DK173089B1

DK173089B1 - Selektivt reaktivt antistof eller funktionelt fragment deraf , konjugat omfattende antistoffet eller dets funktioneller fra

Info

Publication number: DK173089B1
Application number: DK199001499A
Authority: DK
Inventors: Peter Mezes; Brian Gourlie; Mark Rixon
Original assignee: Dow Chemical Co
Priority date: 1988-10-19
Filing date: 1990-06-19
Publication date: 2000-01-10
Also published as: KR900701302A; FI103181B; JPH03502889A; ZA897858B; DE68918217D1; EP0365997B1; HUT56878A; BR8907126A; FI903056A0; CA2000913A1; EP0397821A4; IL92037A0; HU896255D0; AU4429989A; IE64966B1; ATE111519T1; CA2000913C; HU218093B; WO1990004410A1; NO301075B1

Description

DK 173089 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte, selektivt reaktive antistoffer eller funktionelle fragmenter deraf, konjugater omfattende sådanne antistoffer eller funktionelle fragmenter deraf, DNA-sekvenser, som koder for i det mindste selektivt reaktive antistofdele, ekspressionsvehikler indeholdende sådanne DNA-sekvenser, en fremgangs-5 måde til fremstilling af ekspressionsvehikler og celler transformeret med disse vehikler, midler omfattende de selektivt reaktive antistoffer eller funktionelle fragmenter deraf samt en fremgangsmåde til fremstilling af transformerede værter.

Antistoffer er specifikke immunoglobulinpolypeptider (Ig-poly-10 peptider), som fremstilles af hvirveldyrs immunsystem, som reaktion på udfordringer af fremmede proteiner, glycoprotei-ner, celler eller andre antigene fremmede stoffer. Den sekvens af begivenheder, som muliggmr, at organismen kan overkomme invasion af fremmede celler eller få renset systemet for fremmede celler, er 1 det mindste delvis forstået. En vigtig del af ^ denne fremgangsmåde er fremstillingen af antistoffer, som specifikt binder til et bestemt fremmed stof. Bindingsspecificiteten af sådanne polypeptider til et bestemt antigen er neget forfinet og den rekke af specificiteter, som det Individuelle hvirveldyr er 1 stand til at danne, er bemmrkelsesverdigt med hensyn til dets kompleksitet og variationsevne. Millioner af antigener er 1 stand til at fremkalde antistofreaktioner, hvor 20 hvert antistof nasten udelukkende er rettet mod det bestemte antigen, som fremkaldte det«

To hovedkilder for hvirveldyrs antistoffer benyttes for tiden 25 - dannelse in situ af memmale B-lymfocytter og dannelse 1 cellekultur af B-cellehybrider. Antistoffer dannes In situ som 2 DK 173089 B1 et resultat af differentieringen af ikke fuldt udviklede B-lymfocytter i plasmaceller, som forekommer som reaktion på som stimulering med specifikke antigener. I de ikke-differentiere-de B-celler er delene af DNA, som koder for de forskellige regioner på immunoglobul inkaderne, adskilt i det genome DNA.

5 Sekvenserne samles sekventielt før ekspression. Et resume af denne proces er blevet givet af Gough, Trends in Biochem. Sci.

6, 203 (1981).

Det opnåede omlejrede gen er 1 stand til ekspression i den 10 fuldt udviklede B-lymfocyt til fremstilling af det ønskede antistof. Selv når et bestemt pattedyr udsattes for et enkelt antigen, opnås der imidlertid ikke en ensartet antistofpopulation. In situ-1mmunreaktionen over for ethvert scrligt antigen defineres af den mosaik af reaktioner over for forskellige determinanter, som er til stede på antigenet. Hver undergruppe 15 af homologe antistoffer bidrages af en enkelt population af B-celler - således er in situ-dannelse af antistoffer "poly-klon".

Denne begrensede, men iboende heterogenitet, er blevet over-20 vundet i adskillige bestemte tilfalde ved brug af hybridoma-teknologi til dannelse af "monoklone" antistoffer i cellekultur af B-cellehybridomaer ("se Kohier og Hilstein, C., Nature 256, 495-497 (1975)].

Ved denne proces sammensluttes de relativt kortlivede eller 25 dødelige splenocyter eller lymfocyter fra et pattedyr, som er 3 DK 173089 B1 blevet Injiceret med antigen, med en udødelig tumorcellelinie, hvorved der siledes fremstilles hybridceller eller "hybrido-maer", som er både udødelige og 1 stand til at fremstille El-cellens genetisk kodede antistof. De således dannede hybrider segregeres 1 enkelte genetiske stammer ved udvelgelse, fortyn-5 ding og vekst Igen, og hver stamme representerer således en enkelt genetisk linie. De producerer derfor antistoffer, som der er sikkerhed for er homogene over for et ønsket antigen.

Disse antistoffer kaldes "monoklone", idet der henvises til deres rene genetiske herkomst.

10

Monoklone antistoffer med monospecificitet har 1 høj grad haft indflydelse på immunologi, og deres anvendelighed er allerede blevet vist Inden for sådanne videnskaber som biologi, farmakologi, kemi og andre. Sådanne monoklone antistoffer har fundet udbredt anvendelse ikke blot som diagnostiske reagenser 15 [se f.eks. Immunology for the 80's, udgiver Voller, A., Bartlett, A., og Bidwell, D., HTP Press, Lancaster, (1981), men også terapi (se f.eks. Ritz, J. og Schlossman, S.F., Blood 59, 1-11, (1902)].

20 Monoklone antistoffer, som er fremstillet af hybridomaer, har en vigtig ulempe, selvom de teoretisk er effektive som beskrevet ovenfor, og klart er at foretrmkke sammenlignet med poly-klone antistoffer på grund af deres specificitet. Til mange anvendelser er brugen af monoklone antistoffer, som er fremstillet i ikke-humane dyr, alvorlig begrmnset, når der er tale 25 o«, at monoklone antistoffor skal anvendes 1 mennesker. Gen- 4 DK 173089 B1 tagne Injektioner af et "fremmed" antistof 1 mennesker, såsom et museantistof, kan føre til skadelige hypersensitivitets-reaktioner. Et sådant monoklont antistof, som hidrører fra en ikke-human kilde, forårsager, når det Indgives t11 mennesker, ^ en anti stof reakt ion mod ikke-humant antistof (ANHA). Se f.eks. Shawler et al., Journal of Immunology 135, 1530-1535 (1985) for en diskussion om en specifik ANHA-reaktion forårsaget af anvendelse af murint afledte antistoffer, human ant1-muse-anti stofreakt Ion (MAMA-reakt i on).

10 Det menes, at dyreimmunoglobuliner med humane konstante regioner vil give en mindre ANHA-reakti on, når Indgivet til mennesker , end dyre1mmunog1 obu 1 i ner med ikke-humane konstante regioner. Som sådanne menes monoklone antistoffer med gode bln-dingsaf f ini teter for udvalgte antigener og med humane konstante regioner at have stor potentiel anvendelighed til immunolo-15 gisk diagnose og behandling af menneskepatienter med cancer.

Der er indtil nu blevet gjort forskellige forsøg på at fremstille human-afledte monoklone antistoffer ved anvendelse af humane hybridomaer. F.eks. er der blevet fremstillet humane/ humane hybridomaer [Olsson, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sc1.

^ (USA), 77, 5429 (1980)]; humane/murine hybridomaer [(Schlom, J., et al. (ibid) 77, 6841 ( 1980)] og flere andre xenogene hybridkombinationer. Humane monoklone antistoffer er også blevet fremstillet ved transformation af lymfocytter under anvendelse af Epstein-Barr-virus. Sådanne hybridomaer kan imidlertid potentielt indeholde patogene humane viruser. Alternativt 25 5 DK 173089 B1 er primåre antistofproducerende B-celler blevet udødel iggjort In vitro ved transformation med vlralt DNA. Uheldigvis er udbytter af monoklone antistoffer fra humane hybridomacelleli-n1er relativt lave (1 μ0/*1 1 humane hybridomaer sammenlignet med 100 pg/*l 1 musehybridomaer), og produktionsomkostninger ^ er høje.

Selvom humane Immunoglobuliner i høj grad er ønskede ved Immunologisk diagnose og behandling af menneskecancerpatienter, har humane hybrldomateknikker endnu ikke nået et stadie, hvor der let kan opnås humane monoklone antistoffer med ønskede ^ antigene specificiteter. Endvidere kan forskere af indlysende etiske grunde ikke Immunisere humane Individer med udvalgte toksiske eller på anden måde skadelige antigener for at danne antistoffer mod det specifikke antigen. Dette lmgger store restriktloner på Immunologisk diagnose og behandling af menneskepatienter .

15

Fremstillingen af human-afledte monoklone antistoffer er bestemt mulig, men er stadig Ikke effektiv på baggrund af dens lave reproducerbarhed og de andre ovenfor beskrevne problemer [se endvidere Nature 300, 310-318 (1982)]. Som en konsekvens 20 heraf hidrører de fleste monoklone antistoffer fra ikke-humane dyr.

Et monoklont antistof, som reagerer med høj bindingsaffinitet over for humane tumorantigener, men som ikke genkendes som et 6 DK 173089 B1 fremmed stof af mennesker, er 1 høj grad ønskeligt. En fremgangsmåde til overvindelse af denne vanskelighed, er kunstigt at danne et antistof, som meget ligner et humant antistof og ikke genkendes som et fremmed stof inden 1 menneskelegemet, dvs. et kimært eller "menneskeliggjort" antistof.

5

Typisk for kimere antistoffer efterligner den variable region i både lette og tunge keder de variable regioner i antistoffer hidrørende fra en pattedyrsart, mens de konstante dele er homologe med sekvenserne i antistoffer hidrørende fra mennesker.

En klar fordel ved sådanne kimere former er, at de variable 10 regioner f.eks. hensigtsmæssigt kan hidrøre fra for tiden kendte kilder under anvendelse af let tilgængelige hybridomaer af B-celler fra ikke-humane værtsorganismer i kombination med konstante regioner hidrørende fra f.eks. humane cellepræpara ter. Mens specificiteten af den variable region ikke påvirkes af dens kilde er det mindre sandsynligt, at den konstante 15 region værende human ville fremkalde en Immunreaktion fra et humant individ, når antistofferne injiceres, end den konstante region fra en ikke-human kilde.

20 Et kendt humant tumorantigen er tumorassocieret glycoprotein (TAG72). TAQ72 er associeret med overfladen af visse tumor-celler af human oprindelse, specifik LS174T-tumorcellelinien. LS174T [American Type Culture Collection (heri ATCC) nr. CL 188] er en variant af LS180-tarmadenocarcinoml inie (ATCC nr, CL 187).

25 7 DK 173089 B1

Karyotypen af LS174T Hgner den hos LS180, Idet der mangler et X-kromosom 1 en større del af cellerne. Oer er blevet pre-senteret data, som beskrevet i Johnson V.G. et al.. Cancer 5 Res. 46, 850-657 (1986), til karakterisering af TAG72-moleky-let som et mucin. Denne konklusion er baseret på de følgende iagttagelser: (a) TAG72 har en høj molekylvægt (>1 x 10®), som vist ved dens udelukkelse fra en Sepharose· CL-4B-søjle; (b) massefylden af TAG72 bestemt ved 1igevegtscentrifugering i CsCl var 1,45 g/ml, hvilket indikerer et kraftigt glycosyleret 10 glycoprotein; (c) TAG72 har en endring i vandring efter neura-mlnidasefordøjelse, hvilket indikerer, at det er et kraftigt sialyleret molekyle med en righed af O-glycosidikalt koblede oligosaccharider, son er karakteristiske for muciner; (d) blodgruppeantigener, som almindeligvis findes på muciner, findes på affi nitets-oprenset TAG72; og (e) Chondroitinase ABC-fordøjelse havde ingen virkning på TAG72, hvilket viser, at TAG72-epitopet ikke udtrykkes på en chondroitinsulfatproteo-glycan.

Der er blevet udviklet adskillige murine monoklone antistof-20 fer, som har bindingsspecificitet for TAG72. Et af disse monoklone antistoffer betegnet B72.3, er ét murint IgGl, der er fremstillet af hybrldoma B72.3 (ATCC nr. HB-8108). B72.3 er et monoklont første generationsantistof, som er udviklet under anvendelse af et humant brystcarcinomekstrakt som immunogenet (se Colcher, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 25 3199-3203 (1981); og US patentskrifterne nr. 4.522.918 og nr.

4.612.282). Som anvendt heri menes der med betegnelsen "monoklont førstegenerationsantistof" et monoklont antistof, som er 8 DK 173089 B1 fremstillet under anvendelse af som immunogenet, et råcelleekstrakt .

Andre monoklone antistoffer rettet mod TA672 betegnes "CC" (coloncancer). Monoklone CC-anti stoffer er en familie af murine monoklone andengenerationsantistoffer. Som anvendt heri menes der med udtrykket "monoklont andengenerationsantistof" et monoklont antistof, som er fremstillet under anvendelse af som immunogenet, et antigen, der er oprenset med et monoklont førstegenerationsantistof. Monoklone CC-anti stoffer blev fremstillet under anvendelse af TAG72 oprenset med B72.3. En diskussion af metoden til fremstilling af CC-antistofferne er 10 anført i US patentansøgning 7-073.685 (USPA 7-073.685), idet ansøgningen blev indleveret af Schlom et al. 15. juli 1987 og er tilgengelig for offentligheden fra the National Technical Information Service. På grund af deres relativt gode bindingsaffiniteter for TAG72 er de følgende CC-antistoffer blevet deponeret hos ATCC, idet der er blevet anmodet om begrenset 15 adgang: CC49 (ATCC nr. HB 9459); CC83 (ATCC nr. HB 9453); CC46 (ATCC nr. HB 9458); CC92 (ATCC nr. 9454); CC30 (ATCC nr. HB 9457); CC11 (ATCC nr. 9455); og CC15 (ATCC nr. HB 9460).

20

Inden for den kendte tekniK er der ikke blevet Isoleret noget humant antistof, som binder relativt stark,t til TAG72. Passende antistoffer må derfor blive udformet.

Oet er kendt, at funktionen af et Ig-molekyle er afhengig af 25 dets tredimensionelle struktur, hvilket på sin side er afhengig af dets primmre ami nosyresekvens. Således kan endring af am inosyresekvensen i et Ig påvirke dets aktivitet i ugunstig 9 DK 173089 B1 retning. Endvidere kan en »ndring 1 DNA-sekvensert, som"~koder for Ig'et påvirke evnen hos cellen indeholdende ONA-sekvensen til at udtrykke, secernere eller samle Ig.

5 I USPA 7-073.685 beskrives, at CC-anti stof ferne kan »ndres i deres kimsre form ved at erstatte f.eks. konstante museregioner med humane konstant region-(Fc)-områder ved DNA-rekombi-neringsteknikker, som er kendt Inden for området. Oet menes, at de forslag, der er anført i USPA 7-073.685 ikke førte til et faktisk forsøg på at udtrykke nogle som helst kimere Ig-po-10 lypeptidkmder, heller Ikke til at fremstille Ig-aktivitet og heller ikke til at secernere og samle Ig-keder til de ønskede kimmre Ig’er.

Oet er derfor overhovedet ikke klart ud fra den kendte teknik at kendte ONA-rekombineringsteknikker rutinemmssigt vil frem-15 bringe et kimert dyre-humant antistof udfra udvalgte DNA-kil-der, som frembringer funktionelle kimere antistoffer, der binder specifikt til udvalgte humane carcinomaer, og som reducerer fremkomsten af ANHA-bivirkninger, når indgivet til mennesker.

20 Ifølge den foreliggende opfindelse er der nu overraskende tilvejebragt et hidtil ukendt antistof af den i krav 1 angivne art eller et fragment deraf, der er i stand til selektivt at reagere med et særligt antigen eller en særlig antigenfamilie.

Ifølge opfindelsen er der også tilvejebragt hidtil ukendte antistof- eller antistoffragment-konjugater af den i krav 2 omhandlede art til diagnostiske formål samt af den i krav 4 25 angivne art til terapeutiske formål. Ligeledes ifølge opfindelsen anvises en fremgangsmåde af den i krav 15 angivne art til fremstilling af sådanne konjugater.

DK 173089 B1 ΙΟ

Den foreliggende opfindelse angår endvidere DNA-sekvenser af den i krav 8 angivne art, hvilke sekvenser i det mindste koder for en selektivt reaktiv del af et antistof ifølge opfindelsen, og biologisk funktionelle ekspressionsvehikler ifølge krav 10 indeholdende sådanne DNA-sekvenser og anviser også en fremgangsmåde af den i krav 16 angivne art 5 til fremstilling af rekombinante ekspressionsvehikler.

Ydermere angår opfindelsen celler ifølge krav 11 som vært transformeret med det omhandlede biologisk funktionelle ekspressionsvehikel samt anviser en fremgangsmåde som angivet i krav 17 til fremstilling af en transformeret vært.

Endelig angår opfindelsen et middel af den i krav 13 angivne art omfattende et antistof 10 eller antistoffragment ifølge opfindelsen eller et middel af den i krav 14 angivne art omfattende et antistof- eller antistoffragmentkonjugat ifølge opfindelsen.

Fig. 1 illustrerer en grundleggende immunoglobulinstruktur, idet de enzymatiske kløvningssteder er vist.

Fig. 2 illustrerer nukleotidsekvenserne af VHaTAG Vh» CC46 V«.

15 CC49 VH, CC83 VH og CC92 VH.

Fig. 3 illustrerer aminosyresekvenserne af VHaTAG Vh# CC46 VH» CC49 VH, CC83 VH og CC92 VH.

Fig. 4a illustrerer nukleotidsekvensen, og fig. 4b illustrerer den tilsvarende aminosyresekvens af CC49 Vl· 20 Fig. 5a illustrerer nukleotidsekvensen, og fig. 5a illustrerer den tilsvarende aminosyresekvens af CC83 Vj_.

11 DK 173089 B1

Fig. 6a illustrerer nukleotidsekvensen, og fig. 6b illustrerer den tilsvarende aminosyresekvens af CC92 V(..

Fig. 7 illustrerer nukleotidsekvensen af HindIII-PstI-fragmen-5 tet isoleret fra plasnidet pQOl.

Fig. 8 illustrerer piasnidkortet for pBLUESCRIPT SK(-).

Fig. 9 illustrerer plasaidkortet for pRLIOl.

10

Fig. 10 illustrerer et restriktionsenzyakort for genom CC49 L-kzde-DNA-indsxttelse i pRLIOl.

Fig. 11 illustrerer plasaidkortet for pRL200.

15

Fig. 12 illustrerer et restriktionsenzyakort for genom CC83 L-kzde DNA-indsmttelse i pRL200.

Fig. 13 illustrerer nukleotidsekvensen af EcoRI-BamHI-fragmen-20 tet, som er isoleret fra plasnidet pNP9.

Fig. 14 illustrerer plasaidkortet for pHH49.

Fig. 15 illustrerer plasaidkortet for pHS63.

25

Fig. 16 viser nukleotidsekvensen af CC49 Vh, idet de understregede segmenter viser de sekvenser, som er udledt under anvendelse af oligonukleotidpriaere på nRNA.

30 Fig. 17 viser nukleotidsekvensen af CC83 Vh, idet de understregede segmenter viser sakvenserne, som er udledt under anvendelse af oligonukleotidpriaere på mRNA.

Fig. 18 viser aainosyresekvensen af CC49 Vh, idet de under-35 stregede segmenter viser sakvenserne, som er bestemt ved proteins ekvensbestemmeIse.

12 DK 173089 B1

Pig. Id viser aminosyresekvensen af CD83 V^. idet de understregede segmenter viser sekvenserne, som er bestemt ved pro-tei nsekvensbestemme Ise.

5 Fig. 20 viser resultaterne af en SDS-polyacrylamidgel med resultaterne af PNGase F-behandling af CC83-anti stof.

Fig. 21 illustrerer restriktionsenzymkortet for human gamma 1, gamma 2, gamma 3 og gamma 4.

10

Fig. 22 illustrerer pi asmidkortet for pSV2gpt/R/8.

Fig. 23 illustrerer plasmidkortet for pSV2gpt-yl-7,8.

15 Fig. 24 illustrerer plasmidkortet for pSV2gpt-yl-2,3.

Fig. 25 illustrerer plasmidkortet for pSV2gpt-y2.

Fig. 26 illustrerer plasmidkortet for pSV2gpt-y3.

20

Fig. 27 illustrerer plasmidkortet for pSV2gpt-y4.

Fig. 28 illustrerer plasmidkortet for p49yl-7,8.

25 Fig. 29 illustrerer plasmidkortet for p49yl-2,3.

Fig. 30 illustrerer plasmidkortet for p49-y2.

Fig. 31 illustrerer plasmidkortet for p49-y3.

30

Fig. 32 illustrerer plasmidkortet for p49-y4.

Fig. 33 illustrerer plasmidkortet for p38yl-7,8.

35 Fig. 34 illustrerer plasmidkortet for p83yl-2,3.

Fig. 35 illustrerer plasmidkortet for p83-y2.

13 DK 173089 B1

Fig. 36 illustrerer plasmidkortet for ρ83-γ3.

Fig. 37 illustrerer plasmidkortet for ρ83-γ4.

5 Fig. 38 illustrerer den samlede reaktion til dannelse af hybridgener baseret på metoden beskrevet af Horton et al., Gene 77, 61 (1989).

Figurerne 39A, 39B og 39C viser biofordelingen og fuldstændig 10 legemsretention af CH44-1.

Fig. 40A og 40B viser biofordelingen og fuldstændig legens-retention af CH84-1.

15 Immunoglobulinet ifølge opfindelsen er blevet udviklet for at løse problenerne med murine monoklone antistoffer, som er beskrevet i den kendte teknik. Det er karakteriseret ved at have en kimær struktur sammensat af en tung kæde variabel region, som kodes af ONA hidrørende fra VnaTAG.

20

Definitioner

Som anvendt heri refererer "immunoglobulin" til et tetramer eller aggregat deraf, uanset om specifik immunoreaktiv aktivi-25 tet er en egenskab. "Antistoffer" refererer til sådanne samlinger, som har signifikant kendt specifik immunoreaktiv aktivitet over for et antigen, og son omfatter lette og tunge kæder ned eller uden kovalent binding mellem dem. "Ikke-speci-fikt immunoglobulin” ("NSI") betyder sådanne immunoglobuliner, 30 som Ikke har kendt specificitet over for et antigen.

Den grundlæggende immunoglobulinstrukturenhed i hvirveldyr-systemer er relativ godt forstået. [Edelman, G.M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190, 5 (1971)]. Som det ses i fig. 1 er enhederne 35 sammensat af to identiske lette polypeptidkæder med molekylvægt på ca. 23.000 dalton og to Identiske tunge kæder med molekylvægt 53.000-70.000. De fire kæder er forbundne ved 14 DK 173089 B1 hjalp af dlsulfidbindinger i en "Y"-konf iguration, hvor de lette keder er sammenstillede med de tunge keder startende ved Vets mund og fortsettende gennem forskellighedsregionen.

5 Tunge keder er klassificeret som gamma (γ), my (μ), alpha (α), delta (6) eller epsilon (c), med nogen underklasser blandt dem. Denne kedes natur, idet den har en lang konstant region, fastlegger antistoffets "klasse", som IgA, IgO, IgE, IgG eller IgM.

10

Lette keder er klassificeret som enten kappa (κ) eller lambda (λ). Hver tung kedeklasse kan bindes med enten en let κ- eller λ-kede. Generelt er de lette og tunge keder kovalent bundet til hinanden og "ha1e"-delene af de to tunge keder er bundet 15 til hinanden ved hjelp af kovalente d1 sulfidbindinger, når 1mmunog1 obu 1 i nerne dannes enten af hybridomaer eller af B-cel- ler. Hvis ikke-kovalent forbinding af kederne kan gennemføres i den korrekte geometri, vil aggregatet af ikke-disulfid-for-bundne keder imidlertid stadig vare i stand til reaktion med 20 antigenet.

Aminosyresekvenserne løber fra en N-ende ved de forgrenede grenser af Vet til C-enden ved bunden af hver kede. Ved N-enden er der en variabel region og ved C-enden er der en kon-25 stant region.

Udtrykkene "konstant" og "variabel" anvendes funktionelt. De variable regioner i både lette (Vl)- og tunge (VnJ-kmder afgør bindingsgenkendelse og specificitet over for antigenet. De 30 konstante regionsområder i lette (Cl)- og tunge (CH)-kmder giver vigtige biologiske egenskaber, såsom antistofkmdeforbin-ding, sekretion, transplacental mobilitet og komplementbinding.

35 Den variable region er koblet i hver kmde til den konstante region ved en bindingsdel, som forbinder V-gensekvensen og C-gensekvensen. Denne forbindingsdel forekommer ved det genome 15 DK 173089 B1 niveau og forbinder nukleotIdsekvenser via rekombineringsste- der. Forbindingssekvensen er kendt for tiden som en “J"-se-kvens i det lette kadegen, som koder for ca. 12 aminosyrer og som en kombination af en "D"-sekvens og en "J"-sekvens i det 5 tunge kadegen, som sammen koder for ca. 25 aminosyrer.

"Klmmre antistof" refererer for denne opfindelses formål til et antistof, som i den tunge kede har en variabel regionamlno-syresekvens, som kodes for af en nukleotidsekvens hidrørende 10 fra et murint kimliniegen og en konstant regionaminosyrese-kvens, som kodes for af en nukleotidsekvens hidrørende fra et humant gen.

Den foreliggende opfindelse er imidlertid ikke ment snsvert at 15 vare begranset til blot at erstatte murine C-gensekvenser, som koder for konstante immunoglobuli nregioner med humane C-gense-kvenser, som koder for konstante immunoglobul1 nregioner. Den foreliggende opfindelse er således ikke begranset til, hvorvidt sammenslutningspunktet er ved den var1ab1e/konstante-20 granse.

Ved hjalp af forskellige teknikker er det nu muligt at frem stille andrede kimare antistoffer, kimare kompositantistoffer og fragmenterede kimare antistoffer, som der kodes for af nu-25 kleotidsekvenser beskrevet heri.

"Kompositn-immunoglobuliner omfatter variable polypeptidregio-ner, som Ikke tidligere er fundet forbundet med hinanden i naturen. Det er Ikke afgørende, hvorvidt nogle af de ovenfor 30 navnte er kovalent eller ikke-kovalent aggregeret, så lange at aggregeringen er i stand til selektivt at reagere med et bestemt antigen eller antigenfami 11e.

"Ændrede antistoffer" betyder antistoffer, hvor aminosyrese-35 kvenserne isar i den variable region, er blevet varieret. På grund af betydningen af DNA-rekombineringsteknikker for denne opfindelse behøver man ikke at vare begranset til aminosyre- 16 DK 173089 B1 sekvenserne af antistoffer valgt fra naturlige kilder, idet am inosyresekvenser af antistofferne kan omudformes til opnåelse af ønskede egenskaber. Oe mulige variationer er mange og går fra endring af blot en eller få aminosyrer til fuldstændig 5 omformning af en variabel og/eller konstant anti s tofregion.

Ændringer i den variable region vil blive foretaget for at forbedre antigenbindingsegenskaberne. Ændringer i den konstante region vil almindeligvis blive foretaget for at forbedre de 10 cellulære procesegenskaber, såsom komplementfiksering, vekselvirkning med membraner og andre effektorfunkti oner. Ændringer kan foretages ved standardrekombiner ingsteknikker og også ved oligonukleotidrettet mutageneseteknikker [Dalbadie-McFarland, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79, 6409 (1982)].

15 "Fragmenter" af immunoglobuliner omfatter segmenter af proteo-lytisk-kløvede eller rekombinant-fremst i 1 lede dele af et antistofmolekyle, som er i stand til selektivt at reagere med et bestemt antigen eller antigenfamilie. Ikke-begrcnsende eksemp-20 ler på sådanne proteolytiske og/eller rekombinerede fragmenter omfater "Fab", "F(ab')2n og "Fab1", idet deres proteolyti ske kløvningssteder er vist i fig. 1 såvel som "Fv" og Hed et "Fv"-fragment menes, at dele af let kådes variable regioner og tung kædes variable regioner er koblet sammen generelt ved 25 deres carboxyender. Rekombiner ingsteknikker til fremstilling af Fv-fragmenter er anført i WO 88/01649, WO 88/06630, WO 88/07085, W0 88/07086 og W0 88/09344. Med et "VH"-fragment menes, at den variable region har 1 det mindste en del af en tung kædes variable region, som er i stand til at blive an-30 vendt son en antigenbindingsfunktionalitet. Fremstillingen og brugen af en let kædes variable region (V^) som en antigenbindingsfunktional itet er anført i en artikel med titlen "Development of biologically active peptides based on antibody structure" af Williams et al. son findes 1 Proc. Natl. Sci.

35 (USA) 86, 5537-5541 (1989).

forbindelse med denne opfindelse er "dyr" ment at omfatte bovine dyr, porcine dyr, gnavere og primater, omfattende men- 17 DK 173089 B1 nesker, og andre.

"Ekspressionsvektor" er givet en funktionel definition af enhver ONA-sekvens, som er i stand til at udøve ekspression af 5 en bestemt DNA-kode i en passende vert, er Indbefattet i dette udtryk. For tiden er sådanne vektorer ofte i form af plasmider og således anvendes "plasmid" og "ekspressionsvektor" ofte i flang. Opfindelsen er imidlertid ment at omfatte sådanne andre former for ekspressionsvektorer, som tjener akvivalente funk-10 tioner, og som fra tid til anden kan blive kendt inden for området.

Ved "transformation" menes indføringen af DNA i en modtagende vcrtscelle, som andrer genotypen og således resulterer i en 15 endring i den modtagende celle.

"Vartsceller" refererer til celler, som er blevet rekombinant transformeret med vektorer, der er konstruerede under anvendelse af DNA-rekombineringsteknikker. Som defineret heri er 20 antistoffet eller modifikation deraf produceret af en varts-celle i kraft af denne transformation.

Ved beskrivelser af fremgangsmåder til isolering af antistoffer fra rekombinerede vmrter anvendes udtrykkene "celle" og 25 "cellekultur" i flang for at angive kilden for antistof med mindre det klart er specificeret på anden måde. Hed andre ord, udvinding af antistof fra "cellerne" kan betyde enten fra ned-roterede hele celler eller fra cellekulturen indeholdende både mediet og de suspenderede celler.

30

Forkortelser

Nukleinsyrer, aminosyrer, peptider, beskyttelsesgrupper, aktive grupper og lignende dele er, når de er forkortet, forkor-35 tet efter IUPACIUB (Commission on Biological Nomenclature) eller ifølge praksis inden for de omhandlede områder. Oe følgende er eksempler.

18 DK 173089 B1

Reagenser EDTA: EthylentH anintetraeddikesyre SOS: Natr1umdodecy1 sul fat 5

Nukleinsyrer RNA: Ribonukle i nsyre ONA: Deoxyribonukleinsyre 10

Nitroqenholdiqe baser

Pur i ner Pyri midi ner 15 A: Adenin T: Thymin 6: Guanin C: Cytosin U: Uracil Både DNA og RNA indeholder lange keder af phosphorsyre, en 20 sukkerart og nitrogenholdige baser. ONA er en dobbeltstrenget helix, hvor sukkeren er 2-deoxyribose, hvorimod RNA er enkelt-strenget, hvor sukkeren er D-ribose. De fire nitrogenholdige baser, som karakteriserer DNA-nukleotider, er bundne i komplementere par ved hjalp af hydrogenbindinger til dannelse af 25 dobbeltspiralen af DNA: adenin er bundet til thymin; guanin er bundet til cytosin. I RNA er thymin erstattet med uracil i de nmvnte ONA-par.

Aminosyrer 30

Gly: glycin Phe: phenylalanin

Ala: alanin Tyr: tyrosin

Val: valin Thr: threonin

Leu: leuein Cys: cystein 35 Ile: isoleucin Met: methionin

Ser: serin Glu: glutaminsyre

Asp: asparaginsyre Trp: tryptophan 19 DK 173089 B1

Lys: lysin Pro: prolin

Arg: arginin Asn: asparagin

His: hist id in Gin: glutan in 5 Variabel region DNA'et, som koder for den tunge kede består af en Vn-gense-kvens, en Dn-gensekvens og en J^-gensekvens. DNA'et som koder for den lette kede består af en Vi,-gensekvens og en J(_-gense-10 kvens.

VH-gensekvens

Den foreliggende opfindelse er rettet mod udvalgte kimere an-15 tistoffer med V^-regionen kodet af en DNA-sekvens hidrørende fra et kimliniegen, som er specifikt reaktivt over for TAG72 (Vh<xTAG), hvis sekvens er anført i fig. 2. De kimere antistoffer er udvalgt på basis af deres evne til at binde TAG72, dvs. hvor den variable region binder til TAG72 i det mindste 25% 20 mere end den variable region af B72.3 binder til TAG 72.

Generelt måles bindingsaffiniteterne af det kimere antistof og B72.3 ved hjalp af den samme teknik. Eksempler på teknikker til måling af antistofbindingsaffinitet er anført i de følgende referencer: Scatchard G., Annals of the N.Y. Acad, of 25 Sciences 51, 660 (1949); Steward, M.W. og Petty, R.E., Immunology 23, 861 (1972); Muraro, R., et al.. Cancer Research 48, 4588 (1988); og Heyman, B., J. of Immunol. Methods 68, 193- 204 (1984). 1 2 3 4 5 6

En fagmand inden for området vil forstå at som et resultat af 2 den foreliggende opfindelse, dvs. nukleotidsekvensen af (og 3 aminosyresekvenserne kodet af) V^aTAG, er den foreliggende op 4 findelse ment at omfatte effektive homologe nucleotidsekvenser 5 og tilsvarende aminosyresekvenser. "Effektivt homologe" refe- 6 rerer til identitet eller nmsten identitet af nukleotid- eller aminosyresekvenser. Således vil det forstås i denne beskrivelse, at mindre sekvensvariation kan forekomme inden for homo- 20 DK 173089 B1 loge sekvenser, og at hvilke som helst sekvenser, som har i det mindste 80% homolog i, er bedømt at være »kvivalente.

Homolog! udtrykkes ved den brøkdel eller procentdel af 5 matchende baser (eller aminosyrer) efter at to sekvenser {muligvis ikke med den samme længde) er blevet stillet op overfor hinanden. Udtrykket stillet op over for hinanden anvendes i den betydning, som er defineret af Sankoff og Kruskal i kapitel et i deres bog. The Time Harps, String Edits, and Macro-10 molecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison,

Addison-Westley, Reading, MA (1983). Groft sagt stilles to sekvenser op over for hinanden ved at maksimere antallet af matchende baser (eller aminosyrer) mellem de to sekvenser med indsettelsen af et minimalt antal af "blind-" eller "nul-" ba-15 ser i den ene eller den anden af sekvenserne for at opnå den maksimale overlapning.

Som det må forstås inden for området kan forkert matchede nu-kleotider forekomme ved den tredje eller usikre base i codonet 20 uden at forårsage aminosyresubstitutioner i siutpolypeptidsekvensen. Ligeledes kan mindre nukleotidmodifikationer (f.eks. substitutioner, indsættelser eller deletioner) i visse gen-sekvensregi oner tolereres og anses for usignifikante, når som helst sådanne modifikationer resulterer i ændringer i am i no-25 syresekvens, som ikke ændrer slutproduktets funktional itet.

Det er blevet vist, at kemisk syntetiserede kopier af hele eller dele af gensekvenser kan erstatte de tilsvarende regioner i det naturlige gen uden tab af genfunktion. 1 2 3 4 5 6

Homologer af specifikke DNA-sekvenser kan identificeres af 2 fagmanden inden for området under anvendelse af forsøget »ed 3 krydshybridisering af nukleinsyrer under betingelser med 4 stringens, som det er velkendt inden for området [som beskre 5 vet i Nucleic Acid Hybridization, Hames and Higgens (udgive- 6 re), IRL Press, Oxford, UK (1985)]. Givet to sekvenser er algoritmer tilgængelige for beregning af deres homologi: f.eks. Needleham og Wunsch, J. Mol. Bio!., 48, 443-453 (1970); 21 DK 173089 B1 og sankoff og Kruskal (citeret ovenfor) side 23-29. Ligeledes er kommercielle servicer tilgængelige til udførelse af sådanne sammenligninger, f.eks. Intel 1Igenetics, Inc. (Palo Alto, CA).

5 Du- QQ JH~9ensekvenser

Dh“ °9 Jn-flensegmenter forekommer i forskellige typer, selvom typen af D- eller J-gensegment, som velges, ikke er afgørende for opfindelsen. Dvs. Οχ og Jh kan hidrøre fra et hvilket som 10 helst dyr. Foretrukne dyr omfatter mus og mennesker. Humane Dh" og/eller JH-gensegmenter er selvsagt serlig foretrukne, men opfindelsen er ikke således begrenset, hvis et O- eller J-gensegment fra en anden dyreart giver en vigtig egenskab, dvs. forøget binding til TAG72.

15

Eksempler på murine Dh* og J^-sekvenser er anført 1 "Organization, Structure, and Assembly of Immunoglobulin Heavy Chain Diversity DNA Segments", Kurosawa og Tonegawa, J. Exp. Med.

155, 201 (1982); og "Sequences of the Joining Region Genes for 20 Immunoglobulin Heavy Chains and Their Role in Generation of Antibody Diversity", Gough og Bernard, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 509 (1981).

Eksempler på humane Οχ- og J||-sekvenser er anført 1 en artikel 25 med overskriften "Human Immunoglobulin D Segments encoded In Tandem Mult1gen1c Families" ef Slebenlist et al. i Nature 294, 631 (1981); og eksempler på humane J^-sekvenser er anført 1 "Structure of the Human Immunoglobulin μ Locus; Characterization of Embryonic and Rearranged J and 0 Genes" af Ravetch et 30 al., Cell. 27, 583 (1981).

Vi - og JL~9ensekvenseP

Generelt kan hvilke som helst V|.- og J|.-gensekvenser anvendes, 35 som koder for en del af et V^# der er komplementert til det VH, som kodes for af en nukleotidsekvens, der er effektivt homologt med V^aTAG. Ved "komplementer" menes et V^, som bin- 22 DK 173089 B1 der til Vnfet, og som giver en variabel antistofregion med en bindingsaffinitet på mindst 25¾ mere end B72.3 som målt ved en hvilken som helst standardteknik til måling af bindingsaffinitetskonstanter.

5

Den type af Vl- og JL-gensegment, som vælges, er ikke afgørende for opfindelsen. Dvs. Vj_ og kan hidrøre fra et hvilket som helst dyr. Foretrukne dyr omfatter mus og mennesker. Humane Vl* og/eller JL~gensegmenter er selvsagt særligt foretruk-10 ne, men opfindelsen er ikke begrænset således, hvis et J^-gen-segment fra en anden art giver en vigtig egenskab, dvs. forøget binding til TAG72.

Murine JL~sekvenser er anført i en artikel med overskriften 15 "The nucleotide Sequence of a 5,5-kilobase DNA Segment Containing the Mouse Kappa Immunoglobulin J and C Region Genes” af Max, et al. i J. Biol. Chem. 256, 5116-5120 (1981). Humane J|_-sekvenser er anført i en artikel med overskriften "Evolution of Human Immunoglobulin κ J Region Genes” af Heiter et 20 al. i The Journal of Biological Chemistry 357(2), 1516-1522 (1982).

Variable regioners oprindelse 25 Given de ovenfor nævnte oplysninger er det nu muligt at udlede adskillige specifikke udførelsesformer for variable antistof-regioner inden for den foreliggende opfindelses omfang, dvs. med effektiv homologe VH-sekvenser til Vh«TAG og binding til TAG72 på mindst 25¾ mere end den variable region af B72.3 30 binder til TAG72, idet bindingsaffiniteterne af antistoffet og B72.3 måles ved hjælp af den samme teknik. Der er flere mulige teknikker anført nedenfor.

Naturligt fremstillede variable regioner 35

Som reaktion på et immunogen, TAG72, vil et immuniseret dyr udvikle udvalgte anti stofproducerende B-celler. Antistoffernes 23 DK 173089 B1 variable region, son fremstilles af B-cellerne, vil blive kodet af omlejret tunge og lette kede-kimlinie-DNA. F.eks. vil den omlejrede tunge kimliniekede onfatte V-, 0- og J-genseg-nenter omfattende ledersekvensen såvel som eventuelle intro-5 ner, som senere kan fjernes. DNA'et, som koder for let kede, vil onfatte V- og J-gensegmenter omfattende ledersekvensen såvel som eventuelle introner, som senere kan fjernes.

Forskelligartethed kan vmre et resultat af somatiske mutatio-10 ner, som forekommer i en B-celle under produktiv omlejring af Vh<xTAG. Disse somatiske mutationer er nukleotidandringer, som muligvis vil eller som muligvis ikke vil resultere i en amino-syremndring, der mndrer aktiviteten over for TAG72 af det produktivt omlejrede V^· 15

Screenings teknikker

Monoklone eller polyklone antistoffer kan screenes til bestemmelse af hvilke af nmvnte antistoffer, som selektivt binder 20 til TAG72. Sådan screening kan udføres ved hjalp af en rakke velkendte fremgangsmåder, såsom fastfaseradioimmunoanalyse, enzymkoblede, immunosorbentanalyser, rosetteanalyser og blokeringsanalyser . Oe ovenfor beskrevne fremgangsmåder er velkendte inden for området.

25

Nukleotidsekvenserne for variable regioner, som koder for antistoffer, der er fremstillet fra den produktive omlejring af VhoTAG, er nu blevet opnået. Ud over nukleotidsekvensen for VhoTAG, viser fig. 2 også nukleotidsekvenserne, som koder for 30 de tunge kaders variable regioner i henholdsvis CC46-, CC49-, CC83- og CC92-antistoffer. Fig. 3 viser aminosyresekvenserne af VHaTAG VH, CC46 VH, CC49 V«. CC83 VH og CC92 VH svarende til nukleotidsekvenserne, torn er anført i fig. 2. En sammenligning af nukleotid- og aminosyresekvenserne af VhoTAG VH, 35 CC46 VH, CC49 Vh, CC83 V« og CC92 V« viser et meget påfaldende trek, nemlig at kederne har ekstraordinar lighed.

24 DK 173089 B1

Den relative lighed »ellem DNA’et, som koder for CC46 Vh-, CC49 Vh-# CC83 Vn~ og CC92 Vn-regionerne, is*r i det 5'-flan-kerende segment, bekræfter at disse DNA-sekvenser hidrører fra VnaTAG. Somatiske mutationer, som forekommer under produktiv 5 omlejring af Vn-regiongenet, som skal udtrykkes i en B-celle, giver anledning til nogle nukleotidcndringer som muligvis vil eller muligvis Ikke vil resultere i en homolog aminosyreen-dring mellem to produktivt omlejrede VnaTAG-producerende hy-br idomaer.

10

Nukleotidsekvenserne og tilsvarende aminosyresekvenser af CC49 Vl er vist i figurerne henholdsvis 4a og 4b. Nukleotidsekvenserne og tilsvarende aminosyresekvenser af CC83 V(_ er vist i figurerne henholdsvis 5a og 5b. Nukleotidsekvenserne og ti 1 -15 svarende aminosyrer af CC92 Vl er vist i figurerne henholdsvis 6a og 6b.

Sondeteknikker 20 Andre antistoffer, som kodes af DNA hidrørende fra VnaTAG kan udledes ved anvendelse af VnaTAG som en hybridiseringssonde. Almindeligvis kunne en sonde fremstillet ud fra DNA'et eller RNA'et af VnaTAG eller omlejrede gener indeholdende det rekom-binerede VnaTAG anvendes af fagmanden inden for området til at 25 finde homologe gener 1 ukendte hybridomaer. Sådanne homologe antistoffer vil have en DNA-sekvens, hvis mRNA hybridiserer med sonden af hele eller en del af VnaTAG-kiml iniegenet og dets flankerende regioner. Ved "flankerende regioner" er ment at omfatte sådanne DNA-sekvenser fra 5'-enden af VnaTAG til 30 3'-enden af opstrømsgenet og fra 3'-enden af VnaTAG til 5'-en-den af nedstrømsgenet.

Rationelt syntetiserede variable regioner 35 En anden yderligere metode er den rationelle syntese af ændrede variable regioner af de heri beskrevne antistoffer såvel som antistoffer fundet via sondering. En sådan metode har fle- 25 DK 173089 B1 re potentielle fordele. En forsker ville således ikke være nødt til at screene immuniserede værtsdyr i et forsøg P* først at udvælge sådanne antistoffer, som binder til TAG og dernæst udvælge sådanne antistoffer, som specifikt har Vn-regioner, 5 der kodes af DNA hidrørende fra V^aTAG.

Mutagenteknikker VH’ og/eller VL-gensegmenterne kan ’‘ændres'' ved mutagenese.

10 Eksempler på teknikker omfatter addition, deletion eller ikke-konservativ substitution af et begrænset antal af forskellige nukleotider eller den konservative substitution af mange nu-kleotider med det forbehold, at den rette læseramme bevares.

15 Substitutioner, deletioner, indsættelser eller en hvilken som helst underkombination kan forenes til opnåelse af en slutkon-struktion. Da der er 64 mulige codonsekvenser, men kun 20 kendte aminosyrer, er den genetiske kode degenereret 1 den betydning, at forskellige codoner kan give den samme amino-20 syre. Koden er imidlertid præcis for hver aminosyre således, at der er mindst et codon for hver aminosyre, dvs. hvert codon giver en enkelt aminosyre og ingen anden. Det vil være indlysende, at under translation skal den rette læseramme bevares for at opnå den rette aæinosyresekvens 1 det endeligt frem-25 stillede polypeptid.

Teknikker til additioner pi 1 forvejen fastlagte amlnosyreste-der med en kendt sekvens er velkendte. Eksempler p& teknikker omfatter oligonukleotid-formldlet stedrettet mutagenese og 30 polymerasekædereaktion.

Teknikker til deletioner £i 1 forvejen fastlagte aminosyre-steder med en kendt sekvens, er velkendte. Ekse*pier på teknikker omfatter oligonukleotid-formldlet stedrettet mutagenese 35 og polymerasekædereaktion.

Teknikker til substitutioner på i forvejen fastlagte aminosy-resteder med en kendt sekvens er velkendte. Eksempler på tek- 26 DK 173089 B1 nikker omfatter stedrettet mutagenese og polymerasekædereak-t ionsteknikken.

01igonukleotidstedrettet mutagenese involverer i det vesent* 5 lige hybridiser ing af et oligonukleotid , som koder for en ønsket mutation med en enkelt streng af DNA indeholdende regionen, som skal muteres, og anvendelse af den enkelte streng som en skabelon for udstrækning af oligonukleotidet til fremstilling af en streng indeholdende mutationen. Denne teknik er i 10 forskellige former beskrevet af Zoller, M.J. og Smith, M. , Nuc. Acids Res. 10, 6487-6500 (1982); Norris, K., Norris, F., Christiansen, L. og Fiii, N., Nuc. Acids Res. 11, 5103-5112 (1983); Zoller, M.J. og Smith, M., DNA 3, 479-488 (1984); Kramer, W., Schughart, K. og Fritz, W. J., Nuc. Acids Res. 10, 15 6475-6485 (1982).

Polymerasekædereaktion (PCR) involverer i det væsentlige eksponentiel forstærkning af ONA in vitro under anvendelse af sekvensspecificerede oligonukleotider. 01igonukleotiderne kan 20 om ønsket inkorporere sekvensændringer. Polymerasekædereak-tionsteknikken er beskrevet 1 Mullis og Faloona, Meth. Enz. 155, 335-350 (1987). Eksempler på mutagenese under anvendelse af PCR er beskrevet i Higuchi et al., Nucl. Acids Res. 16, 7351-7367 (1988), Ho et al., Gene 77, 51-59 (1989) og "Engi-25 neering Hybrid Restriction Genes Without the Use of Restriction Enzymes: Gene Splicing by Overlap Extension", Horton et al.. Gene 77, 61 (1989).

Ændring af antistoffets variable regioner kan være særligt an-30 vendeligt ved terapeutisk brug af monoklone antistoffer. På nuværende tidspunkt, når et kimært antistof omfattende et fuldstændigt muse-variabelt område indgives til et menneske, genkender menneskelegemets Immunsystem det muse-variable område, skønt i mindre omfang end et fuldstændigt murint antistof, 35 som fremmed og frembringer en immunreaktion der overfor. Således er dets effektivitet betragteligt reduceret ved efterfølgende injektioner af museantistoffet eller kimært antistof i 27 DK 173089 B1 mennesket på grund af indvirkningen af legemets iramunsystem over for det fremmede antistof. Ændringer af de murine \/χ- og VL-regioner kan således reducere den humane immunreaktion over for det cndrede antistof.

5

Rekombineringsteknikker

Antistofferne kan konstrueres ved rekombineringsteknikker. Med andre ord kunne en fagmand inden for området in vitro frem-10 stille en fuldstendig genkodning for de tunge og lette kmders variable regioner, fordi nukleotidsekvenserne af forskellige VH" VL-kodende regioner nu er tilvejebragt.

Det konstruerede gen kan udformes, hvor udvalgte Οχ- og J«-15 gensegmenter er i funktionel kombination med et udvalgt VH- gensegment, dvs. νχαΤΑβ-segmentet eller νχ-gensegmentet af CC49 eller CC83.

F.eks. vil det konstruerede DNA, som koder for tung kede, om-20 fatte Οχ- og Jx-gensekvenser, som støder op til 3'-enden af kimlinie-VxaTAG-gensegmentet, hvorved CDR3 og skelet (FR) 4 af νχ-området ferdiggøres. En ledersekvens kan vare til stede, men kan efterfølgende fjernes.

25 Afhengig af den anvendte lette kede kan det også vere nødvendigt at tilvejebringe et konstrueret DNA, som koder for let kede. Et sådant DNA-gen vil omfatte et V^-gensegment i funktionel kombination, f.eks. stødende op til et Jt-gensegment omfattende ledersekvensen, son efterfølgende kan fjernes.

30 gensegmentet vil variere afhmngig af, hvorvidt den lette kede er af λ- eller κ-systemet. J-regionsekvensen støder op til enden af Vi_-exonet til ferdiggørelse af FR 4 af VL-området. En sådan konstruktion kan udføres ved teknikker, som anvendes til at konstruere νχ-genet.

Det konstruerede gen kan udformes ved konventionelle rekombineringsteknikker, f.eks. til tilvejebringelse af en genindsat- 35 28 DK 173089 B1 telse i et plasmid, som er i stand til ekspression. Derefter kan plasniderne udtrykkes 1 værtsceller. Eksempler pi biologiske rekombineringsteknikker er anført nedenfor.

5 Ved tilvejebringelse af et fragment, som koder enten for den lette kædes eller tunge kædes variable region, vil det sadvan-ligvis vare ønskeligt at Indbefatte hele eller en del af 1n-tronet nedstrøms fra J-regionen, 1sar hvor den variable region hidrører fra vårten, hvori det sammensluttede gen skal udtryk-10 kes. Nir intronet er bevaret vil det vare nødvendigt, at der er funktionelle splejsningsacceptor- og -donorsekvenser ved intronenderne. Intronet mellem J og den konstante region af det sammensluttede gen kan primart vare intronsekvensen forbundet med (1) den konstante region, (2) J-omridet, eller (3) 15 dele af hver. Sidstnævnte kan vare et spørgsmål om hensigtsmæssighed, hvor der er et hensigtsmæssigt restriktionssted i intronerne fra de to kilder. Det kan vare nødvendigt at tilvejebringe adaptere for at forbinde intronet til den konstante region. I nogle tilfalde kan hele eller en del af intronet 20 modificeres ved deletion, nukleotidsubstitution eller nukleo-tidsubstitutioner eller indsættelse til fremme af manipule-ringslethed, ekspression eller lignende. Fortrinsvis bør en tilstrækkelig mængde af intronet vare til stede for at indeholde en fremmer, som er funktionelt aktiv med den naturligt 25 forekommende promotor.

Alternativt kan det vare hensigtsmæssigt at have det sammensluttede gen fri for intronet mellem J-genet og C-genet. Stiledes vil 3'-enden af J-genet støde op til 5'-enden af C-genet.

30 Han kan anvende en exonuklease og ved anvendelse af forskellige fordøjelsesperioder kan man tilvejebringe forskellige 3*-ender, som derefter kan anvendes til binding til den konstante region og udvælgelse foretages for et funktionelt produkt på en række måder; eller ved splejsning med overlappende 35 forlxngelse under anvendelse af polymerasekædereaktionstekno-logi, se Horton et al., supra. I dette tilfælde vil der almindeligvis blive anvendt en kunstig promotor, som ikke behøver at være funktionel aktiv sammen med en fremmer.

29 DK 173089 B1 I en foretrukken udførelsesforn kan generne, son koder for ν^-og v^-regionerne, andres ved at erstatte i det mindste en del af de komplementar itetsbestemmende regioner (CDR'er) i de lette eller tunge kcders variable områder af antistoffet med 5 analoge dele af CDR'er fra et antistof med en anden specificitet. Et eksempel på en teknik, hvor CDR'er erstattes, er beskrevet 1 europcisk patentansøgning nr. 0.239.400 og i PCT-an-søgning nr. W0 88/09344. I et andret antistof ifølge opfindelsen vil kun CDR'erne i antistoffet vare fremmede over for et 10 menneskelegeme, og dette skulle minimere bivirkninger, hvis anvendt til behandling af mennesker. Humane og muse-skelet-regioner har imidlertid karakteristiske trak, som adskiller humane fra muse-skeletregioner. Således kan et antistof sammensat af muse-CDR'er 1 et humant skelet godt ikke vare mere 15 fremmed over for legemet end et agte humant antistof.

Nukleotidsekvenserne svarende til Vn-aminosyresekvenserne af Vh<iTAG, CC46, CC49, CC83 og CC92 såvel som CC49-, CC83- og CC92-VL-gensegmenterne tilvejebringes. Det er således tankt, 20 at CDR'er fra antistofferne ifølge den foreliggende opfindelse kunne podes på skeletregionerne af et humant antistof.

Generelt kan CDR-regionerne fra et humant Vh~ eller V|_-område erstattes af CDR'er fra Vj|- eller V^-regionerne i antistoffer 25 ifølge den foreliggende opfindelse. Eksempler på humane antistoffer, hvorfra skeletdelene kan anvendes, omfatter human plasmacytoma NEWM, [Jones et al., "Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse". Nature 321, 522-828 (1986)], som er offentlig tilgen-30 gelig fra Dr. Greg Winter? og forskellige andre humane Vh- og VL-gener tilgængelige fra Dr. Terrence Rabbitts, som begge er forskere fra the Hedical Research Council, 20 Park Crescent, London, WIN 4AL.

35 Fast laggelsen af hvad der udgør et CDR og hvad der udgør en skeletregion kan foretages på basis af aminosyresekvenserne af et udvalgt Ig som anført 1 Kabat et al., Sequences of Proteins 30 DK 173089 B1 of Immunological Interest, fjerde udgave (1987), U.S. Dept, of Health and Human Services, NIH.

Oe fire skeletregi oner antager overvejende en Ø-lagkonforma-5 tion, og CDR'erne danner løkker, som forbinder og i nogle tilfalde udgør en del af 0-1agstrukturen.

Endvidere er ikke alle aminosyreresterne i løkkeregionerne op løsn 1ngsmiddelti 1 gangelige og 1 et tilfalde er aminosyre-10 rester i skeletregionerne i nvol veret i antigenbinding. [Ami t, A.G., Mariuzza, R.A., Phillips, S.E.V. og Poljak, R.J., Science 233, 747-753, (1986) ] .

Det er også kendt, at de variable regioner i de to dele af et 15 antigenbindingssted holdes 1 den korrekte orientering ved ikke-kovalente inter-kade-reaktioner. Disse kan Involvere amlnosyrerester inden i CDR'erne.

Det er således muligvis ikke nødvendigt for at overføre anti-20 genbindingskapaciteten fra et variabelt område til et andet at erstatte alle CDR'erne med de fuldstandige CDR'er fra den variable donorregion. Det kan vare nødvendigt blot at overføre sådanne rester, som er nødvendige for antigenbindingsstedet, og dette kan involvere overførsel af skeletregionrester såvel 25 som CDR-rester.

Det er således klart at blot at erstatte et eller flere CDR'er med komplementåre CDR'er ikke altid resulterer i et funktionelt andret antistof. Givet de forklaringer, der er anført i 30 EP patentansøgning nr. 0 239 400, vil det Imidlertid vare inden for en fagmands område, enten ved udførelse af rutineforsøg eller ved forsøgs- og fejl-test at opnå et funktionelt andret antistof, 35 Fortrinsvis andres de variable områder i både de tunge og lette kader ved i det mindste delvis CDR-erstatning og om nødvendigt ved delvis skeletregionerstatning og sekvensandring.

31 DK 173089 B1

Selvom COR1 erne kan hidrøre fra et antistof af den samme klasse eller endda underklasse som antistoffet, hvorfra skelet-regionerne hidrører, er det forudset, at CDR'erne vil hidrøre fra et antistof af en anden klasse og fortrinsvis fra et anti-5 stof fra en anden art.

Variable kompositregioner V-genetf som koder for Vl# er almindeligvis det samme V-gen, 10 som koder for det Vl forenet med det valgte V^· F.eks. anvendes V-genet, som koder for VL-regionerne hos CC49 og CC83, hensigtsmæssigt, når der anvendes V-genet, som koder for V« henholdsvis hos CC49 og CC83.

15 Overraskende, fordi Vji-regionerne i antistofferne ifølge den foreliggende opfindelse kodes af Vn-gener hidrørende fra VnaTAG, kan kompositantistoffer med fordel dannes. Med andre ord kan Vn-regionen fra et antistof ifølge den foreliggende opfindelse hensigtsmæssigt forenes med Vfregionen fra et 20 andet antistof ifølge den foreliggende opfindelse. Selvom ami-nosyresekvenserne i CC49- og CC83-tunge kæder overfladisk set er nært beslægtede, ville det forventes, at en ændring af få eller endda en aminosyre drastisk ville påvirke antistoffets bindingsfunktion, dvs. at de opnåede antistoffer generelt 25 antages at være et ikke-specifikt immunoglobulin (NSI), dvs. manglende antistofkarakter, (se europæisk patentansøgning nr.

0 125 023).

Ganske overraskende har dæt nu vist sig, at et antistof med 30 den krævede Vh ifølge opfledelsen ikke behøver at blive rekom-bineret kun med en Vt fra det samme naturligt forekommende dyreantistof. F.eks., som også anført i eksemplerne, er det muligt at fremstille et kimært antistof med en tung kæde med en VH fra CC83 og en let kæée ned et Vj. fra CC49, hvor det så-35 ledes dannede kompositantistof har en bindingsspecificitet 25* større end bindingsaffiniteten af B72.3 til TA672.

32 DK 173089 B1

Konstante regioner

Tung kade-område (Cp-område) 5 C^-områderne kan vmre af forskellige humane isotyper, dvs. IgG (f.eks. IgG}, IgG2/ IgG3 og IgG4), IgA, IgD, IgM såvel som de forskellige undertyper af de individuelle grupper.

For en omtale af human γΐ kan der henvises til Ellison et al., 10 "The nucleotide sequence of a human immunoglobulin C-gamma-1 gene", Nucl. Acid Res 10, 4071-4079 (1982); Takahashi et al., "Structure of human immunglobulin gamma genes: Implications for evolution of a gene family", Cell 29, 671-679 (1982). For en omtale af human gamma 2 (γ2) kan der henvises til Krawinkel IS et al., "Comparison of the hinge-coding segments in human immunoglobulin gamma heavy genes and the linkage of the gamma 2 and gamma 4 subclass genes, ENBO J 1, 403-407 (1982); Ellison et al., "Linkage and sequence homology of two human immunoglobulin gamma heavy chain constant region genes, Proc.

20 Natl. Acad. Sci. (USA) 79, 1984-1988 (182); Takahashi et al., infra. For en omtale af human gamma 3 {>3), se Krawinkel et al. infra, og Takahashi et al., infra. For en omtale af human gamma 4 (γ4) kan der henvises til Ellison et al., "Nucleotide sequence of a human immunoglobulin C-gamma-4 gene, DNA 1, 25 11-18 (1981), Krawinkel et al . infra, og Takahashi et al., infra.

For en omtale af det humane μ kan der henvises til Rabbitts et al., Human Immunoglobulin Heavy Chain Genes: Evolutionary 30 Comparisons of Cp, C6 og Cy genes and Associated Swisch

Sequences", Nucl. Acid Res. 9, 4509-45024.

For en omtale af human α kan der henvises til Flanagan et al., "Mechanisms of Divergence and Convergence of the Human Immu-35 noglobulin alpha 1 and alpha 2 Constant Region Gene Sequences", Cell 36, 681-688 (1984).

33 DK 173089 B1

For en omtale af det humane δ kan der henvises til White et al., "Human Immunoglobulin D: Genomic Sequences of the Delta Heavy Chain", Science 228, 733-737 (1985).

5 For en omtale af det humane c kan der henvises til Max et al., "Duplication and Deletion in the Human Immunoglobulin e Genes", Cell 29, 691-699 (1982).

Let kædeområde (Ci-område) 10 c^-området kan være human kappa (κ) eller human lambda (λ).

For en omtale af human κ kan der henvises til "Cloned Human and Mouse Kappa Immunoglobulin Constant and J Region Genes 15 Conserve Homology in Functional Segments", Heiter et al ., Cell 22, 197-207, November (1980).

For en omtale af human λ kan der henvises til "Processed Genes: A Dispersed Human Immunoglobulin Gene Bearing Evidence 20 of RNA-Type Processing", Hollis et al.. Nature 296, 321-325 (1982).

&H~ og/eller CL-gensegmenterne kan "mndres" ved mutagenese. Eksempler på teknikker omfatter addition, deletion eller ikke-25 konservativ substitution af et begrenset antal af forskellige nukleotider eller den konservative substitution af mange nu-kleotider forudsat, at der bevares den rette læseramme. Endvidere kan hele områder af proteinet endres, f.eks. ved erstatning af Ch3 med 0χ2. Denne substitution foretages på DNA-30 niveau ved indsættelse, deletion eller substitution af hele sekvensexoner.

35 34 DK 173089 B1

Konstruktion af antistoffer Immuniseringer 5 Den første teknik til fremstilling af antistoffer, hvad enten monoklone eller polyklone, hvilke antistoffer har Vn-regioner, som kodes af DNA hidrørende fra VhccTAG, er at immunisere et vartsdyr med oprenset TAG72. Eksempler på protokoller for immunisering af et vartsdyr med TAG72 er anført i US patent- 10 skrift nr. 4.522.918 og nr. 4.612.262 under anvendelse af et humant brystcarcinomekstrakt som immunogenet og US patentansøgning nr. 7.073.685 (som er tilgangelig for offentligheden} under anvendelse af TAG72, som er oprenset med B72.3, som immunogenet.

15

Derefter screenes monoklone eller polyklone antistoffer, som er fremstillet ud fra immuniseringsprotokollen, til bestemmelse af, hvilke af antistofferne, som selektivt binder til TAG72. En sådan screening kan opnås ved hjalp af en lang rakke 20 velkendte procedurer, såsom fastfaseradioimmunoanalyse, enzym koblede immunosorbentana1yser, rosetteanalyser og blokeringsanalyser. De ovenfor navnte procedurer er velkendte inden for området.

25 Syntese af aminosvresekvenser

Immunoglobuliner ifølge den foreliggende opfindelse kan syntetiseres ud fra de aminosyrer, som de udgøres af. Egnede teknikker er Merrifield-fastfasemetoden, som er beskrevet i J.

30 Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963). Denne fastfasemetode til syntetisering af sekvenser af aminosyrer er også beskrevet på siderne 1-4 1 en bog af Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis (W. H. Freemen and Co., San Francisco, 1969).

35 35 DK 173089 B1

Konstruktion af DNA DNA, som koder Vh og Vi 5 DNA'et, som koder for antistoffets tunge og lette kæder, kan opnås ud fra en række kilder, som er kendt for fagmanden Inden for området, f.eks. genomt DNA, cDNA, syntetisk DNA eller en kombination deraf.

10 Celler, som koder for den ønskede sekvens, kan isoleres, og genomt DNA fragmenteres ved hjalp af en eller flere restriktionsenzymer. Det genome DNA kan omfatte eller omfatter muligvis ikke naturligt forekommende introner. De opnåede fragmenter kan derefter klones og screenes under anvendelse af en 15 tung kede-J-regionsonde {J^-sonde) for tiIstedeverelsen af DNA-sekvensen, som koder for polypeptidsekvensen, der har Interesse. DNA-fragmenter, som er Isoleret ved prmparativ aga-rosegelelektroforese ligeres. Rekomblnerede plaquer af bibliotekerne screenes med en muse-Jtf-sonde· 20 DNA'et kan også opnås ud fra et cONA-bibllotek. Nessenger-RNA, som koder for tung eller let kåde. Isoleres fra en passende kilde, enten fuldstændigt udviklede B-celler eller en hybri-domakultur under anvendelse af standardteknikker for RNA-25 Isolering og anvendelsen af ol1go-dT-cellulosekromatografi til segregation af poly-A-oRNA'et. Poly-A-mRNA’et kan yderligere fraktioneres til opnåelse af sekvenser med passende størrelse til kodning for aminosyresekvenserne 1 den lette eller tunge kæde i det ønskede antistof efter behov.

30

Et cDNA-bibliotek fremstilles derefter ud fra blandingen af RNA under anvendelse af en passende primer, fortrinsvis en nukleinsyresekvens, som er karakteristisk for det ønskede cDNA. En sådan primer kan syntetiseres baseret på antistoffets 35 aminosyresekvens. Alternativt kan cDNA fra ikke-fraktioneret poly-A-mRNA fra en cellelinie, som fremstiller det ønskede antistof eller poly-dT, også anvendes. Det opnåede cDNA er 36 DK 173089 B1 eventuelt størrelsesfraktioneret på polyacrylamidgel og derefter forlænget med f.eks. dC-rester til sammenføjning med pBR322 eller en anden passende kloningsvektor, som er blevet kløvet af et passende restriktionsenzym, såsom PstI, og for-5 længet med dG-rester. Alternative metoder til dannelse af kloningsvektorer indeholdende cDNA’et under anvendelse af andre haler og andre klon i ngsvektomester kan selvsagt også anvendes, men det ovenfor stående er en standard og et foretrukket valg. En passende værtscellestamme, typisk Escherichia coli 10 {E. coli), transformeres med de sammenføjning kloningsvektorer og de succesrige transformanter identificeres ved hjælp af f.eks. ampicillin- eller tetracyklinresistens eller andre fænotypekarakteristika, som er iboende i kloningsvektorplas-midet.

15

Succesrige transformanter udtages og overføres til mikrotiter-skåle eller anden bærer til yderligere vækst og bevaring. Nitrocellulosef iIteraftryk af disse voksende kulturer sondebehandles derefter med passende nukleotidsekvenser indeholden-20 de baser, som vides at være komplementære med de ønskede sekvenser i cDNA'et. Der kan anvendes flere sondetyper, fortrinsvis syntetiske enkeltstrengede DNA-sekvenser, som er mærket ved kinasebehandling med γ-32Ρ ATP. Cellerne fikseret til nitrocellulosefilteret lyseres, DNA'et denatureres og 25 fikseres derefter før omsætning med kinasebehandlet sonde.

Kloner, som hybridiserer med succes, påvises ved kontakt med en fotoplade, hvorefter plasmider fra de voksende kolonier Isoleres og sekvensbestemmes ved hjælp af metoder, som er kendte inden for området, til bekræftelse af, at de ønskede 30 dele af genet er til stede.

De ønskede genfragmenter udskæres og halebehandles for at sikre passende læseramme med kontrol segmenterne, når indsat i passende ekspressionsvektorer. Typisk sættes nukleotider til 35 5'-enden til indbefatning af et startsignal og et passende anbragt restriktionsendonukleasested.

37 DK 173089 B1

Fordi opfinderne har tilvejebragt nukleotIdsekvenserne af Vh<xTAG, kan DNA’et også syntetisk syntetiseres, f.eks. under anvendelse af et aodel 380 DNA-synteseapparat fra Applied Biosystems· og konstrueres ved hjalp af standardteknikker.

5

Endelig er et eksempel på en teknik med anvendelse af en kombination af de ovenfor navnte teknikker ved at splejse med overlappende forlængelse under anvendelse af polymerasekade-reaktionsteknologi, se Horton et al., supra. Generelt kan en 10 syntetisk syntetiseret primer med en såkaldt "logrende hale" Indsattes aed en udvalgt sekvens, f.eks. genomt DNA. Derefter forstærkes sekvenserne og splejses sammen.

DNA, som koder for Ch og C|_.

15 DN.4-f ragmen te t, som koder for aminosyresekvensen for den humane konstante region, kan opnås ved screening af kromosomalt DNA fra celler, soa fremstiller humant Immunoglobulin.

20 Vektorer

Det ønskede DNA-fragment kan anbringes 1 en biologisk funktio nel ekspressionsvehikel, aom kan indeholde passende kontrolsekvenser, som ikke er til stede 1 det udvalgte DNA-fragment.

25 Ved "biologisk funktionelt" menes, at ekspressionsvehiklen tilvejebringer replikation og/eller ekspression 1 en passende vart, enten ved opretholdelse som et ekstrakromasomalt element eller ved integration 1 vartsgenomet. Der er et stort antal vektorer tilgangeliga, ellsr de kan let fremstilles og er vel-30 kendte for fagmanden inden for området.

En rakke plasmider, såsoa de, der er beskrevet 1 europæisk patentansøgning nr. 0036776, nr. 0048970 og 0051873, er blevet beskrevet, som allerede indeholder en promotor i læseramme med 35 genet og forligelig med den foreslåede vartscelle.

Vektorerne og fremgangsmåderne beskrevet heri er egnede til brug 1 en lang rakke mikroorganismer, enten prokaryote eller 38 DK 173089 B1 eukaryote, som er modtagelige for transformation. Plasmidet vil vare i stand til replikation i mikroorganismen, isar en bakter i e.

5 Generelt indeholder plasmidvektorer indeholdende de passende promotorer, som kan anvendes af den mikrobielle organisme til ekspression af dens eget protein, også kontrolsekvenser, ribosombindingssteder og transkriptionsafs 1utningssteder. Generelt anvendes replicon- og kontrolsekvenser, som hidrører fra ar-10 ter, der er forligelige med vartscellen i forbindelse med disse varter.

Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, forudsat at der er indbefattet den ca. 250 basepar (bp) sekvens, 15 som strekker sig fra Hi ndi11-stedet mod PvuII-stedet anbragt i det virale origin for replikation. Endvidere er det også muligt og ofte hensigtsmæssigt at anvende promotor- eller kontrolsekvenser, som normalt forbindes med den ønskede gensekvens forudsat, at sådanne kontrolsekvenser er forligelige med 20 vartscellesystemerne.

Endelig skal plasmidet hensigtsmæssigt indeholde et gen, et aarkørgen, som er 1 stand til at give en fenotyp egenskab, der muliggør udvælgelse af værtsceller Indeholdende ekspressions-25 vektoren. Særlig egnede er et gen, som giver overlevelsesselektion. Overlevelsesselektion kan opnås ved at tilvejebringe resistens over for et vakstinhiberende stof eller tilvejebringe en vakstfaktorevne til en bakterie, som mangler en sådan evne.

30

Generelt foretrækkes prokaryoter. F.eks. er pBR322 et plasmid hidrørende fra en E. coli-art [Bolivar et al.. Gene 2, 95 (1977)] særlig egnet. pBR322 indeholder gener for aapicillin og tetracyklinresistens og giver således en let metode til 35 identifikation af transformerede celler.

Selvom disse prokaryoter er de mest almindeligt anvendte omfatter andre mikrobielle stammer, som kan anvendes, E. coli- 39 DK 173089 B1 stammer, såso« E. coli B, E. coli K12-stamme 294 (ATCC nr. 31446) og E. coli X1776 (ATCC nr. 31537), E. coli W3110 (F'r γ", prototrop, ATCC nr. 27325), bacilli, såsom Bacillus subtilis, og andre enterobacteriaceae, såsom Salmonella typhi-5 »urim eller Serratia macrcesans, og forskellige Pseudomonas- arter kan anvendes. Disse eksempler er ment udelukkende at vare illustrative.

Ud over prokaryoter kan eukaryote mikrober også anvendes. Sac-10 charomyces cerevisiae eller almindelig bageger er den mest almindeligt anvendte blandt eukaryote mikroorganismer, selvom en rakke andre stammer er almindeligt tilgangelige.

For ekspression i Saccharomyces anvendes almindeligvis f.eks.

15 plasmidet YRp7 (Stinchcomb, et al., Nature 282, 39 (1979);

Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper, et al.. Gene 10, 157 (1980)]. Dette plasmid indeholder allerede trpl-genet, som giver en selektlonsmarkør for en mutantstamme af gar, som »angler evnen til at vokse 1 tryptophan, f.eks. ATCC nr. 44076 20 eller PEP4-1 [Jones, Genetics 85, 12 (1977)]. Ti 1stedevarelsen af trpl-lasionen som et karakteristika ved garvartscellegenonet giver derefter et effektivt miljø til påvisning af transformation ved vakst ved fravar af tryptophan.

25 Enhver pi asmidvektor indeholdende en gerfor 1igelig promotor, repli kat ionsorigin og afslutningssekvens er egnet til brug 1 gar. Passende proaotorsekvenser 1 garvektorer omfatter promotorerne for 3-phosphoglyceratkinase [Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] eller andre glycolytiske enzymer 30 [Hess, et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland et al.. Biochemistry 17, 4900 (1978)].

Til brug 1 pattedyrceller tilvejebringes kontrolfunktionerne på ekspressionsvektorerne ofte ved hjalp af viralt materiale.

35 F.eks. hidrører almindeligt anvendte promotorer fra polyoma, Adenovirus 2, og oftest Simlen Virus 40 (SV40). De tidlige og sene promotorer 1 SV40-virus er sarligt egnede, fordi de begge 40 DK 173089 B1 let opnås ud fra viruset som et fragment, som også indeholder det SV40-virale replikationsorigin [Fiers, et al.. Nature 273, 113 (1978)].

5 F.eks. indeholder pSV2neo et gen for ampici11 inresi stens, neo-mycinresi stens, som er under kontrol af en SV40-promotor. Således giver pSV2neo en let metode til identifikation af celler, som er transformeret med gener, for både den variable dyre-region og konstante humane region.

10

Fremstilling af kimært PNA

Generne, som koder for den tunge kæde eller den lette kede, vil blive konstrueret ved at forbinde S'-enden af et DNA-15 fragment, som koder for den konstante region med 3'-enden af et DNA-fragment, som koder for den variable region. DNA-se-kvensen, som koder for antistofaminosyresekvensen, kan opnås i forbindelse med promotoren og replikationsstedet fra genomt DNA. I den udstrækning, at værtscellerne genkender de tran-20 skriptionelle regu1 ator i ske signaler og translationsinitieringssignaler forbundet med de heterologe gener, da kan regionen 5' og 3' af den variable regionkodningssekvens bevares med den variable regionkodningssekvens og anvendes til transkrip-tional og translational initieringsregulering. Den ikke-koden-25 de region 3' for den konstante region kan bevares for dens transkriptionsafslutningsregulatoriske sekvenser, såsom afslutning og polyadenylering. Ved henvisning til 5? eller 3' for en dobbeltstreng er det ment at angive retningen af transkription, idet 5' er opstrøms fra 3'.

30

Intronsekvensen mellem den variable region for hver respektiv kæde kan forbindes til det tilsvarende humane konstante Defragment på et hvilket som helst hensigtsmæssigt restriktions-sted. Ved tilvejebringelse af et fragment, som koder for den 35 variable region, vil det sædvanligvis være ønskeligt at indbefatte en del af intronet nedstrøms fra J-regionen. Når in-tronet bevares vil det være nødvendigt, at der er funktionelle 41 DK 173089 B1 splejseacceptor- og -donorsekvenser ved i ntronenderne. Den tilstødende ikke-kodende region 5' for den variable region vil normalt omfatte sådanne sekvenser, som er involveret med initiering af transkription og translation, såsom TATA-kassen, 5 aflukningssekvens og CAAT-sekvens. Scdvanligvis overstiger den 5'-ikke-kodende sekvens ikke ca. 1-2 kilobaser (kb).

En fremmersekvens bør forekomme »ellem J-regionen og den konstante region. Den anvendte fremmer kan vare fremmeren fra 10 enten (1) dyre-V-regionen eller (2) den humane konstante regi on.

Ved bevarelse af 3-regionen, son naturligt støder op til DNA-sekvensen, som koder for den konstante region, kan transkrip-15 tionsafslutningssignalerne tilvejebringes for genet. I de tilfalde, hvor transkriptionsafslutningssignalerne ikke er til-strakkeligt funktionelle 1 ekspressionsvartscellen, da kan der erstattes med en 3’-region( som er funktionel i vartscellen. Hensigtsmassigt kan den ikke-kodende 3'-region opnås fra en 20 ikke-kodende tilstødende 3v-region af en konstant region fra ekspressionsvarten. Den 3*-ikke-kodende region kan forbindes til den konstante region ved hjalp af en hvilken som helst af de metoder, som tidligere er beskrevet for manipulering og ligering af ONA-fragmenter. Denne region kunne derefter anven-25 des som en byggeblok ved fremstilling af genet.

Fremstilling af ekspressionsvehikler

Konstruktion af passende ekspressionsvehikler Indeholdende de 30 ønskede kodnings- og kontrolsekvenser kan fremstilles på følgende måde. Enderne af vektorerne og DNA-fragmenterne kan derefter genligeres til dannelse af de ønskede ekspressionsvehik ler. De anvendte fremgangsmåder er ikke afhangige af DNA-ki1-den eller den påtankte vart« DNA-f ragmenter, som koder for den lette kede og tunge kede, kan indsattes i en separat ekspressionsvehikel eller 1 den 35 42 DK 173089 B1 sanne vektor. Fortrinsvis samles de sammensluttede gener, som koder for de lette og tunge kimære keder 1 to forskellige ekspressionsvektorer, som kan anvendes til co-transformat ion af en modtagende celle, enten samtidig eller på hinanden føl-5 gende.

Metoderne til indsættelse af DNA-fragmenterne indeholdende de kimære gener i ekspressionsvektorer omfatter anvendelse af restriktionsendonukleaser. "Restriktionsendonukleaser" (eller 10 "restriktionsenzymer") er hydrolytiske enzymer, som er 1 stand til katalysering af stedspecifik kløvning af DNA-molekyler. Stedet for restriktlonsendonukleasevirkning bestemmes af forekomsten af en specifik nukleotidsekvens. En sådan sekvens betegnes genkendelsesstedet for restriktionsendonukleasen. Mange 15 restriktionsendonukleaser fra en lang række bakteriearter er blevet isoleret og karakteriseret med hensyn til nukleotid-sekvensen af deres genkendelsessteder. Nogle restriktionsendonukleaser hydrolyserer phosphodiesterblndingerne på begge strenge på det samme punkt frembringende stumpe ender. Andre 20 katalyserer hydrolyse af bindinger adskilt af få nukleotider fra hinanden frembringende frie enkeltstrengede regioner ved hver ende af det kløvede molekyle. Sådanne enkeltstrengede ender er selv-komplementære, følgelig cohæsive, og kan anvendes til at genforbinde det hydrolyserede ONA. Eksempler på 25 restriktionsenzymer omfatter Aat II, Barn HI, Eco RI, Hind III,

Nde I, Spe I, Xba I, Sac I, Bgl II, Pst I, Sal I og Pvu II.

Endvidere kan ekspressionsvektoren have en polykobler Indsat deri, som har en lang række unikke restriktionssteder. Ved 30 fordøjelse af ekspressionsvektoren med de passende restriktionsenzymer vil polykobleren kløves således, at 1 det mindste et ONA-fragment indeholdende genet kan Indsættes. Når polykobleren muliggør skelnelige ender, kan DNA-fragmentet Indsættes i en enkelt retning. Når enderne er ens vil indsættelse af 35 DNA-fragmentet resultere i plasmider med to forskellige retninger.

43 DK 173089 B1

Kløvningen udføres ved behandling af plasmidet med et restriktionsenzym eller restriktionsenzymer. Generelt anvendes ca. 10 μς plasmid eller DNA-fragmenter med ca. 10 enheder enzym 1 ca.

100 μΐ pufferopløsning. Endonukleasefordøjelse vil normalt 5 udføres ved en temperatur 1 Intervallet fra 37* til 65*C ved en pH-verdi på fra 7 til 9. (Passende puffere og substratmeng-der for bestemte restriktionsenzymer er anført af fremstilleren). Reaktionstiden vil vmre fra 1 til 18 timer.

10 Oet kan vare hens igtsmesslgt at forhindre genligerlng af den kløvede vektor ved forbehandling med alkalisk phosphatase. Specifikke betingelser er anført af fremstilleren.

Efter at restriktionsenzymfordøjelsen er fuldstandig, fjernes 15 protein ved ekstraktion med phenol og chloroform. Nukleinsyren udvindes fra den vandige fraktion (indeholdende ca. 0,3 M natriumacetat) ved precipitation med ca. 2,5 vol urner ethanol.

Beskrivelser af kløvningsmetoder med restriktionsenzymer kan 20 findes 1 de følgende artikler: Greene et al., Hethods in Molecular Biology, bind 9, udgiver Wickner, R. B., Marcel Dekker, inc., New York, ”DNA Replication and Biosynthesis1'; Mertz og Oavls, Proc. Nat. Acad. Sci., (USA), 69, 3370 (1972).

25 Størrelsesadskillelse af de kløvede fragmenter ved agarosegel-elektroforese udføres let for at følge reaktionsforløbet. Når fordøjelsen har foregået til den ønskede grad, kan endonuklea-sen Inaktiveres ved opvarmning over 65*C 1 ca. 10 minutter eller ved organisk ekstraktion.

30

Det ønskede fragment oprense* derefter fra fordøjelsesmaterialet. Passende oprensningsteknikker omfatter gelelektroforese eller saccharosegradientcentrifugering. 1

Plasmidvehiklen og fremmede ONA-fragmenter ligeres derefter med DNA-I1gase til gencirkeldannelse. Denne fremgangsmåde refereres til som sammenslutning og DNA-1igering.

44 DK 173089 B1

Et passende pufferbehandlet medium indeholdende DNA-fragmenterne, ONA-ligase og passende co-faktorer anvendes. Den anvendte temperatur vil være mellem 25#C og 4*C. Hår DNA-seg-menterne hydrogenbinder, vil DNA-ligasen vare i stand til at 5 indføre en covalent binding mellem de to segmenter. Oet anvendte tidsrum til sammenslutningen vil variere med den anvendte temperatur, saltopløsningens natur såvel som naturen af de klæbrige ender eller cohasive ender. Generelt kan tidsrummet for ligering være 5 til 18 timer. Se Haniatis T., Molecu-10 lar Cloning, Cold Spring Harbor, supra.

Værtscel ler

Derefter kan ekspressionsvehikelkonstruktionerne anvendes til 15 at transformere en passende værtscelle. Passende værtsceller omfatter celler, som hidrører fra encellede såvel som fler-cellede organismer.

De kimære immunoglobuli ngener kan udtrykkes 1 ikke-lymfoide 20 celler, såsom bakterier eller gær.

Forskellige encellede mikroorganismer kan transformeres, såsom bakterier. Dvs. sådanne encellede organismer, som er i stand til at blive dyrket i kultur eller ved fermentering. Da bak-25 terier almindeligvis er de mest hensigtsmæssige organismer at arbejde med, vil bakterier herefter refereres til som eksempler på de andre encellede organismer. Bakterier, som er modtagelige for transformation, omfatter medlemmer af Entero-bacteriaceae, såsom stammer af Escherichia coli; Salmonella; 30 Bacillaceae, såsom Bacillus subtilis; Pheumococcus; Streptococcus og Haemophilus influenzae.

Når udtrykt i bakterier bliver immunoglobulinets tunge kæder og lette kæder en del af Inklusionslegemer. Kæderne må deref-35 ter isoleres, oprenses og derefter samles til funktionelle immunoglobul1 nmolekyler.

45 DK 173089 B1

Udover prokaryoter kan eukaryote mikrober, såsom gærkulturer, også anvendes. Saccharomyces cerevisae eller almindelig bagegær er den mest almindelig anvendte blandt eukaryote mikroorganismer, selvom der er en række andre stammer almindeligt 5 tilgængelige. Tilstedeværelsen af trpl-læsionen som en egenskab hos gærværtscellegenomet, giver et effektivt miljø til påvisning af transformation ved vækst ved fravær af tryptophan .

10 Udover mikroorganismer kan kulturer af celler hidrørende fra flercellede organismer også anvendes som værter. Principielt er en hvilken som helst sådan cellekultur anvendelig, hvad enten fra hvirveldyr- eller ikke-hvirveldyrkulturer forudsat, at cellelinien er en, som i det mindste oprindeligt fremstil-15 lede antistoffer. Propargering af hvirveldyrceller i kultur er blevet en rutineprocedure i de senere år [Tissue Culture, Academic Press, Kruse og Patterson, udgivere (1973)]. Eksempler på sådanne egnede værtcellelinier er Sp2/0, VERO- og HeLa-cel-ler, kinesisk hamsteræggestokcelleli nier og W138-, BHK-, 20 C0S-7- og HDCK-cellelinier.

Den foretrukne modtagelsescellelinie er en piasmacytomacelle, såsom B-lymfocytter eller hybridomacel ler. PIasmacytomaceller kan syntetisere, samle og udskille immunoglobuliner, som er 25 kodet af transformerede immunoglobulingener. Endvidere har de mekanismen for glycosylering af immunoglobul1 net. Sp2/0 er en foretrukken modtagelsescelle, fordi det er en immunoglobulin-ikke-producerende piasmacytomacelle. Cellen producerer kun Immunoglobulin, som er kodet af de transformerede immunoglobu-30 lingener. Plasmacytomaceller kan dyrkes i kultur eller i mus's peritoneum, hvor udskilt immunoglobulin kan opnås fra ascites-væske.

Transformation af værtsceller 35

Transformation af værtsceller udføres på følgende måde. Eks-pressionsvehiklen 1iniariseres, og DNA1 et indsættes i værts- 46 DK 173089 B1 celler til fremstilling af antistoffet. Eksempler på fremgangsmåder til indsættelse af DNA'et i værtsceller omfatter elektroporati on, protopi astfus ion, calciumphosphat-præcipita-tion eller andre konventionelle teknikker, hvor der anvendes 5 dextransulfat og PEG.

Hvis der anvendes celler uden vældige cellevægsbarrierer som værtsceller, kan transformation udføres ved hjælp af calcium-phosphatpræcipitat ionsmetoden som beskrevet af Graham og Van 10 der Eb, Virology, 52, 546 (1978).

Hvis der anvendes prokaryote celler eller celler, som indeholder væsentlige cellevægskonstruktioner, er den foretrukne transformationsfremgangsmåde calciumbehandling under anvendel-15 se af calciumchlorid som beskrevet af Cohen, F.N. et al., Proc. Nat 1. Acad. Sci. (USA) 69, 2110 (1972).

Værtscellerne kan transformeres enten via co-transformat ion eller målrettet transformation.

20

Til co-transformation kan generne, som koder for den lette kæde og tunge kæde, anvendes til transformation af separate cellekulturer, enten fra den samme art eller fra forskellige arter, separate plasmider for let og tung kæde kan anvendes 25 til at co-transformere en enkelt cellekultur eller endelig kan et enkeltekspressionsplasmid indeholdende begge gener og i stand til at udtrykke generne for både let og tung kæde transformeres ind i en enkelt cellekultur.

30 Ved den målrettede transformationsteknik transformeres værtscellerne med gener, som koder for den lette kæde, og cellerne indeholdende den lette kædemarkør udvælges. Den lette kæde findes under anvendelse af cytopletning eller muligvis ved påvisning af den lette kæde i supernatanten, hvis den er ble-35 vet udskilt. Celler, som er udvalgt for at have den lette kæde, transformeres med den tunge kædekonstruktion, og opnåede celler, som endvidere indeholder den tunge kædemarkør, udvælges.

47 DK 173089 B1

Det er kendt, at nogen udødelige lynfoide cellelinier, såsom plasmacytomacellelinier i deres normale tilstand, udskiller isolerede Ig-lette eller -tunge keder. Hvis en sådan cellelinie transformeres med vektoren indeholdende den kimere tunge 5 eller lette kede ifølge den foreliggende opfindelse vil det således ikke vere nødvendigt at transformere cellelinien eller en anden cellelinie med den anden Ig-kcde forudsat, at den normalt secernerede kede er komplementer med det variable område af Ig-keden, som kodes af vektoren, der indledningsvis 10 blev anvendt til transformation af cellelinien.

Udveloelse oo ekspression af transformerede vertsceller

Cellerne kan almindeligvis efter transformation af vertscel-15 lerne dyrkes i ca. 48 timer for at muliggøre ekspression af markørgener. Cellerne anbringes derefter 1 et selektivt medium, hvor ikke-transformerede celler dråbes udelukkende efterladende celler, som er transformerede med DNA-kontruktionerne.

20 Tunge og lette keder eller dele deraf kan fremstilles isoleret fra hinanden og antistoffer og fragmenter deraf kan opnås. Sådanne fremstillinger nødvendiggør brugen af teknikker til samling af isolerede keder.

25 Muligheden for ved hjelp af fremgangsmåden ifølge opfindelsen at fremstille tunge og lette keder eller dele deraf isoleret fra hinanden giver muligheden for at opnå unikke samlinger af immunogiobuliner, Fab-regioner og envalente antistoffer. Det er muligt, at rekombinere de tunge og lette keder in vitro, 30 ødelagt kun ved kløvning af disulfider mellem keder og at genvinde antistofaktivitet selv uden genoprettelse af disulfider mellem keder (se Edelman, β.Μ., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 50, 753 (1963)9.

35 De transformerede celler dyrkes under betingelser, som er pas sende for fremstillingen af de lette keder og/eller tunge ke- der og undersøges for tung og/eller let kedeproteinsyntese.

48 DK 173089 B1

Eksempler på analyseteknikker omfatter enzymkoblet immunosor-bentanalyse (ELISA), radioimmunoanalyse (RIA) eller fluorescensaktiveret cel 1esorterana1yse (FACS), immunohistokemi og 1ignende.

5

Monoklone antistoffers bindingsaffinitet over for TAG72 bestemmes ved hjelp af metoder, som er velkendte inden for området (se Heyman, B. et al., J. Immunol. Methods 68, 193-204 (1984) og som beskrevet detaljeret i eksemplerne givet her-10 efter).

Udvalgte positive kulturer underklones for at isolere rene transformerede kolonier. En passende teknik til opnåelse af underkloner er via den begrensede fortyndingsmetode, som be-15 skrives af McKeara i Monoclonal Antibodies, Plenum Press, N.Y.

(1980).

Hybridomaer, som fremstiller sådanne kimsre antistoffer, kan dyrkes under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Oe transfor-20 merede celler kan udskille store mmngder af de lette keder og/eller tunge keder ved dyrkning in vitro, såsom ved systemer med hule fibre, spinderkultur, statisk kultur eller in vivo, såsom ascitesproduktion.

25 De kimere antistoffer kan fremstilles i store mengder ved in-jicering af hybridoma ind i det peritoneale hulrum hos pris-tan-primede mus og efter et passende tidsrum (ca. 1-2 uger) Indsamling af ascitesveske fra mus, hvilket giver en meget høj titer af homogent monoklont antistof, og isolering af de mono-30 klone antistoffer derfra ved fremgangsmåder, som er velkendte inden for området [se Stramignoni, P. et al., Inti. J. Cancer 31, 543-552 (1983)]. Hybridomaerne dyrkes op in vivo som tumorer i dyr, hvorfra serumet eller ascitesvmske kan give op til ca. 50 mg/ml monoklone antistoffer. Scdvanligvis vil in-35 jektion (fortrinsvis i nterper i toneal) på ca. 10^ til 10? histoforligelige hybridomaceller i mus eller rotter give en tumordannelse efter få uger. Antistofferne kan derefter opsamles 49 DK 173089 B1 og bearbejdes ved hjelp af velkendte metoder. Se generelt Immunological Methods, bind I & II, udgivere Lefkovits, I. og Pernis B. , (1979 & 1981) Academic Press, New York, N.Y.; og

Handbook of Experimental Immunology, udgivere Weir, D., (1978) 5 Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO.)

Antistofferne kan derefter lagres i forskellige pufferopløsninger, såsom phosphatpufret saltopløsning (PBS), som giver en generel stabil antistofopløsning til yderligere brug.

10

De kimere antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse kan fragmenteres under anvendelse af kendte proteaseenzymer, f.eks. papein og pepsin, til opnåelse af 1 høj grad immuno-reaktive F(ab')2-, F(ab’)” og Fab-fragmenter. Endvidere kan 15 aktive fragmenter af Ig, som er dannet ved proteolyse (ca.

50.000 molvagt) opspaltes til deres fuldstendigt reducerede tunge kede- og lette kmdekomponenter og ganske effektivt rekonstrueres til opnåelse af et aktivt antistof [Haber, E., Proc. Nat 1. Acad. Sci (USA) 52, 1099 (1964); Whitney, p.L. et 20 al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 53, 524 (1965)]. Reaktiviteten af de opnåede F(ab')2-, F(ab')- og Fab-fragmenter bestemmes ved fremgangsmåder, som er beskrevet ovenfor, for det fuldstændige monoklone antistofmolekyle.

25 Anvendelse af antistofferne

Antistofferne ifølge den foreliggende opfindelse såvel som immunoreaktive fragmenter eller rekombinanter deraf giver enestående fordele ved brug til en lang rekke cancerbehandlinger.

30 Ud over evnen til at binde specifikt til maligne celler og lokalisere tumorer har antistofferne konstante, variable regioner, som ikke i påviselig grad binder til normale celler, såsom fibroblaster, endotelceller eller epitelceller i hovedorganerne .

35

Specifikt er antistofferne, immunoreaktive fragmenter eller rekombinanter deraf egnede til, men ikke begrenset til, de 50 DK 173089 B1 følgende typer af cancerbehandling: (19 diagnostiske 1n vivo- analyser konjugeret til en billeddannelsesmarkør til in situ-påvisningen af carcinomlæsioner, son yderligere beskrevet nedenfor; (2) in vivo-terap1 under anvendelse af antistofferne 5 ifølge den foreliggende opfindelse alene eller konjugeret til et terapeutisk niddel, såson et radionuklid, toksin, effektor-celler, andre antistoffer eller via en konplenentnekanisme, som er beskrevet nedenfor; og (3) radioinnunoledet kirurgi, som beskrevet nedenfor.

10

Endvidere er det nu også muligt med et farmaceutisk middel onfattende antistofferne ifølge den foreliggende opfindelse 1 en farmaceutisk acceptabel, ikke-toksisk, steril bærer, såson fysiologisk saltopløsning, ikke-toksiske puffere og lignende.

15

Injlcerbare midler ifølge den foreliggende opfindelse kan være enten 1 suspension eller opløsningsform. I opløsningsform opløses komplekset (eller når ønsket de separate komponenter) 1 en farmaceutisk acceptabel bærer. Sådanne bærere omfatter et 20 passende opløsningsmiddel, konserveringsmidler, såsom benzyl-alkohol, om nødvendigt, og puffere. Egnede opløsningsmidler omfatter f.eks. vand, vandige alkoholer, glycoler og phospho-nat- eller carbonatestere. Sådanne vandige opløsninger Indeholder ikke mere end 50% af det organiske opløsningsmiddel 25 efter volumen.

Injlcerbare suspensioner som midler ifølge den foreliggende opfindelse nødvendiggør et flydende suspenderingsmedium som en bærer med eller uden hjælpestoffer. Suspenderingsmediet kan 30 f.eks. være vandig polyvinylpyrrolidon. Inerte olier, såsom vegetabilske olier eller i høj grad raffinerede mineralolier eller vandig carboxymethylcellulose. Passende fysiologisk acceptable hjælpestoffer, om nødvendigt, til at holde komplekset 1 suspension, kan vælges blandt fortykkelsesmidler, såsom 35 carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidon, gelatine og algi- naterne. Mange overfladeaktive midler er også egnede som suspenderingsmidler, f.eks. lecithin, alkylphenol, polyethylen- 51 DK 173089 B1 oxidaddukter, naphtha!ensulfonater, alkylbenzensulfonater og polyoxyethylensorbitanestrene. Mange stoffer, som påvirker hydrofob 1c i teten, Massefylden og overf1adespend Ingen af det flydende suspensionsnedium , kan bidrage til at fremstille 5 injicerbare suspensioner i individuelle tilfalde. F.eks. er si 1 iconeantiskumningsmidler, sorbitol og sukkerarter egnede suspenderingsmidler.

På grund af at cancerceller er heterogene og som en følge 10 deraf vil et enkelt nonospecifikt kimert antistof muligvis ikke vere i stand til at genkende alle celler, som udtrykker forskellige epitoper af en tunor.

Det kan således vare hensigtsmassigt at indgive flere forskel-15 lige kimare antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse.

Den sekventiel le brug af disse forskellige antistoffer bør i alt vasentligt reducere de anti-idiotype reaktioner hos menneskepatienter, når sammenlignet ned gentaget brug af et enkelt antistof. F.eks. kunne CH92, CH88 og CH44 indgives sekventielt 20 til en patient. Da disse antistoffer har forskel lige lette keder og faktisk forskellige C0R3-regioner, skulle anti-idiotype reaktioner vare Minimeret.

In vivo-diaonostiske analyser 25

Ved anvendelse af in vivo-diagnostiske analyser for humane tunorer eller metastase deraf konjugeres antistofferne, immu-noreaktive fragmenter eller rekombinanter deraf, til en markør, indgives til en patient, og derefter påvises billeddan-30 nelsesmarkøren i patienten ved at udsatte patienten for et passende påvisningsMiddel.

Indgivelse og påvisning af anstistof-billeddannelsesmarkør-konjugatet såvel som Metoder for konjugering af antistoffet 35 til billeddannelsesmarkøreft udføres ved fremgangsmåder, som er ganske kendte eller let bestemmes som beskrevet, f.eks. i Goldenberg, D.H. et al.. Nem England J. Med., 298, 1384-1388 52 DK 173089 B1 (1978); Goldenberg, O.M. et al., J. Amer. Med. Assoc. 280, 630-635 (1983); Goldenberg, D.M. et al., Gastroenterol. 84, 524-532 (1983); Siccardi, A.G. et al.. Cancer Res. 46, 4817-4822 (1986); Epenetos, A.A. et al.. Cancer 55, 984-987 5 (1985); Phil ben, V.J. et al., Cancer 57, 571-576 (1986);

Chiou, R. et al.. Cancer Inst. 76, 849-855 (1986); Colcher, E. et al.. Cancer Res. 43, 736-742 (1983); Colcher, E. et al..

Laboratory Research Methods in Biology and Medicine Immuno-diagnostics, New York, Alan R. Liss, side 215-258 (1983); 10 Keenan, A.M. et al., J. Nucl. Med. 25, 1197-1203 (1984);

Colcher D. et al.. Cancer Res. 47, 1185-1189 (1987); Estaban, J.M. et al.. Inti. J. Cancer 39, 50-59 (1987); Martin, D.T., et al., Curr. Surg. 41, 193-194 (1984); Martin, E.W. Jr. et al., Hybridoma 5, S97-S108 (1986); Martin, D.T. et al., Am. J.

15 Surg. 150, 672-675 (1985); Meares et al., Anal. Biochem. 142, 68-78 (1984); og Krejcarek et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77, 581-585 (1977).

Dosen vil variere afhængig af patientens alder og vægt. Gene- 20 relt bør dosen være effektiv til at visualisere eller påvise tumorsteder adskilt fra normalt væv. Fortrinsvis vil en en-gangsdosis være på mellem 0,1 til 200 mg af et antistof/mar-kør-konjugat per patient.

25 Eksempler på billeddannelsesmarkører, som kan konjugeres til antistoffet, er velkendte for fagmanden inden for området og omfatter stoffer, som kan påvises ved diagnostisk billeddannelse under anvendelse af en gammascanner eller en håndholdt gammasonde eller positronemissionstomografi eller lignende, 30 som beskrevet i de ovenfor citerede referencer, og stoffer, som kan påvi ses ved kernemagnetisk resonansbilleddannelse under anvendelse af et kernemagnetisk resonansspektrometer eller lignende, som beskrevet i de ovenfor citerede referencer. 1

Egnede eksempler på stoffer, som kan påvises under anvendelse af en gammascanner eller lignende, omfatter f.eks. radioisotoper, såsom 1251, 131l, 123i# Hlln, lO^Rh, ^®3Sm, ®7Cu, 53 DK 173089 B1 67Qa, 16®Ho, l®®Re, l®®Re og ®®mTc. 1^5jf 123if l®3sm og ®®mTc foretrækkes på grund af deres lave energi og egnethed til bredt interval-påvisning.

5 Et eksempel på et stof, som kan påvises under anvendelse af et kernemagnetisk resonansspektrofometer eller lignende er gadolinium (Gd) .

In vivo-cancerbehan d-U-hfl 10

Ved denne fremgangsmåde kan antistof/terapeutisk middel-konju-gatet bringes til carclnomstedet, hvorved carcinomvævet direkte udsættes for det terapeutiske middel.

15 Antistofferne ifølge den foreliggende opfindelse, immunoreak-tive fragmenter eller rekombinanter deraf, kan indgives i en farmaceutisk effektiv mmngde til in vivo-behandling af humane carcinomaer eller metastase deraf. En "farmaceutisk effektiv mængde" af antistoffet, det immunoreaktive fragment eller re-20 kombinanten deraf, konjugeret eller ikke-konjugeret til et terapeutisk middel, betyder, at mængden af nævnte antistoffer i det farmaceutiske middel bør være tilstrækkelig til at give effektiv binding med antigenerne, over for hvilke antistofferne har specifik affinitet. Det farmaceutiske middel kan 25 indgives i en enkelt eller flere doser.

Fremgangsmåder til fremstilling og indgivelse af konjugater af antistoffet, immunoreaktive fragmenter eller rekombinanter deraf og et terapeutisk middel er velkendte eller kan let 30 bestemmes af fagmanden inden for området. Endvidere vil passende doser afhænge af patientens alder og vægt og det anvendte terapeutiske middel og er velkendte eller kan let bestemmes af fagmanden inden for området. Repræsentative protokoller er beskrevet i de nedenfor citerede referencer.

35

Eksempler på konjugater af antistof og terapeutisk middel, som kan anvendes ved terapi, omfatter de følgende: (1) antistoffer 54 DK 173089 B1 koblet til radionuklider, såsom 131l, 80Y, 105Rh, *^Sc, 8?Cu, 212g^( 211 At, 67Ga, 125I, 186Re, l88Re, 177|_Uf 99mxCf 153sm, 123i og lllin som beskrevet f.eks. i Goldenberg, D.M. et al., Cancer Res. 41 , 4354-4360 (1981); Carrasqui1 lo, J.A. et al, 5 Cancer Treat. Rep. 68, 317-328 (1984); Zalcberg, J.R. et al., J. Natl. Cancer Inst. 72, 697-704 (1984); Jones, D.H. et al., Int. J. Cancer 35, 715-720 (1985); Lange, P.H. et al., Surgery 98, 143-150 (1985); Kaltovich, F.A. et al., J. Nuel. Med. 27, 897 (1986), Order, S.E. et al., Int. J. Radiother. Oncol.

10 Biol. Phys. 8, 259-261 (1982), Courtenay-Luck, N. et al., Lancet 1, 1441-1443 (1984) og Ettinger, O.S. et al.. Cancer

Treat. Rep. 66, 289-297 (1982); (2) antistoffer koblet til legemidler eller biologiske reaktionmodifikationsmidler, såsom methotrexat, adriamycin og lymfokiner, såsom interferon, son 15 beskrevet f.eks. i Chabner, B. et al., Cancer, Principles and

Practice of Oncology, Philadelphia, PA, J.B. Lippincott Co. bind 1, side 290-328 (1985); Oldham, R. K. et al., Cancer, Principles and Practice of Oncology, Philadelphia, PA, J.B. Lippincott Co., bind 2, side 2223-2245 (1985); Deguchi, T. et 20 al., Cancer Res. 46, 3751-3755 (1986); Oeguchi, T. et al.,

Fed. Proc. 44, 1684 (1985); Embleton, M.J. et al., Br. J.

Cancer 49, 559-565 (1984) og Pimm, M.V. et al., Cancer

Immunol. Immunother. 12, 125-134 (1982); (3) antistoffer kob let til toksiner, som f.eks. beskrevet i Uhr, J.W. et al., 25 Monoclonal Antibodies and Cancer, Academic Press, Inc., side 85-98 (1983), Vitetta, E.S. et al., Biotechnology and Bio.

Frontiers, udgiver P.H. Abelson, side 73-85 (1984) og Vitetta, E.S. et al., Sci., 219, 644-650 (1983); (4) heterofunktionel 1e antistoffer, f.eks. antistoffer koblet eller forenet med et 30 andet antistof således, at komplekset binder både til card no-met og effektorceller, f.eks. dreberceller, såsom T-celler, som beskrevet f.eks. af Perez, P. et al., J. Exper. Med. 163, 166-178 (1986); og Lau, M.A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.

(USA) 82, 8648-8652 (1985); og (5) native, dvs. ikke-konjuge-35 rede eller ikke-kompleksbundne antistoffer, som beskrevet af f.eks. Herlyn, 0. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79, 4761-4765 (1982), Schulz, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 55 DK 173089 B1 (USA) 80, 5407-5411 (1983); Capone, P.M. et al., Proc. Natl.

Acad. Sci., (USA) 80, 7328-7332 (1983); Sears, H.F. et al., Cancer Res. 45, 5910-5913 (1985); Nepom. G.T. et al., Proc.

Natl. Acad. Sci., (USA) 81, 2884-2867 (1984); Koprowski, H. et 5 al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81, 216-219 (1984) og

Houghton, A.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (USA) 82, 1242-1246 (1985).

Fremgangsmåderne til forening af antistoffet eller antistoflo fragmentet til et ønsket terapeutisk middel, som ovenfor be skrevet, er konventionelle og velkendte inden for området.

F.eks. de metoder, som er anført i de ovenfor angivne referencer.

15 Radioimmunoledet kirurgi

Antistoffer, immunoreakt1ve fragmenter eller rekombinante deraf er vigtige inden for radioimmunoledt kirurgi (RIGS). Ved RIGS, som er en intraoperativ behandling, lokaliseres tumorer 20 og udskcres. Et antistof, som er market med en billeddannelsesmarkør injiceres i patienten og bundet antistof lokaliseres ved hjelp af en håndhaldt gammapåvisningssonde (G0P) og udskæres. Et eksempel på GDP er Neoprobe·, kommercielt tilgængelig fra Neoprobe· Corporation, Tampa, FL. Se Martin et al., 25 "Radioimmunoguided surgery: a new approach to the intraoperative detection of tumor using antibody B72.3", Arner. J. Surg.

156, 386-392 (1988); Martin et al. "Radioimmunoguided surgery: intraoperative use of antibody 17-1A in colorectal cancer", Hybridoma 5, S97-S108 (1986).

30

Indgivelse og påvisning af antistof/bi 1leddannelsesmarkør-kon-jugatet såvel som fremgangsmåder til konjugering af antistoffet til bi 1 leddannelsesmarkøren, opnås ved fremgangsmåder, som er kendte eller let kan bestemmes af fagmanden inden for om-35 rådet, som beskrevet f.eks. ovenfor.

Dosen vil variere afhangig af patientens alder og vægt, men generelt er en engangsdosis på 0,1 til 200 mg antistof/markør- 56 DK 173089 B1 konjugat per patient tilstrækkelig.

De følgende ikke-begrensende eksempler er blot til illustration af konstruktionen og ekspressionen af kimere DNA-sekven-5 ser, som koder for antistofferne ifølge opfindelsen. Alle temperaturer, som ikke er angivet på anden måde, er i Celcius. Alle procentangivelser, som ikke på anden måde er angivet, er efter vegt.

10 Eksempler

Erstatning af konstante muse-regioner CC-antistoffer blev udledt fra mus og er signifikant mindre i 15 stand til at udøve effektorfunktioner, som besiddes af de humane konstante regioner.

I de følgende eksempler er udvalgte antistoffer således "menneskeli ggjorte" ved genetisk at fjerne de konstante regioner i 20 de tunge og lette keder og erstatte dem med deres humane ekvi-va1 enter.

Lette konstante musekederegiongener blev erstattet med det humane kappa-gen (κ-gen), og tunge musekedegener blev erstattet 25 med hver af de fire humane gammaisotyper (γΐ, γ2, γ3 og γ4). Hver af disse fire gammaisotyper har enestående biologiske egenskaber. For et generelt overblik se "The Human IgG subclasses", Hamilton, R.G. (1989) Ooc. No. CB0051-289, Calbio-chem Corporation.

30

Fremstilling af tung og let variabel kederegion Isolering af let CC49-kede 35 CC49-hybridomaceller udskiller et antistof med en tung kede af IgGj-isotype og en kappa let kede.

57 DK 173089 B1

Samlet DNA fra CC49-hybridomaceller, Balb/C-musenyreceller og NSl-plasmacytomaceller blev isoleret ved hjalp af fremgangsmåder, som er anført i Cell; 24, 353-356 (1981).

5 Generelt blev ca. 10-20 pg af det ekstraherede DNA fra hver cellelinie fordøjet til fuldstandighed med 80 enheder Barn HI,

Eco RI, Hind III, Spe I, Xba I, Sac I, Bgl II og Pst I i 50-100 aikroliter af en reaktionsblanding indeholdende den passende reaktionspuffer ved 37*C natten over.

10

Dernast blev det samlede ekstraherede DNA fra hver cellelinie underkastet Southern-hybridiseringsteknik udviklet af E.M. Southern [J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)]. DNA-fragmenterne blev fraktioneret på basis af deres størrelse ved hjalp af 15 elektroforese på en 0,6% agarosegel. De dobbeltstrengede ONA-fragmenter blev modificeret til enkeltstrengede DNA-fragmenter i en alkalisk opløsning, og derefter blev et nitrocellulose-filter anbragt i nar kontakt med gelen til overførsel af de modificerede DNA-segaenter til filteret i narvarelse af en 20 oplosning med høj saltkoncentration.

Hybridisering blev udført under anvendelse af en tilfaldig primet <32P>-market L-kede som sonden.

25 Narmere bestemt var sonden et 1,71 kilobasepar (kbp) Hind III-pst I-fragment Indeholdende kodningsexonerne for de murine JL-regioner (J1-J5) og blev isoleret fra plasmidet pGDl. En nukleotidsekvens af sondefragmentet er anvist i fig. 7. Dette plasmid er beskrevet 1 "Site Directed Cleavage of Immunoglobu-30 Tin Gene Segments by Lymphoid Cell Extracts", Agostaro et al., Can. J. Biochem. Cell. Biol. 63, 969-976 (1985). Plasmidet blev tilvejebragt af NobuaiChi Hozumi og John Roder, Mt. Sinai Research Institute, Toronto, Ontario, Canada.

Til radiomarkning af sonden blev a<32>dCTP leveret fra Arners-ham, Arlington Heights, IL, USA og det tilfældige priming-set blev leveret fra Pharmacia Piscataway, NJ, USA.

58 DK 173089 B1

Signalerne i Southern-overførsler blev visualiseret ved autoradiografi under anvendelse af Kodak X-OHAT® AR-film. Der blev ikke iagttaget noget tydeligvis omlejret bånd. I forhold til standarderne blev der således ikke påvist noget unikt bånd på 5 autoradiogrammet for CC49-DNA'et, som var fordøjet med Hind III. Det kunne imidlertid ikke udelukkes fra Southern-resultaterne, at det omlejrede bånd for L-kaden var maskeret ved et bånd, som vandrede i CC49, Hind III-fordøjet DNA parallelt med båndet, som var et resultat af Hind 111-fordøjelse af museny-10 recelle-DNA (reprasenterende kimlinie-DNA'et). Dette viste sig faktisk at være tilfaldet.

Fremstilling af plasmid indeholdende muse-V^-gener 15 LAMBDA-ZAP®, en lambda-baseret indsattelseskloningsvektor, som er i stand til selv-udskæring, blev leveret fra Stratagene Co., La Jolla, Californien, USA. LAMBDA-ZAP® er beskrevet på siderne 20-21 i Stratagene-kataloget fra 1987. De kohasive ender (cos-ender) af LAMBDA-ZAP® blev ligeret natten over ved 20 at følge fremstillerens protokol.

20 mikrogram af det ligerede LAMBDA-ZAP® blev fordøjet med 5 mikroliter (15 enheder) Spe I, leveret fra New England Biolabs, Inc. Det samlede fordøjelsesvolumen var 100 mikroliter.

25 Efter 55 minutters fordøjelse blev yderligere 6 enheder Spe I tilsat. Efter 70 minutter blev reaktionen standset ved phenol-ekstraktion og ethanolpracipitation, som blev udført efter Stratagene's protokol.

30 Fordøjelse med Spe I-restriktionsenzym resulterer i produktion af "klæbrige ender" ved begge ender. Disse klæbrige ender blev modificeret med T4-DNA-polymerase til dannelse af halv-indfyldte Spe I-klæbrige ender, f.eks. 5'ACT/3'TCATG. For at opnå den halvindfyldte reaktion blev DNA-pelleten, som var 35 opnået ved ethanolpracipitationen ovenfor, opløst i 8 mikroliter vand. Hertil blev sat 2 mikrolitter 10 millimolart dTTP, 2 mikroliter 10 millimolært dCTP, 2 mikroliter af Stratagene's 59 DK 173089 B1 10X 1 igasepuffer, 4 »ikroli ter genioniseret, destilleret vand og 2 mikroliter af et Klenow-fragment fra Bethesda Research Laboratories (BRL). Reaktionen blev udført ved omgivelsernes temperatur i 30 minutter. Reaktionen blev standset ved inakti-5 vering af ONA-polymerasen ved 65*C i 10 minutter.

160 mikrogram totalt CC49-hybr1doma-DNA (indeholdende den lette musekedepromotor og L- og VJ-exonerne) blev fordøjet til fuldstmndighed med Hind III. Fragmenter på mellem ca. 1 kb til 10 ca. 20 kb blev udskåret af 0,8% agarosegeler. DNA’et blev oprenset under anvendelse af GENECLEAN·, som er kommercielt tilgængelig fra BIO 101 (La Jolla, CA, USA).

De totalt CC49-hybridoma-DNA-Hind III-fordøjede fragmenter 15 blev halvfyldte svarende til LAMBOA-ZAP·'s Spe I-fragmenter med den undtagelse, at dATP og dGTP blev anvendt. De halvfyldte Hind III-fordøjede fragmenter frembragte 5'A6CTT/31GAA-klebrige ender, som er forligelige med det Spe I-halvfyldte ir LAMBDA-ZApe-fragment ovenfor.

20

Efter phenolekstraktion og ethanolpræcipitation Ifølge beskrivelserne af Maniatis, blev de totalt CC49-hybridoma-Hind III modificerede og LAMBOA-ZAP· Spe I-modificerede DNA-fragmenter ligeret ved hjælp af T4-DNA-ligase. Ugeringsreaktionen blev 25 foretaget under anvendelse af en 6,1 mikroliter 1igeringsblan-ding indeholdende følgende* ca. 0,2 mikrogram af det totalt CC49-hybridoma-Hind IIl-modicerede 0ΝΑ 1 en 3 mikroliter opløsning, ca. 1 mikrogram af LAMBDA-ZAP· Spe I-modificeret DNA i en 1 mikroliter opløsning, 0,6 mikroliter af Stratagene's 30 10X 1igasepuffer, 0,5 mikroliter 10 millimolcr ATP og 1 mikro liter Stratagene-1igase. Oette blev inkuberet natten over i et vandbad, og temperaturen smnket trinvis fra ca. 18*C til ca. 4*C. Denne ligering fjernede både Hind III- og Spe I-stederne.

35 Et genomt bibliotek af ligeret blanding blev fremstillet efter

Stratagene's protokol. 2 mikroliter af den ovenfor fremstille de ligeringsblanding blev kort beskrevet anvendt i Stråtage- 60 DK 173089 B1 ne's Gigapack Gold-emba11 er ingssystem ifølge retningslinierne fra fremstilleren. Femten 150 mm plader med en densitet på 50.000 plaquer per plade blev screenet ifølge fremstillerens retningslinier for positive kloner ved hybri di ser ing til ni-5 trocel 1ulosef i 1 tre, leveret af Schleicher-Schuel1, Keene, HH, USA. Den <32P>-ti1faldigt markede sonde hidrørende fra pGDl, som er beskrevet ovenfor, blev anvendt til hybridiser i ngen.

Der blev opnået to positive kloner.

10 Hver klon blev p1aqueoprenset, og rekombinerede plasmider (fagemider) af LAMBDA-ZAP® indeholdende den variable CC49-L-kade-region blev opnået ved anvendelse af Stratagene's automatiske udskaringsprotokol. Vektordelen af det opnåede rekom-binerede plasmid benavnes pBLUESCRIPT SK(-) og består af 2964 15 bp som beskrevet i Stratagene's katalog fra 1987. Et plasmid-kort for pBLUESCRIPT SK(-) er vist i fig. 8.

ONA’et fra de to positive kloner blev delvis sekvensbestemt og var identiske. En af klonerne, som blev benavnt pRLIOl, blev 20 anvendt til yderligere undersøgelser.

Restriktionskortlaqninq af let CC49-kade pRLIOl var 7,61 kb, og størrelsen af DNA-indsattelsen blev be-25 stemt ved restriktionsenzymkortlagning til at vare 4,65 kb. Et plasmidkort for pRLIOl er vist i fig. 9. Et restriktionsenzymkort for genomt CC49-L-kade-DNA-indsattelse i pRLIOl er vist i fig. 10.

30 Isolering af let CC83-kades variable region

De fremgangsmåder, som blev anvendt til at isolere let CC83-kæde var i alt vasentligt de, som blev anvendt til at isolere let CC49-kade med den følgende undtagelse.

Et genomt bibliotek indeholdende 7 X 105 plaquer blev screenet under anvendelse som sonden det <32P>-ti 1faldigt markede 1,71 35 61 DK 173089 B1

Hind III-Pst I-fragment hidrørende fra p601, so* ovenfor beskrevet. Oer blev opnået en positiv klon. Den positive klon blev betegnet pRL200.

5 Restriktionskortlrngnino af let CC83-k»de PRL200 var 7,44 kb, og størrelsen af DNA-indsettelsen blev bestemt ved restriktionsenzymkortlcgning til at vmre 4,48 kb. Et plasmidkort for pRL200 er vist i fig. 11. Et restriktionsen-10 zymkort for den genome CC83-L-kede-DNA-1ndsette1se i pRL200 er vist i fig. 12.

Isolering af tuno CC49-kedes variable region 15 Fremgangsmåderne, som blev anvendt til at isolere den tunge CC49-kcde, var i alt vesentligt de, som blev anvendt til at isolere let CC49-kede omfattende screeningen af det samme CC49-Hind III-modificerede DNA.

20 Den til screening af biblioteket anvendte hybridiseringssonde blev dannet ud fra pNP9, som indeholder et 1,98 kbp Eco RI-Bam Hi-fragment indeholdende kodningsexonerne for Jh3 °9 JH4 af den tunge CC49-immunoglobulinkede. Sondefragmentets nukleotid-sekvens er vist i fig. 13. Plasmidet blev leveret af Dr. Nobu-25 michi Hozumi og Or. John Roder, Mt. Sinai Research Institute, Toronto, Ontario, Canada.

Et genomt bibliotek Indeholdende 9,5 X 105 plaquer blev scree-net, hvorfra der blev opnået en positiv klon. Den positive 30 klon blev benevnt pHH49.

Restriktionskortlmoning af tuno CC49-kede pHH49 var ca. 7,0 kb, og størrelsen af DNA-indsettelsen blev 35 bestemt ved restriktionsenzymkortlmgning til at vmre ca. 4,0 kb. Et plasmidkort for pHH49 er vist i fig. 14.

62 DK 173089 B1

Isolering af tung CC83-kmde variabel region

Fremgangsmåden, som blev anvendt til at isolere tung CC83-ka-de, var i alt væsentligt de, som blev anvendt til at isolere 5 tung CC49-k*de med de følgende undtagelser.

Ca. 13 mikrogram af ligeret LAMBOA-ZAP*-vektor-DNA blev fordøjet med 12 enheder Spe I, leveret fra New England Biolabs, Inc., i 1 alt 100 mikroliter af en passende puffer. LAMB-10 DA-ZAP* blev fordøjet ved 37*C i 1 time. Reaktionsblandingen blev phenolekstraheret og ethanolpræcipiteret som ifølge Stra-tegene's protokol. Det Spe I-fordøjede LAMBDA-ZAP· blev de-phosphoryleret ifølge fremgangsmåderne, som er anført i Mania-tis bortset fra, at der blev anvendt 40 gange overskud af 15 alkalisk kalvetarmphosphatase (Boehringer Hannheim, Indianapolis, IN, USA).

DNA fra CC83 blev fordøjet til fulstmndighed med Spe I. Fragmenter på mellem ca. 3 kb til ca. 40 kb blev isoleret fra et 20 0,8% agarosegelstykke ved elektroeluering, som beskrevet af

Maniatis og ligeret med den dephosphorylerede Spe I-skårne LAMBDA-ZAP·-vektor.

Et genomt bibliotek indeholdende 5 X 105 plaquer blev screenet 25 under anvendelse af sonden dannet ud fra pNP9, hvis sekvens er anført i fig. 13. Der blev opnået en positiv klon. Den positive klon blev benævnt pHS83.

Restriktionskortleanina af tung CC83-kxde 30 pHS83 var 7,95 kb, og størrelsen af ONA-indsettelsen blev bestemt ved restriktionsenzymkortlsgning til at vsre ca. 5 kb.

Et plasmidkort for pHS83 er vist i fig. 15.

35 63 DK 173089 B1

Sekvensbestemmelse af CC46-, CC49-, CC83- oa CC92-mRNA

Totalt RNA fra ca. 1 X 10? CC49-celler, som var frosset ved -70*c, blev ekstraheret 1 alt vesentligt so« beskrevet af S Mani at i s med de følgende undtagelser. Fire «olar guanidinium-isothiocyanat og 2,5 «olar natriumcitrat, pH-vardl 7,0, og en SW40Ti-rotor centrifugeret ved 31.000 o/« blev anvendt.

I alt 2,7 mg CC49-RNA blev isoleret. Efter centrifugering blev 10 poly A+ mRNA oprenset ud fra ca. 1,66 ng RNA ved oligo(dT)-cellulosekromatografi under anvendelse af type 3 oligo(dT)-cellulose, leveret fra Collaborative Research, Inc., Bedford, MA, USA. Fremgangsmåden var som beskrevet af Aviv og Leder, Proc. Nat * 1. Acad. Sci. (USA) 69, 1406 (1972). Oer blev 1 alt 15 opnået 50,24 pg poly A·*· mRNA fra 1,68 mg mRNA.

I alt 3,82 mg CC83-RNA blev Isoleret fra ca. 1 X 107 celler. I alt 54,6 pg poly A+ mRNA blev isoleret fra 1,91 mg totalt RNA.

20 I alt 0,814 mg CC92-RNA blev isoleret fra ca. 2,6 X 10® cel ler. I alt 41,88 mikrogran poly A+ RNA blev isoleret fra 0,814 mg totalt RNA.

I alt 1,7 mg CC46-RNA blev isoleret ud fra ca. 2,89 X 10® cel-25 ler. I alt 68,88 mikrogram poly A+ RNA blev isoleret fra 1,7 mg totalt RNA.

Syntetiske oligonukleotidprimere blev syntetiseret under anvendelse af et ONA-synteteapparat fra Applied Biosystems 30 (Applied Biosystems (ABI), Foster City, CA, USA) Model 360 A ved phosphoramadit-baseret kemi som specificeret af ABI. Oli-gonukleotiderne blev oprenset, som specificeret af fremstilleren, efter elektroforese på en 20* polyacrylamidgel indeholdende 7M urinstof. 01igonukleotidkoncentrat ioner blev bestemt 35 spektrofotometrisk ved en optisk densitet på 260 nm, hvor 1 00 260 nm enhed er lig med 33 pg/ml enkeltstrenget DNA.

64 DK 173089 B1

De følgende oligonukleotidprimere blev fremst illet til mRNA-sekvensbestemme 1 se: (1) Der blev anvendt til bestemmelse af den 3'-meste mRNA-sekvens i den lette kædes variable region for de lette CC49-, CC83- og CC92-kæder, Kj_ (-), en 22-mer: 5 5'-GGAAGATGGAT ACAGTTG6TGC-3' komplementær til kodningssekvensen for 5’-enden af den konstante region for muse immunoglobulinkappakæder.

10

Endvidere blev der anvendt, til bestemmelse af den resterende sekvens for let CC49-k*de, 49FR1(-), en 17-mer: 51-GGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3’.

15

Endvidere blev der anvendt til bestemmelse af den resterende sekvens for let CC83-kæde, J4(-), en 24-mer: 5'-CCAACTTTGTCCCCGAGCCGAACG-3' 20 og også 83L CDR2(-), en 17-mer: 5'-CAGGGACTCCAGTGTGC-3'.

25 Endvidere blev der anvendt til bestemmelse af den resterende sekvens for let CC92-kæde, J5(-): 5'-CGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3'.

30 For tunge CC46-, CC49-, CC83- og CC92-yl-kæder, CHl(-), en 24-mer: 51-ATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAGAT-3’ 35 komplementær til kodningsekvensen af 5'-enden af den murine γΐ-tunge kædes konstante region. CHl(-) 24-meren anvendes til at bestemme den 3'-meste mRNA-sekvens af tung kædes variable regioner.

65 DK 173089 B1

Endvidere blev der anvendt til bestemmelse af den resterende sekvens for den tunge CC49-kade, JH4(-)-20-mer: 5'-GGTGACTGAG6TTCCTTGAC-3'.

5

Endvidere blev der anvendt til bestemmelse af den resterende sekvens for den tunge CC83-kade, JH2(-)-16-mer: 51-CTGA6GAGACTGTGAG-3'.

10

Endvidere blev der anvendt til bestemmelse af den resterende sekvens for den tunge CC92-kade og den tunge B72.3-kade, B72.3/CC92 HC-20-mer: 15 5'-CCTTGAACTTCTCATTGTAC-3'.

0e følgende fremgangsmåder blev udført som anført af Jan Gel-liebter i BRL FOCUS 9, 1 (19B7).

20 01igonukleotidprimererne blev endemarket på følgende måde: 100 ng oligonukleotid blev forenet i 50 mM Tris HC1 (pH-vardi 8), 10 mM MgCl2« 5 mM dithiothreitol og 1 mM spermidin, 100 pCi (γ.32ρ) ATP (Amersham, 5000 Ci/mmol) og 7 enheder T4-polynu-kleotid-kinase i et volumen på 13 μΐ. Reaktionen fik lov til 25 at foregå ved 37*C i 30 minutter, derefter blev der opvarmet i 5 minutter ved 65*C for at inaktivere kinasen og derefter blev 7 μΐ vand tilsat til opnåelse af en koncentration på 5 ng/μΐ.

De markede primere blev lagret ved -20*C, indtil der var brug for dem.

30

Separate prøver hver indeholdende ca. 13 mikrogram poly(A)+ mRNA af henholdsvis CC49, CC83, CC92 eller CC46 blev gensuspenderet i 10 μΐ sammenføjningspuffer [10 mM Tris HCl (pH-vardi 8,3), og 250 mM KC1J.

En 5 ng prøve af ende-mmrket oligonukleotidprimer blev sat til hver mRNA-prøve, opvarmet til 80*C i 3 minutter og sammenføjet 35 66 DK 173089 B1 i 45 minutter ved 61*C, for K|_ (-) — og 65*C for CH1(-)-oligo-nukleoti derne. AMV omvendt transkriptase (Boehringer Mannheim) blev anvendt i en mængde på 6 enheder for hver mRNA-sekvens-bestemmelsesreaktion. Resten af sekvensbestemmelsen blev ud> 5 ført som anført i BRL FOCUS 9, 1 (1987).

Indledningsvise sekvensdata viste, at de tunge og lette kæder var omlejret på følgende måde: CC49-kappa-let-kæde anvendte en J5; CC49-yl-tung-kæde anvendte en J^A; CC83-let-kæde anvendte 10 en J 4; CC83-gamma-l anvendte en Jh2. CC46-kappa-let-kade anvendte en J2; CC46-tung-kæde anvendte en Jh3· CC92-let-kæde anvendte en J5; CC92-gamma-l anvendte en 3^2.

Fig. 16 viser nukl eot idsekvensen af CC49 V^, idet de under- 15 stregede segmenter viser sekvenserne udledt under anvendelse af oligonukleotidprimere på mRNA.

Fig. 17 viser nukleotidsekvensen af CC83 V^, idet de understregede segmenter viser sekvenserne udledt under anvendelse 20 af oligonukleotidprimere på mRNA.

Hele nukleotidsekvenserne CC46 og CC92 V^, som er vist i fig. 2, blev udledt under anvendelse af oligonukleotidprimere på mRNA.

25

Fig. 4a viser nukleot idsekvensen af CC49 Vl, idet de understregede segmenter viser sekvenserne udledt under anvendelse af oligonukleotidprimere på mRNA.

30 Fig. 5a viser nuk 1 eot i dsekvensen af CC83 Vl, idet de understregede segmenter viser sekvenserne udledt under anvendelse af oligonukleotidprimere på mRNA.

Hele nuk1eotidsekvensen af CC92 VL, som er vist i fig. 6, blev 35 udledt under anvendelse af oligonukleotidprimere på mRNA.

67 DK 173089 B1

Proteinsekvens

Oprensede murine CC49- og CC63-immunoglobulinmolekyler blev sendt til Or. George Tarr hos the University of Michigan Pro-5 tein sequencing-afdeling for NH2-ter*inal aminosyresekvens-analyse. Or. Tarr anvendte Edman-nedbrydningsmetoden, son modificeret af Tarr, G.E., i "Manual Edman Sequencing System", Microcharacterization of Polypeptides: A Practical Manual [John E. Shively, udgiver. Human Press, Inc., Clifton, N.J., 10 side 155-194 (1986)]. Kort beskrevet reducerede og alkylerede Dr. Tarr immunoglobulinmoleky1 erne. De lette og tunge keder fra immunoglobulinmolekylerne blev adskilt ved omvendt fase-HPLC.

15 Fig. 4b viser aminosyresekvensen for CC49 VL, idet resultaterne fra aminosyresekvensbestemmelsen for de første 24 aminosyrer af fuldt udviklet CC49 V|_ er understregne. Fig. 5b viser aminosyresekvensen for CC83 V|_, idet resultaterne for aminosyresekvensbestemmelsen for de første 51 aminosyrer af det 20 fuldt udviklede CC83 er understregne. ASN-20 kunne ikke bestemmes i den lette CC83-kæde på grund af tilstedeværelsen af N-koblede carbohydratrester i denne position, hvilket er vist i PNGaseF-forsøget nedenfor. En sekvens Asn-Ile-Thr svarer til consensussekvensen Asn-X-Thr/Ser for carbohydratved-25 hæftning til Asn.

Da de tunge keder fra immunoglobul i ner CC49 og CC83 er blokeret ved N-enden og utilgængelig for aminosyresekvensbestem-melse blev det native glycopeptid behandlet med cyanogenbromid 30 (CNBr) til kløvning af methioninresterne. Kløvningen resulterede i fragmenter, som blev oprenset ved omvendt fase-HPLC. N-terminal aminosyresekvensbestemmelse blev udført på CNBr-frag-menterne.

35 Resultaterne af aminosyrebestemmelsen af et af CC49 VH CNBr-peptidfragmenterne er vist som understregede rester i fig. ie. Resultaterne fra aminosyrebestemmelsen af et af CC83 VH CNBr- 68 DK 173089 B1 peptidfragmenterne er vist som understregede rester i fig. 19.

Som med CC49 svarer alle andre peptidsekvenser til CNBr-frag-menter hidrørende fra den konstante region i muse-γΐ.

5 Bestemmelse af N-koblet carbohvdrat p& CC83-L-kade

Dette forsøg blev udført for at bekrafte, at der er et N-koblet carbohydrat forbundet til den lette CC83-kade formodentlig ved ASN-20 (se fig. 5b). Enzymet glycopeptidase F (PNGase F), 10 som er isoleret fra kulturfiltratet af Flavobacterium meningo-septicum (Tarentino, A. L. et al.. Biochemistry 24, 4665-4671 (1985)] vil kløve højmannose og/eller biantennare komplekse sukkere N-koblet til ASN til dannelse af en fri carbohydrat-struktur og en ASP-rest fra ASN, hvortil den var forbundet.

15 Forskel i molekylvagt mellem den glycosylerede og ikke-glyco-sylerede form for det samme peptid kan bestemmes ved SDS-PAGE.

Reaktioner med 12 mikrogram med og uden PNGase F (Boehringer Hannheim, Indianapolis, IN, USA) for de oprensede murine anti-20 stoffer CC49, CC83 og CC11 F(ab')2 (en positiv kontrol) blev udført i et vandigt si ut reakt ionsvolumen på 40 mikroliter. 4 mikroliter 10 x puffer (1M kaliumphosphat, 0,1M dinatrium- EDTA, pH-vardi 7,4) blev sat til hver reaktionsblanding. Til de rør betegnet "med PNGase F" blev 7,5 mikroliter PNGase F 25 også tilsat, og alle rør blev inkuberet ved 37*C i 1 time. Til reaktionsrørene blev sat 40 mikroliter Laemmli 2X prøvefortyndingspuffer indeholdende Ø-mereaptoethanol. En 10% SDS-poly-acrylamidgel blev elektroforeseret, gelen plettet med coomas-sie Brilliant Blue R-250 og afplettet. Fig. 20 viser resulta-30 terne. Som vist i bane 2 forekommer et nyt bånd (*) i den PNGase F-behandlede CC83-prøve, men ikke i den ikke-behandlede CC83prøve (bane 3). Oet nye bånd har en molekylvagt på ca. 2000-3000 mindre end det native lette kadebånd, som reprasen-terer fjernelsen af en N-koblet carbohydratdel. Oet eneste 35 consensusglycosyleringssted for den lette CC83-kade er ved ASN 20, så det antages ved følgeslutning heraf, at dette er det faktiske sted for glycosylering, og dette er hvorfor det ikke 69 DK 173089 B1 viste sig ved N-terminalsekvensanalyse af de lette CC83-k*der, son ASN. Den lette CC49-kæde ændrer ikke mobiliteten, når behandlet ned PNGase F (bane 6), nen der iagttages et nyt bånd for det tunge kndefragment af CC11 F(ab’)2 (bane 4*), son tje-5 ner som en positiv kontrol. mRNA-sekvensdata for tung CCll-kæ-de viser et consensusglycosyleringssted i V-omr&det (resultater ikke vist). Standarderne (bane 1) er bovint serumalbumin (8SA), molvegt 6Θ.000 og sojabønnetrypsininhibitor (STI), molvegt 21.500.

10 DNA-sekvens

Plasmid-DNA blev sekvensbestemt direkte under anvendelse af Sequenase DNA-sekvensbestenmelsessættet, leveret af United 15 States Biochemical (USB), Cleveland, OH, USA. USB’s protokol blev fulgt til sekvensbestemmelse af dobbeltstrenget ONA. DNA'et af hver variabel region blev sekvensbestemt under anvendelse af Jh- eller J^-oligo bestemt ud fra mRNA-sekvens-1 nformat ionen at vare specifik for hvert produktivt omlejret 20 henholdsvis tungt kadegen eller let kedegen.

Efter at de indledningsvise sekvenser var bestemt, blev sekvensen forlænget yderligere ved anvendelse af yderligere pri-mere. De yderligere prinere blev syntetiseret under anvendelse 25 af information samlet fra de tidligere dannede sekvenser.

Under anvendelse af den ovenfor nævnte teknik blev DNA-se-kvenserne af CC49’s og CCSS's hele tunge kædes variable re-gionexoner og lette kædes variable regionexoner. DNA-sekvensen 30 blev samlet og analyseret under anvendelse af Hitachi's 0NA-sekvensanalysesoftwareprogram ONASIS*.

De følgende oligonukleotidprlmere blev fremstillet til DNA-se-kvensbestenmel se: 1 35

For begge lette kæder, Cic-intron(-): 70 DK 173089 B1 5 ' -GAAAACCTGTGTCTTACAC 3' .

(2) For CC49 let kæde, CC49 FRI(+): 5 5·-GTACCTGTGGGGACATTG 3', og JK5(-)-23-»er S'CGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-S'.

10 (3) For CC83 let kæde, CC83 CDR2(-): 5'-CAGGGACTCCAGTGTGC 3', 15 CC83 L-intron (-): S'GACTTCAAGATACAAATGTTAG-S', og JK4(-)-20-mer: 20 5'-CCAACTTTGTCCCCGAGCCGAACG.

De fuldstændige nukleot idsekvenser for CC49 Vl og CC83 Vj_ er vist i henholdsvis figurerne 4a og 5a.

25

For CC49 tung kæde, J^4 {-)-20-mer: 5'GGTGACTGAGGTTCCTTGAC-31 , 30 og J^-intron (-): 5'-GCAATGCTCAGAAAACTCC.

For CC83 tung kæde, JH2{-)-16-mer: 5'CTGAGGAGACTGTGAG-3' 35 71 DK 173089 B1 og Jh2-intron(-): 5*-GCAGTAAAATCTATCTAAGCTG.

5 Derefter blev sekvensbestemmelsen af hver tung kede forlenget med de følgende sekvensers CC49/83 HC/5'(+) 5' -GCACTGCTCATGATATGCAAATC-3'; 10 CC49/83 HC/5'(-) 5 ’ -GATTTGCATATCAT6AGCAGTGC-3 ' og CC49/83 H-k*de FRI(-) 15 5’-CTCAGCGTCAGACTQCTG-3’.

De fuldstendige nukleotidsekvenser for CC49 Vh og CC83 Vh er vist i fig. 2.

20

Der blev foretaget sammenligninger mellem den karakteriserede mRNA-sekvens og den karakteriserede DNA-sekvens og mellem den karakteriserede aminosyresekvens med aminosyresekvensen forud-sagt fra DNA-sekvensen. Baseret på disse sammenligninger blev 25 plasmidklonerne identificeret at indeholde den korrekte DNA-sekvens for kodning af CC49 og CC83 tung og let kedes variable regioner.

De forudsagte aminosyresekvenser fra nukleotidsekvenserne af 30 den tunge kedes variable regioner af CC49 og CC83 som vist 1 fig. 2 viser omfattende sekvenslighed overalt 1 skeletregionerne og hypervariable regioner 1 og 2. Hypervarlabel region 3 er ganske forskellig mellem de to på grund af rekombineringen af Vn-regionen med forskellige D- og Jn-sekvenser, idet at 35 CC49 yl tung kede anvendte en ·>η* og CC83 gamma 1 anvendte en J«2.

72 DK 173089 B1

Den omfattende DNA-sekvenshomologi 5' for kodningsregionerne i CC49 og CC83 tung kædes variable regiongener, viser at de to tunge kæders variable regiongener hidrører fra de samme kim-1inieexoner.

5

Isolering af V^aTAG, kimlinieforstadiegen for den tunge kede af CC46. CC49. CC83 og CC92

Fremgangsmåderne, som blev anvendt til at isolere kimliniefor-10 stadiegenet for de tunge kæders variable regioner af CC46, CC49, CC83 og CC92 var i alt væsentligt de samme, som blev anvendt til at isolere CC49 tung kædes variable region bortset fra, at DNA’et, som blev anvendt til at danne LAMBOA-ZAP*-bib-lioteket, kom fra en irrelevant hybridomacelleli nie (dvs. en 15 cellelinie, som fremstiller antistoffer, som ikke væsentligt binder til TAG72). Et genombibliotek indeholdende ca. 900.000 plaquer blev screenet, hvorfra der blev Isoleret en positiv klon. Den positive klon blev bensvnt pV^aTAG. pV^aTAG var ea.

5,2 kb, og størrelsen af DNA-indsættelsen blev bestemt ved re-20 striktionsenzymkortlægning til at vmre ca. 2,2 kb.

DNA-sekvens af VHaTAG

De følgende oligonukleotidprimere blev anvendt til bestemmelse 25 af DNA-sekvensen af VHaTAG: B72.3/CC92 HC-20-mer: 5'-CCTTGAACTTCTCATTGTAC-3·; CC49/CC83 HC 5 1 ( + ) = 5 ’-GCACTGCTCATGATATGCAAATC-3’ ; CC49/CC83 HC S 1(-> s 5'-GATTTGCATATCATGAGCAGTGC-3'; 30 VHaTAG IVS ( + ): 5 '-CTAAAGTGGAGTCAGGGCCTG-3'; VHaTAG IVS {-): 5'-CAGGCCCTGACTCCACTTTAG-3*; VHaTAG CDR2 { + ): 5'-GAATGGATTGGATATATTTCTC-3'.

Den fuldstcndige nukleotidsekvens af V^gaTAG er vist i fig. 2.

35 73 DK 173089 B1

Isolering af humane tunge konstante gener

Plasmidkonstruktioner indeholdende de forskellige humane tunge kæders konstante regioner (pyl, py2, py3 og py4) blev leveret 5 af Dr. Ilan R. Kirsch fra the National Cancer Institute, Bethesda, Maryland.

Restriktionsenzymkortlægning blev udført på disse gener til bekræftelse af deres identitet. Restriktionskort for de humane 10 konstante regioner er vist 1 fig. 21.

Kimær let kæde

Murin CC49 V-reqion 15

Hind IH-stedet i det genome lette CC49-kæde-DNA lokaliseret i den murine intronregion mellem J5 og Ck (se Max, Edward E. et al., J. Biol. Chem. 256, 5116 (1961)) blev mistet ved klo ningsproceduren, hvor halv-indfyldte Hind III-steder blev 20 ligeret til halv-indfyldte Spe I-steder i LAMBDA-ZAP-vektoren. Plasmidet pRLIOl (fig. 9) bar denne modifikation.

Intron-Hind III-stedet blev regenereret som beskrevet i trinnene nedenfor for at muliggøre, at et humant kimlinie-Hind 25 III-Bam HI-kappa-let-kæde-DNA-fragraent (se Hieter, P. et al., J. Biol. Chem. 257, 1516 (1982)) kunne ligeres til den murine variable region direkte. Alle trin blev udført under anvendelse af standardmolekylbiologiteknikker, som er familiære for fagmanden inden for området, og kan findes i manualer, såsom 30 Maniatis.

Et 1,69 kb Bam HI-Pst I-fragment isoleres fra pRLIOl, som beskrevet supra. Et 2,96 kb Barn HI-Pst I-fragment isoleres fra pBluescript SK(-) (leveret fra Stratagene), beskrevet supra.

35 Oe to fragmenter ligeres derefter, og pRL103 nedenfor isoleres .

74 DK 173089 B1 /χ jHinddi / pfltrca js I 4.S5 kb

BamHI I

Plasmid pGDl (beskrevet supra) blev fordøjet med PstI- og 15 HindllI-restriktionsenzymer til opnåelse af det nedvend i ge 1,03 kb intro-holdige fragment, og pRL103 blev også fordøjet med PstI- og Hindlll-restriktionsenzymer til fjernelse af det lille DNA-fragment i polykobleren .

20 De opnåede fragmenter blev ligeret med T4-DNA-1igase til frembringelse af et 5,68 kb plasmid benævnt pRL104. Et delvis restriktionskort for pGDl og pRL104 er vist nedenfor.

25 30 35 75 DK 173089 B1 I pQ01 Iff·* I t0.788bp U—ρ„ι 10 XSv Hindlll

Ck 15 / pRLt04 \\

L

25

Human C)(-region

Plasmid phum Cg blev leveret fra Or. John Roder, Mt Sinai 30 Research Institute, Toronto, Ontario, Canada. Plasmidet hidrører fra pBR322 med et 12 kb Barn Hi-fragment indeholdende det humane Cg-exon indsat deri. pBR322 er beskrevet på side 171 i Stratagene-kataloget fra 1987. 12 kb Barn HI-fragmentrestrik- tionskortet er vist nedenfor [fra Heiter, P. et al., J. Biol.

35 Chem 257, 1516 (1982)].

76 DK 173089 B1 phumCk

Hindlll pHI \n enhancer ^

I-Milt .I I

Ck 10

Plasmidet phum Ck blev fordøjet med Hind III- og Barn Hl-re-striktionsenzymer til opnåelse af et 5,0 kb fragment indeholdende det humane 0κ~βχοη. pRL104 blev fordøjet med Fsp I- og 15 Hind III-restriktionsenzymer til opnåelse af et 4,2 kb fragment indeholdende de muse-let kædes variable exoner af CC49.

De to opnåede fragmenter blev forbundet med T4-0NA-1igase til frembringelse af et 9,2 kb fragment blandt blandingen af op-20 nåede fragmenter. Denne blanding blev fordøjet med Barn HI til opnåelse af en 7,7 kb Bam HI CC49 L-kæde kimær konstruktion med Bam Hi-klæbrige ender, som indeholder både de variable muse-regionexoner og det humane konstante region (kappa) exon.

Disse konstruktioner udnytter de humane fremmersekvenser og de 25 murine promotorsekvenser.

Det kimære Bam Hi-fragment indeholdende både de murine let kædes variable regionexoner (L og VJ) og det humane konstante region kappa (κ) exon blev ligeret ind i Bam ΗΙ-stedet plas-30 midet pSV2neo (5,6 kb), et pBR322-afledt plasmid indeholdende det selekterbare markørgen neo (leveret fra ATCC). Tilstedeværelsen af det aktive neogen gør en celle modstandsdygtig over for vækstinhibering med Geneticin, et neomycinlignende lægemiddel også kaldet G418.

Det kimære Bam Hi-fragment blev indsat i pSV2neo i begge retninger, som vist nedenfor. Begge transkriptionelle retninger 35 77 DK 173089 B1 af det kimare lette kadegen i forhold til neogenet blev konstrueret. Plasmid pSV2neo blev lineariseret ved Bam Hi-stedet, dephosphory1eret (ifølge fremgangsmiderne anført i Maniatis) under anvendelse af alkalisk kalvetarmphosphatase (til mod-5 virkning af selv-1igering) og ligeret med kimare CC49 l-kede Bam ΗΙ-fragmenter fra ovenfor.

a«»_|6ooW .BådiHi

I pRLISO I

η·ο II 1X5kb I

BamHI

VJ5 pm 20

»"» I8»" .BamHI

25 / ^L5p- n#<3 f PW.105 i i 13.5 Kb 1 ^ U—Hindlll

BamHI Ck 0e transkriptionel le retninger af neogenet og den CC49-kimære lette kåde er vist ved pile i pRL150 og pRL105. Delene hidrø-35 rende fra pSV2neo er vist. Oisse plasmider blev oprenset i stor målestok fra preparativ skala fermentering (1,0L) af E. coli-kloner replikerende hver af plasmiderne. De oprensede 78 DK 173089 B1 plasmider blev anvendt til at indføre den kimære CC49-lette kåde i SP2/0 p1asmacytomace11 er soro nedenfor beskrevet.

Murin CC83 V^-region og huwan CR-region 5

Hind III-stedet i pRL200, som var mistet ved kloningsprocessen af CC83-let kæde blev regenereret af den samme grund soro for den kimære lette CC49-kædekonstrukti on. Regenereringen blev opn&et på følgende måde. Plasmidet pRL200 blev lineariseret 10 ved et unikt Nhe I-sted f og begge dets klæbrige ender blev omdannet til stumpede ender ved indfyldning med dNTP’er og DNA-polymerase I. En Barn HI-phosphoryleret kobler (leveret fra New England Biolabs) blev ligeret til det indfyldte sted. Det nye plasmid benævnes pRL201 og er vist nedenfor.

15 —.

^ ~·"·«^/ Soe,/HindM

pRL201 |

7.45 kb I

Hindlll \ Spei Nh,*/8amHl

Prt/

J5 J4 V

2,5 kb Bam HI-Pst I-fragmentet fra pRL201 indeholdende den lette CC83-kades variable genome region-DNA blev hensigtsmæs-30 sigt ligeret til 4 kb Bam HI-Pst I-vektorfragmentet fra pRL104, som var beskrevet tidligere ved de lette CC49-kædekon-struktioner, og som allerede havde det Hind III-bærende in-tronfragment. Det nye plasmid benævnes pRL202 og er vist nedenfor .

35 79 DK 173089 B1 ^ i j Fspf /Hindi« P«L202 \\ S.Skt I] \ /‘"-Pai

BamHl J5

L V

Det ca. 5,05 kb Fsp I-Hind Hi-fragment fra pRL202 blev iso-15 leret og ligeret med det humane Cj(-holdige 5,0 kb Hind III-BamHI-fragment allerede beskrevet for den kimære lette CC49-kædekonstruktion. Dannelsen af den lette CC83-kædevektor blev udført fra dette punkt på en måde identisk med den, som blev udført for den lette CC49-kæde. Den opnåede 8,5 kb Bam HI

20 kimære CC83 lette kædekonstruktion blev også ligeret til pSV2-neoBam HI (phosphataseret) og plasmider med begge mulige retninger af indsættelsen blev opnået som vist i diagramform nedenfor.

25 30 3 5 80 DK 173089 B1 jEcofll Hl n*o [ij P8L203 1

ri ’<3 te I

10 Ba^HI fy

v J4 JS

15 ^ I8"* , \ n«o PW30

20 M ’<3te J

V Γ V __/ 25

Oe transkriptionelle retninger af neo-genet og den kimære lette CC83-kæde er vist ved pile i pRL203 og pRL230. Disse plasmider blev oprenset i stor målestok ud fra præparativ 30 skala fermentering (1,0 1) i en kommerciel inkubator af E.

coli-kloner replikerende hver af plasmiderne. De oprensede plasmider blev anvendt til at indføre den kimære lette CC83-kæde i Sp2/0 piasmacytomacel1 er, som beskrevet senere.

35 Alle fire af de kimare lette kadeplasmidkonstruktioner (pRL105, pRLl50, pRL203 og pRL230) kan lineariseres ved fordøjelse med restriktionsenzymet Aat II. Aat Il-stedet i plas- DK 173089 Bl 81 miderne er i en region, som ikke er væsentlig for ekspressionen af det kimære lette kædegen eller det selekterbare markørgen, neo.

5 Kimære tunge kæder

Humane konstante gamna-genexoner PIasmidvektoren, som blev anvendt til at bære de kimære tunge 10 kædekonstruktioner betegnes pSV2gpt anført i Mulligan og Berg, "Selection of animal cells that express the E. coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78(4), 2072-2076 (1982). pSV2gpt er et pBR322-afledt plasmid indeholdende det selekterbare markørgen, 15 guaninphosphoribosyltransferase (gpt), som kan anvendes til selektiv vækst i medier Indeholdende mycophenolsyre. Til fremstilling af pSVgpt som en modtager for de humane Cyl-, Cy2-, Cy3-, Cy4-exoner, blev det fordøjet ned Eco RI og Barn HI. Det fordøjede DNA blev fraktioneret på en 4% polyacrylamidgel og 20 4,5 kb vektorfragmentet blev udvundet fra gelen ved elektro- eluering, som beskrevet i Maniatis. Dette 1iniariserede plasmid blev betegnet p$V2gpt/R/B, et plasmidkort er vist i fig.

22. Det er i stand til at acceptere Eco RI-Bam Hi-afsluttede fragmenter.

25 5' Hind III-stederne, son er til stede på de humane konstante IgGl-regionfragnenter, blev omdannet til Eco Ri-steder til direkte kloning ind i Eco Ri-stedet i pSV2-gpt. Til yl, y2, y3 og y4 blev Eco Rl-stedet i vektor pBR322 anvendt.

30

Cyl

Fragmentet indeholdende Cyl-exoner blev opnået ved fordøjelse og 1iniarisering af pyl ned Hind III efterfulgt af indfyldning 35 af de Hind Ill-klebrige ender under anvendelse af alle fire dNTP'er og Klenow-fragnentet af DNA-polymerase for at gøre Hind III-enderne stumpede. En Eco Ri-kobler blev ligeret til 82 DK 173089 B1 de stumpede ender til erstatning af Hind III-stedet med et Eco Ri-sted. Denne konstruktion blev derefter fordøjet med Eco RI og Bam HI til frigørelse af et 7,8 kb fragment indeholdende Cyl-exonerne. Dette fragment blev benævnt Cyl-7,8 kb.

5

Fragmentet blev hver ligeret ind i Eco RI-Bam Hi-stederne i pSV2-gpt/R/B. Denne vektorudformning (pSV2-gpt-yl-7,2) muliggør, at der indsættes et hvilket som helst murint tung kæde-variabelt regiongen (med Eco Ri-ender) i Eco Ri-stedet i de 10 humane tunge IgG-kædevektorer. Nærmere bestemt blev 125 ng af det humane Cyl-7,8 kb fragment ligeret til 100 ng af den 1 ini ar i serede pSV2gpt/R/B-vektor i et volumen på 10 μΐ under anvendelse af 400 enheder T4-DNA-1 i gase (leveret fra New England Biolabs). Frosne kompetente E. coli DHl-celler fra 15 Invitrogen (San Diego, CA) blev transformeret med en ligeringsreaktions ifølge Invitrogen's protokol. Det opnåede plasmid blev betegnet pSV2gptyl-7,8. Et plasmidkort for pSV2gptyl-7,8 er vist i fig. 23.

20 Endvidere blev et andet kortere fragment indeholdende Cyl-exo-nerne dannet. Bekymringerne angående den samlede størrelse af den kimære tunge kædevektor med et 7,8 kb Cyl-fragment, en 4,8 kb pSV2-gpt/R/8-vektor og en variabel CC49-region på 1,9 kb (i alt = 14,2 kb) fremkaldte behovet for at reducere den store 25 størrelse af 7,8 kb Cyl-Eco RI-Bam ΗΙ-fragmentet. Kodnings-regionen på 7,8 kb Cyl optager kun den første tredjedel af 5’-enden af fragmentet.

Størrelsesreduktion blev udført ved omdannelse af et nedstrøms 30 Pvu Il-sted til et Bam ΗΙ-sted ved stumpendet addition af en Bam ΗΙ-kobler. Hind III-stedet i py-1 blev omdannet til et Eco Ri-sted ved fordøjelse af py-1 med Hind III, indfyldning af 3'-enden til dannelse af en stumpet ende og addition af Eco Ri-koblere, som ovenfor. Pvu Il-stedet 2,3 kb nedstrøms blev 35 omdannet til et Bam ΗΙ-sted ved efterfølgende fordøjelse med Pvu II og ligering af Bam Hi-koblere direkte til de stumpe Pvu Il-ender. Denne konstruktion blev derefter fordøjet med Eco RI

83 DK 173089 B1 og Bam HI til frigørelse af et 2,3 kb fragment indeholdende Cyl-exonerne. Det afkortede Eco RI-Bam Hi-fragment (2,3 kb) indeholder stadig yl-exonerne og 3 ' -polyadenyler ingssekvensen . Dette reducerer den samlede vektorstørrelse med 5,5 kb, hvil·* 5 ket gør den samlede konstruktion mere håndterlig (i alt s 8,7 kb) .

Ca. 200 ng af det humane Cyl 2,3 kb fragment blev ligeret til 100 ng af den 1 iniariserede plasmid-pSV2gpt/R/B-vektor i et 10 volumen på 10 μΐ under anvendelse af 400 enheder T4-DNA-1igase (New England Biolabs). Frosne kompetente E. coli-celler, leveret fra Invitrogen, blev transformeret med ligeringsreaktionen ifølge Invitrogens protokol. Det opnåede plasmid blev betegnet pSV2gptyl-2,3. Et plasmidkort for pSVgptyl-2,3 er vist i fig.

15 24.

DNA-fragmenter indeholdende de andre tre humane konstante IgG-regionexoner blev også isoleret. Cy2-exonerne blev udvundet fra plasmidet py2 som et 4,0 kb Eco RI-Bam Hi-fragment. Cy3-20 exonerne blev udvundet fra plasmidet py3 som et 8,0 kb Eco RI-Bam Hi-fragment. Cy4-exonerne blev udvundet fra plasmidet py4 som et 7,6 kb Eco RI-Bam ΗΙ-fragment. Fragmenterne blev separat ligeret ind i pSV2gpt/R/B som beskrevet for Cyl-7,8 og Cyl-2,3. Plasmidkort for de opnåede plasmider er vist i fig.

25 25, pSV2gpt-y2; fig 26, pSV2gpt-y3 og fig. 27 pSV2gpt-y4.

Kimare konstruktioner med tunoe kåde:

De fuldstændige kimare konstruktioner med tung kåde variabel 30 region human yl konstant region blev dannet ved indsættelse af et fragment indeholdende de murine variable tunge kaderegion-exoner i plasmiderne indeholdende de humane yl-konstante re-gionexoner beskrevet som følger.

35 Eco Ri-fragmenter indeholdende de murine tunge variable kade-regiongener fra CC49- og CC63-hybridomaceller blev derefter ligeret ind i hver af de yl-y4-holdige pSV2-gpt-vektorer (pSV2gpt-yl; pSV2gpt-y2; pSV2gpt-y3; pSV2gpt-y4) som følger·.

CC 4 9 84 DK 173089 B1

Et fragment indeholdende de tunge variable kaderegionexoner, som koder for den tunge variable CC49-kaderegi on, blev frem-5 stillet ved fordøjelse af 14 pg af pHH49 med 50 enheder Eco RI (leveret fra BRL) ved 37*C i 2 timer. Fordøjelsesmaterialet blev fraktioneret på en 4% polyacrylamidgel og 1,9 kb Eco RI-fragmentet indeholdende de tunge variable kaderegionexoner fra CC49 blev udvundet ved elektroeluering som beskrevet af Mania-10 tis. Dette fragment blev betegnet f49R.

Et fragment indeholdende 7,8 kb sekvensen, som koder for yl, blev fremstillet på følgende måde.

15 Ca. 50 pg af vektoren pSV2gpt yl-7,8 blev fordøjet med Eco RI.

Det opnåede fragment blev dephosphory1eret (til forhindring af selv-1igering) under anvendelse af alkalisk kalvetarmphospha-tase som beskrevet af Maniatis. Fragmentet blev oprenset ud fra 0,8% agarosegel ved elektroeluering. Denne vektor blev be-20 tegnet pSV2gptyl-7,8/R.

EcoRI-stedet er lokaliseret 245 bp opstrøms for transkrip-ti ons initi er ingsstederne og indeholder promotoren og de nødvendige vavsspecifikke sekvenser for effektiv ekspression.

25 Intronregionerne 3' for de variable regiongener indeholder de murine tung kxdefremmersekvenser, som er fraværende på de humane tunge IgG-kædevektorer. Derfor udnytter de kimcre tunge kadevektorer både murine promotor- og fremmersekvenser.

30 Ca. 325 ng liniariseret pSV2gptyl-7,8/R blev ligeret med 188 ng f49R i et volumen på 10 μΐ med en 1 enhed T4-DNA-1 igase (BRL). Frosne kompetente E. coli AG-l-celler fra Stratagene blev transformeret med 1 i ger ingsreaktionen ifølge deres protokol. Det opnåede plasnid blev betegnet p49yl-7,8. Fig. 28 35 illustrerer et plasmidkort for p49yl-7,8.

Ca. 50 af vektoren pSV2gptyl-2,3 blev fordøjet som for SV2gptyl-7,8 med Eco RI. Det opnåede fragment blev dephospho- 85 DK 173089 B1 ryleret under anvendelse af alkalisk kalvetarmphosphatase, som beskrevet af Haniatis. Fragmentet blev oprenset ud fra en 0,8% agarosegel ved elektroeluering. Det 1iniariserede plasmid blev betegnet pSV2gptyl-2,3/R.

5

Ca. 300 ng af det 1iniariserede plasmid pSV2gptyl-2,3/R blev ligeret med 188 ng f49R i et volumen på 10 μΐ med 1 enhed T4 DNA-ligase (BRL). Frosne kompetente E. coli AG-l-celler fra Stratagene (La Jolla, CA) blev transformeret med ligerings-10 reaktionen ifølge deres protokol. Det opnåede plasmid blev betegnet p49yl-2,3. Fig. 29 illustrerer et plasmidkort fra p49yl-2,3.

Plasmiderne pSV2gpt-y2, pSV2gpt-y3 og pSV2gpt-y4 blev separat 15 fordøjet med Eco RI til fremstilling af de liniere plasmidvek-torer, henholdsvis pSV2gpt-y2/R, pSV2gpt-y3/R og pSV2gpt-y4/R. Hver af disse 3 liniere plasmidvektorer blev separat ligeret med f49R. Plasmidkort for de opnåede plasmider er vist i fig.

30, p49-y2; fig. 31, p49-y3; og fig. 32, p49-y4.

20 CC83

Kimere konstruktioner indeholdende den tunge kedes variable region af CC83 blev dannet på en lignende måde som de kimere 25 konstruktioner af CC49. Et fragment indeholdende den tunge kedes variable regionexoner, som koder for den tunge CC83-ka-deregion, blev fremstillet ved fordøjelse af 19 μg pHS83 med 50 enheder Eco RI (leveret fra BRL) ved 37*C i 2 timer. Fordøjelsesmaterialet blev fraktioneret på en 4% polyacrylamidgel 30 og 2,9 kb Eco Ri-fragmentet indeholdende den tunge ksdes variable regionexoner af CC83 blev udvundet ved elektroeluering som beskrevet i Haniatis. Dette fragment blev betegnet f83R.

Ca. 300 ng af det 1iniariterede plasmid pSV2gptyl-7,8/R, op-35 nået som ovenfor, blev ligeret med 270 ng f83R i et volumen på 10 μΐ med 1 enhed T4 DNA-ligase (leveret fra BRL). Frosne kompetente E. coli AG-l-celler, leveret fra Stratagene, blev 86 DK 173089 B1 transformeret med ligeringsreaktionen ifølge Stratagene's protokol. Det opnåede plasmid blev betegnet ρ83γ1-7,8. Fig. 33 illustrerer plasmidkortet for ρ83γ1-7,8.

5 Ca. 90 ng liniariseret plasmid pSV2gpt yl-2,3/R, opnået som ovenfor, blev ligeret med 270 ng f83R i et volumen på 10 μΐ med 1 en enhed T4 DNA-ligase (BRL). Frosne kompetente E. coli AG-l-celler fra Stratagene blev transformeret med ligeringsreaktionen ifølge Stratagene's protokol. Oet opnåede plasmid 10 blev betegnet p83yl-2,3. Fig. 34 illustrerer plasmidkortet for p83yl-2,3.

Plasmiderne pSV2gpt-y2, pSV2gpt-y3 og pSV2gpt-y4 blev separat fordøjet som ovenfor for henholdsvis pSV2gpt-y2/R, pSV2gpt-15 y3/R og pSV2gpt-y4/R med Eco RI til frembringelse af de liniere pi asm idvektorer henholdsvis pSV2gpt-y2/R, pSV2gpt-y3/R og pSV2gpt-y4/R. Hver af disse tre liniere pi asmidvektorer blev separat ligeret med f83R. Plasmidkort for de opnåede plasmider er vist i f i g. 35, p83-y2; fig. 36, p83-y3; og fig.

20 37, p83~y4.

Alle ti af de cirkulære piasmidkonstruktioner (p49yl-7,8; p49yl -2,3; p83yl-7,8; p83yl-2,3, p49-y2; p83-y2; p49-y3; p83-y3; p49-y4; og p83-y4) blev derefter liniariseret til 25 transformation ved fordøjelse med restriktionsenzymet Nde I.

Nde I-stedet i plasmiderne er i en region, som ikke er væsentlig for ekspressionen af det kimære immunoglobulingen eller det selekterbare markørgen gpt. Det er nødvendigt for plasmiderne at være i en liniær form før transformation ind i en 30 modtagende celle for at fremme udvalgt integration af DNA'et ind i det genome værtscelle-DNA.

Bekræftelse af konstruktion 35 Da EcoRI-fragmenterne kan ligeres i begge retninger blev den korrekte retning bestemt ved fordøjelse med Nco I. I de ovenfor anførte konstruktioner bekræftes korrekte ligeringer for 87 DK 173089 B1 plasmidkonstruktion ved udførelse af restriktionsenzymsted-kortlagning på plasmidet. Restriktionsenzymkortet dannet ved restriktionsenzymfordøjelse og gelelektroforese sammenlignes med det, som teoretisk kan dannes ud fra de individuelle ud-5 gangsfragmenter. På grund af erfaring med den transkriptio-nelle retning i de lette kmdevektorer blev de tunge kadevek-torer kun konstrueret i den modsatte transkriptionelle retning i forhold til gpt-genet.

10 Transformation af pi asmider ind i museplasmacvtomaceller Når både kimere gener for let kmde og tung kåde blev transformeret ind i den samme celle opnås tetramere (H2L2) immunoglo-buliner. Syntese og sekretion af disse "kimare" antistofpro-15 teiner blev opnået ved indførsel af de kimare (muse V:human C-region) gener i museplasmacytomaceller (Sp2/). Transformation blev opnået ved elektroporation [Sahagan, B.G. et al., J. Immunology 137, 1066 (1986)].

20 Ekspression af kimare (muse V:human C-region) gener i transformerede museplasmacytomaceller (Sp2/0) opnås under anvendelse af to forskellige teknikker. Ved en måde kan forskellige forhold mellem let kede-gener og tung kede-gener indføres sammen. Dette refereres til som cotranformation. Alternativt 25 kan stabile kloner, som barer det kimare lette kadegen, opnås, og derefter anvendes i en anden metode, som der refereres til som målrettet transformation. Ved hver metode er målet at opnå kloner, som indeholder gener for både H-kaden og L-kaden, som fremstiller intakt ^l^-lsmunoglobulin, som navnt ovenfor.

30 A. Cotransformat ioner

Cotransformation involverer transformationen af celler med begge legemiddel resistensmarkører på samme tidspunkt og efter-35 følgende udvalgelse med et eller begge legemidler. Co-trans-formation af tunge kede- og lette kadevektorer (i forhold på henholdsvis 1:1 og 1:10) blev oprindelig udført udelukkende 88 DK 173089 B1 under anvendelse af neo-udvælgelse. Neo-resistente cellelinier blev opnået, som udtrykte de første kimære IgGl-antistoffer med påviselig TAG72-bindingsaktivitet. Cotransformation blev udført i overensstemmelse med de protokoller, som er udført i 5 Cornelia Gorman, "High Efficiency Gene Transfer into Mammalian Cells", DNA Cloning, bind II, D.M. Glover, udgiver, IRL Press, Oxford, England (1985).

B. Målrettede transformationer 10

Konstruktioner indeholdende lette og tunge kimære immunoglobu-lingener blev på hinanden følgende transformeret under anvendelse af ind i Sp2/0-museplasmacytomace11 er. Målrettet transformation involverer transformation og udvælgelse med en vek-15 tor indeholdende et første lægemiddel resistensgen (dvs. Gene-ticin for den kimære lette kædegenvektor) efterfulgt af transformation og udvælgelse med en vektor indeholdende et andet lægemiddelresistensgen (dvs. mycophenolsyre for den kimære tunge kædegenvektor).

20

Neo-udvæloelse Før transformation med pSV2neo-vektorer, som indeholder kimære lette kædekonstruktioner, blev lægemiddeludvælgelsesbetingel-25 ser for inhibering af vækst af ikke-transformerede Sp2/0-plas-macytomaceller [leveret fra the American Type Culture Collection (ATCC)] opnået ved titrering af det neomyciniignende lægemiddel Geneticin (GIBCO). Publicerede værdier for koncentrationer af Geneticin til brug ved lægemiddelselektion lå i 30 intervallet fra 100-1000 pg/ml. Koncentrationer over 400 ug/ml viste sig at forhindre vækst af Sp2/0-celler i vores vævskulturmiljø.

Konstruktion af let kædeholdige celler 35

Sp2/0-museplasmacytomaceller blev indledningsvis transformeret med let kædeholdige pSV2-neo-vektorer på følgende måde. Celler 89 DK 173089 B1 blev dyrket i RPMI 1640 medium med S\ føtalt kalveserum. Celler blev vasket 1 PBS og suspenderet til en koncentration på 1 X 10^ levedygtige celler/ml PBS. 0,8 ml celler blev overført til en elektroporationscuvette (på 1s) Indeholdende 20 pg let 5 kedeholdig pSV2-neovektor (pRL105 og pRL150 for den CC49-kime-re l-kede og pRL203 og pRL230 for den CC83-kimere L-kede) li-niariseret med Aat Il-restriktlonsendonuklease. Aat II blev Inaktiveret ved opvarmning af prøverne til 65eC i 10 minutter.

Det 1iniariserede DNA blev ethanolprecipiteret og derefter 10 opløst 1 10-20 mikroliter PBS. Efter 15 minutter på is blev elektroporation udført under anvendelse af et Gene Pulser-elektroporationsapparat med tilsat kapacitetsforlenger (Bio-Rad) ved 0,2 kvolt og 960 pF. Tidskonstanten (t) var generelt ca. 26 msek.

15

Efter transformation fik celler lov til at komme sig på is i 15 minutter for at muliggøre afslapning af pertuberede membraner. Herefter blev cellerne suspenderet i 24 ml RPMI 1640 medium indeholdende 5% føtalt kalveserum (RPMI+) og overført 20 til en 96 eller 24 brøndplade. Til formindskelse af sandsynligheden for mere end en legemiddel res 1 stent celle per brønd, blev cellerne også fortyndet 10-gange i medium (RPMI+) og udpladet i en anden 96-brønd (eller 24-brønd) plade. Cellesuspensionen blev inkuberet ved 37*C og 5% COj-atmosfere.

25

Efter 48 timer (for at muliggøre ekspression af legemiddel-resistens) blev mediet fjernet og erstattet med medium indeholdende 1 mg/ml Geneticin.

30 Efter 7-10 dage blev Genøtiein-resistente kloner subdyrket og cellerne screenet for klumre lette keder ved cytopietning.

Cytopletni ng 35 Portioner af celler blev pelleteret på et preparatglas under anvendelse af en cytospin-2-centrifuge (Shandon, Inc.). Efter lufttørring blev cellerne fikseret i eddikesyre/ethanol (5 90 DK 173089 B1 dele eddϊkesyre/95 dele ethanol). Efter skylning med PBS 3 gange (uden CA + 2 og Mg + 2) blev præparatglassene anbragt i et fugtigt kammer (100% relativ fugtighed) og plettet i 20 minutter med 20 μΐ gede-anti-human kappa-FITC, et fluorescent far-5 vestof-konjugeret antistof, som er specifik for humane lette kappa-kæder. Det konjugerede antistof blev fortyndet 1:3 med 1% BSA i PBS. Efter vask natten over med PBS blev præparat-glassene monteret med f1uoromount-G, histologisk monteringsmedium (leveret fra Southern Biotech) under et dækglas. Præpa-10 ratglassene blev iagttaget med et Olympus model BH-2 mikroskop udstyret med en epi-illuminering U.V.-anordning.

Baseret på fluorescens-intensiteten viste konstruktionerne med retningen af den lette kæde i modsat transkriptionel retning i 15 forhold til retningen af transkription af neor-genet i vektoren sig at give den højeste L-kæde-ekspression. Derfor var pRL105 den foretrukne CC49-L kædekonstruktion og pRi.230 var den foretrukne CC83-L-kædekonstruktion. Som et resultat af disse forsøg blev de følgende kimære let kæde-holdige celle-20 linier (hidrørende fra Sp2/0) anvendt til de målrettede transformat i oner:

For den kimære CC49-L-kæde blev der opnået en cellelinie (49K-13-13), som udtrykte den kimære lette kæde hidrørende fra 25 CC49. Denne cellelinie blev anvendt til alle efterfølgende målrettede transformationer med kimære tunge kædevektorer til konstruktioner anvendende den kimære CC49 lette kæde.

For den kimære CC83-L-kæde blev der opnået tre cellelinier 30 (83K-26-5, 83K-34-10 og 83K-42-2), som udtrykte den kimære lette kæde hidrørende fra CC83. En cellelinie (83K-26-5) plettede mere intens end de andre og havde lokaliserede regioner med cytopi asmi sk immunofluorescens. Alle tre cellelinier blev sammenlignet med hensyn til deres relative evne til at frem-35 stille store mængder af kimært antistof efter transformation med den kimære tunge CC83 gl-kædevektor. Flere kloner, som udtrykker kimære anstistoffer , blev udledt fra elektroporation 91 DK 173089 B1 af 83K-34-10-målet evd nogen af de andre to kimare lette kade-måcellelinier. Derfor blev den 83K-34-10-1et kade-cel1 el i nie anvendt som et mål for efterfølgende elektroporationer med kimere tunge kadevektorer til konstruktioner indeholdende den 5 lette CC83-kades variable region.

Dannelse af qpt-resistente kloner, som barer CC49- og CC83-ki-mare H-kadekonstruktioner 10 Før transformation »ed pSV2-gpt-vektorer, som indeholder ki-mare tunge kadekonstruktioner, blev lagemiddeludvalgelse for inhibering af vakst af ikke-transformerede Sp2/0-plasmacytoma-celler [leveret fra the American Type Culture Collection (ATCC)] etableret. Betingelser for lagemiddeludvalgelse af 15 celler, som er transformeret med pSV2-gpt-vektorer var vanskeligere at etablere. E. coli-gpt-genet, som koder for enzymet guanosinphosphoribosyltransferase bibringer evnen til at udnytte xanthin og hypoxanthin som substrater for biosyntesen af guanin, når den mammale guaninmetaboliske vej inhiberes af 20 mycophenolsyre (MPA).

Publicerede vardier for koncentrationerne af MPA, som muliggør vaksten af andre lymfoide cellelinier, som var transformeret med pSV2gpt-vektorer, viste sig at vare nasten to størrelses-25 ordener for høje til at muliggøre vaksten af Sp2/0-celler transformeret med pSV2-gpt-vektorer i vores vavskulturmi 1jø.

Som en følge heraf viste en koncentration på 0,1 pg/ml MPA sig at vare optimal for udvalgelse af gpt-resistens. Endvidere viste anvendelsen af aminopterin og thymidin (for yderligere 30 at lukke af for guaninvejen) sig at vare unødvendige.

35 92 DK 173089 B1

Dannelse af kloner, som fremstiller kimart 44-antistof CH44-1 5 49K-13-13-celler blev anvendt som et mål for kimære tunge kædekonstruktioner. Cellerne blev transformeret med 20 Mg kimær tung kæde-DNA-vektor (p49yl-7,8 eller p49yl-2,3), som var liniariseret ved en Nde I-fordøjelse. Transformation ved elektroporation blev udført som beskrevet ovenfor for kimære 10 lette kæder.

Udvælgelse efter 48 timer blev imidlertid udfert ved at erstatte det geneticin-holdige medium med medium indeholdende geneticin og 0,3 pg/ml mycophenolsyre, 250 pg/ml xanthin og 10 15 pg/ml hypoxanthin.

Transformerede celler voksede til makroskopisk synlige kolonier i løbet af 14 dage. På dette tidspunkt blev 50 μΐ super-natent fjernet og analyseret ved ELISA-metoder for binding til 20 TAG og ekspression af human IgG-konstant region. Brønde indeholdende celler med positiv TAG-binding blev udvidet til 24-brøndplader med friskt lægemiddeludvælgelsesmedium og fik lov til at vokse i 3-7 dage.

25 Subkloning blev udført på følgende måde. Levedygtige celle tællinger blev bestemt, og cellerne blev genpladet i to 96-brøndplader. En plade fik 50 levedygtige celler og den anden 250 levedygtige celler. De ikke-subklonede celler blev udvidet til 6-brøndplader indtil cel1etætheden var tilstrækkelig til 30 at muliggøre lagring i flydende nitrogen i det tilfælde, at gen-underklon ing ville være nødvendigt.

Efter subkloning blev de kloner, som havde den højeste kimære antistofproduktion udvalgt til kimær anti stofprodukt ion i bio-reaktorer.

CH44-2 93 DK 173089 B1

De metoder, som blev anvendt til sekventielt at transformere Sp2/0-plasmacytomacellerne ved konstruktionen af CH44-1 blev 5 gentaget med den undtagelse, at 20 pg p49-y2 blev anvendt som den kimære tunge kædevektor.

CH44-3 10 De metoder, som blev anvendt til sekventielt at transformere Sp2/0-plasmacytomacellerne ved konstruktionen af CH44-1 blev gentaget med den undtagelse, at 20 pg ρ49-γ3 blev anvendt som den tunge kædevektor, 15 CH44-4

De metoder, som blev anvendt til sekventielt at transformere Sp2/0-plasmacytomacellerne ved konstruktionen af CH44-1 blev gentaget med den undtagelse, at 20 pg p49-y4 blev anvendt som 20 den tunge kædevektor.

Dannelse af kloner, som fremstiller kimært 88-antistof CH88-1 25

Metoderne, som blev anvendt til sekventielt at transformere Sp2/0-plasmacytomacellerne ved konstruktionen af CH44-1 blev gentaget med de følgende undtagelser: 30 83K-26-5, 83K-34-10 og 83K-42-2-ce1ler, som havde vist, at de fremstillede kimær let CC83-k»de, blev transformeret som beskrevet ved transformationen af CH44-1 med den undtagelse, at 20 pg p83yl-7,8 eller p83yl-2,3, pSV2gpt-vektoren, som indeholder det kimære tunge CC83-kædegen, blev anvendt som den 35 tunge kædevektor.

94 CH88-2 DK 173089 B1

Metoderne, som blev anvendt til sekventielt at transformere Sp2/0-plasmacytomacel1 erne ved konstruktionen af CH88-1 blev 5 gentaget med den undtagelse, at 20 pg ρ83-γ2 blev anvendt som den tunge kædevektor.

CH88-3 10 De metoder, som blev anvendt til sekventielt at transformere Sp2/0-plasmacytomace1 lerne ved konstruktionen af CH88-1 blev gentaget med den undtagelse, at 20 ug ρ83-γ3 blev anvendt som den tunge kædevektor.

15 CH88-4

De metoder, som blev anvendt til sekventielt at transformere Sp2/0-plasmacytomace1 lerne ved konstruktionen af CH88-1 blev gentaget med den undtagelse, at 20 pg ρ83-γ4 blev anvendt som 20 den tunge kædevektor.

Dannelse af kloner, som fremstiller kimært 84-antistof På grund af den høje sekvens 1 ighedsgrad mellem den tunge kædes 25 variable regioner hos CC49 og CC83 blev kimære antistoffer dannet, hvis lette og tunge kæder hidrørte fra forskelligt ophav ved blandede målrettede transformationer. Til dannelse af begge "blandede" kombinationer blev de kimære tunge kædevektorer med isotype y\ af CC49 og CC83 elektroporeret ind i 30 de kimære lette kædemål, henholdsvis 83K34-10 og 49K-13-13. De opnåede cellelinier blev betegnet CH48-1 og CH84-1, hvor den første talangivelse repræsenterer henholdsvis ophavet for den tunge kæde og lette kæde. F.eks. repræsenterer CH48-1 yl-iso-typen, hvor den tunge kæde hidrører fra CC49 og den lette kæde 35 hidrører fra CC83.

CH48-l-kompositantistoffet bandt ikke til TAG72. Dette skyldes ikke manglende evne for fremstilling af virkeligt kimært anti- 95 DK 173089 B1 stof, da de fleste legemiddel resistente cellelinier fremstillede kimært IgG (som bestemt ved ELISA-analyse under anvendelse af gede-anti-human Ig-f«lde med gede-anti-human IgG-alka-lisk phosphatase som en sonde). Hvis der var nogen bindings-5 affinitet til stede, var den signifikant mindre end den, som blev iagttaget for antistof B72.3 af første generation, hvilket var ca. en størrelsesorden mindre affinitet forTAG72 end både CC49 eller CC83.

10 Overraskende bandt CC84-1 til TAG72 med affinitet svarende til begge ophav. Dette nye antistof blev dannet fra grunden i vores laboratorie og er ikke endnu blevet påvist i naturen.

Kompetetivundersøgelser blev foretaget for at afgøre specifi-15 citeten af dette nye blandede-antistof CH84-1. Det bør bemær kes, at både CC49 og CC83 har nogen kompetitiv genkendelse for TAG72-antigenet. Det viste sig, at CH84-1 konkurrerede mere med CC49 for binding til TAG72 end det gjorde med CC83. Dette ville indikere, at specificiteten for binding til TAG72 ligger 20 i den lette kæde.

Humane γ2-, -3- og -4-isotyper blev også dannet med dette blandede-antistof, frembringende CH84-2-, CH84-3- og CH84-4- kloner.

25 CH84-1

Metoden, som blev anvendt til sekventielt at transformere Sp2/0-plasmacytoiaacellerne ved konstruktionen af CH44-1 blev 30 gentaget med den følgende undtagelse: 49K-13-13-cel1 er, som udviser produktion af CH44-let kæde ved cytopletning, blev derefter transformeret som beskrevet ved den transf ormerede af CH44-1 med den undtagelse, at 20 μς 35 p83yl-2,3, pSV2gpt-vektoren, som indeholder det tunge CH83- kædegen blev anvendt i stedet for p49yl-2,3, pSV2gpt-vektoren, som indeholder det tunge CH44-kædegen.

CH84-2 96 DK 173089 B1

Metoderne, som blev anvendt til sekventielt at transformere

Sp2/0-plasmacytomacellerne ved konstruktionen af CH84-1 blev 5 gentaget med den undtagelse, at 20 pg ρ83-γ2 blev anvendt i stedet for p83yl-2,3.

CH84-3 10 Metoderne, som blev anvendt til sekventielt at transformere

Sp2/0-plasmacytomacellerne ved konstruktionen af CH84-1 blev gentaget med den undtagelse, at 20 pg ρ83-γ3 blev anvendt i stedet for p83yl-2,3.

15 CH84-4

Metoderne, som blev anvendt til sekventielt at transformere

Sp2/0-plasmacytomacellerne ved konstruktionen af CH84-1 blev gentaget med den undtagelse, at 20 pg p83-y4 blev anvendt i 20 stedet for p83yl-2,3.

Oprensn i nq af rekombinerede antistoffer

Celler, som udtrykker de kimære antistoffer, blev fjernet ved 25 centrifugering fra dyrkningsmediet, og mediet blev filtreret gennem et 0,2 pm filter. Kimære antistoffer blev oprenset i to trin fra kultursupernatanter. I det ferste trin ved oprensningen blev der anvendt en protein A-affi nitetskassette (Nygene

Corporation, Yonkers, NY) ifølge fremst i 1 lerens spec i f i kat i o-30 ner. Der blev ført op til 1,0 liter kul tursupernatent gennem en 1 mg kapacitetskassette ved 5 ml/mi nut ter. Kassetten blev vasket med phosphatpufret saltopløsning (PBS) til fjernelse af spor af albumin. Det kimare antistof blev udvundet ved elue-ring med 0,1 M natriumnitratpuffer, pH-værdi 3,0. pH-vardien 35 af fraktionerne indeholdende det kimære antistof blev øjeblikkelig indstillet til neutralitet med en 1 M opløsning af Trizma-base. Den endelige oprensning blev opnået ud fra denne 97 DK 173089 B1 opløsning efter koncentration på en Amicon centricon 30-enhed ved hjalp af gelfiltrering under anvendelse af en Pharmacia Superose 12 HR 16/50-søjle, som specificeret af fremstilleren (Pharmacia, Piscataway, NJ).

5 EKSEMPEL: Dannelse af et immunoglobulin, som indeholder den murine VnaTAG-kimlinievariable region

Oe følgende eksempler er anført for at bibringe en fagmand 10 inden for området en reproducerbar teknik til fremstilling af et antistof med en V^-region, som kodes af en DNA-sekvens hidrørende fra VnaTAG.

Komponenter for et ekspressionsdygtigt tungt VnaTAG-kædegen 15

Et muse/humant-kimært antistofmolekyle kan dannes, som indeholder den murine V^aTAG-kimlinie tunge kådes variable region, en let kædes variable region, som er komplementær med VnaTAG Vh» såsom enten den CC49- eller CC83-murine lette kædes vari-20 able region, og humane konstante regioner.

2,2 kb Hindlll-kimlinie-DMA-fragmentet indeholdende VpaTAG Vh~ exonsekvensen anvendes som en skabelon til opnåelse af en funktionelt omlejret VpaTAG-variabel region. Den murine genome 25 J-Cp-intronregion anvendes som en kilde for de murine tunge kcdefremmersekvenser. Denne sidstnmvnte region opnås ud fra plasmidet pNP9 (se eksempel ovenfor under "isolering af CC49-tung kådes variable region”). Fig. 36 viser den samlede reaktion ved fremstillingen af hybride gener baseret på meto-30 den beskrevet af Horton et al., (1989), supra. Fire oligonu-kleotider (oligoer) udformes til anvendelse ved enzymatisk forstcrkning og mod i fikat i on af mål-DNA'et. Oli go 1 sammenføjes med 5'-enden af VnaTAG spændende EcoRI-stedet, som er 249 bp 5' for ATG-initieringscodonet. Oligo 2 sammenføjes med 35 sekvenser komplementære med 3'-enden af VpaTAG-exonet og indeholder også sekvenser, som koder for et D-segment. 0-segment-sekvenserne i oligo 2 sammenføjer ikke med nogen VpaTAG-se- 98 DK 173089 B1 kvenser. Oligo 3 indeholder sekvenser, som er komplementære med 5'-enden af den murine genome J-Cp-region og inkorporerer sekvenser, som koder for D-segmentet (samme som i oligo 2) og J-segmentet. Oligo 4 sammenføjer med 3'-enden af J-Cp-regionen 5 og indeholder sekvenser, som er komplementåre med EcoRI-stedet anbragt 1219 bp 3' fra Jh4. Sekvensen for disse oligoer er som følger: 10 Oligo 1 5’GTCTAG.AATTCATAAAAACTT7ATC (25 mer)

Oligo 2 CAG7GTATT7CTGTAAAAGATCTACTATGGTTACG(35 mer) 15

Oligo 3 5'7C7ACTÅ7GGTTACG7GGCGTCAAGGAACC7CAG7CACC

GTC7CCTCAGGTAAGAA7GGCCTCTCCAGGTC7 3' (72 mer) 20

Oligo 4 5' AC77C7AAAA7G7A7T7AG.4ATTCA7777C 3' 25 I dette eksempel er D-sekvensen SP2,3 taget fra den publicerede sekvens af Kurosawa og Tonegawa J. Exp. Med., 155:201 (1982). D-sekvensen er vist i fede typer i oligoer 2 og 3. Et hvilket som helst andet karakteriseret murint eller humant D-segment kan anvendes ved erstatning med deres sekvens i disse 30 stillinger i oligo 2 og 3.

J-segmentet i oligo 3 er understreget. Det er det murine J^4 taget fra den publicerede sekvens af Gough og Bernard Proc, Natl . Acad. Sci. (USA), 78:509 (1981). Indbefatningen af et- 35 hvert andet murint eller humant J-segment kan foretages ved at anvende deres sekvens i stedet for sekvensen for Jp4 i oligo 3.

99 DK 173089 B1 I oligo 1 og 4 er EcoRI-stederne (GAATTC) vist i kursiv.

Samling af intakte VnotTAG-gener 5 Der blev udført separate DNA-forstærkningsreakti oner under anvendelse af de ovenfor beskrevne komponenter. DNA-forstærkningsreakt i on nr. 1 kopierer VnaTAG-sekvensen og adderer et D-segment til dens 3'-ende. DNA-forstærkningsreaktion nr. 2 kopierer de murine intronsekvenser indeholdende de tunge kæde-10 fremmersekvenser og adderer D- og J-segmenterne, som der kodes for inden i oligo 3. De forstærkede produkter fra reaktion 1 og 2 geloprenses, forenes og oligo 1 og 4 tilsættes for at begynde reaktion nr. 3. I reaktion 3 sammenføjes produkterne fra reaktioner 1 og 2 over deres fælles D-sekvenser. Efterføl-15 gende DNA-forstærkning fra oligoer 1 og 4 giver produktet vist i bunden af fig. 38. Dette fragment fordøjes med EcoRI og geloprenses. Det modificerede V^aTAG-fragment ligeres ind i EcoRI-stedet i pSV2gptyl (2,3) som beskrevet i det ovenfor anførte eksempel "kimære tunge kædekonstruktioner". Hele det 20 ν^αΤΑ6-0-J-fremmerholdige fragment sekvensbestemmes fuldstæn dig for at sikre, at der ikke er blevet indført nogen mutationer under DNA-forstærkningsreaktionerne. Oe andre tre tung kæde-y-i sotyper kan dannes ved at ligere det samme modificerede V^dTAG-fragment ind i de andre tre y-holdige pSV2gpt-vekto-25 rer (pSV2gpt-y2; pSV2gpt-y3; pSV2gpt-y4).

Ekspression af det modificerede N^eTAS-gen

De modificerede V^aTAG-genholdige plasmider kan liniariseres 30 med Ndel og indføres via elektroporation i de kimære lette CC49- eller CC83-kædeudtrykkende cellelinier (se eksempel ovenfor, "C. Målrettede transformationer"). De transformerede celler udvælges for vækst i nærværelse af geneticin og myco-phenolsyre som beskrevet ovenfor under "C. Målrettede trans-35 formationer". Tilstedeværelsen af udtrykt antistof overvåges ved TAG72-ELISA (se afsnit under RESULTATER, enzym-koblede immunoanalyser (ELISA). Det udtrykte antistof fra disse cel- DK 173089 B1 100 ler vil indeholde humant Ig yl,tc konstante regioner sammen med den lette CC49- eller CC83-kædes variable region og en tung kædes variable region fra de modificerede V^eTAC-kiml i-ni e-Vn-exoner.

5

Fire eksempler på modificerede konstruktioner med V^dTAG-tung kædes variable region med en forskel i 0- og J-segmenter er vist nedenfor.

10 V^-segment D-segment J-seament

VnaTAG #1 muse-D (SP2,3) muse-J

VHaTAG #ii human D (Dl) muse-J

15

VHaTAG #iii muse-D (SP2,3) human J

VHaTAG #iv human D (Dl) human J

20 Sekvensen for den humane D-sekvens Dl er fra Siebenlist et al., Nature, 294^.631 (1981). Sekvensen for det humane J^l er mra Ravetch et al.. Cell 27, 583 (1981).

Dannelsen af Vh<xTAG #i er beskrevet ved hjælp af de ovenfor 25 skematisk viste oligoer l til 4. Til dannelse af VHaTAG #ii til -iv er det nødvendigt at ændre de tilsvarende D- og J-segmenter i oligoer 2 og 3. De følgende oligoer skildrer disse ændringer. Eerstatning med disse oligoer i reaktion nr.l og reaktion nr. 2 vil resultere i dannelsen af Vh<xTAG #ii til 30 - i v.

35 101 DK 173089 B1 7HaTAu ->i i

Oligo 2 5' CAGTGTATTTCTGTAAAAGAGTACTGGTGGT (34 ner)

_ GTAT

5 01 i go 3 5' GTACTGGTGGTGTA7TGGGGTCAAGGAACC (72 ner) 7CAG7CACCGTC7CC7CAGQ7AACAA7GCCC7 CTCCAGGTCT 3' 1° 7HaTAG Ή li

Oligo 2 5' CAG7G7ATTTCTGTAAAAGATCTACTATGG (35 ner)

TTACG

Oligo 3 5’ TCTAC7ATGGTTACG7GGGGCCAGGGCAC (72 ner) 15 CCTGGTCACCG7CTCC7CAGG7AAGAA7GGCC7C7CCAGGTC7 3’ VHa7AG »iv 20

Oligo 2 5’ CAG7GTA777C7GTAAAAGAG7ACTGGTG (35 ner) GTG7A7

Oligo 3 5' GTACTGGTGGTG7AT7GGGGCCAGGGCAC (72 mer) CCTGGTCACCGTCTCCTCAGG7AAGAA7GGC 25 CTCTCCAGG7C7 3*

Resultater 30 L·_antistof-producerende cellelinier

Samtidig påvisning af tunge og lette keder blev opnået under anvendelse af to sondeantistoffer: 35 i) Gede-anti-human kappa merket med det fluorescerende farvestof FITC; og 2) Gede-anti-human IgG merket med det fluorescerende farvestof TRITC.

102 DK 173089 B1

Cellelinier med positive reaktioner med hensyn til både tung og let kede blev yderligere undersøgt for dermed forbundet kimar immunoglobulinproduktion og biologisk aktivitet, dvs. binding til TAG72.

5

Enzvmkoblede immunoanalvser (ELISA)

Til udvælgelse af en transformeret celle, som producerer et kimært monoklont antistof, blev der benyttet ELISA-teknik.

10 Kloner indeholdende de tunge kæde- og lette kædelægemiddel-selektionskonstruktioner blev udvalgt ved deres vækst i selektiv kulturmedium. De følgende cellelinier blev undersøgt (1) CH44-1: en cellelinie med CC49 Vh, CC49 Vl, og konstant region af IgGj; (2) CH44-2: en cellelinie med CC49 Vh, CC49 Vl, og 15 konstant region af IgG2; (3) CH44-4: en cellelinie med CC49

Vh, CC49 Vl, og konstant region af IgG4; (4) CH88-1: en cellelinie med Vh, CC83 Vl, og konstant region af IgGj; (5) CH88-2: en cellelinie med CC83 Vh, CC83 Vl, og konstant region af IgG2; (6) CH88-3: en cellelinie med CC83 Vh, CC83 Vl og 20 konstant region af IgG3; (7) CH88-4: en cellelinie med CC83

Vh, CC83 Vl og konstant region af IgG4; (8) CH84-1: en cellelinie med CC83 Vh, CC49 Vl, og konstant region af IgGj; (9) CH84-2: en cellelinie med CC83 Vh, CC49 Vl, og konstant region af IgG2; (10) CH84-3, en cellelinie med CC83 Vh, CC49 Vl, og 25 konstant region af IgG3; og (11) CH84-4: en cellelinie med CC83 Vh, CC49 Vl, og konstant region af IgG4.

Supernatenterne fra disse kulturer blev underkastet ELISA. Tilstedeværelsen af kimært anti-TAG72-anti stof blev målt 30 direkte ved omsætning af et overskud af gede-anti-humant IgG-antistof mærket med et enzym, såsom alkalisk phosphatase efter at det kimære anti-TAG72-anti stof havde fået lov til at binde sig til mikrotiterbrønde overtrukket med antigen (TAG72).

Anti-TAG72akti vitet blev bestemt som et kriterie for succesrig 35 rekombi ner ing.

Efter vækst i 14 dage blev 50 μΐ supernatant fjernet fra brøndene med de underklonede celler og gen-analyseret for TAG-bin- 103 DK 173089 B1 ding ved ELISA. Prøver af supernatanter (50 μΐ) fra lægemiddelresistente cellelinier blev ført til brønde af Nunc Immulon 96-brøndplader, son i forvejen var blevet overtrukket med TAG-antigen (1/50 fortynding). Efter vask til fjernelse af ikke-5 bundet materiale blev brøndene inkuberet med gede-anti-humant IgG-antistof konjugeret med alkalisk phosphatase (GAHIgG-AP), som en sonde til påvisning af de humane konstante regioner i de kimære antistoffer, som havde bundet sig til TAG-antigenet immobi1 i seret på pladen. En anden vask til fjernelse af ikke-10 bundet sonde (GAHIgG-AP) efterfulgt af tilsætningen af et chromogent alkalisk phosphatasesubstrat gjorde det muligt for farve at udvikles i de brønde, som havde TAG-binding forbundet med humane konstante regioner (dvs. kimære anti-TAG72-anti-stoffer). Absorbansaflæsninger ved 405 nm viste den relative 15 mængde af kimært antistof, som var fremstillet af de lægemiddelresistente cellelinier.

CH44-1 20 Anti-TAG72-aktivitet blev anvendt som et kriterie for suc cesrig rekombinering. Brønde i mikrotiterplade blev overtrukket med TAG ved inkubering af 50 μΐ af en 1:75 fortynding af oprenset TAG72 [Huraro, R., et al.. Cancer Research 78, 4588-4596 (1988)] i 18 timer ved stuetemperatur. Brøndene blev 25 derefter vasket 4 gange med phosphatpufret saltopløsning (PBS) og derefter blokeret med BSA ved inkubering af 50 μΐ 0,5% BSA i PBS i 2 timer ved 37*C efterfulgt af vask fire gange med PBS. Disse plader er stabile, hvis de holdes fugtige ved 4*C. Prøver på 50 mikroliter tilføres derefter til hver brønd. En 30 blind indeholdende frisk medium anvendes som en kontrol. Alle prøverne blev inkuberet enten i pladen i 90 minutter ved 37*C eller natten over ved 4*C i en lukket beholder.

Pladerne blev derefter vasket 4 gange med PBS og gede-anti-35 human IgG-alkalisk phosphatase (Southern Biotech Assoc.) blev sat til hver brønd ved tilsætningen af 50 μΐ af en 1:250 fortynding. Opløsningen blev Inkuberet ved 37eC i 90 minutter.

DK 173089 B1 104

Farveudvik1 ing blev overvåget efter vask af pladerne 4 gange med PBS til fjernelse af sonden.

Substratet blev inkuberet i 200 μΐ opløsning af substrat-p-5 nitrophenylphosphat (Kirkegaard & Perry) i ethanol ami npuf ret saltopløsning i 6 minutter ved stuetemperatur til farveudvik-ling. Den optiske densitet ved 450 nm i hver brønd blev aflæst af en Dynatech-mikropladeaf1æser (Dynatech Inc.).

10 Sp2/0-kolonier i brønde med supernatenter med TAG72-bindende kimær anti stofaktivitet blev subklonet ved begrænset fortynding. Individuelle subkloner blev udvalgt på basis af relativ høj produktion af kimært antistof.

15 CH44-2

Den for CH44-1 anvendte TAG-ELISA-fremgangsmåde blev gentaget med den undtagelse, at antistoffet var CH44-2.

20 CH44-3

Oen for CH44-1 anvendte TAG-ELISA-fremgangsmåde blev gentaget med den undtagelse, at antistoffet var CH44-3.

25 CH44-4

Den for CH44-1 anvendte TAG-ELISA-fremgangsmåde blev gentaget med den undtagelse, at antistoffet var CH44-4.

30 CH88-1

Den for CH44-1 anvendte TAG-ELISA-fremgangsmåde blev gentaget med den undtagelse, at antistoffet var CH88-1.

35 105 CH88-2 DK 173089 B1

Der> for CH44-1 anvendte TAG-ELISA-fremgangsmåde blev gentaget med den undtagelse, at antistoffet var CH88-2.

5 CH88-3

Den for CH44-1 anvendte TAG-ELISA-fremgangsmåde blev gentaget med den undtagelse, at antistoffet var CH88-3.

10 CH88-4

Den for CH44-1 anvendte TAG-ELISA-fremgangsmåde blev gentaget med den undtagelse, at antistoffet var CH88-4.

15 CH84-1

Den for CH44-1 anvendte TAG-ELISA-fremgangsmåde blev gentaget med den undtagelse, at antistoffet var CH84-1.

20 CH84-2

Den for CH44-1 anvendte TAG-ELISA-fremgangsmåde blev gentaget med den undtagelse, at antistoffet var CH84-2.

25 CH84-3

Den for CH44-1 anvendte TAG-ELISA-fremgangsmåde blev gentaget med den undtagelse, at antistoffet var CH84-3.

30 CH84-4

Den for CH44-1 anvendte TAG-ELISA-fremgangsmåde blev gentaget med den undtagelse, at antistoffet var CH84-4.

35 CH84-1 106 DK 173089 B1

5 B. In vivo-carcinommå 1 retning

De kimare monoklone antistoffer, som blev anvendt til dyre-undersøgelser vist i tabellerne 1-4 i det efterfølgende blev 10 market med Nal25i under anvendelse af Iodogen (Pierce Chemical, Rockford, IL). Narmere bestemt blev fra ca. 0,5-2 mg oprensede kimare monoklone antistoffer indstillet til ca. 0,5 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH-vardi 7,2) og derefter sat til et glasrør på 12 cm x 75 cm, som var overtrukket med 50 μ g 15 Iodogen efterfulgt af tilsatning af fra 0,1-0,5 mCi af Nal25I (New England Nuclear, Boston, MA). Efter en inkubering på 2 minutter ved stuetemperatur blev proteinet fjernet fra det uopløselige Iodogen, og det ikke-inkorporerede 125j blev adskilt fra antistoffet ved ge1fi 11rer ing gennem en 10 ml søjle 20 Sephadex® G-25 under anvendelse af PBS som pufferen. Iode-ringsprotokollen gav market kimart IgG-antistof med en specifik aktivitet på 0,05 til 0,2 pCi/pg.

Athymiske hunmus (nu/nu) på en CDl-baggrund blev leveret fra 25 Charles River med en alder på ca. 4 uger. Ni dage senere blev musene podet subkutant (0,1 ml/mus) med LS174T-celler (1 χ io6 cel ler/dyr).

Athymiske mus, som har carcinomaer 70 til 400 mg i vagt, blev 30 ca. 12 til 13 dage efter podning med cellerne indgivet injektioner intravenøst på fra 0,5 til 2,0 pCi (10-50 pg protein) i PBS af de kimare monoklone antistoffer, som var blevet joderet som ovenfor beskrevet. Grupper på fem mus blev aflivet på forskellige tidspunkter ved exsanguination, carcinomet og normale 35 vav blev udskåret og vejet og cpm blev målt i en gammataller. cpm/mg af hvert vav blev derefter bestemt og sammenlignet med det, der blev fundet i carcinomet.

107 DK 173089 B1

Resultaterne for CH44-1 er vist i tabellerne 1-2 og figurerne 39A, 39B og 39C. Resultaterne for CH84-1 er vist i tabellerne 3 og 4 og figurerne 40A og 40B.

5 Procent injiceret dosis per gram l2Sl-m»rket antistof

Tabel 1 CH44-1 10 _________________

Vav ~ 0,75 tiner 23,5 49,5 122 timer timer timer blod, i alt 29,70 15,84 8,09 7,31 15------------------ ----- lever 8,13 4,13 2,19 1,96 »ilt 6,19 3,39 2,12 1,36 20 nyre 4,35 2,80 1,52 1,33 tumor 3,31 25,95 28,83 44,16 lunge 7,34 5,39 2,90 2,36 25----------------- —.......... .

tumor, vagt 0,18 0,12 0,09 0,11

Ca. 122 timer efter injektion var procent injiceret dosis i 30 forhold til tumor for CH44-1 44,16% som vist i tabel 1. CH44-1 var derfor effektiv til målfinding af det humane tumor in-situ. Dette viser, at de kimere monoklone antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse var effektive til at nå frem til carcinomaet som mål in vivo og således er egnet til in vivo-35 behandling af cancer.

Procent injiceret dosis per organ af K.antistof

Tabel 2 108 DK 173089 B1 5 CH44-1

Vav ' 0,75 timer 23,5 49,5 122 timer timer timer 10 blod, i alt 47,72 23,03 13,29 12,01 lever 10,97 5,20 3,20 2,69 milt 1,09 0,48 0,25 0,22 nyre 1,25 0,72 0,42 0,40 tumor 0,57 3,08 2,82 4,55 20 lunge 1,20 0,87 0,57 0,37

Gl-kanal 6,64 4,78 3,96 2,83 krop 43,17 49,68 35,35 29,95 samlet legeme- 91,30 76,34 53,28 46,20 retention 3Q Som vist i tabel 2 var procentvxrdien af injiceret dosis i forhold til tumor for CH44-1 4,55% 122 timer efter injektion. CH84-1 var derfor effektiv med hensyn til at n& frem til det humane tumor in-situ som mål. Dette viser, at de kimxre monoklone antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse var ef-35 fektive til at nå frem til carcinomaet som mål in vivo og således var egnede til in vivo-behandling af cancer.

Procent injiceret dosis per gram l^Si-markgt.antistof

Tabel 3 109 DK 173089 B1 5 CH84-1

Vav " 1 tine 23 timer 47 timer 118-119 timer 10 blod 30,68 15,65 6,74 6,49 lever 12,55 4,26 2,35 1,57 milt 10,93 3,35 2,56 1,70 15.............-.....—-------------------------- --------------- nyre 5,59 2,51 1,53 1,55 tumor 4,06 20,52 17,58 30,27 20 lunge 10,77 4,80 2,58 2,24 tumor, vagt 0,15 0,22 0,20 0,24 25 Som vist i tabel 3 var procentvardien af injiceret dosis i forhold til tumor for CH84-1 30,27% ca. 118 timer efter injektion. CH84-1 var derfor effektivt med hensyn til at nå frem til den humane tumor in situ som mål. Dette viser, at de kimare monoklone antistoffer ifølge den foreliggende opfindel-30 se var effektive til at ni frem til carcinomaet som mål in vivo og således var egnede til in vivo-behandling af cancer.

35

Procent injiceret dosis per organ af l25l-market antistof

Tabel 4 110 DK 173089 B1 5 CH84-1

Vav 1 time 23 47 118-119 timer timer timer 10 blod, i alt 45,98 22,11 10,08 9,37 lever 13,64 5,34 3,13 1,94 milt 1,35 0,49 0,32 0,16 nyre 1,39 0,62 0,38 0,38 *5 tumor 0,59 4,33 3,63 7,02 lunge 1,77 0,69 0,42 0,31

Gl-kanal 7,38 4,92 3,41 2,32 krop 44,83 52,19 30,32 24,06 20 ____________________________________ ____ samlet legeme- 93,58 81,00 47,14 45,48 reten t i on 25 Som vist i tabel 4 var procentværdien af injiceret dosis i forhold til tumor for CH84-1 7,02% ca. 118 timer efter injektion. CH84-1 var derfor effektiv med hensyn til at nå den humane tumor in situ som mål. Dette viser, at de kimare monoklone antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse var ef- 30 fektive til at nå frem til carcinomaet som mål in vivo og således var egnede til in vivo-behandling af cancer.

Deponer i ng af cellelinier, som fremstiller kimare antistoffer 35 Der blev som eksempler deponeret 11 cellelinier, som udskiller kimare antistoffer, der alle har lette kappa-kader fremstillet ved hjælp af de ovenfor beskrevne eksempler hos the American 111 DK 173089 B1

Type Culture Collection (ATCC) den 19. oktober 1988. Specifikt er de følgende cellelinier blevet deponeret: (1) CH44-1: en cellelinie med CC49 VH# CC49 VL og konstant region af IgGx (ATCC nr. HB 9884); (2) CH 88-2: en cellelinie ned CC83 VH, 5 CC83 V|_, og en konstant region af IgG2 (ATCC nr. HB 9880); (3) CH44-4: en cellelinie ned CC49 VH. CC49 VL, og konstant region af IgG4 (ATCC nr. 9877); (4) CH88-1: en cellelinie med VH, CC83 Vi_. og konstant region af IgGj (ATCC nr. 9882); (5) CH44-2: en cellelinie ned CC49 VH, CC49 V^, ©9 en konstant region 10 af IgG2 (ATCC nr. 9881); (6) CH88-3: en cellelinie med CC83

Vh, CC83 VL, og konstant region af IgG3 (ATCC nr. 9876); (7) CH88-4: en cellelinie med CC83 VH, CC83 VL, og konstant region af IgG4 (ATCC nr. 9874); (8) CH84-1: en cellelinie med CC83 V^, CC49 Vl, og konstant region af IgG^ (ATCC nr. 9883); (9) 15 CH84-2: en cellelinie ned CC83 VH, CC49 VL, og konstant region af IgG2 (ATCC nr. 9879); (10) CH84-3: en cellelinie med CC83 VH, CC49 VL og konstant region af IgG3 (ATCC nr. 9878); og (11) CH84-4: en cellelinie ned CC83 Vh# CC49 V^, og konstant region af IgG4 (ATCC nr. 9875).

20

De følgende eksempler illustrerer ekspression af variable regioner af antistofferne ifølge opfindelsen med modificerede konstante regioner. Molekylerne med disse modificerede konstante regioner udviser nndret serumhalveringstid, vævsbiofor-25 deling, effektorfunktioner etc. i forhold til et antistof med en umodificeret konstant region.

Antistofferne med afkortede tunge keder er illustreret i fig.

41 (a og b). De blev produceret genetisk ved sekventiel fjer-30 nelse af de C-term1na1e donener af de humane γΐ eller y3 tunge keder. De tunge keder blev nodificeret ved successiv fjernelse af CH3- og CH2-domenerne i de humane γΐ (Ellison et al., ( 1982) og Takahashi et al. (1982)) og fjernelse af CH3- og CH2- og hingedomener i de hunane γ3 (Krawinkel et al., (1982) 35 og Takahashi et al., (1982)) konstante regiongener, som blev anvendt ved ekspression af kimere antistoffer.

DK 173089 B1 112

Fjernelse af CH3-domænet 1 den humane yl tunge kæde resulterer i et molekyle med en størrelse på 5/6 af størrelsen for det Intakte antistof, der refereres til som "CH3-mi nus", og den konstante regionsekvens er angivet i sekvens 1. Det næste 5 mindre molekyle, den F(ab1)2_1ignende konstruktion, blev dannet ved fjernelse af både CH2- og CH3-dom*nerne i den humane yl tunge kæde, hvilket efterlader hinge- og CHl-domænerne.

Det resulterende kimære, genetiske F (ab' )2-®>°lekyle er ca. 2/3 af størrelsen af det intakte antistof, og den konstante re-10 gionsekvens er vist i sekvens 2. De humane yl tunge kæder er koblet ved hjælp af et par af disulfidbindinger ved Cys-239 og Cys-242 (Kabat et al., 1987) i hingedomænet. Det lette kæde C-terminus, Cys-213 (Kabat et al., (1987)) er forbundet til den yl tunge kæde ved Cys-233 (Kabat et al., (1987)), ligeledes i 15 hinge-domænet (se fig. 41). yl-isotypen blev anvendt til kon struktion af CH3-minus- og F(ab'^-molekylerne, eftersom hinge-domænet blev anvendt i begge disse konstruktioner. Ved udformning af det Fab-størrelsesafpassede molekyle, som er 1/3 af størrelsen af et intakt antistof, ville fjernelse af hinge-20 domænet imidlertid eliminere stedet for vedhæftning af den lette kæde. Den humane y3 tunge kæde blev udvalgt til Fab-konstruktion, og den konstante regionsekvens er vist i sekvens 3.

25 30 35 DK 173089 Bl 113

Sekvens l

AGC7TTC7GGGGCAGGCCAGGCCTSACC??SGCTT7GGGGCAGGGAGGGGGC7AAGG7GA GGCAGGTGGCGCCAGCAGGTGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACAC7GGACGCTGAA CCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTSCGCCTGGGCCCAGCTCTG7CCCACACC GCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCT GGCACCC7CC7CCAAGAGCACC7C7GGGGGCACAGCGGCCCTGGGC7GCC7GG7CAAGGA CTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA CACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC7CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAA CACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGG AAGCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAG CAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGG GAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACC CAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGG AGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCG GACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAAT CTTGTGAC AAAACTC AC AC ATGCCCACCGTGC CC AGGTAAGCC AGC C CAGGCC7C GC CC7 CCAGC7CAAGGCGGGACAGGTGCCC7AGAG7AGCC7GCA7CCAGGGACAGGCCCCAGCCG GG7GC7GACACG7CCACC7CCATCTC77CCTCAGCACC7GAAC7CC7GGGGGGACCG7CA G7CT7CC7C77CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC ACATGCGTGGTGGTGGACG7GAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT7CAACTGGTACGTG GACGGCG7GGAGG7GCATAA7GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG TACCGGGTGG7CAGCG7CCTCACCG7CCTGCACCAGGAC7GGC7GAATGGCAAGGAG7AC AAG7GCAAGG7C7CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA7CGAGAAAACCA7C7CCAAAGCC AAA

114 DK 173089 B1

Sekvens 2

AGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACCTTGGCTTTGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGA

GGCAGGTGGCGCCAGCAGGTGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGAA

CCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACC

GCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCT

GGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA

CTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA

CACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT

GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAA

CACCAAGGTGGACAAGAAAGT7GGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGG7GTCTGCTGG

AAGCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAG

caaggcaggccccgtctgcctcttcacccggagcctctgcccgcccca'Gtcatgctcagg

GAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACC

CAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGG

AGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCG

GACACCTTCTpTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAAT

CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA

Sekvens 3

AGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACTTTGGCTGGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGAC

GCAGGTGGCGCCAGCCAGGCGCACACCCAATGCCCGTGAGCCCAGACACTGGACCCTGCC

TGGACCCTCGTGGATAGACAAGAACCGAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCC

CACACCGCAGTCACATGGCGCCATCTCTCTTGCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTT

CCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGT

CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG

CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT

GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAAGCC

CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTT

115 DK 173089 B1

Domænerne med tunge keder blev deleteret under anvendelse af SOE-teknikken (Horton et al., 1989; Ho et al., 1989) ved fjernelse af de tilsvarende exoner. I fig. 42a er den generelle proces illustreret: to DNA-fragmenter (AB og CO) dannes sepa-5 rat ved traditionel PCR. Dette gennemføres ved anvendelse af kort ol igonukleotidprimer, svarende til hver af 51 (a og c)-og 3' (b og d)-enderne af de pågældende fragmenter. Efter oprensning blandes de to DNA-fragmenter, denatureres og rean-neleres over de overlapningsregioner, der hidrører fra "wag-10 ging tail". Efter endnu en PCR under anvendelse af de yderste ol igonukleotidprimere (a og d), udstrækkes og amplificeres de overlappende fragmenter som et enkelt fragment.

Gener konstante regioner med tunge kæder koder alle for ly-15 sin som den sidste aminosyre efter glycin og før termine- ringscodonet (Ounnick et al., 1980; Kabat et al., 1987). C-terminuset af udskilt fuldt udviklet tungt kade-protein har Imidlertid vist sig at vare glycin (Kabat et al., 1987), hvilket indikerer post-translationsbearbejdning af det termi-20 nåle lysin. På grund af den mulighed, at denne post-transla-tionsbearbejdning er nødvendig for effektiv ekspression, blev hver afkortet konstruktion afsluttet ved hjalp af mindst to aminosyrer af C-terminuset af den humane yl tunge kåde. Således starter 404 bp DNA-fragmentet, a-x (se fig. 42b) med Gly-25 Lys og termineringscodoner og indbefatter polyadenyleringssig-nalsekvensen. Dette fragment blev anvendt som 31-sammenføj-ningsfragment for alle de konstruktioner, der er beskrevet heri. Eftersom DNA-sekvensen af 3'-størstedelen svarende til 190 bp af dette fragment ikke er kendt, blev PCR gennemført 30 fra en 3'-primer hidrørende fra den naboliggende vektorsekvens og Indbefattede fragmentets Bam HI-restriktionssted.

Som vist i fig. 42b blev de første produkter af de to første PCRer, fragmenterne y-bl og a-x oprenset og underkastet en 35 SOE-reaktion, som dannede y-bl-x-fragmentet for Fab-vektor-konstruktionen. De genetiske F(ab')2“ og CH3-minus-f ragmenter blev konstrueret ved tilsvarende metoder under anvendelse af 116 DK 173089 B1 3'-primerne b2 og b3 og den humane yl-skabelon, hvilket gav y-b2-x- og y-b3-x-fragmenterne efter SOE-reaktioner. Før den endelige oprensning af SOE-produkterne blev fragmenterne fordøjet med både EcoRI og BamHI til dannelse af 3’-overlappende 5 ender til efterfølgende ligering ind i sådanne steder i pSV2-gpt-vektoren.

Vektorkonstruktionerne med afkortede tunge kæder er udformet til at forliges med enhver tung kæde-var i abe 1 region på et Eco 10 Ri-fragment.

Materialer og metoder

Restriktionsenzymer og DNA-modificerende enzymer leveredes af 15 BRL (Gaithersburg, MD), Stratagene (LaJolla, CA) og New England Biolabs (Beverly, MA). Deoxynuk1eoti der leveredes af Pharmacia (Piscataway, NJ).

Udformning af oligonukleotidprimere for PCR/SOE

20 49VDJ-exonet, CHl-exonet af y3 og hinge- og CH2-exonerne af yl udviser alle ved deres 3'-ender det første nukleotid af den første codon af det næste exon. Dette partielle codon blev udeladt ved udformning af de tilsvarende oligonukleotidprimere 25 (henholdsvis bO (se fig. 42c), bl, b2 og b3). Sekvensen af primer y (5'-GGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTC-3' ) hidrørte fra DNA-sekvensen 5' til Eco Ri-stedet i pSV2gpt (Mulligan & Berg, 1981). Sekvensen af primer x (5'-TATCTTATCATGTCTGGATCC-31) hidrørte fra DNA-sekvensen 3’ til Barn Hi-stedet i pSV2gpt 30 (Mulligan β Berg, 1981). Den region, hvorfra disse sekvenser hidrørte, var oprindeligt klonet fra pBR322. Sekvensen af primer a (5' -GGTAAATGAGTGCGACGG-31 ) begynder med de sidste to codoner (Gly-Lys) af CH3-exonet af humant yl. Sekvensen af primer bO (5'-CCGTCGCACTCATTTACCTGAGGAGACGGTGACTCA-3') blev 35 udformet således, at 5'-halvdelen ville "logre'' (eng.: "wag") og være fuldstændig komplementær til de 5' 18 nukleotider af primer a. 3'-halvdelen er komplementær til de 6 komplette C- DK 173089 B1 117 terminale codoner af J-regionen af CC49-tung kede VDJ exonet. Sekvensen for primer bl (5'-CC6TCGCACTCATTTACCAACTCTCTTGTCCA-CCTT-3') svarer til primer bO i 5'-halvdelen, men 3'-halvdelen er komplementer til de 6 komplette C-terminale codoner af 5 CHl-exonet af humant y3. Sekvensen af primer b2 (5'-CCGTCGCAC-TCATTTACCTGGGCACGGTGGGCATGT-31) svarer også i udformning til primer bO i 5'-halvdelen, men 3’-halvdelen er komplementer til de 6 komplette C-terminale codoner af hinge-exonet af humant yl. Sekvensen af primer b3 (5'-CCGTCGCACTCATTTACCTTTGGCTTTGGA-10 GATG6T-3' ) svarer også til primer bO i 5-halvdelen, men 3'-halvdelen er komplementer til de 6 C-terminale codoner af CH2-exonet af humant yl.

PCR- oo SOE-metoder 15

Fragmentet a-x (svarende til 404 nt) blev dannet ved PCR (Saiki, et al., 1988) under anvendelse af den Nde I-lineari-serede skabelon pyl-gpt, som indeholder det humane yl gen, og ol igonukleotidpr imerne a og x. Fragmentet y-bO (762 nt) blev 20 dannet ved PCR under anvendelse af primerne y og bO på den li-neariserede p49yl-gpt skabelon. Fragment y-bl (544 nt) blev produceret ved PCR under anvendelse af primerne y og bl på py3-gpt skabelonen, som Indeholder det humane y3 gen. Fragmenter y-b2 (977 nt) og y-b3 (1425 nt) blev produceret på pyl-gpt 25 skabelonen under anvendelse af henholdsvis primerne y og b2 og y og b3. Fragmentet y-bO-x (svarende til 1166 nt) blev dannet ved SOE-metoden (Ho, et al., 1989). Dette involverer denaturering og annelering af de gel-oprensede fragmenter y-bO og a-x og PCR-ekstension af 5'- og 3'-primerne y og x. På tilsva-30 rende måde blev fragmenterne y-bl-x (svarende til 948 nt), y-b2-x (svarende til 1381 nt) og y-b3-x (svarende til 1829 nt) dannet ved SOE-teknologi efter annelering af henholdsvis fragmenterne y-bl, y-b2 og y-b3 med fragment a-x efterfulgt af PCR-ekstension med primerne y og x.

Termisk cykling blev gennemført. Skabelon- og primerkoncentrationer var henholdsvis 0,1-1,0 ng/ml og 1 nmol/ml i 0,1 ml 35 DK 173089 B1 118 (Saiki et al., 1988). PCR- og SOE-beti ngel ser var: denature-ring-2 minutter ved 92-96*C; annelering-3 minutter ved 37eC til 50 * C; ekstension i 10 minutter ved 71*C-74eC (30 cykler).

5 Vektorkonstruktion

Efter phenol/chloroform-ekstraktion og ethanolpræcipitering af SOE-reaktionsdel tagerne blev fragmenterne fordøjet med Eco RI og Barn HI og geloprenset (Maniatis et al., 1982). Hvert frag-10 ment blev ligeret med Eco RI/Bam ΗΙ-fragmentet af SV2-gpt vektoren. Disse vektorer er i stand til at acceptere ethvert Vn-fragment med Eco Ri-ender. l,9kb Eco Ri-fragmentet indeholdende CC49 Vh blev ligeret ind i Eco Ri-stedet på hver af vektorerne med afkortede tunge keder, og kloner blev analyseret 15 ved hjalp af Nco I-digestion for korrekt orientering af Vh--fragmentet.

Elektroporeringsudvalgelse og ekspression 20 Hver af de kimære CC49 afkortede tunge kade-vektorer blev li-neariseret med Nde I og elektroporeret ind i målceller, som udtrykker den kimære CC49 lette kæde. TA6-72 bindingsaktivitet i et medium af mycophenolsyre (MPA)-res i stente kolonier blev påvist ved hjælp af ELISA med alkalisk phosphatase-konjugeret 25 gedeanti-human kappa-anti stof (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL). Vektoren indeholdende 49Hv-frag-mentet alene (p49Vh-gpt) blev også elektroporeret ind i målceller (SP2/0), som ikke udtrykker let kæde eller tung kæde (Shulman et al., 1978). Den mulige TAG-72 bindingsaktivitet 30 produceret ved hjælp af disse MPA-res i stente kolonier blev målt ved kompet i t i on-ELISA. Kolonier med pos i tiv TA6-7 2 ELISA-aktivitet blev udstrakt til plader med 24 brønde, sub-klonet og udvalgt.

35 119 DK 173089 B1

Deponering af cellelinier

Cellelinie Ch44-Fab (ATCC HB 10228), Ch44-F(ab')2 (ATTCC HB 10429) og Ch44-CH3~ (ATCC HB 10430) blev deponeret ved the 5 American Type Culture Collection (ATCC) den 18. april, 1990.

Forkortelser jo bp basepar gpt * guanos1nphosphori bosy11ransferase Hv tung kåde variabel region (også Vh) kb = kilobasepar

Mr 3 molekylvagt (også molec. wt.) 25 neo » neomycinphosphotransferase nt nukleotid oligo = oligonukleotid TAG-72 =» tumorassocieret glycoprotein-72 20 Referencer

Dunnick, et al. (1980), "A mouse immunoglobulin heavy chain deletion mutant: isolation of a cDNA clone and sequence analysis of the mRNA", Nucl. Acids. Res._, 25 8:1475-1484.

Ellison etal. (1980), MThe nucleotide sequence of a human immunoglobulin C-gamma-1 gene”, Nucl. Aoid Reg, 10:4071-4079.

30 Ho, etaL (1989), "Site-Directed Mutagenesis by Overlap

Extension Using the Polymerase Chain Reaction", Gene, 77:51-59.

35 Horton, etal (1989), "Engineering Hybrid Genes without the use of Restriction Enzymes: Gene Splicing by Overlap Extension", Gene. 77:61-68.

DK 173089 B1 120

Rabat, etal. (1987), "Sequences of Proteins of Immunological Interest (4th. edition)'*, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health.

5

Krawinkel etal. (1982), "Comparison of the hinge-coding segments in human immunoglobulin gamma heavy genes and the linkage of the gamma 2 and gamma A subclass genes", EMBO J, 1:A03-A07 10 Maniatis etal. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor, N.Y.

Mulligan & Berg (1981), "Selection for animal cells that express the E. coli gene coding for xanthine-guanine 15 phosphoribosyl transferase", Proc. Natl. Acad. Sci. USa, 78:2072-2076.

Saiki etal. (1988), "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA ^ polymerase", Science. 239:A87-A9l",

Shulman etal. (1978), "A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies", Nature, 276:269-270.

25 Takahashi etal. ( 1982), "Structure of human immunglobulln gamma genes: Implications for evolution of a gene family", Cell. 29:671-679.

2 s C - r it 30

Forklaring til tegningen I fig. 41 er vist et diagram af antistoffer med afkortede tunge kmder.

i fig. 41a) er vist CH3-m1nus- og F(ab'^-molekyler hidrørende fra humant IgGl og Fab-molekylet hidrerende fra humant IgG3; 35 DK 173089 B1 121 i fig. 41b) er vist Hv-molekylet hidrørende fra den tunge kade-variable region vist alene eller sammen med den lette kåde 1 enten en hypotetisk dimer eller tetramer form. Fuld størrelses-afpasset IgGl er vist i tro målestoksforhold; 5 i fig. 42 a) er vist et diagram af SOE-teknikken, hvoraf fremgår logrende haler og de komplementåre overlap, der er vist som en mørk kasse; 10 i fig. 42b) er vist et diagram af den humane tunge kade- konstante region og o 1 igonukleotidprimerne {med logrende haler), der anvendes til dannelse af DNA-fragmenterne a-x, y-bl, y-b2 og y-b3; 15 i fig. 42c) er vist et diagram af CC49 tung kade-variabel region og oligonukleotidprimerne (med logrende haler), der anvendes til dannelse af y-bO fragmentet til Hv-genkonstruktio-nen.

20 Den foreliggende opfindelse skal ikke begranses i omfang ved de deponerede cellelinier, da de deponerede udførelsesformer er ment som en enkelt illustration af et aspekt af opfindelsen og fordi alle cellelinier, som er funktionelt ekvivalente, er inden for opfindelsens omfang. Selvom opfindelsen er blevet 25 beskrevet detaljeret og med henvisning til specifikke udførelsesformer derfor, vil det således vare indlysende for en fagmand inden for området, at der kan foretages andringer og modifikationer deraf uden at afvige fra ånden og omfanget af de ledsagende krav.

30 35

Claims

122 DK 173089 B1

1. Antistof frembragt af en af cellelinierne CH44-1 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880), CH44-4 (ATCC HB 9877), CH 88-1 (ATCC HB 9882), CH 88-2 (ATCC

2. Antistof- eller antistoffragmentkonjugat omfattende et antistof eller et antistoffrag-10 ment ifølge krav 1 konjugeret til en billeddannelsesmarkør.

3. Antistof- eller antistoffragmentkonjugat ifølge krav 2, hvor billeddannelsesmarkøren er l25I, 131I, mI, 11‘In, 105Rh, 1J3Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, mLu, I86Re, ,8*Re eller "“Tc.

4. Antistof- eller antistoffragmentkonjugat omfattende antistoffet eller antistoffragmentet ifølge krav 1 konjugeret til et terapeutisk middel.

5 CH 88-3 (ATCC HB 9876), CH 88-4 (ATCC HB 9874), CH 84-1 (ATCC HB 9883), CH 84-2 (ATCC HB 9879), CH 84-3 (ATCC HB 9878) eller CH 84-4 (ATCC HB 9875).

5. Antistof- eller antistoffragmentkonjugat ifølge krav 4, hvor det terapeutiske middel er et radionuklid, lægemiddel eller biologisk reaktionsmodifikationsmiddel, toksin eller et andet antistof.

5 HB 9881), CH 88-3 (ATCC HB 9876), CH 88-4 (ATCC HB 9874), CH 84-1 (ATCC HB 9883), CH 84-2 (ATCC HB 9879), CH 84-3 (ATCC HB 9878) eller CH 84-4 (ATCC HB 9875) eller et fragment deraf, der er i stand til selektivt at reagere med et særligt antigen eller en særlig antigenfamilie.

6. Antistof- eller antistoffragmentkonjugat ifølge krav 5, hvor radionuklidet er *3II, »Y, ,05Rh, 67Sc, 67Cu, 212Bi, 2“At, 67Ga, l25I, li6Re, ,MRe, 177Lu, ""Tc, *53Sm, l23I eller 20 ‘“In.

7. Antistof- eller antistoffragmentkonjugat ifølge krav 5, hvor lægemidlet eller det biologiske reaktionsmodifikationsmiddel er methotrexat, adriamycin eller lymphokin. 123 DK 173089 B1

8. DNA-sekvens som i det mindste koder for en del af et antistof, der er i stand til selektivt at reagere med et særligt antigen eller en særlig antigenfamilie, og som er indeholdt i en af cellelinierne CH44-1 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880), CH44-4 (ATCC HB 9877), CH 88-1 (ATCC HB 9882), CH 88-2 (ATCC HB 9881),

9. DNA-sekvens ifølge krav 8, hvor sekvensen koder for mindst en del af et CH-gen, der koder for IgG,.4, IgM, IgA, IgD eller IgE.

10. Biologisk funktionel ekspressionsvehikel indeholdende DNA-sekvensen ifølge et hvilket som helst af kravene 8 eller 9.

11. Celle transformeret med det biologisk funktionelle ekspressionsvehikel ifølge krav 10.

12. Celle, der frembringer et antistof, som produceret af en af cellelinierne CH44-1 15 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880), CH44-4 (ATCC HB 9877), CH 88-1 (ATCC HB 9882), CH 88-2 (ATCC HB 9881), CH 88-3 (ATCC HB 9876), CH 88-4 (ATCC HB 9874), CH 84-1 (ATCC HB 9883), CH 84-2 (ATCC HB 9879), CH 84-3 (ATCC HB 9878) eller CH 84-4 (ATCC HB 9875).

13. Middel omfattende antistoffet eller antistoffragmentet ifølge krav 1 i en farmaceutisk 20 acceptabel, ikke-toksisk, steril bærer.

14. Middel omfattende antistof- eller antistoffragmentkonjugatet ifølge et hvilket som helst af kravene 2 til 7 i en farmaceutisk acceptabel, ikke-toksisk, steril bærer. 124 DK 173089 B1

15. Fremgangsmåde til fremstilling af et antistof- eller antistoffragmentkonjugat omfattende, at antistof eller antistoffragment ifølge krav 1 bringes i kontakt med en billeddannelsesmarkør eller et terapeutisk middel.

16. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant ekspressionsvehikel omfattende, 5 at en DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 8 eller 9 indsættes i et ekspressionsvehikel.

17. Fremgangsmåde til fremstilling af en transformeret vært omfattende, at ekspressionsvehiklet ifølge krav 10 indsættes i en egnet vært. 10