PT92013B - Processo para a preparacao de uma nova familia de anticorpos modificados com afinidade elevada para o tratamento de cancro - Google Patents

Description

Este invento esta relacionado com o campo da produção de imunoglobulinas e modificações das sequências de aminoácidos dos anticorpos naturais Especif icamente o invento esta relacionado com a utilização de técnicas de DNA recombinante para produzir genes quiméricos e com o tirar partido destas técnicas de modioficação de genes para construir anticorpos quiméricos.

Os anticorpos são polipeptidicos de imunoqlobulinas (Ig) especificas produzidos pelo sistema imunológico dos vertebrados como resposta a desafios por parte de proteinas , glicoproteinas , células ou outras substâncias antigènicas estranhas. A sequência de acontecimen tos que permite ao orgnaismo superar a invasão por células estranhas ou libertar o sistema de substâncias estranhas estã pelo menos parcialmente compreendido Uma parte importan te deste processo e a produção de anticorpos que se ligam especificamente a uma substância estranha particular A especificidade de ligação de tais polipeptideos a um antigenio particular e altamente refinada e o numero elevado de especificidades que podem ser geradas por cada vertebrado e notável na sua complexidade e variabilidade Milhões de antigenios são capazes de induzir respostas de anticorpos cada anticorpo quase exclusivamente dirigido contra o antigenio particular que o induziu

Duas fontes principais de anticorpos ou vertebrados são presentemente utilizadas -- produção in situ pelos linfócitos B de mamíferos e produção em culturas de células por híbridos de células B. Os anticorpos são produzidos in situ como resultado da diferenciação dos linfócitos B imaturos em plasmocitos, a qual ocorre como respostas a estimulação por antigénios específicos. Nas células B indiferenciadas, as porções de DNA codificadoras das várias regiões das cadeias de imunoglobulinas estão se-4-

paradas no DNA genomico As sequências são montadas sequencialmente antes da expressão Uma revisão deste processo foi apresentada por Gough. Trends in Biochem Sei 6 203 (19 81)

O gene rearranjado resultante e capaz de ser expresso no linfocito B maduro para produzir o anticorpo pretendido No entanto mesmo quando um mamífero em particular e exposto a apenas um unico antigenio não resulta uma população uniforme de anticorpos A respostas imune in situ a qualquer antigenio particular e definida pelo mosaico de respostas a vários determinantes que estão presentes no antigenio Cada subserie de anticorpos homólogos surge de uma unica população de células B — portanto a geração in situ de anticorpos è policlonal .

Esta heterogeneidade limitada mas inerente foi ultrapassada em muitos casos particulares pela utilização da tecnologia de hibridomas para criar anticorpos monoclonais em culturas celulares por hibridomas de células B / Ver Kohler e Milstein. C nature 256 49 5-49 7 (19 75)_7

Neste processo os esplenocitos ou linfócitos com uma vida muito curta de um mamífero a que foi injectado antigenio são fundidos com uma linha de células de tumor imortais produzindo assim células hi\ bridas ou hibridomas'¹ os quais são imortais e capazes de produzir o anticorpo codificado geneticamente pela célula B Os híbridos assim formados são segregados em estirpes geneticas isoladas por selecção diluição e crescimento e cada estirpe representa assim uma unica linha genetica Eles produzem portanto anticorpos que seguramente são homogéneos contra um antigenio pretendido Estes anticorpos, referenciando os seus progenitores geneticamente puros , são designados monoclonais.

os anticorpos monoclonais com mono-especificidade influenciaram grandemente a imunologia a sua utilidade foi largamente demonstrada em ciências tais como a biologia, farmacologia, quimica e outras. Tais anticorpos monoclonais têm larga aplicação mas não sò como reagentes de diagnóstico (ver, por exemplo, Immunology for th* BO's Eds. Vollen, A.. Bartlett A., e Bidwell, D., MTP Press, Lancaeter (1981), mas também em terapia (ver, por exemplo Ritz , J. e Schlossman . S F. . Blood , 59 1-11 (19 82 ) 7

Os anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas se bem que teoricamente eficazes conforme discutido atras e claramente preferíveis aos anticorpos policlonias devido a sua especificidade sofrem de uma importante desvantagem Em muitas aplicações a utilização de anticorpos monoclonais produzidos em animais não humanos esta gravemente restringida quando os anticorpos monoclonais se destinam a seres humanos As injecções repetidas de um anticorpo estranho em humanos como seja anticorpo de ratinho pode conduzir a reacções de hipersensibilidade prejudiciais Tal anticorpo monoclonal não humano quando injectado em humanos provoca uma resposta anti-anticorpo não humano (ANHA). Para uma discussão de uma resposta ANAA espeeifica provocada por utilização de anticorpos murinos, resposta humana anti-anticorpos de ratinho (HAMA), ver Shawler et al., Journal of Immunology 135, 1530-1535 (19 89 ).

Pensa-se que imunoglobulinas animais tendo regiões constantes humanas originarão menos resposta ANHA quando injectadas em humanos do que imunoglobulinas animais tendo regiões contantes não humanas Como tal. pensa-se que os anticorpos monoclonais tendo boas afinidades de ligação para antigenios seleccionados e tendo regiões contsnates humanas possuem um maior potencial de utilização em diagnósticos e terapia imunologicos de pacientes humanos com cancro

Ate agora foram feitas varias tentativas para produzir anticorpos monoclonais de origem humana usando hibridomas humanos Por exemplo ja foram preparados hibridomas humano-humano /Olsson. L. et al Proc Natl Acad Sei (USA) 77. 5429 (19 80) 7; hibridomas humano-murino /TSchlom. J. et al (ibid) 77 6841 (19 80 )_7 e várias outras combinações xenognenicasefe híbridos. Também foram produzidos anticorpos monoclonais humanos pela transformação de linfòcitos usando o virus Epstein-Barr. No entant tais hibridomas podem potencialmente alojar virus humanos patogénicos. Como alternativa células B primárias produtoras de anticorpos foram imortalizadas in vitro por transformação com DNA virai. Infelizmente, as produções de anticorpos monoclonais a partir de linha celulares de hibridomas humanos são relativamente baixas (1 ug/ml em humano comparado com 100 ug/ml nos hibridomas de ratinho) e os custos de produção são devados

Se bem gue as imunoglobulinas humanas sejam altamente desejáveis em diagnostico imunologicp e terapia de pacientes humanos com cancro as técnicas de hibridomas humanos nào atingiram ainda a fase em que anticorpos monoclonais humanos com as especificidades antigenicas necessárias podem ser facilmente obtidos Em adição por razões obvias os investigadores não podem imunizar seres humanos com antigenios seleccionados toxicos ou de outro modo prejudiciais para gerar anticorpos contra o antigenio especifico Isto impõe grandes restrições ao diagnostico e terapia imunologicos de pacientes humanos

A produção de anticorpos monoclonais derivados de humanos è certamente possível mas è ainda pouco eficaz face a sua fraca reprodutibilidade e a outros problemas referidos atras. / Em adição, ver Nature 300, 316-317 (19 82 ) 7. Consequentemente, a maior parte dos anticorpos monoclonais derivam de animais não humanos.

E altamente desejável um anticorpo monoclonal que reaja com afinidade de ligação elevada a antigénios de tumores humanos mas que não seja reconhecido como substância estranha pelos humanos. Um método para ultrapassar esta dificuldade e criar artificialmente um anticorpo que seja muito semelhante a um anticorpo humano e que não seja reconhecido como substância estranha no corpo humano i e um anticorpo quimérico ou humanizado

Tipicamente nos anticorpos quiméricos a região variavel de ambas as cadeias leve e pesada assemelha-se as regiões variaveis de anticorpos derivados de uma especie de mamífero enquanto que as porções constantes são homologas as sequências de anticorpos derivados de humanos Uma vantagem obvia de tais formas quiméricas e que por exemplo as regiões variaveis podem convenientemente ser derivadas de fontes presentemente conhecidas usando hibridomas facilmente disponíveis de células B de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões contstantes derivadas , por exemplo , de preparações de células humanas. Se bem que a especificidade da região variável não seja afectada pela sua fonte, a região constante sendo humana com menos probabilidade induzirá uma resposta imune num indivíduo humano quando os anticorpos são injectados relativamente a uma região constante de uma fonte não humana

Um antigenio de tumores humanos conhecidos e a glicoproteina associada a tumores (TAG 72) TAG 72 esta associado a superfície de certas linhas de células tumorais de origem humana especificamente a linha de células tumorais LS174T LS174T / American Type Culture Collection (aqui ATCC) NQ CL 188 7 e uma variante da linha de adenocarcinoma do colon LS 180 (ATCC N2 Cl 187)

O cariotipo de LS174T e semelhante ao de LS180 sem um cromossoma X na maioria das celul os resultados foram apresentados como descrito em Johnson, V.G. et al. , Câncer Res. 46 , 850-857 (19 86), para caracterizar a molécula TAg72 como uma mucina. Esta conclusão baseia-se nas seguintes observações:

(a) TAG72 tem um peso molecular elevado (7 1x10^) como se mostra pela sua exclusão de uma coluna de Sepharose (b) a densidade de TAG 72 determinada por centrifugação de equilibrio em CsCl era de 1 45 g/ml indicando uma glicoproteina altamente glicosilada:

(c) TAG 72 apresenta uma alteração na migração apos digestão com neuraminidase indicando que e uma molécula altamente sialilada com uma abundância de oligossacaridos ligados O-glicosidicamente característica das mucinas;

(d) antigenios de grupos sanguineos normalmente encontrados em mucinas encontram-se também em TAG72 purificado por afinidade; e (e) a digestão em CHondroitinase ABC não tem efeito sobre TAG72, demonstrando assim que o epítopo TAG72 não è expresso num proteoglicano-sulfato de condroitina.

Foram já desenvolvidos numerosos anticorpos monoclonais murinos os quais possuem especificidade de ligação para TAG 72. Um destes anticorpos monoclonais, designado B72.3, é uma IgGl murina produzida pelo hibridoma B72.3 (ATCC NS HB-8108). B72.3 é um anticorpo monoclonal de primeira geração desenvolvido usando um extracto de carcinoma da mama humano como imunogénio (ver Colcher, D. et al. , proc. Natl. Acad . Sei. (USA) 78 . 3199-3203 (1981). e as Patentes U.S. 4 522 918 e 4 612 282). Conforme aqui è usada a expressão anticorpo monoclonal de primeira geração significa um anticorpo monoclonal produzido usando, como imunogénio. um extracto celular bruto.

Outros anticorpos monoclonais dirigidos contra TAG72 são designados CC (cancro do cólon) Os anticorpos monoclonais CC são uma familia de anticorpos monoclonais murinos de segunda geração. Tal como aqui é usada a expressão anticorpo monoclonal de segunda geração significa um anticorpo monoclonal produzido usando como imunogénio, um antigénio purificado com um anticorpo monoclonal de primeira geração. Os anticorpos monoclonais CC foram preparados usando TAG72 purificado com B72.3. Uma discussão do método para a produção de anticorpos CC está descrita no Pedido de Patente dos Estados Unidos 7-0 73 , 685 (USPA 7-0 73, 685), o pedido foi entregue por Schlom et al em 15 de Julho, 1987 e está disponivel ao público a partir do national Technical Information Service. Devido à suas afinidades de ligação a TAG72 relativamente boas, os anticorpos CC que se seguem foram depositados na ATCC. tendo sido requerido acesso restringido: CC49 (ATCC NS HB 9459); CC83 (ATCC NS HB 9453); CC46 (ATCC NS HB 9458); CC92 (ATCC NS HB 9 454); CC30 (ATCC NS HB 9 45 7); CC11 (ATCC No .9 455); e CC15 (ATCC No. HB9460)..

Tanto quanto se sabe não foi isolado um anticorpo humano que se ligue de um modo relativamente forte a TAG72 Consequentemente devem ser conseguidos anticorpos adequados í E conhecido que a função de uma molécula de Ig depende da sua estrutura tridimensional , a qual por sua vez depende da sua sequência primaria de amino ácidos. Assim, alterando a sequência de aminoãcidos de uma Ig pode-se afectar de modo adverso a sua actividade. Ainda, uma alteração na sequência de DNA codificadora da Ig pode afectar a capacidade da célula contendo a sequência de DNA para expressar, secretar ou montar Ig

USPA 7-73 685 ensina que os anticorpos CC podem ser alterados para a sua forma quimérica substituindo e g domínios de regiões constantes de ratinho (Fc) por regiões constantes humanas através de técnicas de DNA recombinante bem conhecidas Pensa-se que os objectivos estabelecidos em USPA 7-0 73 685 não levaram a uma tentativa real para expressar quaisquer cadeias polipeptidicas quiméricas de Ig nem para produzir actividade de Ig nem para secretar e montar cadeias de Ig nas Igs quiméricas pretendidas

Não e pois totalmente claro da literatura que técnicas de DNA recombinante conhecidas sejam de rotina usadas na promoção de um anticorpo quimérico animal-humano a partir de fontes de DNA seleccionadas dando origem a anticorpos quiméricos funcionais que se liguem especificamente a carcinomas humanos seleccionados e que reduzem a iniciação de efeitos secundários tipo ANHA quando injectados em humanos.

Surpreendentemente ο presente invento e capaz de satisfazer muitas das necessidades atras referidas e proporciona um método para a produção dos anticorpos pretendidos Por exemplo o presente invento proporciona um método para fundir genes codificadores de pelo menos uma parte de uma Ig animal que se liga a carcinomas humanos expressando TAG72 e genes codificadores de pelo menos parte de uma Ig humana 0 presente invento proporciona também um método para se conseguir a expressão de proteinas que podem ser secretadas e montadas para dar um anticorpo quimérico funcional.

Ainda, o presente invento proporciona um vector de expressão contendo uma sequência de DNA que codifica anticorpos e fracções deles as quais são dirigidos contra TAG72 .

presente invento também proporciona células transformantes com vectores de expressão contendo uma sequência de DNA que codifica anticorpos e fracções deles os quais são dirigidos contra TAG72

Finalmente o presente invento proporciona novos anticorpos para usar em ensaios de diagnostico in vivo; terapia in vivo: e cirurgia radioimunoguiada

Consequentemente este invento esta relacionado com um anticorpo ou fragmento de anticorpo compreendendo uma região variavel tendo uma cadeia leve (V^) e uma cadeia pesada (V_H) a referida V_H sendo codificada por uma sequência de DNA homologa do gene germinal TAG

Π (VH<?<TAG) como se mostra na Figura 2 em que a região variavel se liga a TAG72 pelo menos mais de 25% do que a região variável de B72.3 se liga a TAG72 . com as afinidades de ligação do anticorpo e B72.3 sendo medidos pela mesma técnica.

Este invento também diz respeito a uma sequência de DNA codificadora de pelo menos uma fracção de uma cadeia pesada de anticorpo, a referida sequên cia compreendendo um segmento de sequência de DNA homologo do gene germinal V °<-TAG (V ^TAG) em que o segmento de seΠ quência de DNA codifica pelo menos uma fracção de uma região variavel da cadeia pesada (V„)

Π

Ainda o invento diz respeito a uma sequência de DNA compreendendo:

(A) um segmento da sequência codificador de uma cadeia pesada o referido segmento da sequência tendo:

(1) um subsegoento da sequência homologo do gene germinal TAG (V_h°<TAG), em que o segmento da sequência de DNA codifica pelo menos uma fracção de uma V e

Π (2) um subsequente da sequência codificador de pelo menos uma fracção de uma C · e

Π (B) um segmento da sequência codoficador de uma cadeia leve o referido segmento da cadeia tendo:

(1) um subsegmento da sequência codificador de pelo menos uma fracção de uma região variavel de cadeia leve animal (VL) e (2) um subsegmento da sequência codificador de pelo menos

uma fracção de uma região constante da cadeia leve humana (C ) em que o anticorpo codificado pela sequência de DNA se liga a TAG72 pelo menos 25% mais do que a região variavel de B72.3 se liga a TAG72 . com as afinidades de ligação do anticorpo e de B72.3 sendo medidas pela mesma técnica.

invento ainda inclui o anticorpo atrás referido sòzinho ou conjugado com uma marca visualizadora ou agente terapêutico. 0 invento também inclui uma composição compreendendo o anticorpo atrás referido na forma não conjugada ou conjugada num veiculo não tóxico, farmaceuticamente aceitável e estéril.

O invento também e dirigido a um método para o diagnostico in vivo de cancro que se caracteriza pela administração a um animal de uma quantidade farmacêuticamente eficaz da composição atras referida para a detecção in situ de lesões de carcinoma invento e também dirigido a um método para a terapia intraoperativa que se caracteriza por (a) administração a um animal de uma quantidade farmacêuticamente eficaz da referida composição pela qual os tumores são localizados e (b) excisão dos tumores localizados

Em adição. o invento também diz respeito a um processo para a preparação de vários anticorpos ou fragmentos de anticorpos. seus conjugados um veiculo de expressão recombinante adequado e a inserção num hospedeiro adequado. Alguns destes processos são expressos como se segue.

□m processo para a preparação de um anticorpo ou fragmento de anticorpo caracterizado

por se pôr em contacto uma região com uma região para formar uma região variável do anticorpo ou fragmento de anticorpo. Um processo para a preparação de um conjugado de anticorpo ou fragmento de anticorpo caracterizado por se pôr em contacto um anticorpo ou fragmento de anticorpo com uma marca visualizadora ou agente terapêutico Um processo para a preparação de um veiculo de expressão recombinante caracterizado pela inserção de uma sequência de DNA num veiculo de expressão Um processo para a preparação de um hospedeiro transformado caracterizado pela inserção do plasmídeo num hospedeiro adequado

Noutros aspectos o invento e dirigido para DNA que codifica os anticorpos atras referidos e seus fragmentos assim como para vectores de expressão ou plasmideos capazes de efectuar a produção de tais imunoglobulinas em células hospedeiras adequadas . Ele inclui as células hospedeiras e culturas celulares que resultam da transformação com estes vectores .

Descrição dos Desenhos

Figura 1 ilustra a estrutura básica de uma imunoglobulina com os sitios de clivagem enzimàtica indicados.

Figura 2 ilustra as sequências de nucleotideos de V de V_u TAG. V„ de CC46 . V„ de CC49 ,

Π Π Π Π

V„ de CC83 e V„ de CCS 2

Π Π

Figura 3 ilustra as sequências de aminoacidos de V de V„ TAG V„ de CC46 V_u de n ri η π

CC49 V_u de CC83 e V_u de CC9 2 η M

Figura 4 ilustra a sequência de nucleotideos e a Figura 4b ilustra a correspondente sequência de aminoacidos de V de CC49

Li

Figura 5a ilustra a sequência de nucleotideos e Figura 5b ilustra a correspondente sequência de aminoácidos da V de CC83.

L

Figura 6a ilustra a sequência de nucleotideos e Figura 6b ilustra a correspondente sequência de aminoácidos da V de CC9 2.

Li

Figura 7 ilustra a sequência de nucleotideos do fragmento HindIII-PstI isolado a partir do plasmídeo pGDl

Figura 8 ilustra o mapa do plasmideo pBLVESCRIPT SK(-)

Figura 9 ilustra o mapa do plasmideo pRLlOl.

Figura 10 ilustra um mapa de enzimas de restrição da inserção de DNA genòmico da cadeia L de CC49 em pRLlOl.

Figura 11 ilustra o mapa do plasmideo pRL200.

Figura 12 ilustra um mapa de enzimas de restrição da inserção do DNA genomico da cadeia L de CC83 em pRL200

Figura 13 ilustra a sequência de nucleotideos do fragmento Eco RI-BamHI isolado a partir do plasmideo pNP9

Figura 14 ilustra o mapa do plasmideo pHH49

Figura 15 ilustra o mapa do plasmideo pH583.

Figura 16 mostra a sequência de nucleotideos da de CC49 . com os segmentos sublinhados mostrando as sequências derivadas usando os oligonucleotideos iniciadores em mRNA.

Figura 17 mostra a sequência de nucleotideos da de CC83 com os segmentos sublinhados mostrando as sequências derivadas usando oligonucleotideos iniciadores em mRNA

Figura 18 mostra a sequência de aminoácidos da de CC49 com os segmentos sublinhados mostrando as sequências determinados por sequenciação de proteina

Figura 19 mostra a sequência de aminoácidos da V_H de CC83 com os segmentos sublinhados mostrando as sequências determinadas por sequenciação de proteina .

Figura 20 mostra os resultados de um gel de SDS-poliacrilamida com os resultados do tratamento do anticorpo CC83 com PNGase F.

Figura 21	ilustra	o	mapa
de enzimas de restrição da gama 1, gama humanas.	2 , gama	3	e gama 4
Figura 22 plasmideo pSV2gpt/R/B	ilustra	o	mapa	do
Figura 23 do plasmideo pSV2gpt-\ 1-7 8	ilustra	o	mapa
Figura 24 plasmideo pSV2gpt-Y' 1-2 3	ilustra	o	mapa	do

Figura 25 ilustra o mapa do plasmideo pSV2gpt- Y2

Figura 26 ilustra o mapa do plasmídeo pSV2gpt-/3

Figura 27 ilustra o mapa do plasmídeo pSV2gpt~Y 4.

Figura 28 ilustra o mapa do plasmideo p49Yl-7.8.

Figura 29 ilustra o mapa do plasmideo p49 γΐ-2.3.

Figura 30 ilustra o mapa do plasmideo p49 - γ 2

Figura 31 ilustra o mapa do plasmideo p49 - Y 3

Figura 32 ilustra o mapa do plasmideo p49~Y4

Figura 33 ilustra o mapa do plasmideo ρ83γΐ-7 8

Figura 34 ilustra o mapa do plasmideo p83 )fl-2.3

Figura 35 ilustra o mapa do plasmideo ρ83~γ2.

Figura 36 ilustra o mapa do plasmídeo p83- 3

Figura 37 ilustra o mapa do plasmídeo p83- 4

Figura 38 ilustra a reacção global para a obtenção por engenharia genetica dos genes híbridos baseada no método de Horton et al gene 77 61 (19 89 )

Figuras 39 A 39 B e 39 C mostram a biodistribuição e retenção global do corpo para CH44-1.

Figuras 40A e 40B mostram a biodistribuição e retenção global do corpo para CH84-1.

A imunoglobulina deste invento foi desenvolvida face aos problemas postos pelos anticorpos monoclonais murinos descritos noutros trabalhos.

Ela caracteriza-se por possuir uma estrutura quimérica composta por uma região variavel da cadeia pesada codificada pelo DNA derivado do V oÓTAG.

Π

Definições:

Conforme aqui é usado imunoglobulina refere-se a um tetrâmero ou seus agregados em que a actividade imuno-reactiva especifica pode ou não estar presente. Anticorpos refere-se a estruturas que têm uma importante actividade imuno-reactiva especifica conhecida contra um antigenio compreendendo cadeias leves e pesadaí com ou sem ligação covalente entre eles: Imunoglobulina não especifica (NSI) pretende incluir as imunoglobulinas que não possuem especificidade conhecida para um antigenio

A unidade estrutural basica da imunoglobulina em sistemas vertebrados esta relativamente bem compreendida /~Edelman G Μ Ann N Y Acad Sei 190 5 (19 71)_7 Como se vê na Figura 1 as unidades são compostas por duas cadeias polipeptidicas leves idênticas com um peso molecular de aproximadamente 23000 daltons e duas cadeias pesadas idênticas de peso molecular 53000-70000 . As quatro cadeias estão ligadas por pontes dissulfureto numa configuração Y em que as cadeias leves acompanham as cadeias pesadas começando na boca do Y e continuando ao longo da região de diversidade.

As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou epsilar, com algumas si|b unidades entre elas A natureza desta cadeia , uma vez que tem uma região constante: grande, determina a classe do anticorpo como sendo IgA, IgD, IgE. IgG ou IgM ficadas como kapa (k) ou pesada pode estar ligada Em geral as cadeias leve

As cadeias leves são classilambda ( ) Cada classe de cadeia a uma cadeia leve kapa ou lambda e pesada estão covalentemente

ligadas uma a outra e as porções cauda das duas cadeias pesadas estão ligadas uma a outra por ligações covalentes dissulfureto quando as imunoglobulinas são produzidas por hibridomas ou por células B No entanto se ocorrer associação não covalente das cadeias na geometria correcta. o agregado de cadeias não ligadas por pontes dissulfureto mantém a capacidade de reagir com o antigenio.

As sequências de aminoácidos vão de um extremo N nas pontas da bifurcação do Y até ao extremo C no final de cada cadeia. No extremo N existe uma região variável e no extremo C existe uma região constante .

Os termos constante e varia vel são em termos funcionais As regiões variaveis das cadeias leve (V^) e pesada (V_H) determinam o reconhecimento da ligação e a especificidade para o antigenio Os dominios da região constante das cadeias leve (C ) e pesada (C„) conferem propriedades biológicas importantes tais como associação de cadeias de anticorpos secreção mobilidade transplacentaria e ligação do complemento

A região variavel esta ligada em cada uma das cadeias a região constante por uma ligação que liga a sequência V do gene e a sequência C do gene A ligação ocorre ao nivel genomico combinando sequências de nucleotideos via sitios de recombinação. A sequência de ligação é conhecida normalmente como uma sequência J no gene da cadeia leve, a qual codifica cerca de 12 aminoácidos e como uma combinação de uma sequência D e uma sequência J no gene da cadeia pesada, as quais em conjunto codificam aproximadamente 26 aminoácidos.

Anticorpo quimérico para os fins deste invento refere-se a um anticorpo tendo na cadeia

pesada uma sequência de aminoácidos da região variável codificada por uma sequência de nucleotideos derivada de um gene germinal murino e sequências de aminoácidos de uma região constante codificadas por uma sequência de nucleotideos derivada de um gene humano

No entanto o presente invento não pretende estar limitado a mera substituição de sequências de genes C animais codificadoras de regiões constantes de imunoglobulinas por sequências de genes humanos codificadores de regiões constantes de imunoglobulinas Assim o presente invento não esta limitado ao ponto de fusão estar ou não na fronteira variavel/constante

Através de varias técnicas e agora possível produzir anticorpos quiméricos alterados, anticorpos quiméricos compostos e fragmentos de anticorpos quiméricos codificados por sequências de nucleotideos aqui descritas.

As imunoglobulinas compostas compreendem regiões polipeptidicas variaveis até agora não encontradas associadas na aatureza. Não e critico se elas est ou não covalentemente agregadas desde que a agregação permita a reacção selectiva com um antigenio particular ou familiê de antigénios ão

Anticorpos alterados¹’ significa anticorpos em que as sequências de aminoácidos particular mente na região variavel foi alterada Devido a importância das técnicas de DNA recombinante para este invento não e necessário a restrição a sequências de aminoácidos de anticorpos seleccionados de fontes naturais As variações possíveis são muitas e a gama de alterações vai desde um a alguns aminoácidos ate uma remodelação completa de uma região cons-23-

tante e/ou variável do anticorpo.

As alterações na região variável serão feitas no sentido de melhorar as características de ligação ao antigenio. As alterações na região constante serão feitas em geral para melhorar as características dos processos celulares, tais como fixação do complemento, interacção com membranas e outras funções efectoras. As alterações podem ser feitas por técnicas recombinantes convencionais e também por técnicas de mutagenese dirigida com oligonucleotideos /DabbadieMcFarland et al , Proc Natl. Acad Sei (USA) 79_ 6409 (19 82 )7

Os “fragmentos das imunoglobulinas incluem segmentos de uma molécula de anticorpo obtidos por clivagem proteolitica ou preparados por via recombinante os quais são capazes de reagir selectivamente com um antigenio particular ou família de antigenios São exemplos não limitantes de tais fragmentos proteoliticos e/ou recombinantes Fab......F(ab )e Fab estando os seus sitios de clivagem proteolitica apresentados na Figura 1; assim como Fv As técnicas recombinantes para a produção de fragmentos Fv estão descritas em WO 88/01649 ,

WO 88/06630, WO 88/0 7085, WO 88/0 7086 e WO 88/09 344.

Neste invento animais pretende incluir bovinos, porcinos, roedores e primatas, incluindo humanos e outros.

Vector de expressão é uma definição funcional de qualquer sequência de DNA que seja capaz de efectuar a expressão de um codigo de DNA especifico num hospedeiro adequado presentemente tais vectores são frequentemente na forma de plasmídeos; assim plasmideo e vector de expressão são muitas vezes usados indiscrimi-24-

nadamente No entanto o invento pretende incluir outras formas de vectores de expressão que tenham função equivalentes e que possam de tempos a tempos tornarem-se conhecidos

Por transformação pretende-se significar a introdução de DNA numa célula hospedeira recipiente a qual modifica o genòtipo e consequentemente resulta numa alteração da célula recipiente.

Células hospedeiras refere-se a células que foram transformadas por via recombinante usando vectores construídos através de técnicas de DNA recombinante. Conforme aqui definido o anticorpo ou sua modificação produzido por uma célula hospedeira e devido a esta transformação.

Nas descrições de processos para o isolamento de anticorpos a partir de hospedeiros recombinantes os termos célula e cultura de células são usados indiscriminadamente para significar a fonte de anticorpo a menos que de outro modo seja especificado Por outras palavras a recuperação do anticorpo a partir das células pode significar a partir de um sedimento de células totais ou a partir de uma cultura de células contendo o meio e as células resuspensas

Abreviaturas:

Ácidos nucleicos aminoácidos peptideos. grupos protectores grupos activos e funções semelhantes . quando abreviadas são abreviadas de acordo com a IUPACIUB (Commission on Biogical Nomemclature) ou com o que normalmente e usado nas aguas respectivas Seguem-se alguns exemplos

Reagentes

EDTA: Acido etilenodiaminotetracetico

SDS: Dodecilsulfato de sodio

Ácidos nucleicos

RNA: Ácido ribonucleico

DNA: Acido desoxirribonucleico

-26Bases azotadas

Purinos

A; Adenina

Pirimidinas

T: Timina

G: Guanina

C: Citosina

U: Uracilo

O DNA e o RNA contem cadeias longas de ácido fosfórico, um açúcar e bases azotadas. 0 DNA è uma hélice de cadeia dupla . em que o açúcar e 2-desoxirribose, enquanto que o RNA tem uma unica cadeia em que o açúcar e D-ribose A quatro bases azotadas que caracterizam os nucleotideos do DNA estão ligadas em pares complementares por ligações de hidrogénio para formar a dupla helice de DNA: adenina e ligada a timina: guanina e ligada a citosina NO RNA a timidina e substituída por uracilo nos pares do DNA referidos

-2 7-

Aminoacidos

Gli :	glicina	Fen :	fenilalanina
Ala:	alanina	Tir:	tirosina
Vai:	valina	Tre:	treonina
Leu:	leucina	Cis:	cisteina
Ile:	isoleucina	Met:	metionina
Ser:	serina	Glu:	ácido glutâmico
Asp:	acido aspàrtico	Trp:	triptof ano
His:	hisina	Pro:	prolina
Arg:	arginina	Asn:	asparagina
His:	histidina	Glu:	glutamina

Região variavel

DNA codificador da cadeia pesada consiste numa sequência do gene V uma sequência

Π do gene D„ e uma sequência do gene J„ 0 DNA codificador π n da cadeia leve consiste numa sequência do gene V e numa L sequência do gene J

Li

Sequência do gene V

Π

O presente invento è dirigido a anticorpos quiméricos seleccionados tendo a região V„

Π codificada por uma sequência de DNA derivada de um gene germinal que reage especificamente com TAG72 (V_ucZ.TAG)

Π cuja sequência está descrita na Figura 2. Os anticorpos quiméricos são seleccionados com base na sua capacidade para se ligarem a TAG72 nomeadamente quando a região variável se liga a TAG72 pelo menos 25 por cento mais do que a região variavel de B72 3 se liga a TAG72 Geralmente as afinidades de ligação do anticorpo quimérico e B72 3 são medidas pela mesma técnica São exemplos de técnicas para medição da afinidade de ligação do anticorpo as descritas nas seguintes referências: Scatchard G Annals of N Y Acad of Sciences 51 660 (19 49 ) ; Steward M W e Petty

R E Immunology 23 881 (19 72): Huraro R et al Câncer

Research 48 4588 (1988); e Heyman B J of Immunol

Methods 68_ 19 3-20 4 (19 84)

Alguém familiarizado com a matéria vera que, como resultado do presente invento, nomeadamente a sequência de nucleotideos de V_uiX^TAG (assim como a

Π sequência de aminoácidos por ela codificada), o presente invento destina-se a incluir sequências de nucleotideos eficazmente homólogos e correspondentes sequências de aminoácidos. Eficazmente homólogo refere-se a identidade ou quase identidade das sequências de nucleotideos ou de aminoácidos Assim, nesta divulgação compreender-se-a que possam existir pequenas variações das sequências dentro das sequências homologas e que quaisquer sequências tendo pelo menos 80% de homologia sejam praticamente equivalentes

A homologia e expressa como a fracção ou percentagem de bases coincidentes (ou aminoácidos) apos duas sequências (possivelmente de tamanho diferente) terem sido alinhadas 0 termo alinhamento e usado no sentido definido por Sankoff e Kruskal no Capitulo do seu livro The Time Warps String Edits and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Addison-Wesley Reading MA (1983) Resumidamente duas sequências são alinhadas de modo a tornar máximo o numero de bases coincidentes (ou aminoácidos) entre as duas sequências com a inserção de um numero mínimo de bases em branco ou nulas ou ambas as sequências de modo a obter-se a maxima sobreposição.

Como é conhecido podem ocorrer diferenças na terceira base do codão sem que cause substituiç ções de aminoácidos na sequência polipeptidica final. Também podem ser toleradas pequenas modificações nos nucleotideos (e.g. substituições, inserções ou delecções) em certas regiões da sequência do gene e são consideradas significantes sempre que tais modificações resultem em alterações da sequêr cia de aminoácidos que não alterem a função do produto final Foi demonstrado que copias das sequências geneticas na sua totalidade ou apenas partes obtidas por sintese química podem substituir as correspondentes regiões no gene natural sem perda da função do gene os homologos cfe sequências de DNA especificas podem ser identificadas usando o teste de hibridação cruzada de ácidos nucleicos em condições de restrição conforme e conhecido na area / como descrito em Nucleic Acid Hybridization Hames e Higgens (eds) IRL Press Oxford. UK (1985)_7 dadas duas sequências existem algoritmos para fazer a analise da sua homologia por computadores: e.g. Needleham e Wanseh . J. Mol. Biol., 48 , 443-453 (19 70 ); e Sankoff e Kruskal (citado atras) páginas 23 - 29.

Tambêm existem serviços comerciais para efectuarem tais comparações e g Intelligenetics Inc. (Paio Alto CA)

Sequências dos genes D e J„

Π tt

Os segmentos dos genes D_u e J„

Π Π existem em vários tipos se bem que o tipo de segmento do ge: D ou J seleccionado não seja critico para este invento. Ou seja e podem ser derivados de qualquer animal. os animais preferidos incluem ratinhos e o homem. Obviamente os segmentos dos genes humanos D_u e/ou são particularmente preferidos, mas o invento não está por este motivo limitado se um segmento do gene D ou J de uma outra espécie animal proporcionar uma propriedade importante, i.e. aumentar a ligação a TAG 72.

Exemplos de sequências murinas e J_H estão descritos em Organization, Structure and

Assembly of Immunoglobulin Heavy Chain Diversity DNA Segments Kurosawa and Tonegawa J Exp med 155 201 (19 82 ); e

Sequences of the Joining Region Genes for Immunoglobulin Heavy Chains and Their Role in generation of Antibody Diversity Gough and Bernard proc natl Acad Sei (USA) 78 509 (19 81)

Exemplos de sequências humanas D_h e estão descritas num artigo intitulado Human Immunoglobulin D Segments encoded in Tandem Multigenetic Families de Siebenlist et al em Nature 29 4 631 (19 81); e eiesiplos de sequências humanas estão descritas em Structure of

the Human Immunoglobulin μ Locus: Characterization of Embryonic and Rearranged J and D genes de Ravetach et al. Cell 27, 583 (19 81) .

Sequências dos genes V e J.

Li L

De um modo geral podem ser empregues quaisquer sequências dos genes V e J que codiL» L· fiquem uma fracção de uma V complementar da V„ codificada Li Π por uma sequência de nucleotideos eficazmente homologa de TAG Por complementar^-' entende-se uma que se ligue a V_H e que dê uma região variavel de anticorpo tendo uma afinidade de ligação de pelo menos mais 25% do que B72 3 conforme medido por qualquer técnica convencional para a medição de constantes de afinidades de ligação.

O tipo de segmento de gene e seleccionado não è critico para o invento. Ou seja ^VL ^{e d}L P°^{dem ser} derivados de qualquer animal, os animais preferidos incluem o ratinho e o homem. Obviamente, são particularmente preferidos os segmentos dos genes V e/ou J_L humanos, mas o invento não lhes esta limitado se um segmento do gene de uma outra espécie proporcionar uma propriedade importante i e aumento da ligação a TAG72 .

Sequências murinas estão descritas num artigo intitulado The nucleotide Sequence of a 5 5-Kilobase DNA Segment Containing the House Kappa Immunoglobulin of an C Region Genes de Max et al em J Biol Chem 256 5116-5120 (1981) As sequências humanas

estão descritas num artigo intitulado Evolution of Human Immunoglobulin K J Regions Genes de Heiter et al em The Journal of Biological Chemistry 357 (2). 1516-1522 (19 82 ) .

flericação das Regiões Variáveis

Face ao que foi dito atras torna-se agora pqssivel realizar numerosas derivações especif cas das regiões variaveis dos anticorpos dentro do âmbito do presente invento i e tendo sequências V„ eficazmente

Π homologas de 'A-TAG e que se ligam a TAG72 pelo menos mais 25% do que a região variavel de B72 3 se liga a TAG72 com as afinidades de ligação ao anticorpo e de 372 3 sendo medidas pela mesma técnica Estão estabelecidas abaixo varias técnicas possíveis

Regiões variaveis produzidas naturalmente

Como resposta a um imunogènio TAG72, um animal imunizado expandirá células B produtoras de anticorpos seleccionados. A região variável dos anticorpos produzidos pelas células B será codificada pelo DNA germinal das cadeias leve e pesada rearranjado Por exemplo, a cadeia pesada germinal rearranjada incluirá os segmentos dos genes V, D e J incluindo a sequência lider. assim como quaisquer intrões que possam ser subsequentemente removidos

Poderá resultar variabilidade a partir das mutações somáticas que ocorram numa célula B durante o rearranjo do V^O^TAG. Estas mutações somáticas são trocas de nucleotideos que podem ou não resultar numa troca de aminoácidos que altere a actividade contra TAG72 da V_H produtivamente rearranjada.

Técnicas de despiste

Os anticorpos monoclonais ou policlonais podem ser detectados determinando quais dos referidos anticorpos se ligam selectivamente a TAG72. Este despiste pode ser conseguido através de qualquer um de uma série de processos bem conhecidos, tais como radioimunoensaio em fase sólida, ensaios com imunoadsorventes ligados a enzimas, ensaios de formação de rosetas e ensaios de bloqueio.

Os processos atrás referidos são bem conhecidos na área.

As sequências de nucleotideos codificadores das regiões variáveis dos anticorpos produzidos a partir do rearranjo produtivo da V„t><TAG foram agora conΠ seguidos. Além da sequência de nucleotideos de V„ (XJTAG. a

Π

Figura 2 também mostra as sequências de rrcleotideos codificadores das regiões variáveis das cadeias pesadas dos anticorpos CC46. CC49 . CC83 e CCS 2 respectivamente. A Figura 3 mostra as sequências de aminoácidos de V de V_uo< TAG, V„ η π n de CC46. de CC49 . de CC83 e V_H de CCS 2 . correspondendo às sequências de nucleotideos descritas na Figura 2. Uma crjnparação das sequências de nucleotideos e de aminoácidos da V_H de V_H TAG, V_{R de} CC46. V_H de CC49 , V_H de CCS 2 mostra

uma caracteristica importante que é a semelhança extraordinária entre as cadeias.

A semelhança relativa do

DNA codificadora das regiões V„ de CC46 , V„ de CC49 , V„ de π π π

CC83 e V_H de CC9 2 , particularmente no segmento delimitante 5', prova que aquelas sequências de DNA derivam de V„ ^TAG.

Π

As mutações somáticas que ocorrem durante o rearranjo produtivo do gene da região V_u a ser expresso numa célula B

Π dão origem a algumas alterações que podem ou não resultar numa troca de aminoacidos homologa entre dois hibridomas produtores de V„ot TAG rearranjado

Π

As sequências de nucleotideos e as correspondentes sequências de aminoacidos de V de Li

CC49 estão apresentadas nas Figuras 4a e 4b respectivamente As sequências de nucleotideos e as correspondentes sequências de aminoacidos de de CC83 estão apresentados na Figura 5a e 5b respectivamente As sequências de nucleotideos e as correspondentes sequências de aminoacidos da V de CC92

Li estão apresentadas nas Figuras 6a e 6b respectivamente

Técnicas com sondas:

Outros anticorpos codificados por DNA derivado de TAG podem ser derivatizados usando

V_Hc/· TAG como sonda de hibridação. geralmente, uma sonda feita a partir do DNA ou RNA de V„ &CTAG ou de genes rearranΠ jados contendo a TAG recombinada poderá ser usada pelos familiarizados com a matéria para encontrar genes homologos em hibridomas desconhecidos Tais anticorpos homologos terão uma sequência de DNA cujo mRNA hibrida com a sonda de todo

ou parte do gene germinal V_u 0( TAG e suas regiões delimitantes

Π

Por regiões delimitantes pretende-se significar as sequências de DNA do extremo 5 da V„ e<TAG ate ao extremo 3 do gene

Π a montante e do extremo 3 de ^TAG ate ao extremo 5 do gene a jusante

Regiões variáveis sintetizadas de modo racional

Uma outra abordagem e a sintese racional de regiões variaveis alteradas dos anticorpos aqui divulgados assim como dos anticorpos cfescobertos com o auxilio de sondas Tal abordagem tem varias vantagens potenciais Nomeadamente um investigador não tera de fazer o despiste de animais hospedeiros imunizados tentando primeiro pescar os anticorpos que se ligam a TAG e em seguida pescar os anticorpos que especificamente possuem regiões codificadas pelo DNA derivado de V„ /TAG

Π

Técnicas mutagenicas

Os segmentos dos genes V

Π e/ou podem ser alterados por mutagénese. Como exemplo pode-se referir a adição, delecção ou substituição não conser vativa, de um número limitado de vários nucleotideos ou a substituição conservativa de muitos nucleotideos, desde que seja mantida a grelha de leitura correcta.

Pode-se combinar substituições , delecções. inserções ou quaisquer subcombinações para se chegar a uma construção final. Uma vez que existem 64 possiveis sequências de codões mas apenas vinte aminoácidos conhecidos . o código genético è degenerado no sentido de diferentes codões poderem dar o mesmo aminoácido. No entanto o codigo è preciso para cada aminoãcido; assim existe pelo menos um codão para cada aminoácido i.e.. cada codão dá um único aminoãcido e nenhum outro. E óbvio que durante a tradução deve ser mantida a grelha de leitura correcta para se obter a sequência de aminoãcidos correcta no polipeptideo final produzido.

São bem conhecidas as técnicas para adição em posições de aminoãcidos préviamente determinad;. tendo uma sequência conhecida. Técnicas exemplificativas incluem mutagénese dirigida mediada por oligonucleotideos e reacção com polimerases de cadeias.

As técnicas para as delecções em posições de aminoácidos pré-determinados tendo uma sequência conhecida são do conhecimento geral. Técnicas exemplificativas incluem mutagenese dirigida e a técnica de reacção com polimerases de cadeias.

A mutagenese dirigida com oligonucleotideos essencialmente envolve hibridação de um oligonucleotideo codificador de uma mutação pretendida com uma cadeia simples de DNA contendo a região a ser mutagenizad; e usando a cadeia simples como molde para o prolongamento do oligonucleotideo para produzir uma cadeia contendo a mutação. Esta técnica, em várias formas, está descrita por Zoller M.J. e Smith, M., Nucleic Acids Res. 10 , 6487-6500 (19 82); Norris, K., Norris, F., Christiansen, L. e Fiii, N., Nuc.

Acid . Res. 11 , 5103-5112 (1983); Zoller, M.J. e Smith M.,

DNA 2, 473-488 (19 81); Kramer, W. , Schughart, K e Fritz, W.

-3 7-

J., Nuc. Acids Res. 10_, 64 75-6485 (19 82).

A reacção de cadeias com polimerase (PCR) essencialmente envolve a amplificação exponencial de DNA in vitro usando oligonucleotideos ou uma sequência especifica os oligonucleotideos podem incorporar alterações de sequências caso se pretenda A técnica da reacção de cadeias com polimerase esta descrita em Mullis e Faloona. meth Enz 155 335-350 (19 8 7) Exemplos de mútagenese usando PCR estão descritos em Higuchi et al Nucleic Acids Res 16 7351-736 7 (19 88) Ho et al Gene 17 51-59 (1989) e Engineering Hybrid Restriction genes without the use of Restriction Enzymesi Gene Splicing by Overlap Extension Horton et al gene 7 7 61 (19 89 )

A alteração das regiões variáveis dos anticorpos pode ser particularmente util quando da aplicação terapêutica dos anticorpos monoclonais. presentemente, quando um anticorpo quimérico compreendendo um domínio variavel completo de ratinho è injectado num ser humano o sistema imunologico humano reconhece como estranho o domini variavíel de ratinho . se bem que menos do que um anticorpo murino completo, e produz uma resposta imune contra ele. Assim, em subsequentes injecções do anticorpo de ratinho ou do anticorpo quimérico num ser humano, a sua eficacia e consideravelmente reduzida pela acção do sistema imune do corpo contra o anticorpo estranho Consequentemente alterações das regiões e murinas poderá reduzir a resposta imune humana contra o anticorpo alterado

Tecnicas recombinantes

Os anticorpos podem ser construídos por técnicas recombinantes. Por outras palavras, devido à disponibilidade cte sequências de nucleotideos das várias regiões codificadoras de V e de V um especialista na matéria poderá produzir in vitro um gene completo codificador das regiões da cadeia pesada e leve.

gene construído pode ser conseguido de modo a que segmentos seleccionados dos genes ^Dh ^{θ es}'^te3^{am em} combinação funcional com um segmento do gene V seleccionado i e . o segmento V„ TAG ou o segmento

Π Π do gene V„ de CC49 ou de CC83

Π

Por exemplo o DNA codificador de cadeia pesada construído incluirá sequências dos genes e que sejam contíguas com o extremo 3 do segmento de gene TAG germinal completando assim o cDR3 e o esqueleto (framework) (FR) 4 do domínio V„ Poderá existir

Π uma sequêçia lider que poderá ser subsequentemente removida

Dependendo da cadeia leve empregue. poderá ser também necessário arranjar um DNA codificador de cadeia leve construído tal DNA compreendera um segmento de gene em combinação funcional, e.g., contiguo com um segmento do gene J , incluindo a sequência lider que ti pode ser subsequentemente removida . 0 segmento do gene J

Li variará de acordo com a cadeia leve ser do sistema lambda ou kapa. A sequência da região J é contigua com o extremo do exão V para completar FR4 do dominio V . tal construção pode ser efectuada através das técnicas usadas para construir o gene V„.

fl

O gene construído pode ser manipulado através de técnicas recombinantes convencionais por exemplo para se conseguir uma inserção do gene num plasmideo capaz de efectuar a expressão. A partir daqui os plasmideos podem ser expressos em células hospedeiras. Estão descritos a seguir exemplos de técnicas de biologia recombinantes

Ao arranjar-se um fragmento codificador de uma região variavel de cadeia leve ou da cadeia pesada sera normalmente desejável incluir todo ou parte do intrão a jusante da região J particularmente sempre que a região variavel derive do hospedeiro em que o gene fundido vai ser expresso Se se mantiver o intrão sera necessário que hajam sequências aceitadoras e dadoras de “splicing” nos extremos do intrão 0 intrão entre a região J e a região constante do gene fundido pode ser basicamente a sequência de intrão associada com (1) a região constante (2) o domínio J ou (3) fraeções de cada uma Esta ultima pode ser uma questão de conveniência sempre que exista um sitio de restrição util nos intrões das duas fontes. Pode ser necessário arranjar adaptadores para ligar o intrão a região constante . Nalguns casos , todo ou apenas uma porção do intrão pode ser modificado por delecção . sústituição(ões) de nucleotideos ou inserção para aumentar a facilidade de manipulação, expressão ou similares. De preferência devera estar presente uma quantidade suficiente do intrão para conter um potenciador que seja funcionalmente activo com o promotor natural

Como alternativa pode ser desejável ter o gene fundido sem o intrão entre o gene J e o gene C Assim o extremo 3 do gene J sera adjacente ao extremo 5 do gene C Pode-se usar uma nuclease e usando diferentes periodos de digestão pode-se conseguir vários

extremos 3 que podem ser então usados na ligação a região constante e fazer-se a selecção de um produto funcional através de uma variedade de naneiras : ou pode-se fazer splicing com extensão sobreponivel usando a tecnologia da reacção de cadeias com polimerase ver Horton et al supra Neste caso de um modo geral poderá usar-se um promotor artificial que não necessite de ser funcionalmente activo com um potenciador

Numa realização preferida, os genes codificadores das regiões V„ e V, podem ser alterados substituindo pelo menos partes das regiões determinantes da complementaridade (CDRs) nos domínios variáveis das cadeias leve ou pesada do anticorpo com partes analogas de cDRs de um anticorpo de diferente especificidade. Um exempfct desta técnica de substituição de cDRs esta descrito no Pedido de Patente Europeia 0 239 400 de Gregory Winter; e no pedido PCT WO 88/09344 de Huston et al Num anticorpo alterado do presente invento apenas os CDRs do anticorpo serão estranhos para um corpo humano e isto devera minimizar os efeitos secundários se usados em terapia humana No entanto as regiões de esqueleto humanas e de ratinho possuem características partciualres que as distinguem umas das outras Assim um anticorpo contendo CDRs de ratinho num 'esqueleto base' humano pode não ser mais estranho para o corpo do que um genuino anticorpo humano

São dadas as sequências de nucleotideos correspondentes as sequências de aminoacidos de V_H de V_HDÓTAG. CC46 CC49 , CC83 e CC9 2 , assim como as dos segmentos dos genes CC49 , CC82 e CC92. Consequentemente é aparente que os CDRs dos anticorpos do presente invento podem ser transferidos para as regiões de esqueleto de um anticorpo humano.

>_ζ geralmente . as regiões de

CDR de um dominio V ou V_r humano podem ser substituídos π L» por CDRs das regiões V„ ou V. dos anticorpos do presente invento São exemplos de anticorpos humanos dos quais as fracções esqueleto podem ser usadas NEWM de plasmacitoma humano /“ Jones et al Replacing the complementarity-determining regi in a human antibody with those from a mouse

Nature 321 522-525 (19 86)_7 disponível ao publico através do Dr Gregwinter; e vários outros genes de V„ e V_r humanos π L que podem ser pedidos ao Dr Terrence Rabbits sendo ambos os investigadores do Medicai Research Council 20 Park Crescer London WIN 4AL

A determinação do que constitui um CDR e do que constitui uma região de esqueleto pode ser feita com base nas sequências de aminoácidos de uma Ig seleccionada conforme indicado em kabat et al Sequences of Proteins of Immunological Interest Fourth Edition (1987)

U.S. Dept. of Health and Human Services NIH.

As quatro regiões de esqueleto adoptam normalmente uma conformação de folha B e os CDRs formam ansas de ligação e nalguns casos formando parte da estrutura em folha B

Ainda nem todos os residuos de aminoacidos nas regiões das ares são acessíveis a solventes e num caso os residuos de aminoacidos nas regiões de esqueleto estão envolvidos na ligação do antigenio /Amit AG Marinzza RA Phillips SEV ePoljak R J Science 233 747-753 (19 86 ) 7

Sabe-se também que as regiões variaveis das duas partes de um sitio de ligação ao antigenio são mantidas na orientação correcta através de interacções

não covalentes entre-cadeias . Estas podem envolver resíduos de aminoãcidos dentro das CDRs.

Assim . para transferir a capacidade de ligação do antigenio de um domínio variavel i- · para outro pode ser necessário substituir todos os CDRs com os CDRs completos da região variavel dadora Pode ser necessário transferir apenas os resíduos que sejam necessários para o sitio de ligação ao antigenio e isto pode envolver a transferência de resíduos de regiões de esqueleto·' assim como de resíduos de CDR

E pois claro que a mera substituição de um ou mais CDRs com CDRs complementares pode nem sempre resultar num anticorpo alterado funcional No entanto, dadas as explicações descritas no pedido de patente europeia 0 239 400 estara dentro da competência dos familiarizados com a matéria, quer por experimentação de rotina quer por tentativas obter um a±icorpo alterado funcional .

De preferência, os dominios variáveis em ambas as cadeias pesada e leve são alterados através de pelo menos substituição parcial de CDR e. caso seja necessário, por substituição parcial da região de esqueleto e alteração da sequência Se bem que os CDRs possam derivar de um anticorpo da mesma classe ou subclasse do anticorpo de onde derivam as regiões de esqueleto e aparente que as CDRs derivarão de um anticorpo de uma classe diferente e de preferência de um anticorpo de uma especie diferente

-43Regiões variaveis compostas

De um modo geral o gene V codificador da V é o mesmo gene V que codifica a V, naturalt« Lf mente combinada com a escolhida. Por exemplo, o gene V que codifica as regiões V_L de CC49 e CC83 é vantajosamente usado quando se emprega o gene V que codifica a V_o de CC49

Π e CC83, respectivamente .

Surpreendentemente. devido as regiões V„ dos anticoroos do oresate invento serem codifiΠ ** cados pelos genes V derivados de V OÇTAG podem ser formados

Π Π anticorpos compostos vantajosos Por outras palavras a região de um anticorpo do presente invento pode ser adequadamente combinada com a região V de um outro anticorpo do presente invento Se bem que as sequências de aminoácidos das cadeias pesadas de CC49 e CC83 estejam superficialmente perto seria de esperar que uma mudança dé alguns ou mesmo de um so aminoãcido afectasse drasticamente a função de ligação do anticorpo i e os aticorpos resultantes presume-se que sejam uma imunoglobulina não especifica (NSI) i e sem caracter de anticorpo/ver pedido de Patente Europeia 0 125 023 )

Surpreendentemente encontrou-se que um anticorpo tendo a V„ necessária deste invento

Π não necessita de ser apenas recombinada com uma V do mesmo L anticorpo natural do animal. Por exemplo, conforme estabelecido nos exemplos, è possível produzir um anticorpo quimérico tendo uma cadeia pesada com uma V„ de CC83 e uma cadeia leve

Π com uma de CC49 , em que o anticorpo composto assim formado tem uma especificidade de ligação 25% superior a afinidade de ligação de B72 3 para TAG72

Regiões constantes

Domínio da cadeia pesada (C„)z

Π

Os domínios C_H podem ser de vários isotipos humanos, i.e.. IgG (e.g. IgGl. IgG2. IgG3 e IgG4). IgA. IgD. IgM assim como os vários subtipos dos grupos individuais.

Para uma discussão d humana, ver Ellison et al.. The nucleotide sequence of a human immunoglobulin C-gamma-1 gene. Nucl. Acid Res. 10 .

71-40 79 (19 82); Takahashi et al ; Structure of human immunoglobulin gamma genes: Implications for evolution of a gene family Cell 29 . 671-679 (19 82). Para uma discussão de gama 2 ( )$“2 ) humana, ver Krawinkel et al., Comparasion of the hinge-coding segments in human immunoglobulin gamma heavy genes and the linkage of the gamma 2 and gamma 4 subclass genes, EMBO J. 1, 403-407 (1982); Ellison et al., Linkage and sequence homology of two human immunoglobulin gamma heavy chain constant region genes, proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 79 , 1984-19 88 (182); Takahashi et al. , infra.

Para uma discussão de gama 3 (^3) humana, ver Krawinkel et al., infra e Takahashi et al., infra. Para uma discussão da gamma 4 (^4) humana, ver Ellison et al. , Nucleotide sequence of a human immunoglobulin C-gamma-4 gene, DNA 1 . 11-18 (1981), Krawinkel et al infra e Takahashi et al., infra.

Para uma discussão da mu humana . ver Rabbitts et al.. Human Immunoglobulin Heavy Chain Genes: Evolution Comparisons of Cp. (Ç and C Ygenes and

Associated Switch Sequences Nucl . Acid. Res 9 4504-450 24 .

Para uma discussão da alfa humana, ver Flanagan et al.. mechanisms of Divergence and Convergence of the Human Immunoglobulin alpha 1 and alpha 2 Constant region Gene Sequences. Cell 36 , 681-688 (19 84),

Para uma discussão da delta humana, ver White et al Human Immunoglobulin D: Genomic Sequences of the Delta Heavy Chain Science 228 733-737 (19 85 )

Para uma discussão da epsilon humana ver Max et al DuDlication and Deletion in the Humman Immunoglobulin Genes' Cell 29 69 1-699 (19 82)

Domínio da Cadeia leve (C. ) L>

O domínio C^ pode ser kapa (k) humana ou lambda (^ ) humana.

Para uma discussão de k humana ver cloned Human and Mouse kappa Immunoglobulin Constant and JRegions Genes Conserve Homology in Functional Segments. hei ter et al . , Cell 2 2 19 7-20 7 . November (19 80 )

Para uma discussão da k. humana . ver processed Genes: A Dispersed Human Immunoglobulin Gene Bearing Evidence of RNA-Type Processing Hollis et

al . Nature 29 6: 321-325 (19 82)

Os segmentos dos genes e/ou podem ser alterados por mutagenese Técnicas exemplificativas incluem a adição e delecção ou substituição não conservativa de um numero limitado de vários nucleotideos ou a substituição conservativa de muitos nucleotideos desde que seja mantida a grelha de leitura correcta. Em adi ção, domínios completos da proteína podem ser alterados por exemplo por substituição de CH^ por CH^ Esta substituição é feita ao nivel do DNA por inserção, delecção ou substitui ção de exões completos da sequência.

Construção de Anticorpos

Imunizações

A primeira técnica para a produção de anticorpos monoclonais ou policlonais tendo regiões codificadas por DNA derivado de V^oáATG e imunizar um animal hospedeiro com TAG72 purificado Protocolos exemplificativos para a imunização de um animal hospedeiro com TAG72 estão descritos nas patentes d S 4 522 9 18 e 4 612 282. usando um extracto de carcinoma de mama humano como imunogènio; e Pedido de Patente dos Estados Unidos

7-673, 685 (o qual esta disponível ao publico) usando TAG72 purificado com B72.3 como imunogènio.

A seguir os anticorpos monoclonais ou policlonais produzidos a partir do protocolo de imunização são testados para determinar quais dos referidos anticorpos se ligam selectivamente a TAG72 Tal despiste pode ser conseguido através de qualquer um de uma serie de processos conhecidos como seja radioimunoensaio em fase solida ensaios com imunoadsorventes ligados a enzimas ensai de formação de rosetas e ensaios de bloqueio Os processos atras descritos são bem conhecidos na area

Síntese de sequências de aminoácidos constituintes de Merrifield -2154 (19 63)

As imunoglobulinas do presente invento podem ser sintetizadas a partir dos seus aminoácidos São técnicas adequadas o método de fase sólida como descrito em J Amer Chem . Soc . 85 2149Este método de fase solida para a sintese de sequências de aminoácidos está também descrito nas paginas 1-4 de um livro de Stewart e Young. Solid Phase peptide Svnthesis (W.H. Freemen and Co . San Francisco. 19 69 )

Construção de DNA

DNA codificador de

V_H e de V_L

DNA codificador das cadeias pesadas e eleves dos anticorpos pode ser obtido a partir de uma variedade de fontes conhecidas dos familiarizados com a matéria, por exemplo DNA genomico. cDNA DNA sintético ou uma combinação deles -48-

Pode-se isolar as células codií i cadoras da sequência pretendida e fragmentar-se o DNA genómico com uma ou mais enzimas de restrição . 0 DNA genómico pode ou não incluir intrões naturais. Os fragmentos resultantes podem ser então clonados e despistados usando uma sonda da região J da cadeia pesada (J^) relativamente a presença da sequência de DNA codificadora da sequência polipeptidica com interesse os fragmentos de DNA isolados por electroforese preparativa em gel de agarose são ligados As placas recombinantes das bibliotecas são despistadas com uma sonda J„ de ratinho

Π

DNA pode também ser obtido a partir de uma biblioteca de cDNA 0 RNA mensageiro codificador da cadeia pesada ou leve e isolado a partir de uma fonte adequada células B maduras ou uma cultura de hibridomas empregando técnicas convencionais de isolamento de RNA e usando cromatografia em oligo-dt celulose para segregar o mRNA poliA 0 mRNA poli-A pode ainda ser fraccionado para se obter sequêne cias de tamanho suficiente para codificar as sequências de aminoãcidos na cadeia leve ou pesada do anticorpo pretendido conforme necessário.

Prepara-se então uma biblioteco de cDNA a partir da mistura de mRNA usando um iniciador adequado de preferência uma sequência de acido nucleico que é caracteristica do cDNA pretendido Tal iniciador pode ser sintetizado com base na sequência de aminoãcidos do anticorpo Como alternativa pode-se usar também cDNA de mRNA poli-A ngo fraccionado derivado de uma linha celular produtora do anticorpo pretendido ou poli-dt 0 cDNA resultante e facultativamente fraccionado de acordo com o seu tamanho num gel de poliacrilamida e depois prolongado por exemplo com residuos dC para emparelhamento com pBR322 ou outro vector de clonagem adequado que foi previamente clivado com uma enzima de restrição adequada como seja Pst I e prolongado com residuos dG Meios alternativos podem ser usados na formação de

vectores de clonagem contendo o cDNA, outras caudas e outros vectores de clonagem mas o referido è tradicionalmente usado e o escolhido preferencialmente . Uma estirpe de célula hospedeira adequado, tipicamente Escherichia coli (E.coli) é transformada com os vectores de clonagem emparelhados e os transformantes conseguidos são identificados por exemplo através da resistência a ampicilina ou a tetraciclina ou outros características fenotipicas existentes no plasmideo vector de clonagem

Os transformantes positivos são repicados e transferidos para placas de microtitulação ou outro suporte para crescimento e manutenção Amostras absorvidas a filtros de nitrocelulose destas culturas em crescimento são então despistados com sequências de nucleotideos adequados contendo bases que se sabe serem complementarei! das sequências pretenidas no cDNA Podem ser usados vários tipos de sondas de preferência sequências de DNA de cadeia

Γ32

P ATP

As células fixadas a filtro de nitrocelulose são lisadas o DNA desnaturado e depois fixado antes da reacção com a sonda fosforilada. Os clones que dão hibridações positivas são detectados através do contacto com uma fotoplaca, em seguida os plasmideos das colónias em crescimento são isolados e sequenciados por métodos conhecidos para confirmar a presença das fracções do gene pretendidas.

Os fragmentos de gene pretendidos são removidos e dotados dos extremos adequados de modo a assegurar uma grelha de leitura correcta relativamente aos segmentos de controle quando inseridos em «ctores de expressão adequados Tipicamente são adicionados nucleotideos ao extremo 5 para incluir umsinal de iniciação e um sitio para enzimas de restrição adequadamente colocado

Devido aos inventores terem conseguido as sequências de nucleotideos da V„ TAG. o DNA ri pode ser também sintetizado sinteticamente por exemplo usanTM do um sintetizador de DNA Applied Biosystems Model 308A e construído segundo técnicas convencionais.

Finalmente uma técnica exemplificativa para a utilização da combinação das técnicas ref ridas consiste no splicing com prolongamento de sobreposiç usando tecnologia de reacção de cadeias com polimerase ver Horton et al., supra. De um modo geral, um iniciador obtido sintéticamente . tendo a chamada cauda ondulante pode ser inserido com uma sequência seleccionada por exemplo DNA genomico Em seguida as sequências são amplificadas e spliced em conjunto

DNA codificador de C„ e de C_r π L fragmento de DNA codificador da sequência de aminoacidos da região constante humana pode ser obtido por despiste do DNA cromossomico de células produtoras de imunoglobulina huamana.

Vectores fragmento de DNA pretendido pode ser colocado num veiculo de expressão biologicamente funcional o qual deve conter sequências de controle adequadas não presentes no fragmento de DNA seleccionado Por biologici mente funcional pretende-se significar que o veiculo de expressão proporciona replicação e/ou expressão num hospedeiro adequado . quer através da manutenção de um elemento extracromossòmico quer por integração no genoma do hospedeiro . Existe um grande numero de vectores disponieis ou então podem ser fácilmente preparados e são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria.

Foram descritos vários plasmideos. como sejam os descritos nos Pedidos de Patentes Europeias 0 0 3 6 7 76 , 0 0 4 89 70 e 0051873 os quais ja contêm um promotor na mesma grelha de leitura do gene e compativeis com a célula hospedeira proposta

Os vectores e métodos aqui descritos são adequados para usar numa larga gama de microorganismos procarioticos ou eucarioticos os quais são susceptiveis de serem transformados O plasmideo sera capaz de se replicar no microorganismo particularmente uma bactéria

Em geral os vectores plasmideos contendo os promotaes adequados os quais podem ser usados pelo organismo microbiano para expressão da sua própria proteina, também contem sequências de controle, sitios de ligação ao ribossoma e sitios de terminação da transcrição . De um modo geral, o replicão e as sequências de controle que derivam de especies compativeis com a célula hospedeira

são usados tendo em consideração estes hospedeiros.

Podem também ser usados fragmentos maiores ou menores do SV40 desde que esteja incluída a sequência de aproximadamente 250 pares de bases (pb) que vai desde o sitio HindIII até ao sitio Pvu II situado na origem de replicação virai. Ainda, é também possível e por vezes desejável . utilizar sequências de promotor ou de controle normalmente associadas com a sequência de gene pretenida desde que tais sequências de controle sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

Finalmente . o plasmideo deverá ter um gene, um gene marcador, que seja capaz de proporcio^ nar uma propriedade fenotipica que permita a selecção de célu las hospedeiras contendo o vector de expressão. È particularmente um gene que proporciona selecção do tipo sobrevivênc:. A selecção de sobrevivência pode ser conseguida conferindo resistência à substância inibidora do crescimento ou dando a capacidade de crescimento a uma bactéria deficiente relativamente a tal capacidade.

Em geral, são preferidos os procariotas. Por exemplo, pBR 322 um plasmideo derivado de uma espécie de E. coli /“Bolivar, et al. , Gene 2_, 9 5 (1977)_7 é particularmente útil. pBR322 contem genes para a resistência à ampicilina e à tetracilcina e proporciona assim meios fáceis de identificação das células transformadas .

Se bem que estes procariotas sejam os mais normalmente usados . outras estirpes microbianas podem igualmente ser utilizadas. como sejam estirpes de E. coli B. E. coli kl2 estirpe 294 (ATCC NS 31446) e E. coli X1776 (ATCC No. 31537). E. coli W3110 (F^-. Y^-. prototròfica

ATCC No. 27325), bacilos tais como Bacillus subtilis e outras enterobacteràceas tais como Salmonella Typhimurium ou Serratia marcesans e varias espécies de Pseudomonas.

Estes exemplos pretendem ser apenas ilustrativos .

Além de procariotas podem ser também usados microorganismos eucariòticos. Saccharomyces cerevisiae ou a vulgar levedura de padeiro . e o microorganis mo eucariotico mais vulgarmente usado se bem que existam disponiveis varias outras estirpes para a expressão em Saccharomyces o plasmideo YRp7 por exemplo /^-Stinchcomb et al Nature 282 39 (19 79 ) ; Kingsman et al gene J7 1 41 (19 79 )

Tschemper et al Gene 10 15 7 (19 80 ) _7 e normalmente usado

Este plasmideo ja contem o gene trp 1 que proporciona uma marca selectiva para uma estirpe mutante de levedura sem a capacidade para crescer em triptofano por exemplo ATCC No 4 40 76 ou PEP4-1 /Jones Genetics 85 12 (19 77) 7

A presença da lesão trpl como uma caracteristica do genoma da célula de levedura hospedeira proporciona por um ambiente eficaz para a detecção da transformação por crescimento na ausência de triptofano

Qualquer vector plasmideo contendo um promotor compatível com levedura, origem de replicação e sequência de terminação ê adequado para usar em levedura. Sequências promotoras adequadas em vectores de levedura incluem os promotores da 3-fosfoglicerato-cinase / Hitzeman , et al . , J. Biol. Chem. 255 . 20 73 (19 80 ) 7 ou outras enzimas glicoliticas /Hess, et al J. Adv. Enzyme Reg. T_. 149 (19 68); Holland et al Biochemistry 17 4900 (19 78 ) 7

para usar em células de mamífero , as funções de controle nos vectores de expressão são muitas vezes proporcionados por material virai Por exemplo os promotores normalmente usados derivam de polioma Adenovi rus 2 e mais frequentemente do Virus Simio 40 (SV40) os promotores precoce e tardio do virus SV40 são particularmente uteis porque ambos podem ser facilmente obtidos a partir do virus como um fragmento que também contem a origem de replicação virai do SV40 /“Fiers et al Nature 2 73 113 (19 78) _7

Por exemplo pSV e neo contem um gene para resistência a ampicilina e resistência a neomicina , o qual esta sob o controle de um promotor de SV40 . Assim, pSV2 neo proporciona meios fáceis para a identificação de células transformadas com genes para a região variável animal e região constante humana.

Preparação de DNA quimérico

Os genes codificadores da cadeia pesada ou da cadeia leve serão construidos através da ligação do extremo 5 de um fragmento de DNA que codifique a região constante com o extremo 3 de um fragmento de DNA que codifique a região variavel A sequência de DNA codificadora da sequência de aminoácidos de anticorpo pode ser obtida em associação com o promotor e o sitio de replicação a partir de DNA genomico Desde que as células hospedeiras reconheçam os sinais reguladores da transcrição e de iniciação da tradução associados aos genes heterologos , então a região 5 e 3 da sequência codificadora da região

variâvel pode ser mantida com a sequência codificadora da região variavel e empregues na iegulação da transcrição e iniciação da tradução. A região não codificadora 3' da região constante pode ser mantida devido às suas sequências reguladoras da terminação da transcrição, tais como as de terminação e poliadenilação. Ao referir-se 5' ou 3' para uma cadeia dupla, pretende-se significar a direcção da trans crição, sendo 5‘ a montante de 3¹.

A sequência intrão entre a região variavel para cada cadeia pode ser ligada ao correspondente fragmento de DNA da região constante humana em qualquer sitio de restrição adequado Ao obter-se um fragmento codificador da região variavel sera desejável incluir uma fracção do intrão a jusante da região J Sempre que o intrão e mantido e necessário que haja sequências aceitadoras e dadoras de 'splicing funcionais nos extremos do intrão A região 5 não codificadora contígua da região variavel incluirá normalmente as sequências envolvidas na iniciação da transcrição e tradução como seja a caixa TATA sequência de capping e sequência CAAT Geralmente a sequência não codificadora 5 não excede cerca de 1-2 quilobases (kb) .

Deverá existir uma sequência codificadora entre a região J e a região constante. O potenciador empregue pode ser o potenciador de (1) a região V animal ou (2) a região constante humana.

Ao manter-se a região 3' naturalmente contígua a sequência de DNA codificadora da região constante. pode-se proporcionar ao gene sinais de terminação da transcrição. Sempre que os sinais de terminação da transcrição não sejam satisfatoriamente funcionais na celiia hospedeira da expressão então pode ser usada uma

região 3 funcional da célula hospedeira Por conveniência a região 3 não codificadora pode ser obtida a partir de uma região 3 não codificadora contigua de uma região constante do hospedeiro de expressão A região não codificadora 3 pode ser ligada a região constante através de qualquer um dos métodos atras descritos para a manipulação e ligação de fragmentos de DNA Esta região pode então ser usada como um bloco de construção na preparação do gene

Preparação de veiculos de expressão

A construção de veiculos de expressão adequados contendo as sequências codificadoras ede controle pretendidas pode ser obtida como se segue Os extremos dos vectores e fragmentos de DNA podem então ser realizados para formar os veiculos de expressão pretendidos os métodos empregues não estão dependentes da fonte de DNA ou do hospedeiro pretendido os fragmentos de DNA codifieadores da cadeia e da cadeia pesada podem ser inseridos num veiculo de expressão separado ou no mesmo vector De preferência os genes fundidos codificadores das cadeias quiméricas leve e pesada são montados em dois vectores de expressão diferentes os quais podem ser usados para cotransformar uma célula recipiente ao mesmo tempo ou sequenciadamente.

Os meios para inserção dos fragmentos de DNA contendo os genes quiméricos em vectores de expressão incluem a utilização de endonucleases de restrição .

Endonucleases de restrição (ou enzimas de restrição) são enzimas hidroliticas capazes de catalisar a clivagem em sitios específicos das moléculas de DNA. 0 locus de acção da endonuclease de restrição é determinado pela existência de uma sequência de nucleotideos especifica. Tal sequência é designada sitio de reconhecimento da endonuclease de restrição Muitas endonucleases de restrição derivadas de uma variedade de especies bacterianas foram isoladas e caracterizadas em termos da sequência de nucleotideos dos seus sitios de reconhecimento Algumas endonucleases de restrição hidrolisam as ligações fosfodiester em ambas as cadeias no mesmo ponto produzindo extremos cerses Outras catalisam a hidrólise de ligações separadas uma da outra por alguns nucleotideos produzindo regiões de cadeia simples livres em cada um dos extremos da molécula clivada. Tais extremos de cadeia simples são auto-complementares , portanto coesivos e podem ser usados para religar o DNA hidrolisado. São exemplos de enzimas de restrição Aat II, Bam Hl, Eco RI, Hind III, Nde I, Spe I, Xba I Sac I, Bgl II, Pst I, Sal I e Pvu II.

Em adição o vector de expressão pode ter um poliadaptador inserido nele, o qual tem uma pluralidade de sitios de restrição únicos. Por digestão do vector de expressão com as enzimas de restrição adequadas, o poliadaptador será clivado de modo que pelo menos um fragmento de DNA contendo o gene possa ser inserido. Sempre que o poliadaptador permita a formação de extremos distintos . o fragmento de DNA pode ser inserido numa unica orientação; sempre que os extremos foram iguais a inserção do fragmento de DNA resultara em plasmideos tendo duas orientações diferentes

A clivagem e efectuada por tratamento do plasmideo com uma ou mais enzimas de restri-58-

ção. Em geral usa-se cerca de 10 ug de plasmideo ou de fragmentos de DNA com cerca de 10 unidades de enzima em cerca de 100 ul de solução tampão . A digestão com endonucleases sera normalmente efectuada a temperaturas que variam entre 3 72C e 652C, a um pH entre 7 e 9. os tampões adequados e quantidades de substracto para as enzimas de restrição particulares são especificadas pelos fabricantes).

O tempo de reacção sera de 1 a 18 horas.

Poderá ser util evitar a reêiização do vector clivado por pre-tratamento com fosfatase alcalina. As condições especificas são fornecidas pelo f abricante

Apos completada a digestão com enzimas de restrição a proteina e removida por extracção com fenol e cloroformio O acido nucleico e recuperado a partir da fracção aquosa (contendo acetato de sodio aproximadamente 0 3M) por precipitação com cerca de 2 5 volumes de etanol

As descrições dos métodos de clivagem com enzimas de restrição podem ser encontradas nos seguintes artigos: Greene et al Methods in Molecular Biology . Vol. 9 ed. Wickens. R. B., Mareei Dekker, Inc. ,

New York DNA Replication and Biosynthesis , Mertz and Davis, proc. natl . Acad. Sei-, (USA). 69 , 3370 (19 72).

A separação pelo tamanho dos fragmentos clivados e facilmente efectuada por electroforese em gel de agarose para se seguir o curso da reacção. Uma vez decorrida a digestão ate ao nivel pretendido. a endonuclease pode ser incativada por aquecimento acima de 652 durante cerca de 10 minutos ou por extracção orgânica

O fragmento pretendido e então purificado a partir da mistura de digestão Técnicas de purificação adequadas incluem electroforese em gel ou centrifugação em gradiente de sacarose 0 veiculo plasmídeo e os fragmentos de DNA estranhos são então ligados com DNA .<?· ligase para recircularizarem Este processo e referido como emparelhamento e ligação de DNA

Usa-se um meio adequadamente tamponado contendo os fragmentos de DNA. DNA-ligase e cofactores adequados A temperatura empregue será entre 25° e 4°C. Quando os segmentos de DNA estabelecem ligações de hidrogénio, a DNA ligase serà capaz de introduzir uma ligação covalente entre os dois segmentos. O tempo empregue no emparelhamento variara com a temperatura empregue . a natureza da solução salina . assim como a natureza dos extremos coesivos.

De um modo geral. o tempo da ligação pode ir de 5 a 18 horas . Ver Maniatis T . Molecular Cloning Cold Spring Harbor supra.

Cèlulas hospedeiras

Daqui em diante as construções do veiculo de expressão podem ser usadas para transformar uma célula hospedeira adequada. Células hospedeiras adequadas incluem células derivadas de organismos unicelulares assim como de organismos multicelulares os genes quiméricos de imunogiobulina podem ser expressos em células não linfoides tais como bactérias ou leveduras

Vários microorganismos unicelulares podem ser transformados por exemplo bactérias Ou seja organismos microcelulares que são capazes de serem cultivados em culturas ou em fermentação Uma vez que as bactérias são geralmente o organismo mais conveniente para se trabalhar eles serão daqui em diante referidas como exemplos de outros organismos unicelulares . bactérias susceptiveis de serem transformados incluem membros das Enterobacteriaceae . tais como estirpes de Escherichia coli; Salmonella; Bacileáceas, tais como bacillus subtilis Pneumococcus ; Streptococcus e Haemophilus influenzae.

Quando expressas em bactérias as cadeias pesadas das imunoglobulinas e as cadeias leves tornam-se parte dos corpos de inclusão As cadeias devem ser então isoladas. purificadas e depois montadas em moléculas de imunogiobulina funcionais

Alem de procariotas também podem ser usados microorganismos eucarioticos tais como culturas de leveduras Saccharomyces cerevisiae ou a vulgar levedura de padeiro e dos microorganismos eucarioticos mais vulgarmente usados se bem que existam outras estirpes

dispersiveis A presença da lesão trp 1 como uma caracteristica do genoma da célula de levedura hospedeira proporciona um ambiente eficaz para a detecção da transformação através do crescimento na ausência de triptofano.

Τ'.:, Alem de microorganismos podem ser também usadas como hospedeiros células derivadas de organismos multicelulares . Em priacipio qualquer cultura celular poderá ser usada, seja de uma cultura de vertebrados ou de invetebrados , desde que a linha celular seja uma gene pelo menos originalmente tenha produzido anticorpos. A propagação de células de vertebrados em cultura tornou-se um ensaio de rotina nos últimos anos /Tissue Culture Academic Press Kruse e Patterson . editores (19 73) 7 São exemplos de tais linhas celulares hospedeiras as células Sp2/0 VERO e HeLa linhas celulares de ovário de hamster chinês (CHO) e as linhas celulares W13B BHK COS-7 e MDCK

A linha celular recipiente preferida e uma célula de plasmacitona como seja células de linfócitos B ou de hibridoma As células de plasmacitoma podem sintetizar montar e secretar imunoglobulinas codificadas por genes de imunoglobulinas transformados Ainda elas possuem o mecanismo de glicosilação da imunoglobulina Sp2/0 e uma célula recipiente preferida porque e uma célula de plasmacitoma não produtora de imunoglobulina. A célula produz apenas imunoglobulina codificada pelos gnes de imunoglobulina transformados. As células de plasmacitoma podem ser crescidas em cultura ou no peritoneu de ratinhos onde a imunoglobulina secretada pode ser obtida a partir do fluido ascitico.

Transformação de células hospedeiras

A transformação de células hospedeiras e conseguida como se segue. 0 veiculo de expressão é linearizado e o DNA e inserido nas células hospedeiras para a produção do anticorpo Exemplos de métodos para a inserção de DNA em células hospedeiras incluem electroporação fusão de protoplastos precipitação com fosfato de calcio ou outras técnicas convencionais as quais usam dextran-sulfato e PEG

Se se usar como células hospedeiras células sem grandes barreiras de parede celular a transformação pode ser efectuada pelo método de precipitação com fosfato de cálcio como descrito por Graham e Van der Eb Virology 52 546 (19 78)

Se se usar células procarioticas ou células que contenham construções substanciais de paredes celulares, o método de transformação preferido e o tratamento com cálcio usando cloreto de cálcio como descrito por Cohen, F.N. et al., proc. Natl. Acad. Sei (USA)

69_, 2110 (19 72 ) .

As células hospedeiras podem ser tranqformadas através de cotransformação ou de transforma ção dirigida.

para a cotransformação os genes codificadores da cadeia leve e de cadeia pesada podem ser usados para transformar culturas de células separadas da mesma especie ou de especies diferentes: plasmídeos separados para a cadeia leve e pesada podem ser usados para cotransformar uma unica cultura de células; ou finalmente

um plasmídeo da expressão contendo ambos os genes e capaz de expressar os genes da cadeia leve e da cadeia pesada pode ser usado para transformar uma unica cultura de células

Na técnica de transformação dirigida as células hospedeiras são transformadas com genes codificadores da cadeia leve e as células contendo a marca da cadeia leve são seleccionadas. Encontra-se a cadeia leve usando um corante ou possivelmente por detecção da cadeia leve no sobrenadante se ela foi secretada. As células seleccionadas por possuírem a cadeia leve são transformados com a construção da cadeia pesada e as células resultantes contêm ainda a marca da cadeia pesada seleaionada.

E conhecido que algumas linhas de células linfoides imortalizadas tais como linhas celulares de plasmaciutoma no seu estado normal secretam cadeias leves ou pesadas de Ig isoladas Consequentemente se tal linha celular fôr transformada com o vector contendo à cadeia pesada ou leve quimérica do presente invento não será necessário transformar a linha celular ou uma outra linha celular com a outra cadeia de Ig desde que a cadeia normalmente secretada seja complementar do dominio variavel da cadeia de Ig codificada pelo vector inicialmente usado para transformar a linha celular

Selecção e expressão de células hospedeiras transformadas

De um modo geral . apos transformação das células hospedeiras as células podem ser cultivadas durante cerca de 48 horas para permitir a expressão de genes marcadores As células são então colocadas num meio selectivo onde as células não transformadas são mortas deixando apenas células transformadas com as construções de DNA

As cadeias pesada e leve ou porções delas podem ser produzidas separadamente umas das outras e os anticorpos ou seus fragmentos podem ser obtidos . Tais preparações requerem a utilização de técnicas para montar as cadeias isoladas.

A capacidade do método do invento para produzir cadeias pesadas e eleves ou fraeções delas , isoladas das outras oferece a oportunidade de obter montagens únicas de imunoglobulinas. regiões Fab e a±icorpos univalentes. E possivel recombinar as cadeias pesada e Jeve in vitro separadas por clivagem das ligações disulfureto entre as cadeias e voltar a ter actividade de anticorpo sem restauração das pontes dissulfureto entre as cadeias /ver Edelraan. G M. et al proc natl Acad Sei (USA) 50 753 (19 63 ) 7

As células transformadas são cultivadas em condições adequadas â produção das cadeias leves e/ou pesadas e testadas quanto a sintese proteica das cadeias leve e/ou pesada Exemplos de técnicas de ensaio incluem ensaio imunoadsorvente ligado a enzimas (ELISA) radioimunoensaio (RIA) ou analise por separação de células activadas por fluorescência (FACS) imuno-histoquimica e similares.

A afinidade de ligação de anticorpos monoclonais para TAG72 e determinada por meios bem conhecidos na area (ver Heyman, 3., et al., J. Immunol. Methods £8, 19 3-20 4 (19 84) e como descrito detalhadamente nos Exerçios aqui apresentados).

As culturas positivas seleccionadas são subclonadas para se isolar colónias transformad puras. Uma técnica adequada para a obtenção de subclones e pelo método de diluição limite ensinado por McKeara em Monoclonal Antibodies Plenum Press N Y (19 80 )

Os hibridomas que produzem tais anticorpos quiméricos podem ser cultivados usando processos conhecidos As células transformadas podem secretar granqdes quantidades das cadeias leve e/ou pesada por cultura in vitro como seja através de sistemas de fibras ocas culturas em spinners' cultura estatica ou in vitro como seja a produção em ascites

Os anticorpos quiméricos podem ser produzidos em grandes quantidades através da injec ção de um hibridoma na cavidade peritoneal de ratinhos a quem foi dado pristano preeviamente e apos um tempo adequado (cerca de 1-2 semanas), colheita do fluido ascitico a partir de ratinhos, o que dá um titulo muito alto do aticorpo monoclonal homogéneo e isolamento dos anticorpos monoclonais a partir dele por métodos bem conhecidos na área /'ver Stramignoni, P. et al. , Intl. J. câncer 31, 543-552 (19 83) 7 · Os hibridomas são cultivados in vivo na forma de tumores em animais, o soro ou fluido ascitico dos quais pode proporcionar ate cerca de 50 mg/ml de anticorpos mono clonais Geralmente, a injecção (de preferência intraperitoneal) de cerca de 10 a 10 células de hibridoma histocompativeis em ratinhos <&u ratos resultara na formação de

tumores apos algumas semanas. Os anticorpos podem ser então colhidos e processados por métodos bem conhecidos. (Ver na generalidade. Immunological Methods. vols. I e II. . eds. Lefkovits. I. and Pernis. B.. (19 79 e 19 81) Academic Press.

New York. N.Y.. e Handbook of Experimental Immunology ed. . Weir. D (19 78) Blackwell Scientific Publications. St. Louis

Os anticorpos podem ser então guardados em várias soluções tampão tais como tampão de fosfatos salino (PBS) o que dá uma solução de anticorpo de um modo geral estável a ser usada posteriormente.

Os anticorpos quiméricos do presente invento podem ser fragmentados usando enzimas conheeidas com actividade de protease, por exemplo papaina e pepsina, para obter fragmentos Fíab'^, F (ab¹) e Fab altamente imuno-reactivos. Em adição, os fragmentos activos de Ig formados por proteólise (aproximadamente 50 000 de PM) podem ser obtidos nos seus componentes de cadeia pesada e de cadeia leve totalmente reduzidos e eficazmente reconstruídos para dar um anticorpo activo /“Haber. E.. Proc. Natl. Acad. Natl. Acad. Sei (USA) 5_2. 1099 (19 64 ). Whitney. P.L.. et al . . Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 53 (19 65) 7- A reactividade dos fragmentos F (ab^-^. F (ab' ) e Fab resultantes foi determinada pelos métodos descritos atrás para a molécula de anticorpo monoclonal completa.

i

-67Utilizações dos anticorpos

Os anticorpos do presente invento assim como fragmentos imuno-reactivos ou seus recombinantes proporcionam caracteristicas únicas para utilização numa variedade de tratamentos de cancro Alem da capacidade de ligação especifica a células malignas e de localizar tumores os anticorpos possuem regiões variaveis constantes que não se ligam de modo detectavel a células normais tais como fibroblastos células endoteliais ou células epiteliais nos principais orgãos

Especificamente os anticorpos fragmentos imuno-reactivos ou seus recombinantes são uteis no tratamento dos tipos de cancros que se seguem:

(1) ensaios de diagnostico in vivo conjugados com uma marca visualizadora. para a detecção in si tu de lesões de carcinoma como descrito abaixo;

(2) terapia in vivo. usando os anticorpos do presente invento sozinhos ou conjugados com um agente terapêutico como seja um radionucleico, toxina, células efectoras. outros anticorpos ou via um mecanismo de complemento, como descrito abaixo; e (3) cirurgia radioimunoguiada. como descrito abaixo.

Ainda e ainda possivel ter uma composição farmacêutica compreendendo os anticorpos do presente invento num veiculo não toxico farmaceuticamente aceitável e esteril como seja soro fisiologico tampões não toxicos e similares

As composições injectaveis do presente invento podem estar na forma de suspensão ou de solução Na forma de solução o complexo (ou quando pretendi-68-

do os componentes separados) e dissolvido num veiculo farmaceuticamente aceitavel Tais veiculos compreendem um solvente adequado preservativos tais como álcool benzilico se necessário e tampões Solventes uteis incluem por exemplo agua álcoois aquosos glicois e esteres de fosfonato ou carbonato Tais soluções aquosas contêm nãonais de 50% do solvente orgânico por volume

As suspensões injectáveis como composições do presente invento requerem um meio de suspensão liquido, com ou sem adjuvantes como veiculo . O meio de suspensão pode ser. por exemplo, polivinilpirrolidona aquosa, oleos inertes tais como óleos vegetais ou oleos minerais altamente refinados ou carboximetilcelulose aquosa. Os adjuvantes fisiologicamente aceitáveis adequados, se necessários para manter o complexo em suspensão, podem ser escolhidos entre os espessantes tais como carboximetilcelulose . polivinilpirrolidona. gelatina e alginatos Muitos tensiactivos são também uteis com agentes de suspensão por exemplo. lecitina alquilfenol polietileno naftalenossulfonatos e esteres de polioxietilenosorbitanto . Muitas substâncias que afectam a hidrofobicidade densidade e tensão superficial do meio de suspensão liquido podem ser usados para fazer suspensões injectáveis em casos individuais Por exer pio anti-espumentes de silicone sorbitol e açucares são também uteis como agentes de suspensão aditivos de oxido de alquilbenzenossulfonatos

Devido as células cancerosas serem heterogeneas e consequentemente um unico anticorpo quimérico mono-especifico pode não ser capaz de reconhecer todas as células que expressam diferentes epitopos de um tumor

Assim pode ser desejável administrar vários anticorpos quiméricos diferentes do presente invento A utilização sequenciada destes vários anticorpos devera reduzir substancialmente as respostas anti-iditotipicas em pacientes humanos quando comparado com a utilização repetida de um unico anticorpo Por exemplo CH92 CH88 e CH44 poderão ser administrados sequenciadamente a um paciente. Uma vez que estes anticorpos têm diferentes cadeias leves e de facto deverão ser minimizadas diferentes respostas anti-idiotipicas contra regiões CDR3

Ensaios de Diagnostico In Vivo

Para os ensaios de diagnostico in vivo de tumores humanos ou suas mestatases usando os anti corpos fragmentos imuno-reactivos ou seus recombinantes são conjugados com uma marca administrados a um paciente e depois a presença de marca visualizadora no paciente e detectada expondo o paciente a um meio de detecção adequado

A administração e detecção do conjugado anticorpo-marca visualizadora assim como os métodos de conjugação do anticorpo com a marca visualizadora são conseguidos por métodos conhecidos ou fáceis de conseguir como descrito por exemplo em Goldenberg D M et al 29 8 1384-1388 (19 78); Goldenberg

New England J Med D M. et al . J Amer Goldenberg D.M et al Siccardi, AG. et al Epenetos, A.A. et al.

Med Assoe 280 _ 630 -635 (1983);

. Gastroenterol . 84 . 524-532 (19 83); Câncer Res . 16. 4817-4822 (19 86 ); Câncer 55. 9 84-9 8 7 (19 85); Philben .

V.J. et al . . Câncer 5 7 . 571-576 (19 86); Chion. R. et al . , Câncer Inst . 76 , 849 -855 (19 86); Colcher . E et al . , Câncer Res. 43 , 736-742 (19 83); Colcher E. . et al laboratory Research Methods in Biology and Medicin Immunodiagnostics,

New York. Alan, R Liss. pep 215-258 (1983): Keenan, AM

et al . J.	Nucl Med	25 119 7-120 3 (19 84)	; Colcher	D	et al
Câncer Res	£7 1185-	1189 (19 8 7); (19 8 7):	Estaban		J M	et
al Intl	J Câncer	39_ 50 -59 (19 8 7): Martin D	T	et	al
Curr Surg	41 19 3-19 4 (19 84): Martin E	W Jr	e t	al
Hybridoma 5	59 7-510 8	(19 86 ) : Martin D T	et âl·	Am	J	Surg
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-78 (1934): e Krejcarek et al Biochem and Biophys Res Comm 77 581-585 (1977)

A dosagem variara dependendo da idade e do peso do paciente Geralmente a dosagem devera ser eficaz para permitir viasulizar ou detectar sitios de tumores distintos dos tecidos normais De preferência uma unica dosagem sera entre 0 1 e 200 mg de um conjugado de anticorpo-marca por paciente.

Exemplos de marcas visualizadoras que podem ser conjugados com o anticorpo são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria e incluem substâncias que podem ser detectadas por diagnostico através de imagens usando um scanner (varredor) gama ou uma sonda gama manual ou Position Emmission Tomography ou similares. como descrito nas referências atraas citadas e substâncias que podem ser detectadas por ressonância magnética nuclear usando um espectrometro de ressonância magnética nuclear ou similares como descrito nas referências atras citadas

Exemplos adequados de substâncias que podem ser detectadas usando um scanner¹ gama ou simila125 res incluem por exemplo radioisotopos tais como I

131_ 123_τ 111_τ 10 5 153_c

I I In Rh Sm

186 188_n 99125_T 123_T

Re Re e Tc I I ridos devido a sua baixa energia uma gama larga de detecção

Cu

153

Ga

166„ 177

Ho . Lu „ 99 m_m

Sm e Tc sao os prefe e a serem adequados para

Um exemplo de uma substância que pode ser detectada usando um espectrometro de ressonância magnética nuclear ou similar e o gadolinio (Gd).

Tratamento de cancro in Vivo neste método o conjugado de anti corpo agente terapêutico pode ser libertado para o sitio de carcinoma expondo assim directamente o tecido de carcinoma do agente terapêutico

Os anticorpos do presente invento fragmentos imuno-reactivos ou seus recombinantes podem ser administrados numa quantidade farmacêuticamente eficaz para o tratamento in vivo de carcinomas humanos ou suas metastases Uma quantidade farmacêuticamente eficaz do anticorpo fragmento imuno-reactivo ou seu recombinante conjugado ou não conjugado com um agente terapêutico, signi fica a quantidade dos referidos anticorpos na composição fermacêutica que deve ser suficiente para se conseguir uma ligação eficaz aos antigenios contra os quais os referidos anticorpos posuem afinidade especifica. A composição farmacêutica pode ser administrada numa dosagem simples ou múltipla.

Os métodos de preparação e administração dos conjugados do anticorpo . fragmentos imuno-reac tivos ou seus recombinantes e um agente terapêutico são bem conhecidos ou facilmente determinados pelos familiarizados com a matéria Ainda as dosagens adequadas codependerão da idade e peso do paciente e do agente terapêutico empregue e são bem conhecidos ou facilmente determinados pelos familiarizados com a matéria protocolos representativos estão descritos nas referências citadas abaixo

Exemplos dos conjugados de anticorpo-agente terapêutico que podem ser usados em terapia incluem os seguintes:

o

186 nuclidos 211 ‘A

111.

„ 131_T tais como I ⁶⁷Ga. ¹²⁵I (1) anticorpos acoplados a radio47, ⁹⁰Y ¹⁰⁵Kh

188,

177,

Sc ⁶⁷Cu. ²¹²Bi . ^mTc. ¹⁵³Sm. ¹²³I

Re Re . Lu e In como descrito por exemplo, em Goldenberg, D.M. et al Câncer Res. 41, 4354-4360 (1981); Carrasquillo. J.A. et al Câncer Treat. rep. 68 , 317-328 (19 84); Zalcherg , J.Q. et al J. Natl. Câncer Inst . 72 , 694-704 (19 84); Jones. D.H. et al . , Int. J. Câncer. 35, 715-720 (19 85); Lange PH., et al Surgery 9 8. 143-150 (19 85); Kaltovich, F.A. et al ,

J. Nucl med . 2 7 , 89 7 (19 8 6) , Order , SE et al , Int. J

Biol Phys £ 259 -261 (9 82 ) Courtenaylancet 1. 1441-1443 (1984) e Ettinger

Radiother. Oncol -Luck, N. et al

D S et al Câncer Treat Rep 6 6 2 89 - 29 7 (19 8 7);

(2) anticorpos acoplados a drogas ou modificadores da resposta biologica tais como metotrexato adriamicina e linfo· quinas tais como o interferão como descrito por exemplo

Câncer Principies and Practice of

PA J B Lippincolt Co Vol 2

T et al Câncer Res 46 Fed

J

Deguchi em Chabner B et al Oncology Philadelphia pag 2223-2245 (19 85)

751-3 755 (19 86); Deguchi T et al (19 85); Embleton MJ et al Br (19 84) e Pimm MV et al

Proc 44 1684

Câncer 49 559 -565

Câncer Immunol Immunother

125-134 (19 82);

(3) anticorpos acoplados a toxinas, como descrito, por exemplo , em Uhr, J.W. et al., Monoclonal Antibodies and Câncer, Academic Press, lnc. pág. 85-98 (1983), Vitetta, E.S. et al., Biotechnology and Bio Frontiers Ed. P.H. Abenson, pág. 73-85 (1984) e Vitetta, E.S. et al., Sei, 219, 644-650 (19 83 );

(4) anticorpos heterofuncionais. por exemplo, anticorpos acoplados ou combinados com um outro anticorpo de modo a que o complexo se ligue ao carcinoma e as células efectoras e.g células assassinas tais como células T como descrito por exemplo em Perez P et al J Exper Med 163 166-178 (19 86); e Lau Μ A et al proc Natl Acad Sei (USA) 82 8648-8652 (19 85): e (5) anticorpos nativos i e não conjugados ou não complexados anticorpos como descrito por exemplo em Herlyn D et al proc natl Acad Sei (USA) Ί9 4761-4765 (19 82); Schulz G et al Proc natl Acad Sei (USA) 80 540 7-5411 (19 83); Capone Ρ M et. al. Proc Natl Acad Sei (USA) 80 7328-7332 (19 83); Sears; H F et al Câncer

Res. 45 59 10-5913 (19 85); Nepon . G.T. et al . . Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81 . 2864-2867 (19 84); Koprowski, H. et al . , Proc. natl. Acad. Sei. (USA) (Π. 216-219 (19 84); e

Houghton, A. N. et al. . Proc. natl. Acad. Sei (USA) 82 1242-1246 (19 85).

Os métodos para a combinação de anticorpo ou fragmento de anticorpo com um agente terapêutico pretendido como descrito atras são os convencionais já conhecidos . Por exemplo. os métodos dados ftas referências atrás.

Cirurgia radioimuno dirigida

Anticorpos, fragmentos imuno-reactivos ou seus recombinantes, são importantes para a cirurgia radioimuno dirigida (RIGS). Em RIGS, uma terapia intra-operativa , os tumores são localizados e removidos.

Um anticorpo marcado com uma marca visualizadora é injectado num paciente e o anticorpo ligado é localizado com uma sonda manual de deteção gama (GDP) e removido. Um exemplo z TM de GDP e neoprobe , comercialmente disponivel na neoprobe TM

Corporation, Tampa, F.L. Ver Martin et al., Radioimmunoguided surgery: a new approach to the intraoperative detecti of tumor using antibody B72.3, Amer. J. Surg. 1567 386-39 2 (19 88); Martin et al. . Radioimmunoguided surgery: intraoperative use of antibody 17 - IA in colorectal câncer . Hybridoma 5. 59 7-510 8 (19 86).

A administração e detecção do conjugado anticorpo-marca visualizadora assim como métodos de conjugação do anticorpo com a marca visualizadora são conseguidos por métodos já conhecidos ou fácilmente determinados por alguém familiarizado com o campo, como descrito, por o exemplo atrás.

A dosagem variará de acordo com a idade e peso do paciente, mas geralmente é suficiente uma dosagem simples de 0 ,1 a 200 mg de conjugado de Etnticorpo-marca por paciente.

Os Exemplos não limitantes, que se seguem têm apenas fins ilustrativos relativamente à

construção e expressão de sequências de DNA quimérico codificadoras dos anticorpos deste invento Todas as temperaturas são em centígrados a menos que de outro modo seja indicado Todas as percentagens são por peso a menos que de outro modo seja indicado

EXEMPLOS

Substituição de regiões constantes de ratinho

Anticorpos CL foram obtidos a partir de ratinho e verificou-se serem significativamente menos eficazes na realização de funções efectoras caracteristicas das regiões constantes humanas

Consequentemente nos exemplos que se seguem anticorpos seleccionados são humanizados removendo geneticamente as regiões constantes das cadeias pesada e leve e substituindo-as com os seus equivalentes humanos

Os genes das regiões constantes da cadeia leve de ratinho foram substituídos com o gene kapa (k) humano e os genes da cadeia pesada de ratinho foram substituídos com os quatro isotipos gama humanos ( Tl ^2 ^e ) Cada um destes quatro isotipos gama possuem propriedades biológicas únicas Para uma revisão geral, ver The human IgG subclasses. Hamilton, R.G.

(19 89 ) Doc. No. (B0 0 51-289 , Calbiochem Corporation.

Preparação da região variavel da cadeia pesada e da cadeia leve

Isolamento da cadeia leve CC49

As células de hibridoma CC49 secretam um anticorpo tendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve do isotipo IgGl

Isolou-se DNA total das células de hibridoma CC49 de células de rim de ratinho Balb/c e de células de plasmacitoma NSI. de acordo com os processos descritos na Cell; 24 : 353-356 (19 81)

De um modo geral, cerca de 10-20 ug do DNA extraido de cada linha celular foi totalmente digerido com 80 unidades de BamHI. Eco RI. Hind III.

Spe I, Xba I, Saci. Bgl II e Pst I em 50-100 microlitros de uma mistura de reacção contendo o tampão de reacção adequado a 3 7SC durante a noite

Em seguida o DNA total extraido de cada linha celular foi sujeito a técnica de hibridação Southern desenvolvida por E M Southern /~J Mol Biol 9 8 503-517 (19 75) 7 Os fragmentos de DNA foram fraccionados com base no seu tamanho por meio de electroforese num gel de 0 8% de agarose Os fragmentos de DNA de cadeia dupla foram modificados em fragmentos de DNA de cadeia simples numa solução alcalina; e depois um filtro de nitrocelulose foi colocado em contacto estreito com o gel para transferir os segmentos de DNA modificados para o filtro na presença de uma solução de concentração salina elevada.

A hibridação foi efectuada usan32 do, como sonda, uma cadeia L marcada com P numa reacção de iniciação ao acaso.

Mais especificamente , a sonda era um fragmento HindIII-Pst I de 1.71 quilo-pares de bases (kpb) contendo os exões codificadores das regiões J.

Lí murinas (J1-J5) e foi isolada a partir do plasmideo pGDl Na Figura 7 esta apresentada uma sequência de nucleotideos do fragmento sonda Este plasmideo esta descrito em Site Directed Cleavage of Immunoglobulin Gene Segments by Lymfhoid Cell Extracts Agostaro et al Can J Biochem cell Biol 63 9 69 -9 76 (19 85 ) 0 plasmideo foi fornecido por Nobumichi Hozumi e John Roder Mt Sinai Research Institute Toronto Ontario Canada para marcar radioactivamênte a sonda adquiriu-se alf a < 32P dCTP a Amersham Arlington Heights II USA e o “Kit de iniciação ao acaso foi adquirido a Pharmacia Piscataway NJ USA

Os sinais nas transferências

Southern foram visualizados por auto-radiografia usando fil TM me Kodak X-OMAT AR. Não se observou qualquer banda reaarranjada. Assim, relativamente aos padrões, não se detectou qualquer banda única no auto-radiograma do DNA de CC49 digerido com HindIII. Não se pode no entanto excluir dos dados de Southern que a banda rearranjada pera a cadeia L estivesse mascarada por uma banda migrando no DNA de CC49 digerido com HindIII paralela a banda resultante da digestão em HindIII do DNA de células de rim de ratinho (tçresen tando o DNA germinal

Isto de facto foi o que aconteceu .

Preparação de plasmideo contendo genes V de ratinho L

TM

LAMBDA-ZAP um vector de clonagem de inserções baseado em lambda capaz de auto-excisão foi adquirido a Stratagene Co . La Jolla CA USA LAMBDATM

-ZAP esta descrito nas paginas 20-21 do catalogo StrataTM gene de 1987. Os extremos coesivos (cos) de LAMBDA-ZAP foram ligados durante a noite seguindo o protocolo do fabricante .

Vinte microgramas do LAMBDATM

-ZAP ligado foram digeridos com 5 mícrolitros (15 unidades) de Spe I, adquiridos a New England Biolabs. Inc O volume total da digestão foi de 100 mícrolitros. Apos 55 minutos de digestão, adicionaram-se mais 6 unidades de Spe I. Apos 70 minutos a reacção foi parada por extracção com fenol e precipitação com etanol efectuadas segundo o protocolo da Stratagene

A digestão com a enzima de restrição Spe I resulta na produção de ‘extremos coesivos em ambos os extremos Estes extremos coesivos foram modificados com DNA-polimerase de T4 para criar extremos coesivos Spe I semi-preenchidos e.g . 5 ATC/3 TCATG Para se conseguir a reacção de semi-preenchimento o sedimento de DNA obtido na precipitação com etanol atras foi dissolvido em 8 microlitros de agua A isto adicionou-se 2 mícrolitros de dTTP 10 milimolar 2 microlitros de dCTP 10 milimolar.

microlitros de tampão ligase 10 x da Stratagene. 4 microlitros de agua destilada desionizada e 2 microlitros de um fragmento klenow da bethesde Research Laboratories (BRL) A reacção foi efectuada a temperatura ambiente duran te 30 minutos A reacção foi parada por inactivação da DNA polimerase a 65°C durante 10 minutos

Cento e sessenta microgramas de

DNA total do hibridoma CC49 (contendo o promotor da cadeia leve de ratinho leve de ratinho e os exões L e VJ) foram digeridos totalmente com Hind III Fragmentos entre cerca de 1 kb e cerca de 20 kb foram removidos de geis de 0.8%

TM de agarose. O DNA foi purificado usando GENECLEAN , o qual pode ser adquirido comerciaimente a BIO 101 (La Jolla CA, USA).

Os fragmentos de DNA total do hibridoma CC49 digerido com Hind III foram semi-preenchidos TM de modo semelhante aos fragmentos Spel de LAMBDA-ZAP com excepção de se ter usado dATP e dGTP os fragmentos assim digeridos com HindIII e semi-preenchidos produziram extremos coesivos 5 AGCTT/3 GAA os quais são compatíveis com

TM o fragmento Spe I semi-preenchido de LAMBDA-ZAP atras ref erido

Apos extracção com fenol e precipitação com etanol de acordo com os ensinamentos de Maniatis fragmentos HindIII de DNA total de hibridoma

CC49 modificados e fragmentos Spel modificados de LAMBDATM

-ZAP foram ligados por meio de DNA-ligase de T4 A reacção de ligação foi realizada usando uma mistura de ligação de 6 1 microlitros contendo o seguinte: cerca de 0 .2 microgramas de DNA total do hibridoma CC49 cortado com

HindIII modificado numa solução de 3 microlitros, cerca TM de 1 micrograma de DNA de LAMBDA-ZAP cortado com Spel e modificado numa solução de 1 microlitro. 0.6 microlitros

de tampão ligase 10 x da Stratagene. 0 .6 microlitros de ATP 10 milimolar e 1 microlitro de ligase da Stratagene.

Isto foi incubado durante a noite num banho-Maria e a temperatura baixada lentamente de cerca de 18°C até cerca de 4°C. Esta ligação eliminou os sitios HindIII e Spe I.

Fez-se uma biblioteca genòmica da mistura ligada de acordo com o protocolo da Stratagene Resumidamente. 2 microlitros da mistura de ligação produzida acima foi usado no sistema de empacotamento Gigapack Gold da Stratagene seguindo as instruções do fabricante Quinze placas de 150 mm tendo uma densidade de 50 000 placas por caixa foram despistadas de acordo com as instruções do fabricante relativamente aos clones positivos por hibridação em filtros de nitrocelulose obtida a Schleicher-Schmell Keene NH USA Na hibridação usou-se uma sonda derivada de pGDl marcada ao acaso com 32P 3 Obtiveram-se dois clones positivos

Cada um dos clones foi purificado por placas e os plasmídeos recombinantes (fagemideos) de TM

LAMBDA-ZAP contendo a região variavel da cadeia L de CC49 foram obtidos usando o protocolo de excisão automatica da Stratagene. A fracção de vector do plasmideo recombinante resultante foi designada pBLUESCRIPT SK (-) e consiste em 2964 pb como descrito no catálogo da Stratagene de 1987.

Na Fig. 8 está apresentado um mapa de plasmideo pBLUESCRIPT Sk (- ) .

O DNA dos dois clones positivos foi parcialmente sequenciado e ambos eram idênticos. Um dos clones. designado pRLlO1 foi usado em estudos posteriores

Maoa de restrição da cadeia leve de CC49 pRLlOl tinha 7 61 kb e o tamanho da inserçào de DNA foi determinado por mapeamento com enzimas de restrição como sendo 4 65 kb Na Figura 9 esta apresentado um mapa de plasmideo pRLlOl Na Figura 10 esta apresentado um mapa de enzimas de restrição da inserção de DNA genomico da cadeia L de CC49

Isolamento da região variavel da cadeia leve de CC83

Os processos usados para isolar a cadeié leve de CC83 foram essencialmente os usados para isolar a cadeia leve de CC49 com a seguinte excepção

Uma Diblioteca genomica contendo 7x10^ placas foi despistada usando como sendo o fragmento Hind III- Pst I de i 71 pb marcago ao acaso com <^32P ) derivado de pGDl como descrito atras Obteveve-se um clone positivo O clone positivo foi designado pRL200

Mapeamento de restrição da cadeia leve de CC83 pRL200 tinha 7 44 kb e o tamanho da inserção de DNA foi determinado por mapeamento com enzimas de restrição como sendo de 4 48 kb Na Figura 1 esta apresentado um mapa do plasmideo pRL2Q0 Na Fig 12 esta apresentado um mapa de enzimas de restrição da inserção de DNA geno-82-

mico da cadeia L de CC83 em pRL200

Isolamento da região variavel da cadeia de CC49

Os processos usados para isolar a cadeia pesada de CC49 foram essencialmente os usados cara isolar a cadeia leve de CC49 incluindo o despiste do mesmo DNA de CC49 cortado com HindIII e modificado

A sonda de hibridação usada para o despiste da biblioteca foi gerada a partir de pNP9 o qual contem um fragmento EcoRI-BamHI de 198 kb contendo os exões codificadores de J„3 e J_u4 da cadeia pesada da imnnoΠ Π globulina CC49 A sequência de nucleotideos do fragmento sonda esta apresentado na Figura 13 O plasmídeo foi proporcionado pelo Dr Nobumichi Hozumi e Dr John Roder. Ht Sinai Research Institute. Toronto Ontario, Canada

Fez-se o despiste de uma biblioteca genomica contendo 9 5 x 10$ placas do qual se obteve um clone positivo. O clone positivo foi designado pHH49

Mapeamento de restrição da cadeia pesada de CC49 pHH49 tinha cerca de 70 kb e o tamanho da inserção de DNA foi determinado por mapeamento com enzimas de restrição como sendo de aproximadamente 4 0 kb Na Figura 14 esta apresentado um mapa do plasmideo pHH49

-83Isolamento da região variavel da cadeia pesada de CC83

Os processos usados para isolar a cadeia pesada de CC83 foram essencialmente os usados para iso lar a cadeia pesada de CC49 com as excepções que se seguem

Cerca de treze microgramas de DMA do TM vector LAM3DA-ZAP ligado foram digeridos com 12 unidades de Spe I adquiridor a New England Biolabs Inc um total TM de 100 microlitros de um tampão adequado O LAMBDA-ZAP foi digerido a 3 7°C durante uma hora A mistura de reacção foi extraída com fenol e precipitada com etanol como no pro TM tocolo da Stratagene 0 LAMBDA-ZAP digerido com Spel foi desf osf ori 1 ado de caordo com os processos descritos em Mamatis excepto ter-se uaado um excesso de 40 vezes de fosfatase alcalina de intestino de vitela (Boehringer Mannheim Indiana polis IN USA)

DNA de CC83 foi digerido totalmente com Soei Os fragmentos entre cerca de 3 kb e cerca de 40 kb foram isolados a partir de uma fatia de gel de 0 8 por cento de agarose por electroeluição como descrito por TM

Mamatis e ligados com o vector LAMBDA-ZAP cortado com Spel e desfosforilado

Uma biblioteca genomica contendo 5x10 placas foi despistada usando a sonda gerada a partir de pNP9 a sequência do qual esta apresentada na Figura 13 Obteve -se um clone positivo O clone positivo foi designado DHS83

Mapeamento de restrição da cadeia pesada de CC83 pHS83 tinha 795 kb e o tamanho da inserção de DNA foi determinado por mapeamento com enzimas í;7 de restrição como sendo de cerca de 5 kpb Na Figura 15 esta apresentado um mapa do plasmideo pHS83

Sequenciação de mRNA de CC46 CC49 CC83 e CC9 2

RNA total de cerca de 1x10 células CC49 congeladas a - 70 SC foi extraído essencialmente como descrito por Maniatis com as excepções que se seguem Usaram -se isotiocianato de guanidinio quatro molar e citrato de sodio 2 5 molar pH 7 0 e sem rotor SW40TÍ centrifugado a 31 000 rpm

Isolou-se um total de 2 7 mg de RNA de CC49 Apce centrifugação purificou-se mRNA poli A a partir de cerca de 1 68 mg de RNA por cromatografia em oligo (dT)-celulose usando oligo (dt)-celulose tipo 3 adquirida a Collaborative Research Inc Bedford mA USA

O processo foi como descrito por Aviv e Leder Proc Natl Acad Sei (USA) 69 140 8 (19 72)

Um total de 50 24 pg de mRNA poli A⁺ foi obtido a partir de 1 68 miligramas de mRNA

Isolou-se um total de 3 82 mg de 7

RNA de CC83 a partir de aproximadamente 1x10 células Um total de 54 6 ug de mRNA poli A* foi isolado a partir de 1.9 1 miligramas de RNA total.

Ú··:

Isolou-se um total de 1.7 mg de RNA

O de CC49 a partir de aproximadamente 2 89 x 10 células Um total de 68 88 microgramas de RNA poli A^v foi isolado a partir de 1.7 mg de RNA total

Sintetizaram-se iniciadores oligonucleotidicos sintéticos usando um sintetizador de DNA da Applied Biosystem (Applied Biosystems (ABI) Foster City CA USA) Modelo 380A pelo método químico baseado em fosforamidetos como especificado por ABI Os oligonucleotideos foram purificados conforme especificado pelo fabricante apos electroforese num gel de 20% de poliacrilamida contendo ureia 7M As concentrações de oligonucleotideos foram determinados espectrofotometricamente a uma densidade óptica de 260 mm onde 1 OD 260 nm e igual a 33 ug/ml de DNA de cadeia simples

Fizeram-se os seguintes oligonucleotideos iniciadores para a sequência de mRNA: (1) Para as cadeias leves de CC49 CC83 e CC9 2 K. (-) um 22-mero:

L»

-GGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3 complementar de sequência codificadora do extremo 5 da região constante das cadeias capa de imunoglobulina de ratinho foi usado para determinar a sequência de mRNA mais 3 da região variavel da cadeia leve

Em adição para a cadeia leve de CC49

FRI(-) um 17-mero;

-GGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3 foi usado para determinar a restante sequência

Em adição para a cadeia leve de CC83

Ju(-) um 24-mero:

-CCAACTTTGTCCCCGAGCCGAACG-3 e também 83 L CDR2(-), um 17-mero:

-CAGGGACTCCAGTGTGC-3 foi usado para determinar a restante sequência

Em adição para a cadeia leve de CCS 2

J5(-):

-CGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3 foi usado para determinar a restante sequência

Para as cadeias pesadas 1 de CC46 CC49 CC83 e CCS 2 CHI ( - ) um 24-mero:

-ATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAGAT-3 complementar da sequência codificadora do extremo 5 da região constante da cadeia pesada 1 de ratinho 0 24-mero· CHl(-) foi usado para determinar a sequência de mRNA mais 3' das regiões variaveis da cadeia pesada.

Em adição para a cadeia pesada de CC49

JH4 (- ) 20-mero:

-8 7-

5¹-GGTGACTGAGGTTCCTTGAC-3’ foi usada para determinar a restante sequência.

Em adição, para a cadeia pesada de

CC83 . JH2(-)-16 mero:

5'-CTGAGGAGACTGTGAG-3 foi usado para determinar a restante sequência,

Em adição para a cadeia pesada de CC9 2 e para a cadeia pesada de B72.3, B72.3/CC9 2 HC-20 mero:

5¹-CCTTGAACTTCTCATTGTAC-3¹ foi usada para determinar a restante sequência.

os processos que se seguem foram efectua dos como descrito por Jan Gelliebter em BRL FOCUS 9_. 1 (19 87).

Os-iniciazdores oligonucleotidicos foram usados nos extremos como se segue: 100 ng de oligonucleotideo foram combinados em 50 mM Tris HC1 (pH8). 10 mM

MGC1_ . 5 mM ditiotreitol e 1 mM espermidina. 100 uCi de o o (X- P) ATP (Amersham. 5000 Ci/mMole) e 7 unidades de polinucleotideo-cinase de T4 num volume de 13 yl. A reacção decorreu a 3 72C durante 30 minutos, depois foi aquecida durante 5 minutos a 65SC para inactivar a cinase e depois adicionados 7 yl de agua para fazer a concentração 5 ng/yl.

Os iniciadores marcados foram guardados a -20SC até serem necessários.

Amostras separadas . cada uma contendo cerca de 13 microgramas de mRNA poli (A) de CC49 CC83 CC92 ou CC46 respectivamente foram ressuspensos em 10 ul de tampão de emparelhamento /”10 mM Tris HC1 (pH 8 3) e 250 mM KC1_7

Uma amostra de 5 ng de iniciador oligonucleotidico marcado nos extremos foi adicionado a cada uma das amostras de mRNA aquecido ate 80 SC durante 3 minutos e emparelhado durante 45 minutos a 6lsc para os oligonucleotideos (-) e a 65SC para os oligonucleotideos CHI (-) Usou-se transcriptase reversa de AMV (Boehringer Mannheim) a um nivel de 6 unidades para cada reacção de sequenciação de mRNA A restante da sequenciação foi efectuada como estabelecido em BRL FOCUS 9 1 (19 8 7)

Os resultados da sequenciação inicial mostraram que as cadeias pesada e leve foram rearranjadas como se segue: a cadeia leve kapa de CC49 usou um J5; a cadeia pesada 7$ 1 de CC49 usou um J„4 A cadeia leve CC83 usou

Π um J4; a gama 1 de CC83 usou um J^2 A cadeia leve kapa de CC46 usou um J2 ; a cadeia pesada de CC46 usou um J„3 A

Π cadeia leve de CC9 2 usou um J5; a gama 1 de CC9 2 usou uma J_H2

A Figura 16 mostra a sequência.de nucleotideos de Vh de CC49 com os segmentos sublinhados mostrando as sequências derivadas usando os iniciadores oligonucleotidicos em mRNA

A Figura 17 mostra a sequência de nucleotideos de de CC83 com os segmentos sublinhados mostrando as sequências derivadas usando os iniciadores oligonucleotidios em mRNA

Todas as sequências nucleotidicas da V_H de CC46 e V_H de CC92. apresentadas na Figura 2 foram derivadas usando iniciadores oligonucleotideos em mRNA.

A Figura 4a mostra a sequência de nucleotideos da VL de CC49 com os segmentos sublinhados mostran do as sequências derivadas usando iniciadores oligonucleotidicos em mRNA.

A Figura 5a mostra a sequência de nucleotideos da VI de CC83 com os segmentos sublinhados mostrando as sequências derivadas usando os iniciadores oligonucleotideos em mRNA

Toda a sequência nucleotidica da V de

Li cC92 apresentada na Figura 6 foi derivada usando iniciadores oligonucleotidicos em mRNA

Sequência proteica.

As moléculas das imunoglobulinas murinas CC49 e CC83 purificadas foram enviadas ao Dr. George Tare do serviço da University of Michigan Protein Sequencing para a analise da sequência de aminoácidos NF^-terminal 0 Dr.

Tarr usou o método de degradação de Edman; conforme modificado por Tarr. G E em Manual Edman Sequencing System. Microcharacterization of Polypeptides: A Praticai Manual / John E Shively ed Human Press Inc Clifton N J pag 155-19 4 (19 86) 7 Resumidamente o Dr Tarr reduziu e fez a alquilação das moléculas de imunoglobulina As cadeias leve e pesada das moléculas de imunoglobulinas foram separadas por HPLC em fase reversa

-9 0-

A Figura 4b mostra a sequência de aminoacidos da de CC49 estando sublinhados os resultados da sequenciação de aminoacidos dos primeiros 24 aminoacidos da de CC49 madura A Figura 5b mostra a sequência de aminoacidos da de CC83 . com os resultados da determinação da sequência de aminoacidos dos 5 primeiros aminoacidos da de CC83 madura sublinhados. ASN-20 não foi determinada na cadeia leve de CC83 . devido à presença de resíduos de açúcar ligados em N nesta posição o que estã apresentado na experiência de PNGase F abaixo. A sequência Asn-Ile-Tre corresponde a sequência consensa Asn-X-Tre/Ser para a ligação do açúcar a Asn.

Uma vez que as cadeias pesadas das imunoglobulinas CC49 e CC83 estão bloqueadas no extremo N e portanto indisponíveis para determinação da sequência de aminoacidos o glicopeptideo nativo foi tratado com brometo de cianogenio (CNBr) para clivar nos resíduos de metionina A clivagem resultou em fragmentos que foram purificados por HPLC de fase reversa A sequenciação dos aminoacidos N-terminais foi efectuada nos fragmentos obtidos com CNBr

Os resultados da determinação de aminoacidos de um dos fragmentos peptidicos da clivagem com CNBr da de CC49 estão indicados como resíduos sublinhados na Figura 18 os resultados da determinação de aminoacidos de um dos fragmentos peptidicos obtidos por clivagem da V„ de n

CC83 com CNBr estão indicados como resíduos sublinhados na Figura 19 Tal como acontece com CC49 todas as outras sequências peptidicas correspondem a fragmentos de CNBr derivados da região constante de ratinho 1

-9 1-

Determinação do açúcar ligado em N na cadeia L de CC83

Esta experiência foi efectuada para verificar que existe um açúcar ligado em N ligado a cadeia leve de CC83 presuMvelmente em ASN-20 (ver Figura 5b)

A enzima glicopeptidase F (PNGase F) que foi isolada a partir do filtrado de cultura de Flavobacterium nenlngosepticum /Tarentino A L et al Biochemistry 24 4665-4671 (198527 clivara açucares complexos com alto têor de manose e/ou biantenarios ligados em N a ASN para gerar uma estrutura sem açucares e um residuo ASP a partir da ASN a que estava ligado A diferença no peso molecular entre a forma glicosilada e não glicosilada do mesmo peptideo pode ser determinada por SDS-PAGE

Reacções de doze microgramas com e sem PNGase F (Boehringer Manheim. Indianapolis. IN. USA) para os anticorpos murinos purificados CC49 . CC83 e CC11 F(ab )₂ (um controlo positivo) foram efectuadas num vdume de reacção final de 40 microlitros Quatro microlitros de tampão 10x (fosfato de potássio 1M EDTA di-sodico 0 .1 M pH 74) foram adicionados a cada uma das misturas de reacção Aos tubos designados com PNGase F foram também adicionados 7 5 microlitros de PNGase F e todos os tubos foram incubados a 372C durante 1 h Aos tubos de reacção adicionou-se 40 microlitros de tampão Lacmmli de diluição da amostra 2x contendo B-mercaptoetanol Um gel de 10 por cento de SDS e poliacrilamida foi sujeito a dectroforese o gel foi cortado com Coomassie Brilliant Blue R-250 e descorado A Figura 20 mostra os resultados Como se mostra na celha 2 uma nova banda (x) surge na amostra de CC83 tratada com PNGase F mas não na amostra de CC83 não trstada (celha 3) A nova banda tem um peso molecular de aproximadamente 2000-3000 inferior a banda da cadeia leve nativa o que representa a remoção de uma fracção de açúcar ligada em N O unico sitio consensas de glicosilação para a cadeia leve de CC83 e em ASN20 assim assumiu-se que este e óefacto o sitio de glicosilação e encontra-se o motivo porque não apareceu ASN na analise da sequência N-terminal das cadeias leves de CC83. A cadeia leve de CC49 não altera a sua mobilidade quanto tratada com PNGase F (calha 6). mas observou-se uma nova banda para o fragmento da cadeia pesada de CC11 F (ab )₂ (calha 4 ) que serve como controle positivo Os dados da sequência de mRNA da cadeia pesada de CC11 indicam um sitio consensus de glicosilação ao doninio V (dados não apresentados) os padrões (Calha 1) são albumina do soro boivina (BSA) PM 68000 e o inibidor da tripsina de soja (STI) PM 21 500

Sequencia de DNA

O DNA de plasmideo foi sequenciado directamente usando o kit¹ de sequenciação de DNA sequenase adquirido a United States Biochemical (USB) Cleveland

OH USA Segiu-se o protocolo da USB para sequenciar o

DNA de cadeia dupla O DNA de cada uma das regiões viáveis foi sequenciado usando o oligo J„ ou J. determinado a Π b partir da informação da sequência de mRNA como sendo especifico para cada gene das cadeias pesada e leve produtivamente rearranjado. respectivamente

Depois de determinadas as sequências iniciais a sequência foi prolongada ainda usando iniciadores adicionais Os iniciadores adicionais foram sintetizados usando informação tirada das sequências previamente geradas

-9 3-

□sando a técnica atras descrita obtiveram-se as sequências de DNA completas dos exões da região variavel da cadeia pesada e dos exões da região variavel da cadeia leve de CC49 e de CC83 A sequência de DNA foi compilada e analisada usando o programa de software para anaTM lise da sequência de DNA da Hitachi DNASIS

Para a sequenciação de DNA fizeram-se ias seguintes oligonucleotideos iniciadores:

(1) Para ambas as cadeias leve, intrão CK (-);

-GAAAACCTGTGTCTTACAC 3 (2) Para a cadeia leve de CC49 CC49 FRI (+):

-GTACCTGTGGGGACATTG 3 e JK5 (-)-23 mero

CGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3 (3) Para a cadeia leve de CC83 CC83 CDR 2 (-)

-CAGGGACTCCAGTGTGC 3 intrão CC83 L (-):

GACTTCAAGATACAAATGTTAG-3

-9 4-

e JK4 (-)-20 mero;

CCAACTTTGTCCCCGAGCCGAACG

As sequências de nucleotideos completas para de CC49 e de CC83 estão apresentadas nas Figu ras 4a e 5a e respectivamente

Para a cadeia pesada de CC49 J 4 (-)

Π

-20 mero:

GGTGACTGAGGTTCCTTGAC-3 e

Intrão J„ 4 (-):

Π

-GCAATGCTCAGAAAACTCC

Para a cadeia pesada de CC83 JH2 (-)-16 mero:

CTGAGGAGACTGTGAG-3 e Intrão ( - ) :

-GCAGTAAAATCTATCTAAGCTG

-9 5-

Em segyida a sequenciação de cada uma das cadeias pesadas foi prolongada com as seguintes sequências : CC49 /83 HC /5 (+ ) .

-GCACTGCTCATGATATGCAAATC-3 ;

CC49 /83 HC/5 (-)

-GATTTGCATATCATGAGCAGTGC-3 ; e cadeia/tde CC49 /83 FRI (-)

-CTAGCGTCAGACTGCTG-3

As sequências de nucleotideos completas para V de CC49 e V de CC83 estão apresentadas na

Π Π

Figura 2

Fizeram-se comparações entre a sequência de mRNA caracterizada e a sequência de DNA caracterizada e entre a sequência de aminoacidos caracterizada com a sequência de aminoacidos prevista a partir da sequência de DNA. Com base nestas comparações, os clones dos plamideos foram identificados como contendo a sequência de DNA correcta para codificar as regiões variaveis das cadeias leves e pesadas de CC49 e de CC83 .

As sequências de aminoacidos previstas a partir das sequências de nucleotideos das regiões variaveis da cadeia pesada de CC49 e de CC83 como se msotra na Figura 2 mostram grande semelhança de sequências ao lon-9 6região â recome noΗ⁴ θ ³ go das regiões de regiões hipervariaveis 1 e 2 A hipervariavel 3 e muito diferente nas duas devido binação da região com diferentes sequências D ti ffieadamente a cadeia pesada de CC49 usou uma J gama 1 de CC83 usou uma J„ 2 π

DNA 5 relativamente regiões variaveis de que os dois genes da derivados dos mesmos

A grande homologia de sequências de as regiões codificadoras nos genes das cadeia pesada de CC49 e CC83 mostra região variavel da cadeia pesada foram exões germinais.

Isolamento do gene orecursor germinal V TAG oara a cadeia

Π oesada de CC46 CC49 CC83 e CC9 2

Os processos usados para isolar o gene precursor germinal das regiões variaveis da cadeia pesada de CC46 CC49 CC83 e CC9 2 foram essencialmente os usados para isolar a região variavel da cadeia pesada de

CC49 excepto o DNA usado para gerar a biblioteca LAMBDATM

-ZAP provir de uma linha celular de hibridoma irrelevante (i e uma linha celular que produz anticorpos que não se ligam apreciavelmente a TAG 72) Faz-se o depiste de uma biblioteca genomica contendo aproximadamente 900 000 placas tendo-se isolado um clone positivo. O clone positivo foi designado pV ^TAG- oV ·Χ TAG tinha cerca de 5 .2 kb e o

Π Π tamanho da inserção de DNA foi determinado por mapeamento com enzimas de restrição como sendo de cerca de 2.2 kb

-9 7Sequência de DNA de V Í^TAG

Π

(Jsaram-se os seguintes iniciadores oiigonucleotidicos na determinação da sequência de DNA de V_UO<.TAG:

Π

B72 3/CC92 HC-20 mero: 6 -CCTTGAACTTCCTCATTGTAC-3 ; CC49/CC83 HC 5 (M: 5 -GCACTGCTCATGATATGCAAATC-3 ;

CC49/CC83 HC 5 (-): 5 -GATTTGCATATCATGAGCAGTGC_3 ;

V_h=<TAG IVS ( ): 5 -CTAAAGTGGAGTCAGGGCCTG-3 ;

V^TAG IVS (-): 5 -CAGGCCCTGACTCCACTTTAG-3 ;

V TAG CDR 2 (-t): 5 -GAATGGATTGGATATATTTCTC-3

Π

A sequência completa de nucleotideos de V^c< TAG esta apresentada na Figura 2

Isolamento dos genes da região constante da cadeia pesada humana

As construções dos plasmideos contendo as varias regiões constantes da cadeia pesada (ργΐ p p2 p jç 3 e p ^4 ) foram proporcionadas pelo Dr Ilan R Kirsch do national Câncer Institute Bethesda Maryland

O mapeamento com eazimas de restrição foi efectuado nestes genes para confirmar a sua identidade Os mapas de restrição das regiões constantes humanas estão apresentadas na Figura 21

-9 8-

Cadeia leve quimérica

Região V de CC49 murina sitio Hind III do DNA genomico da cadeia leve de CC49 situado na região do intrão murino entre J5 e (ver Max Edward E et al J Biol Chem 256 5116 (1981) foi perdido no processo de clonagem onde os sitios HindIII semi-preenchidos foram ligados a sitios Spe I semi-preenchidos no vector LAMBDA-ZAP O plasmideo pRLlOl (Figura 9) possui esta modificação 0 sitio HindIII do intrão foi regenerado conforme descrito nos passos abaixo de modo a permitir que um fragmento HindIII-BamHI de DNA de cadeia leve kapa germinal humana (ver Hieter P et al J Biol Chem 257 1516 (1982) se ligue directamente a região variavel murina Todos os passos foram efectuados usando técnicas de biologia molecular convencioaais familiares para os entendidos no assunto e podem ser encontradas num manual como seja a Maniatis

Isolou-se um f rag meto Bam ΗΙ-Pst I de 1 69 kb a partir do pRLlOl descrito atras Isolou-se um fragmento BamHI-pst I de 2 96 kb a partir de pBluescript SK (-) (adquirido a Stratagene) descrito atras os dois fragmentos foram então ligados e isolado pRL!03 abaixo

O plasmideo pGDl (descrito atras) foi digerido com as enzimas de restrição PstI e HindIII para dar o fragmento necessário de 1 03 kb com intrão e pRLIO 3 foi também digerido com as enzimas de restrição PstI e HindIII para remover um fragmento pequeno de DNA no poll-adaptador

Os fragmentos resultantes foram ligados com DNA-ligase de T4 para produzir um plasmideo de 5 68 kb designado pRLIO4 Em baixo esta apresentado um mapa de restri ção parcial de pGDl e pRLIO4

-100

<^J3

J-

BamHl '

V

-101-

Região C„ humana plasmideo phum C foi proporcionado pelo Dr. John. Roder mt. Sinai Research Institute Toronto Ontario. Canada O plasmideo derivou de pBR322 com um fragmento Bam HI de 12 kb contendo inserido o exão de C humana

K p3R322 esta descrito na pagina 171 do catalogo de Stratagene de 1987 O mapa de restrição do fragmento Bam HI de 12 kb esta apresentado abaixo /de Heiter P et al J Biol Chem 257 1516 (19 82) 7 phumCk

plasmídeo phum foi digerido com as enzimas de restrição HindXII e BamHI para dar um fragmento de 5 0 kb contendo o exão humano pRLlO4 foi digerido com as enzimas de restrição FspI e HindIII para dar um fragmento de 4.2 kb contendo os exões da região variavel da cadeia leve de ratinho de CC49 .

Os dois fragmentos resultantes foram ligados com DNA-ligase de T4 para produzir um fragmento de 9 .2 kb entre a mistura de fragmentos resultantes Esta mistura foi digerida com BamHI para dar uma construção BamHI quimérica da cadeia CC49L tendo 7 7 kb e extremos coesivos Bam-H a qual contem os exões da região variavelkde ratinho e o exão da região constante humana (Kapa) Estas construções utilizam as sequências potenciadoras humanas e as sequências de promotor murino fragmento quimérico BamHI contendo os exões da região variavel da cadeia leve murina (L e V ) e o exao da região constante kapa (k) humana foi ligado ao sitio Bam Hl do plasmídeo pSV2 neo (5 6 kb) um plasmídeo derivado de pBR322 contendo o gene marcador seleccionavel neo (adquirido a ATCC) A presença do gene neo activo torna a célula resistente a inibição do crescimento por Geneticin uma droga do tipo neomicina também designada G418 fragmento quimérico BamHI foi inseri do no pSV2 neo em amabas as orientações como se mostra abaixo Construiram-se ambas as orientações de transcrição do gene da cadeia leve quimérica relativamente ao gene neo 0 plasmídeo pSV2 neo foi linearizado no sitio Bam Hl desfos forilado (de acordo com processos estabelecidos em Maniatis) usando foáfatase alcalina de intestino de vitela (para evitar auto-ligação) e ligado aos fragmentos NBamHI da cadeia L quimérica de CC49 descritos atras

-10 3-

Psil

As orientações da transcrição do gene neo e da cadeia leve quimérica de CC49 estão indicadas por setas em DRL150 e pRLlO5. As partes derivadas de pSV neo estão indicadas Estes plasmideos foram purificados em larga escala a partir de uma fermentação em escala preparativa (1.0 1) de clones de E coli replicando cada um dos plasmideos Os plasmideos purificados foram usados para introduzir a cadeia leve quimérica de CC49 em células de plamacitoma SP2/0 como discutido abaixo

Região V de CC83 murina e região C., humana

Li K

O sitio Hind III em pRL200 que foi perdido no processo de clonagem da cadeia leve de CC83 foi regenerado pelo mesmo motivo que na construção da cadeia leve quimérica de CC49 . A regeneração foi conseguida como se segue. O plasmideo pRL200 foi linearizado num sitio unico Nhe I e ambos os seus extremos coesivos foram convertidos em extremos cerses por preenchimento com dNTPs e DNA-polimerase I. Um adaptador fosforilado Bam Hl (adquirido a New England Biolabs) foi ligado ao sitio preenchido- O novo plasmideo foi designado pRL201 e esta apresentado abaixo

-10 5-

fragmento BamHI-Pst I de 2 5 kb do pRL201 contendo o DNA genomico da região variavel da cadeia leve de CC83 foi convenientemente ligado ao fragmento vector BamHI-PstI de 4 kb do pRL.104 que foi atras descrito nas cons truções da cadeia leve de CC49 e que ja possuia o fragmento intrão portador de HindIII O novo plasmideo foi designado pRL202 e esta apresentado abaixo

L

-10 6-

fragmento FspI-HindIII de aproximadamente 5 05 kb do pRL202 foi isolado e ligado com o fragmento HindIII-BamHI de 5 0 kb contendo humana ja descrito para a construção quimérica da cadeia leve de CC49 A obtenção do vector da cadeia leve de CC83 foi conseguida a partir deste ponto de modo idêntico ao efectuado para a cadeia leve de CC49 . A construção quimérica resultan te BamHI de 8.5 kb e contendo a cadeia leve de CC83 foi também ligada a pSV2 neo Bam HI (desf osf orilado) e os plasmideos com ambas as orientações possíveis da inserção foram obtidos conforme esquematizado abaixo.

-10 7-

As orientações da transcrição do gene neo e da cadeia leve quimérica de CC83 estão indicadas por setas em pRL203 e pRL230. Estes plasmídeos foram purificados em larga escala a partir de uma escala preparartiva (1.0 1) de fermentação num incubador comercial de clones de E. coli replicando cada um dos plasmídeos. Os plasmídeos purificados foram usados para introduzir a cadeia leve quimérica de CC83 em células de plasmacitoma Sp2/0 . como discutido mais tarde

As quatro construções de plasmideo contendo a cadeia leve quimérica (pRLlO5 pRL150 pRL203 e pRL230) podem ser linearizadas por digestão com a enzima de restrição Ast II O sitio Aat II nos plasmídeos fica numa região que não e essencial para a expressão do gene dacadeia leve quimérica ou do gene da marca seleccionavel neo

Cadeias pesadas quiméricas

Exões da região constante gama humana

O vector plasmideo usado para efectuar as construções de cadeias pesadas quiméricas designa-se pSV2gpt, descrito em Mulligan e Berg. Selection ofanimal cells that express the E coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransf erase¹' Proc natl Acad Sei (USA) 78 (4) 20 72-20 76 (19 82) pSV2gpt e um plasmideo derivado de pBR322 contendo o gene da marca seleccionavel guanino fosforibosil-transferase (gpt ) o qual pode ser usado para o crescimento selectivo em meio contendo acido

Eco RI de pSV2gpt Para VTL ξ 2 micofenolico Para preparar pSVgpt como recipiente para os exões C γΐ C /2 C /3 C /4 ele foi digerido em Eco RI e Bam HI 0 DNA digerido foi fraccionado num gel de 4 por cento de poliacrilamida e o fragmento vector de 4.5 kb foi recuperado do gel por electroeluição como descrito em Maniatis. Este plasmideo linearizado foi designado pSV2gpt/R/B. na Figura 22 esta apresentado um mapa do plasmideo. Ele é capaz de aceitar fragmentos com extremos Eco RI-Bam HI.

os sitios HindIII 5 . presentes nos fragmentos da região constante da IgGl humana, foram convertidos em sitios Eco RI para a clonagem directa no sitio p θ

Eco RI no vector pBR322 usou-se o sitio r⁴ fragmento contendo os exões de C γΐ humana foi obtido por digestão e linearização de p Vl ^com HindIII seguido de preenchimento dos extremos coesivos HindIII usando os quatro dNTPs e o fragmento Klenow da DNA-polimerase para tornar cerses os extremos HindIII.

Um adaptador EcoRI foi ligado aos extremos cerses para substituir o sitio HindIII com um sitio EcoRI. Esta construção foi então digerida com EcoRI e BamHI para produzir um fragmento de 7.8 kb contendo os exões de C ^1 Este fragmento foi designado C ^1-7 8 kb

-109 -

Os fragmentos foram então ligados nos sitios EcoRI-BamHI do pSV2-gpt/R/B Este vector (pSV2-gpt- n- 1 2) permite inserir qualquer gene da região variavel da cadeia pesada murina (com extremos EcoRI) no sitio EcoRI dos vectores da cadeia pesada de IgG humana Mais especificamente 125 ng do fragmento C )0. -7 8 kb humano foi ligado a 100 ng do vector pSV2gpt/R/B linearizado num volume de 10 ul usando 400 unidades de DNA-ligase de T4 (adquirido a New England Biolabs). Células competentes congeladas de E coli DHi da Invitrogen (San Diego . CA) foram usadas para transformação com uma reacção de ligação de acor do com o protocolo da Invitrogen. O plasmideo resultante foi designado pSV2gpt ^1-7.8. Na Figura 23 está apresentado um mapa do plasmideo pSV2 gpt ^1-7.8.

Em adição, produziu-se um outro fragmento mais pequeno contendo os exões C γ 1 Questões relacionadas com o tamanho total do vector da cadeia pesada quimérica com um fragmento C 1 de 7 8 kb um vector pSV2-gpt /R/B de 4 5 kb e uma região variavel de CC49 de 1 9 kb (total = 14 2 kb) levou-nos a reduzir o tamanho do fragmento Eco RI-BamHI de C γΐ com 7 8 kb A região codificadora de C^çl- 7 8 kb ocupa apenas o primeiro terço do extremo 5 do fragmento

A redução do tamanho foi conseguida através da conversão de um sitio Pvu II a jusante num sitio BamHI através da adição de extnanos cerses de um adaptador BamHI O sitio HindIII de p -1 foi convertido num sitio Eco RI por digestão de ρ γ-l com HindIII preenchimento do extremo 3 para criar um extremo cerse e adição de adaptadores EcoRI como atras O sitio Psu II 2.3 kb a jusante foi convertido num sitio Bam HI por subsequente digestão com PvuII e ligação dos adaptadores Bam HI directamente aos extremos cerses Pvu II. Esta construção foi então digerida com EcoRI e Bam HI para libertar um fragmento de 2,3 kb contendo os exões C /Ί 0 fragmento EcoRI-BamHI encurtado (2.3 kb) ainda contem os exões de 1 e a sequência de poliadenilação 3Ί$~ Isto reduz o tamanho total do vector em 5 5 kb tornando a construção mais manipulável (total =87 kb)

Aproximadamente 200 ng do fragmento de C Yl humana de 2 3 kb foi ligado a 100 ng do vector plasmídeo pSV2gpt/R/B linearizado num volume de 10 ul usando 400 unidades de DNA-ligase de T4 (New England Biolabs) Células E coli competentes congeladas adquiridas â Invitrogen foram transformadas com a reacção de ligação de acordo com o protocolo da Invitrogen O plasmídeo resultante foi designado pSV2gpt/ 1-2 3 na Figura 24 esta apresentado um mapa do plasmídeo pSV2gpt 1-2 3

Os fragmentos de DNA contendo os outros três exões da região constante de IgG humana foram também isolados . Os exões C 2 foram recuperados do plasmideo p /2 como um fragmento de 4,0 kb EcoRI-Bam HI. Os exões C 3 foram recuperados do plasmídeo p )p 3 como um fragmento EcoRI-Bam HI de 8 0 kb. Os exões C 'p 4 foram recuperados a partir do plasmideo p 4 como um fragmento EcoRI-BamHI de 7 6 kb Os fragmentos foram separadamente ligados a pSV2gpt/R/B como descrito para 0)^1-7 8 e C^l-2 3 Os mapas dos plasmídeos resultantes estão apresentados na Figura 25 pSV2gpt-')Ç' 2: Figura 26 pSV2gpt- ^3 e Figura 27 pSV2gpt-)Ç 4

-1J1Construções quiméricas da cadeia pesada:

Obtiveram-se construções quiméricas da região constante 'Ç' 1 humana e da região variável da cadeia pesada através da inserção de um fragmento contendo os exões da região variavel da cadeia pesada murina em plasmideos contendo os exões da região constante 1 humana descrito como se segue

Fragmentos EcoRI contendo os genes da região variavel da cadeia pesada murina das células de hibridoma CC49 e CC83 foram então ligados a cada um dos vectores pSV2-gpt contendo 1~V⁴ (pSV2gpt-1) pSv2gpt-^2: pSV2gpt- 'Ç' 3 : pSV2gpt- 4) como se segue

CC49

Um fragmento contendo os exões da região variavel da cadeia pesada codificador da região variavel da cadeia pesada de CC49 foi preparado por digestão de 14 ug de pHH49 com 50 unidades de EcoRI {adquirido a BRL) a 372C durante 2 horas.

O produto da digestão foi fraccionado num gel de 4 por cento de poliacrilamida e o fragmento EcoRI de 1 ,9 kb contendo os exões da região variavel da cadeia pesada de CC49 foi recuperado por electroeluição como descrito por Maniatis Este fragmento foi designado f49R

Um fragmento contendo a sequência de 7 8 kb codificadora de Y 1 foi preparado como se segue

Aproximadamente 50 ug do vector pSV2gpt ^1-7 8 foi digerido com EcoRI O fragmento resultante foi desfosforilado (para evitar a auto-ligação) usando fosfatase alcalina de intestino de vitela como descrito por Maniatis O fragmento foi purificado a partir de um gel de 0 8 por cento de agarose por electroeluição Este vector foi designado pSV2gptY1-7 8/R

O sitio EcoRI esta situado 245 pb a montante dos sitios de iniciação da transcrição e contem o promotor e a sequências especificas de tecido necessárias para uma expressão eficaz. As regiões de intrõies 3 dos genes da região variavel contém as sequências potenciadoras da cadeia pesada murina que estão ausentes nos vectores da cadeia pesada de IgG humana Portanto os vectores quiméricos da cadeia pesada usam ambas as sequências de promotor e potenciador murinas

Aproximadamente 325 ng de pSV2gpt yi-7 8/R linearizado foi ligado com 188 ng de f49R num volume de 10 ul com 1 unidade de DNA-ligase de T4 (BRL) Células competentesdcongeladas de E coli AG-1 de Stratagene foram transformadas com a reacção de ligação de acordo com o seu protocolo O plasmideo resultante foi designado p49 \l-7 8 A Figura 28 ilustra um mapa do plasmideo cp 44^1-7 8

Aproximadamente 50 ug do vector pSV2gpt γΐ-2 3 foi digerido com ECORI como para SV2gpt γΐ-78 O fragmento resultante foi desfosforilado usando fosfatase alcalina de intestino de vitela como desrito por Maniatis O fragmento foi purificado a partir de um gel de 0,8 por cento de agarose por electroeluição Este plasmideo linearizado foi designado pSV2gpt'yi-2 3/R

Aproximadamente 300 ng do plasmideo pSV2 gpt Y1-2 3/R linearizado foi ligado com 188 ng de f 49 R num volume de 10 ul com 1 unidade de DNA-ligase de T4 (BRL) As células competentes congeladas de E.coli AG-1 da Stratagene (La Jolla. CA) foram transformadas com a reacção de ligação de acordo com o seu protocolo. O plasmideo resultante foi designado p49 ¢/1-2.3. A Figura 29 ilustra um mapa de plasmideo para p49 γΐ-2.3.

Os plasmideos pSV2gpt- y 2. pSV2gpt- /3 e pSV2gpt-'jÇ4 foram digeridos separadamente em EcoRI para produzir os vectores lineares dos plasmideos pSV2gpt-Ί/2/R. pSV2gpt-'Ç3/R e pSV2gpt-4/R respectivamente Cada um destes 3 vectores plasmideo lineares foram separadamente ligados com f49R Os mapas dos plasmideos resultantes estão apreaeitados na Figura 30 p49-^/2; Figura 31 ρ49-^3·.

e Foigura 32 p49 4

CC83

Construções quiméricas contendo a região variavel da cadeia pesada de CC83 foram geradas de modo semelhante as construções quiméricas de CC49 . Um fragmento contendo os exões da região variavel da cadeia pesada codificadora da região da cadeia pesada de CC83 foi preparado por digestão de 19 ug de pHS83 com 50 unidades de EcoRI (adquirido a BRL) a 372C durante 2 horas. O produto da digestão foi fraccionado num gel de 4 por cento de poliacrilamida e o fragmento EcoRI de 2.9 kb resultante contendo os exões da região variavel da cadeia pesada de CC83 foi recuperado por electroeluição como descrito em Maniatis. Este fragmento foi designado f83R.

Aproximadamente 300 ng do plasmídeo pSv2gpt Y'l-7.8/R linearizado, obtido como atras, foi ligado com 270 ng de f83R num volume de 10 çl com 1 unidade de DNA-ligase de T4 (adquirido à BRL). Células competentes congeladas de E. coli AG-1, adquiridas à Stratagene, foram transformadas com a reacção de ligação de acordo com p protocd.o da Statragene. 0 plasmídeo resultante foi designado p83^ 1-7.8. A Figura 33 ilustra o mapa do plasmídeo p83 yi-7.8.

Aproximadamente 90 ng do plasmídeo linearizado pSV2gpt-Y~l-2.3/R . obtido atrás, foi ligado com 2 70 ng de f83R num volume de 10 ul com 1 unidade de DNA-ligase de T4 (BRL). Células competentes congeladas de E. coli AG-1 da Stratagene foram transformadas com a reacção de ligação de acordo com o seu protocolo. O plasmideo resultate foi designado ρ83γ·1-2.3. A Figura 34 ilustra o mapa do plasmideo p83^1-2.3.

Os plasmídeos pSV2gpt-^2, pSV2gpt-\3 e pSV2gpt- 4 foram separadamente dirigidos como atrás para pSV2gpt-)^2/R, pSV2gpt-3/R e pSV2gpt-^4/R, respectivamente , com EcoRI para produzir os vectores plasmídeos lineares pSV2gpt-1^2/R, pSV2gpt-^3/R e pSV2gpt-^4/R respectivamente. Cada um destes 3 vectores plasmideo linezares foram separadamente ligados com f83R. Os mapas dos plasmideo:: resultantes estão apresentados na Figura 35 , ρδΒ-^^- 2 ;

Figura 36. p83 'Ç'- 3 e Figura 37. p83-^4.

As dêz construções de plasmídeos circulares (p49 Tl-7.8 ; p49Vl-2.3; p83 ^1-7.8: ρ83^1-2.3. p49-\'2; e p83-)Ç4) foram então linearizadas para transformação por digestão com a enzima de restrição Nde I. 0 sitio Ndel nos plasmideos e numa região que não é essencial para a expressão do gene quimérico da imunogiobulina ou para o gene da marca seleccionável. gpt. Os plasmideos necessitam de estar numa forma linear antes da transformação de uma célula recipiente para aumentar a integração seleccionada do DNA no DNA genomico da célula hospedeira

Verificação da construção

Uma vez que os fragmentos EcoRI podem ser ligados em ambas as orientações a orientação correcta foi determinada por digestão com Ncol Nas construções descritas atras as ligações correctas para a construção do plasmideo foram confirmadas por mapeamento com enzimas de restrição do plasmideo. 0 mapa de enzimas de restrição gera do através da digestão com enzimas de restrição e electrofo rese em gel foi comparado com o que pode ser teoricamente gerado a partir dos fragmentos de partida individuais. Devido à experiência com a orientação da transcrição nos vectores de cadeia leve . os vectores da cadeia pesada foram construídos apenas na orientação de transcrição oposta a do gene gpt

Transformação das células de plasmacitoma de ratinho com os plasmideos

Quando ambos os genes quiméricos da cadeia leve e da cadeia pesada foram usados para transformar a mesma célula obtiveram-se imunoglobulinas tetraméricas (f^L^)· A sintese e secreção destas proteinas de anticorpos quiméricos foi conseguida através da introdução de gens quiméricos (região V de ratinho: C humana) nas células de plasmacitoma de ratinho (Sp2/). A transformação foi conseguida por electroporação Γ Sahagan, B. G. et al J. Immunology 13 7 10 66 (19 86) 7

A expressão de genes quiméricos (região V de ratinho: C humana) nas células de plasmacitoma de ratinho trasformadas (SP2/0) foi conseguida usando duas técnicas diferentes Diferentes proporções de genes de cadeia leve para cadeia pesada podem ser introduzidos Isto e referido como cotransfecção Como alternativa podem ser obtidos clones estáveis portadores do gene da cadeia leve quimérica e subsequentemente usados num método designado transformação dirigida Em ambos os métodos a finalidade e obter clones contendo genes para a cadeia leve e para a cadeia pesada que produzem a imunoglobulina intacta H₂h₂ atras referida

A. Cotransformação

A cotransformação envolve a transfor mação de células em ambas as marcas de resistência a drogas ao mesmo tempo e subsequente selecção com uma ou ambas as drogas A cotransformação de vectores portadores da cadeia pesada e da cadeia leve (nas proporções de 1:1 a 1:10 respectivamente) foi originalmente efectuada usando apenas selecção neo. As linhas celulares resistentes a neo obtidas expressam os primeiros anticorpos IgGl quiméricos com actividade de ligação a TAG72 demonstrável. A cotransformação foi conduzida de acordo com os protocolos descritos em Cornelia Gorman, ,High Efficiency Gene Transfer into Mammalian Cells , DNA Clonlng , Vol II, D.M. Glover ed. , IRL Press. Oxford, England (19 85 )

B Transformações dirigidas

As construções contendo genes quiméricos das cadeias leve e pesada de imunoglobulinas foram sequenciadamente usadas para transformar células de plasmacitoma de ratinho Sp2/0 A transformação dirigida envolve transformação e selecção com um vector contendo um primeiro gene de resistência a drogas (i e Geneticin para o vector do gene quimérico da cadeia leve) seguido de transformação e selecção com um vector contendo um segundo gene de resistência a drogas (i e acido micofenolico para o vector do gene quinerico da cadeia pesada).

Selecção neo

Antes da transformação com os vectores pSV2-neo os quais contêm construções quiméricas da cadeia leve estabelecemos condições de selecção de drogas para a inibição do crescimento de células de plasmacitoma Sp2/0 não transformadas /'adquiridas a American Type Culture Collection (ATCC 7 através de titulação de droga tipo neomicina Geneticin (GIBCO) Os valores publicados para as concentre ções de Geneticin usadas na selecção com drogas variam então entre 100 e 1000 ug/ml As concentrações acima de 400 ng/ml inibem o crescimento das células Sp2/0 no novo sistema de cultura de tecidos

Construção de células contendo a cadeia leve

Células Sp2/0 de plasmacitoma de ratinho foram inicialmente transformadas com vectores pSV2-neo contendo a cadela leve como a seguir se descreve. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 5 por cento de soro fetal de vitela As células foram lavadas com PBS e ressuspenaas para uma concentração de 1x10 ? células viáveis/ / ml de PBS 0 8 ml de células foi transferido para uma cuvete de electroporação (em gelo) contendo 20 ug do vector PSV2-neo contendo a cadeia leve (pRL105 e pRL150 para a cadeia L quimérica de CC49 e pRL20 3 e pRL230 para a cadeia L quimérica de CC83) linearizado com a endonuclease de restrição Aat II Aat II foi inactivada por aquecimento das amostras a 65SC durante 10 minutos 0 DNA linearizado foi precipitado com etanol e subsequentemente dissolvido em 10-20 microlitros de PBS Apos 15 minutos em gelo, a electroporação foi efectuada usando um sistema de electroporação Gene Pulser com um prolongador de capacitância (BioRad) a 0,2 k volts e 960 uF. A constante tempo (t) foi geralmente de aproximadamente 26 mseg.

Após transformação, as células foram deixadas a recuperar em gelo durante 15 minutos para permitir o relaxamento das memebranas perturbadas. Em seguida, as células foram ressuspenas em 24 ml de meio RPMI 1640 contendo 5% de soro fetal de vitela (RPMI+ ) e transferidas para uma placa de 96 ou 24 cavidades Para diminuir a probabilidade da presença de mais de uma célula resistente a droga por cavidades as células foram também diluidas 10 vezes em meio (RPMI-p ) e semeadas numa outra placa de 9 6 cavidades (ou de 24) A suspensão de células foi incubada a 37SC e atmosfera de 5 por cento de CO^

Apos 48 horas (para permitir a expressão da resistência a droga) o meio foi removido e substituído por meio contendo 1 mg/ml de Geneticin

Apos 7-10 dias osclones resistentes a Geneticin foram subcultivados e as células despistadas quanto a presença de cadeias leves quiméricas por citocoloração.

Citocoloração

Amostras de cleulas foram sedimentadas numa lâmina de vidro usando uma centrifuga Cytospin-2 (Shandon Inc ) Apos secagem ao ar as células foram fixadas em acido acetico/etanol ( 5 partes de acido acético/ 95 partes de etanol) Apos 3 lavagens com PBS (sem Ca e Mg ) as lâminas foram colocadas numa caiara húmida (100% RH) e coradas durante 20 minutos com 20 ul de anticorpo de cabra anti-kapa humana-FITC; um anticorpo conjugado com um corante fluorescente que e especifico para as cadeias leves kapa humanas. O anticorpo conjugado foi diluído a 1:3 com 1%BSA em PBS. Após lavagem durante a noite com PBS, as lâminas foram montadas com fluoromount-G, meio de montagem histológico (adquirido a Southern Biotech) sob uma lâmina. As lâminasforam observadas com um microecopico Olympus modelo BH-2 equipado com um dispositivo de epi-iluminação com UV.

Com base na intensidade da fluorescência as construções com a orientação da cadeia leve na orientação de transcrição oposta relativamente â direcção de transcrição do gene neo no vector observou-serdarem o nivel mais alto de expressão da cadeia leve Assim dRL105 foi a construção da cadeia L de CC49 preferida e pRL230 foi a construção da cadeia L de CC83 preferida Como resultado destas experiências usaram-se nas transformações dirigidas as seguintes linhas celulares contendo a cadeia leve quimérica (derivadas de Sp2/0):

Para a cadeia L quimérica de CC49 obteve-se uma linha celular (49K-13-13) que expressava a cadeia leve quimérica derivada de CC49 . Esta linha celular foi usada em todas as transformações dirigidas subsequentes com vectores da cadeia pesada quimérica para construções usando a cadeia leve quimérica CC49

Para a cadeia L quimérica de CC83 obtiveram-se três linhas celulares (83k-26-5 83K-34-10 e

83k-42-2) que expressam a cadeia leve quimérica derivada de CC83 Uma linha celular (83k-26-5) corou mais intensamente do que as outras e tinha regiões localizadas de imunofluorescência citoplasmica As três linhas celulares foram comparadas quanto a sua capacidade relativa para produzir niveis elevados de anticorpo qiimerico após transformação com o vector da cadeia pesada quimérica de IgGl de CC83. Mais clones expressando os anticorpos quiméricos foram derivados por electroporação do alvo 83-34-10 do que a partir das duas outras linhas celulares alvo de cadeias leves quiméricas. Portanto, a linha celular 83k-34-10 da cadeia leve foi usada como alvo para subsequentes electroporações com vectores da cadeia pesada quimérica nas construções contendo a região variavel da cadeia leve de CC83

Geração de clones resistentes a gpt portadores de construções quiméricas da cadeia H de CC49 e de CC83

Antes da tranformação com os vectores pSV2-gpt os quais contêm construções quiméricas da cadeia pesada foi estabelecida a selecção com drogas para a inibição do crescimento de células de plasmacitoma Sp2/0 não transformadas / adquiridas a American Type Culture Collection (ATCC_7. As condições para a selecção com drogas das células transformadas com os vectores pSV2-gpt foi mais dificil de estabelecer. O gene gpt de E. coli que codifica aenzima guanosina-fosforribosiltransferase . confere a capacidade de utilizar xintamina e hipoxantina como substractos para a biossintese de guanina quando a via metabólica da guanina de mamiferos è inibida pelo acido micofenolico (MPA).

Os valores publicados para as concentrações de MPA que permitem o crescimento de outras linhas celulares linfoides transformadas com os vectores pSV2-gpt encontrou-se serem quase duas ordens de grandeza muito elevados para permitirem o crescimento de células Sp2/0 transformadas em vectores pSV2-gpt no nosso sistema de cultura de tecidos Subseqiuentemente uma concentração de 0 1 ug/ml de MPA \erificou-se ser óptima para a selecção da resistência a gpt Em adição verificou-se ser necessária a adição de aminopterina de timidina (para bloqaear a via da guanina)

Obtenção de clones produtores do anticorpo quimérico C4

CH44-1

Usou-se células 49k-13-13 como alvo das construções de cadeias pesadas quiméricas As células foram transformadas com 20 ug do vector contendo o DNA da cadeia pesada quimérica (p49 Yl-7 8 ou p45 yl-2 3) linearizado por digestão com Ndel A transformação por electroporação foi efectuada como atras para as cadeias leves quiméricas

No entanto a selecção apos 48 horas foi efectuada substituindo o meio contendo geneticina com meio contendo geneticina e 0 3 ug/ml de acido micofenolico 250 ug/ml de xantina e 10 ug/ml de hipoxantina

-123-

As células trasformadas cresceram ate serem visíveis colonias macroscópicas em 14 dias Naquela altura . 50 ul do sobrenadante foi removido e testado por métodos de ELISA quanto a ligação a TAG e expressão da região constante de IgG humana. As cavidades contendo células com ligação positiva a TAG foram expandidas para placas de 24 cavidades com meio fresco para selecção com drogas e deixadas crescer durante 3-7 dias.

A subclonagem foi efectuada como se segue. As contagens de células viáveis foram determinadas e as células semeadas novamente em duas placas de 56 cavidades Uma placa recebeu 50 células viáveis e a outra 250 células viáveis As células subclonadas foram expandidas para placas de 6 cavidades ate a densidade celular ser suficiente para permitir o armazenamento em azoto liquido ao caso de ser necessária nova subclonagem

Apos subclonagem os clones que apresentaram a produção de anticorpo quimérico mais elevada foram seleccionados quanto a produção de anticorpo quiméricos em bio-reactores

CH 44-2

Os processos usados para transformar sequencialmente as células de plasmacitoma SP2/0 na construção de CH44-1 foram repetidos com excepçao de 20 ug de p49-Y2, terem sido usados como vector da cadeia pesada quimérica.

CH44-3

Os processos usados para transformar sequenciadamente as células de plasmacitoma Sp2/0 ça constru ção de CH44-1 foram repetidos com excepção de terem sido usados 20 ug de p49 - V3 como vector da cadeia pesada

CH44-4

Os processos usados para transformar sequenciadamente as células de plasmacitoma Sp2/0 na constru ção de CH44-1 foram repetidos com excepção de terem sido usados 20 ug de p49 - 4 como vector da cadeia pesada

Geração de clones produtores do anticorpo quimérico 88

CH88-1

Os processos usados para transformar sequenciadamente as células de plasmacitoma Sp2/0 na constru ção de CH44-1 foram repetidos com as seguintes excepções:

Células 83k-26-5 83k-34-10 e 83k-42-2 apresentando produção da cadeia leve quimérica de CC83 foram transformadas como descrito na transformação de CH44-1 com excepção de se ter usado como vector da cadeia pesada 20 ug de peS^l-V.e ou p83 ^T-2.3, o vector pSV2 gpt que

-125contem o gene da cadeia pesada quimérica de CC83

CH88-2

Os processos usados para transformar sequenciadamente as células de plasmacitoma Sp2/0 na constru ção de CH88-1 foram repetidos com excepção de se ter usado 20 ug de p83-V2 como vector da cadeia pesada

CH88-3

Os processos usados para transformar sequenciadamente as células de plasmacitoma Sp2/0 na constru ção de CH88-1 foram repetidas com excepção de se ter usado 20 ug de p83-íf 3 como vector da cadeia pesada.

CH88-4

Os processos usados para transformar sequenciadamente as células de plasmacitoma Sp2/0 na constru ção de CH88-1 foram repetidas com excepção de se ter usado 20 ug de p83- 4 como vector da cadeia pesada

Geração de clones produtores do anticorpo quimérico 84

Devido ao elevado grau de semelhança das sequências entre as regiões variáveis da cadeia pesada de CC49 e CC83. geraram-se anticorpos quiméricos cujas cadeias leve e pesada foram obtidas a partir de ancestores diferentes por transformações dirigidas mistas . Para gerar ambvas as combinações mistas . os vectores da cadeia quimérica pesada isotipo fr 1 de CC49 e CC83 foram electroporados nos alvos de cadeias leves quiméricas 83k34-10 e 45k-13-13 respectivamente As linhas celulares resultantes foram designadas CH48-1 e CH84-1 onde a primeira designação numerica representa as cadeias pesada e eleve parentais respecti vamente Por exemplo CH48-1 representa o isotipo y1 com a cadeia pesada derivada de CC49 e a cadeia ]s/e derivada de CC83

O anticorpo composto CH48-1 não se liga a TAG 72 Xsto não foi devido a incapacidade para fazer anticorpos quiméricos bona fida uma vez que a maior parte das células resistentes a drogas produzem IgG quiméricas (conforme determinado por analise de ELISA usando anticorpos de cabra anti-Ig humaba com anticorpo de cabra anti IgG humana-fosfatase alcalina como sonda). No caso de existir alguma afinidade de ligação ela e significativamente inferior ao observado para o anticorpo de orimeira geração B72.3. a qual tinha aproximadamente uma ordem de grandeza a menos de afinidade para TAG72 do gene CC49 ou CC83 .

Surpreendentemente. CH84-1 ligou-se a TAG-72 com afinidade semelhante aos seus progenitores Este novo anticorpo foi gerado de novo no nossos laborstorio e ainda não foi detectado na natureza

Realizaram-se estudos de competição para determinar a especificidade deste novo anticorpo misto CH84-1 Deve-se notar que CC49 e CC83 apresentasse algum reconhecimento competitivo para o antigenio TAG72. Foi encontrado que CH84-1 compete mais com CC49 para a ligação a TAG72 do que com CC83 Isto indicaria que a especificidade para a ligação a TAG72 reside na cadeia leve.

Os isotipos humanos )j~2 . 3 e 4 foram também gerados com este anticorpo misto, produzindo clones CH84-2, CH84-3. CH84-4.

CH 84-1 processo usado para transformar sequencialmente as células de plasmacitoma Sp2/0 na constru ção de CH 44-1 foram repetidos com a seguinte excepção:

Células 49K-13-13 apresentando produção da cadeia leve de CH44 por citocoloração foram então transformadas como descrito nas transformadas de CH44-1. com excepção de 20 ug de p83 1-2 3 o vector pSV2gpt que contem o gene da cadeia pesada de CH83 substituir p49 ^l-2 3 o vector pSV2gpt que contem o gene da cadeia pesada de CH44 .

CH84-2

Os processos usados para transformar sequenciadamente células de plasmacitoma Sp2/0 na construção de CH84-1 foram repetidas com excepção de 20 ug de p83- J/2 substituir ρ83γΐ-2 3

Os processos usados para transformar sequencidamente as células de plasmacitoma Sp2/0 na construção de CH84-1 foram repetidas com excepção de 20 ug de p83- Ό substituir p83 K~1 — 2 .3

CH84-4

Os processos usados para transformar sequenciadamente células de plasmacitoma Sp2/0 na construção de CH84-1 foram repetidas com excepção de 20 ug de p83- /4 substituir p83 )Çl-2 3

Purificação dos anticorpos recombinantes

As células expressando os anticorpos quiméricos foram removidas por centrifugação a partir do meio de cultura e o meio foi filtrado através de um filtro de 0 .2 um. Os anticorpos quiméricos foram purificados em dois passos a partir dos sobrenadantes de cultura. No primei ro passo da purificação, a cassete de afinidade com proteína A (Nygene Corporation, Yonkers, NY) foi utilizada de acordo com as especificações do fabricante. Até 1.0 1 dosobrenadante de cultura foi passado através de uma cassete com 1 mg de ca; cidade, a 5 ml/min. A cassete foi lavada com tampão de fosfatos salino (PBS) para remover os vestigios de albumina. O anticorpo quimérico foi recuperado por eluição com tampão de nitrato de sodio 0 1M pH 3.0 . O pH das fracções contendo o anticorpo quimérico foram imediatamente ajustadas a neutralidade com uma solução 1M da base Trizma A purificação final foi conseguida a partir desta solução apos concentração numa variedade 'centricon 30 Amicon por filtração em gel usando uma coluna Pharmacia Superose 12 HR 16/50 como especificado pelo fabricante (Pharmacia Piscataway NJ)

EXEMPLO: Obtenção de uma imunoglobulina contendo a região variavel germinal de V_u ^TAG murino

Π

Os exemplos que se seguem são descritos para dar a alguém dentro da matéria, uma técnica reprodutível para a preparação de um anticorpo tendo uma região V_H codificada por uma sequência de DNA derisda de V_u / TAG.

Π

Componentes para um gene de cadeia pesada VX TAG exoressavel

Π

Pode-se conseguir uma molécula de anticorpo quimérico ratinho-humano que contenha a região variavel da cadeia pesada germinal de V„KTAG murina . uma

Π região variavel da cadeia leve que e complementar na V„ de

Π

V_H o*. TAG. como seja uma região variável da cadeia leve de CC49 ou CC83 murino e regiões constantes humanas.

fragmento de DNA germinal HindIII de 2,2 kb contendo a sequência do exão V„ de V„c<TAG foi

Π Π usado como molde para se obter uma região variável de V^oCTAG funcionalmente rearranjada. A região do intrão J-C genomico murino foi usada como fonte de sequências potenciadoras da cadeia pesada murina Esta ultima região foi obtida a partir do plasmideo pNP9 (ver exemplo acima em Isolamento da região variavel da cadeia pesda de CC49) A Figura 38 mostra a reacção global para a engenharia de genes hibridos baseados no método de Horton et al (19 89 ) sypra Projectaram-se quatro oligonucleotideos (oligos) para serem usados na amplificação enzimatica e modificação do DNA alvo Oligo 1 emparelha com o extremo 5 de V„ ^TAG indo do sitio EcoRI

Π que esta 249 pb 5 relativamaTte ao codão de iniciação ATG Oligo 2 emparelha com sequências complementares do extremo 3 do exão V^c<TAG e também contem sequências codificadoras de um segmento D As sequências do segmento D em oligo 2 não emparelham com quaisquer sequências V^q^TAG. Oligo 3 contem sequências complementares do extremo 5 da região J-Cu genomica murina e incorpora sequências codificadoras do segme to D (oligo 2) e o segmento J. Oligo 4 emparelha com o extremo 3' da região J-Cu e contem sequências complementares do sitio EcoRI situado 1219 pb 3 relativamente a JH4. Segue-se a sequência destes oligos:

-131-

Oligo 1 5’GTCTAGAATTCArAAAAACTTTATG (25 mer)

Oligo 2 CAGTGTATTTCTGTAAAAGATCTACTATGGTTACG(35 mer) igo 3 5 *TCTACTATGGTTACGTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACC

GTCTCÇTÇAGGTAAGAATGGCCTCTCCAGGTCT 3’ (72 mer)

Oligo 4 5' ACTTCTAAAATGTATTTAGAA7TCATTTTC 3'

Neste exemplo , a sequência D e Sp .3 tirada da sequência publicada por Kurosawa e Tonegawa J Exp. Med 155:201 (19 82 ). A sequência D esta apresentada a cheio nos oligos 2 e 3 Qualquer outro segmento murino ou humano caracterizado pode ser usado substituindo a uma sequência nestas posições de oligo 2 e 3

O segmento J em oligo 3 esta sublinha do Ε o J^4 murino letirado da sequência publicada de Gough e Bernard Proc Natl Acad Sei (USA) 78: 509 (19 81) A inclusão de qualquer outro segmento J murino ou huaano pode ser feita substituindo a sequência de J_H4 em oligo 3 por ele

Em oligo 1 e 4 os sitios EcoRI (GAATC) estão apresentados em itálico

Montagem de genes intactos de V ¢0 TAG

Π

Realizaram-se duas reacções separadas de amplificação de DNA usando os compoenntes descritos abaixo. A reacção 1 de amplificação de DNA copia a sequência V^^TAG e adiciona um segmento D ao seu extremo 3' .

A reacção 2 de amplificação de DNA copia as sequências intrão murinas. contendo as sequências potenciadoras da cadei pesada e adiciona os segmentos D e J codificados por oligo 3. Os produtos amplificados da reacção 1 e 2 foram purificado em gel . combinados e adicionados oligos 1 e 4 para iniciar a reacção ^3 Na reacção 3 os produtos da reacção 1 e 2 emparelham nas suas sequências D comuns A amplificação subsequente do DNA a partir de oligos 1 e 4 da o produto apresenta ao fundo da Figura 38 Este fragmento foi digerido com EcoRI e purificado num gel O fragmento ⁰⁰ TAG modificado foi liga ao sitio EcoRI de pSV2gpt )Ç1 (2 3) como descrito no exemplo abaixo 'Construções de cadeias pesadas quiméricas' Todo o fragmento contendo ο V «4 TAG-D-J-potenciador foi sequenciado para assegurar que não foram introduzidas mutações durante as reacções de ampolificação de DNA Os outros três isotipos

X da cadeia pesada podem ser gerados ligando o mesmo fragmento V^^TAG modificado aos outros três vectores pSV2gpt contendo pSV2gpt- (Ç2 ; pSV2gpt- λ~3 ; pSV2gpt-C4).

-133-

Expressão do gene V TAG modificado

Π

Os plasmideos contendo o gene

V_H (ATAG modificado podem ser linearizados com Ndel e introduzidos via electroporação em linhas celulares expressando a cadeia Jeve quimérica de CC49 ou CC83 (ver exemplo atras .

C Transformações dirigidas. As células transformadas foram seleccionadas por crescimento na presença de Geeticin e acido micofenolico como descrito atras em C. Transformações dirigi das A presença do aznticorpo expresso e controlada por ELISA com TAG 72 (ver secção de Imunoensaios ligados a enzimas (ELISA) nos RESULTADOS. O anticorpo expresso nestas células conterá regiões constantes de Ig Π, K humanas com a região variavel· da cadeia leve de CC49 ou de CC83 e uma região variavel da cadeia pesada dos exões de V„ germinal

Π de V £*- TAG modificado

Π

Estão apresentados ateiao quatro exem pios de construções da região variavel da cadeia pesada de V^^TAG modiuficado tendo uma variedade de segmentos D e J;

V„ Segmento

Π

Segmento D

Segmento J

TAG		i	D	de ratinho	(SP2.3)	J	derat inho
TAG	=&	ii	D	humano D (	Dl )	J	de ratinho
TAG	&	iii	D	de ratinho	(SP2.3)	J	humano
TAG	&	i v	D	humano (Dl	)	J	humano

-134A sequência Dl humana foi tirada de Siebenlist et al Nature. 29 4 : 631 (19 81 ) A sequência de J„ 1 humana foi retirada de Ravetch et al Cell 27: 583

Π — — (19 81)

A obtenção de VTAG 1 esta descrita com os oligos 1 a 4 atras esquematizados Para se obter Vj-í^-TAG U ii a iv os correspondentes segmentos

Π

D e J necessitam de ser trocados nos oligos 2 e 3 Os oligos que se seguem mostram estas alterações A substituição des-

tes oligos	na reacção 1 e na reacção 2 resultara
geração de	V TAG $ ii a iv Π
VHaTAG #ii
Oligo 2	5' CAGTGTATTTCTGTAAAAGAGTACTGGTGGT (34 mer) GTAT
Oligo 3	5' GTACTGGTGGTGTATTGGGGTCAAGGAACC (72 mer) TCAGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGCC7 CTCCAGGTCT 3'
VHaTAG #iii
Oligo 2	5' CAGTGTATTTCTGTAAAAGATCTACTATGG (35 mer) TTACG
Oligo 3	5’ TCTACTATGGTTACGTGGGGCCAGGGCAC (72 mer) CCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAATnnr.r.TnTnnAOGTPT 3'
VpaTAG #iv
Oligo 2	5' CAGTGTATTTCTGTAAAAGAGTACTGGTG (35 mer) GTGTAT
Oligo 3	5’ GTACTGGTGGTGTATTGGGGCCAGGGCAC (7? mer) CCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGr CTCTCCAGGTCT 3'

Resultados

A. Linhas Celulares produtoras de anticorpos quiméricos'

A detecção simultânea das cadeias pesada e leve foi conseguida usando dois anticorpos sonda:

1) Cabra anti-kapa humana marcado com o corante fluorescente FITC e;

2) Cabra anti-IgG humana marcado com o corante fluorescente TRITC

Linhas celulares tendo respostas positivas para as cadeias pesada e leve foram testadas ainda relativamente a produção de imunoglobulina quimérica associa da -e actividade biologica viz. ligação a TAG 72.

Imunoensaios ligados a enzimas (ELISA) uma linha celular tendo V„ de CC49

Π

Para seleccionar uma célula transfor mada produtora de um anticorpo monoclonal quimérico, usou-se a técnica de ELISA. Os clones contendo construções de cadeia pesadas , leves e pares de selecção com drogas foram seleccionados pelo seu crescimento em meio de cultura selectivo.

As linhas celulares que se seguem foram testadas (1) CH44-1:

uma linha celular tendo V_u de CC49 . V. de CC49 e região consn L tante de IgGl. (2) CH44-2: uma linha celular contendo V de CC49 de CC49 e região constante de · de CC49 e a região L» (4) CH88-1: uma linha celular tendo V

H (3) CH44-4:

constante de IgG4;

de CC83 e a região constante de IgGl linha celular tendo V„ de CC83

Π (5) CH88-2: uma de CC83 e a região constante de IgG2; (6) CH88-3

CC83 uma linha celular tendo V constante de IgG4 uma linha celular tendo V„ de

Π de CC83 e a região constante de IgG3 de CC83 (7) CH88-4 de CC83 e a região

H ---- _L

8) CH84-1: uma linha celular tendo

V_u de CC83

Π

CH84-2 região constante de IgG

V de CC49 e a região constante de IgGl;

Li uma linha celular tendo V di

Π

CC83 (9 ) de CC49 e a (10) CH84-3: uma linha aelular tendo de CC83

V de CC49 e a região constante de IgG3; L e (11) CH84-4: uma linha celular tendo V de CC83. V. de n L

CC49 e a região constante de IgG4

Os sobrenadantes destas culturas foram sujeitos a ELISA. A presença de anticorpo quimérico anti-TAG72 foi medida directamente por reacção de um excesso de anticorpo de cabra anti-IgG humana marcado com uma enzima como seja a fosfatase alcalina, após deixar o anticorpo quimérico anti-TAG72 ligar-se as placas de microtitulação revestidas com antigénio (TAG 72) A actividade anti-TAG72 foi determinada como um critério de recombinação com

Apos crescimento durante 14 dias removeu-se 50 ul de sobrenadante das cavidades das células subclonadas e testou-se novamente quanto a ligação a TAG por ELISA Amostras de sobrenadantes (50 ul) das linhas celulares resistentes a drogas foram aplicadas a cavidades de placas de 96 cavidades Nunc Immulon que foram previamente revestidas com antigenio TAG (diluição 1/50) Apos lavagem para remover material não ligado' as cavidades foram incubadas com anticorpos de cabra anti-IgG humana conjugados com fosfatase alcalina (GAHIg G-AP) usados como sonda para detectar as regiões constantes humanas dos anticorpos quiméricos que se ligaram ao antigenio TAG imobilizado na placa Segiu-se uma outra lavagem para remover a sonda não ligada (GA HigG-AP) depois a adição de um substracto cromogènico da fosfatase alcalina . deixou-se aparecer côr nas cavidades que possuiam ligação a TAG associada as regiões constantes humanas (i.e. anticorpos quiméricos anti-TAG 72). As leituras de absorvância a 405 nm indicam a quantidade relativa de anticorpo quimérico produzido pelas linhas celulares resistentes a drogas

CH44-1 □sou-se a actividade anti-TAG 72 como critério para uma recombinação com êxito As cavidades das placas de microtitulação foram revestidas com TAG através da incubação de 50 ul de uma diluição 1:75 de TAG 72 purificado / Muraro R et al Câncer Research 48 . 4588-459 6 (19 88)_7 durante 13 horas a temperatura ambiente.

As cavidacés foram então lavadas 4 vezes com tampão de fosfato salino (PBS) e depois bloqueadas com BSA. através da incubação de 50 ul de BSA a 0 ,5 por cento em PBS durante horas a 372C, seguido de lavagem 4 vezes com PBS. Estas placas são estáveis se mantidas húmidas a 4QC. Aplicou-se então 50 ul de amostra a cada cavidade. Como controlo usou-se um branco contendo meio fresco. Todas as amostras foram incubadas na placa durante 90 minutos a 372C ou durante a noite a 42C num recipiente fechado

As placas foram então lavadas 4 vezes com PBS e aplicou-se anticorpos de cabra anti-IgG huma na-fosfatase alcalina (Southern Biotech Assoe ) a cada cavidade adicionando 50 ul de uma diluição 1:250 A solução foi incubada a 372C durante 90 minutos O desenvolvimento de cor·' apos lavagem das placas 4 vezes com PBS para remover a sonda foi controlado

O substrato foi incubado em 200 ul de solução do substrato p-nitrofenil-fosfato (Kirkegaard & Perry) em soro fisiologico tamponado com etanolamina durante 6 minutos a temperatura aibiente para o desenvolvimento de côr A densidade óptica a 450 nm de cada cavidade for lida num leitor de microplacas Dynatech (Dynatech Inc . ) .

As colonias Sp2/0 nos poços com sobrenadanhes tendo actividade de anticorpo quimérico com ligação a TAG 72 foram subclonadas por diluição limite. Escolheram-se subclones individuais com base na produção relativamente elevada de anticorpo quimérico

CH44-2

O processo TAG-ELISA usado com CH44-1 foi repetido com excepção de o anticorpo ser CH44-2

CH44-3 processo TAG-ELISA usado com CH44-1 foi repetido com excepção de o anticorpo ser CH44-3.

CH44-4

O processo TAG-ELISA usado com CH44-1 foi repetido com excepção de o anticorpo ser CH44-4

CH88-1

O processo TAG-ELISA usado com CH44-1 foi repetido com excepção de o anticorpo ser CH88-1

CH88-2 processo TAG-ELISA usado com CH44-1 foi repetido com excepção de o anticorpo ser CH88-2.

CH38-3 processo TAG-ELISA usado como CH44-1 foi repetido com excepção de o anticorpo ser CH88-3

CH88-4

O processo TAG-ELISA usado com CH44-1 foi repetido com excepção de o anticorpo ser CH88-4

CH84-1 processo TAG-ELISA usado com CH44-1 foi repetido com excepção de o anticorpo ser CH84-1.

CH84-2 processo TAG-ELISA usado com CH44-1 foi repetido com excepção de o anticorpo ser CH84-2

CH84-3

O processo TAG-ELISA usado com CH44-1 foi repetido com excepção de o anticorpo ser CH84-3

CH84-4 processo TAG-ELISA usaco com CH44-1 foi repetido com excepção de o anticorpo ser CH84-4.

CH48-1 processo TAG-ELISA usado com CH44-1 foi repetido com excepção de o anticorpo ser CH48-1

B Direccionamento in vivo para carcinomas

Os anticorpos monoclonais quiméricos usados nos estu^Qs com animais e apresentados nas Ta125 belas 1-4 abaixo foram marcados com Na I usando Iodogen (Piasce Chemical Rockford IL) . Mais especif icamente . cerca de 0 .5-2 mg de anticorpos monoclonais quiméricos purificados foram ajustados a cerca de 0 ,5 ml com tampão de fosfato de sódio 0,1M (pH 7.2) e depois adicionados a um tubo de vidro de 12 cm x 75 cm revestido com 50 ug de Iodogen seguido 12 5 da adiçao de 0 ,1-0 ,5 mCi de Na I (New England Nuclear.

Boston, MA). Apos 2 min de incubação a temperatura ambiente 125 a proteína foi removida do Iodogen indoluvel e ο I não incorporado foi separado do anticorpo por filtração em TM gel através de uma coluna de 10 ml de Sephadex G-25 usando PGS como tampão 0 protocolo de iodinação deu anticorpo quimérico IgG marcado com uma actividade especifica de 0 05 a 0 2 uCi/ug

Adquiriram-se ratinhos fêmea etimicos (mu/mu) num fundo CDl a Charles River com aproximadamente 4 semanas de idade. Nove dias mais tarde, os ratinhos foram inoculados subcutâneamente (0,1 ml/ratinho) com célul LS174T (1 x 106 células/animal).

Os ratinhos atimicos portadores de carcinomas de 70 a 400 mg de peso, cerca.de 12 a 13 dias apos inoculação das células foram injectados intravenosamente com 0 5 a 2 0 uCi (10-50 ug de proteína) em PBS dos anticorpos monoclonais quiméricos os quais foram iodinados como descrito atras Mataram-se grupos de cinco ratinhos a vários tempos por exsanguinação o carcinoma e os tecidos normais foram removidos e pesados e os cpm medidos num contador gama Determinou-se então os cpm/mg para cada tecido e comparou-se com o encontrado no carcinoma apresentados na Tabela resultados para CH84-1 e Figuras 40 A e 40 B

Os resultados para CH44-1 estão 1-2 e Figuras 39 A 39 B e 39 C Os estão apresentados nas Tabelas 3-4 injectada por grama de anticorpo marcado

Percentagem da dose com

125

Tabela 1

TECIDO	CH44-1
0.75 HORA	5 23.5 HORAS	49.5 HORAS	122 HORAS
sangue,tota	1 29.70	15.84	8.09	7.31
fígado	8.13	4.13	2.19	1.96
baço	6.19	3.39	2.12	1.36
rim	4.35	2.80	1.52	1.33
tumor	3.31	25.95	28.83	44.16
pulmões	7.34	5.39	2.90	2.36
rumor,peso	0.18	0.12	0.09	0.11

-144-

Como se mostra na Tabela 1. aproximadamente 122 horas pos-injecçao. a percentagem de dose injecta da no tumor para CH44-1 foi de 44.6 por cento Assim CH44-1 foi eficaz no direccionamento para o tumor humano in situ Isto demonstra que os anticorpos monoclonais quiméricos do presente invento foram eficazes para o direccionamento para o carcinoma in vivo e portanto uteis no tratamento in vivo do cancro

Percentagem da dose injectada por orgão de anticorpo marcado com

125

Tabela 2

Tecido	CH44-1
0.75 Hora	23.5 Horas	49.5 Horas	122 Horas
Sangue	47.72	23.03	13.29	12.01
total fígado	10.97	5.20	3.20	2.69
baço	1.09	0.48	0.25	0.22
rim	1.25	0.72	0.42	0.40
tumor	0.57	3.08	2.82	4.55
pulmão	1.20	0.87	0.57	0.37
total G1	6.64	4.78	3.96	2.83
carcassa	43.17	49.68	35.35	29.95
Retenção am todo corp	91.30 3	76.34	53.28	46.20

Como se mostra na Tabela 2. as 1 22 horas pos-injecção . a percentagem de dose injectada no tumor para CH44-1 foi de 45 5 CH84-1 foi portanto eficaz no direccionamento para o tumor in situ. Isto demonstra que os anticorpos monoclonais quiméricos do presente invento foram eficazes para o direccionamento para o carcinoma in vivo e portanto uteis para o tratamento in vivo de cancro.

Percentagem da dose injectada por grama

125_T com I de anticorpo marcad

Tabela 3

Tecido	CH84-1
1 Hora	23 Horas	47 Horas	118-119 Horas
sangue	30.68	15.65	6.74	6.49
figado	12.55	4.26	2.35	1.57
baço	10.93	3.35	2.56	1.70
rim	5.59	2.51	1.53	1.55
tumor	4.06	20.52	17.58	30.27
pulmão	10.77	4.80	2.58	2.24
tumor,peso	0.15	0.22	0.20	0.24

-148-

Como se mostra na Tabela 3 aproximadamente as 118 horas pos-injecção a percentagem de dose injectada no tumor para CH84-1 foi de 30 27 por cento. CH84-1 foi portanto eficaz no direccionamento para o tumor humano in situ Isto demonstra que os anticorpos monoclonais quiméricos do presente invento foram eficazes para o direccionamento para o carcinoma in vivo e portanto uteis para o tratamento in vivo de cancro.

Percentagem da dose infectada por orgão do anticorpo 125 do com ± marca

Tabela 4

	CH84-1
Tecido	1 Hora	23 Horas	47 Horas	118-119 Horas
sangue, tota	45.98	22.11	10.08	9.37
figado	13.64	5.34	3.13	1.94
baço	1.35	0.49	0.32	0.16
rim	1.39	0.62	0.38	0.38
Tumor	0.59	4.33	3.63	7.02
pulmão	1.77	0.69	0.42	0.31
tracto G1	7.38	4.92	3.41	2.32
?arcassa	44.83	52.19	30.32	24.06
retenção pe; corpo tota.	o 93.58	81.00	47.14	45.48

50 r

Z\

Como se mostra na Tabela 4, aproximadamente as 118 horas pós-injecção a percentagem de dose injectada no tumor para CH84-1 foi de 7.02 por cento. CH84-1 foi portanto eficaz no direccionamento para o tumor humano in situ. Isto demonstra que os anticorpos monoclonais quiméricos do presente invento foram eficazes no direccionamento para o carcinoma in vivo e portanto úteis no tratamento in vivo de cancro.

Depósito de linhas celulares produtoras de anticorpos quiméricos

Onze linhas celulares secretando anticorpos quiméricos, todas tendo uma cadeia leve kapa feita de acordo com os exemplos atrás, foram depositadas na American Type Culture Collection (ATCC) em 19 de Outubro de 1988. Especificamente, foram depositadas as linhas celulares que se seguem: (1) CH44-1: uma linha celular tendo de CC49, de CC49 e a região constante de IgG₁ (ATCC N^a HB 9884); (2) CH88-2: uma linha celular tendo VH de CC83, VL de CC83 e a região constante de IgG2 (ATCC N^a HB 9880); (3) CH44-4: uma linha celulat tendo V„ de CC49, VT de CC49 e a região constante de IgG4 (ATCC N^a 9877)? (4) CH88-1: uma linha celular tendo VH VL de CC83 e a região constante de IgG^ (ATCC N^a 9882); (5) CH44-2: uma linha celular tendo de CC49, VL de CC49 e a região constante de lgG2 (ATCC N^a 9881);

(6) CH88-3: uma linha celular tendo V_H de CC83, V_L de CC83 e a região constante de IgG₃ (ATCC N^a 9876); (7) CH88-4: uma linha celular tendo V_H de CC83, de CC83 e a região constante de IgG₄ (ATCC N° 9874); (8) CH84-1:

uma linha celular tendo de CC83 de CC49 e a região constante de IgG^ (ATCC No 9 883); (9) CH84-2: uma linha celular tendo de CC83 de CC49 e a região constante de IgG₂ (ATCC No 9879); (10) CH84-3: uma linha celular tendo V_H de CC83 de CC49 e a região constante de IgG.j (ATCC No 9 8 78 ) ; e (11) CH84-4: uma linha celular tendo V„

Π de CC83 . de CC49 e a região constante de IgG^ (ATCC No .9 8 75 ) .

O âmbito do presente invento não deve ser limitado pelas linhas celulares depositadas uma vez que estas pretendem ter apenas caracter exemplificativo de um as pecto do invento e todas as linhas celulares que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do âibito do invento De facto se bem que este invento tenha sido descrito detalhadamente e com referência a realizações especificas dele sera aparente para os familiarizados com a matéria que podem ser feitas varias alterações e modificações sem que haja afastamento do espirito e âmbito das reivindicações apensas

151.1

EXEMPLOS SUPLEMENTARES

Os exemplos que se seguem são proporcionados para mostrar que as regiões variáveis dos anticorpos reivindicados podem ser expressas com regiões constantes modificadas. As moléculas com estas regiões constantes modificadas possuem semi-vida no soro, biodistribuição, funções efectoras, etc., modificadas relativamente a um anticorpo com uma região constante não modificada.

Introdução

Os anticorpos de cadeias pesadas encurtadas estão ilustrados na Fiqura A (1 & 2). Foram produzidos por via genética através da remoção sequenciada dos domínios C-terminais das cadeias pesadas humanas gamai e gama3. As cadeias pesadas foram modificadas pela remoção sucessiva dos domínios CH3 e CH2 de gamai humana (Ellison et al.. (1982) e Takahashi et al. (1982) e a remoção de CH3 e CH2 e domínios charneira (hinge) dos genes das regiões constantes de gama3 humanos (Krawinkel et al. . (1982) e Takahashi et al. (1982)) usados na expressão de anticorpos quiméricos.

A remoção do domínio CH3 da cadeia pesada gamai humana resulta numa molécula com 5/6 do tamanho do anticorpo intacto, referido como CH3-menos e a sequência da região constante descrita na sequência 1. A molécula seguinte mais pequena, a construção tipo F(ab')₂, foi gerada por remoção dos domínios CH2 e CH3 da cadeia pesada gamai humana nos domínios charneira e CHI. A molécula quimérica resultante F(ab')₂ tem cerca de 2/3 do tamanho do anticorpo intacto e a sequência da região constante

151.2

está descrita na sequência 2. As cadeias pesadas humanas gamai estão ligadas por um par de ligações dissulfureto em Cis-239 e Cis-242 (Kabat, et al., 1987) no domínio charneira. 0 extremo C da cadeia leve, Cis-213 (Kabat et al.. (1987), está ligado à cadeia pesada gamai em Cis-233 (Kabat, et al.. (1987)), também no domínio charneira (Fig. A). O isotipo gamai foi usado para a construção das moléculas CH3-menos e F(ab')₂, uma vez que o domínio charneira é utilizado em ambas as construções. No entanto, quando se projecta a molécula do tamanho de Fab, a qual é 1/3 do tamanho de um anticorpo intacto, a remoção do domínio charneira, eliminaria o local de ligação da cadeia leve. A cadeia pesada gama3 humana foi escolhida para a construção de Fab e a sequência da região constante está descrita na sequência 3.

Os domínios da cadeia pesada foram eliminados usando a técnica SOE (Horton, et al.. 1989; Ho, et al.. 1989) por remoção dos exões correspondentes. A Figura B ilustra o processo geral: dois fragmentos de DNA(AB e CD) foram gerados separadamente por PCR tradicional. Isto é conseguido usando oligonucleótidos iniciadores curtos, correspondendo a cada um dos extremos 5' (a e c) e 3' (b e d) dos fragmentos com interesse. Após purificação, os dois fragmentos de DNA são misturados, desnaturados e novamente emparelhados com as regiões de sobreposição derivadas da caudas ondulantes. Após um ouro PCR, usando os oligonucleótidos mais exteriores (a e d), os fragmentos sobreponíveis são prolongados e amplificados como um único fragmento.

Os genes para as regiões constantes da cadeia pesada codificam todos lisina como último aminoácido a seguir a glicina e antes do codão de terminação (Dunnick, et al.. 1980; Kabat, et al· , 1987). No entanto, encontrou-se que o extremo C da proteína da cadeia pesada madura é glicina (Kabat, et al.. 1987), indicando processamento pós-tradução da lisina terminal. Devido à

151.3

possibilidade deste processamento pós-tradução ser necessário para uma expressão eficaz, cada uma das construções encurtadas foi terminada pelos dois últimos aminoâcidos do extremo C da cadeia pesada gamai humana. Assim, o fragmento de DNA de 404 pb, a-x (ver Figura B2), comça com Gli-Lis e codões de terminação e inclui a sequência sinal de poliadenilação. Este fragmento foi usado como fragmento de ligação 3' para todas as construções descritas nesta publicação. Uma vez que a sequência de DNA da parte mais 3' «190 pb deste fragmento não é conhecida, o PCR foi efectuado a partir de um iniciador 3' derivado da sequência adjacente do vector e incluiuo sítio de restrição BamHI do fragmento.

Como se mostra na Figura B2, os produtos iniciais dos dois primeiros PCRs, fragmentos y-bl e a-x foram purificados e sujeitos à reacção SOE a qual gerou o fragmento y-bl-x para a construção do vector de Fab. Os fragmentos genéticos F(ab')„ e CH3-menos foram construídos por métodos semelhantes usando os iniciadores 3', b2e b3 e o molde gamai humano, o qual deu os fragmentos y-b2-x e y-b3-x após reacções SOE. Antes da purificação final dos produtos SOE, os fragmentos foram digeridos com EcoRI e BamHI para gerar extremos sobreponíveis 3' para subsequente ligação naqueles locais no vector pSV2-gpt.

As construções do vector da cadeia pesada encurtada são projectadas para acomodar qualquer região variável da cadeia pesada num fragmento EcoRI.

151.4

Materiais e Métodos

As enzimas de restrição e enzimas de modificação de DNA foram obtidas da BRL (Gaithersburg, MD), Stratagene (LaJolla, CA) e New England Biolabs (Beverly, MA). Os desoxinucleótidos foram adquiridos à Pharmacia (Piscataway, NJ).

Programação de Oligonucleótidos Iniciadores para PCR/SOE

O exão 49VDJ, o exão CHI de gama3 e os exões charneira e CH2 de gamai todos possuem nos seus extremos 3' o primeiro nucleótido do primeiro codão do exão seguinte. Este codão parcial foi omitido quando da projecção dos correspondentes oligonucleótidos iniciadores (bO (ver Fig. B3), bl, b2 e b3, respectivamente). A sequência do iniciador y (5'-GGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTC-3·) derivou da sequência do DNA 5' do local EcoRI do pSV2gpt (Mulligan & Berg, 1981). A sequência do iniciador x (5'-TATCTTATCATGTCTGGATCC-3') derivou da sequência de DNA 3' do local BamHI do pSV2gpt (Mulligan & Berg, 1981). A região de onde derivam estas sequências foi originalmente clonada em pBR322. A sequência do iniciador a (5'-GGTAAATGAGTGCGACGG-3') começa com os dois últimos codões (Gli-Lis) do exão CH3 de gamai humana. A sequência do iniciador bO (5'-CCGTCGCACTCATTTACTGAGGAGACGGTGACTCA-3') foi projectada de forma a que a metade 5' seria ••ondulante’’ e exactamente complementar dos 18 nucleótidos 5' do iniciador a. A metade 3' é complementar dos 6 codões C-terminais da região J do exão VDJ da cadeia pesada CC49. A sequência do iniciador bl (5'-CCGTCGCACTCATTTACCAACTCTCTTGTCCACCTT-3') é semelhanteao iniciador bO na metade 5', mas a metade 3' é complementar dos 6 codões C-terminais do exão CHI de gama3 humana. A sequência do iniciador b2 (5'-CCGTCGCACTCATTTACCTGGGCACGGTGGGCATGT-3') é também semelhante na sua programação ao iniciador bO na metade

151.5

5', mas ametade 3' é complementar dos 6 codões completos C-terminais do exão charneira de gamai humana. A sequência do iniciador b3 (5'CCGTCGCACTCATTTACCTTTGGCTTTGGAGATGGT-3^z)é também semelhante ao iniciador bO na metade 5', mas a metade 3é complementar dos 6 codões C-terminais do exão CH2 de gamai humana.

Métodos de PCR e SOE

O fragmento a-x (»404 nt) foi gerado por PCR (Saiki, et al.. 1988) usando o molde linearizado com Ndel, pgamal-gpt, o qual contem o gene gamai humano e os oligonucleótidos iniciadores a e x. 0 fragmento y-bO (762 nt) foi gerado por PCR usando os iniciadores y e bO no molde p49gamal-gpt linearizado. O fragmento y-bl (544 nt) foi produzido por PCR usando os iniciadores y e bl no molde pgama3-gpt, o qual contem o gene gama3 humano. Os fragmentos y-b2 (977 nt) e y-b3 (1425 nt) foram produzidos no molde pgamal-gpt usando os iniciadores y e b2 e y e b3, respectivamente. O fragmento y-bO-x (»1166 nt) foi gerado pelo método SOE (Ho, et al.. 1989), Este envolve desnaturação e emparelhamento dos fragmentos purificados em gel, y-bO e a-x e extensão por PCR dos iniciadores 5' e 3', y e x. De forma semelhante, os fragmentos y-bl-x («948 nt), y-b2-x («1381 nt) e y-b3-x («1829 nt) foi gerado por tecnologia de SOE após emparelhamento dos fragemtnos y-bl, y-b2 e y-b3, respectivamente com o fragmento a-x seguido de extensão por PCR com os iniciadores y e x.

Realizaram-se os ciclos térmicos. As concentrações do molde e dos iniciadores foram 0,1-1,0 ng/ml e 1 nmole/ml, respectivamente, em 0,1 ml (Saiki, et al.. 1988). As condições de PCR e SOE foram: desnaturação 2 minutos a 92-96°C,· emparelhamento 3 min entre 37°C e 50°C; extensão durante 10 minutos a 71°C-74°C (30 ciclos).

151.6

Construção de vectores

Após extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol das reacções de SOE, os fragmentos foram digeridos com EcoRI e BamHI e purificados em gel (Maniatis, et al.. 1982). Cada um dos fragmentos foi ligado ao fragemtno EcoRI/BamHI do vector SV2-gpt. Estes vectores são capazes de aceitar qualguer fragmento com extremos EcoRI. O fragmento EcoRI de 1,9 Kb contendo a V_H

CC49 foi ligado ao sítio EcoRI de cada dos vectores de cadeias pesadas encurtadas e os clones analizados por digestão com Ncol para determinar a orientação correcta do fragmento V„.

Electroporacão, seleccão e expressão

Cada um dos vectores com cadeia pesada encurtada CC49 foi linearizado com Ndel e electroporados com as células alvo que expressam a cadeia leve quimérica CC49. A actividade de ligação a TAG-72 no meio das colónias resistentes ao ácido micofenólico (MPA) foi detectada por ELISA com anticorpos anti-kapa humana conjugados com fosfatase alcalina (Southern Biotechnology Associates, Inc. Birmingham, AL). O vector contendo o fragmento 49Hv sozinho (p49Vh-gpt) foi também electroporado com células alvo (SP2/O) o qual não expressa a cadeia leve ou a cadeia pesada (Shulman, et al.. 1978). A possível actividade de ligação de TAG-72 produzida por estas colónias resistentes a MPA foi medida por ELISA de competição. As colónias com actividade positiva de TAG-72 em ELISA foram expandidas para placas de 24 cavidades, subclonadas e seleccionadas.

Depósito de linhas celulares

As linhas celulares Ch44-Fab (ATCC HB 10428), Ch44-F(ab')₂ (ATCC HB 10429) e Ch44-CH₃“ (ATCC HB 10430) foram

151.7

depositadas na American Type Culture Collection (ATCC) em 18 de Abril, 1990.

O contrato com a ATCC proporciona e o requerente assegura (1) que o acesso às culturas contidas nos referidos depósitos estarão disponíveis durante a pendência do pedido de patente atrás identificado, a alguém determinado pelo Comissariado de Patentes e Marcas a ser indicado como 73 CRF 1.14 e 35 USC 122, (2) que todas as restrições sobre a disponibilidade para o público do referido invento assim depositado será irrevogável e sem condições ou restrições retiradas guando da concessão da patente, (3) que os referidos depósitos deverão ser mantidos com todo o cuidado necessário para os manter viáveis e descontaminados no depositário durante um período de 30 anos após as respectivas datas de depósito ou cinco anos após o último pedido ou vida exequivel da patente, qualquer que seja é maior e (4) que os referidos depósitos devem ser substituídos caso tenham sofrido mutações ou ficado inviáveis.

Abreviaturas pb = pares de bases gpt = guanosina fosforribosil-transferase

Hv = região variável da cadeia pesada (também Vh)

Kb = quilopares de bases

Mr = peso molecular (também peso molec.) neo = neomicina-fosfotransferase nt = nucleótido oligo = oligonucleótido

TAG—72 = glicoproteína -72 associada a tumores

151.8

Referências

Dunnick, et al. (1980), A mouse immunoglobulin heavy chain deletion mutant: isolation of a cDNA clone and sequence analysis of the mRNA, Nucl. Acids. Res., 8:1475-1484.

Ellison etal. (1980), The nucleotide sequence of a human immunoglobulin C-gamma-1 gene, Nucl. Acid Res, 10:40714079.

Ho, etal. (1989), Site-Directed Mutagenesis by Overlap Extension Using the Polymerase Chain Reaction, Gene, 77:51-59.

Horton, etal. (1989), Engineering Hybrid Genes without the use of Restriction Enzymes: Gene Splicing by Overlap Extension, Gene, 77:61-68.

Kabat, etal. (1987), Sequences of Proteins of

Immunological Interest (4th. edition), U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health.

Krawinkel etal. ( 1982), Comparison of the hinge-coding segments in human immunoglobulin gamraa heavy genes and the linkage of the gamma 2 and gamma 4 subclass genes, EMBO J, 1:403-407

Maniatis etal. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor, N.Y.

Mulligan & Berg (1981), Selection for animal cells that express the E. coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyl transferase, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78:2072-2076.

1.9

Saiki et al. ( 1988), Primer-directed enzywatic araplification of DNA with a thermostable DNA polymerase, Science, 239:487-491”,

Shulman etal. (1978), A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies”, Nature, 276:269-270.

Takahashi etal. ( 1982), Structure of human imraunglobulin ganuna genes: Implications for evolution of a gene family, Cell, 29:671-679.

Legendas das Figuras

Figura A

Diagrama dos anticorpos de cadeias pesadas encurtadas.

1) As moléculas CH3-menos e F(ab')₂ derivadas da IgGl humana e a molécula Fab derivada de IgG3 humana.

2) A molécula Hv derivada da região variável da cadeia pesada apresentada sózinha ou em associação com a cadeia leve numa conformação dimérica ou tetramérica hipotética. A IgGl de tamanho completo está mostrada como escala.

Figura B

1) Diagrama da técnica SOE, indicando as caudas ondulantes e a sobreposição complementar, mostrado como caixa preta.

2) Diagrama da região constante da cadeia pesada humana e os oligonucleótidos iniciadores (com caudas ondulantes) usados para gerar os fragmentos de DNA a-x, y-bl, y-b2 e y-b3.

3) Diagrama da região variável da cadeia pesada CC49 e os oligonucleótidos iniciadores (com caudas ondulantes) usadas para gerar o fragmento y-bO para a construção do gene Hv.

AGC777C7GGGGCAGGCCAGGCC7GACC77GGC777GG>j'j'~ AG’j^j/^-x'jG>jvj>j^7AAGGTGA GGCAGG7GGCGCCAGCAGGTGCAGACGGAA7GGGGA7GAGGGGAGACAC7GGACGC7GAA CC7CGCGGACAG7TAAGAACCCAGGGGCG7G7GCGCC7GGGCGGAGC7G7G7GGGACACC GCGGTCACA7GGCACCACC7C7C77GCAGCC7GGACCAAGGGCCGA7CGG7C77CCCCC7 GGCACCC7CC7CCAAGAGCACC7C7GGGGGCACAGCGGCCG7GGGC7GCC7GG7CAAGGA C7AC77CCCCGAACCGG7GACGG7GTCG7GGAACTCAGGCGCCG7GACCAGCGGCG7GCA CACC77CCCGGCTG7CC7ACAGTCC7CAGGACTC7ACTCCC7CAGCAGCG7GGTGACCGT GCCC7CCAGCAGC77GGGCACCCAGACC7ACATC7GCAACG7GAA7CACAAGCCCAGCAA CACCAAGGTGGACAAGAAAGT7GG7GAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGG7G7C7GCTGG AAGCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAG CAAGGCAGGCCCCGTC7GCC7C77CACCCGGAGCCTC7GCCCGCÇCCACTCATGCTCAGG GAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACC CAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGC7CAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGG AGGACCC7GCCCC7GACC7AAGCCCACCCCAAAGGCCAAAC7G7CCAC7CCG7CAGC7CG GACACC7TC7C7CG7CCCAGA77CCÀG7AAC7CCCAA7C77C7C7C7GCAGAGCCCAAA7 C77G7GACAAAAC7CACACATGCCCACCG7GCCGAGG7AAGCCAGCCCAGGCC7GGCGC7 ccagctcaaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacàggccgcagccg GG7GC7GACACG7CCACC7CCA7C7C77CC7GAGCACC7GAAC7CC7GGGGGGACCG7CA G7C77CCTC7TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC7CATGATC7CGCGGACCGC7GAGGTC ACA7GCG7GG7GG7GGACG7GAGCCACGAAGACCC7GAGG7CAAG77CAAC7GG7ACGTG GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG 7ACCGGG7GG7CAGCG7CC7CACCG7GC7GCACCAGGAC7GGC7GAA7GGCAAGGAG7AC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA7CGAGAAAACCATC7CCAAAGCC AAA

SEQUÊNCIA 1

151.12

AGC777C7GGGGCAGGCCAGGCC7GACC77GGC777GGGGCAGGGAGGGGGC7AAGG7GA GGCAGG7GGCGCCAGCAGG7GCACACCCAATGCCCA7GAGCCCAGACAC7GGACGC7GAA cctcgcggacagttaagaacccaggggcc7C7GCGCC7GGGCc:cagc7C7Stcc:cacacc gcggtcacatggcaccacctctcttgcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccct ggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaagga ctacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgca caccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgt gccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaa CACCAAGG7GGACAAGAAAG77GG7GAGAGGCCAGC ACAGGoAGvj^j AGGvj x \j j. C7GC7GG aagcaggctcagcgctcctgcctggacgcatcccggctatgcagcccgagtccagggcag CAAGGCAGGCCCCG7C7GCC7C77CACCCGGAGCC7C7GCCCGCCCCAC7CATGC7CAGG gagagggtcttctggctttttcccaggctctgggcaggcacaggctaggtgcccctaacc CAGGCCC7GCACACAAAGGGGCAGG7GC7GGGC7CAGACC7GCCAAGAGCCA7A7CCGGG aggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactctccactccctcagctcg GACACC77CTCTCC7CCCAGATTCGAGTAACTCCCAATC77C7C7C7GCAGAGCCCAAAT CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCG7GCCCA

SEQUÊNCIA 2

AGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACTTTGGCTGGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGAC GCAGGTGGCGCCAGCCAGGCGCACACCCAATGCCCG7GAGCCCAGACACTGGACCCTGCC TGGACCCTCGTGGATAGACAAGAACCGAGGGGCC7CTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCC CACACCGCAGTCACATGGCGCCATCTC7CTTGCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGT CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAAGCC CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTT

SEQUÊNCIA 3

151.13

151.14

CHI,charneira CH2“, CH3Hv

FIGURA A2

151.15

Gene l _ _x Gene II

REMOÇÃO E LIGAÇÃO POR EXTENSÃO DE SOBREPOSIÇÃO

151.16

CONSTRUÇÃO DAS CADEIAS PESADAS ENCURTADAS

POR REMOÇÃO E LIGAÇÃO POR EXTENSÃO DE SOBREPOSIÇÃO (SOE)

FIGURA

151.17

CONSTRUÇÃO DO FRAGMENTO 49Hv

FIGURA B3

Claims (25)

1. lâ. - Processo para a preparação de um anticorpo ou fragmento de anticorpo caracterizado por se pôr em contacto:

   uma região variavel tendo uma cadeia pesada (V„). a referida

   Π sendo codificada por uma sequencia de DNA efectivamente homologa do gene germinal V„^,s6TAG)

   Π com uma região variavel tendo uma cadeia leve (V ) a refeL rida sendo codificada por um segmento do gene V animal e por um segmento do gene J animal para formar uma região variavel do anticorpo ou fragmento de anticorpo em que a região variavel se liga a TAG72 com pelo mais 25% mais afinidade do que a reqião variavel de B72 7 se liga a TAG72 sendo as afinidades de ligação do anticorpo e de B72 3 medidas pela mesma técnica
2. 2â - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a região variavel V„ ser

   Π codificada por um segmento de gene D animal e por um segmento de gene J animal.
3. 3â. - Processo de acordo com a reivindicação 2 . caracterizado por o segmento J da cadeia leve ser codificado por um gene seleccionado de entre segmentos do gene J de ratinho e humanos
4. 4â - Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o segmento do gene D da cadeia pesada ser codificado por um gene seleccionado de entre genes segmentos de gene D de ratinho e humanos e o segmento de genes J ser codificado por um gsie seleccionado de entre segmentos de gene J de ratinho e humanos
5. 5â - Processo de acordo com a reivin dicação 1 caracterizado por a região variavel derivar das regiões variaveis de CC46 CC49 CC83 ou CC92
6. 6ê - Processo de acordo com a reivin dicação 1. caracterizado por a região variavel compreender (1) regiões de complementaridade diversidade (CDR) sendo codificadas por um gene derivado de TAG e (2) regiões de armação, adjacentes as regiões CDR. derivadas de genes humanos.
7. 7â - Processo de acordo com a reivin dicação 1 caracterizado por o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreender ainda uma região constante tendo pelo menos uma porção de uma cadeia leve humana (C ) e de uma b cadeia pesada humana (C„)

   Π
8. 8â - Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por a C_H ser IgG₁_₄ IgM IgA IgD ou IgE
9. 9â - Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por C_r ser kapa ou lambda b
10. 10ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo ou fragmento de anticorpo ser produzido por uma linha celular de CH44-1. CH44-2. CH44-4. CH88-2. CH88-3 , CH88-4 . CH84-1 , CH84-2.

    CH84-3 ou CH84-4 llâ. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os veiculos de expressão recombinantes contendo sequências de DNA codificadoras da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo ou fragmento de anticorpo serem inseridos num hospedeiro adequado.
11. 12â - Processo de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por 10-30 ug dos veiculos de expressão recombinantes contendo sequências de DNA codificado ras da cadeia pesada e da cadeia leve de anticorpo ou de fragmento de anticorpo serem linearizados na presença de ate 1 x 10 ⁷ células hospedeiras seguido de electroporação das células hospedeiras a 200 volts e 9 60uFarads em que a célula hospedeira expressa a região variavel do anticorpo oudo fragmento de anticorpo como descrito na reivindicação 1
12. 13â - Processo para a preparação de um conjugado de anticorpo ou fragmento de anticorpo caracterizado por se por em contacto:

    um anticorpo ou fragmento de anticorpo , como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 com uma marca paraformação de imagens ou agente terapêutico.

    143 _ Processo de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por a marca para formação de

    125 imagens ser I

    131,. 123.

    Ga

    166

    177

    Lu

    Ί 186

    111

    IN

    10 5

    Rh

    153

    Sm

    Cu d 99 m„ Re ou Tc
13. 15â - Processo de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por o agente terapêutico ser um radionuclido droga ou modificador da resposta biologica toxina ou um outro anticorpo com a reiser ¹³¹X. ^ie\e.
14. 16â - Processo de acordo vindicação 15 caracterizado por o radionuclido

    Y

    188

    10 5

    Re

    Rh

    177

    Sc

    Cu

    212

    Bi

    211

    At . 99m_ 153_O 123_T

    Le . Tc . Sm . I ou ⁶⁷Ga ¹²⁵I In .
15. 17â. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a droga oumodif icador da resposta biologica ser metotrexato. adrimicina ou linfocina.
16. 18a. - Processo para a preparação de um veiculo de expressão recombinante. caracterizado pela:

    inserção de uma sequência de DNA a referida sequência compreendendo um segmento de sequência de DNA sendo efectivamente homologo do gene germinal V XTAG(V n/TAG)

    Π Π em que o segmento da sequência de DNA codifica pelo flenos uma porção de uma região variavel de cadeia pesada (V„)

    Π num veiculo de expressão
17. 19 ã - Processo de acordo com a reivindicação 18 caracterizado poor a sequência V_H compreender ainda um segmento de sequência de DNA de genes D animais e um segmento de sequência de DNA de genes J animais
18. 20â. - Processo de acordo com a reivindicação 19 . caracterizado por a sequência de DNA codificadora de V_H ser derivada de sequências codificadoras das regiões V_H de CC46 . CC49 , CC83 e CCS 2.
19. 21â . - Processo de aqjrdo com a rei-156- vindicação 19 , caractetizado por a sequência de DNA codificar uma V„ tendo

    Π (1) pelo menos uma região de diversidade e complementaridade (CDR) codificada por um gene efectivamente homologo de

    V TAG e ri (2) regiões de armação adjacentes as regiões CDR codificadas por um gene humano
20. 22â - Processo de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por compreender ainda um segmento de sequência de DNA codificador de pelo menos uma porção de uma região constante da cadeia pesada humana ^(CH>·
21. 23â. - Processo de acordo com a reivindicação 21 . caracterizado por o segmento de sequência de DNA codificar pelo menos uma fracção de um gene C„

    Π codificadora de IgGj__^ IgM. IgA IgD ou IgE.
22. 24â - Processo de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por cerca de 20 ug de veiculo de expressão ser posto em contacto com cerca de 10 ug do segmento da sequência de DNA com 10 unidades de enzima em 10 ul de solução tampão
23. 25è - Processo de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por a digestão ser efectuada a temperaturas que variam de 37° a 65°C a um pH de 7-9 durante 1 a 18 horas

    -15 726â - Processo para a preparação de um hospedeiro transformado caracterizado por compreender a inserção de um veiculo de expressão conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 25 num hospedeiro adequado
24. 27â - Processo de acordo com a reivindicação 26 caracterizado por o veiculo de expressão ser um plasmideo
25. 28â. - Processo de acordo com a reivindicação 27. caracterizado por 10-30 ug de plasmideo se7 rem linearizados na presença de até 1 x 10 células hospedei ras . seguido de electroporação das células hospedeiras a 200 volts e 9 60 uFarads