JPH07509776A - Ｂ型肝炎ウイルス受容体活性を有するエンドネキシン■由来ポリペプチド，並びに診断および製剤組成物におけるその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

Ｂ型肝炎ウィルス受容体活性を有するエンドネキシン■由来ポリペプチド、並び に診断および製剤組成物におけるその用途本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ ）受容体活性を有するポリペプチドに関する。 本発明は、ＨＢＶ感染に対抗する新規製剤組成物とともにＨＢＶに対する新規ワ クチン組成物にも関する。Ｂ型肝炎ウィルスは、世界的に分布するウィルスであ って、慢性肝臓疾患や肝癌のような大きな医学的問題を生起している（Ｇａｎｅ ｍ　（１９８２年）　、５ｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＺｅｎｔｇｒａｆ　（１９９ ０年）］。それは、アヒル、ジリスおよびウッドチャックの肝炎ウィルスととも にヘパドナウィルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）という科に属し、顕著 な肝親和性および種特異性をそれらと共有している（　Ｓｕｍｍｅｒｓら（１９ ８１年）　、ＧａｎｅｍおよびＶａｒｍｕｓ　（１９８７年）　、　Ｌｅｅｎｄ ｅｒｓら（１９９２年）〕。 ＨＢＶ外皮は、大きさの異なる３種類の関連する糖蛋白質（表面抗原、すなわち ＨＢｓＡｇ）からなるが、それらのすべてがただ１個のＳ遺伝子の生産物であっ て、それらは（１）「メジャー」またはスモールＳ蛋白質と称される、２２６の アミノ酸からなる小型の膜横断（糖）蛋白質、（２）ｒミドル」蛋白質、すなわ ちＳ遺伝子のブレＳ２領域に対応するＮ末端に５５のアミノ酸が加わったスモー ルＳ蛋白質；　（３）Ｓ＋ブレＳ２＋プレｓｉ領域（第１０８〜１１９番Ｎ末端 アミノ酸）で構成される３８９または４００のアミノ酸からなる「ラージ」　（ 糖）蛋白質である［ｔＩｅｅｒｍａｎら（１９８４年）　、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら （１９８７年）］。 ＨＢＶが標的細胞に付着し、最終的には侵入する機序は、あまり理解されていな い。ＨＢＶ外皮蛋白質と細胞表面膜との相互作用を解明するための多くの試みが なされている。ＨＢＶはヒト肝細胞の表面の特定の分子を認識すること、そして ウィルス外皮（メジャー、ミドルおよびラージＨＢｓＡｇ）はこれらの受容分子 の認識に重要な役割を果たしている可能性があることが示唆されている。 ＴｈｅｉｌｍａｎｎおよびＧｏｅｓｓｅｒ　（１９９１年）は、先行技術の概観 を与えたが、そこには、ＨＢＶの結合は、ＨＢＶ外皮のブレＳ蛋白質のエピトー プに媒介されることを示す増加する証拠が提示されている。 実際、ラージＨＢｓＡｇのブレＳ１領域（第２１〜４７アミノ酸残基）は、ヒト の肝組織はもとよりＨｅｐＧ２細胞にも由来する形質膜に対しての、付着部位を 含むことが報告されている［　Ｎｅｕｒａｔｈら（１９８６年）　、　Ｐｏｎｔ ｉｓｓｏら（１９８９年ａ）　、　Ｐｏｎｔｉｓｓｏら（１９８９年ｂ）　、　 Ｎｅｕｒａｔｈら（１９９０年）　、Ｄａｓｈら（１９９２年）　、　Ｐｅｔｉ ｔら（１９９２年）］。その上、ミドルＨＢｓＡｇは、ブレＳ２領域内で、重合 したヒト血清アルブミン（ｐＨＳＡ）に特異的に結合することが発見された［Ｍ ａｃｈｉｄａら（１９８４年）　、　Ｐｏｎｔｉｓｓｏら（１９８９年ａ）　、 　Ｄａｓｈら（１９９１年）］。更に、ｐＨ３Ａは、その結合は種特異的ではな いが、肝細胞に結合する。ＶｅｒｏおよびＨｅｐＧ２細胞へのメジャーＨＢｓＡ ｇの特異的結合も既に立証されている［Ｋａｉｓｅｒら（１９８６年）　、　Ｐ ｅｅｐｌｅｓら（１９８７年）］が、ＨＢＶのこの表面蛋白質は、肝細胞へのウ ィルスの侵入に重要な役割は果たしていないと考えられた［　Ｐｏｎｔｉｓｓｏ ら（１９８９年ａ）　、Ｐｏｎｔｉｓｓｏら（１９８９年以前の研究では、メジ ャーＨＢｓＡｇは、正常なヒト肝細胞に特異的に結合できることが観察された［ Ｌｅｅｎｄｅｒｓら（１９９０年）］。対照的に、ラージＨＢＳＡｇと形質膜小 胞との特異的結合は明白であるが、正常な肝細胞と組換えラージＨＢｓＡｇとの 間には、特異的結合は全く起こらない［Ｌｅｅｎｄｅｒｓら（１９９［）年）］ 。更に、メジャーＨＢｓＡｇで予防接種された個体は、ＨＢＶ感染に耐性である 。その上、メジャーＨＢｓＡｇ内の環状配列［Ｗａｔｅｒｓら（１９８６年）］ に対するマウスモノクローナル抗体であるＲＦ−ＨＢｓ−１は、チンパンジーで のＨＢＶ感染を無効化することが示され［Ｉｗａｒｓｏｎら（１９８５年）］、 この環状エピトープに対する抗体は、予防接種された患者、およびＨＢＶ感染か ら回復中の回復期患者に常に存在する［Ｗａｔｅｒｓら（１９８７年）］、更に 、抗メジャーＨＢｓＡｇモノクローナル抗体は、ＨｅｐＧ２細胞へのウィルス粒 子の結合を、ブレＳ１ペプチドに対するモノクローナル抗体より効率的に阻害す ることが示されている［Ｐｅｔｉｔら（１９９１年）］。最後に、正常細胞への メジャーＨＢｓＡｇの特異的結合は、アフリカミドリザルの腎細胞（Ｖｅｒｏ細 胞系）およびヒト肝芽腫ＨｅｐＧ２細胞系についても見いだされている［Ｐｅｅ ｐｌｅｓら（１９８７年）　、Ｋａｉｓｅｒら（１９８６年）］。 エンドネキシン■（アネキシンＶ）は、アネキシンとして知られる構造的に関連 するＣ　ａ”依存性リン脂質結合蛋白質の種族の一員であって、３２〜６７キロ ダルトンの分子量を有する［Ｋｌｅｅ　（１９８８年）　、　ＺａｋｓおよびＣ ｒｅｕｔｚ　（１９９０年）］、この種族の個々の蛋白質は、開口分泌のメジエ ータ−１細胞骨格の成分、ホスホリパーゼＡ２の阻害剤、凝固の阻害剤および蛋 白質−チロジンキナーゼを同定するという一見無関係な目標を有した研究者らに よって発見された。完全または部分的な配列分析によって、少なくとも１２の別 個のアネキシンの存在が確定されている。これらの蛋白質は、蛋白質のｒＥＦハ ンド」族のような他の公知のＣａ”結合蛋白質との構造的類似性を有さない［Ｚ ａｋｓおよびＣｒｅｕｔｚ　（１９９０年）］。 多数の研究室からのデータも、アネキシンは異なる種（例えばヒト、ラット、ウ シ、ニワトリなど）の様々な組織から見いだされること、例えば、シネキシンは 肝臓から日常的に単離されるが、副腎髄質、脳、牌臓および末梢血白血球にも存 在することを示している［Ｋｌｅｅ　（１９８８年）］。エンドネキシン■は、 胎盤、肝臓、牌臓、肺および腸に見いだされる［Ｃｏｍｅｒａら（１９８９年） 　、　Ｗａｌｋｅｒら（１９９０年）］。 エンドネキシン■は、当初は、胎盤膜への可逆的なＣａ”依存性結合を受ける主 要な細胞内蛋白質として検出された［Ｈａｉｇｌｅｒら（１９８７年）　、　５ ｃｈｌａｅｐｆｅｒら（１９８７年）　、　Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら（１９８７） 年］。独立に、同じ蛋白質が、血液凝固の生体外阻害剤として［Ｆｕｎａｋｏｓ ｈｉら（１９８７年）　、　Ｉｗａｓａｋｉら（１９８７年）　、　Ｇｒｕｎｄ ｍａｎｎら（１９８８年）］、およびホスホリパーゼＡ２活性のそれとして（Ｐ ｅｐｉｎｓｋｙら（１９８８年）コ同定された。 配列比較は、個別にエンドネキシンＨ［Ｋａｐｌａｎら（１９８８年）］、胎盤 抗凝固蛋白質すなわちＰ　Ａ　Ｐ　（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら（１９８７年）〕、 Ｐ　Ｐ　４　［Ｇｒｕｎｄｍａｎｎら（１９８８年）］、リボコルチンＶ　［Ｐ ｅｐｉｎｓｋｙら（１９８３年）］およびアネキシンＶ　［Ｂｉａｎｃｈｉら（ １９９２年）】と呼ばれる蛋白質が実際は一つであって、その後はエンドネキシ ン■と呼ばれることになる同じ蛋白質であることを示した。 ステロイドの副作用なしに抗炎症効果が望まれる様々な病態の治療のためのエン ドネキシンＨの臨床的用途のみならず、（血液凝固におけるような）正常なリン 脂質の構造または機能に干渉することが望ましい臨床的状態の診断および治療の ためのその用途が、ヨーロッパ公開特許第０．３９９．２８５号公報に示唆され ている。その上、ヨーロッパ公開特許第０．３３０．３９６号公報は、リウマチ 性疾患、アレルギー性疾患、皮膚科疾患、眼科疾患および膠原病の治療における リボコルチン■の用途を開示している。アネキシン族の抗凝固蛋白質である血管 抗凝固蛋白質（ＶＡＣ＝エンドネキシン■）を腫瘍の転移防止のための薬剤とし て用いることは、国際公開特許第９１１０７１８７号公報に開示されている。こ の特許願には、好ましくは体重１ｋｇあたり約０．０１〜約０．１ｍｇ、より好 ましくは体重１ｋｇあたり約０．０１〜０．０５ｍｇにわたるＶＡＣを活性成分 として含有し、静脈内、筋向または皮下のいずれにも投与される製剤組成物が記 載されている。 観察された、血液凝固およびホスホリパーゼＡ２活性の生体外阻害は、これらの 酵素に対する基質であるリン脂質の捕獲に起因するものと思われ［１（ａＬｇｌ ｅｒら（１’１８７年）　、　Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら（１９８７年）］、エンド ネキシンＨの生理学的機能の反映ではない可能性がある。Ｐｅｐｉｎｓｋｙら（ １９１１７年）では、生体外でのホスホリパーゼＡ２の検定では、リボコルチン 様蛋白質が阻害性であるが、阻害の機序には、議論の余地が残されている。その 結果、エンドネキシンＨの真の生理学的機能は大部分未確定のままである。更に 、いくつかの所見は、膜構造を変化させる際のアネキシン類の能動的な役割とい う概念を支持する［総説についてはＫａｒｓｈｉｋｏｖら（１９９２年）を参照 されたい］。これに関連して、アネキシン５は、完全な膜蛋白質のような挙動を 示すことが記載されている［Ｂｉａｎｃｈｉら（１９９２年）］、更に、エンド ネキシン■は、いったん膜に結合すると、Ｃａ”イオンに対する際立った選択性 を有するカルシウム選択的な、電位型（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ　）カチオ ンチャネルを形成することが証明された（Ｒｏｊａｓら（１９９０年）］。 エンドネキシン■は、アキキシン／リボコルチン族の他の成員との、特に各蛋白 質内で４回反復される共通配列内で、広範囲の配列相同性を有する。これらの蛋 白質での主要な構造的差異は、アミノ末端領域の可変の長さである［総説につい てはＣｒｏＩＩｌｐｔｏｎら（１９８８年）を参照のこと］。ヒトおよびラット のエンドネキシン■蛋白質は、９２％の配列相同性を共有している［Ｋａｐｌａ ｎら（１９８８年）、Ｐｅｐｉｎｓｋｙら（１９８８年）］。加えて、ヒトのエ ンドネキシン■、並びに細胞表面に作用して、細胞外マトリックス成分のコラー ゲンへの粘着を媒介すると想定される蛋白質であるニワトリのアンコリンｃｍも （Ｐｒａｆｆｌｅら（１９８８年）］、驚くべき程の構造的類似性を有する［Ｈ ａｉｇｌｅｒら（１９８９年）］。 上記のとおり、多（の研究が、ウィルスの結合がＨＢＶ外皮のブレＳ蛋白質のエ ピトープに媒介されるとの証拠に主として基づいて、ヒト肝細胞に存在し得るＨ ＢＶに対する受容体の解明に関係している。しかしながら、そのような受容体の 存在に関しては、いかなる直接的な生化学的証拠も発見できなかった。この理論 とは反対に、上記のデータのい（っかは、正常なヒト肝細胞はもとよりＶｅｒｏ およびＨＥＰＧ２細胞とのメジャーＨＢｓＡｇ（Ｓ蛋白質）の結合を指し示して いる。 したがって、本発明の目的は、ヒト肝細胞に存在し得る、組換えおよび血清由来 のラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇに特異的に結合するＨＢＶ受容体の 性質を解明することにある。 本発明の目的は、ＨＢＶ受容体活性を有するポリペプチド、およびそれに由来す る基本要素を提供することである。 本発明のもう一つの目的は、Ｂ型肝炎ウィルスの感染の予防および治療に役立つ 製剤組成物を提供することである。 本発明のもう一つの目的は、ＨＢＶ感染に対する新規ワクチン組成物を提供する ことである。 本発明のもう一つの目的は、いくつかの範喀のＨＢＶ感染（すなわち、慢性的肝 臓感染を発症することが予測される人々）を診断する新規な手段を提供すること である。 本発明のもう一つの目的は、ＨＢＶ感染症の治療に用い得る可能な薬物を包含す るＨＢＶ受容体リガンドの判定を可能にするスクリーニング法を提供することで ある。 本発明は、より具体的には、ヒトエンドネキシン■とラージおよび／またはメジ ャーＨＢｓＡｇとの間の結合を生体外で判定する方法において、 −ラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇの受容体であるという特性を有する ポリペプチドであって、・ヒトのエンドネキシン■、 または ・ラージおよび／もしくはメジャーＨＢｓＡｇに容易に結合するような、ヒトエ ンドネキシン■由来ムティン、または ・ヒトエンドネキシンＨの断片（ここで、この断片は、本ラージおよび／もしく はメジャーＨＢｓＡｇに容易に結合するようなもの、 または ＊ヒトエンドネキシンＨに対して産生された抗体によって認識され、モしてＨＢ Ｖ感染を無効化（中和）することができるようなもの、 または 車上記エンドネキシン■を、またはラージおよび／もしくはメジャーＨＢｓＡｇ を、または上記に定義のポリペプチドに対応し、ラージおよび／もしくはメジャ ーＨＢｓＡｇの受容体であるという特性を失わないような局所的な変異部分を含 む変種ポリペプチドを、容易に認識する抗体を容易に生成するようなものである ）、特に： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦ　ＩＴＩＦＧＴＲ３ＶＳＨＬＲＫ ＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ。 なるエンドネキシンＨのペプチド類 を含むか、またはそれによって構成されるポリペプチド、あるいは 一上記に定義のエンドネキシン■、またはそのムティンもしくはその断片に関す る受容体リガンドまたはアンチセンスペプチド、あるいは 一エンドネキシン■、上記に定義のムティンもしくは上記に定義の断片に向けら れたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、あるいは −上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対するポリクロー ナルもしくはモノクローナル抗体、あるいは−エンドネキシン■、上記に定義の ムティンもしくは上記に定義の断片に対して産生された抗イデイオタイプ抗体、 またはエンドネキシン■、上記に定義のムティンにもしくは上記に定義の断片に 対して産生された拭払イディオタイプ抗体、あるいは−上記に定義の受容体リガ ンドもしくはアンチセンスペプチドに対して産生された抗イデイオタイプ抗体、 または上記に定義の受容体リガンドもしくはアンチセンスペプチドに対して産生 された拭払イディオタイプ抗体、あるいは 一ラージおよび／もしくはメジャーＨＢｓＡｇの受容体であるという特性を有す るポリペプチドの少なくとも一つをコードするか、または上記に定義のムティン もしくは断片の少なくとも一つをコードする遺伝子もしくは遺伝子断片でトラン スフェクション（導入）された細胞に対して活性である物質 の使用を含む方法に関する。 本発明者らは、ヒト肝細胞の形質膜にエンドネキシン■であるとして存在するＨ ＢＶ受容体を単離し、特性付けることができた。精製された感染性ＨＢＶ粒子は 、感染した個体の血液からは少量が得られるにすぎない。充分量の精製された感 染性ＨＢＶ粒子を得るための精製操作は、これらの粒子の特性を失うことなしに は困難である。したがって、本発明は、好適にも、２２ｎｍの非感染性血漿由来 の粒子、およびコウボ由来の組換えＨＢｓＡｇからなる粒子を利用したが、これ らはより大量に入手することが可能である［ＭｃＡｌｅｅｒら（１９８４年）］ 。これらの粒子は、ＨＢＶのラージおよび／またはメジ型−ＨＢｓＡｇ外皮蛋白 質のみを含有する。 ヒトエンドネキシン■は、例えばＫａｐｌａｎら（１９８８年）に開示されてい る。 本明細書中では、「ヒトエンドネキシン■」という表現は、「ヒト肝エンドネキ シン■」を指す。 「ラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇの受容体であるという特性な荷する ポリペプチド」という表現は、そのポリペプチドは、上記に定義の条件下でラー ジおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇに結合できるという事実に対応する。結合 の性質は、例えば、ＤＳＳ　（スペリン酸ジスクシンイミジル）が理想的な架橋 結合剤として作用できる可能性によって決定される。そのため、エンドネキシン ■とラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇとの結合相互作用は、分子が１１ ．４オングストロームの相互作用距離で作用し合うようなそれとなる。 上記の結合条件は、例として与えられており、上記の条件下で定義されたものと 結合の機能が同等のままであるような限度内で、当業者によって変更できること に留意すべきである。 ラージおよび／またはメジャーＨＢＳＡｇに容易に結合する「ヒトのエンドネキ シンＨに由来するムティン」という用語は、実験的には、下記の条件下で決める ことができる：１１１標識ムティン約１５ｎｇ（０，４４ピコモル）を、マイク ロタイタープレートの１ウエルごとに被覆しておいたラージおよび／またはメジ ャーＨＢｓＡｇｌμｇとともに室温で１時間温置（インキュベート）し、標識さ れていない過剰な（２μｇ）ヒトエンドネキシンＨによって、少なくとも４０％ 、好ましくは５０％以上の阻害が得られたならば、特異的結合が生起したと考え 、結合の阻害は、先ずマイクロタイタープレートのウェルを洗浄し、次いで残留 放射能の量を計測することによって測定する。 ラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇに容易に結合する「エンドネキシンＨ の断片」という表現は、実験的には、下記の条件下で同定してよい： 約０．４４ピコモルのｌ！ｓ工標識断片を、マイクロタイタープレートの１ウエ ルごとに被覆しておいたラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇｌμｇととも に室温で１時間温置し、過剰な（２μｇの）非標識ヒトエンドネキシン■によっ て、少なくとも４０％、好ましくは５０％以上の阻害が得られたならば、特異的 結合が生起したと考え、結合の阻害は、先ずマイクロタイタープレートのウェル を洗浄し、次いで残留放射能の量を計測することによって判定する。 ラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇに容易に結合するエンドネキシン■の 断片の例は、本明細書の実施例の項に含まれ、より具体的には、下記のアミノ酸 配列を有するＦまたはＳとして指定されたペプチドを包含する： ペプチドＦ：ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲ３ＥＩＤ　（ビークＦ）、ペブｆドｓ　： 　ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩ ＫＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ　（ビークＳ）、Ｊ、及びペプチド：　ＤＥＥＫＦ ＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ　（ビーク ＬおよびＮ）。 「受容体リガンド」という用語は、ヒト肝エンドネキシンＨに結合する特性を有 する特異的リガンドまたはリガンドの一部に対応し、ヒト肝エンドネキシン■に 結合する特性は、下記のとおり試験することができる： 放射能標識したラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇを、約５０．０００の ヒト肝細胞を含有する懸濁液とともに室温で１時間温置し、増加量の受容体リガ ンドを加えることによって、少なくとも４０％、好ましくは５０％以上の阻害が 得られたならば、特異的結合が生起したと考え、結合の阻害は、先ず肝細胞懸濁 液を洗浄し、次いで残留放射能の量を計測することによって判定し、負の対照と して、ヒトエンドネキシン■を欠（細胞、例えばラット肝細胞を、上記のとおり 、放射線標識した受容体リガンドと温室する。 受容体リガンドの好ましい例示は、例えば、下記に定義のアンチセンスペプチド はもとより、肝細胞の形質膜に存在するヒト肝エンドネキシンＨに特異的に結合 し得る薬物も包含する。 「アンチセンスペプチド」という用語は、Ｂｌａｌｏｃｋ　（１９９０年）およ びＲｏｕｂｏｓ　（１９９０年）によって総説されている。これに関連して、分 子認識説［Ｂｌａｌｏｃｋ　（１９９０年）］は、相補的核酸配列が作用し合う ことばかりでなく、その上に、蛋白質の相互作用部位が相補的アミノ酸配列で構 成されている（センス−受容体リガンドまたはセンス−アンチセンスペプチド） ことも述べている。したがって、同−読み枠内の相補的核酸配列に由来する２ペ プチドは、一方のアミノ末端を他方のカルボキシル末端と整合させたときに、そ れらの疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸の全体的な入れ替えを示す。この倒錯し たヒトロバシー的パターンは、そのような２ペプチドが特異的相互作用の原因と なる相補的配置をとることを可能にするものと思われる。 「受容体リガンド」という用語は、ヒト肝細胞の形質膜に存在するヒトエンドネ キシン■を容易に認識するあらゆるリガンドに対応する。 ヒトエンドネキシンＨに対する抗イデイオタイプ抗体という用語は、ヒトエンド ネキシンＨに対して出現させたモノクローナル抗体の可変領域の抗原決定基に対 して出現させたモノクローナル抗体を意味する。免疫グロブリンのこれらの抗原 決定基は、イディオタイプ（イデオトーブのセット）として知られ、そのため、 抗体の「指紋」として考えることができる［総説についてはｄｅ　Ｐｒｅｖａｌ 　（１９７８年）　、　ＦｌｅｉｓｈｍａｎｎおよびＤａｖｉｅ　（１９８４年 ）を参照されたい］、モノクローナルの抗イデイオタイプ抗体を生産する方法は 、ＧｈｅｕｅｎｓおよびＭａｃＦａｒｌｉｎ　（１９８２年）によって記載され ていて、本明細書の実施例の項に文書化されている。モノクローナル抗イデイオ タイプ抗体は、それらを出現させたモノクローナル抗体のイディオタイプととも に免疫複合体を形成する特性を有する。これに関連して、このモノクローナル抗 体はＡｂｌと呼ばれ、抗イデイオタイプ抗体はＡｂ２と呼ばれる。したがって、 ヒトエンドネキシン■、またはそれに由来するムティンもしくは断片に関するＡ ｂ２は、ＨＢＶの受容体結合部位を認識することができ、その結果、このＨＢＶ の結合部位をブロックすることができ、それによって、ＨＢＶの付着および感染 を防止する。 抗イデイオタイプ抗体（Ａ　ｂ　２　）は、それ自体、Ａｂｌの代理として働き 得る、これらのポリペプチドに対する拭払イディオタイプ抗体（Ａｂ３）を生産 するための抗原として用い得る。 「ヒトのエンドネキシンＨに対する拭払イディオタイプ抗体」という表現は、ヒ トのエンドネキシンＨに対する抗イデイオタイプ抗体の可変領域に対して出現さ せた抗体を指す。 本発明は、下記のうちの少なくとも一つを活性物質として含有する製剤組成物に も関するニ ーラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇの受容体であるという特性を有する ポリペプチドであって、・体重１ｋｇあたり０．６〜５０ｍｇ、好ましくは１〜 ３０ｍｇ、より好ましくは５〜１５ｍｇの量で存在するヒトエンドネキシン■、 または ・ラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇに容易に結合するような、ヒトエン ドネキシン■由来ムティン、または ・ヒトエンドネキシンＨの断片（ここで、この断片は、＊ラージおよび／または メジャーＨＢｓＡｇに容易に結合するよう＊ヒトエンドネキシンＨに対して産生 された抗体に容易に認識され、ＨＢＶ感染を無効化（中和）することができるよ うなもの、または 車上記エンドネキシン■を、または上記に定義のポリペプチドに対応し、ラージ および／もしくはメジャーＨＢｓＡｇの受容体であるというその特性を失わない ような局所的な変異部分も含む変種ポリペプチドを、容易に認識する抗体を生成 できるようなものである）、特に： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲ３ＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶ ＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ、なるエンドネキシンベブチドを含むか、ま たはそれによって構成されるポリペプチド、あるいは 一上記に定義のエンドネキシン■、そのムティンまたはその断片に関する受容体 リガンドもしくはアンチセンスペプチド、あるいは 一ヒトエンドネキシン■、またはそのムティンに、またはその断片に対して産生 された、好ましくは体重１ｋｇあたり１０μｇ〜１ｍｇの量で存在するヒトモノ クローナル抗体、もしくはマウスモノクローナル抗体の人体適応バージョン、あ るいは−上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対するポリ クローナルもしくはモノクローナル抗体、好ましくはヒトモノクローナル抗体、 あるいは 一ヒトエンドネキシンＨに、もしくは上記に定義のムティンに、もしくは上記に 定義の断片に対して産生された抗イデイオタイプ抗体、またはヒトエンドネキシ ンＨに、もしくは上記に定義のムティンに、もしくは上記に定義の断片に対して 出現させた抵抗イディオタイプ抗体、あるいは 一上記に定義の受容体リガンドもしくはアンチセンスペプチドに対して出現させ た抗イデイオタイプ抗体、または上記に定義の受容体リガンドもしくはアンチセ ンスペプチドに対して産生された抵抗イディオタイプ抗体、あるいは 一ラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇの受容体であるという特性を有する ポリペプチドの少なくとも一つをコードするか、または上記に定義のムティンも しくは断片の少なくとも一つをコードする遺伝子もしくは遺伝子断片によってト ランスフエフシロンされた細胞に対して活性である物質。 「マウスモノクローナル抗体の人体適応バージョン」という表現は、組換えＤＮ Ａ技術を用いて、マウスおよび／またはヒトの、ＨおよびＬ鎖をコードするゲノ ムＤＮＡ配列の一部、またはＨおよびＬｌｌをコードするｃＤＮＡクローンから 出発して作成されたモノクローナル抗体に対応する。 「受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対するヒトモノクローナル抗体 」という表現は、例えば′、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のマウスのヒト末 梢血リンパ球（ＰＢＬ）再集団形成を用いて製造したモノクローナル抗体に関す る［最近の総説についてはＤｕｃｈｏｓａｌら（１９９２年）を参照されたい］ 。要するに、（ヒトＢ細胞のすべてを生成することが可能な）ヒト造血器官系を 用いて５ＣＩＤマウスを再集団形成させる。再集団形成後、これらの５ＣＩＤマ ウスを、例えばＨＢＶで免疫して、ヒトモノクローナル抗体の形成を誘導する。 これに代えて、ＨＢＶ感染から回復中の、ＨＢＶに反応したＢ細胞を有すると思 われ、好ましくは無効化能（中和能）を有するＩｇを保有または分泌する回復期 患者からＢ細胞を採取し、エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）またはレトロ ウィルスをトランスフェクションさせることによりこれらのＢ細胞を不死化する ことによって、ヒトモノクローナル抗体を製造することができる。これに代えて 、必ずしも）（ＢＶに感染していない異なる人々からの同じＢ細胞、または白血 球のプールを採取し、単離したｍ　ＲＮ　ＡからｃＤＮＡライブラリー（全体の でもよいが、優先的には、ＰＣＲを用いてＨＩｌｃＤＮＡおよびＣ１１ｃＤＮＡ のみを形成した）を作成する。最後に、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｏファージおよびｃ　 Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｌファージを加え併せ、組換えＩｇＧ抗ＨＢＶのスクリーニングを 実施することかできる。 ヒトエンドネキシン■またはそのムティン、またはその断片に対するヒトモノク ローナル抗体は、はじめに、ヒトエンドネキシンＨの断片またはムティン（患者 に免疫応答を容易に誘発する）で免疫し、この患者からＢ細胞を採取し、そして これらのＢ細胞で５ＣＩＤマウスを再集団形成させることによって得ることがで きる。これらの再集団形成させた５ＣＩＤマウスを同じエンドネキシンＨの断片 またはムティンで免疫すると、上記に定義のとおり、大量のエンドネキシンＨの ヒトモノクローナル抗体を得ることができる。 本発明の好都合な実施態様によれば、製剤（医薬）組成物は、活性物質として、 ヒトのエンドネキシン■、もしくは下記のアミノ酸を表１に示したとおりに置き 換え得る該ヒトエンドネキシン■由来のムティン、または上記に定義の、より具 体的にはＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ、ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥ ＫＶＬＴＥｌ、ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、オヨび ＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ というエンドネキシンペプチドのような、ヒトエンドネキシンＨの断片を含むか 、あるいはそれらで構成されたポリペプチドを含有し、該エンドネキシン■は、 体重１ｋｇあたり０．６〜５０１Ｉ１ｇ、好ましくは１〜３０１０ｇ、より好ま しくは１０〜１５ｍｇの量で存在する。 アミノ酸　同義群 Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　、　Ｔｈｒ　、　Ｇｌｙ　、　ＡｓｎＡｒｇ　Ａｒｇ　、　Ｈ ｉｓ　、　Ｌｙｓ　％Ｇｌｕ　、　ＧｉｎＬｅｕ　Ｌｅｕ　、　Ｉｌｅ　、　Ｍ ｅｔ　、　Ｐｈｅ　、　Ｖａｌ　、　ＴｙｒＰｒｏ　Ｐｒｏ　％Ａｌａ　％Ｔｈ ｒ　、　ＧＬｙＴｈｒ　Ｔｈｒ　％Ｐｒｏ　％Ｓｅｒ　、　Ａｌ’ａ　、　Ｇｌ ｙ　、　Ｈｉｓ　、　ＧｉｎＡｌａ　Ａｌａ　、　Ｐｒｏ　、　Ｇｌｙ　、　Ｔ ｈｒＶａｌ　Ｖａｔ　、　Ｍｅｔ　、　ｌｉｅ　、　Ｔｙｒ　％Ｐｈｅ　、　Ｌ ｅｕ　、　ＶａｌＧｌｙ　Ｇｌｙ　、　Ａｌａ　、　Ｔｈｒ　、　Ｐｒｏ　、　 ５ｅｔ１１ｅ　Ｉｌｅ　、　Ｍｅｔ　、　Ｌｅｕ　、　Ｐｈｅ　、　Ｖａｌ　、 　Ｉｌｅ　、　ＴｙｒＰｈｅ　Ｐｈｅ　、　Ｍｅｔ　、　Ｔｙｒ　％Ｉｃｅ　、 　Ｌｅｕ　、　Ｔｒｐ　、　ＶａｌＴｙｒ　Ｔｙｒ　、　Ｐｈｅ　、　Ｔｒｐ　 、　Ｍｅｔ　、　Ｉｌｅ　％Ｖａｌ　、ＬｅｕＣｙｓ　（：ｙｓ　、　Ｓｅｒ　 、　ＴｈｒＨｉｓ　Ｈｉｓ　、　Ｇｉｎ　、　Ａｒｇ　、　Ｌｙｓ　％Ｇｌｕ　 、　ＴｈｒＧｉｎ　Ｇｌｎ　、　Ｇｌｕ　、　Ｈｉｓ　、　Ｌｙｓ　、　Ａｓｎ 　、　Ｔｈｒ　、　ＡｒｇＡｓｎ　Ａｓｎ　、　Ａｓｐ　、　Ｓｅｒ　、　Ｇｉ ｎＬｙｓ　Ｌｙｓ　、　Ａｒｇ　、　Ｇｌｕ　、　Ｇｉｎ　、　ＨｉｓＡｓｐ　 Ａｓｐ　、　Ａｓｎ　、　ＧｌｕＧｌｕ　Ｇｌｕ　、　Ｇｉｎ　、　Ａｓｐ　、 　Ｌｙｓ　、　Ａｓｎ　、　Ｈｉｓ　、　ＡｒｇＭｅｔ　Ｍｅｔ　、　Ｉｌｅ　 、　Ｌｅｕ　、　Ｐｈｅ　％Ｖａ１本発明のこの好適実施態様による物質は、Ｈ ＢＶのエンドネキシン■結合部位について、肝細胞形質膜に存在するヒトエンド ネキシン■と競合する。これらのポリペプチド、ムティンおよび断片は、それら がウィルスをブロックする限りは薬理学的に活性であり、したがってＨＢＶが肝 細胞に付着かつ感染するのを防止する。 もう一つの好適な製剤組成物は、活性物質として、上記に定義の受容体リガンド またはアンチセンスペプチドを含有する。 本発明の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドは、ＨＢＶ受容体であるエ ンドネキシンＨの分子に存在するＨＢＶ結合部位について、ウィルスと競合する 。これらの受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドは、それらがヒト肝細胞 に存在するヒトエンドネキシン■のＨＢＶ結合部位をブロックする限りは薬理学 的に活性であり、したがって肝細胞をウィルスの付着および感染から防護する。 本発明のもう一つの好適製剤組成物は、活性物質として、−ヒトエンドネキシン Ｈに、そのムティンに、または上記に定義の断片に、より具体的にはエンドネキ シンベブチド：ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ、 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩ　ＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫ ＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ に対して産生された抗イデイオタイプ抗体、あるいは−ヒトエンドネキシンＨに 、またはそのムティンに、または上記に定義の断片に、より具体的にはエンドネ キシンベブチド：ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲ３ＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦ　Ｉ　Ｔ　Ｉ　ＦＧＴＲＳＶＳＨ ＬＲＫＶＦＤＫＹＭＴ　Ｉ　ＳＧＦＩＥＥＴＩ に対して産生された拭払イディオタイプ抗体を含有する。 エンドネキシンＨに、またはそのムティンに、または上記に定義の断片に対して 産生された抗イデイオタイプ抗体は、ＨＢＶの受容体結合部位を認識し、その結 果、ＨＢＶのこの結合部位をブロックし、それによってＨＢＶの付着および感染 を防止する。 エンドネキシンＨに、またはそのムティンに、または上記に定義の断片に対して 出現させた拭払イディオタイプ抗体は、ウィルスとの競合体であり、それらが肝 細胞のヒトエンドネキシン■のＨＢｓＡｇ結合部位をブロックする限り、薬理学 的に活性であり、肝細胞をウィルスから防護する。 ｒＨＢＶ結合部位」という表現は、より具体的には、ＨＢｓＡｇ結合部位に関す る。 もう一つの好都合な製剤組成物は、活性物質として、−上記に定義の受容体リガ ンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生されたポリクローナルもしくはモ ノクローナル抗体、好ましくはヒトモノクローナル抗体、あるいは−上記に定義 の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生された抗イデイオタ イプ抗体、あるいは−上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチド に対して産生された拭払イディオタイプ抗体を含有する。 受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生された抗イデイオタイ プ抗体は、ウィルスとの競合物質であり、それらが肝細胞のヒトエンドネキシン ■のＨＢｓＡｇ結合部位をブロックする限り、薬理学的に活性であり、肝細胞を ウィルスから防護する。 受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生されたポリクローナル もしくはモノクローナル抗体はもとより、拭払イディオタイプ抗体も、肝細胞の ヒトエンドネキシン■と競合し、それらがウィルスのエンドネキシン■付看部位 をブロックする限り、薬理学的に活性であり、ウィルスが肝細胞を攻撃するのを 防止する。 もう一つの好適な製剤組成物は、活性物質として、−ヒトエンドネキシンＨに、 またはそのムティンに、またはその断片、より具体的にはエンドネキシンペプチ ド：ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲ３ＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶ ＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ に対して産生されたヒトモノクローナル抗体はもとよりマウスモノクローナル抗 体の人体適応バージョンも含有し、該抗体は、好ましくは体重１ｋｇあたり１０ μｇ〜１ｍｇの量で存在する。 エンドネキシンＨに、またはそのムティンに、またはその断片に対して産生され たヒトモノクローナル抗体はもとよりマウスモノクローナル抗体の人体適応バー ジョンも、ＨＢＶ受容体のＨＢＶ結合部位、すなわちエンドネキシンＨについて ＨＢＶと競合し、それらがエンドネキシン■のＨＢＶ結合部位をブロックする限 り、ＨＢＶによって生起された疾病および／または感染の治療もしくは予防に薬 理学的に有効であり、したがって、肝細胞をＨＢＶの付着および感染から防護す る。このタイプの製剤組成物は、肝移植を受けなければならない慢性的ＨＢＶキ ャリアーに非常に役立つことができる。 本発明の製剤組成物は、好ましくは、慢性的ＨＢＶキャリアー、またはＨＢＶに 慢性的および／もしくは急性的に感染しているキャリアーの治療に用いることが できる。 好適実施態様によれば、本発明の製剤組成物における活性物質の量は、体重１ｋ ｇあたり約０．６〜約５０ｍｇ、好ましくは約１〜約３０ｍｇ、より好ましくは １０〜１５Ｈのエンドネキシン■の投与量に相当する。これらの製剤組成物の投 与の方式は、経腸的または、好ましくは非経腸的、すなわち静脈内、腹腔内、筋 向もしくは皮下であって、静脈内投与が好適である。 これらの製剤組成物の活性物質は、担体賦形剤なしに単独で投与してよいが、製 薬上許容され得る無害の担体または希釈剤とともに投与してもよ（、その比率は 、個々の担体の適切性および化学的性質によって決定される。 本発明は、活性物質として、上記に定義のエンドネキシンのムテインまたは断片 、より具体的にはエンドネキシンペプチドＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲ５ＶＳＨＬＲＫＶ ＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ を含有するワクチン組成物にも関する。 本発明は、活性物質として、 本上記に定義の受容体リガンドもしくはアンチセンスペプチド、または 本上記に定義の受容体リガンドもしくはアンチセンスペプチドに対して産生され た抗イデイオタイプ抗体を含有するワクチン組成物にも関する。 本発明による、上記に定義のエンドネキシンのムティンもしくは断片、受容体リ ガンドもしくはアンチセンスペプチド、または受容体リガンドおよびアンチセン スペプチドに対する抗イデイオタイプ抗体のいずれかを含有するＨＢＶワクチン 組成物は、既存のＨＢＶワクチン組成物には応答しないであろうＨＢＶ感染患者 に、より容易に免疫応答を生起すると思われることから、既知のＨＢＶワクチン 組成物にまさる特定の利点を有する。 先行技術のワクチン組成物、例えば、Ｈｉｌｌｅａ＋ａｎら（１９８３年）（Ｈ ＢＶに慢性的に感染している患者の血清から調製した粒子）、ＭｃＡｌｅｅｒら （１９８４年）、（組換えコウボワクチン）に記載され、Ｔｈｅｉｌｍａｎｎお よびＧｏｅｓｓｅｒ　（１９９１年）に総説がある。 本発明のワクチン組成物では、活性物質は、１回の免疫化につき、体重１ｋｇあ たりＨＢｓＡｇｌＯ〜１１００ＩＬに相当するエンドネキシン■結合部位の量、 すなわち、活性物質的０．１ナノモル〜１マイクロモル、好ましくは０．１〜１ ００ナノモル、最も好ましくは１〜１００ナノモルの量で存在する。 本発明の好都合な実施態様によれば、抗体゛は、体重１ｋｇあたり１０μｇ〜Ｌ Ｈの量で存在するのが好ましい。 本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードする組換えベクターを 用いて予め形質転換しておいた、細胞である宿主を適切な培地で培養し、該形質 転換した細胞性宿主が生産したポリペプチドを上記の該培地から回収することに よって製造することができる。 本発明のポリペプチド、より具体的にはペプチドは、古典的化学合成によって製 造することもできる。 この合成は、均質な溶液中で、または固相中で実施することができる。 例えば、均質溶液中での用い得る合成手法は、Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌによってｒ Ｍｅｔｈｏｄｅ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　ＣｈｅｍｉｅＪ　（有機化 学の方法）と題するＥ、　Ｗｕｎｓｈ編、第１５巻の工およびＩＩ、　Ｔｈ１ｅ ａ＋ｅ社、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（１９７４年）の書籍に記載されたそれである。 本発明のポリペプチドは、Ａｔｈｅｒｔｏｎおよび５ｈｅｐａｒｄによってｒｓ ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｊ　（Ｉ　ＲＬ 　Ｐｒｅｓｓ社、０ｘｆｏｒｄ（１９８９年））と題する彼らの書籍に記載され た方法に従って、固相中で製造することもできる。 アンチセンスペプチドは、Ｇｈｉｓｏら（１９９０年）に記載されたとおりに製 造することができる。この技術を用いて、相補性に関する簡単なヌクレオチド配 列分析によって、既知のペプチドとの適切な生理学的相互作用を有するペプチド を論理的に構築し、結合部位に相補的なペプチドを合成することが可能である。 本発明のモノクローナル抗体は、一方ではエンドネキシン■またはそのムティン もしくはその断片、または上記に定義の受容体リガンドもしくはアンチセンスペ プチドに対して免疫された動物、特にマウスまたはラットの牌臓細胞と、他方で は骨髄腫細胞系の細胞とから古典的方法に従って容易に形成され、初めに動物の 免疫化に用いられたポリペプチドを認識するモノクローナル抗体が生産できると いう、ハイブリドーマの能力によって容易に選別されるいかなるハイブリドーマ を用いても生産することができる。 本発明の抗体は、酵素性、蛍光性または放射性タイプの適切な標識で標識するこ とができる。 ヒトエンドネキシン■またはそのムティンもしくは上記に定義の５断片に対して 産生された抗イデイオタイプ抗体、またはヒトエンドネキシン■またはそのムテ ィンもしくは上記に定義の断片に対して産生された拭払イディオタイプ抗体、あ るいはヒトエンドネキシン■またはそのムティンもしくは上記に定義の断片に対 するマウスモノクローナル抗体の人体適応バージョンもしくはヒトモノクローナ ル抗体は、上記のとおりに製造することができる。 上記に定義の受容体リガンドもしくはアンチセンスペプチドに対して産生された 抗イデイオタイプ抗体、または上記に定義の受容体リガンドもしくはアンチセン スペプチドに対して産生された拭払イディオタイプ抗体、または受容体リガンド もしくはアンチセンスペプチドに対して産生されたヒトモノクローナ・ル抗体は 、上記のとおりに製造することができる。 本発明のポリペプチドの、細菌、例えば大腸菌、または真核細胞、例えばビール コウボ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または培養されたを椎動物もしくは無 を椎動物の宿主、例えば昆虫細胞、チャイニーズへムスター卵巣（ＣＨＯ）　、 Ｃｏ５ｔ、ＢＨＫおよびＭＤＣＫ細胞における発現を実施するには、下記の工程 を実施するニ一本発明のポリペプチドの一つをコードするヌクレオチド配列を、 適切な調節要素、特に細胞性宿主のポリメラーゼによって認識されるプロモータ ーの制御下で、また原核細胞性宿主の場合は、該細胞性宿主における該ヌクレオ チド配列の発現を可能にする適切なリポソーム結合部位（ＲＢＳ）の制御下で挿 入しておいたベクター、特にプラスミド、コスミド、ファージまたはウィルス（ ワクシニアＡもしくはＢ）［挿入断片］によって、適切な細胞性宿主を形質転換 させる工程、 一該挿入断片の発現を可能にする条件で該形質転換した細胞性宿主を培養する工 程。 酵母における発現のためには、調節要素は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼま たは他の解糖酵素についてのプロモーター、適切なポリアデニル化および終止シ グナルとともに適切な複製開始点を含むことができる。培養細胞に対する発現ベ クターは、複製開始点。 発現させようとする遺伝子の前に位置するプロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡ 切断部位、ポリアデニル化部位、および転写終止シグナルを有する。 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）における発現のためには、調節要素は、転写および翻 訳のための必要なすべてのシグナルを含まなければならない、それらは、大腸菌 で機能的である合成または天然供給源由来のいずれかのプロモーターを含むこと ができる。大腸菌での発現に広範囲に用いられるプロモーターの例は、ｌａｃ　 、　ｔｒｐ　、　ｔａｃ並びにラムダＰｉおよびＰｒプロモーターである。それ らは、下流のコード担持配列の翻訳を、したがって発現も可能にする合成または 天然供給源由来のいずれかのリポソーム結合部位を含むこともできる。 本発明は、分子が、上記に定義のポリペプチドのいずれか一つに関して受容体リ ガンドとしての挙動を示す能力を検出する方法であって、 一該分子を、上記の該ポリペプチドの一つをコードする挿入断片によってそれ自 体修飾されたベクターによって予め形質転換した、接触後に該挿入断片の発現が 必要ならば、このポリペプチドに特異的である１またはそれ以上の部位をその表 面に有する細胞性宿主に、該分子が該ポリペプチドに対する親和性を示すならば 、上記の該特異的部位の少なくとも一つと該分子との間の結合の形成を可能にす る条件下で実施されるように接触させること、−形成された可能性のあるリガン ド−ポリペプチド形式の複合体を検出すること を特徴とする方法にも関する。 本文脈中では、「リガンド」という用語は「受容体リガンド」を意味することが 理解されなければならない。 これに関連して、新規な抗肝炎薬のためのスクリーニング法を開発することがで きる。 本発明は、１個または数個の受容体リガンドに対する上記に定義のポリペプチド の親和性を検出する方法であって、−適切な宿主細胞を、上記に定義のポリペプ チドまたはペプチドの一つをコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞のポリメ ラーゼに認識され、かつ該宿主細胞における該ヌクレオチド配列の発現を可能に する調節要素、特にプロモーターの制御下で、予め挿入しておいた、ベクター、 特にプラスミドまたはファージ（挿入断片）を用いて形質転換させること、 一形質転換した細胞を、該挿入断片の発現、および発現した該ポリペプチドの、 膜に向かう輸送を可能にする結果、リガンドとの相互作用に必要とされる配列を 形質転換した宿主細胞の表面に露出させる条件下で培養すること、 −この宿主細胞を所定のリガンドと接触させること、−該形質転換した宿主細胞 と該所定のリガンドとの親和反応を検出すること を特徴とする方法にも関する。 上記の方法は、上記に定義され、またエンドネキシンＨの配列の一部のみを含む 断片の同定を可能にする。 この同定は、発現、発現生産物の輸送、および形質転換した宿主細胞の膜への発 現生産物の露出に関連する工程を実施する際に、エンドネキシン■をコードする 核酸より小さな挿入断片を用いることにある。発現、発現生産物の輸送および膜 へのその露出はもとより、前記に定義されたようなリガンドとの反応も得られた ときに、該断片を決定することが可能である。その結果、完全な配列の大きさよ り小さな大きさの断片を用いることによる、前記に定義されたようなリガンドと の反応の不在は、何らかの必須の部位が削除されていることを示すことになる。 本発明は、本発明のポリペプチドのいずれか一つに関してのリガンドの、存在し 得る親和性の検出のためのキットであって、−上記に定義されたような修飾され たベクターによって形質転換した細胞性宿主の培養物、または該細胞性宿主の膜 の標本、−修飾されたベクターに含まれるヌクレオチド配列の発現を、この配列 の上流に定置したプロモーターが、物理的または化学的手段を用いて誘導できる プロモーターであるときに誘導し、そして蛋白質を得るための該物理的または化 学的手段、−上記の該ポリペプチドに対して所定の親和性を有する一つまたはい くつかの対照リガンド、 一発現した蛋白質の生物学的活性を特徴付けるための物理的または化学的手段 を包有するキットにも関する。 本発明は、ＨＢＶ感染の治療に容易に用いられる薬物をスクリーニングする方法 にも関する。 本発明は、ラージお″よび／またはメジャーＨＢｓＡｇを生体外で検出する方法 であって、 −ＨＢＶを含有すると思われる生体試料と、一定量の（ｉ）ヒトエンドネキシン ■、そのムティン、または上記に定義されたその断片、特にエンドネキシンベブ チド：ＤＨＴＬＩ　ＲＶＭＶＳＲ８ＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲ３ＶＳＨＬＲＫＶ ＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ 並びに一定量の（ｉｉ）ＨＢｓＡｇの競合物質として作用する受容体リガンドま たは上記に定義されたアンチセンスペプチドとを、（ｉ）ヒトエンドネキシン■ または上記に定義された機能性相当物と（ｉｉ）受容体リガンドまたはアンチセ ンスペプチドとの間の、並びにヒトエンドネキシン■とラージおよび／またはメ ジャーＨＢｓＡｇとの間の複合体の形成を可能にする条件下で、かつ成分（ｉ） または（ｉｉ）のいずれかに検出可能な標識を担持させ、いずれか一方の成分を できる限り固定して接触させること、−（ｉ）ヒトエンドネキシン■またはその 機能性相当物と（ｊ、ｉ　）受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドとの間 でおそらく形成された複合体、および（ｉ）ヒトエンドネキシン■またはその機 能性相当物と（ｉｉ）ＨＢｓＡｇとの間に形成された複合体の量を検出すること 、 一該試料中に存在するＨＢＶの量を、ＨＢＶを含まないことが既知である対照試 料に対する複合体形成の低下として推計することを含む方法にも関する。 用い得る生体試料は、すべてのタイプの体液または生検材料、好ましくけ血液試 料、より好ましくは血清および／または血漿試料を包含する。 本発明は、体組織（生検）、血漿または血清から採取した生体試料中の肝細胞の 損傷を生体外で測定する方法であって、−損傷した肝細胞からのヒトエンドネキ シン■を含有すると思われる生体試料を、 ・上記に定義されたような受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドで被覆し たプレート、あるいは ・ヒトエンドネキシンＨに、または上記に定義のヒトエンドネキシンＨのムティ ンに、または上記に定義のヒトエンドネキシン■由来断片に対するポリクローナ ルおよび／もしくはモノクローナル抗体、好ましくはヒトモノクローナル類もし くはマウスモノクローナル類の人体適応バージョンで被覆したプレート、あるい は・ヒトエンドネキシン■に、または上記に定義のヒトエンドネキシンＨのムテ ィンに、または上記に定義のヒトエンドネキシン■由来断片に対して産生された 拭払イディオタイプ抗体で被覆したプレート、あるいは ・上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生された 抗イデイオタイプ抗体で被覆したプレートのいずれかと接触させること、 一ヒトエンドネキシン■と受容体リガンドもしくはアンチセンスペプチドとの間 、またはヒトエンドネキシン■とモノクローナルもしくはポリクローナル抗体と の間、またはヒトエンドネキシン■と上記に定義の拭払イディオタイプ抗体との 間またはヒトエンドネキシン■と上記に定義の抗イデイオタイプ抗体との間のい ずれかに形成された複合体を検出すること を含む方法にも関する。 これに関連して、肝細胞の損傷は、有害な免疫学的または病理学的機序によって 、特にＨＢＶによって生起された慢性肝感染症の場合に、より具体的には肝硬変 および肝癌の場合に出現することが公知である。その結果、生体外での判定手法 を、病状を診断かつ監視するのに用いることができる。 本発明は、ＨＢＶの生体外判定のための診断キットにおいて、−生産物をその上 に沈積させるための少なくとも１枚のマイクロプレートであって、該生産物が、 ＊ヒトエンドネキシン■もしくは上記に定義されたようなそのムティン、または 上記に定義されたようなヒトエンドネキシン■由来断片、特にエンドネキシンペ プチド： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶ ＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ、あるいは ＊ヒトエンドネキシンＨに、もしくは上記に定義されたようなそのムティンに、 または上記に定義されたようなヒトエンドネキシン■由来断片に対して産生され た抗イデイオタイプ抗体を含むマイクロプレート、 一診断しようとする、そしてＨＢｓＡｇを含有すると思われる試料を、ＨＢｓＡ ｇに対する競合物質、例えば：木上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセン スペプチド、あるいは ＊ヒトエンドネキシンＨに、もしくは上記に定義されたようなそのムティンに、 または上記に定義されたようなヒトエンドネキシン■由来断片、特にエンドネキ シンベブチド：ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶ ＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、好ましくはヒトのモノク ローナル類、またはマウスのモノクローナル類の人体適応バージョン、あるいは ＊ヒトエンドネキシンＨに対して産生された拭払イディオタイプ抗体、あるいは ＊上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生された 抗イデイオタイプ抗体 とともに含有する標本 −ＨＢｓＡｇと、該プレートに沈積した生産物との反応を実施するための適切な 緩？＃Ｉ液 −ＨＢｓＡｇと、該プレートに沈積した生産物との間に形成された複合体を測定 するための適切なマーカーを含むキットにも関する。 代替的な実施態様によれば、マイクロプレートは、それに沈積した： ＊または、上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対抗する ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、好ましくはヒトモノクローナル抗 体、あるいは木上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対し て産生された拭払イディオタイプ抗体 も含む。 本発明は、エンドネキシンＨの生体外測定のための診断キットにおいて、 一生産物をそれに沈積させるための少な（とも１枚のマイクロプレートであって 、該生産物が、 ＊上記に定義されたような受容体リガンドまたはアンチセンスペプチド、あるい は ＊ヒトエンドネキシンＨに、もしくは上記に定義のヒトエンドネキシンＨのムテ ィンに、または上記に定義のヒトエンドネキシン■由来断片、特にエンドネキシ ンベブチド：ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶ ＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ に対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、好ましくはヒトのモノク ローナル類、またはマウスのモノクローナル類の人体適応バージョン、あるいは ＊ヒトエンドネキシンＨに、もしくは上記に定義のヒトエンドネキシンＨのムテ ィンに、または上記に定義のヒトエンドネキシン■由来断片、特にエンドネキシ ンベブチド：ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩ　 ＫＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫ ＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴ） に対して産生された拭払イディオタイプ抗体を含むマイクロプレート、 一診断しようとする試料を、おそう（はヒトエンドネキシン■の競合物質、例え ば二 ・上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生された ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、あるいは ・ヒトエンドネキシンＨに、もしくはヒトエンドネキシン■のムティンに、また は上記に定義のヒトエンドネキシン■由来断片、特にエンドネキシンベブチド： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲ３ＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩ　ＦＧＴＲ３ＶＳＨＬＲＫ ＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ に対して産生された抗イデイオタイプ抗体、あるいは・上記に定義の受容体リガ ンドまたはアンチセンスペプチドに対して出現させた抗イデイオタイプ抗体 とともに含有する種本、 一診断しようとする試料を、おそらくは、探索されるヒトエンドネキシンＨの競 合物質、例えば： ・上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生された ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、好ましくはヒトモノクローナル抗 体、あるいは・ヒトエンドネキシンＨに、もしくは上記に定義のヒトエンドネキ シンＨのムティンに、または上記に定義のヒトエンドネキシン■由来断片に対し て産生された抗イデイオタイプ抗体、あるいは・上記に定義の受容体リガンドま たはアンチセンスペプチドに対して産生された拭払イディオタイプ抗体 とともに含有する橋本、 一ヒトエンドネキシン■とプレートに沈積した生産物との免疫学的反応を実施す るための適切な緩衝液、−ヒトエンドネキシン■とプレートに沈積した生産物と の複合体の形成を検出するための適切なマーカーを含むキットにも関する。 このキットの形式は、慢性的肝感染症の病状を診断かつ監視するのに好都合であ ろう。 本発明は、 ・上記に定義のポリペプチド、あるいは・上記に定義の受容体リガンドまたはア ンチセンスペプチド、あるいは ・上記に定義のヒトエンドネキシンＴＩに、もしくは上記に定義のそのムティン に、または上記に定義のその断片、特にエンドネキシンベブチドニ ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲ３ＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩ　ＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫ ＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ に対して産生されたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、好ましくはヒ トモノクロ−六ル抗体、またはマウスモノクローナル抗体の人体適応バージョン 、あるいは ・上記に定義のヒトエンドネキシン■に、もしくは上記に定義のそのムティンに 、または上記に定義のその断片、特にエンドネキシンペプチド： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲ３ＥＩＤ、 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩ　ＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫ ＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ に対する抗イデイオダイブ抗体、あるいは・上記に定義のヒトエンドネキシンＨ に、もしくは上記に定義のそのムティンに、または上記に定義のその断片、より 具体的にはエンドネキシンペプチド； ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲ３ＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬ、ＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩ ＫＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫ ＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ に対する拭払イディオタイプ抗体、あるいは・上記に定義のアンチセンスペプチ ドに対して産生された抗イデイオタイプ抗体、あるいは ・上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対する拭払イディ オタイプ抗体、あるいは ・上記に定義の物質 をＢ型肝炎の治療に役立つ薬物の製造に用いることにも関する。 本発明は、 ・上記に定義のポリペプチド、あるいは・上記に定義の受容体リガンドまたはア ンチセンスペプチド、あるいは ・上記に定義のヒトエンドネキシンＨに、もしくは上記に定義のそのムティンに 、または上記に定義のその断片、特にエンドネキシンペプチド： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲ３ＥＩＤ、 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲ３ＶＳＨＬＲＫＶ ＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ に対して産生されたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、好ましくはヒ トモノクローナル抗体、またはマウスモノクローナル抗体の人体適応バージョン 、あるいは ・上記に定義のヒトエンドネキシンＨに、もしくは上記に定義のそのムティンに 、または上記に定義のその断片、特にエンドネキシンベブチド： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩ　ＦＧＴＲ３ＶＳＨＬＲＫ ＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ に対する抗イデイオタイプ抗体、あるいは・上記に定義のヒトエンドネキシンＨ に、もしくは上記に定義のそのムティンに、または上記に定義のその断片、特に エンドネキシンペプチド： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ、 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩ　ＦＧＴＲ５ＶＳＨＬＲＫ ＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ に対する拭払イディオタイプ抗体、あるいは・上記に定義のアンチセンスペプチ ドに対して産生された抗イデイオタイプ抗体、あるいは ・上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対する拭払イディ オタイプ抗体、あるいは ・上記に定義の物質 をＢ型肝炎の感染症に対するワクチンの製造に用いることにも関する。 本発明は、 ・上記に定義のポリペプチド、あるいは・上記に定義の受容体リガンドまたはア ンチセンスペプチド、あるいは ・上記に定義のヒトエンドネキシンＨに、または上記に定義のそのムティンに、 または上記に定義のその断片、特にエンドネキシンベブチド： ＤＨＴＬＩ　ＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲ３ＶＳＨＬＲＫＶ ＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ に対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、あるいは・上記に定義の ヒトエンドネキシンＨに、または上記に定義のそのムティンに、または上記に定 義のその断片、特にエンドネキシンベブチド： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦ　Ｉ　Ｔ　Ｉ　ＦＧＴＲＳＶＳＨ ＬＲＫＶＦＤＫＹＭＴ　Ｉ　ＳＧＦＩＥＥＴＩ に対する抗イデイオタイプ抗体、あるいは・上記に定義のヒトエンドネキシンＨ に、または上記に定義のそのムティンに、または上記に定義のその断片、特にエ ンドネキシンベブチド： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ。 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲ３ＶＳＨＬＲＫＶ ＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ に対する拭払イディオタイプ抗体、あるいは・上記に定義のアンチセンスペプチ ドに対して産生された抗イデイオタイプ抗体、あるいは ・上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対する拭払イディ オタイプ抗体、あるいは ・上記に定義の物質 をＢ型ウィルス感染症の診断手段の製造に用いることにも関する。 本発明は、 ヒトエンドネキシン■、上記に定義のそのムティンまたは断片、特にエンドネキ シンペプチド： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ、 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫ ＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦ　Ｉ　Ｔ　Ｉ　ＦＧＴＲＳＶＳＨ ＬＲＫＶＦＤＫＹＭＴ　Ｉ　ＳＧＦＩＥＥＴＩ とＨＢＶとの結合および／またはその発現を調節し得る、試験中の潜在薬のため のモデルとしての、ヒトではない晴乳類のトランスジェニック動物であって、 そのようなトランスジェニック動物に組み込まれた、ヒトエンドネキシン■遺伝 子、またはそのムティンもしくは断片、より具体的にはエンドネキシンベブチド ： ＤＨＴＬＩ　ＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ、 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡ、ＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩ ＫＱＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩ　ＦＧＴＲ３ＶＳＨＬＲ ＫＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＩＥＥＴＩ をコードするヌクレオチド配列の構成的、または誘発可能な発現に起因する、容 易にＨＢＶで感染され、かつ容易に肝細胞損傷を患うトランスジェニック動物に も関する。 ヒトではない補乳類のトランスジェニック動物は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ−ａ ｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｌｏｇｙ　（Ｇｏｒｄｏｎ　ＪＷ　、第１１ ５巻、１７１〜２２２ページ、１９８９年）に記載のプロトコルに従って製造す ることができる。 ［図面の簡単な説明］ 図１．マイクロタイタープレートに被覆した組換えメジャーＨＢｓＡｇ　（レー ン１〜４）に、および同じプレート上に被覆したＢＳＡ　（Ｌ／−７５〜６）　 ｊ：結合シタ蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のオートラジオグラム。 レーン１〜２：過剰な非標識形質膜蛋白質の不在下（レーン１）および存在下（ レーン２）での、　＋２Ｊ標識ヒト形質膜蛋白質の結合。 レーン３〜４：過剰な非標識形質膜蛋白質の不在下（レーン３）および存在下（ レーン４）での、　１２＠Ｉ標識ラツト形質膜蛋白質の結合。 レーン５〜６：過剰な非標識形質膜蛋白質の不在下（レーン５）および存在下（ レーン６）での、　＋８１標識ヒト形質膜蛋白質のＢＳＡ被覆ウェルへの結合。 図２Ａ、　ヒト肝形質膜蛋白質の、調製用ＰＡＧＥによって単離した３４キロダ ルトン分画の二次元ゲル電気泳動。４．１のｐＩ値（矢印）を有する相対的酸性 の蛋白質が、メジ型−ＨＢｓＡｇ結合蛋白質として同定されている（図２Ｂも参 照されたい）。 図２　Ｂ、高結合ＥＬＩＳＡディツシュに固定化したメジャーＨＢｓＡｇへの結 合、洗浄および溶出後の”２′′工標識ヒト形質膜蛋白質のＩ　ＥＦ／５ＤＳ− ＰＡＧＥ分析のオートラジオグラム。図の唯一のスポットは、３４キロダルトン の分子量および４．１のｐｈ値を有する蛋白質に対応する（図２Ａも参照された い）。 図３．ゲル基質中の３４キロダルトン蛋白質の限定的酸加水分解後に逆相ＨＰＬ Ｃで分別したペプチドの溶出パターン、この３４キロダルトン蛋白質は、図２に 示した二次元ゲル電気泳動がら得たものである。矢印で示したピーク分画を、ア ミノ酸配列について解析し、データバンクでの検索に用いた。 図４．競合物質の不在または存在下で高結合ＥＬＩＳＡディツシュに固定化した 組換えメジャーＨＢｓＡｇに結合したヒト肝Ｅ−ＩＩの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の オートラジオグラム、過剰な非標識Ｅ−１１の不在下（レーン１）または存在下 （レーン２）で、また別の実験では、過剰な組換えメジャーＨＢｓＡｇの存在下 （レーン３）で、または過剰な非標識ヒト肝形質膜蛋白質の存在（レーン４）下 で、　１２＠■標識ヒト肝Ｅ−ＩＩを用いた。ウサギ抗Ｅ−ＩＩＩｇＧとの標識 Ｅ−Ｉ１１１７）前部室（１：　２００）は、メジャーＨＢｓＡｇへのＥ−１１ の結合を阻害する（レーン５）、免疫前のＩｇＧと前部室を実施したときは、阻 害は全く見いだされなかった（レーン６）。Ｅ−ＩＩはエンドネキシン■を表し ている。 図５．各種の濃度のウサギ抗Ｅ−Ｉ１１ＫＧの存在下（・−・）、または匹敵し つる濃度のウサギ免疫前ＩｇＧの存在下（■−■）でのメジャーＨＢｓＡｇへの 放射能標識Ｅ−ＩＩの結合（ｃｐａ＋　）。 図６．固相に固定化したメジャーＨＢｓＡｇおよびＢＳＡへの放射能標識エンド ネキシンＨの結合（ｃｐｍ　）。レーンｌおよび２は、それぞれメジャーＨＢｓ ＡｇおよびＢＳＡへの、Ｌｏｎｇ放射能標識ヒト肝エンドネキシンＨの結合を示 す。レーン３および４は、１０ｎｇ放射能標識ラット肝エンドネキシン■を用い た同じ実験の結果を示す。 図７．競合物質の存在および不在下での、正常なヒト培養肝細胞への放射能標識 メジャーＨＢｓＡｇの特異的結合。レーン１は、競合物質の不在下（対照）での 放射能標識メジャーＨＢｓＡｇの特異的結合を示す。レーン２は、エンドネキシ ンＨの存在下での放射能標識メジャーＨＢ　ｓ　Ａ　ｇの結合を示す。レーン３ は、対照蛋白質（マウスＩｇＧ）の存在下での放射能標識ＨＢｓＡｇの結合を示 す。 図８．左パネル：　１！８Ｉ榎識エンドネキシン■、および固相に固定化した組 換えまたは血清由来メジャーＨＢ　ｓ　Ａ、　ｇを用いた架橋結合実験の５ＤＳ −ＰＡＧＥ分析のオートラジオグラム。ＤＳＳの存在下での、組換え（レーン３ ）または血清由来（レーン４）メジャーＨＢｓＡｇへのエンドネキシンＨの架橋 結合は、約９０キロダルトンの分子量を有する、（」加的な標識蛋白質複合体を 招いた。レーン１　（組換えＨＢｓＡｇ）およびレーン２（血清由来ＨＢｓＡｇ ）は、架橋結合剤の不在下での対照実験を示す。 右パネル：それぞれの溶液で、放射能標識及び非標識のエンドネキシン■（レー ン１）、ＢＳＡ　（レーン３）、アシアロフェチュイン（レーン４）またはＨＢ ｓＡｇ　（レーン２）を用いた架橋結合実験のＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ分 析のオートラジオグラム。メジャーＨＢ　ｓ　Ａ　ｇを用いた実験においてのみ 、９０キロダルトンの見かけ分子量を有する追加的なバンドが５ＡＳ−ＰＡＧＥ 上で観察された。６８キロダルトンの分子量を有するバンドは、ヒト肝エンドネ キシンＨの二量体を示す。この二量体は、固相に固定化したＨＢｓＡｇを用いて 架橋結合実験を実施したときには、ＰＡＧＥ上に認められなかった。゛ 図９．懸１ｆｒＩ液中でのヒト（棒１〜４）およびラット（棒５〜８）の肝細胞 への、１５ｎｇの放射能標識したヒト肝エンドネキシン■の、対照の百分率とし ての（棒１および５）結合、棒２〜４および６〜８は、過剰な（２μｇ）非標識 エンドネキシン■（棒２および６）、過剰な（２μｇ）非標識メジャーＨＢｓＡ ｇ（棒３および７）並びに過剰な（２μｇ）非標識ＢＳＡ　（棒４および８）の 存在下での、放射能標識ヒト肝Ｅ−ＩＩの結合を示す。 図１０．各種の濃度の非標識ヒトエンドネキシン■の存在下での、ヒト（ロ）お よびラット（＋）の肝細胞への、放射能標識したヒトエンドネキシン■の、対照 の百分率としての結合を示す。 図１１．競合物質の存在および不在下での正常なヒト（棒１〜５）およびラット （棒６〜１０）の肝細胞（５０，０００）への放射能標識メジャーＨＢｓＡｇの 結合。棒１　（１，５００ＣＩ）０１）および棒６（５００ｃｐ［ｏ）は、競合 物質の不在下での放射能標識ＨＢｓＡｇ（１）結合を示す。棒２（６００ｃｐｍ ）および７（４８０ｃｐａ＋　）は、過剰な（２μｇ）非標識ＨＢｓＡｇの存在 下での結合を示す。棒３（９００ｃｐｍ）および棒ｓ（９００ｃｐｍ）は、過剰 な（ヒト肝細胞については７μｇ、ラット肝細胞については２μｇ）非標識ヒト 肝Ｅ−ＩＩを加える前に、肝細胞をはじめ放射能標識ＨＢｓＡｇと１置したとき の放射能標識ＨＢｓＡｇとの結合を示す。棒４（９６０ｃｐｍ）および９　（１ ，０００ｃｐｍ　）は、細胞を加える前に放射能標識ＨＢＳＡｇおよび過剰な（ ７μｇ、２μｇ）非標識ヒト肝Ｅ−ＩＩを前部室したときの結果を示す。棒５（ ６００ｃｐｍ）および１０（５００ｃｐｍ）は、放射能標識２ＬＬｇ　）　Ｅ− ＩＩと１置したときの結果を示す。結合は百分率で示されているが、放射能標識 ＨＢｓＡｇの結合については、ヒトとラットの肝細胞との間には著しい差が残る ことに注目しなければならない、Ｅ−１１はエンドネキシン■を示す。 図１２．コウボで発現させたエンドネキシンＨの５ＤＳ−′　ＰＡＧＥ分析。細 胞を回収、破砕かつ遠心分離した。レーンｌは、細胞質分画中の大量の３４キロ ダルトン蛋白質（エンドネキシン■）の存在を示す。ＥＧＴＡ処理および細胞ベ レットの再遠心分離の後、膜結合エンドネキシン■も上清に遊離させた（レーン ２）、レーン３〜８は、ＤＥ−５２セルロースイオン交換カラムから溶出させた 分画を示す。 図１３．精製したヒト肝エンドネキシン■（レーン１）および組換えエンドネキ シン■（レーン２）のウェスタンプロット分析。検出は、ウサギ抗ヒトエンドネ キシン■抗体、およびペルオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギ抗体を用いて実施した 。 同じウサギの免疫前血清は、組換えエンドネキシン■とは反応しなかった（レー ン３）。 図１４．放射能標識ヒト肝エンドネキシン■（左パネル）および組換えコウボ由 来エンドネキシン■（右パネル）のＩＥＦ／５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のオートラジ オグラム。分子量（３４キロダルトン）または等電点（４，１）における差は全 （証明できなかった。 図１５．固相メジャーＨＢ　ｓ　Ａ　ｇに結合させたヒト肝（レーン１）および 組換えエンドネキシン■（レーン２）の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のオートラジオグ ラム。結合の特異性を測定するために、過剰な非標識メジャーＨＢＳＡｇ　（レ ーン３）または非標識ヒト肝エンドネキシンパ（レーン４）の存在下で、放射能 標識組換えエンドネキシン■を加えた。この場合は、抗エンドネキシン■抗体と の前温室後も（レーン５）、ウシ血清アルブミンを固相に固定化したときも（レ ーン６）、組換えエンドネキシンＨの結合は全く観察されなかった。免疫前血清 との放射能標識゛した蛋白質の前温室は、ＨＢｓＡｇへの結合に影響しなかった （レーン７）。 図１６．放射能標識ヒト肝（レーン１）または組換えエンドネキシン■（レーン ２）と、固相メジャーＨＢｓＡｇとの間の架橋結合実験の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析 、架橋結合は、約９０キロダルトンの分子量を有する特異的標識複合体を招いた 。レーン３は、架橋結合剤を用いない対照実験を示す。 図１７．免疫前のウサギ（○、口、Δ）、およびラット肝エンドネキシン■（ム ）またはヒト肝エンドネキシン■（・生来、１組換え）で免疫したウサギにおけ る、ＥＬＩＳＡによって測定した抗エンドネキシンＨの応答（パネルＡ）および 抗ＨＢｓの応答（パネルＢ）。 図１８．ヒト肝エンドネキシン■で免疫したウサギ血清の抗ＨＢｓ活性（パネル Ｂ）および抗エンドネキシン■活性（パネルＡ）の特異性、パネルＡ：固相に固 定化したメジャーＨＢｓＡｇを用いたＥＬＩＳＡの前に、抗血清をそれぞれメジ ャーＨＢｓＡｇと（・−・）、エンドネキシン■と（−一■）、またはＢＳＡと （ムーム）製置した場合。パネルＢ：固相に固定化したヒト肝エンドネキシン■ を用いたＥＬＩＳＡの前に、抗血清をそれぞれヒト肝エンドネキシン■と（■− ■）、ＨＢｓＡｇと（・−・）、またはＢＳＡと（ムーム）製置した場合の同様 の実験。 図１９．メジャーＨＢｓＡｇまたは組換えエンドネキシン■と反応している抗体 の、ＣＮＢｒ活性化セファロースと組合せた精製組換えエンドネキシンＨによる アフィニティークロマトグラフィーによる分別。ＥＬＩＳＡによる測定の限りで 、抗ＨＢｓ活性（０−０）は、主として通過流分画（１〜６）に見いだされたが 、抗エンドネキシン■活性（・−・）は、専ら溶出分画（１４〜１７）に見いだ された。 図２０．ヒト肝エンドネキシン■で免疫したウサギの血清の、免疫ドツトプロッ トでの反応性。パネルＡ：組換えＨＢｓＡｇ　（１）およびヒト肝エンドネキシ ン■（２）。パネルＢ：同じウサギの免疫前血清。パネルＣ：アフィニティーク ロマトグラフィーを用いた抗体の分離後に（エンドネキシン■カラム）、抗エン ドネキシン■活性を捕捉除去した。アフィニティー精製抗ＨＢｓ抗体（Ａｂ２） は、血清由来メジャーＨＢｓＡｇ　（２）はもとより組換えメジャーＨＢｓＡｇ （１）も認識した。 図２１．左パネル：ヒト肝Ｅ−ＩＩで免疫したウサギの血清を用いた放射能標識 メジャーＨＢｓＡｇの免疫沈降。レーン１は、ヒツジ抗ＨＢｓ抗体による放射能 標識メジャーＨＢｓＡｇの対照免疫沈降を示す。アフィニティー精製抗ＨＢｓ　 （ＡＢ２）抗体（レーン２）、免疫前血清（レーン３）、または過剰な非標識Ｈ ＢｓＡｇの存在下でのアフィニティー精製ウサギ抗ＨＢｓ　（Ａｂ２）（レーン ４）を用いた放射能標識メジャーＨＢｓＡｇの免疫沈降を、ポリクローナル抗Ｈ Ｂｓを用いた免疫沈降の百分率として示す。 右パネル：ウサギ抗Ｅ−ＩＩ抗体による放射能標識ヒト肝エンドネキシンＨの免 疫沈降。レーン１は、アフィニティー精製抗Ｅ−ＩＩ抗体を用いた放射能標識ヒ ト肝Ｅ−ＩＩの免疫沈降を示す。免疫前血清（レーン２）、または過剰な非標識 ヒト肝Ｅ−ＩＩの存在下での抗ヒト肝Ｅ−ＩＩ（レーン３）を用いた放射能標識 ヒト肝Ｅ−ＩＩの免疫沈降を、精製抗Ｅ−１１抗体を用いた免疫沈降の百分率と して示す。 Ｅ−ＩＩはエンドネキシン■を指す。 図２２．抗イディオタイプ抗体への結合に対する放射能標識ＨＢｓＡｇと非標識 ＨＢｓＡｇとの、および放射能標識メジャーＨＢｓＡｇへの結合に対する抗イデ イオタイプ抗体とヒト肝Ｅ−ＩＩとの競合。非標識）（ＢｓＡｇの系統希釈物と の固相上の抗イデイオタイプ抗体の前温室（○−Ｏ）は、抗イデイオタイプ抗体 への放射能標識ＨＢｓＡｇの結合（ｃｐｍ　）を妨げる。放射能標識ＨＢｓＡｇ を、Ｃａ”＋およびＭ　ｇｌ−の存在下でＥ−ＩＩの系統希釈物と前温室すると （・−・）、抗イデイオタイプ抗体への放射能標識ＨＢｓＡｇの結合に対する匹 敵し得る阻害が観察された。対照実験での平均結合ｃｐｍを垂直な棒で線引きし た黒三角によって示す。 図２３Ａ、Ｆビーク阻害検定：加水分解したヒト肝Ｅ−ＩＩの逆相ＨＰＬＣを用 いて得られたペプチド分画の存在下での、固相に固定化したメジャーＨＢｓＡｇ への放射能標識ヒト肝Ｅ−ＩＩの結合。 レーン＋および−は、それぞれ正常なヒト肝Ｅ−ＩＩの不在および存在下での放 射能標識Ｅ−ＩＩの結合を示す。レーンＡ〜Ｙは、それぞれのＨＰＬＣ分別分画 の存在下での放射能標識Ｅ−ＩＩの結合を示す、Ｅ−１１はエンドネキシン■を 指す。 図２３Ｂ、ウサギ抗Ｅ−ＩＩＩｇＧのＦａｂフラグメントで免疫したニワトリに おける抗ＨＢｓ活性の発生。 ウサギ抗Ｅ−ＩＩの免疫前卵黄免疫グロブリンのＦａｂフラグメントで免疫した 鶏卵から得た卵黄免疫グロブリン（Ｉ　ｇＹ）の抗ＨＢｓ　（Ａｂ２）（■）お よび抗ウサギＩｇＧ（・）活性、これらの検定については、ＨＢｓＡｇおよびウ サギＩｇＧをそれぞれ固相で固定化した。吸光はＡ４５０ｒ＋ｍで読んだ。Ｅ− ＩＸはエンドネキシン■を詣す。 図２３Ｃ１生来Ｅ−ＩＩによって生成された放射能標識Ａｂ２（Ａ　ｂ　２／Ｅ −ＩＩ）と、他のＡｂ２°との間のメジャーＨＢｓＡｇへの結合についての競合 （ｃｐ＋ｍ　）。 Ｅ−ＩＩによるウサギの免疫化によって生成された放射能標識Ａｂ２　（Ａｂ２ ／Ｅ−ＩＩ）の、合成Ｆペプチドまたはニワトリ抗ＨＢｓＩｇＧによるウサギの 免疫化によって生成されたＡｂ２の存在または不在下での固相上のメジャーＨＢ ｓＡｇへの結合（ｃｐｍ　）は、ウサギ抗Ｅ−４ＩＩｇＧのＦａｂフラグメント による免疫化の後に生起した。Ａｂ２／Ｅ−１１（■）またはＡｂ２／Ｆ（・） （合成Ｆペプチドによって生成された）の系統希釈物との固定化メジャーＨＢｓ Ａｇの前部室は、メジャーＨＢｓＡｇへの放射能標識Ａｂ２／Ｅ−ＩＩの結合を 妨げる。不適切なウサギＩｇＧ（Δ）は結合を妨げない、Ｅ−ＩＩはエンドネキ シン■を指す。 図２３Ｄ、Ａｂ２／Ｆａｂ　（ウサギ抗Ｅ−ＩエエｇＧによって生成された）と のメジャーＨＢｓＡｇの前部室（−）、またはメジャーＨＢｓＡｇの系統希釈物 の存在下での結合（・）も、メジャーＨＢｓＡｇへの放射能４ｊＪｍＡｂ２／Ｅ −ＩＩの結合（ｃｐｍ　）を妨げる。Ｅ−ＩＩはヒト肝エンドネキシン■を指す 。 ［実施例］ 材料および方法 旦Σ肚形亘腺少星鳳 ヒトの肝組織を死後臓器供与者から得た。ヒト肝組織を４℃で保存し、１−ｃｒ ｔｒ３の小片に切断し、液体窒素中で瞬間凍結し、処理するまで一８０℃で貯蔵 した。形質膜の単離は、Ｈｕｂｂａｒｄら（１９８３年）の方法に従い、Ｌｅｅ ｎｄｅｒｓら（１９９０年）によって記載されたとおりの多少の変更を加えて実 施した。 略記すルト、肝組織３０ｇを０．２５Ｍ（７）３７Ｍ緩衝液（０，２５Ｍ）中で ４℃で解凍し、ワーリングブレングー中で均一化した後、Ｄｏｕｎｃｅによる均 一化を施した。ホモジネートをｌｏ。 メツシュのナイロンフィルターで濾過し、０．２５Ｍの３７Ｍ緩衝液で濾液を２ ０％（重量／体積）に調整し、３００ｇ　（４℃）で１０分間遠心分離した。ベ レットを微量体積の０．２５Ｈの３７Ｍ緩衝液に再懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅホモジ ナイザーで均一化し、再び３００ｇで１０分間遠心分離した。両方の上清をプー ルし、１．５００ｇ　（４℃）で１０分間遠心分離した。ベレットを微量体積の ０．２５Ｍの３７Ｍ緩衝液に再懸濁し、２Ｍの３７Ｍ緩衝液（２Ｍ（７）シ：＋ 糖、ｐＨ７，２の５ｍＭ（７）ト’Ｊス、１　ｍＭ（Ｄ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　！、０ ．１ｍＭのＰＭＳＦ）を加えて、１．１８ｇ／ｍｌの密度に到達させた。当初の ２倍の体積の懸濁液を得るために、１．４２ＭのＳＴＭ緩衝？ｉ（１，４２Ｍの ショ糖、ｐＨ７，２の５ｍＭのトリス、１ｎ＋ＭのＭｇＣ１，，０，１ｍＭのＰ ＭＳＦ）を加えた。 懸濁液２５ｍ１に０．２５ＨのＳＴＭ緩衝緩衝液４奢ｌね、ＳＷ２７のローター を用いて８２，０００ｇ　（４℃）で１時間の遠心分離に付した。中間相に浮遊 する形質膜を捕集し、０．２５Ｈの３７Ｍ緩衝液を用いて１．０５ｇ／＋ｎｌの 密度にし、Ｔｉ５０．２０−ターを用いて２０，０００ｇ　（４℃）で１５分間 でペレット化した。ベレットを微量体積の０．２５Ｍの３７Ｍ緩衝液に再懸濁し 、液体窒素中で凍結させ、使用まで一８０℃で貯蔵した。 肚罠艮蛋血亘Ω辿比 非変性性洗剤であるＣ　ＨＡ　Ｐ　Ｓ　［Ｈｊｅｌｍｅｌａｎｄ　（１９８０年 ）］　（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン スルホネート）（米国カリフォルニア州Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｂｉｏ−Ｒａｄ社 ）を用いて、形質膜から蛋白質を抽出した。 形質膜懸濁液を等体積のＣＨＡＰＳ抽出緩衝液（４０％グリセリン、ｐＨ７，２ の０．２Ｍのリン酸カリウム緩衝液、２０ｍＭのＣＨＡ、　Ｐ　Ｓ　）で室温で ３０分間処理した。１０．ＯＯＯｒｐｍで１０分間の遠心分離によって得られた 上清をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して一晩（４℃）透析した。 Ｂｒａｄｆｏｒｄ　［Ｂｒａｄｆｏｒｄ　（１９７６年）］に従い、Ｂｉｏ−Ｒ ａｄ　ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙを用いて抽出物の蛋白質濃度を測定した。 肚」先Ｗ猜ａ荒神庫 ＣＨＡＰＳ抽出された形質膜蛋白質２ｇｇを、５ａｌａｃｉｎｓｋｉら（１９８ １年）の方法に従い、Ｉｏｄｏｇｅｎ　（１，３，４，６−テトラクロロ−３α 、６α−ジフエニルグリコリル）（米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　Ｐｉｅ ｒｃｅ社）との室温で１７分間の部属によって、１．３７Ｘ１０’ベクレルのＮ ａ　”’Ｉ　（英国Ｂｕｃｋｓ　、　Ａａ＋ｅｒｓｈａｍ社）で標識した。混合 物にＩＭのＫＩ溶液１００μｍを加えることによって反応を停止させ、反応混合 物を、ＰＢＳに溶かした１％ＢＳＡ（米国Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ　、　Ｓｉｇｍａ 社）でブロックしたセファデックスＧ２５のカラム（スエーデン国Ｕｐｐｓａｌ ａ％Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に通すことによって、遊離ヨウ素を除去した。標識 した形質膜蛋白質は、１週間を超えることなく４℃で貯蔵し、その後、使用した 。 各分画の、沈澱可能な＋２′工蛋白質の取り込みは、Ｂ５Ａ３００μｇの存在下 で２５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（ベルキー国Ｂｅｅｒｓｅ、　Ｊａｎｓｓｅ ｎ社）を用いてこれらの分画５μｍを沈澱させることによって測定した。８０％ を超える１■工沈澱可能な分画のみをその後の研究に用いた。 ヒト　エンドネキシンＨに・　るウサギポリクローナル　の成 ２０Ｈｇの精製ヒト肝エンドネキシン■を含有する溶液をＰＢＳで１ｎ＋１の体 積にし、完全フロインドアジュバント（米国ミズーリ州Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　、 　Ｓｉｇｍａ社）１ｍｌと充分に混合した。この抗原を注射する前に、各ウサギ から血？！５ｍｌを採取し、血清をオフタロ二−免疫拡散法を用いて調べて、ヒ トエンドネキシンＨに対する自然免疫を排除した。２匹のウサギに、抗原含有溶 液０．５ｍｌを４回皮下注射した（４回の注射についてウサギ１匹あたり２０Ｈ ｇのヒト肝エンドネキシン旧、１６日および４０日口の２回のブースター注射の 後、両ウサギとも、オフタロニー免疫拡散法で証明された限りで、エンドネキシ ンＨに対する免疫応答を示した。 −士人　″　゛　ＥＬＩＳＡ 各抗原１１００ｎを、４℃で一晩の温室によって高結合ＥＬＩＳＡディツシュ（ ドイツ国、Ｎｕｅｒｔｉｎｇｅｎ、　Ｇｒｅｉｎｅｒ　ＬａｂｏｒｔｅｃｈｎＬ ｋ社）に固定化した。ウェルなリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）　／Ｂｌｏｔｔｏ１ ％とともに温室することによって、非特異的結合部位をブロックした後、ウェル を抗体の系統希釈物とともに温室し、その後、ペルオキシダーゼと結合させたブ タ抗ウサギ抗血清（デンマーク国Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、　Ｄａｋｏｐａｔｔｓ　Ａ ／Ｓ社）とともに温室した。反応生成物を、過酸化水素の存在下でテトラメチル ベンジジン（ＴＭＢ）（ドイツ国１４Ｂｎｎ１１ｅｉｚ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ社）を用いて発色させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した。 ドツトプロット ＰＢＳに溶かした各抗原１ｍｇをニトロセルロースフィルター（ドイツ国Ｄａｓ ｓｅ１％５ｃｈｌｅＬｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｈｕｅ１１社）上に点滴した。非特 異的結合部位は、Ｐ　Ｂ　Ｓ　／　Ｂｌｏｔｔｏ　１％とともに温室することに よってブロックした。次いで、フィルターをウサギ抗血清のｌ：５００希釈物と ともに温室した。Ｐ　Ｂ　Ｓ　／Ｔｗｅｅｎ２００　、０５％で洗浄した後、フ ィルターをペルオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギ抗血清（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ　Ａ ／Ｓ　）とともに温室した。反応生成物を、過酸化水素の存在下で、５０關のト リス（ｐｉ（７，５）に溶かした０、０６％ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ　 ）を用いて発色させた。 の　゛および 先づ、蛋白質Ａ−セファロース（スエーデン国Ｕｐｐｓａｌａ、Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ社）でのカラムクロマトグラフィーによって抗体を精製した。次いで、得ら れたＩｇＧ蛋白質（５ａ＋ｇ）を、精製した組換えヒト肝エンドネキシン■をＣ ＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）と組合せることによって作 成したアフィニティークロマトグラフィーにかけた。結合抗体は４．５ＭのＭ　 ｇ　Ｃｌ　＊で溶出させた。 メジャーＨＢｓＡ　の　・　・ 蛋白質２ｕｇを、５ａｌａｃｉｎｓｋＬら（１９８１年）の方法に従い、Ｉｏｄ ｏｇｅｎ　（１，３，４，６−チトラクロロー３　ａ　＋　６　ａ−ジフェニル グリコリル）（米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　Ｐｉｅｒｃｅ社）との室温 で１７分間の温室によって、１．３７Ｘ１０’ベクレルのＮａ”’Ｉ（英国Ｂｕ ｃｋｉｎｇｈａｍｓＭｒｅ　、　Ａｍｅｒｓｈａｍ社）で標識した。ＰＢＳに溶 かした１％ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）　（Ｓｉｇ＋＋＋ａ　）でブロッ クしたセファデックスＧ２５のカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に反応混合物を 通すことによって、遊離ヨウ素を除去した。比活性はＨＢｓＡｇ１μｇあたり１ ．７ＸＩＯ’ｃｐｍに達した。組換えメジャーＨＢｓＡｇは、Ｗ、Ｊ、　Ｍｉｌ ｌｅｒ博±［米国ペンシルバニア州ＷｅｓｔＰｏｉｎｔ％Ｍｅｒｃｋ　５ｈａｒ ｐ　ａｎｄ　Ｄｏｈｍｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、分析研究開発部：　Ｍｃ Ａｌｅｅｒら（１，９８４年）］の親切な贈呈品であった。血清由来メジャーＨ ＢｓＡｇは、Ｎ、　Ｌｅｌｉｅ博±［オランダ国Ａｍ５ｔｅｒｄａａ＋　、オラ ンダ赤十字輸血サービス中央研究所：　Ｂｒｕｍｍｅｌｈｕｉｓら（１９８１年 ）］の親切な贈呈品であった。 ヒト　の ヒト肝細胞は、死後供与者から得られたヒト肝組織から、以前に記載されたとお りの（Ｒｉｊｎｔｊｅｓら（１９８６年）　、Ｍｏｓｈａｇｅら（１９８８年） 〕二段階コラゲナーゼ潅流によって単離した。単離した細胞の、トリパンブルー 排除検定によって測定した限りでの生存度は９０％であった。細胞は、細胞外基 質（ＥＣＭ）で被覆したカバーガラスを有する２４穴プレートで培養した（１ウ エルあたり２００．０００細胞）、細胞は、１．５％ＤＭＳＯで補強した、ホル モン的に規定された培地中で培養した。単離の３日後に、細胞を結合実験に用い た。結合検定の前に、１ｍＭのＣａ”および１ｍＭのＭ　ｇ２　゛並びに１％Ｂ ＳＡを含有する水冷培地とともに細胞を温室して、非特異的結合を削減した。 ベス九ヱ合或 記載されたペプチドはすべて、開裂の際にカルボキシル末端アミドのペプチドを 生成するために、酸に不安定な結合剤であるｐ［５−α−１（９Ｈ−フルオレン −９−イル）メトキシホルムアミド−２，４−ジメトキシベンジルコフェノキシ 酢酸［Ｒｉｎｋら（１９８７年）］で官能化したポリスチレン−ポリオキシエチ レングラフト共重合体であるＴｅｎｔａｇｅｌ　５−ＲＡＭ　（ドイツ国Ｔｕｅ ｂｉｎｇｅｎ　、　ＲａｐｐＰｏｌｙｍｅｒｅ社）上で合成した。ｔｅｒｔｉｏ −ブチルに基づ（側鎖保護、およびＦｍｏｃ　−ａ−アミノ保護を用いた。カッ プリングは、形成済みＯ−ペンタフルオロフェニルエステル類を用いて実施した 。合成はすべて、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ　９０５０　ＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ 　（米国カリフォルニア州、Ｎｏｖａｔ、ｏ社）上で連続フロー法を用いて実施 した。捕獲剤の存在下でのトリフルオロ酢酸による開裂、およびジエチルエーテ ルによる抽出の後、Ｃ１８逆相クロマトグラフィーを用いてすべてのペプチドを 分析した。 １；　された　えメジャーおよびラージＨＢｓＡｒＨＢｓＡ　との　・　・　ン 　の”Ａ組換えメジャーＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　（ＭｃＡｌｅｅｒら（１９８４年） ］または血清由来ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　［Ｂｒｕｍｍｅｌｈｕｉｓら（１９８１年 ）］を用いて、高結合ＥＬＩＳＡデ（’／シュ（ドイツ国、Ｎｕｅｒｔｉｎｇｅ ｎ％ＧｒｅｉｎｅｒＬａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ社）を被覆した（ｔｕｇ／ウェル ）、ＰＢＳに溶かした３％ゼラチン（ドイツ国Ｄａｒｍｓｔａｄｔ　、　Ｍｅｒ ｃｋ社）溶液とともに室温で２時間ウェルを温室することによって、非特異的結 合部位を減少させた。ＰＢＳ−０，０１％Ｔｗｅｅｎ８０で洗浄した後、１ｍＭ のＣａ”および１ｍＭのＭ　ｇ　２　゛の存在下で放射能標識形質膜蛋白質（８ ００，０ＯＯｃｐＩ１１）を加えた。室温で１時間の温室後、ウェルを、洗浄液 中にもはや放射能が見いだされな（なるまで、ＰＢＳ−０，０１％Ｔｗｅｅｎ８ ０−１　ｍＭのＣａ”−１ｍＭのＭｇ３　＋で洗浄した。次いで、９Ｍの尿素（ ベルキー国Ｂｅｅｒｓｅ、　Ｊａｎｓｓｅｎ社）および１％トリトンＸ　−１０ ０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）を含有する溶液４０μｍをウェルに加えた。−晩の４℃ での温室後、ウェルの溶出液をプールし、−８０℃で貯蔵して使用した。 溶出した蛋白質の純度は、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび二次元Ｉ　ＥＦ／５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥを用いて検定した。図１に示したとおり、３４キロダルトンの見かけ分子 量を有する１蛋白質のバンドが５ＤＳ−ＰＡＧＥに観察されたが、二次元ＩＥＦ ／５ＤＳ−ＰＡＧＥの分析は、ただ１種類の蛋白質（３４キロダルトン、ｐＩ＝ ４．１）がメジャーＨＢｓＡｇによって結合されたことを示した（図２Ｂ）。 ＢＳＡ被覆マイクロタイタープレートを用いた対照実験、または過剰な非標識形 質膜蛋白質（図１）もしくはメジャーＨＢｓＡｇ（データは示さず）の存在下で の対照実験では、ＥＬＩＳＡディツシュに結合した放射能標識蛋白質は皆無であ った。加えて、ラットの肝臓からの放射能標識形質膜蛋白質を用いた場合には、 負の結果が観察された。 同様の結合実験を実施したが、ここでは、組換えメジャーＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　［ ＭｃＡｌｅｅｒら（１９８４年）ｌｌｕｇや等Ｍ量の組換えラージＨＢ　ｓ　Ａ 　ｇ　［ＭｃＡｌｅｅｒら（１９８４年）］を用いて、上記のようにマイクロタ イタープレートを被覆した。上記の条件下での放射能標識形質膜蛋白質の添加は 、組換えラージＨＢｓＡｇはもとより組換えメジャーＨＢｓＡｇにも結合した３ ４キロダルトンの放射能標識形質膜蛋白質の検出を招いた。しかし、ラージＨＢ ｓＡｇは、メジャーＨＢ　ｓ　Ａ　ｇより効率的に放射能標識蛋白質に結合する ように思われることに注目することが重要である。 ２：３４キロダルトン　の　および二゛−ゲル　動 メジャーＨＢｓＡ　に士Ａ　る３４キロダルトン　百のヒト肝形質膜のＣＨＡＰ Ｓ抽出蛋白質からの３４キロダルトン蛋白質分画の大規模単離（図１および「材 料および方法」を参照されたい）を下記のとおり実施した。 ３４キロダルトンの見かけ分子量を有する蛋白質分画を、水平な成形済み５ＤＳ −ＰＡＧＥ勾配ゲル（ＥｘｃｅｌＧｅｌ　；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）、垂直な １ｍｍの１０％Ｔｒｉｃｉｎｅ　（Ｊａｎｓｓｅｎ　）　［Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ およびＷｏｎＪａｇｏｗ　（１９８７年）］ゲルまたはＭｏｄｅｌ　４９１　Ｐ ｒｅｐ　Ｃｅ１ｌ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）のいずれかから単離した 。前二者の場合は、０，１％５ＤＳ−１９２ｄのグリシン中で、切除した３４キ ロダルトンのバンドからＳ　＆　Ｓ　Ｂｉｏｔｒａｐ　（ドイツ国Ｄａｓｓｅｌ 、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄＳｃｈｕｅ１１社）を用いて蛋白質を電気溶出 させた。後者の場合は、３４キロダルトン蛋白質を、溶離緩衝液（０，１％ＳＤ Ｓ−１９２ｍＭのグリシン）中に回収し、適切な分画をプールした。溶出分画は 、液体窒素中で瞬間凍結し、使用するまで一８０℃で貯蔵した。 二次元電気泳動に先立ち、３４キロダルトン蛋白質の分画を５ａｖａｎｔ　５ｐ ｅｅｄｖａｃでの真空遠心分離、またはＣｅｎｔｒｔｐｒｅｐ瀘過［分離：ｌＯ キロダルトン（米国マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ　、　Ｗ、　Ｒ。 Ｇｒａｃｅ　＆　Ｃｏ、社Ａｍ１ｃｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　）　］を用いて１ ０倍に濃縮し、ＴＣＡ（２０ｗ／ｖ％の最終濃度）で−晩（４℃）析出させ、２ ０％ＴＣＡ、アセトンおよび１％（ｖ／ｖ　）　トリエチルアミン含有アセトン で洗浄した。試料は、減圧下で乾燥し、２００μｍを上回る溶解緩衝液［９，５ Ｍ尿素、５％２−メルカプトエタノール、２％ＣＨＡＰＳおよび５％Ｒｅ５ｏｌ ｙｔｅ　：　ｐＨ３、５〜１０　（米国カリフォルニア州すンフランシスコ、Ｈ ｏｅｆｅｒ社）］に溶解した。 ３４キロダルトン　百の二゛−′重 等電点電気泳動（Ｉ　ＥＦ）／５ＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌら（１９ ７７年）のシステムに基づき、Ｍｅｈｅｕｓら（１９８７年）によって記載され た下記の変更を加えた。第一の次元は、Ｐ　Ａ　Ｇ　−Ｇｅ１ｂｏｎｄ　ｆｉｌ ｍ（米国メイン州Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　Ｆ　Ｍ　Ｃ社）に被覆した、Ｐｈａｒｍ ａｌｙｔｅ　：　ｐＨ２、５〜５　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）とＲｅ５ｏｌｙｔ ｅ　：　ｐＨ４〜８　（Ｈｏｅｆｅｒ）の混合物（３二１）を用いて構成したｐ Ｈ勾配を有する超薄（０，５ｍＭ）ポリアクリルアミドゲルで実施した。 ＩＥＦゲルは、試料をかける前に予備操作（５００Ｖで１時間）を行ない、６， ２５０ボルトアワー（５００Ｖで０．５時間、１．０ＯＯＶで２時間そして２． ０ＯＯＶで２時間）で操作した。第一次元での電気泳動の後、１０％（ｗ／ｖ） ＴＣＡで３０分間ゲルを固定し、４０％メタノールで一晩洗浄し、１０体積％酢 酸−５０体積％メタノールに溶かした０、１％（ｗ／ｖ　）クーマシーブリリア ントブルーＲ−２５０（Ｍｅｒｃｋ　）中で染色した。 第二次元での電気泳動のために、適切なレーンを切り出し、蒸留水（１０分間） 、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　：ｐＨ６，８（１０分間）で洗浄し、４％５ＤＳ −１００ｍＭ、ＤＴＴ−５０ｍＭ、トリス−ＨＣｌ　：ｐＨ６，８に対して平衡 させた（３０分間）。第二次元での電気泳動は、１０％Ｔｒｉｃｉｎｅゲル中で 実施し［ＳｃｈａｇｇｅｒおよびＹｏｎＪａｇｏｗ　（１９８７年）］、クーマ シーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。 上記で得られた蛋白質分画は、−次元ゲル電気泳動上では３４キロダルトンの単 一の蛋白質のバンドを示したが、二次元電気泳動では、はぼ同じ分子量を有する いくつかの蛋白質が認められた（図２Ａ）。二次元電気泳動での問題のスポット を、結合検定（実施例１）から得られた放射能榎識メジャーＨＢｓＡｇ結合性蛋 白質と、染色およびオートラジオグラフィー後の非標識３４キロダルトン分画と の混合物の分析によって同定した。標識および非標識材料の同時移動からは、３ ４キロダルトンの分子量および４．１のｐＩを有する単一の放射性蛋白質スポッ トに符合するクーマシー可染スポットが得られた［図２Ａ（矢印）および２Ｂ］ 。 ３：３４キロダＪレトンのメジャーＨＢｓＡ　士人　の配剋迭定 二次元ゲルから、問題の蛋白質のスポットを切り出し、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら（ １９９１年）によって記載された方法を用いて１スポツトに濃縮し、メタノール ／酢酸／水（５０：　１０　：　５０）に溶がした０、１％ボンソーＳで染色し た。 配列決定可能量のこの３４キロダルトン蛋白質（４μｇと推算）を５６個の二次 元Ｉ　Ｅ　Ｆ　−Ｓ　Ｄ　Ｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅゲルから採取した。濃縮したスポ ットを、Ｖａｎｆｌｅｔｅｒｅｎら（１９９２年）の方法に従って、ペプチドに 開裂した。略述すると、染料の解離後、３％ギ酸に溶かしたゲル基質中で蛋白質 を１１２℃で４時間加水分解した。 溶出したペプチドを、１４０　ＢＳｏｌｖｅｎｔ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔ ｅｍ　（米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ　（：ｉｔｙ　、　Ａｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓｙｓｔｅａ＋社）を用いたＶｙｄａｃ　Ｃ−４カラム（２，１ｘ２５ ０ｍｍ、米国カリフォルニア州、Ｈｅ５ｐｅｒｉａ社）での逆相ＨＰＬＣによっ て分離し、ｏ、ｉ％トリフルオロ酢酸に溶カルだアセトニトリルの線形に増大す る勾配を用いて溶出した。カラムを、１００ＯＳダイオードアレー検出器（Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の８ｕｌ流動セルに直接接続した。ペプチ ドのピークを、チャートレコーダーに登録し、手動で集めた。これらのペプチド のＨＰＬＣパターンを図３に示す、最後に、得られたペプチドを、オンライン１ ２０フエニルチオヒダントイン分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋＋ ＋ｓ）を装備したパルス液体型モデル４７７ＡＳｅｑｕｅｎａｔｏｒ　（Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。異なるペプチドのア ミノ酸配列を表２に明らかにする。 表２０図３に示した（矢印）のピークを配列決定することによって得られたアミ ノ酸配列。 ０は明確なシグナルを与えなかったアミノ酸を示す。＊はこの残基からはシグナ ルが全（得られなかったことを示す。 去思！４；メジャーＨＢｓＡ　”人　としてのヒトエンドネヱ乞ンユΩ伺Ｉ 分析から得られたアミノ酸配列を、スイス蛋白質データバンク（ジュネーブ大学 医用生化学部門およびＥＭＢＬデータライブラリー）でふるい分け、エンドネキ シン■がメジ型−ＨＢｓＡｇ結合性蛋白質と同一であるという結果を得た。　Ｋ ａｐｌａｎら（１９８８年）によって報告されたエンドネキシン■の配列との比 較は、ピークＡＨ５が第２１〜３１アミノ酸に、ピークＡＨ２１が第３０８〜３ １８アミノ駿に、ピークＡＨ２４ａが第１７６〜１８６アミノ酸に、ピークＡＨ ２４ｂが第３０８〜３１９アミノ酸に、ピークＡＨ２４ｃが第３０４〜３１９ア ミノ酸に、ピークＡＨ２５が第１８０〜１８８アミノ酸に、そしてピークＡＨ４ ２が第９３〜１０８アミノ酸にそれぞれ対応することを示す。 ＡＨ５、ＡＨ２１、ＡＨ２４、ＡＨ２５、ＡＨ４２というペプチドのアミノ酸配 列（図３および表２）および配列データバンクの検索（スイス蛋白質データバン ク）の情報に基づき、本発明の３４キロダルトン蛋白質は、疑問の余地なく、ア ネキシン族に属し、ヒトエンドネキシン■またはアネキシン５　［Ｋａｐｌａｎ ら（１，９８８年）、Ｖｌａｌｋｅｒら（１９９２年）］として同定できること が見いだされた。 ５：　されたヒトおよびラットエンドネキシン■のメジャーＨＢｓＡ　への士Ａ ヒトおよびラットエンドネキシン■のそれぞれの肝組織からの単離は、これ以後 は、Ｈａｉｇｌｅｒら（１９８７年）の方法に従い、い（つかの僅かな変更を加 えて実施した。簡単に述べると、肝組織５０ｇを、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ　（ｐ Ｈ７，４）、１５０ｍＭのＫＣＩ、２ｍＭのＭｇＣ１□、１ｍＭのベンズアミジ ンおよび１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有する均一 化緩衝液（緩衝液Ｈ）中で４℃で解凍した。解凍した組織をワーリングプレング ー中でホモジナイズし、ホモジネートを８００ｇ　（４℃）で１５分間遠心分離 した。ペレットを緩衝液Ｈに再懸濁し、再び遠心分離した。双方の上清をプール し、１００メツシユのナイロンフィルターを通じて濾過した。濾液にＣａ　Ｃｌ 　ｚを加えて、１ｍＭの最終濃度とし、溶液を３０分間放置した。Ｃａ”の存在 下では、すべてのカルシウム依存性リン脂質結合性蛋白質が形質膜に結合する［ Ｈａｉｇｌｅｒら（１９８７年）］、３３０分後溶液を１００，０００ｇ　（４ ℃）で２０分間遠心分離し、上清を棄却した。ペレットを緩衝液Ｈに再懸濁し、 Ｄｏｕｎｃｅ均一化によってＣａＣ１−を補強し、１００，０００ｇで遠心分離 した。この段階を３回反復した。洗浄段階の後、ペレットを２ｍＭのＥ　Ｇ　Ｔ 　Ａを含有する緩衝液Ｈに再懸濁し、１５分間放置し、１００．０００ｇ　（４ ℃）で２０分間遠心分離した。すべてのカルシウム依存性形質膜蛋白質は、膜か ら遊離される。上清を棄却し、＾ｍｉｅｏｎＹＭ　−１０（米国マサチューセッ ツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ　、　Ａｍ１ｃｏｎ。 Ｃｏｎｎ社）の膜を通じての圧力濾過によって１５ｍ１に濃縮した。 濃縮したＥＧＴＡ溶出物を、酢酸アンモニウム（０，０６Ｍ、ｐ＋＋８．３）で 平衡させたセファデックスＧ−１００カラム（２，５Ｘ９０ｃｍ）（スエーデン 国Ｕｐｐｓａｌａ　％Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で分画した。流速は０．５ｍｌ／ 分であり、５ｍｌの分画を捕集した。問題の分画を濃縮し、１２％５ＤＳ−ＰＡ ＧＥで調べ、５ｍＭの酢酸アンモニウムに調整した（ｐＨ８，６５）。この試料 を、ＤＥ−５２セルロース（英国Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ　、　Ｗｈａｔｍａｎ社） カラム（ＩＸ４ｃｍ）にかけ、酢酸アンモニウム緩ｉｌｉ液（５ｍＭ、　ｐＨ８ ，６５）で平衡させ、下記の酢酸アンモニウム（５ｍＭ、　ｐＨ８，６５）の勾 配で溶出させた８５〜３００１Ｍを１６０ｍ１．３０〜７５ｍＭを６０＋ｏｌ、 ７５〜３５０＋ｍＭを１２５ｍ１．流速は０．５ｍｌ／分であり、５ｍｌの分画 を捕集した。±３００ｍＭの酢酸アンモニウムで溶出したピークを濃縮し、１２ ％５ＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ　Ｄｒｙ　５ｔｒｉｐ　Ｋｉ ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を第一次元に、Ｅｘｃｅｌゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ　）を第二次元に用いた二次元ゲル電気泳動で検査した。最後に、精製蛋白質 １０μｇを限定酸加水分解に付し、上記のとおり配列決定した。 結合研究は、標識形質膜蛋白質について記載された実験的条件下で１２５工標識 ヒトおよびラット肝エンドネキシン■を用いて実施した（実施例１を参照された い）、シかし本形式の結合研究では、ＥＬＩＳＡディッシェのウェルに被覆した メジャーＨＢｓＡｇｌｕｇに１５ｎｇの１１１１Ｉｔｊｌ識ヒトまたはクツ１− エンドネキシン■を加えることによって結合を実施した。 図４（レーン１）に示したとおり、これによって、組換えメジャーＨＢｓＡｇへ のヒト肝エンドネキシンＨの結合が得られた。結合の特異性は、過剰な非標識ヒ ト肝エンドネキシン■（２μｇ）、メジャーＨＢｓＡｇ　（２μｇ）またはヒト 形質膜蛋白質（２０ｕｇ）がメジャーＨＢｓＡｇへの結合について競合できるこ とによって立証された（図４レーン２〜４）。 ウサギ抗ヒトエンドネキシンＵＩｇＧ（ｒ材料および方法」で説明したとおり精 製した）との標識ヒト肝エンドネキシン■の前部室け、メジャーＨＢｓＡｇへの ヒト肝エンドネキシン■の結合を阻害する（図４レーン５〜６）。この結合は、 同じウサギの免疫前ＩｇＧによって阻害されない０図５は、様々な濃度の抗エン ドネキシン■との放射能標識ヒト肝エンドネキシンＨの前部室の、メジャーＨＢ 　ｓ　Ａ　ｇへの結合についての結果を表す０等量の放射能標識ヒトおよびウサ ギ肝エンドネキシンｎ（１０ｎｇ）を用いた結合実験は、ラット肝エンドネキシ ン■は、ヒト肝エンドネキシン■と比較すると、メジャーＨＢｓＡｇとはほとん ど結合し得ないことを立証した。 ６：ヒト　エンドネキシンＨによる、なヒト　へのメジャーＨＢｓＡ　の±４の ヒト肝エンドネキシン■が、正常な肝細胞への放射能標識メジャーＨＢｓＡｇの 結合を阻害し得るか否かを調べるために、放射能標識メジャーＨＢｓＡｇおよび 過剰な非標識ヒト肝エンドネキシン■を、培養細胞への添加の前に４℃で３０分 間前温温室た。 はぼ２００，０００個の細胞を結合用培養液（１ｍＭのＣａ”、１ｍＭのＭ　ｇ ｘ　４および１％ＢＳＡで補強した培養液）１ｍｌとともに４℃で１時間温置し た。過剰な非標識ＨＢｓＡｇの不在下または存在下で（非特異的バックグラウン ド結合を測定するため）、ヒト肝エンドネキシン■または対照蛋白質と温置した 放射能標識メジャーＨＢ　ｓ　Ａ　ｇを加え、細胞を４℃で２時間温置した。次 いで、細胞を、洗浄液中にもはや放射能が見いだされなくなるまで、冷結合用培 養？＆で洗ＩＬ、０．２規定ＮａＯＨ１０，５％ＳＤＳで溶解して、結合してい る放射能の測定に付した。 図７に示したとおり、培養ヒト肝細胞への放射能標識メジャーＨＢｓＡｇの結合 は、ヒト肝エンドネキシンＨによって阻害された。 ７：ヒトエンドネキシン■へのメジャーＨＢｓＡ　の　１金 ５０ｍＭのＤＳＳ　（スペリン酸ジスクシンイミジル）（米国イリノイ州Ｒｏｃ ｋｆｏｒｄ、　Ｐｉｅｒｃｅ社）をＤＭＳＯに１ｍＭの最終濃度として溶かした 溶液を、メジャーＨＢｓＡｇで被覆した、　Ｉ＊Ｊ櫟識エンドネキシン■を含有 するウェルに加えることによって、架橋結合を実施した。４℃で３０分間反応を 進行させ、１Ｍグリシンを１００ｍＭの最終濃度まで加えることによって、反応 を停止した。最後に、ウェルを上記のとおりに洗浄し、結合蛋白質を溶出させ、 １２％５ＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。 “！８Ｉ［識エンドネキシンＨの結合実験（実施例１に記載のとおり）で、１ｍ ＭのＤＳＳを、固定化された組換えまたは血清由来メジャーＨＢｓＡｇに加えた ときは、９０キロダルトンの見かけ分子量を有する追加的なバンドが５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ上に認められた（図８）。 この蛋白質複合体は、 （１）１分子のエンドネキシン■（分子量３４キロダルトン）と２分子のメジャ ーＨＢｓＡｇ　（分子量２７キロダルトン）との間の相互作用、または （２）２分子のエンドネキシン■と１分子のメジャーＨＢｓＡｇとの間の相互作 用 の結果のいずれがであり得る。 同様な結果が、ＤＳＳを、　１′工標識エンドネキシン■とメジャーＨＢｓＡｇ との混合物溶液に加えたときに得られたが、ＤＳＳを、　＋′工標識エンドネキ シン■と、ＢＳＡ、アシアロフェチュイン（ＡＳＦ）または非標識エンドネキシ ン■との混合物に加えたときは、そのような蛋白質複合体は全く見いだされなが った（図８）。 そのような蛋白質複合体は、放射能標識ラット肝エンドネキシン■およびメジャ ーＨＢ　ｓ　Ａ　ｇを架橋結合させたときにも見いだされなかった。架橋結合の 特異性は、ＤＳＳ以外の化学的架橋結合剤（ＤＭＡすなわちジメチルアジビミダ ート、ＤＭＰすなわちジメチルビメリミダート、ＤＴＢＰすなわちジチオビスブ ロビオンイミダート、ＤＴＰすなわちジチオブロビオンイミダート）を用いた場 合の±９０キロダルトン複合体の不在によっても、更に立証された。これらの知 見に基づき、メジャーＨＢｓＡｇとヒト肝エンドネキシン■との間の相互作用は 特異的であり、エンドネキシン■とＨＢｓＡｇとの間の相互作用距離は１１．４ オングストローム（ＤＳＳの鎖長）であると推算し得る。 １８、ヒトおよびラット　への１２ｓＩ、・ヒト　エンドネエ乞２且二精童 エンドネキシン■が、メジャーＨＢｓＡｇの正常な肝細胞への結合を妨げ得るか 否かを調べるには、ヒト肝エンドネキシン■自体がこれらの細胞に結合し得るか 否かを決定することが必要であった。 そのため、ヒトおよびラットの肝細胞を、　１２６Ｉで標識したヒト肝エンドネ キシン■とともに温置した。 ＋２Ｊ標識ヒト肝エンドネキシン■（約１５ｎｇ）を、過剰な（２μｇ）非標識 ヒト肝エンドネキシン■、過剰な（２μｇ）非標識メジャーＨＢｓＡｇ、または 過剰な（２μｇ）非標識ＢＳＡの存在下で加えた。 図９に示したとおり、結合は、ヒト肝細胞とエンドネキシン■との間で得られた が、ラット肝細胞を用いては、同様の結合パターンが観察されなかった。更に、 過剰なメジャーＨＢｓＡｇは、正常な細胞（ラットおよびヒト）への１ｌｌｌｉ 標識ヒト肝エンドネキシンＨの結合を妨げることができ、ＨＢｓＡｇとヒト肝エ ンドネキシン■との間には相互作用が存在して、それが肝細胞とヒト肝エンドネ キシン■との間での結合の競合へと導くことを示した。対照として、ＢＳＡをＩ ！ＳＩ標識ヒト肝エンドネキシン■の存在下で加えた。この場合、　１２′工標 識ヒト肝エンドネキシンＨの結合の阻害は全く立証できなかった。 １２Ｊ標識ヒト肝エンドネキシン■のヒトおよびラット肝細胞への結合における 差異を調べるために、変化させた量の過剰な非標識エンドネキシン■を用い、ヒ トおよびラット肝細胞（５０，０００細胞）に対して結合の研究を実施した９図 １０に示したとおり、ヒト肝細胞とラットのそれとの間には、　１２′工標識ヒ ト肝エンドネキシンＨの結合に関して顕著な差異が存在する。前者の場合、少量 の非標識ヒト肝エンドネキシンＨの添加は、　１２１１１標識ヒト肝エンドネキ シンＨの増大した結合を招くが、７μｇ　（最終濃度ニアμｇ／ｍｌ）以上の非 標識ヒト肝エンドネキシン■を反応混合物に加えたときには、結合の阻害が発生 した。しかしながら、後者の場合（ラット肝細胞）、　ＩＩＪ標識ヒト肝エンド ネキシンＨの結合の阻害は、１μｇ　（最終濃度＝１μｇ／ｍｌ）の非標識ヒト 肝エンドネキシン■の添加後に観察された。より少量の非標識ヒト肝エンドネキ シン■を加えたときですら、結合の増加は観察されなかった。 ヒト肝エンドネキシン■が、正常細胞への１２１ｉ標識メジャーＨＢｓＡｇの結 合を阻害し得るか否かを調べるには、培養液中に一定の濃度の遊離エンドネキシ ン■が存在しなければならない。上記のとおり、追加の１１１標識ヒト肝エンド ネキシン■が５０．０００個のヒト肝細胞に結合するのを防ぐには、少なくとも ７μｇ／ｍｌのヒト肝エンドネキシン■が必要である。ラット肝細胞については 、これは少なくとも１μｇ／ｍｌというヒト肝エンドネキシン■の量になる。 肝細胞へのメジャーＨＢｓＡｇの結合に対するヒト肝エンドネキシンＨの効果を 測定するために、いくつかの実験プロトコルを用いた。第一に、　＋ｘｓＨ標識 メジャーＨＢｓＡｇを正常肝細胞（ヒトおよびラット）とともに４℃で３０分間 温Ｉｂてから、過剰な（それぞれ７または１μｇ）非標識ヒト肝エンドネキシン ■を加えた。第二に、　１２１１標識メジヤ−ＨＢｓＡｇと過剰な非標識ヒト肝 エンドネキシン■を４℃で３０分間混合してから、細胞懸濁液に加えた。 第三に、過剰な非標識ヒト肝エンドネキシン■をはじめに正常肝細胞とともに４ ℃で３０分間温Ｉｂてから、　＋ａｓｌ標識メジャーＨＢｓＡｇを加えた。図１ １に示したとおり、三つの場合のすべてにおいて、ヒト肝エンドネキシンＨの添 加は、ヒト肝細胞への目５工標識メジャーＨＢｓＡｇの結合を阻害する。対照的 に、ラット肝細胞を用いると、過剰量のヒト肝エンドネキシン■および１Ｒ″″ 工標識ＨＢｓＡｇを、または＋２Ｊ標識ＨＢｓＡｇおよびそれに続いて過剰なヒ ト肝エンドネキシン■を肝細胞に加えたときに、°２６エ標識ＨＢｓＡｇの増大 した結合（競合物質の不在下での放射能標識ＨＢｓＡｇの低い結合と比較しての ）が観察された。しかしながら、細胞を過剰な非標識ヒト肝エンドネキシン■と ともに前温室したときは、メジャーＨＢ　ｓ　Ａ　ｇの増大した結合は全く観察 されなかった。 ９：ヒト　エンドネキシン■のｃＤＮＡクローン　、およびコウポにおＧる　え ヒト　エンドネキシンＨのエンド　キシンｌＩｃＤＮＡクローンのラムダＺａｐ ベクター（米国カリフォルニア州Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社） のＥｃｏＲＩ部位に、ヒト肝ｃＤＮＡライブラリーを構築し、ＸＬＩブルー細胞 （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を感染するのに用いた。ライブラリーからの約６．５ Ｘ１０”のプラークをＮＺＹプレートに散布、３７℃で一晩温室してから、ニト ロセルロースフィルター（ドイツ国Ｄａｓｓｅｌ、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎ ｄ　５ｃｈｕｅ貝社）上に二重のレプリカを作成した。次いで、これらのレプリ カを、標準ハイブリッド形成プロトコル、および合成３６量体オリゴヌクレオチ ド（５°−ＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＴＣＡＡＧＧＣＡ ＴＧＴＴＴ−３°）というプローブを用いて、エンドネキシン■陽性クローンに ついてふるい分けた。プローブの配列は、単離されたメジ型−ＨＢｓＡｇ結合性 蛋白質の前記の分析から得られたアミノ酸（および相関する核酸）配列データ（ 表２）から演鐸されている。ＤＮＡ５°末端標識システム（米国ウィスコンシン 州Ｍａｄｉｓｏｎ　、　Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、１００ｎ１００ｎピコＭ ）のプローブを標識した。 フィルターを、増感スクリーンを用いて４８時間オートラジオグラフィーにかけ た。両フィルターに陽性のハイブリッド形成シグナルを与えるプラークを陽性と 見なし、その後のスクリーニングに用いた。最後に、１０個のエンドネキシン■ 陽性クローンを、低密度で再培養し、オリゴヌクレオチドのプローブを用いてプ ラークを再スクリーニングすることによって、同定かつ精製した。 陽性クローンのファージストックを用いて、ヘルパーファージＲ４０８（Ｓｔａ ｔａｇｅｎｅ　）の存在下でＸＬＩブルー細胞を感染させた。組換λによって、 これは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドの構築を招く。ＬＢ／アンピシリン プレート上に出現する細胞のコロニーは、ＥｃｏＲＩ部位にｃＤＮＡ挿入断片を 有するｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを含有する。エンドネキシン■陽性ク ローンの同一性を確認するために、アルカリｌ容解ミニブレブ法を用いてプラス ミドＤＮＡをＸＬＩブルー細胞から単離した。このＤＮＡを、ＲＮアーゼＡ（ド イツ国Ｍａｎｈｅｉｍ　、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）の存在下でＥｃｏＲＩ（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で消化した。消化パターンに基づき、１．６キロベース （ｋｂ）の挿入断片を有する５クローン、およびヒト胎盤ｃＤＮＡの全長にほぼ 等しい２．２キロベースの挿入断片を有する１クローンを選別し、０゜８％アガ ロースゲル上で培養し、Ｈｙｂｏｎｄというナイロン膜（英国Ｂｕｃｋｉｎｇｈ ａｍｓｈｉｒｅ　、　Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に移し、３６量体オリゴヌクレオチ ドのプローブとともにハイブリッド形成した。５クローンからは、４クローンが 再び陽性であると判明した。ＴａｑＴｒａｃｋ配列決定システム（Ｐｒｏｍｅｇ ａ　）を用いたこれらのクローンのＤＮＡ配列決定から、１．６キロベースのク ローンにおけるすべての開始および終止コドンが明らかにされた。全クローンの 完全な配列決定から、ヒト肝３４キロダルトン蛋白質と既報のヒト胎盤エンドネ キシンＵ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　［Ｋａｐｌａｎら（１９８８年）］との間の差異は ないことが明らかにされた。 １丸ヒト　−エンドネキシンＨのビール　・　・　Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ にお秩ゑヱ現 ヒト肝エンドネキシン■をコードする配列を、９８１塩基対のＮｃｏ　Ｉ／Ｅｃ １１３６ＩＩフラグメントとしてｐＢＳＫ　（−）ｈエンドネキシン■クローン ５．３．ｌｅｎから単離し、次いで、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶ開放ベクターｐＹＩ Ｇｌに挿入した。このベクターは、ｐＴＺ１８Ｕの誘導体であって［Ｍｅａｄら （１９８６年）］、構成性のビール酵母菌プロモーター［例えばＰＧＫ　（ホス ホグリセリン酸キナーゼ）、ＧＡＰ　（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素 酵素）またはＭＦＩα（接合因子α）プロモーター］およびビール酵母菌ターミ ネータ−（例えばＴＲＰｌ、ＧＡＰまたはＭＦＩターミネータ−）を担持する。 得られたベクターをｐＹＩＧｌ　ｈＥＸＮＩＩと呼んだ。 第二段階では、プロモーター／ヒトエンドネキシン■コード担持配列／ターミネ ータ−というモジュールを大腸菌／ビール酵母菌シャトルベクターであるｐｓＹ ｌに移した。このベクターは、ビール酵母菌２μ環状プラスミド全体、大腸菌ｐ ＢＲ３２２配列およびビール酵母菌栄養素要求性マーカー、例えばＵＲＡ３、Ｈ ＩＳ３またはＬＥＵ２を担持する。この移転は、モジュールを±２，６００塩基 対のＢａｍＨＩフラグメントとしてベクターｐＹ　Ｉ　Ｇ　１　ｈ　ＥＸＮＩＩ から単離し、これをＢａｍＨＩ開放ベクターｐｓＹ１に挿入することによって実 施した。ベクターは、モジェールがセンスおよびアンチセンスの方向に挿入され たところで単離した。これらの構造体をｐｓＹｌｈＥＸＮＩＩｓおよびｐＳＹｌ 　ｈＥＸＮＩＩａｓと呼んだ。 ｐｓＹｌｈＥＸＮＨｓおよびｐＳＹｌｈＥＸＮＩＩａｓのプラスミドＤＮＡを、 スフェロプラスト形成法［Ｋｌｅｂｅら（１９８３年）］を用いて、ビール酵母 菌ＡＶＢ１００株内で形質転換した。数コロニーが、３％ブドウ糖で補強したＹ ＰＤ培養液中で２８℃で増殖した。 コウボ細胞の分別によって、何回かの時間的間隔を置いて試料を採取し、５ＤＳ −ＰＡＧＥおよびウェスタンプロット法を用いて分析した。 ２４時間の増殖後には、クーマシーブリリアントブルー染色が可能な誘導された バンド（分子量３４〜３５キロダルトン）を５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に視認すること ができた。１２０時間の増殖後も、発現レベルの低下は全く観察し得なかった（ データは示さず）。 発現した蛋白質の同一性は、ウサギポリクローナル抗エンドネキシン■血清を用 いたウェスタンプロット法によって確認することができた。 成熟したヒトエンドネキシン■は、可溶性分画にほとんど限定的に存在する。 えエンドネキシン■の　゛ 培養コウボ細胞を、ブラウンホモジナイザーを用い、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ ｐＨ７，４）　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　、１５０ａ＋ＭのＫＣＩ、２ｍＭの Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｘ、１ｍＭのベンズアミジン（米国Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　、　Ｓ ｉｇｍａ社）、１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）（Ｓｉｇ ｍａ　）および０．１ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃＳ　Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） を含有する均一化緩衝液（緩衝液Ｈ）中で破砕し、ｔｏｏ、０００ｇ（４℃）で ３０分間遠心分離して、細胞砕片を除去した。上清（ＳｕｐＩ）は、使用するま で一８０℃で貯蔵した。ベレットは、緩衝液Ｈ中でホモジナイズし、ｌｌ１１Ｍ のＣａ”で強化し、４℃で１５分間放置した。１００，０００ｇ　（４℃）で２ ０分間の遠心分離の後、ペレットを、２　ＬｏＭ（１）　Ｅ　Ｇ　Ｔ　Ａを含有 する緩衝液Ｈ中でホモジナイズし、１５分間放置し、１００，０００ｇで再遠心 分離した。最終的な上清（ＳｕｐＩＩ）も、使用するまで一８０℃で貯蔵した。 Ｓｕｐ　Ｉおよび■は、セファデックスＧ　−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　） カラムによって、その後、Ｈａｉｇｌｅｒら（１’３８７年）によって記載され たとおり、ＤＥ−５２セルロースカラム（英国Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ　、　Ｗａｔ ｍａｎ社）によって更に分別した。精製されたエンドネキシンＨの蛋白質濃度は 、Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質検定法を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ　（１９７６年）に従 って測定した。 えヒト　エンドネキシン■の　″　萱゛昌図１２〜１４に示したとおり、組換え エンドネキシン■の分子量、等電点および抗エンドネキシン■抗体認識特性は、 生来のヒト肝エンドネキシンＨのそれらと同一であることが判明した。 えヒト　エンドネキシン■のＨＢｓＡ　“４　の　２゛ハ組換え蛋白質の機能的 活性を確認するため、メジャーＨＢｓＡｇへの放射能標識組換えエンドネキシン ■の結合を、上記のとおり、生来のヒト肝エンドネキシンメジャーＨの代わりに 実施した。 図１５に示したとおり、雨量白質ともメジャーＨＢｓＡｇに結合するが、ＢＳＡ には結合しない。特異性は、過剰な非標識メジャーＨＢｓＡｇ、または過剰な生 来の非標識ヒト肝エンドネキシンＨの添加による結合の競合によって立証される 。組換え放射能標識エンドネキシン■を、生来のヒト肝エンドネキシンＨに対し てのポリクローナル抗エンドネキシン■抗体とともに前部室したときは、ＨＢｓ Ａｇへの結合は完全に阻害される。このことは、エンドネキシン■を同じウサギ の免疫前血清とともに前部室したときには該当しない、ＨＢｓＡｇに対する組換 えエンドネキシンＨの結合は、生来のヒト肝蛋白質によって示される結合とは決 して相違しないことに注目することができる。ＨＢｓＡｇとの結合活性のもう一 つの確認は、メジャーＨＢｓＡｇと組換え放射能標識エンドネキシン■との間の 架橋結合実験から得られる。メジャーＨＢｓＡｇとエンドネキシン■との架橋結 合によって得られる、９０キロダルトンの見かけ分子量を有するこの特異的複合 体は、生来のヒト肝エンドネキシン■を用いた実験と同様、組換えエンドネキシ ン■を用いた実験でも得られた（図１６）。ＢＳＡまたは非標識ＨＢｓＡｇを用 いた対照実験、または架橋結合剤を用いない実験では、高分子量の複合体を得る ことは全くできない。このことは、ＨＢｓＡｇとエンドネキシン■との間の相互 作用は特異的であり、化学的架橋結合剤の添加によって安定化されることを確認 する。 １１０：ヒト　エンドネキシン■に・する　イブ　オタイブ体 ウサギ　血゛の　、±”　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ精製された組換えヒト肝エンドネキシ ンＨによるウサギの免疫化が、その特異的受容体リガンドに反応する抗イデイオ タイプ抗体の発生を招くか否かを調べるために、生来の、または組換えのヒト肝 エンドネキシン■で免疫したウサギ（「材料および方法」を参照されたい）を間 隔を置いて採血し、ＥＬＩＳＡを用いて検査して、抗ＨＢｓ活性のあり得る存在 を判定した。図１７に示したとおり、抗ＨＢｓおよび抗エンドネキシン■活性が 血清中に立証された。４匹のウサギ（２匹は生来のヒト肝エンドネキシン■で免 疫し、２匹は組換えのヒト肝エンドネキシン■で免疫した）はすべて、比較し得 る抗ＨＢｓ活性を示した。この活性は、免疫前血清がメジャーＨＢｓＡｇと反応 せず、抗ＨＢｓ活性が（ＥＬＩＳＡによって測定した限りで）、過剰なメジャー ＨＢｓＡｇとの抗血清の前部室によって排除され得たことから、特異的であった （図１８）。対照的に、同量のラット肝エンドネキシン■で免疫したウサギは、 ヒト肝エンドネキシン■と比較しての９０％の配列相同性にもかかわらず、ＨＢ ｓＡｇ結合性を保有せず、抗ＨＢｓ抗体を発生しなかったが、同時に、匹敵し得 る抗Ｅ−１１応答を発生した（図１７、パネルＢ）。 イディオタイプ　および　イブ　オタイブ　のＨＢｓＡｇエピトープに対する抗 エンドネキシン■の交差反応性の可能性を排除するために、ウサギ抗血清中に存 在する抗ＨＢｓおよび抗エンドネキシン■活性を、ＣＮＢｒ活性化セファロース にカップリングさせた組換えエンドネキシン■を用いたアフィニティークロマト グラフィー（「材料および方法」を参照されたい）によって分離した。アフィニ ティーカラムからの溶出分画（１３〜１８）はもとより通過流分画（１〜１２） も捕集し、メジャーＨＢｓＡｇおよびエンドネキシン■とのそれらの反応性につ いて検査した（ＥＬＩＳＡ）。図１９に明らかにしたとおり、抗ＨＢｓ活性は圧 倒的に通過流分画（１〜６）に見いだされたが、抗エンドネキシン■反応性は溶 出分画（１４〜１７）に限定的に見いだされ、ウサギ抗エンドネキシン■抗体に おける抗ＨＢｓ反応性はメジ型−ＨＢｓＡｇエピトープに対してであることを示 している。 ドツトプロット ＥＬＩＳＡによって判定された限りでの上記の結果を確認するため、メジャーＨ ＢｓＡｇおよびエンドネキシン■をニトロセルロースフィルター上に点滴し、異 なる抗血清とともに温室した。図２０は、ウサギ抗血清はヒト肝Ｅ−ＩＩおよび メジャーＨＢｓＡｇの双方に反応性であるが、蛋白質Ａおよびエンドネキシン■ のカラムクロマトグラフィーの通過流分画（＝精製された抗ＨＢｓ抗体）はメジ ャーＨＢｓＡｇに対してのみ反応性であることを示している。 、・メジャーＨＢｓＡ　の　応 上記のとおり分離された抗体が、溶液中の抗原にも反応性であるか否かを調べる ために、放射能標識したヒト肝エンドネキシン■およびメジャーＨＢｓＡｇをそ れぞれ用いた実験を実施した０図２１に示したとおり、放射能標識した蛋白質は 双方とも、ヒト肝エンドネキシン■で免疫したウサギの血清によって沈降させる ことができたが、免疫前血清による対照実験は、これらの放射能標識蛋白質の沈 降の不在を示した。放射能標識メジャー！（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇを、いくつかの抗Ｈ Ｂｓ抗体（または対照血清）の１：１００希釈物中で温室し、４℃で一晩放置し た。次いで、混合物を蛋白質Ａ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）ととも に４℃で３時間温置した。徹底的な洗浄の後、蛋白質Ａ−セファロースをベレッ ト化し、計数管に移した。標識された蛋白質の沈降は、過剰量の標識されていな いそれぞれの蛋白質の添加によって低下した。 阻免聾稙倉少去囚 精製された抗ＨＢｓ抗体が、ヒト肝エンドネキシンＨに結合するメジャーＨＢｓ Ａｇの特異的エピトープと反応する抗イデイオタイプ抗体（Ａｂ２）であるか否 かを調べるために、高結合ＥＬＩＳＡディツシュに固定化したＡｂ２を用いて、 競合結合の実験を実施した。これらの実験のために、高結合ＥＬＩＳＡディツシ ュを、蛋白質Ａを５００ｎｇ、およびエンドネキシン■のカラムクロマトグラフ ィーで精製した、抗エンドネキシン■活性を保有しない抗イデイオタイプ抗体（ 図１５を参照されたい）で被覆し、次いで、ＰＢＳ／ゼラチン３％（ドイツ国Ｄ ａｒｍｓｔａｄｔ　、　Ｍｅｒｃｋ社）とともに温室して、非特異的結合部位を ブロックし、Ｐ　Ｂ　Ｓ　／Ｔｗｅｅｎ２０−０．０５％で洗浄した。次いで、 ウェルを結合混合物とともに室温で１時間温置した。温室後、ウェルをＰ　Ｂ　 Ｓ　／Ｔｗｅｅｎ２０−０．０５％で徹底的に洗浄し、結合した放射能標識ＨＢ ｓＡｇを５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中に遊離させ、計数管に移した。 図２２に示したとおり、ヒト肝エンドネキシン■は、Ｃａ”およびＭｇ２４の存 在下で、メジャーＨＢｓＡｇへの結合について抗ＨＢｓ抗体と成功裡に競合した 。したがって、抗ＨＢｓ抗体は、エンドネキシンＨの、メジャーＨＢｓＡｇと作 用する領域を模倣すると結論される。 ’７４　１１：ＨＢｓＡ　の士人　を六　エンドネキシン■　ベズ±上 エンドネキシン■の　０口 実施例３に記載の方法に従って、精製エンドネキシン■を処理した（３％ギ酸中 での１１２℃、４時間の加水分解）、ギ酸による処理の後、蛋白質消化物を、実 施例３に記載のＶｙｄａｃ　Ｃ−４カラム（２，ｌＸ２５０ｍｍ、米国カリフォ ルニア州、Ｈｅ５ｐｅｒｉａ社）による逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃを用いて分離した。ペ プチドのビークをチャートレコーダーに登録し、手動で回収した。複数回の消化 および分離を実施し、溶出パターン（図３に示したそれと比較し得る）を注意深 （比較して、同一ビークの分画を同定して、結合実験および配列決定に用いた。 エンドネキシン■ペプチド　百の　での　えメジャーＨＢｓＡ　ｒＨＢｓＡ　に ・　る　・　、＝ヒトエンド　キシＺ旦Ω積童 実施例１および５に記載の方法に従って、結合実験を実施した。 しかし、固定化メジャーＨＢｓＡｇへの放射能標識エンドネキシンＨの結合は、 消化された非標識ヒト肝エンドネキシンＨの個々のビーク分画（上記を参照され たい）の存在下で実施した。実験は三重に実施した。これらの結果に基づき、４ つのペプチド分画（ビークＦ、Ｑ、Ｑ、Ｒ，Ｓ）が、メジャーＨＢｓＡｇへの放 射能榎識エンドネキシン■の結合を他の分画より顕著に阻害することが見いださ れた（図２３Ａ）。したがって、これらのペプチドは、エンドネキシン■の重要 なメジ型−ＨＢｓＡｇ結合エピトープの一つであると考えられた。平行する実験 での同一のピーク分画の配列決定によって、ビークＦおよびＳに対応するペプチ ドをヒトエンドネキシンＨのアミノ酸第２６６〜２８０番（ビークＦ：　ＤＨＴ ＬＩＲＶＭＶＳＲ３ＥＩＤ）およびアミノ酸第９２〜１３８番（ビークＳ：ＤＡ ＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩ　ＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫＱＶ ＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ）として決定した［番号付けはＫａｐｌａｎら（１９８８ 年）による〕。また、やや低い結合阻害能を示すビークＬおよびＮを分析し、ヒ トエンドネキシンのアミノ酸第１９０〜２２５番（ＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲ３ ＶＳＨＬＲＫＶＦＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ）を包含する領域に対応する ことが判明した。 次いで、ペプチドＦの配列に基づく合成ペプチドＴＬＩＲＶＭＶＳＳＥＩＤＬＦ を用いて、ウサギを免疫した。この合成Ｆペプチドで免疫したウサギは、強い抗 ペプチド応答を生起することが判明した。正常エンドネキシン■はこれらの抗体 とは反応性でなかった。 しかし、高力価の抗ＨＢｓ抗体（Ａｂ２＝抗イディオタイプ抗体）がウサギ抗血 清中に再び見いだされ、このペプチド内のエピトープは、メジャーＨＢｓＡｇの 結合に実際に関与し得ることが示唆された。 エンドネキシン■　のＦ　Ａｂｏ　２　のエンドネキシン■を用いた抗体の親和 精製、およびそれに続く蛋白質Ａカラムクロマトグラフィーの後、ＩｇＧ標本を 、標準的プロトコル［Ｇｏｒｅｖｉｃら（１９８５年）］に従って、ペプシンで 消化した。 消化後、蛋白質Ａカラムクロマトグラフィーを用いて標本を分別した。Ｆ　（Ａ ｂ’　）２断片を含有する通過流分画を用いて、ニワトリを免疫した。 Ｆ　Ａｂｏ　２　によるニワトリの 標準的免疫化プロトコルに従って、ニワトリを免疫した。最初の注射の前に、免 疫前ＩｇＹを卵（卵黄）から単離した。卵を回収し、Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓら（１ ９８１年）に記載のとおり、ＩｇＹの単離に用いた。生成された抗体のふるい分 けを、上記のＥＬＩＳＡを用いて実施した。これらのＥＬＩＳＡの結果は、抗エ ンドネキシンＩＩＦ（Ａｂ’）２断片（イディオタイプ性）の注射後の抗ＨＢｓ 抗体（抗イデイオタイプ）の生成を明確に立証している（図２３Ｂ）。この知見 は、エンドネキシン■およびメジャーＨＢｓＡｇが独自の受容体−リガント関係 を有するという概念を更に裏付ける。 イブ　オタイブ　日の　１４ 正常なヒト肝エンドネキシンＨによって生成された抗ＨＢｓ抗体（Ａｂ２／Ｅ− ＩＩ）、合成Ｆペプチドによるそれ（Ａｂ２／Ｆ）、またはＦ　（Ａｂ’　）２ 断片によるそれ（Ａｂ２／ＦＡｂ）がメジャーＨＢｓＡｇの同一のエピトープを 認識するか否かを調べるため、競合結合の検定を実施した（図２３０）。この目 的のために、親和精製したＡｂ２／Ｅ−ＩＩ　（Ｅ−ＩＩはヒト肝エンドネキシ ン■を指す）を放射能標識し、非標識のＡｂ２／Ｅ−Ｉｌ、Ａｂ２／Ｆ、Ａｂ２ ／ＦＡｂ、対照蛋白質として無関係のＩｇＧ、またはメジャーＨＢｓＡｇの存在 または不在下で、高結合ＥＬＩＳＡディツシュに固定化したメジャーＨＢｓＡｇ に加えた０図２３Ｄに示したとおり、放射能標識Ａｂ２／Ｅ−ＩＩの結合は、非 標識メジャーＨＢｓＡｇまたは非標識Ａｂ２／Ｅ−ＩＩ、Ａｂ２／Ｆ、Ａｂ２／ ＦＡｂの添加によって、投与量依存性の様式で阻害することができるが、ウサギ ＩｇＧはメジャーＨＢｓＡｇへの放射能標識Ａｂ２／Ｅ−ＩＩの結合を阻害しな かった。したがって、ウサギを正常なヒト肝エンドネキシン■または合成Ｆペプ チドで免疫することによって、および抗Ｅ−ＩＩＦ　（Ａｂ’　＞２で免疫され たニワトリによって生成された抗ＨＢｓ抗体は、メジャーＨＢｓＡｇの同一の領 域を認識すると結論付けることができる。前の結果も、Ａｂ２／Ｅ−ＩＩは、メ ジャーＨＢｓＡｇへの結合についてヒト肝エンドネキシン■と競合することを立 証していることから、Ｆペプチドは、ヒト肝エンドネキシン■へのメジャーＨＢ ｓＡｇの結合に関与していると結論付けることができる。 弘里文献少ニス上 Ｂｉａｎｃｈｉ　Ｒ，Ｇｉａｍｂａｎｃｏ　１．Ｃｅｃｃａｒｅｌｌｉ　Ｐ、　 Ｐｕ１ａ　Ｇ、　Ｄｏｎａｔｏ　Ｒ（１９９２）Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ 　ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ　ｉｓｏｆｏｒｍｓ　（ＣａＥＰ３３　ａｎｄ　ＣａＢＰ ３７）　ａｎｄ　ａｎｎｅｘ奄氏@Ｖｌ　ｉ。 ｂｏｖｉｎｅ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｂｅｈａｖｅ　１ｉｋｅ　ｉｎｔｅｇｒａｌ　 ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ■窒刀@２９６：１ ５ｇ−１６２ Ｂｌａｌｏｃｋ　Ｊ　（１９９０）　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｏｆ　 ｐｅｐｔｉｄｅｓ　５ｐｅｃｉｆｉｅｄ　ｂｙ　’５ｅｎｓ■f　ａｎｄ ’ａｒｕｉｓｅｎｓｅ’　５ｔｒａｎｄｓ　ｏｆ　ＤＮＡ、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　８：ｌ４Ｏ−１４４Ｂｒａｄｆｏｒｄ　ＭＭ　（１９７６ ）　Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔ ｈｅ　ｑｕａｍｉｔａ狽奄盾氏@ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ　ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｕｔｉｌ ｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔ■奄氏|ｄｙｅ　ｂ ｉｎｄｉｎｇ、　ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ７２：２４ｇ−２５４ Ｂｒｕｍｍｅｌｈｕｉｓ　Ｗ、　Ｗｉｌｓｏｎ−ｄｅ　５ｔＱｒｌｅｒ　Ｌ、　 Ｒａａｐ　Ａ　（１９８１）　Ｉｎ：　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ@Ｂ　ｖａｃｃｉｎ ｅ （ｅｄｓ、　Ｍａｕｐａｓ　Ｐ　＆　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）　ｐ、　５１−５６ 　（Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　oｒｅｓｓ、　Ａｍ ｓｔｅｒｄａｍ） Ｃｏｍｅｒａ　Ｃ１Ｒｏｔｂｈｕ＋　Ｂ、　Ｃａｖａｄｏｒｅ　ＪＣ，ｅｔ　ａ ｌ、　（１９８９）　Ｆｕｒｔｉｌｅｒ　ｃｌｕｒａｃｔｅ窒奄嘯≠狽奄盾氏@ ｏｆ ｆｏｕｒ　１ｉｐｏｃｏｒｔｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒ ａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃ仁ＩＩｓ、i　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ ４０：３６１−３７０ Ｃｒｏｍｐｔｏｎ　Ｍ、Ｍｏ５ｓ　Ｓ、Ｃｒｕｍｐ＋ｏｎ　Ｍ　（１９８ｇ）　 Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅｌｉｐｏｃｏｎｉｎ／ｃａｌｐａｃ＋ｉｎ　 ｆａｍｉｌｙ、　ＣＣ１１５５：１−３Ｄａｓｈ　Ｓ、　Ｒ，ｔｏ　Ｋ、　Ｊｏ ｓｌｕ　Ｂ、　Ｎａｙａｋ　ＮＣ，Ｐａｎｄａ　ＳＫ　（１９９１）　５１ｇｎ １ｆｉｃａｎｃｅ　盾■@ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ　ａｌｂｕｍｉｎ　ａｎｄ　ｉｓ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　 ｉｎ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｉｒ＋ｆｅｃ＋ｉｏｎ　ｏ■@ｈｅｐａ＋ｏｃ ｙ＋ｅｓ、　Ｈｅｐａ＋ｏｌｏｇｙ１３：１３４−１４２ ｄｅ　ＰｒＣｖａｌ　Ｃ（１９７ｇ）Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ、Ｉｎ： 　Ｂａｃｈ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ　ＹｏｒｋB Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ：　１４４−２１９Ｄｕｃｈｏｓａｌ八、　Ｅｍ 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Ｋｌｅｂｅ　Ｒ，Ｈａｒｒｉｅｓ　Ｊ　、　Ｓｌ＋ａｒｐ　Ｚ　（１９８３）　 Ａ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｍｅ出ｏｄ　Ｆｏｒ　ｐｏｌｙｅ山ｙ撃■獅■|ｇｌｙｃ ｏｌ ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｂａ ｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｙｅａｓｔ、　Ｇｅｎｅ　２５：３R３−３４１ ＫＪｅｅ　Ｂ　（１９８８）Ｃａ２”−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｐｈｏｓｐｈｏｌ ｉｐｉｄ−ａｎｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐ窒盾狽■奄獅■ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：６６４５−６６５３゜Ｐｅｅｐｌｅｓ　ＭＥ 、　Ｋｏｍａｉ　Ｋ、　Ｒａｄｅｋ　ＲｌＢａｎｋｏｗｓｋｉ　ＭＪ　（１９８ ７）　Ａ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌ■ ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｍａｌｌ　Ｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｒ　 ｈｅｐａｔ出ｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１U０：１３５４４２ Ｌｚｅｎｄｅｒｓ　ＷＰＪ、　Ｇｌａｎｓｂｅｅｋ　ＨＬ、　Ｄｅ　Ｂｒｕｉｎ 　ＷＣＣ，Ｙａｐ　ＳＨ（１９９０）　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏ虫RＣ ｍａｊｏｒ　ａｎｄ　ｌａｒｇｅ　ＨＢｓＡｇ　ｔｏ　ｈｕｒ＋ｕｎ　ｈｅｐａ ｔｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　１ｉｖｅｒ　ｐｌａｓｍａ　ｍｅ高ｂ窒≠獅■刀F　 ｐｕｕｔｉｖｅ ｅｘ＋ｅｒｎｘｌ　ａｎｄ　１ｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｆｏｒ　 １ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｒ　■■垂≠狽奄狽奄刀 @Ｂ　ｖｉｒｕｓ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　１２：１４１−１４７Ｌｚｅｎｄｅｒｓ　Ｗ、　Ｈｅｒ ＋ｏｇｓ　Ｋ、　Ｍｏｓｈａｇｅ　Ｈ，Ｙａｐ　ＳＨ（１９９２）　Ｈｏ５ｔ　 ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｔ窒盾垂奄唐■ ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ、　Ｌｉｖｅｒ　１２：５１−５５ ゜ＭｃＡＩｅｅｒ　Ｗ、　Ｂｕｙｎａｃｋ　Ｒ，Ｍａｉｇｅｔｔｅｒ　Ｄ、　Ｗ ａｒｎｐｌｅｒ　Ｄ、　Ｍｉｌｌｅｒ　Ｗ、　Ｈｉｌｌｅｍａ氏@Ｍ （１９ＥＧ４）　Ｈｕｍａｒ＋　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｆ ｒｏｍ　ｒｅｃｏ３ｎｂｉｎａｎｔ　ｙｅａｓｔ、　Ｊ　／fｕｎ　Ｍｅｄ　Ａ ｓ５ｏｃ ２５１：２８１２−２８１５ Ｍａｅｈｉｄａ　Ａ、　Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ　Ｓ、　Ｏｈｎｕｍａ　ｅｔ　ａｌ 、　（１９８４）　Ａ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｃｏｎｔ≠奄獅奄獅■@５５ 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Ｆｉｇｕｒｅ　２１Ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　２２ 固定化ＨＢｓＡｇに結合した放射能ｊ９＠Ｅ−ＴＩ　（％）・Ｘ　■　の ０　′、′ Ｆｉｇｕｒｅ　Ｚ３Ｃ ・ 八ｄ○ Ｆｉｇｕｒｅ　２３Ｄ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号庁内整理１ｔ−ＭＡ６１Ｋ　３９１００ 　Ｈ９２８４−４Ｃ３９／３９５　Ｄ　９２８４−４Ｃ Ｎ　９２８４−４Ｃ ＣＯ７Ｋ　１４／４７　８３１８−４Ｈ１６／１８　８３１８−４Ｈ ＧＯＩＮ　３３１５７６　Ｂ　７０５５−２Ｊ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０９ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４８（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：８６５） Ｉ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトエンドネキシンＩＩとメジャーＨＢｓＡｇとの間の結合を生体外（イン ・ビトロ）で判定する方法において、−ラージおよび／もしくばメジャーＨＢｓ Ａｇの受容体であるという特性を有するポリペプチドであって、・ヒトエンドネ キシンＩＩ、 または、 ・ラージおよび／もしくはメジャーＨＢｓＡｇに容易に結合するようなヒトエン ドネキシンＩＩ由来ムテイン、または、 ・ヒトエンドネキシンＩＩの断片（ここで、この断片は、＊ラージおよび／もし くはメジャーＨＢｓＡｇに容易に結合するようなもの、 または、 ＊ヒトエンドネキシンＩＩに対して産生された抗体に容易に認識され、そしてＨ ＢＶ感染を無効化（中和）することができるようなもの、 または、 ＊上記ヒトエンドネキシンＩＩを、またはラージおよび／もしくはメジャーＨＢ ｓＡｇを、または上記に定義のポリペプチドに対応し、ラージおよび／もしくは メジャーＨＢｓＡｇの受容体であるという特性を失わないような局所的な変異部 分を含む変種ポリペプチドを、容易に認識する抗体を容易に生成するようなもの である）、特に： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ、 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫＱ ＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶＦ ＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ、 なるエンドネキシンＩＩのペプチド類 を含むか、またはそれによって構成されるポリペプチド、あるいは −上記に定義のヒトエンドネキシンＩＩ、そのムテインもしくはその断片に関す る受容体リガンドまたはアンチセンスペプチド、あるいは −エンドネキシンＩＩ、上記に定義のムテインまたは上記に定義の断片に対する ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、あるいは −上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対するポリクロー ナルもしくはモノクローナル抗体、あるいは−ヒトエンドネキシンＩＩ、上記に 定義のムテインもしくは上記に定義の断片に対して産生された抗イディオタイプ 抗体、またはヒトエンドネキシンＩＩ、上記に定義のムテインもしくは上記に定 義の断片に対して産生された抗抗イディオタイプ抗体、あるいは−上記に定義の 受容体リガンドもしくはアンチセンスペプチドに対して産生された抗イディオタ イプ抗体、または上記に定義の受容体リガンドもしくはアンチセンスペプチドに 対して産生された抗抗イディオタイプ抗体、あるいは −上記に定義のＨＢｓＡｇの受容体であるという特性を有するポリペプチドの少 なくとも一つをコードするか、または上記に定義のムテインもしくは断片の少な くとも一つをコードする遺伝子もしくは遺伝子断片でトランスフェクションされ た細胞に対して活性である物質 の使用を含む方法。
2. ２．下記： −ラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇの受容体であるという特性を有する ポリペプチドであって、・体重１ｋｇあたり０．６〜５０ｍｇ、好ましくは１〜 ３０ｍｇ、より好ましくは１０〜１５ｍｇの量で存在するヒトエンドネキシンＩ Ｉ、または、 ・ラージおよび／またはメジャーＨＢｓＡｇに容易に結合するような、ヒトエン ドネキシンＩＩ由来ムテイン、または、 ・ヒトエンドネキシンＩＩの断片（ここで、この断片は、＊ラージおよび／また はメジャーＨＢｓＡｇに容易に結合するようなもの、 または ＊エンドネキシンＩＩに対して産生された抗体に容易に認識され、ＨＢＶ感染を 無効化（中和）することができるようなもの、または ＊上記ヒトエンドネキシンＩＩを、またはラージおよび／もしくはメジャーＨＢ ｓＡｇを、または上記に定義のポリペプチドに対応し、ラージおよび／もしくは メジャーＨＢｓＡｇの受容体であるという特性を失わないような局所的な変異部 分を含む変種ポリペプチドを、容易に認識する抗体を生成するようなものである ）、特に：ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ、 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫＱ ＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶＦ ＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ、 なるエンドネキシンＩＩのペプチド類を含むか、またはそれによって構成される ポリペプチド、あるいは −上記に定義のエンドネキシンＩＩ、そのムテインまたはその断片に関する受容 体リガンドもしくはアンチセンスペプチド、あるいは −エンドネキシンＩＩ、またはそのムテイン、またはその断片に対して産生され た、好ましくは体重１ｋｇあたり１０μｇ〜１ｍｇの量のヒトモノクローナル抗 体またはマウスモノクローナル抗体の人体適応バージョン、あるいは −上記に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対するポリクロー ナルもしくはモノクローナル抗体、好ましくはヒトモノクローナル抗体、あるい は −ヒトエンドネキシンＩＩもしくは上記に定義のムテインもしくは上記に定義の 断片に対して産生された抗イディオタイプ抗体、またはヒトエンドネキシンＩＩ もしくは上記に定義のムテインもしくは上記に定義の断片に対して産生された抗 抗イディオタイプ抗体、あるいは −上記に定義の受容体リガンドもしくはアンチセンスペプチドに対して産生され た抗イディオタイプ抗体、または上記に定義の受容体リガンドもしくはアンチセ ンスペプチドに対して産生された抗抗イディオタイプ抗体、あるいは −ラージおよび／もしくはメジャーＨＢｓＡｇの受容体であるという特性を有す るポリペプチドの少なくとも一つをコードするか、または上記に定義のムテイン もしくは断片の少なくとも一つをコードする遺伝子もしくは遺伝子断片でトラン スフェクションされた細胞に対して活性である物質 の少なくとも一つを、活性物質として含有する製剤組成物。
3. ３．活性物質として、体重１ｋｇあたり０．６〜５０ｍｇ、好ましくは１〜３０ ｍｇ、より好ましくは１０〜１５ｍｇの量で存在するヒトエンドネキシンＩＩ、 または該ヒトエンドネキシンＩＩ由来ムテイン、または請求項１に定義のヒトエ ンドネキシンＩＩの断片、特に、エンドネキシンＩＩペプチド類： ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ、 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫＱ ＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶＦ ＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ、 を含むか、またはそれによって構成されるポリペプチドを含有する、請求項２記 載の製剤組成物。
4. ４．活性物質として、請求項１に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプ チドを含有する請求項２記載の製剤組成物。
5. ５．活性物質として、 −ヒトエンドネキシンＩＩ、そのムテインまたは請求項１に定義の断片、特にエ ンドネキシンＩＩペプチド類：ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ、 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫＱ ＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶＦ ＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ、 に対して産生された抗イディオタイプ抗体、あるいは−ヒトエンドネキシンＩＩ 、そのムテインまたは請求項１に定義の断片、特にエンドネキシンＩＩペプチド 類：ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ、 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫＱ ＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶＦ ＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ、 に対して産生された抗抗イディオタイプ抗体を含有する請求項２記載の製剤組成 物。
6. ６．活性物質として、 −請求項１に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生さ れたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、好ましくはヒトモノクローナ ル抗体、あるいは−請求項１に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチ ドに対して産生された抗イディオタイプ抗体、あるいは−請求項１に定義の受容 体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生された抗抗イディオタイプ 抗体を含有する請求項２記載の製剤組成物。
7. ７．活性物質が、体重１ｋｇあたり０．６〜５０ｍｇ、好ましくは１〜３０ｍｇ 、より好ましくは１０〜１５ｍｇの量で存在する請求項２〜６のいずれか一項に 記載の製剤組成物。
8. ８．活性物質として、 ＊請求項１に定義の受容体リガンドもしくはアンチセンスペプチド、または ＊請求項１に定義の受容体リガンドもしくはアンチセンスペプチドに対して出現 させた抗イディオタイプ抗体、または＊請求項１に定義のエンドネキシンのムテ インもしくは断片を含有するワクチン組成物。
9. ９．請求項１に定義のポリペプチドのいずれか一つに関して受容体リガンドとし ての挙動を示す分子の能力を検出し、新規抗肝炎薬のスクリーニング法を開発す るための方法であって、−該分子と、 上記ポリペプチドもしくはペプチドのいずれか一つをコードするインサート（挿 入断片）によってそれ自体修飾されたペクターによって予め形質転換され、必要 ならば接触後に該インサートの発現の後、このポリペプチドに特異的である１ま たはそれ以上の部位をその表面に有する細胞性宿主とを接触させることであって 、該分子が該ポリペプチドに対する親和性を示すならば、上記特異的部位の少な くとも一つと該分子との間の結合の形成を可能にする条件下で実施すること、 −形成された可能性のあるリガンド−ポリペプチドタイプの複合体を検出するこ と を特徴とする方法。
10. １０．１個または数個の受容体リガンドに対する請求項１または２に定義のポリ ペプチドの親和性を検出する方法であって、−適切な宿主細胞を、宿主細胞のポ リメラーゼに認識され、かつ該宿主細胞における該ヌクレオチド配列の発現を可 能にする調節要素、特にプロモーターの制御下に、上記のポリペプチドまたはペ プチドのいずれか一つをコードするヌクレオチド配列を、予め挿入しておいた、 ベクター、特にプラスミドまたはファージを用いて形質転換させること、 −形質転換した宿主細胞を、該インサートの発現、および発現された該ポリペプ チドまたはペプチド配列の膜に向かう輸送を可能にする結果、リガンドとの相互 作用に必要とされる配列を形質転換した宿主細胞の表面に露出させる条件下で培 養すること、−この宿主細胞を所定のリガンドと接触させること、−該形質転換 した宿主細胞と該所定のリガンドとの間の親和反応を検出すること を特徴とする方法。
11. １１．ＨＢＶまたはラージおよび／もしくはメジャーＨＢｓＡｇを生体外で検出 する方法であって、 −ＨＢＶを含有すると思われる生体試料と、一定量の（ｉ）ヒトエンドネキシン ＩＩ、そのムテイン、または上記に定義されたその断片、特に、エンドネキシン ペプチド：ＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤ、 ＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫＱ ＶＹＥＥＥＹＧＳＳＬＥ、およびＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶＦ ＤＫＹＭＴＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩ、 並びに一定量の（ｉｉ）ＨＢｓＡｇの競合物質として作用する上記に定義された 受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドとを、（ｉ）ヒトエンドネキシンＩ Ｉまたは上記に定義された機能往相当物と（ｉｉ）受容体リガンドまたはアンチ センスペプチドとの間の、並びにヒトエンドネキシンＩＩとラージおよび／もし くはメジャーＨＢｓＡｇとの間の複合体の形成を可能にする条件下で、かつ成分 （ｉ）または（ｉｉ）のいずれかに検出可能な標識を担持させ、いずれか一方の 成分は固定されていてもよい状態で接触させること、−（ｉ）ヒトエンドネキシ ンＩＩもしくはその機能性相当物と（ｉｉ）受容体リガンドもしくはアンチセン スペプチドとの間でおそらくは形成された複合体、および（ｉ）ヒトエンドネキ シンＩＩもしくはその機能性相当物と（ｉｉ）ラージおよび／もしくはメジャー ＨＢｓＡｇとの間に形成された複合体の量を検出すること、−該試料中に存在す るＨＢＶの量を、ＨＢＶを含まないことが既知である対照試料についての複合体 形成の低下として推計すること を含む方法。
12. １２．血漿または血清から採取した生体試料中の肝細胞の損傷を生体外で測定す る方法であって、 −損傷した肝細胞からのヒトエンドネキシンＩＩを含有すると思われる生体試料 を、 ・請求項１に定義されたような受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドで被 覆したプレート、あるいは・ヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のヒ トエンドネキシンＩＩのムテインまたは請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩ Ｉ由来断片に対するポリクローナルおよび／もしくはモノクローナル抗体、好ま しくはヒトのモノクローナル抗体類、もしくはマウスモノクローナル抗体類の人 体適応バージョンで被覆したプレート、あるいは ・ヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩのム テインまたは請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩ由来断片に対して産生さ れた抗抗イディオタイプ抗体で被覆したプレート、あるいは ・請求項１に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生さ れた抗イディオタイプ抗体で被覆したプレートのいずれかと接触させること、 −ヒトエンドネキシンＩＩと受容体リガンドもしくはアンチセンスペプチドとの 間、またはヒトエンドネキシンＩＩとモノクローナルもしくはポリクローナル抗 体との間、またはヒトエンドネキシンＩＩと上記に定義の抗抗イディオタイプ抗 体との間、またはヒトエンドネキシンＩＩと上記に定義の抗イディオタイプ抗体 との間のいずれかに形成された複合体を検出すること を含む方法。
13. １３．ＨＢＶの生体外判定のための診断キットにおいて、−生産物をその上に沈 積させるための少なくとも１枚のマイクロプレートであって、該生産物が、 ＊ヒトエンドネキシンＩＩ、または請求項１に定義されたようなそのムテイン、 または請求項１に定義されたようなヒトエンドネキシンＩＩ由来断片、 あるいは、 ＊請求項１に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対するポリク ローナルもしくはモノクローナル抗体、好ましくはヒトモノクローナル抗体、 あるいは、 ＊ヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義されたようなそのムテインまた は請求項１に定義されたようなヒトエンドネキシンＩＩ由来断片に対して産生さ れた抗イディオタイプ抗体、あるいは＊請求項１に定義の受容体リガンドまたは アンチセンスペプチドに対して産生された抗抗イディオタイプ抗体を含むマイク ロプレート、 −診断しようとする、そしてＨＢｓＡｇを含有すると思われる試料を、ＨＢｓＡ ｇに対する競合物質、例えば：＊請求項１に定義の受容体リガンドまたはアンチ センスペプチド、あるいは ＊ヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のそのムテインまたは請求項１ に定義のヒトエンドネキシンＩＩ由来断片に対するモノクローナルもしくはポリ クローナル抗体、好ましくはヒトのモノクローナル抗体類、もしくはマウスのモ ノクローナル抗体類の人体適応バージョン、あるいは ＊ヒトエンドネキシンＩＩに対して産生された抗抗イディオタイプ抗体、あるい は ＊請求項１に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生さ れた抗イディオタイプ抗体とともに含有する標本 −ＨＢｓＡｇと、該プレートに沈積した生産物との反応を実施するための適切な 緩衝液 −ＨＢｓＡｇと、該プレートに沈積した生産物との間に形成された複合体を測定 するための適切なマーカーを含むキット。
14. １４．ヒトエンドネキシンＩＩの生体外測定のための診断キットであって、 −生産物をその上に沈積させるための少なくとも１枚のマイクロプレートであっ て、該生産物が、 ＊請求項１に定義されたような受容体リガンドまたはアンチセンスペプチド、あ るいは ＊ヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩのム テインまたは請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩ由来断片に対するモノク ローナルもしくはモノクローナル抗体、好ましくはヒトのモノクローナル抗体類 、もしくはマウスのモノクローナル抗体類の人体適応バージョン、あるいは＊ヒ トエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩのムテイ ンまたは請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩ由来断片に対して産生された 抗抗イディオタイプ抗体、あるいは＊請求項１に定義の受容体リガンドまたはア ンチセンスペプチドに対して産生された抗イディオタイプ抗体を含むマイクロプ レート、 −診断しようとする試料を、 おそらくは、探索されるヒトエンドネキシンＩＩの競合物質、例えば： ＊請求項１に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生さ れたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、好ましくはヒトのモノクロー ナル抗体、あるいは＊ヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のヒトエン ドネキシンＩＩのムテインまたは請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩ由来 断片に対して産生された抗イディオタイプ抗体、あるいは＊請求項１に定義の受 容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対して産生された抗抗イディオタイ プ抗体とともに含有する標本、 −ヒトエンドネキシンＩＩとプレートに沈積した生産物との免疫学的反応を実施 するための適切な緩衝液、−ヒトエンドネキシンＩＩとプレートに沈積した生産 物との複合体の形成を検出するための適切なマーカーを含むキット。
15. １５．Ｂ型肝炎の治療に役立つ薬物の製造を目的としての、・請求項１に定義の ポリペプチド、あるいは・請求項１に定義の受容体リガンドまたはアンチセンス ペプチド、あるいは ・請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のそのムテイ ンまたは請求項１に定義のその断片に対して産生されたポリクローナルもしくは モノクローナル抗体、好ましくはマウスのモノクローナル抗体の人体適応バージ ョンもしくはヒトモノクローナル抗体、あるいは ・請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のそのムテイ ンまたは請求項１に定義のその断片に対する抗イディオタイプ抗体、あるいは ・請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のそのムテイ ンまたは請求項１に定義のその断片に対する抗抗イディオタイプ抗体、あるいは ・請求項１に定義のアンチセンスペプチドに対して産生された抗イディオタイプ 抗体、あるいは ・請求項１に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対する抗抗イ ディオタイプ抗体、あるいは・請求項１に定義の物質 の使用。
16. １６．Ｂ型肝炎の感染症に対するワクチンの製造を目的としての、 ・請求項１に定義のポリペプチド、あるいは・請求項１に定義の受容体リガンド またはアンチセンスペプチド、あるいは ・請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のそのムテイ ンまたは請求項１に定義のその断片に対するポリクローナルもしくはモノクロー ナル抗体、好ましくは、マウスのモノクローナル抗体の人体適応バージョンもし くはヒトのモノクローナル抗体、あるいは ・請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のそのムテイ ンまたは請求項１に定義のその断片に対する抗イディオタイプ抗体、あるいは ・請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のそのムテイ ンまたは請求項１に定義のその断片に対する抗抗イディオタイプ抗体、あるいは ・請求項１に定義のアンチセンスペプチドに対して産生された抗イディオタイプ 抗体、あるいは ・請求項１に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対する抗抗イ ディオタイプ抗体、あるいは・請求項１に定義の物質 の使用。
17. １７．Ｂ型肝炎ウイルスの感染の診断手段の製造を目的としての、 ・請求項１に定義のポリペプチド、あるいは・請求項１に定義の受容体リガンド またはアンチセンスペプチド、あるいは ・請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のそのムテイ ンまたは請求項１に定義のその断片に対するポリクローナルもしくはモノクロー ナル抗体、好ましくは、マウスのモノクローナル抗体の人体適応バージョンもし くはヒトのモノクローナル抗体、あるいは ・請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のそのムテイ ンまたは請求項１に定義のその断片に対する抗イディオタイプ抗体、あるいは ・請求項１に定義のヒトエンドネキシンＩＩまたは請求項１に定義のそのムテイ ンまたは請求項１に定義のその断片に対する抗抗イディオタイプ抗体、あるいは ・請求項１に定義のアンチセンスペプチドに対して産生された抗イディオタイプ 抗体、あるいは ・請求項１に定義の受容体リガンドまたはアンチセンスペプチドに対する抗抗イ ディオタイプ抗体、あるいは・請求項１に定義の物質 の使用。
18. １８．エンドネキシンＩＩ、請求項１に定義のそのムテインもしくは断片と、Ｈ ＢＶとの結合および／またはその発現を調節し得る試験中の潜在薬のためのモデ ルとしてのヒトではない哺乳類のトランスジェニック動物であって、 そのようなトランスジェニック動物に組み込まれたヒトエンドネキシンＩＩ遺伝 子、またはそのムテインもしくは断片をコードするヌクレオチド配列の構成的ま たは誘導可能な発現が原因で、容易にＨＢＶで感染され、かつ容易に肝細胞損傷 を患うトランスジェニック動物。