CN101337990B - 人源抗狂犬病毒中和性抗体及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了人源抗狂犬病毒中和性抗体及其制备方法与用途。本发明的抗体其重链可变区和轻链可变区分别具有序列表中序列2和序列4所示的氨基酸序列,该抗体的改构体的重链可变区和轻链可变区分别具有序列表中序列8和序列10所示的氨基酸序列。上述抗体通过以下方法制备:首先通过分子生物学或其它方法制备抗体的CDR区或可变区或IgG部分或全基因,在原核细胞如大肠杆菌等、真核细胞如酵母菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞如CHO等中表达,经过纯化获得本发明的抗体。本发明的抗体具有特异中和活性强、亲和力高、无毒副作用的特点,适用于狂犬病的预防和急救治疗,同时适用于狂犬病毒的检测,具有良好的应用前景。

Description

人源抗狂犬病毒中和性抗体及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及一种人源单克隆抗体,具体涉及一种人源抗狂犬病毒中和性抗体,还涉及该抗体的制备方法与用途。
背景技术
狂犬病毒(Rabies Virus)是弹状病毒科(Rhabdoviridaes)狂犬病毒属(Lyssavirus)血清I型病毒,呈典型的子弹状结构。大小约75×180nm。其基因组大小约为12Kb,为单股不分节段负链RNA。其基因组编码NP(核蛋白),M1P(衣壳基质蛋白),M2P(包膜基质蛋白),GP(糖蛋白),LP(转录酶大蛋白)等五种结构蛋白。这五种蛋白均具有抗原性。其中NP,M1P和LP与病毒RNA一起形成核衣壳(RNP)复合物。病毒颗粒中的糖类主要以糖蛋白和脂糖的形式存在。G蛋白位于病毒体表面,是狂犬病毒重要的抗原成分,可诱导机体产生中和抗体及细胞免疫,同时也是病毒入侵敏感细胞的重要物质。糖蛋白诱导和刺激机体产生免疫应答,在一定程度上完全依赖与完整的二级和三级结构。
由狂犬病毒引起的狂犬病是世界性人畜共患疾病,几乎遍及世界各个国家和地区。由于狂犬病一旦发病目前尚无法医治,死亡率几乎是100%。狂犬病的动物传染源广泛存在,在世界范围内,每年大约有6百万到1千万人暴露于狂犬病危险动物之下,并导致40000到70000人的死亡,控制难度较大,所以研制狂犬病的预防制品非常重要。
目前,应用于狂犬病的紧急预防性治疗药物主要是血源性免疫球蛋白,包括抗狂犬病毒马血清(ERIG)和人抗狂犬病毒免疫球蛋白(HRIG)。但是因为ERIG易引起过敏反应和血清病,以及HRIG存在潜在病毒污染的问题,使得临床使用存在安全隐患,而治疗效果也有待于提高。因此,研制血源性免疫球蛋白的替代新产品,开发人源性或者人源化基因工程抗体已十分迫切。
抗体技术由细胞工程抗体(杂交瘤-单克隆抗体)发展到基因工程抗体,尤其是抗体库技术的出现,将抗体工程发展到了一个新阶段。利用噬菌体抗体库技术、转基因鼠技术等针对特定靶抗原筛选人源特异、高亲和力的抗体克隆,获得抗体新基因;进一步应用基因工程、细胞工程技术生产人源抗体和小分子抗体(如Fab,diabody)等,已经成为现在和未来抗体药物研发的主流技术趋势。
在国内外针对狂犬病毒的治疗性抗体研究中,值得关注的包括:(1)2001年,Ray K等人成功利用噬菌体抗体库技术筛选到狂犬病毒人单链抗体,筛选出的anti-GPRV(glycoprotein antigen of the rabies virus)ScFv-Fc分子具有中和活性。(2)武汉生物制品研究所的闭兰等人2004年从半合成噬菌体抗体库筛选出狂犬病毒G蛋白的人单链抗体A12,流式细胞仪(FACS)检测表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染细胞出现特异性反应,在快速荧光灶抑制实验(RFFTT)中表现具有完全中和病毒能力。(3)University of Massachusetts Medical School的Jamaica于2005年通过转基因鼠技术获得了抗体克隆HuMAB17,其c7单链抗体已经被验证能抗25种不同的狂犬病毒,被认为通过进一步的活性制备有希望成为HRIG的有效替代品。
发明内容
针对现有狂犬病毒感染的预防性治疗中所使用的抗血清制品的缺陷,本发明提供了新的抗狂犬病毒中和性人源单克隆抗体,该抗体的重链和轻链的可变区分别具有如序列表中序列2和序列4所示的氨基酸序列,其编码基因分别具有如序列表中序列1和序列3所示的核苷酸序列。
针对小分子抗体如单链抗体通常都存在的稳定性差的问题,本发明还提供了一种抗狂犬病毒中和性人源单克隆抗体的基因工程小分子稳定性改构体(3d-dsFv),即三域二硫键稳定性Fvs。该改构体是在上述人源单克隆抗体的基础上改构而成,在抗体可变区VH和VL之间,通过定点突变引入二硫键形成位点VH46Cys和VL99Cys,在VH和VL之间添加二硫键;同时以重链CH1的5’端的12个氨基酸为连接肽顺序连接VH和VL,构建三域二硫键稳定性抗体。其中重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列8所示,其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示,轻链可变区的氨基酸序列如序列表中序列10所示,其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示。基因改构的3d-dsFv抗体结构的抗原结合特异性没有发生改变,不同条件下的稳定性获得了明显改善,实时SPR技术测定抗体亲和力也获得了提高,更加适合于应用。
本发明的人源抗狂犬病毒中和性抗体(HuAb-RV),还包括对上述抗体的氨基酸序列通过对氨基酸残基的添加、删除、修改形成的,具有相同功能的抗体。
本发明的HuAb-RV具有特异中和活性强、亲和力高、无毒副作用的特点,可发展为狂犬病的紧急预防性治疗制剂。本发明的HuAb-RV,不仅可以完全消除抗狂犬病毒马血清易引起的过敏反应,而且可以克服人抗狂犬病毒免疫球蛋白存在的潜在病毒污染的问题,具有良好的应用前景。
本发明同时提供了HuAb-RV的制备方法。首先是制备HuAb-RV编码基因(如CDR区或可变区或IgG部分或全基因),可以采用化学合成或基因工程例如PCR方法,然后将该基因克隆入任一表达载体,如原核、酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞表达载体等,制备重组表达载体,其中原核表达载体可以为pCANTAB-5E、pET系列等,酵母表达载体可以为pPIC系列,哺乳细胞表达载体可以为pEF1、pTriEx等。然后将制备的重组表达载体分别转入宿主细胞如大肠杆菌、酵母菌、昆虫、植物或哺乳动物细胞等中进行表达,其中大肠杆菌可以为HB2151、BL21(DE3)等、酵母为GS115等、哺乳动物细胞为CHO等。将表达产物纯化获得人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体。
本发明的HuAb-RV基因是通过以下方法进行筛选的。首先使用aG疫苗(维尔博,法国)经志愿者免疫诱导,从外周血淋巴细胞中分离、克隆抗体重、轻链可变区基因(VH和VK),构建人源噬菌体抗体免疫文库,比较容易地用狂犬病毒抗原,采用酶联板固相抗原捕获法,筛选HuAb-RV噬菌体阳性克隆,进而获得具有特异中和活性、高亲和力的HuAb-RV基因。在实施该发明中,该基因及其改构体可以通过本领域已知的技术进行化学合成或通过PCR等生物学方法进行制备。可以在原核细胞、酵母菌、昆虫、植物或哺乳动物细胞等中获得表达,经过纯化获得均质的HuAb-RV蛋白,包括全分子IgG或抗体片段或改构体衍生物等,从而制备人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体,这种直接获得中和性人源抗体克隆及其基因的方法具有明显的技术优势,获得的基因工程抗体是完全人源性的,不需复杂的人源化制备过程,产品几乎没有免疫原性和毒副作用,不需过敏实验就可以直接使用。
本发明同时提供了人源抗狂犬病毒中和性抗体在狂犬病毒检测和狂犬病紧急预防和治疗中的用途。在实验中,HuAb-RV重组抗体与狂犬病毒抗原能特异结合,与现有治疗性抗狂犬马抗具有很强的竞争抑制结合活性,改构体对抗原的亲和力高于原ScFv母本抗体,其结合力更强,具有很强的稳定性和靶向结合能力。本发明的抗体在细胞实验中表现出出色的中和活性和抗感染能力,而且对细胞无毒性。本发明的抗体使用更为安全、有效,作用机理明确。基因工程技术制备的人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体,可以在体内外有效中和狂犬病毒,抑制狂犬病毒所引起的细胞病变,具有抗感染作用,可以保护幼鼠逃避致死量狂犬病毒的攻击,起到紧急预防和治疗的作用。本发明的抗体可以用于狂犬病紧急预防和治疗以及狂犬病毒检测。
本发明针对目前抗血清产品存在的缺陷,为满足研制新一代人源抗体的需求,提供了一种全新的人源抗狂犬病毒中和性抗体编码基因以及特异针对狂犬病毒的高亲和力的人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体,并应用基因工程技术进一步设计构建了以Fv为基础的抗体改构体,并通过体内外生物学活性研究进行了证实。本发明还公开了上述抗体的制备方法。本发明的人源基因工程抗体具有特异性强、亲和力高、稳定性好,免疫原性低或无的特点。作为血源性免疫球蛋白的替换品,有很多优点:其有效成分明确,为人源抗狂犬病毒中和性抗体;特异性高,针对狂犬病毒的表面G糖蛋白(GPRV);无或低免疫原性,完全人源性蛋白结构;能够不限量的生产,可基因工程化制备放大。本发明的人源基因工程抗体可以作为狂犬病的紧急预防和治疗药物和狂犬病毒的特异检测抗体,具有非常广阔的市场前景。
附图说明
图1为提取人脾淋巴细胞总RNA产物的琼脂糖电泳图谱。
图2为人抗体VH和VL基因扩增图谱:A图为VH1-6基因扩增产物的琼脂糖电泳;B图为VL1-6基因扩增产物的琼脂糖电泳。其中M为DNA分子量标准DL2000;1-6泳道为VH1a-6a或VK1a-6a基因的PCR产物。
图3为组装的人单链抗体(ScFv)基因库,重链与轻链基因拼接产物的琼脂糖电泳图谱,其中M为DNA分子量标准DL2000;1-6泳道为组装ScFv的PCR产物。
图4为人源抗狂犬病毒抗体(HuAb-RV)的重组构建与表达鉴定图谱,其中
A.ScFv基因的克隆:M.DL2000;1.ScFv基因;
B.ScFv表达的SDS-PAGE与WB鉴定:M.蛋白分子标准;1.表达株蛋白;2.空载体菌蛋白;3.表达株蛋白免疫印记
C.3d-dsFv基因的克隆:M.DL2000;1.3d-dsFv基因;
D.3d-dsFv表达的SDS-PAGE与WB鉴定:M.蛋白分子标准;1.表达株蛋白免疫印记;2.空载体菌蛋白;3.表达株超声沉淀蛋白;4.表达株超声上清蛋白;
图5为HuAb-RV(ScFv,3d-dsFv)的纯化制备及其二硫键结构分析,其中:
A.纯化ScFv的NATIVE-PAGE:M.低分子量蛋白标准;1.纯化的ScFv蛋白;
B.纯化3d-dsFv的NATIVE-PAGE:M.低分子量蛋白标准;1-2.纯化的3d-dsFv蛋白。
C.3d-dsFv的二硫键结构分析:M.低分子量蛋白标准;1.纯化的3d-dsFv蛋白(DTT处理);2.纯化的3d-dsFv蛋白(DTT未处理)。
图6为HuAb-RV(ScFv,3d-dsFv)的抗原结合特异性分析,其中抗原包括:3株狂犬病毒RV-aG(疫苗株)、RV-CVS(攻毒株)、RV-Rep(减毒株),以及无关抗原:1株轮状病毒Wa,1种破伤风类毒素抗原TET,和对照BSA。
图7为HuAb-RV(ScFv,3d-dsFv)竞争马血清结合狂犬病毒的活性分析。
图8为HuAb-RV(ScFv,3d-dsFv)在人血清中的稳定性分析。
图9为HuAb-RV(ScFv或3d-dsFv)与狂犬病毒感染细胞的特异靶向结合(FACs),其中
A.狂犬病毒感染细胞;
B.狂犬病毒感染细胞与ScFv;
C.狂犬病毒感染细胞与3d-dsFv;
D.狂犬病毒感染细胞与抗狂犬病马血清。
图10为HuAb-RV(ScFv或3d-dsFv)抑制狂犬病毒感染和细胞病变的结果,其中:
A.狂犬病毒感染细胞;
B.狂犬病毒感染细胞与ScFv;
C.狂犬病毒感染细胞与3d-dsFv;
具体实施方式
实施例1人源抗狂犬病毒噬菌体免疫文库的构建与筛选
一、材料:
1.菌株:辅助噬菌体M13K07购自Biolab公司;宿主菌E.coli TG1为Pharmacia公司产品。
2.试剂:NotI、SfiI等限制性内切酶均为Promega公司产品;FicollPlus Pague和anti M13-HRP为Pharmacia产品;总RNA提取试剂盒、RT逆转录试剂盒、PCR扩增试剂为TAKARA公司产品;BSA(牛血清白蛋白组分V)为GIBCO公司产品;DEPC、羧苄青霉素、四环素和硫酸卡那霉素购自SIGMA公司。
3.载体:噬菌体载体pCANTAB-5E为Pharmacia公司产品。
二、方法结果:
1.狂犬病aG疫苗的志愿者免疫
使用aG疫苗(维尔博公司,法国)对三名志愿者进行首次免疫,然后在第7、28天用aG疫苗加强免疫两次。
2.人源抗狂犬病毒噬菌体免疫文库的构建
2.1人源噬菌体免疫文库构建的引物设计:通过上海博亚公司设计合成下列引物:
IgG,IgM cDNA的合成引物;人源重链可变区(VH)的扩增引物;人源轻链可变区(V K)的扩增引物;人源ScFv组装用Linkers;含限制性酶切位点Sfi I/Not I的ScFv克隆扩增引物。
2.2淋巴细胞的分离和细胞总RNA的提取
收取抗凝血40ml,以20ml Ficoll离心分离乳白色淋巴细胞层,用PBS洗3次,2000rpm,5min,5.8×107细胞悬浮至终体积为1ml。参见试剂盒操作说明(Modified RNAgents Total RNA Isolation protocols)提取细胞总RNA 20μg,结果见附图1。
2.3cDNA的合成
参见TAKARA试剂盒(BcaBESTTM RNA PCR KIT Verl.1)操作说明。以纯化的总RNA为模板,反转录合成cDNA第一链,RT反应条件为:30℃10分钟、42℃30分钟、99℃5分钟、5℃5分钟。
2.4PCR扩增抗体可变区VH和Vκ基因
以2μl cDNA为模板,PCR反应系统中添加1.6mmol/L MgCl2,1mmol/LdNTP,加入2.5U的Tag酶,热启动,减少非特异性反应。PCR条件为:94℃30秒、57℃50秒、72℃60秒行25个循环,最后72℃延伸10分钟。扩增目的产物Vh1-6和Vκ1-6进行纯化,大小为300-400bp,结果见附图2。
2.5ScFv单链抗体基因的组装(splicing overlap extension,SOE)
分别测定VH链、Vκ链及Linker DNA相对的量,进行等摩尔混合,通过PCR进行组装。首先无引物拼接,94℃5分钟后,加入0.5μl(2.5U)Tag聚合酶,进行20个循环反应,94℃1分钟,54℃2分钟,72℃3分钟,最后72℃延伸10分钟。然后进行有引物扩增,在ScFv的5’和3’端引入限制性内切酶位点Sfi I/NotI,进行30轮PCR循环:94℃1分钟,55℃2分钟,72℃2分钟。最后72℃延伸10分钟。PCR产物大小约为750bp,结果见附图3。
2.6重组噬菌体单链ScFv抗体文库的构建
2.6.1ScFv克隆入噬菌体载体
pCANTAB-5E是Pharmacia公司商业化载体,按常规方法从带有质粒DNA的TG1菌中提取和纯化载体DNA。用Sfi I和Not I双酶切消化ScFv的PCR产物和载体pCANTAB-5E并分别纯化。然后将ScFv单链基因通过连接反应克隆入pCANTAB-5E载体。
2.6.2重组噬菌体单链ScFv抗体文库的构建
将连接产物电转化200μl事先制备的TG1电转致敏菌,电转设置为:2500V,电击30秒。电转后加入5-10ml 2×YT-G(含2%葡萄糖),37℃振荡培养1小时。将重组转化菌10μl涂含2%葡萄糖的2×YT-氨苄平皿,30℃培养过夜。通过计算菌落检测库容量为108
3.人源抗狂犬病毒噬菌体阳性克隆的筛选
3.1单链噬菌体抗体库的富集筛选
噬菌体文库经过M13KO7超感染后,产生的重组噬菌粒可释放于细菌培养上清中,用于噬菌体阳性克隆的筛选。噬菌体单链抗体库的富集筛选选择微量孔板筛选方法,将狂犬病毒抗原包被96孔板,然后进行吸附-洗脱-富集的四轮筛选过程,第四轮的阳性克隆率为44%,结合活性(OD450)>1.000。
3.2噬菌体阳性克隆的序列分析
对挑选的噬菌体阳性克隆HuAb-RV的ScFv进行测序,获得其编码基因的核苷酸序列。与Kabat数据库中已知基因序列比较,确定家族定位;推导获得抗体基因编码的氨基酸序列,结果显示,抗狂犬病毒抗体克隆HuAb-RV的ScFv全长738bp,编码248氨基酸,HuAb-RV的核苷酸序列(ScFv,744bp;VH,357bp;VL,336bp),其中linker序列编码基因和氨基酸序列分别如序列表中序列5和序列6所示。HuAb-RV的VH基因长357bp,如序列表中序列1所示,编码119个氨基酸,如序列表中序列2所示,属于人重链IgG VH IV族;Vκ基因长336bp,如序列表中序列3所示,编码112个氨基酸,如序列表中序列4所示,属于K chain I家族。Kabat和Genbank数据库检索分析结果表明,它们均为首次发现的人免疫球蛋白可变区基因,是一株新发现的抗狂犬病毒抗体基因。Vκ基因与VH基因之间由编码(Gly4Ser)3的DNALinker正确连接构成ScFv结构。抗体的VH与Vκ通过不同方式进行结构组合和重构,可构建获得一系列功能抗体变构体,如单链抗体(ScFv)、二硫键稳定型抗体(dsFv)、单链二硫键稳定型抗体(ScdsFv)、双体(diabody)、Fab抗体片段、多结构域抗体或是全分子抗体等等。
实施例2人源抗狂犬病毒中和性抗体的重组制备
一、材料:
1.菌株:宿主菌E.coli HB2151为Pharmacia公司产品;E.coli BL21(DE3)为Novagen公司产品。
2.试剂:E-tag亲和层析纯化介质和Ni-NTA亲和纯化用Histrap HP预装柱购自Amersham Pharmacia公司;PCR扩增试剂为TAKARA公司产品;羧苄青霉素购自SIGMA公司;咪唑购自Amresco公司。
3.载体:噬菌体重组表达载体pCANTAB-5E为Pharmacia公司产品;表达载体pET22b为Novagen公司产品。
二、方法结果:
1.人源ScFv的重组制备
1.1人源ScFv在大肠杆菌中的可溶表达
将筛选获得的阳性克隆的重组表达质粒pCan-ScFv及空载体分别转化大肠杆菌HB2151,PCR鉴定挑选重组工程菌株,结果见附图4-A。进行诱导表达:工程菌在LB-Amp培养基中,37℃培养至OD600=0.5,加0.3mmol/L IPTG诱导4小时可达到表达水平的平台期,SDS-PAGE分析ScFv的表达产物分子量约为26KDa,附图4-B显示与预期结果一致。薄层扫描分析显示,重组表达水平为15%。表达蛋白定位分析表明,表达蛋白以可溶形式存在于胞内。
SDS-PAGE分析:取1ml诱导后的菌液,12000rpm离心2min,弃上清,菌体加入100μl上样缓冲液(10%蔗糖,2%SDS,50mmol/L Tris-HCl,pH6.8,10%巯基乙醇,0.002%溴酚蓝)悬起沉淀,沸水中煮5分钟,12000rpm离心,取上清10μl电泳。对比空载体和重组质粒转化工程菌的蛋白条带,观察有无外源基因表达。
1.2 ScFv的纯化
利用表达产物C末端的E-tag,进行E-tag亲和层析纯化(纯化介质购自Amersham Pharmacia公司),将收集的洗脱蛋白进行NATIVE-PAGE分析,见附图5-A,并进行蛋白定量。
2.稳定型改构体3d-dsFv的重组构建与制备
2.1 人源3d-dsFv的重组构建
以ScFv基因为模板,采用长引物设计,通过连续三步PCR扩增,在ScFv中引入两个突变氨基酸,即VH44Gly/Cys,VK 100Gln/Cys。突变体基因分析表明,成功的在ScFv中定点引入了突变:44GGC→TGC,100CAA→TGC,其它基因序列保持不变,突变基因可以正确编码成两个氨基酸Cys。通过SOE技术,以12个氨基酸的CH1’为linker,氨基酸组成如序列表中序列12所示,核酸编码序列如序列表中序列11所示,CH1’连接VH和Vκ,构建成3d-dsFv。3d-dsFv的氨基酸序列如下:VHm44G/C(C为突变位点)如序列表中序列8所示,VKm100N/C(C为突变位点)如序列表中序列10所示。
2.2 3d-dsFv的重组制备
2.2.1 3d-dsFv的重组表达
构建的pET-3d-dsFv重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),实现高水平表达,表达蛋白占菌体蛋白的30%以上,以包含体形式存在。
2.2.2 包含体的制备与溶解
4000rpm、离心10分钟,收集诱导表达后的菌体。加入相当于原菌液1/10的蒸馏水,悬起沉淀,超声破碎细胞,10,000rpm、离心10分钟收集包含体沉淀。依次用2.5mol/L NaCl,0.05%Triton-X-100,4mol/L尿素洗涤沉淀得到包含体。将包含体溶解于变性液(pH8.0 0.50mmol/L Tris,6mol/LUrea,0.1mol/L DTT)中,4℃搅拌过夜。
2.3 3d-dsFv的稀释法复性与亲和纯化
将处理好的变性蛋白3d-dsFv装入透析袋,在含不同浓度(6M,4M,2M,0M)尿素的PBS中梯度稀释复性。逐渐除去变性蛋白中的尿素,使蛋白在此缓慢过程中,重新进行蛋白折叠,复性为与天然抗体蛋白结构相同或相似的可溶蛋白。复性蛋白进行了SDS-PAGE和NATIVE-PAGE分析:在还原蛋白电泳中,复性产物因为再变性,二硫键打开,电泳迁移率变大,蛋白带在27KDa,显示的是抗体变性产物;而在非还原蛋白电泳中,抗体可变区间可以保持了已形成的二硫键,电泳迁移率相对小,见附图5-C所示。
上样buffer A(20mmol/L Na3PO4,0.5mol/L NaCl,40mmol/L imidazole,PH 7.4)平衡Ni-NTA纯化柱,复性蛋白直接上样,buffer B(20mmol/L Na3PO4,0.5mol/L NaCl,400mmol/L imidazole,PH 7.4)为洗脱液,收集洗脱峰,纯化的蛋白用NATIVE-PAGE检测,见附图5-B所示。
实施例3人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体的生物学活性分析
一、材料:
1.试剂:anti His-HRP为Pierce公司产品;FITC标记系列抗体为Promega公司产品;BSA(牛血清白蛋白组分V)、DMEM培养基和胎牛血清为GIBCO公司产品;硫氰酸氨购自北京生化试剂公司;抗肉毒马血清购自中国药品生物制品鉴定所;亲和力测定用试剂如HBS溶液、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)、N羟基琥珀亚胺(NHS)、乙醇胺均为Pharmacia公司产品。
2.材料:CM5芯片为Pharmacia公司产品;Balb/C小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。
3.仪器:Biacore3000为GE公司产品。
二、方法结果:
1.人源抗狂犬病毒基因工程抗体的抗原结合活性(ELISA)
1.1huAb-RV的抗原特异结合活性
用ELISA检测验证了HuAb-RV重组抗体与狂犬病毒抗原(3株)均能特异结合,其中代表性3株病毒抗原有:疫苗株RV-aG(维尔博,法国),标准攻毒株RV-CVS、毒株SAD B19(武汉生物制品研究所);HuAb-RV重组抗体与其它抗原不结合,包括轮状病毒(中国毒种保藏中心)、破伤风类毒素TET(中国药品生物制品检定所),以及BSA等。结果见附图6。利用高亲和力HuAb-RV的敏感性结合特点可以应用于狂犬病毒的特异性检测。
1.2huAb-RV的竞争抑制结合活性
以狂犬病毒抗原包被双复孔,等量抗狂犬血清与梯度抗体huAb-RV孵育后做为一抗,1∶3000稀释anti-his mAb为二抗,进行ELISA试验,利用分光光度计在450nm波长下测定OD值。
如图7所示,随着抗体量huAb-RV(ScFv或3d-dsFv)的增加,能检测出的结合抗体huAb-RV呈梯度上升趋势。其中,3d-dsFv加入量为16μg时能50%竞争抑制抗狂犬血清对狂犬病毒的结合。
1.3huAb-RV的相对亲和力
抗体蛋白与抗原结合过程中加入不同浓度的硫氰酸氨,当结合量纵轴数值下降为1/2时,即ELISA检测的OD450下降为不加硫氰酸氨时的50%时,相应的硫氰酸氨浓度表示为相对亲和力。结果显示,3d-dsFv的相对亲和力指数是1.4,而ScFv是0.8,说明重组制备的3d-dsFv对抗原的亲和力高于原ScFv母本抗体,其结合力更强,具有更好的应用性质。
1.4huAb-RV的稳定性
以狂犬病毒抗原包被双复孔,在37℃人血清环境下孵育不同时间段(1h-72h)的等量各抗体蛋白分别做为一抗,1∶3000稀释anti-His mAb为二抗,进行ELISA试验,利用分光光度计在450nm波长下测定OD值。同时设立破伤风类毒素、BSA阴性对照及抗狂犬病毒马血清的阳性对照。
结果表明,ScFv在12h基本丧失活性;3d-dsFv稳定性得到较大提高,在72h时仍保持54.2%的活性(图8)。
2.人源抗狂犬病毒基因工程抗体的靶向结合能力(FACs)
将感染狂犬病毒的Vero细胞分别与ScFv与3d-dsFv在4℃孵育过夜,与同样4℃孵育的FITC标记羊抗小鼠二抗和小鼠抗His一抗4℃过夜结合,PBS洗涤细胞3-5遍,甲醛固定后用流式细胞仪检测。设抗狂犬病毒马血清为阳性对照,抗破伤风马血清为阴性对照,FITC标记兔抗马抗体为检测抗体。结果表明,相比于阴性对照,各抗体与抗狂犬病毒马血清一样,均能使流式细胞仪激发光发生明显偏振;荧光显微镜下清晰可见特异荧光(图9);说明各抗体均能特异结合狂犬病毒感染细胞,并靶向狂犬病毒表面糖蛋白。
3.人源抗狂犬病毒基因工程抗体的中和活性和抗感染作用
3.1细胞病变抑制实验
在24孔细胞培养板中,用含5%血清的DMEM培养BHK21细胞生长至单层,吸去培养液。100TCID50的DMEM(5%血清)稀释狂犬病毒CVS株与梯度稀释的抗体4℃孵育过夜,并接种至单层BHK21细胞并使其均匀分布,置37℃CO2培养箱中吸附2h,吸去上清。加入2%血清的DMEM产毒维持液,37℃CO2培养箱继续培养10-14d,观察细胞形态变化。结果表明,随着抗体量的增加,BHK21的病变逐渐减少。其中,不同形式的抗体分子ScFv和3d-dsFv能不同程度的抑制细胞病变,当剂量达到32μg/ml时,3d-dsFv能完全抑制细胞病变,保护细胞,且对细胞无毒性。
3.2快速荧光灶抑制试验(RFFIT)
依据巴斯德研究所制定的RFFIT检测方法和质控标准进行实验。计算出致50%细胞感染的样品及标准品稀释度,通过Reed-Mench法计算ED50,已知标准品为2.0IU/ml,我们可以计算出3d-dsFv样品中狂犬病毒中和抗体效价为83.3IU/mg。
3.3体内中和活性(动物保护实验)
不同稀释度的重组基因工程抗体及狂犬抗血清各0.5ml,与毒力为100LD50的CVS攻毒株病毒悬液等量混合,在37℃孵育1h,取0.03ml注射小鼠(昆明鼠:10-12g)脑腔。4d内死亡小鼠不计,观察28天。结果显示,与抗狂犬马血清相一致,400IU/kg的3d-dsFv抗体蛋白可以有效中和100LD50的CVS病毒,抑制病毒的致死效应,保护90%幼鼠存活。只施用抗体蛋白药物组,动物一切正常,没有死亡或其它异常反应,说明注射剂量重组抗体蛋白无毒性。相对应的,只施以100LD50的CVS病毒的动物,全部死亡,结果见附表1。
表1.3d-dsFv对CVS的体内中和活性
Figure S2008101155080D00161
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
<120>人源抗狂犬病毒中和性抗体及其制备方法与用途
<130>
<160>12
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>357
<212>DNA
<213>
<400>1
caggtgcagc tgcaggagtc ggggggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc cctgagactc   60
tcctgtgcag gctctggatt cactttagat gattatgcca tgcactgggt ccgccaattt  120
cctgggaagg gcctggagtg ggtctcgggt ataaattgga acggtagtat caaaggttat  180
tcggactctg tgaagggccg attcagcgtc tccagagaca acgccaagaa cgtcctctat  240
ctgcaaatga ccaatctgag acctgaagac acggccctct attattgtgc taaagagaca  300
attctggcca cttggggccg gggaaccctg gtcaccgtct cctcagcttc caccaag     357
<210>2
<211>119
<212>PRT
<213>
<400>2
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Ser Ile Lys Gly Tyr Ser Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ser Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Val Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Asn Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Glu Thr Ile Leu Ala Thr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
        115
<210>3
<211>336
<212>DNA
<213>
<400>3
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc     60
atcacttgcc gggccagtca caacattaat agctggttgg cctggtatca gcagagacca    120
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aggttcagtg gcagtggggc tgggacagat ttcaatctca ccatcagcag cccgcagcct    240
gatgattttg cagcttatta ctgccaacac tataatactt tttctgcgac gttcggccaa    300
gggaccaagg tggagatcaa acgtactgtg gctgca                              336
<210>4
<211>112
<212>PRT
<213>
<400>4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Asn Ile Asn Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
            35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Asn Leu Thr Ile Ser Ser Pro Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Thr Phe Ser Ala
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
<210>5
<211>45
<212>DNA
<213>
<400>5
ggtggtggcg gttcaggtgg tggcggttca ggtggtggcg gttca                  45
<210>6
<211>15
<212>PRT    
<213>
<400>6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>7
<211>357
<212>DNA
<213>
<400>7
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<210>8
<211>119
<212>PRT
<213>
<400>8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Phe Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Ser Ile Lys Gly Tyr Ser Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ser Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Val Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Asn Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Glu Thr Ile Leu Ala Thr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
            100                  105                  110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
        115
<210>9
<211>336
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<213>
<400>9
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc     60
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<210>10
<211>112
<212>PRT
<213>
<400>10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Asn Ile Asn Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Asn Leu Thr Ile Ser Ser Pro Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Thr Phe Ser Ala
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
<210>11
<211>36
<212>DNA
<213>
<400>11
gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca ctggcc    36
<210>12
<211>12
<212>PRT
<213>
<400>12
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala
1               5                   10

Claims (9)

1.人源抗狂犬病毒中和性抗体,其特征在于重链和轻链的可变区氨基酸序列分别如序列表中序列2和序列4所示。
2.根据权利要求1所述的人源抗狂犬病毒中和性抗体,其特征在于重链和轻链的可变区编码基因的核苷酸序列分别如序列表中序列1和序列3所示。
3.权利要求1所述人源抗狂犬病毒中和性抗体的基因工程改构体,其特征在于重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别如序列表中序列8和序列10所示。
4.权利要求3所述人源抗狂犬病毒中和性抗体的基因工程改构体,其特征在于重链可变区和轻链可变区编码基因的核苷酸序列分别如序列表中序列7和序列9所示。
5.权利要求1-2任一所述人源抗狂犬病毒中和性抗体或权利要求3-4任一所述基因工程改构体的制备方法,包括如下步骤:
(1)制备人源抗狂犬病毒中和抗体或基因工程改构体编码基因,包括IgG部分或全基因;
(2)将该基因克隆入原核或真核表达载体,制备重组表达质粒;
(3)将制备的重组表达质粒分别转入原核细胞或真核细胞中进行表达。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其中制备人源抗狂犬病毒中和性抗体或基因工程改构体编码基因采用化学合成或基因工程方法。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其中原核表达载体为pCANTAB-5E或pET系列,真核表达载体为pPIC系列、pEF1或pTriEx;原核细胞是大肠杆菌HB2151或BL21(DE3),真核细胞是GS115或CHO。
8.权利要求1-2任一所述人源抗狂犬病毒中和性抗体或权利要求3-4任一所述基因工程改构体在制备狂犬病预防或治疗药剂中的用途。
9.权利要求1-2任一所述人源抗狂犬病毒中和性抗体或权利要求3-4任一所述基因工程改构体在制备狂犬病毒检测试剂中的用途。
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