con la invención pueden utilizarse en cualquiera de los ¡nmunoensayos conocidos que dependen de la interacción de enlace entre los anticuerpos y antígenos de la rabia. Ejemplos de dichos ensayos son radio-, enzima, fluorescencia, quimiluminiscencia, inmunoprecipitación, aglutinación por látex, e ¡nmunoensayos de hemaglutinación, y, en particular, métodos de inmunocoloración. Los anticuerpos de conformidad con la invención pueden utilizarse como tales o en forma de derivados conjugados de enzima y un inmunoensayo de enzima. Cualquiera de las modificaciones conocidas del inmunoensayo de enzima pueden utilizarse, por ejemplo, inmunoensayo de enzima en fase soluble (homogéneo), inmunoensayo de enzima en fase sólida (heterogéneo), inmunoensayo de enzima sencilla o inmunoensayo de enzima doble (intercalado) con determinación directa o indirecta (competitiva) de la presencia del virus de rabia. Un ejemplo de dicho inmunoensayo de enzima es un inmunoensayo de enzima intercalado en donde un portador adecuado, por ejemplo, la superficie plástica de una placa de microtitulación o de un tubo de prueba, por ejemplo, poliestireno, polipropileno o cloruro de polivinilo, vidrio o esferas de plástico, papel de filtro, dextrano, etc., acetato de celulosa u hojas de nitrocelulosa, partículas magnéticas o similares, se reviste con un anticuerpo monoclonal de la invención mediante absorción simple u opcionalmente después de la activación del portador, por ejemplo, con glutaraldehido o bromuro de cianógeno. Posteriormente las soluciones de prueba que contienen el virus de la rabia y finalmente los anticuerpos recombinantes de la invención que comprenden una enzima detectable, por ejemplo, fosfatasa alcalina, se agregan. La cantidad del virus de rabia en la solución de prueba es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo recombinante unido y se determina al agregar una solución de substrato de enzima. La reacción de substrato de enzima da como resultado, por ejemplo, un cambio de color que puede ser observado por el ojo o con dispositivos de medición óptica.
Los anticuerpos de conformidad con la invención pueden utilizarse como tales o en forma de derivados radiactivamente marcados en un radioinmunoensayo . (RIA). Como se describió anteriormente para los inmunoensayos de enzima, cualquiera de las modificacionés conocidas de un radioinmunoensayo puede utilizarse. Las pruebas se llevan a cabo en una manera análoga a los inmunoensayos de enzima descritos anteriormente utilizando una etiqueta radioactiva, por ejemplo, 125l, en lugar de una etiqueta de enzima. La cantidad de complejo inmune formado, el cual corresponde a la cantidad del virus de rabia presente en las soluciones de prueba se determina al medir la radioactividad del complejo inmune. Para inmunocoloración las criosecciones del material de biopsia criopreservado o secciones de tejido incrustados con parafina se tratan con una solución que contiene un anticuerpo recombinante de la invención que comprende una enzima detectable. El anticuerpo recombinante unido se detecta mediante tratamiento con un substrato de enzima adecuado, preferiblemente un substrato de enzima que conduce a un depósito sólido (cepa) en el sitio del anticuerpo recombinante de la invención. En lugar de los anticuerpos recombinantes que comprenden una enzima, un anticuerpo recombinante que comprende estreptavidina y una solución de conjugado de biotina-enzima pueden utilizarse, lo cual conduce a la concentración elevada de enzima en el sitio del anticuerpo y preferiblemente sensibilidad incrementada del método de inmunocoloración. El depósito sólido del substrato de enzima se detecta mediante inspección con un microscopio, por ejemplo, con un microscopio de fluorescencia, o mediante escudriñamiento de la densidad óptica en la longitud de onda de la cepa. El uso de conformidad con la invención de los anticuerpos recombinantes como se describe de aquí en adelante para la determinación del virus de la rabia también incluye otros inmunoensayos conocidos per se, por ejemplo pruebas de inmunofluorescencia, aglutinación de látex con anticuerpo revestido o partículas de látex revestidas con antígeno, hemaglutinación con corpúsculos de sangre revestidos con antígeno o anticuerpo, pruebas de luz evanescente utilizando una fibra óptica revestida con anticuerpo y otros inmunosensores que actúan directamente que convierten el evento de enlace en una señal eléctrica u óptica, o similar. La invención también se refiere a equipos de prueba para la determinación cualitativa y cuantitativa de presencia del virus de rabia que comprende anticuerpos recombinantes de la invención y, opcionalmente, adjuntos, controles positivos y/o negativos, reguladores de pH, instrucciones y descripciones de resultados ejemplares. Además, los anticuerpos recombinantes de la invención, son útiles para la prevención de infección de rabia en pacientes con exposición posible al virus de rabia o tratamiento de pacientes que han sido infectados con rabia. Por lo tanto la invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo recombinante de conformidad con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Se prefieren composiciones farmacéuticas para aplicación parenteral. Las composiciones para aplicación intramuscular, subcutánea o intravenosa son por ejemplo soluciones acuosas isotónicas o suspensiones, opcionalmente preparadas justo antes de utilizarse para preparaciones liofilizadas o concentradas. Las suspensiones en aceite contienen como componentes aceitoso los aceites vegetales, sintéticos o semisintéticos acostumbrados para propósitos de inyección. Las composiciones farmacéuticas se pueden esterilizar y contener auxiliares, por ejemplo para conservar, estabilizar, humectar, emulsionar o solubilizar los ingredientes, sales para la regulación de la presión osmótica, reguladores de pH y/o compuestos que regulen la viscosidad, por ejemplo carboxicelulosa sódica, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, dextrano, polivinilpirrolidona o gelatina. Las composiciones farmacéuticas de la invención contienen de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 50% de ingredientes activos. Puede estar en una forma de dosis unitaria, como ampolletas o frascos listos para usar, o también en forma sólida liofilizada. En general, las dosis profilácticamente y terapéuticamente efectiva para los mamíferos se encuentran entre aproximadamente .5 y 250 de un anticuerpo recombinante anticuerpo de la invención por kilogramo de peso corporal dependiendo de tipo de anticuerpo, el estado del paciente y el modo de aplicación. Se seleccionará el modo específico de administración y la dosis apropiada por el médico asistente, tomando en cuenta las particularidades del paciente, el estado de la enfermedad, el tipo de tumor tratado y similares. Se preparan las composiciones farmacéuticas de la invención mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante procedimientos de mezclado, disolución, confección o liofilización convencionales. Las composiciones farmacéuticas para inyección se procesan, se llenan en ampolletas o frascos, y se sellan bajo condiciones asépticas de conformidad con métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades las composiciones y/o métodos relacionados con cockteles de anticuerpo en los cuales se combinan uno o más anticuerpos. En modalidades preferidas, los cocteles contienen dos o más anticuerpos de la presente invención.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Células Se obtuvieron las células de humanos para hibridación a partir de la sangre periférica de 5 donantes entre 7 y 21 días después de la tercer dosis de una vacuna primaria para la rabia y de 5 donantes inmunes a la rabia de a 10 a 21 días posteriores a la administración de la vacuna potenciado durante pedido en todos los casos la vacuna empleada fue la vacuna con células diploides humana Rabivac (cepa de virus Pitman Moore 1503-3M, Behringwerke, Marburg, FRG). Todo los donantes mostraron ser negativos en las pruebas de VIH y hepatitis B. Se obtuvieron de ATCC (Rockville, MD) las células de heteromieloma híbrido de ratón-humano SHM-D33 empleadas como pares de fusión de híbrido (Teng, N.N. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 80, 7308, 1983) y leucocitos de tití transformados con virus de Epstein-Barr (EBV) B95-8, que se emplearon como una fuente de EBV (Henderson et al., J. Exp. Med. Vol. 76, p.152, 1977).
Virus de la rabia Para evaluar la capacidad de las preparaciones de anticuerpos para neutralizar una variedad de cepas de virus de la rabia se emplearon una serie de cepas de laboratorio fijas antigénicamente distintas, así como dos virus de rabia de calle representativos. Se obtuvieron cepas fijas Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA), con estándar de virus experimental, ya fuera adaptados a cerebro de ratón (CVS-24) o adaptados a cultivo de células (CVS-1 ) y Pitman-Moore (PM) de la colección de virus de la Thomas Jefferson University. Se obtuvieron virus de rabia de murciélago de pelo plateado (SHBRV), que está relacionado con la mayor parte de los casos de rabia reciente en los Estados Unidos de Norteamérica, y el virus de la rabia del coyote callejero (COSRV), que es un miembro de los virus de rabia de cánidos, según lo descrito ( orimoto et al., Proc. Nati Acad. Sci. E.U.A. Vol. 93 p. 5653, 1996). Se ha descrito en otros documentos la purificación de virus y preparación de glicoproteína (G) y nucleoproteína (N) (Dietzschold et ai., World Health Organization, Geneva, p.175, 1996).
Transformación con EBV de PBLs humanos Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) a partir de sangre entera mediante centrifugado de densidad en un Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), como se describe en otros documentos (Plebanski et al., Immunology Vol. 75, p. 86, 1992). Posteriormente se disminuyeron las células T mediante selección negativa utilizando esferas magnéticas recubiertas con anticuerpo anti-CD2 monoclonal (Dynal Inc., Lake Success NY) y un concentrador de partículas magnético (Dynal). Se recolectaron e inmortalizaron células CD-2 negativas, principalmente células B, según se ha descrito previamente (Swaminathan, 1992). En resumen, se lisaron células B95-8, cultivas para confluencia en RPMIi64o (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island NY) y adicionadas con suero bovino fetal al 10% (FBS; Gibco), mediante congelamiento-descongelamiento en hielo seco para liberar el EBV intracelular. Se aclaró el supernatante que contenía EBV al hacerlo girar a 1000 RPM durante 10 minutos y mediante filtración a través de un filtro de 0.45 µ??. Se concentró el virus mediante centrifugado a 8000 RPM durante dos horas a 4°C. Se incubaron 7 X 106 de células B (suspendidas en ml de medio de cultivo B95-8) durante 2 horas a 37°C con virus preparados a partir de 25 mis de células B95-8. Después de la infección, se lavaron dos veces con medio de cultivo, se colocaron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pozos (Nunc, Fisher Scientific, Pittsburg, PA) en una concentración de 1 X 104 células/pozo y se cultivaron a 37°C en una atmósfera humedecida de 5% C02 y 95% de aire.
Establecimiento de heterohíbridos de ratón/humano Después de que se cultivaron las líneas de células transformadas con EBV durante aproximadamente 4 semanas, se cultivó el supernatante y se probó para buscar la presencia de anticuerpo específico para virus de rabia en ELISA. Primero se transfirieron los pozos positivos a cultivos de 1 ml y luego de 2ml (placas con 48 y 24 pozos, Nunc) y posteriormente se ensayó el supernatante en la prueba rápida de inhibicación de focal de fluorescencia (RFFIT) para el anticuerpo neutralizante del virus de la rabia, como se detalla en otros documentos (Hooper, ASM Press, WA p. 755, 1997). Se hibridaron líneas de células que producían anticuerpos neutralizantes con células SHM-D33 (número de accesos ATCC CRL1668) como sigue. Se añadieron números ¡guales de células SHM-D33 y transformadas con EBV (aproximadamente 5 x 106 cada una) en un tubo de fondo redondo de poliestireno estéril (Falcon, Fisher Scientific) y se centrifugó a 1000 RPM durante 10 minutos. Las células se lavaron dos veces con medio libre de suero y la pella de células se volvió a suspender en 00 µ? de medio. Se calentaron los tubos en un baño de agua a 37°C durante un minuto y posteriormente se añadió 0.5 mi de polietilenglicol tibio (37°C) al 50% (peso/vol) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO. Cat. # P-7181 ), gota a gota durante un periodo de 45 minutos mientras se agitaba suavemente el tubo. Posteriormente se detuvo la reacción de fusión mediante la lenta adición de 3 mi de medio libre de suero en 30 segundos, seguido por la adición de 9 mi en 30 segundos. Se permitió a los tubos permanecer a temperatura ambiente durante 8 minutos y posteriormente se incubaron durante 2 minutos en un baño de agua a 37°C. Posteriormente las células se centrifugaron a 500 g durante 3 minutos y la sedimentación de células se resuspendió en 30 mi de medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM; Gibco) que contenía 10% FBS, así como 0.04 µ? de aminopterina (Gibco) y 10 µ? de ouabaina (Sigma) para seleccionar contra las células que no habían sido hibridadas. La suspensiones de células se colocaron en placas de microtitulación con fondo plano con 96 pozos en una concentración de 1 x 104 células por pozo y se incubaron como se describió anteriormente para las líneas. Cuando se establecieron las colonias de células heterohíbridas (aproximadamente 6 semanas de cultivo) se probaron los supernatantes para buscar la producción de anticuerpos específicos para el virus de la rabia en ELISA y RFFIT. Se clonaron un mínimo de tres veces las células productoras de anticuerpo al limitar la dilución en placas de microtitulación. Se titularon las células en placas con fondo redondeado de 96 pozos en diluciones dobles que empezaron a partir de 4 células por pozo. Se expandieron las células de pozos que contenían un promedio 0.25 células o menos para recolectar el supernatante y su análisis posterior.
Análisis de anticuerpo específico para virus de rabia en ELISA Se evaluó la especificidad e isotipo de anticuerpos en ELISA de fase sólida. Se recubrieron placas (PolySorb™, Nunc) a temperatura ambiente en una cámara humidificada de la noche a la mañana con 5*g/ml de virus de rabia ERA, glicoproteína, o nucleoproteína diluida en solución salina reguladora de fosfato (PBS). Posteriormente las placas se bloquearon con 5% de leche en polvo en PBS y se lavaron en PBS que contenía 0.05% Tween2o (PBS-Tween) previo a la adición de muestras de supernantante. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 2 horas, las placas se lavaron con PBS-Tween para eliminar anticuerpo primario no ligado y se añadieron varios anticuerpos secundarios bíotimilados conjugados con enzima específicos para los diversos isotipos humanos de cadena pesada durante 1 hora a temperatura ambiente. Se detectó el anticuerpo secundario ya fuera mediante la producción de un producto final soluble en el medio al añadir el substrato apropiado (3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) en solución reguladora de fosfato-citrato fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) en 0.1 M de solución reguladora de glicina, Sigma) o posterior a la adición de avidina-fosfatasa alcalina (30 min. a temperatura ambiente) y substrato PNPP. Se detuvo la reacción Peroxidasa-TMB al añadir 2M H2S04. Se registraron los valores de absorbancia en un espectrofotómetro de microplacas (Biotek, Winooski VT) a 450 nm para el producto TMB y 405 nm para la reacción PNPP.
RFFIT Se ensayaron muestras de supernatantes para cada línea de células transformada para buscar la presencia de anticuerpos neutraiizadores de virus de la rabia utilizando una variación de la prueba rápida de inhibicación de focal de fluorescencia (RFFIT) como se había descrito previamente (Hooper, ASM Press, WA p. 1997). Se diluyeron muestras de supernatante (50 µ?) en placas de fondo plano de 96 pozos (Nune). Se añadió la dilución de virus de la rabia que se sabía ocasionaba una infección de 80-90% de las células indicadoras a cada muestra de prueba y las placas se incubaron a 37°C durante 1 hora. Se incluyeron en cada ensayo muestras de control con suero inmune de medio negativo y de rabia positivo. Después de la incubación, se añadieron 30 µ? de una concentración de 1.8 x 106 células/ml de riñon de hámster bebe (BHK) a cada pozo y los cultivos se incubaron de la noche a la mañana (37°C). Posteriormente se lavaron las placas una vez con PBS enfriado con hielo y se fijaron con acetona al 90% enfriado con hielo durante 20 minutos a -20°C. Después de fijarse, se removió la acetona y las placas se secaron con aire. Para detectar células BHK infectadas, se añadieron 40 µ? de globulina monoclonal con núcleo proteína antirabia FITC (Centocor, Malvern PA) a cada pozo durante 45 min a 37°C. Posteriormente se lavaron las placas 3 veces con agua destilada y se analizaron bajo microscopio fluorescente.
Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad Se purificó anticuerpo lgG1 utilizando una columna de proteína A (rProtein A Sepharose™ Fast FIow, Amersham Pharmacia Biotech). En resumen, los supernatantes se aclararon mediante filtración a través de una membrana de 0.45 µ?? y se ajustó el pH a 8.0 con N NaOH. Se corrió el supernatante por la columna con una velocidad de flujo lineal de aproximadamente 100 cm/hora. Después de lavar en PBS (pH 8), se eluyó el anticuerpo de la columna utilizando 0.1 M de una solución de ácido cítrico y después se dializó contra PBS. Se purificó el anticuerpo lgG3 utilizando una columna de proteína G (Protein G Sepharose™ Fast FIow, Amersham Pharmacia Biotech). Se aclaró el supernatante con contenido de lgG3 mediante filtración a través de una membrana de 0.45 µ?? y se ajustó el pH a 7.0 con IN NaOH. Se corrió el supernatante por la columna con una velocidad de flujo lineal de aproximadamente 11cm/hora. Después de lavar con PBS, se eluyó el anticuerpo de la columna empleando 0.1 de solución reguladora de glicina, pH 3.0, y posteriormente se dializó contra PBS. Se purificó el anticuerpo Ig utilizando proteína de unión mannano y una modificación de una técnica descrita anteriormente (Nevens et a!., J Chromatogr, Vol. 597, p. 247, 1992). En resumen, el supernatante que contenía IgM se trató con EDTA, y se fijó su pH en 8.0 con M NaOH, se filtró y se enfrió a 4°C. Se lavó la proteína de unión mannano-agarosa (Sigma) en una columna a 4°C con una solución reguladora que consistía de 0.1 M Na**CO3/0.5M NaC1 , pH 8.3 y posteriormente se añadió supernatante y se incubó en la columna durante 15 min. a 4°C. Posteriormente se lavó la columna con un volumen considerable de solución reguladora de unión y se dejó alcanzar una temperatura ambiente durante una hora. Se eluyó el IgM de la columna con una solución reguladora de unión a temperatura ambiente y se dializó contra PBS. Se determinaron las concentraciones de proteína de las preparaciones de anticuerpos realizados utilizando un ensayo de detección de proteínas (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA) como sigue. Se añadieron 100µ? de muestra a 5 mi de 1/5 de dilución de concentrado de agente reactivo decolorante y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se incluyeron en cada ensayo estándares de control PBS negativo y diversos estándares de proteína de albúmina de suero bovino (BSA). Después de la incubación, se leyó en un espectrofotómetro las muestras a 595 nm. Se calcularon las concentraciones de proteína de las muestras de prueba con referencia a la absorbancia de los estándares BSA. Se evaluó la pureza de todas las preparaciones de anticuerpos mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 12.5% bajo condiciones reductoras (SDS-PAGE). Los anticuerpos purificados mostraron dos bandas principales sobre SDS-PAGE que corresponden a las cadenas de inmunoglobina aisladas pesadas y ligeras.
Generación, aislamiento y generación de secuencias de clones ADNc Se aisló ARN total de la célula de hibridoma JA al utilizar RNAzol B (Biotecx Laboratories, Houston). Se llevaron a cabo las reacciones de transcriptasa inversa a 42°C durante 1 hora con transcriptasa inversa con virus de mieloblastosis aviaria (Promega) y cebador oligo(dT). Una porción del producto de transcriptasa inversa fue sujeta a una amplificación de la reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos de cadena pesada: cebador gG-HF1 (5'-ACCATGGAGTTTGGGCTGAG-3' (SEQ. ID.NO:5), codón de inicio; parte subrayada, número de acceso Y14737), y cebador lgG-HR2 (5'-ACTCATTTACCCGGGGACAG-3' (SEQ. ID. NO: 6), codón de inicio, parte subrayada, número de acceso # y 14737) o cebadores específicos de cadena ligera: cebador lgG-LF5 (5'-AGCATGGAAGCCCCCAGCTCA-3' (SEQ. ID. NO: 7), codón de inicio; parte subrayada, número de acceso M63468), y cebador lgG-LR2 (5'-CTCTAACACTCTCCCCTGTTG-3' (SEQ. ID. NO: 8), codón de inicio, parte subrayada número de acceso M63438). Se llevó a cabo la amplificación para 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 60 segundos, templando a 50°C durante 60 segundos y polimerización a 72°C durante 90 segundos con polimerasa Taq DNA (Promega). Se purificaron los productos PCR (1.4 kb para cadena pesada, .7 kb para cadena ligera) y se generó la secuencia utilizando el kit de generación secuencia en ciclo AmpliTaq (Perkin-Elmer) con los cebadores específicos. Los productos PCR se clonaron en un vector de 6 clonación TA, pCR2.1 (Invitrogen). Se generó la secuencia de la cadena pesada clonada y del ADNc de la cadena ligera utilizando el kit de generación de secuencia en ciclo AmpliTaq (Perkin-Elmer) con ios cebadores específicos.
Secuencia de codificación de anticuerpo neutralizador de virus de la rabia monoclonal El ADN de anticuerpo monoclonal y las secuencias complementarias al mismo son ácidos nucleicos de anticuerpo monoclonales provistos mediante la presente invención. En una modalidad específica de la presente, se provee una secuencia de ADNc de anticuerpo monoclonal para la cadena pesada (SEQ. ID. NO:1 ) y la cadena ligera (SEQ.ID. NO:2) del anticuerpo monoclonal de JA de clon, estando desprovisto así de cualesquiera intrones. La invención también provee oligonucleótidos de cadena individual para utilizarse como cebadores en PCR que amplifican un fragmento con contenido se secuencia de anticuerpo monoclonal, por ejemplo la región variable o hipervariable del anticuerpo monoclonal. El oligonucleótido que tiene la secuencia de una porción hibridable, por lo menos 8 nucleótidos, de un gen de un anticuerpo monoclonal y otro oligonucleótido que tenga el complemento inverso de una secuencia hacia el extremo 3' en la misma cadena del gen del anticuerpo monoclonal, para que cada oligonucleótido sede la síntesis en una dirección hacia la otra. Los oligonucleótidos preferiblemente están en la escala de 10-35 nucleótidos en longitud.
La presente invención provee las secuencias de ADN de longitud total para las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo monoclonal del clon de heterohíbrido JA (SEQ. ID NO: 1 y SEQ. ID NO: 2, respectivamente) y los polipéptidos codificados de los aminoácidos #1-474 para la cadena pesada (SEQ ID NO: 4) y los aminoácidos #1-234 para la cadena ligera (SEQ. ID NO: 4)· En una modalidad específica que se describe en la presente, la invención se relaciona con la secuencia de ácido nucleico del anticuerpo monoclonal a partir del clon de heterohibridoma JA. En un aspecto preferido, pero no restrictivo de la invención, el clon de heterohibridomas JA es la fuente del anticuerpo monoclonal ADN.
Equivalentes funcionales de anticuerpos neutralizadores del virus de la rabia monoclonales La invención también incluye equivalentes funcionales de los anticuerpos descritos en esta especificación. Los equivalentes funcionales tienen características de unión comparables con los de los anticuerpos e incluyen, por ejemplo, anticuerpos de cadena quimerizada e individual, así como fragmentos de los mismos. Se describen métodos para producir dichos equivalentes funcionales en la solicitud de la PCT WO 93/21319, la solicitud de patente europea No. 239,400; la solicitud de PCT WO 89/09622; la solicitud de patente europea 33,745; y la solicitud de patente europea EP 332,424.
Equivalentes funcionales incluyen polipéptidos con secuencias de aminoácido sustancialmente iguales a la secuencia de aminoácido de la variable de las regiones hipervariables de los anticuerpos de la presente invención. La secuencia de aminoácidos "sustancialmente igual" se define en la presente como una secuencia con por lo menos 70%, preferiblemente por lo menos alrededor de 80% y preferentemente por lo menos alrededor de 90% de homología a otra secuencia de aminoácido, según lo determina el método de búsqueda FASTA de conformidad con Pearson y Lipman, Proc. Nati. ¡nst. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448, 1988. Los anticuerpos quimerizados tienen regiones constantes derivadas sustancialmente o exclusivamente de regiones constantes de anticuerpos humanos y regiones variables derivadas sustancial o exclusivamente de la secuencia de la región variable de un anticuerpo monoclonal para cada heterohibridoma estable (Champion, J.M., et a!., Journal of Immunological Methods, 235 81-90, 2000). Los anticuerpos de cadena individual o fragmentos Fv son polipéptidos que consisten de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo ligado a la región variable de la cadena ligera, con o sin un' ligador de interconexión. Así, el Fv comprende el sitio de combinación de anticuerpo total. Equivalentes funcionales además incluyen fragmentos de anticuerpos que tienen las mismas, o sustancialmente las mismas, características de unión a los de todo el anticuerpo. Dichos fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab del fragmento F(ab').sub.2.
Preferiblemente los fragmentos de anticuerpo contienen todo el complemento S* de la región determinante de todo el anticuerpo, aunque los fragmentos que contienen menos de total de tales regiones, como 3, 4 ó 5 regiones determinantes de complemento, también son funcionales. Los equivalentes funcionales son miembros de la ciase de inmunoglobulina IgG y subclases de la misma, pero pueden ser o pueden combinar cualquiera de las siguientes clases de inmunoglobullna: IgM, IgA, IgD, o IgE, y subclases de la misma. Las cadenas pesadas de diversas subclases, como la subclase IgG son responsables de diferentes funciones de efectores y así, al elegir la región constante de cadena pesada deseada, se producen los anticuerpos quiméricos con una función de efector deseada. Las regiones constantes preferidas son gamma 1 (lgG1 ), gamma 3 (lgG3) y gamma 4 (lgG4). La región constante de cadena ligera puede ser del tipo kappa o lambda. Las inmunoglobulinas de la presente invención pueden ser monovalentes, divalentes, o polivalentes. Las inmunoglobulinas monovalentes son dímeros (HL) formados de una cadena pesada quimérica asociada mediante puentes de disulfuro con una cadena ligera quimérica. Las inmunoglobulinas divalentes son tetrámeros (H2L2) formados de dos dímeros asociados mediante por lo menos un puente de disulfuro.
Técnicas estándares de ADN recombinante Se describen técnicas estándares de ADN recombinante en Sambrook et al., "Molecular Cloning", segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) y en Ausubel et al. (Eds) "Current Protocols ¡n Molecular Biology", Green Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York (1990). En resumen, se selecciona una fuente de células adecuadas que contenga moléculas de ácido nucleico que expresan el ADN deseado, como un anticuerpo o anticuerpo equivalente. Se prepara ARN total mediante procedimientos estándares a partir de una fuente adecuada. El ARN total se utiliza para dirigir la síntesis de ADN. Se proveen métodos estándares para aislar ARN y sintetizar ADN en manuales estándares de biología molecular como por ejemplo los que se describen anteriormente. El ADN se puede amplificar mediante métodos conocidos, por ejemplo, se puede utilizar ADN como un molde para la amplificación mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR); ver Saiki et al., Science, 239, 487, 1998 o Mullís et al., patente de E.U.A. No. *83,195. Las secuencia de los cebadores de nucleótido para la amplificación PCR se derivan de la secuencia conocida a ser amplificada. Los oligonucleótidos se sintetizan mediante métodos conocidos en la técnica. Métodos adecuados incluyen aquellos descritos por Caruthers en Science 230, 281-285, 1985. Se utilizan una mezcla de oligonucleótidos del extremo 3' o hacia el extremo 5" en la amplificación PCR. Se optimizan las condiciones para cada par de cebador particular de conformidad con procedimientos estándares. Se analiza el producto PCR, por ejemplo, mediante electroforesis para ADNc que tenga el tamaño correcto, y corresponda a la secuencia entre los cebadores.
Alternativamente, se puede amplificar la región codificadora en dos o más fragmentos de traslape. Los fragmentos de traslape están diseñados para incluir un sitio de restricción que . permita el ensamble del ADNc intacto de los fragmentos. Para aislar las regiones de codificación de proteína completas para las cadenas pesadas y ligeras de cada anticuerpo monoclonal a partir de cada línea de células de heterohibridoma, por ejemplo, el cebador de oligonucleótido de PCR hacia el extremo 5' complementa la secuencia en el extremo 5', abarcando el codón de inicio ATG y por lo menos 5-10 nucleótidos hacia el extremo 5' del codón de inicio. El cebador de oligonucleótidos de PCR hacia el extremo 3' es complementario a la secuencia e n el extremo 3' de las secuencia ADN deseada. El ADN deseado codifica la porción completa de las cadenas pesadas y ligeras de cada anticuerpo monoclonal, incluyendo el codón de paro. El ADNc a ser amplificado, como el que codifica los anticuerpos o equivalentes de anticuerpos, se puede replicar en una gran variedad de vectores de clonación en una amplia variedad de células hospedero, La célula hospedero puede ser procariótica o eucariótica. El vector en el cual el ADNc del anticuerpo monoclonal se empalma puede comprender segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas. Algunos vectores de clonación procarióticos adecuados incluyen, pero no están restringidos a, plásmidos de E. coli, como colE1 , pCR1 , pBR322, pMB9, pUC, pKSM, y RP4. Vectores procarióticos también incluyen, pero no están restringidos a, derivados de ADN fago como M13 y otros fagos de ADN filamentosos de cadena individua!. El vector que contiene el ADNc de anticuerpo monoclonal a ser expresado es transfectado en una célula hospedero adecuada, como se describió anteriormente. La célula hospedero se mantiene en un medio de cultivo apropiado y es sujeta a condiciones bajo las cuales se replican las células y el vector.
Anticuerpos quiméricos En general, se producen los anticuerpos quiméricos al preparar, para los componentes de cadena ligera y pesada de la inmunoglobulina quimérica, un gen fusionado que comprende un primer segmento ADN que codifica por lo menos la porción funcional de la región humana variable, preferiblemente la glicoproteína, que neutraliza específicamente el virus de la rabia humana que está ligada (por ejemplo, una región variable reacomodada funcionalmente con un segmento de unión) a un segundo segmento de ADN que codifica por lo menos una parte de la región humana constante. Cada gen fusionado se ensambla o se inserta en un vector de expresión. Las células receptoras capaces de expresar los productos del gen posteriormente son transfectadas con los genes. Las células receptoras transfectadas se cultivan bajo condiciones que permiten la expresión de los genes incorporados y se recuperan las inmunoglobulinas expresadas o cadenas de inmunoglobulina. 3 Los genes que codifican la región variable de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina se obtienen a partir de células linfoides que producen anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia monoclonales. Por ejemplo, las líneas de células de heterohibridoma que producen anticuerpo monoclonal contra la glicoproteína de la rabia proporcionan una fuente de región variable de inmunoglobulina para ios anticuerpos quiméricos presentes. Se obtienen presiones constantes a partir de células productoras de anticuerpo humano mediante técnicas de clonación estándares. De manera alternativa, ya que los genes representan las dos clases de cadenas ligeras y las clases dadas de cadenas pesadas ya han sido clonadas, las regiones constantes de origen humano están fácilmente disponibles a partir de estos clones. Se preparan fragmentos de unión de anticuerpo quiméricos como F(ab').sub.2. y fragmentos Fab al designar un gen de cadena pesada quimérica en forma truncada. Por ejemplo, un gen quimérico que codifique a una porción de cadena pesada F(ab').sub.2. podría incluir secuencias de ADN que codifiquen el dominio CHi y región de pivoteo de la cadena pesada. Alternativamente, dichos fragmentos se pueden obtener mediante el corte enzimático de una inmunoglobulina quimérica. Por ejemplo, el corte de papaína o pepsina puede generar fragmentos Fab ó F(ab').sub.2., respectivamente. Preferiblemente, los genes fusionados que codifican las cadenas quiméricas pesadas y ligeras, o porciones de las mismas, se ensamblan en dos vectores de expresión diferentes que se pueden emplear para co- transfeccionar una célula receptora. Cada vector contiene dos genes seleccionares, uno para la selección en un sistema de bacterias y uno para la selección en un sistema eucariótico, y cada vector cuenta con un par diferente de genes. Estos vectores permiten la producción y amplificación de los genes fusionados en sistemas de bacterias, y la posterior cotransfeccion de células eucarioticas y selección de las células cotransfeccionadas. Ejemplos de genes seleccionares para el sistema de bacterias incluyen, pero no se restringen a, los genes que confieren resistencia a la ampicilina y el gen que confiere resistencia al cloramfenícol. Se prefieren dos genes seleccionabas para la selección de transfectores, pero no se restringen a: (i) el gen de xantina-guanina fosforibositransferasa (gpt), y (ii) el gen de fosfotransferasa de Tn5 (designado neo). La selección con gpt se basa en la capacidad de la enzima codificada por este gen para emplear xantina como un substrato para la síntesis de nucleotido de purina; la enzima endógena análoga no puede hacer esto. En un medio que contenga xantina y ácido micofenólico, el cual bloquea la conversión de monofosfato de inusina a monofosfato de xantina, únicamente las células que expresan el gen gpt pueden sobrevivir. La producción de neo bloquea la inhibición de síntesis de proteína en células eucarioticas ocasionada por el G418 antibiótico y otros antibióticos de su clase. Se pueden emplear simultáneamente o secuencialmente los dos procedimientos de selección para seleccionar la expresión de genes de cadena de inmunoglobuüna introducidas en dos vectores ADN diferentes en una célula eucariótica.
Sistemas de expresión Debido a la degeneración inherente del código genético, otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Secuencias de ADN alteradas que pueden emplearse de conformidad con la invención incluyen deleciones, adiciones o sustituciones de diferentes residuos de nucleótidos que resultan en una secuencia que codifica al mismo producto de gen o a uno funcionalmente equivalente. El producto de gen en sí puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácido dentro de una secuencia de cadena pesada o ligera que pueden ocasionar un cambio imperceptible, produciendo así un anticuerpo monoclonai funcionalmente equivalente. De conformidad con la presente invención, se insertan secuencias de nucleótido que codifican cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo neutralizante del virus de la rabia monoclonai, un fragmento o análogo del mismo, en un vector de expresión apropiado. Este vector también contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de las secuencias de codificación de proteína insertada para generar moléculas de ADN recombinantes que dirijan la expresión de inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera para la formación del anticuerpo neutralizante del virus de la rabia monoclonai. La línea de células receptoras preferida es una célula de mieloma. Las células de mieloma pueden sintetizar, ensamblar y secretar inmunoglobulinas codificadas por genes de ¡nmunoglobulina transfectados. Adicionalmente, poseen el mecanismo para la glicosilación de la ¡nmunoglobulina. Una célula receptora particularmente preferida es una línea de células de mieloma que no produce ¡nmunoglobulina, como Sp2/0. Estas líneas de células producen únicamente la ¡nmunoglobulina codificada por los genes de ¡nmunoglobulina transfectados. Se puede hacer crecer células de mieloma en cultivo o en el peritoneo de ratones en los que se puede obtener ¡nmunoglobulina secretada a partir del fluido ascítico. Otras células linfoides como los linfocitos B o células de hibridoma pueden funcionar como células receptoras adecuadas. Existen diversos métodos para transfectar células linfoides con vectores que contengan genes codificadores de ¡nmunoglobulina. Una manera preferida de introducir ADN en células linfoides es mediante electroporación. En este procedimiento las células receptoras son sujetas a un impulso eléctrico en presencia del ADN a ser incorporado. Otra manera de introducir ADN es mediante la función de protoplasto. En este método, se utiliza lisosoma para desprender paredes celulares de bacterias que alojen el plásmido recombinante que contenga el gen de ¡nmunoglobulina. Se fusionan los esferoblastos resultantes con células de mieloma con polietilenglicol. Después de la fusión de protoplastos, se seleccionan y aislan los transfectores. Otra técnica que se puede utilizar para introducir ADN en tipos de células es precipitación con fosfato de calcio.
Los genes de ¡nmunoglobulina también se pueden expresar en células no linfoides, como por ejemplo bacterias o levadura. Cuando se expresan en bacteria, las cadenas pesadas de ¡nmunoglobulina y las cadenas ligeras se vuelven partes de los cuerpos de inclusión. Así, se deben aislar y purificar y posteriormente ensamblar las cadenas de moléculas de imunoglobulina funcionales. Otras estrategias para expresión en E. coli están disponibles (ver por ejemplo Pluckthun, A., BioTechnology 9:545-551 , 1991 ; Skerra, A. et al., BioTechnology 9:273-278,1991 ), incluyendo la secreción a partir de E.coli como proteínas de fusión que comprenden una secuencia de señal.
EJEMPLO 2 Se determinó la secuencia completa de dos anticuerpos monoclonales contra el virus de la rabia, Ab 57 y MAb JB.1. Los anticuerpos monoclonales se unen a la glicoproteína de varias cepas de virus de rabia. El tratamiento posterior a la exposición así como el tratamiento profiláctico, con un coctel de anticuerpos monoclonales, neutraliza el virus de la rabia en el sitio de entrada y previene que el virus se esparsa al sistema nervioso central (CNS). Así, para la exposición transdérmica o mucosa al virus de la rabia, se instila un coctel de anticuerpos monoclonales específicos para la rabia en el sitio de la mordedura, además de que se administra sistemáticamente. Ya que se restringe la replicación viral casi exclusivamente a las células neuronales, la neutralización y depuración del virus mediante los anticuerpos monoclonales de la presente invención previa a la entrada en el CNS es una profilaxis efectiva posterior a la exposición. Se suministra un coctel de anticuerpos monoclonales contra el virus de la rabia al paciente que ha estado expuesto, o tiene un alto riesgo de exposición, al virus de la rabia. El coctel de anticuerpos monoclonales de la presente invención inhibe de la manera efectiva la formación de cualesquiera vanantes de rabia que puedan escapar la neutralización, ya que cada anticuerpo monoclonal en el coctel de anticuerpo monoclonales tiene especificidad por un epítope que se conserva en diferentes virus de la rabia callejero. La secuencia de nucleótido de la cadena pesada MAb JB.1 antirrábica humana es SEQ ID NO:9. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de MAb JB.1 antirrábica humana es SEQ ID NO:10. La secuencia de nucleótido de la cadena ligera MAb JB.1 antirrábica humana es SEQ ID NO:1 1 . La secuencia de aminoácido de la cadena ligera MAb JB.1 antirrábica humana es SEQ ID NO:12. La secuencia de nucleótido de la cadena ligera de MAb 57 antirrábica humana es SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácido de la cadena ligera MAb 57antirrabica humana es SEQ ID NO:14. La secuencia de nucleótido de la cadena pesada MAb 57 antirrábica humana es SEQ ID NO:15. La secuencia de aminoácido de cadena pesada MAb 57 antirrábica humana es SEQ ID NO: 6.
LISTADO DE SECUENCIAS <110> Yniversidad Thomas Jefferson HOOPER, Douglas C. DIETZSCHOLD, Bern ard <120> Anticuerpos recombinantes, y composiciones y métodos para producir y utilizar los mismos <130> 8321-110PC <151> 2001-08-21 <160> 16 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 1430 <212> Adn <213> Homo sapiens <400> 1 accatggagt ttgggctgag ctggcttttt cttgtggcta ttttaaaagg tgtccagtgt SO gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 120 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 180 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtgcta gtggtcatag cacatatttg 240 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 300 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga 360 gaggttacta tgatagttgt acttaatgga ggctttgact actggggcca gggaacccgg 420 gtcaccgtct cctccgcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 480 aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600 gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660 ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720 aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 780 gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1140 ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 12S0 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccg.tg 1320 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtccccgg gtaaatgagt 1430 <210> 2 <211> 708 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 agcatggaag ccccagctca gcttctcttc ctcctgctac tctggctccc agataccacc 60 ggagaaattg tgttgacaca gtctccagcc accctgtctt tgtctccagg ggaaagagcc 120 accctcgcct gcagggccag tcagactgct agcaggtact tagcctggta ccaacagaaa 180 cctggccagg ctcccagact cctcatctat gatacatcca acagggccac tggcatccca 240 gccaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tctccatcag cagcctggag 300 cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagcgtttca actggccgtg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaatt caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708 <210> 3 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala lie Ser Ala Ser Gly His Ser Thr Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Glu Val Thr Met lie Val Val Leu Asn 115 120 125 Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190. Gly al His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 2B5 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 HÍS Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Al Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 355 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 370 375 380 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln GTy Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 4 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Al Cys Arg Ala Ser Gln Thr 35 40 45 Ala Ser Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu lie Tyr Asp Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala 55 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Phe 100 105 110 Asn Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Phe Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 1S5 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 accatggagt ttgggctgag ' 20 <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6-actcatttac ccggggacag 20 <210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 agcatggaag ccccagctca 20 <210> 8 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 ctctaacact ctcccctgtt g 21 <210> 9 <211> 1557 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 atggacacac tttgctccac gctcctgctg ctgaccatcc cttcatgggt cttgtcccaa 60 attaccttga aggagactgg tcctacgctg gtgaaaccca cacagaccct cacgctgacc 120 tgcaccttct cggggttctc actcagcact agtggagtgg gtgtgggctg gatccgtcag 180 cccccaggaa aggccctgga gtgggttaca ctcatttatt gggatgatga taagcgttac 240 agtccatctc tggagaacag ggtcaccatc aggaaggaca cctccaaaaa ccaggtggct 300 cttacaatga cgaacatgga ccctttggac acaggcacat actactgtgc gcacagacaa 360 catatcagca gcttcccgtg gttcgattcc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 420 tcagcttcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctct 480 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc ggtgacggtg 540 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacacct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 ctcaaaaccc cacttggtga cacaactcac acatgcccac ggtgcccaga gcccaaatct 780 tgtgacacac ctcccccgtg cccacggtgc ccagagccca aatcttgtga cacacctccc 840 ccgtgcccac ggtgcccaga gcccaaatct tgtgacacac ctcccccatg cccacggtgc 900 ccagcacctg aactcctggg aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggat 960 acccttatga tttcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1020 gaccccgagg tccagttcaa gtggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1080 aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1140 caccaggact ggctgaacgg taaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1200 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggacagc cccgagaacc acaggtgtac 1260 accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1320 aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcagcgggca gccggagaac 1380 aactacaaca ccacgcctcc catgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1440 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacatct tctcatgctc cgtgatgcat 1500 gaggctctgc acaaccgctt cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 1557 <210> 10 <211> 518 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Asp Thr Leu Cys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Thr lie Pro Ser Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln lie Thr Leu Lys Glu Thr Gly Pro Thr Leu Val Lys 20 25 30 Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Ser Thr Ser Gly Val Gly Val Gly Trp He Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Leu Glu Trp Val Thr Leu lie Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr 65 70 75 80 Ser Pro Ser Leu Glu Asn Arg Val Thr lie Arg Lys Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asii Gln Val Ala Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Leu Asp Thr Gly 100 105 110 Thr Tyr Tyr Cys Ala His Arg Gln His lie Ser Ser Phe Pro Trp Phe 115 120 125 Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser "Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 235 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro 245 250 255 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 260 265 270 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro 275 280 235 Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu 290 295 300 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys ASp 305 310 315 320 Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 325 330 335 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly 340 345 350 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 355 360 365 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 370 375 380 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 385 390 395 400 Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 405 410 415 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 420 425 430 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 435 440 445 Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr 450 455 460 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 465 470 475 480 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn lie Phe Ser Cys 485 490 495 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu 500 505 510 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 515 <210> 11 <211> 699 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 atggcctgga ccgttctcct cctcggcctc ctctctcact gcacagggtc tgtgacgtcc 60 tatgtgctga ctcagccacc ctcggtgtca gtggccccag gaaagacggc caggattaac 120 tgtgggggaa acaacattga atatagaagt gtgcactggt accagcagaa gtcaggccag 180 gcccctgtag cggtcatcta tgataatagt gaccggccct cagggatccc tgagcgattc 240 tctggttcca aatctgggaa cacggccacc ctgaccatca gcagggtcga agccggggat 300 gaggccgact attactgtca ggtgtgggat attagtagtg atgtggtctt cggcggaggg 360 accaagctga ccgtcctagg tcagcccaag gctgccccct cggtcactct gttcccgccc 420 tcctctgagg agcttcaagc caacaaggcc acactggtgt gtctcataag tgacttctac 480 ccgggagccg tgacagtggc ctggaaggca gatagcagcc ccgtcaaggc gggagtggag 540 accaccacac cctccaaaca aagcaacaac aagtacgcgg ccagcagcta tctgagcctg 600 acgcctgagc agtggaagtc ccacagaagc tacagctgcc aggtcacgca tgaagggagc 660 accgtggaga agacagtggc ccctacagaa tgttcatag 699 <210> 12 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Trp Thr Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ser His Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Val Thr Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Thr Ala Arg lie Asn Cys Gly Gly Asn Asn lie Glu Tyr Arg Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Ala 50 55 60 Val lie Tyr Asp Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe 65 70 75 80 ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Arg Val 85 90 95 Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp lie Ser 100 105 110 Ser Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 115 120 125 pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 130 135 140 Leu Gln Ala Asii Lys Al Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 165 170 175 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 180 185 190 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 195 200 205 Arg Ser Tyr Ser C s Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 210 215 220 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 <210> 13 <211> 726 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 atgagtgtcc ccaccatggc ctgggctctg ctcctcctca gcctcctcac tcagggcaca 60 ggatcctggg ctcagtctgc cctgactcag cctcgctcag tgtccgggtc tcctggacag 120 tcagtcaoca tctcctgcac tggaaccagc agtgatattg gtggttataa ctttgtctcc 180 tggtaccaac aacacccagg caaagccccc aaactcatga tttatgatgc cactaagcgg 240 ccctcagggg tccctgatcg cttctctggc tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc 300 atctctgggc tccaggctga ggatgaggct gattattact gctgctcata tgcaggcgac 360 tacaccccgg gcgtggtttt cggcggaggg accaagctga ccgtcctagg tcagcccaag 420 gctgccccct cggtcactct gttcccgccc tcctctgagg agcttcaagc caacaaggcc 480 acactggtgt gtctcataag tgacttctac ccgggagccg tgacagtggc ctggaaggca 540 atagcagccc cgtcaaggcg ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca 600 gtacgcggcc agcagctacc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcac 660 agctgccagg tcacgcatga agggagcacc gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt .720 tcatag 726 <210> 14 <211> 242 <212> P T <213> Homo sapiens <400> 14 Met Ser Val Pro Thr Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Thr Gln Gly Thr Gly Ser Trp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg 20 25 30 Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr lie Ser Cys Thr Gly 35 40 45 Thr Ser Ser Asp lie Gly Gly Tyr Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu et lie Tyr Asp Ala Thr Lys Arg 65 70 75 80 Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr 85 90 95 Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 100 105 110 Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr Pro Gly Val Val Phe Gly 115 120 125 Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser 130 135 140 Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala 145 150 155 160 Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val 165 170 175 Ala Trp Lys Ala Asp. Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr 180 185 190 Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu 195 200 205 Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln 210 215 220 Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala pro Thr Glu 225 230 235 240 Cys Ser <210> 15 211> 1431 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 15 atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggotgaggtg aagaagcctg ggtcc cggt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggaggcac cttcaacagg tatactgtca actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggaggcatc atccctatct ttggtacagc aaactacgca 240 cagaggttcc agggcagact caccattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgatgacacg gccgtgtatt tctgtgcgag agagaatctc 360 gataattcgg ggacttatta ttatttctca ggctggttcg acccctgggg ccagggaacc 420 ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 480 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 540 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 600 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 660 agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 720 gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccaoc gtgcccagca' 80 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 840 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 900 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 960 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1020 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1080 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1140 cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1200 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1260 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 1320 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1380 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtccc cgggtaaatg a 1431 <210> 16 <211> 476 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe' Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 pro Gly Ser Ser val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45 Asn Arg Tyr Thr Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Arg Phe Gln Gly Arg Leu Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Phe Ser Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 130 135 140 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 145 150 155 160 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 165 170 175 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 180 185 190 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 195 200 205 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 210 215 220 Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 225 230 235 240 Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 245 250 255 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 260 265 270 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 275 280 285 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 290 295 300 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu al His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 305 310 315 320 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 325 330 335 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 340 345 350 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 355 360 365 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 370 375 380 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 385 390 395 400 Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 405 410 415

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1. - Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:10, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:16. 2. - La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque también comprende uno o más secuencias de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 , SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:15. 3. - Un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2. 4. - Una célula hospedero que comprende un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 3. 5. - Un método para producir un anticuerpo recombinante aislado que comprende cultivar una célula hospedero de conformidad con la reivindicación 4 y aislar los anticuerpos recombinantes expresados en la misma. 6 - Un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. 7. - Una célula hospedero que comprende un vector de conformidad con la reivindicación 6. 8. - Un método para producir un anticuerpo recombinante aislado que comprende cultivar una célula hospedero de conformidad con la reivindicación 7 y aislar los anticuerpos recombinantes expresados en la misma. 9. - Un anticuerpo recombinante que comprende una región constante de MAb57 ligada a una región variable diferente a MAb57. 10. - Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo recombinante de conformidad con la reivindicación 9. 11. - Un vector de expulsión que comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 0. 12. - Una célula hospedero que comprende un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 11 . 13. -Un método para producir un anticuerpo recombinante aislado que comprende cultivar una célula hospedero de conformidad con la reivindicación 12 y aislar los anticuerpos recombinantes expresados en la misma. 14. - El uso de un anticuerpo recombinante de conformidad con la reivindicación 9 para preparar un medicamento para tratar a un individuo expuesto a un virus de la rabia. 15. -Un anticuerpo recombinante que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia SEQ ID NO:10 y una cadena ligera que tiene una secuencia SEQ ID NO:12. 16. -EI uso de un anticuerpo recombinante de conformidad con la reivindicación 15 para la preparación de un medicamento para tratar a un individuo expuesto a un virus de la rabia. 17. - Un anticuerpo recombinante que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia SEQ ID NO:16 y una cadena ligera que tiene la secuencia SEQ ID ??. 4. 8. - El uso de un anticuerpo recombinante de conformidad con ia reivindicación 17 para la preparación de un medicamento para tratar un individuo expuesto a un virus de la rabia.
MXPA04001609A 2001-08-21 2002-08-21 Anticuerpos recombinantes, y composiciones y metodos para elaborar y utilizar los mismos. MXPA04001609A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31402301P 2001-08-21 2001-08-21
PCT/US2002/026584 WO2003016501A2 (en) 2001-08-21 2002-08-21 Recombinant antibodies, and compositions and methods for making and using the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA04001609A true MXPA04001609A (es) 2005-03-07

Family

ID=23218208

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA04001609A MXPA04001609A (es) 2001-08-21 2002-08-21 Anticuerpos recombinantes, y composiciones y metodos para elaborar y utilizar los mismos.

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP1530579B1 (es)
CN (1) CN1636019B (es)
AT (1) ATE557040T1 (es)
AU (1) AU2002332600B2 (es)
CA (1) CA2457362C (es)
HK (1) HK1071898A1 (es)
MX (1) MXPA04001609A (es)
NZ (1) NZ531291A (es)
RU (1) RU2292353C2 (es)
WO (1) WO2003016501A2 (es)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040013672A1 (en) * 2000-05-16 2004-01-22 Thomas Jefferson University Recombinant antibodies, and compositions and methods for making and using the same
CN101537180B (zh) 2002-07-18 2016-02-10 莫鲁斯有限公司 抗体混合物的重组生产
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
ES2408582T3 (es) * 2003-05-30 2013-06-21 Merus B.V. Biblioteca de Fab para la preparación de una mezcla de anticuerpos
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
WO2005000225A2 (en) * 2003-06-02 2005-01-06 University Of Oxford Production of rabies antibodies in plants
DK1737971T3 (da) 2004-01-20 2017-11-13 Merus Nv Blandinger af bindingsproteiner
RS53269B (en) * 2004-05-27 2014-08-29 Crucell Holland B.V. BINDING MOLECULES WHICH MAY NEUTRALIZE FRAGILE VIRUS AND USE
EP1941043B1 (en) * 2005-10-21 2011-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the recombinant expression of a polypeptide
CN101100663B (zh) * 2006-07-05 2011-08-24 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 重组人抗狂犬病毒单克隆抗体的制备方法
KR101522036B1 (ko) 2006-12-05 2015-05-20 크루셀 홀란드 비.브이. 액체 항-광견병 항체 조성물
CN101337990B (zh) * 2008-06-25 2011-04-06 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 人源抗狂犬病毒中和性抗体及其制备方法与用途
CN101696242B (zh) * 2009-10-26 2011-12-28 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 人源抗狂犬病毒中和抗体Fab及其制备方法和应用
PT2838918T (pt) 2012-04-20 2019-08-23 Merus Nv Métodos e meios para a produção de moléculas heterrodiméricas do tipo ig
RU2682677C2 (ru) * 2017-09-07 2019-03-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН "ЕНИИВИ" Роспотребнадзора) Способ постэкспозиционной профилактики клещевого энцефалита

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1282703B1 (en) * 2000-05-16 2008-10-15 Thomas Jefferson University Rabies virus-specific neutralizing human monoclonal antibodies and nucleic acids and related methods

Also Published As

Publication number Publication date
EP1530579A2 (en) 2005-05-18
AU2002332600B2 (en) 2007-03-22
CA2457362C (en) 2012-01-17
ATE557040T1 (de) 2012-05-15
EP1530579B1 (en) 2012-05-09
RU2292353C2 (ru) 2007-01-27
CN1636019B (zh) 2010-06-16
EP1530579A4 (en) 2006-02-08
WO2003016501A3 (en) 2005-03-24
WO2003016501A2 (en) 2003-02-27
NZ531291A (en) 2006-02-24
CA2457362A1 (en) 2003-02-27
RU2004108115A (ru) 2005-09-27
CN1636019A (zh) 2005-07-06
HK1071898A1 (en) 2005-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2457362C (en) Human monoclonal rabies virus neutralizing antibodies, and methods for making and using the same
KR101413785B1 (ko) Ｄｉｃｋｋｏｐｆ-1 및/또는 -4의 항체에 대한 조성물 및 사용 방법
CA2721713C (en) Anti-il-17a/il-17f cross-reactive antibodies and methods of use thereof
TW202216757A (zh) 中和性抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗體及其使用方法
KR20120088551A (ko) 보체 단백질 ｃ３ｂ를 표적화하는 항체를 위한 조성물 및 방법
CN107406508A (zh) 人源化的抗trop‑2单克隆抗体及其应用
CA2419148C (en) Rabies virus-specific neutralizing human monoclonal antibodies and nucleic acids and related methods
WO2023011147A1 (zh) 人源化高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体及应用
CN108135999B (zh) 针对狂犬病的人抗体及其用途
RU2764740C1 (ru) Биспецифическое антитело против вируса бешенства и его применение
JP6055763B2 (ja) ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｇＢタンパク質に対する高親和性ヒト抗体
US10689434B2 (en) Antibody against hepatitis B surface antigen and use thereof
KR20210041586A (ko) 항-cxcr2 항체 및 이의 용도
KR101729458B1 (ko) 핵산
AU2002332600A1 (en) Recombinant antibodies, and compositions and methods for making and using the same
CA2550155C (en) Hla-dr-specific antibodies, compositions and methods
US20030157112A1 (en) Recombinant antibodies, and compositions and methods for making and using the same
CN113956352B (zh) 新型冠状病毒中和性抗体及其制备方法与用途
US20040013672A1 (en) Recombinant antibodies, and compositions and methods for making and using the same
RU2807067C2 (ru) Антитела против CXCR2 и их применение
KR20200139631A (ko) 퇴행성관절염 예방 또는 치료용 항-oscar 항체
TW202216765A (zh) 抗-pd-1抗體
CN114409774A (zh) 广谱人源化抗新型冠状病毒单克隆抗体及应用

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration