FI103181B - Uusi vasta-aine ja siihen liittyvät vasta-ainekonjugaatit, DNA-sekvens sit, ilmentämisvehikkelit ja solut - Google Patents

Uusi vasta-aine ja siihen liittyvät vasta-ainekonjugaatit, DNA-sekvens sit, ilmentämisvehikkelit ja solut Download PDF

Info

Publication number
FI103181B
FI103181B FI903056A FI903056A FI103181B FI 103181 B FI103181 B FI 103181B FI 903056 A FI903056 A FI 903056A FI 903056 A FI903056 A FI 903056A FI 103181 B FI103181 B FI 103181B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
antibody
atcc
dna
human
cells
Prior art date
Application number
FI903056A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI903056A0 (fi
FI103181B1 (fi
Inventor
Peter S Mezes
Brian B Gourlie
Mark W Rixon
Original Assignee
Dow Chemical Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dow Chemical Co filed Critical Dow Chemical Co
Publication of FI903056A0 publication Critical patent/FI903056A0/fi
Priority to FI961439A priority Critical patent/FI103477B1/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI103181B publication Critical patent/FI103181B/fi
Publication of FI103181B1 publication Critical patent/FI103181B1/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6877—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the antibody being an immunoglobulin containing regions, domains or residues from different species
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1084—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K51/1087—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin comprises domains from different animal species, e.g. chimeric immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Description

103181
Uusi vasta-aine ja siihen liittyvät vasta-ainekonjugaatit, DNA-sekvenssit, ilmentämisvehikkelit ja solut * Tämä keksintö liittyy immunoglobuliinien tuottoon v ~ 5 ja luonnossa esiintyvien vasta-aineiden aminohappojaksoi hin tehtyihin muunnoksiin. Erityisesti tämä keksintö liittyy yhdistelmä-DNA-tekniikan käyttöön kimeeristen geenien tuottamiseen ja näiden muokkausmenetelmien hyödyntämiseen kimeeristen vasta-aineiden konstruoimisessa.
10 Vasta-aineet ovat spesifisiä immunoglobuliini (Ig) -polypeptidejä, joita selkärankaisten immuunijärjestelmä tuottaa vasteena altistumisesta vieraille proteiineille, glykoproteiineille, soluille tai muille antigeenisille vieraille aineille. Tapahtumasarja, jonka avulla organis-15 min on mahdollista torjua vieraiden solujen tunkeutuminen tai vapauttaa elimistö vieraista aineista, tunnetaan ainakin osittain. Tärkeä osa tässä prosessissa on spesifisesti tiettyä vierasta ainetta sitovien vasta-aineiden valmistus. Näiden polypeptidien sitoutumisspesifisyys tiettyä 20 antigeeniä vastaan on hyvin hienostunutta, ja niiden spesifisyyksien lukumäärä, joita selkärankaisyksilö kykenee muodostamaan, on huomattava monimutkaisuutensa ja vaihtelevuutensa puolesta. Miljoonat antigeenit kykenevät herättämään vasta-ainevasteita kunkin vasta-aineen ollessa .· 25 suunnattu miltei yksinomaan sen herättänyttä nimenomaista antigeeniä vastaan.
Nykyisin on käytössä kaksi tärkeintä selkärankaisten vasta-ainelähdettä - muodostaminen nisäkkäiden B-lym-fosyyttien toimesta in situ ja muodostaminen B-soluhybri-30 dien toimesta soluviljelmässä. Vasta-aineet muodostuvat in T ·. situ tuloksena B-lymfosyyttien esiasteiden erilaistumises ta plasmasoluiksi, joka tapahtuu vasteena tiettyjen anti-* — geenien aiheuttamalle stimulaatiolle. Immunoglobuliiniket- jujen eri alueita koodaavat DNA-alueet ovat erilaistumat-35 tornien B-solujen genomin DNA:ssa erillään toisistaan. En- « 2 103181 nen ilmentymistä nämä jaksot kootaan vaiheittain yhteen. Katsauksen tähän prosessiin on laatinut Gough (1981)
Trends in Biochem. Sei. 6, 203.
Tulokseksi saatu uudelleenjärjestetty geeni pystyy 5 ilmentymään kypsissä B-lymfosyyteissä halutun vasta-aineen tuottamiseksi. Jopa silloinkin, kun tietty nisäkäs altistetaan vain yhdelle antigeenille, ei saada tulokseksi yhdenmukaista vasta-ainepopulaatiota. Tiettyä nimenomaista antigeeniä vastaan suunnattu immuunivaste in situ määräy-10 tyy antigeenin pinnalla olevia useita eri determinantteja vastaan muodostuneista vasteista koostuvan mosaiikin perusteella. Kukin homologisten vasta-aineiden alajoukko on yhden B-solupopulaation tuottama - tämän vuoksi vasta-aineiden muodostuminen in situ on "polyklonaalista".
15 Tämä rajoitettu, mutta luontainen heterogeenisyys on voitettu useissa erityistapauksissa käyttämällä hybri-doomatekniikkaa "monoklonaalisten" vasta-aineiden muodostamiseksi soluviljelmissä B-soluhybridoomien avulla, [ks.
Kohler ja Milstein, C., (1975) Nature 256, 495 - 497], 20 Tässä menetelmässä antigeenillä ruiskutetusta ni säkkäästä saadut suhteellisen lyhytikäiset eli kuolevaiset splenosyytit tai lymfosyytit fuusioidaan kuolemattomaan kasvainsolulinjaan, josta siten muodostuu hybridisoluja eli "hybridoomia", jotka ovat sekä kuolemattomia että pys-" 25 tyvät tuottamaan tämän B-solun geneettisesti koodaamaa vasta-ainetta. Näin muodostuneet hybridit segregoidaan yksiksi geneettisiksi kannoiksi valikoimalla, laimentamalla ja uudelleenkasvatuksella ja kukin kanta edustaa siten yhtä geneettistä linjaa. Tämän vuoksi nämä kannat tuotta-30 vat vasta-aineita, jotka varmuudella ovat homogeenisia ha-'· luttua antigeeniä vastaan. Puhtaaseen geneettiseen polveu tumiseen viitaten näitä vasta-aineita nimitetään "mono-klonaalisiksi". '
Monospesifiset monoklonaaliset vasta-aineet ovat 35 vaikuttaneet immunologiaan suuresti ja niiden käyttökel- 3 103181 poisuus luonnontieteissä, kuten biologiassa, farmakologiassa, kemiassa ja muissa tieteissä on jo osoitettu. Näille w monoklonaalisille vasta-aineille on löytynyt laajaa käyt töä ei vain diagnostisina reagensseina [ks. esim. teos * 5 Immunology for the 80's, Voller, A., Bartlett, A. ja Bid- well, D. (toim.) MTP Press, Lancaster, 1981] vaan myös hoidossa [ks. esim. Ritz, J. ja Schlossman, S.F., (1982)
Blood 59, 1 - 11] .
Vaikkakin hybridoomien tuottamat monoklonaaliset 10 vasta-aineet ovat edellä esitetyn tarkastelun mukaisesti teoriassa tehokkaita ja ne ovat spesifisyytensä puolesta polyklonaalisia vasta-aineita edullisempia, niillä on yksi merkittävä heikkous. Monissa sovellutuksissa muissa eläimissä kuin ihmisissä tuotettujen monoklonaalisten vasta-15 aineiden käyttö on hyvin rajoitettua, kun monoklonaalisia vasta-aineita aiotaan käyttää ihmiseen. Toistuvat "vieraan" vasta-aineen, kuten hiiren vasta-aineen, ruiskeet ihmisiin voivat johtaa haitallisiin yliherkkyysreaktioihin. Tällainen muusta kuin ihmisestä peräisin oleva mono-20 klonaalinen vasta-aine aiheuttaa ihmiseen ruiskutettuna ei-ihmisvasta-aineen vastaisen (ANHA) vasteen. Tiettyä hiirestä peräisin olevien vasta-aineiden käytöstä aiheutunutta ANHA-vastetta, ihmisen hiirivasta-ainetta vastaan syntynyttä (HAMA) vastetta, on tarkasteltu julkaisussa ; 25 Shawler et ai. . (1985) Journal of Immunology 135, 1530 - 1535 .
Uskotaan, että ihmisen muuttumattomia alueita omaavat eläinten immunoglobuliinit aiheuttavat ihmiseen injektoituina pienemmän ANHA-vasteen kuin muusta eläimestä kuin 30 ihmisestä peräisin olevan muuttumattoman alueen sisältävät T : eläinten immunoglobuliinit. Valittuja antigeenejä vastaan hyviä sitoutumisaffiniteettejä ja ihmiseltä peräisin ole- * - via muuttumattomia alueita omaavilla monoklonaalisillä vasta-aineilla arvellaan sellaisenaan olevan suurta hyö- 4 103181 dyntämispotentiaalia immunologisessa diagnostiikassa ja syöpäpotilaiden hoidossa.
Tähän mennessä on tehty useita yrityksiä ihmisestä peräisin olevien monoklonaalisten vasta-aineiden valmista-5 miseksi ihmisen hybridoomia käyttäen. On esimerkiksi valmistettu ihmis-ihmishybridoomia [Olsson et ai., (1980)
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 5429]; ihmis-hiirihybridoo-mia [Schlom, J., et ai.. (1980) ibid. 77, 6841] ja useita muita vierasperäisiä hybridiyhdistelmiä. Ihmisen mono-10 klonaalisia vasta-aineita on myös tuotettu transformoimalla lymfosyyttejä Epstein-Barr-virusta käyttäen. Tällaisissa hybridoomissa voi kuitenkin mahdollisesti esiintyä patogeenisiä ihmisviruksia. Vaihtoehtoisesti on vasta-aineita tuottavia primäärisiä B-soluja tehty kuolemattomiksi in 15 vitro virus-DNA:11a transformoimalla. Ihmishybridoomaso-lulinjoista saadut monoklonaalisten vasta-aineiden saaliit ovat valitettavasti suhteellisen pieniä (1 μg/ ml ihmis-hybridoomissa verrattuna 100 Mg/ml hiiren hybridoomissa) ja tuotantokustannukset ovat korkeat.
20 Vaikka ihmisen immunoglobuliinit ovat hyvin halut tuja syöpäpotilaiden immunologisessa diagnostiikassa ja hoidossa, eivät ihmishybridoomatekniikat ole vielä saavuttaneet vaihetta, jossa tarvittavia antigeenispesifisyyksiä omaavia ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita voisi olla 25 helposti saatavissa. Lisäksi selvien eettisten syiden vuoksi tutkijat eivät voi immunisoida ihmisiä valituilla toksisilla tai muuten haitallisilla aineilla tiettyä antigeeniä vastaan suunnattujen vasta-aineiden muodostamiseksi. Ihmisen kyseessä ollessa tämä asettaa suuria rajoituk-30 siä potilaiden immunologiselle diagnostiikalle ja hoidol-' le. *
Ihmisestä peräisin olevien monoklonaalisten vasta-aineiden tuotto on varmasti mahdollista, mutta tämä on vielä tehotonta alhaisen toistettavuuden ja edellä mainit-35 tujen muiden ongelmien vuoksi. [Ks. lisäksi Nature 300, * < 5 103181 316 - 317 (1982)]. Useimmat monoklonaaliset vasta-aineet ovat tämän vuoksi peräisin muista eläimistä kuin ihmisestä .
Suurella sitoutumisaffiniteetilla ihmisen syöpäan-' 5 tigeeneihin reagoiva monoklonaalinen vasta-aine, jota ei tunnisteta vieraaksi aineeksi ihmisessä, on hyvin haluttu. Menetelmä tämän vaikeuden välttämiseksi on muodostaa keinotekoisesti vasta-aine, joka on hyvin suuressa määrin ihmisen vasta-aineen kaltainen ja jota ihmisruumis ei tun-10 nista vieraaksi aineeksi, ts. kimeerinen tai "humanisoitu" vasta-aine.
Kimeeristen vasta-aineiden kyseessä ollessa on tyypillistä, että sekä raskaan että kevyen ketjun vaihteleva alue muistuttaa yhdestä nisäkäslajista peräisin olevien 15 vasta-aineiden vaihtelevia alueita ja että muuttumattomat osat ovat homologisia ihmisestä peräisin olevissa vasta-aineissa esiintyvien jaksojen suhteen. Yksi näiden kimeeristen muotojen selvä etu on se, että esimerkiksi vaihte-levat alueet voidaan kätevästi saada nykyisin tunnetuista 20 lähteistä, kun käytetään muusta isäntäeläimestä kuin ihmisestä saatuja ja helposti saatavissa olevia B-solujen hyb-ridoomia yhdessä esimerkiksi ihmissoluvalmisteista saatujen muuttumattomien alueiden kanssa. Kun näiden vasta-aineiden vaihtelevan alueen spesifisyyteen ei vaikuta tämän 25 alkuperä ja kun muuttumaton alue taas on peräisin ihmisestä, on vähemmän todennäköistä, että ne potilaaseen ruiskutettaessa herättävät tässä immuunivasteen verrattuna muusta kuin ihmisestä peräisin olevasta muuttumattomasta alueesta aiheutuvaan vasteeseen.
30 Yksi tunnettu ihmisen syöpäkasvainantigeeni on syö- ; päkasvaimeen liittyvä glykoproteiini (TAG-72). TAG-72 liittyy ihmisestä peräisin olevien solujen, erityisesti ^ - syöpäkasvainsolulinjan LS174T pintaan. LS174T [American
Type Culture Collection (tässä ATCC) nro CL 188] on linjan β 103181 LS180 (ATCC nro CL187), paksunsuolen adenokarsinoomalinjan variantti.
Tl LS174T:n karyotyyppi on samanlainen kuin LS180:n, X-kromosomin puuttuessa suurimmasta osassa soluja. On esi-5 tetty julkaisussa Johnson, V.G. et ai. . (1986) Cancer Res.
46, 850 - 857 kuvattuja koetuloksia, joiden perusteella TAG-72-molekyyli on luonnehdittavissa mukiiniksi. Tämä johtopäätös perustuu seuraaviin havaintoihin: (a) TAG- 72:11a on suuri molekyylipaino (> 1 x 106) , jota osoittaa 10 sen ekskluusio Sepharose™ CL-4B -pylväästä; (b) TAG-72:n CsCl:ssä suoritetulla tasapainosentrifugoinnilla määritetty tiheys oli 1,45 g/ml, joka viittaa vahvasti glykosyloi-tuun glykoproteiiniin,- (c) TAO-72:n havaitaan muuttavan kulkeutumistaan neuraminidaasilla suoritetun pilkkomisen 15 jälkeen, joka viittaa siihen, että se on runsaasti sialyy-liryhmiä sisältävä molekyyli, jossa on runsaasti mukii-neille ominaisia O-glykosidisin sidoksin kytkeytyneitä oligosakkarideja; (d) mukiineissa yleisesti esiintyviä veriryhmäantigeeneja on havaittu affiniteettipuhdistetussa 20 TAG-72:ssa ja (e) pilkkominen Chondroitinase ABC:llä ei vaikuttanut TAG-72:een, joka osoittaa sen, että TAG-72-epitooppi ei ilmene proteoglykaanin pinnalla, joka on kon-droitiinisulfaattia.
i On kehitetty monia hiiren monoklonaalisia vasta- | 25 aineita, joilla on sitoutumisspesifisyyttä TAG-72:ta vas taan. Yksi näistä monoklonaalisista vasta-aineista, jolle Ϊ on annettu merkintä B72.3, on hybridooman B72.3 (ATCC nro HB-8108) tuottama hiiren IgGl. B72.3 on ensimmäisen suku- ; polven monoklonaalinen vasta-aine, joka on kehitetty käyt- 30 täen immunogeeninä ihmisen rintasyöpäuutetta [ks. Colcher, D., et ai.. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 3199 - * 3203) ; ja US-patentit 4 522 918 ja 4 612 282] . Ilmaisu "ensimmäisen sukupolven monoklonaalinen vasta-aine" tarkoittaa tässä käytettynä monoklonaalista vasta-ainetta, n 7 103181 joka on tuotettu käyttäen immunogeeninä solujen raakauu-tetta.
Muita TAG-72:ta vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita merkitään "CC":llä (paksunsuolen syöpä).
' 5 Monoklonaaliset CC-vasta-aineet ovat toisen sukupolven hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden ryhmä. Ilmaisu "toisen sukupolven monoklonaalinen vasta-aine" tarkoittaa tässä käytettynä monoklonaalista vasta-ainetta, joka on tuotettu käyttäen immunogeeninä ensimmäisen sukupolven mo-10 noklonaalisella vasta-aineella puhdistettua antigeeniä. Monoklonaaliset CC-vasta-aineet valmistettiin B72.3:lla puhdistettua TAG-72:ta käyttämällä. CC-vasta-aineiden tuottamiseen käytetyn menetelmän tarkastelu on esitetty US-patenttihakemusjulkaisussa nro 7-073 685 (USPA 7-073 15 685), hakemuksen ovat jättäneet Schlom et ai. 15.7.1987 ja se on yleisesti saatavissa laitoksesta National Technical Information Service. Suhteellisen hyvien TAG-72:ta vastaan suunnattujen sitoutumisaffiniteettiensa vuoksi ATCCrhen on talletettu rajoitettua saatavuutta vaatien seuraavat CC-20 vasta-aineet: CC49 (ATCC nro HB 9459), CC83 (ATCC nro HB 9453), CC46 (ATCC nro HB 9458), CC92 (ATCC nro HB 9454), CC30 (ATCC nro HB 9457), CC11 (ATCC nro HB 9455) ja CC15 (ATCC nro HB 9460) .
Tällä alalla ei ole tunnettua, että olisi eristetty •m 25 ihmisen vasta-aine, joka sitoutuu vahvasti TAG-72:een. Tämän vuoksi sopivat vasta-aineet täytyy valmistaa keinotekoisesti .
On tunnettua, että Ig-molekyylin toiminta riippuu sen kolmiulotteisesta rakenteesta, joka puolestaan riippuu 30 sen primaarisesta aminohappojärjestyksestä. Ig:n aminohap-‘ pojärjestyksen muuttaminen voi siten vaikuttaa huononta- vasti tämän aktiivisuuteen. Muutos Ig:tä koodaavassa DNA- * jaksossa voi vaikuttaa DNA-jakson sisältävän solun kykyyn ilmentää tai erittää Ig:tä tai suoriutua tämän kokoonpa-35 nosta.
103181 8 US-patenttihakemusjulkaisuun 7-073 685 sisältyvän opin mukaan voidaan CC-vasta-aineet muuntaa kimeeriseksi muodokseen korvaamalla esim. hiiren muuttumattomat alueet (Fc) ihmisen muuttumattomilla alueilla käyttäen sinänsä 5 tunnettua yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. On luultavaa, että US-patenttihakemusjulkaisussa 7-073 685 esitetyt ehdotukset eivät johtaneet varsinaiseen yritykseen ilmentää mitään kimeerisiä Ig-polypeptidiketjuja, tuottaa Ig-aktii-visuutta, eikä erittää ja panna kokoon Ig-ketjuja halu-10 tuiksi kimeerisiksi Ig-molekyyleiksi.
Tällä alalla sinänsä tunnetuista lähtökohdista katsoen ei sen vuoksi ole lainkaan selvää, että yhdistelmä-DNA-tekniikat tuottavat rutiininomaisesti käytettynä ki-meerisen eläin-ihmisvasta-aineen sellaisista valituista 15 DNA-lähteistä, jotka muodostavat toimivia, spesifisesti ihmisen valittuihin karsinoomiin sitoutuvia kimeerisiä vasta-aineita, joihin ihmiseen ruiskutettuna liittyy ANHA-sivuvaikutusten käynnistyminen vähäisemmässä määrin.
Tämä keksintö kykenee yllättäen täyttämään monet 20 näistä edellä mainituista tarpeista ja tarjoaa käyttöön menetelmän näiden haluttujen vasta-aineiden tuottamiseksi.
Tämä keksintö tarjoaa esimerkiksi käyttöön menetelmän, jolla voidaan fuusioida geenejä, jotka koodaavat ainakin osaa TAG-72:ta ilmentävistä ihmisen karsinoomiin sitoutu-25 vista eläimen Ig-molekyyleistä geenien kanssa, jotka koodaavat ainakin osaa ihmisen Ig-molekyylistä. Tämä keksintö voi myös tarjota käytettäväksi menetelmän sellaisen proteiinin ilmentämiseksi, joka voidaan erittää ja panna kokoon, jotta saadaan toimiva kimeerinen vasta-aine.
30 Tämä keksintö tarjoaa lisäksi käyttöön ilmentämis- . » ; vektorin, joka sisältää TAG-72:ta vastaan suunnattuja vas ta-aineita tai näiden osia koodaavan DNA-jakson.
Tämä keksintö tarjoaa käyttöön myös solut, jotka on " I transformoitu ilmentämisvektorilla, joka sisältää TAG- • · 9 103181 72:ta vastaan suunnattuja vasta-aineita ja näiden osia koodaavan DNA-jakson.
Lopuksi tämä keksintö tarjoaa käyttöön uusia vasta-aineita käytettäväksi diagnostisissa in vivo -määrityksis-' 5 sä ja radioimmunologisesti ohjatussa kirurgiassa.
Edellä esitetyn perusteella tämä keksintö kohdistuu vasta-aineeseen, jota tuottaa jokin solulinjoista CH44-1 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880), CH44-4 (ATCC HB 9877), CH 88-1 (ATCC HB 9882), CH 88-2 (ATCC HB 9881), CH 10 88-3 (ATCC HB 9876), CH 88-4 (ATCC HB 9874), CH 84-1 (ATCC
HB 9883), CH 84-2 (ATCC HB 9879), CH 84-3 (ATCC HB 9878) ja CH 84-4 (ATCC HB 9875) tai sen fragmentti, joka pystyy reagoimaan selektiivisesti TAG-72-antigeenin kanssa.
Tämä keksintö kohdistuu myös DNA-jaksoon, joka koo-15 daa ainakin osaa vasta-ainetta, joka pystyy selektiivisesti reagoimaan TAG-72-antigeenin kanssa ja on jossakin solulinjoista CH44-1 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880), CH44-4 (ATCC HB 9877), CH 88-1 (ATCC HB 9882), CH 88-2 (ATCC HB 9881), CH 88-3 (ATCC HB 9876), CH 88-4 (ATCC HB 20 9874), CH 84-1 (ATCC HB 9883), CH 84-2 (ATCC HB 9879), CH
84-3 (ATCC HB 9878) ja CH 84-4 (ATCC HB 9875).
Tämä keksintö kohdistuu myös vasta-aine- tai vasta-aine f ragmenttikonjugaa11iin, joka sisältää edellä mainitun vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin konjugoituna kuvan-25 tamismarkkeriin.
Tämä keksintö koskee lisäksi menetelmää sopivan il-mentämisyhdistelmävehikkelin (-kantajan) valmistamiseksi ja tämän liittämiseksi sopivaan isäntään. Seuraavassa esitetään joitakin näistä menetelmistä. Menetelmä ilmentämis-30 yhdistelmävehikkelin valmistamiseksi käsittää DNA-jakson ’ liittämisen ilmentämisvehikkeliin. Menetelmä transformoi- « dun isännän valmistamiseksi käsittää plasmidin liittämisen * sopivaan isäntään.
Muussa suhteessa tämä keksintö kohdistuu DNA:hän, 35 joka koodaa edellä mainittuja vasta-aineita ja näiden 10 103181 fragmentteja sekä ilmentämisvektoreihin tai plasmideihin, jotka kykenevät aikaansaamaan näiden immunoglobuliinien tuoton sopivissa isäntäsoluissa. Siihen sisältyvät isän-täsolut ja soluviljelmät, jotka ovat tuloksena näillä vek-5 toreilla suoritetusta transformaatiosta.
Kuvioiden selitykset
Kuviossa 1 on kuvattu immunoglobuliinin perusrakenne, johon on merkitty entsymaattiset pilkkoutumiskohdat.
Kuviossa 2 on kuvattu VHaTAG -VH:n, CC46 -VH:n, CC4 9 10 -VH:n, CC83 -VH:n ja CC92 -VH:n nukleotidi jaksot.
Kuviossa 3 on kuvattu VHaTAG -VH:n, CC46 -VH:n, CC49 -VH:n, CC83 -VH:n ja CC92 -VH:n aminohappojaksot.
Kuviossa 4a on kuvattu CC49 -VL:n nukleotidijakso ja kuviossa 4b on kuvattu tätä vastaava aminohappojakso.
15 Kuviossa 5a on kuvattu CC83 -VL:n nukleotidi jakso ja kuviossa 5b on kuvattu tätä vastaava aminohappojakso.
Kuviossa 6a on kuvattu CC92 -VL:n nukleotidi jakso ja kuviossa 6b on kuvattu tätä vastaava aminohappojakso.
Kuviossa 7 on kuvattu plasmidista pGDl eristetyn 20 Hind I - Pst I -fragmentin nukleotidijakso.
Kuviossa 8 on kuvattu pBLUESCRIPT SK(-):n plasmidi- kartta.
Kuviossa 9 on kuvattu pRL101:n plasmidikartta.
Kuviossa 10 on kuvattu pRL10l:ssä oleva CC49:n 25 L-ketjun genomisen DNA:n liittymä.
Kuviossa 11 on kuvattu pRL200:n plasmidikartta.
Kuviossa 12 on kuvattu pRL101:ssä oleva CC83.-n L-ketjun genomisen DNA:n liittymä.
Kuviossa 13 on kuvattu plasmidista pNP9 eristetty 30 EcoR I - BamH I -fragmentin nukleotidijakso.
*
Kuviossa 14 on kuvattu pHH49:n plasmidikartta.
Kuviossa 15 on kuvattu pHS83:n plasmidikartta.
Kuvio 16 esittää CC49 VH:n nukleotidijakson, alleviivattujen segmenttien osoittaessa niitä jaksoja, jotka ! 11 103181 on saatu käyttämällä oligonukleotidialukkeita lähetti -RNA:n yhteydessä.
- Kuvio 17 esittää CC83 VH:n nukleotidijakson, alleviivattujen segmenttien osoittaessa niitä jaksoja, jotka - 5 on saatu käyttämällä oligonukleotidialukkeita lähetti- RNA:n yhteydessä.
Kuvio 18 esittää CC49 VH:n aminohappojakson, alleviivattujen segmenttien osoittaessa niitä jaksoja, jotka on määritetty proteiinin sekvenssoinnilla.
10 Kuvio 19 esittää CC83 VH:n aminohappojakson, alle viivattujen segmenttien osoittaessa niitä jaksoja, jotka on määritetty proteiinin sekvenssoinnilla.
Kuvio 20 esittää SDS-polyakryyliamidigeelitulokset, jotka kuvaavat CC83-vasta-aineen PNGaasi F -käsittelyn 15 tuloksia.
Kuvio 21 kuvaa ihmisen gamma l:n, gamma 2:n, gamma 3:n ja gamma 4:n restriktioentsyymikartan.
Kuviossa 22 on kuvattu pSV2gpt/R/P:n plasmidi- kartta.
20 Kuviossa 23 on kuvattu pSV2gpt-7l-7.8:n plasmidi- kartta.
Kuviossa 24 on kuvattu pSV2gpt-yl-2.3:n plasmidi- kartta.
Kuviossa 25 on kuvattu pSV2gpt-72:n plasmidikartta. .. 25 Kuviossa 26 on kuvattu pSV2gpt-y3-7.8:n plasmidi kartta .
Kuviossa 27 on kuvattu pSV2gpt~74:n plasmidikartta. Kuviossa 28 on kuvattu ρ49γ1-7.8:η plasmidikartta. Kuviossa 29 on kuvattu p49yl-2.3:n plasmidikartta. 30 Kuviossa 30 on kuvattu ρ49-γ2:η plasmidikartta.
Kuviossa 31 on kuvattu ρ49-γ3:η plasmidikartta. Kuviossa 32 on kuvattu ρ49-γ4:η plasmidikartta. Kuviossa 33 on kuvattu ρ83γ1-7.8:η plasmidikartta. Kuviossa 34 on kuvattu ρ83γ1-2.3:η plasmidikartta. 35 Kuviossa 35 on kuvattu ρ83-γ2:η plasmidikartta.
12 103181
Kuviossa 36 on kuvattu ρ83-γ3:η plasmidikartta.
Kuviossa 37 on kuvattu ρ83-γ4:η plasmidikartta.
Kuviossa 38 on kuvattu kokonaisreaktio hybridigee-nien muodostamiseksi, joka perustuu julkaisussa Horton et 5 ai., (1989) Gene 77, 61 esitettyyn menetelmään.
Kuviot 39A, 39B ja 39C esittävät CH44-l:n bioja kaantumisen ja kerääntymisen koko kehon alueelle.
Kuviot 40A ja 4OB esittävät CH84-l:n biojakaantumisen ja kerääntymisen koko kehon alueelle.
10 Tämän keksinnön mukainen immunoglobuliini on kehi tetty vastaukseksi hiiren monoklonaalisiin vasta-aineisiin liittyviin, aiemmin tällä alalla kuvattuihin ongelmiin.
Tämän luonteenomaisena piirteenä on se, että sillä on ki-meerinen rakenne, joka koostuu VHaTAG:sta peräisin olevan 15 DNA:n koodaamasta raskaan ketjun vaihtelevasta alueesta.
Määritelmät "Immunoglobuliini" tarkoittaa tässä käytettynä tet-rameeriä tai tämän aggregaattia riippumatta siitä, onko sille ominaista immunoreaktiivinen aktiivisuus. "Vasta-20 aineet" viittaavat sellaisiin antigeeniä vastaan merkittävää ja tunnettua spesifisyyttä osoittavaa aktiivisuutta omaaviin kokoonpanoihin, jotka käsittävät kevyet ja raskaat ketjut, joiden välillä joko on kovalenttinen sidos tai tämä puuttuu. "Epäspesifinen immunoglobuliini" ("NSI") 25 tarkoittaa niitä immunoglobuliinejä, joilla ei tiedetä olevan tunnettua spesifisyyttä antigeeniä vastaan.
Immunoglobuliinin rakenteen perusyksikkö selkärankaisten järjestelmissä on suhteellisen hyvin tunnettu [Edelman, G.M., (1971) Ann. N.Y. Acad. Sei., 190, 5]. Ku- 30 ten kuviosta 1 nähdään, yksiköt koostuvat kahdesta saman- 4 laisesta kevyestä polypeptidiketjusta, joiden molekyyli-paino on noin 23 000 daltonia, ja kahdesta samanlaisesta raskaasta ketjusta, jonka molekyylipaino on 53 000 - 70 000. Nämä neljä ketjua liittyvät disulfidisidoksin 35 "Y":n muotoiseksi kuvioksi, jossa raskaat ketjut jäävät 13 103181 kevyiden ketjujen väliin alkaen Y:n suulta ja jatkuen vaihtelevaa luonnetta osoittavan alueen läpi. r Raskaat ketjut luokitellaan gammaksi, myyksi, al faksi, deltaksi tai epsiloniksi, joiden joukossa on joita-' 5 kin alaluokkia. Sen vuoksi, että tässä ketjussa on pitkä muuttumaton alue, vasta-aineen luokka määräytyy sen luonteen mukaan IgA:ksi, IgDrksi, IgEtksi, IgG:ksi tai IgMrksi.
Kevyet ketjut luokitellaan joko kappa- (k) tai 10 lambda (X) -ketjuksi. Kukin raskaan ketjun luokka voi sitoutua kevyen joko kappa- tai lambda-ketjun kanssa. Kevyet ja raskaat ketjut sitoutuvat yleensä toisiinsa kovalentti-sesti ja kahden raskaan ketjun ''häntä"osat sitoutuvat toisiinsa kovalenttisilla disulfidisidoksilla immunoglobulii-15 nien muodostuessa hybridoomien tai B-solujen toimesta. Jos ketjujen ei-kovalenttinen yhteenliittyminen voidaan saada toteutumaan oikeaa geometriaa noudattaen, kykenevät disul-fidisidoksilla kytkeytymättornien ketjujen muodostamat aggregaatit vielä reagoimaan antigeenin kanssa.
20 Aminohappojaksot alkavat Y:n haarautuneissa päissä olevista N-terminaalisista päistä ja jatkuvat kummankin ketjun alapäässä olevaan C-terminaaliseen päähän. Vaihte-leva osa on N-terminaalisessa päässä ja C-terminaalinen pää on muuttumaton alue.
;· 25 Termejä "muuttumaton" ja "vaihteleva" käytetään toiminnallisesti. Sekä kevyiden (VL) että raskaiden (VH) ketjujen vaihtelevat alueet määräävät sitoutumiseen tarvittavan tunnistuskyvyn ja antigeeniä vastaan suunnatun spesifisyyden. Kevyiden (CL) ja raskaiden (CH) ketjujen 30 muuttumattoman alueen osiin sisältyy tärkeitä biologisia v ominaisuuksia, kuten vasta-aineketjujen assosiaatio, eri tys, siirtyminen istukasta sikiöön, ja komplementin sito- i minen.
Kummassakin ketjussa vaihteleva alue liittyy muut-35 tumattomaan alueeseen V-geenijakson ja C-geenijakson liit- 14 103181 tävällä liitoksella. Liittäminen tapahtuu genomisella tasolla siten, että nukleotidijaksot liittyvät rekombinaa-tiokohtien välityksellä. Liittävä jakso tunnetaan nykyisin 12 aminohappoa koodaavana "J"-jaksona kevyen ketjun gee-5 nissä ja yhteensä noin 25 aminohappoa koodaavana "D"- ja "J"-jakson yhdistelmänä raskaan ketjun geenissä.
"Kimeerinen vasta-aine" tarkoittaa tämän keksinnön yhteydessä vasta-ainetta, jonka raskaassa ketjussa on hiiren ituradan geenistä peräisin olevan nukleiinihappojakson 10 koodaama vaihtelevan alueen aminohappojakso ja ihmisgeenistä peräisin olevan nukleotidijakson koodaamat muuttumattoman alueen aminohappojaksot.
Tämän keksinnön tarkoituksena ei kuitenkaan ole rajoittua kapea-alaisesti vain korvaamaan immunoglobulii-15 nin muuttumattomia alueita koodaavat hiiren C-geenin jak-| sot immunoglobuliinin muuttumattomia alueita koodaavilla ihmisen C-geenin jaksoilla. Tätä keksintöä ei siten rajoita se, onko fuusiokohta vaihtelevan ja muuttumattoman alueen rajalla vai ei.
20 Tässä keksinnössä kuvattujen nukleotidijaksojen j. koodaamia muunnettuja kimeerisiä vasta-aineita, koostettu ja kimeerisiä vasta-aineita ja fragmentoituja kimeerisiä vasta-aineita on nykyisin mahdollista tuottaa useilla eri menetelmillä.
.. 25 "Kooste"immunoglobuliinit käsittävät polypeptideis- tä koostuvia vaihtelevia alueita, joiden ei ole aiemmin havaittu luonnossa liittyvän yhteen. Ei ole ratkaisevaa, ovatko nämä liittyneet kovalenttisesti tai ei-kovalentti-sesti, kunhan aggregaatti pystyy valikoivasti reagoimaan := 30 tietyn antigeenin tai antigeeniryhmän kanssa.
"Muunnetut" vasta-aineet tarkoittavat vasta-aineita, joissa aminohappoja on muunneltu, varsinkin vaihtele-: r valla alueella olevien aminohappojaksojen ollessa kysees sä. Koska yhdistelmä-DNA-tekniikat ovat olennaista tälle 35 keksinnölle, ei ole tarpeen rajoittua luonnollisista läh- 55 15 103181 teistä peräisin olevien vasta-aineiden aminohappojaksoihin; vasta-aineiden aminohappojaksot voidaan suunnitella uudelleen haluttujen ominaisuuksien saavuttamiseksi. Mahdollisia variaatioita on monia ja ne ulottuvat yhden tai * 5 muutaman aminohapon muutoksesta vasta-aineen vaihtelevan ja/tai muuttumattoman alueen täydelliseen uudelleenmuokkaukseen.
Muutoksia vaihtelevaan alueeseen tehdään antigeenin sitomisominaisuuksien parantamiseksi . Muutoksia muuttumat-10 tomaan alueeseen tehdään yleensä sellaisten solutoimintojen ominaisuuksien parantamiseksi, kuten komplementin sitominen, vuorovaikutus kalvojen kanssa ja muut efektori-toiminnot. Muutoksia voidaan tehdä tavallisilla yhdistelmät ekniikoi11a sekä oligonukleotidikohdemutageneesilla 15 [Dalbadie-McFarland, et ai. . (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 6409].
Immunoglobuliinien "fragmentteihin" kuuluvat vasta-ainemolekyylin proteolyyttisesti pilkotut tai yhdistelmä-tekniikoilla valmistetut osat, jotka kykenevät reagoimaan 20 valikoivasti tietyn antigeenin tai antigeeniryhmän kanssa. Keksinnön suoja-aluetta rajoittamattomiin esimerkkeihin näistä proteolyyttisistä ja/tai yhdistelmäfragmenteista kuuluvat "Fab", "F(ab')2» ja "Fab'", joiden proteolyysissä pilkkoutuvat kohdat on esitetty kuviossa 1; sekä "Fv" ja .. 25 "VH". "Fv"-fragmentti tarkoittaa sitä, että kevyen ketjun vaihtelevien ja raskaan ketjun vaihtelevien alueiden osia liittyy yhteen yleensä karboksiterminaalisista osistaan. Fv-fragmenttien tuottamiseen tarkoitettuja yhdistelmätek-niikoita on esitetty patenttijulkaisuissa W0 88/01 649, WO 30 88/06 630, WO 88/07 085, WO 88/07 086 ja WO 88/09 344.
"VH"-fragmentti tarkoittaa sitä, että vaihtelevalla alueella on ainakin osa raskaan ketjun vaihtelevaa aluetta, jota * kyetään käyttämään antigeenin sitomistoimintona. Kevyen ketjun vaihtelevan alueen (VL) valmistus ja käyttö anti- 35 geeniä sitovassa toiminnossa esitetään artikkelissa, jonka 16 103181 otsikko on "Development of biologically active peptides based on antibody structure", Williams et al ♦ . (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5537 - 5541.
Tässä keksinnössä "eläimiin" kuuluviksi on tarkoi-5 tettu nautaeläimet, siat, jyrsijät ja kädelliset ihmiset mukaan lukien, ja muut.
"Ilmentämisvektorille" annetaan toiminnallinen määritelmä, johon käsitteeseen liittyy mikä tahansa DNA-jakso, joka kykenee aikaansaamaan määrätyn DNA-koodin ilmenit) tymisen sopivassa isännässä. Nämä vektorit ovat nykyään plasmidien muodossa; "plasmidia" ja "ilmentämisvektoria" käytetään siten usein toisiaan korvaten. On kuitenkin tarkoitus, että tähän keksintöön kuuluvat muutkin vastaavalla tavalla toimivat ilmentymisvektorit, joita tällä alalla 15 opitaan ehkä toisinaan tuntemaan.
"Transformaatiolla" tarkoitetaan sitä, että vastaanottavaan isäntäsoluun viedään DNA:ta, joka muuttaa genotyyppiä sillä seurauksella, että tuloksena on muuttunut vastaanottajasolu.
20 "Isäntäsolut" tarkoittavat soluja, jotka on trans formoitu yhdistelmätekniikoita soveltaen vektoreilla, jotka on konstruoitu yhdistelmä-DNA-tekniikoilla. Tässä yhteydessä määritellysti tapahtuu isäntäsolun vasta-aineen tai tämän muunnoksen tuotto tällaisen transformaation an- 25 siosta.
Kuvattaessa menetelmiä vasta-aineiden eristämiseksi yhdistelmäisännistä, käytetään käsitteitä "solu" ja "soluviljelmä" toisiaan korvaavina tarkoittamaan vasta-aineen lähdettä, ellei toisin selvästi mainita. Toisin sanoen, i 30 vasta-aineen talteenotto "soluista" voi tarkoittaa tai- A ^ : teenottoa sentrifugoiduista kokonaisista soluista tai so luviljelmästä, joka sisältää sekä ravintoliuoksen että ! f siihen suspendoidut solut.
17 103181
Lyhenteet
Nukleiinihapot, aminohapot, peptidit, suojaavat ryhmät, aktiiviset ryhmät ja samantyyppiset osat lyhennetään lyhennyksiä käytettäessä IUPABIUBm (Commission on · 5 Biological Nomenclature) tai asianomaisten alojen käytän nön mukaan. Seuraavat ovat esimerkkejä.
Reagenssit EDTA: etyleenidiamiinitertaetikkahappo SDS: natriumdodekyylisulfaatti 10 Nukleiinihapot RNA: ribonukleiinihappo DNA: deoksiribonukleiinihappo
Typpiexnäkset
Puriinit Pyrimidiinit 15 A: adeniini T: tyrniini G: guaniini C: sytosiini U: urasiili
Sekä DNA että RNA sisältävät pitkiä fosforihaposta, sokerista ja typpiemäksistä koostuvia ketjuja. DNA on kak-20 sinauhainen kierre, jossa sokeri on 2-deoksiriboosi, kun taas RNA on yksinauhainen, ja siinä sokeri on D-riboosi. Neljä typpiemästä, jotka ovat luonteenomaisia DNA-nukleo-tideille, liittyvät komplementaarisina pareina vetysidok-silla DNA:n kaksoiskierteen muodostamiseksi; adeniini :· 25 liittyy tymiiniin; guaniini liittyy sytosiiniin. RNA:ssa urasiili korvaa tymiinin luetelluissa DNA-pareissa.
Aminohapot
Gly: glysiini Phe: fenyylialaniini
Ala: alaniini Tyr: tyrosiini 30 Vai: väliini Thr: treoniini V Leu: leusiini Cys: kysteiini lieu: isoleusiini Met: metioniini ‘ Ser: seriini Glu: glutamiinihappo
Asp: asparagiinihappo Trp: tryptofaani 35 Lys: lysiini Pro*, proliini 103181 18
Arg: arginiini Asn: asparagiini
His: histidiini Gin: glutamiini
Vaihteleva alue
Raskasta ketjua koodaava DNA koostuu VH-geenijaksos-5 ta, DH-geenijaksosta ja JH-geenijaksosta. Kevyttä ketjua koodaava DNA koostuu VL-geenijaksosta ja JL-geeni jaksosta.
V„-geenijakso Tämä keksintö kohdistuu valikoituihin kimeerisiin vasta-aineisiin, joilla olevaa VH:ta koodaa spesifisesti 10 TAG-72:ta vastaan reagoivasta ituradan geenistä (VHaTAG) johdettu DNA-jakso, jonka geenin nukleotidijärjestys on esitetty kuviossa 2. Kimeeriset vasta-aineet valikoidaan näiden kyvyn perusteella sitoa TAG-72:ta, joka tarkoittaa sitä, että vaihteleva osa sitoutuu TAG-72:een ainakin 25 % 15 paremmin kuin B72.3:n vaihteleva osa sitoutuu TAG-72:een. Kimeerisen vasta-aineen ja B72.3-.n sitoutumisaffiniteetit määritetään yleensä samalla menetelmällä. Esimerkkejä vasta-aineiden sitoutumisaffiniteetin mittausmenetelmistä esitetään seuraavissa viitteissä: Scatchard, G., (1949) 20 Annals of the N.Y. Acad. of Sciences 51, 660; Steward, ; M.W. ja Petty, R.E., (1972) Immunology 23, 881; Muraro, R., et ai.. (1988) Cancer Research 48, 4588 ja Heyman, B., (1984) J. of Immunol. Methods 68, 193 - 204.
- Alan ammattimies käsittää, että tuloksena tästä 25 keksinnöstä, siis VHocTAG:n nukleotidijärjestyksestä (ja tämän koodaamasta aminohappojaksosta), tämän keksinnön on tarkoitus kattaa sisällöltään homologiset nukleotidijaksot ja vastaavat aminohappojaksot. "Sisällöltään homologiset" tarkoittaa sitä, että nukleotidi- tai aminohappojaksot 30 ovat identtiset tai lähes identtiset. Tässä kuvauksessa on ' ’· siten itsestään selvää, että homologisissa jaksoissa voi esiintyä pientä sekvenssivaihtelua ja että mitkä tahansa i -- ? jaksot, joilla on ainakin 80-%:inen homologia, tulkitaan _ toisiaan vastaaviksi.
i_ 35 Homologia ilmoitetaan toisiaan vastaavien emästen (tai aminohappojen) osuutena tai prosenttiosuutena sen ie 19 103181 jälkeen, kun kaksi (mahdollisesti eripituista) jaksoa on aseteltu toisiinsa nähden rinnakkain. Käsitettä rinnak-kainasettelu käytetään siinä mielessä kuin sen ovat määritelleet Sankoff ja Kruska teoksensa The Time Warps, String 5 Edits, and Macromolecules; The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA (1983) ensimmäisessä luvussa. Pääpiirteissään esitettynä tapahtuu kahden jakson rinnakkainasettelu maksimoimalla toisiaan vastaavien emästen (tai aminohappojen) lukumäärä kahden 10 jakson välillä lisäämällä minimimäärä "tyhjiä"- tai "nolla" -emäksiä jompaankumpaan jaksoon maksimaalisen limittymisen saavuttamiseksi.
Kuten tällä alalla on selvää, nukleotidien vastaa-vuuseroja voi esiintyä koodisanan kolmannen eli horjuvan 15 emäksen kohdalla ilman, että tästä aiheutuu aminohappojen korvautumisia lopullisessa polypeptidijaksossa. Voidaan myös sietää pieniä merkityksettömiksi katsottavia nukleo-tidimuutoksia (korvautumisia, lisäyksiä tai poistumia) geenijakson tietyillä alueilla aina silloin, kuin muutok-20 sen tuloksena on sellainen muutos aminohappojaksossa, joka ei muuta lopullisen tuotteen toiminnallista luonnetta. On osoitettu, että kemiallisesti syntetisoidut erät kokonaisia geenijaksoja tai jaksojen osia voivat korvata luonnollisen geenin vastaavia alueita geenin toiminnan tästä kär-.. 25 simättä.
Alan ammattimiehet voivat tunnistaa tietyt DNA-jaksojen homologit käyttäen nukleiinihappojen ristiinhybri-disoitumista rajoittavien olosuhteiden vallitessa, kuten tällä alla hyvin tiedetään [kuvaus tästä on esitetty teok-30 sessa Nucleic Acid Hybridization, Hames ja Higgens (toim.) IRL Press, Oxford, UK (1985)]. Kun kaksi jaksoa tunnetaan, on saatavissa algoritmeja näiden homologian laskemiseksi, * esim. Needleham & Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48, 443 - 453 ja Sankoff ja Kruska (viittaus edellä), sivut 23 - 29.
35 Näiden vertailujen suorittamiseksi on myös saatavissa kau- 20 103181 pallisia palveluja, esim. Intelligenetics, Inc. (Palo Alto, CA).
« DB~ ja JB-geenijaksot
Dh- ja JH-geenijaksoista esiintyy useita eri tyyppe-5 jä, vaikkakin valitun D- tai J-geenisegmentin tyyppi ei ole tämän keksinnön suhteen ratkaiseva. Toisin sanoen DH ja JH voivat olla peräisin mistä tahansa eläimestä. Edullisiin eläimiin kuuluvat hiiret ja ihmiset. Ihmisen DH- ja/tai JH-geenisegmentit ovat luonnollisesti erityisen edullisia, 10 mutta tätä keksintöä ei rajoiteta näin, jos toisen eläimen Dh- ja JH-geenisegmenteistä saadaan tärkeä ominaisuus, esimerkiksi parempi sitoutumiskyky TAG-72:een.
Kuvaavia esimerkkejä hiiren DH- ja JH-jaksoista esitetään julkaisuissa "Organization, Structure, and Assembly 15 of Immunoglobulin Heavy Chain Diversity DNA Segments",
Kurosawa ja Tonegawa, (1982) J. Exp. Med. 155, 201 ja ; Sequences of the Joining Region Genes for Immunoglobulin 1 Heavy Chains and Their Role in Generation of Antibody
Diversity" Gough ja Bernard, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci.
" 20 USA 78, 509.
Kuvaavia esimerkkejä ihmisen DH- ja JH-jaksoista esitetään julkaisussa "Human Immunoglobulin D Segments encoded in Tandem Multigenic Families", Siebenlist et al. .
(1981) Nature 294, 631 ja kuvaavia esimerkkejä ihmisen JH-: 25 jaksoista julkaisussa "Structure of the Human Immunoglobu lin μ Locus: Characterization of Embryonic and Rearranged J and D Genes", Ravetch et al.. (1981) Cell 27, 583.
VL- ja JL-geenijaksot
Yleensä voidaan käyttää mitä tahansa VL- ja JL-gee-30 nijaksoa, joka koodaa VHaTAG:n suhteen sisällöltään homolo- i ” t - • t gisen nukleotidi jakson koodaaman VH:n suhteen komplementaa rista VL:n osaa. "Komplementaarisella" tarkoitetaan VL:ää,
f— I
joka sitoutuu VH:hon ja josta saadaan vasta-aineen vaihtein leva alue, jolla on ainakin 25 % suurempi sitoutumisaf- 35 finiteetti kuin B72.3:lla millä tahansa tavallisella si- 21 103181 toutumisaffiniteettivakioiden määritysmenetelmällä määritettynä .
Valitun VL- tai JL-geenisegmentin tyyppi ei ole tämän keksinnön suhteen ratkaiseva. Toisin sanoen VL ja JL 5 voivat olla peräisin mistä tahansa eläimestä. Edullisiin eläimiin kuuluvat hiiret ja ihmiset. Ihmisen VL ja/tai JL-geenisegmentit ovat luonnollisesti erityisen edullisia, mutta tätä keksintöä ei rajoiteta näin, jos toisen eläimen VL ja JL-geenisegmenteistä saadaan tärkeä ominaisuus, esi-10 merkiksi parempi sitoutumiskyky TAG-72:een.
Hiiren JL-jaksot esitetään julkaisussa "The Nucleotide Sequence of a 5,5-kilobase DNA Segment Containing the Mouse Kappa Immunoglobulin J and C Region Genes", Max e£ al., (1981) J. Biol. Chem. 256 5116 - 5120. Ihmisen JL-15 jaksot esitetään julkaisussa "Evolution of Human Immunoglobulin K J Region Genes", Heiter et al. . (1982) The
Journal of Biological Chemistry 357 1516 - 1522.
Vaihtelovien alueiden johtaminen
Edellä opitun perusteella on mahdollista johtaa 20 useita tämän keksinnön suojapiiriin kuuluvia yksityiskohtaisia sovellutusmuotoja, jotka koskevat vasta-aineiden vaihtelevia alueita, ts. alueita, joiden VH-jaksot ovat sisällöltään homologisia VHaTAG:n suhteen ja jotka sitoutuvat TAG-72:een ainakin 25 % paremmin kuin mitä B72.3:n ; 25 vaihteleva alue sitoutuu TAG-72:een, kun vasta-aineen ja B72.3:n sitoutumisaffiniteetit mitataan samalla menetelmällä. Seuraavassa on esitetty useita mahdollisia menetelmiä .
Luonnollisella tavalla muodostetut vaihtelevat alu-3 0 eet
Reagoidessaan immunogeeniä, TAG-72:ta, vastaan immunisoitu eläin lisää valittuja vasta-ainetta tuottavia * B-solujaan. B-solujen tuottamien vasta-aineiden vaihteleva alue tulee olemaan ituradan uudelleenjärjestyneiden ras-35 kaan ja kevyen ketjun DNA:n koodaamaa. Uudelleenjärjesty- 22 103181 neeseen ituradan raskaaseen ketjuun kuuluvat esimerkiksi V- D- ja J-geenisegmentit johtojaksoineen sekä mitkä ta-hansa intronit, jotka voidaan myöhemmin poistaa. Kevyttä ketjua koodaavaan DNA:han tulee sisältymään V- ja J-gee-5 nisegmentit johtojaksoineen sekä mitkä tahansa intronit, jotka voidaan myöhemmin poistaa.
Vaihtelua voi syntyä B-soluissa tapahtuvista somaattisista mutaatioista VHocTAG:n vasta-ainetta tuottavan uudelleenjärjestymisen aikana. Nämä somaattiset mutaatiot 10 ovat nukleotidimuutoksia, joiden seurauksena voi syntyä tai jäädä syntymättä aminohappomuutos, joka muuttaa vasta-ainetta tuottavasti uudelleenjärjestyneen VH:n aktiivisuutta TAG-72:ta kohtaan.
Seulontamene telinä t 15 Monoklonaalisia ja polyklonaalisia vasta-aineita „ voidaan seuloa sen määrittämiseksi, mitkä mainituista vas ta-aineista sitoutuvat valikoivasti TAG-72:een. Tällainen ; seulonta voidaan tehdä millä tahansa monista tunnetuista i menetelmistä, kuten kiinteän faasin radioimmunomäärityk- - 20 sellä, entsyymivälitteisillä immunosorbenttimäärityksillä, rosetinmuodostusmäärityksillä ja toimintakyvyn estoon perustuvilla määrityksillä. Nämä menetelmät ovat sinänsä hy-~ vin tunnettuja.
Tässä keksinnössä on nyt saatu selville VHaTAG:n : 25 vasta-aineita tuottavasta uudelleenjärjestymisestä synty viä vaihtelevia alueita koodaavat nukleotidijaksot. Ku-viossa 2 esitetään VHaTAG:n nukleotidijakson lisäksi nukleotidi jaksot , jotka koodaavat CC46:n, CC49:n, CC83:n ja j, CC92:n raskaan ketjun vaihtelevien alueiden nukleotidijak- 30 soja. Kuviossa 3 esitetään VHaTAG -VH:n, CC46 -VH.-n, CC4 9 ' ~ * * \ -VH:n, CC83 -VH:n ja CC92 -VH:n aminohappojaksot, jotka vas- taavat kuviossa 2 esitettyjä nukleotidijaksoja. V„aTAG , -VH:n, CC46 -VH:n, CC49 -VH.-n, CC83 -VH:n ja CC92 -VH:n ami nohappo jaksojen vertailusta käy ilmi silmiinpistävimpänä ' f· 23 103181 piirteenä se, että nämä ketjut ovat hyvin huomattavassa määrin samanlaisia.
CC46 -VH-, CC49 -VH-, CC83 -VH- ja CC92 -VH -alueita koodaavan DNA:n samankaltaisuus erityisesti 5'-pään 5 puoleisessa segmentissä on todisteena sille, että nämä DNA-jaksot ovat peräisin VHaTAG:sta. B-solussa ilmentyvän VH-alueen geenin vasta-ainetta tuottavan uudelleenjärjestymisen aikana tapahtuvat somaattiset mutaatiot tuottavat joitakin nukleotidimuutoksia, joiden tuloksena voi syntyä 10 tai jäädä syntymättä homologisen aminohapon muutos kahden vasta-ainetta tuottavasti uudelleenjärjestynyttä vasta-ainetta tuottavan VHaTAG -hybridooman välille.
CC49 VL*.n nukleotidi jaksot ja vastaavat aminohappo-jaksot on esitetty kuvioissa 4a ja 4b. CC83 VL:n nukleoti-15 dijaksot ja vastaavat aminohappojaksot on esitetty kuvioissa 5a ja 5b. CC92 VL:n nukleotidi jaksot ja vastaavat aminohappojaksot on esitetty kuvioissa 6a ja 6b.
Koetinmenete lmät
Muita VHaTAG:sta peräisin olevan DNA:n koodaamia 20 vasta-aineita voidaan johtaa käyttäen VHaTAG:a koettimena hybridisoinnissa. Alan ammattimiehet voivat yleensä käyttää koetinta, joka on valmistettu VHaTAG-.n RNA:sta tai DNArsta tai rekombinoitunutta VHaTAG:a sisältävistä uudelleenjärj estyneistä geeneistä, havaitsemaan homologisia :· 25 geenejä tuntemattomissa hybridoomissa. Näillä homologisil la vasta-aineilla on DNA-jakso, jonka lähetti-RNA hybridi -soituu koettimen kanssa, joka koostuu joko kokonaisuudessaan tai osittain VHaTAG:sta ja tämän molemminpuolisista vierusalueista. "Vierusalueisiin" on tarkoitus kuulua ne 30 DNA-jaksot, jotka ulottuvat VHaTAG:n 5'-päästä edeltävän geenin 3'-päähän ja VHaTAG:n 3'-päästä tästä myöhempänä olevan geenin 5'-päähän.
24 103181
Suunnitelmallisesti syntetisoidut vaihtelevat alueet
Vielä yksi lähestymistapa on tässä kuvattujen vas- * ta-aineiden sekä koettimien avulla löydettyjen vasta-ai-5 neiden vaihtelevien alueiden suunnitelmallinen synteesi.
Tällä lähestymistavalla on useita mahdollisia etuja. Tutkijan ei nimittäin olisi tarpeen seuloa immunisoituja koe-eläimiä yrittäessään ensin löytää ne vasta-aineet, jotka sitoutuvat TAGrhen ja sitten löytää ne vasta-aineet, joil-10 la erityisesti on VHaTAG.-sta peräisin olevan DNA:n koodaamat VH-alueet.
Mutageneesimenetelmät VH- ja/tai VL-geenijaksoja voidaan "muokata" muta-geneesillä. Kuvaaviin esimerkkeihin näistä menetelmistä 15 kuuluvat eri nukleotidien pienten määrien lisäykset, de-leetiot tai tuotteen ominaisuutta säilyttämättömät korvautumat tai tuotteen ominaisuudet säilyttävät useiden nukleotidien korvautumat edellyttäen, että asianmukainen lu-kuvaiheistus säilyy.
20 Korvautumia, deleetioita, lisäyksiä tai mitä tahan sa näiden alayhdistelmiä voidaan yhdistää toisiinsa lopullisen konstruktion aikaansaamiseksi. Koska koodisanojen mahdollisia jaksoja on 64 mutta aminohappoja on vain 20, geneettinen koodi on horjuva siinä mielessä, että eri koo-;· 2 5 disanoista voi olla tuloksena sama aminohappo. Koodi on kuitenkin tarkka kunkin aminohapon suhteen; siten kullekin aminohapolle on ainakin yksi koodisana, ts. jokaisesta koodisanasta saadaan vain yksi aminohappo eikä muita aminohappoja. On selvää, että translaation aikana on lukuvai-| 30 heistuksen säilyttävä oikeana, jotta lopputuloksena ole- t vaan polypeptidiin saadaan oikea aminohappojakso.
, 1 Menetelmät ennakolta määrättyihin aminohappokohtiin tehtävien lisäysten suorittamiseksi ovat tunnettuja. Esi-! merkkeihin näitä menetelmistä kuuluvat oligonukleotidivä- 35 litteinen kohdemutageneesi ja polymeraasiketjureaktio.
25 1 03 1 81
Menetelmät ennakolta määrättyihin aminohappokohtiin tehtävien deleetioiden suorittamiseksi ovat tunnettuja. Esimerkkeihin näitä menetelmistä kuuluvat oligonukleotidi-välitteinen kohdemutageneesi ja polymeraasiketjureaktio.
5 Menetelmät ennakolta määrättyihin aminohappokohtiin tehtävien korvausten suorittamiseksi ovat tunnettuja. Esimerkkeihin näitä menetelmistä kuuluvat oligonukleotidivä-litteinen kohdemutageneesi ja polymeraasiketjureaktio.
Oligonukleotidivälitteinen kohdemutageneesi käsit-10 tää olennaisesti haluttua mutaatiota koodaavan oligonukle-otidin hybridisoimisen mutatoitavan alueen käsittävään yksinauhaiseen DNA:hän ja tämän yksinauhaisen nauhan käytön oligonukleotidin pidentämisen templaattina mutaation sisältävän nauhan tuottamiseksi. Tämä menetelmä eri muo-15 töineen on kuvattu julkaisuissa Zoller, M.J., ja Smith, M., (1982) Nucl. Acids Res. 10, 6487 - 6500; Norris, K.,
Norris, F., Christiansen, L. ja Fiii, (1983) N. Nuc. Acids Res. 11, 5103 - 5112; Zoller, M.J. ja Smith, M., (1984) DNA 3, 479 - 488; Kramer, W. , Schughart, K. ja Fritz, 20 W.J., (1982) Nuc. Acids Res. 10, 6475 - 6485.
Polymeraasiketjureaktio (PCR) sisältää olennaisesti DNA:n eksponentinalisen monistamisen in viro käyttäen sekvenssiltään määrättyjä oligonukleotidejä. Oligonukleoti-deihin voi haluttaessa sisältyä jaksojen muutoksia. Poly-;· 25 meraasiketjureaktiomenetelmä on kuvattu julkaisussa Mullis ja Faloona, (1987) Meth. Enz. 155, 335 - 350. Esimerkkejä PCR:ää käyttävistä mutageneeseistä on kuvattu julkaisuissa Higuchi et ai. . (1988) Nucl. Acids Res. 16, 7351 - 7367;
Ho et ai., (1989) Gene 77, 51 - 59 ja "Engineering Hybrid 30 Restriction Genes Without the Use of Restriction Enzymes: Gene Splicing by Overlap Extension", Horton et al.. (1989)
Gene 77, 61.
’ Muutosten teolla vasta-aineen vaihteleviin aluei siin voi olla erityistä käyttöä monoklonaalisten vasta-35 aineiden terapeuttisessa käytössä. Kun nykyisin annostel- 26 103181 laan hiiren täydellisen vaihtelevan alueen käsittävää ki-meeristä vasta-ainetta ruiskeina ihmiseen, ihmisruumiin immuunijärjestelmä tunnistaa hiiren vaihtelevan alueen vieraaksi, vaikka tämä alue on pienempi kuin hiiren koko-5 nainen vasta-aine, ja tuottaa tätä vastaan immuunivasteen. Kun sitten ihmiseen injektoidaan myöhemmin hiiren vasta-ainetta tai kimeeristä vasta-ainetta, tämän aineen tehokkuus pienenee huomattavasti kehon immuunijärjestelmän vierasta vasta-ainetta vastaan suunnatun toiminnan ansiosta. 10 Tästä seuraa se, että hiiren VH- ja VL-alueisiin tehdyt muutokset voivat vähentää ihmisen immuunivastetta muunnettua vasta-ainetta vastaan.
Yhdistelmä-DNA-tekniikat
Vasta-aineita voidaan konstruoida yhdistelmä-DNA-15 tekniikoilla. Toisin sanoen, koska useiden eri VH:ta ja VL.-ää koodaavien alueiden nukleotidi jaksot on nyt saatu käyttöön, voi alan ammattimies tuottaa täydellisen, raskaiden ja kevyiden ketjujen vaihtelevia alueita koodaavan geenin in viro.
20 Konstruoitu geeni voidaan suunnitella siten, että valitut Dh- ja JH-geenisegmentit ovat siinä toiminnallisessa yhteydessä valitun VH-geenisegmentin kanssa, ts. VHaTAG-I segmentin tai CC49:n tai CC83:n VH-geenisegmentin kanssa.
Konstruoitu raskasta ketjua koodaava DNA sisältää :* 25 esimerkiksi DH- ja JH-geeni jaksot, jotka ovat ituradan VHaTAG-geenisegmentin vieressä täydentäen näin CDR3:n ja VH-alueen kehyksen (FR) 4. Johtojakso voi olla läsnä tai se voidaan myöhemmin poistaa.
Käytetystä kevyestä ketjusta riippuen voi olla myös 30 tarpeen saada käyttöön konstruoitua kevyttä ketjua koodaava DNA. Tämä DNA käsittää toiminnallisessa yhteydessä olevan VL-geenisegmentin, joka on esimerkiksi JL-geenisegmen-tin vieressä ja johon liittyy johtojakso, joka voidaan myöhemmin poistaa. JL-geenisegmentti vaihtelee riippuen 35 siitä, kuuluuko kevyt ketju lambda- vai kappasysteemiin. n fl 27 103181 J-alueen jakso on VL-eksonin loppupään vieressä täydentäen VL-osan FR 4 -.n. Tämä konstruktio voidaan tehdä VH-geenin konstruktioon käytetyillä menetelmillä.
Konstruoitu geeni voidaan muokata esimerkiksi ta-5 vanomaisilla yhdistelmätekniikoilla ilmentymiskykyisen geeni-insertin aikaansaamiseksi plasmidiin. Tämän jälkeen plasmideja voidaan ilmentää isäntäsoluissa. Seuraavassa esitetään esimerkkejä biologisista yhdistelmämenetelmistä.
Kun suunnitellaan otattavaksi käyttöön fragmentti, 10 joka koodaa joko kevyen ketjun tai raskaan ketjun vaihte-levaa aluetta, on tavallisesti haluttua se, että J-aluetta jäljempänä oleva introni liitetään mukaan kokonaisuudessaan tai osittain varsinkin silloin, kun vaihteleva alue on peräisin isännästä, jossa fuusioitua geeniä tullaan 15 ilmentämään. Silloin, kun introni säilytetään, tarvitaan intronin päissä olevat toimintakelpoiset irrotuskohdan vastaanottaja- ja luovuttajajaksot. J:n ja fuusioidun geenin muuttumattoman alueen välinen introni voi olla ensisijaisesti intronijakso, joka liittyy (1) muuttumattomaan 20 alueeseen, (2) J-osaan tai (3) osiin molemmista. Viimeksi mainittu voi soveltua käytettäväksi mukavuussyistä silloin, kun kätevä restriktiokohta esiintyy näistä kahdesta lähteestä peräisin olevissa introneissa. Voi olla tarpeen ottaa käyttöön sovittamia intronin liittämiseksi muuttu-:· 25 mattomaan alueeseen. Joissakin tapauksissa introni voidaan muokata kokonaan tai osittain deleetiolla, nukleotidi(e)n korvauksella (-silla) tai insertiolla käsittelyhelppouden, ilmentymisen tai muun sellaisen parantamiseksi. Edullisesti tulisi intronia olla riittävästi, jotta siihen sisäl-30 tyisi ilmentymisen tehostaja-alue, joka on toiminnallises-ti aktiivinen luonnossa esiintyvän promoottorin kanssa.
Vaihtoehtoisesti voi olla haluttua se, että fuusi-1 oidussa geenissä ei esiinny J-geenin ja C-geenin välistä intronia. J-geenin 3'-pää tulee siten olemaan C-geenin 5'-35 pään vieressä. Voidaan käyttää eksonukleaasia ja vaihtele- 28 1 03 1 81 via pilkkoutumisaikoja käyttäen voidaan saada erilaisia 3'-päitä, joita sitten voidaan käyttää muuttumattomaan alueeseen tehtävään liitokseen ja suorittaa valinta toi- ' minnallisen tuotteen suhteen useilla eri tavoilla; tai 5 suorittamalla leikkaus pidentämällä limittäin olevia osia polymeraasiketjureaktiomenetelmällä (ks. Horton et ai., yllä). Tässä tapauksessa käytetään yleensä keinotekoista promoottoria, jonka ei tarvitse olla toiminnallisesti aktiivinen tehostaja-alueen kanssa.
10 Yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa voidaan muuttaa VH- ja VL-alueita koodaavia geenejä korvaamalla ainakin osia vasta-aineen vaihtelevien osien kevyessä ja raskaassa ketjussa olevista kömpiementaarisuutta määräävistä alueista (CDR) minkä tahansa eri spesifisyyden omaa-15 van vasta-aineen CDR:ien analogisilla osilla. Esimerkkinä CDR: ien korvausmenetelmästä on patenttihakemus julkaisuihin Gregory Winter, EP-0 239 400 ja Huston, et ai. PCT WO 88/ 09 344 sisältyvä oppi. Tämän keksinnön mukaisessa muunnetussa vasta-aineessa vain vasta-aineen CDR:t ovat ihmis-20 ruumiille vieraita ja tämän tulisi minimoida sivuvaikutukset, jos tätä vasta-ainetta käytetään ihmisten hoitoon.
Ihmisen ja hiiren kehysalueilla on kuitenkin luonteenomaiset piirteensä, jotka erottavat ihmisen ja hiiren kehys-alueet toisistaan. Vasta-aine, joka käsittää hiiren CDR:t 25 ihmisen kehysalueessa ei siten saata olla ruumiille sen enempää vieras kuin oikea ihmisen vasta-aine.
Tässä keksinnössä tarjoutuu käyttöön VHaTAG:n, CC46:n, CC49:n, CC83:n ja CC92:n VH-aminohappojaksoja vastaavat nukleotidijaksot sekä CC49:n, CC83:n ja CC92:n VL-30 geenisegmenttien nukleotidijaksot. Tämän mukaisesti on ennakoitavissa, että tämän keksinnön mukaisista vasta-aineista saadut CDR:t voidaan liittää ihmisen vasta-aineen ψ kehysalueisiin.
Ihmisen VH- tai VL-osista peräisin olevat CDR-alueet 35 voidaan yleensä korvata tämän keksinnön mukaisten vasta- 29 103181 aineiden VH- tai VL-osista peräisin olevilla CDR-alueilla. Esimerkkeihin ihmisen vasta-aineista, joista peräisin olevia kehysalueita voidaan käyttää, kuuluvat ihmisen plasma-sytooma NEWM ["Replacing the complementarity-determining 5 regions in a human antibody with those from a mouse", Jones et al., (1986) Nature 321 522 - 525], joka on yleisesti saatavissa Dr. Greg Winteriltä; ja useat muut ihmisen VH- tai VL-geenit, jotka ovat saatavissa Dr. Terrence Rabbittsilta, molempien tutkijoiden ollessa laitoksesta 10 Medical Research Council, 20 Park Crescent, London, WIN 4 AL.
Sen määritys, mistä CDR koostuu ja mistä kehysalue koostuu voidaan tehdä valittujen Ig-molekyylien aminohappojärjestyksen perusteella, kuten teoksessa Kabat et ai.. 15 (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4.
painos, US Dept. of Health and Human Services, NIH, on esitetty.
Neljä kehysaluetta esiintyvät suurimmaksi osaksi /3-liuskakonformaatiossa ja CDR:t muodostavat näitä j8-lius-20 karakenteita yhdistäviä silmukoita ja joissakin tapauksessa osan näistä rakenteista.
Lisäksi kaikki silmukka-alueiden aminohapporyhmät eivät ole liuottimen ulottuvilla ja yhdessä tapauksessa kehysalueissa sijaitsevat aminohapporyhmät liittyvät anti-:· 25 geenin sitomiseen [Amit, A.G., Mariuzza, R.A., Phillips, S.E.V., ja Poljak, R.J., (1986) Science 233, 747 - 753].
On myös tunnettua, että antigeeniä sitovan kohdan kahden osan vaihtelevat alueet pysyvät oikein orientoituneena ketjujen välisten ei-kovalenttisten vuorovaikutusten 30 ansiosta. CDR:ssä esiintyvät aminohapot voivat osallistua ’ näihin vuorovaikutuksiin.
Yhden vaihtelevan alueen antigeeniä sitovan kyvyn " siirtämiseksi toiseen ei siten saata olla tarpeellista korvata kaikkia CDR:iä luovuttajalta saatavista täydelli-35 sistä vaihtelevista alueista peräisin olevilla täydelli- 3„ 103181 sillä CDR:llä. Voi olla tarpeen siirtää vain ne ryhmät, joita tarvitaan antigeenin sitoutumiskohtaa varten ja tähän voi liittyä kehysalueilla olevien ryhmien siirto sekä CDR-ryhmien siirto.
5 On siten selvää, että pelkästään yhden tai useamman komplementaarisen CDR:n korvaaminen ei aina johda toimintakykyiseen muunnettuun vasta-aineeseen. EP-patenttihake-musjulkaisussa 0 239 400 esitettyjen selitysten perusteella voidaan alan ammattimiehen pätevyydellä saada toimiva 10 muunnettu vasta-aine joko rutiinikokeita suorittamalla tai testaamalla yrityksen ja erehdyksen kautta.
Sekä raskaassa että kevyessä olevat vaihtelevat osat muutetaan edullisesti siten, että CDR:t korvataan ainakin osittain ja, mikäli tarpeen, kehysalueet korvataan 15 osittain ja jaksoa muutetaan. Vaikka CDR:t voivat olla peräisin samasta eläinluokasta tai jopa samasta alaluokasta kuin se vasta-aine, josta kehysalueet ovat peräisin, on odotettavaa, että CDR:t ovat peräisin eri eläinluokan vasta-aineesta ja edullisesti eri eläinlajista.
20 Koostetut vaihtelevat alueet VL:ää koodaava V-geeni on yleensä sama V-geeni, joka koodaa luonnollisella tavalla vapaasti valittuun VH:hon liittynyttä VL:ää. Esimerkiksi CC49:n ja CC83:n VL-alueita koodaavien V-geeneien käyttö on eduksi käytettäessä V-gee-L :· 25 niä, joka koodaa CC49.-n ja CC83:n VH:ta, tässä järjestyk sessä ilmoitettuna.
i
Koska tämän keksinnön mukaisten vasta-aineiden VH-alueet ovat VHaTAG:sta peräisin olevien VH-geenien koodaa-: mia, on yllättävää, että koostevasta-aineita on edullises- 30 ti muodostettavissa. Toisin sanoen, yhden tämän keksinnön mukaisen vasta-aineen VH-alue voidaan liittää toisen tämän i * keksinnön mukaisen vasta-aineen VL-alueeseen. Vaikka CC49:n t : i ja CC83:n raskaiden ketjujen aminohappojaksot muistuttavat pinnallisesti tarkasteltuina läheisesti toisiaan, olisi 35 odotettavissa, että muutaman tai yhden aminohapon muutos 31 103181 vaikuttaisi voimakkaasti vasta-aineen sitoutumistoimin-toon, ts. tuloksena olevien vasta-aineiden otaksutaan yleensä olevan epäspesifinen immunoglobuliini (NSI) ts. sellainen, jolta vasta-aineluonne puuttuu (ks. EP-hakemus-5 julkaisu 0 125 023) .
On jokseenkin hämmästyttävää, että nyt on havaittu se, että tämän keksinnön mukaisen VH:n omaavaa vasta-ainetta ei tarvitsekaan yhdistää uudelleen yksinomaan samasta luonnossa esiintyvästä eläimen vasta-aineesta peräisin 10 olevaan VL:ään. Kuten esimerkeissä esitetään, on esimerkiksi mahdollista tuottaa kimeerinen vasta-aine, jonka raskaassa ketjussa oleva VH on peräisin CC83:sta ja kevyessä ketjussa oleva VL on peräisin CC49:stä, jolloin näin muodostetulla koostevasta-aineella on sitoutumisspesifisyys, 15 joka on 25 % suurempi kuin B72.3:lla on TAG-72:ta vastaan.
Muuttumattomat alueet
Raskasketju- (CH-) osa CH-osat voivat olla ihmisen eri isotyyppejä, ts. IgG (esimerkiksi IgG^ IgG2, IgG3 ja IgG4) , IgA, IgD, IgM sekä 20 kunkin ryhmän eri alatyyppejä.
Ihmisen yl:tä on tarkasteltu julkaisuissa Ellison et ai., (1982) "The nucleotide sequence of a human immunoglobulin C-gamma-1 gene", Nucl. Acid Res. 10, 4 071 - 4079 ja Takahashi et al.. (1982) "Structure of human immu- .* 25 noglobulin gamma genes: Implications for evolution of a gene family", Cell 29, 671 - 679. Ihmisen gamma 2:ta (γ2) on tarkasteltu julkaisuissa Krawinkel et ai.. (1982) "Comparison of the hinge-coding segments in human immunoglobulin gamma heavy genes and the linkage of the 30 gamma 2 and gamma 4 subclass genes", EMBO J. 1, 403 - 407, Ellison et al. . (1982) "Linkage and sequence homology of two human immunoglobulin gamma heavy chain constant region ' genes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1984 - 1988 ja
Takahashi et al.. ks. yllä. Ihmisen gamma 3:a (γ3) on tar-35 kasteltu julkaisuissa Krawinkel et al. . (ks. yllä) ja 32 1 03 1 81
Takahashi et ai., (ks. yllä). Ihmisen gamma 4:ää (74) on tarkasteltu julkaisuissa Ellison et ai., (1981) "Nucleo tide sequence of a human immunoglobulin C-gamma-4 gene" DNA 1, 11 - 18, Krawinkel et al.. (ks. yllä) ja Takahashi 5 et ai.. (ks. yllä).
Ihmisen myytä on tarkasteltu julkaisussa Rabbitta et ai. . "Human Immunoglobulin Heavy Chain Genes: Evol utionary Comparisons of Ομ, C6 ja C genes and Associated Switch Sequences", Nucl. Acids Res. 9, 4509 - 4524.
10 Ihmisen alfaa on tarkasteltu julkaisussa Flanagan et ai. . (1984) "Mechanisms of Divergence and Convergence of the Human Immunoglobulin alpha 1 and alpha 2 Constant Region Gene Sequences", Cell 36, 681 - 688.
Ihmisen deltaa on tarkasteltu julkaisussa White et 15 ad·/ (1985) "Human Immunoglobulin D: Genomic Sequences of the Delta Heavy Chain" Science 228, 733 - 737.
Ihmisen epsilonia on tarkasteltu julkaisussa Max et ai., (1982) "Duplication and Deletion in the Human Immunoglobulin ε Genes", Cell 29, 691 - 699.
20 Kevytketju (CL) -osa CL-osa voi olla ihmisen kappa (κ) tai ihmisen lambda (λ) .
Ihmisen K:aa on tarkasteltu julkaisussa Heiter et ai., (1980) "Cloned Human and Mouse Kappa Immunoglobulin :· 25 Constant and J Region Genes Conserve Homology in Func tional Segments", Cell 22, 197 - 207.
Ihmisen λ:aa on tarkasteltu julkaisussa Hollis et ai., (1982) "Processed Genes: A Dispersed Human Immunoglobulin Gene Bearing Evidence of RNA-type Processing", 30 Nature 296, 321 - 325.
] r ! CH- ja/tai CL-geenisegmenttejä voidaan "muuttaa" mu- j · tageneesillä. Esimerkkeihin näistä menetelmistä kuuluvat ! eri nukleotidien pienten määrien lisäykset, deleetiot tai tuotteen ominaisuutta säilyttämättömät korvautumat tai 35 tuotteen ominaisuudet säilyttävät useiden nukleotidien 103181 33 korvautumat edellyttäen, että asianmukainen lukuvaiheistus säilyy. Lisäksi voidaan muuttaa proteiinin kokonaisia alueita, kuten esimerkiksi korvaamalla CH3 CH2:lla. Tämä korvaus tehdään DNA-tasolla liittämällä, poistamalla tai 5 korvaamalla kokonaisia jakson eksoneita.
Vasta-aineiden konstruktio
Immunisoinnit
Ensimmäinen sellaisten vasta-aineiden tuotossa käytettävä menetelmä, riippumatta siitä, ovatko vasta-ai-10 neet monoklonaalisia vai polyklonaalisia, joiden VH-alueet ovat VHaTAG:sta peräisin olevan DNA:n koodaamaa, on isän-täeläimen immunisointi puhdistetulla TAG-72:lla. Esimerkkejä toimenpiteistä, joiden mukaan isäntäeläin immunisoidaan TAG-72:11a, esitetään US-patenteissa 4 522 918 ja 15 4 612 282, joissa immunogeeninä on käytetty ihmisen rinta rauhasen karsinoomasta saatua uutetta; ja US-patenttihake-musjulkaisussa 7-073 685 (joka on julkisesti saatavilla), jossa immunogeeninä on käytetty B72.3:lla puhdistettua TAG-72:ta.
20 Tämän jälkeen immunisointitoimenpiteillä saadut monoklonaaliset tai polyklonaaliset vasta-aineet seulotaan sen märittämiseksi, mitkä mainituista vasta-aineista sitoutuvat valikoivasti TAG-72:een. Tämä seulonta voidaan suorittaa millä tahansa monista tunnetuista menetelmistä, :· 25 kuten kiinteän faasin radioimmunomäärityksellä, entsyymi- välitteisillä immunosorbenttimäärityksillä, rosetinmuodos-tusmäärityksillä ja toimintakyvyn estomäärityksillä. Nämä menetelmät ovat sinänsä hyvin tunnettuja.
Aminohappojaksojen synteesi 30 Tämän keksinnön mukaiset immunoglobuliinit voidaan syntetisoida niiden koostumukseen kuuluvista aminohapois-ta. Sopivia menetelmiä ovat Merrifieldin kiinteän faasin menetelmä, joka on kuvattu artikkelissa J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 - 2154 (1963). Tämä kiinteän faasin menetelmä 35 aminohappojaksojen syntetisoimiseksi on myös kuvattu si- 34 103181 vuilla 1-4 Stewartin ja Youngin kirjassa Solid Phase Peptide Synthesis [W.H. Freeman and Co., San Francisco, (1969)].
DNA:n konstruktio
5 VH: ta j a VL: ää koodaava DNA
Vasta-aineen raskasta ja kevyttä ketjua koodaava DNA voidaan saada useista eri lähteistä, jotka ovat tunnettuja alan ammattimiehille, esimerkiksi genomin DNA, cDNA, synteettinen DNA tai näiden yhdistelmät.
10 Haluttua jaksoa sisältävät solut voidaan eristää ja genomin DNA pilkkoa yhdellä tai useammalla restriktioent-syymillä. Genomin DNA:han voi liittyä luonnossa esiintyviä introneja tai nämä voivat siitä puuttua. Saatavat fragmentit voidaan sitten kloonata ja seuloa raskaan ketjun 15 J-alueen (JH) koetinta käyttäen mielenkiinnon kohteena olevaa polypeptidijaksoa koodaavan DNA-jakson esiintymisen suhteen. Preparatiivisella agaroosigeelielektroforeesilla eristetyt DNA-fragmentit liitetään ligaasilla. Kirjastojen yhdistelmäplakit seulotaan hiiren JH-koettimella.
20 DNA voidaan saada myös cDNA-kirjastosta. Raskasta tai kevyttä ketjua koodaava lähetti-RNA eristetään sopivasta lähteestä, joko kypsistä B-soluista tai hybridooma-viljelmästä, normaaleja RNA:n eristysmenetelmiä käyttäen ja käyttäen oligo-dT-selluloosakromatografiaa poly-A-lä-: 25 hetti-RNA:n erottamiseksi . Poly-A-lähetti-RNA voidaan tar vittaessa lisäksi fraktioida, jotta saadaan sellaiset jaksot, jotka ovat riittävän suuria koodaamaan halutun vasta-aineen raskaan tai kevyen ketjun aminohappojaksoja.
Tämän jälkeen lähetti-RNA-seoksesta valmistetaan 30 cDNA-kirjasto käyttäen sopivaa aluketta, joka on edulli-\ sesti halutun cDNA:n ominaisuuksien mukainen nukleiinihap- pojakso. Tällainen aluke voidaan syntetisoida vasta-aineen
T
aminohappojaksoon perustuen. Toisena vaihtoehtona voidaan myös käyttää haluttua vasta-ainetta tuottavasta solulin-35 jasta saatua fraktioimatonta poly-A-lähetti-RNA:ta tai 35 103181 poly-dT:tä. Tulokseksi saatu cDNA fraktioidaan valinnaisesti koon mukaan polyakryyliamidigeelissä ja pidennetään esimerkiksi dC-ryhmillä sopivalla restriktioentsyymillä, kuten Pst I:llä, pilkottuun pBR 322:een tai muuhun sopi-5 vaan kloonausvektoriin liittämistä varten ja pidennetään dG-ryhmillä. Voidaan myös tietenkin käyttää vaihtoehtoisia keinoja cDNA:n sisältävien kloonausvektoreiden muodostamiseksi muita päätteitä ja muista vektoreista koostuvia loppuosia käyttäen, mutta tämä on tavallinen ja edullinen 10 vaihtoehto. Sopiva isäntäsolukanta, joka on tyypillisesti Escherichia coli (E. coli), transformoidaan yhteen liitetyillä kloonausvektoreilla ja onnistuneesti transformoituneet solut tunnistetaan esimerkiksi ampisilliini- tai tet-rasykliiniresistenttiyden tai jonkin muun kloonausvektori-15 plasmidissa olevan fenotyyppisen ominaisuuden perusteella.
Onnistuneesti transformoituneet solut poimitaan talteen ja siirretään mikrotiitterilevyille tai muulle alustalle jatkokasvatusta ja säilytystä varten. Näistä kasvavista viljelmistä nitroselluloosasuodattimelle teh-20 tyjä siirrostusjälkiä käsitellään nukleiinihappojaksoista koostuvilla koettimilla, jotka sisältävät cDNArssa olevia haluttuja jaksoja vastaan komplementaarisia emäksiä. Voidaan käyttää useita koetintyyppejä, joista edullisia ovat synteettiset yksinauhaiset, y^P-ATPillä kinaasikäsittelyl-: 25 lä leimatut DNA-jaksot. Nitroselluloosasuodattimeen kiin nittyneet solut hajotetaan, DNA denaturoidaan ja kiinnitetään sitten ennen kinaasikäsitellyllä koettimella suoritettavaa reaktiota. Kloonit, joissa hybridisoituminen on onnistunut, havaitaan tuomalla ne valokuvauslevyn yhtey-30 teen, jonka jälkeen kasvavista pesäkkeistä eristetään plasmidit ja suoritetaan sekvenssointi sinänsä tunnetuilla menetelmillä haluttujen geenin osien läsnäolon varmennukseksi .
Halutut geenifragmentit irrotetaan ja räätälöidään 35 ohjaussegmenttien suhteen sopivan lukuvaiheistuksen var- 36 1 03 1 81 mistamiseksi sopiviin ilmentämisvektoreihin liitettäessä. Nukleotidejä liitetään tyypillisesti 5'-päähän aloitussig-naalin ja sopivassa paikassa olevan restriktioendonukleaa-sikohdan liittämiseksi mukaan.
5 Koska tämän keksinnön tekijät ovat esittäneet VHaTAG:n jaksojen nukleotidijärjestyksen, voidaan DNA myös valmistaa synteettisesti, esimerkiksi käyttäen Applied Biosystems™ mallin 380A DNA-syntetisaattoria ja konstruoida tavallisilla menetelmillä.
10 Lopuksi esimerkkinä menetelmistä, joissa käytetään näiden menetelmien yhdistelmiä, on leikkaaminen polymeraa-siketjureaktiomenetelmällä suoritettavan limitysten pidennyksen avulla, joka on esitetty julkaisussa Horton et ai. (ks. yllä). Synteettisesti valmistettu aluke, jolla on 15 niin sanottu "heiluva häntä", voidaan liittää valittuun jaksoon, esimerkiksi genomin DNA:hän. Tämän jälkeen jaksot monistetaan ja leikataan yhdessä.
CH:ta ja CL:ää koodaava DNA
Ihmisen muuttumattoman alueen aminohappojaksoa koo-20 daava DNA voidaan saada ihmisen immunoglobuliinia tuottavien solujen kromosomaalista DNA:ta seulomalla.
Vektorit
Haluttu DNA-fragmentti voidaan sijoittaa biologisesti toimintakykyiseen ilmentämiskantajaan, joka voi si-;' 25 sältää sopivia ohjausjaksoja, joita valitussa DNA-fragmen- tissa ei esiinny. "Biologisesti toimintakykyisellä" tarkoitetaan, että ilmentämiskantaja on suunniteltu huolehtimaan lisääntymiseen ja/tai ilmentämiseen liittyvistä toiminnoista sopivassa isännässä joko niin, että se lisääntyy 30 kromosomin ulkopuolisena yksikkönä, tai että tämä liittyy isännän genomiin. Käytettävissä on suuri määrä vektoreita tai niitä voidaan valmistaa helposti ja ne tunnetaan alan ammattimiesten piirissä.
On kuvattu joukko plasmideja, kuten EP-hakemusjui-35 kaisuissa nro 0 036 776, 0 048 970 ja 0 051 873 kuvatut 37 1 03 1 81 plasmidit, jotka sisältävät valmiiksi geenin kanssa oikeassa lukuvaiheistuksessa olevan promoottorin, joka on > yhteen sopiva ehdotetun isäntäsolun kanssa.
Tässä kuvatut vektorit ja menetelmät ovat sopivia 5 käytettäväksi transformoitavissa olevan joko prokaryoo-teista tai eukaryooteista koostuvan laajan mikro-organismi joukon yhteydessä. Plasmidi tulee olemaan lisääntymiskykyinen tässä mikro-organismissa, erityisesti bakteerissa.
10 Plasmidivektorit, jotka sisältävät sopivia promoot toreita, joita mikro-organismi voi käyttää oman proteiininsa ilmentämiseen, sisältävät yleensä myös ohjausjaksoja, ribosomia sitovia kohtia ja transkription lopetuskoh-tia. Isäntäsolun kanssa yhteen sopivista lajeista peräisin 15 olevia replikoni- ja ohjausjaksoja käytetään yleensä näiden isäntäsolujen yhteydessä.
Voidaan käyttää myös pienempiä tai suurempia SV40-fragmentteja, edellyttäen, että mukaan on liitetty noin 250 emäsparin (ep) jakso, joka ulottuu Hind III -kohdasta 20 Pvu II -kohdan suuntaan, joka sijaitsee viruksen replikaa-tion aloituskohdassa. On myös lisäksi mahdollista ja usein haluttua käyttää promoottori- tai ohjausjaksoja, jotka tavallisesti liittyvät haluttuun geenijaksoon edellyttäen, että nämä ohjausjaksot ovat yhteen sopivia isäntäsolusys-; 25 teemin kanssa.
On haluttua, että plasmidissa olisi lopuksi geeni, markkerigeeni, josta voitaisiin saada ilmentämisvektorin sisältävien isäntäsolujen valikoimisen mahdollistava feno-tyyppin611 ominaisuus. Erityisen käyttökelpoinen on geeni, 30 joka tarjoaa käytettäväksi valikoinnin eloonjäämisen perusteella. Eloonjäämiseen perustuva valikointi suoritetaan tarjoamalla käyttöön kasvua estävää ainetta vastaan suunnattu resistenssi tai tarjoamalla käyttöön kasvutekijän muodostuskyky bakteerille, jolta tämä puuttuu.
38 103181
Prokaryoottiset organismit ovat yleensä edullisia. Esimerkiksi E. coli -lajista johdettu plasmidi pBR322 [Bolivar et ai.. (1977) Gene 2, 95] on erityisen käyttö kelpoinen. pBR322 sisältää ampisilliini- ja tetrasyklii-5 niresistenssigeenit ja näistä saadaan helppo keino transformoituneiden solujen tunnistamiseksi.
Vaikka nämä prokaryoottiset organismit ovat yleisimmin käytettyjä, voidaan käyttää muita mikrobikantoja, joihin kuuluu E. coli -kantoja, kuten E. coli B, E. coli 10 K12 kanta 294 (ATCC nro 31446) ja E. coli X1776 (ATCC nro 31537) , E. coli W3110 (F”, y~, prototrofinen, ATCC nro 27325), basillit, kuten Bacillus subtilis ja muut entero-bacteriaceae-ryhmän jäsenet, kuten Salmonella tvphimurium tai Serratia macrcesans ja voidaan käyttää useita eri 15 Pseudomonas-laiei a. Näiden esimerkkien on tarkoitus olla vain kuvaavia.
Prokaryoottien lisäksi voidaan käyttää eukaryootti-sia mikrobeja. Eukaryoottisista mikro-organismeista on yleisimmin käytetty Saccharomvces cerevisiae. eli tavaili-20 nen leivontahiiva, vaikka muitakin kantoja on yleisesti saatavilla.
Saccharomyces-hiivassa tehtävään ilmentämiseen käytetään yleensä esimerkiksi plasmidia YRp7 [Stinchcomb et ai., (1979) Nature 282, 39, Kingsman et ai.. (1979) Gene ·' 25 7, 141 ja Tschemper et ai. . (1980) Gene 10, 157]. Tämä plasmidi sisältää valmiina trpl-geenin, joka tarjoaa käytettäväksi valikointiin soveltuvan markkerin sellaista hiivan mutanttikantaa varten, jolta puuttuu kyky kasvaa tryptofäänissä, esimerkiksi ATCC nro 44076 tai PEP-1 . 30 [Jones, (1977) Genetics 85, 12] . Trpl-vaurion esiintyminen ..· isäntäsolun genomin piirteenä tarjoaa käyttöön tehokkaan ympäristön transformaation havaitsemiseksi ilman tryptof-aania tapahtuvan kasvun perusteella.
Hiivassa käytettäväksi soveltuu mikä tahansa plas-35 midivektori, joka sisältää hiivan kanssa yhteen sopivan 39 1 03 1 81 promoottorin, lisääntymisen alkukohdan ja lopetuskohdan. Sopiviin promoottorijaksoihin hiivavektoreissa kuuluvat 3-fosfoglyseraattikinaasin [Hitzeman et ai.. (1980) J.
Biol. Chem. 255, 2073] tai muiden glykolyttisten entsyy-5 mien [Hess, et ai.. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149,
Holland et ai. (1978) Biochemistry 17, 4900] promoottorit.
Nisäkässoluissa tapahtuvaa käyttöä varten ilmentä-misvektorien ohjaustoiminnot saadaan virusperäisestä materiaalista. Yleisesti käytetyt promoottorit ovat peräisin 10 polyoomaviruksesta, adenovirus 2-.sta ja useimmin simian virus 40:stä (SV40). SV40-viruksen varhaiset ja myöhäiset promoottorit ovat erityisen käyttökelpoisia, koska molemmat ovat helposti saatavissa viruksesta fragmenttina, joka myös sisältää SV40-viruksen replikaation alkukohdan [Fiers 15 et ai.. (1978) Nature 273, 113].
Esimerkiksi pSV2neo sisältää ampisilliiniresistens-si neomysiiniresistenssigeenin, joka on SV40:n promoottorin ohjaama. pSV2neo tarjoaa käyttöön kätevän keinon sekä eläimestä peräisin olevaa vaihtelevaa aluetta että ihmi-20 sestä peräisin olevaa muuttumatonta aluetta vastaavilla geeneillä transformoitujen solujen tunnistamiseksi.
Kimeerisen DNA:n valmistus
Raskasta ketjua tai kevyttä ketjua koodaavat geenit konstruoidaan liittämällä muuttumatonta aluetta koodaavan . 25 DNA-fragmentin 5'-pää vaihtelevaa aluetta koodaavan DNA- fragmentin 3'-päähän. Vasta-aineen aminohappojaksoa koo-daava DNA-jakso voidaan saada genomin DNArsta talteen yhdessä promoottori- ja replikaatiokohtien kanssa. Siinä laajuudessa kuin isäntäsolu tunnistaa heterologisiin gee-30 neihin liittyviä transkription ohjaus- ja translaation aloitussignaaleja, voidaan vaihtelevaa aluetta koodaavan jakson 5'- ja 3'-vierusalueet säilyttää yhdessä vaihtele-τ vaa aluetta koodaavan jakson kanssa ja käyttää ohjaamaan transkriptiota ja translaation aloitusta. Muuttumattoman 35 alueen koodaamaton 3'-vierusalue voidaan säilyttää tran- 40 103181 skription ohjausjaksojen, kuten lopetus- ja polyadenylaa-tiojaksojen vuoksi. Viitattaessa kaksoisnauhassa 5'-suuntaan tai 3'-suuntaan tarkoitetaan transkription suuntaa, jossa 5' edeltää 3':a.
5 Kutakin asianomaista ketjua vastaavan vaihtelevan alueen välinen intronijakso voidaan liittää vastaavaan ihmisen muuttumattoman ketjun DNA-fragmenttiin mitä tahansa kätevää restriktiokohtaa käyttäen. Kun vaihtelevaa aluetta koodaavaa fragmenttia ollaan hankkimassa käyttöön, on 10 tavallisesti haluttavaa se, että mukaan liitetään osa J-alueen jälkeisestä intronista. Silloin, kun introni säilytetään, on tarpeen, että intronin päissä on irrottamiseen toimintakelpoiset vastaanottaja- ja luovuttajajaksot. Vaihtelevan alueen viereinen, tämän 5'-puolella oleva koo-15 daamaton jakso sisältää tavallisesti ne jaksot, jotka liittyvät transkription aloitukseen ja translaatioon, kuten TATA-box-alue, molekyylin pääte (capping) -jakso ja CAAT-jakso. Tavallisesti koodaamattoman 5'-jakson koko ei ylitä noin 1-2 kiloemäksen (ke) kokoa.
20 Tehostaja-alueen tulisi esiintyä J-alueen ja muut tumattoman alueen välissä. Käytetty tehostaja-alue voi olla joko (1) eläimestä peräisin olevan V-alueen tai (2) ihmisestä peräisin olevan muuttumattoman alueen tehostaja-alue .
• 25 Säilyttämällä muuttumatonta aluetta koodaavan DNA- jakson 3'-vierusalue luonnollisessa paikassaan tämän jakson vieressä voidaan geenille saada transkription lopetus-signaalit. Silloin, kun transkription lopetussignaalien toiminta ilmentymisisäntäsolussa ei ole tyydyttävää, voi-30 daan nämä korvata isäntäsolussa toimivalla 3'-alueella. Koodaamaton 3'-alue voidaan saada kätevästi ilmentämis- isännästä saatavasta muuttumattoman alueen koodaamattomas-ta 3'-vierusalueesta. Koodaamaton 3'-vierusalue voidaan liittää muuttumattomaan alueeseen millä tahansa aiemmin 35 kuvatulla DNA-fragmenttien manipulointi- ja liittämiskei- 41 103181 nolla. Tätä aluetta voitaisiin sitten käyttää rakennusyk-sikkönä geenin valmistuksessa.
Ilmentämiskantaj ien valmistus
Haluttuja koodaavia ja ohjaavia jaksoja sisältävien 5 sopivien ilmentämiskantajakonstruktio voidaan tuottaa seuraavasti. Vektoreiden ja DNA-fragmenttien päät voidaan sitten liittää uudelleen yhteen haluttujen ilmentämiskantaj ien muodostamiseksi. Käytetyt menetelmät eivät riipu DNA-lähteestä eivätkä isännäksi aiotusta solusta.
10 Kevyttä ketjua ja raskasta ketjua koodaavat DNA- fragmentit voidaan liittää erilliseen ilmentämiskantajaan tai samaan vektoriin. Kevyttä ja raskasta kimeeristä ketjua koodaavat fuusioidut geenit kootaan yhteen edullisesti eri ilmentämisvektoreissa, joita voidaan käyttää joko rin-15 nakkain tai peräkkäin vastaanottajasolun rinnakkaistrans-formaatiossa.
Keinoihin kimeerisiä geenejä sisältävien DNA-fragmenttien liittämiseksi ilmentämisvektoreihin kuuluu rest-riktioendonukleaasien käyttö. "Restriktioendonukleaasit" 20 (tai "restriktioentsyymit") ovat hydrolyyttisiä entsyymejä, jotka kykenevät katalysoimaan kohdespesifistä DNA-mole-kyylien pilkkoutumista. Restriktioendonukleaasin vaikutus-kohdan määrää spesifisen nukleotidijakson esiintyminen. Tätä jaksoa nimitetään restriktioendonukleaasin tunnistus-j 25 kohdaksi. Useista eri bakteerilajeista on eristetty useita restriktioendonukleaaseja ja ne on luonnehdittu tunnistus-kohtiensa nukleotidijaksojen perusteella. Jotkin restriktioendonukleaasit hydrolysoivat molempien nauhojen fosfo-diesterisidokset samasta kohdasta, jolloin päät jäävät 30 tasaisiksi. Toiset katalysoivat muutamien nukleotidien päässä toisistaan olevien sidosten hydrolyysiä muodostaen vapaita yksinauhaisia alueita pilkotun molekyylin kumpaan-* kin päähän. Nämä yksinauhaiset päät ovat itsekomplementaa- risia ja sen vuoksi kohesiivisia ja niitä voidaan käyttää 35 hydrolysoidun DNA:n liittämiseen uudelleen yhteen. Edusta- 103181 42 viin esimerkkeihin restriktioendonukleaaseista kuuluvat Aat 11, BamH I, EcoR I, Hind III, Nde I, Spe I, Xba I, Sac I, Bql II, Pst I, Sal I, ja Pvu II.
Ilmentämisvektorissa voi lisäksi olla tähän liitet-5 ty liitoskohtaryhmä (polylinker), jossa on useita uniikkeja restriktiokohtia. Pilkottaessa ilmentämisvektori sopivilla restriktioentsyymeillä, pilkkoutuu liitoskohtaryhmä siten, että voidaan liittää ainakin yksi geenin sisältävä DNA-fragmentti. Silloin, kun liitoskohtaryhmästä on saa-10 tavissa toisistaan erottuvat päät, voidaan DNA-fragmentti liittää yhdellä tavalla orientoituneena, jos taas päät ovat samoja, seuraa DNA-fragmentin liittämisestä kahden eri orientaation omaavia plasmideja.
Pilkkominen suoritetaan käsittelemällä plasmideja 15 restriktioentsyym(e)illä. Yleensä käytetään noin 10 μg plasmidia noin 10 entsyymiyksikön kanssa noin 100 μΐ-.εεζ puskuriliuosta. Endonukleaasilla pilkkominen suoritetaan tavallisesti 37 °C:sta 65 °C:seen ulottuvalla lämpötila-alueella pH:ssa 7-9. (Tietyille nimenomaisille restrik-20 tioentsyymeille sopivat puskurit ja substraattimäärät ovat valmistajien spesifioimia.) Reaktioaika voi olla 1-18 tuntia.
?
Voi olla hyödyllistä estää pilkotun vektorin liittyminen takaisin yhteen suorittamalla esikäsittely alka-; 25 lisella fosfataasilla. Spesifiset olosuhteet ovat valmis- ! ta jän kuvaamia.
Kun restriktioentsyymillä pilkkominen on viety loppuun, poistetaan proteiini fenoli- ja kloroformiuutoksel-la. Nukleiinihappo otetaan talteen (0,3 M natriumasetaat-30 tia sisältävästä) vesifaasista saostamalla noin 2,5-ker-taisella tilavuudella etanolia.
Restriktioentsyymeillä suoritettavien pilkkomisme-netelmien kuvauksia on seuraavissa julkaisuissa: Greene et ai., Methods in Molecular Biology, osa 9, (Wickner, R.B., 35 toim.) Marcel Dekker, Inc., New York ja Mertz ja Davis, f s 43 1 03 1 81 (1972) "DNA Replication and Biosynthesis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 3370.
Reaktion kulun seuraamiseksi suoritetaan pilkottujen fragmenttien erottaminen koon mukaan kätevästi agaroo-5 sigeelielektroforeesilla. Kun pilkkoutuminen on saavuttanut halutun tason, voidaan endonukleaasi inaktivoida kuumennuksella yli 65 °C:seen noin 10 minuutin ajaksi tai uuttamalla orgaanisella liuotteella.
Haluttu fragmentti puhdistetaan sitten pilkkoutu-10 mistulosten joukosta. Sopiviin puhdistusmenetelmiin kuuluvat geelielektroforeesi tai sakkaroosigradienttisentri-fugointi.
Plasmidikantaja ja vieraan DNA:n fragmentit liitetään sitten DNA-ligaasilla rengasrakenteen uudelleenmuo-15 dostamiseksi. Tätä prosessia kutsutaan pituussuuntaiseksi yhtymiseksi ja DNA-ligaatioksi.
Käytetään sopivalla tavalla puskuroitua liuosta, joka sisältää DNA-fragmentit, DNA-ligaasin ja sopivia ko-faktoreita. Käytetty lämpötila on välillä 25 °C - 4 °C. 20 Kun DNA-segmentit sitoutuvat toisiinsa vetysidoksilla, kykenee DNA-ligaasi muodostamaan kovalenttisen sidoksen kahden segmentin välille. Pituussuuntaiseen yhtymiseen käytettävä aika vaihtelee riippuen käytetystä lämpötilasta, suolaliuoksen luonteesta sekä tarttuvien päiden eli : 25 kohesiivisten päiden luonteesta. Ligaatioon tarvittava aika voi yleensä olla 5-18 tuntia. Katso Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, yllä.
Isäntäsolut Tämän jälkeen ilmentämiskantajakonstruktioita voi-30 daan käyttää·transformoimaan sopiva isäntäsolu. Sopiviin isäntäsoluihin kuuluvat yksisoluisista sekä monisoluisista organismeista peräisin olevat solut.
Kimeerisiä immunoglobuliinigeenejä voidaan ilmentää lymfaattiseen järjestelmään kuulumattomissa soluissa kuten 35 bakteereissa ja hiivoissa.
44 103181
Useita eri yksisoluisia mikro-organismeja, kuten bakteereja, voidaan transformoida. Toisin sanoen sellaisia organismeja, joilla on kyky kasvaa viljelmissä tai fermen-taation avulla. Koska bakteerit ovat työskentelyyn yleensä 5 kätevimmin soveltuvia organismeja, niihin viitataan myöhempänä muita yksisoluisia organismeja edustavana esimerkkinä. Transformaatioherkkiin bakteereihin kuuluvat Entero-bacteriaceae-lahkon jäsenet, kuten Escherichia coli -kannat ja Salmonella; Bacillaceae-lahkon jäsenet, kuten 10 Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus ja Haemophilus influenzae.
Kun immunoglobuliinin raskaita ja kevyitä ketjuja ilmennetään bakteereissa, ne joutuvat inkluusiokappalei-siin. Ketjut on sitten eristettävä, puhdistettava ja 15 koottava tämän jälkeen toimintakykyisiksi immunoglobulii-nimolekyyleiksi.
Prokaryoottien lisäksi voidaan myös käyttää euka-ryoottisia mikrobeja, kuten hiivaviljelmiä. Eukaryootti-sista mikro-organismeista on yleisimmin käytetty Saccharo-20 mvces cerevisiae. eli tavallinen leivontahiiva, vaikka muitakin kantoja on yleisesti saatavilla. Trpl-vaurion esiintyminen isäntäsolun genomin piirteenä tarjoaa käyttöön tehokkaan ympäristön transformaation havaitsemiseksi ilman tryptofaania tapahtuvan kasvun perusteella, i: j ' 25 Mikro-organismien lisäksi isäntinä voidaan käyttää monisoluisista organismeista peräisin olevia soluviljelmiä. Periaatteessa mikä tahansa tällainen soluviljelmä on käyttökelpoinen riippumatta siitä, onko se selkärankaisten vai selkärangattomien viljelmistä, edellyttäen, että solu-30 linja on sellainen, että se ainakin alunperin on tuottanut vasta-aineita. Selkärankaissolujen lisäämisestä viljelylle ; on tullut viime vuosina rutiinimenetelmä [Tissue Culture,
i T
Kruse ja Patterson, (toim.) Academic Press 1973]. Esimerk- { kejä näistä käyttökelpoisista isäntäsolulinjoista ovat 35 Sp2/0, VERO- ja HeLa-solut, kiinanhamsterin munasarja 45 1 03 1 81 (CHO) -solulinjat ja W138-, BHK-, COS-7- ja MDCK-solulin-jat.
Edullinen vastaanottajasolulinja on plasmasytooma-solulinja, kuten B-lymfosyyttisolu- tai hybridoomasolulin-5 ja. Plasmasytoomasolut voivat syntetisoida, koota ja erittää transformoitujen immunoglobuliinigeenien koodaamia immunoglobuliineja. Niissä on lisäksi immunoglobuliinin glykosylaatiomekanismi. Sp2/0 on edullinen vastaanottaja-solu, koska se on immunoglobuliinia tuottamaton plasmasy-10 toomasolu. Tämä solu tuottaa vain transformoitujen immunoglobuliinigeenien koodaamaa immunoglobuliinia. Plasmasy-toomasoluja voidaan kasvattaa viljelmässä tai hiirten vatsaontelossa, jolloin eritetty immunoglobuliini voidaan saada askites-nesteestä.
15 Isäntäsolujen. transformaatio
Isäntäsolujen transformaatio suoritetaan seuraavasti. Ilmentämiskantaja linearisoidaan ja DNA viedään isän-täsoluihin vasta-aineen tuottamista varten. Kuvaaviin esimerkkeihin DNA:n viemisestä isäntäsoluihin kuuluvat 20 elektroporaatio, protoplastifuusio, kalsiumfosfaattisaos-tus tai muut tavanomaiset menetelmät, joissa käytetään dekstraanisulfaattia ja PEGrtä.
Jos isäntäsoluina käytetään soluja, joissa ei ole huomattavia soluseinän muodostamia esteitä, transformaatio : 25 voidaan suorittaa julkaisussa Graham ja Van der Eb, (1978)
Virology 52, 546 kuvatun kalsiumfosfaattisaostusmenetelmän mukaan.
Jos käytetään prokaryoottisia soluja tai vahvoja soluseinärakenteita sisältäviä soluja, edullinen transfor-30 maatiomenetelmä on julkaisussa Cohen, F.N. et ai., (1972)
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 2110 esitetyn menetelmän mukainen kalsiumkäsittely kalsiumkloridilla.
Isäntäsolut voidaan transformoida joko rinnakkais-transformaatiolla tai kohdetransformaatiolla.
46 103181
Rinnakkaistransformaation suorittamiseksi voidaan käyttää kevyttä ketjua ja raskasta ketjua koodaavia geenejä joko samaa tai eri lajia olevien erillisten soluviljelmien transformaatioon; erillisiä kevyen ja raskaan ketjun 5 plasmideja voidaan käyttää yhden soluviljelmän rinnakkais-transformaatioon tai viimeisenä vaihtoehtona voidaan yhden soluviljelmän transformaatioon käyttää yhtä ilmentämis-plasmidia, joka sisältää molemmat geenit ja joka kykenee ilmentämään sekä kevyttä että raskasta ketjua vastaavia 10 geenejä.
Kohdetransformaatiomenetelmässä isäntäsolut transformoidaan kevyttä ketjua koodaavilla geeneillä ja valikoidaan kevyen ketjun markkerin sisältävät solut. Kevyt ketju havaitaan soluvärjäyksellä tai mahdollisesti havait-15 semalla kevyt ketju supernatantista, jos tämä ketju on erittynyt. Kevyen ketjun esiintymisen suhteen valikoidut solut transformoidaan raskaan ketjun konstruktiolla ja ^ saadut solut valikoidaan näihin lisäksi sisältyvän raskaan j ketjun markkerin suhteen.
20 Tiedetään, että jotkin kuolemattomat imusolulinjat, kuten plasmasytoomasolulinjat, erittävät normaalitilassaan f erillisiä kevyitä tai raskaita Ig-ketjuja. Tästä seuraa se, että jos tällainen solulinja transformoidaan tämän keksinnön mukaista kimeeristä raskasta tai kevyttä ketjua 25 sisältävällä vektorilla, ei ole tarpeen transformoida tätä solulinjaa tai toista solulinjaa toisella Ig-ketjulla, edellyttäen, että normaalisti erittyvä ketju on komplementaarinen soluiinjan alkuperäiseen transformaatioon käytetyn vektorin koodaaman Ig-ketjun vaihtelevan osan suhteen.
i : 30 Transformoitujen isäntäsolujen valikointi ja ilmen täminen V * Isäntäsolujen transformaation jälkeen solut voidaan kasvattaa 48 tunnin ajan, jotta markkerigeenien ilmentymi-_";I nen voisi tapahtua. Solut viedään sitten valikoivaan kas- 35 vatuslluokseen, jossa transformoitumattomat solut kuolevat jij 47 103181 vain DNA-konstruktioilla transformoitujen solujen jäädessä henkiin.
Raskaita ja kevyitä ketjuja tai näiden osia voidaan tuottaa erillään toisistaan ja näistä voidaan saada vasta-5 aineita ja näiden fragmentteja. Tällaisiin preparointeihin vaaditaan erillisten ketjujen kokoamismenetelmien käyttöä.
Se, että tämän keksinnön mukaisella menetelmällä kyetään tuottamaan kevyitä ja raskaita ketjuja erillään toisistaan tarjoaa mahdollisuuden saada ainoalaatuisia 10 immunoglobuliinien, Fab-alueiden ja univalenttien vasta- aineiden yhdistelmiä. On mahdollista yhdistää uudelleen in viro vain ketjujen välisistä disulfidisidoksistaan pilkkomalla erotetut raskaat ja kevyet ketjut ja saada vasta-aineaktiivisuus palautumaan jopa muodostamatta uudelleen 15 ketjujen välisiä disulfidisidoksia [ks. Edelman, G.M. et ai.. (1963) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 50, 753].
Transformoidut solut kasvatetaan olosuhteissa, jotka ovat sopivia kevyiden ja/tai raskaiden ketjujen tuottamiseen ja näistä määritetään raskaan ja/tai kevyen ketjun 20 proteiinisynteesi. Esimerkkeihin käytettävistä määritys menetelmistä kuuluvat entsyymivälitteinen immunosorbentti-määritys (ELISA), radioimmunomääritys (RIA), fluoresenssi-aktivoitu solulajitteluanalyysi (FACS), immunohistokemia tai näiden kaltaiset määritykset.
25 Monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumisaffini- * teetti TAG-72:ta vastaan määritetään sinänsä tunnetuilla keinoilla [ks. Heyman B., (1984) J. Immunol. Methods 68, 193 - 204 ja yksityiskohtainen esimerkeissä esitetty kuvaus] .
30 Valitut positiiviset viljelmät jatkokloonataan puh- . taiden transformoitujen pesäkkeiden eristämiseksi. Sopiva menetelmä jatkokloonien saamiseksi on äärilaimennusmene-telmä, joka on opetettu McKearan teoksessa Monoclonal Antibodies, Plenum Press, N.Y. (1980) .
48 103181
Hybridoomat, jotka tuottavat näitä kimeerisiä vasta-aineita, voidaan kasvattaa tunnetuilla menetelmillä. Transformoidut solut voivat erittää suuria määriä kevyitä ja/tai raskaita ketjuja viljeltäessä niitä in viro, kuten 5 ontelokuitusysteemeissä, pyörijäviljelmissä ja staattisissa viljelmissä, tai in vivo, kuten askitesnesteeseen tuotettaessa .
Kimeerisiä vasta-aineita voidaan tuottaa suurissa määrissä viemällä hybridooma ruiskeena pristaanilla esikä-10 siteltyihin hiiriin ja keräämällä sopivan ajan kuluttua (noin 1-2 viikkoa) askitesneste hiiristä talteen, josta on tuloksena korkean tiitterin saavuttavaa homogeenista vasta-ainetta, ja eristämällä tästä monoklonaaliset vasta-aineet sinänsä tunnetuilla menetelmillä [ks. Stramignoni, 15 P. et ai. . (1983) Inti. J. Cancer 31, 543 - 552]. Hybri- j doomat kasvavat in vivo, kuten syöpäkasvaimet eläimissä, ja näiden seerumista tai askitesnesteestä voidaan saada monoklonaalisia vasta-aineita, joiden pitoisuus voi olla jopa 50 mg/ml. Tavallisesti noin 106 - 107 kudostyypiltään 20 yhteen sopivaa hybridoomasolua sisältävä ruiske hiiriin tai rottiin johtaa syöpäkasvaimen muodostumiseen muutaman viikon kuluttua. Vasta-aineet voidaan sitten ottaa talteen ja käsitellä tunnetuilla menetelmillä. [Ks. yleisesti teos Immunological Methods osat I ja II, Lefkovits, I. ja Per-t· 25 nis, B. (toim.) (1979 & 1981) Academic Press, New York, j·: N.Y. ja Handbook of Experimental Immunology, Weir, D.
(toim.) (1978) Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO].
j.. Vasta-aineet voidaan sitten varastoida useissa eri i4 30 puskuriliuoksissa, kuten fosfaatilla puskuroidussa fysio- logisessa suolaliuoksessa (PBS), josta saadaan yleensä pysyvä vasta-aineliuos myöhempää käyttöä varten.
Tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet voidaan pilkkoa tunnettuja proteaasientsyymejä käyttäen, esimerkiksi 35 papaiinilla tai pepsiinillä, jotta saadaan erittäin immu- 49 103181 noreaktiivisia F(ab')2-, F(ab')- ja Fab-fragmentteja. Lisäksi proteolyysin tuloksena muodostuneet Ig:n aktiiviset fragmentit (mp. noin 50 000) voidaan halkaista täysin pelkistettyihin raskaasta ketjusta ja kevyestä ketjusta muo-' 5 dostuviin komponentteihinsä ja rekonstruoida melko tehok kaasti aktiivisen vasta-aineen muodostamiseksi [Haber, E. (1964) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 52, 1099 ja Whitney, P.L. et ai. . (1965) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 53, 524].
Tuloksena olevien F(ab')2-, F(ab')~ ja Fab-fragmenttien 10 reaktiivisuus määritetään samoilla menetelmillä, joita käytettiin täydellisten monoklonaalisen vasta-aineen yhteydessä.
Vasta-aineiden käyttötavat Tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet sekä näiden 15 immunoreaktiiviset fragmentit tai rekombinantit tarjoavat käyttöön ainoalaatuisia etuja, sillä näillä vasta-aineilla on kyky sitoutua spesifisesti pahanlaatuisiin soluihin ja paikallistaa syöpäkasvaimia, niillä on myös pysyvät vaih-televat alueet, jotka eivät havaittavasti sitoudu normaa-20 leihin soluihin, kuten fibroblasteihin, endoteelisoluihin tai suurimpien elinten epiteelisoluihin.
Tarkemmin sanottuna nämä vasta-aineet sekä näiden immunoreaktiiviset fragmentit tai rekombinantit ovat käyttökelpoisia diagnostisissa in vivo -määrityksissä liitet-25 tynä kuvantamismarkkeriin karsinoomapesäkkeiden havaitse miseksi in situ ja radioimmuno-ohjatussa kirurgiassa, kuten jäljempänä on tarkemmin kuvattu.
Diagnostiset in vivo -määritykset
Vasta-aineita, immunoreaktiivisia fragmentteja ja 30 niiden rekombinantteja käyttävissä ihmisen syöpäkasvainten ' tai niiden etäpesäkkeiden diagnostisissa in vivo -määri tyksissä liitetään mainitut aineet markkeriin ja annetaan potilaalle, jonka jälkeen kuvantamismarkkerin esiintyminen potilaassa todetaan potilaan altistamisella tarkoituksen-35 mukaisille tunnistamismenetelmille.
50 1 03 1 81
Vasta-aine-kuvantamismarkkerikonjugaatin antaminen ja havaitseminen sekä menetelmät vasta-aineen konjugoimi-seksi kuvantamismarkkeriin suoritetaan jo tunnetuilla tai helposti määriteltävillä menetelmillä, kuten esimerkiksi 5 julkaisuissa Goldenberg, D.M. et ai. . (1978) New England J. Med., 298, 1384 - 1388, Goldenberg, D.M. et ai.. (1983) J. Amer. Med. Assoc., 280, 630 - 635, Goldenberg, D.M. ai., (1983) Gastroenterol. 84, 524 - 532, Siccardi, A.G. et ai. . (1986) Cancer Res. 46., 4817 - 4822, Epenetos, A.A.
10 et ai. , (1985) Cancer, 55, 984 - 987, Philben, V.J. et ai. , (1986) Cancer, 57, 571 - 576, Chiou, R. et ai. . (1986) Cancer Inst., 76, 849-855, Colcher, E. et ai., (1983) Cancer Res., 43, 736 - 742, Colcher, E. et ai. .
(1983) Laboratory Research Methods in Biology and Medicine 15 Immunodiagnostics, New York, Alan R. Liss, s. 215 - 258,
Keenan, A.M. et ai.. (1984) J. Nucl. Med.,25, 1197 - 1203,
Colcher, D. et ai. . (1987) Cancer Res., 47, 1185 - 1189,
Estaban, J.M. et ai.. (1987) Inti. J. Cancer, 39, 50 - 59,
Martin, D.T. et ai. . (1984) Curr. Surg. , 41, 193 - 194, 20 Martin, E.W. et ai.. (1986) Hybridoma, 5, S97 - S108, Martin, D.T. et ai.. (1985) Am. J. Surg., 150, Meares et ai., (1984) Anal. Biochem., 142, 68 - 78 ja Krejkarek et ai.. (1977) Biochem. and Biophys. Res. Comm., 77, 581 - 585 on kuvattu.
.Γ 25 Annostus vaihtelee riippuen potilaan iästä ja pai nosta. Yleensä annostuksen tulisi olla tehoava syöpäkasvainten paikkojen havaitsemiseen tai näkyväksi tekemiseen niin, että nämä erottuvat normaalista kudoksesta. Kerta-annos on edullisesti 0,1 - 200 mg vasta-aine-markkerikon-30 jugaattia potilasta kohden.
Alan ammattimiesten hyvin tuntemiin esimerkkeihin | vasta-aineisiin konjugoitävistä kuvantamismarkkereista kuuluvat aineet, jotka voidaan havaita diagnostisella ku-vantamisella gammaskannerilla, kädessä pidettävällä gamma-35 koettimella, positroniemissiotomografiällä tai niitä vas- l 51 103181 taavilla laitteilla, kuten edellä esitetyissä viitteissä on kuvattu, sekä aineet, jotka voidaan havaita kuvantamal-la ydinmagneettisella resonanssilla käyttäen ydinmagneet-tisen resonanssin spektrometriä tai vastaavaa laitetta, - 5 kuten edellä esitetyissä viitteissä on kuvattu.
Sopiviin esimerkkeihin aineista, jotka voidaan havaita käyttäen gammaskanneria tai vastaavaa, kuuluvat esimerkiksi radioisotoopit, kuten 125I, 13II, l23I, mIn, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re ja "“Te. 125I, 123I, l53Sm 10 ja """Te ovat edullisia matalan energiansa ansiosta sekä niiden sopivuudesta etäältä suoritettavaan havaitsemiseen.
Esimerkkinä aineesta, joka voidaan havaita käyttäen ydinmagneettisen resonanssin spektrometriä tai vastaavaa laitetta on gadolinium (Gd).
15 Radiointmuno-ohjattu kirurgia
Vasta-aineet ja niiden immunoreaktiiviset fragmentit ja rekombinantit ovat tärkeitä radioimmuno-ohjatussa kirurgiassa (RIGS). RIGS:ssa, intraoperatiivisessa hoidossa, syöpäkasvaimet paikallistetaan ja leikataan pois. Ku-20 vantamismarkkerilla leimattu vasta-aine annetaan ruiskeena potilaaseen, sitoutunut vasta-aine paikallistetaan kädessä pidettävällä gammakoettimella (GDP) ja leikataan pois. Esimerkiksi soveltuva GDP on Neoprobe™ ja se on kaupallisesti saatavilla yhtiöstä Neoprobe™ Corporation, Tampa, 25 FL. Katso Martin et ai.. (1988) "Radioimmunoguided surge ry: A new approach to the intraoperative detection of tumor using antibody B72.3", Amer. J. Surg. 156, 386 - 392, Martin et al. . (1986) "Radioimmunoguided surgery: intra operative use of antibody 17-1A in colorectal cancer", 30 Hybridoma 5, S97 - S108.
Vasta-aine-kuvantamismarkkerikonjugaatin antaminen ja havaitseminen sekä menetelmät vasta-aineen konjugoimi-seksi kuvantamismarkkeriin suoritetaan alan ammattimiehen jo tuntemin tai vaivatta määriteltävissä olevin menetel-35 min, kuten esimerkiksi edellä olevasta käy ilmi.
52 103181
Annos vaihtelee riippuen potilaan iästä ja painosta, mutta yleensä 0,1 - 200 mg:n kerta-annos vasta-aine-markkerikonjugaattia potilasta kohden on riittävä.
Seuraavat suojapiiriä rajoittamattomat esimerkit on 5 tarkoitettu ainoastaan kuvaamaan tämän keksinnön mukaisten kimeerisiä DNA-jaksoja koodaavien vasta-aineiden konstruktiota ja ilmentämistä. Ellei toisin ole mainittu, kaikki lämpötilat on ilmoitettu celciusasteina. Kaikki prosenttiluvut ovat painoprosentteja, ellei toisin ole mainittu.
10 Esimerkit
Hiiren muuttumattomien alueiden korvaaminen CC-vasta-aineet olivat peräisin hiiristä ja ne ovat merkittävästi kykenemättömämpiä efektoritoimintojen suoritukseen kuin ihmisen muuttumattomat alueet.
15 Tämän seurauksena seuraavissa esimerkeissä tietyt vasta-aineet "humanisoidaan" poistamalla geneettisesti raskaiden ja kevyiden ketjujen muuttumattomat alueet sekä korvaamalla ne niiden ihmisissä olevilla vastineilla.
Hiiren kevyen ketjun muuttumattoman alueen geenit 20 korvattiin ihmisen kappa (k) -geenillä ja hiiren raskaan ketjun geenit korvattiin kullakin ihmisen neljästä gamma-isotyypistä (γΐ, γ2, 73 ja y4) . Kullakin näistä neljästä gamma-isotyypistä on ainoalaatuisia biologisia ominaisuuksia. Yleinen katsaus on saatavilla julkaisusta "The Human 25 IgC subclasses", Hamilton, R.G. (1989) dokum. nro CB0051-289, Calbiochem Corporation.
Raskaan ja kevyen ketjun vaihtelevan alueen valmistus CC49 kevyen ketjun eristäminen 30 CC49-hybridoomasolut erittävät vasta-ainetta, jossa on IgG,-raskasketjuisotyyppi ja kevyt kappaketju.
Kokonais-DNA eristettiin CC49-hybridoomasoluista, Balb/C-hiiren munuaissoluista ja NSI-plasmasytoomasoluista julkaisussa Cell 24, 353-356 (1981) esitetyn menetelmän 3 5 mukaan.
- - ä „ 103181 bo
Yleensä noin 10 - 20 μg uutettua DNA:ta kustakin solulinjasta pilkottiin täydellisesti käyttämällä 80 yksikköä Bam Hl, Eco Rl, Hind III, Spe I, Xba I, Sac I, Bal II ja Pst I 50 - 100 mikrolitrassa sopivaa reaktiopuskuria 5 sisältävää reaktioseosta 37 °C:n lämpötilassa yli yön.
Seuraavaksi suoritettiin kustakin solulinjasta uutetulle kokonais-DNA:lie Southern-hybridisointi, jonka on kehittänyt E.M. Southern, (1975) J.Mol.Biol. 98, 503 - 517. DNA-fragment it fraktioitiin koon perusteella elektro-10 foreesissa 0,8-%:isessa agaroosigeelissä. Kaksinauhaiset DNA-fragment it muunnettiin yksinauhaisiksi emäsi iuoksessa, jonka jälkeen nitroselluloosasuodatin asetettiin kosketuksiin geelin kanssa muunnettujen DNA-jaksojen siirtämiseksi suodattimelle korkean suolapitoisuuden omaavan liuoksen 15 läsnä ollessa.
Hybridisointi suoritettiin käyttämällä koettimena satunnaisalukkeiden avulla 32P-leimattua L-ketjua.
Tarkemmin sanottuna koetin oli 1,71 kiloemäsparin (ke) suuruinen, pGDl -plasmidista eristetty Hind III - Pst 20 I -fragmentti, joka sisältää koodaavat eksonit hiiren JL-alueista (J1-J5). Koetinfragmentin nukleotidijakso on esitetty kuviossa 7. Tämä plasmidi on kuvattu julkaisussa "Site Directed Cleavage of Immunoglobulin Gene Segments by Lymphoid Cell Extracts", Agostaro et al.. (1985) Can. J.
25 Biochem. Cell Biol. 63, 969 - 976. Plasmidi saatiin tutki-joilta Nobumichi Hozumi ja John Roder, Mt. Sinai Research Institute, Toronto, Ontario, Kanada.
Koettimen leimaamiseksi radioaktiivisella merkkiaineella hankittiin alfa32P-dCTP Amersham-yhtiöstä, Arlington 30 Heights, IL, USA, ja satunnaisalukepakkaus hankittiin Pharmacia-yhtiöstä, Piscataway, NJ, USA.
Signaalit Southern-siirroista saatiin esille auto-radiografiällä käyttäen Kodak X-OMAT™ AR -filmiä. Yhtäkään selvästi uudelleenjärjestymisen seurauksena syntynyttä 35 vyöhykettä ei havaittu. Suhteessa standardeihin Hind „ 103181 54 III :11a pilkotun CC49-DNA:n autoradiograinmissa ei siten havaittu yhtäkään uniikkia vyöhykettä. Southern-määritys-tuloksista ei kuitenkaan voitu sulkea pois sitä, että uudelleenjärjestäytymisen seurauksena syntyneen L-ketjun 5 vyöhykkeen peitti vyöhyke, joka kulkeutui CC49:n Hind III:lla pilkotussa DNArssa samalla tavalla sellaisen vyöhykkeen kanssa, joka oli tuloksena hiiren munuaissolun DNA:n (joka edustaa ituradan DNA:ta) pilkkoutumisesta Hind III :11a. Asian havaittiinkin olevan näin.
10 Hiiren VL-geenejä sisältävän plasmidin valmistus LAMBDA-ZAP™, lambda-faagiin perustuva itsensä irrottamaan kykenevä insertiokloonausvektori, hankittiin Stratagene Co. -yhtiöstä, La Jolla, CA, USA. LAMBDA-ZAP™ on kuvattu Stratagenen vuoden 1987 luettelossa sivuilla 15 20 - 21. LAMBDA -ZAP™:n kohesiiviset (cos) päät liitettiin ligaasilla yön yli valmistajan käyttöohjeita noudattaen.
Kaksikymmentä mikrogrammaa ligaasilla liitettyä LAMBDA-ZAP™:a pilkottiin käyttäen 5 mikrolitraa (15 yksikköä) Spe I:tä, joka oli hankittu New England Biolabs, Inc.
20 -yhtiöstä. Pilkkomisliuoksen lopullinen tilavuus oli 100 mikrolitraa. 55 minuutin pilkkomisen jälkeen lisättiin vielä 6 yksikköä Spe I:tä. 70 minuutin kuluttua reaktio pysäytettiin Stratagenen käyttöohjeiden mukaisesti uuttamalla fenolilla ja saostamalla etanolilla.
25 Spe I -restriktioentsyymillä suoritetun pilkkomisen tuloksena kumpaankin päätteeseen muodostui "tarttuvat päät". Nämä tarttuvat päät muunnettiin T4-DNA-polymeraa-silla, jotta saataisiin puoliksi täytetyt Spe I -tarttuvat päät, esim. 5'ACT/3'TCATG. Puolitäyttöreaktion suoritta-30 miseksi etanolisaostuksessa aikaansaatu DNA-nappi liuotet-tiin 8 mikrolitraan vettä. Tähän lisättiin 2 mikrolitraa 10-millimolaarista dTTP:tä, 2 mikrolitraaa 10-millimolaa-rista dCTP:tä, 2 mikrolitraa Stratagenen 10X -ligaasipus-kuriliuosta, 4 mikrolitraa deionisoitua, tislattua vettä 55 103181 ja 2 mikrolitraa Klenow-fragmenttia, joka oli hankittu Bethesda Research Laboratories (BRL) -yhtiöstä.
Reaktio suoritettiin huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Reaktio pysäytettiin inaktivoimalla DNA-polyme-- 5 raasi 65 °C:n lämpötilassa 10 minuutin ajan.
Satakuusikymmentä mikrogrammaa kokonais-CC49-hyb-ridooma-DNA:ta (joka sisältää hiiren kevyen ketjun promoottorin sekä L- ja VJ-eksonit) pilkottiin loppuun saakka Hind III -entsyymillä. 1-20 ke:n pituiset fragmentit 10 leikattiin pois 0,8-%:isista agaroosigeeleistä. DNA puhdistettiin käyttäen GENECLEAN™:ia, joka on kaupallisesti saatavilla BIO 101 -yhtiöstä (La Jolla, CA, USA).
Hind 111:11a pilkotut kokonais-CC49-hybridooma-DNArt täytettiin puoliksi samalla tavoin kuin LAMBDA-15 ZAP™:in Spe I -fragmentit, sillä poikkeuksella, että käytettiin dATP:tä ja dGTP:tä. Puoliksi täytetyt Hind III :11a pilkotut fragmentit muodostivat 5'AGCTT/3'GAA-tarttuvat päät, jotka ovat yhteen sopivia aikaisemmin mainittujen Spe I -puolitäytettyjen LAMBDA-ZAP™-fragmenttien kanssa.
20 Fenolilla suoritetun uuton ja etanolilla suoritetun saostuksen jälkeen, Maniatisin teoksen oppien mukaan ko-konais-CC49~hybridooman Hind III :11a muunnetut ja LAMBDA-ZAP™:n Spe I:llä muunnetut DNA-fragmentit liitettiin T4-DNA-ligaasin avulla. Ligaasireaktion kokoonpanossa käytet-.r" 25 tiin 6,1 mikrolitraa ligaasiliitosseosta, joka sisälsi seuraavat aineet: noin 0,2 mikrogrammaa CC49-hybridooman Hind III :11a muunnettua kokonais-DNA:ta 3 mikrolitrassa liuosta, noin 1 mikrogramma LAMBDA-ZAP™:n Spe I:llä muunnettua DNA:ta 1 mikrolitrassa liuosta, 0,6 mikrolitraa 30 Stratagenen 10X -ligaasipuskuriliuosta, 0,5 mikrolitraa : 10-millimolaarista ATP:ta ja 1 mikrolitra Stratagene-li- gaasia. Tätä inkuboitiin yön yli vesihauteessa ja lämpötila laskettiin vähitellen 18 °C:n lämpötilasta noin 4 °C:n lämpötilaan. Tämä ligaasilla liittäminen poisti 35 sekä Hind III- että Spe I -kohdat.
56 103181
Ligatoidun seoksen genomikirjasto tehtiin Stratage-nen käyttöohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 2 mikrolitraa yllä valmistettua ligaatioseosta käytettiin Stratagenen Gigapack Gold pakkaussysteemiin valmistajan ohjeita nou-5 dattaen. Viisitoista 150 mm:n maljaa, joiden plakkitiheys tiheys oli 50 000 plakkia maljaa kohti, seulottiin positiivisten kloonien suhteen valmistajan ohjeiden mukaan hybridisoimalla Schleicher-Schuell-yhtiöstä, Keene, NH, USA hankituille nitroselluloosasuodattimille. Hybridi-10 soinnissa käytettiin 32P-satunnaisleimattua, aikaisemmin kuvatusta pGDl.-stä peräisin olevaa koetinta. Saatiin kaksi positiivista kloonia.
Molemmat kloonit puhdistettiin yksittäisten plakkien kautta ja LAMBDA-ZAP™:in CC49 L -ketjun vaihtelevan 15 alueen sisältävät yhdistelmäplasmidit (fagemidit) saatiin käyttämällä Stratagenen automaattista irrotusprotokollaa. Tuloksena olleen rekombinoituneen plasmidin vektoriosaa J kutsutaan pBLUESCRIPT SK(-):ksi ja se koostuu 2 964 emäs- parista, kuten Stratagenen vuoden 1987 luettelossa kuva-20 taan. pBLUESCRIPT SK(-):n plasmidikartta on esitetty ku- viossa 8.
; Kahdesta positiivisesta kloonista saatu DNA sek- venssoitiin osittain ja kummatkin olivat identtisiä. Yhtä klooneista, jolle annettiin tunnus pRLIOI, käytettiin myö- 25 hempiin tutkimuksiin.
CC49:n kevyen ketjun restriktiokartoitus pRLIOI:n koko oli 7,61 ke ja DNA-insertin koko määritettiin restriktioentsyymikartoituksella 4,65 ke:n suuruiseksi. pRLIOI:n plasmidikartta on esitetty kuviossa 9.
30 pRLIOI:ssä olevan CC49:n L-ketjun genomisesta DNA:sta koostuvan insertin restriktioentsyymikartta on esitetty j · kuviossa 10.
CC83:n kevyen ketjun vaihtelevan alueen eristäminen
Seuraavaa poikkeusta lukuun ottamatta CC83:n kevyen _ 35 ketjun eristämiseen käytetyt menetelmät olivat olennaises- 'iä =,t 57 103181 ti samat kuin CC49:n kevyen ketjun eristämiseen käytetyt menetelmät.
7 X 105 plakkia sisältävä genomikirjasto seulottiin käyttäen koettimena 32P-satunnaisleimattua pGDlrstä saatua 5 1,71:n suuruista Hind III - Pst I -fragmenttia aikaisemmin kuvatulla tavalla. Saatiin yksi positiivinen klooni. Positiiviselle kloonille annettiin tunnus pRL200.
CC83:n kevyen ketjun restriktiokartoitus pRL200:n koko oli 7,44 ke ja DNA-insertin koko mää-10 ritettiin restriktioentsyymikartoituksella 4,48 ke:n suuruiseksi. pRL200:n plasmidikartta on esitetty kuviossa 11. pRL200:ssa olevan CC83:n L-ketjun genomisesta DNA:sta koostuvan insertin restriktioentsyymikartta on esitetty kuviossa 12.
15 CC49:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen eristämi nen CC49:n raskaan ketjun eristämiseen käytetyt menetelmät olivat olennaisesti samat kuin mitä käytettiin CC49:n kevyen ketjun eristämisessä, mukaan lukien saman 2 0 CC49:n Hind III :11a muunnetun DNA:n seulonta.
Kirjaston seulontaan käytetty hybridisaatiokoetin muodostettiin pNP9:stä, joka sisältää CC49:n immunoglobu-liinin raskaan ketjun JH3*.a ja JH4:ää vastaavat koodaavaat eksonit sisältävän 1,98 ke:n Eco R I - Bam H I -fragmen-.. 25 tin. Koetinfragmentin nukleotidisekvenssi esitetään ku viossa 13. Plasmidi saatiin tutkijoilta Dr. Nobumich Hozu-mi ja Dr. John Roder, Mt. Sinai Research Institute, Toronto, Ontario, Kanada.
Seulottiin 9,5 X 105 plakkia sisältävä genomikirjas-30 to ja siitä saatiin yksi positiivinen klooni. Tämä posi-tiiviselle kloonille annettiin tunnus pHH49.
CC49:n raskaan ketjun restriktiokartoitus pHH49:n koko oli 7,0 ke ja DNA-insertin koko määritettiin restriktioentsyymikartoituksella noin 4,0 ke:n 58 103181 suuruiseksi. pHH49:n plasmidikartta on esitetty kuviossa 14 .
CC83:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen eristäminen 5 Seuraavin poikkeuksin CC83:n raskaan ketjun eristä miseen käytetyt menetelmät olivat olennaisesti samat kuin mitä käytettiin CC49:n kevyen ketjun eristämisessä.
Noin kolmetoista mikrogrammaa ligaasilla liitettyä LAMBDA-ZAP™-vektorin DNA:ta pilkottiin käyttäen 12 yksik-10 köä New England Biolabs, Inc. -yhtiöstä hankittua Spe I:tä sopivassa puskuriliuoksessa, jonka kokonaistilavuus oli 100 mikrolitraa. LAMBDA-ZAP™ pilkottiin 37 °C:n lämpötilassa yhden tunnin ajan. Reaktioseos uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla Stratagenen käyttöohjeiden mu-15 kaan. Spe I:llä pilkottu LAMBDA-ZAP™ defosforyloitiin Maniatisin teoksessa esitettyjen menetelmien mukaisesti, j sillä poikkeuksella, että käytettiin 40-kertaista yli- j määrää vasikan suolen alkalista fosfataasia (Boehringer
Mannheim, Indianapolis, IN, USA).
20 CC83:sta saatu DNA pilkottiin loppuun saakka käyt täen Spe I:tä. Noin 3 - 40 ke:n pituiset fragmentit eristettiin 0,8-%:isen agaroosigeelin viipaleesta sähkövirralla eluoimalla, kuten Maniatisin teoksessa on kuvattu, ja liitettiin ligaasilla defosforyloituun, Spe I:llä katkais-25 tuun LAMBDA-ZAP™-vektori in.
Seulottiin 5 X 105 plakkia sisältävä genomikirjasto käyttäen pNP9:stä muodostettua koetinta, jonka sekvenssi _L- on esitetty kuviossa 13. Siitä saatiin yksi positiivinen klooni. Tälle positiiviselle kloonille annettiin tunnus 30 pHS83.
CC83:n raskaan ketjun restriktiokartoitus pHS83:n koko oli 7,95 ke ja DNA-insertin koko määritettiin restriktioentsyymikartoituksella noin 5 ke: n suuruiseksi. pHS83:n plasmidikartta on esitetty kuviossa : 35 15.
li im im 59 103181 CC46:n, CC49:n, CC83:n ja CC92:n lähetti-RNA:n sek-venssointi
Kokonais-RNA uutettiin noin 1 X 107:stä -70 °C:n lämpötilaan pakastetusta CC49-solusta olennaisesti samalla 5 tavoin kuin Maniatisin teoksessa on raportoitu, seuraavin poikkeuksin. Käytetty liuos koostui 4 M:sta guanidiumiso-tiosyanaatista ja 2,5 M:sta natriumsitraatista ja sen pH oli 7,0, sekä sentrifugointi suoritettiin SW40Ti roottorilla 31000 kierr./min.
10 Yhteensä saatiin eristetyksi 2,7 mg CC49:n RNA:ta.
Sentrifugoinnin jälkeen poly-A+ lähetti-RNA puhdistettiin noin 1,68 mg:sta RNA:ta oligo(dT)selluloosakromatografiällä käyttäen Collaborative Research, Inc. -yhtiöstä, Bedford, MA, USA, hankittua tyypin 3 oligo(dT)selluloosaa. 15 Käytetty menetelmä oli julkaisussa Aviv ja Leder, (1972) Proc. Nat'l. Acad. Sei. (USA) 69, 1408 esitetyn mukainen.
1,68 milligrammasta lähetti-RNA:ta saatiin yhteensä 50,24 μg poly-A+ lähetti-RNA:ta.
Yhteensä 3,28 mg CC83-.n RNA:ta eristettiin noin l X 20 107 solusta. 1,91 mg:Sta kokonais-RNA:ta eristettiin 54.6 poly-A+ lähetti-RNA:ta.
Yhteensä 0,814 mg CC92:n RNA:ta eristettiin noin 2.6 X 108 solusta. 0,814 mg:sta kokonais-RNA:ta eristettiin 41.88 μg poly-A+ lähetti-RNA:ta.
" 25 Yhteensä 1,7 mg CC46:n RNA:ta eristettiin noin 2,89 X 10* solusta. 1,7 mg:sta kokonais-RNA:ta eristettiin 68.88 μg poly-A+ lähetti-RNA:ta.
Synteettiset oligonukleotidialukkeet syntetisoitiin käyttäen Applied Biosystems -yhtiön [Applied Biosystems 30 (ABI), Foster City, CA, USA) 380A -mallista DNA-synteti-soijaa ABI:n määrittelemää fosforamadiittiin perustuvaa kemiaa käyttäen. 7 M ureaa sisältävällä 20-%:isella poly-akryyliamidigeelillä suoritetun elektroforeesin jälkeen oligonukleotidit puhdistettiin valmistajan ohjeiden mukai-35 sesti. Oligonukleotidin konsentraatiot määriteltiin spekt- so 103181 rofotometrisesti optisesta tiheydestä 260 nm:ssä, jossa 1 optisen tiheyden yksikkö 260 nm:ssä vastaa 33 /zg/ml yksi-nauhaista DNA:ta.
Seuraavat oligonukleotidialukkeet tehtiin lähetti-5 RNA -sekvenssointia varten: (1) CC49:n, CC83:n, CC92:n kevyitä ketjuja varten valmistettua KL(-):a, 22-meeriä: 5'GGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3', joka on komplementaarinen hiiren immunoglobuliinin kappa-ketjujen muuttumattoman alueen 5'-pään koodaavalle jaksoi-10 le, käytetään määrittämään kevyen ketjun vaihtelevan jakson 3'-päätä lähimpänä oleva lähetti-RNA-jakso.
Lisäksi, CC49:n kevyttä ketjua varten valmistettua 49FR1(-):a, 17-meeriä: 5'GGAAGATGGATACATTGGTGC-3' 15 käytettiin määrittämään jäljellä oleva sekvenssi.
Lisäksi, CC83:n kevyttä ketjua varten valmistettua ketjua varten valmistettua J4(-):a, 24-meeriä: 5'-CCAACTTTGTCCCCGAGCCGAACG-3' ja myös 83L CDR2(-):a, 17-meeriä: 20 5'-CAGGGACTCCAGTGTGC-3' käytettiin määrittämään jäljellä oleva sekvenssi.
Lisäksi, CC92:n kevyttä ketjua varten valmistettua J5(-):a: 5'-CGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3' 25 käytettiin määrittämään jäljellä oleva sekvenssi.
1 CC46:n, CC49:n, CC83:n ja CC92:n 1 raskaita ketju ja varten valmistettiin CH1(-):, 24-meeri: 5'-ATGGATGTAGTTTGGGCAGCAGAT-3', joka on komplementaarinen hiiren γΐ raskaan ketjun muuttu-30 mattoman alueen 5'-pään koodaavalle jaksolle. 24-meeriä : CH1 (-) käytetään määrittämään 3'-päätä lähinnä oleva ras- ,[ kaan ketjun vaihtelevien alueiden lähetti-RNA-sekvenssi .
Lisäksi CC49:n raskasta ketjua varten valmistettua JH4(-):ää, 20-meeriä: 1 35 5'-GGTGACTGAGGTTCCTTGAC-3' 61 103181 käytettiin määrittämään jäljellä oleva jakso.
Lisäksi CC83:n raskasta ketjua verten valmistettua JH2(-):a, 16-meeriä: 5'-CTGAGGAGACTGTGAG-3' 5 käytettiin määrittämään jäljellä oleva jakso.
Lisäksi CC92:n raskasta ketjua varten ja B72,3:n raskasta ketjua varten valmistettua B72,3/CC92 HC -20 -meeriä: 5'-CCTTGAACTTCTCATTGTAC-3' 10 käytettiin määrittämään jäljellä oleva jakso.
Seuraavat menettelyt suoritettiin kuten julkaisussa Jan Gelliebter, (1987), BRL FOCUS 9, 1 on pääkohdittain esitetty.
Oligonukleotidialukkeet leimattiin päätteistään 15 seuraavalla tavalla: 100 ng oligonukleotidia yhdistettiin liuokseen, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitolia ja 1 mM spermidiiniä, 100 μα (γ-32Ρ) ATP:ta (Amersham, 5000 Ci/millimooli) ja 7 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia ja jonka tilavuus oli 13 μΐ. Reak-20 tion annettiin edetä 37 °C:n lämpötilassa 30 minuutin ajan, jonka jälkeen se lämmitettiin 65 °C:n lämpötilaan 5 minuutin ajaksi kinaasin inaktivoimiseksi ja tämän jälkeen lisättiin 7 μΐ vettä, jotta konsentraatioksi saataisiin 5 ng/μΐ. Leimatut alukkeet varastoitiin -20 °C:n lämpöti-r 25 laan kunnes niitä tarvittiin.
Erillisiä näytteitä, joista kukin sisälsi noin 13 mikrogrammaa CC49:n, CC83:n, CC92:n tai CC46:n poly-A+- lähetti-RNA:ta tässä järjestyksessä ilmoitettuna, resus-pendoitiin 10 μΐ-.ssa vastinnauhojen yhtymiseen tarkoitet-30 tua puskuriliuosta [10 mM Tris-HCl (pH 8,3) ja 250 mM KC1] .
5 ng.-n näyte päätteistä leimattua oligonukleotidi-aluketta lisättiin kuhunkin lähetti-RNA -näytteeseen, lämmitettiin 80 °C:n lämpötilaan 3 minuutin ajaksi ja vas-35 tinnauhojen annettiin yhtyä toisiinsa 45 minuutin ajan 62 103181 61 °C:n lämpötilassa käytettäessä KL(-)- ja 65 °C:n lämpötilassa käytettäessä CH l(-) -oligonukleotideja. AMV-kään-teiskopioijaentsyymiä (Boehringer-Mannheim) käytettiin 6 yksikköä kutakin lähetti-RNA:n sekvenssointireaktiota koh-5 ti. Sekvenssoinnin loppuosa suoritettiin julkaisussa BRL FOCUS 9, 1 (1987) esitetyllä tavalla.
Alussa saadut sekvenssointitulokset osoittivat, että raskaat ja kevyet ketjut olivat järjestäytyneet uudelleen seuraavalla tavalla: CC49:n kappa-ketjussa oli 10 käytössä J5, CC49:n raskaassa γΐ -ketjussa oli käytössä Jh4, CC83:n kevyessä ketjussa oli käytössä J4, CC83:n gam-ma-l:ssä oli käytössä JH2. CC46:n kevyessä kappa-ketjussa oli käytössä J2, CC46:n raskaassa ketjussa oli käytössä Jh3, CC92:n kevyessä ketjussa oli käytössä J5 ja CC92:n 15 gamma-l:ssä oli käytössä JH2 .
j Kuviossa 16 on esitetty CC49:n VH:n nukleotidisek- ? venssi, jossa alleviivatut segmentit osoittavat jaksoja, jotka on saatu käyttäen oligonukleotidialukkeita lähettiin RNA:11a.
f 20 Kuvio 17 esittää CC83:n VH:n nukleotidisekvenssin, jossa alleviivatut segmentit osoittavat jaksoja, jotka on saatu käyttäen oligonukleotidialukkeita lähetti-RNA:11a.
Kuviossa 2 esitetyt CC46:n VH:n ja CC92:n VH:n kokoja naiset nukleotidijaksot saatiin käyttäen oligonukleotidi- ; 25 alukkeita lähetti-RNA: 11a.
Kuvio 4a esittää CC49:n VL:n nukleotidisekvenssin, .1 jossa alleviivatut segmentit osoittavat jaksoja, jotka on saatu käyttäen oligonukleotidialukkeita lähetti-RNA:11a.
Kuvio 5a esittää CC83:n VL:n nukleotidisekvenssin, 30 jossa alleviivatut segmentit osoittavat jaksoja, jotka on saatu käyttäen oligonukleotidialukkeita lähetti-RNA:11a.
Kuviossa 6 esitetty CC92:n VL:n kokonainen nukleoti-dijakso saatiin käyttäen oligonukleotidialukkeita lähetti-RNA:11a.
63 103181
Proteiinisekvenssi
Puhdistetut hiiren CC49- ja CC83-immunoglobuliini-molekyylit lähetettiin Dr. George Tarrille, University of Michiganin proteiinisekvenssointipalveluun NH2-pään amino-5 happojaksoanalyysiä varten. Dr. Tarr käytti Edman-pilkko- mismenetelmää, jota oli muunneltu teoksessa Tarr, G.E., "Manual Edman Sequencing System" Microcharacterization of Polypeptides: A Practical Manual [John E. Shively, toim., Humana Press, Inc., Clifton, N.J., s. 155 - 194 (1986)] 10 esitetyllä tavalla. Lyhyesti sanottuna Dr. Tarr pelkisti ja alkyloi immunoglobuliinimolekyylit. Immuno-globuliini-molekyylien kevyet ja raskaat ketjut erotettiin käänteis-faasi-HPLC:llä.
Kuviossa 4b on esitetty CC49:n VL:n aminohappojakso, 15 jossa on alleviivattuna aminohappojaksomäärityksen tulokset kypsän CC49 VL:n ensimmäisten 24 aminohapon kohdalta. Kuviossa 5b on esitetty CC83:n VL:n aminohappojakso, jossa on alleviivattuna aminohappojaksomäärityksen tulokset kypsän CC83:n VL:n ensimmäisten 51 aminohapon kohdalta. ASN-20 20:tä ei pystytty määrittämään CC83:n kevyestä ketjusta, tässä paikassa olevien N-kytkeytyneiden hiilihydraattiryh-mien vuoksi, joka on esitetty myöhempänä olevassa PNGaasi F -kokeessa. Jakso Asn-Ile-Thr vastaa konsensusjaksoa Asn-X-Thr/Ser hiilihydraattien liittämiseksi Asn:ään.
25 Koska immunoglobuliinien CC49 ja CC83 raskaat ket jut on suojattu N-päästä eivätkä siten ole käytettävissä aminohappojakson määritykseen, luontaista glykopeptidiä käsiteltiin syanogeenibromidilla (CNBr) metioniiniryhmien kohdalta tapahtuvan pilkkoutumisen aikaansaamiseksi. Pilk-30 koutumisessa syntyi fragmentteja, jotka puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC: llä. N-pään aminohapposekvenssointi suoritettiin CNBR-fragmenteilla.
Aminohappomäärityksen tulokset yhden CC49:n VH:n CNBr-peptidifragmentin kohdalta on esitetty alleviivattui-35 na ryhminä kuviossa 18. Aminohappomäärityksen tulokset 64 103181 yhden CC83:n VH:n CNBr-peptidifragmentin kohdalta on esitetty alleviivattuina ryhminä kuviossa 19. Kuten CC49:n suhteen oli laita, kaikki muut peptidijaksot vastaavat hiiren γ1:η muuttumattomasta alueesta saatuja CNBr-frag-5 mentteja.
CC83:n L-ketjussa olevan N-kytketyn hiilihydraatin määritys Tämä koe suoritettiin, jotta voitaisiin varmistua siitä, että CC83:n kevyeen ketjuun on liittynyt N-kytkey-10 tynyt hiilihydraatti, oletettavasti paikassa ASN-20 (katso kuvio 5b). Entsyymi glykopeptidaasi F (PNGaasi F), joka on eristettävissä Flavobacterium meninoosepticum -bakteeri-viljelmän suodoksesta [Tarentino, A. L et ai.. (1985) Biochemistry 24, 4665 - 4671], pilkkoo ASNrään N-kytkeytynei-15 tä korkeita mannoosi- ja/tai kaksiosaisesti haaroittuneita kompleksisokereita vapaan hiilihydraattirakenteen ja ASP-ryhmän muodostamiseksi siitä ASNrstä, johon se oli liittyneenä. Ero saman peptidin glykosyloituneen ja glykosyloi-tumattoman muodon molekyylipainojen välillä voidaan mää-20 rittää SDS-PAGE:11a.
Suoritettiin kahdentoista mikrogramman reaktiot, joissa joko käytettiin tai ei käytetty PNGaasi F:ää (Boeh-ringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA) vaikuttamaan puhdistettuihin hiiren CC49:n, CC83:n vasta-aineisiin ja .. 25 CC11: n F(ab')2:een (positiivinen kontrolli) liuoksessa, jonka lopullinen reaktion vesitilavuus oli 40 mikrolitraa. Neljä mikrolitraa 10 x -puskuriliuosta (1 M kaliumfosfaattia, 0,1 M dinatrium-EDTA, pH 7,4) lisättiin kuhunkin reaktioseokseen. "PNGaasi F:ää käytetty" -merkinnällä va-30 rustettuihin putkiin lisättiin 7,5 mikrolitraa PNGaasi « F:ää ja kaikkia putkia inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa yhden tunnin ajan. Reaktioputkiin lisättiin 40 mikrolitraa Laemmli 2X näytelaimennuspuskuriliuosta, joka sisälsi β-merkaptoetanolia. Elektroforeesi suoritettiin 10-prosent-35 tisessa SDS-polyakrylamidigeelissä, geeli värjättiin Coo- 65 103181 massie Brilliant Blue R-250:lla ja väri poistettiin. Tulokset on esitetty kuvassa 20. Kuten kanavassa 2 on esitetty, uusi vyöhyke (*) esiintyy PNGase F-käsitellyssä CC83-näytteessä, mutta ei käsittelemättömässä CC83-näyt-5 teessä (kanava 3). Uusi vyöhyke on noin 2 000-3 000 mole-kyylipainoyksikköä pienempi kuin luontainen kevyen ketjun vyöhyke, mistä käy ilmi N-kytkeytyneen hiilihydraattiosan poistuminen. Ainoa konsensus-glykosylointipaikka CC83:n kevyelle ketjulle on paikassa ASN 20, joten päättelemällä 10 voidaan olettaa, että tämä on glykosyloinnin todellinen paikka ja tämä on syynä siihen, miksi se ei tullut esille CC83:n kevyen ketjun N-pään sekvenssianalyysissä ASN:nä. CC4 9: n kevyen ketjun liikkuvuus ei muutu PGNase F.-llä käsiteltäessä (kanava 6) , mutta uusi vyöhyke havaitaan 15 CC11:n raskaan ketjun F (AB') 2-fragment il la (kanava 4*), joka toimii positiivisena kontrollina. CCll:n raskaan ketjun lähetti-RNA:n sekvenssointitulokset osoittavat konsen-susglykosylaatiopaikan V-alueessa (tuloksia ei ole esitetty) . Standardeina (kanava 1) käytettiin naudan seerumin 20 albumiinia (BSA), mp. 68 000 ja soijapavun trypsiini-inhibiittoria (STI), mp. 21 500.
DNA-jakso
Plasmidin DNA sekvenssoitiin suoraan käyttäen Se-quenase-DNA-sekvenssointipakkausta, joka oli hankittu Uni-:· 25 ted States Biochemical (USB) -yhtiöstä, Cleveland, OH, USA. Kaksinauhaisen DNA:n sekvenssoimiseksi noudatettiin USB:n käyttöohjeita. Kunkin vaihtelevan alueen DNA sekvenssoitiin käyttäen JH- tai JL-oligonukleotidia, jotka lähetti-RNA-jakson informaation perusteella oli määritetty 30 olemaan spesifisiä kummankin tuottavasti uudelleenjärjes-,· tyneen raskaan ketjun tai kevyen ketjun geenin suhteen, tässä järjestyksessä mainittuna.
Kun alkusekvenssit oli määritetty, sekvenssiä laajennettiin käyttäen lisäalukkeita. Lisäalukkeet synte- 66 103181 tisoitiin käyttäen hyväksi aikaisemmin muodostetuista sekvensseistä kerättyä tietoa.
Yllä kuvattua tekniikka käyttäen saatiin aikaan CC49:n ja CC83:n kokonaiset raskaan ketjun vaihtelevien 5 alueiden eksonit ja kevyen ketjun vaihtelevien alueiden eksonit. DNA-jakso koottiin ja analysoitiin käyttäen Hitachin DNA-jakson analysointiohjelmaa DNASIS™.
DNA-sekvenssointia varten valmistettiin seuraavat oligonukleotidialukkeet: 10 (1) Kummallekin kevyelle ketjulle CK-introni(-): 5'-GAAAACCTGTGTCTTACAC 3'.
(2) CC49:n kevyelle ketjulle CC49 FRI(+) : 5'-GTACCTGTGGGGACATTG 3', ja JK5(-)-23-meeri 15 5'-CGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3'.
(3) CC83:n kevyelle ketjulle CC83 CDR2(-): 5'-CAGGGACTCCAGTGTGC 3', CC83 L-introni (-): 5'GACTTCAAGATACAAATGTTAG-3', 20 ja JK4(-)-20-meeri: 5'-CCAACTTTGTCCCCGAGCCGAACG.
CC49 VL:n ja CC83 VL:n täydelliset nukleotidi jaksot on esitetty tässä järjestyksessä kuvissa 4a ja 5a.
CC49:n raskaalle ketjulle JH4 (-)-20 meeri: 25 5'GGTGACTGAGGTTCCTTGAC-3' ja Jh4 introni (-) : 5'-GCAATGCTCAGAAAACTCC.
CC83:n raskaalle ketjulle JH2(-)-16 meeri: 5'CTGAGGAGACTGTGAG-3' 30 ja Jh2 introni (-) : :! 5'-GCAGTAAAATCTATCTAAGCTG.
Tästä lähtien kunkin raskaan ketjun sekvenssointia laajennettiin seuraavilla jaksoilla: CC49/83 HC/5'(+) 5'-GCACTGCTCATGATATGCAAATC-3', 35 CC49/83 HC/5'(-) 67 103181 5'-GATTTGCATATCATGAGCAGTGC-3', ja CC49/83 H-ketju FRI (-) 5'-CTCAGCGTCAGACTGCTG-3'.
CC49:n VH:n ja CC83:n VH:n täydelliset nukleotidi -5 jaksot on esitetty kuviossa 2.
Suoritettiin vertailuja luonnehditun lähetti-RNA-jakson ja luonnehditun DNA-jakson välillä, sekä luonnehditun aminohappojakson ja DNA-jaksosta ennustetun aminohap-pojakson välillä. Näihin vertailuihin perustuen havaittiin 10 plasmidikloonien sisältävän oikean CC49:n ja CC83:n raskaan ja kevyen ketjun vaihtelevia jaksoja koodaavan DNA-jakson.
Kuten kuviosta 2 käy ilmi, CC49:n ja CC83:n raskaan ketjun vaihtelevien alueiden nukleotidijaksoista peräisin 15 olevissa ennustetuissa aminohappojaksoissa on huomattavasti jaksojen välistä samankaltaisuutta kehysalueilla ja suuresti vaihtelevilla alueilla 1 ja 2. Suuresti vaihte-leva alue 3 on melkoisesti erilainen näiden kahden välillä johtuen VH-alueen rekombinoitumisesta erilaisten D- ja JH-20 sekvenssien kanssa nimenomaan siksi, että CC49:n 1-raskas ketju käytti JH4-.ää ja CC83:n gamma-1 käytti JH2:ta.
CC49:n ja CC83.*n raskaan ketjun vaihtelevan alueen geenien huomattava DNA-jaksojen homologia koodaavien jaksojen 5'-puolella osoittaa, että nämä kaksi raskaan ketjun 25 vaihtelevan alueen geeniä olivat peräisin samoista ituradan eksoneista.
VHOfTAGiin, CC46:n, CC49:n, CC83:n ja CC92:n raskaan ketjun ituradan esiastegeenin eristäminen CC46:n, CC49:n, CC83:n ja CC92:n raskaan ketjun 30 vaihtelevien alueiden ituradan esiastegeenin eristämiseen käytetyt menetelmät olivat olennaisesti samoja, kuin mitä käytettiin CC49:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen eristämiseen, paitsi että LAMBDA-ZAP™-kirjaston muodostamiseen käytetty DNA tuli irrelevantista hybridoomasolulinjasta 35 (eli solulinjasta, joka tuottaa vasta-aineita, jotka eivät 103181 6 8 huomattavasti sitoudu TAG-72:een). Noin 900 000 plakkia sisältävä DNA-kirjasto seulottiin ja siitä eristettiin yksi positiivinen klooni. Positiivinen klooni sai nimen pVHaTAG. pVHaTAG:in koko oli noin 5,2 ke ja DNA-insertin 5 koon määritettiin restriktioentsyymikartoituksella olevan noin 2,2 ke.
pVHaTAG: in DNA- j akso pVHaTAG:in DNA-jakson määritykseen käytettiin seu-raavia oligonukleotidialukkeita: 10 B72,3/CC92 HC-20 meeri: 5'-CCTTGAACTTCTCATTGTAC-3' CC49/CC83 HC 5' (+): 5'-GCACTGCTCATGATATGCAAATC-31 CC49/CC83 HC 5' (-): 5'-GATTTCGATATCATGAGCAGTGC-3' VHoTAG IVS (+): 5'-CTAAAGTGGAGTCAGGGCCTG-3'
VhCCTAG IVS (-) : 5 '-CAGGCCCTGACTCCACTTTAG-3 ' 15 V„aTAG CDR2 (+): 5'-GAATGGATTGGATATATTTCTC-3'.
VHoTAG:in täydellinen nukleotidijakso on esitetty kuviossa 2.
Ihmisen raskaiden muuttumattomien geenien eristäminen 20 Erilaisia raskaan ketjun muuttumattomia alueita sisältävät plasmidikonstruktiot (ργΐ, ργ2, ργ3 ja ργ4) saatiin Dr. lian R. Kirschiltä National Cancer Institutes-ta, Betesha, Maryland.
Näille geeneille suoritettiin restriktioentsyymi-;· 25 kartoitus niiden identtisyyden varmistamiseksi. Ihmisen muuttumattomien alueiden restriktiokartat on esitetty kuviossa 21.
Kimeerinen kevyt ketju
Hiiren CC49 V-alue 30 J5:n ja Ck:n välillä olevaan hiiren intronialueeseen paikallistetun CC49:n kevyen ketjun genomisen DNA:n Hind III -kohta [katso Max, Edward E. et ai., (1981) J. Biol. Chem. 256, 5116] menetettiin kloonausmenettelyssä, jossa Ϊ" puoliksi täytetyt Hind III -kohdat liitettiin ligaasilla 35 puoliksi täytettyihin Spe I -kohtiin LAMBDA-ZAP-vektoris- 11 rw 69 103181 sa. Tämä muunnos kulkeutui plasmidin pRLIOI mukana (kuvio 9). Intronin Hind III -kohta muodostettiin uudelleen myöhemmin esitetyissä vaiheissa pääkohdittain kuvatulla tavalla, jotta Hind III - Bam H I -ihmisen ituradan kappa-5 kevyen ketjun DNA-fragmentti pystyttäisiin liittämään li-gaasilla suoraan hiiren vaihtelevaan alueeseen. Kaikki vaiheet suoritettiin käyttäen standardeja ammattimiehille tuttuja molekyylibiologisia menetelmiä ja ne voidaan löytää käsikirjasta, kuten Maniatis.
10 1,69 ke:n kokoinen Bam H I - Pst I -fragmentti eristettiin pRLIOI:stä aikaisemmin esitetyllä tavalla.
2,96 ke:n kokoinen Bam H I - Pst I -fragmentti eristetään pBluescript SK(-):sta (hankittu Stratageneltä) aikaisemmin esitetyllä tavalla. Tämän jälkeen nämä kaksi fragmenttia 15 liitetään ligaasilla ja seuraavassa esitetty pRL103 eristetään.
/y N. «Hindlll 20 // I PRL103 B J5
I 4.65 kb B
BamHl /
Plasmidia pGDl (kuvattu aikaisemmin) pilkottiin Pst 30 I- ja Hind III -restriktioentsyymeillä, jotta saataisiin tarpeellinen 1,03 ke:n kokoinen intronin sisältävä fragmentti ja pRL103 pilkottiin myös Pst I- ja Hind III -restriktioentsyymeillä liitoskohtaryhmässä (polylinker) olevan pienen DNA-fragmentin poistamiseksi.
70 103181
Tuloksena olleet fragmentit liitettiin ligaasilla, jotta saatiin 5,68 ke:n kokoinen plasmidi, jolle annettiin tunnus pRL104. pGDl:n ja pRL104:n osittainen restriktio-kartta on esitetty seuraavassa.
5 _ 10 / / pG01 tT J5 10,788 bp ] pst, H,ndUl
Ck 20 .Hindlll pRL104 \\
5680 bp I
BamHI J5
— 30 L
U Ihmisen CK-alue
Plasmidi phum CK hankittiin Dr. John Roderilta, Mt.
35 Sinai Research Institute, Toronto, Ontario, Kanada. Plas- siä im i m 71 103181 midi on peräisin pBR322:sta, jossa oli 12 ke:n kokoinen siihen liitetyn ihmisen CK-eksonin sisältävä Bam H I -fragmentti. pBR.322 on kuvattu Stratagenen vuoden 1987 luettelon sivulla 171. 12 ke:n Bam H I -fragmentin restriktio-5 kartta on esitetty seuraavassa [julkaisusta Heiter, P. et. ai· , (1982) J. Biol. Chem. 257 1516].
phumCk 10 Hindlll
BamHI \ n enhancer
I BaniHI
Ck 15
Plasmidi phum Ck pilkottiin Hind III- ja Pst I -re-striktioentsyymeillä, jotta saatiin 5,0 ke:n kokoinen fragmentti, joka sisältää ihmisen Ck-eksonin. pRL104:ää pilkottiin Fsp I- ja Hind III -restriktioentsyymeillä, 20 jotta saatiin 4,2 ke:n fragmentti, joka sisältää CC49:n hiiren kevyen ketjun vaihtelevat eksonit.
Nämä kaksi tuloksena ollutta fragmenttia liitettiin T4-DNA-ligaasilla, jotta saatiin 9,2 ke:n fragmentti yhdessä tuloksena olleen fragmenttiseoksen kanssa. Tätä ; 25 seosta pilkottiin Bam H I:llä, jotta saatiin 7,7 ke:n ko- « koinen Bam H I CC49 L-ketjun kimeerinen konstruktio, jossa on Bam H I -tarttuvat päät ja joka sisältää sekä hiiren vaihtelevan alueen eksonit että ihmisen muuttumattoman alueen (kappa) eksonin. Nämä konstruktiot käyttävät hyväk-30 seen ihmisen tehostajajaksoja sekä hiiren promoottorijaksoja.
Kimeerinen Bam H I -fragmentti, joka sisälsi sekä hiiren kevyen ketjun vaihtelevan alueen eksonit (L ja VJ) että ihmisen muuttumattoman alueen kappa (k) -eksonin, 35 liitettiin ligaasilla Bam H I -kohtaan plasmidiin pSV2neo 72 103181 (5,6 ke) , joka on pBR322:sta johdettu valikoitavan markke-rigeenin neo (hankittu ATCC:ltä) sisältävä plasmidi. Aktiivisen neo-geenin esiintyminen muuttaa solun resistentiksi genetisiinin, neomysiinin kaltaisen myös G418:ksi 5 kutsutun lääkkeen aiheuttamalle kasvun inhibiitiolle.
Kimeerinen Bam H I -fragmentti liitettiin pSV2neo:on kummassakin orientaatiossa, kuten myöhempänä on esitetty. Konstruoitiin kimeerisen kevyen ketjun geenin kummatkin transkriptiossa esiintyvät orientaatiot suhtees-10 sa neo-geeniin. Plasmidi pSV2neo linearisoitiin Bam H I -kohdasta, defosforyloitiin (Maniatisin teoksissa esitettyjen menetelmien mukaan) käyttämällä vasikan suolen alkalista fosfataasia (itseligaation estämiseksi) ja liitettiin ligaasilla aiempana kuvattuun kimeeriseen CC49:n L-15 ketjun Bam H I -fragmenttiin.
rS=*Cl/Ba",HI
II PRL150 1 I 13.5 kb fi
BamHI Ck ^*1 Hindlll VJ5
Pstl 73 103181
amp jEeoRI BamHI
neo [f PRL105 I
W 13.5 Kb ft U—Hindlll 10 BamHICk JJgo-geenin ja CC49:n kimeerisen kevyen ketjun transkriptiossa esiintyvät orientaatiot on osoitettu nuolilla 15 pRL120:ssa ja pRL105:ssä. pSV2neo:sta johdetut osat on osoitettu. Nämä plasmidit puhdistettiin suuressa mittakaavassa kutakin plasmidia monistavan E. coli -kloonin pre-paratiivisesta fermentaatiosta (1,0 1). Puhdistettuja plasmideja käytettiin viemään kimeerinen CC49:n kevyt ket-20 ju SP2/0 plasmasytoomasoluihin, kuten myöhempänä on esitetty.
Hiiren CC83:n VL-alue ja ihmisen CK-alue CC83:n kevyen ketjun kloonaamisen yhteydessä menetetty pRL200:ssa oleva Hind III -kohta muodostettiin uu-: 25 delleen samasta syystä kuin CC49:n kevyen ketjun kimeeri- sessä konstruktiossa. Uudelleen muodostaminen suoritettiin seuraavalla tavalla. Plasmidi pRL200 linearisoitiin uniikista Nhe I -kohdasta ja sen kummatkin tarttuvat päät muutettiin tasalla oleviksi täyttämällä dNTP:illä ja DNA-30 polymeraasi I:llä. Fosforyloitu Bam H I -kytkijä (hankittu New England Biolabs -yhtiöltä) liitettiin ligaasilla täytettyyn kohtaan. Uudelle plamidille annettiin tunnus pRL201 ja se on esitetty seuraavassa.
74 103181 *«* - ^ ^'/Hindlll
I pRL201 I
7.45 kb
Hindlll \ Spel --'K Jh Nhel/BamHI
Pstl / L
J5 J4 V
15 pRL201:stä saatu 2,5 ke:n Bam HI- Pst I -frag mentti, joka sisälsi CC83:n kevyen ketjun vaihtelevan alueen genomin DNA:n, liitettiin kätevästi ligaasilla pRL104:stä saatuun aikaisemmin CC49:n kevyen ketjun konstruktion yhteydessä kuvattuun 4 ke:n Bam H I - Pst I vek- 20 torifragmenttiin, joka jo sisälsi Hind III:n sisältävän intronifragmentin. Uudelle plasmidille annettiin tunnus pRL202 ja se on esitetty seuraavassa.
-^/Fspl ; 25 sy" y Hindlll ' pRL 202 6.5 kb ;]
BamHI / 35 L V " 75 103181 pRL202:sta saatu noin 5,05 ke:n Fsp I - Hind III -fragmentti eristettiin ja liitettiin ligaasilla ihmisen Ck:n sisältävään Hind III - Bam H I -fragmenttiin, joka on jo kuvattu CC49:n kevyen ketjun kimeerisen konstruktion 5 yhteydessä. CC83:n kevyen ketjun vektorin muodostaminen suoritettiin tästä eteenpäin täysin samoin kuin CC49:n kevyen ketjun muodostaminen. Tuloksena ollut 8,5 ke:n CC83:n kevyen ketjun kimeerinen Bam H I -konstruktio liitettiin myös ligaasilla pSV2neo-Bam H I:een (fosfataasi- 10 käsitelty) ja saatiin kummankin mahdollisen insertin orientaation omaavia plasmideja, kuten seuraavassa esitetystä diagrammista käy ilmi.
alDB i EcoRI Jy _ I .BamHl neo ! PRL203 1
U.3 ίφ I
BamHl Jy
V J4 JS
25 lEcoRI BamHl 30 li \js
neo f »"»O I
; W 14.3 kb η
BamHl 35 Ck 103181
Neo-qeenin ja CC83:n kiraeerisen kevyen ketjun transkriptiossa esiintyvät orientaatiot on osoitettu nuolella pRL203:Ssa ja pRL230:ssa. Nämä plasmidit puhdistettiin suuressa mittakaavassa kutakin plasmidia monistavan EL.
5 coli -kloonin preparatiivisesta fermentaatiosta (1,0 1) kaupallisesti saatavilla olevassa inkubaattorissa. Puhdistettuja plasmideja käytettiin viemään kimeerinen CC83:n kevyt ketju Sp2/0 plasmasytoomasoluihin, kuten myöhempänä on esitetty.
10 Kaikki neljä kimeeristä kevyen ketjun plasmidikon- struktiota voidaan linearisoida pilkkomalla restriktioent-syymillä Aat II. Plasmideissa oleva Aat II -kohta on alueella, joka ei ole välttämätön kimeerisen kevyen ketjun geenin tai valikoitavan markkerigeenin neo:n ilmentymisel-15 le.
Kimeeriset raskaat ketjut
Ihmisen gamma-muuttumattomien geenien eksonit
Kimeerisiä raskaan ketjun konstruktioita kantamaan ! käytetty plasmidivektori on nimetty pSV2gpt:ksi ja se on 20 esitetty julkaisussa Mulligan ja Berg, (1984) "Selection of animal cells that express the E. Coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase", Proc. Natl.
J Acad. Sci. (USA) 78 (4), 2072-2076. pSV2gpt on pBR322:Sta i .
johdettu plasmidi, joka sisältää valinnaisen markkerigee-H * 25 nin, guaniinifosforibosyylitransferaasin (gpt), jota voi daan käyttää valikoivaan kasvuun mykofenolihappoa sisältä-vässä liuoksessa. pSVgpt:n valmistamiseksi ihmisen C7I-, C72-, C73-, C74-eksonien vastaanottajaksi se pilkottiin
Eco R I:llä ja Bam H I:llä. Pilkottu DNA fraktioitiin j s 30 4-%:isella polyakrylamidigeelillä ja 4,5 ke:n vektorifrag- j ‘ mentti saatiin geelistä sähkövirralla eluoimalla, kuten il · ·
Maniatisin teoksessa on kuvattu. Tämä linearisoitu plas-. . midi nimettiin pSV2gpt/R/B:ksi ja plasmidikartta on esi- L tetty kuviossa 22. Se kykenee ottamaan vastaan Eco R I - 35 Bam H I -päätteisiä fragmentteja.
77 103181 5'-pään Hind III -kohdat, jotka esiintyvät ihmisen IgG,-muuttumattoman alueen fragmenteissa, muunnettiin Eco R I -kohdiksi pSV2gpt:n Eco R I -kohtaan suunnattua kloonausta varten, ylin, 72:n, 73:n ja 74 :n tapauksissa käy-5 tettiin vektorin pBR322 Eco R I -kohtaa.
C7I
Ihmisen C7l-eksonit sisältävä fragmentti saatiin aikaan pilkkomalla ja linearisoimalla p 1-plasmidi Hind III :11a ja sen jälkeen täyttämällä Hind III:n tarttuvat 10 päät käyttämällä kaikkia neljää dNTP:tä ja DNA-polymeraa-sin Klenow-fragmenttia Hind III -päiden tasaamiseksi. Eco R I -kytkijä liitettiin ligaasilla tasaisiin päihin Hind III -kohdan korvaamiseksi Eco R I -kohdalla. Tämän jälkeen tämä konstruktio pilkottiin Eco R I:llä ja Bam H I:llä, 15 jotta saatiin vapautetuksi C7l-eksonit sisältävä 7,8 ke:n fragmentti. Tämä fragmentti nimettiin C7l-7,8 ke.-ksi.
Kukin fragmenteista liitettiin sitten ligaasilla pSV2-gpt/R/B:n Eco Rl- Bam H I -kohtiin. Tämä vektorin (pSV2-gpt-7l-7,2) rakenne mahdollistaa minkä tahansa hii-20 ren raskaan ketjun vaihtelevan alueen geenin (joissa on Eco R I -päät) liittämisen ihmisen raskaan IgG-ketjun vektoreiden Eco R I -kohtaan. Tarkemmin sanottuna 125 ng ihmisen C7l-7,8 ke -fragmenttia liitettiin ligaasilla 100 ng*.aan linearisoitua pSV2gpt/R/B -vektoria liuoksessa, : 25 jonka tilavuus oli 10 μΐ, käyttäen 400 yksikköä T4-DNA- ligaasia (hankittu New England Biolabs -yhtiöstä). Pakastetut Invitrogen-yhtiöstä (San Diego, CA) hankitut kompetentit E. coli DH1 -solut transformoitiin ligaasireaktiol-la Invitrogenin käyttöohjeiden mukaisesti. Tuloksena ollut 30 plasmidi nimettiin pSV2gpt7l-7,8:ksi. pSV2gpt7l-7,8 :n plasmidikartta on esitetty kuviossa 23.
Lisäksi muodostettiin toinen lyhyempi fragmentti, joka sisälsi C7l-eksonit. Huoli kimeerisen 7,8 ke-.n C7I -fragmentin, 4,5 ke:n pSV2-gpt/R/B-vektorin ja 1,9 ke:n 35 CC49:n vaihtelevan alueen sisältävän raskaan ketjun vekto- ™ 103181 rin (yhteensä 14,2 ke) koosta joudutti tarvetta pienentää 7.8 ke:n C7I Eco Rl- Bam H I -fragmentin suurta kokoa.
7.8 ke:n C7l:n koodaava alue käsittää ainoastaan ensimmäisen kolmanneksen 5'-pään fragmentista.
5 Koon pienentäminen suoritettiin muuttamalla jälkim mäinen Pvu II -kohta Bam H I -kohdaksi Bam H I -kytkijän tasaisen pään lisäyksellä. ργ-Ι-.η Hind III -kohta muutettiin Eco R I -kohdaksi pilkkomalla p7l:tä Hind III :11a, täyttämällä 3'-pää tasaisen pään aikaansaamiseksi ja li-10 säämällä Eco R I -kytkijöitä, kuten aiemminkin. 2,3 ke:tä jäljempänä oleva Pvu II -kohta muutettiin Bam H I -kohdaksi pilkkomalla seuraavaksi Pvu II:11a ja liittämällä Bam H I -kytkijät suoraan tasaisiin Pvu II -päihin. Tämän jälkeen tätä konstruktiota pilkottiin Eco R I:llä ja Bam H 15 I:llä, jotta saatiin vapautetuksi 2,3 ke:n fragmentti, joka sisälsi C7l-eksonit. Lyhennetty Eco Rl- Bam H I -fragmentti (2,3 ke) sisältää yhä 71-eksonit ja 3'-pään polyadenylaatiojakson. Tämä pienentää vektorin lopullista kokoa 5,5 ke:llä, mikä tekee tuloksena olevan konstruktion 20 paremmin hallittavaksi (yhteensä 8,7 ke).
Noin 200 ng ihmisen C7l-2,3 ke -fragmenttia liitettiin ligaasilla 100 ng:aan linearisoitua pSV2gpt/R/B-vek-toria käyttäen 400 yksikköä T4-DNA-ligaasia (New England Biolabs) liuoksessa, jonka tilavuus oli 10 μΐ. Pakastetut ] · 25 kompetentit Invitrogen-yhtiöstä hankitut E. coli -solut transformoitiin ligaasireaktiolla Invitrogenin käyttöoh- jeiden mukaisesti. Tuloksena ollut plasmidi nimettiin pSV2gpt7l-2,3:ksi. pSV2gpt7l-2,3:n plasmidikartta on esitetty kuviossa 24.
30 Muut kolme ihmisen IgG:n muuttumattoman jakson ek- ; ' sonia sisältävät DNA-fragmentit eristettiin myös. C72-ek- « · j sonit saatiin plasmidista P72 4,0 ke:n Eco Rl- Bam H I - fragmenttina. C73-eksonit saatiin plasmidista P73 8,0 ke:n u Eco Rl- Bam H I -fragmenttina. C74-eksonit saatiin plas- 35 midista p74 7,6 ke:n Eco Rl- Bam H I -fragmenttina.
73 79 1 03 1 81
Fragmentit liitettiin erikseen ligaasilla pSVgpt/ R/B:hen, kuten Ογ1-7,7:η ja Ογ1-2,3:η kohdalla on kuvattu. Tuloksena olleiden plasmidien plasmidikartat on esitetty siten, että kuviossa 25 on esitetty pSV2gpt~72, kuviossa 26 5 pSV2gpt~73 ja kuviossa 27 pSV2gpt-74.
Raskaan ketjun kimeeriset konstruktiot Täydelliset raskaan ketjun vaihtelevan alueen ihmisen 71 muuttumattoman alueen kimeeriset konstruktiot muodostettiin liittämällä hiiren raskaan ketjun vaihtelevan 10 alueen eksonit sisältävä fragmentti ihmisen 7l:n muuttumattoman alueen eksonit sisältäviin plasmideihin seuraa-vaksi kuvatulla tavalla.
Tämän jälkeen CC49- ja CC83-hybridoomasoluista peräisin olevat hiiren raskaan ketjun vaihtelevan alueen 15 geenit liitettiin ligaasilla kuhunkin 71 - 74 m sisältävään pSV2-gpt -vektoriin (pSV2gpt-7l, pSV2gpt~72, pSV2gpt-73, pSV2gpt-74) seuraavalla tavalla.
CC49
Raskaan ketjun vaihtelevan alueen CC49:n raskaan 20 ketjun vaihtelevaa aluetta koodaavat eksonit sisältävä fragmentti valmistettiin pilkkomalla 14 /ig pHH49:ää käyttäen 50 yksikköä Eco R I:tä (hankittu BRLrstä) 37 °C:n lämpötilassa 2 tunnin ajan. Pilkkomistuote fraktioitiin
4-%:isella polyakrylamidigeelillä ja 1,9 ke:n CC49:n ras-: 25 kaan ketjun vaihtelevan alueen eksonit sisältävä Eco I
-fragmentti saatiin sähkövirralla eluoimalla, kuten Ma-niatisin teoksessa on kuvattu. Tämä fragmentti nimettiin f49R:ksi.
71:tä koodaavan 7,8 ke:n jakson sisältävä fragment-30 ti valmistettin seuraavalla tavalla.
Noin 50 μg vektoria pSV2gpt 7l-7.8:aa pilkottiin Eco R I:llä. Tuloksena ollut fragmentti defosforyloitiin (itseligaasin estämiseksi) käyttämällä vasikan suolen alkalista fosfataasia Maniatisin teoksessa kuvatulla taval-35 la. Fragmentti puhdistettiin 0,8-%:iselta agaroosigeelil- 103181 80 ta sähkövirralla. Tämä vektori nimettiin pSV2gpt-7l-7.8/ Riksi.
Eco R I -kohta sijaitsee 245 ep. aiempana transkription aloituskohdista ja se sisältää promoottorin ja 5 tehokkaaseen ilmentymiseen tarvittavat kudosspesifiset jaksot. Vaihtelevan alueen geenien 3'-puolella olevat int-ronit sisältävät hiiren raskaan ketjun tehostajajaksot, joita ei esiinny ihmisen IgG.-n raskaan ketjun vektoreissa. Tästä seurauksena on, että raskaan ketjun kimeeriset vek-10 torit käyttävät sekä hiiren promoottori- että tehostaja-jaksoja.
% Noin 325 ng linearisoitua pSV2gpt l-7.8/R:ää lii tettiin ligaasilla 188 ngiaan f49R:ää liuoksessa, jonka tilavuus oli 10 μΐ ja joka sisälsi 1 yksikön T4-DNA-ligaa-15 siä (BRL). Pakastetut Stratageneltä hankitut kompetentit , E. coli-AG-1 -solut transformoitiin ligaasireaktiolla val mistajan ohjeiden mukaisesti. Tuloksena ollut plasmidi Γ nimettiin ρ49γ1-7.8:ksi. Kuviossa 28 on esitetty ρ49γ1- 7.8:n plasmidikartta.
20 Noin 50 μg vektoria pSV2gpt7l-2.3:a pilkottiin Eco R Iillä, kuten SV2gpt7l-7.8inkin tapauksessa. Tuloksena ollut fragmentti defosforyloitiin käyttämällä vasikan suolen alkalista fosfataasia Maniatisin teoksessa kuvatulla tavalla. Fragmentti puhdistettiin 0,8-%:isesta agaroosi-: 25 geelistä eluoimalla sähkövirralla. Tämä linearisoitu plasmidi nimettiin pSV2gpt l-2.3/R:ksi.
Noin 300 ng linearisoitua pSV2gpt7l-2.3/R:ää liitettiin ligaasilla 188 ngiaan f49R:ää liuoksessa, jonka tilavuus oli 10 μΐ ja joka sisälsi 1 yksikön T4-DNA-ligaa-30 siä (BRL). Pakastetut Stratageneltä (La Jolla, CA) hankitut kompetentit E. coli-AG-1 -solut transformoitiin ligaasireaktiolla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tuloksena ollut plasmidi nimettiin ρ49γ1-2.3:ksi. Kuviossa 29 on esitetty p497l-2.3:n plasmidikartta.
103181 81
Plasmidit pSV2gpt-72, pSV2gpt-y3 ja pSV2gpt-74 pilkottiin erikseen Eco R I:llä, jotta saatiin vastaavassa järjestyksessä ilmoitettuna lineaariset plasmidivektorit pSV2gpt-72/R, pSV2gpt~73/R ja pSV2gpt-y4/R. Kukin näistä ' 5 kolmesta lineaarisesta plasmidivektorista liitettiin erik seen ligaasilla käyttäen f49R:ää. Tuloksena olleiden plas-midien plasmidikartat on esitetty siten, että kuviossa 30 on esitetty ρ49-γ2, kuviossa 31 ρ49-γ3 ja kuviossa 32 p49-γ3.
10 CC83 CC83:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen sisältävät kimeeriset konstruktiot muodostettiin samalla tavoin kuin CC49:n kimeeriset konstruktiot. Raskaan ketjun vaihtelevan alueen CC83:n raskaan ketjun aluetta koodaavat eksonit si-15 sältävä fragmentti valmistettin pilkkomalla 19 jig pHS83:ää käyttäen 50 yksikköä Eco R I:tä (hankittu BRLrstä) 37 °C:n lämpötilassa 2 tunnin ajan. Pilkkomistuote fraktioitiin 4-%:isella polyakrylamidigeelillä ja 2,9 ke:n CC83:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen eksonit sisältävä Eco I -frag-20 mentti saatiin sähkövirralla eluoimalla, kuten Maniatisin teoksessa on kuvattu. Tämä fragmentti nimettiin f83R:ksi.
Noin 300 ng linearisoitua plasmidia pSV2gpt7l-7.8/ R, joka oli saatu aikaisemmin kuvatulla tavalla, liitettiin ligaasilla 270 ng:aan f83R:ää liuoksessa, jonka tila-: 25 vuus oli 10 μΐ ja joka sisälsi 1 yksikön T4-DNA-ligaasia (BRL). Pakastetut Stratageneltä hankitut kompetentit E. coli-AG-l -solut transformoitiin ligaasireaktiolla Strata-genen ohjeiden mukaisesti. Tuloksena ollut plasmidi nimettiin p837l-7.8:ksi. Kuviossa 33 on esitetty p837l-7.8:n 30 plasmidikartta.
Noin 90 ng linearisoitua plasmidia pSV2gpt7l-2.3/R, joka saatiin aikaisemmin kuvatulla tavalla, liitettiin ligaasilla 270 ng:aan f83R:ää liuoksessa, jonka tilavuus oli 10 μΐ ja joka sisälsi 1 yksikön T4-DNA-ligaasia (BRL) .
35 Pakastetut Stratageneltä hankitut kompetentit E. coli-AG-l 82 103181 -solut transformoitiin ligaasireaktiolla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tuloksena ollut plasmidi nimettiin ρ83γ1-2.3:ksi. Kuviossa 34 on esitetty ρ83γ1-2.3:n plasmi-dikartta.
5 Plasmidit pSV2gpt-72, pSV2gpt-y3 ja pSV2gpt-74 pil kottiin erikseen, kuten aiempana vastaavassa järjestyksessä pSV2gpt-72/R.-n, pSV2gpt~73/R:n ja pSV2gpt-74/R:n kanssa, Eco R I:llä, jotta saatiin vastaavassa järjestyksessä lineaariset plasmidivektorit pSV2gpt-72/R, pSV2gpt-73/R ja 10 pSV2gpt-74/R. Kukin näistä kolmesta lineaarisesta plasmi-divektorista liitettiin erikseen ligaasilla f83R:ään. Tuloksena olleiden plasmidien plasmidikartat on esitetty kuviossa 30 p49~72, kuviossa 31 p49~73 ja kuviossa 32 p49-73- 15 Tämän jälkeen kaikki kymmenen rengasrakenteista plasmidikonstruktiota (p497l-7.8, p497l-2.3, p837l-7.8, p837l-2,3, p49-72, p83-72, p49~73, p83-73, p49~74 ja p83-74) linearisoitiin transformaatiota varten pilkkomalla restriktioentsyymillä Nde I. Plasmideissa oleva Nde I 20 -kohta on alueella, joka ei ole olennainen kimeerisen im- munoglobuliinigeenin tai valikoitavan markkerigeenin, - gpt.-n ilmentymiselle. Ennen transformaatiota vastaanotta- j jasoluun plasmidien täytyy olla lineaarisessa muodossa, jotta DNA:n valikoiva integroituminen isäntäsolun genomin : 25 DNA:han vahvistuisi.
Konstruktion varmentaminen
Koska Eco R I -fragmentit voidaan liittää ligaasilla kummassakin orientaatiossa, määritettiin Eco R I -fragmenttien oikea orientaatio pilkkomalla Neo I:llä. Aiemmin 30 esitetyissä konstruktioissa vahvistettiin plasmidikon- struktioiden oikea liittymistäpä suorittamalla plasmidille restriktioentsyymipaikkojen kartoitus. Restriktioentsyy-meillä pilkkomisesta ja geelielektroforeesista saatua re-striktioentsyymikarttaa verrataan teoreettisesti yksittäi-L 35 sistä lähtöfragmenteista muodostettuun karttaan. Kevyen : Ϊ31
TO
mi 103181 83 ketjun vektoreissa käytetystä transkriptionaalisesta orientaatiosta saatujen kokemusten perusteella raskaan ketjun vektorit konstruoitiin ainoastaan transkriptionaa-liseen orientaatioon, joka on vastakkainen gpt-geenin 5 suhteen.
Plasmidien transformaatio hiiren plasmaeytoomaeo- luihin
Kun sekä kevyen että raskaan ketjun kimeeriset geenit transformoidaan samaan soluun, saadaan aikaan tetra-10 meerisiä (¾¾) immunoglobuliineja. Näiden "kimeeristen" vasta-aineproteiinien synteesi ja erittyminen saatiin aikaan viemällä kimeeriset (hiiren V-alue:ihmisen C-alue) geenit hiiren plasmasytoomasoluihin (Sp2/). Transformaatio suoritettiin elektroporaatiolla [Sahaga, B.G. et ai..
15 (1986) J. Immunology 137, 1066] .
Transformoiduissa hiiren plasmasytoomasoluissa (Sp2/0) olevien kimeeristen (hiiren V-alue:ihmisen C-alue) geenien ilmentyminen suoritetaan käyttämällä kahta erilaista menetelmää. Toisessa muodossa soluun voidaan viedä 20 samanaikaisesti kevyen ketjun geenejä ja raskaan ketjun geenejä erilaisissa keskinäisissä suhteissa. Tästä käytetään nimitystä rinnakkaistransformaatio. Vaihtoehtoisesti voidaan tehdä kimeerisen kevyen ketjun geeniä kantavia vakaita klooneja, joita sitten voidaan käyttää toisessa : 25 muodossa, josta käytetään nimitystä kohdetransformaatio.
Kummassakin menetelmässä päämääränä on saada aikaan klooneja, jotka sisältävät sekä H- että L-ketjun geenejä, jotka tuottavat aiemmin mainittua intaktia H2L2-immunoglobu-liinia.
30 A. Rinnakkaistransformaatiot i ,, Rinnakkaistransformaatioon sisältyy kummatkin lää- keaineresistenssin markkerit sisältävien solujen samanaikainen transformaatio ja sitä seuraava valikointi yhdellä tai kummallakin lääkeaineella. Raskaan ketjun ja kevyen 35 ketjun vektoreiden (suhteissa 1:1 ja 1:10, tässä järjes- 84 103181 tyksessä ilmoitettuna) rinnakkaistransformaatio suoritettiin alunperin käyttäen ainoastaan neo-valikointia. Saatiin aikaan neo-resistentteja solulinjoja, jotka ilmensivät ensimmäisiä osoitettavissa olevan TAG-72-sitomisakti-5 viteetin omaavia kimeerisiä IgGl-vasta-aineita. Rinnakkaistransformaatio suoritettiin seuraten tarkasti teoksessa Cornelia Gorman, (1985) "High Efficiency Gene Transfer into Mammalian Cells", DNA Cloning, osa II, D.M. Glover, toim., IRL Press, Oxford, England, esitettyjä ohjeita.
10 B. Rohdetransformaatiot
Kevyitä ja raskaita kimeerisiä immunoglobuliinigee-, nejä sisältävät konstruktiot transformoitiin peräkkäin hiiren plasmasytoomasoluihin Sp2/0. Kohdetransformaatioon sisältyy transformaatio ja valikointi ensimmäisen lääkeai-15 neresistenssigeenin (ts. genetisiiniresistenssin kimeeri-sen kevyen ketjun geenin vektorin kyseessä ollessa) sisältävällä vektorilla, joita seuraa transformaatio ja valikointi toisen lääkeaineresistenssigeenin (ts. mykofenoli-happoresistenssin kimeerisen raskaan ketjun geenin vekto- I ! 20 rin kyseessä ollessa) sisältävällä vektorilla. Neo-valikointi
Ennen kimeerisiä kevyen ketjun konstruktioita sisältävillä pSV2-neo-vektoreilla suoritettua transformaatiota vahvistettiin lääkeaineella suoritettavan valikoin-T- .· 25 nin olosuhteet transformoimattoimien Sp2/0 plasmasytooma- solujen kasvun ehkäisyyn titraamalla neomysiinin kaltai- i sella lääkkeellä, genetisiinillä (GIBCO). Julkaisuissa esiintyvät arvot lääkeaineilla suoritettavassa valikoinnissa käytettävistä genetisiinipitoisuuksista vaihtelevat 30 välillä 100 - 1 000 /ig/ml. 400 /ig/ml:aa suurempien pitoi-:] suuksien havaittiin estävän Sp2/0-solujen kasvua tämän keksinnön yhteydessä käytetyssä kudosviljelmäympäristössä. Kevyen ketjun sisältävien solujen konstruktio Hiiren Sp2/0 plasmasytoomasolut transformoitiin 35 aluksi kevyen ketjun sisältävillä pSV2-neo-vektoreilla 103181 85 seuraavasti. Soluja kasvatettiin RPMI 1640 -liuoksessa, joka sisälsi 5 prosenttia naudan sikiön seerumia. Solut pestiin PBS:ssä ja suspendoitiin pitoisuuteen 1 X 107 elinkykyistä solua/ml PBS. 0,8 ml soluja siirrettiin elektro-5 poraatiokyvettiin (jäissä) , joka sisälsi 20 /xg kevyen ketjun sisältävää Aat II -restriktioendonukleaasilla lineari-soitua pSV2-neo-vektoria (pRL105 ja pRL150 CC49:n kimee-ristä L-ketjua varten ja pRL203 ja pRL230 CC83:n kimeeris-tä L-ketjua varten). Aat II inaktivoitiin lämmittämällä 10 näytteet 65 °C:n lämpötilaan 10 minuutin ajaksi. Lineari-soitu DNA saostettiin etanolilla ja liuotettiin välittömästi sen jälkeen 10 - 20 mikrolitraan PBS:ää. Jäähauteel-la 15 minuutin ajan kestäneen seisotuksen jälkeen suoritettiin elektroporaatio käyttäen Gene Pulser -elektropo-15 raatiolaitetta, johon oli lisätty kapasitanssin laajennin (BioRad), 0,2 kV:n ja 960 μΡ:η voimakkuudella. Aikavakio (t) oli yleensä noin 26 ms.
Transformaation jälkeen solujen annettiin palautua jäähauteella 15 minuutin ajan, jotta perturboituneet kal-20 vot voisivat relaksoitua. Jälkeenpäin solut suspendoitiin 24 mlraan RPMI 1640 -liuosta, joka sisälsi 5 % naudan sikiön seerumia (RPMI+) ja siirrettiin 96- tai 24-kuoppai-selle levylle. Sen mahdollisuuden pienentämiseksi, että kuoppaa kohti tulisi useampi kuin yksi lääkeaineelle re-; 25 sistentti solu, soluja laimennettiin myös 10-kertaisesti liuoksessa (RPMI+) ja maljattiin toiselle 96-kuoppaiselle maljalle. Solususpensiota inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa ja 5-%:isessa C02-atmosfäärissä.
48 tunnin kuluttua (jotta resistenssi lääkeaineelle 30 ehtisi ilmentyä) liuos poistettiin ja korvattiin 1 mg/ml genetisiiniä sisältävällä liuoksella.
7-10 päivän kuluttua genetisiinile resistentit kloonit jatkoviljeltiin ja solut seulottiin kimeeristen kevyiden ketjujen suhteen värjäämällä ne.
86 103181
Soluvärjäys
Eriä soluja sisältävästä liuoksesta sentrifugoitiin solumatoiksi aluslaseille käyttäen Cytospin-2-sentrifuugia (Shandon, Inc.). Ilmakuivauksen jälkeen solut kiinnitet-5 tiin etikkahappo/etanoliliuoksessa (5 osaa etikkahappoa/95 osaa etanolia). Kun solut oli huuhdeltu 3 kertaa PBS:llä (ilman Ca2+- ja Mg2+-ioneja) aluslasit asetettiin kosteaan kammioon (suhteellinen kosteus 100 %) ja ne värjättiin 20 minuutin ajan 20 μΐ-.lla FITC-konjugoidulla vuohen vasta-10 aineella ihmisen kappaa vastaan, joka on ihmisen kevyitä kappa-ketjuja vastaan spesifinen, fluoresoivaan väriaineeseen konjugoitu vasta-aine. Konjugoitua vasta-ainetta laimennettiin suhteessa 1:3 PBS-liuoksella, jossa oli 1 % BSA:ta. Sen jälkeen kun alusiaseja oli pesty yön yli, ne 15 petattiin käyttäen fluoromount-G:tä, histologista petaus-liuosta (hankittu Southern Biotech -yhtiöstä), peitinlasin alle. Levyjä tarkasteltiin Olympuksen BH-2-mallisella mikroskoopilla, joka oli varustettu päältävalaisu-UV-lisä-laitteella.
20 Fluoresenssin intensiteettiin perustuen niiden konstruktioiden, joissa kevyen ketjun orientaatio oli vektorissa olevan neor-geenin transkription suunnan suhteen vastakkaisessa transkriptionaalisessa orientaatiossa, havaittiin antavan voimakkaimman L-ketjun ilmentymisen. Tä-·' 25 män vuoksi pRL105 oli edullinen CC49:n L-ketjun ja pRL230 oli edullinen CC83:n L-ketjun konstruktio. Näiden kokeiden tuloksena seuraavia kimeerisen kevyen ketjun sisältäviä solulinjoja (Sp2/0:sta peräisin olevia) käytettiin kohde-transformaatioissa : 30 CC49:n kimeerisen L-ketjun tapauksessa saatiin yksi solulinja (49K-13-13), joka ilmensi CC49:stä saatua kimee-ristä kevyttä ketjua. Tätä solulinjaa käytettiin kaikkiin tätä seuraaviin kohdetransformaatioihin kimeerisillä raskaan ketjun vektoreilla niitä konstruktioita varten, jois-35 sa käytettiin kimeeristä CC49:n kevyttä ketjua.
103181 87 CC83:n kiraeerisen L-ketjun tapauksessa saatiin kolme solulinjaa (83K-26-5, 83K-34-10 ja 83K-42-2), jotka ilmensivät CC83:sta saatua kimeeristä raskasta ketjua. Yksi solulinja värjäytyi muita voimakkaammin ja siinä 5 esiintyi paikallisia sytoplasman immunofluoresenssia osoittavia alueita. Kaikkia kolmea solulinjaa verrattiin keskenään niiden suhteellisen kimeerisen vasta-aineen tuottamiskyvyn suuruuden suhteen kimeerisellä CC83 gl:n raskaan ketjun vektorilla suoritetun transformaation seulo rauksena. 83K-34-10-kohteen elektroporaatiosta saatiin enemmän kimeerisiä vasta-aineita ilmentäviä klooneja kuin kummastakaan kahdesta muusta kimeerisen kevyen ketjun koh-desolulinjasta. Tämän vuoksi 83K-34-10-kevyen ketjun solulinjaa käytettiin kohteena tätä seuraaviin elektroporaa-15 tioihin, joissa käytettiin kimeerisiä raskaan ketjun vektoreita niissä konstruktioissa, jotka sisälsivät CC83:n kevyen ketjun vaihtelevan alueen.
CC49:n ja CC83:n kimeerisiä H-ketjun konstruktioita kantavien gpt-resistenttejen kloonien muodostaminen 20 Ennen kimeerisiä raskaan ketjun konstruktioita si sältävillä pSV2-gpt-vektoreilla suoritettua transformaatiota vahvistettiin lääkeaineella suoritettavan valikoinnin olosuhteet transformoimattomien Sp2/0-plasmasytooma-solujen [hankittu American Type Culture Collectionista ; 25 (ATCC)] kasvun ehkäisemiseksi. Olosuhteet pSV2-gpt-vekto reilla transformoitujen solujen lääkeaineilla suoritettavalle valinnalle olivat paljon vaikeammin vahvistettavissa. E. colin gpt-geeni. joka koodaa guanosiinifosforibo-syylitransferaasientsyymiä, antaa kyvyn käyttää hyväksi 30 ksantiinia ja hypoksantiinia guaniinin biosynteesin subs-’· traatteina silloin, kun nisäkkäiden guaniinin aineenvaih- duntapolku on estynyt mykofenolihapon (MPA) vaikutuksesta.
Julkaistujen MPA:n pitoisuusarvojen, jotka sallivat muiden pSV2-gpt-vektoreilla transformoitujen imusolulinjo-35 jen kasvun, havaittiin olevan melkein kaksi kertaa liian 88 1 03 1 81 korkeita pSV2-gpt:llä transformoitujen Sp2/0-solujen kasvun sallimiseksi tässä keksinnössä käytetyssä kudosvilje-ly-ympäristössä. Tämän jälkeen MPA:n optimaalisen pitoisuuden gpt-resistenssin suhteen tapahtuvaan valikointiin 5 havaittiin olevan 0,1 μg/ml. Lisäksi aminopteriinin ja tymidiinin käytön (guaniinitien sulkemiseksi vielä tehokkaammin) havaittiin olevan tarpeetonta.
Kimeeristä 44-vasta-ainetta tuottavien kloonien
muodostaminen 10 CH44-I
49K-13-13-soluja käytettiin kohteena kimeerisille raskaan ketjun konstruktioille. Solut transformoitiin käyttäen 20 μg Nde I:llä pilkottua linearisoitua kimeeristä raskaan ketjun DNA-vektoria (ρ49γ1-7.8 tai ρ49γ1-2.3). 15 Transformaatio elektroporaatiolla suoritettiin kuten aiemmin kimeerisille kevyille ketjuille.
48 tunnin kuluttua suoritettu valikointi suoritettiin kuitenkin korvaamalla genetisiiniä sisältävä liuos liuoksella, joka sisälsi genetisiiniä ja mykofenoli-20 happoa 0,3 ^g/ml, ksantiinia 250 /xg/ml ja hypoksantiinia 10 μg/ml.
Transformoidut solut kasvoivat paljain silmin näkyviksi pesäkkeet 14 päivässä. Tässä vaiheessa 50 μΐ super-natanttia poistettiin ja määritettiin ELISA-menetelmillä ·' 25 TAG:hen suunnatun sitoutumisen ja ihmisen IgG:n muuttumat toman alueen ilmentymisen suhteen. Positiivista TAG-sitou-tumista osoittavia soluja sisältävät kuopat jatkoviljel-tiin 24-kuoppaisiin levyihin, joissa oli uutta lääkeaine-valikointiliuosta ja niiden annettiin kasvaa 3-7 päivän 30 ajan.
Jatkokloonaus suoritettiin seuraavalla tavalla. Elinkykyisten solujen määrä laskettiin ja solut maljättiin uudelleen 96-kuoppaisille levyille. Yhdelle levylle tuli 50 elinkykyistä solua ja toiselle 250 elinkykyistä solua. 35 Uudelleenjatkokloonauksen varalta jatkokloonaamattomia β9 103181 soluja jatkoviljeltiin 6-kuoppaisille maljoille, kunnes solujen tiheys oli tarpeeksi suuri nestetypessä tapahtuvaa varastointia varten.
Jatkokloonauksen jälkeen eniten kimeeristä vasta-5 ainetta tuottavat kloonit valikoitiin bioreaktoreissa suoritettavaa kimeerisen vasta-aineen tuotantoa varten.
CC44-2
Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC44-l:n konstruktiossa 10 toistettiin sillä poikkeuksella, että kimeerisenä raskaan ketjun vektorina käytettiin 20 μg p49~72:ta.
CC44-3
Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC44-l:n konstruktiossa 15 toistettiin sillä poikkeuksella, että kimeerisenä raskaan ketjun vektorina käytettiin 20 μg p49~73:a.
CC44-4
Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC44-l:n konstruktiossa 20 toistettiin sillä poikkeuksella, että kimeerisenä raskaan ketjun vektorina käytettiin 20 /zg p49~74:ää.
Kimeeristä 88-vasta-ainetta tuottavien kloonien muodo s t aminen CH88-1 " 25 Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor- » moinnissa käytetyt menetelmät CC44-l:n konstruktiossa toistettiin seuraavin poikkeuksin.
Kimeeristä CC83:n kevyttä ketjua tuottavat 83K-25- 5-, 83K-34-10- ja 83K-42-2-solut transformoitiin, kuten 30 CH44-l:n transformoinnin yhteydessä on kuvattu, sillä ' poikkeuksella, että raskaan ketjun vektorina käytettiin 20 μg p837l-7.8:aa tai p837l-2.3:a, kimeerisen CC83:n raskaan ketjun geenin sisältävää pSV2gpt-vektoria.
90 103181 CC88-2
Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC88-l:n konstruktiossa toistettiin sillä poikkeuksella, että kimeerisenä raskaan 5 ketjun vektorina käytettiin 20 p83-y2:ta.
CC88-3
Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transformoimassa käytetyt menetelmät CC88-l:n konstruktiossa toistettiin sillä poikkeuksella, että kimeerisenä raskaan 10 ketjun vektorina käytettiin 20 μg p83-y3:a.
CC88-4
Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC88-l:n konstruktiossa toistettiin sillä poikkeuksella, että kimeerisenä raskaan 15 ketjun vektorina käytettiin 20 μg p83-y4:ää.
Kimeeristä 84-vasta-ainetta tuottavien kloonien muodostaminen
Koska CC49:n ja CC83:n raskaan ketjun vaihtelevien alueiden välillä on paljon jaksojen samankaltaisuutta, 20 muodostettiin sekakohdetransformaatioilla sellaisia kimee-risiä vasta-aineita, joiden kevyet ja raskaat ketjut polveutuivat eri kannoista. CC49:n ja CC83:n kimeeriset raskaan ketjun γΐ-isotyypin vektorit siirrettiin elektropo-raatiolla vastaavassa järjestyksessä kimeerisen kevyen j . 25 ketjun kohteisiin 83K34-10 ja 49K13-13 kummankin "sekoite tun" kombinaation muodostamiseksi. Tuloksena olleet solu-linjat nimettiin CH48-l:ksi ja CH84-l:ksi, jossa ensimmäinen luku ilmoittaa raskaan ja kevyen ketjun polveutumisen vastaavassa järjestyksessä mainittuna. Esimerkiksi CH48-1 30 tarkoittaa sellaista γΐ-isotyyppiä, jonka raskas ketju on : peräisin CC49:stä ja kevyt ketju peräisin CC83:sta.
Koostettu vasta-aine CH48-1 ei sitoutunut TAG-72:een. Tämä ei johtunut sen kyvyttömyydestä muodostaa bona fide- kimeeristä vasta-ainetta, koska useimmat lääke-35 aineresistentit solulinjat tuottivat kimeeristä IgG:tä 1 sä T-·
Tl 103181 91 (määritettynä ELISA-analyysillä, jossa käytettiin vuohen vasta-aineesta ihmisen Ig:tä vastaan muodostettua loukkua ja jossa koettimena toimi vuohen vasta-aine ihmisen IgG-alkalinen fosfataasi -konjugaattia vastaan). Jos sitoutu-5 misaffiniteettia esiintyikin, oli se huomattavasti pienem pi kuin mitä havaittiin ensimmäisen sukupolven vasta-aineella B72,3, jolla oli noin yhtä kertaluokkaa pienempi affiniteetti TAG-72:ta kohtaan, kuin joko CC49:llä tai CC83:11a.
10 Oli yllättävää, että CH84-1 sitoutui TAG-72:een sa malla affiniteetilla kuin sen lähtökannat. Tämä uusi vasta-aine muodostettiin laboratoriossamme de novo, eikä sitä ole vielä tavattu luonnossa.
Tämän uuden sekavasta-aineen, CH84:n spesifisyyden 15 määrittämiseksi suoritettiin kompetitiotutkimuksia. On syytä ottaa huomioon, että sekä CC49:ssä että CC83:ssa esiintyy jonkin verran TAG-72-antigeeniin kohdistuvaa kilpailevaa tunnistuskykyä. Havaittiin, että CH84-1 kilpaili TAG-72:een sitoutumisessa enemmän CC49:n kanssa kuin mitä 20 se kilpaili CC83:n kanssa. Tämä viittaisi siihen, että TAG-72:een sitoutumisen spesifiteetti sijaitsisi kevyessä ketjussa.
Myös ihmisen γ2, -3 ja -4-isotyyppejä muodostettiin tällä sekavasta-aineella ja tuloksena olivat CH84-2-, :· 25 CH84-3- ja CH84-4-kloonit.
CC84-1
Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC44-l:n konstruktiossa toistettiin seuraavalla poikkeuksella: 30 49K-13-13-solut, joiden soluvärjäyksellä havaittiin \ tuottavan CC44:n kevyttä ketjua, transformoitiin CH44-l:n transformoinnin yhteydessä kuvatulla tavalla, sillä poikkeuksella, että 20 μg p83vl-2.3:a, CH83:n raskaan ketjun geenin sisältävää pSV2gpt-vektoria käytettiin ρ49γΐ-2.3:η, 103181 92 CH44:n raskaan ketjun geenin sisältävän pSV2gpt-vektorin sijasta.
CC84-2
Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-5 moinnissa käytetyt menetelmät CH84-l:n konstruktiossa toistettiin sillä poikkeuksella, että 20 μg p83~72:ta käytettiin p83-7l-2.3:n sijasta.
CC84-3
Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-10 moinnissa käytetyt menetelmät CH84-l:n konstruktiossa toistettiin sillä poikkeuksella, että 20 /zg p83-73:a käytettiin p83-7l-2.3:n sijasta.
CC84-4
Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-15 moinnissa käytetyt menetelmät CH84-l:n konstruktiossa toistettiin sillä poikkeuksella, että 20 μg p83~74:ää käytettiin p83-7l-2.3:n sijasta.
Rekombinattivasta-aineiden puhdistus | Kimeerisiä vasta-aineita ilmentävät solut poistet- i 20 tiin viljelyliuoksesta sentrifugoimalla ja liuos suodatettiin 0,2 μπ\ suodattimen läpi. Kimeeriset vasta-aineet puh-' distettiin viljelmän supernatanteista kahdessa vaiheessa.
Ensimmäisessä puhdistusvaiheessa käytettiin proteiini A -n affinitettipakkausta (Nygene Corporation, Yonkers, NY) 25 valmistajan ohjeiden mukaisesti. Korkeintaan 1,0 1 viljel män supernatanttia päästettiin 5 millilitran minuuttino-peudella 1 mg:n kapasiteetin omaavan pakkauksen läpi. Pakkaus pestiin fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella lopun albumiinin poistamiseksi. Kimeerinen 30 vasta-aine saatiin eluoimalla 0,1 M natriumnitraattipusku-I ' riliuoksella, pH 3,0. Kimeerisen vasta-aineen sisältävien fraktioiden pH säädettiin välittömästi neutraaliksi 1 -h— M:lla Tri2ma-emäsliuoksella. Lopullinen puhdistus saatiin aikaan tästä liuoksesta geelisuodatuksella käyttäen Phar-35 macia Superose 12 HR 16/50 -pylvästä valmistajan (Phar- 93 103181 macia, Piscataway, NJ) ohjeiden mukaan, Amicon centricon 30 -laitteella suoritetun konsentroinnin jälkeen.
Esimerkki:
Hiiren ituradan VHaTAG:n vaihtelevan alueen sisäl-5 tävän immunoglobuliinin muodostaminen
Seuraavissa esimerkeissä on esitetty alan ammattimiesten käyttöön toistettava menetelmä VHaTAG:ista peräisin olevan DNA-jakson koodaaman vasta-aineen valmistamiseksi.
Ilmentymiskykyisen VeaTAGsn raskaan ketjun geenin 10 komponentit
On mahdollista muodostaa kimeerinen hiiri-ihmisvas-ta-aine, joka sisältää hiiren VHaTAG:n ituradan raskaan ketjun vaihtelevan alueen, VHaTAG VH:lle komplementaarisen kevyen ketjun vaihtelevan alueen, kuten joko CC49:n tai 15 CC83 :n hiiren vaihtelevan alueen ja ihmisen muuttumattomat alueet.
2,2 ke:n VHorTAG VH.-n eksonijakson sisältävää ituradan Hind III-DNA-fragmenttia käytetään templaattina, jotta saadaan funktionaalisesti uudelleenjärj estynyt VHofTAG: n 20 vaihteleva alue. Hiiren genomin J-C/i-intronialuetta käytetään lähteenä hiiren raskaan ketjun tehostajajaksoille. Jälkimmäinen jakso saadaan plasmidista pNP9 (katso aiempana ollut esimerkki "CC49:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen eristäminen"). Kuviossa 38 on esitetty hybridigee- 2 5 nien rakentamiseen käytetty kokonaisreaktio, joka perustuu julkaisussa Horto et ai. , (1989), yllä, kuvattuun menetelmään. Neljä oligonukleotidia (oligot) on suunniteltu käytettäväksi kohde-DNA:n entsyymeillä suoritettavaan monistukseen ja muunteluun. Oligonukleotidi 1 yhtyy pituus- 3 0 suunnassa Vhq;TAG:n 5'-päähän kattaen Eco R I kohdan, joka * on 249 ep:a ATG-koodisanasta 5'-päätä kohti. Oligonukleo tidi 2 yhtyy VHaTAG:n eksonin 3'-päälle komplementaarisiin jaksoihin ja sisältää myös D-segmenttiä koodaavat jaksot. Oligonukleotidi 2:ssa olevat D-segmentin jaksot eivät yhdy 35 mihinkään Vhq;TAG:n jaksoon. Oligonukleotidi 3 sisältää hii- 94 103181 ren genomin J-C^-alueen 5'-päälle komplementaariset jaksot ja siihen kuuluvat D-segmenttiä (sama kuin oligonukleotidi 2:ssa) ja J-segmenttiä koodaavat jaksot. Oligonukleotidi 4 yhtyy J-C/z-alueen 3'-päähän ja sisältää 1219 ep.-a JH4:stä 5 3'-päätä kohti sijaitsevalle Eco R I -kohdalle komplemen taariset jaksot. Näiden oligonukleotidien jaksot ovat seu-raavat:
Oligonukleotidi 1 5' GTCTAGÄATTCAIAAAAACTTTATG (25-mee- ri)
10 Oligonukleotidi 2 CAGTGTATTTCTGTAAAAGATCTACTATGGTTACG
(35-meeri)
Oligonukleotidi 3 5'TCTACTATGGTTACGTGGGGTCAAGGAACCTCAGT- CACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGCCTCTCCAGGTCT 3' (72-meeri) ^ Oligonukleotidi 4 5' ACTTCTAAAATGTATTTAGAATTCATTTTC 3' 15 Tässä esimerkissä D-jakso on SP2,3, joka on otettu julkaisussa Kurosawa ja Tonegava (1982), J. Exp. Med. 155, 201 julkaistusta jaksosta. Oligonukleotideissä 2 ja 3 D-jakso on esitetty lihavoituna. Mitä tahansa muuta luonneh-7 dittua hiiren tai ihmisen D-segmenttiä voidaan käyttää 20 korvaamalla niillä näissä asemissa oligonukleotideissä 2 ja 3 esiintyneet segmentit.
J-segmentti oligonukleotidissä 3 on alleviivattu.
Se on julkaisussa Gough ja Bernard, (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 78, 509 julkaistusta jaksosta otettu hii-:· 25 ren JH4 - segmentti. Mikä tahansa muu hiiren tai ihmisen J- segmentti voidaan liittää korvaamalla niillä oligonukleo-tidissä 3 esiintynyt JH4-segmentti.
Oligonukleotideissä 1 ja 4 Eco R I -kohdat (GAÄTTC) on esitetty kursivoituna.
30 Intaktien VgOfTAG-geeni en kokoaminen -f -
Suoritettiin kaksi erillistä DNA-monistusreaktiota käyttäen yllä kuvattuja komponentteja. DNA-monistusreaktio 1 kopioi VHaTAG-jakson ja liittää D-segmentin sen 3'-päähän. DNA-monistusreaktio 2 kopioi raskaan ketjun tehosta-35 jajaksot sisältävät hiiren intronijaksot ja liittää oligo- 4-ä t m
TW
103181 95 nukleotidin 3 koodaamat D- ja J-segmentit. Reaktioiden 1 ja 2 tuloksena olleet monistetut tuotteet puhdistetaan geelissä, yhdistetään ja oligonukleotidit 1 ja 4 lisätään reaktion 3 aloittamiseksi. Reaktiossa 3 reaktioiden 1 ja 2 5 tuotteet yhtyvät pituussuunnassa yhteisten D-jaksojensa muodostaman sillan välityksellä. Tämän jälkeen oligonuk-leotideista 1 ja 4 suoritettu DNA-monistus saa aikaan kuvion 38 alaosassa esitetyn tuotteen. Tämä fragmentti pilkotaan käyttäen Eco R I:tä ja se puhdistetaan geelissä. 10 Muunnettu VHaTAG-fragmentti liitetään ligaasilla pSV2gpt 1(2.3):n Eco R I -kohtaan yllä olevan esimerkin "Raskaan ketjun kimeeriset konstruktiot" mukaisesti. Koko V„aTAG-D-J-tehostaja-alueen sisältävä fragmentti sekvenssoidaan täydellisesti, jotta voidaan varmistua, ettei DNA-monis-15 tusreaktioiden aikana ole päässyt tapahtumaan mutaatioita. Muut kolme raskaan ketjun γ-isotyypit voidaan muodostaa liittämällä ligaasilla sama muunnettu VHaTAG-fragmentti muihin kolmeen γ·.η sisältävään pSV2gpt-vektoriin (pSV2gpt-γ2, pSV2gpt-y3, pSV2gpt-y4).
20 Muunnetun VHaTAG-geenin ilmentyminen
Plasmideja sisältävä muunnettu VHccTAG-geeni voidaan linearisoida Nde I:llä ja viedä elektroporaation välityksellä kimeerisiin CC49:n ja CC83:n kevyttä ketjua ilmentäviin solulinjoihin (katso yllä oleva esimerkki "C. Kohde-:· 25 transformaatiot"). Transformoidut solut valikoidaan kasvun suhteen genetisiinin ja mykofenolihapon läsnä ollessa esimerkissä "C. Kohdetransformaatiot" kuvatulla tavalla. Ilmennetyn vasta-aineen esiintymistä tarkkaillaan TAG-72 ELISA:11a (katso kohta "Tulokset, Entsyymivälitteiset im-30 munomääritykset (ELISA)"). Näissä soluissa ilmennetty vasta-aine sisältää ihmisen Ig:n muuttumattomat γΐ, κ-alueet, joissa on CC49:n tai CC83:n kevyen ketjun vaihteleva alue, ja muunnetuista ituradan VHaTAG VH:n eksoneista peräisin olevan raskaan ketjun vaihtelevan alueen.
103181 96
Alla on esitetty neljä esimerkkiä muunnetuista VHaTAG:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen konstruktioista, joissa on erilaisia D- ja J-segmenttejä.
Vu-segment ti D-segmentti_J-segment ti
5 V„aTAG #i hiiren D (SP2,3) hiiren J
VHaTAG #ii ihmisen D (Dl) hiiren J
VHaTAG #iii hiiren D (SP2,3) ihmisen J
VHaTAG #iv ihmisen D (Dl) ihmisen J
10 Ihmisen D-jakso Dl saatiin julkaisusta Siebenlist, et ai. , (1981) Nature, 294, 631. Ihmisen JH1-jakso saatiin julkaisusta Ravetch, et ai. (1981) Cell 27, 583.
VHaTAG #i:n muodostaminen on kuvattu taulukossa esitetyillä oligonukleotideilla 1-4. VHaTAG:ien #ii - #iv 15 muodostamiseksi vastaavat D- ja J-segmentit täytyy vaihtaa oligonukleotideissa 2 ja 3. Seuraavissa oligonukleoti- deissa nämä muutokset on esitetty. Näiden oligonukleoti-dien korvaamisen reaktioissa 1 ja 2 tuloksena muodostuvat VHarTAG:t #ii - #iv.
20 VgtxTAG #ii
Oligonukleotidi 2 5' CAGTGTATTTCTGTAAAAGAGTACTGGTGGT
(34-meeri)
Oligonukleotidi 3 5' GTACTGGTGGTGTATTGGGGTCAAGGAACC
TCAGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGCCT : 25 CTCCAGGTCT 3' (72-meeri)
VaaTAG #iii
Oligonukleotidi 2 5' CAGTGTATTTCTGTAAAAGATCTACTATGG
TTACG (35-meeri)
Oligonukleotidi 3 5' TCTACTATGGTTACGTGGGGCCAGGGCAC
30 CCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGCCTCTC- CAGGTCT 3' (72-meeri)
VeöTAG #iv
Oligonukleotidi 2 5' CAGTGTATTTCTGTAAAAGAGTACTGGTG
GTGTAT (35-meeri) 103181 97
Oligonukleotidi 3 5' GTACTGGTGGTGTATTGGGGCCAGGGCAC
CCTGGTGACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGC CTCTCCAGGTCT 3' (72-meeri)
Tulokset 5 A. Kimeeristä vasta-ainetta tuottavat solulinjat
Kevyiden ja raskaiden vasta-aineiden samanaikainen tunnistus suoritettiin käyttämällä kahta koetinvasta-ai-netta: 1) Fluoresoivalla FITC-väriaineella leimattu vuohen 10 vasta-aine ihmisen kappaa vastaan ja, 2) Fluoresoivalla TRITC-väriaineella leimattu vuohen vasta-aine ihmisen IgG:tä vastaan.
Solulinjat, joilla oli positiivinen reaktio sekä raskaiden että kevyiden ketjujen suhteen testattiin lisäk-15 si niihin liittyvän kimeerisen immunoglobuliinin tuoton suhteen ja biologisen aktiivisuuden eli niiden sitoutumisen suhteen TAG-72 reen.
Entsyymivälitteiset immunomääritykset (ELISA) ELISA-menetelmää käytettiin kimeeristä monoklonaa-20 lista vasta-ainetta tuottavan transformoidun solun valitsemiseen. Raskaan ja kevyen ketjun lääkeainevalikointiin tehdyt konstruktiot sisältäviä klooneja valikoitiin niiden kasvun perusteella valikoivassa viljelyliuoksessa. Testattiin seuraavat solulinjat (1) CH44-1: solulinja, jossa on .. 25 CC49 VH, CC49 VL ja IgGx:n muuttumaton alue, (2) CH44-2: solulinja, jossa on CC49 VH, CC49 VL ja IgG2:n muuttumaton alue, (3) CH44-4: solulinja, jossa on CC49 VH, CC49 VL ja IgG4:n muuttumaton alue, (4} CH88-1: solulinja, jossa on VH, CC83 VL ja IgGx:n muuttumaton alue, (5) CH88-2: solulin-30 ja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG2:n muuttumaton alue, : (6) CH88-3: solulinja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG3:n muuttumaton alue, (7) CH88-4: solulinja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG4:n muuttumaton alue, (8) CH84-1: solulinja, jossa on CC83 VH, CC49 VL ja IgGx:n muuttumaton alue, (9) 35 CH84-2-. solulinja, jossa on CC83 VH, CC49 VL ja IgG2:n muut- 103181 98 tumaton alue, (10) CH84-3: solulinja, jossa on CC83 VH> CC49 VL ja IgG3:n muuttumaton alue ja (11) CH84-4: solulinja, jossa on CC83 VH, CC49 VL ja IgG4:n muuttumaton alue.
Näiden viljelmien supernatanteille suoritettiin 5 ELISA. Kimeerisen TAG-72-vasta-aineen vasta-aineen esiintyminen mitattiin suoraan reaktiolla, jossa käytettiin ylimäärin entsyymillä, kuten alkalisella fosfataasilla, leimattua vuohen ihmisen IgG-vasta-aineen vasta-ainetta sen jälkeen, kun kimeerisen TAG-72-vasta-aineen vasta-ai-10 neen oli annettu sitoutua antigeenillä (TAG-72) päällystettyihin mikrotiitterikuoppiin . TAG-72-vasta-aineaktiivi-suus määritettiin, jotta saatiin arvosteluperuste onnistuneelle rekombinaatiolle.
14 päivän kasvatuksen jälkeen otettiin 50 μΐ jatko-15 kloonattuja soluja sisältävien kuoppien supernatanteista, joista sitten tehtiin uudelleen ELISA-määritykset TAG-si-toutumisen suhteen. Näytteet (50 μΐ) lääkeaineille resis-. , tenttien solulinjojen supernatanteista vietiin Nunc Immu- | lon 96-kuoppaisten levyjen kuoppiin, jotka oli aiemmin 20 päällystetty *TAG-antigeenillä (laimennettu 1/50) . Sitoutumattoman materiaalin poistamiseksi suoritetun pesun jälkeen kuoppia inkuboitiin käyttäen koettimena vuohen ihmi-j: sen alkalisen fosfataasilla konjugoidun vuohen ihmisen
IgG-vasta-aineen vasta-ainetta (GAHIgG-AP) ihmisen TAG-25 antigeeniin sitoutuneiden levyyn immobilisoituneiden ki-meeristen vasta-aineiden muuttumattomien alueiden tunnis-tamiseksi. Toinen pesukerta, jota seurasi kromogeenisen alkalisen fosfataasisubstraatin lisääminen, sitoutumattoman koettimen (GAHIgG-AP) poistamiseksi mahdollisti värin j. 30 kehittymisen niissä kuopissa, joissa oli ihmisen muuttu- j- *· mattomiin alueisiin liittynyttä TAG-sitoutumiskykyä (toi sin sanoen kimeerisiä vasta-aineita TAG-72:ta vastaan). 405 nm alueelta saadut absorbanssilukemat osoittavat lääkeaineille resistenttejen solulinjojen kimeerisen vasta-35 aineen suhteellisen tuoton.
- :i.33 99 1 03 1 81 CH44-1 TAG-72:n vastaan suunnattua aktiivisuutta käytettiin onnistuneen rekombinaation arvosteluperusteena. Mik-rotiitterimaljojen kuopat päällystettiin TAG:llä inkuboi-5 maila 50 /*l:lla 1:75 laimennettua puhdistettua TAG-72:ta [Murano, R., et ai.. (1988) Cancer Research 48 4588 - 4596] 18 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen kuopat pestiin 4 kertaa fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS), jonka jälkeen ne suojattiin 10 BSA:lla inkuboimalla 50 μ1:1ΐ3 PBS-liuosta, jossa oli 0,5-%:ista BSA:ta, 2 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa, jonka jälkeen ne pestiin neljä kertaa PBS:llä. Nämä maljat pysyvät muuttumattomina, jos niitä säilytetään kosteina 4 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen kuhunkin kuoppaan lisä-15 tään 50 mikrolitraa näytettä. Kontrollimaljana käytetään maljaa, joka sisältää tuoretta liuosta. Kaikkia näytteitä inkuboitiin joko maljassa 37 °C:n lämpötilassa 90 minuutin ajan tai suljetussa astiassa 4 °C:n lämpötilassa yön yli.
Tämän jälkeen maljat pestiin 4 kertaa PBS:llä ja 20 kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 μΐ 1:250 laimennettua al-kalisen fosfataasin kanssa konjugoidun vuohen ihmisen IgG-vasta-aineen vasta-ainetta (Southern Biotech Assoc.). Liuosta inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa 90 minuutin ajan. Koettimen poistamiseksi suoritetun 4-kertaisen pesun jäl-25 keen tarkasteltiin värin kehittymistä.
Värin kehittymisen aikaansaamiseksi substraattia inkuboitiin huoneen lämpötilassa 6 minuutin ajan 200 μΐ:ssa etanoliamiinilla puskuroidussa substraattia, p-nitrofenyylifosfaattia (Kirkegaard ja Perry), sisältä-30 vässä fysiologisessa suolaliuoksessa. Optinen tiheys : 450 nm:ssä mitattiin kustakin levystä Dynatechin mikro- tiitterilevylukijalla (Dynatech Inc.).
Kimeerisen vasta-aineen TAG-72-sitomisaktiviteettia osoittavia supernatantteja sisältävissä kuopissa olevia 35 Sp2/0-pesäkkeistä jatkokloonattiin äärilaimennuksella.
!oo 103181
Suhteellisen suuren kimeerisen vasta-aineen tuottokyvyn perusteella valittiin yksittäisiä jatkoklooneja.
CH44-2 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä 5 toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy tettiin CH44-2:ta.
CH44-3 CH44-1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy- 10 tettiin CH44-3:a.
CH44-4 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH44-4:ää.
15 CH88-1 CH44-1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy tettiin CH88-l:tä.
CH88-2 20 CH4 4 -1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy tettiin CH88-2:ta.
CH88-3 CH44-1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä ·' 25 toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy tettiin CH88-3:a.
CH88-4 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä | toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy- ! 30 tettiin CH88-4:ää.
CH84-1 i » CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy- 1 tettiin CH84-l:tä.
m 103181 CK84-2 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH84-2:ta.
5 CH84-3 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH88-3:a.
CH84-4 10 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH84-4:ää.
CH48-1 CH44-1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä 15 toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH84-4:ää.
Karsinoomaan ohjautuminen in vivo
Eläinkokeissa käytetyt ja myöhempänä tulevissa taulukoissa 1-4 esitetyt kimeeriset monoklonaaliset vasta-20 aineet leimattiin Na125I:llä käyttäen Iodogeniä (Pierce Chemical, Rockford, IL). Tarkemmin sanottuna noin 0,5 -2 mg puhdistettuja kimeerisiä monoklonaalisia vasta-aineita sisältävän 0,1 M natriumfosfaattiliuoksen tilavuus säädettiin 0,5 ml:ksi, jonka jälkeen se lisättiin 12 cm x 75 cm 25 kokoiseen 50 ^g:lla Iodogeniä päällystettyyn lasiputkeen, jonka jälkeen lisättiin 0,1 - 0,5 mCi NalzsI:a (New England Nuclear, Boston, MA). 2 minuutin huoneenlämmössä tapahtuneen inkuboinnin jälkeen proteiini poistettiin liukenemattomasta Iodogenistä ja liittymättä jäänyt 125I erotettiin 30 vasta-aineesta geelisuodattamalla se 10 ml:n Sephadex1^ σι 25 -kolonnin läpi käyttäen PBS:ää puskuriliuoksena. Jodi- tusprotokollan tuloksena saatiin leimattu kimeerinen IgG-vasta-aine, jonka spesifinen aktivisuus oli 0,05 - 0,2 μCi/μg.
Naaraspuoliset taustaltaan CD1-tyyppiset kateen-35 korvan suhteen vaillinaiset hiiret hankittiin Charles 102 103181
Riveriltä noin 4 viikon ikäisinä. Yhdeksän päivän kuluttua hiiriin istutettiin ihonalaisesti (0,1 ml/hiiri) LS174T-soluja (1 X 106 solua/eläin).
Kateenkorvan suhteen vaillinaisille 70 - 400 mg 5 painoisille hiirille, joihin oli muodostunut karsinoomia, annettiin noin 12 - 13 päivän kuluttua syöpäsolujen istuttamisesta suonensisäisenä ruiskeena 0,5 - 2,0 /iCi (10 -50 μg proteiinia) kimeerisiä monoklonaalisia ylläkuvatulla tavalla joditettuja vasta-aineita PBS-liuoksessa. Viiden 10 hiiren ryhmiä lopetettiin eri aikoina laskemalla niistä veri, normaalit ja karsinoomakudokset leikattiin irti ja punnittiin, sekä pulssimäärät minuuttia kohti mitattiin gammalaskurilla. Kunkin kudoksen pulssimäärät minuuttia kohti määritettiin ja verrattiin karsinoomasta saatuihin 15 tuloksiin.
Tulokset CH44-1:n osalta on esitetty taulukoissa 1 - 2 ja kuvissa 39A, 39B ja 39C. Tulokset CH84-l:n kohdalta on esitetty taulukoissa 3 - 4 ja kuvissa 40A ja 40B.
| Prosenttimäärä injektoidusta annoksesta U5I-leimat- 20 tua vasta-ainetta kudosgrammaa kohti
Taulukko 1 CH44-1 25 Kudos 0,75 h 23,5 h 49,5 h 122 h veri, koko- 29,70 15,84 8,09 7,31 maksa 8,13 4,13 2,19 1,96 perna 6,19 3,39 2,12 1,36 i 30 munuainen 4,35 2,80 1,52 1,33 ; ; > syöpäkasvain 3,31 25,95 28,83 44,16 keuhko 7,34 5,39 2,90 2,36 syöpäkasvain, villityyppi 0,18 0,12 0,09 0,11 t-: 35 j-5 Kuten taulukossa 1 on esitetty, noin 122 tunnin kuluttua injektiosta syöpäkasvaimen sisältämä prosentti- 103181 103 määrä injektoidusta annoksesta oli 44,16 prosenttia CH44-l:n osalta. Tämän perusteella CH44-1 ohjautui tehokkaasti ihmisen syöpäkasvaimeen in situ. Tämä osoittaa, että tämän keksinnön mukaiset kimeeriset monoklonaaliset vasta-aineet 5 ohjautuivat tehokkaasti karsinoomaan in vivo.
Prosenttimäärä injektoidusta annoksesta ffiI-leimattua vasta-ainetta elintä kohti Taulukko 2 10 CH44-1
Kudos 0,75 h 23,5 h 49,5 h 122 h veri, koko- 47,72 23,03 13,29 12,01 15 maksa 10,97 5,20 3,20 2,69 perna 1,09 0,48 0,25 0,22 munuainen 1,25 0,72 0,42 0,40 syöpäkasvain 0,57 3,085 2,823 4,55 keuhko 1,20 0,87 0,57 0,37 20 ruoansulatuskanava 6,64 4,78 3,96 2,83 ruho 43,17 49,68 35,35 29,95 koko ruumiin ·. 25 retentio 91,30 76,34 53,28 46,20
Kuten taulukossa 2 on esitetty, noin 122 tunnin kuluttua injektiosta syöpäkasvaimen sisältämä prosenttimäärä injektoidusta annoksesta oli 4,55 prosenttia CH44-30 l:n osalta. Tämän perusteella CH84-1 ohjautui tehokkaasti • ihmisen syöpäkasvaimeen in situ. Tämä osoittaa, että tämän keksinnön mukaiset kimeeriset monoklonaaliset vasta-aineet ohjautuivat tehokkaasti karsinoomaan in vivo.
104 103161
Prosenttimäärä injektoidusta annoksesta ‘“l-leimattua vasta-ainetta kudosgrammaa kohti Taulukko 3 5 CH84-1
Kudos 1 h 23 h 47 h 118-119 h veri, koko- 30,68 15,65 6,74 6,49 10 maksa 12,55 4,26 2,35 1,57 perna 10,93 3,35 2,56 1,70 munuainen 5,59 2,51 1,53 1,55 syöpäkasvain 4,06 20,52 17,58 30,27 keuhko 10,77 4,80 2,58 2,24 15 syöpäkasvain, villityyppi 0,15 0,22 0,20 0,24
Kuten taulukossa 3 on esitetty, noin 118 tunnin kuluttua injektiosta syöpäkasvaimen sisältämä prosentti-20 määrä injektoidusta annoksesta oli 30,27 prosenttia CH84-l:n osalta. Tämän perusteella CH84-1 ohjautui tehokkaasti ihmisen syöpäkasvaimeen 117 situ. Tämä osoittaa, että tämän keksinnön mukaiset kimeeriset monoklonaaliset vasta-aineet i ohjautuivat tehokkaasti karsinoomaan in vivo.
25 105 103181
Prosenttimäärä injektoidusta annoksesta ^I-leimattua vasta-ainetta elintä kohti Taulukko 4 5 CH84-1
Kudos 1 h 23 h 47 h 118-119 h veri, koko- 45,98 22,11 10,08 9,371 10 maksa 13,64 5,34 3,13 1,94 perna 1,35 0,49 0,32 0,16 munuainen 1,39 0,62 0,38 0,38 syöpäkasvain 0,59 4,335 3,633 7,02 keuhko 1,77 0,69 0,42 0,31 15 ruuansulatuskanava 7,38 4,92 3,41 2,32 ruho 44,83 52,19 30,32 24,06 koko ruumiin 20 retentio 93,58 81,00 47,14 45,48
Kuten taulukossa 4 on esitetty, noin 118 tunnin kuluttua injektiosta syöpäkasvaimen sisältämä prosenttimäärä injektoidusta annoksesta oli 7,02 prosenttia CH84-25 l:n osalta. Tämän perusteella CH84-1 ohjautui tehokkaasti ihmisen syöpäkasvaimeen in situ. Tämä osoittaa että tämän keksinnön mukaiset kimeeriset monoklonaaliset vasta-aineet ohjautuivat tehokkaasti karsinoomaan in vivo.
Kimeerisiä vasta-aineita tuottavien solulinjojen 30 talletus 'j Esimerkeissä valmistetut yksitoista kuvaavaa esi merkkiä kimeerisiä vasta-aineita erittävistä kevyen kappa-ketjun omaavista solulinjoista talletettiin talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC) lokakuun 35 19. päivänä 1988. Tarkemmin sanottuna seuraavat solulinjat on talletettu: (1) CH44-1: solulinja, jossa on CC49 VH, 10β 103181 CC49 VL ja IgG,:n muuttumaton alue (ATCC no. HB 9884), (2) CH44-2: solulinja, jossa on CC49 VH/ CC49 VL ja IgG2:n muuttumaton alue (ATCC nro HB 9880), (3) CH44-4: solulin ja, jossa on CC4 9 VH, CC49 VL ja IgG4:n muuttumaton alue 5 (ATCC nro 9877), (4) CH88-1: solulinja, jossa on VH, CC83 VL ja IgGi:n muuttumaton alue (ATCC nro 9882), (5) CH88-2: solulinja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG2:n muuttumaton alue (ATCC nro 9881), (6) CH88-3: solulinja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG3:n muuttumaton alue (ATCC nro 9876), (7) 10 CH88-4: solulinja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG4:n muuttumaton alue (ATCC nro 9874), (8) CH84-1: solulinja, jossa on CC83 VH, CC49 VL ja IgG^n muuttumaton alue (ATCC nro 9883), (9) CH84-2: solulinja, jossa on CC83 VH, CC49 VL ja IgG2:n muuttumaton alue (ATCC nro 9879), (10) CH84-3: 15 solulinja, jossa on CC83 VH, CC49 VL ja IgG3:n muuttumaton alue (ATCC nro 9878) ja (11) CH84-4-. solulinja, jossa on CC83 VH, CC49 VL ja IgG4:n muuttumaton alue (ATCC nro 9875) .
Vaikka tämä keksintö on kuvattu yksityiskohtaisesti ja viittauksin sen erityisiin sovellutusmuotoihin, on am-20 mattimiehelle kuitenkin selvää, että useita erilaisia muutoksia ja modifikaatioita voidaan tehdä poikkeamatta patenttivaatimusten hengestä ja suojapiiristä.
*· - -4— . x

Claims (10)

1. Vasta-aine, tunnettu siitä, että sitä tuottaa jokin solulinjoista CH44-1 (ATCC HB 9884),
2. Vasta-aine- tai vasta-ainefragmenttikonjugaatti, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin kon-jugoituna kuvantamismarkkeriin.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen vasta-aine- tai vasta-ainefragmenttikonjugaatti, tunnettu siitä, kuvantamismarkkeri on 125I, 131I, 123I, 311In, 10SRh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 16iHo, 177Lu, 186Re, 188Re tai 99mTc.
4. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se 20 koodaa ainakin osaa vasta-ainetta, joka pystyy selektiivisesti reagoimaan TAG-72-antigeenin kanssa ja on jossakin solulinjoista CH44-1 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880), CH44-4 (ATCC HB 9877), CH 88-1 (ATCC HB 9882), CH 88-2 (ATCC HB 9881), CH 88-3 (ATCC HB 9876), CH 88-4 (ATCC
25 HB 9874), CH 84-1 (ATCC HB 9883), CH 84-2 (ATCC HB 9879), CH 84-3 (ATCC HB 9878) ja CH 84-4 (ATCC HB 9875) .
5 CH 88-3 (ATCC HB 9876), CH 88-4 (ATCC HB 9874), CH 84-1 (ATCC HB 9883), CH 84-2 (ATCC HB 9879), CH 84-3 (ATCC HB 9878) ja CH 84-4 (ATCC HB 9875) tuottamaa vasta-ainetta.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa ainakin osaa CH-gee-niä, joka koodaa IgG^tä, IgM:ä, IgA:ta, IgD:tä tai
30 IgE:tä.
5 CH44-2 (ATCC HB 9880), CH44-4 (ATCC HB 9877), CH 88-1 (ATCC HB 9882), CH 88-2 (ATCC HB 9881), CH 88-3 (ATCC HB 9876), CH 88-4 (ATCC HB 9.874), CH 84-1 (ATCC HB 9883), CH 84-2 (ATCC HB 9879), CH 84-3 (ATCC HB 9878) ja CH 84-4 (ATCC HB 9875) tai sen fragmentti, joka pystyy reagoimaan 10 selektiivisesti TAG-72-antigeenin kanssa.
6. Biologisesti toimintakykyinen ilmentämisvehik-keli, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukaisen DNA-sekvenssin.
7. Solu, tunnettu siitä, että se on 35 transformoitu patenttivaatimuksen 6 mukaisella ilmentämis- vehikkelillä. 108 1 03 1 81
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen solu, tunnettu siitä, että se tuottaa jonkin solulinjoista CH44-1 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880), CH44-4 (ATCC HB 9877), CH 88-1 (ATCC HB 9882), CH 88-2 (ATCC HB 9881),
9. Menetelmä yhdistelmäilmentämisvehikkelin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuk- 10 sen 4 tai 5 mukainen DNA-sekvenssi insertoidaan ilmentä-misvehikkeliin.
10. Menetelmä transformoidun isännän valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 9 mukainen ilmentämisvehikkeli viedään sopivaan isäntään. • I :— * _1 -2 109 1 03 1 81
FI903056A 1988-10-19 1990-06-18 Uusi vasta-aine ja siihen liittyvät vasta-ainekonjugaatit, DNA-sekvenssit, ilmentämisvehikkelit ja solut FI103181B1 (fi)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI961439A FI103477B1 (fi) 1988-10-19 1996-03-29 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin valmistamiseksi

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25994388A 1988-10-19 1988-10-19
US25994388 1988-10-19
PCT/US1989/004402 WO1990004410A1 (en) 1988-10-19 1989-10-04 A novel family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment
US8904402 1989-10-04

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI903056A0 FI903056A0 (fi) 1990-06-18
FI103181B true FI103181B (fi) 1999-05-14
FI103181B1 FI103181B1 (fi) 1999-05-14

Family

ID=22987104

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI903056A FI103181B1 (fi) 1988-10-19 1990-06-18 Uusi vasta-aine ja siihen liittyvät vasta-ainekonjugaatit, DNA-sekvenssit, ilmentämisvehikkelit ja solut

Country Status (21)

Country Link
EP (2) EP0397821A4 (fi)
JP (1) JP2935520B2 (fi)
KR (1) KR0161525B1 (fi)
AR (1) AR242434A1 (fi)
AT (1) ATE111519T1 (fi)
AU (2) AU4429989A (fi)
BR (1) BR8907126A (fi)
CA (1) CA2000913C (fi)
DE (1) DE68918217T2 (fi)
DK (1) DK173089B1 (fi)
ES (1) ES2059670T3 (fi)
FI (1) FI103181B1 (fi)
HK (1) HK162795A (fi)
HU (1) HU218093B (fi)
IE (1) IE64966B1 (fi)
IL (1) IL92037A (fi)
NO (1) NO301075B1 (fi)
NZ (1) NZ231012A (fi)
PT (1) PT92013B (fi)
WO (1) WO1990004410A1 (fi)
ZA (1) ZA897858B (fi)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5869620A (en) * 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US6121424A (en) * 1991-11-25 2000-09-19 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5976531A (en) * 1990-04-19 1999-11-02 The Dow Chemical Company Composite antibodies of human subgroup IV light chain capable of binding to tag-72
US6495137B1 (en) 1990-04-19 2002-12-17 The Dow Chemical Company Humanized anti-tag-72 monoclonal antibodies using human subgroup 4 kappa light chains
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US6800738B1 (en) 1991-06-14 2004-10-05 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
CA2111858A1 (en) * 1991-07-15 1993-02-04 James S. Crowe Production of antibodies
WO1993012231A1 (en) * 1991-12-13 1993-06-24 Dow Chemical (Australia) Limited Composite antibodies of human subgroup iv light chain capable of binding to tag-72
AU696627B2 (en) * 1991-12-13 1998-09-17 Dow Chemical Company, The Composite antibodies of human subgroup IV light chain capable of binding to TAG-72
AU5670194A (en) * 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
DE69327229T2 (de) 1992-12-11 2000-03-30 Dow Chemical Co Multivalente einkettige Antikörper
US6348581B1 (en) 1996-10-31 2002-02-19 The Dow Chemical Company High affinity humanized anti-TAG-72 monoclonalantibodies
DE69829001T2 (de) * 1998-02-25 2006-03-23 The Dow Chemical Co., Midland Humanisierte monoklonale antikörper mit hoher affinität gegen tag-72
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
US7560534B2 (en) 2000-05-08 2009-07-14 Celldex Research Corporation Molecular conjugates comprising human monoclonal antibodies to dendritic cells
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
EP1532162B1 (en) 2002-06-28 2013-08-07 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Humanized anti-tag-72 cc49 for diagnosis and therapy of human tumors
DE10311248A1 (de) * 2003-03-14 2004-09-30 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper
US7589181B2 (en) 2003-08-29 2009-09-15 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Minimally immunogenic variants of SDR-grafted humanized antibody CC49 and their use

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US73685A (en) * 1868-01-21 Improvement in ploughs
GB8720833D0 (en) * 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
FR2788040B1 (fr) * 1998-12-31 2001-03-23 Airsec Sa Distributeur d'objets

Also Published As

Publication number Publication date
AU633026B2 (en) 1993-01-21
HU896255D0 (en) 1991-09-30
KR900701302A (ko) 1990-12-01
DK149990A (da) 1990-08-17
CA2000913A1 (en) 1990-04-19
NO902696L (no) 1990-08-16
HK162795A (en) 1995-10-27
PT92013B (pt) 1995-07-06
AU4429989A (en) 1990-05-14
WO1990004410A1 (en) 1990-05-03
HU218093B (hu) 2000-05-28
IL92037A (en) 1998-03-10
EP0365997A3 (en) 1992-03-04
JP2935520B2 (ja) 1999-08-16
KR0161525B1 (ko) 1998-12-01
EP0397821A1 (en) 1990-11-22
ZA897858B (en) 1991-06-26
NZ231012A (en) 1993-02-25
HUT56878A (en) 1991-10-28
CA2000913C (en) 1999-02-16
IL92037A0 (en) 1990-07-12
IE64966B1 (en) 1995-09-20
DE68918217T2 (de) 1995-02-09
AU4354089A (en) 1990-04-26
EP0365997A2 (en) 1990-05-02
DE68918217D1 (de) 1994-10-20
BR8907126A (pt) 1991-02-13
IE893347L (en) 1990-04-19
EP0365997B1 (en) 1994-09-14
NO301075B1 (no) 1997-09-08
FI903056A0 (fi) 1990-06-18
PT92013A (pt) 1990-04-30
EP0397821A4 (en) 1992-03-18
JPH03502889A (ja) 1991-07-04
AR242434A1 (es) 1993-03-31
NO902696D0 (no) 1990-06-18
FI103181B1 (fi) 1999-05-14
ATE111519T1 (de) 1994-09-15
DK173089B1 (da) 2000-01-10
ES2059670T3 (es) 1994-11-16
DK149990D0 (da) 1990-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI103181B (fi) Uusi vasta-aine ja siihen liittyvät vasta-ainekonjugaatit, DNA-sekvens sit, ilmentämisvehikkelit ja solut
JP3492373B2 (ja) モノクローナル抗体
US5591593A (en) Minimum recognition unit of a PEM mucin tandem repeat specific monoclonal antibody and detection method using same
RU2204606C2 (ru) Антитело vff-18 и его аналоги
US7183384B2 (en) Monoclonal antibody 7H11 reactive with human cancer
KR20010015818A (ko) 합성된 가변성 부분 및 변형 특이성을 가지는면역글로불린 분자
US5993813A (en) Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment
US5976531A (en) Composite antibodies of human subgroup IV light chain capable of binding to tag-72
US6207815B1 (en) Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment
US5645817A (en) Granulocyte-binding antibody constructs, their preparation and use
AU752494B2 (en) High affinity humanized ANTI-CEA monoclonal antibodies
EP0618969B1 (en) Composite antibodies of human subgroup iv light chain capable of binding to tag-72
FI103477B (fi) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen vasta-aineen tai vasta-ainef ragmentin valmistamiseksi
CA2321932A1 (en) High affinity humanized anti-tag-72 monoclonal antibodies
US6641999B1 (en) Probing method for identifying antibodies specific for selected antigens
NO316023B1 (no) Fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt antistoff eller etterapeutisk aktivt fragment derav som er selektive for TAG-72
MXPA00008391A (en) High affinity humanized anti-cea monoclonal antibodies
AU9058291A (en) Composite antibodies of human subgroup IV light chain capable of binding to tag-72

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Owner name: THE DOW CHEMICAL COMPANY