TW202216765A - 抗-pd-1抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於用於治療及診斷方法之新穎抗-PD-1 (計劃性細胞死亡1)抗體及其抗原結合片段，及使用其之組合物。
Description
本發明大體上係關於用於治療及診斷用途之抗-PD-1 (計劃性細胞死亡1)抗體。更特定言之，揭示用於治療藉由表現PD-1之細胞表徵之各種疾病或病症的抗-PD-1抗體及使用方法。亦揭示包含抗-PD-1抗體之醫藥組合物及套組。
計劃性細胞死亡1，又稱為PD-1及CD279 (分化簇279)為主要表現於T細胞以及其他免疫細胞上的細胞表面受體蛋白質。PD-1路徑為誘導及維持免疫耐受性之關鍵調節因子。該蛋白質充當「免疫檢查點」抑制劑，亦即其用以調節免疫系統中細胞之活性以便調節且限制自體免疫疾病。PD-1具有兩種配位體PD-L1及PD-L2，其與細胞表面受體相互作用。在結合時，PD-1誘導胞內信號，其負面地調節T細胞反應。在活化T細胞之表面上，在T細胞識別外周抗原後使PD-1表現上調；隨後，PD-1與PD-L1及PD-L2之較高結合成為下游抑制性信號傳導之關鍵步驟。PD-1亦與提高的Treg細胞增殖及增強的免疫抑止功能相關。
近年來已瞭解，許多癌症可藉由修飾「免疫檢查點」抑制劑來保護自身免受免疫系統影響且因此避免偵測。PD-1抑制劑(一種阻斷PD-1之新類別藥物)活化免疫系統以攻擊腫瘤且用以治療某些類型之癌症。
相比之下，有缺陷的PD-1抑制功能亦與免疫介導性疾病之病理生理學相關，且PD-1或其配位體之表現可失調或並不完全參與某些自體免疫性適應症。因此，誘導PD-1活化及使用PD-1/PD-L1及/或PD-L2系統代表一種抑制免疫反應之替代性途徑且為各種免疫及發炎性病症提供治療。
因此，需要誘導PD-1路徑、增強抑制功能且為受PD-1/PD-L1及/或PD-L2系統控制之免疫及發炎性病症提供治療的療法。特定言之，需要調節PD-1與PD-L1或PD-L2之間的相互作用而不阻斷此相互作用之生物治療劑，諸如抗體。
本發明提供特異性結合至人類PD-1之抗體。在本發明之一個態樣中，本發明之抗體不阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用。在本發明之一個態樣中，本發明之抗體增強PD-1與PD-L1之間的相互作用。在本發明之一個態樣中，本發明之抗體活化PD-1信號傳導路徑。在一個實施例中，本發明抗體為抗-PD-1促效劑抗體。舉例而言，本發明之抗體適用於治療及/或預防可藉由調節PD-1與PD-L1之間的相互作用，特定言之藉由活化PD-1路徑而緩解的疾病或病症。
在一個態樣中，本發明提供一種具有下文所描述之特性中之一或多者的抗-PD-1抗體，尤其單株抗-PD-1抗體，例如人類化單株抗-PD-1抗體。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體以高親和力，例如20 nM或更低、例如10 nM或更低、例如5 nM或更低結合至純化重組人類PD-1。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體以50 nM或更低親和力結合至純化重組食蟹獼猴PD-1。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體選擇性地結合至PD-1，尤其人類PD-1。在一個態樣中，本發明之抗體不結合於小鼠、大鼠或兔PD-1。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體不阻斷PD-L1與PD-1之結合。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體增強PD-L1與PD-1之結合。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體例如藉由抑制IFNγ產生、抑制IL-17A產生或抑制IL-21產生來減弱功能性細胞分析中之T細胞活性。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體抑制小鼠模型中之人類細胞累積且減少小鼠模型中人類發炎性細胞介素之含量。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體具有有利的藥物動力學特性。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體具有有利的生物物理學特性，例如產率、品質、穩定性或溶解性。在一個態樣中，本發明提供本發明之抗體之抗原結合片段。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含：
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在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD-1抗體或抗原結合片段，其包含：
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或
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或
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包含SEQ ID NO: 165之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 166之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區，
或
包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 79之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及
包含SEQ ID NO: 165之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 167之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD-1抗體或抗原結合片段，其包含：
重鏈可變區，其包含以下中之任一者：
SEQ ID NO:73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:74之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 75之胺基酸序列(H-CDR3)，
SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 76之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)，
SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 78之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)，或
SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 79之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)；
及
輕鏈可變區，其包含以下中之任一者：
SEQ ID NO: 30之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 31之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)，
SEQ ID NO: 164之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 31之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)，
SEQ ID NO: 165之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 166之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)，
SEQ ID NO: 165之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 167之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)。
在一個實施例中，抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之CDR係根據Chemical Computing Group (CCG)編號定義。
在一個實施例中，本發明提供如上文所闡述抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人類化抗體或其抗原結合片段。
在一個實施例中，本發明提供如上文所闡述之抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：單株抗體、Fab、F(ab´)2、Fv及scFv。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含以下之胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 108及SEQ ID NO: 92；各別地SEQ ID NO: 109及SEQ ID NO: 93；各別地SEQ ID NO: 110及SEQ ID NO: 94；各別地SEQ ID NO: 111及SEQ ID NO: 95；各別地SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 96；各別地SEQ ID NO: 113及SEQ ID NO: 97；各別地SEQ ID NO: 114及SEQ ID NO: 98；各別地SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 99；各別地SEQ ID NO: 116及SEQ ID NO: 100；各別地SEQ ID NO: 117及SEQ ID NO: 101；各別地SEQ ID NO: 118及SEQ ID NO: 102；各別地SEQ ID NO: 119及SEQ ID NO: 103；各別地SEQ ID NO: 120及SEQ ID NO: 104；各別地SEQ ID NO: 121及SEQ ID NO: 105；各別地SEQ ID NO: 122及SEQ ID NO: 106；各別地SEQ ID NO: 123及SEQ ID NO: 107。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137或SEQ ID NO: 139中任一者之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127或SEQ ID NO: 129中任一者之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含各別地SEQ ID NO: 131及SEQ ID NO: 125之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含各別地SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 127之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1 抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含各別地SEQ ID NO: 135及SEQ ID NO: 127之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含各別地SEQ ID NO: 137及SEQ ID NO: 129之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含各別地SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 129之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其與各別地SEQ ID NO: 131及SEQ ID NO: 125之胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其與各別地SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 127之胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其與各別地SEQ ID NO: 135及SEQ ID NO: 127之胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其與各別地SEQ ID NO: 137及SEQ ID NO: 129之胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其與各別地SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 129之胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致。
在一個實施例中，本發明提供如上文所描述之抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含選自由以下組成之群的重鏈恆定區：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恆定區，例如人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA或IgE。
在一個實施例中，本發明提供如上文所描述之抗-PD1抗體，其中重鏈恆定區為具有Ser228Pro突變之IgG4的重鏈恆定區。
在一個實施例中，本發明提供如上文所描述之抗-PD1抗體，其中重鏈恆定區為IgG1之重鏈恆定區。
在一個實施例中，本發明提供如上文所描述之抗-PD1抗體，其中重鏈恆定區為具有Leu234Ala及Leu235Ala突變之IgG1的重鏈恆定區。
在一個實施例中，本發明提供如上文所描述之抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由κ及λ組成之群的輕鏈恆定區。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其包含各別地SEQ ID NO: 143及SEQ ID NO: 141之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其包含各別地SEQ ID NO: 147及SEQ ID NO: 145之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其包含各別地SEQ ID NO:149及SEQ ID NO: 145之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其包含各別地SEQ ID NO: 153及SEQ ID NO: 151之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其包含各別地SEQ ID NO: 155及SEQ ID NO: 151之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 143之胺基酸組成且該輕鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 141之胺基酸組成。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 147之胺基酸組成且該輕鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 145之胺基酸組成。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 149之胺基酸組成且該輕鏈胺基酸序列由SEQ ID NO: 145之胺基酸組成。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 153之胺基酸組成且該輕鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 151之胺基酸組成。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 155之胺基酸組成且該輕鏈之胺基酸序列由SEQ ID NO: 151之胺基酸組成。
在一個實施例中，如上文所描述之抗-PD1抗體或其抗原結合片段為單株抗體或其抗原結合片段。
在一個實施例中，如上文所描述之抗-PD1抗體或其抗原結合片段為人類化抗體或其抗原結合片段。
在一個實施例中，如上文所描述之抗-PD1抗體或其抗原結合片段為促效劑抗-PD1抗體或其抗原結合片段。
在一個實施例中，如上文所描述之抗-PD1抗體或其抗原結合片段以高親和力，例如20 nM或更低、例如10 nM或更低、例如5 nM或更低結合至人類PD-1。
在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其與如上文所描述之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段競爭結合於PD-1。在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其與抗體A、抗體B、抗體C、抗體D或抗體E競爭結合於PD-1。
在一個實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含如上文所描述之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，及醫藥學上可接受之賦形劑。
在一個實施例中，本發明提供如上文所描述之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其用作藥劑。
在一個實施例中，本發明提供一種治療PD-1路徑病症之方法，其包含向需要其之患者投與醫藥學上有效量的如上文所描述之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供如上文所描述之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其用於治療PD-1路徑病症。在一個實施例中，本發明提供如上文所描述之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段的用途，其用於製造用於治療PD-1路徑病症之藥劑。
在一個實施例中，本發明提供一種調節人類患者中PD-1與PD-L1之間的相互作用的方法，其包含向人類患者投與足以活化人類患者之PD-1路徑之量的包含如上文所描述之抗-PD-1抗體或抗原結合片段之組合物。在一個實施例中，本發明提供如上文所描述之抗-PD-1抗體或抗原結合片段，其用於調節人類患者中PD-1與PD-L1之間的相互作用。在一個實施例中，本發明提供如上文所描述之抗-PD-1抗體或抗原結合片段之用途，其用於製造用於調節人類患者中PD-1與PD-L1之間的相互作用的藥劑。
在一個實施例中，本發明提供一種減弱人類患者之表現PD-1之T細胞活性的方法，其包含向人類患者投與足以下調人類患者之免疫反應之量的包含如上文所描述之抗-PD-1抗體或抗原結合片段的組合物。在一個實施例中，本發明提供如上文所描述之抗-PD-1抗體或抗原結合片段，其用於減弱人類患者之表現PD-1之T細胞活性。在一個實施例中，本發明提供如上文所描述之抗-PD-1抗體或抗原結合片段的用途，其用於製造用於減弱人類患者之表現PD-1之T細胞活性的藥劑。
在一個實施例中，在以上方法中，在用於以上用途之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段中或在以上抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之用途中，疾病係選自由以下組成之群：全身性硬化症(SSc)、全身性紅斑性狼瘡、多發性肌炎、巨大細胞動脈炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎及發炎性腸病。
在一個實施例中，在以上方法中，在用於以上用途之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段中或在以上抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之用途中，該抗體或其抗原結合片段係藉由非經腸途徑、靜脈內途徑或皮下投藥途徑投與。
在一個實施例中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其編碼如上文所描述之重鏈可變區及/或輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其編碼如上文所描述之重鏈及/或輕鏈。
在一個實施例中，本發明提供一種表現載體，其包含如上文所描述之聚核苷酸。
在一個實施例中，本發明提供一種宿主細胞，其包含如上文所描述之表現載體。在一實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。
在一個實施例中，本發明提供一種製造抗體之方法，其包含以下步驟：
- 在允許形成抗體之條件下培養宿主細胞，該宿主細胞包含：包含編碼如上文所描述之重鏈可變區之經分離聚核苷酸的表現載體及包含編碼如上文所描述之輕鏈可變區之聚核苷酸的表現載體，及
- 回收該抗體。
在一個實施例中，本發明提供一種製造抗體之方法，其包含以下步驟：
- 在允許形成抗體之條件下培養宿主細胞，該宿主細胞包含：包含編碼如上文所描述之重鏈之經分離聚核苷酸的表現載體及包含編碼如上文所描述之輕鏈之聚核苷酸的表現載體；及
- 回收該抗體。
在一個實施例中，上述方法進一步包含純化抗體之步驟。在一個實施例中，上述方法進一步包含將抗體調配至醫藥組合物中之步驟。
在一個實施例中，本發明提供一種多特異性抗體，其包含第一抗-PD-1促效劑抗原結合位點及第二抗原結合位點。
在一個實施例中，第二抗原結合位點為抗-CD48結合位點、抗-CD-2結合位點、抗-CD11a結合位點或抗-CD3結合位點。
在一個實施例中，第一抗-PD-1促效劑抗原結合位點包含如上文所描述之重鏈可變區及輕鏈可變區。
在一個實施例中，多特異性抗體為雙特異性抗體。
本發明解決對免疫及發炎性病症，尤其受PD-1/PD-L1及/或PD-L2系統控制之免疫及發炎性病症之治療的需求。為解決此需要，本發明提供不阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用的抗-PD-1抗體。在一個態樣中，本發明提供增強PD-1與PD-L1之間的相互作用的抗體。在本發明之一個態樣中，本發明之抗體活化PD-1信號傳導路徑。在一個態樣中，本發明之抗體為抗-PD-1促效劑抗體。PD-1促效作用藉由抑制人類疾病中自體反應性T細胞之擴增及效應功能來恢復免疫平衡，在該等人類疾病中，PD-1經表現但可能不與其配位體接合或最佳接合。在一個態樣中，本發明之抗體適用於治療免疫及發炎性病症及移植排斥反應。舉例而言，本發明之抗體適用於治療及/或預防可藉由調節PD-1與PD-L1之間的相互作用，特定言之藉由活化PD-1路徑而緩解的疾病或病症。在一個態樣中，本發明之抗體適用於治療及/或預防全身性硬化症(SSc)、全身性紅斑性狼瘡、多發性肌炎、巨大細胞動脈炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎或發炎性腸病。
在一個態樣中，本發明提供一種具有下文所描述之特性中之一或多者的抗-PD-1抗體，尤其單株抗-PD-1抗體，例如人類化單株抗-PD-1抗體。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體以高親和力，例如20 nM或更低、例如10 nM或更低、例如5 nM或更低結合至純化重組人類PD-1。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體以50 nM或更低之親和力結合至純化重組食蟹獼猴PD-1。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體選擇性地結合至PD-1，尤其人類PD-1。在一個態樣中，本發明之抗體不結合至小鼠、大鼠或兔PD-1。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體不阻斷PD-L1與PD-1之結合。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體增強PD-L1與PD-1之結合。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體例如藉由抑制IFNγ產生、抑制IL-17A產生或抑制IL-21產生來減弱如下文中所展示之若干功能性細胞分析中之T細胞活性。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體抑制小鼠模型中之人類細胞累積且減少小鼠模型中人類發炎性細胞介素之含量。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體具有有利的藥物動力學特性。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體具有有利的生物物理學特性，例如產率、質量、穩定性或溶解性。此等特性例如展示於下文實例中。
抗體或免疫球蛋白之通用結構為熟習此項技術者所熟知，此等分子係通常約150,000道爾頓之由兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈構成之雜四聚糖蛋白。各輕鏈藉由一個二硫鍵共價連接至重鏈以形成雜二聚體，且雜三聚分子經由雜二聚體之兩個相同重鏈之間的共價二硫鍵形成。儘管該等輕鏈及重鏈藉由一個二硫鍵連接在一起，但兩個重鏈之間的二硫鍵數目因免疫球蛋白同型而不同。各重鏈及輕鏈亦具有有規律地間隔之鏈內二硫橋鍵。各重鏈在胺基端具有可變域(V
H=可變重鏈)，之後為三個或四個恆定域(C
H1、C
H2、C
H3及C
H4)以及C
H1與C
H2之間的鉸鏈區。各輕鏈具有兩個域，胺基端可變域(V
L=可變輕鏈)及羧基端恆定域(C
L)。V
L域非共價締合V
H域，然而C
L域通常經由二硫鍵共價連接至C
H1域。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈及重鏈可變域之間形成界面(Chothia等人, 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663, Vargas-Madrazo E, Paz-García E. J Mol Recognit. 2003;16(3):113-120)。可變域在本文中亦稱為可變區，且恆定域稱為恆定區。
亦即，不同抗體之間極不同的可變域內之某些域為「高變的」。此等高變域含有直接參與各特定抗體與其特異性抗原決定子之結合及特異性之殘基。輕鏈可變域與重鏈可變域中之高變性集中於三個稱為互補決定區(CDR)或高變環(HVL)之區段中。CDR藉由序列比較定義，Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.，然而HVL在結構上根據可變域之三維結構定義，如Chothia及Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917所描述。在此等兩種方法產生CDR之略不同標識之情況下，結構性定義為較佳的。如Kabat所定義，在輕鏈可變域中，CDR-L1位於約殘基24-34處，CDR-L2位於約殘基50-56處，且CDR-L3位於約殘基89-97處；在重鏈可變域中，CDR-H1位於約殘基31-35處，CDR-H2位於約殘基50-65處，且CDR-H3位於約殘基95-102處。CDR之替代性定義係根據Chemical Computing Group (CCG)編號(Almagro等人, Proteins 2011; 79:3050-3066及Maier等人, Proteins 2014; 82:1599-1610)。因此，重鏈及輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3定義對既定抗體具有特異性之特有及功能特性。
重鏈及輕鏈中之每一者內之三個CDR藉由構架區(FR)分隔開，其含有趨向於較不可變之序列。自重鏈可變域及輕鏈可變域之胺基端至羧基端，FR及CDR按以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。FR之主要β片構形使各鏈內之CDR彼此緊密靠近以及緊密靠近來自另一鏈之CDR。所得構形有助於抗原結合位點(參見Kabat等人, 1991, NIH公開案第91-3242號, 第I卷, 第647-669頁)，但並非所有CDR殘基必需直接參與抗原結合。
FR殘基及Ig恆定域不直接參與抗原結合，但有助於抗原結合及/或介導抗體效應功能。認為一些FR殘基以至少三種方式對抗原結合產生顯著作用：非共價直接結合於抗原決定基、與一或多個CDR殘基相互作用及影響重鏈與輕鏈之間的界面。恆定域不直接參與抗原結合，但介導各種Ig效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)。
脊椎動物免疫球蛋白之輕鏈基於恆定域之胺基酸序列而歸屬於兩個明確不同的類別κ及λ中之一者。藉由比較，根據恆定域之序列將哺乳動物免疫球蛋白之重鏈分配至五個主要類別中之一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA進一步劃分成子類(同型)，例如分別為IgG
1、IgG
2、IgG
3、IgG
4、IgA
1及IgA
2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。該等類別之原生免疫球蛋白的子單元結構及三維構形已為所熟知的。
術語「抗體」、「抗-PD-1抗體」、「人類化抗-PD-1抗體」及「變異型人類化抗-PD-1抗體」在本文中以最廣泛意義使用，且特定涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、微小修飾(諸如N或C端截短)之抗體及抗體片段(諸如抗體之展現所需生物活性，例如PD-1結合之可變域及其他部分)。
術語「單株抗體」 (mAb)係指大體上同質的抗體群中之抗體；亦即，除可能少量存在的天然存在之突變或可能熟知的改變(諸如自抗體重鏈移除C端離胺酸)或轉譯後修飾(諸如胺基酸異構化或去醯胺化、甲硫胺酸氧化或天冬醯胺或麩醯胺酸去醯胺化)以外，群體中之個別抗體係一致的。單株抗體針對單一抗原決定子「抗原決定基」具有高度特異性。因此，修飾語「單株」指示針對相同抗原決定基之大體上同質的抗體群，且不應視為需要藉由任何特定方法來產生該抗體。應瞭解單株抗體可藉由此項技術中已知之任何技術或方法製得；包括例如融合瘤方法(Kohler等人, 1975, Nature 256:495)，或此項技術中已知之重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)，或使用Clackson等人, 1991, Nature 352: 624-628及Marks等人, 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597中所述之技術使用噬菌體抗體庫分離以重組方式產生之單株的方法。
嵌合抗體由來自一個物種(例如非人類哺乳動物，諸如小鼠)之抗體之重鏈及輕鏈可變區及另一物種(例如人類)抗體之重鏈及輕鏈恆定區組成，且可如下獲得：使編碼來自第一物種(例如小鼠)之抗體之可變區的DNA序列連接於來自第二(例如人類)物種之抗體之恆定區的DNA序列，及用含有連接序列之表現載體轉型宿主使其產生嵌合抗體。替代地，嵌合抗體亦可為重鏈及/或輕鏈之一或多個區或域與單株抗體中來自另一免疫球蛋白類別或同型或來自共同或生殖系序列之對應序列相同、同源或為其變異體之抗體。嵌合抗體可包括此類抗體之片段，其限制條件為抗體片段展現其親本抗體之所需生物活性，例如結合於同一抗原決定基(參見例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855)。
術語「抗體片段」、「抗原結合片段」、「抗-PD-1抗體片段」、「人類化抗-PD-1抗體片段」、「變異型人類化抗-PD-1抗體片段」係指全長抗-PD-1抗體之一部分，其中保持可變區或功能性能力，例如特異性PD-1抗原決定基結合。抗體片段之實例包括(但不限於) Fab、Fab'、F(ab')
2、Fd、Fv、scFv及scFv-Fc片段、雙功能抗體、線抗體、單鏈抗體、微型抗體、由抗體片段形成之雙功能抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。
抗體片段可例如藉由用酶(諸如木瓜酶或胃蛋白酶)處理全長抗體以產生適用抗體片段來獲得。使用木瓜酶消化以產生各自具有單一抗原結合位點之兩種相同的抗原結合抗體片段(稱為「Fab」片段)，及殘餘「Fc」片段。Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之C
H1域。胃蛋白酶處理產生F(ab')
2片段，其具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原。
根據本發明之抗體片段之另一實例為Fab'片段。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於在C
H1域之C端存在額外殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。F(ab')
2抗體片段係由鉸鏈區中之半胱胺酸殘基連接之Fab'片段對。亦已知抗體片段之其他化學偶聯。
「Fv」片段含有由一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域之緊密非共價締合之二聚體之組成的完整抗原識別及結合位點。在此構形中，各可變域之三個CDR相互作用以界定V
H-V
L二聚體表面上之抗原結合位點。六個CDR共同地賦予抗體以抗原結合特異性。
抗體片段亦可包括「單鏈Fv」或「scFv」片段。「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段為包含抗體之V
H域及V
L域的單鏈Fv變異體，其中該等域存在於單一多肽鏈中。單鏈Fv能夠識別且結合抗原。scFv多肽亦可視情況含有位於V
H與V
L域之間的多肽連接子以有助於藉由scFv形成抗原結合所需之三維結構(參見例如Pluckthun, 1994, The Pharmacology of monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁)。
抗體片段亦可形成包含一對串疊型Fd區段(V
H-C
H1-V
H-C
H1)以形成一對抗原結合區之串疊型Fd區段。此等「線抗體」可為雙特異性或單特異性抗體，如例如Zapata等人, 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062中所述。
在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體為人類化抗體或抗體片段。人類化抗體或人類化抗體片段為特定類型之嵌合抗體，其包括免疫球蛋白胺基酸序列變異體或其片段，能夠結合至預定抗原且包含實質上具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的一或多個FR及實質上具有非人類免疫球蛋白之胺基酸序列的一或多個CDR。通常稱為「導入」序列之此非人類胺基酸序列通常獲自「導入」抗體域，特定言之可變域。一般而言，人類化抗體至少包括插入人類重鏈可變域或輕鏈可變域之FR之間的非人類抗體之CDR或HVL。由例如Almagro等人, (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633或WO12092374 A2中描述抗體之人類化方法。
本發明描述特異性人類化抗-PD-1抗體，其含有衍生自小鼠前導723C2之插入於人類生殖系序列重鏈及輕鏈可變域之FR之間的CDR。另外，小鼠前導723C2之重鏈CDR3中的半胱胺酸經人類化抗-PD-1抗體中衍生自小鼠前導723C2之酪胺酸置換(「DC」至「DY」)。
在一個態樣中，人類化抗-PD-1抗體包含至少一個及通常兩個可變域之實質上所有(諸如例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc及Fv片段中所含者)，其中所有或實質上所有CDR與非人類免疫球蛋白之彼等CDR對應，且特定言之，在本文中，CDR係小鼠前導723C2之鼠類序列，且FR係人類免疫球蛋白共同或生殖系序列之彼等FR。在另一態樣中，人類化抗-PD-1抗體亦包括免疫球蛋白Fc區、通常人類免疫球蛋白Fc區之至少一部分。通常，抗體將含有輕鏈以及至少重鏈之可變域兩者。適當時，抗體亦可包括重鏈之C
H1、鉸鏈、C
H2、C
H3及/或C
H4區中之一或多者。
根據本發明之人類化抗-PD-1抗體可選自任何類別之免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何同型，包括IgG
1、IgG
2、IgG
3、IgG
4、IgA
1及IgA
2。舉例而言，恆定域可為補體固定恆定域，其中人類化抗體需要展現細胞毒活性且同型通常為IgG
1。在不需要此類細胞毒活性之情況下，恆定域可具有另一同型，例如IgG
2。替代性人類化抗-PD-1抗體可包含來自超過一個免疫球蛋白類別或同型之序列，且選擇特定恆定域以使所需效應功能達最佳在一般熟習此項技術者之能力內。
在一個態樣中，本發明之抗體之恆定域為IgG4Pro，其具有一個防止Fab臂交換之置換突變(Ser228Pro)。此Ser至Pro突變係在IgG4主鏈鉸鏈區中且通常稱為Ser228Pro，但其在重鏈中之位置可因幾個胺基酸而不同，例如視可變區之長度及/或IgG1與IgG4之間的鉸鏈長度差異而定。鉸鏈區中之Ser至Pro突變(Cys-Pro-Ser-Cys-Pro)在本文中稱為「Ser228Pro」，與其在重鏈中之位置無關。在另一態樣中，本發明之抗體之恆定域為IgG1KO，其在鉸鏈區中具有兩個突變Leu234Ala及Leu235Ala以減少效應功能(ADCC)。
人類化抗-PD-1抗體之FR及CDR或HVL無需與親本序列精確對應。舉例而言，導入CDR、或HVL、或共同或生殖系FR序列之一或多個殘基可藉由取代、插入或缺失而改變(例如，誘變)，使得所得胺基酸殘基不再與親本序列之對應位置中之原始殘基相同，但儘管如此抗體仍保持結合於PD-1之功能。此類改變通常並非大範圍的且將為保守性改變。通常，至少75%之人類化抗體殘基將與親本共同或生殖系FR及導入CDR序列之彼等殘基對應，更通常至少90%，且最通常大於95%、或大於98%或大於99%。
影響重鏈可變區與輕鏈可變區之間的界面(「V
L-V
H界面」)之免疫球蛋白殘基為影響兩個鏈相對於彼此之接近度或定向之殘基。可參與鏈間相互作用之某些殘基包括VL殘基34、36、38、44、46、87、89、91、96及98及V
H殘基35、37、39、45、47、91、93、95、100及103 (利用Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)中所闡述之編號系統)。美國專利第6,407,213號亦論述諸如V
L殘基43及85及V
H殘基43及60之殘基亦可參與此相互作用。儘管此等殘基僅針對於人類IgG指示，但其在物種間均適用。選擇用於取代至共同序列中之合理預期參與鏈間相互作用之重要抗體殘基。
術語「共同序列」及「共同抗體」係指在任何特定類別、同型或子單元結構之所有免疫球蛋白中之每一位置(例如人類免疫球蛋白可變域)處包含最通常出現之胺基酸殘基的胺基酸序列。共同序列可基於特定物種或許多物種之免疫球蛋白。應瞭解，「共同」序列、結構或抗體涵蓋如某些實施例中所述之共同人類序列，且係指在任何特定類別、同型或子單元結構之所有人類免疫球蛋白中之每一位置處包含最通常出現之胺基酸殘基的胺基酸序列。因此，共同序列含有在每一位置具有存在於一或多個已知免疫球蛋白中之胺基酸的胺基酸序列，但其不可精確重複任何單一免疫球蛋白之整個胺基酸序列。可變區共同序列不獲自任何天然產生之抗體或免疫球蛋白。Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md，及其變異體。重鏈及輕鏈共同序列之FR及其變異體提供適用於製備人類化抗-PD-1抗體之序列。參見例如美國專利第6,037,454號及第6,054,297號。
人類生殖系序列天然見於人類群體中。彼等生殖系基因之組合產生抗體多樣性。抗體之輕鏈的生殖系抗體序列來自保守人類生殖系κ或λ v基因及j基因。類似地，重鏈序列來自生殖系v基因、d基因及j基因(LeFranc, M-P及LeFranc, G, 「The Immunoglobulin Facts Book」 Academic Press, 2001)。
「經分離」抗體為已自其天然環境之組分識別出且分離及/或回收之抗體。抗體之天然環境的污染物組分為可干擾抗體之診斷或治療用途之彼等物質，且可為酶、激素及其他蛋白性或非蛋白性溶質。在一個態樣中，抗體將純化至至少大於95%分離重量之抗體，例如純化至至少大於95%、96%、97%、98%或99%。
經分離抗體包括原位產生於重組細胞內之抗體，因為抗體之天然環境中的至少一種組分將不存在。然而，分離之抗體通常將藉由至少一個純化步驟製備，在該步驟中移除重組細胞物質。
如根據本發明所使用，術語「抗體效能」係指有助於抗體識別抗原之因素/特性或抗體之活體內效應。抗體之胺基酸序列的變化可影響諸如摺疊之抗體特性，且可影響物理因素，諸如抗體結合於抗原之初始速率(k
a)、抗體自抗原之解離常數(k
d)、抗體對於抗原之親和力常數(Kd)、抗體之構形、蛋白質穩定性及抗體之半衰期。
如根據本發明所使用，術語「促效劑抗體」或「促效性抗體」係指在結合至PD-1後誘導至少一種由PD-1配位體PD-L1誘導之生物活性的抗體。在一個態樣中，該誘導當與不存在促效劑抗體之情況下的誘導相比較時為統計顯著的。在一個態樣中，例如，如下文所描述之一個實例中所量測，當至少一種生物活性經誘導比不存在促效劑抗體之情況大至少約20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、、80%、85%、90%、95%或100%時，抗體為促效劑抗體。在一些實施例中，「促效劑抗體」增強PD-1與PD-L1之間的相互作用。用於偵測PD-1促效劑特性之例示性分析描述於本文中或為此項技術中所已知。
「多特異性」係指特異性結合兩種或更多種不同抗原或相同抗原內之兩種或更多種不同抗原決定基的蛋白質，諸如抗體。
「雙特異性」係指特異性結合兩中不同抗原或相同抗原內之兩種不同抗原決定基的蛋白質，諸如抗體。
在一些實施例中，本發明之特異性結合PD-1的抗體或其抗原結合片段為雙特異性抗體。在一些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段為多特異性抗體。本文中所提供之特異性結合PD-1之單特異性抗體可經工程改造成亦涵蓋於本發明之範疇內的雙特異性抗體。
全長雙特異性抗體可例如在兩個單特異性二價抗體之間使用Fab臂交換(例如，半分子交換、交換一個重鏈-輕鏈對)藉由在各半分子中之重鏈CH3界面處引入取代以有利於在無細胞環境中或使用共表現具有不同特異性的兩個抗體半分子之雜二聚體形成來產生。Fab臂交換反應為二硫鍵-鍵合之結果。
雙特異性抗體亦可使用以下設計來產生：諸如Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech)、杵-臼(Genentech)、CrossMAb (Roche)與靜電誘導之CH3相互作用(Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed)、LUZ-Y (Genentech)、鏈交換工程域體(SEEDbody) (EMD Serono)、Biclonic (Merus)及DuoBody®產品(Genmab A/S)。
舉例而言，可使用本文所描述之PD-1抗體之VH/VL域或所公佈抗-PD-1促效劑抗體之任何VH/VL區及所公佈抗-CD2、抗-CD48、抗-CD11a或抗CD3抗體之任何VH/VL區各別地產生雙特異性PD-1/CD2、雙特異性PD-1/CD48、雙特異性PD-1/CD11a或PD-1/CD3抗體。
本發明之另一實施例為包含結合PD-1之第一域及結合CD2、CD48、CD11a或CD3之第二域的雙特異性抗體。
如本文所使用，在兩個或更多個核酸或多肽序列之情況下，術語「一致」或「一致性百分比」係指在針對最大對應性比較及比對時，兩個或更多個序列或子序列相同或有指定百分比之相同的核苷酸或胺基酸殘基。為確定一致性百分比，出於最佳比較目的而比對序列(例如，可在第一胺基酸序列或核酸序列中引入間隙以與第二胺基酸或核酸序列最佳比對)。隨後比較相對應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。若第一序列中之位置被與第二序列中之相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據，則分子在該位置處一致。兩個序列之間的一致性百分比為該等序列共有的一致位置數之函數(亦即，一致性% = 一致位置數/位置(亦即重疊位置)總數× 100)。在一些實施例中，適當時，在序列內引入間隙之後，進行比較之兩個序列長度相同(例如不包括延長超過比較序列之額外序列)。舉例而言，當比較可變區序列時，不考慮前導序列及/或恆定域序列。對於兩個序列之間的序列比較，「對應」CDR係指兩個序列中相同位置之CDR (例如每一序列之CDR-H1)。
可使用數學演算法實現判定兩個序列之間的一致性百分比或相似性百分比。用於比較兩個序列之數學演算法之較佳非限制性實例為Karlin及Altschul，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268，如Karlin及Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877中經修改之算法。將此類演算法併入至Altschul等人, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410之NBLAST及XBLAST程式中。BLAST核苷酸檢索可用NBLAST程式(得分=100，字長=12)執行以獲得與編碼所關注蛋白質之核酸同源之核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可用XBLAST程式(得分=50，字長=3)執行，以獲得與所關注蛋白質同源之胺基酸序列。為獲得用於比較目的之間隙比對，可如Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402中所描述來利用間隙式BLAST。替代地，PSI-Blast可用於進行偵測分子之間之遠緣關係之迭代檢索(同上)。當利用BLAST、間隙式BLAST及PSI-Blast程式時，可使用個別程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。用於比較序列之數學演算法之另一較佳非限制性實例為Myers及Miller，CABIOS (1989)之演算法。此類演算法併入ALIGN程式(版本2.0)中，所述程式為GCG序列比對軟件包之一部分。當利用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4。用於序列分析之額外演算法在此項技術中為已知的且包括如Torellis及Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5中所描述之ADVANCE及ADAM；以及Pearson及Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-8中所描述之FASTA。在FASTA內，ktup係設定檢索之敏感性及速度的對照選項。若ktup = 2，則藉由觀察比對殘基對得到比較之兩個序列中之類似區；若ktup = 1，則檢查單一比對胺基酸。對於蛋白質序列，ktup可設定為2或1，或對於DNA序列設定為1至6。若ktup未得以指定，則對於蛋白質預設值為2，且對於DNA為6。替代地，可使用CLUSTAL W演算法進行蛋白質序列比對，如Higgins等人，1996，Methods Enzymol. 266:383-402中所描述。
核酸序列在其置放至與另一核酸序列具有功能關係時「可操作地連接」。舉例而言，若核酸前序列或分泌性前導子表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其與編碼該多肽之核酸可操作地連接；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其與該序列可操作地連接；或若核糖體結合位點經定位以便有助於轉譯，則其與編碼序列可操作地連接。一般而言，「可操作地連接」意謂經連接之DNA序列為連續的，且在分泌性前導子之情況下，其為連續的且在讀框內。然而，強化子視情況係連續的。連接可藉由在適宜限制性位點處接合來實現。若此類位點不存在，則可使用合成寡核苷酸接附子或連接子。
如本文所用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用且所有此類名稱均包括其子代。因此，「轉化體」及「轉化細胞」包括與傳遞次數無關的主要目標細胞及自其衍生之培養物，其可例如經編碼本發明之抗體或其抗原結合片段之一或多個胺基酸序列的一或多個表現載體轉染。
出於根據本發明之治療之目的，術語「哺乳動物」係指歸類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家畜與農畜及動物園、競技或寵物動物，諸如狗、馬、貓、奶牛及其類似動物。哺乳動物較佳為人類。
如本文中所使用之「病症」為將得益於用本文所描述之抗-PD-1抗體，尤其本文所描述之人類化抗-PD-1抗體治療的任何病狀。此病症包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患所討論之病症之彼等病理病狀。
如本文中所使用，術語「PD-1路徑病症」或「PD-1路徑疾病」係指可藉由調節PD-1與PD-L1之間的相互作用，尤其藉由活化PD-1路徑而緩解的病狀。「PD-1路徑病症」或「PD-1路徑疾病」包括表現PD-1之T細胞相關疾病，「PD-1路徑病症」或「PD-1路徑疾病」亦包括藉由活化的自體反應性T細胞表徵且其中需要減弱表現PD-1之T細胞活性及/或下調免疫反應的病狀，該等T細胞表現PD-1且為慢性炎症及自體免疫疾病之驅動子。PD-1路徑病症之實例包括諸如以下之疾病或病症：全身性硬化症(SSc)、全身性紅斑性狼瘡症、多發性肌炎、巨大細胞動脈炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎及發炎性腸病。
術語「特異性結合」或其類似術語意謂抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與在生理條件下相對穩定之抗原形成複合物。用於判定兩個分子是否特異性結合之方法描述於本文中或為此項技術中熟知的，且包括例如平衡透析、表面電漿子共振及類似者。在一個實施例中，根據本文實例部分中所描述之親和力結合方法，特異性結合之特徵在於K
D為約1 × 10
-7M (100 nM)或更低。在另一實施例中，根據本文實例部分中所描述之親和力結合方法，特異性結合之特徵在於K
D為約5 × 10
-8M (50 nM)或更低。在另一實施例中，根據本文實例部分中所描述之親和力結合方法，特異性結合之特徵在於K
D為約1 × 10
-8M (10 nM)或更低。在另一實施例中，根據本文實例部分中所描述之親和力結合方法，特異性結合之特徵在於K
D為約5 × 10
-9M (5 nM)或更低。然而，特異性結合人類PD-1之經分離抗體可能與其他抗原(諸如來自其他物種之PD-1分子)具有交叉反應。另外，分離抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學物質。
術語「皮下投與」係指藉由相對地緩慢的持續遞送將藥物，例如本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段自藥物容器引入至動物或人類患者之皮膚下，較佳皮膚與下層組織之間的袋內。捏起或拉起皮膚且遠離下層組織可產生袋。
術語「皮下輸注」係指藉由相對緩慢的持續性遞送將藥物，例如本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段自藥物容器引入至動物或人類患者之皮膚下，較佳地皮膚與皮下組織之間的袋內，持續一段時間，包括(但不限於) 30分鐘或更短，或90分鐘或更短。視情況，輸注可藉由植入於動物或人類患者之皮膚下的藥物遞送泵之皮下植入來進行，其中泵遞送預定量之藥物，保持預定時段，諸如30分鐘、90分鐘或橫跨治療方案長度之時段。
術語「皮下推注」係指動物或人類患者之皮膚下方之藥物投與，其中推注藥物遞送小於約15分鐘；在另一態樣中，小於5分鐘，且在又一態樣中，小於60秒。在甚至又一態樣中，投與係在皮膚與下層組織之間的袋內，其中袋可藉由捏起或拉起皮膚且遠離下層組織而產生。舉例而言，「皮下推注」係指在小於大約15分鐘；在另一態樣中，小於5分鐘且在又一態樣中，小於60秒內向人類患者投與本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段。
術語「治療有效量」用以指抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之減輕或改善所治療病症之症狀中之一或多者的量。藉此，其係具有有益患者結果之量。功效可視待治療之病狀而定以習知方式量測。
如本文中所用，術語「治療」及「療法」及其類似術語意謂包括疾病或病症之治療性以及預防性或抑制措施，產生任何臨床上需要或有益的作用，包括(但不限於)緩解或減輕一或多種症狀，消退、減緩或停止疾病或病症之進展。因此，舉例而言，術語治療包括在疾病或病症之症狀發作之前或之後投與抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，由此預防或去除疾病或病症之一或多種病徵。作為另一實例，該術語包括在臨床表現疾病之後投與抗-PD-1抗體或其抗原結合片段以對抗疾病之症狀。此外，在發作之後及在已發生臨床症狀之後投與抗-PD-1抗體或其抗原結合片段包含如本文所使用之「治療」或「療法」，其中投與影響疾病或病症之臨床參數，諸如組織損傷程度或癌轉移之量或程度，治療是否導致改善疾病。此外，只要本發明之組合物單獨或與另一治療劑組合對於所治療病症之至少一種症狀相比於不使用抗-PD-1抗體組合物或其抗原結合片段下之該症狀有緩解或改善，該結果應視為有效治療潛在病症，不論病症之所有症狀是否緩解。
術語「藥品說明書」用以指治療產品之商業包裝中通常包括之說明書，其含有關於使用此等治療產品之適應症、用法、投藥、禁忌及/或警告的資訊。
抗體
本文描述且揭示抗-PD-1抗體，尤其人類化抗-PD-1抗體，以及包含本發明之抗-PD-1抗體之組合物及製品。亦描述抗-PD-1抗體之抗原結合片段。抗-PD-1抗體及其抗原結合片段可用於治療多種疾病或病症，尤其由活化的自體反應性T細胞表徵之疾病或病症，該等T細胞表現PD-1且為慢性發炎及自體免疫疾病之驅動子。抗-PD-1抗體及其抗原結合片段各包括特定識別PD-1抗原決定基之至少一部分。在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體及其抗原結合片段為促效劑抗-PD-1抗體及其抗原結合片段。
根據本發明之抗-PD-1抗體之產生及其表徵描述於實例中。在初始表徵中，基於其優良的抗體效能選擇抗-PD-1嵌合之前導723C2，如例如以下實例中所描述。變異體庫係藉由將嵌合前導之CDR置放至人類共同重鏈及輕鏈可變域之FR中且此外藉由不同變化對FR進行工程改造來產生。另外，小鼠前導723C2之重鏈CDR3中的半胱胺酸經人類化抗-PD-1抗體中衍生自小鼠前導723C2之酪胺酸置換(「DC」至「DY」)。自「DC」變化至「DY」對抗體之藥理學特性不具有影響。用於產生人類化抗體之製程經描述於實例中。
代表性小前導之可變區之胺基酸序列展示於表1及2中。此等小鼠前導之CDR區及前導723C2之經工程改造之變異體的CDR區展示於表3及4中。
表1：抗-PD-1小鼠前導-VK序列
表2：抗-PD-1小鼠前導-VH序列
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| 313C12VH | EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQTPEKGLEWIAYINSDSNTIYYADTVKGRFTISRDNARKTLYLQMTSLRSEDTAMYYCSPLVAPDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 110) |
| 414A12VH | QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGHTFTSNWIHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSDSYTYYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYSCACPGRNSNFAYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 111) |
| 502H1VH | QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVTWIRKPSGQGLEWLAHIFWDGDKRYNPSLKSRLTISKDSSSNQVFLMITGVGTADAATYYCARYYYFDYGYAIDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 112) |
| 701C1VH | EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVKQKPGQGLEWIGYIDPSNDDTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAREAYYGGLYGMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 113) |
| 701E9VH | QVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFIDYTIHWVKQSPGQGLEWIGWIFPGSTNDTKYNDKFKGKATMTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARYRTDFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 114) |
| 703D10VH | QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYSFTSYWMHWVRQRPGQGLEWIGDIDPSNSYAYHSQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARADGTSHWYFDVWGAGTAVTVSS (SEQ ID NO: 115) |
| 708E4VH | QIQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYLNWVKQRPGHGLEWIGWIYPGSSDTKHNENFKGKATLTVDTYSSTAYMQLGSLTSEDSAVYFCTRYSNFFFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 116) |
| 709A6VH | QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLTHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSRNQVFLEITSVDTADTATYFCARSSQGLYSSYDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 117) |
| 718C2VH | EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVRQKPGQGLEWIGYIDPDNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAREAYYGGLYGMDYWGQGSSVTVSS (SEQ ID NO: 118) |
| 723C2VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGSSYYPDSVKGRFTISRDNTKNTLYLQMSSLKSEDTAVYYCARLPHYFAMDCWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 119) |
| 803E6VH | EVKLVESEGGLVQPGSSMKLSCTASGFTFSDYYMAWVRQVPEKGLEWVANINYDGFNTYYLDSLKSRFIISRDNAKNILYLQMSSLKSEDTATYYCARGGYWSLYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 120) |
| 811G3VH | QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIGWIYPGGGHTKYNEKFKGEATLTVDTSSRTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARYSNYYFDFWGHGTTLTVSS (SEQ ID NO: 121) |
| 814E10VH | QIQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTSYYIQWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGTTNYNENFKGKTTLTADKSSSTVYMLLSSLTSEDSAVYFCARYGLVPFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 122) |
| 820C3VH | QIQLQQSGPELVKTGASVKISCKASGNTFNSNYIQWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGSTNYSEKFKGKTTLTADKSSSTAYMLVSSLTSEDSAVYFCARYGPVPFDYWGQGTTLSVSS (SEQ ID NO: 123) |
各種小鼠抗體之小鼠輕鏈及重鏈CDR分別展示於表3及表4中。表3及4亦展示經由人類化製程衍生自小鼠抗體723C2之三個輕鏈CDR及三個重鏈CDR。
表3：輕鏈CDR序列
表4：重鏈CDR序列
| L-CDR1 | L-CDR2 | L-CDR3 | |
| 306E6 | RSSKSLLHRNGITYLY (SEQ ID NO:1) | EMSNLAS (SEQ ID NO:2) | GQNLEFPLT (SEQ ID NO:3) |
| 307A3 | RSSKSLLHRNGITYLY (SEQ ID NO:1) | EMSNLAS (SEQ ID NO:2) | GQNLEFPLT (SEQ ID NO:3) |
| 313C12 | KASQNVGTAVA (SEQ ID NO:4) | SVSNRYT (SEQ ID NO:5) | QQYSSYPFT (SEQ ID NO:6) |
| 414A12 | HASQGINNNIG (SEQ ID NO:7) | HKSNLED (SEQ ID NO:8) | VQYAQFPYT (SEQ ID NO:9) |
| 502H1 | RSSKSLLHRNGITYLY (SEQ ID NO:10) | QMSNLAS (SEQ ID NO:11) | AQNLELPLT (SEQ ID NO:12) |
| 701C1 | KSSQSLLYSSNQKNYLA (SEQ ID NO:13) | WASTRES (SEQ ID NO:14) | HQYYSSPLT (SEQ ID NO:15) |
| 701E9 | RASQEISGYLS (SEQ ID NO:16) | AASTLDS (SEQ ID NO:17) | LQYASYPLT (SEQ ID NO:18) |
| 703D10 | SANSSVSFMH (SEQ ID NO:19) | STSSLAS (SEQ ID NO:20) | QQRSSYPLT (SEQ ID NO:21) |
| 708E4 | KASQNVVTYVA (SEQ ID NO:22) | SASYRYS (SEQ ID NO:23) | QQYHSYPYT (SEQ ID NO:24) |
| 709A6 | RASESVDIYGISFLH (SEQ ID NO:25) | RASNLDS (SEQ ID NO:26) | QQSNKDPLT (SEQ ID NO:27) |
| 718C2 | KSSQSLLYSSNQKIYLA (SEQ ID NO:28) | WASTRES (SEQ ID NO:14) | QQYYNSPLT (SEQ ID NO:29) |
| 723C2 | SASSSISSDYLH (SEQ ID NO:30) | RTSNLAS (SEQ ID NO:31) | QQGTSLPRA (SEQ ID NO:32) |
| Hu_723C2-463-60 | SASQSISSDYLH (SEQ ID NO:164) | RTSNLAS (SEQ ID NO:31) | QQGTSLPRA (SEQ ID NO:32) |
| Hu_723C2-462-07 | QASQSISSDYLH (SEQ ID NO:165) | RTSNLET (SEQ ID NO:166) | QQGTSLPRA (SEQ ID NO:32) |
| Hu_723C2-462-08 | QASQSISSDYLH (SEQ ID NO:165) | RTSNLES (SEQ ID NO:167) | QQGTSLPRA (SEQ ID NO:32) |
| 803E6 | KSSQSLLHSGNQKNYMT (SEQ ID NO:33) | WASTRES (SEQ ID NO:14) | QNDYSYPLT (SEQ ID NO:34) |
| 811G3 | RASQEISGYLS (SEQ ID NO:16) | VASTLDS (SEQ ID NO:35) | LQYANYPYT (SEQ ID NO:36) |
| 814E10 | SASQDIINYLN (SEQ ID NO:37) | STSSLHS (SEQ ID NO:38) | HQYSQLPYT (SEQ ID NO:39) |
| 820C3 | SASQDIFNYLN (SEQ ID NO:40) | YTSSLHS (SEQ ID NO:41) | QQYSNLPYT (SEQ ID NO:42) |
| H-CDR1 | H-CDR2 | H-CDR3 | |
| 306E6 | GYTFTDYYVN (SEQ ID NO:43) | DIHPNSGDTTYNQKFKD (SEQ ID NO:44) | RRYDYDGFAY (SEQ ID NO:45) |
| 307A3 | GYTFTDYYVN (SEQ ID NO:43) | DIHPNNGGITYNQKFKG (SEQ ID NO:46) | RRYDYDGFAY (SEQ ID NO:45) |
| 313C12 | GFTFSDYGMH (SEQ ID NO:47) | YINSDSNTIYYADTVKG (SEQ ID NO:48) | LVAPDY (SEQ ID NO:49) |
| 414A12 | GHTFTSNWIH (SEQ ID NO:50) | EIDPSDSYTYYNQKFKG (SEQ ID NO:51) | PGRNSNFAY (SEQ ID NO:52) |
| 502H1 | GFSLSTSGMGVT (SEQ ID NO:53) | HIFWDGDKRYNPSLKS (SEQ ID NO:54) | YYYFDYGYAIDY (SEQ ID NO:55) |
| 701C1 | GYTFTSYVIH (SEQ ID NO:56) | YIDPSNDDTKYNEKFKG (SEQ ID NO:57) | EAYYGGLYGMDY (SEQ ID NO:58) |
| 701E9 | GYTFIDYTIH (SEQ ID NO:59) | WIFPGSTNDTKYNDKFKG (SEQ ID NO:60) | YRTDFDY (SEQ ID NO:61) |
| 703D10 | GYSFTSYWMH (SEQ ID NO:62) | DIDPSNSYAYHSQKFKG (SEQ ID NO:63) | ADGTSHWYFDV (SEQ ID NO:64) |
| 708E4 | GYTFTDYYLN (SEQ ID NO:65) | WIYPGSSDTKHNENFKG (SEQ ID NO:66) | YSNFFFDY (SEQ ID NO:67) |
| 709A6 | GFSLSTSGMGVS (SEQ ID NO:68) | HIYWDDDKRYNPSLKS (SEQ ID NO:69) | SSQGLYSSYDY (SEQ ID NO:70) |
| 718C2 | GYTFTSYVMH (SEQ ID NO:71) | YIDPDNDGTKYNEKFKG (SEQ ID NO:72) | EAYYGGLYGMDY (SEQ ID NO:58) |
| 723C2 | GFTFSDYYMS (SEQ ID NO:73) | YISSGGGSSYYPDSVKG (SEQ ID NO:74) | LPHYFAMDC (SEQ ID NO:75) |
| Hu_723C2-463-60 | GFTFSDYYMS (SEQ ID NO:73) | YISSGGGSKYYPDLVKG (SEQ ID NO:76) | LPHYFAMDY (SEQ ID NO:77) |
| Hu_723C2-461-47 | GFTFSDYYMS (SEQ ID NO:73) | YISSGGGSSYYPDAVKG (SEQ ID NO:78) | LPHYFAMDY (SEQ ID NO:77) |
| Hu_723C2-461-40 | GFTFSDYYMS (SEQ ID NO:73) | YISSGGGSSYYPDLVKG (SEQ ID NO:79) | LPHYFAMDY (SEQ ID NO:77) |
| 803E6 | GFTFSDYYMA (SEQ ID NO:80) | NINYDGFNTYYLDSLKS (SEQ ID NO:81) | GGYWSLYFDY (SEQ ID NO:82) |
| 811G3 | GYTFTDYYIN (SEQ ID NO:83) | WIYPGGGHTKYNEKFKG (SEQ ID NO:84) | YSNYYFDF (SEQ ID NO:85) |
| 814E10 | GYTFTSYYIQ (SEQ ID NO:86) | WIYPGDGTTNYNENFKG (SEQ ID NO:87) | YGLVPFDY (SEQ ID NO:88) |
| 820C3 | GNTFNSNYIQ (SEQ ID NO:89) | WIYPGDGSTNYSEKFKG (SEQ ID NO:90) | YGPVPFDY (SEQ ID NO:91) |
將上表3及4中列出的使用Chemical Computing Group (CCG)編號界定之CDR加下劃線(Almagro等人, Proteins 2011; 79:3050-3066及Maier等人, Proteins 2014; 82:1599-1610)。
衍生自小鼠抗體723C2之人類化輕鏈及重鏈可變區之代表性數目提供且展示於表5及6中。
表5：人類化723C2-VK序列
表6：人類化723C2-VH序列
| 723C2VK-463-60 | GATATCCAGATGACGCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCGTCCGTGGGCGACCGCGTGACGATCACCTGTAGCGCGTCCCAGAGCATCAGCAGCGACTATCTGCATTGGTATCAGCAGAAACCAGGTAAAGCCCCTAAACTGCTGATCTACCGGACCTCCAATCTGGCAAGCGGCGTGCCTAGCCGTTTCAGCGGTAGCGGCTCCGGTACCGACTTCACCTTTACTATCTCCAGCCTGCAGCCTGAAGACATCGCGACGTATTATTGTCAGCAGGGTACTAGCCTGCCTCGCGCCTTCGGCCAGGGGACCAAACTGGAAATCAAA (SEQ ID NO:124) |
| DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQSISSDYLHWYQQKPGKAPKLLIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGTSLPRAFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:125) | |
| 723C2VK-462-07 | GATATCCAGATGACGCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCGTCCGTGGGCGACCGCGTGACGATCACCTGTCAGGCGTCCCAGAGCATCAGCAGCGACTATCTGCATTGGTATCAGCAGAAACCAGGTAAAGCCCCTAAACTGCTGATCTACCGGACCTCCAATCTGGAAACCGGCGTGCCTAGCCGTTTCAGCGGTAGCGGCTCCGGTACCGACTTCACCTTTACTATCTCCAGCCTGCAGCCTGAAGACATCGCGACGTATTATTGTCAGCAGGGTACTAGCCTGCCTCGCGCCTTCGGCCAGGGGACCAAACTGGAAATCAAA (SEQ ID NO:126) |
| DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSDYLHWYQQKPGKAPKLLIYRTSNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGTSLPRAFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:127) | |
| 723C2VK-462-08 | GATATCCAGATGACGCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCGTCCGTGGGCGACCGCGTGACGATCACCTGTCAGGCGTCCCAGAGCATCAGCAGCGACTATCTGCATTGGTATCAGCAGAAACCAGGTAAAGCCCCTAAACTGCTGATCTACCGGACCTCCAATCTGGAAAGCGGCGTGCCTAGCCGTTTCAGCGGTAGCGGCTCCGGTACCGACTTCACCTTTACTATCTCCAGCCTGCAGCCTGAAGACATCGCGACGTATTATTGTCAGCAGGGTACTAGCCTGCCTCGCGCCTTCGGCCAGGGGACCAAACTGGAAATCAAA (SEQ ID NO:128) |
| DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSDYLHWYQQKPGKAPKLLIYRTSNLESGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGTSLPRAFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:129) |
| 723C2VH-463-60 | GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGTGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGCGGCTCCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCAAGCGGTTTCACCTTTAGCGACTACTATATGTCCTGGGTGCGTCAGGCGCCAGGTAAAGGTCTGGAATGGGTGTCATACATCAGCTCCGGGGGCGGTAGCAAGTACTATCCGGACCTGGTGAAAGGGCGCTTTACTATCTCCCGGGATAATGCAAAAAATAGCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGCGGGCGGAAGATACCGCCGTGTATTACTGTGCGCGTCTGCCGCATTATTTCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:130) |
| EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSYISSGGGSKYYPDLVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAVYYCARLPHYFAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:131) | |
| 723C2VH-461-41 | GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGTGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGCGGCTCCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCAAGCGGTTTCACCTTTAGCGACTACTATATGTCCTGGGTGCGTCAGGCGCCAGGTAAAGGTCTGGAATGGGTGGCATACATCAGCTCCGGGGGCGGTAGCAGCTACTATCCGGACCTGGTGAAAGGGCGCTTTACTATCTCCCGGGATAATGCAAAAAATAGCCTGTACCTGCAGATGCAGAGCCTGCGGGCGGAAGATACCGCCGTGTATTACTGTGCGCGTCTGCCGCATTATTTCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:132) |
| EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGSSYYPDLVKGRFTISRDNAKNSLYLQMQSLRAEDTAVYYCARLPHYFAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:133) | |
| 723C2VH-461-47 | GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGTGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGCGGCTCCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCAAGCGGTTTCACCTTTAGCGACTACTATATGTCCTGGGTGCGTCAGGCGCCAGGTAAAGGTCTGGAATGGGTGGCATACATCAGCTCCGGGGGCGGTAGCAGCTACTATCCGGACGCTGTGAAAGGGCGCTTTACTATCTCCCGGGATAATGCAAAACAGAGCCTGTACCTGCAGATGCAGAGCCTGCGGGCGGAAGATACCGCCGTGTATTACTGTGCGCGTCTGCCGCATTATTTCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:134) |
| EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGSSYYPDAVKGRFTISRDNAKQSLYLQMQSLRAEDTAVYYCARLPHYFAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:135) | |
| 723C2VH-461-44 | GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGTGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGCGGCTCCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCAAGCGGTTTCACCTTTAGCGACTACTATATGTCCTGGGTGCGTCAGGCGCCAGGTAAAGGTCTGGAATGGGTGGCCTACATCAGCTCCGGGGGCGGTAGCAGCTACTATCCGGACCTGGTGAAAGGGCGCTTTACTATCTCCCGGGATAATGCAAAACAGAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCGGAAGATACCGCCGTGTATTACTGTGCGCGTCTGCCGCATTATTTCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:136) |
| EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGSSYYPDLVKGRFTISRDNAKQSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLPHYFAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:137) | |
| 723C2VH-461-40 | GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGTGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGCGGCTCCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCAAGCGGTTTCACCTTTAGCGACTACTATATGTCCTGGGTGCGTCAGGCGCCAGGTAAAGGTCTGGAATGGGTGGCCTACATCAGCTCCGGGGGCGGTAGCAGCTACTATCCGGACCTGGTGAAAGGGCGCTTTACTATCTCCCGGGATAATGCAAAACAGAGCCTGTACCTGCAGATGCAGAGCCTGCGGGCGGAAGATACCGCCGTGTATTACTGTGCGCGTCTGCCGCATTATTTCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO:138) |
| EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGGSSYYPDLVKGRFTISRDNAKQSLYLQMQSLRAEDTAVYYCARLPHYFAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:139) |
衍生自小鼠抗體723C2之人類化輕鏈及重鏈可變區的選擇組合產生抗體A、B、C、D及E：
抗體A： 723C2-IgG4Pro-463-60與IgK-463-60 (重鏈可變區723C2VH-463-60及輕鏈可變區723C2VK-463-60)；
抗體B： 723C2-IgG4Pro-461-41與IgK-462-07 (重鏈可變區723C2VH-461-41及輕鏈可變區723C2VK-462-07)；
抗體C： 723C2-IgG4Pro-461-47與IgK-462-07 (重鏈可變區723C2VH-461-47及輕鏈可變區723C2VK-462-07)；
抗體D： 723C2-IgG4Pro-461-44與IgK-462-08 (重鏈可變區723C2VH-461-44及輕鏈可變區723C2VK-462-08)；
抗體E： 723C2-IgG4Pro-461-40與IgK-462-08 (重鏈可變區723C2VH-461-40及輕鏈可變區723C2VK-462-08)。
抗體A、B、C、D及E具有表7中所示之重鏈及輕鏈序列。
表7：抗體A、B、C、D及E之重鏈及輕鏈DNA及胺基酸序列
| 抗體A | IgK輕鏈#463-60 | GATATCCAGATGACGCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCGTCCGTGGGCGACCGCGTGACGATCACCTGTAGCGCGTCCCAGAGCATCAGCAGCGACTATCTGCATTGGTATCAGCAGAAACCAGGTAAAGCCCCTAAACTGCTGATCTACCGGACCTCCAATCTGGCAAGCGGCGTGCCTAGCCGTTTCAGCGGTAGCGGCTCCGGTACCGACTTCACCTTTACTATCTCCAGCCTGCAGCCTGAAGACATCGCGACGTATTATTGTCAGCAGGGTACTAGCCTGCCTCGCGCCTTCGGCCAGGGGACCAAACTGGAAATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO:140) |
| DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQSISSDYLHWYQQKPGKAPKLLIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGTSLPRAFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:141) | ||
| IgG4Pro重鏈#463-60 | GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGTGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGCGGCTCCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCAAGCGGTTTCACCTTTAGCGACTACTATATGTCCTGGGTGCGTCAGGCGCCAGGTAAAGGTCTGGAATGGGTGTCATACATCAGCTCCGGGGGCGGTAGCAAGTACTATCCGGACCTGGTGAAAGGGCGCTTTACTATCTCCCGGGATAATGCAAAAAATAGCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGCGGGCGGAAGATACCGCCGTGTATTACTGTGCGCGTCTGCCGCATTATTTCGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTCCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCTAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGC (SEQ ID NO:142) | |
| EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSYISSGGGSKYYPDLVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAVYYCARLPHYFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:143) | ||
| 抗體B | IgK輕鏈#462-07 | GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCCAGGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCGACTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACCGCACCAGCAACCTGGAGACCGGCGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGGCACCAGCCTGCCACGCGCCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO:144) |
| DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSDYLHWYQQKPGKAPKLLIYRTSNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGTSLPRAFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:145) | ||
| IgG4Pro重鏈#461-41 | GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCAGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCGACTACTACATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCTACATCAGCAGCGGCGGCGGCAGCAGCTACTACCCAGACCTGGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGCAGAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCCTGCCACACTACTTCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTCCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCTAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGC (SEQ ID NO:146) | |
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抗體A、B、C、D及E之輕鏈及重鏈可變區在表7中帶下劃線。重鏈恆定區中之鉸鏈區以粗體展示，其中Ser228Pro突變加框。
小鼠前導723C2亦轉化成人類IgG1WT、IgG1KO及IgG4Pro形式。IgG4Pro在鉸鏈區中具有一個突變Ser228Pro，其防止Fab臂交換。IgG1KO在鉸鏈區中具有兩個突變Leu234Ala及Leu235Ala以降低效應功能(ADCC)。
人類IgG1WT、IgG1KO及IgG4Pro形式中之嵌合723C2展示於表8中。
表8：人類IgG1WT、IgG1KO及IgG4Pro中之嵌合723C2之重鏈及輕鏈DNA及胺基酸序列
H-CDR3中對應於DC至DY之變化的胺基酸在表8中之胺基酸序列中帶下劃線。
| IgG1WT 中之嵌合723C2 (723-IgG1WT) | IgK輕鏈 | GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTACCACAATGGCCGCCTCTCCAGGCGAGAAGATCACCATCACATGTAGCGCCAGCAGCAGCATCAGCAGCGACTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCTTCAGCCCCGAGCTGCTGATCTACAGAACAAGCAATCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTTTCTGGTTCTGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACAATCGGATCCATGGAAGCCGAGGACGTGGCCACCTATTACTGTCAGCAGGGCACAAGCCTGCCTAGAGCCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO:156) |
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| IgG1WT重鏈 | GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTTGTTCAACCTGGCGGCAGCCTGAAACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCGACTACTACATGAGCTGGGTCCGACAGACCCCTGAGAAGAGACTGGAATGGGTCGCCTACATCAGCTCTGGCGGCGGAAGCAGCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACACCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGTCCAGCCTGAAGTCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACTGCCTCACTACTTCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTTTCTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGCGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTACTAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTAAGTTTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT (SEQ ID NO:158) | |
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人類化及胺基酸序列變異體
其他變異型抗-PD-1抗體及抗體片段可基於表3及4中所描繪之CDR集合進行工程改造。應瞭解，在該等變異型抗-PD-1抗體及抗體片段中，CDR之胺基酸序列保持不變，但例如FR區之周圍區域可經工程改造。抗-PD-1抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當核苷酸變化引入至抗-PD-1抗體DNA中或藉由肽合成來製備。此類變異體包括例如自本文中實例之抗-PD-1抗體之胺基酸序列內之殘基缺失及/或插入及/或取代。進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為該最終構築體擁有所需特徵。胺基酸變化亦可改變人類化或變異型抗-PD-1抗體之轉譯後製程，諸如改變糖基化位點之數目或位置。
在一些實施例中，本發明包括具有可變重鏈及可變輕鏈之抗-PD-1抗體或其抗體片段，其中可變重鏈胺基酸序列及可變輕鏈胺基酸序列與表1、2、5及6中所揭示之胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少98%或至少99%一致。
在一些實施例中，本發明包括具有可變重鏈及可變輕鏈之抗-PD-1抗體或其抗體片段，其中可變重鏈胺基酸序列及可變輕鏈胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 131、133、135、137或139及SEQ ID NO: 125、127或129之胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少92.5%、至少95%、至少98%或至少99%一致。
在一些實施例中，本發明包括具有重鏈及輕鏈之抗-PD-1抗體，其中重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列與表7及8中所揭示之胺基酸序列至少95%、至少98%或至少99%一致。
抗體之另一類型胺基酸變異體涉及改變抗體之原始糖基化模式。在此上下文中，術語「改變」意謂缺失一或多個見於抗體中之碳水化合物部分，及/或添加一或多個先前不存在於抗體中之糖基化位點。舉例而言，抗體可包含人類IgG1重鏈之位置297處的胺基酸取代以藉由置換天冬醯胺297 (例如，N297A、N297G)消除寡醣基轉移酶複合物介導之醣基化。
在一些態樣中，本發明包括編碼本文所述之抗-PD-1抗體之胺基酸序列變異體之核酸分子。編碼抗-PD-1抗體之胺基酸序列變異體的核酸分子係藉由此項技術中已知之多種方法製備。此等方法包括(但不限於)自天然來源分離(在天然存在之胺基酸序列變異體的情況下)或藉由對抗-PD-1抗體的早期製備變異體或非變異型進行寡核苷酸介導(或定點)突變誘發、PCR突變誘發及卡匣突變誘發來製備。舉例而言，根據本發明之核酸分子亦涵蓋在嚴格條件下與如本文所揭示之核酸分子雜交的核酸分子，其中術語「嚴格條件」在本發明之範疇內可包括例如在42℃下在包含50%甲醯胺、5×SSC及1% SDS之緩衝液中雜交，或在65℃下在包含5×SSC及1% SDS之緩衝液中雜交，均在65℃下用0.2×SSC及0.1% SDS洗滌。例示性嚴格雜交條件亦可包括在37℃下在40%甲醯胺、1 M NaCl及1% SDS之緩衝液中雜交且在45℃下於1×SSC中洗滌。
在某些實施例中，抗-PD-1抗體為抗體片段。存在已開發用於產生抗體片段之技術。片段可經由完整抗體之蛋白水解消化衍生(參見例如Morimoto等人, 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及Brennan等人, 1985, Science 229:81)。替代地，片段可在重組宿主細胞中直接產生。舉例而言，Fab'-SH片段可自大腸桿菌(E. coli)直接回收且經化學偶合以形成F(ab')
2片段(參見例如，Carter等人, 1992, Bio/Technology 10:163-167)。藉由另一途徑，F(ab')
2片段可自重組宿主細胞培養物直接分離。產生抗體片段的其他技術對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。
在一個態樣中，抗-PD-1抗體及其抗原結合片段可包括修飾，諸如醣基化或去醯胺。
在某些實施例中，可能需要使用抗-PD-1抗體片段，而非完整抗體。可能需要修飾抗體片段以增加其血清半衰期。此情況可例如藉由將救助受體結合抗原決定基併入至抗體片段中來達成。在一種方法中，抗體片段之適當區域可經改變(例如，經突變)，或可將抗原決定基併入至肽標籤中，接著例如藉由DNA或肽合成在任一末端或在中間融合至抗體片段。參見例如WO 96/32478。舉例而言，若不適宜使用全長IgG1支架，則本發明之抗體片段亦可與人類血清白蛋白融合以增加血清半衰期。抗體片段與人類血清白蛋白之此融合蛋白質在需要融合兩種不同抗體片段以增加親合力或以產生具有延長血清半衰期之雙特異性結合蛋白的情況下可為有利的(發現例如，WO05077042 A2)。
在其他實施例中，本發明包括抗-PD-1抗體之共價修飾。共價修飾包括半胱胺醯基殘基、組胺醯基殘基、離胺醯基及胺基端殘基、精胺醯基殘基、酪胺醯基殘基、羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)、麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基、或絲胺醯基、或羥丁胺醯基殘基之修飾。另一類型之共價修飾涉及以化學方式或酶促方式將糖苷偶合至抗體。若適用，則此類修飾可藉由抗體之化學合成或藉由酶促或化學裂解進行。可藉由使抗體之靶向胺基酸殘基與能夠與選定的側鏈或胺基或羧基端殘基反應之有機衍生藥劑反應來將抗體之其他類型的共價修飾引入至分子中。
存在於抗體上之任何碳水化合物部分的移除可以化學方式或酶促方式實現。化學去糖基化係由Hakimuddin等人, 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52及Edge等人, 1981, Anal. Biochem. 118:131描述。抗體上碳水化合物部分之酶促裂解可藉由使用如由Thotakura等人, 1987, Meth. Enzymol 138:350所述之各種內醣苷酶及外醣苷酶實現。
另一類型之適用共價修飾包含以美國專利第4,640,835號、美國專利第4,496,689號、美國專利第4,301,144號、美國專利第4,670,417號、美國專利第4,791,192號及美國專利第4,179,337號中之一或多者中所闡述之方式使抗體連接至各種非蛋白質聚合物中之一者，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
抗原決定基結合
在另一態樣中，本發明係關於識別特定「PD-1抗原決定基(PD-1 antigen epitope/PD-1 epitope)」及「PD-1抗原決定基」之抗體或其抗原結合片段。
如本文所用，術語「PD-1抗原決定基(PD-1 antigen epitope/PD-1 epitope)」係指能夠結合至抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之分子(例如肽)或分子片段。此等術語進一步包括例如由本發明之抗體或抗體片段中之任一者識別的PD-1抗原決定子。
PD-1抗原決定基可包括於蛋白質、蛋白質片段、肽或其類似物中。抗原決定基最常係蛋白質、短寡肽、寡肽模擬物(亦即，模擬PD-1抗原之抗體結合特性的有機化合物)或其組合。
在一個態樣中，本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段以模擬生理學配位體之結合的方式特異性結合於PD-1抗原決定基，從而得到抗體介導之促效作用。
本發明亦提供一種抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其與根據本發明之抗-PD-1抗體競爭結合至PD-1。在一個實施例中，本發明提供一種抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其與本文所描述之抗體A、抗體B、抗體C、抗體D或抗體E競爭結合至PD-1。競爭分析可例如如PLoS One. 2014; 9(3): e92451中所描述使用生物感測器，或PLoS One 2020年3月5日;15(3):e0229206，或藉由本文所揭示之方法來進行。
治療用途
在一個實施例中，本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段適用於治療或預防PD-1路徑病症。
在另一實施例中，本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段適用作藥劑。
因此，在一個實施例中，本發明提供一種調節人類患者之PD-1與PD-L1之間的相互作用的方法，其包含向該人類患者投與組合物，該組合物包含足以活化該人類患者之PD-1路徑的量的根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其用於調節人類患者之PD-1與PD-L1之間的相互作用。在一個實施例中，本發明提供根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段的用途，其用於製造用於調節人類患者之PD-1與PD-L1之間的相互作用的藥劑。
在一個實施例中，本發明提供一種減弱人類患者之表現PD-1之T細胞活性的方法，其包含向該人類患者投與組合物，該組合物包含足以下調該人類患者之免疫反應的量的根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其用於減弱人類患者之表現PD-1之T細胞活性。在一個實施例中，本發明提供根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段的用途，其用於製造用於減弱人類患者之表現PD-1之T細胞活性的藥劑。
在一個實施例中，PD-1路徑疾病或病症為全身性硬化症(SSc)、全身性紅斑性狼瘡、多發性肌炎、巨大細胞動脈炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎及發炎性腸病。因此，在一個實施例中，本發明提供一種治療或預防人類患者之全身性硬化症(SSc)、全身性紅斑性狼瘡、多發性肌炎、巨大細胞動脈炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎或發炎性腸病的方法，其包含向該人類患者投與包含根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段的組合物。在一個實施例中，本發明提供根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防人類患者之全身性硬化症(SSc)、全身性紅斑性狼瘡、多發性肌炎、巨大細胞動脈炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎或發炎性腸病。在一個實施例中，本發明提供根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段的用途，其用於製造用於治療或預防人類患者之全身性硬化症(SSc)、全身性紅斑性狼瘡、多發性肌炎、巨大細胞動脈炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎或發炎性腸病的藥劑。
在一個實施例中，PD-1路徑疾病或病症為慢性或急性的，諸如慢性發炎疾病或急性發炎性疾病。在一個實施例中，PD-1路徑疾病或病症為關節炎、類風濕性關節炎、哮喘、COPD、骨盆發炎性疾病、阿茲海默氏症(Alzheimer's Disease)、發炎性腸病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、佩洛尼氏病(Peyronie's Disease)、腹腔病、膽囊病、潛毛病、腹膜炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、脈管炎、手術黏附、中風、I型糖尿病、萊姆病(Lyme disease)、腦膜腦炎、自體免疫性葡萄膜炎、多發性硬化症、狼瘡(諸如全身性紅斑性狼瘡)、格林巴利氏症候群(Guillain-Barr syndrome)、異位性皮膚炎、自體免疫肝炎、纖維化肺泡炎、格雷氏病(Grave's disease)、IgA腎病變、特發性血小板減少性紫癜、梅尼爾氏病(Meniere's disease)、天疱瘡、原發性膽汁性肝硬化、類肉瘤病、硬皮病、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、其他自體免疫性病症、胰臟炎、創傷(手術)、移植物抗宿主病、移植排斥反應、心臟病(包括缺血性疾病，諸如心肌梗塞)以及動脈粥樣硬化、血管內凝血、骨吸收、骨質疏鬆、骨關節炎、齒根骨膜炎及胃酸過少、與缺乏胎兒母體耐受性相關之不孕症、休格連氏症候群(Sjogren's Syndrome)、白癜風、重症肌無力或全身性硬化症。
因此，在一個實施例中，本發明提供一種治療或預防人類患者之以上疾病或病症中之一者的方法，其包含向該人類患者投與包含根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段的組合物。在一個實施例中，本發明提供根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防人類患者之以上疾病或病症中之一者。在一個實施例中，本發明提供根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段的用途，其用於製造用於治療或預防人類患者之以上疾病或病症中之一者的藥劑。
在一個態樣中，所使用或如上文所描述之用途或如上文所描述之方法中的PD-1抗體或其抗原結合片段為促效劑抗-PD-1抗體或其抗原結合片段。
非治療用途
本文所述之抗體適用作親和純化劑。在此過程中，使用此項技術中熟知之方法將抗體固定於諸如蛋白質A樹脂之固相上。使固定抗體與含有待純化之PD-1蛋白質(或其片段)之樣品接觸，且此後用將移除樣品中除PD-1蛋白質外之實質上所有物質之適合溶劑洗滌載體，該PD-1蛋白質經結合至固定抗體。最後，用自抗體釋放PD-1蛋白質之另一適合溶劑洗滌載體。
如本文中所揭示之本發明之抗-PD-1抗體及其片段亦適用於診斷分析以偵測及/或定量PD-1蛋白質，例如偵測特定細胞、組織或血清中之PD-1表現。
在一些實施例中，有利的是例如出於診斷性目的用可偵測部分標記抗體。許多可偵測標識均可獲得，包括放射性同位素、螢光標記、酶受質標記、量子點及類似者。標記可使用各種已知技術與抗體間接結合。舉例而言，抗體可與生物素結合，且上文所提及之三大類別標記中之任一者可與抗生素蛋白結合，反之亦然。生物素選擇性結合至抗生素蛋白，且因此標記可以此間接方式與抗體結合。或者，為實現標記與抗體之間接結合，可使抗體與小半抗原(諸如地高辛)結合，且不同類型之上文所提及標記中之一者與抗半抗原抗體(例如抗地高辛抗體)結合。因此，可實現標記與抗體之間接結合。
例示性放射性同位素標記包括
35S、
14C、
125I、
3H及
131I。抗體可用放射性同位素使用例如Current Protocols in Immunology, 第1及2卷, 1991, Coligen等人編. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs中所描述之技術來標記。放射性可例如藉由閃爍計數來量測。
例示性螢光標記包括衍生自以下之標記：可獲得的稀土螯合物(銪螯合物)或螢光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺醯基、麗絲胺(Lissamine)、藻紅素及德克薩斯紅(Texas Red)，或例如以下螢光標記中之任一者：二烷基胺基香豆素、若丹明異硫氰酸酯、Alexa 350、Alexa 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、AMCA、胺基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、羧基若丹明6G、羧基-X-若丹明(ROX)、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素343、花青染料(Cy3、Cy5、Cy3.5、Cy5.5)、丹磺醯基、達珀西(Dapoxyl)、二烷基胺基香豆素、DM-NERF、曙紅、赤藻紅、螢光素、FA、羥基香豆素、IRDyes (IRD40、IRD 700、IRD 800)、JOE、麗絲胺若丹明B、Marina Blue、甲氧基香豆素、Naphtho螢光素、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、PyMPO、5-羧基-4',5-二氯-2',7'-二甲氧基螢光素、5-羧基-2',4',5,7'-四氯螢光素、5-羧基螢光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基胺基、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、6-FAM、丹磺醯氯、螢光素、HEX、6-JOE、NBD (7-硝苯-2-氧雜-I,3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫(cresyl fast violet)、甲酚藍紫、亮甲酚藍、對胺基苯甲酸、赤蘚紅、酞菁、偶氮甲鹼、花青、黃嘌呤、琥珀醯螢光素、稀土金屬穴狀化合物、三雙吡啶二胺銪、銪穴狀合物或螯合物、二胺、雙花青苷、La Jolla藍染料、別藻藍蛋白、allococyanin B、藻青蛋白C、藻青蛋白R、硫胺、藻紅藍蛋白、藻紅蛋白R、REG、若丹明綠、若丹明異硫氰酸酯、若丹明紅、TAMRA、TET、TRIT (四甲基若丹明異硫醇)、四甲基若丹明或德克薩斯紅。螢光標記可經由例如已知技術(諸如Current Protocols in Immunology, 同上中所揭示之技術)與抗體結合。螢光可使用螢光計定量。
存在此項技術中已知之各種充分表徵之酶受質標記(關於綜述，參見例如美國專利第4,275,149號)。酶一般催化顯色受質之化學改變，該化學改變可使用各種技術量測。舉例而言，改變可為可以分光光度法量測之受質之顏色變化。或者，酶可改變受質之螢光或化學發光。上文描述定量螢光變化之技術。化學發光受質藉由化學反應以電子方式激發且接著可發射可使用例如化學發光儀量測之光，或為螢光受體供給能量。
酶標記之實例包括螢光素酶(諸如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶)(美國專利第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫呔𠯤二酮、蘋果酸鹽去氫酶、尿素酶、過氧化酶(諸如辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRPO))、鹼性磷酸酶、β-半乳糖、澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶(諸如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環氧化酶(諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化酶、微過氧化酶及其類似物。使酶與抗體結合之技術描述於例如O'Sullivan等人, 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, Methods in Enzym. (J. Langone及H. Van Vunakis編), Academic press, N.Y., 73: 147-166中。
酶-受質組合之實例包括例如：辣根過氧化酶(HRPO)與作為受質之氫過氧化酶，其中氫過氧化酶氧化染料前驅體，諸如鄰苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基聯苯胺鹽酸鹽(TMB)；鹼性磷酸酶(AP)與作為顯色受質之對硝基苯磷酸酯；及β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)與諸如對硝苯基-β-D-半乳糖苷酶之顯色受質或螢光受質4-甲基香豆素基-β-D-半乳糖苷酶。
熟習此項技術者可獲得許多其他酶-受質組合。關於此等組合之一般綜述，參見美國專利第4,275,149號及美國專利第4,318,980號。
在另一實施例中，本發明之抗-PD-1抗體或抗體片段未經標記使用且結合抗-PD-1抗體或其片段之標記抗體偵測。舉例而言，經標記之抗人類Fc或抗人類Fab抗體可用於偵測未經標記之抗-PD-1抗體或片段。根據本發明之未標記抗-PD-1抗體或其片段的用途可有利於實現更佳的組織穿透，作為螢光標記將增加其融合之抗體或抗體片段之分子量及/或增加其疏水性，從而減少組織穿透。
本文所述之抗體可用於任何已知分析方法，諸如競爭性結合分析、直接及間接夾心分析，及免疫沈澱分析。參見例如Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 第147至158頁(CRC Press, Inc. 1987)。
診斷套組
本發明之人類化抗-PD-1抗體可用於診斷套組中，亦即預定量之試劑與用於進行診斷分析之說明書的封裝組合。若抗體用酶標記，則套組可包括酶所需之受質及輔因子，諸如提供可偵測發色團或螢光團之受質前體。另外，可包括其他添加劑，諸如穩定劑、緩衝液(例如阻斷緩衝液或裂解緩衝液)及其類似物。各種試劑之相對量可廣泛變化以提供實質上使分析敏感性最佳之試劑溶液中之濃度。試劑可以乾燥粉末(通常凍乾)形式提供，包括在溶解時將提供具有適當濃度之試劑溶液的賦形劑。
診斷套組
本發明之抗-PD-1抗體或其片段可用於診斷套組中，亦即預定量之試劑與用於進行診斷分析之說明書的封裝組合。若抗體用酶標記，則套組可包括酶所需之受質及輔因子，諸如提供可偵測發色團或螢光團之受質前體。另外，可包括其他添加劑，諸如穩定劑、緩衝液(例如阻斷緩衝液或裂解緩衝液)及其類似物。各種試劑之相對量可廣泛變化以提供實質上使分析敏感性最佳之試劑溶液中之濃度。試劑可以乾燥粉末(通常凍乾)形式提供，包括在溶解時將提供具有適當濃度之試劑溶液的賦形劑。
組合物及其投與
可向具有本文所描述之PD-1路徑疾病或病症或處於其風險下的個體投與包含根據本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段的組合物。本發明進一步提供抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造用於預防或治療PD-1路徑疾病或病症之藥劑。如本文中所使用之術語「個體」意謂可投與抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之任何哺乳動物患者，包括例如人類及某些非人類哺乳動物，諸如靈長類動物及狗。特別意欲使用本文所描述之方法治療之個體包括人類。本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段可單獨或與其他組合物組合投與。
在一個態樣中，本發明亦提供包含本發明之抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物。
已知各種遞送系統且可用以投與抗-PD-1抗體或其抗原結合片段。引入方法包括(但不限於)玻璃體內、滴眼劑、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外及經口途徑。抗-PD-1抗體或其抗原結合片段可例如藉由輸注、推注或注射投與，且可與其他生物活性劑一起投與。投藥可為全身性或局部的。用於此類注射之調配物可以例如預填充注射器製備。
抗-PD-1抗體或其抗原結合片段可以包含治療有效量之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段及一或多種醫藥學上可相容之成分的醫藥組合物形式投與。
在典型實施例中，根據常規程序將醫藥組合物調配成適用於向人類靜脈內或皮下投與之醫藥組合物。通常，藉由注射投與之組合物係於無菌等張水性緩衝液中之溶液。必要時，醫藥物亦可包括增溶劑及諸如利多卡因(lignocaine)之局部麻醉劑以減輕注射部位之疼痛。一般而言，該等成分係在指示活性劑之量之密閉性密封容器(諸如安瓿或藥囊)中單獨供應或以單位劑型混合在一起，例如呈凍乾粉末或無水濃縮物形式。當藉由輸注投與醫藥物時，其可用含有無菌醫藥級水或生理鹽水之輸注瓶來配藥。當藉由注射投與醫藥物時，可提供注射用無菌水或生理鹽水之安瓿，使得該等成分可於投與前混合。
此外，醫藥組合物可以醫藥套組形式提供，該醫藥套組包含(a)含有呈凍乾形式之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之容器及(b)含有注射用醫藥學上可接受之稀釋劑(例如無菌水)之第二容器。可使用醫藥學上可接受之稀釋劑復水或稀釋凍乾之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段。視需要與該(等)容器相關聯的可為由管理醫藥或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式的注意事項，該注意事項反映由人類投藥之製造、使用或銷售機構之批准。
可藉由標準臨床技術測定有效治療或預防PD-1路徑疾病或病症的抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之量。另外，活體外分析可視情況用於幫助鑑別最佳劑量範圍。欲用於調配物中之精確劑量亦將視投藥途徑及病症階段而定，且應根據醫師之判斷及各患者之情況來決定。可自來源於活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推出有效劑量。
舉例而言，抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之毒性及治療功效可藉由測定ED
50(在50%群體中治療上有效的劑量)之標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定。展現大治療指數之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段為較佳。
自細胞培養物分析及動物研究獲得之資料可用於調配用於人類的劑量範圍。抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之劑量通常於包括具有極小或不具毒性之ED
50的循環濃度範圍內。劑量可在此範圍內變化，視所採用劑型及所用投藥途徑而定。對於方法中所用之任何抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，治療有效劑量最初可由細胞培養物分析估計。可在動物模型中調配劑量以達成循環血漿濃度範圍，包括如在細胞培養物中所測定之IC
50(亦即，達成症狀之一半最大抑制的測試化合物之濃度)。此資訊可用於更精確地測定適用於人類之劑量。可例如藉由高效液相層析、ELISA及其類似方法量測血漿中之含量。
在一個實施例中，抗-PD-1抗體以規律的時間間隔投與。
在一些實施例中，本發明之抗體可調配成包括例如1 mg /ml至250 mg/ml、例如20 mg/ml至200 mg/ml的劑量。
在一些實施例中，包含抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物可進一步包含結合或未結合至結合劑之治療劑。
此類組合療法投與對疾病參數(例如症狀之嚴重度、症狀數目或復發頻率)可具有累加或協同作用。
關於用於組合投與之治療方案，在一特定實施例中，將抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與治療劑同時投與。在另一特定實施例中，在投與抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之前或之後投與治療劑。
聚核苷酸、載體、宿主細胞及重組方法
本發明係關於經分離之聚核苷酸，其包含編碼抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之序列；載體；及宿主細胞，其包含聚核苷酸；及用於產生抗體之重組技術。經分離之聚核苷酸可編碼任何所需形式之抗-PD-1抗體，包括例如全長單株抗體、Fab、Fab'、F(ab')
2及Fv片段、雙功能抗體、線抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體。
包含編碼抗-PD-1抗體或其片段或鏈之序列的聚核苷酸可與如此項技術中已知的一或多個調節或對照序列融合，且可包含於如此項技術中已知的適合之表現載體或宿主細胞中。編碼重鏈或輕鏈可變域之聚核苷酸分子中之每一者可獨立地融合至編碼恆定域(諸如人類恆定域)之聚核苷酸序列，從而使得能夠產生完整抗體。替代地，聚核苷酸或其部分可融合在一起，從而提供用於產生單鏈抗體之模板。
對於重組產生，將編碼抗體之聚核苷酸插入至用於選殖(DNA擴增)或表現之可複製載體中。可獲得許多適用於表現重組抗體之載體。載體組分一般包括(但不限於)以下一或多者： 信號序列、複製起點、一或多個標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。
抗-PD-1抗體亦可以融合多肽形式產生，其中抗體與異源多肽(諸如信號序列)在成熟蛋白或多肽之胺基端具有特異性裂解位點之其他多肽融合。選定的異源信號序列通常為經宿主細胞識別且處理(亦即，藉由信號肽酶裂解)之信號序列。對於不識別且處理抗-PD-1抗體信號序列之原核宿主細胞，信號序列可經原核信號序列取代。信號序列可為例如鹼性磷酸酶、青黴素酶、脂蛋白、熱穩定腸毒素II前導子及其類似物。對於酵母分泌，原生信號序列可經例如獲自酵母轉化酶α因子(包括酵母(Saccharomyces)及克魯維酵母(Kluyveromyces) α-因子前導子)、酸磷酸酶、白色念珠菌(C. albicans)澱粉酶之前導序列或WO90/13646中所描述之信號取代。在哺乳動物細胞中，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導子，例如單純疱疹gD信號。此類前驅區之DNA在閱讀框架中接合至編碼人類化抗-PD-1抗體之DNA。
表現載體及選殖載體含有使得載體能夠在一或多個選定的宿主細胞中複製之核酸序列。一般而言，在選殖載體中，此序列為使得載體能夠獨立於宿主染色體DNA而複製之序列，且包括複製起點或自主複製序列。此類序列對於各種細菌、酵母及病毒而言為熟知的。來自質體pBR322之複製起點適用於大多數革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacteria)，2-υ.質體起點適用於酵母，且各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體不需要複製起點組分(通常可僅使用SV40起點，因為其含有早期啟動子)。
表現載體及選殖載體可含有編碼可選標記之基因，以便於識別表現。典型可選標記基因編碼如下蛋白質，該等蛋白質賦予對抗生素或其他毒素，例如安比西林(ampicillin)、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)或四環素(tetracycline)之抗性，或者補充營養缺陷型缺乏，或在其他替代方案中，提供不存在於複合培養基中之特定營養素，例如編碼用於桿菌之D-丙胺酸消旋酶之基因。
選擇方案之一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞生長。此等經異源基因成功轉型之細胞產生賦予耐藥性之蛋白質且因此在選擇療法中存活。此類顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及潮黴素。哺乳動物細胞之常見可選標記係使得能夠鑑別可攝取編碼人類化抗-PD-1抗體之核酸的細胞之標記，諸如DHFR (二氫葉酸還原酶)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及金屬硫蛋白-II (諸如靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷去胺酶、鳥胺酸去羧酶及其類似物。首先藉由在含有甲胺喋呤(Mtx) (DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中培養所有轉型體來識別經DHFR選擇基因轉型之細胞。當採用野生型DHFR時，適當的宿主細胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(例如DG44)。
替代地，經編碼抗-PD-1抗體、野生型DHFR蛋白質及另一種可選標記(諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH))之DNA序列轉型或共轉型的宿主細胞(尤其含有內源性DHFR之野生型宿主)可藉由在含有針對可選標記(諸如胺基糖苷抗生素，例如卡那黴素(kanamycin)、新黴素或G418)之選擇劑的培養基中進行細胞生長來選擇。參見例如美國專利第4,965,199號。
在酵母細胞作為宿主細胞執行重組生產之情況下，存在於酵母質體YRp7中之TRP1基因(Stinchcomb等人, 1979, Nature 282: 39)可用作可選標記。TRP1基因為在色胺酸中不具有生長能力之酵母突變菌株(例如ATCC編號44076或PEP4-1)提供選擇標記(Jones, 1977, Genetics 85:12)。酵母宿主細胞基因體中存在trp1損傷接著提供藉由在不存在色胺酸下生長偵測轉型之有效環境。類似地，諸如ATCC 20,622及38,626之Leu2p缺乏酵母菌株由帶有LEU2基因之已知質體來補充。
另外，衍生自1.6 μm環形質體pKD1之載體可用於克魯維酵母之轉型。或者，針對克魯維乳球菌(K. lactis)報導用於大規模產生重組小牛凝乳酶之表現系統(Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135)。亦已揭示用於藉由工業克魯維酵母菌株分泌成熟重組人類血清白蛋白之穩定多複本表現載體(Fleer等人, 1991, Bio/Technology 9:968-975)。
表現載體及選殖載體通常含有藉由宿主生物體識別且可操作地連接於編碼抗-PD-1抗體或其多肽鏈之核酸分子的啟動子。適合於與原核宿主一起使用之啟動子包括phoA啟動子、β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子，諸如tac啟動子。其他已知細菌啟動子亦為適合的。用於細菌系統中之啟動子亦將含有可操作地連接於編碼人類化抗-PD-1抗體之DNA的夏因-達爾加莫(Shine-Dalgamo，S.D.)序列。
已知許多真核啟動子序列。幾乎所有的真核基因均具有富AT區，其位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處。在許多基因轉錄起點上游70至80個鹼基處發現的另一序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大部分真核基因之3'端處為AATAAA序列，其可為將聚A尾添加至編碼序列之3'端的信號。所有此等序列適合插入至真核表現載體中。
適合與酵母宿主一起使用之啟動序列之實例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶的啟動子，該等糖分解酶諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸去氫酶、己糖激酶、丙酮酸去羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙醣磷酸異構酶、磷酸葡萄糖異構酶以及葡糖激酶。
誘導性啟動子具有藉由生長條件控制之額外轉錄優勢。此等啟動子包括用於醇去氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關之衍生酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸去氫酶及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶的酵母啟動子區。適用於酵母表現之載體及啟動子進一步描述於EP 73,657或Baghban等人，Molecular Biotechnology (2019) 61:365-384中。酵母強化子亦宜與酵母啟動子一起使用。
可控制哺乳動物宿主細胞中自載體之抗-PD-1抗體轉錄，例如藉由獲自諸如以下之病毒之基因體的啟動子實現：多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽鳥肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40 (SV40)；異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；或熱休克啟動子，限制條件為此類啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子宜以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制性片段形式獲得。人類巨細胞病毒之即刻早期啟動子適宜以HindIII E限制性片段形式獲得。在哺乳動物宿主中使用牛科動物乳頭瘤病毒作為載體來表現DNA的系統揭示於美國專利第4,419,446號中。此系統的修飾描述於美國專利第4,601,978號中。亦參見Reyes等人, 1982, Nature 297:598-601，其揭示在來自單純性疱疹病毒之胸苷激酶啟動子的控制下，人類p-干擾素cDNA於小鼠細胞中之表現。或者，可使用勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)長末端重複序列作為啟動子。
可用於重組表現載體中之另一適用要素係強化子序列，其用以增加高級真核生物之編碼抗-PD-1抗體之DNA之轉錄。現已知來自哺乳動物基因(例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)的許多強化子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點後側(bp 100-270)上之SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、複製起點後側上之多瘤病毒強化子以及腺病毒強化子。關於增強真核啟動子活化之元件之描述亦參見Yaniv, 1982, Nature 297:17-18。強化子可剪接至載體中在抗-PD-1抗體編碼序列5'或3'端之位置處，但較佳位於啟動子5'端之位點處。
真核宿主細胞(酵母細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞、動物細胞、人類細胞或來自其他多細胞生物體之有核細胞)中使用的表現載體亦可含有終止轉錄及穩定mRNA所需的序列。此類序列通常可獲自真核或病毒DNA或cDNA的5'及偶爾3'非轉譯區。此等區域在編碼抗-PD-1抗體之mRNA的未轉譯部分中含有以聚腺苷酸化片段形式轉錄之核苷酸區段。一種有用的轉錄終止組分係牛生長激素聚腺苷酸化區域。參見WO94/11026及其中所揭示之表現載體。在一些實施例中，可使用CHEF系統表現抗-ANGPT2抗體。(參見例如美國專利第5,888,809號，其揭示內容以引用之方式併入本文中)。
本文中適用於在載體中選殖或表現DNA的宿主細胞為上文所描述之原核生物、酵母或高級真核生物細胞。適用於此目的之原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸內菌科(Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏桿菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)(例如鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌屬(Serratia)(例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans))及志賀桿菌屬(Shigella)；以及桿菌屬(Bacilli) (諸如枯草桿菌(B. subtilis)及地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)(例如1989年4月12日公開之DD 266,710中所揭示之地衣芽孢桿菌41 P))、假單胞菌屬(Pseudomonas) (諸如綠膿桿菌(P. aeruginosa))及鏈黴菌屬(Streptomyces)。一種較佳大腸桿菌選殖宿主係大腸桿菌294 (ATCC 31,446)，但諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776 (ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110 (ATCC 27,325)之其他菌株係適合的。此等實例為說明性而非限制性的。
除原核生物以外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為編碼抗-PD-1抗體之載體的適合選殖或表現宿主。在低級真核宿主微生物中最常使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通麵包酵母。然而，多種其他屬、種及菌株通常可用且適用於本文，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyce)宿主，例如乳酸克魯維酵母(K. lactis)、脆壁克魯維酵母(K. fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克魯維酵母(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、沃爾第克魯維酵母(K. waltii)(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)及馬克斯克魯維酵母(K. marxianus)；耶氏酵母屬(yarrowia)(EP 402,226)；畢赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌(Candida)；里氏木黴(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗厚神經胞子菌(Neurospora crassa)；施氏酵母屬(Schwanniomyce)，諸如西方施氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；及絲狀真菌，例如紅黴菌屬(Neurospora)、青黴菌屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)及麴菌屬(Aspergillus)宿主，諸如構巢麴黴(A. nidulans)及黑麴黴(A. niger)。
適用於表現經糖基化抗-PD-1抗體之宿主細胞源自多細胞生物體。無脊椎細胞之實例包括植物及昆蟲細胞，包括例如許多桿狀病毒菌株及變異體以及來自諸如以下宿主之對應容許昆蟲宿主細胞：草地黏蟲(Spodoptera frugiperda) (毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti) (蚊蟲)、白紋伊蚊(Aedes albopictus) (蚊蟲)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster) (果蠅)及家蠶(Bombyx mori) (桑蠶(silk worm))。用於轉染之各種病毒株可公開獲得，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica) NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5菌株，且此類病毒可尤其用於轉染草地黏蟲細胞。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及菸草之植物細胞培養物亦可用作宿主。
本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段亦可併入至病毒載體中，亦即將編碼抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸引入至病毒載體中且接著在用病毒感染之後表現於患者體內。
在另一態樣中，抗-PD-1抗體或其抗原結合片段之表現係在脊椎動物細胞中進行。脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中之繁殖已變成常規程序且可廣泛獲得技術。適用哺乳動物宿主細胞株之實例係經SV40轉型之猴腎臟CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)、人類胚胎腎株(經次選殖以便在懸浮培養物中生長之293或293細胞，Graham等人, 1977, J. Gen Virol. 36: 59)、幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR1 (CHO，Urlaub等人, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216；例如DG44)、小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)(TM4，Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251)、猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)、水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)、人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TR1細胞(Mather等人, 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68)、MRC 5細胞、FS4細胞、及人類肝腫瘤株(Hep G2)。
宿主細胞經用於產生抗體或其抗原結合片段的上述表現或選殖載體轉型且在適當時經調節之習知營養物培養基中培養以便誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所要序列的基因。
用以本文所描述之產生抗體或其抗原結合片段的宿主細胞可在多種培養基中培養。諸如Ham's F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.)、最低必需培養基((MEM)，(Sigma-Aldrich Co.)、RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.)及達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基((Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)，Sigma-Aldrich Co.)之可商購培養基適合於培養宿主細胞。另外，Ham等人, 1979, Meth. Enz. 58: 44；Barnes等人, 1980, Anal. Biochem. 102: 255；美國專利第4,767,704號、美國專利第4,657,866號、美國專利第4,927,762號、美國專利第4,560,655號、美國專利第5,122,469號、WO 90/103430及WO 87/00195中之一或多者中所描述的培養基中之任一者可用作用於宿主細胞之培養基。此等培養基中之任一者可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如慶大黴素)、痕量元素(定義為通常以微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源。亦可以熟習此項技術者已知之適當濃度包括其他補充劑。培養條件(諸如溫度、pH值及其類似條件)為先前用於經選擇用於表現之宿主細胞之培養條件，且對於一般熟習此項技術者而言將顯而易見。
當使用重組技術時，抗體可於細胞內、周質間隙中產生或直接分泌於培養基中。若抗體於細胞內產生，則第一步可將細胞破壞以釋放蛋白質。可例如藉由離心或超過濾移除微粒碎片，亦即宿主細胞或裂解片段。Carter等人, 1992, Bio/Technology 10:163-167描述用於分離將分泌至大腸桿菌之周質間隙的抗體之程序。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯基氟(PMSF)存在下歷時約30 min解凍細胞漿料。可藉由離心來移除細胞碎片。在抗體分泌至培養基中之情況下，通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮此類表現系統之上清液。在任何先前步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。可使用多種方法自宿主細胞分離抗體。
由細胞製備之抗體組合物可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和力層析加以純化，其中親和力層析為典型純化技術。蛋白質A作為親和配位體之適合性視抗體中存在之任何免疫球蛋白Fc域之種類及同型而定。可使用蛋白質A純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(參見例如Lindmark等人, 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13)。針對所有小鼠同型及人類γ3，推薦蛋白質G (參見例如Guss等人, 1986 EMBO J. 5:1567-1575)。連接親和配位體之基質最常為瓊脂糖，但其他基質係可用的。與瓊脂糖可達成者相比，機械穩定性基質(諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允許較快流動速率及較短處理時間。在抗體包含C
H3域之情況下，Bakerbond ABX
TM樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.)適用於純化。亦可利用其他蛋白質純化技術，諸如離子交換管柱上之分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、矽膠層析、肝素SEPHAROSE™層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱，此視欲回收的抗體而定。
在任何初步純化步驟之後，包含所關注之抗體及污染物之混合物可經歷通常在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)下執行之使用溶離緩衝液之約2.5與4.5之間的pH值下之低pH疏水性相互作用層析。
亦包括在低嚴格、中等嚴格及高嚴格條件下，尤其在如本文所定義之高嚴格條件下與由編碼抗-PD-1抗體或抗體片段之經分離聚核苷酸序列表示之所有核苷酸序列或一部分(例如，編碼可變區之部分)雜交的核酸。雜交核酸之雜交部分的長度通常為至少15 (例如20、25、30或50)個核苷酸。雜交核酸之雜交部分與編碼抗-PD-1多肽(例如重鏈或輕鏈可變區)之一部分或所有核酸的序列或其互補序列至少80%，例如至少90%、至少95%或至少98%一致。可使用本文所描述之類型之雜交核酸例如作為選殖探針、引子，例如PCR引子或診斷探針。在一個態樣中，「高嚴格條件」意謂針對長至少100個核苷酸的探針，在42℃下在5×SSPE、0.3% SDS、200微克/毫升剪切及改性的鮭魚精子DNA及50%甲醯胺中預雜交及雜交，接著進行標準南方墨點法程序12至24小時。最後在65℃下使用0.2×SSC、0.2% SDS洗滌載劑材料三次，每次15分鐘。
在一個實施例中，本發明係關於一種包含編碼重鏈可變區之核苷酸序列的經分離聚核苷酸，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 108至123中之任一者之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種包含編碼輕鏈可變區之核苷酸序列的經分離聚核苷酸，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 92至107中之任一者之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種包含編碼重鏈可變區之核苷酸序列的經分離聚核苷酸，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137或SEQ ID NO: 139中之任一者之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 136或SEQ ID NO: 138中之任一者之核苷酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種包含編碼輕鏈可變區之核苷酸序列的經分離聚核苷酸，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127或SEQ ID NO: 129中之任一者之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 126或SEQ ID NO: 128中之任一者之核苷酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種包含編碼重鏈之核苷酸序列的經分離聚核苷酸，該重鏈包含SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 153或SEQ ID NO: 155中之任一者之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 152或SEQ ID NO: 154中之任一者之核苷酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種包含編碼輕鏈之核苷酸序列的經分離聚核苷酸，該輕鏈包含SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 145或SEQ ID NO: 151中之任一者之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 144或SEQ ID NO: 150中之任一者之核苷酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種包含編碼重鏈之核苷酸序列的經分離聚核苷酸，該重鏈包含SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 161或SEQ ID NO: 163中之任一者之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 160或SEQ ID NO: 162中之任一者之核苷酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種包含編碼輕鏈之核苷酸序列的經分離聚核苷酸，該輕鏈包含SEQ ID NO: 157之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含SEQ ID NO: 156之核苷酸序列。
製品
在另一態樣中，包括含有適用於治療上文所述病症之材料的製品。製品包含容器及標籤。適合的容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器及試管。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。容器固持有效治療病狀之組合物且可具有無菌接取口。舉例而言，容器可為具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。組合物中之活性劑係抗-PD-1抗體或其抗原結合片段。容器上或與容器相關聯之標籤指示該組合物用於治療所選病狀。製品可進一步包含第二容器，該第二容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者的觀點來看合乎需要的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射器及帶有使用說明書之藥品說明書。
本發明在以下實例中進一步加以描述，其不意欲限制本發明之範疇。
實例
實例 1 ： 抗體產生 ( 免疫接種 )使MHC A型、C型、D型、E型、H型、G型菌株小鼠免疫接種有重組單體人類PD-1或人類PD-1-人類Fc-His蛋白質。此重組蛋白之基因符號為PDCD1且GeneID為5133。隨後藉由流式細胞測量術使用表現用於結合之人類PD-1抗原的CHO-人類PD-1細胞來評估血清學。在B細胞分離之前，向所選血清陽性小鼠給予最終增強免疫。所有選擇的小鼠展現出血清的陽性抗體效價。在陽性血清學下，收集脾臟細胞以用於回收抗原特異性B細胞。根據IACUC (實驗動物照護及使用委員會)批准之方案進行所有程序。
實例 2 ： 人類化抗 -PD-1 抗體之產生將小鼠前導抗體723C2轉化成由723C2之小鼠可變域及人類恆定IgG1WT、IgG1KO或IgG4Pro域組成之嵌合抗體。小鼠抗體723C2輕鏈可變區(Vκ)及重鏈可變區(VH)之序列展示於上文表1及2中。IgG4Pro具有一個防止Fab-臂交換的置換突變(Ser228Pro)。IgG1KO在鉸鏈區中具有兩個突變Leu234Ala及Leu235Ala以降低效應功能(ADCC)。產生嵌合抗體以確認抗體之功能且確保獲得校正序列。人類IgG1WT、IgG1KO及IgG4Pro形式中之嵌合723C2之序列展示於表8中。人類IgG1WT及IgG4Pro中之嵌合723C2在H-CDR3中含有DC至DY之突變。然而，人類IgG1KO中之嵌合723C2不具有突變。此位點中之突變在表8中經突出顯示。隨後經由設計及篩選製程使抗體之可變區人類化。製備其中人類及小鼠殘基以使得任何給定位置中可存在人類或小鼠殘基的方式變化的庫。針對在人類生殖系抗體與小鼠抗體之間不同的彼等胺基酸，製得此庫。僅選擇保留親本小鼠抗體之功能的純系。抗體723C2之代表性人類化可變區展示於表5及6中。
以此方式，抗體A、抗體B、抗體C、抗體D及抗體E為衍生自小鼠抗體723C2之人類化抗體(選殖入人類IgG4Pro/κ主鏈中)。抗體A、B、C、D及E展示於表7中。
實例 3 ： 抗體與重組 PD-1 蛋白質之結合A) 人類IgG4Pro主鏈中之嵌合抗-PD-1抗體結合至重組人類PD-1之動力學及親和力展示於下文中(表9)。使用ProteOn XPR36(Biorad，Hercules，CA)使用由瞬時轉染接著單一管柱純化產生之材料來量測動力學及結合親和力。
表9
B) 量測衍生自小鼠抗體723C2之人類化抗-PD-1抗體的親和力。使用ProteOn XPR36(Biorad，Hercules，CA)及全局擬合1:1結合模型所量測的動力學結合資料顯示與重組人類PD-1之相互作用介於1 nM至10 nM範圍內(表10)。亦測試抗體PD1AB-6-4P (揭示於Celgene之WO2017/058859中的IgG4Pro主鏈中之抗體)。
表10
C) 在ProteOn XPR36上量測抗-PD-1抗體結合至食蟹獼猴PD-1之親和力及動力學資料，且全局擬合1:1結合模型(表11)。亦測試抗體PD1AB-6-4P。
表11
D) 對人類PD-1之分子選擇性
在基於細胞之分析中，藉由流式細胞測量術評估抗-PD-1抗體對人類PD-1蛋白質之選擇性。將不表現人類PD-1蛋白質之親本Jurkat細胞或表現人類PD-1蛋白質之Jurkat細胞與如下所示之濃度的經AlexaFluor 647標記之抗-PD-1抗體一起培育。作為對照，將親本的且表現PD-1之Jurkat細胞與抗-TNP同型對照抗體一起培育。培育之後，洗滌細胞以移除未結合抗體，固定於PFA中，且接著於染色緩衝液中洗滌。藉由流式細胞測量術評估抗體與Jurkat細胞之結合。亦藉由流式細胞測量術評估未染色細胞，作為陰性對照。抗-PD-1抗體選擇性地結合至人類PD-1，高達至少1微莫耳，如由結合至表現人類PD-1蛋白質之Jurkat細胞的劑量依賴性抗體，且缺乏經AlexaFluor 647標記之抗-PD-1抗體與不具有PD-1表現之親本Jurkat細胞的結合指示。使用抗體C (Ab C)之代表性實驗的結果展示於圖1中。
實例 4 ： 人類 PD-1 -Fc 結合至人類 PD-L1 -Fc 之競爭結合分析人類PD-L1-Fc以60 µg /mL之濃度胺偶合於BioRad ProteOn XPR36儀器上之GLM晶片之通道1至3上；三種測試抗體(抗體C、MK-3475 (派立珠單抗)及PD1AB-6-4P)分別以30 µg /mL胺偶合於通道4、5及6上。人類PD1-Fc以25 nM之濃度注射於晶片表面上之通道1至6中。感測圖譜指示PD-L1與PD-1受體之間的特異性結合(圖2A)。將500 nM抗體C、MK-3475及PD1AB-6-4P與25 nM PD1-Fc預混合且以分析物形式注射在晶片上之所有通道中以評估個別抗體是否抑制PD-L1與PD-1之結合。如感測圖譜所表明，抗體C及PD1AB-6-4P兩者與PD-L1非競爭性結合至PD-1抗原。基於競爭分析中所觀測之非結合感測圖譜，MK-3475及PD-L1為彼此與PD-1之潛在結合阻斷劑(圖2B)。
實例 5 . 在存在抗 -PD-1 促效劑抗體之情況下 PD-L1 與 PD-1 之增強結合在人類IgG4Pro主鏈中存在PD-1促效劑抗體723C2而H-CDR3中不存在DC至DY突變的情況下，詢問PD-1/PD-L1相互作用。利用多種分析證實抗體723C2增強PD-L1與PD-1之結合。利用基於ELISA之生物化學分析評估PD-1與培養盤結合之PD-L1的結合(BPS Bioscience)。在4℃下使白色96孔微量盤塗佈有50µl含2µg /ml PD-L1之PBS隔夜。移除上清液且用由製造商BPS Bioscience (目錄號72005)提供之1×免疫緩衝液洗滌培養盤三次，接著在室溫(RT)下用阻斷緩衝液阻斷一小時。添加抗體以及相關對照物，接著在室溫下添加0.5 ng/ml (10ng)之PD-1生物素持續兩小時。用阻斷緩衝液阻斷培養盤10分鐘。將抗生蛋白鏈菌素辣根過氧化物酶二級抗體添加至洗滌培養盤中一小時，接著用PD-1分析緩衝液洗滌。將培養盤阻斷10分鐘。剛好在讀取之前將化學發光受質混合物添加至培養盤中。在光度計(Envision)上或在能夠讀取化學發光之微量滴定盤上讀取化學發光信號。
如與同型對照物處理之樣品相比，化學發光信號增加所指示，在存在抗體723C2的情況下觀測到PD-1與PD-L1之相互作用增強(圖3A)。抗體723C2在圖3A中指定為723C2-4P。此與MK3475 (阻斷PD-L1 - PD-1相互作用之已知抗-PD-1拮抗劑抗體)形成對比。在此分析中，抗體PD1AB-6-4P顯示PD-1-PD-L1之增強有限(圖3A)。
利用基於細胞之分析證實基於ELISA之結果，從而表明PD-1/PD-L1相互作用在存在抗體723C2的情況下增強。在此處，藉由用DELFIA (解離增強之鑭系元素螢光免疫分析)受體-配位體結合分析(Perkin Elmer)量測可溶性PD-1與過度表現PD-1之CHO細胞之結合來評估PD-1/PD-L1之相互作用。
接種10,000個細胞且在37℃ + 5% CO2培育箱(含濕氣培育箱)中培育隔夜。將生物素標記之PD-L1 EC 10 (130nM)及10µl PD-1抗體添加至各孔中且在室溫下培育1小時。用50µl之1×TRF洗滌緩衝液洗滌培養盤兩次。將20µL之Eu-抗生蛋白鏈菌素試劑添加至分析盤中，且在室溫下培育一小時。添加增強溶液且在室溫下培育30分鐘。在螢光盤讀取器(激發：320或340 nm，發射：615 nm)上讀取培養盤。在此分析中且在ELISA分析之證實中，此基於細胞之分析中存在抗體723C2使PD-1/PD-L1相互作用增強(圖3B)。抗體723C2在圖3B中指定為723C2-4P。
亦利用其中PD-1表現於CHO細胞上之第二種基於細胞之分析來評估PD-1/PD-L1相互作用。在此分析中，藉由流式細胞測量術量測結合至表現PD-1之CHO細胞的PD-L1-多聚體。將50µl之2 × 10
6個細胞/毫升添加至各孔中(100,000個細胞/孔)。將細胞離心且再懸浮於50µl之指定抗體濃度中且在冰上培育60分鐘。將PDL1-生物素及抗生蛋白鏈菌素-APC合併於染色緩衝液中(1µg/ml PDL1-生物素+0.25µg/ml抗生蛋白鏈菌素-APC)。添加50µl之2×PDL1-生物素/抗生蛋白鏈菌素-APC混合物至細胞中且在冰上培育60分鐘。將細胞洗滌且再懸浮於180µl染色緩衝液+20µ PFA中且在BD LSR II上獲取資料。如圖3C中所指示，此基於細胞之分析亦顯示在存在抗體723C2的情況下PD-L1與PD-1之結合增強。抗體-6-4P對PD-L1結合不具有作用，而MK3475拮抗劑抗體抑制PD-L1與PD-1之結合(圖3C)。抗體723C2在圖3C中指定為723C2-4P。
亦用抗體C、抗體PD1AB-6-4P、抗體1-4Pro、抗體PD1B1090-4Pro、抗體PD1B1094-4Pro及抗體ANB-030-4Pro進行如上文所描述之CHO PD-1-PD-L1 Delphia-Eu TRF分析。抗體1-4Pro在IgG4-Pro主鏈中包含Eli Lilly之WO2019/168745中所描述的抗體1之重鏈及輕鏈可變區。抗體PD1B1090-4Pro及抗體PD1B1094-4Pro在IgG4-Pro主鏈中包含Janssen Biotech之WO2018/226580中所描述的PD1B1090及PD1B1094各別之重鏈及輕鏈可變區。抗體ANB-030-4Pro在IgG4-Pro主鏈中包含在CAS編號CAS 2412764-40-8下描述的抗體ANB-030之重鏈及輕鏈可變區(亦對應於Anaptysbio之WO2020/247648中所描述的APE12537之重鏈及輕鏈可變區)。亦包括IgG4-Pro主鏈中之抗-TNP抗體。
抗體C展示PD-1\PDL-1結合以濃度依賴性方式恆定(N=3)增強(圖3D)。所有其他抗-PD-1促效劑始終展示PD-1\PDL-1結合未增強(圖3D)。
實例 6 ： 功能性細胞分析 ， 抑制 THP-1/Jurkat-PD-1 促效劑報導子分析中之 NFAT 活化研發THP-1/Jurkat PD1 NFAT共培養分析以評估由多次活動產生之抗-PD1抗體的促效劑活性。THP-1細胞株係獲自ATCC。內部產生Jurkat報導子細胞株。Jurkat報導子細胞在細胞表面上過度表現人類PD-1 (hPD-1)且亦表現NFAT-驅動螢光素酶報導子以量測細胞回應於刺激之活化狀態。在存在THP-1細胞的情況下用CD3 × CD33 BiTE活化Jurkat PD1 NFAT細胞。BiTE之抗-CD33臂結合THP-1細胞上表現之CD33，而抗-CD3臂結合Jurkat細胞上之CD3分子。BiTE用以接合THP-1及Jurkat細胞，從而在兩種細胞之間形成免疫突觸同時使Jurkat細胞活化。經由NFAT驅動螢光素酶報導子量測Jurkat PD-1 NFAT細胞之活化。此分析係在存在抗-PD1抗體的情況下運行以鑑別促效劑抗體。如由螢光素酶信號損失所指示，展現20%或更大的活化減少之分子歸類為促效劑抗體(表12)。表12中之抗-PD-1抗體306E6至820C3係在小鼠IgG1主鏈上。選擇若干此等抗體以對人類IgG4Pro主鏈進行額外型態分析(表示為表12中之嵌合抗體)。
表12
實例 7 ： 功能性細胞分析 - 抑制人類 PD-1 基因敲入脾細胞之 IFNγ 產生用以選擇靠前的抗-PD1抗體之初級細胞分析為hPD1基因敲入小鼠脾細胞分析。自表現人類PD1而非小鼠PD1之C57BL/6小鼠收集脾臟。自脾臟分離脾細胞且用濃度為0.1 µg/ml之抗-CD3 (純系2C11)活化。48小時之後藉由MSD分析(Meso Scale Discovery)定量mIFNγ含量來量測T細胞活化。在存在選自THP-1/Jurkat PD1 NFAT篩選分析之抗-PD1抗體的情況下運行分析。基於mIFNγ之抑制% (50%或更大)及序列分枝系選擇自此分析鑑別出之靠前的分子。抑制及IC50值展示於表13中。
表13
實例 8 ： 功能性細胞分析 ， 抑制人類 PBMC 分析之 IFNγ 產生如藉由在人類初級細胞分析中之IFNγ產生所量測，進一步表徵抗-PD-1促效劑抗體調節T細胞功能活性之能力。自人類全血分離PBMC且用1.5pM之抗-CD3 (純系OKT3，BioLegend)活化。72小時之後藉由MSD分析定量hIFNγ含量來評估T細胞活化及功能。與同型對照處理之細胞相比，所鑑別之抗-PD-1促效劑抗體能夠減少IFNγ分泌(表14A)。
表14A
亦在此分析中測試抗體C、抗體1-4Pro、抗體PD1B1090-4Pro、抗體PD1B1094-4Pro、抗體ANB-030-4Pro及阿巴西普(abatacept)。結果展示於表14B中。亦在此分析中測試抗體C，抗體1-4Pro、抗體PD1B1090-4Pro、抗體PD1B1094-4Pro及抗體ANB-030-4Pro於IgG1野生型主鏈及IgG1 KO主鏈中之可變區，以及阿巴西普。結果展示於以下概述之表14C中。在各實驗中，測試五個供體。
表14B
表14C
抗體1-4Pro、抗體PD1B1090-4Pro、抗體PD1B1094-4Pro及抗體ANB-030-4Pro於IgG1 KO主鏈中之可變區的IFNγ抑制小於40%，其中IC
50值高於30nM。
實例 9 ： 功能性細胞分析 ， 抑制 Th17- 單核球共培養分析之 IL-17A 產生測試抗-PD-1促效劑抗體對Th17分化T細胞之IL-17分泌的功能性抑制。研發初級細胞共培養分析以評估藉由PD-1調節IL-17。自PBMC分離之人類初級T細胞在以下偏斜條件下經Th17分化：在Th17偏斜培養基(X-VIVO15培養基+IL-1β (10 ng/mL)、IL-23 (10 ng/mL)、IL-6 (10 ng/mL)、IL-2 (2 ng/mL)、TGFβ (0.5 ng/mL)、5 µg/mL抗-IL4、5 µg/mL抗-IFNγ)中用0.5 µg/ml培養盤結合之抗-CD3 (純系UCHT1)刺激CD4 T細胞4天。4天之後，自抗-CD3塗佈之培養盤移除細胞且轉移至含有Th17偏斜培養基之燒瓶中。接著分化，將Th17細胞靜置至少3天，隨後與自體單核球共培養且用40 fM 抗-CD3 (純系OKT3)在存在PD-1抗體的情況下再刺激。由於抗-PD-1抗體展現促效劑活性所必需之Fc要求，需要共培養系統。在此分析中在存在抗-PD-1促效劑抗體的情況下觀測到IL-17之抑制。抗體IC
50及IL-17反應之最大抑制展示於下表中(表15)。相對於同型對照抗體比較最大抑制。
表15
實例 10 ： 功能性細胞分析 ， 抑制 Tfh- 單核球共培養分析之 IL-21 產生研發一種評估抗-PD-1促效劑抗體抑制T濾泡輔助(Tfh)細胞活體外活性之能力的分析。CD4 T細胞及自體單核球係獲自ALLCELLS。T 藉由用Dynabeads人類T-活化劑CD3/CD28 (Gibco)在存在IL-23 (25 ng/ml)及TGFβ (5 ng/ml)的情況下活化細胞5天而使該等細胞偏向Tfh譜系，且接著在洗滌細胞且移除活化珠粒之後，在存在4.5 pM抗-CD3 (純系OKT3，BioLegend)及抗-PD-1促效劑抗體的情況下與自體單核球合併。24小時後，收集上清液且分析IL-21之存在(Meso Scale Discovery，MSD V-Plex人類IL-21套組)。藉由抗-PD-1促效劑抗體抑制經再刺激Tfh分化細胞之IL-21產生。代表性IC50及Emax抑制值展示於表16中。
表16
實例 11 ： FcgR 相互作用對 PD-1 促效劑活性之作用藉由利用不同主鏈形式(IgG1野生型、IgG1 KO或IgG4 Pro)之候選抗PD-1促效劑抗體或二價抗體片段(F(ab')2片段)表徵Fc-Fcg受體相互作用對促效劑抗體之功能活性的作用。藉由上文所描述之人類PBMC分析中調節活化T細胞之IFNγ產生的能力評估抗體變異體之功能活性。如藉由IFNg產生減少所量測，親本723C2及820C3抗體之二價F(ab')2片段的功能促效劑活性損失(圖4A及4B)。相比之下，人類IgG4Pro主鏈中之全長抗體以劑量依賴性方式抑制IFNγ產生(圖4A及4B，各別地指定為723C2-4P及820C3-4P)。在此等分析中，自全血分離人類PBMC且用1.5 pM之抗-CD3純系OKT3在存在抗-PD-1抗體或所指定抗-PD-1抗體之F(ab')2片段的情況下活化。72小時之後，藉由MSD分析量測上清液中之人類IFNγ細胞介素含量。
由於此表明抗-PD-1抗體之功能促效劑活性需要Fc相互作用，723C2抗體產生於IgG1WT、IgG1KO及IgG4Pro主鏈上以進一步表徵此等相互作用(各別地723-IgG1WT 723-IgG1KO及723-IgG4Pro，於下表17中)。IgG1 WT及IgG4 Pro均結合至人類Fc受體達至不同程度，而IgG1 KO主鏈極大地減少與Fc受體之結合。IgG4 Pro上之抗-PD-1促效劑抗體展現人類PBMC分析中IFNγ之最高程度抑制，而IgG1 KO上之抗體展現極大地減少活性(表17)。總體而言，此等資料指示抗-PD-1抗體之功能性促效作用取決於Fc相互作用。
表17
實例 12 ： 活體內模型 - 異種 CD4
+T
細胞 GvHD 模型活體內異種CD4
+T細胞GvHD小鼠模型用以測試PD-1促效劑抗體之功效。每組八隻NSG小鼠(NOD.
Cg-Prkdc
scidIl2rg
tm1Wjl /SzJ，The Jackson Laboratory)經IV注射來自健康供體leukopak之5×10
6個CD4
+T細胞(藉由陰性選擇純化)。根據以下每週以0.625 mg/kg IP向小鼠給藥兩次；第1組：723 (IgG4-Pro)，第2組：PD1AB-6-4P (IgG4-Pro)，第3組：抗-TNP同種型(IgG4-Pro)，第4組：阿維魯單抗(hIgG1-LALAPG)，第5組：抗-TNP同種型(hIgG1-LALAPG)，第6組：CTLA4-Ig (hIgG1-LALA)。TNP為三硝基苯酚。LALA表示常用於破壞抗體效應功能之Leu234Ala/Leu235Ala突變。PG表示Pro329Gly突變，其藉由預防與Fcγ受體結合而消除效應功能。
運行三個實驗重複，各自具有單獨的供體。在第四週，相比於所有測試供體之同種型匹配對照，在第1組、第2組及第6組中注意到人類細胞累積之顯著抑制(表18)。在第四週，細胞介素之定量展示所有供體中人類IFNγ、TNFα及IL-10之含量的顯著減少(表19)。亦測試人類IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12p70及IL-13，但全部低於分析之偵測極限。
表18：人類CD45+細胞累積
表19：人類血漿細胞介素產生
實例 13 ： 食蟹獼猴之藥物動力學研究在中國來源之雄性食蟹獼猴中單次靜脈內(IV)推注劑量0.1、0.3及1.5 mg/kg或皮下(SC)劑量1.5 mg/kg (n=3/組)之後，評估抗體C之藥物動力學(PK)。使用兩種不同的MSD免疫分析形式確定抗體C之血清濃度：(1)「總」藥物通用抗人類捕獲及偵測分析及(2)具有抗原(PD1-ECD)捕獲及抗人類偵測之「游離」藥物分析。兩種分析之PK概況可重疊，表明內源性sPD-1不干擾抗體C之量測且對TMDD幾乎無影響。抗體C展現出劑量依賴性CL (使用游離及「總」分析)，在0.1與0.3 mg/kg之間表明目標介導之藥物處置(TMDD)對總體清除率之貢獻。各別劑量中之每一者之NCA藥物動力學參數的概述展示於下表20中。
表20
實例 14 ： CHO 細胞中之 轉染及產生以及生物物理學資料CHO細胞中之轉染及產生：
CHO-E細胞以約2×10E6個細胞/毫升在Irvine BalanCD Transfectory CHO + 4mM L-麩醯胺酸(或Glutamax)中轉染。1L轉染所需的量為0.15mg HC DNA加0.3mg LC DNA及1.05mg填充劑DNA (鯡魚精子)及0.15 mg XBP1 DNA。將DNA稀釋於100mL OptiPro SFM中且經由0.2 µm過濾器進行無菌過濾。將0.75mL Mirus TransIT Pro轉染劑添加至經稀釋之DNA混合物中且立即將DNA複合物添加至製備的CHO-E細胞中，且將搖瓶返回至140 rpm的37℃、5% CO2振盪器。轉染後24小時，將溫度轉變為32℃，將2mL之Gibco抗凝集劑及100ml Irvine Transfectory補充劑添加至經轉染的細胞中。轉染後五天，將振盪器溫度轉變為30℃。視葡萄糖含量下降在2 g/L至1g/L之間的時候而定，在第5天或第7天添加200mL之Irvine Transfectory補充劑。將經傳染之培養物保持10天。藉由使細胞短暫離心進行採集，接著經由0.2 µm PES過濾器(Thermo Scientific)進行無菌過濾。
採集之後，藉由具有蛋白質A生物感測器之ForteBio/Pall Octet Red 96儀器如下取樣澄清的細胞培養上清液以用於效價。
抗體A、抗體C及抗體E之效價係在18至38 mg/L之間，其中自蛋白質純化中回收約80%，且在SEC純化之後回收大於98%單體。蛋白質經緩衝液更換於含有10mM 組胺酸-HCl，pH 6.0之最終緩衝液中且在4℃下穩定至少4個月且在此緩衝液中之溶解性高達180 mg/ml。
表21
表22
AUC：如藉由在0.5至1 mg/ml之濃度下之沈降速度法所量測之分析型超速離心；SEC：尺寸排阻層析；%M：單體百分比。
實例 15 ： 雙特異性抗體 材料及方法 小鼠抗體及試劑。抗-hPD1 (EH12.2H7) (Biolegend，329912)；抗-hCD48 (Bio-gems，10511 -25-500)；來自eBiosciences的IgG1 (目錄號16-4714-85)、抗-hCD3 (OKT3) (16-0037-85)、抗-hCD3 (UCHT1) (16-0038-85)及抗-CD11a (140011982)；抗-hCD71 (Southern Biotech，9670-14)。aCD3/aCD28人類T細胞活化劑Dynabeads(Gibco，11131D)
Imagestream 。將Jurkat PD-1細胞與AF-488霍亂毒素(Life Technologies，V-34403)及交聯抗體(Jackson ImmunoResearch)及APC aCD3 (Biolegend，317318)、PV786 aPD-1 (Biolegend，329930)或APC aCD48 (Sigma，SAB4700193)在冰上之XVIVO 15培養基(Lonza)中培育10分鐘。細胞藉由轉移至預溫熱X-VIVO 15中而活化且使其培育額外12分鐘。藉由添加冷PBS-2% PFA (大致1:10比率，細胞:PFA)停止細胞活化，且將細胞在冰上之固定溶液中培育20分鐘。將細胞洗滌且再懸浮於XVIVO中別使用Imagestream軟體分析端帽形成及周長臨限值。
流式細胞測量術 。將1×10
5個Jurkat、Jurkat-PD-1或aCD3/aCD28刺激之初級人類T細胞與1mg/ml之初級mAb在4℃下培育1小時，或在測試雙特異性分子的情況下，自6.25 mg/ml之起始濃度及連續稀釋1:4產生8-點結合曲線。將細胞洗滌且在4℃下用各別地1:100稀釋之PE-抗-小鼠Ig (Life Technologies，P852)或1:800稀釋之PE-山羊抗人類F(ab')
2(Invitrogen AHI1707)染色1小時。將樣品洗滌，固定於1×固定/裂解緩衝液(eBioscience，00-5333-57)中且在LSR2 (BD)上進行分析
PD-1 補充分析。過度表現全長PD-1-PK及胞內全長SHP1-EA融合蛋白質之2×10
4個Jurkat T細胞係購自DiscoverX (DRX-BI-080515A)且根據製造商說明進行培養。將細胞再懸浮於細胞接種培養基(DiscoverX，93-0563R4B)中，且與初級小鼠或人類抗體在4℃下一起預培育30 min。根據實驗，另外將細胞與10 mM之泛Src激酶抑制劑PP2 (Abcam，ab120308)或失活類似物PP3 (Abcam，ab120617)一起預培育。將細胞洗滌且用或不用交聯二級山羊抗-小鼠IgG (Thermo Scientific，31170)處理。將細胞轉移至384-白色Opti-培養盤(PerkinElmer)，接受快速偵測試劑(DiscoverX，93-0247)，且在EnVision盤讀取器(Perkin Elmer)上讀取。
初級 huT 細胞活化 。用500 nM Cell Trace Violet (Life Technologies，目錄號c34557)標記初級人類Pan-T細胞(AllCells，PB009-1F)。根據製造商說明書，使Epoxy-dynabeads M450 (Invitrogen，14011)共價塗佈有2.5 mg之小鼠Ab/10
7個珠粒。使細胞不受刺激或用培養盤結合之抗-CD3 (UCHT1) (250及500 ng/mL)在存在Ab塗佈之環氧基珠粒的情況下刺激。在96h後採集細胞，用BV510 抗CD4 (BD，562970)及PeCy7抗-CD8 (BD，335787) Ab染色，且藉由含Cell Trace Violet稀釋液之LSR2 (BD)分析細胞增殖。初級記憶CD4
+/CD45RO
+T細胞(AllCells，PB009-7F)分別用1毫克/孔的培養盤結合之抗-CD3 (UCHT1)在存在1毫克/孔的培養盤結合之同型對照(ISO)或BsAb的情況下刺激。在72 h時採集培養物上清液且分析IL-2及IL-10分泌(MSD)。
BsAb 產生及構築體設計。由公開的用作建構嵌段的之抗-CD48 (US2012/0076790)及抗-PD1 (WO 2011/110621Al)序列產生雙特異性抗體(BsAb)。用杵-臼技術設計雙特異性構築體以便於兩個不同目標可變區(IgG1-KO)之異二聚化以產生含有抗-PD-1及抗-CD48 (PD-1/CD48)，或抗-PD-1及抗-TNP作為對照(PD-1/ISO)的BsAb (圖7A)。針對各別目標獲得之可變區序列經選殖入含有人類恆定區之pTT-5 (已由加拿大國家研究委員會授權)表現載體中。簡言之，可變區胺基酸序列經密碼子優化用於哺乳動物表現。目標V-基因之輕鏈及重鏈經選殖入含有接合連接子區段之相同表現載體中。藉由限制酶消化使用EcoRI及NheI識別位點來使載體線性化。可變區之DNA序列經整合DNA技術(IDTDNA)定序為G-嵌段(dsDNA)，與載體及鄰接連接子區段具有重疊的同源末端。隨後根據製造商之方案經由Gibson組裝方法(NEBuilder HiFi套組，New England Biolabs，目錄號E5510S)接合G-嵌段。隨後藉由將組裝混合物轉換至勝任細胞(NEB 5-α C2987，New England Biolabs)中，且接著在37℃下於具有100µg/ml卡本西林(carbenicillin) (Teknova)之LB瓊脂盤上生長隔夜來完成傳統的選殖。揀取個別集落且在37℃下於具有卡本西林之LB培養基中生長隔夜。藉由使用Lasergene軟體包(DNAstar)進行序列分析證實插入物之陽性純系。序列證實之質體DNA在0.5L培養物中按比例增加且接著根據製造商之方案經由Plasmid Plus megaprep套組(Qiagen，目錄號12981)純化。
CHO-E 瞬時轉染 。將CHO-E細胞以2e6個細胞/毫升於補充有2mM麩醯胺酸之FS-CHO中進行轉染。對於1L mAb轉染量，將1mg輕鏈(LC)質體DNA及0.5mg重鏈(HC)質體DNA稀釋於100mL之OptiPro SFM (Gibco)中且經由0.2 µm過濾器(Millipore)進行無菌過濾。添加1.5mL之TransIT Pro (Mirus Bio LLC)轉染劑且使其在室溫下培育15-30分鐘。隨後將複合物添加至製備的CHO-E細胞中，且將搖瓶返回至振盪器中。轉染後24小時，將10mL之抗凝集劑及150mL之CHO CD有效饋料B(均來自Gibco)添加至經轉染的細胞中且將溫度轉變為32℃。將經傳染之培養物保持6至12天且在整個培養期間常規地監測細胞生長、存活率及營養物消耗。藉由在4℃下以4700rpm離心，接著進行無菌過濾來完成培養物採集。
BsAb 純化 。將採集之培養物上清液以1.0ml/min負載於來自GE (目錄號11003493)之用緩衝液A (DPBS，pH7.2)預平衡的1ml HiTrap MabSelect SuRe管柱上。用10ml緩衝液A、緩衝液B (DPBS加1.0 M NaCl)中之每一者且再用緩衝液A以1ml/min洗滌管柱。隨後，用30mM乙酸鈉，pH3.5溶離結合之蛋白質。用1%體積比體積之3M乙酸鈉，pH約9中和5ml溶離份。在蛋白質A溶離之後，最終緩衝液為60mM NaOAc，pH約5。藉由aSEC，對於PD1/ISO之單體百分比為71%，且對於PD1/CD48之單體百分比為63%。
進一步精製經MabSelect Sure純化之材料以藉由陽離子交換移除聚集物。使用來自Thermo Fisher (目錄號4481316)之Poros GoPure HS預裝填的管柱進行離子交換。將蛋白質A樣品負載於用緩衝液A (60mM NaOAc，pH 5.0)預平衡之1ml Poros HS管柱上且用10管柱體積之緩衝液A洗滌管柱。隨後用20管柱體積的0%至40%梯度之緩衝液B (60mM NaOA，1 M NaCl，pH 5.0)以0.5 ml/min溶離結合之蛋白質。合併峰周圍之溶離份且將鹽濃度調節至100mM NaCl。用過濾單元對樣品進行無菌過濾，量測蛋白質濃度，測定內毒素含量且運行SDS-PAGE以及aSEC。
NFAT 螢光素酶分析。內部產生Jurkat PD-1 NFAT報導子細胞株。將來自GeneCopoeia (EX-B0169-M02)之人類PD-1選殖入載體中，該載體經由電穿孔轉染至Jurkat細胞(ATCC)中。隨後經由電穿孔將NFAT螢光素酶報導子(Promega E8481)轉染至表現PD-1之純系中。THP-1細胞株購自ATCC (TIB-202)且根據製造商說明書進行培養。
將Jurkat PD-1及NFAT報導子細胞再懸浮於分析培養基(RPMI，2% HI-FBS)中，且將3×10
4個細胞/條件與一定劑量之BsAb (起始濃度為100 nM且1:3稀釋)在384平底Opti-培養盤中一起預培育15 min。添加THP-1細胞(3×10
4個細胞/條件)，且在37℃下用10 nM aCD3 × aCD33活化劑溶液刺激細胞6h。藉由添加Steady-Glo®螢光素酶分析試劑形式15 min (Promega，E2520)分析NFAT報導子且在EnVision盤讀取器中進行讀取。
結果 CD48 及 PD-1 交聯增強 PD-1 磷酸化 。CD48為小鼠及人類淋巴球中公認的脂質筏及IS常駐蛋白(Elishmereni及Levi-Schaffer，2011)。為更佳的限定脂質筏中之CD48的存在及豐度相對於PD-1及CD3之存在及豐度，吾等實施ImageStream實驗以在單細胞層級上定量此等受體與霍亂毒素(CT)誘導之脂質筏聚結(端帽)在過度表現PD-1之Jurkat細胞中之共定位。使用螢光團標記之MAb進行對CD48、CD3及PD-1於由CT誘導之脂質筏帽內之共定位的分析。此分析顯示，不同於PD-1，容易在CT誘導之端帽內觀測到CD3及CD48。其中較小周長值與加帽相關的周長定量揭示，在活化之後CD48之端帽顯而易見，但比CD3略微不豐富。相比之下，PD-1通常不與CT共定位，與PD-1需要主動過程(例如，與PDL-1相互作用)以便募集至脂質筏富集之IS的假設一致(Yokosuka等人，2012)。
CD48存在於脂質筏中且與Src激酶(T細胞中之Lck)組成性締合，使得吾等假設，類似於CD3，CD48近似於PD-1將誘導PD-1活化/磷酸化，因為PD-1活化之正準機制需要Lck介導之PD-1的胞內ITSM及ITIM域磷酸化(Chemnitz等人, 2004；Parry等人, 2005；Sheppard等人, 2004)。為了測試此假設，產生定製Jurkat細胞株以表現具有一半b-半乳糖(PK)之人類PD-1融合蛋白，及具有一半互補b-半乳糖(EA)之胞溶質全長SHP1融合蛋白。由於SHP1募集至產生功能性b-半乳糖之磷酸化PD1，由此依據PK/EA募集量測PD-1活化。在此等細胞中確認PD-1、CD48及CD3之表現之後，設定實驗以評估MAb抗CD48以在交聯後誘導PD-1活化之潛能(圖5)。在不存在PD-1 MAb或Fc特異性二級F(ab')2抗體的情況下，不誘導PD-1活化。與二級抗體交聯誘導PD-1活化約3倍；然而，在存在CD48或CD3 Mab的情況下，PD-1活化增強約9倍，從而表明CD48或CD3與PD-1之緊密締合可增強PD-1活化。由自交聯誘導之低水準PD-1活化係出人意料的，因為研究已證實，小部分Lck與T細胞中之PD-1組成性締合(Sheppard等人, 2004)。
PD-1 之 CD48- 依賴性活化需要 Src- 激酶活性。為判定藉由CD48增強PD-1活化/磷酸化是否取決於Src激酶活性，在存在泛Src激酶抑制劑PP2或失活類似物PP3的情況下實施交聯實驗。Src-激酶抑制在自交聯或與CD48共交聯後消除PD-1活化，從而表明PD-1活化需要Lck活性。為進一步驗證此概念，藉由在存在抗CD71 (一種不遷移至脂質筏或不與Src-激酶締合之受體)之抗體的情況下使PD-1與次佳量之抗-PD-1交聯來評估PD-1活化(Schatzlmaier等人, 2015)。PD-1與CD71之交聯並不引起PD-1活化，從而支持PD-1易位至富含活化Src激酶之環境中能夠使得PD-1磷酸化及活化的發現。
CD48 依賴性 PD-1 活化使 AR 誘導之初級人類 T 細胞增殖鈍化。為在功能上評估CD48依賴性PD-1活化調節T細胞功能之能力，使磁性珠粒共價地共塗佈有CD48、PD-1 MAb及同型對照，且在用培養盤結合之抗-CD3刺激的初級人類T細胞(CD4+及CD8+)上測試。首先，吾等證實CD48及PD-1在預活化之人類CD4
+及CD8
+T淋巴球中之表現。為評估經塗佈珠粒對細胞活化之作用，人類泛T細胞用CellTrace-Violet標記，隨後用CD3 MAb活化，且藉由CellTrace之稀釋分析細胞增殖(圖6)。如圖6中所示，相對於用單獨塗佈有CD48或PD-1 MAb之珠粒處理的細胞，共塗佈有CD48及PD-1 MAb兩者之珠粒能夠顯著地減少T細胞增殖，且對CD4
+之抑制作用比CD8
+細胞更顯著。作為額外對照，吾等亦測試共塗佈有PD-1及CD11a Mab之珠粒；在假定CD11a不為組成性脂質筏常駐蛋白質時選擇後者。如所預期，PD-1在與CD11a共募集時不具有抑制功能。此等結果進一步支持藉由脂質筏常駐分子(亦即，CD48)之PD-1活化可有效地活化PD-1以抑制T細胞擴增的假設。
針對 PD-1 及 CD48 之 雙特異性抗體誘導 PD-1 活化以調節 AR 刺激之人類 T 細胞中的細胞介素分泌及 NFAT 活化。使用各別單株抗體塗佈之珠粒獲得的結果提示吾等產生雙特異性抗體(BsAb)以便測試PD-1與CD48之分子定位將提供活化人類T細胞上之抑制信號的假設(圖7)。產生公開之抗體(來自專利申請案WO 2011/110621Al之促效性抗-PD-1抗體)，且來自US2012/0076790之抗-CD48 Ab及BsAb經工程改造為杵或臼單重/輕鏈構築體以產生含有抗-PD-1及抗-CD48 (PD-1/CD48)，或抗-PD-1及抗-TNP作為對照(PD-1/ISO)之BsAb (圖7A)。藉由在過度表現PD-1之Jurkat細胞上進行流式細胞測量術以便偵測PD-1及CD48結合，或在缺乏PD-1表現之Jurkat細胞上進行流式細胞測量術以偵測僅CD48結合來展現各臂與PD-1或CD48之結合(圖7B)。使用上文所描述之Jurkat PD-1補充分析系統，吾等證實PD-1/CD48 BsAb相比於PD-1/ISO對照組約3倍更強效的誘導PD-1活化，從而證實使用此BsAb形式之PD-1/CD48共定位亦使得PD-1磷酸化增強(圖6)。為評估PD-1/CD48 BsAb之功能性效應，人類記憶CD4+ T (PD1
+)細胞用培養盤結合之抗-CD3e在存在培養盤結合之PD-1/CD48 BsAb或對照抗體的情況下刺激，且分析細胞介素分泌(圖7C)。此分析揭示PD-1/CD48 BsAb之免疫調節效應，因為其顯著減少促發炎細胞介素IL2之分泌，但增強抗炎細胞介素IL-10之產生。由於IL-2分泌需要NFAT轉錄活化(Chow等人, 1999)，在表現PD-1及NFAT-螢光素酶報導子之Jurkat T細胞中評估PD-1/CD48 BsAb對NFAT活化之作用，且用抗-CD3e在存在用於共刺激之THP-1細胞的情況下進行活化。此分析展示相比於對照抗體，PD-1/CD48 BsAb能夠減少NFAT報導子＞10%至30%，且指示PD-1之CD48依賴性活化亦抑制導致IL-2產生之關鍵T細胞效應子轉錄事件。
| 抗體 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(nM) |
| 嵌合306E6 | 1.36E+05 | 7.65E-03 | 56.4 |
| 嵌合307A3 | 1.16E+05 | 7.40E-03 | 63.5 |
| 嵌合313C12 | 6.71E+04 | 5.77E-05 | 0.859 |
| 嵌合414A12 | 1.80E+05 | 2.69E-04 | 1.50 |
| 嵌合502H1 | 5.47E+04 | 3.49E-04 | 6.39 |
| 嵌合701C1 | 2.34E+04 | 3.05E-04 | 13.0 |
| 嵌合701E9 | 8.83E+04 | 1.43E-04 | 1.62 |
| 嵌合703D10 | 3.46E+04 | 3.29E-04 | 9.49 |
| 嵌合708E4 | 4.31E+04 | 3.48E-04 | 8.08 |
| 嵌合709A6 | 8.74E+04 | 4.83E-04 | 5.52 |
| 嵌合718C2 | 2.84E+04 | 1.13E-04 | 3.98 |
| 嵌合723C2 | 2.26E+05 | 5.82E-04 | 2.58 |
| 嵌合803E6 | 1.06E+05 | 5.30E-04 | 5.02 |
| 嵌合811G3 | 8.77E+04 | 8.01E-04 | 9.14 |
| 嵌合814E10 | 8.07E+04 | 1.49E-04 | 1.85 |
| 嵌合820C3 | 1.06E+04 | 2.86E-04 | 2.71 |
| ka (1/Ms) | kd (1/s) | KD (nM) | |
| IgG4Pro中之嵌合723C2 | 2.26E+05 | 5.82E-04 | 2.58 |
| 抗體A | 1.59E+05 | 4.34E-04 | 2.73 |
| 抗體B | 2.59E+05 | 4.21E-04 | 1.62 |
| 抗體C | 1.75E+05 | 4.63E-04 | 2.65 |
| 抗體D | 2.22E+05 | 5.74E-04 | 2.58 |
| 抗體E | 1.78E+05 | 4.92E-04 | 2.77 |
| PD1AB-6-4P | 2.10E+05 | 4.60E-03 | 22.0 |
| 抗體 | ka (1/Ms) | kd (1/s) | KD (nM) |
| IgG4Pro中之嵌合723C2 | 1.85E+05 | 7.21E-03 | 38.9 |
| 抗體A | 1.78E+05 | 4.73E-03 | 26.5 |
| 抗體B | 1.69E+05 | 5.58E-03 | 32.9 |
| 抗體C | 1.54E+05 | 6.33E-03 | 41.0 |
| 抗體D | 1.49E+05 | 6.74E-03 | 45.2 |
| 抗體E | 1.73eE+05 | 6.63E-03 | 38.2 |
| PD1AB-6-4P | NA | NA | 25.0 |
| 抗體 | IC 50 值(nM) ，NFAT 活性之抑制 | Emax 值(%) ，NFAT 活性之抑制 |
| 306E6 | 1.14 | 45.5 |
| 307A3 | 1.03 | 42.6 |
| 313C12 | 0.37 | 42.2 |
| 414A12 | 0.39 | 45.0 |
| 502H1 | 0.34 | 48.9 |
| 701C1 | 1.69 | 53.2 |
| 701E9 | 0.22 | 46.0 |
| 703D10 | 10.9 | 47.4 |
| 708E4 | 0.17 | 48.7 |
| 709A6 | 0.04 | 29.8 |
| 718C2 | 0.82 | 50.8 |
| 723C2 | 0.14 | 43.7 |
| 803E6 | 0.38 | 48.3 |
| 811G3 | 0.14 | 44.5 |
| 814E10 | 0.25 | 40.7 |
| 820C3 | 0.14 | 48.7 |
| 嵌合718C2 | 0.38 | 44.4 |
| 嵌合703D10 | 0.39 | 41.9 |
| 嵌合723C2 | 0.13 | 42.6 |
| 嵌合820C3 | 0.14 | 40.0 |
| 抗體 | IC 50 值(pM) ，IFNγ 之平均抑制 | Emax 值(%) ，IFNγ 之平均抑制 |
| 306E6 | 22 | 19.5 |
| 703D10 | 3205 | 65 |
| 313C12 | 459 | 79 |
| 718C2 | 995 | 64.5 |
| 814E10 | 74.2 | 63 |
| 708E4 | 915 | 73.5 |
| 723C2 | 121.5 | 74 |
| 820C3 | 205 | 82 |
| 抗體 | IC 50 值(pM) ，IFNγ 之幾何平均抑制 | Emax 值(%) ，IFNγ 之平均抑制 |
| IgG4Pro中之嵌合723C2 | 18.0 | 66.5 |
| IgG4Pro中之嵌合820C3 | 38.5 | 56.7 |
| 抗體A | 7.4 | 49.0 |
| 抗體B | 18.4 | 48.9 |
| 抗體C | 17.7 | 46.8 |
| 抗體D | 18.0 | 50.1 |
| 抗體E | 8.1 | 47.8 |
| PD1AB-6-4P | 31.5 | 40.1 |
| 抗體 | IC 50 值(nM) ，IFNγ 之幾何平均抑制 | Emax 值(%) ，IFNγ 之平均抑制 |
| 抗體C | 0.03 | 59 |
| 抗體1-4Pro | 0.01 | 55 |
| PD1B1090-4Pro | 0.79 | 72 |
| PD1B1094-4Pro | 0.46 | 64 |
| ANB-030-4Pro | 0.27 | 66 |
| 阿巴西普 | 0.39 | 66 |
| 抗體 | IC 50 值(nM) ，IFNγ 之幾何平均抑制 | Emax 值(%) ，IFNγ 之平均抑制 |
| 抗體C | 0.03 | 59 |
| 抗體1-IgG1WT | 0.01 | 46 |
| PD1B1090-IgG1WT | 0.07 | 83 |
| PD1B1094-IgG1WT | 0.12 | 79 |
| ANB-030-IgG1WT | 0.03 | 78 |
| 阿巴西普 | 0.39 | 66 |
| 抗體 | IC 50 值(pM) ，IL-17A 之平均幾何抑制 | Emax 值(%) ，IL-17A 之平均抑制 |
| IgG4Pro中之嵌合723C2 | 14.4 | 70.0 |
| 抗體A | 41.1 | 69.8 |
| 抗體B | 25.3 | 63.4 |
| 抗體C | 32.5 | 62.9 |
| 抗體D | 31.9 | 63.9 |
| 抗體E | 8.1 | 59.2 |
| PD1AB-6-4P | 175.8 | 67.5 |
| 抗體 | IC 50 值(pM) ，IL-21 之幾何平均抑制 | Emax 值(%) ，IL-21 之平均抑制 |
| IgG4Pro中之嵌合723C2 | 12 | 85 |
| 抗體C | 6 | 84 |
| PD1AB-6-4P | 50 | 71 |
| IFNγ 之抑制% ( 均值, SD) | IC 50 ( 幾何均值(nM), SD) | |
| 723-IgG4Pro | 57±17 | 0.03±0.136 |
| 723-IgG1WT | 45±16 | 0.015± 0.021 |
| 723-IgG1KO | 29±17 | 0.02± 0.4 |
| % hCD45 + 細胞( 均值± SD) | |||
| 供體1 | 供體2 | 供體3 | |
| 第1 組 | 2.23 (2.83) | 3.52 (6.37) | 0.63 (0.68) |
| 第2 組 | 14.86 (13.43) | 3.63 (3.12) | 1.31 (0.92) |
| 第3 組 | 43.57 (18.33) | 21.92 (14.73) | 15.07 (14.48) |
| 第4 組 | 40.70 (19.29) | 21.09 (9.41) | 24.70 (16.73) |
| 第5 組 | 48.98 (17.87) | 25.22 (14.73) | 19.86 (3.95) |
| 第6 組 | 3.24 (1.88) | 6.63 (5.50) | 1.76 (1.96) |
| hIFNγ (pg/mL, 均值±SD) | hTNFα (pg/mL, 均值±SD) | hIL-10 (pg/mL, 均值±SD) | |||||||
| 供體1 | 供體2 | 供體3 | 供體1 | 供體2 | 供體3 | 供體1 | 供體2 | 供體3 | |
| 第1 組 | 331 (333) | 6616 (16780) | 372 (742) | 1 (1) | 8 (17) | 1 (1) | 1 (1) | 2 (5) | 0 (0) |
| 第2 組 | 11475 (18275) | 2846 (3079) | 631 (606) | 9 (10) | 6 (4) | 1 (1) | 6 (8) | 1 (1) | 0 (0) |
| 第3 組 | 40323 (36540) | 24450 (15273) | 11967 (9048) | 18 (7) | 43 (27) | 19 (13) | 12 (6) | 12 (6) | 4 (2) |
| 第4 組 | 76077 (61582) | 28643 (12275) | 13302 (11700) | 29 (15) | 37 (15) | 19 (14) | 18 (7) | 10 (3) | 4 (3) |
| 第5 組 | 39655 (48118) | 20180 (9671) | 15435 (10619) | 21 (9) | 34 (14) | 20 (9) | 16 (8) | 11 (7) | 4 (3) |
| 第6 組 | 837 (1498) | 7163 (9580) | 871 (1907) | 1 (1) | 13 (15) | 3 (4) | 1 (1) | 8 (15) | 1 (1) |
| 劑量(mg/kg) | 途徑 | CL (ml/d/kg) | Vc(ml/kg) | AUC (µg h/ml) | T 1/2( 天) | MRT ( 天) | F% |
| 0.1 | i.v. | 14.3 | 35.6 | 171 | 2.9 | 4.1 | - |
| 0.3 | i.v. | 6.2 | 38.6 | 1,190 | 8.7 | 12.1 | - |
| 1.5 | i.v. | 3.0 | 33.9 | 12,400 | 18 | 25 | - |
| 1.5 | s.c. | - | - | 12,000 | - | 22.7 | 96.9 |
| 蛋白質A 管柱 | IEX 管柱 | ||||
| 效價(mg/L) | 產率(mg/L) | 回收率 | 產率(mg/L) | 回收率 | |
| 抗體A | 22/18 | 25/21 | 114%/117% | 18/18 | 71%/83% |
| 抗體C | 23 | 22 | 95% | 18 | 83% |
| 抗體E | 38 | 38 | 100% | 31 | 80% |
| 品質 | 穩定性 | 溶解性 | ||
| 新鮮時SEC (%M) | 在40℃下SEC 1週(%M) | 在40℃下SEC 4週(%M) | 在180 mg/ml下AUC (%M) | |
| 抗體A | 99.08 | 98.41 | 97.55 | 97.7 |
| 抗體C | 98.99 | 97.87 | 96.68 | 95.7 |
| 抗體E | 98.61 | 97.80 | 96.96 | 99.9 |
圖 1：在基於細胞之分析中藉由流式細胞測量術評估的抗-PD-1抗體對人類PD-1蛋白質之選擇性。MFI表示「平均螢光強度」。
圖 2：人類PD-1-Fc結合至人類PD-L1-Fc之競爭結合分析。描繪25 nM PD-1-Fc與偶合於GLM芯片表面上之PD-L1-Fc胺之結合曲線的感測圖譜(圖2A)。抗體C、MK-3475及PD1AB-6-4P (500nM)與結合至偶合於GLM芯片表面上之PD-L1-Fc胺的25 nM PD-1-Fc預混合之感測圖譜(圖2B)。
圖 3：在存在抗-PD-1促效劑抗體之情況下PD-L1與PD-1之增強結合。PD-1生物素：PD-L1相互作用分析(圖3A)。CHO PD-1-PD-L1 Delphia-Eu TRF分析(圖3B及3D)。CHO PD-1:生物素PD-L1結合分析(圖3C)。在圖3D中，僅描繪針對抗體C之個別資料點；圖3D中未描繪針對其他抗體之個別資料點，因為其彼此極為接近。POC表示「對照之百分比」。
圖 4：在存在衍生自親本723C2促效劑抗體(圖4A)或親本促效劑抗體820C3 (圖4B)之抗-PD-1促效劑抗體或F(ab')2片段的情況下的T細胞功能活性。POC表示「對照之百分比」。
圖 5：交聯後藉由抗CD48之MAb誘導PD-1活化。
圖 6：用CellTrace-Violet標記人類泛T細胞、用CD3 MAb之活化及藉由CellTrace之稀釋對細胞增殖之分析。
圖 7：雙特異性構築體(圖7A)。藉由在過度表現PD-1之Jurkat細胞上進行流式細胞測量術來展現各臂與PD-1或CD48之結合(圖7B)。在存在培養盤結合之PD-1/CD48 BsAb或對照抗體之情況下用培養盤結合之抗-CD3e刺激人類記憶CD4+ T (PD1
+)細胞(圖7C)。MFI表示「平均螢光強度」。
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Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg
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Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly
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50 55 60
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多肽」
<![CDATA[<400> 143]]>
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Pro Asp Leu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro His Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
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<![CDATA[<211> 645]]>
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聚核苷酸」
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gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
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agccgcttca gcggcagcgg cagcggcacc gacttcacct tcaccatcag cagcctgcag 240
ccagaggaca tcgccaccta ctactgccag cagggcacca gcctgccacg cgccttcggc 300
cagggcacca agctggagat caagcgtact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcaattgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
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多肽」
<![CDATA[<400> 145]]>
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr Ser Leu Pro
85 90 95
Arg Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> source]]>
<![CDATA[<223> /註釋=「人工序列之描述：合成]]>
聚核苷酸」
<![CDATA[<400> 146]]>
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggaggc ctggtgcagc caggcggcag cctgagactg 60
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ccaggcaagg gcctggagtg ggtggcctac atcagcagcg gcggcggcag cagctactac 180
ccagacctgg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatgc agagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcctgcca 300
cactacttcg ccatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagcgcctcc 360
acaaagggcc cttccgtgtt ccccctggcc ccttgctccc ggtccacctc cgagtctacc 420
gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480
tctggcgccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccctgctg tgctgcagtc ctccggcctg 540
tactccctgt cctccgtcgt gaccgtgccc tcctctagcc tgggcaccaa gacctacacc 600
tgtaacgtgg accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agcgggtgga atctaagtac 660
ggccctccct gccccccctg ccctgcccct gaatttctgg gcggaccctc cgtgttcctg 720
ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atctcccgga cccccgaagt gacctgcgtg 780
gtggtggacg tgtcccagga agatcccgag gtccagttta attggtacgt ggacggcgtg 840
gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggaacagt tcaactccac ctaccgggtg 900
gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960
gtgtccaaca agggcctgcc ctccagcatc gaaaagacca tctccaaggc caagggccag 1020
ccccgcgagc cccaggtgta caccctgcct ccaagccagg aagagatgac caagaaccag 1080
gtgtccctga cctgtctggt caagggcttc tacccctccg atatcgccgt ggaatgggag 1140
tccaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ctgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tgtactctcg gctgaccgtg gacaagtccc ggtggcagga aggcaacgtc 1260
ttctcctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgtcc 1320
ctgagcctgg gc 1332
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<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> source]]>
<![CDATA[<223> /註釋=「人工序列之描述：合成]]>
多肽」
<![CDATA[<400> 147]]>
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Asp Leu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Gln Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro His Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
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<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> source]]>
<![CDATA[<223> /註釋=「人工序列之描述：合成]]>
聚核苷酸」
<![CDATA[<400> 148]]>
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc caggtggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc gactactaca tgagctgggt gcgccaggct 120
ccaggcaagg gtctggaatg ggtggcctac atcagcagcg gcggcggcag cagctactac 180
ccagacgccg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acgccaagca gagcctgtac 240
ctgcagatgc agagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcctgcca 300
cactacttcg ccatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagcgcctcc 360
acaaagggcc cttccgtgtt ccccctggcc ccttgctccc ggtccacctc cgagtctacc 420
gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480
tctggcgccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccctgctg tgctgcagtc ctccggcctg 540
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tgtaacgtgg accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agcgggtgga atctaagtac 660
ggccctccct gccccccctg ccctgcccct gaatttctgg gcggaccctc cgtgttcctg 720
ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atctcccgga cccccgaagt gacctgcgtg 780
gtggtggacg tgtcccagga agatcccgag gtccagttta attggtacgt ggacggcgtg 840
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<![CDATA[<211> 444]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> source]]>
<![CDATA[<223> /註釋=「人工序列之描述：合成]]>
多肽」
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Gln Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Gln Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro His Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
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聚核苷酸」
<![CDATA[<400> 150]]>
gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
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agccgcttca gcggcagcgg cagcggcacc gacttcacct tcaccatcag cagcctgcag 240
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多肽」
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp
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Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
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聚核苷酸」
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ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atctcccgga cccccgaagt gacctgcgtg 780
gtggtggacg tgtcccagga agatcccgag gtccagttta attggtacgt ggacggcgtg 840
gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggaacagt tcaactccac ctaccgggtg 900
gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960
gtgtccaaca agggcctgcc ctccagcatc gaaaagacca tctccaaggc caagggccag 1020
ccccgcgagc cccaggtgta caccctgcct ccaagccagg aagagatgac caagaaccag 1080
gtgtccctga cctgtctggt caagggcttc tacccctccg atatcgccgt ggaatgggag 1140
tccaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ctgtgctgga ctccgacggc 1200
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多肽」
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Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
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多肽」
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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gtgtccaaca agggcctgcc ctccagcatc gaaaagacca tctccaaggc caagggccag 1020
ccccgcgagc cccaggtgta caccctgcct ccaagccagg aagagatgac caagaaccag 1080
gtgtccctga cctgtctggt caagggcttc tacccctccg atatcgccgt ggaatgggag 1140
tccaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ctgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tgtactctcg gctgaccgtg gacaagtccc ggtggcagga aggcaacgtc 1260
ttctcctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgtcc 1320
ctgagcctgg gc 1332
<![CDATA[<210> 163]]>
<![CDATA[<211> 444]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> source]]>
<![CDATA[<223> /註釋=「人工序列之描述：合成]]>
多肽」
<![CDATA[<400> 163]]>
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro His Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<![CDATA[<210> 164]]>
<![CDATA[<211> 12]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> source]]>
<![CDATA[<223> /註釋=「人工序列之描述：合成]]>
肽」
<![CDATA[<400> 164]]>
Ser Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp Tyr Leu His
1 5 10
<![CDATA[<210> 165]]>
<![CDATA[<211> 12]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> source]]>
<![CDATA[<223> /註釋=「人工序列之描述：合成]]>
肽」
<![CDATA[<400> 165]]>
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp Tyr Leu His
1 5 10
<![CDATA[<210> 166]]>
<![CDATA[<211> 7]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> source]]>
<![CDATA[<223> /註釋=「人工序列之描述：合成]]>
肽」
<![CDATA[<400> 166]]>
Arg Thr Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<![CDATA[<210> 167]]>
<![CDATA[<211> 7]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> source]]>
<![CDATA[<223> /註釋=「人工序列之描述：合成]]>
肽」
<![CDATA[<400> 167]]>
Arg Thr Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
Claims (34)
- 一種抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含： 包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 44之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 45之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 2之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 3之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 46之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 45之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 2之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 3之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 48之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 49之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 5之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 6之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 51之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 52之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 8之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 9之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 54之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 55之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 11之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 12之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 57之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 58之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 14之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 15之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 59之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 60之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 61之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 17之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 18之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 63之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 64之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 20之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 21之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 66之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 67之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 23之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 24之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 69之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 70之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 26之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 27之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 72之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 58之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 14之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 29之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 74之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 75之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 31之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 76之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 31之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 78之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 31之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 79之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 31之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 76之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 164之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 31之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 79之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 165之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 166之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 78之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 165之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 166之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 79之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 165之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 167之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 81之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 82之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 14之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 34之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 84之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 85之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 35之胺基酸序列L-CDR2)；及SEQ ID NO: 36之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 87之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 88之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 38之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 39之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 89之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 90之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 91之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 41之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 42之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區。
- 如請求項1之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其包含： 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 74之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 75之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 31之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 76之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 31之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 78之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 31之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 79之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 31之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 76之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 164之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 31之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 79之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 165之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 166之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 78之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 165之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 166之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區， 或 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 79之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 77之胺基酸序列(H-CDR3)的重鏈可變區，及 包含SEQ ID NO: 165之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 167之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 32之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區。
- 如請求項1或2之抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人類化抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項1或2之抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：單株抗體、Fab、F(ab´)2、Fv及scFv。
- 如請求項1之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段抗體，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含以下之胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 108及SEQ ID NO: 92；各別地SEQ ID NO: 109及SEQ ID NO: 93；各別地SEQ ID NO: 110及SEQ ID NO: 94；各別地SEQ ID NO: 111及SEQ ID NO: 95；各別地SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 96；各別地SEQ ID NO: 113及SEQ ID NO: 97；各別地SEQ ID NO: 114及SEQ ID NO: 98；各別地SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 99；各別地SEQ ID NO: 116及SEQ ID NO: 100；各別地SEQ ID NO: 117及SEQ ID NO: 101；各別地SEQ ID NO: 118及SEQ ID NO: 102；各別地SEQ ID NO: 119及SEQ ID NO: 103；各別地SEQ ID NO: 120及SEQ ID NO: 104；各別地SEQ ID NO: 121及SEQ ID NO: 105；各別地SEQ ID NO: 122及SEQ ID NO: 106；各別地SEQ ID NO: 123及SEQ ID NO: 107。
- 如請求項1之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137或SEQ ID NO: 139中任一者之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127或SEQ ID NO: 129中任一者之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含以下之胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 131及SEQ ID NO: 125；各別地SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 127；各別地SEQ ID NO: 135及SEQ ID NO: 127；各別地SEQ ID NO: 137及SEQ ID NO: 129；或各別地SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 129。
- 如請求項1之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其與各別地SEQ ID NO: 131及SEQ ID NO: 125；各別地SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 127；各別地SEQ ID NO: 135及SEQ ID NO: 127；各別地SEQ ID NO: 137及SEQ ID NO: 129；各別地SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 129之胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致。
- 如請求項1、2及5至8中任一項之抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含選自由以下組成之群的重鏈恆定區：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恆定區。
- 如請求項9之抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈恆定區為具有Ser228Pro突變之IgG4的重鏈恆定區。
- 如請求項9之抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈恆定區為IgG1之重鏈恆定區。
- 如請求項9之抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈恆定區為具有Leu234Ala及Leu235Ala突變之IgG1的重鏈恆定區。
- 如請求項1、2及5至8中任一項之抗-PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由κ及λ組成之群的輕鏈恆定區。
- 如請求項1之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其包含以下之胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 143及SEQ ID NO: 141；各別地SEQ ID NO: 147及SEQ ID NO: 145；各別地SEQ ID NO: 149及SEQ ID NO: 145；各別地SEQ ID NO: 153及SEQ ID NO: 151；或各別地SEQ ID NO: 155及SEQ ID NO: 151。
- 如請求項5至8及14中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為單株抗體。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至15中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，及醫藥學上可接受之賦形劑。
- 如請求項1、2、5至8及14中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其用作藥劑。
- 如請求項1、2、5至8及14中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段，其用於治療PD-1路徑病症。
- 一種如請求項1至15中任一項之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段或如請求項16之醫藥組合物的用途，其用於製造用於治療PD-1路徑病症之藥劑。
- 如請求項19之用途，其中該疾病係選自由以下組成之群：全身性硬化症(SSc)、全身性紅斑性狼瘡、多發性肌炎、巨大細胞動脈炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎及發炎性腸病。
- 如請求項19至20中任一項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係藉由非經腸途徑、靜脈內途徑或皮下途徑投與。
- 一種經分離之聚核苷酸，其編碼如請求項5至7中任一項之重鏈可變區及/或輕鏈可變區。
- 一種經分離之聚核苷酸，其編碼如請求項14之重鏈及/或輕鏈。
- 一種表現載體，其包含如請求項22或23之聚核苷酸。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項24之表現載體。
- 如請求項25之宿主細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
- 一種製造抗體之方法，其包含以下步驟： 使宿主細胞在允許抗體形成之條件下培養，該宿主細胞包含：包含編碼如請求項5至7中任一項之重鏈可變區之經分離之聚核苷酸的表現載體及包含編碼如請求項5至7中任一項之輕鏈可變區之聚核苷酸的表現載體；及 回收該抗體。
- 一種製造抗體之方法，其包含以下步驟： 使宿主細胞在允許抗體形成之條件下培養，該宿主細胞包含：包含編碼如請求項14之重鏈之經分離之聚核苷酸的表現載體及包含編碼如請求項14之輕鏈之聚核苷酸的表現載體；及 回收該抗體。
- 如請求項27或28之方法，其進一步包含純化該抗體之步驟。
- 如請求項27或28之方法，其進一步包含將該抗體調配成醫藥組合物之步驟。
- 一種多特異性抗體，其包含第一抗-PD-1促效劑抗原結合位點及第二抗原結合位點。
- 如請求項31之多特異性抗體，其中該第二抗原結合位點為抗-CD48結合位點、抗-CD-2結合位點、抗-CD11a結合位點或抗-CD3結合位點。
- 如請求項31之多特異性抗體，其中該第一抗-PD-1促效劑抗原結合位點包含如請求項1至8中任一項之重鏈可變區及輕鏈可變區。
- 如請求項31至33中任一項之多特異性抗體，其中該抗體為雙特異性抗體。
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