ES2219640T3 - Anticuerpos monoclonales reformados contra un isotopo de inmunoglobulina. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A ANTICUERPOS MONOCLONALES, HUMANOS, REFORMADOS DIRIGIDOS CONTRA DETERMINANTES ISOTIPICOS DE LA INMUNOGLOBULINA E (IGE), A SUS EQUIVALENTES DIRECTOS Y A LOS DERIVADOS DE DICHOS ANTICUERPOS. LAS MOLECULAS DE LA INVENCION SON UTILES PARA EL DIAGNOSTICO, PROFILAXIS Y TRATAMIENTO DE LA ALERGIA.

Description

Anticuerpos monoclonales reformados contra un isotipo de inmunoglobulina.

La invención se refiere a anticuerpos monoclonales humanos reformados dirigidos contra determinantes isotípicos de la inmunoglobulina E (IgE) y a derivados de dichos anticuerpos. Los anticuerpos y sus derivados son útiles para diagnósticos in vitro e in vivo, y para la profilaxis y el tratamiento de alergias.

La alergia es un estado de hipersensibilidad inducido por una respuesta inmune exagerada a un agente extraño (el alergeno). La hipersensibilidad inmediata (de tipo I), caracterizada por reacciones alérgicas inmediatamente después del contacto con el alergeno, está mediada por células B y se basa en reacciones de antígeno-anticuerpo, mientras que la hipersensibilidad retrasada está mediada por células T y se basa en mecanismos de inmunidad celular. En los últimos años, el término "alergia" se ha hecho cada vez más sinónimo de la hipersensibilidad de tipo I.

La hipersensibilidad inmediata se basa en la producción de anticuerpos de la clase de inmunoglobulinas E (anticuerpos IgE) por las células B que, tras la confrontación con el alergeno, se diferencian en células plasmáticas secretoras de anticuerpos. La reacción inducida por la IgE es un acontecimiento local que se produce en el sitio de la entrada del alergeno en el cuerpo, es decir, en las superficies mucosas y/o en ganglios linfáticos locales. La IgE producida localmente primero sensibilizará a los mastocitos locales, es decir, los anticuerpos IgE se unen con sus regiones constantes a receptores FC_{e} presentes en la superficie de los mastocitos, y después la IgE "excedente" entra en la circulación y se une a receptores presentes tanto en los basófilos circulantes como en los mastocitos fijados a tejidos de todo el cuerpo. Cuando la IgE unida posteriormente entra en contacto con el alergeno, los receptores Fc_{e} forman enlaces cruzados por medio de la unión del alergeno, después de lo cual las células se desgranulan y liberan varios mediadores anafilácticos tales como histamina, prostaglandinas, leucotrienos, etc. Es la liberación de estas substancias la que es responsable de los síntomas clínicos típicos de la hipersensibilidad inmediata, particularmente la contracción del músculo liso del tracto respiratorio o del intestino, la dilatación de vasos sanguíneos pequeños y el aumento de su permeabilidad al agua y a proteínas plasmáticas, y la secreción de moco que producen, por ejemplo, rinitis, eccema atópico y asma, y la estimulación de terminaciones nerviosas de la piel que produce picor y dolor.

Además, se intensifica la reacción tras el segundo contacto con el alergeno porque algunas células B forman un "grupo de memoria" de células B IgE-positivas en la superficie (células B sIgE^{+}) después del primer contacto con el alergeno por la expresión de IgE en la superficie celular.

Un concepto prometedor para el tratamiento de la alergia implica la aplicación de anticuerpos monoclonales que presentan especificidad de isotipo de IgE y de esta manera son capaces de unirse a la IgE. Esta estrategia se basa en la inhibición de reacciones alérgicas por medio de la regulación negativa de la respuesta inmune de IgE, que es el primer acontecimiento en la inducción de la alergia y asegura el mantenimiento del estado alérgico. Como no se ve afectada la respuesta de otras clases de anticuerpo, se consigue tanto un efecto inmediato como un efecto de larga duración sobre los síntomas alérgicos. Además, los anticuerpos adecuados como agentes antialérgicos deben reaccionar con células B IgE-positivas en la superficie que se transforman en células plasmáticas productoras de IgE, de forma que pueden usarse para eliminar funcionalmente esas células B. Sin embargo, los anticuerpos contra IgE en principio también pueden inducir la liberación de mediadores de mastocitos sensibilizados a IgE por formación de enlaces cruzados con los receptores Fc_{e}, antagonizando de esta manera el efecto beneficioso ejercido sobre el nivel sérico de IgE y de células B sIgE^{+}. Por consiguiente, los anticuerpos aplicables en la terapia de alergias no deben ser capaces de reaccionar con la IgE unida a mastocitos y basófilos sensibilizados, sino que debe retener la capacidad de reconocer a las células B sIgE^{+}.

Tales anticuerpos específicos de isotipo de IgE se han descrito, por ejemplo, por Chang et al.(Biotechnology 8, 122-126 (1990)), en el documento WO 89/06138 y en la solicitud EP Nº 0396505 A2. Sin embargo, como los anticuerpos descritos no son de origen humano son menos adecuados para la aplicación en seres humanos debido a su inmunogenicidad como proteínas extrañas, su persistencia bastante larga en la circulación y la formación concebible de complejos inmunes perjudiciales. Estos inconvenientes pueden reducirse potencialmente por medio de la transformación de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de roedor anti-IgE en un anticuerpo quimérico que combina los dominios variables del anticuerpo de roedor con dominios constantes de un anticuerpo humano. Esta estrategia conserva el sitio de unión a antígenos del anticuerpo anti-IgE parental de roedor, mientras que confiere el isotipo y las funciones efectoras humanas. Sin embargo, para uso en seres humanos tal anticuerpo quimérico puede no tener suficientes ventajas clínicas con respecto al anticuerpo de roedor original.

En la solicitud EP Nº 0 476 226 A1 también se han descrito anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a la IgE humana.

La inmunogenicidad de un anticuerpo quimérico puede reducirse adicionalmente injertando regiones hipervariables de roedor, también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), en las regiones flanqueantes de dominios de región variable de cadena pesada y ligera humana, dando como resultado anticuerpos humanos reformados. La técnica implica la substitución o injerto recombinante de secuencias existentes dentro de los dominios variables de cadena ligera y pesada humana "genéricos" por secuencias de CDR de roedor con especificidad de antígeno (solicitud EP Nº 0 239 400 A2). Se considera que está técnica transferirá la porción crítica y principal del sitio de unión a antígenos al anticuerpo humano.

Las inmunoglobulinas o anticuerpos intactos naturales comprenden una molécula tetramérica generalmente con forma de Y que tiene un sitio de unión a antígenos al final de cada brazo superior. Un sitio de unión a antígenos consta del dominio variable de una cadena pesada asociado con el dominio variable de una cadena ligera. Más específicamente el sitio de unión a antígenos de un anticuerpo está formado esencialmente por las tres CDR del dominio variable de una cadena pesada (V_{H}) y las 3 CDR del dominio variable de la cadena ligera (V_{L}). Tanto en las V_{L} como en las V_{H} las CDR se alternan con cuatro regiones flanqueantes (FR) formando una cadena polipeptídica de la fórmula general

(I),FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

donde la cadena polipeptídica se describe como una cadena que empieza en el extremo N-terminal y termina en el extremo C-terminal. Las CDR de V_{H} y V_{L} también se denominan H1, H2, H3 y L1, L2, L3, respectivamente. La determinación en cuanto a lo que constituye una FR o una CDR normalmente se realiza comparando las secuencias de aminoácidos de varios anticuerpos inducidos en la misma especie y las reglas generales para la identificación se conocen en la técnica ("Sequences of proteins of immunological interest", Kabat E.A. et al., US department of health and human service, Public health service, National Institute of Health).

Recientemente se ha descubierto que la contribución realizada por un dominio variable de cadena ligera a la energética de la unión es pequeña en comparación con la realizada por el dominio variable de cadena pesada asociado, y que los dominios variables de cadena pesada aislados tienen una actividad de unión a antígenos por sí mismos. Tales moléculas comúnmente se denominan anticuerpos de un solo dominio (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)).

Las CDR forman bucles que, dentro de los dominios, se conectan para dar una estructura de lámina b. La relación entre la secuencia de aminoácidos y la estructura de un bucle puede describirse por un modelo de estructura canónica (Chothia et al., Nature 342, 887-883 (1989)). De acuerdo con este modelo, los anticuerpos tienen sólo algunas conformaciones de cadena principal o "estructuras crónicas" para cada región hipervariable. Las conformaciones de determinan por la presencia de algunos restos aminoacídicos clave en sitios específicos en las CDR y, para ciertos bucles, en las regiones estructurales. Las regiones hipervariables que tienen las mismas conformaciones en diferentes inmunoglobulinas tienen restos aminoacídicos iguales o muy similares en estos sitios.

Se han realizado injertos de CDR para varios anticuerpos monoclonales de roedor produciendo anticuerpos humanos (o humanizados) reformados con una afinidad de unión significativamente menor que la del anticuerpo donador de CDR de roedor. Ciertos hallazgos recientes han indicado que además de la transferencia de cambios de CDR dentro de la región flanqueante de la secuencia humana, puede ser necesario proporcionar una actividad de unión a antígenos satisfactoria en el producto con CDR injertadas.

Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) han descrito que las CDR de un anticuerpo monoclonal anti-Tac murino pueden injertarse en una región flanqueante humana. Las regiones flanqueantes humanas se eligieron para maximizar la homología con la secuencia murina. Los autores usaron un modelo informático del anticuerpo parental murino para identificar los restos aminoacídicos localizados dentro de la FR que están suficientemente próximos como para interaccionar con las CDR o el antígeno. Estos restos se mutaron para dar el resto encontrado en la secuencia murina. El anticuerpo anti-Tac humanizado tenía una afinidad que sólo era aproximadamente 1/3 de la del anticuerpo anti-Tac murino y el mantenimiento del carácter humano de este anticuerpo fue problemático.

Riechmann et al. (Nature 332, 323 - 327 (1988)) han descrito anticuerpos reformados/humanizados contra el antígeno CAMPATH-1.

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que es posible producir anticuerpos humanos reformados dirigidos contra la IgE humana, que tienen una afinidad de unión al antígeno, por ejemplo, a la IgE, que aproximadamente equivale e incluso excede la del anticuerpo donador de CDR murino.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo monoclonal humano reformado específico para IgE que comprende al menos un sitio de unión a antígenos que comprende regiones flanqueantes de tipo humano y, en secuencia, las regiones hipervariables CDR1_{H}, CDR2_{H} y CDR3_{H}; teniendo dicha CDR1_{H} la secuencia de aminoácidos Met-Tyr-Trp-Leu-Glu, teniendo dicha CDR2 la secuencia de aminoácidos Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala y teniendo dicha CDR3 la secuencia Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr, teniendo dicho anticuerpo humano reformado una afinidad de unión a antígenos mayor del 90% de la del anticuerpo donador de CDR murino, un equivalente directo o un derivado de dicho anticuerpo reformado. En la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 1, la CDR1_{H} se extiende desde el aminoácido 31 al 35, la CDR2_{H} se extiende desde el aminoácido 50 al 66 y la CDR3_{H} se extiende desde el aminoácido 99 al 112. El anticuerpo donador de CDR-murino es el anticuerpo monoclonal TES-C21.

Preferiblemente, la invención se refiere a un anticuerpo humano reformado que comprende al menos un sitio de unión a antígenos, que comprende:

a)

un primer dominio que forma parte de una cadena pesada, que comprende, en secuencia, las regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3_{H}, teniendo dicha CDR1_{H} la secuencia de aminoácidos Met-Tyr-Trp-Leu-Glu, teniendo dicha CDR2_{H} la secuencia de aminoácidos Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala y teniendo dicha CDR3_{H} la secuencia de aminoácidos Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr; y b) un segundo dominio que forma parte de una cadena ligera, que comprende, en secuencia, las regiones hipervariables CDR1_{L}, CDR2_{L} y CDR3_{L}, teniendo dicha CDR1_{L} la secuencia de aminoácidos Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His, teniendo dicha CDR2_{L} la secuencia de aminoácidos Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser y teniendo dicha CDR3_{L} la secuencia de aminoácidos Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr, teniendo dicho anticuerpo humano reformado una afinidad de unión a antígenos mayor del 90% de la del anticuerpo donador de CDR murino. Las CDR1_{H}, CDR2_{H} y CDR3_{H} del primer dominio son las CDR de la proteína cuya secuencia se identifica en la SEC ID Nº: 1. Las CDR1_{L}, CDR2_{L} y CDR3_{L} del segundo dominio se extienden desde el aminoácido 24 al 34, del 50 al 56 y del 89 al 87, respectivamente, en la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 3.

Cuando el sitio de unión a antígenos comprende tanto el primer como el segundo dominio, éstos pueden localizarse en la misma cadena polipeptídica o, preferiblemente, cada dominio puede estar en una cadena diferente, siendo parte el primer dominio de una cadena pesada de inmunoglobulina, o fragmento de la misma, y siendo parte el segundo dominio de una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de la misma.

De acuerdo con la invención, un anticuerpo humano reformado se refiere a una molécula caracterizada porque (1) comprende al menos un sitio de unión a antígenos en el que cada cadena existente comprende una región flanqueante de tipo humano y (2) cualquier región constante presente es al menos substancialmente homóloga, preferiblemente idéntica, a una región constante de inmunoglobulina humana. Como se usa en este documento, una "región flanqueante de tipo humano" es una región flanqueante que consta, en secuencia, de regiones flanqueantes FR1, FR2, FR3 y FR4, que comprende al menos aproximadamente 70 o más, preferiblemente al menos aproximadamente 75 o más aminoácidos idénticos a los de una región flanqueante de una secuencia de inmunoglobulina humana particular. Por lo tanto, todas las partes excepto posiblemente las CDR de un anticuerpo humano reformado son substancialmente homólogas a partes correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulina humana nativas. Por ejemplo, un anticuerpo humano reformado no incluiría un anticuerpo quimérico que comprendiera una región variable murina y una región constante humana.

Una región flanqueante de tipo humano puede ser idéntica a una región flanqueante de una inmunoglobulina humana particular o, preferiblemente, puede diferir de la región flanqueante humana particular, es decir, un número limitado de restos aminoacídicos pueden insertarse, delecionarse o reemplazarse por otros restos aminoacídicos. Tales modificaciones pueden limitarse a una sola FR, es decir, FR1, FR2, FR3 o FR4, o implicar dos, tres o las cuatro FR. Por ejemplo, un aminoácido hidrófobo dentro de la región flanqueante aceptora humana puede reemplazarse por otro aminoácido, preferiblemente también un aminoácido hidrófobo, por ejemplo, un aminoácido homólogo, reemplazarse por dos aminoácidos o delecionarse. De forma similar, un aminoácido hidrófilo dentro de la región flanqueante humana puede substituirse por otro aminoácido, dos aminoácidos o delecionarse, manteniendo preferiblemente los aminoácidos de reemplazo la estructura de enlaces de hidrógeno de la región flanqueante original. Tales modificaciones pueden realizarse en una base de "ensayo y error", es decir, su efecto se evalúa comparando la afinidad de unión a antígenos del anticuerpo humano reformado creado con la del anticuerpo donador de CDR murino TES-C21. Más adelante se describen ensayos adecuados para la determinación de la afinidad de unión a antígenos.

En particular, un número limitado de restos aminoacídicos, preferiblemente de 1 a 12 restos, dentro de una región flanqueante aceptora humana elegida pueden reemplazarse por restos aminoacídicos presentes en las posiciones correspondientes en un anticuerpo monoclonal murino (intercambio humano H murino), particularmente el anticuerpo murino TES-C21, y/o con restos aminoacídicos presentes en posiciones correspondientes en un anticuerpo humano diferente (intercambio humano H humano). Preferiblemente, la substitución prevista de uno o más aminoácidos se basa en la identificación previa de restos flanqueantes particulares considerados potencialmente cruciales para la unión de antígenos y/o el empaquetamiento de V_{L}/V_{H}. Tales aminoácidos cruciales incluyen restos flanqueantes que, debido a su naturaleza y/o localización especial:

- se cree que están en contacto o localizados cerca de aminoácidos dentro de las CDR del anticuerpo;

- podrían estar implicados en interacciones críticas con el antígeno;

- se cree que están implicados en el mantenimiento de la integridad total de la estructura V_{H}/V_{L} emparejada, influyendo directa o indirectamente sobre las interacciones dentro entre los dominios V_{H} y V_{L}.

Los métodos que se sabe que son adecuados para la identificación de los denominados aminoácidos cruciales incluyen el modelado molecular. Por ejemplo, pueden crearse modelos moleculares de un sitio de unión a antígenos y presentarse en un monitor informático por medio del uso de programas informáticos que generalmente están disponibles y son bien conocidos para los especialistas en la técnica.

En particular, el diseño de un anticuerpo reformado de la invención pueden comprender las siguientes etapas:

a)

construcción de un modelo molecular verosímil para V_{L} y V_{H} del anticuerpo murino TES-C21, por ejemplo, basado en las secuencias de aminoácidos representadas en las SEC ID Nº: 1 y 3 y las correspondientes estructuras resueltas de un anticuerpo murino que, según se ha determinado, es muy homólogo por correspondencia de secuencias. Las estructuras resueltas pueden proceder del mismo anticuerpo murino o de dos anticuerpos murinos diferentes.

b)

Selección de regiones flanqueantes aceptoras humanas adecuadas a partir de V_{H} y V_{L} de secuencias de inmunoglobulina humana conocidas, por ejemplo, secuencias que se pueden obtener a partir de una base de datos disponible públicamente, tal como la base de datos KABAT ("Sequences of proteins of immunological interest", Kabat E.A. et al., US department of health and human service, Public health service, National Instituye of Health). Son regiones flanqueantes aceptoras humanas adecuadas, por ejemplo, regiones flanqueantes de inmunoglobulina particulares que son muy homólogas, preferiblemente inusualmente homólogas en comparación con las demás secuencias de la base de datos, a los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo TES-C21 o, más preferiblemente, regiones flanqueantes consenso de muchos anticuerpos humanos que son muy homólogas a los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo TEC-C21. No es necesario que las secuencias flanqueantes de cadena pesada y ligera elegidas para el injerto procedan del mismo anticuerpo humano, sino que preferiblemente proceden de diferentes anticuerpos humanos.

c)

Construcción de un modelo molecular de V_{H} y V_{L} de un anticuerpo humano reformado que comprende las CDR del TES-C21 murino y las FR de la región flanqueante aceptora humana seleccionada de acuerdo con la fórmula I.

d)

Comparación de los modelos moleculares obtenibles en las etapas a) y c).

En un anticuerpo humano reformado de la invención, uno, algunos o todos los restos aminoacídicos cruciales identificados pueden substituirse por otro resto aminoacídico, en particular, con el resto presente en esa posición particular en el anticuerpo TES-C21. Preferiblemente, un resto aminoacídico "original" dentro de la región flanqueante humana seleccionada no se reemplaza si forma parte de una estructura canónica postulada o es importante para determinar la estructura de un bucle hipervariable. Sin embargo, la substitución de restos aminoacídicos puede no restringirse a aminoácidos cruciales. Preferiblemente, los cambios que afectan a restos no cruciales son cambios de tipo humano-humano.

En un anticuerpo humano reformado de la invención, el aminoácido Cys puede estar en estado oxidado formando enlaces -S-S.

Los ejemplos de un anticuerpo humano reformado proporcionado por la presente invención incluyen un anticuerpo de un solo dominio, un anticuerpo monocatenario así como un anticuerpo intacto de múltiples cadenas, por ejemplo, tetramérico que comprende cadenas pesada y ligera de longitud completa, y cualquier fragmento del mismo, por ejemplo, fragmentos Fv, F(ab')_{2}, Fab' y Fab.

Un anticuerpo de un solo dominio comprende un solo sitio de unión a antígenos que comprende un solo dominio.

Un anticuerpo de una sola cadena (también denominado scFv) consta esencialmente de los dominios variables de una cadena pesada y de una cadena ligera. Preferiblemente, estos dominios variables se unen covalentemente a través de un enlazador peptídico corto que comprende de aproximadamente 10 a 30, particularmente aproximadamente 15 aminoácidos seleccionados entre glicina y serina. Un enlazador peptídico preferido es el polipéptido de 15 aminoácidos que consta de 3 unidades repetitivas de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. Un anticuerpo de una sola cadena no incluye una parte constante de cadena pesada o ligera.

El anticuerpo humano reformado de la invención es específico para IgE, es decir, está dirigido contra un determinante isotípico de la IgE humana. Por consiguiente, el anticuerpo de la invención reconoce un determinante antigénico en la cadena pesada común a las inmunoglobulinas de clase IgE, es decir, reacciona con moléculas de IgE de diferentes especificidades pero no reacciona con inmunoglobulinas de otros isotipos o con cadenas ligeras de inmunoglobulina.

Se requiere que un anticuerpo reformado de la invención tenga una afinidad de unión a IgE que al menos sea aproximadamente igual que la del anticuerpo murino TES-C21. Como se usa en este documento antes o más adelante, la expresión "es al menos aproximadamente igual" significa que la afinidad de unión a IgE del anticuerpo humano reformado (anticuerpo de ensayo), en una base estadística, es al menos de aproximadamente un 90%, preferiblemente mayor del 90%, particularmente entre aproximadamente un 100% y aproximadamente un 250%, con respecto a la del anticuerpo de referencia TES-C21. Un anticuerpo reformado debe compararse con la estructura correspondiente de TES-C21. Por ejemplo, si el anticuerpo reformado es un anticuerpo de un solo dominio, su afinidad debe estar relacionada con el TES-C21 de un solo dominio. Este anticuerpo murino de un solo dominio puede prepararse fácilmente basándose en la información proporcionada en las SEC ID Nº: 1 y 3. En la descripción, no se realiza ninguna distinción entre "afinidad" o "avidez" de un anticuerpo, sino que el término "afinidad" hace referencia a la afinidad o a la avidez.

La determinación de afinidades de la referencia y el anticuerpo de ensayo reformado debe realizarse de la misma forma, es decir en condiciones idénticas en el mismo ensayo. Los anticuerpos comparados entre sí deben tener aproximadamente el mismo grado de pureza. Se prefiere usar anticuerpos muy purificados.

La afinidad de unión de un anticuerpo por IgE se determina usando un ensayo cuantitativo adecuado que puede establecerse fácilmente por una persona con experiencia habitual en la técnica basándose en técnicas y principios conocidos.

Un parámetro adecuado a determinar es la constante de equilibrio K_{aff} (constante de afinidad). Se ha desarrollado una diversidad de ecuaciones matemáticas para facilitar los cálculos experimentales de las constantes de afinidad para la interacción de anticuerpo-antígeno. Los métodos experimentales adecuados para la medición de la K_{aff} pueden basarse, por ejemplo, en la medición de la relación entre antígeno unido y libre, por ejemplo, por un radioinmunoensayo competitivo (RIA) o por el ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima competitivo (EIA), o en la medición de la concentración total de anticuerpo, por ejemplo, el EIA no competitivo de fase sólida descrito por Beatty et al., (J. Immunol. Meth. 100, 173-179 (1987)).

Preferiblemente, la K_{aff} se determina analizando la interacción bioespecífica a tiempo real (Jönsson, U. et al., Biotechniques 11, 620-627 (1991) del anticuerpo con el antígeno IgE en un sistema BIA core^{TM} usando chips de superficie CM5 (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Suecia). El ensayo se realiza esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante e implica la determinación de las constantes cinéticas K_{ass} y K_{diss}. Un antígeno adecuado es, por ejemplo, la IgE humana disponible en el mercado proporcionada por Serotec (por ejemplo, BP 094, Dottikon, Suiza) o un anticuerpo quimérico que tiene una región constante humana tal como SE 44 (Sun et al., J. Cell. Biol. 109, 289a (1989)). En particular, este ensayo comprende un ciclo experimental, que comprende:

1)

la inmovilización de un denominado anticuerpo de captura en la superficie de un chip por medios químicos, es decir, para las mediciones que implican al anticuerpo murino TES-C21 se emplea un anticuerpo anti-ratón, por ejemplo IgG anti-ratón, o para las mediciones que implican un anticuerpo humano reformado de la invención se emplea un anticuerpo anti-humano, por ejemplo IgG anti-humana;

2)

la unión del anticuerpo de referencia o de ensayo al anticuerpo de captura inmovilizado; y

3)

la puesta en contacto del anticuerpo de referencia o de ensayo unido con una concentración fija de antígeno.

Preferiblemente se realizan varios, por ejemplo, cuatro ciclos experimentales usando una cantidad constante de anticuerpo unido y variando la concentración (conocida) de IgE. Después de completar cada ciclo se regenera la superficie, por ejemplo, con un ácido tal como HCl.

El diseño de un anticuerpo reformado de la invención pretende construir un anticuerpo que presente una alta velocidad de asociación (K_{ass}), preferiblemente de 2,5 x 10^{5} M^{-1}s^{-1} o superior, junto con una baja velocidad de disociación (K_{diss}), preferiblemente de 1,9 x 10^{-5} s^{-1} o inferior.

Como se usa en este documento, un equivalente directo de un anticuerpo humano reformado de la invención es un anticuerpo humano reformado que comprende, en secuencia, CDR1, CDR2 y CDR3 como se muestra en la SEC ID Nº: 1 y, opcionalmente, CDR1, CDR2 y CDR3 como se muestra en la SEC ID Nº: 3, donde dentro de un dominio variable hasta cuatro restos aminoacídicos dentro de las CDR, es decir uno, dos, tres o cuatro aminoácidos dentro de las CDR se han reemplazado por otro aminoácido. De esta manera, por la expresión "equivalentes directos del mismo" se entiende un anticuerpo humano reformado de un solo dominio (proteína Y).

(1)

en el que las regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3 consideradas en conjunto tienen una homología de al menos un 90% con las CDR mostradas en la SEC ID Nº: 1 y,

(2)

que tiene una afinidad por IgE que al menos es aproximadamente igual a la de la proteína de referencia de la invención que tiene FR idénticas a las de la proteína Y, pero que tiene CDR idénticas a las de la SEC ID Nº: 1; o

un anticuerpo reformado que tiene dos dominios por sitio de unión (proteína Y').

(1)

en la que las regiones hipervariables CDR1_{H}, CDR2_{H}, CDR3_{H} y CDR1_{L}, CDR2_{L}, CDR3_{L} consideradas en conjunto tienen una homología de al menos un 80%, preferiblemente del 90% con las CDR mostradas en las SEC ID Nº: 1 y 3, y

(2)

que tiene una afinidad por la IgE que al menos es igual a la de la proteína de referencia de la invención que tiene FR y partes constantes idénticas a las de la proteína Y' pero que tiene regiones hipervariables CDR1_{H}, CDR2_{H}, CDR3_{H} y CDR1_{L}, CDR2_{L}, CDR3_{L} idénticas a las de las SEC ID Nº: 1 y 3.

El último criterio puede ensayarse determinando la K_{aff}, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito anteriormente.

El anticuerpo monoclonal murino TES-C21 presenta (entre otras) las siguientes características, que también son comunes para un anticuerpo humano reformado de la presente invención:

- inhibe la unión de IgE a células que llevan receptores Fc_{e} I o II;

- se une específicamente a células secretoras de IgE humana;

- no reconoce ni se une la IgE unida en la superficie de células que llevan receptores Fc_{e} I o II, por ejemplo mastocitos y basófilos sensibilizados,

- no induce la liberación de mediadores (por ejemplo, histamina), e

- inhibe la formación de IgE en la respuesta inmune.

Estas capacidades características pueden determinarse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la solicitud EP Nº 0 396 505 A2.

Un anticuerpo reformado preferido, o un derivado del mismo de la invención, comprende al menos:

a)

una cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de la misma que comprende un dominio variable que comprende, en secuencia, las regiones hipervariables CDR1_{H}, CDR2_{H}, CDR3_{H} y la parte constante o un fragmento de la misma de una cadena pesada humana, teniendo dicha CDR1_{H} la secuencia de aminoácidos Met-Tyr-Trp-Leu-Glu, teniendo dicha CDR2_{H} la secuencia de aminoácidos Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-ThrAsn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala, y teniendo dicha CDR3_{H} la secuencia Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr-; y

b)

una cadena ligera de inmunoglobulina, o un fragmento de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende, en secuencia, las regiones hipervariables CDR1_{L}, CDR2_{L}, CDR3_{L} y la parte constante, o un fragmento de la misma, de una cadena ligera humana, teniendo dicha CDR1_{L} la secuencia de aminoácidos Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His, teniendo dicha CDR2_{L} la secuencia de aminoácidos Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser, y teniendo dicha CDR3_{L} la secuencia de aminoácidos Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr.

Un fragmento de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina es una cadena pesada o ligera que no es una cadena de longitud completa y comprende un dominio variable y opcionalmente parte de la parte constante de la cadena.

Es más preferido un anticuerpo humano reformado, o un derivado del mismo, que comprende al menos

a)

una cadena pesada que comprende un dominio variable que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 11 que empieza con el aminoácido en la posición 1 y que termina con el aminoácido en la posición 123 y la parte constante de una cadena pesada humana; y

b)

una cadena ligera que comprende un dominio variable que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 5 que empieza con el aminoácido en la posición 1 y que termina con el aminoácido en la posición 107 y la parte constante de una cadena ligera humana.

Se prefiere particularmente un anticuerpo humano reformado o un derivado del mismo, que comprende al menos:

a)

una cadena pesada que comprende un dominio variable que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 13 que empieza con el aminoácido en la posición 1 y que termina con el aminoácido en la posición 123 y la parte constante de una cadena pesada humana; y

b)

una cadena ligera que comprende un dominio variable que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 5 que empieza con el aminoácido en la posición 1 y que termina con el aminoácido en la posición 107 y la parte constante de una cadena ligera humana.

Las designaciones de restos proporcionadas en la presente solicitud corresponden a la numeración lineal de los restos aminoacídicos.

La parte constante de una cadena pesada humana puede seleccionarse entre cualquiera de los isotipos alfa (a), delta (d), gamma (g) o mu (\mu). Pueden usarse cadenas pesadas de diversas subclases tales como las subclases de IgG 1-4. Se prefiere la parte constante de la cadena de gI humana. Las diferentes clases y subclases de cadenas pesadas están implicadas en diferentes funciones efectoras y, de esta manera, eligiendo el tipo de la región constante de la cadena pesada, pueden producirse anticuerpos humanos reformados con las funciones efectoras deseadas. La parte constante de una cadena ligera es una cadena lambda (l) o, preferiblemente, kappa (k).

El anticuerpo más preferido es un anticuerpo humano reformado denominado H3L1 producido por la línea celular EH31.8.

La invención también se refiere a un derivado de un anticuerpo humano reformado de la invención. Un derivado de un anticuerpo humano reformado tiene la especificidad antigénica de dicho anticuerpo. De acuerdo con la invención, se entiende que un derivado es cualquier molécula que se pueda obtener por medio de la modificación de un anticuerpo de la invención, por ejemplo, por adsorción o modificación química. Por ejemplo, dependiendo del uso deseado del derivado, un anticuerpo de la invención puede modificarse por medio de la unión covalente o no covalente de otra molécula proteica o no proteica. La unión covalente que da como resultado conjugados de anticuerpo se consigue, por ejemplo, usando técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica. En tales conjugados, el anticuerpo se une a la molécula de conjugación directamente o por medio de un grupo espaciador o enlazador. Son ejemplos de derivados anticuerpos humanos reformados marcados radiactivamente y conjugados de un anticuerpo humano reformado de la invención, por ejemplo, con un enzima, un marcador fluorescente o quimioluminiscente, una substancia citotóxica o citostática adecuada, un quelato metálico, una proteína que no es un enzima tal como avidina, o con una molécula no proteicas tal como biotina.

Los enzimas usados para los conjugados de anticuerpo de la invención son, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, b-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucoamilasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa o glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

Los marcadores fluorescentes incluyen fluoresceína, fluorocromo, rodamina y similares.

Son marcadores quimioluminiscentes, por ejemplo, ésteres de acridinio de luminol.

Son ejemplos de quelatos metálicos el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), el ácido dietilentriaminopentaacético (DPTA), 1,4,8,11-tetraazatetradecano, el ácido 1,4,8,11-tetraazatetradecano-1,4,8,11-tetraacético, el ácido 1-oxa-4,7,12,15-tetraazaheptadecano-4,7,12,15-tetraacético y similares.

Los anticuerpos marcados radiactivamente o los fragmentos de la invención contienen, por ejemplo, yodo radiactivo (^{123}I, ^{125}I, ^{131}I), tritio (^{3}H), carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), itrio (^{90}Y), tecnecio (^{99m}Tc) o similares.

La invención se refiere además a un método para la fabricación de anticuerpos humanos reformados anti-IgE, equivalentes directos y derivados de los mismos de acuerdo con la invención.

El anticuerpo humano reformado, el equivalente directo o el derivado del mismo de acuerdo con la invención se prepara por un proceso que es conocido per se, caracterizado porque ciertas células hospedadoras adecuadas como se definen más adelante que producen una proteína de la invención se multiplican in vitro o in vivo y, si se desea, la proteína deseada se aísla y opcionalmente se convierte en un derivado de la misma. Una proteína de la invención puede prepararse por un proceso que comprende cultivar cualquier hospedador transformable adecuado en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína, aislar dicha proteína, y, opcionalmente, convertir la proteína aislada en otra proteína de la invención, por ejemplo, por escisión proteolítica, o en un derivado de la invención, por ejemplo, por unión de otro compuesto, por ejemplo una proteína o una molécula no proteica, como se ha mencionado anteriormente.

En una realización preferida de la invención, se proporciona un proceso para producir un anticuerpo humano reformado anti-IgE de múltiples cadenas que comprende (1) cultivar una célula hospedadora adecuada que se ha transformado con una primera y segunda construcciones de ADN de la invención como se definen más adelante y (2) recuperar un anticuerpo humano reformado anti-IgE activo del cultivo. En este contexto, un anticuerpo activo es un anticuerpo que se une específicamente a IgE. Un anticuerpo de múltiples cadenas es un anticuerpo que comprende al menos un sitio de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada y ligera.

Como alternativa, la cadena pesada y ligera puede recuperarse por separado y reconstituirse en un anticuerpo activo después de plegamiento in vivo. Los métodos de reconstitución apropiados son bien conocidos en la técnica. Por lo tanto, un proceso para producir un anticuerpo de múltiples cadenas de la invención también puede comprender:

(1)

cultivar una primera célula hospedadora que se transforma con una primera construcción de ADN de la invención y recuperar dicha cadena pesada o fragmento de la misma del cultivo y

(2)

cultivar una segunda célula hospedadora que se transforma con una segunda construcción de ADN de la invención y recuperar dicha cadena ligera o fragmento de la misma del cultivo y

(3)

reconstituir in vitro un anticuerpo reformado anti-IgE activo a partir de la cadena pesada o el fragmento de la misma obtenido en (1) y la cadena ligera o fragmento de la misma obtenido en (2).

De una manera similar, también se proporciona un proceso para producir un anticuerpo humano reformado de una sola cadena o de un solo dominio de la invención que comprende (1) cultivar una célula hospedadora que se transforma con una construcción de ADN que codifica respectivamente un anticuerpo humano reformado de una sola cadena o un solo dominio de la invención y (2) recuperar dicho polipéptido del cultivo.

Los fragmentos de los anticuerpos humanos reformados, por ejemplo, fragmentos Fab, Fab' o F(ab')_{2}, pueden prepararse por técnicas de ADN recombinante como las descritas anteriormente o a partir de un anticuerpo humano reformado de múltiples cadenas intacto preparado como se ha mencionado anteriormente por métodos conocidos per se, por ejemplo, por digestión con enzimas tales como papaína o pepsina y/o escisión de enlaces disulfuro por reducción química.

Las células hospedadoras adecuadas incluyen células eucariotas, por ejemplo, células animales, células vegetales y hongos, y células procariotas, tales como bacterias gram-positivas y gram-negativas, por ejemplo E. coli. Las células hospedadoras eucariotas preferidas son células de mamífero y células de levadura.

Como se ha usado anteriormente o más adelante, in vitro significa ex vivo, incluyendo de esta manera, por ejemplo, condiciones de cultivo de células y de cultivo de tejidos.

Por ejemplo, la multiplicación de células de mamífero in vitro se realiza en medios de cultivo adecuados, que son los medios de cultivo convencionales habituales, tales como medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) o medio RPMI 1640, opcionalmente suplementado con suero de mamífero, por ejemplo, suero de ternero fetal, u oligoelementos y suplementos para mantener el crecimiento, por ejemplo, células alimentadoras tales como células de exudado peritoneal de ratón normal, células de bazo, macrófagos de médula ósea, 2-aminoetanol, insulina, transferrina, lipoproteína de baja densidad, ácido oleico o similares.

La producción in vitro proporciona preparaciones de anticuerpos relativamente puras y permite un aumento a escala para proporcionar grandes cantidades de los anticuerpos deseados. Las técnicas para el cultivo de células bacterianas, levaduras y células de mamífero son conocidas en la técnica e incluyen cultivos en suspensión homogéneos, por ejemplo, en un reactor Airlift o en un reactor agitador continuo, o cultivos de células inmovilizadas o atrapadas, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, en microperlas de agarosa o en cartuchos cerámicos.

También pueden obtenerse grandes cantidades de los anticuerpos humanos reformados deseados de la invención multiplicando células de mamífero in vivo. Para este fin, se inyectan células de hibridoma que producen los anticuerpos deseados en mamíferos histocompatibles para originar el crecimiento de tumores productores de anticuerpos. Opcionalmente, los animales se inducen con un hidrocarburo, especialmente aceites minerales tales como pristano (tetrametil pentadecano), antes de la inyección. Después de una a tres semanas, los anticuerpos se aíslan a partir de los fluidos corporales de esos mamíferos. Por ejemplo, se inyectan células transfectadas derivadas de la línea celular de hibridoma Sp2/0 que producen los anticuerpos deseados por vía intraperitoneal en ratones Balb/c opcionalmente pretratados con pristano, y después de una a dos semanas, se recoge el fluido ascítico a partir de los animales.

En los sobrenadantes de cultivo celular se seleccionan los anticuerpos humanos reformados deseados, preferentemente con un inmunoensayo enzimático, por ejemplo un ensayo de sándwich o un ensayo dot, o un radioinmunoensayo usando IgE como antígeno. Por ejemplo, puede usarse un inmunoensayo enzimático de sándwich para determinar si en los sobrenadantes de cultivo celular están presentes inmunoglobulinas montadas correctamente, usando un anticuerpo dirigido a la región constante humana de la cadena ligera k o l (según sea apropiado) y otro anticuerpo dirigido a la región constante humana de la cadena pesada, por ejemplo, g, de la subclase deseada, estando uno de dichos anticuerpos aplicado como un recubrimiento en un soporte sólido y estando el otro conjugado con un enzima que permite la detección con un substrato enzimático adecuado. Tal inmunoensayo es, por ejemplo, un ensayo de inmunoadsorbente ligado a enzima (ELISA) donde un soporte adecuado, por ejemplo placas de microtitulación de plástico, se recubre con inmunoglobulina E y se incuba con el sobrenadante de cultivo a ensayar. Los anticuerpos monoclonales unidos se detectan por incubación con un anticuerpo marcado con enzima que reconoce los anticuerpos anti-IgE en el sobrenadante y por la adición posterior de una solución del substrato enzimático apropiado. La reacción del substrato enzimático produce, por ejemplo, un cambio de color que puede observarse a simple vista o con dispositivos de medición óptica.

Para el aislamiento de los anticuerpos humanos reformados, las inmunoglobulinas presentes en los sobrenadantes de cultivo o en el fluido ascítico pueden concentrarse, por ejemplo, por precipitación con sulfato amónico, diálisis frente a un material higroscópico tal como PEG, filtración a través de membranas selectivas o similares. Si es necesario y/o se desea, los anticuerpos se purifican por los métodos cromatográficos habituales, por ejemplo, por exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba o cromatografía de afinidad, por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad. Preferiblemente, los anticuerpos humanos reformados se aíslan a partir de los sobrenadantes celulares que los contienen por un procedimiento que comprende una etapa de purificación cromatográfica, por ejemplo, cromatografía de afinidad, por ejemplo con proteína A (si el anticuerpo de la invención comprende una parte Fc), cromatografía de intercambio iónico y/o exclusión molecular.

Los derivados de anticuerpo humano reformado de la invención se preparan por métodos conocidos per se, por ejemplo, por adsorción de los anticuerpos humanos reformados en otro compuesto o por acoplamiento proporcionando conjugados unidos químicamente. Los conjugados de anticuerpos de la invención con una proteína, por ejemplo, un enzima, se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar un anticuerpo preparado como se ha descrito anteriormente con la proteína en presencia de un agente de acoplamiento, por ejemplo, glutaraldehído, peryodato, N,N'-o-fenilendimaleimida, N-(m-maleimidobenzoiloxi)-succinimida, N-(3-[2'-piridilditio]-propionoxi)-succinimida, N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida o similares. Los conjugados con biotina se preparan, por ejemplo, por medio de la reacción de anticuerpos con un éster activado de biotina tal como el éster de biotina N-hidroxisuccinimida. Los conjugados con marcadores fluorescentes o quimioluminiscentes se preparan en presencia de un agente de acoplamiento, por ejemplo, los indicados anteriormente, o por reacción con un isotiocianato, preferiblemente isotiocianato de fluoresceína.

Los anticuerpos reformados marcados radiactivamente con yodo (^{123}I, ^{125}I, ^{131}I) se obtienen a partir de los anticuerpos de la invención por yodación de acuerdo con métodos conocidos per se, por ejemplo, con sodio o yoduro potásico radiactivo y un agente oxidante químico, tal como hipoclorito sódico, cloramina T o similares, o un agente oxidante enzimático tal como lactoperoxidasa, o glucosa oxidasa y glucosa. Los anticuerpos o fragmentos de acuerdo con la invención se acoplan a itrio (^{90}Y) por ejemplo por quelación con ácido dietilentriaminopentaacético (DPTA). Los anticuerpos o fragmentos marcados con tecnecio-99m se preparan por procesos de intercambio de ligando, por ejemplo, por reducción de pertecnetato (TcO_{4}^{-}) con solución de ion estannoso, quelación del tecnecio reducido en una columna de Sephadex y aplicación de los anticuerpos a esta columna, o por técnicas de marcaje directo, por ejemplo, por incubación de pertecnetato, un agente reductor tal como SnCl_{2}, una solución tampón tal como solución de ftalato sódico-potásico, y los anticuerpos de la invención.

Los conjugados de anticuerpos de la invención con una proteína también pueden prepararse directamente por técnicas de ADN recombinante, por ejemplo, las descritas más adelante.

El proceso para producir un anticuerpo humano reformado, un equivalente directo o un derivado de acuerdo con la invención debe producir la proteína deseada en una cantidad suficiente para las determinaciones de afinidad y especificidad.

La invención también se refiere a moléculas de ADN recombinantes que codifican los anticuerpos humanos reformados de la invención y equivalentes directos de los mismos. De una manera muy general, se proporcionan moléculas de ADN que codifican un anticuerpo humano reformado de un solo dominio de la invención, un anticuerpo humano reformado de una sola cadena de la invención, y una cadena pesada o ligera o fragmentos de las mismas de un anticuerpo humano reformado de la invención. Por definición, tales moléculas de ADN comprenden ADN monocatenarios codificantes, ADN bicatenarios que constan de dichos ADN codificantes y ADN complementarios a los mismos, o los propios ADN complementarios (monocatenarios). Más específicamente, la invención se refiere a una primera y segunda construcciones de ADN como se describen más adelante.

La primera construcción de ADN codifica una cadena pesada o un fragmento de la misma y comprende:

a)

una primera parte que codifica un dominio variable que comprende FR y CDR alternas, siendo dichas CDR, en secuencia, CDR1_{H}, CDR2_{H}y CDR3_{H}, cuyas secuencias de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 se extienden desde la posición 31 a 35, 50 a 66 y 99 a 112, respectivamente; empezando esta primera parte con un codón que codifica el primer aminoácido del dominio variable y terminando con un codón que codifica el último aminoácido del dominio variable y, opcionalmente,

b)

una segunda parte que codifica una parte constante de cadena pesada humana o un fragmento de la misma que empieza con un codón que codifica el primer aminoácido de la parte constante de la cadena pesada y termina con un codón que codifica el último aminoácido de la parte constante o un fragmento de la misma, seguido de un codón sin sentido. Preferiblemente, esta primera parte codifica un dominio variable que tiene una secuencia de aminoácidos substancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 13 que empieza con el aminoácido en la posición 1 y termina con el aminoácido en la posición 123. Más preferiblemente, la primera parte tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 13 que empieza con el nucleótido en la posición 79 y termina con el nucleótido en la posición 447. La segunda parte puede ser un fragmento de ADN de origen genómico (que comprende intrones) o un fragmento de ADNc (sin intrones). Si está presente, se prefiere una segunda parte que codifica la parte constante de la cadena gI.

La segunda construcción de ADN codifica una cadena ligera o un fragmento de la misma y comprende

a)

una primera parte que codifica un dominio variable que comprende FR y CDR alternas, siendo dichas CDR, en secuencia, CDR1_{L}, CDR2_{L} y CDR3_{L}, cuyas secuencias de aminoácidos en la SEC ID Nº: 3 se extienden desde la posición 24 a 34, 50 a 56 y 89 a 97, respectivamente; empezando esta primera parte con un codón que codifica el primer aminoácido del dominio variable y terminando con un codón que codifica el último aminoácido del dominio variable y, opcionalmente,

b)

una segunda parte que codifica una parte constante de cadena ligera humana o un fragmento de la misma que empieza con un codón que codifica el primer aminoácido de la parte constante de la cadena ligera y termina con un codón que codifica el último aminoácido de la parte constante o un fragmento de la misma, seguido de un codón sin sentido. Preferiblemente, esta primera parte codifica un dominio variable que tiene una secuencia de aminoácidos substancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 5 que empieza con el aminoácido en la posición 1 y termina con el aminoácido en la posición 107. Más preferiblemente, la primera parte tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 5 que empieza con el nucleótido en la posición 82 y termina con el nucleótido en la posición 403. La segunda parte puede ser un fragmento de ADN de origen genómico (que comprende intrones) o un fragmento de ADNc (sin intrones). Si está presente, se prefiere una segunda parte que codifica la parte constante de la cadena \kappa.

Se prefieren las primeras y segundas construcciones de ADN que comprenden tanto la primera como la segunda parte. En este caso, la primera y la segunda partes pueden estar separadas por secuencias de intrones.

Ventajosamente, la primera y la segunda construcciones de ADN comprenden una tercera parte que está localizada cadena arriba de la primera parte y que codifica un péptido líder; esta tercera parte empieza con el codón de codifica el primer aminoácido y termina con un codón que codifica el último aminoácido del péptido líder. Un péptido líder adecuado es un péptido requerido para la secreción de las cadenas por el organismo hospedador en el que se expresan y que posteriormente se elimina por el hospedador. Preferiblemente, las terceras partes de la primera y segunda construcciones de ADN codifican un péptido líder de un gen de inmunoglobulina. Más preferiblemente, la tercera parte de la primera construcción de ADN codifica un péptido líder que tiene una secuencia de aminoácidos substancialmente idéntica a la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 13, que empieza con el aminoácido en la posición -19 y termina con el aminoácido en la posición -1. Además, más preferiblemente, la tercera parte de la segunda construcción de ADN codifica un péptido líder que tiene una secuencia de aminoácidos substancialmente idéntica a la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 5, que empieza con el aminoácido en la posición -20 y termina con el aminoácido en la posición -1.

La invención también se refiere a un ADN recombinante que codifica un equivalente directo de un anticuerpo humano reformado de la invención y un ADN recombinante que codifica un conjugado de un anticuerpo de la invención con una proteína.

El presente estado de la técnica es tal que una persona con experiencia habitual en la técnica podrá sintetizar las moléculas de ADN de la invención dada la información escrita proporcionada en este documento, es decir, las secuencias de aminoácidos de las CDR y las secuencias de ADN que las codifican (SEC ID Nº: 1 y 3). Un método adecuado para obtener una construcción de ADN que codifica un dominio variable de un anticuerpo humano reformado de la invención comprende la síntesis de varios oligonucleótidos, su amplificación por el método de PCR, y su unión para dar la secuencia de ADN deseada. Un método alternativo para construir un gen de dominio variable comprende:

-

clonar un gen que codifica un anticuerpo monoclonal humano de cualquier especificidad,

-

determinar los segmentos de ADN que codifican las FR y CDR,

-

retirar los segmentos de ADN que codifican las CDR, de forma que los segmentos de ADN que codifican las FR se fusionen entre sí con sitios de restricción adecuados en las uniones,

-

preparar cassettes de CDR sintéticos de doble cadena de acuerdo con las secuencias identificadas anteriormente en las SEC ID Nº: 1 y 3, teniendo dichos cassettes extremos adherentes,

-

unir los cassettes en las uniones de las FR (Solicitud EP Nº 0 239 400 A2).

Si se desea, las construcciones de ADN de la invención pueden mutarse por una diversidad de procedimientos convencionales bien conocidos, por ejemplo, induciendo mutaciones aleatorias o por mutagénesis de localización dirigida. En una construcción de ADN que codifica un anticuerpo humano reformado de la invención, la mutagénesis puede no conducir a una alteración de ningún aminoácido localizado dentro de una CDR. En una construcción de ADN que codifica un equivalente directo de un anticuerpo reformado de la invención, un reemplazo de un nucleótido por otro nucleótido puede alterar la secuencia de aminoácidos en una o más CDR.

Un ADN que codifica un equivalente directo de los anticuerpos reformados de la invención puede prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, por mutación aleatoria o de localización dirigida de un ADN que codifica un anticuerpo reformado de la invención. Una mutación que no es una mutación silenciosa, sino que ocasiona el reemplazo de al menos un resto aminoacídico localizado dentro una CDR, puede producir un ADN que codifica un equivalente directo de un anticuerpo reformado de la invención, si la proteína producida de esta manera satisface el criterio mencionado anteriormente.

Como se usa en la siguiente parte de la memoria descriptiva, se entiende que un anticuerpo humano reformado de la invención incluye equivalentes directos del mismo.

Además, la invención se refiere a un ADN recombinante que es un vector híbrido que comprende al menos una de las construcciones de ADN descritas anteriormente, por ejemplo, un inserto que codifica un dominio variable de cadena ligera y/o un dominio variable de cadena pesada, siendo capaz dicho vector de replicarse en un hospedador procariota y/o eucariota.

Los vectores híbridos preferidos de la invención comprenden un inserto que codifica una cadena ligera como se ha descrito anteriormente en este documento, y/o un inserto que codifica una cadena pesada como se ha descrito anteriormente en este documento.

Los vectores híbridos de la invención comprenden un origen de replicación o una secuencia de replicación autónoma, una o más secuencias marcadoras dominantes y, opcionalmente, secuencias de control de la expresión, secuencias señal y sitios de restricción adicionales.

Preferiblemente, el vector híbrido de la invención comprende un inserto descrito anteriormente unido operativamente a una secuencia de control de la expresión, en particular las descritas más adelante en este documento.

Los vectores típicamente realizan dos funciones en colaboración con células hospedadoras compatibles. Una función es facilitar la clonación del ácido nucleico que codifica la cadena de inmunoglobulina, es decir, producir cantidades útiles del ácido nucleico (vectores de clonación). La otra función es asegurar la replicación y expresión de las construcciones génicas en un hospedador adecuado, bien por mantenimiento como un elemento extracromosómico o por integración en el cromosoma del hospedador (vectores de expresión). Un vector de clonación comprende las construcciones génicas descritas anteriormente, un origen de replicación o una secuencia de replicación autónoma, secuencias marcadoras selectivas y, opcionalmente, secuencias señal y sitios de restricción adicionales. Un vector de expresión también comprende secuencias de control de la expresión esenciales para la transcripción y traducción de los genes.

Un origen de replicación o secuencia de replicación autónoma se proporciona por construcción del vector para incluir un origen exógeno tal como el derivado del virus de Simio 40 (SV40) u otra fuente viral, o por mecanismos cromosómicos de la célula hospedadora.

Los marcadores permiten la selección de células hospedadoras que contienen el vector. Los marcadores de selección incluyen genes que confieren resistencia a metales pesados tales como cobre, o a antibióticos tales como tetraciclina, ampicilina, geneticina (G-418), neomicina, kanamicina o higromicina, o genes que complementan una lesión genética de la célula hospedadora tales como la ausencia de timidina quinasa, hipoxantina fosforil transferasa, dihidrofolato reductasa o similares.

Las secuencias señal pueden ser, por ejemplo, presecuencias o líderes de secreción que codifican un péptido líder que dirige la secreción del anticuerpo, señales de unión o similares.

Como secuencias de control de la expresión, el ADN del vector comprende un promotor, secuencias necesarias para el inicio y terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm y, opcionalmente, potenciadores y secuencias reguladoras adicionales. Puede emplearse una amplia diversidad de secuencias promotoras, dependiendo de la naturaleza de la célula hospedadora. Los promotores que son fuertes y al mismo tiempo están bien regulados son los más útiles. Son secuencias para el inicio de la translación, por ejemplo, secuencias de Shine-Dalgarno. Las secuencias necesarias para el inicio y la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm están disponibles comúnmente en las regiones 5' y en las regiones 3' no codificantes, respectivamente, de ADNc virales o eurariotas, por ejemplo, del hospedador de expresión. Los potenciadores son secuencias de ADN estimuladoras de la transcripción de origen genómico o viral, por ejemplo, derivadas del virus de Simio, virus de polioma, papilomavirus bovino, virus del sarcoma de Moloney o particularmente del citomegalovirus humano.

Los diversos segmentos de ADN del ADN del vector están unidos operativamente, es decir, son contiguos y se ponen en una relación funcional entre sí.

Son ejemplos de vectores que son adecuados para la replicación y expresión en una cepa de E. coli. bacteriófagos, por ejemplo, derivados de bacteriófagos \lambda, o plásmidos.

Los vectores adecuados comprenden un replicón completo, un gen marcador, secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción de forma que el ADN extraño y, si es apropiado, la secuencia de control de la expresión pueda insertarse en estos sitios, y opcionalmente secuencias señal y potenciadores. Un vector de expresión de acuerdo con la invención comprende un cassette de expresión que comprende un promotor adecuado y una construcción de ADN como se ha definido anteriormente, estando dicho ADN controlado por dicho promotor.

Son promotores microbianos, por ejemplo, el promotor a la izquierda fuerte P_{L} del bacteriófago \lambda que está controlado por un represor sensible a la temperatura. También son adecuados promotores de E. coli. tales como el promotor lac (lactosa) regulado por el represor lac e inducido por isopropil-\beta-D-tiogalactósido, el promotor trp (triptófano) regulado por el represor trp e inducido, por ejemplo, por privación de triptófano, y el promotor tac (promotor híbrido trp-lac) regulado por el represor lac.

Los vectores que son adecuados para la replicación y expresión en levaduras contienen un inicio de replicación en levaduras y un marcador genético selectivo para levaduras. Un grupo de tales vectores incluye las denominadas secuencias ars (secuencias de replicación autónoma) como origen de replicación. Estos vectores están retenidos extracromosómicamente dentro de la célula de levadura después de la transformación y se replican de forma autónoma. Además, pueden usarse vectores que contienen todo o parte del ADN del plásmido 2\mu (2 micras) de Saccharomyces cerevisiae. Tales vectores se integrarán por recombinación en plásmidos 2\mu que ya existen dentro de la célula, o se replicarán de forma autónoma. Las secuencias 2\mu son particularmente adecuadas cuando se desea conseguir una alta frecuencia de transformación y un alto número de copias.

Son secuencias de control de la expresión que son adecuadas para la expresión en levaduras, por ejemplo, las de genes de levadura muy expresados. De esta manera, pueden usarse los promotores para el gen TRP1, el gen ADHI o ADHII, el gen de la fosfatasa ácida (PHO3 o PHO5), el gen del isocitocromo o un promotor implicado en la ruta glicolítica, tal como el promotor de la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato quinasa (PGK), hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Los promotores adecuados para células hospedadoras de mamíferos se pueden obtener a partir de un gen de inmunoglobulina humana o partir de virus tales como el virus de Simio 40 (SV40), el virus del sarcoma de Rous (RSV), adenovirus 2, papilomavirus bovino (BPV), mutante de papovavirus BK (BKV) o citomegalovirus de ratón o humano (CMV). Se prefiere el promotor del CMV humano. Como alternativa, los vectores pueden comprender promotores de productos de expresión de mamífero tales como actina, colágeno, miosina, etc., o el promotor nativo y las secuencias de control que normalmente están asociadas con las secuencias génicas de inmunoglobulina.

Los vectores pueden ser adecuados tanto para hospedadores procariotas como para hospedadores eucariotas. Una vez preparada una molécula de ADN de la invención, puede transferirse convenientemente a un vector de expresión adecuado. Están disponibles para el público vectores de expresión que comprenden un promotor adecuado o genes que codifican partes constantes de cadena pesada o ligera.

Las construcciones génicas para la cadena ligera y para la cadena pesada se transfieren secuencial o simultáneamente a las células hospedadoras con la ayuda de dos vectores. Como alternativa, tanto la cadena ligera como la cadena pesada se clonan en el mismo vector híbrido y se incorporan en un procedimiento de una etapa como una sola construcción en las células hospedadoras. Una tercera alternativa utiliza la co-transfección de fragmentos de ADN no unidos.

Los ADN recombinantes que codifican el anticuerpo humano reformado deseado pueden prepararse, por ejemplo, por cultivo de una célula hospedadora transformada.

En particular, tales ADN pueden prepararse por un método que comprende

a)

preparar ADN que codifica el dominio variable de cadena pesada y/o de cadena ligera de un anticuerpo humano reformado específico para IgE

b)

preparar ADN que codifica la región constante de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano, por ejemplo, aislando el ADN a partir de una biblioteca genómica y seleccionando los ADN deseados que codifican dichas regiones constantes de anticuerpos usando sondas de ADN;

c)

incorporar el ADN de la etapa a) o el ADN de las etapas a) y b) en vectores híbridos apropiados;

d)

transferir los vectores híbridos obtenidos a una célula hospedadora receptora o recuperar el ADN que codifica los genes deseados y transferir el ADN no unido a una célula hospedadora receptora adecuada,

e)

seleccionar y cultivar la célula hospedadora transformada y, opcionalmente,

f)

aislar el ADN deseado.

El ADN humano genómico de acuerdo con la etapa b) del proceso descrito anteriormente se aísla a partir de un tejido humano adecuado, preferiblemente a partir de placenta humana o de células de hígado fetal humano, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. A partir de este ADN se construye una biblioteca de ADN genómico por digestión limitada con endonucleasas de restricción adecuadas siguiendo procedimientos establecidos. La biblioteca de ADN genómico se replica, por ejemplo, en membranas de nitrocelulosa y se seleccionan las secuencias de ADN de interés con una sonda. El ADN deseado puede amplificarse usando tecnología de PCR.

Más adelante se describe la transferencia de los ADN recombinantes, por ejemplo, la transferencia de vectores híbridos y la selección de células transformadas.

Además, la invención se refiere a una célula hospedadora adecuada transformada con los ADN recombinantes descritos anteriormente, particularmente una célula hospedadora que se transforma con un ADN que codifica la cadena ligera y/o un ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo humano reformado deseado de la invención. Se prefiere que la célula hospedadora contenga un gran número de copias de los vectores por célula.

Las células hospedadoras de la presente invención tienen que ser capaces de cultivarse in vitro. Las células hospedadoras adecuadas son de origen procariota o eucariota e incluyen células bacterianas, particularmente E. coli., levaduras, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, o células de mamífero. Para proporcionar un medio adecuado para la producción de anticuerpos tetraméricos funcionales, se prefieren células hospedadoras de origen eucariota, particularmente de mamífero o de levadura, ya que la biosíntesis de moléculas de anticuerpo tetraméricas funcionales requiere el plegamiento y montaje correctos de la cadena polipeptídica naciente. Pueden usarse hospedadores procariotas, especialmente E. coli., para la producción de fragmentos de anticuerpo de la invención, por ejemplo, fragmentos Fab y Fv.

Son ejemplos de hospedadores adecuados microorganismos que carecen o presentan deficiencias en enzimas de restricción o modificación, tales como bacterias, en particular cepas de Escherichia coli, y levaduras, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae.

Las células hospedadoras preferidas de acuerdo con la invención son células de mamífero, por ejemplo células COS-7, células de melanoma de Bowes, células de ovario de hámster chino (CHO), células de pulmón embrionario L-132 y células de mamífero de origen linfoide, tales como células de linfoma, mieloma, hibridoma, trioma o cuadroma. Las más preferidas son las células de mieloma de ratón NSO.

Éstas células hospedadoras se transfectan con la construcción del gen de cadena ligera (L) sola, con la construcción del gen de cadena pesada (H) sola o con ambas, transferidas secuencial o simultáneamente con la ayuda de dos vectores distintos en un procedimiento de una etapa por medio del uso de un vector de doble construcción (cadena L/cadena H) como se ha indicado anteriormente. Como alternativa, pueden introducirse construcciones génicas no unidas por transfección en las células hospedadoras secuencial o simultáneamente.

Se prefieren células hospedadoras transfectadas con las dos construcciones génicas que secreten anticuerpos humanos reformados, como se ha descrito anteriormente, particularmente la línea celular EH31.8. Otros ejemplos de células hospedadoras de la invención son células transfectadas con plásmidos recombinantes similares que contienen orientaciones alternativas de las construcciones génicas de cadena H y L, incorporando elementos de ADN adicionales para facilitar altos niveles de expresión de los anticuerpos de la invención.

Las células hospedadoras de la invención son genéticamente estables, producen y preferiblemente secretan anticuerpos humanos reformados de la invención de especificidad constante y pueden activarse a partir de cultivos ultracongelados por descongelación y reclonación.

Las células hospedadoras transformadas se cultivan por métodos conocidos en la técnica en un medio líquido que contiene fuentes de carbono asimilables, por ejemplo carbohidratos tales como glucosa o lactosa, nitrógeno, por ejemplo, aminoácidos, péptidos, proteínas o sus productos de degradación tales como peptonas, sales de amonio o similares, y sales inorgánicas, por ejemplo sulfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio. El medio también contiene, por ejemplo, substancias promotoras del crecimiento tales como oligoelementos, por ejemplo, hierro, cinc, manganeso y similares.

El medio se elige preferiblemente para ejercer una presión de selección y prevenir el crecimiento de células que no se hayan transformado o hayan perdido el vector híbrido. De esta manera, por ejemplo, se añade un antibiótico al medio si el vector híbrido contiene un gen de resistencia a antibióticos como marcador. Si, por ejemplo, se usa una célula hospedadora que es auxotrófica en un aminoácido esencial mientras que el vector híbrido contiene un gen que codifica una enzima que complementa el defecto del hospedador, se usa un medio mínimo deficiente en dicho aminoácido para cultivar las células transformadas.

El cultivo se realiza por procesos que son conocidos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el valor de pH del medio y el tiempo de fermentación, se eligen de forma que se obtenga una titulación máxima del polipéptido o derivado de la invención. De esta manera, una cepa de E. coli. o de levadura preferiblemente se cultiva en condiciones aerobias sumergiendo el cultivo al tiempo que se agita o se remueve a una temperatura de aproximadamente 20ºC a 40ºC, preferiblemente a aproximadamente 30ºC, y a un valor de pH de 4 a 8, preferiblemente de aproximadamente pH 7, durante un período de aproximadamente 4 a 30 horas, preferiblemente hasta que se consigan rendimientos máximos del polipéptido o derivado de la invención.

Cuando la densidad celular ha alcanzado un valor suficiente, el cultivo se interrumpe y el polipéptido o derivado puede aislarse. Si el vector híbrido contiene una secuencia señal de secreción adecuada, el polipéptido o el derivado se secreta por la célula transformada directamente en el medio de cultivo. De otra manera, las células tienen que destruirse, por ejemplo, por tratamiento con un detergente tal como SDS, NP-40^{TM}, Triton^{TM} o ácido desoxicólico, lisarse con lisozimas o una enzima de actuación similar, o romperse por un choque osmótico o ultrasonidos. La ruptura de las células también será necesaria si la secuencia señal dirige la secreción de la proteína deseada en el periplasma celular. Si se usa una levadura como microorganismo hospedador, la pared celular puede retirarse por digestión enzimática con una glucosidasa. Como alternativa o adicionalmente, para romper las células pueden usarse fuerzas mecánicas tales como fuerzas de cizallamiento (por ejemplo, prensa French, molino de bolas (Dyno mill) y similares) o agitación con perlas de vidrio u óxido de aluminio, o como alternativa congelación, por ejemplo en nitrógeno líquido, y descongelación, por ejemplo a una temperatura de 30ºC a 40ºC, así como ultrasonidos.

El sobrenadante celular o la solución obtenida después de la centrifugación de la mezcla obtenida después de la ruptura de las células, que contiene proteínas, ácidos nucleicos y otros constituyentes, se enriquece en proteínas, incluyendo los polipéptidos de la invención, de una manera que es conocida per se. De esta manera, por ejemplo, la mayoría de los constituyentes no proteicos se retiran por tratamiento con polietilenimina y las proteínas, incluyendo los polipéptidos y derivados de la invención, se aíslan, por ejemplo, por los métodos mencionados anteriormente.

La invención también se refiere a procesos para la preparación de células hospedadoras transformadas caracterizados porque se transforman células hospedadoras receptoras adecuadas como las descritas anteriormente en este documento con uno o dos vectores de acuerdo con la invención, y se seleccionan las células transformadas.

La transformación de microorganismos se realiza como se describe en la bibliografía, por ejemplo, para S. cerevisiae (A. Hinnen el al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75: 1929, 1978) y para E. coli. (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53: 159, 1970).

Por consiguiente, el procedimiento de transformación de células E. coli. incluye, por ejemplo, el pretratamiento con Ca^{2+} de las células para permitir la captación del ADN, y la incubación con el vector híbrido. La selección posterior de las células transformadas puede conseguirse, por ejemplo, transfiriendo las células a un medio de crecimiento selectivo que permite la separación de las células transformadas de las células parentales dependiendo de la naturaleza de la secuencia marcadora del ADN del vector. Preferiblemente se usa un medio de crecimiento que no permite el crecimiento de las células que no contienen el vector. La transformación de levaduras comprende, por ejemplo, etapas de eliminación enzimática de la pared celular de la levadura por medio de glucosidasas, tratamiento de los esferoplastos obtenidos con el vector en presencia de polietilenglicol e iones Ca^{2+}, y regeneración de la pared celular incluyendo los esferoplastos en agar. Preferiblemente, el agar de regeneración se prepara de una manera que permita la regeneración y selección de las células transformadas como se ha descrito anteriormente al mismo tiempo.

La transformación de células de origen eucariótico superior, tales como líneas celulares de mamífero, preferiblemente se consigue por transfección. La transfección se realiza por técnicas convencionales, tales como precipitación con fosfato cálcico, microinyección en el núcleo celular, fusión de protoplastos, electroporación, es decir introducción de ADN por un pulso eléctrico corto que aumenta transitoriamente la permeabilidad de la membrana celular, o similares. La transfección puede realizarse en presencia de compuestos adyuvantes, por ejemplo dietilaminoetildextrano, dimetilsulfóxido, glicerol, polietilenglicol o similares, o como coprecipitados del ADN del vector y fosfato cálcico.

Después del procedimiento de transfección, las células transfectadas se identifican y se seleccionan con la ayuda de un procedimiento de selección correspondiente al marcador de selección del ADN usado para la transfección. Los marcadores de selección incluyen genes que confieren resistencia a metales pesados tales como cobre, o a antibióticos, por ejemplo, G-418 (geneticina, un derivado de neomicina) o higromicina, o genes que complementan una lesión genética de la célula hospedadora tal como la ausencia de timidina quinasa, hipoxantina fosforribosil transferasa, dihidrofolato reductasa, o similares. Por ejemplo, si el ADN usado para la transfección comprende un marcador para la resistencia a geneticina, las células transformadas se identifican y se separan de las células no transformadas por cultivo en presencia del antibiótico geneticina.

Un anticuerpo humano reformado de acuerdo con la invención o un derivado del mismo es útil para la determinación cualitativa y cuantitativa de IgE, especialmente en fluidos corporales, por ejemplo en suero, in vitro e in vivo.

Por ejemplo, el anticuerpo humano reformado o un derivado del mismo puede usarse en cualquiera de los inmunoensayos conocidos que se basan en la interacción de unión entre los determinantes antigénicos de IgE y los parátopos de dicho anticuerpo. Son ejemplos de tales ensayos radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos, de inmunofluorescencia, de quimioluminiscencia, de inmunoprecipitación, de aglutinación de látex o de hemaglutinación.

El anticuerpo humano reformado de acuerdo con la invención puede usarse tal cual o en forma de un derivado marcado radiactivamente en un radioinmunoensayo (RIA). Puede usarse cualquiera de las modificaciones conocidas de un RIA, por ejemplo, RIA en fase soluble (homogéneo), RIA en fase sólida (heterogéneo), RIA individual o RIA doble (de sándwich) con determinación directa o indirecta (competitiva) de IgE.

Un ejemplo de tal radioinmunoensayo es un RIA de sándwich en el que un soporte adecuado, por ejemplo, la superficie de plástico de una placa de microtitulación o de un tubo de ensayo, por ejemplo, de poliestireno, polipropileno o policloruro de vinilo, perlas de vidrio o de plástico, papel de filtro, dextrano, etc., láminas de acetato de celulosa o de nitrocelulosa, partículas magnéticas o similares, se recubre con un anticuerpo de la invención por medio de una simple adsorción u opcionalmente después de la activación del soporte. Después se añaden soluciones de ensayo que contienen IgE y finalmente un anticuerpo reformado que también reacciona con el antígeno y que está marcado radiactivamente, por ejemplo, con ^{125}I. La cantidad de IgE en las soluciones de ensayo es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo reformado unido y se determina midiendo la radiactividad unida al vehículo.

Un anticuerpo humano reformado de acuerdo con la invención puede usarse tal cual o en forma de un derivado conjugado con enzima en un inmunoensayo enzimático. Como se ha descrito anteriormente para los radioinmunoensayos, puede usarse cualquiera de las modificaciones conocidas de un inmunoensayo enzimático.

Los ensayos se realizan de una manera análoga a los radioinmunoensayos descritos anteriormente usando un marcador enzimático en lugar de un marcador radiactivo. La cantidad de complejo inmune formado que corresponde a la cantidad de IgE presente en las soluciones de ensayo se determina añadiendo una solución de substrato enzimático. La reacción del substrato enzimático produce, por ejemplo, un cambio de color que puede observarse a simple vista o con dispositivos de medición óptica.

Un anticuerpo reformado de acuerdo con la invención puede usarse tal cual o en forma de un derivado conjugado con marcadores quimioluminiscentes en un ensayo de quimioluminiscencia. Como se ha descrito anteriormente en relación con los radioinmunoensayos, puede usarse cualquiera de las modificaciones conocidas de un ensayo de quimioluminiscencia.

Los ensayos se realizan de una manera análoga a los radioinmunoensayos descritos anteriormente usando un marcador quimioluminiscente en lugar de un marcador radiactivo. La cantidad de complejo inmune formado que corresponde a la cantidad de IgE presente en las soluciones de ensayo se determina añadiendo un compuesto que produce luminiscencia, por ejemplo, H_{2}O_{2} y NaOH, y midiendo la emisión de luz con dispositivos de medición óptica.

El uso de acuerdo con la invención de un anticuerpo humano reformado o un derivado del mismo como se ha descrito anteriormente en este documento para la determinación de IgE también incluye otros inmunoensayos conocidos per se, por ejemplo ensayos de inmunofluorescencia, aglutinación de látex con partículas de látex recubiertas con anticuerpo o con antígeno, hemaglutinación con corpúsculos de glóbulos rojos recubiertos con anticuerpo o con antígeno, ensayos de luz evanescente usando una fibra óptica recubierta con anticuerpo y otros inmunodetectores de actuación directa que convierten el suceso de unión en una señal eléctrica u óptica, o similares.

Un anticuerpo humano reformado de acuerdo con la invención o un derivado del mismo también es útil para la determinación de células productoras de IgE, preferentemente en un ensayo de células formadoras de placas (PFC).

Un ensayo de células formadoras de placas de acuerdo con la invención se basa en los principios de un inmunoensayo en fase sólida. Puede usarse cualquiera de las modificaciones conocidas de un inmunoensayo en fase sólida, por ejemplo, un radioinmunoensayo, un inmunoensayo enzimático, de inmunofluorescencia o de quimioluminiscencia, o similares.

Un ejemplo de tal ensayo de células formadoras de placas es un ensayo PFC basado en un ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Para la determinación de la cantidad total de células productoras de IgE, un soporte adecuado como se ha descrito anteriormente para un RIA de sándwich se recubre con un anticuerpo de la invención. Se añade una suspensión de células productoras de IgE que se obtienen a partir de fluidos corporales que contienen tales células por centrifugación, filtración o similares, y un segundo anticuerpo policlonal o monoclonal específico para IgE, por ejemplo, un anticuerpo de la invención que reconoce un epítopo diferente de IgE que el primer anticuerpo, que está conjugado con una enzima, por ejemplo, fosfatasa alcalina. La cantidad de células productoras de IgE en las suspensiones de ensayo es directamente proporcional a la cantidad de segundo anticuerpo unido y se determina añadiendo una solución de substrato apropiada, que tiene como resultado, por ejemplo, la aparición de un producto de reacción coloreado, y contando las manchas coloreadas (placas). Para la determinación de la fracción de células productoras de IgE que producen IgE dirigida contra un alergeno específico, el soporte primero se recubre con el alergeno o con un conjugado adsorbible del alergeno antes de añadir una suspensión celular como se ha descrito anteriormente. La fracción de IgE en la suspensión de ensayo que se dirige contra el alergeno se une al alergeno unido a la superficie y se determina añadiendo un anticuerpo de la invención conjugado con un enzima y una solución de substrato apropiada dando como resultado, por ejemplo, la aparición de un producto de reacción coloreado, y contando las manchas coloreadas (placas).

Además, la invención se refiere a kits de ensayo para la determinación cualitativa y cuantitativa de IgE y/o de células productoras de IgE, que comprenden anticuerpos monoclonales y/o derivados de los mismos de la invención y, opcionalmente, otros anticuerpos monoclonales o policlonales y/o adyuvantes.

Los kits de ensayo de acuerdo con la invención para un radioinmunoensayo contienen, por ejemplo, un soporte adecuado, opcionalmente soluciones liofilizadas o concentradas de uno o más anticuerpos monoclonales, soluciones de un anticuerpo monoclonal marcado radiactivamente o de IgE marcada radiactivamente, soluciones patrón de IgE, soluciones tampón y, opcionalmente, detergentes para prevenir la adsorción no específica y la formación de agregados, pipetas, recipientes de reacción, curvas de calibración y similares. Uno o más de los anticuerpos monoclonales del kit de ensayo son anticuerpos monoclonales de la invención. Los kits de ensayo para la determinación de células productoras de IgE que producen IgE dirigida contra un alergeno específico contienen adicionalmente soluciones del alergeno o un conjugado adsorbible del alergeno.

Los kits de ensayo de acuerdo con la invención para un inmunoensayo enzimático contienen, por ejemplo, un soporte adecuado, opcionalmente soluciones liofilizadas o concentradas de uno o más anticuerpos monoclonales, opcionalmente soluciones liofilizadas o concentradas de un anticuerpo monoclonal marcado con un enzima, de IgE marcada con un enzima, o de un suero policlonal anti-IgE y/o de anticuerpos monoclonales o policlonales marcados con enzima que reconocen y se unen al anticuerpo anti-IgE, substratos enzimáticos en forma sólida o disuelta, soluciones patrón de IgE, soluciones tampón, detergentes, pipetas, recipientes de reacción, curvas de calibración, tablas de escala de colores y similares. Uno o más de los anticuerpos monoclonales del kit de ensayo son anticuerpos monoclonales de la invención. Los kits de ensayo para la determinación de células productoras de IgE que producen IgE dirigida contra un alergeno específico también contienen soluciones del alergeno o un conjugado adsorbible del alergeno.

Además, los anticuerpos humanos reformados de acuerdo con la invención y sus derivados pueden usarse para la determinación cualitativa y cuantitativa de células B IgE positivas en la superficie (sIgE^{+}) por cualquiera de las técnicas convencionales de tinción conocidas, por ejemplo, por análisis de citometría de flujo.

Además, los anticuerpos monoclonales de la invención y/o sus derivados son útiles para el tratamiento y/o la profilaxis de alergias.

El efecto terapéutico se consigue por medio de una regulación negativa de la respuesta inmune de IgE debido a las características específicas de los anticuerpos humanos reformados y sus derivados de acuerdo con la invención:

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son capaces de neutralizar la IgE formada por medio de su unión a la IgE libre y de inhibir la unión de IgE a las células que llevan receptores Fc_{\varepsilon } I o II, en particular mastocitos y basófilos.

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Reconocen y se unen a la IgE expresada en la superficie de células B IgE positivas en la superficie (células B sIgE^{+}) y, por lo tanto, son útiles para reducir la población de las células que forman un "grupo de memoria" que tiene como resultado la producción de IgE después de una segunda exposición al alergeno. La posibilidad de producir anticuerpos humanos reformados de (sub)clases de inmunoglobulinas elegidas permite la activación de mecanismos celulares del sistema inmune del hospedador dando como resultado una destrucción específica de las células B sIgE^{+}. Esto también puede conseguirse por medio de conjugados de los anticuerpos monoclonales de la invención con fármacos citotóxicos que liberarán tales fármacos a las células diana.

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Como los anticuerpos humanos reformados de la invención y sus derivados no reconocen la IgE citófila en células que llevan receptores Fc_{\varepsilon } I o II, por ejemplo, mastocitos y basófilos, no inducen la liberación de mediadores por estas células.

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Los anticuerpos monoclonales y sus derivados de acuerdo con la invención también tienen un efecto terapéutico de larga duración porque tienen un efecto inhibidor significativo sobre la formación de IgE en la respuesta inmune.

Por consiguiente, los anticuerpos humanos reformados de la invención y sus derivados proporcionan un tratamiento que, en lugar de tratar los síntomas, afecta realmente a la causa subyacente de la alergia, por ejemplo, por medio de la eliminación de anticuerpos IgE y células B IgE positivas en la superficie, eliminando de esta manera la posibilidad de una respuesta alérgica, y la inhibición de la formación de IgE. Es especialmente ventajoso que el tratamiento no requiera dosis repetidas en curso, y que los anticuerpos humanos reformados y sus derivados de la invención puedan usarse para el tratamiento profiláctico por medio de la administración antes de la detección de cualquiera de los síntomas de alergia.

Como sólo son débilmente inmunogénicos o no inmunogénicos cuando se administran a seres humanos, los anticuerpos humanos reformados y sus derivados de acuerdo con la invención son especialmente útiles para diagnósticos in vivo, aplicaciones terapéuticas y profilaxis. Preferiblemente, los anticuerpos humanos reformados se toleran por el organismo humano como autoproteínas cuando se administran para fines terapéuticos.

La dosis terapéutica diaria para mamíferos está comprendida entre aproximadamente 0,1 mg y 10 mg por kg de peso corporal dependiendo del estado del paciente y del modo de aplicación.

La invención también se refiere a preparaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo humano reformado y/o derivados del mismo de acuerdo con la invención. Las preparaciones farmacéuticas comprenden, por ejemplo, los anticuerpos humanos reformados y/o sus derivados en una cantidad terapéuticamente eficaz junto o en mezcla con vehículos farmacéuticos, sólidos o líquidos, inorgánicos u orgánicos.

Se prefieren las preparaciones farmacéuticas para aplicación parenteral e inhalación. Son preparaciones para aplicación intramuscular, subcutánea o intravenosa o para inhalación, por ejemplo, soluciones o suspensiones acuosas isotónicas, opcionalmente preparadas poco antes del uso a partir de preparaciones liofilizadas o concentradas. Las preparaciones farmacéuticas pueden esterilizarse y contener adyuvantes, por ejemplo, para conservar, estabilizar, humedecer, emulsionar o solubilizar los ingredientes,sales para la regulación de la presión osmótica, tampones y/o compuestos que regulan la viscosidad, por ejemplo, carboxicelulosa sódica, dextrano, polivinilpirrolidona o gelatina. Se preparan por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por mezcla convencional, disolución o liofilización, y contienen de aproximadamente un 0,01% a aproximadamente un 50% de ingredientes activos. Las preparaciones para inyección se procesan, se introducen en ampollas, viales o dispositivos de inyección desechables y se cierran herméticamente en condiciones asépticas de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Las preparaciones farmacéuticas de la invención pueden usarse para la profilaxis y tratamiento de reacciones alérgicas en seres humanos, en particular las típicas de una hipersensibilidad de tipo inmediato como la asociada, por ejemplo, con asma alérgica, rinitis alérgica y eccema atópico.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1: vectores de expresión de mamífero basados en HCMV usados para producir C21-L1 fusionado al dominio constante de cadena ligera \kappa humana y C21-H1 fusionado al dominio constante de cadena pesada \gamma1 humana.

La invención se refiere particularmente a los anticuerpos humanos reformados, los ADN recombinantes, las células hospedadoras transformadas y el método para su preparación como se describe en los ejemplos. Los siguientes ejemplos ilustran la invención pero no la limitan de manera alguna.

Abreviaturas: V_{L} = región variable de cadena ligera; V_{H} = región variable de cadena pesada; CDR = región determinante de complementariedad; FR = región flanqueante; HCMV = citomegalovirus humano.

Materiales

Las IgG humanas con cadenas ligeras \kappa, purificadas a partir de plasma humano, se adquieren en Sigma, Buchs, Suiza (IgG1: I-3889, IgG2: I-4139, IgG3: I-4389 e IgG4: 1-4639). La IgM humana (Nº de Cat. PHP003) y la IgD humana (Nº de Cat. PHP005) procedentes de suero de mieloma humano se obtienen en Serotec. Las IgA procedentes de plasma humano (IgA1: 400105; IgA2: 400108) proceden de Calbiochem, Läufelfingen, Suiza.

Ejemplo 1 Modelado molecular de V_{L} y V_{H} del mAb C21

Se construye un modelo molecular de las regiones V_{L} (SEC. ID Nº 1) y V_{H} (SEC ID Nº: 3) del anticuerpo monoclonal de ratón C21, que reconoce la IgE humana, en el caso de la V_{L}, sobre la estructura resuelta del anticuerpo de ratón anti-lisozima muy homólogo HyHEL-10 (Padlan, E.A., Silverton, E.W., Sheriff, S., Cohen, G.H., Smith-Gill y Davies, D.R., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos, 86: 5938; denominada secuencia 3 HFM en la base de datos de Brookhaven, Bernstein et al., J. Mol. Biol. 112, 535-542 (1977)) y, en el caso de la V_{H}, sobre la estructura del anticuerpo de ratón anti-lisozima HyHEL-5 (Sheriff, S., Silverton, E.W., Padlan, E.A., Cohen, G.H., Smith-Gill, S.J., Binzel, B.C. y Davies, D.R., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos, 84: 8075; denominada secuencia 2 HFL en la base de datos de Brookhaven, supra). Las regiones variables de cadena ligera y pesada del mAb C21 y HyHEL-10 o HyHEL-5 tienen una identidad de aminoácidos del 91 y del 90%, respectivamente. El modelo se construye en una terminal de trabajo Silicon Graphics IRIS 4D con el sistema operativo UNIX y usando el paquete de modelado molecular QUANTA (Polygen Corp. Estados Unidos). Se retienen los restos idénticos en la región flanqueante; los restos no idénticos se substituyen usando el procedimiento de solapamiento máximo (Show, M.E. y Amzel, L.M., 1986, Proteins 1:267) incorporado en la instalación de modelado de proteínas de QUANTA.

Las regiones determinantes de complementariedad CDR1 (L1), CDR2 (L2) y CDR3 (L3) de la región V_{L} y CDR1 (H1) y CDR2 (H2) de la región V_{H} del anticuerpo C21 de ratón corresponden a formas canónicas postuladas previamente (Chothia, C., Lesk, A.M., Tramontano, A., Levitt, M., Smith-Gill, S.J., Air, G., Sheriff, S., Padlan, E.A., Davies, D., Tulip, W.R., Colman, P.M., Spinelli, S., Alzari, P.M. y Poljak, R.J., 1989, Nature, 342:877). Los ángulos de torsión de la cadena principal de estos bucles se mantienen como en las estructuras de anticuerpo original (HyHEL-10 para L1-L3 y HyHEL-5 para H1-H2). Hay estructuras no canónicas para la CDR3 (H3) de las regiones V_{H}, por lo tanto, se modelan de forma diferente. Se extraen 30 bucles candidatos a partir de 91 estructuras proteicas de alta resolución usando un algoritmo publicado (Jones, T.A. y Thirup, S., 1986, EMBO, J., 5: 819-822) como el aplicado en QUANTA, y la mejor versión se selecciona a simple vista. Los bucles se anclan sobre tres restos flanqueantes en cualquier lado de la CDR H3. De esta manera, la H3 de la región V_{H} se modela sobre la proteína de Bence-Jones RHE (Furey, W., Wang, B.C., Yoo, C.S. y San, M., 1983, J. Mol. Biol., 167: 661-692) en la región de los restos 87-106, que corresponde en líneas generales a la CDR3 (L3).

El modelo se somete a minimización de la energía por los métodos de descensos más pronunciados y gradientes conjugados usando el potencial CHARM (Brooks, B.R., Bruccoleri, R.E., Olafson, B.D., States, D.J., Swaminathan, S. y Karplus, M., 1983, J. Comp. Chem., 4: 187) como se indica en QUANTA, para aliviar los contactos atómicos desfavorables y optimizar las interacciones de Van der Waals y electrostáticas.

Ejemplo 2 Diseño de regiones V_{L} y V_{H} de C21 humano reformado

El diseño de las regiones V_{L} y V_{H} de C21 humano reformado se basa principalmente en las secuencias consenso de las regiones V_{L} y V_{H} humanas (versiones C21-L1, C21-L2, C21-L3, C21-H1 y C21-H3) como se encuentra en la base de datos KABAT (Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. y Gottesman, K.S., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª Edición, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office). Además, otras dos regiones V_{H} de C21 humano reformado (C21-Hay1 y C21-Hay3) se basan en las regiones flanqueantes (FR) de un anticuerpo humano individual.

Para el diseño de regiones variables de C21 humano reformado basadas en secuencias consenso, las secuencias de aminoácidos de las regiones V_{L} y V_{H} del anticuerpo C21 de ratón se comparan con las secuencias consenso para regiones V_{L} y V_{H} de anticuerpos humanos de la base de datos KABAT. Este análisis revela que la región V_{L} de C21 de ratón y la región V_{H} de C21 de ratón son las más similares a la secuencia consenso del subgrupo III de V_{L} \kappa humana (con una identidad de la secuencia de aminoácidos del 77%) y la secuencia consenso del subgrupo I de V_{H} humana (identidad de secuencia de aminoácidos del 71%), respectivamente. Estas secuencias consenso humanas se usan para diseñar las regiones variables de cadena ligera y pesada de C21 humano reformado C21-L0 y C21-H0 que contienen CDR de C21 murino y las FR humanas de la secuencia consenso respectiva. Los modelos moleculares de las regiones variables de C21 de ratón (ejemplo 1) se usan para identificar restos flanqueantes que son potencialmente importantes para conseguir una buena unión al antígeno y que podrían ser críticos para el empaquetamiento de _{L}/V_{H}. Como resultado de este análisis gráfico, algunos de los aminoácidos consenso humanos indicados dentro de las FR se intercambian por sus correspondientes restos de C21 de ratón. Estos cambios sólo se consideran dentro de la región flanqueante humana si no están dentro de una de las siguientes categorías:

(1)

La secuencia consenso humana (subgrupo humano 1; HSG1) no revela ninguna preferencia de aminoácidos dominante en esta posición, pero el aminoácido que se encuentra en la secuencia de C21 de ratón original está presente al menos en una secuencia individual del subgrupo de la región variable de inmunoglobulina humana respectiva. Por ejemplo, se describe que HSG 1 no tiene ninguna secuencia consenso en el resto aminoacídico 19 (Rabat et al., supra) aunque varios anticuerpos humanos tienen un resto de Lys en esta posición. Como también aparece Lys en la secuencia de C21, queda retenida en el anticuerpo monoclonal reformado.

(2)

El aminoácido de la posición flanqueante forma parte de una estructura canónica postulada, importante en la determinación de la estructura de las CDR o bucles hipervariables, y de esta forma es de esperar que sea indispensable para mantener la forma y la integridad del sitio de unión a antígenos (Chothia, C. y Lesk, A.M., 1987, J. Mol. Biol., 196:901; Chothia, C. et al., 1989, supra).

De acuerdo con estas reglas, cuatro y seis aminoácidos dentro de las regiones variables de cadena ligera y pesada humanas reformadas C21-L0 y C21-H0 han cambiado cuando se comparan con las secuencias consenso humanas, dando como resultado las versiones C21-L1' y C21-H1. Las posiciones de los aminoácidos cambiados son 1, 3, 49 y 60 en C21-L1' y su versión modificada identificada más adelante C21-L1 (SEC. ID Nº 5). En C21-H1 (SEC. ID Nº 11), las posiciones de los aminoácidos cambiados son 38, 40, 67, 68, 70 y 87. Una excepción a las reglas mencionadas anteriormente es la posición 76 de la región V_{H} de C21 humano reformado, donde elegimos el aminoácido humano más frecuente para esta posición (Thr) encontrado en la secuencia consenso de V_{H} humana.

Otras nuevas versiones de V_{L} y V_{H} contienen las siguientes alteraciones (en comparación con C21-L1 y C21-H1, respectivamente):

C21-L2 (SEC. ID Nº 7): ácido aspártico (en lugar de serina) en la posición 60;

C21-L3 (SEC. ID Nº 9): ácido glutámico (en lugar de ácido aspártico) en la posición 1; valina (en lugar de leucina) en la posición 3;

C21-H3 (SEC. ID Nº 13): arginina (en lugar de lisina) en la posición 38; alanina (en lugar de arginina) en la posición 40; arginina (en lugar de lisina) en la posición 67; arginina (en lugar de treonina) en la posición 87.

Una investigación de la base de datos usando C21-L1' y C21-H1 revela que la versión de V_{L} de C21 humano reformado C21-L1' es la más similar (con una identidad de secuencia del 91%) a la región variable de cadena ligera \kappa humana HUMIG KAF (base de datos EMBL, Heidelberg, Alemania; Newkirk, M.M., Gram H., Heinrich, G.F. Oestberg, L., Capra, J.D. y Isserman, R.L., 1988, J. Clin. Invest. 81:1511-1518) y que la versión de V_{H} de C21 humano reformado C21-H1 es la más similar (con una identidad de secuencia del 78%) a la región variable de cadena pesada humana HUMIG HAY (base de datos EMBL, supra; Dersimonian, H., Schwartz, R.S., Barrett, K.J. y Stollar, B.D., 1987, J. Immunol., 139:2496-2501). Estas secuencias se denominan más adelante KAF y HAY, respectivamente. Las FR de KAF y la secuencia consenso del subgrupo III de V_{L} \kappa humana difieren sólo en las posiciones 49 y 85. En la posición 49, queda retenido el correspondiente aminoácido de C21 de ratón (lisina), debido a su supuesta unión al antígeno, mientras que en la posición 85 el aminoácido consenso III de V_{L} humana valina se cambia por metionina, como se encuentra en KAF. De esta manera, la versión modificada de C21-L1', denominada C21-L1 (SEC ID Nº: 5), se basa en la región variable de cadena ligera humana individual KAF (Newkirk, M.M. et al., 1988, supra). Difiere de la primera versión de C21-L1' en que hay una metionina en lugar de una valina en la posición 85. Las versiones reformadas C21-L2 (SEC ID Nº: 7) y C21-L3 (SEC ID Nº: 9) también tienen una metionina en la posición 85.

Por el contrario, las FR de la región variable de cadena pesada humana HAY y la secuencia consenso de subgrupo I de V_{H} humana difieren en varias posiciones. Para construir regiones V_{H} de C21 humano reformado que muestren un alto grado de similitud con este anticuerpo humano individual, se diseñan dos versiones más de regiones V_{H} de C21 humano reformado basándose en las FR de la región variable de cadena pesada de la región variable de cadena pesada humana HAY. La construcción de las versiones de V_{H} de C21 humano reformado basadas en HAY necesitan cinco cambios en las FR2 y FR3 de las versiones de C21 humano reformado C21-H1 y C21-H3 en las posiciones 43, 44, 48, 76 y 77, respectivamente. Estas versiones basadas en HAY se denominan C21-Hay1 (SEC ID Nº: 15) y C21-Hay3 (SEC ID Nº: 17), respectivamente. Otras dos diferencias adicionales entre las FR de HAY y la secuencia consenso del subgrupo I de V_{H} humana en las posiciones 30 y 72 quedan retenidas como en la región V_{H} de 21 de ratón, y no se consideran cambios, debido a que son restos canónicos que definen la estructura de las CDR (Chothia, C. et al., 1989, supra).

Ejemplo 3 Diseño y construcción de genes de anticuerpos humanizados

Para el diseño de cassettes de genes de anticuerpos humanizados, se añaden secuencias adicionales necesarias para la expresión y la clonación eficaces en los extremos 5' y 3' de las regiones codificantes resultantes. Se añaden secuencias líder eucarióticas para conseguir una expresión eficaz de anticuerpos C21 humanos reformados en fase con las regiones variables humanizadas diseñadas. La secuencia líder para la región V_{L} de C21 humano reformado procede de la secuencia líder encontrada en la cadena ligera \kappa del anticuerpo humano KAF (Newkirk, M.M. et al., 1988, supra) del que se usa la región variable para el reformado de la región V_{L} de C21. La secuencia líder para la región V_{H} de C21 humano reformado procede de la secuencia líder encontrada en la cadena pesada del anticuerpo humano HG3 CL (Rechavi, G., Ram, D., Glazer, L., Zakut, R. y Givol., D. 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos, 80:855-859), un miembro del subgrupo I de V_{H} humana (Kabat, E. A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. y Gottesman, K.S., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª Edición, U.S. Departament of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office). Las secuencias proteicas resultantes para las regiones V_{L}/V_{H} de C21 humano reformado después se traducen en secuencias de ADN usando la tabla de uso de codones para secuencias de ratón, como se encuentra en el Analysis Software Package del Genetic Computer Group, Universidad de Wisconsin, Estados Unidos. A los fragmentos de ADN diseñados también se les añaden señales de traducción eucarióticas en el extremo 5' (Kozak, M., 1987, J. Mol. Biol., 196: 947-950), sitios de ayuste donadores en el extremo 3' (Breathnach, R., Benoist, C., O'Hare, K., Gannon, F y Chambon, P., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 75:4853-4857) y sitios de restricción de ADN Hind III (extremos 5'), Bam HI y Xba I (extremos 3') para la subclonación conveniente en los vectores de expresión de mamífero diseñados.

Después se construyen los cassettes de genes de anticuerpos humanizados diseñados, que codifican las regiones V_{L} y V_{H} de C21 humano reformado C21-L1 y C21-H1, por síntesis de genes usando polinucleótidos de ADN sintéticos. Los fragmentos de ADN enteros se subdividen en seis regiones que solapan entre sí en 20 nucleótidos. Para cada cassette génico de la región variable de C21 humano reformado se adquieren 6 polinucleótidos fosforilados en posición 5' y purificados por PAGE denominados C21-LA (SEC ID Nº: 19), C21-LB (SEC ID Nº: 20), C21-LC (SEC ID Nº: 21), C21-LD (SEC ID Nº: 22), C21-LE (SEC ID Nº: 23), C21-LF (SEC ID Nº: 24), C21-HA (SEC ID Nº: 25), C21-HB (SEC ID Nº: 26), C21-HC (SEC ID Nº: 27), C21-HD (SEC ID Nº: 28), C21-HE (SEC ID Nº: 29) y HF (SEC ID Nº: 30) en Genosys Biotechnologies Houston, Texas, Estados Unidos. Después se ensamblan en una síntesis de genes basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Primero se templan 5 pmol de cada polinucleótido (es decir, LA a LF) y se extienden en 100 \mul de reacción que contiene Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, \beta-mercaptoetanol 10 mM, Tween-20 al 0,05% (p/v), NP-40 al 0,05% (Merck, Zürich), dNTP 200 \muM (N = G, A, T o C) y 5 U de ADN polimerasa de VentTM (New England Biolabs). Las etapas de temperatura son 95ºC/1 min, 50ºC/2 min y 72ºC/4 min usando un ciclo de temperaturas Techne PHC-2. Después de este primer ciclo, se añaden 50 pmol de cebadores oligonucleotídicos C21-5' (SEC ID Nº: 31) y C21-L3' (SEC ID Nº: 33) o C21-H3' (SEC ID Nº: 32) que hibridan en los extremos 5' y 3' del fragmento de ADN de longitud completa deseado y el fragmento de ADN de longitud completa se amplifica en una reacción de PCR de aproximadamente 20 ciclos usando los siguientes parámetros de ciclo. 95ºC/1 min, 60ºC/2 min y 72ºC/2 min. La mezcla de PCR después se extrae una vez con un volumen de cloroformo y el ADN se precipita añadiendo 1/10 volúmenes del LiCl 8 M y 3 volúmenes de etanol. El ADN precipitado se redisuelve en H_{2}O y se digiere con las endonucleasas de restricción Hind III y Bam HI en condiciones sugeridas por el proveedor (Boehringer, Mannheim, Alemania). Los fragmentos de ADN de los tamaños esperados (C21-L1 = 416 pb y C21H1 = 459 pb) se purifican electroforéticamente en agarosa al 1%/TBE y se escinden del gel. Se cortan piezas de gel en fragmentos más pequeños, se congelan en nitrógeno líquido durante 5 minutos y después se eluyen a través de lana de vidrio por centrifugación en una microcentrífuga (30 min, 136000 x g). Después de la extracción en fenol-cloroformo y de la precipitación en LiCl/etanol a temperatura ambiente, los fragmentos de restricción Hind III-Bam HI purificados se subclonan en pBluescript KS II M13+ (Stratagene) y se introducen por transfección en células E. coli. competentes (cepa HB101 de GIBCO-BRL). Se secuencian múltiples clones plasmídicos de insertos de ADN que contienen KS+C21/L1 o KS+C21/H1 del tamaño correcto usando Sequenase (USB). Las mutaciones puntuales y/o deleciones dentro de la secuencia de ADN se corrigen cambiando fragmentos de enzimas de restricción de ADN entre diferentes clones y/o por mutagénesis por PCR de localización dirigida de acuerdo con un procedimiento publicado (Kammann, M., Laufs, J., Schell J. y Gronenborn B., 1989, Nucl. Acids Res., 17:5404). Después se subclonan los fragmentos Hind III/Bam HI que presentan las secuencias de ADN correctas en los vectores de expresión de cadena ligera o de cadena pesada para crear los plásmidos HCMV-\kappa-C21/L1 y HCMV-\gamma1-C21/H1 (representados en la fig. 1), donde el fragmento Hind III-Bam HI que codifica la región variable de cadena ligera o de cadena pesada humana reformada está unido a un ADN que codifica las regiones constantes \kappa y \gamma1, respectivamente. Los dos plásmidos comprenden el origen del virus de Simio 40 (SV40), el dominio potenciador de HCMV, el promotor de HCMV, y el gen selectivo de ampicilina (Kettleborough et al., 1991, supra).

Las versiones de la región V_{L} de C21 humano reformado C21-L2 y C21-L3 se generan por mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, haciendo uso de sucesos de recombinación que se producen durante las reacciones de PCR (Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G. y Ehrlich, H., 1986, Cold Spring Harbour Symp., 51:263 y Yolov, A.A. y Shabarova, Z. A., 1990, Nucl. Acids. Res., 18:3983). Se sintetizan cebadores oligonucleotídicos C21-5' (SEC ID Nº: 31), L/D60SL (SEC ID Nº: 35), L/D60S-SL (SEC ID Nº: 36) (para C21-L2), RSP (SEC ID Nº: 34), L/E1D-V3L (SEC ID Nº: 37), L/E1D-V3L-SL (SEC ID Nº: 38) (para C21L3) y C21-L3' (SEC ID Nº: 33) (para C21-L2 y -L3) para generar por amplificación por PCR dos fragmentos de ADN, para cada una de las dos versiones de región V de cadena ligera. Excepto para los cebadores oligonucleotídicos terminales (C21-5', RSP y C21-L3') los oligonucleótidos incorporan las secuencias necesarias para los cambios de codones deseados. Excepto en el caso de los pares de cebadores RSP y L/E1D-V3L, se combinan aproximadamente 50 pmol de cada uno de los pares de cebadores apropiados con aproximadamente 10 ng del fragmento Xho I-Not I de KS+C21/L1, y 3 unidades de ADN polimerasa VentTM y se usan 25 ciclos de amplificación por PCR (60ºC/25 s, 72ºC/40 s y 93ºC/25 s). Para el par de cebadores RSP y L/E1D-V3L, se usan aproximadamente 150 ng de ADN plasmídico de KS+C21/L1 como molde y el fragmento de ADN deseado se amplifica por PCR usando 35 ciclos (40ºC/30 s, 72ºC/1 min y 93ºC/30 s). Los productos de estas reacciones, purificados por electroforesis en gel de agarosa, primero se combinan y se extienden aproximadamente 5-30 ng de cada fragmento de ADN con cinco unidades de ADN polimerasa VentTM (95ºC/1 min, 50ºC/2 min y 72ºC/4 min). Después se añaden los cebadores oligonucleotídicos terminales C21-5' y C21-L3' y el ADN de longitud completa combinado se amplifica por PCR usando 25 ciclos (95ºC/1 min, 50ºC/2 min y 72ºC/2 min). Los ADN amplificados por PCR para C21-L2 y C21-L3 después se subclonan en pBluescript KS II M13+ (Stratagene) después de la digestión usando las endonucleasas de restricción de ADN Hind II y Bam HI, y se secuencian. Las secuencias correctas después se transfieren al vector de expresión HCMV-\gamma1 como se ha descrito anteriormente.

Las versiones de la región V_{H} de C21 humano reformado C21-H3, C21-Hay1 y C21-Hay3 se generan de una manera similar a la descrita para C21-L1 y C21-L2. Para obtener estas versiones de la región V_{H} de C21, se usan cebadores oligonucleotídicos C21-5', H/R38K-A40R-L (SEC ID Nº: 39), H/R38K-A40R-SL (SEC ID Nº: 40), H/R67K-L (SEC ID Nº: 41), H/R67K-SL (SEC ID Nº: 42), H/R87T-L (SEC ID Nº: 43), H/R87T-S (SEC ID Nº: 44), HayFR2 (SEC ID Nº: 45), HayFR2-S (SEC ID Nº: 47), HayFR3 (SEC ID Nº: 48), HayFR3S (SEC ID Nº: 49) y C21-H3' para la amplificación por PCR, usando C21-H1 (para C21-H3 y C21-Hay1) o C21-H3 (para C21-Hay3) como moldes de ADN, fragmentos de ADN bicatenarios que contienen los cambios de codones deseados para las diferentes versiones V_{H} de C21 humano reformado. De forma correspondiente, los fragmentos purificados en gel de agarosa después se ensamblan por medio de recombinación por PCR para producir los fragmentos de ADN de longitud completa, como se ha descrito anteriormente. Después de la digestión con las endonucleasas de restricción de ADN Hind III y Bam HI, seguido de clonación en pBluescript KS II M 13+ (Stratagene) como se ha descrito anteriormente, se comprueba que los clones plasmídicos contienen la secuencia correcta antes de clonarse en el vector de expresión HCMV- \gamma1.

Ejemplo 4 Expresión transitoria de plásmidos recombinantes en células COS

Se someten a electroporación células COS usando 10 \mug de los vectores de expresión de HCMV que llevan los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de C21 humano reformado. Se añaden 10 \mug de plásmidos de expresión de cadena H y L a 0,8 ml de una suspensión de 1 x 10^{7} células/ml de células COS en PBS/o (PBS que carece de Ca2+ y Mg2+ suministrado por GIBCO-BRL, Basilea, Suiza, nº de cat. 041-04190M). Después se usa un pulsador de genes Bio-Rad para suministrar a las células suspendidas un pulso de 1900 V a una capacitancia de 25 \muF. Se deja que las células se recuperen durante 10 minutos antes de cultivarlas en 10 ml de DMEM que contiene un 5% v/v de suero de ternero fetal inactivado térmicamente y sin gammaglobulina (GIBCO-BRL, Basilea, Suiza, nº de cat. 063-06510H). Después de 72 horas de incubación, el medio se recoge, y se centrifuga para retirar las células y el desecho celular. El sobrenadante de las células COS después se filtra a través de una membrana de 0,45 \mum y se analiza con respecto a la presencia del anticuerpo ensamblado de isotipo \gamma1/\kappa humano por ELISA. Los anticuerpos humanizados se purifican adicionalmente por cromatografía de afinidad con proteína A.

Ejemplo 5 Ensayo ELISA para la producción de IgG/\kappa humana

Se recubren placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc MaxiSorb, nº de cat. 439454) durante una noche con 50 \mul de una dilución 1:1000 de IgG de cabra anti-humana (específica de Fc; Dianova, Nº 109-005-098) en PBS/o, pH 7,2. Después de esto y de todas las etapas posteriores, las placas se lavan 3 veces con 200 \mul de PBST (PBS/o pH 7,2 que contiene un 0,05% de Tween-20). Los sitios de unión libres se bloquean durante una hora a 37ºC con 100 \mul de tampón RIA (albúmina de suero bovino al 1% en PBST). Se añaden 50 \mul de muestras, y sus diluciones en tampón RIA, y las mezclas se incuban durante 1 hora a 37ºC. El anticuerpo humano recombinante muy purificado F5-444 (isotipo \gamma1/\kappa humano, Solicitud de Patente Europea Nº 498767) sirve como patrón. Después se aplican 50 \mul de una dilución 1:1000 de antisuero de cabra anti-cadena ligera \kappa humana purificado por afinidad conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma, Buchs, Suiza, nº de cat. A-7164) en tampón RIA y se incuban durante 1 hora a 37ºC. Se usan 100 \mul de solución de substrato ABTS (ácido 2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)) BioRad, Glattbrugg, Suiza; Nº 172-1064) para el revelado. Después de un tiempo de incubación apropiado, la reacción enzimática se detiene usando un volumen igual (100 \mul) de ácido oxálico al 2% (p/v). La absorción a 415 nm se usa para cuantificar el anticuerpo humano unido y totalmente ensamblado.

Ejemplo 6 Purificación por proteína A de anticuerpos humanizados a partir de sobrenadantes de células COS

Se purifican anticuerpos humanizados expresados de forma transitoria mediante cromatografía de afinidad en una columna Prosep A de 1 ml (Bioprocessing Ltd, Durham, Inglaterra) introducida en una columna de FPLC HR 5/5 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). La columna se hace funcionar a un caudal constante de 2 ml/min en un sistema de FPLC (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y la proteína que eluye de la columna se detecta en una celda de flujo por absorbancia u.v. a 280 nm. La columna se prepara por lavado con 10 volúmenes de columna de PBS/o pH 8,0 (fosfato Na 20 mM, NaCl 150 mM), pre-elución con 10 volúmenes de columna de tampón citrato sódico 100 mM, pH 3,0, y re-equilibrado con 10 volúmenes de columna de PBS/o pH 8,0. Los sobrenadantes de células COS (20-50 ml) clarificados por filtración a través de una membrana de 0,45 \mum, se introducen directamente en la columna con una bomba peristáltica. Después, la columna se lava con PBS/o pH 8,0 hasta que la absorbancia u.v. vuelve al nivel basal. Después, se eluye IgG bovina por lavado con tampón citrato sódico 100 mM, pH 5,0 hasta que el nivel basal vuelve a cero. Finalmente se eluyen anticuerpos humanizados usando tampón citrato sódico 100 mM, pH 3,0 y los eluatos se ajustan inmediatamente a pH 7,0 por medio de la adición de Trizma-Base 1 M (Sigma, Buchs, Suiza). La pureza de los anticuerpos humanizados se analiza por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida usando tinción con azul Coomassie (Laemmli, Reino Unido, 1970, Nature, 227:680-685). Para el análisis del biosensor, los eluatos de la proteína A neutralizados se concentran en un microconcentrador Centricon-10 (Amicon) y el tampón se cambia por PBS/o pH 7,2. Dependiendo de la pureza de la preparación de anticuerpos, la concentración proteica se cuantifica por absorción u.v. a 280 nm o por el ensayo ELISA \gamma/\kappa humano usando un anticuerpo quimérico recombinante purificado conocido F5-444 de isotipo correspondiente como patrón.

Ejemplo 7 Análisis de la avidez y especificidad de anticuerpos C21 humanos reformados y de ratón mediante análisis de interacción bioespecífica (BIA)

La avidez y especificidad de las diferentes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras variables de C21 humano reformado se analizan usando un análisis de interacción bioespecífica en tiempo real (Jönsson, U., Fagerstam, L., Ivarsson, B., Johnsson, B., Karlsson, R., Lundh, K., Löfas, S., Persson, B., Ross, H., Rönnberg, I., Sjölander, S., Stenberg, E., Stahlberg, R., Urbaniczky, C., Östlin, H. y Malmqvist, M., 1991, BioTechniques, 11:620-627). Todos los experimentos se realizan en el sistema BIAcore^{TM} (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia) usando chips detectores CM5. Como anticuerpos de captura, se inmovilizan aprox. 11.000 RU (11 ng/mm^{2}) de IgG1 policlonal de conejo anti-ratón (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia, nº de cat. BR-1000-55) o de IgG de conejo anti-humana (obtenida en Pharmacia Biosensor AB) en la superficie del chip de detección usando sus grupos amino y la química EDC/NHS esencialmente como se ha descrito previamente (Jönsson, U. et al., 1991, supra). Se realizan cuatro ciclos experimentales para cada anticuerpo para determinar la velocidad de asociación de unión a la IgE humana. Cada ciclo consta de la unión de una cantidad constante de anticuerpo de ensayo al anticuerpo de captura respectivo seguido de la interacción de este anticuerpo de ensayo con una concentración fija de antígeno (IgE humana; anticuerpo monoclonal SE44; 3,125, 6,25, 12,5 y 25 nM) seguido de una regeneración final de la superficie usando HCl 40 mM. Los detalles experimentales son los siguientes:

(1)

el caudal es de 5 \mul por min;

(2)

como tampón de proceso se usa HBS (Hepes 10 mM, EDTA 3,4 mM, NaCl 150 mM, BIAsurfactant al 0,05%, pH 7,4);

(3)

los anticuerpos de ensayo (en PBS/o pH 7,2) se diluyen en HBS a una concentración final de 5-10 \mug/ml, y se unen al anticuerpo de captura para obtener 1300-2200 RU (1,3-2,2 ng/mm^{2}) de anticuerpo de ensayo unido;

(4)

la IgE monoclonal humana (SE44) se pasa sobre el anticuerpo de ensayo unido durante 9 minutos;

(5)

se usan 4 \mul de HCl 40 mM para retirar los complejos de anticuerpo-antígeno y para preparar la superficie para el siguiente ciclo;

(6)

la temperatura de ensayo es de 25ºC.

Después se calculan las constantes de asociación de las interacciones anticuerpo-antígeno usando programas informáticos aplicados en el sistema BIAcore^{TM}.

Para la determinación de las constantes de velocidad de disociación se usa un protocolo similar, con la excepción de que se incluye una fase de disociación. Las condiciones de ensayo son las descritas anteriormente. Primero se unen anticuerpos de ensayo a la superficie del chip de detección a través de anticuerpos de captura inmovilizados. Se deja unir IgE (SE44), a la concentración más alta (25 nM), al anticuerpo. Después de la unión, se pasa tampón HBS sobre la superficie del chip de detección a un caudal constante de 5 \mul/min y se controla la reducción de la señal de resonancia durante un período de 15 a 25 minutos. Finalmente, el chip de detección se regenera por medio de lavado con 4 \mul de solución de HCl 40 mM. Como la disociación de los complejos de anticuerpo: IgE es una reacción de primer orden, se cogen las partes lineales de los sensogramas para calcular las constantes de velocidad de disociación usando programas informáticos aplicados en el sistema BIAcore^{TM}.

En la tabla 1 se resumen las constantes cinéticas K_{ass} (constante de velocidad de la asociación anticuerpo-antígeno) y K_{diss} (constante de velocidad de la disociación del complejo anticuerpo-antígeno) y la avidez (representada por la constante de equilibrio K_{aff}) de anticuerpos C21 humanos reformados.

TABLA 1

1

Todos estos anticuerpos C-21 humanos reformados tienen velocidades de asociación bastante similares. Las reducciones en avidez de unión se producen principalmente por las velocidades de disociación superiores. En diferentes versiones de cadenas ligeras de C21 humano reformado se analiza la importancia de las posiciones 1 y 3 en el extremo amino. Se obtiene una buena unión al antígeno cuando los aminoácidos en estas posiciones son iguales a los presentes en la cadena ligera de C21. Usando el KAF FR1 humano entero disminuye la unión independientemente de la cadena pesada asociada.

Los anticuerpos C21 humanos reformados también se ensayan con respecto a la unión a todos los isotipos de inmunoglobulinas humanas por análisis de interacción bioespecífica. En primer lugar, los anticuerpos de ensayo se unen por separado a anticuerpos de captura inmovilizados en chips de detección como se ha destrito anteriormente. Después se bloquea la reactividad cruzada de estos anticuerpos IgG de conejo anti-humanos e IgG1 de conejo anti-ratón inmovilizados usando un anticuerpo anti-CEA quimérico ReK.41 a 10 \mug/ml durante 5 minutos (\gamma1/\kappa humano, Solicitud de Patente Europea Nº 323806), antes de pasar sucesivamente sobre esta superficie pretratada 5 \mug/ml de inmunoglobulinas humanas de todos los isotipos IgM, IgD, IgA1, IgA2, IgG4, IgG3, IgG2, IgG1 e IgE (SE44) durante 5 minutos cada una. Finalmente, la superficie se regenera con HCl 40 mM. Los caudales, la temperatura y otras condiciones son iguales a las descritas anteriormente. Los sensogramas se registran con el sistema BIAcore^{TM}. Los anticuerpos C21 humanos reformados son específicos para el isotipo de IgE humana.

Ejemplo 8 Preparación de líneas celulares permanentes

Se purifican ADN plasmídicos de vectores de expresión de cadena H y L de CMV humano TESC-21 reformado para transfección por centrifugación hasta el equilibrio en gradientes de cloruro de cesio dos veces. Los genes de inmunoglobulina recombinantes se introducen en células de mieloma de ratón NSO por electroporación con el uso de un aparato Gene Pulser (BioRad, Richmond, CA). Las células NSO (2 a 3 x 10^{7}) se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspenden en 0,8 ml de PBS que contiene 10 \mug de cada ADN plasmídico de cadena H y L linealizado con BspCl. La electroporación se realiza en un campo eléctrico de 210 V y una capacitancia de 960 \muFD. Las células recuperadas se diluyen en medio de hibridoma sin proteínas (PFHM, Gibco) que contiene FBS (suero bovino fetal) al 2%, y se ponen en placas de microtitulación de 96 pocillos a una concentración de 104 células por pocillo. Después de una incubación de 48 horas, los transfectantes se seleccionan en PFHM que contiene 0,7 mg/ml de G418 (Gibco) y FCS (suero de ternero fetal) al 2%. Después de 2 semanas, en los pocillos que contienen colonias resistentes a fármacos se analiza la producción de IgG humana por medio de un ELISA. Se desarrolla un ELISA para la cuantificación del anticuerpo IgG/kappa humano recombinante expresado en el sobrenadante de cultivo. Se recubren placas de 96 pocillos Immulon 2 (Dynatech Labs) durante una noche con 100 \mul de anticuerpo kappa de cabra anti-humano (Southern Biothech) a 0,5 \mug/ml en PBS a temperatura ambiente. Después, los pocillos se bloquean con Blotto (leche deshidratada en polvo al 5% en PBS) durante 1 h y se lavan con PBS que contiene Tween-20 (PBST) al 0,05%. Se añade sobrenadante de cultivo (5 \mul) a los pocillos recubiertos y se incuban durante 1 h. Después de lavar con PBST, se añaden a cada pocillo 100 \mul de anticuerpo IgG(Fc) de cabra anti-humano conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Lab), diluido a 1/50.000 en Blotto, y la placa se incuba durante 1 h. Se añade solución de substrato de peroxidasa que contiene 3',3'',5',5''-tetrametil bencidina al 0,1% (Sigma) y peróxido de hidrógeno al 0,003% (Sigma) a 100 \mul por pocillo y se incuba a temperatura ambiente durante 0,5 h. La reacción se interrumpe por la adición de 50 \mul de ácido sulfúrico 2 M y se lee la densidad óptica de la mezcla de reacción en cada pocillo a 450 nm con un lector de placas Dynatech MR5000. Se usan plásmidos de expresión de CMV humano TESC-21 reformado, H1, H3, L1 y L3, para transfectar células NSO en cuatro combinaciones: H3L1, H3L3, H1L1 y H1L3. Un total de 142, 122, 68 y 64 pocillos de H3L1, H1L1 y H1L3, respectivamente, proporcionan lecturas de densidad óptica superiores a 0,05 con una lectura de fondo inferior a 0,01. Para cada combinación, se elige una línea celular basándose en los niveles de secreción de IgG: EH31.8, que secreta el anticuerpo H3L1; EH33.16, que secreta el anticuerpo H3L3; EH11.13, que secreta el anticuerpo H1L1; y EH13.5, que secreta el anticuerpo H1L3.

Datos de deposición

Las siguientes líneas celulares se han depositado en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, Estados Unidos, el 23 de septiembre de 1992 con los números de acceso proporcionados entre paréntesis).

Línea celular EH31.8 que produce el anticuerpo humano reformado H3L1 (HB 11130)

Línea celular EH11.13 que produce el anticuerpo humano reformado H1L1 (HB 11132)

Línea celular TES-C21 que produce el anticuerpo monoclonal murino TES-21 (HB 11133)

Línea celular EH33.16 que produce el anticuerpo reformado H3L3 (HB 11131)

Línea celular EH13.5 que produce el anticuerpo reformado H1L3 (HB 11134)

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: CIBA-GEIGY AG

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Klybeckstr. 141

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Basilea

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Suiza

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4002

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: + 41 61 69 11 11

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: + 41 61 696 79 76

\vskip0.500000\baselineskip

(I)

TÉLEX: 962 991

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: TANOX BIOSYSTEMS, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 10301 Stella Link

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Houston

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Texas

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 77025

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos monoclonales reformados contra un isotipo de inmunoglobulina

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 49

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1,0, Versión nº 1.25 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 370 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..369

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: / producto = "dominio variable de cadena pesada de anticuerpo TES-C21"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 322 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..321

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: / producto = "dominio variable de cadena ligera del anticuerpo TES-C21 murino"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 424 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 22..402

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 82..402

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: / producto = "región variable de cadena ligera C1-L1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 127 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 424 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 22..402

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 82..402

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: / producto = "región variable de cadena ligera C21-L2"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 127 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 424 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 22..402

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 82..402

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: / producto = "región variable de cadena ligera C21-L3"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 127 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 468 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 22..447

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 79..447

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: / producto = "región variable de cadena pesada C21-H1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 142 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 468 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 22..447

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 79..447

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: / producto = "región variable de cadena pesada C21-H3"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 142 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 467 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 22..447

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 79..447

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: / producto = "región variable de cadena pesada C21-Hay1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 142 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 467 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 22..447

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 79..447

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: / producto = "región variable de cadena pesada C21-Hay3"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 142 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 105 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAAGAAAGC TTGCCGCCAC CATGGAGACC CCCGCCCAGC TGCTGTTCT GCTGCTGCTG

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGCTGCCCG ACACCACCGG CGACATCCTG CTGACCCAGA GCCCC

\hfill

105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGTTGGTG CCGATGCTCT GGCTGGCCCT GCAGCTCAGG GTGGCCCTCT CGCCGGGGCT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGCTCAGG GTGCCGGGGC TCTGGGTCAG CAGGA

\hfill

95

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 75 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGACATCG GCACCAACAT CCACTGGTAC CAGCAGAAGC CCGGCCAGGC CCCCAGGCTG

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGATCAAGT ACGCC

\hfill

75

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 87 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGGTGAAGT CGGTGCCGCT GCCGCTGCCG CTGAACCTGC TGGGGATGCC CTGATGCTC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGCTGGCGT ACTTGATCAG CAGCCTG

\hfill

87

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 84 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGCACCGA CTTCACCCTG ACCATCAGCA GGCTGGAGCC CGAGGACTTC GCCATGTACT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTGCCAGCA GAGCGACAGC TGGC

\hfill

84

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 82 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT TCTAGAATAC TCACGTTTGA TCTCCACCTT GGTGCCCTGG CCGAAGGTGG

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGCCAGCT GTCGCTCTGC TG

\hfill

82

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAAGAAAGC TTGCCGCCAC CATGGACTGG ACCTGGAGGG TGTTCTGCCT GCTGGCCCGTG

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCCCGGCG CCCACAGCCA GGTGCAGCTG GTGCAGA

\hfill

97

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 103 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCCAGTAC ATGCTGAAGG TGTAGCCGCT GGCCTTGCAG CTCACCTTCA CGCTGGCGCC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCTTCTTC ACCTCGGCGC CGCTCTGCAC CAGCTGCACC TGG

\hfill

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 105 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCTTCAGC ATGTACTGGC TGGAGTGGGT GAAGCAGAGG CCCGGCCACG GCCTGGAGTG

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGGGCGAC ATCAGCCCCG GCACCTTCAC CACCAACTAC AACGA

\hfill

105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCTCGCTG GTCAGGCTGC TCAGCTCCAT GTAGGCGGTG TTGGTGCTGG TGTCGGCGGT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGGTGGCC TTGGCCTTGA ACTTCTCGTT GTAGTTGGTG GTGAAGG

\hfill

107

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCAGCCTGA CCAGCGAGGA CACCGCCGTG TACTACTGCG CCAGGTTCAG CCACTTCAGC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCAGCAACT ACGACTACTT CGA

\hfill

83

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT TCTAGAACTC ACCTGAGCTC ACGGTCACCA GGGTGCCCTG GCCCCAGTAG

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGAAGTAGT CGTAGTTGCT GCC

\hfill

83

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAAGAAAGC TTGCCGCCAC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT TCTAGAACTC ACC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT TCTAGAATAC TCAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACAGCTATG ACCATG

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGAACCTGT CGGGGATGCC GCTGATGCTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCGACAGGT TCAGCGGCAG CGGCA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTCAGCACG ATCTCGCCGG TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGATCGTGC TGACCCAGAG CCCCGGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGGGGCCT GCCTCACCCA CTCCAGCC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGCAGGCC CCCGGCCACG GCCTGGAGT

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGGTGGCC CTGGCCTTGA ACTTCTCGTT GTAG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAGGCCAGG GCCACCTTCA CCGCCGAC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCTCGCTC CTCAGGCTGC TCAGCTCCAT G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCCTGAGG AGCGAGGACA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATCCACTC CAGCCTCTGG CCGGGCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATCCACTC CAGCCTCTGG CCGGGGGCCT GCC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGAGGCTGG AGTGGATGGG CGAGATC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGCTGGCGC TGGTGTCGGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCAGCGCCA GCACCGCCTA C

\hfill

21

Claims (21)

1. Un anticuerpo monoclonal humano reformado específico para IgE que comprende un sitio de unión a antígenos que comprende regiones flanqueantes de tipo humano y, en secuencia, las regiones hipervariables CDR1_{H}, CDR2_{H} y CDR3_{H}; teniendo dicha CDR1_{H} la secuencia de aminoácidos Met-Tyr-Trp-Leu-Glu, teniendo dicha CDR2_{H} la secuencia de aminoácidos Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala y teniendo dicha CDR3_{H} la secuencia Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr, teniendo dicho anticuerpo humano reformado una afinidad de unión a antígenos mayor del 90% de la del anticuerpo donador de CDR murino producido por la línea celular HB11133.

2. Un anticuerpo humano reformado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un sitio de unión a antígenos que comprende:

a)

un primer dominio que forma parte de una cadena pesada, que comprende, en secuencia, las regiones hipervariables CDR1_{H}, CDR2_{H} y CDR3_{H}, teniendo dicha CDR1_{H} la secuencia de aminoácidos Met-Tyr-Trp-Leu-Glu, teniendo dicha CDR2_{H} la secuencia de aminoácidos Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala y teniendo dicha CDR3_{H} la secuencia de aminoácidos Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr; y

b)

un segundo dominio que forma parte de una cadena ligera, que comprende, en secuencia, las regiones hipervariables CDR1_{L}, CDR2_{L} y CDR3_{L}, teniendo dicha CDR1_{L} la secuencia de aminoácidos Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His, teniendo dicha CDR2_{L} la secuencia de aminoácidos Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser y teniendo dicha CDR3_{L} la secuencia de aminoácidos Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr, teniendo dicho anticuerpo humano reformado una afinidad de unión a antígenos mayor del 90% de la del anticuerpo donador de CDR murino producido por la línea celular HB11133.

3. Un anticuerpo humano reformado de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende:

a)

una cadena pesada que comprende un dominio variable que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 11 que empieza con el aminoácido en posición 1 y que termina con el aminoácido en la posición 123 y la parte constante de una cadena pesada humana; y

b)

una cadena ligera que comprende un dominio variable que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 5 que empieza con el aminoácido en la posición 1 y que termina con el aminoácido en la posición 107 y la parte constante de una cadena ligera humana.

4. Un anticuerpo humano reformado de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende:

a)

una cadena pesada que comprende un dominio variable que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 13 que empieza con el aminoácido en la posición 1 y que termina con el aminoácido en la posición 123 y la parte constante de una cadena pesada humana; y

b)

una cadena ligera que comprende un dominio variable que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 5 que empieza con el aminoácido en la posición 1 y que termina con el aminoácido en la posición 107 y la parte constante de una cadena ligera humana.

5. Un anticuerpo humano reformado de acuerdo con la reivindicación 3 denominado H1L1 producido por la línea celular EH11.13 (designación de la ATCC HB11132), o un anticuerpo derivado del mismo por medio de la unión covalente o no covalente de otra molécula proteica o no proteica.

6. Un anticuerpo humano reformado de acuerdo con la reivindicación 4 denominado H3L1 producido por la línea celular EH31.8 (designación de la ATCC HB11130), o un anticuerpo derivado del mismo por medio de la unión covalente o no covalente de otra molécula proteica o no proteica.

7. Un anticuerpo reformado que comprende:

a)

una cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de la misma que comprende un dominio variable que comprende, en secuencia, las regiones hipervariables CDR1_{H}, CDR2_{H} y CDR3_{H} y la parte constante o un fragmento de la misma de una cadena pesada humana, teniendo dicha CDR1_{H} la secuencia de aminoácidos Met-Tyr-Trp-Leu-Glu, teniendo dicha CDR2_{H} la secuencia de aminoácidos Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala, y teniendo dicha CDR3_{H} la secuencia Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr-; y

b)

una cadena ligera de inmunoglobulina, o un fragmento de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende, en secuencia, las regiones hipervariables CDR1_{L}, CDR2_{L} y CDR3_{L} y la parte constante, o un fragmento de la misma, de una cadena ligera humana, teniendo dicha CDR1_{L} la secuencia de aminoácidos Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His, teniendo dicha CDR2_{L} la secuencia de aminoácidos Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser, y teniendo dicha CDR3_{L} la secuencia de aminoácidos Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr, comprendiendo dichas cadenas pesada y ligera un dominio V que tiene opcionalmente hasta cuatro restos aminoacídicos reemplazados dentro de las CDR por otro aminoácido, y teniendo dicho anticuerpo humano reformado una afinidad de unión a antígenos mayor del 90% de la del anticuerpo donador de CDR murino producido por la línea celular HB11133.

8. Un anticuerpo humano reformado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y 7, donde la cadena pesada comprende la región constante humana de cadena pesada gamma 1, o un anticuerpo derivado del mismo por medio de la unión covalente o no covalente de otra molécula proteica o no proteica.

9. Un anticuerpo humano reformado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 y 7, donde la cadena pesada comprende la región constante humana de cadena pesada \gamma, y la cadena ligera comprende la región constante humana de cadena ligera \kappa, o un anticuerpo derivado del mismo por medio de la unión covalente o no covalente de otra molécula proteica o no proteica.

10. Un conjugado que comprende un anticuerpo reformado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y 7 y otra molécula proteica o no proteica.

11. Un proceso para preparar un anticuerpo humano reformado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un conjugado de la reivindicación 10, que comprende cultivar una célula hospedadora adecuada que produzca dicho anticuerpo humano reformado y, si es necesario, aislar dicha proteína y opcionalmente convertirla en un derivado.

12. Una construcción de ADN que codifica una cadena pesada, que comprende

a)

una primera parte que codifica un dominio variable que comprende FR y CDR alternas, siendo dichas CDR, en secuencia, CDR1_{H}, CDR2_{H} y CDR3_{H}, cuyas secuencias de aminoácidos se identifican en la reivindicación 7 y, opcionalmente,

b)

una segunda parte que codifica una parte constante de cadena pesada humana o un fragmento de la misma.

13. Una construcción de ADN que codifica una cadena ligera, que comprende

a)

una primera parte que codifica un dominio variable que comprende FR y CDR alternas, siendo dichas CDR, en secuencia, CDR1_{L}, CDR2_{L} y CDR3_{L}, cuyas secuencias de aminoácidos se identifican en la reivindicación 7 y, opcionalmente,

b)

una segunda parte que codifica una parte constante de cadena pesada humana o un fragmento de la misma.

14. Un vector híbrido que comprende una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 12 y/o una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 13.

15. Una célula hospedadora transformada con un vector híbrido de acuerdo con la reivindicación 14.

16. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 15, que es la línea celular EH 11.13 (designación de la ATCC HB11132).

17. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 15, que es la línea celular EH 31.8 (designación de la ATCC HB11130).

18. Un anticuerpo humano reformado de las reivindicaciones 1-9 o un conjugado de la reivindicación 10 para uso en la profilaxis y/o tratamiento de reacciones alérgicas en seres humanos.

19. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de las reivindicaciones 1-9 o un conjugado de la reivindicación 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Uso in vitro de un anticuerpo de las reivindicaciones 1-9 o un conjugado de la reivindicación 10 para la determinación cualitativa o cuantitativa de IgE.

21. Kit de ensayo para la determinación cualitativa o cuantitativa de IgE que comprende un anticuerpo de las reivindicaciones 1-9 o un conjugado de la reivindicación 10.