JP2723671B2 - ＧＰ▲ＩＩ▼ｂ／▲ＩＩＩ▼ａと反応性のヒト型化抗体 - Google Patents

ＧＰ▲ＩＩ▼ｂ／▲ＩＩＩ▼ａと反応性のヒト型化抗体

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YAMANOCHI SEIYAKU KK
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Description

【発明の詳細な説明】
技術分野 本発明は、新規な生物学的製剤を開発するために組換
えDNA技術とモノクローナル抗体技術を組み合わせるこ
とに関するものであり、更に詳細には、例えば、GP II
b/III a抗原に特異的な（ヒトにおける）非免疫原性の
免疫グロブリンを製造すること並びにそれらをインビト
ロおよびインビボで使用することに関する。 背景技術 心血管疾病は先進国における死亡および疾病の主要原
因である。アテローム性動脈硬化または動脈の狭窄およ
び硬化は心血管疾病の主要原因である。動脈血栓症、即
ち凝血塊または血栓の形成は通常、特に血管壁上に形成
されたプラークに開裂が生じたときアテローム性動脈硬
化の影響を受けた動脈で発生する。冠状動脈における血
栓形成は、血流遮断が持続する場合には急性心筋梗塞
（心臓発作）または血流遮断が一過性である場合には不
安定狭心症を引き起こすことがある。脳動脈の血栓は卒
中または一過性の虚血性発作を引き起こすことがある。
動脈血栓は血小板がタンパク質フィブリンと一緒に凝集
して形成される。 糖タンパク質GP II b/III aは血小板の表面に存在
し、そして血小板の凝集に重要な役割を果たす。従っ
て、血栓形成において重要な役割を果している（全般的
には、Phillips等、Blood 71、831（1988）参照、これ
は本明細書に参考として組み入れる）。GP II b/III a
コンプレックスは、１つまたはそれ以上のジスルフィド
結合で結合した大きい（分子量＝125kDa）鎖と小さい
（分子量＝25kDa）鎖からなる１分子のGP II b（分子量
＝140kDa）と、１本鎖からなる１分子のGP III a（分子
量＝105kDa）とから構成されている。Ca2+イオンは、接
着分子のインテグリンファミリーの一員であるGP II b/
III aのヘテロダイマー構造を維持するために必要であ
る。血小板がトロンビン、アデノシンジホスフェート
（ADP）またはエピネフリンのような生理的アゴニスト
で活性化されるとき、血小板表面のGP II b/III a分子
の構造または環境が変化するので、血小板は血清タンパ
ク質フィブリノーゲンと結合することができる。フィブ
リノーゲンは血小板を架橋することによって凝集塊を形
成する。GP II b/III aはまた接着性タンパク質である
フィブロネクチン、フォン ビルブラント因子およびビ
トロネクチンの受容体であるため、損傷を受けた血管の
内皮下層に血小板が接着しそして偽足を伸ばす原因とな
る。 GP II b/III aと結合し、フィブリノーゲンとの結合
を阻害する多数のモノクローナル抗体が開発されてき
た。これらの抗体にはマウスモノクローナル抗体10E5
（Coller等、J.Clin.Invest.72、325（1983）、マウス
モノクローナル抗体AP−２（Pidard等、J.Biol.Chem.25
8、12582（1983）およびマウスモノクローナル抗体7E3
（Coller、J.Clin.Invest.76、101（1985）。これらは
本明細書に参考として組み入れる）および本明細書に記
載したC4G1が含まれる。フィブリノーゲン結合を阻害す
ることによって、これらの抗体はADPのようなアゴニス
トに応答してインビトロで血小板の凝集を阻止する。そ
れ故、抗GP II b/III a抗体は血小板の更なる凝集を防
止することによって血栓の形成を阻止することができ
る。実際に、7E3抗体による治療は、特に組織プラスミ
ノーゲンアクチベーター（tPA）と組み合わせて投与す
るとき、イヌの冠動脈血栓症のモデルにおいて冠動脈の
再開通に寄与することが見い出されている（Gold等、Ci
rculation 77、670（1988））。 残念ながら、7E3またはC4G1のような非ヒトモノクロ
ーナル抗体の使用はヒトの治療、特に以下で説明するよ
うな繰り返して行われる治療法では明白な欠点を有して
いる。例えば、マウスモノクローナル抗体はヒトでの半
減期が短くそしてヒトで使用するとき他の重要な免疫グ
ロブリンの機能特性を欠く傾向がある。 恐らく更に重要なことには、非ヒトモノクローナル抗
体はヒト患者に注射するときかなりの範囲でヒトに抗原
性を示すアミノ酸配列を含んでいる。多数の研究によっ
て、外来抗体の注射後に抗体に対して患者が引き起こす
免疫応答が非常に強烈であり、初期治療後の抗体の治療
上の有用性を消失させることが示されている。更に、益
々多数の種々のマウスまたは他の抗原性のある（ヒトに
対して）モノクローナル抗体が種々の疾病を治療するた
めに開発されることが期待されるので、任意の異なる非
ヒト抗体による最初のまたは幾つかの治療後に、交差反
応性のため、関係のない療法であってもその後の治療が
無効またはそれ自体危険になることさえある。 いわゆる「キメラ抗体」の産生（例えば、ヒト定常領
域に結合したマウスの可変領域）が幾らか上記の外来抗
体への反応を逃れる事が証明されているが、重要な抗原
性の問題は残っている。一般的に、典型的なヒトモノク
ローナル抗体産生技術を使用して、多くの抗原と同様に
GP II b/III a抗原と反応し、高い親和性をもつヒト免
疫グロブリンを産生することは非常に困難であろう。血
小板凝集を阻害し、血栓症の治療剤として使用し得るヒ
ト免疫グロブリンは知られていない。同様に、いわゆる
「ヒト型化した」または「改変した」抗体を製造するた
めに組換えDNA技術（例えば、Riechmann等、Nature 33
2,323（1988）およびヨーロッパ公開特許第0239400号参
照、これらは本明細書に参考として組み入れる）を使用
すると、一部予測できない結合親和性のため、不確かな
結果がもたらされる。 かくして、ヒトにおいて実質的に抗原性がなく、治療
的処方および他の使用に適する方法で容易に且つ経済的
に生産されるGP II b/III a抗原に特異的なヒト型化免
疫グロブリンの改良が必要とされている。本発明はこれ
らや他の必要性を満たすものである。 発明の開示 本発明は、例えば、動脈血栓症に関連したヒト疾患の
治療に有用な新規組成物、即ちGP II b/III a抗原と特
異的に結合し得るヒト型化免疫グロブリン含有組成物を
提供する。この免疫グロブリンは、少なくとも１つの鎖
がヒトフレームワーク領域断片に機能的に結合した１つ
またはそれ以上のマウス相補性決定領域（CDR）からな
る２対のL/H鎖コンプレックスを有することができる。
例えば、天然マウスアミノ酸残基を更に有するかまたは
有していないマウス相補性決定領域をヒトフレームワー
ク領域に導入して結合定数が約107M-1より強い親和性で
GP II b/III a抗原と結合し得るヒト型化免疫グロブリ
ンを産生することができる。これらのヒト型化免疫グロ
ブリンはまた、相補性決定領域を与えるマウスモノクロ
ーナル抗体とGP II b/III aの結合を阻害することもで
きる。 本発明の免疫グロブリンは、結合フラグメントおよび
他の誘導体を含めて、トランスフェクトした細胞、好ま
しくは不死化した真核細胞、例えばミエローマまたはハ
イブリドーマ細胞での永続的発現により種々の組換えDN
A技術で容易に産生させることができる。ヒト型化免疫
グロブリンのフレームワーク領域をコードする第１の配
列および所望の免疫グロブリン相補性決定領域をコード
する第２の配列セットからなるポリヌクレオチドは合成
的にかまたは適当なcDNAとゲノムDNA断片を組み合わせ
ることによって製造することができる。 ヒト型化免疫グロブリンは実質的に純粋な形態で単独
で、または血栓に対して活性のある組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター若しくはアスピリンのような治療剤と
一緒に使用することができる。これら化合物は全て、急
性心筋梗塞、不安定狭心症、卒中および他の血小板介在
疾患の治療に特に有用である。ヒト型化免疫グロブリン
またはそれらのコンプレックスは製剤的に可能な剤形で
製造することができ、この形態は投与様式の依拠して変
化する。 ヒト型化免疫グロブリンはまたヒト患者の血栓あるい
は表面にGP II b/III aを発現するある種の癌の存在お
よび位置の診断に用いるために標識物質と一緒に使用す
ることもできる。このような標識物質には放射線不透過
性染料、放射線造影剤、蛍光分子、スピン標識分子、酵
素または、特に放射線学または磁気共鳴イメージング技
術において診断的価値のある他の標識物質が含まれる
が、これらに限定されない。 図面の簡単な説明 第１図は、ＨおよびＬ鎖可変領域cDNAのアンカード
（anchored）PCRクローニング図式を示す。RANは熱フェ
ノール抽出法を使用して約107個のハイブリドーマ細胞
から作成した。簡単に言えば、細胞を1mlのRNA抽出緩衝
液（50mMの酢酸ナトリウム、pH5.2/1％ SDS）に懸濁し
て撹拌し、0.5mlのフェノールpH5.2を用いて65℃で15分
間抽出し、次いで氷上で更に15分間抽出した。水層を回
収しそしてエタノールで２度沈殿させた。cDNAは逆転写
酵素（BRL、メリーランド州ベセスダ）およびプライマ
ーとしてオリゴdT12-18（Pharmacia、ニュージャージ州
ビスカットウェイ）を使用して10μｇの総RNAから合成
した。ポリ（dG）テールは末端デオキシヌクレオチドト
ランスフェラーゼ（BRL）を使用してcDNAの３′末端に
結合させた（E.Y.Loh等、Science 243、217（198
9））。可変領域遺伝子（Ｖ）は、ポリ（dG）テールと
ハイブリッド形成するプライマーmc045（TAATCTAGAATTC
CCCCCCCCCCCCCCCC）および定常領域遺伝子（Ｃ）とハイ
ブリッド形成するプライマーを用いてAmpliTag（Perkin
Elmer−Cetus）を使用して増幅させた。Ｌ鎖では、使
用したプライマーはmc046（TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGG
GAAGATGGATACAGTTGGTGC）であった。Ｈ鎖では、使用し
たプライマーはmc047（TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGAC
（CAT）GATGGGG（GC）TGT（TC）GTTTTGGC）であった。
括弧内の配列は縮重に対応する塩基を示す。縮重に対応
する塩基が導入されたのでプライマーは大部分のガンマ
鎖遺伝子とハイブリッド形成することができたであろ
う。次いで、増幅したフラグメントはEcoR IおよびHind
IIIで消化し、そして配列決定のためpUC18ベクター中
にクローン化させた。 第２図は、抗体C4G1のＬ鎖（第２図Ａ）とＨ鎖（第２
図Ｂ）の可変領域のcDNA配列および翻訳されたアミノ酸
配列を示す。CDR配列には下線が引いてある。成熟Ｌ鎖
タンパク質はアミノ酸21Aspで始まりそして成熟Ｈ鎖タ
ンパク質はアミノ酸20Glnで始まっており、それぞれの
シグナル配列で先行されている。 第３図は、プラスミドpVg1−dhfr（第３図Ａ）および
pVk（第３図Ｂ）の概略図を示す。プラスミドpVg1−dhf
rは次の部分を有している:ampおよびdhfr遺伝子を含有
する約4200の塩基対BamH I−EcoR Iフラグメント;EcoR
IおよびXba Iリンカーがそれぞれ５′および３′末端に
接続したヒトサイトメガロウイルス（CMV）IE1遺伝子プ
ロモーターおよびエンハイサーを含有する630の塩基対
フラグメント（Boshart等、Cell 41、521（1985）、こ
れは本明細書に参考として組み入れる）；並びに215塩
基対の先行イントロンおよびポリ（Ａ）シグナルを有す
るヒトガンマー１定常領域を含有する2800塩基対のHind
III−Pvu IIフラグメント（Ellison等、Nucleic Acids
Res.10、4071（1982）、これは本明細書に参考として
組み入れる）。プラスミドpVkは、ガンマー１遺伝子を
置換したヒトカッパ定常領域遺伝子および約335塩基対
の先行イントロンを含有する1530塩基対のEcoR I−Xba
Iフラグメント（Hieter等、Cell 22、197（1980）、こ
れは本明細書に参考として組み入れる）並びにdhfr遺伝
子を置換したgpt遺伝子を用いて同様にして構築した。
ヒトガンマー１およびカッパ定常領域遺伝子を含有する
フラグメントは創製されたXba IおよびBamH I部位がそ
れぞれ５′および３′末端に接続されている。これらプ
ラスミドは当該技術分野で周知の方法を使用して指定さ
れた部分から構築した（Maniatis等、Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual、第２版、ニューヨーク州コー
ルドスプリングハーバーのCold Harbor Laboratory参
照）。例えば、pVg1−dhfrは、hyg遺伝子を含有するHin
d III−Bg1 IIフラグメントをdhfr遺伝子を含有し、Bg1
II部位まで含む660塩基対のフラグメントで置換し（Si
monsen等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80、2495（198
3）、そして免疫グロブリンモーターおよびエンハンサ
ーを含有するEcoR I−Xba IフラグメントをCMVプロモー
ターおよびエンハンサーを含有するフラグメントで置換
することによってプラスミドpVγ１から構築した（Quee
n等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86、10029（1989）。 第４図は、抗体無し キメラC4G1抗体 ヒト型化C4G1抗体 で染色したHEL92.1.7細胞のホローサイトメトリー（flu
orocytometry）を示す。細胞はFACS緩衝液（PBS＋２％
FCS＋0.1％ アジ化ナトリウム）中約５×106/mlで懸濁
した。100μｌの細胞懸濁液をポリスチレン管に移し、
そして氷上で80ngの精製抗体と共に30分間インキュベー
トした。細胞はFACS緩衝液で洗浄し、そしてFITC標識ヤ
ギ抗ヒトIg抗体と共に氷上で更に30分間インキュベート
した。細胞は再度洗浄し、そして最後にPBS＋１％パラ
ホルムアルデヒド中に再懸濁した。細胞はFACSmate（Be
cton Dickinson）で分析した。 第５図は、ヒト型化C4G1抗体（上部列）およびマウス
C4G1抗体（下部列）のＬ鎖（第５図Ａ）およびＨ鎖（第
５図Ｂ）可変領域のシグナル配列を含まないアミノ酸配
列を示す。各鎖の３つのCDRには下線が引いてある。ヒ
ト型化抗体中でマウスアミノ酸またはコンセンサスヒト
アミノ酸で置換されているフレームワークの残基には二
重線が引いてある。ヒト型化C4G1抗体の完全なＬ鎖（第
５図Ｃ）およびＨ鎖（第５図Ｄ）のアミノ酸配列を示
す。 第６図は、ヒト型化C4G1のＨ鎖（rh29−rh32）および
Ｌ鎖（rh33−rh36）の構築に使用したオリゴヌクレオチ
ドを示す。下記のオリゴヌクレオチド対を混合し、Klen
owポリメラーゼまたはAmpliTaqで伸長させ、そしてpUC1
8に連結する前に指定された酵素:rh29およびrh30はXba
IおよびEco R Iで、rh31およびrh32はXba IおよびEco R
Iで、rh33およびrh34はXba IおよびHind IIIで、rh35
およびrh36はXba IおよびHind IIIで切断した。次い
で、rh29−rh30およびrh31−rh32フラグメントはXba I
およびXho Iを用いてpUC18から切断しそしてpVgl−dhfr
のXba I部位に一緒に連結し、そしてrh33−rh34およびr
h35−rh36フラグメントはXba IおよびHind IIIで切断し
そしてpVkのXba I部位に一緒に連結した。 第７図Ａ及びＢは、ヒト型化FabおよびＦ（ab′）２
フラグメントのＨ鎖の発現にそれぞれ使用されるプラス
ミドpHFab.D（第７図Ａ）およびpHF（ab′）2.D（第７
図Ｂ）の概略図を示す。このプラスミドはプラスミドpV
gl−dhfr（第３図）に類似しているが、pHFab.Dはヒト
Ｃγ１遺伝子のCH1とヒンジエクソンの最初の５個のア
ミノ酸、続いて停止コドンおよびスプライス供与シグナ
ルしか有しておらず；そしてpHF（ab′）2.DはCH1、ヒ
ンジおよびCH2の最初の２個のアミノ酸、続いて停止コ
ドンおよびスプライス供与シグナルしか有していない。
最終エクソンの後にはポリＡシグナルを有するマウスγ
2a定常領域遺伝子以外から得られる領域が続いている。
また、第７図Ｃ及びＤは、ヒト型化C4G1抗体のFabフラ
グメント（第７図Ｃ）およびＦ（ab′）２−１と称され
る組換えＦ（ab′）２フラグメント（第７図Ｄ）のＨ鎖
のアミノ酸配列を夫々示す。 第８図は、ヒト型化およびマウスC4G1抗体およびフラ
グメントの血小板への競合的結合を示す。約３×107個
の血小板は4.5ngの放射性ヨウ素標識マウスC4G1トレー
サー抗体（3.5μCi/μｇ）および種々の量の非標識マウ
スC4G1抗体若しくはフラグメント（黒印）かまたはヒト
型化C4G1抗体若しくはフラグメント（白印）と共にイン
キュベートした。図中Ａは、完全抗体、Ｂは、Fabフラ
グメント、Ｃは、マウスＦ（ab′）２およびヒト型化Ｆ
（ab′）２−１フラグメントを示す。 第９図においては、図ＡはマウスC4G1抗体によるおよ
び図Ｂはヒト型化C4G1抗体による血小板凝集阻止効果を
示す。Ｙ軸は光透過パーセントを示し、Ｘ軸は時間
（分）を示す。各パネルの上部の黒い曲線は抗体を添加
しないときに血小板凝集で生じた光透過の上昇を示し、
下部のより薄い曲線は、光透過の変化で測定されるとお
り、抗体の添加によって血小板凝集が強く阻止されるこ
とを示す。 発明を実施するための最良の形態 本発明に従って、GP II b/III a関連エピトープと特
異的に反応するヒト型化免疫グロブリンが提供される。
これらの免疫グロブリンはGP II b/III aに対して少な
くとも結合定数が約107M-1、好ましくは108M-1乃至1010
M-1またはそれ以上の強さの結合親和性を有し、例えば
血小板凝集を阻止できる。ヒト型化免疫グロブリンはヒ
トのフレームワークを有し、そして免疫グロブリン、典
型的には、GP II b/III a抗原と特異的に反応するマウ
ス免疫グロブリンから得られる１つまたはそれ以上の相
補性決定領域（CDR）を有する。好ましい実施態様で
は、１つまたはそれ以上のCDRはC4G1抗体に由来する。
かくして、経済的に大量生産し得る本発明の免疫グロブ
リンは、例えば、種々の技術によるヒト患者の血小板介
在疾患の治療用途が見い出されている。 基本的な抗体構造単位は四量体からなっていることが
知られている。各四量体は２つの同一対のポリペプチド
鎖からなっており、各対は１つの「Ｌ」鎖（約25kD）お
よび１つの「Ｈ」鎖（約50−70kD）を有している。各鎖
のアミノ末端部分には主として抗原認識を行う約100か
ら110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域がある。各
鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクター機能を
果たす定常領域である。 Ｌ鎖はカッパ（κ）かまたはラムダ（λ）かのいずれ
かに分類される。Ｈ鎖はガンマ（γ）、ミュー（μ）、
アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）
として分類され、そして抗体のアイソタイプ（isotyp
e）をそれぞれIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEとして明示
する。Ｌ鎖およびＨ鎖内で、可変および定常領域は約12
またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合さ
れており、Ｈ鎖はまた約10またはそれ以上のアミノ酸の
「Ｄ」領域も有している（一般的には、Fundamental Im
munology、W.Paul編、７章、131〜166頁、ニューヨーク
州のRaven Press（1984）、これは本明細書に参考とし
て組み入れる）。 各L/H鎖対の可変領域は抗体の結合部位を形成する。
これらの鎖は全て、基本的には同一の構造をもち相補性
決定領域またはCDRとも呼ばれる３つの超可変領域と、C
DRを結合する相対的に保存されたフレームワーク領域と
からなる（［Sequences of Proteins of Immunological
Interest」、E.Kabat等、米国保健福祉省（1987）；お
よびChothiaおよびLesk、J.Mol.Biol.、196、901〜917
（1987）、これらは本明細書に参考として組み入れ
る）。各対の２つの鎖から得られるCDRはフレームワー
ク領域によって正しく位置が決定され、特定のエピトー
プに結合することができる。 本明細書で使用するとき、用語「免疫グロブリン」
は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされ
た１つまたはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク
質を言う。認識される免疫グロブリン遺伝子にはカッ
パ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンお
よびミュー定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリ
ン可変領域遺伝子がある。免疫グロブリンは、例えば、
Fv、FabおよびＦ（ab′）２並びに二機能性ハイブリッ
ド抗体（例えば、Lanzavecchia等、Eur.J.Immunol.17、
105（1987））或いは、抗体以外の種々の形態並びに１
本鎖（例えば、Huston等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.、85、5879〜5883（1988）およびBird等、Science、2
42、423〜426（1988）、これらは本明細書に参考として
組み入れる）で存在することができる。（一般的には、
Hood等、Immunology、ニューヨーク州ベンジャミン、第
２版（1984）、Halow and Lane、Antibodies.A Laborat
ory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory（1988）
並びにHunkapillerおよびHood、Nature、323、15〜16
（1986）、これらは本明細書に参考として組み入れ
る）。 キメラ抗体は、抗体のＬおよびＨ鎖遺伝子が異なる種
に属する免疫グロブリン遺伝子断片から、典型的には遺
伝子工学によって構築されるものである。例えば、マウ
スモノクローナル抗体から得られる遺伝子の可変（Ｖ）
断片はγ１およびγ３のようなヒト定常（Ｃ）断片と結
合させることができる。それ故、典型的な治療用キメラ
抗体は、マウス（他の哺乳動物種を使用することもでき
る）抗体から得られるＶまたは抗原結合ドメインおよび
ヒト抗体から得られるＣまたはエフェクタードメインか
らなるハイブリッドタンパク質である。 本明細書で使用するとき、用語「フレームワーク領
域」はKabat等、前掲で定義されているように、１つの
種の異なる免疫グロブリン中で相対的に保存されている
（即ち、CDR以外の）免疫グロブリンＬおよびＨ鎖可変
領域の部分を言う。本明細書で使用するとき、「ヒトフ
レームワーク領域」は自然産生のヒト抗体フレームワー
クと実質的に同一（約85％またはそれ以上同一）である
フレームワーク領域である。 本明細書で使用するとき、用語「ヒト型化免疫グロブ
リン」はヒトフレームワーク、非ヒト抗体から得られる
少なくとも１つのCDRを含んでなり、その際存在する任
意の定常領域はヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に
同一、即ち、少なくとも約85〜90％、好ましくは少なく
とも95％が同一である免疫グロブリンを言う。それ故、
ヒト型化免疫グロブリンの部分は全て、多分CDRを除い
て、１つまたはそれ以上の天然のヒト免疫グロブリン配
列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、ヒト
型化免疫グロブリンはキメラマウス可変領域／ヒト定常
領域抗体は包含しないであろう。 ヒト型化抗体はヒトの治療に使用するときマウス、そ
して場合によってはキメラ抗体に比べて少なくとも下記
の３つの利点を有している： １）エフェクター部分がヒトであるので、ヒト型化抗体
はヒト免疫系の他の部分とより良好に相互に作用するこ
とができる（例えば、補体依存性細胞傷害（CDC）また
は抗体依存性細胞傷害（ADCC）によって標的細胞をより
効果的に破壊する）。 ２）ヒト免疫系はヒト型化抗体のフレームワークまたは
Ｃ領域を外来物として認識せず、そしてその結果このよ
うな注入抗体に対する抗体応答は全体として外来のマウ
ス抗体または部分的に外来のキメラ抗体に対するより少
ない。 ３）注入されたマウス抗体はヒト血液循環での半減期が
通常の抗体の半減期より短いと報告されている（D.Shaw
等、J.Immunol.138、4534〜4538（1987））。注入され
たヒト型化抗体は多分、自然産生のヒト抗体と本質的に
同一の半減期を有しており、投与すべき投与量および回
数をより少なくすることができるであろう。 ある面では、本発明は、GP II b/III a抗原の所望の
エピトープに結合し得る免疫グロブリン（例えば、モノ
クローナル抗体C4G1、7E3、10E5またはAP−２）から得
られるＨおよび／またはＬ鎖CDRをコードする組換えポ
リヌクレオチド、に向けられている。これらの領域をコ
ードするポリヌクレオチドは典型的には、適当なヒトフ
レームワーク領域をコードするポリヌクレオチドに結合
する。ヒトフレームワークは、CDRを得る非ヒト免疫グ
ロブリンのフレームワークまたは可変領域のアミノ酸配
列を、ヒト免疫グロブリンのシークエンスコレクション
中の対応する配列と比較して、相同性の高い配列を選び
用いる。モノクローナル抗体C4G1のＨおよびＬ鎖CDRを
含んでなるポリペプチド鎖をコードする代表的なポリヌ
クレオチドは第２図に含まれる。コドン縮重および重要
でないアミノ酸の置換によって、それらの配列を他のポ
リヌクレオチド配列で以下で詳記するように容易に置換
することができる。ヒト型化免疫グロブリンの設計は、
以下のように行うことができる。 （１）（ａ）〜（ｃ）に該当するアミノ酸は、CDRを得
る非ヒト免疫グロブリン（供与体免疫グロブリン）から
のフレームワークアミノ酸により、フレームワークを用
いるヒト免疫グロブリン（受容体免疫グロブリン）のフ
レームワークアミノ酸を置換する。 （ａ）受容体免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域
中の該アミノ酸がヒト免疫グロブリンのその位置に稀で
あり、そして供与体免疫グロブリン中の対応するアミノ
酸がヒト免疫グロブリン中のその位置に典型的である； （ｂ）該アミノ酸がCDRの１つのすぐ近くである；また
は （ｃ）該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおい
てCDRの約３Å以内にある。（Queen等、前掲およびCo
等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88、2869（1991）参照。
これらは共に本明細書に参考として組み入れる）。 （２）受容体免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域
中の該アミノ酸及び給与体免疫グロブリンの対応するア
ミノ酸がヒト免疫グロブリン中のその位置に稀である場
合、ヒトフレームワークのその位置に典型的であるアミ
ノ酸に置換する。ヒト型化免疫グロブリンの製造の詳細
な説明については、Queen等、前掲およびCo等前掲参
照。 上記ポリヌクレオチドは典型的には、ヒト型化免疫グ
ロブリンをコードする配列に操作的に連結された、天然
関連領域または異種プロモーター領域を含む発現調節ポ
リヌクレオチド配列を更に有している。好ましくは、発
現調節配列は真核宿主細胞を形質転換し得るベクター中
の真核プロモーター系であるが、原核宿主の調節配列を
使用することもできる。ベクターが適当な宿主に導入さ
れるとすぐ、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現に
適する条件下で維持し、そして所望の場合続いてＬ鎖、
Ｈ鎖、L/H鎖二量体または完全抗体、結合フラグメント
または他の免疫グロブリンを採集しそして精製すること
ができる。 所望のヒト型化抗体を永続的に発現し得る本発明の塩
基配列は種々のポリヌクレオチド（ゲノムまたはcDNA、
RAN、合成オリゴヌクレオチド等）および成分（例え
ば、Ｖ、Ｊ、ＤおよびＣ領域）から多種多様の技術によ
って形成させることができる。適当なゲノムと合成ヌク
レオチド配列を結合させることが現在最も通常の製造方
法であるが、cDNA配列を使用することもできる（ヨーロ
ッパ公開特許第0239400号およびL.Reichmann等、Nature
332、323〜327（1988）参照、これらは共に本明細書に
参考として組み入れる）。 ヒト定常領域DNA配列は種々のヒト細胞から周知の方
法に従って単離することができるが、不死化Ｂ細胞から
が好ましい（Kabat、前掲およびWP87/02671参照）。本
発明の免疫グロブリンの製造に使用するCDRは同様に、G
P II b/III aに結合し得るモノクローナル抗体から誘導
され、そして周知の方法によって抗体を産生し得るマウ
ス、ラット、ウサギまたは他の脊椎動物を含めて任意の
好都合な哺乳類種中で製造される。上記ポリヌクレオチ
ド供給源としての細胞並びに免疫グロブリン発現および
分泌に使用する宿主細胞はATCCのような多数の供給源か
ら得ることができる（Catalogue of Cell Lines and Hy
bridomas、第５版（1985）、米国メリーランド州ロック
ビル、これは本明細書に参考として組み入れる）。 本明細書に特に記載したヒト型化免疫グロブリンに加
えて、他の「実質的に同一の」修飾免疫グロブリンを容
易に設計することができ、そして当該技術分野の熟練者
に周知の種々の組換えDNA技術を使用して製造すること
ができる。例えば、フレームワーク領域において、幾つ
かのアミノ酸置換、末端および中間部分でのアミノ酸付
加並びに欠失等によって天然配列の一次構造を変えるこ
とができる。更に、多種多様のヒトフレームワーク領域
を単独でまたは組み合わせて本発明のヒト型化免疫グロ
ブリンのベースとして使用することができる。一般的
に、遺伝子の修飾は特定部位の突然変異誘発のような種
々の周知の技術で容易に達成することができる（Gillma
nおよびSmith、Gene ８、81〜97（1979）並びにS.Rober
ts等、Nature 328、731〜734（1987）参照、これらは共
に本明細書に参考として組み入れる）。 或いは、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン活性
（例えば、補体結合活性）を有する主要な抗体構造の一
部分だけからなるポリペプチドフラグメントを製造する
ことができる。これらのポリペプチドフラグメントは当
該技術分野で周知の方法による完全抗体のタンパク質分
解酵素による切断によってか、或いは特定部位の突然変
異誘発を使用してベクターpVkおよびpVg1−dhfr（第３
図）の所望の位置に、例えばFabフラグメントを製造す
るためにCH1の後にまたはＦ（ab′）２フラグメントを
製造するためにヒンジ領域の後に停止コドンを挿入する
ことによって製造することができる。１本鎖抗体はVLと
VHをDNAリンカーで結合させることによって製造するこ
とができる（Huston等、前掲、およびBird等、前掲参
照）。また、多数の遺伝子と同様に、免疫グロブリン関
連遺伝子は、各々が１つまたはそれ以上の明確な生物学
的活性を有する別々の機能性領域も有しているので、こ
れら遺伝子は他の遺伝子から得られる機能性領域に融合
させて新しい特性を有する融合タンパク質を製造するこ
とができる。 上記したように、ポリヌクレオチドは、その配列を発
現調節配列と操作的に結合させた（即ち、発現調節配列
を確実に機能化させるように位置させた）後宿主内で発
現させられる。これらの発現ベクターは典型的には、エ
ピソーム（episome）としてかまたは宿主染色体DNAに組
み込まれて宿主生物内で複製可能である。一般的に、発
現ベクターには所望のDNA配列で形質転換された細胞の
検出が可能になるように選択マーカー、例えばテトラサ
イクリンまたはネオマイシンが含まれる（例えば、米国
特許4,704,362参照、これは本明細書に参考として組み
入れる）。 大腸菌（E.Coli）は本発明のポリヌクレオチドをクロ
ーン化するのに特に有用な原核生物宿主である。使用に
適する他の微生物宿主には桿菌、例えば枯草菌（Bacill
us subtilus）、および他の腸内細菌、例えばサルモネ
ラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）および種々の
シュードモナス（Pseudomonas）種が含まれる。これら
の原核生物宿主中で、宿主細胞と適合できる発現調節配
列を典型的に含有する発現ベクターも製造することがで
きる（例えば、複製オリジン（origin））。更に、例え
ばラクトースプロモーター系、トリプトファン（trp）
プロモーター系、ベータラクタマーゼプロモーター系、
またはファージラムダから得られるプロモーター系のよ
うな多数の多様な周知のプロモーターが存在する。プロ
モーターは、任意にオペレーター配列を有し、典型的に
は発現を調節し、そして転写および翻訳を開始させそし
て完結させるリボソーム結合部位配列等を有している。 酵母のような他の微生物も発現用に使用することがで
きる。サッカロミセス（Saccaromyces）は好ましい宿主
であり、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解
糖酵素を含むプロモーターのような発現調節配列、およ
び所望の複製オリジン、終結配列等を有する適当なベク
ターを有している。 微生物に加えて、哺乳動物由来培養細胞も本発明のポ
リペプチドを発現させそして製造するために使用するこ
とができる（Winnacker、From Genes to Clones、VCH P
ublishers、ニューヨーク州ニューヨーク（1987）参
照、これは本明細書に参考として組み入れる）。真核細
胞は、完全免疫グロブリンを分泌し得る多数の適当な宿
主細胞株が当該技術分野で開発されている。これらには
CHO細胞株、種々のCOS細胞株、HeLa細胞、好ましくはミ
エローマ細胞株等または形質転換されたＢ細胞若しくは
ハイブリドーマが含まれる。これら細胞の発現ベクター
は発現調節配列、例えば複製オリジン、プロモーター、
エンハンサー（Queen等、Immunol.Rev.89、49〜68（198
6）、これは本明細書に参考として組み入れる）、並び
に必要なプロセッシング伝達部位、例えばリボソーム結
合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位およ
び転写ターミネーター配列を含むことができる。好まし
い発現調節配列は免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノ
ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルス
等から誘導されるプロモーターである。 重要なポリヌクレオチド配列（例えば、ＨおよびＬ鎖
をコードする配列および発現調節配列）を含有するベク
ターは周知の方法で宿主細胞中に導入することができ、
該方法は細胞宿主のタイプに依存して変化する。例え
ば、塩化カルシウムトランスフェクションは通常原核細
胞に使用され、一方リン酸カルシウム処理またはエレク
トロポレーション（electroporation）は他の細胞宿主
用に使用することができる。（一般的には、Maniatis
等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Sp
ring Harbor Press（1982）、これは本明細書に参考と
して組み入れる。） 発現された、本発明の完全抗体、それらの二量体、個
々のＬおよびＨ鎖または他の免疫グロブリンは、硫酸ア
ンモニウム沈降法、アフィニティカラム、カラムクロマ
トグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当該技術の標準的
な方法に従って精製することができる（一般的には、R.
Scopes、Protein Purification、Springer−Verlag,ニ
ューヨーク（1982）、これは本明細書に参考として組み
入れる）。医薬品として使用するためには、少なくとも
約90乃至95％純度の実質的に純粋な免疫グロブリンが好
ましく、そして98乃至99％またはそれ以上の純度のもの
が最も好ましい。ひとたび部分的にまたは所望の純度に
まで精製されると、このポリペプチドは治療的に（体外
的適用を含む）またはアッセイ法、蛍光免疫染色法等の
開発および実施に使用することができる。（一般的に
は、Immunological Methods、ＩおよびII巻、Lefkovits
およびPernis編、Academic Press、ニューヨーク州ニュ
ーヨーク（1979および1981）参照）。 本発明の免疫グロブリンは典型的には、心血管疾病及
び他の血栓塞栓性疾患の治療に単独での使用が可能であ
る。例えば、治療に適する典型的な疾病状態には急性心
筋梗塞、不安定狭心症、卒中、一過性虚血発作、深部静
脈血栓症および肺塞栓症が含まれる（一般的には、Hoff
brand ＆ Pettit、Essential Haematology、Blackwell
Scientific Publications、オックスフォード（1980）
参照）。これら免疫グロブリンはまた血管形成術後の再
閉塞及び血管手術後、透析や心肺体外循環等の血液体外
循環後または最中の閉塞を防ぐために使用することもで
きる。 本発明の免疫グロブリンは、他の血小板が関与する疾
患の治療にも使用できるであろう。例えば、腎炎、末梢
循環障害、閉塞性血栓血管炎、移植後の血栓、慢性動脈
閉塞症、閉塞性動脈硬化症、冠硬化症、うっ血性心不全
及び脳血管れん縮等の治療である。また、血栓性血小板
減少性紫斑病、HUS及び血小板の関与する自己免疫疾患
の治療、癌転移の抑制、巨核球又は巨核芽球の分化又は
誘導を促す為にも用いることができるかもしれない。 本発明のヒト型化免疫グロブリンは、GP II b/III a
に結合する抗体のうち血小板凝集を阻害する免疫グロブ
リン由来のCDRを用いることが好ましい。また、血管内
皮と反応する抗体は、血管内皮に障害を与える可能性が
あり、7E3等は血管内皮と反応することが知られている
（ANNALS NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES 614、204（19
91））。従って、さらに好ましくは、血小板上にはエピ
トープがあるが、血管内皮上にはエピトープが存在しな
いか、少ないC4G1等の免疫グロブリン由来のCDRを用い
る。マウス抗体C4G1によって同定される抗原決定基に結
合するヒト型化免疫グロブリンのような本発明のヒト型
化免疫グロブリンは、投与した場合、内皮細胞を損傷さ
せないことが期待される。 ADP、アドレナリン刺激による血小板凝集では、これ
らのアゴニスト添加後最初に見られる可逆的な一次凝集
と、次いで用量依存的に非可逆的で放出反応を伴う二次
凝集が見られる。7E3等の抗体では、血小板を予め抗体
で処理しておいた場合に凝集阻害をすることは知られて
いるが、血小板凝集の過程で抗体を加えた場合に凝集阻
害をすることが知られているものはなかった。しかし、
C4G1は、一次凝集を阻害するのみならず、一次凝集が惹
起された後に添加した場合に、二次凝集を阻害する作用
を持つことが確認された。従って、C4G1又は前述のC4G1
と同様の作用をもつ免疫グロブリン由来のCDRを用いた
ヒト型化免疫グロブリンは、血栓性疾患急性期に於ける
血小板活性化及び凝集の初期過程をも抑制することが期
待できる。 血栓性疾患の治療に際し、PTCA、PTCR等によって血行
再建がえられた後の急激なトロンボキサンA2、PAI−１
等の血中レベルの上昇が知られている。その原因として
血小板の活性化及び種々のメディエーター（TGF−β
１、PDGF等）の放出が重要視されている。マウスC4G1
は、in vitroでADP刺激による血小板凝集を抑制すると
ともに、血小板放出反応も抑制した。従って、マウスC4
G1等の血小板凝集と血小板放出反応を抑制する免疫グロ
ブリン由来のCDRを用いたヒト型化免疫グロブリンは、
人に投与した際に、血小板凝集を抑制するのみでなく、
血小板放出反応を抑制してPTCA、PTCR等の血行再建療法
後の副作用を抑制する可能性がある。 本発明の任意のヒト型化免疫グロブリンはまた他の抗
体、特に、種々の血小板抗原または血液凝固因子と反応
するヒト型化抗体と組み合わせて使用することもでき
る。例えば、ヒト型化免疫グロブリンの混合物が反応し
得る適当な抗原にはVLA−２、VLA−５、GP I b、GP I
V、フォン ビルブラント因子、トロンビンおよび血小
板トロンビンレセプターが含まれる（Coller、New Eng.
J.Med.322、33（1990）参照）。 これら免疫グロブリンはまた他の治療剤と一緒に使用
される、別々に投与される組成物として使用することも
できる。典型的には、これら薬剤にはアスピリンおよび
ヘパリンがあるが、心血管疾病を治療するために当該技
術分野の熟練者に周知の多数の他の薬剤（例えば、tP
A）を使用することもできる。 本発明のヒト型化免疫グロブリンおよび該免疫グロブ
リンの製剤組成物は非経口投与、即ち皮下、筋肉内また
は静脈内投与に特に有用である。非経口投与は通常、投
与可能な担体、好ましくは水性担体に溶解した免疫グロ
ブリンまたはその混合物の溶液からなる。種々の水性担
体、例えば水、緩衝水、0.4％の食塩水、0.3％のグリシ
ン、５％のグルコース、ヒトアルブミン溶液等を使用す
ることができる。これらの溶液は無菌でありそして一般
的に粒子物質を有していない。これらの組成物は慣用で
周知の滅菌技術によって滅菌することができる。これら
組成物はpH調整および緩衝化剤、等張化剤、毒性調整剤
等のような生理学的条件に近づけるのに必要な製剤的に
投与されうる補助物、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウ
ム、クエン酸ナトリウム等を含有することができる。こ
れら処方中の免疫グロブリンの濃度は広範に、即ち、約
0.5重量％未満から、通常は少なくとも約１重量％から1
5または20重量％ほどの多い量まで変化させることがで
き、そして選択される特別の投与様式に従って、主とし
て容積、粘度等に基づいて選択される。 かくして、注射用の典型的な製剤組成物は1mlの滅菌
緩衝水および１〜10mgの免疫グロブリンを含むように構
成することができよう。静脈内注入用の典型的な組成物
は250mlの滅菌リンゲル溶液および150mgの抗体（免疫グ
ロブリン）を含むように構成することができよう。非経
口的に投与できる組成物の実際の製造方法は当該技術分
野の熟練者に既知であるかまたは明らかであり、そし
て、例えば、Remington's Pharmaceutical Science、第
15版、Mack Publishing Company、ペンシルベニア州イ
ーストン（1980）（これは本明細書に参考として組み入
れる）に更に詳細に記載されている。 本発明の免疫グロブリンは貯蔵するため冷凍するかま
たは凍結乾燥しそして使用する前に適当な溶媒で再生さ
せることができる。この技術は慣用の免疫グロブリンに
関して有効であることが示されており、そして当該技術
分野で既知の凍結乾燥および再生技術を使用することが
できる。凍結乾燥および再生が種々の程度の抗体（免疫
グロブリン）活性損失をもたらすことがあり（例えば、
通常の免疫グロブリンでは、IgM抗体はIgG抗体より多く
の活性が損なわれる傾向がある）そして使用量は調整し
て補正しなければならないと当該技術分野の熟練者は考
えるであろう。 本願のヒト型化免疫グロブリンまたはその混合物を含
有する組成物は治療的または予防的処置に使用すること
ができる。治療的な適用では、組成物は動脈血栓症また
は他の血小板介在疾患に既に罹っている患者に、疾病お
よびその合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に
それらを抑止するのに十分な量で投与される。これを達
成するために適当な量は「治療的有効投与量」と定義さ
れる。この用途に有効な量は疾病の重篤さおよび患者自
身の免疫系の一般的な状態に依存するが、一般的には投
与量当たり約１から約200mgまでの抗体（免疫グロブリ
ン）の範囲であり、より一般的には患者当たり５から25
mgまでの投与量が使用される。本発明の物質は一般的に
重篤な疾病状態、即ち生命を脅かすかまたは生命を脅か
す可能性のある状況下で使用することができることに留
意すべきである。このような場合には、本発明のヒト型
化免疫グロブリンによって生体外物質の最少化および
「外来物質」拒絶の可能性の低下が達成されることから
みて、実質的に多量の上記免疫グロブリンを投与するこ
とが可能であり、そして治療する医師によって望ましい
と考えられよう。典型的な予防的使用には、バルーン血
管形成術を受けている患者の急性閉塞を防ぐためや１度
心臓発作または卒中を起こした患者のその後の発作を防
ぐための治療がある。 これら組成物の１回または複数回投与は治療する医師
によって選択される投与値およびパターンで実施するこ
とができる。いずれにしても、本薬剤処方は患者を有効
に治療するのに十分な量の本発明の免疫グロブリン（単
数または複数）を提供する。 特別の実施態様では、本発明のヒト型化免疫グロブリ
ンからなる組成物はヒト患者の血栓の存在および位置を
診断するために使用することができる。例としてであっ
て限定するためではないが、マウス抗体C4G1が結合する
抗原決定基は血小板上に存在するが血管内皮細胞には存
在しないかまたは量が少ない。かくして、マウス抗体C4
G1によって同定される抗原決定基に結合するヒト型化免
疫グロブリンのような本発明のヒト型化免疫グロブリン
は、有意な濃度の活性化血小板を含有する解剖学的部
位、例えば血栓部位を同定するために標識しそして使用
することができる。例としてであって限定するためでは
ないが、１つまたはそれ以上の標識物質をヒト型化免疫
グロブリンに結合させることができる。代表的な標識物
質には放射線不透過性染料、放射線造影剤、蛍光分子、
スピン標識分子、酵素または、特に放射線学または磁気
共鳴像形成技術で診断的価値のある他の標識物質が含ま
れるがこれらに限定されない。 本発明のヒト型化免疫グロブリンには更にインビトロ
での広範な有用性を見い出すことができる。例として、
本発明の免疫グロブリンはGP II b/III a抗原の検出、
血小板の単離等に使用することができる。 診断の目的では、本発明の免疫グロブリンは標識する
かまたは標識しないで用いることができる。標識しない
免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリン定常領域に特異
的な抗体でヒト型化抗体（免疫グロブリン）と反応する
他の標識抗体（二次抗体）と組み合わせて使用すること
ができる。或いは、本発明の免疫グロブリンは直接標識
することができる。放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基
質、酵素コファクター、酵素インヒビター、リガンド
（特にハプテン）等のような広範囲の標識を使用するこ
とができる。多数のタイプのイムノアッセイが利用可能
でありそしてそれらは当該技術分野の熟練者に周知であ
る。 細胞活性に対する保護若しくはその検出または選択し
た抗原の存在の検出に対象抗体（免疫グロブリン）を用
いて使用するためにキットとして供給することもでき
る。かくして、本発明対象の免疫グロブリン組成物は単
独かまたは所望の細胞タイプに特異的な他の抗体と一緒
にして、通常容器中の凍結乾燥形態で提供することがで
きる。標識若しくは毒素と抱合するかまたは抱合しない
ことができる本発明の免疫グロブリンは、トリス、リン
酸塩、炭酸塩等のような緩衝液、安定化剤、保存剤、不
活性タンパク質、例えば血清アルブミン等および１組の
使用説明書と共にキットに含めることができる。一般的
に、これらの材料は活性免疫グロブリンの量に基づいて
約５％未満で存在し、そして通常は再び免疫グロブリン
濃度に基づいて少なくとも約0.001重量％の総量で存在
している。しばしば、活性成分を希釈するために化学作
用を起こさない増量剤または賦形剤を含めることが望ま
しく、その際賦形剤は総組成物の約１から99重量％まで
で存在することができる。免疫グロブリンと結合可能な
二次抗体をアッセイに使用する場合、これは通常別々の
バイアル中に存在する。二次抗体は典型的には標識と抱
合しており、そして上記した免疫グロブリン処方物と類
似する方法で処方される。 以下の実施例は説明のために提供するものであって限
定するものではない。これら実施例はC4G1抗体に関連し
ているが、GP II b/III a抗体に対し高い結合親和性を
有するヒト型化抗体の製造はまた10E5、7E3、AP−２ま
たはGP II b/III aのエピトープに結合する他のモノク
ローナル抗体から得られるCDRの使用も意図されている
ことが理解されよう。 実施例 Ｈ鎖およびＬ鎖cDNAのクローニング Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域遺伝子のcDNAは、定常領域
とハイブリッド形成しそしてHind III部位を含有する
３′プライマーおよびdGテールとハイブリッド形成しそ
してEcoR I部位を含有する５′プライマーを使用して、
アンカードPCR（E.Y.Loh等、Science 243、217（198
9））を使用してクローン化した（第１図に示される図
式）。PCR増幅フラグメントはEcoR IおよびHind IIIで
消化し、そして塩基配列決定のためにpUC18ベクター中
にクローン化した。C4G1では、２つのガンマー１特異性
および２つのカッパ特異的クローンの配列決定をした。
２つのガンマー１クローンおよび２つのカッパクローン
はそれぞれ配列が同一である。cDNA可変領域配列および
推定アミノ酸配列は第２図に示す。 キメラ抗体の構築および発現 プラスミドベクターはキメラ抗体遺伝子を構築および
発現させるために調製した。プラスミドpVg1−dhfr（第
３図Ａ）はヒトサイトメガロウイルスIEIプロモーター
およびエンハンサー（M.Boshart等、Cell 41、521（198
5））、先行イントロン部を有するヒトゲノムＣγ１断
片、並びに選択用のジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）
遺伝子（Simonsen等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80、249
5（1984）、これは本明細書に参考として組み入れる）
を含有している。プラスミドpVk（第３図Ｂ）はpVg1−d
hfrに類似しているが、ヒトゲノムCk断片およびgpt遺伝
子を含有している。C4G1HおよびＬ鎖可変領域の誘導体
はPCRによってcDNAから調製した。５′プライマーはATG
コドンで開始してＶ領域とハイブリッド形成しそしてXb
a I部位を含有していた;3′プライマーはＪ領域の最後
の15個のヌクレオチドとハイブリッド形成しそしてスプ
ライス供与シグナルおよびXba I部位を含有していた（Q
ueen等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86、10029（1989）、
これは本明細書に参考として組み入れる）。修飾したＶ
領域は定常領域のCMVプロモーターと部分的イントロン
との間のそれぞれのプラスミドベクターのXba1部位中に
クローン化した。 キメラ抗体を発現させるために、Ｈ鎖およびカッパ鎖
プラスミドはエレクトロポレーションによりSp2/0マウ
スミエローマ細胞にトランスフェクトし、gpt発現で選
択した。最大量の完全抗体を分泌するクローンはELISA
法で検出した。精製したキメラC4G1抗体はGP II b/III
a抗原を発現するHEL 92.1.7細胞と結合し、これはフロ
ーサイトメトリーによって、示された（第４図）。 ヒト型化抗体のコンピューターモデル構築 ヒト型化抗体中で高結合親和性を保持するために、Qu
een等の一般的な方法に従った（Queen等、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 86、10029（1989）およびWO 90/07861参
照、これらは本明細書に参考として組み入れる）。ヒト
抗体が元々のマウス抗体と相同であればあるほど、マウ
スCDR抗体をヒトフレームワークと組み合わせることに
よって、親和性を減少させる歪みをCDR抗体中に導入す
る可能性がますます少なくなる。通常は、Ｈ鎖とＬ鎖の
組合せの不適合性の可能性を減少させるように、フレー
ムワーク配列を提供するためには同一のヒト抗体から得
られるＨ鎖およびＬ鎖が選択される。NBRFタンパク質配
列データベースによる配列ホモロジー検索に基づいて
（MicroGenie Sequence Analysis Software（Beckman）
で実施した）、C4G1のヒト型化用のフレームワーク配列
を提供するためにEu抗体を選択した。 C4G1可変領域のモデルを構築するためにコンピュータ
ープログラムENCAD（M.Levitt、J.Mol.Biol.168、595
（1983）、これは本明細書に参考として組み入れる）を
使用した。このモデルを使用して、CDR（下記４のカテ
ゴリー）と相互作用できるほどCDRに十分近接したC4G1
フレームワーク中のアミノ酸を決定した。ヒト型化Ｌ鎖
およびＨ鎖C4G1可変領域を設計するために、アミノ酸は
各位置でその位置が下記の５つのカテゴリーの１つまた
はそれ以上の範囲内にない限り、EU抗体と同一であるよ
うに選択した： （１）位置がCDR内にある、 （２）Euアミノ酸がその位置でヒト抗体に稀であり、一
方C4G1アミノ酸がその位置でヒト抗体に典型的である、 （３）位置がCDRにぴったり隣接している、 （４）上記モデルが、アミノ酸は抗原結合領域（CDR）
と物理的に近接することができることを示唆する。 カテゴリー（２）では、「稀である」はEuL鎖および
Ｈ鎖と同一のサブグループ（Kabat等、前掲で定義され
ている）においてヒト配列の約20％未満で生じるアミノ
酸を含むように解釈され、そして「典型的」は上記サブ
グループにおいてヒト配列の約25％以上ではあるが一般
的には50％以上で生じるアミノ酸を含むように解釈され
る。これらのカテゴリーの位置では、マウスC4G1抗体か
ら得られるアミノ酸を使用した。更に、位置が５番目の
カテゴリー、即ち、 （５）Euアミノ酸がその位置ではヒト抗体において非常
に稀であり、そしてC4G1アミノ酸は異なっているが稀で
ある場合、 この場合は、その位置のヒト抗体に典型的なアミノ酸を
使用することができる。 各カテゴリー内のアミノ酸は表１に示す。幾つかのア
ミノ酸は１つ以上のカテゴリー内にあることができる。
ヒト型化C4G1 L鎖およびＨ鎖可変領域の最終配列は、マ
ウスC4G1配列と比較して、第５図Ａ、Ｂに示す。 ヒト型化抗体の合成 ヒト型化抗体の遺伝子を構築するために、ヒト型化Ｈ
およびＬ鎖のタンパク質配列をコードするヌクレオチド
配列を選択した。これには典型的な免疫グロブリンシグ
ナルペプチドが含まれ、一般的にはマウス配列中に見ら
れるコドンを使用した。幾つかの縮退コドンを変化させ
て制限酵素認識部位を創製するかまたは望ましくない制
限酵素認識部位を除去した。このヌクレオチド配列はま
た、キメラ遺伝子で使用される同一のスプライス供与シ
グナルおよび各末端のXba I部位も有していた。各遺伝
子は４つの部分的に重複する合成オリゴヌクレオチドか
ら構築した。各可変領域遺伝子用に、ストランド間で交
互に重複した２重の重複オリゴヌクレオチドを合成し
た。これはアミノ酸翻訳領域の配列並びにシグナルペプ
チドおよびスプライス供与シグナルを有していた（第６
図）。オリゴヌクレオチドはアプライド バイオシステ
ムズ（Applied Biosystems）380B DNA合成機で合成し
た。各オリゴヌクレオチドは約110〜140塩基の長さであ
り、約15塩基を重複させた。２本鎖DNAフラグメントは
各オリゴヌクレオチド対からKlenowポリメラーゼで合成
し、制限酵素で消化し、pUC18ベクターに連結しそして
配列決定した。次いで、それぞれ正しい半分の配列を有
する２つのフラグメントをpVg1−dhfrまたはpVk発現ベ
クターのXba I部位に正しい方向で連結して完全なＨ鎖
およびＬ鎖遺伝子を製造した。例えば、ヒト型化C4G1可
変領域遺伝子はpVg1−dhfrのXba Iフラグメントに含ま
れる。反応は当該技術分野で周知の条件下で実施した
（Maniatis等、前掲）。ヒト型化C4G1抗体の完全Ｈ鎖お
よびＬ鎖の予想されるアミノ酸配列は第５図Ｃおよび第
５図Ｄに示す。 Ｈ鎖およびＬ鎖プラスミドはエレクトロポレーション
によってSp2/0マウスミエローマ細胞中にトランスフェ
クトさせ、そして細胞はgpt発現で選択した。クローン
は培養上清液中のヒト抗体産生をELISA法でスクリーニ
ングし、そして抗体は産生量の最も多いクローンから精
製した。抗体はスタフィロコッカスプロテインＡ−セフ
ァロースCL−4B（Pharmacia）のカラムに組織培養上清
液を通過させて精製した。結合抗体は0.2Mグリシン−HC
l、pH3.0で溶出し、そして1Mトリス、pH8.0で中和し
た。緩衝液はPD10カラム（Pharmacia）を通過させるこ
とによってPBSに交換した。 ヒト型化FabおよびＦ（ab′）２フラグメントの製造 ２つの別のベクトーをヒト型化FabおよびＦ（ab′）
２フラグメントを製造するために構築した（第７図Ａお
よび第７図Ｂ）。ベクターを使用して直接製造した組換
えＦ（ab′）２フラグメントを酵素消化で製造したＦ
（ab′）２フラグメントと区別するために、組換えフラ
グメントはＦ（ab′）２−１と称する。Xba I部位から
反時計回りでBam HI部位まで、これらのプラスミドはpV
g1−dhfrと同一である（第３図Ａ）。しかし乍ら、完全
なヒトＣγ１遺伝子の代わりに、プラスミドpH Fab.Dは
CH1エクソンおよびヒンジエクソンの最初の５個のアミ
ノ酸、続いて停止コドンおよびスプライス供与シグナル
しか有しておらず、そしてプラスミドpHF（ab′）2.Dは
CH1、ヒンジおよびCH2の最初の２個のアミノ酸（ヒンジ
の１部としてスプライスに架橋するコドンを計数し
て）、続いて停止コドンおよびスプライス供与シグナル
しか有していない。両プラスミド共に、最終エクソンの
後に162塩基対のSal I−Bam HIフラグメントが続いてお
り、これはマウスγ2a定常領域遺伝子のＣH3エクソンの
すぐ後の領域から得られそしてポリアデニル化シグナル
を含有している。次いで、上記のヒト型化C4G1 H鎖可変
領域遺伝子を含有するXba Iフラグメントはプラスミドp
H Fab.DおよびpH F（ab′）2.Dの各々のXab I部位中に
正しい方向で挿入した。プラスミドは全て、遺伝子工学
分野の熟練者に周知のオリゴヌクレオチド合成およびPC
Rを含む標準的な方法で構築した。ヒト型化C4G1 Fabお
よびＦ（ab′）２−１フラグメント中のＨ鎖の予想アミ
ノ酸配列は第７図Ｃおよび第７図Ｄに示す；これらフラ
グメント中のＬ鎖は完全抗体中のＬ鎖と同一である（第
５図Ｃ）。 各Ｈ鎖遺伝子を含有するプラスミドはヒト型化C4G1 L
鎖遺伝子を含有するプラスミドとそれぞれ一緒にエレク
トロポレーションによってSp2/0細胞にトランスフェク
トさせ、そして細胞はgpt発現で選択した。クローンは
培養上清液中のヒト抗体フラグメントをELISA法でスク
リーニングし、そしてヒト型化C4G1抗体FabまたはＦ（a
b′）２−１フラグメントは最大産生量を与えるクロー
ンから精製した。各フラグメントについて、濃縮培養上
清液は最初20mMのトリス緩衝液、pH8.6中でDEAE−セフ
ァロースカラムを通過させ、非吸着画分を更に精製に供
した。FabフラグメントはCM−セファロースおよびフェ
ニル−セファロースで更に精製したが、一方Ｆ（ab′）
２−１フラグメントはCM−セファロースおよびフェニル
−セファロース並びにＳ−200で更に精製して当該技術
分野で周知の方法を使用してFab′他のオリゴマーから
Ｆ（ab′）２−１を分離した。当該技術分野で既知の他
のタンパク質製造および精製方法も使用することができ
る。例えば、Ｆ（ab′）２−１のDEAE−セファロース非
吸着フラクションはＦ（ab′）２−１の収量を増加させ
るために10mMの還元グルタチオン中pH9.0でインキュベ
ートすることができる。 ヒト型化C4G1抗体およびフラグメントはまた他の僅か
にまたはかなり異なる方法で精製することもできる。各
場合において、細胞は10,000gで10分間遠心して培養液
から分離し、上清液は0.45μｍフィルターでろ過し、そ
してその後、全抗体については30,000そしてフラグメン
トについては10,000の分子量カットオフ（MWCO）膜を使
用して約20倍に濃縮した。例えば、全ヒト型化C4G1抗体
を製造するために、濃縮培養上清液を1MのトリスでpH7.
5に調整し、10,000gで10分間遠心し、そして0.45μｍフ
ィルターでろ過した。次いで試料は、平衡および洗浄緩
衝液として0.15M NaCl、0.05Mトリス、pH7.5、2mM EDTA
を使用してプロテインＡ−セファロースFFカラム（Phar
macia）にアプライした。抗体はトリス塩酸でpH3.5に調
整した0.1Mの酢酸で溶出し、そして集めたフラクション
はトリスでpH7.5に調整した。次いで、集めたものを無
菌透析チューブを使用してPBSで透析し、そして0.2μｍ
フィルターを使用してフィルター滅菌した。 サルでのエクスビボ実験用のヒト型化C4G1 Fabフラグ
メントを精製するために、濃縮培養上清液は20mMトリ
ス、pH8.6でフィルターろ過し、10,000gで10分間遠心
し、そして0.45μｍフィルターでろ過した。試料は10mM
トリス、pH8.6で平衡化したDEAEセファロース（Pharmac
ia）カラムにアプライし、そして非吸着画分を集めた。
DEAEプールのバッファをMESで10mMにし、そしてHClでpH
6.5に調整した。次いで、試料を10mM MES、pH6.5で平衡
化したCMセファロース（Pharmacia）カラムにアプライ
し、０〜500mM NaCl勾配で溶出した。Fabフラグメント
は最初のピークに含まれていた。このピークフラクショ
ンのプールは10,000MWCO膜を使用して濃縮し、そしてPB
Sで平衡化したセファクリルＳ−200（Pharmacia）カラ
ムにアプライした。ピークフラクションを集め、そして
0.2μｍのフィルターを使用してフィルター滅菌した。 ヒト型化C4G1 F（ab′）２−１フラグメントは次のよ
うに製造しそして精製することができる。濃縮培養上清
液は20mMトリス、pH8.6でフィルターろ過し、10,000gで
10分間遠心し、そして0.45μｍフィルターでろ過する。
試料は10mMトリス、pH8.6で平衡化したDEAEセファロー
ス（Pharma4cia）カラムにアプライし、そして非吸着画
分を集める。DEAEプールは10,000MWCO膜を使用して約10
倍に濃縮し、酢酸でpH5.0に調整し、そして沈殿物を遠
心で除去する。次いで、試料はトリスでpH9.0に調整
し、10mM還元グルタチオンを加えそして22℃で30分間イ
ンキュベートする。次いで、試料は0.1Mトリス、pH9.0
に対し４℃で16時間透析し、その結果約30％のＦ（a
b′）２−１が形成される。次いで、試料は10,000MWCO
膜を使用して約１倍に濃縮し、そしてセファクリルＳ−
200カラムに入れる。90kDaのピークを集め、そして0.2
μｍフィルターを使用してフィルター滅菌する。 より高産生のヒト型化C4G1抗体およびフラグメント産
生する細胞株は産生細胞株を高い濃度のメトトレキセー
ト中でインキュベートすることによって得られる（Simo
nsen等、前掲）。或いは、FabおよびＦ（ab′）２フラ
グメントは、上記の組換え方法の代わりに当該技術分野
で周知の方法を使用して、完全ヒト型化C4G1抗体の酵素
消化によって製造することができる（Antibodies.A Lab
oratory Manual、HalowおよびLane編、Cold Spring Har
bor Laboratory、1988、これは本明細書に参考として組
み入れる）。 例えば、ヒト型化C4G1 F（ab′）２のもう１つの形
態、即ちＦ（ab′）２−２と称する形態は以下のような
ペプシン消化によって製造した。ヒト型化C4G1 IgG産生
細胞の培養上清液は1MトリスでpH8.5に調整し、そして5
0mMトリスpH8.5、150mM NaCl、2mM EDTAで平衡化したプ
ロテインＡ親和性膜デバイス（Nygene）に適用した。全
抗体は0.1Mグリシン−HCl pH2.5で溶出し、そして集め
たフラクションは1MトリスでpH3.5に調整した。このよ
うにして製造したIgGはブタ胃粘膜から得られるペプシ
ン（Sigma）で消化した。ペプシンは0.1Mグリシン−HCl
pH3.5に溶解させ、そしてIgG溶液に加えた（酵素:IgG
比率（w/w）1:100である）。反応混合物は37℃で３時間
反転させながらインキュベートし、そして反応は1Mトリ
スを加えてpH8.0に調整することによって停止させた。
次いで、ペプシン消化フラクションは0.75M（NH4）2SO4
に調整し、そして50mM CH3COONa pH6.0、0.75M（NH4）2
SO4で平衡化したフェニル−5PW（Tosoh）カラムにアプ
ライした。試料は、0.75Mから0Mまでの（NH4）2SO4の直
線的勾配で溶出した。Ｆ（ab′）２−２は主ピークに含
まれていた。 ヒト型化抗体の特性解析 ヒト型化C4G1抗体についてマウスおよびキメラ抗体と
比較してその性質を検討した。ヒト型化抗体は、キメラ
抗体と同様の方法でフローサイトメトリー分析した結果
HEL92.1.7細胞と結合し（第４図）、これはヒト型化抗
体がGP II b/III a抗原を認識することを示していた。 精製したヒト型化C4G1抗体、Fabフラグメント、Ｆ（a
b′）２−１フラグメントおよびＦ（ab′）２−２フラ
グメントは還元し、そしてSDS−PAGEを行った。完全抗
体はおおよその分子量25kDaおよび50kDaの２つのバンド
を示し、そしてFabおよびＦ（ab′）２−１フラグメン
トは約25kDaのダブレットのバンドを示した。ヒト型化C
4G1 F（ab′）２−２フラグメントはSDS−PAGEでＦ（a
b′）２−１フラグメントと同じ易動性を示した。これ
らの結果はアミノ酸組成から算出されたＬ鎖およびＨ鎖
またはＨ鎖フラグメントの分子量と矛盾しなかった。 ヒト型化C4G1抗体、FabフラグメントおよびＦ（a
b′）２−１フラグメントの親和性はマウスC4G1抗体お
よびフラグメントとの競合的結合によって測定した。精
製したヒト血小板をGP II b/III a抗原の供給源として
使用した。血小板は、フィコール−ハイパク（Ficoll−
hypaque）での遠心によって正常なヒト提供者から得ら
れるバフィーコートから精製した。競合させるヒト型化
またはマウス抗体若しくはフラグメントは量を変えて4.
5ngの放射性ヨウ素標識トレーサーC4G1抗体（3.5μCi/
μｇ）に加え、そして３×107個の血小板と共に0.2mlの
改変タイロード緩衝液中室温で１時間インキュベートし
た。細胞は2mlの氷冷緩衝液で洗浄し、そして遠心しペ
レット化した。放射活性を測定し、そして結合および遊
離トレーサー抗体の濃度を計算した（第８図）。種々の
抗体およびフラグメントの結合親和性はQueen等、Proc.
Nat.Acad.Sci.USA 86、10029（1989）と同様にして計算
した。この結果は、それぞれヒト型化とマウスのC4G1抗
体（第８図Ａ）、ヒト型化とマウスのC4G1 Fabフラグメ
ント（第８図Ｂ）、およびヒト型化とマウスのC4G1 F
（ab′）２フラグメント（第８図Ｃ）の間の結合親和性
に有意な差異のないことを明らかに示している。競合結
合実験をGP II b/III a抗原の供給源としてHEL92.1.7細
胞で行い、同じ結果が得られた。更に、これら細胞への
実際の結合親和性は結合定数が約108M-1またはそれ以上
であった。 マウスとヒト型化C4G1抗体およびフラグメントが血小
板凝集を阻止する能力を測定した。各抗体またはフラグ
メントは５μg/mlの最終濃度で、新たに採血したクエン
酸添加血液を200×ｇで10分間遠心して製造した血小板
に富む血漿（PRP）に加え、そして37℃で撹拌し乍ら５
分間インキュベートした。ADPは凝集を開始させるため
4.6μＭの終濃度で加えた。血小板凝集は、シエンコ（S
ienco）二チャンネル凝集計、モデルDP−247FまたはHEM
A−TRACERを使用して光透過率によってモニターした。
ヒト型化とマウスのC4G1抗体の凝集阻止能力（第９図）
またはそれぞれヒト型化とマウスのFabおよびＦ（a
b′）２−１フラグメントの凝集阻止能力に有意な差異
はなかった。そしてヒト型化C4G1 F（ab′）２−１とＦ
（ab′）２−２フラグメントの凝集阻止能力に有意な差
異はなかった。 マウス及びヒト型化C4G1抗体のヒトさい帯静脈内皮細
胞（HUVEC）への結合を、GP III aに特異的なマウスモ
ノクローナル抗体B6A3の結合と比較し、調べた。HEL92.
1.7細胞への抗体の結合も調べた。抗体は上述したよう
に放射標識した（3.5μCi/μｇ）。500μl HUVECあるい
はHEL92.1.7（２×104/ml、２×105/ml、２×106/ml）
の懸濁液を1.5mlエッペンドルフチューブ中、室温ある
いは４℃で各モノクローナル抗体の100fmolと90分間イ
ンキュベートした。インキュベーション後、エッペンド
ルフ遠心チューブ中のシリコンオイルの上へチューブ内
容物を移し、室温で２分間、10,000gで遠心した。ペレ
ットと上清を、ガンマカウンターで別々に測定した。非
特異的結合を、100倍量の非標識抗体で測定し、特異的
結合を出す為に総結合量から差し引いた。マウス及びヒ
ト型化C4G1モノクローナル抗体が、２×105/ml、２×10
6/mlの細胞濃度で、マウスB6A3と同程度にHEL92.1.7細
胞に特異的結合を示した。一方、マウスB6A3は２×106/
mlでHUVECに特異的に結合したが、マウス及びヒト型化C
4G1は、いずれの細胞濃度でもHUVECに特異的結合を示さ
なかった。 エクスビボのADP誘導血小板凝集阻止活性 サルでヒト型化C4G1 FabとＦ（ab′）２フラグメント
のエクスビボ血小板凝集阻止能力を測定した。全て健康
なヒト提供者から得られた血小板はヒト型化C4G1に応答
するが、ある種のアカゲザルから得られた血小板はヒト
型化C4G1に応答しなかった。それ故、ヒト型化C4G1に応
答する血小板を有するアカゲザルだけを本実験用に選択
した。 各フラグメントは5mlの生理食塩水溶液に懸濁し、そ
してアカゲザル（雄、体重2.8〜5.0kg）に静脈内に投与
した。プラセボ対照では、5mlの生理食塩水溶液を投与
した。血液は塩酸ケタミンによる麻酔下で投与１時間後
に集め、そして直ちにクエン酸を添加し、そして200gで
10分間遠心した。上清液をPRP（多血小板血漿）とし
た。先血小板血漿（PPP）は、PRPを得た残りの血液を20
00gで遠心して調製した。PRPはPPPで希釈して血小板数
を３×108/mlにした。 凝集を開始させるためADPは20μＭの最終濃度で加え
た。血小板凝集は光透過によってモニターした。 ヒト型化C4G1 FabおよびＦ（ab′）２−１フラグメン
トで処理したサルから得られた血小板で血小板凝集は完
全に阻止された。Ｆ（ab′）２−１フラグメントは0.5m
g/体重kgの投与量で血小板凝集を完全に阻止した。これ
らフラグメントでの処理はサルで重篤な血小板減少症を
生じさせなかった。 前述のことから、本発明のヒト型化免疫グロブリンは
他のGP II b/III a特異的抗体を超える多数の利点を提
供すると評価されよう。マウスモノクローナル抗体と比
較して、本発明のヒト型化免疫グロブリンは実質的によ
り少ない異種アミノ酸配列を含有している。ヒト患者へ
の注射後に抗原性を生じせしめる可能性が減少している
ことは有意な治療上の改善を示している。 全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または
特許出願を特にそして個々に指摘して参考として組み入
れる場合と同じ程度に本明細書に参考として組み入れ
る。本発明は明確化および理解の目的で説明および実施
例によって幾らか詳細に記載しているが、ある種の変更
および修正が請求の範囲の範囲内で実施され得ることは
明白である。
【配列表】
配列番号:1 配列の長さ:29 配列の型：核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 配列番号:2 配列の長さ:46 配列の型：核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 配列番号:3 配列の長さ:50 配列の型：核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 配列番号:4 配列の長さ:381 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列の特徴： 特徴を表す記号:sig_peptide 存在位置:1..60 配列 配列番号:5 配列の長さ:127 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号:Region 存在位置:44..54 配列の特徴： 特徴を表す記号:Region 存在位置:70..76 配列の特徴： 特徴を表す記号:Region 存在位置:109..117 配列 配列番号:6 配列の長さ:414 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列の特徴： 特徴を表す記号:sig_peptide 存在位置:1..57 配列 配列番号:7 配列の長さ:138 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号:Region 存在位置:70..74 配列の特徴： 特徴を表す記号:Region 存在位置:89..105 配列の特徴 特徴を表す記号:Region 存在位置:138..147 配列： 配列番号:8: 配列の長さ:107 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型:N−末端フラグメント 配列の特徴 特徴を表す記号:Region 存在位置:24..34 配列の特徴 特徴を表す記号:Region 存在位置:50..56 配列の特徴 特徴を表す記号:Region 存在位置:89..97 配列： 配列番号:9: 配列の長さ:107 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型:N−末端フラグメント 配列の特徴 特徴を表す記号:Region 存在位置:24..34 配列の特徴 特徴を表す記号:Region 存在位置:50..56 配列の特徴 特徴を表す記号:Region 存在位置:89..97 配列 配列番号:10 配列の長さ:119 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型:N−末端フラグメント 配列の特徴 特徴を表す記号:Region 存在位置:31..35 配列の特徴 特徴を表す記号:Region 存在位置:50..66 配列の特徴 特徴を表す記号:Region 存在位置:99..108 配列 配列番号:11 配列の長さ:119 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型:N−末端フラグメント 配列の特徴 特徴を表す記号:Region 存在位置:31..35 配列の特徴 特徴を表す記号:Region 存在位置:50..66 配列の特徴： 特徴を表す記号:Region 存在位置:99..108 配列 配列番号:12 配列の長さ:214 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号:13 配列の長さ:449 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号:14 配列の長さ:113塩基 配列の型：核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 配列番号:15 配列の長さ:123塩基 配列の型：核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 配列番号:16 配列の長さ:141塩基 配列の型：核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： 配列番号:17 配列の長さ:137塩基 配列の型：核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 配列番号:18 配列の長さ:117塩基 配列の型：核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 配列番号:19 配列の長さ:117塩基 配列の型：核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 配列番号:20 配列の長さ:117塩基 配列の型：核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 配列番号:21 配列の長さ:120塩基 配列の型：核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 配列番号:22 配列の長さ:222アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号:23 配列の長さ:235アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 21/08 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ツー ジェー ユン アメリカ合衆国 94025 カリフォルニ ア メンローパーク オークグローブ アベニュー445 (56)参考文献 Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｖ ｃｈ，38［５］（1985）ｐ．547−559 Ｂｌｏｏｄ，70［１］（1987）ｐ．16 −22 Ｂｌｏｏｄ，68［３］（1986）ｐ. 783−786 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，258［20 ］（1983）ｐ．12582−12586 Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，72 ［１］（1983）ｐ．325−338 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，264［１ ］（1989）ｐ．259−265

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号８に示されるアミノ酸配列と同一
    または配列番号８に示されるアミノ酸配列にアミノ酸残
    基の付加、欠失若しくは置換を施すことによって得るこ
    とができるアミノ酸配列である成熟Ｌ鎖可変領域、及
    び、配列番号10に示されるアミノ酸配列と同一または配
    列番号10に示されるアミノ酸配列にアミノ酸残基の付
    加、欠失若しくは置換を施すことによって得ることがで
    きるアミノ酸配列である成熟Ｈ鎖可変領域を含むヒト型
    化免疫グロブリンであって、下記の性質を有するヒト型
    化免疫グロブリン。 ヒト血小板上の糖タンパク質GP II b/III aにエピト
    ープが存在する。 ヒト血管内皮上にはエピトープが存在しない。 結合定数が少なくとも約107M-1の親和性を有する。 アゴニストに応答して起きるヒト血小板の凝集を阻止
    できる。
  2. 【請求項２】免疫グロブリンが、配列番号12に示される
    アミノ酸配列と同一または配列番号12に示されるアミノ
    酸配列にアミノ酸残基の付加、欠失若しくは置換を施す
    ことによって得ることができるアミノ酸配列である成熟
    Ｌ鎖、及び、配列番号13と同一または配列番号13に示さ
    れるにアミノ酸配列にアミノ酸残基の付加、欠失若しく
    は置換を施ることによって得ることができるアミノ酸配
    列である成熟Ｈ鎖可変領域を含む請求の範囲１記載のヒ
    ト型化免疫グロブリン。
  3. 【請求項３】免疫グロブリンが、請求の範囲１または２
    記載のヒト型化免疫グロブリンの酵素消化によって得る
    ことができるヒト型化免疫グロブリン。
  4. 【請求項４】酵素が、パパインまたはペプシンであるこ
    とを特徴とする請求の範囲３記載のヒト型化免疫グロブ
    リン。
  5. 【請求項５】免疫グロブリンが、FabまたはＦ（ab′）
    ２である請求の範囲１、３または４のいずれかに記載の
    ヒト型化免疫グロブリン。
  6. 【請求項６】請求の範囲１乃至５のいずれかに記載のヒ
    ト型化免疫グロブリンを含んで成る血栓塞栓性疾患治療
    剤。
  7. 【請求項７】請求の範囲１記載のヒト型化免疫グロブリ
    ンの成熟Ｌ鎖可変領域をコードする配列または成熟Ｈ鎖
    可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】請求の範囲７記載のポリヌクレオチドを含
    んで成るベクター。
  9. 【請求項９】請求の範囲８記載のベクターをトランスフ
    ェクトした宿主細胞。
  10. 【請求項１０】第１のベクターが成熟Ｌ鎖可変領域をコ
    ードする配列を含んで成り、そして第２のベクターが成
    熟Ｈ鎖可変領域をコードする配列を含んで成る請求の範
    囲８記載の２種類のベクターをトランスフェクトした請
    求の範囲９記載の宿主細胞。
  11. 【請求項１１】請求の範囲９または10記載の宿主細胞を
    培養し、培養物からヒト型化免疫グロブリンを採取する
    ことを特徴とする請求の範囲１乃至５のいずれかに記載
    のヒト型化免疫グロブリンの製造方法。
  12. 【請求項１２】請求の範囲９または10記載の宿主細胞を
    培養し、培養物からヒト型化免疫グロブリンを採取し、
    これを酵素消化することを特徴とする請求の範囲１、３
    乃至５のいずれかに記載のヒト型化免疫グロブリンの製
    造方法。
  13. 【請求項１３】酵素がパパインまたはペプシンであるこ
    とを特徴とする請求の範囲12記載のヒト型化免疫グロブ
    リンの製造方法。
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