KR100298608B1 - 면역글로불린이소타입에대한재구성된모노클로날항체 - Google Patents

면역글로불린이소타입에대한재구성된모노클로날항체 Download PDF

Info

Publication number
KR100298608B1
KR100298608B1 KR1019930019631A KR930019631A KR100298608B1 KR 100298608 B1 KR100298608 B1 KR 100298608B1 KR 1019930019631 A KR1019930019631 A KR 1019930019631A KR 930019631 A KR930019631 A KR 930019631A KR 100298608 B1 KR100298608 B1 KR 100298608B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
human
ser
antibody
seq
Prior art date
Application number
KR1019930019631A
Other languages
English (en)
Other versions
KR940006602A (ko
Inventor
노먼하드맨
프랭크콜빈거
조세살단하
Original Assignee
더블류. 하링, 지. 보이롤
노바티스 아게
에릭 피. 미라벨
타녹스 바이오시스템즈, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB929220228A external-priority patent/GB9220228D0/en
Application filed by 더블류. 하링, 지. 보이롤, 노바티스 아게, 에릭 피. 미라벨, 타녹스 바이오시스템즈, 인코포레이티드 filed Critical 더블류. 하링, 지. 보이롤
Publication of KR940006602A publication Critical patent/KR940006602A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100298608B1 publication Critical patent/KR100298608B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6873—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an immunoglobulin; the antibody being an anti-idiotypic antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Abstract

본 발명은 이소타입 면역글로불린 E(IgE)의 결정소에 대한 재조형 사람 모노클로날 항체, 이 항체의 직접 등가물 및 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 분자는 알레르기 진단, 예방 및 치료에 유용하다.

Description

면역글로불린 이소타입에 대한 재구성된 모노클로날 항체
제1도는 사람 κ 경쇄 불변 영역에 융합된 C21-L1 및 사람 γ 1 중쇄 불변 영역에 융합된 C21-H1 생산에 사용되는 HCMV-포유동물 발현벡터를 나타낸다.
본 발명은 면역글로불린 E(IgE)의 이소타입(isotype) 결정기에 대한 재구성된(reshaped) 사람 모노클로날 항체 및 상기 항체의 유도체에 관한 것이다. 상기 항체 및 이의 유도체는 시험관내 및 생체내 알레르기 진단, 예방 및 치료에 유용하다.
알레르기는 외래물질(알레르겐: allergen)에 대한 지나친 면역반응으로 발생되는 과민성 상태를 말한다. 알레르겐과 접촉한 즉시 알레르기 반응을 나타내는 것이 특징인 즉시형(유형 Ⅰ) 과민반응은 B 세포를 통해 매개되며 항원-항체 반응을 기초로 하고 있는 반면에, 지연형 과민반응은 T 세포에 의해 매개되며 세포성 면역 기전을 기초로하고 있다. 최근에, "알레르기"란 용어는 점차 유형 I 과민반응과 동의어화되어 가고 있다.
즉시형 과민반응은, 알레르겐과 접촉시 항체 분비 형질 세포로 분화하는 B 세포에 의한 면역글로불린 부류 E(IgE 항체) 항체 생성을 기초로 한다. IgE 유도 반응은 알레르겐의 체내 유입소, 즉 점막 표면 및/또는 국소 림프절에서 발생하는 국소적인 것이다. 국소적으로 생성된 IgE는 먼저 국소 비만 세포(mast cell)를 감작한다; 다시말해서 IgE 항체의 불변 영역이 비만 세포 표면상의 Fcε
수용체에 결합하고, 그후 "과량의" IgE가 순환계로 유입되어 신체 전체에 걸쳐 순환하는 호염구 및 조직-고정된 비만 세포상의 수용체와 결합한다. 결합된 IgE가 이후에 알레르겐과 접촉하게 되면, Fcε
수용체는 알레르겐의 결합으로 교차결합하게 되며, 이에 따라 세포가 히스타민, 프로스타글란딘, 류코트라이엔 등과 같은 다수의 아나필락시스 매개체(anaphylactic mediator)를 과립화시켜 방출한다. 이들 물질의 방출은 즉시형 과민반응의 전형적인 임상적 증상, 즉, 기도 또는 소장의 평활근 수축, 모세혈관의 팽창 및 물과 혈장 단백질에 대한 이들의 투과력 증가, 점액 분비와 이로인한 비염, 아토피성 엑제마(excema), 천식 및 소양증과 통증으로 나타나는 피부에서의 신경말단의 자극 등의 원인이 된다.
또한, 알레르겐과의 2차 접촉시 반응이 강하게 나타나는데, 이는 일부의 B세포가, 알레르겐과의 첫번째 접촉 후에 세포 표면에 IgE를 발현시켜 표면 IgE 양성 B 세포(sIgE+B 세포)의 "기억 풀(memory pool)"을 형성하기 때문이다.
알레르기 치료에 대한 유망한 개념은 모노클로날 항체의 적용을 포함하는데, 이 항체는 IgE-이소타입-특이적이어서 IgE와 결합할 수 있다. 이러한 접근은, 알레르기 유도의 가장 초기 사건이며 알레르기 상태를 지속하도록하는 IgE 면역 반응을 하향조절(downregulation)함으로써 알레르기 반응을 억제한다는데 근거하고 있다. 이로써 다른 항체 부류의 반응은 영향을 받지 않으므로 알레르기성 증상에 대한 신속하고 지속적인 효과가 성취된다. 또한, 항-알레르기제로서 적합한 항체는, IgE 생성 형질 세포가 되는 표면 IgE 양성 B 세포와 반응해야만 하며 이에 의해 기능적으로 B 세포를 제거하는데 사용할 수 있어야 한다. 그러나 원리적으로, IgE에 대한 항체는 또한 Fcε수용체를 교차결합시킴으로써 IgE 감작된 비만 세포로부터 매개체 방출을 유도할 수도 있고, 이로써 혈청 IgE 및 sIgE+B 세포 농도에 대해 발휘되는 유익한 효과에 대해 길항작용을 나타낸다. 결국, 알레르기 요법에 적용가능한 항체는 감작된 비만 세포 및 호염구상에 결합된 IgE와는 반응할 수 없지만 sIgE+B 세포를 인지할 수 있는 능력은 보유해야만 한다.
이와 같은 IgE 이소타입-특이적 항체는 장(chang) 등[참조: Biotechnology 8, 122-126(1990)]이 PCT 특허원 제89/06138호 및 유럽 특허원 제396505호의 문헌에서 기술하고 있다. 그러나, 전술한 항체가 사람 기원이 아니기 때문에, 외래 단백질로서 외래 면역원성, 순환계중에서의 이들의 상당히 긴 잔류시간 및 장애가 되는 면역 복합체의 형성 등의 이유로 사람에 적용하기에는 적합하지 않다. 이러한 단점은, 예를 들어 설치류의 항-IgE 모노클로날 항체를, 설치류 항체의 가변 도매인을 사람 항체의 불변 도메인과 결합시킨 키메라성 항체로 변형시킴으로써 잠재적으로 감소시킬 수 있다. 이 방법은 설치류 모체의 항-IgE 항체의 항원-결합 부위를 지니고 있으면서 사람 이소타입 및 이펙터(effector) 기능을 부여한다. 그러나, 사람에게 사용하기 위해, 이와 같은 키메라성 항체는 본래의 설치류 항체에 비해 충분한 임상적 장점을 갖지는 못한다.
키메라성 항체의 면역원성은, 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)이라고도 불리는 설치류의 초가변 영역을 사람 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 도메인 골격으로 이식시켜 사람 항체를 재구성함으로써 추가로 감소시킬 수가 있다. 이 기술은, "속칭(generic)" 사람 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 중에 존재하는 것에 대한 항원-특이적 설치류 CDR 서열의 치환 또는 재조합 이식을 포함한다(참조: 유럽 특허원 제239,400호). 이 기술이, 항원-결합 부위의 결정적이고 중요한 부분을 사람 항체에 전이시킨다고 여겨진다.
천연의 순수한 면역글로불린 또는 항체는 일반적으로 각각의 상부 암(arm) 말단에 항원 결합-부위를 갖는 Y자 형태의 4량체 분자로 구성되어 있다. 항원 결합부위는 경쇄의 가변 도메인 및 이와 연관된 중쇄의 가변 도메인으로 구성되어 있다. 보다 상세하게는, 항체의 항원 결합 부위는 필수적으로 중쇄의 가변 도메인(VH)의 3개의 CDR과 경쇄 가변 도메인(VL)의 3개의 CDR로 구성되어 있다. VL및 VH모두에서, CDR은 4개의 골격 영역(FR: framework region)과 교대로 존재하여 일반식 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I)의 폴리펩타이드 쇄를 형성하는데, 여기에서 폴리펩타이드 쇄는 N-말단 선단으로부터 출발하여 C-말단 선단으로 종료된다. VH및 VL의 CDR은 각각 H1, H2, H3 및 L1, L2, L3로도 언급된다. FR을 구성하는 것 또는 CDR을 구성하는 것에 대한 결정은 일반적으로 동종내에서 생성된 여러가지 항체의 아미노산 서열을 비교함으로써 이루어지며, 동정에 대한 일반적인 법칙은 문헌중에 공지되어 있다[참조: "Sequences of proteins of immunological interest", Kabat E.A. et al., US department of health and human service, Public health service, National Institute of Health].
최근, 결합의 에너지학과 관련하여, 경쇄 가변 도메인에 의한 것이 중쇄 가변 도메인에 의한 것 보다 결합 에너지가 작으며 분리된 중쇄 가변 도메인은 이들 자체에 항원 결합 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 분자는 일반적으로 단일 도메인 항체로 언급된다[참조: Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546, 1989].
CDR은 도메인내에서 b-시트 골격에 결합된 루프를 형성한다. 아미노산 서열과 루프 구조간의 상관성은 표준 구조 모델로서 설명될 수 있다[참조: Chothia et al., Nature, 342, 887-883, 1989]. 이 모델에 따르면, 항체는 각각의 초가변 영역에 대해 단지 소수의 주쇄 입체구조 또는 '표준 구조'만을 갖는다. 이 입체구조는 CDR내 특이적 부위와 특정 루프의 경우에 골격 영역에서 소수의 주요 아미노산 잔기의 존재로 결정된다. 상이한 면역글로불린에서 동일한 입체구조를 갖는 초가변 영역은 상기 위치에서 동일하거나 거의 유사한 아미노산 잔기를 갖는다.
여러가지 설치류 모노클로날 항체에 대해 CDR 이식을 수행하여, 설치류 CDR-공여 항체보다 현저하게 낮은 결합 친화도를 갖는 재구성 사람(또는 사람화) 항체를 생산해왔다. 최근의 발견은, CDR의 전이외에, 사람 서열의 골격내에서의 변화가 CDR-이식된 생성물에서 만족할만한 항원 결합 활성을 제공하는데 필요할 수 있음을 지적하고 있다.
퀸 등[참조: Queen et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 86, 10029-10033, 1989]은 쥐의 항-Tac 모노클로날 항체로부터의 CDR을 사람 골격내로 이식할 수 있음을 발표하였다. 사람의 골격은 쥐의 서열과의 상동성을 최대화하도록 선택한다. 상기 저자들은 CDR 또는 항원과 상호작용하기에 충분히 근접한 FR중에 위치한 아미노산 잔기를 동정하기 위해 쥐 모 항체의 컴퓨터 모델을 사용하였다. 이들 잔기들은 쥐의 서열에서 발견되는 잔기로 돌연변이시킨다. 사람화시킨 항-Tac 항체는 쥐의 항-Tac 항체의 약 1/3정도 밖에 안되는 친화도를 가지며 이들 항체가 사람 특성을 유지한다는 점에는 약간의 의문점이 남는다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러 쥐의 CDR-공여 항체와 같거나 이보다 훨씬 뛰어난 항원 결합 친화도, 예를 들어 IgE 결합 친화도를 갖는, 사람 IgE에 대한 재구성 사람 항체를 제조하는 것이 가능하다는 사실을 밝혀내었다.
따라서, 본 발명의 목적은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 서열중에 포함하는 항원 결합 부위를 하나 이상 함유하는, IgE에 특이적인 재구성 사람 모노클로날 항체, 이의 직접적 등가물 또는 유도체를 제공하는 것으로, 이때 CDR1은 Met-Tyr-Trp-Leu-Glu의 아미노산 서열을, CDR2는 Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala의 아미노산 서열을, CDR3는 Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr의 아미노산 서열을 가지며, 이 재구성 사람 항체는 쥐의 CDR-공여 항체와 적어도 거의 동일한 항원 결합 친화도를 갖는다. 서열 1에 나타낸 아미노산 서열에서, CDR1은 아미노산 31 내지 35에 걸쳐 있고 CDR2는 아미노산 50 내지 66에 걸쳐 있으며 CDR3는 아미노산 99 내지 112에 걸쳐 있다. 쥐의 CDR-공여 항체는 모노클로날 항체 TES-C21이다.
바람직하게는, 본 발명은
a) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3를 차례로 포함하는 제1 도메인(여기서, CDR1은 Met-Tyr-Trp-Leu-Glu의 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala의 아미노산 서열을 가지며, CDR3는 Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr의 아미노산 서열을 갖는다) 및
b) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3를 차례로 포함하는 제2 도메인(여기서, CDR1은 Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His의 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser의 아미노산 서열을 가지며, CDR3는 Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr의 아미노산 서열을 갖는다)을 포함하는 항원 결합 부위 하나 이상을 포함하고, 쥐의 CDR-공여 항체와 적어도 거의 동일한 항원 결합 친화도를 갖는 재구성 사람 항체, 이의 직접적인 등가물 또는 유도체에 관한 것이다. 제1 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열 1에서 확인된 단백질 서열의 CDR이다. 제2 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 서열 3에 나타낸 아미노산 서열중에서, 각각 아미노산 24 내지 34, 50 내지 56 및 89 내지 97에 걸쳐 있다.
항원 결합 부위가 제1 및 제2 도메인 둘다를 포함하는 경우, 이들은 동일한 폴리펩타이드 쇄상에 존재하거나, 또는 바람직하게는 각 도메인이 상이한 쇄상에 존재할 수도 있으며, 이때 제1 도메인은 면역글로불린 중쇄 부분 또는 이의 단편이고, 제2 도메인은 면역글로불린 경쇄 부분 또는 이의 단편이다.
본 발명에 따르면, 재구성된 사람 항체는 (1) 각각의 존재하는 쇄가 사람-형골격을 포함하는 항원 결합 부위를 하나 이상 포함하며, (2) 존재하는 모든 불변 영역이 사람 면역글로불린 불변 영역과 적어도 실질적으로 상동성이거나, 바람직하게는 동일함을 특징으로 하는 분자를 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "사람-형 골격"이란, 특정 사람 면역글로불린 서열의 골격중의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 약 70개 이상, 바람직하게는 약 75개 이상 포함하는 골격 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4이 차례로 구성된 골격이다. 따라서, 가능하다면 재구성 사람 항체의 CDR을 제외한 모든 부분이 하나 이상의 천연 사람 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 상동성이다. 예를 들어, 재구성 사람 항체는 쥐의 가변 영역 및 사람의 불변 영역을 포함하는 키메라성 항체를 포괄하지는 않는다.
사람-형 골격은 특정한 사람 면역글로불린 골격과 동일할 수 있거나, 바람직하게는 특정한 사람 골격과 상이할 수 있다: 즉, 제한된 수의 아미노산 잔기가 삽입 또는 결실되거나 다른 아미노산 잔기로 대체될 수도 있다. 이러한 변형은 단일 FR, 즉 FR1, FR2, FR3, 또는 FR4에 국한될 수도 있거나 4개의 FR중 2개, 3개 또는 4개 모두를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 사람 수용체 골격중의 소수성 아미노산은 다른 아미노산, 바람직하게는 또한 소수성 아미노산, 예를 들어 동종의 아미노산으로 대체되거나 두개의 아미노산으로 대체되거나 또는 결실될 수도 있다. 마찬가지로, 사람 골격중의 친수성 아미노산 역시 다른 아미노산, 두개의 아미노산으로 치환되거나 결실될 수도 있으며, 이로써 바람직하게는 최초 골격의 수소결합은 유지하면서 아미노산을 대체한다. 이러한 변형은 '시행착오'를 기본으로 수행되는데, 예를 들어 이의 효과는 제조한 재구성 사람 항체의 항원-결합 친화도와 쥐 CDR-공여 항체 TES-C21의 항원-결합 친화도를 비교하여 평가한다. 항원 결합 친화도를 측정하기에 적합한 검정은 하기한 바와 같다.
특히, 선택된 사람 수용체 골격내의 제한된 수의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 내지 12개의 잔기를, 쥐의 모노클로날 항체, 특히 쥐 항체 TES-C21중의 상응 하는 위치에 존재하는 아미노산 잔기로 대체하고/하거나(사람 H 쥐의 교환), 상이한 사람 항체중의 상응하는 위치에 존재하는 아미노산 잔기로 대체(사람 H 사람 교환)시킬 수도 있다. 바람직하게는, 가정된 아미노산(들)의 치환은 항원 결합 및/또는 VL/VH패킹에 잠재적으로 결정적인 것으로 간주되는 특정 골격 잔기를 미리 확인하는 것을 기본으로 한다. 이와 같은 결정적 아미노산은, 이들의 특별한 성격 및/또는 위치 때문에, 항체의 CDR내 아미노산과 접촉하고 있거나 이와 가까이 위치 한다고 여겨지고; 항체와의 결정적 상호작용에 관련될 수도 있으며; VH및 VL도메인내 또는 도메인 사이의 상호작용에 직접적 또는 간접적 영향을 끼쳐 쌍을 이룬 VH/VL구조의 전체적 통합성 유지와 관련된 것으로 여겨지는 골격 잔기를 포함한다.
소위 결정적 아미노산의 동정에 적합한 것으로 공지된 방법은 분자 모델링법이다. 예를 들어, 항원 결합 부위의 분자 모델은, 일반적으로 입수가능하고 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 컴퓨터 모니터상에서 창작하고 나타낼 수 있다.
특히, 본 발명의 재구성 항체 디자인은 다음 단계를 포함한다:
a) 예를 들어, 서열 1 및 3에 나타낸 아미노산 서열과 서열 매칭으로 상동성이 크도록 결정된 쥐 항체의 밝혀진 상응하는 구조에 기초한, 쥐 항체 TES-C21의 VL및 VH에 대한 그럴듯한 분자 모델의 작제 단계(이때, 밝혀진 구조는 동일한 쥐의 항체 또는 상이한 쥐의 항체로부터 기원할 수 있다);
b) 공지된 사람 면역글로불린 서열, 예를 들어 일반적으로 입수할 수 있는 데이타베이스(예: KABAT 데이타베이스; "Sequences of proteins of immunological interest", Kabat E.A. et al., US department of health and human service, Public health service, National Institute of Health)로부터 수득가능한 서열의 VH및 VL로부터 적합한 사람 수용체 골격의 선별 단계[이때, 적합한 사람 수용체 골격은, 예를 들어, 항체 TES-C21의 VH및 VL도메인과 데이타베이스중에서 나머지 서열을 비교하여 상동성이 높거나, 바람직하게는 특별하게 상동성이 높은 특정 면역 글로불린으로부터의 골격, 가장 바람직하게는 항체 TES-C21의 VH및 VL도메인과 상동성이 높은 다수의 사람 항체로부터의 컨센서스 골격이다. 이식을 위해 선택한 중쇄 및 경쇄 골격 서열은 동일한 사람 항체로부터 유래된 것일 필요는 없으나, 바람직하게는 상이한 사람 항체로부터 유래된 것이다];
c) 일반식(Ⅰ)에 따르는, 쥐 TES-C21의 CDR 및 선택된 사람 수용체 골격으로 부터의 FR을 포함하는, 재구성 사람 항체의 VH및 VL의 분자 모델 작제 단계; 및
d) 단계 a) 및 c)에서 수득가능한 분자 모델의 비교 단계.
본 발명의 재구성 사람 항체에서, 동정된 결정적 아미노산 잔기 하나, 일부 또는 전부가 다른 아미노산 잔기, 특히 항체 TES-C21중 특정 위치에 존재하는 잔기로 치환될 수도 있다. 바람직하게는, 선택된 사람 골격내의 "최초" 아미노산 잔기는, 이것이 추정된 표준 구조의 일부이거나 초가변 루프의 구조 결정에 중요한 것이라면 치환시키지 않는다. 그러나, 아미노산 잔기의 치환이 결정적 아미노산에 국한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 비-결정적 잔기에 영향을 가하는 변화는 사람-사람 유형의 변화이다.
본 발명의 재구성 사람 항체에서 아미노산 Cys는 -S-S-결합을 형성하는 산화 상태일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 재구성 사람 항체의 예로는 단일 도메인 항체, 단쇄 항체, 및 완전한 길이의 중쇄 및 경쇄를 갖는 천연 다중쇄 항체(예: 4량체 항체) 및 이의 임의 단편(예: Fv, F(ab')2, Fab' 및 Fab 단편) 등을 들 수 있다.
단일 도메인 항체는 단일 도메인을 포함하는 단일 항원 결합 부위를 포함한다.
단쇄 항체(scFv라고도 명명)는 필수적으로 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인으로 구성되어 있다. 바람직하게는, 이들 가변 도메인은 글리신 및 세린으로부터 선택된 약 10 내지 30개, 특히는 약 15개 아미노산을 포함하는 짧은 펩타이드 링커를 통해 공유적으로 결합된다. 바람직한 펩타이드 링커는 3개의 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 반복 단위로 구성된 15개 아미노산 폴리펩타이드이다. 단쇄 항체는 중쇄 또는 경쇄 어느 쪽의 불변 부분도 포함하지 않는다.
본 발명의 재구성 사람 항체는 IgE에 대해 특이적이다. 다시 말해서 이는 사람 IgE의 이소타입 결정기에 대한 항체이다. 따라서, 본 발명의 항체는 IgE 부류의 면역글로불린에서 통상적인 중쇄상의 항원성 결정기를 인지하는데, 즉, 이는 상이한 특이성을 갖는 IgE 분자와는 반응하나 다른 이소타입의 면역글로불린 또는 면역글로불린 경쇄와는 반응하지 않는다.
본 발명의 재구성 항체는 적어도 쥐의 항체 TES-C21과 적어도 거의 동일한 IgE-결합 친화도를 갖는 것이 요구된다. 본원의 전후에서 사용되는 바와 같이, 용어 "적어도 거의 동일한"이란 것은, 통계학적 기준으로 재구성 사람 항체(시험 항체)의 IgE-결합 친화도가, 참조 항체 TES-C21의 약 90% 이상, 바람직하게는 90%를 초과, 특히 약 100% 내지 약 250%인 것을 의미한다. 재구성 항체는 TES-C21의 상응하는 구조와 비교해야 한다. 예를 들어, 재구성 항체가 단일 도메인 항체인 경우, 이의 친화도는 단일 도메인 TES-C21과 연관되어야 한다. 이러한 쥐의 단일 도메인 항체는 서열 1 및 3에 주어진 정보에 기초하여 용이하게 제조할 수 있다. 상세한 설명에서는, 항체의 "친화도" 또는 "결합력"을 구별하지 않고 있으며, "친화도"란 용어는 친화도 또는 결합력중 어느 하나를 의미한다.
참조 및 재구성 시험 항체의 친화도 측정은 동일한 방식 즉, 동일 검정의 동일 조건하에 수행한다. 다른것과 비교하여 항체는 거의 같은 수준의 순도를 가져야만 한다. 고도로 정제된 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
IgE에 대한 항체의 결합 친화도는, 공지된 기술과 원리를 근거로 하여, 당해 분야의 통상적 기술을 가진 사람에 대해 용이하게 확립될 수 있는 적절한 정량적 검정을 사용하여 측정한다.
측정하기에 적합한 매개 변수는 평형 상수 Kaff(친화도 상수)이다. 항원-항체 상호작용에 대한 친화도 상수의 실험적 계산을 용이하게 하기 위해 여러가지 수학식이 개발되었다. Kaff를 측정하기에 적합한 실험 방법은, 예를 들어 결합된 항원과 유리의 항원 비율 측정(예: 경쟁적 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay) 또는 경쟁적 효소-결합 면역분석(EIA: Enzyme-linked immumoassay)) 또는 총 항체 농도 측정[예: 문헌(참조: Beatty et al., J. Immunol. Meth. 100, 173-179 (1987))에 기술되어 있는 비경쟁적 고체상 EIA]에 의존한다.
바람직하게는, Kaff는, CM5 표면칩을 사용하는 BIA 코어TM시스템(Pharmacia Biosensor; Uppsala, Sweden)상에서 항체와 IgE 항원과의 실시간 생체특이적 상호작용[참조: Jonsson, U. et al, Biotechniques 11, 620-627, 1991]을 분석함으로써 측정한다. 이 검정은 필수적으로 제조자의 지시에 따라 수행하며 동역학적 상수 kass및 kdiss측정을 포함한다. 적절한 항원은, 예를 들어 세로텍(Serotec; Dottikon Switzerland)이 시판하고 있는 사람 IgE(예: BP 094) 또는 Se 44와 같은 사람 e 불변 영역을 갖는 키메라성 항체이다[참조: Sun et al., J. Cell. Biol. 109, 289a, 1989]. 특히, 이 검정은 1) 수반되는 쥐 항체 TES-C21인 항-마우스 항체(예: 항-마우스 IgG) 또는 수반되는 본 발명의 재구성 사람 항체인 항-사람 항체(예: 항-사람 IgG)를 측정하기 위해, 화학적 방법으로 칩 표면상에 소위 포획 항체를 고정시키고; 2) 참조 또는 시험 항체를 고정된 포획 항체에 결합시키며; 3) 결합된 참조 또는 시험 항체를 고정된 농도의 항원과 접촉시킴을 포함하는 시험 주기로 구성된다.
바람직하게는 일정량의 결합된 항체 및 다양한(공지된) 농도의 IgE를 사용하여 다수, 예를 들어 4회의 실험 주기를 수행한다. 각 주기의 종료후, 표면은, 예를 들어 HCl과 같은 산을 사용하여 재생시킨다.
본 발명의 재구성 항체의 디자인은 높은 결합율(kass), 바람직하게는 2.5 x 105M-1s-1또는 그 이상을 나타내면서, 낮은 해리율(kdiss), 바람직하게는 1.9 x 10-5s-1또는 그 이하를 나타내는 항체를 작제하는데 그 목적이 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명에 따른 재구성 사람 항체의 직접적인 등가물은, 서열 1에 나타낸 것과 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 차례로 포함하고 임의로 서열 3에 나타낸 것과 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3를 차례로 포함하는 재구성 사람 항체인데, 이때 하나의 가변 영역내의 CDR중에서 4개 이하의 아미노산 잔기, 즉 CDR중의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 잔기는 다른 아미노산으로 대체된다. 따라서, "이의 직접적인 등가물"이란 용어는 (1) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3가 전체적으로 서열 1에 나타낸 것과 같은 CDR에 대해 90% 이상의 상동성을 나타내고, (2) 단백질 Y의 것과 동일한 FR을 가지나 서열 1중의 CDR과 동일한 CDR을 갖는 본 발명의 참조 단백질의 것과 적어도 거의 동일한, IgE에 대해 친화도를 갖는 단일 도메인 재구성 사람 항체(단백질 Y)를 의미하거나; 또는 (1) 초가변 영역 CDR1H, CDR2H, CDR3H및 CDR1L, CDR2L, CDR3L이 전체적으로 서열 1 및 3에 나타낸 바와 같은 CDR에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내고, (2) 단백질 Y'의 것과 동일한 FR 및 불변 부분을 가지나 서열 1 및 3에 나타낸 것과 동일한 초가변 영역 CDR1H, CDR2H, CDR3H및 CDR1L, CDR2L, CDR3L을 갖는 본 발명의 참조 단백질의 것과 적어도 거의 동일한, IgE에 대해 친화도를 갖는 도메인을 결합 부위당 2개 갖는 재구성 항체(단백질 Y')를 의미한다.
후자의 기준은, 예를 들어 상기한 방법에 따라 Kaff를 측정하여 시험할 수 있다.
쥐 모노클로날 항체 TES-C21은 여러가지 특성중에서 다음 특성을 나타내며, 이는 또한 본 발명의 재구성 사람 항체에서도 공통적인 것이다:
- Fcε수용체 I 또는 Ⅱ를 갖는 세포에 대한 IgE의 결합 억제;
- 사람-IgE 분비 세포와 특이적으로 결합;
- Fcε수용체 Ⅰ 또는 Ⅱ를 갖는 세포, 예를 들어, 감작된 비만 세포 및 호염구 표면에 결합된 IgE를 인지하거나 이와 결합하지 않음;
- 매개체(예: 히스타민) 방출을 개시하지 않음;
- 면역 반응에서 IgE 형성 억제.
이러한 특징적인 능력들은 본원에서 참고로 인용되고 있는 당해 분야에 널리 공지된 문헌[참조: 유럽 특허원 제396505호]에 따른 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 재구성 항체 또는 이의 유도체는 적어도,
a) 초가변 영역 CDR1H, CDR2H및 CDR3H을 차례로 포함하는 가변 도메인 및 사람 중쇄의 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(여기서, CDR1H는 Met-Tyr-Trp-Leu-Glu의 아미노산 서열을 가지고, CDR2H는 Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala의 아미노산 서열을 가지며, CDR3H는 Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr의 아미노산 서열을 갖는다); 및
b) 초가변 영역 CDR1L, CDR2L및 CDR3L을 차례로 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 사람 경쇄의 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(여기서, CDR1L은 Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His의 아미노산 서열을 가지고, CDR2L은 Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser의 아미노산 서열을 가지며, CDR3L은 Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr의 아미노산 서열을 갖는다)을 포함한다.
면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 단편은 완전한 길이의 쇄가 아니면서 쇄의 가변 도메인 및 임의로 쇄의 불변 도메인을 포함하는 중쇄 또는 경쇄이다.
보다 바람직한것은,
a) 서열 11의 아미노산 위치 1에서 시작하고 아미노산 위치 123에서 종료되는 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 사람 중쇄의 불변 부분을 포함하는 하나의 중쇄; 및
b) 서열 5의 아미노산 위치 1에서 시작하여 아미노산 위치 107에서 종료되는 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 사람 경쇄의 불변 부분을 적어도 포함하는 하나의 경쇄를 포함하는 재구성 사람 항체 또는 이의 유도체이다.
특히 바람직한 것은,
a) 서열 13의 아미노산 위치 1에서 출발하고 아미노산 위치 123에서 종료되는 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 사람 중쇄의 불변 부분을 포함하는 하나의 중쇄; 및
b) 서열 5의 아미노산 위치 1에서 시작하고 아미노산 위치 107에서 종료되는 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 사람 경쇄의 불변 부분을 적어도 포함하는 하나의 경쇄를 포함하는 재구성 사람 항체 또는 이의 유도체이다.
본원에 나타낸 잔기 표기는 아미노산 잔기의 선형 넘버링에 상응한다.
사람 중쇄의 불변 부분은 임의의 이소타입 α(알파), δ(델타), γ(감마) 또는 뮤(μ)로부터 선택할 수 있다. IgG 아부류 1 내지 4와 같은 여러가지 아부류의 중쇄가 사용될 수 있다. 바람직한 것은 사람 g1쇄의 불변 부분이다. 중쇄의 상이한 부류 및 아부류는 상이한 이펙터 작용에 수반되므로, 중쇄 불변 영역의 유형을 선택함으로써 목적하는 이펙터 기능을 갖는 재구성 사람 항체를 제조할 수 있다. 경쇄의 불변 부분은 람다(λ), 바람직하게는 카파(κ)쇄이다.
가장 바람직한 것은 세포주 EH 31.8로 제조한 H3L1으로 지정된 재구성 사람항체이다.
본 발명은 또한 본 발명의 재구성 사람 항체의 유도체에 관한 것이다. 재구성 사람 항체의 유도체는 상기 항체의 항원 특이성을 갖는다. 본 발명에 따라 유도체는, 예를 들어 흡착 또는 화학적 변형에 의한 본 발명의 항체 변형으로 수득가능한 모든 분자를 의미한다. 예를 들어, 유도체의 목적하는 용도에 따라, 본 발명의 항체는 다른 단백질성 또는 비-단백질성 분자의 공유적 또는 비-공유적 결합에 의해 유도체화할 수 있다. 예를 들어, 당해 분야에 공지된 커플링 기술을 사용하여 공유 결합을 수행하여 항체 접합체를 생성한다. 이러한 접합체에서, 항체는 접합 파트너에 직접 결합하거나 스페이서(spacer) 또는 링커 그룹을 통해 결합한다. 유도체의 예에는 방사능 표지된 재구성 사람 항체, 또는 예를 들어 효소, 형광성 또는 화학발광성 마커, 적절한 세포독성 또는 세포성장억제 물질, 금속 킬레이트, 아비딘과 같은 효소가 아닌 단백질 또는 바이오틴과 같은 비-단백질성 분자와 본 발명의 재구성 사람 항체와의 접합체이다.
본 발명의 항체 접합체에 사용되는 효소는, 예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코아밀라제, 카본산 안하이드라제, 아세틸콜린에스테라제, 라이소자임, 말레이트 데하이드로게나제 또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 등이다.
형광성 마커로는 플루오레세인, 플루오로크롬, 로다민 등이 있다.
화학발광성 마커는 루미놀의 아크리디늄 에스테르이다.
금속 킬레이트의 예로는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DPTA), 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸, 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산, 1-옥사-4,7,12,15-테트라아자헵타데칸-4,7,12,15-테트라아세트산 등이 있다.
본 발명의 방사능 표지된 항체 또는 단편에는, 예를 들어 방사능 요오드(123I,125I,131I), 3중 수소(3H), 탄소(14C), 황(35S), 이트륨(90Y), 테크네튬(99mTC) 등이 포함된다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 항-IgE 재구성 사람 항체, 이의 직접적인 등가물 및 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재구성 사람 항체, 이의 직접적인 등가물 또는 유도체는, 하기에서 더 상세히 한정되는 바와 같이, 본 발명의 단백질을 생성시키는 적절한 숙주 세포를 시험관내 또는 생체내에서 배양시키고, 필요할 경우, 목적하는 단백질을 분리하며, 임의로 이의 유도체로 전환시킴을 특징으로하는, 그 자체가 공지된 방법으로 제조한다. 본 발명의 단백질은, 상기 단백질 발현을 허용하는 조건하에서 임의의 적절한 형질전환가능한 숙주를 배양하여 단백질을 발현시키고, 이 단백질을 분리하며, 임의로, 분리된 단백질을, 예를 들어 단백질분해적 절단으로 본 발명의 다른 단백질로 전환시키거나 또는 예를 들어, 상술한 바와 같이, 단백질 또는 비-단백질성 분자와 같은 다른 화합물을 부착시켜 본 발명의 유도체로 전환시킴을 포함하는 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, (1) 하기 정의한 바와 같은 본 발명의 제1 및 제2 DNA 작제물로 형질전환시킨 적절한 숙주 세포를 배양하고, (2) 배양물로부터 활성 항-IgE 재구성 사람 항체를 회수함을 포함하여, 다중쇄 항-IgE 재구성 사람 항체를 제조하는 방법을 제공하고 있다. 이러한 관점에서, 활성 항체는 IgE에 특이적으로 결합하는 항체를 말한다. 다중쇄 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원-결합 부위를 하나 이상 함유하는 항체이다.
선택적으로, 중쇄 및 경쇄는 시험관내에서 폴딩시킨 후에 별도로 회수하여 활성 항체로 재구성할 수 있다. 적절한 재구성 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 다중쇄 항체를 제조하기 위한 방법은 또한, (1) 본 발명의 제1 DNA 작제물로 형질전환시킨 제1 숙주 세포를 배양하고 배양물로부터의 중쇄 또는 이의 단편을 회수하고, (2) 본 발명의 제2 DNA 작제물로 형질전환시킨 제2 숙주 세포를 배양하고 배양물로부터 경쇄 또는 이의 단편을 회수하며, (3) (1)에서 수득한 중쇄 또는 이의 단편 및 (2)에서 수득한 경쇄 및 이의 단편으로부터 활성 항-IgE 재구성 항체를 시험관내에서 재구성함을 포함할 수 있다.
유사한 방법으로, (1) 본 발명의 단쇄 또는 단일 도메인 재구성 사람 항체를 암호화하는 DNA 작제물로 각각 형질전환시킨 숙주 세포를 배양하고, (2) 배양물로 부터 폴리펩타이드를 회수함을 포함하는, 본 발명의 단쇄 또는 단일 도메인 재구성 사람 항체의 제조방법이 제공된다.
재구성 사람 항체의 단편, 예를 들어 Fab, Fab' 또는 F(ab')2단편은 상술한 바와 같은 재조합 DNA 기술로 제조할 수 있거나, 또는 공지된 방법, 예를 들어 파파인 또는 펩신과 같은 효소를 사용한 분해 및/또는 화학적 환원에 의해 디설파이드 결합의 절단으로 상기한 바와 같이 작제한 완전한 다중쇄 재구성 사람 항체로부터 제조할 수 있다.
적절한 숙주 세포에는 진핵세포(예: 동물, 식물 및 진균 세포) 및 그람-양성 및 그람-음성 세균(예: 이. 콜라이)이 포함되며, 바람직한 진핵 숙주 세포는 포유 동물류 기원 세포 및 효모 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, 시험관내란 생체외를 의미하며, 세포 배양 및 조직 배양 조건을 포함한다.
예를 들어, 시험관내 포유동물 세포를 적절한 배양 배지중에서 증식시키는데, 이는 임의로 포유동물 혈청(예: 태 송아지 혈청) 또는 미량 원소 및 성장 유지 보조제(예: 정상 마우스 복강 삼출성 세포, 지라 세포, 골수 대식세포와 같은 공급 세포, 2-아미노에탄올, 인슐린, 트렌스페린, 저밀도 지단백질, 올레산 등)를 보충한, 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM) 또는 RPMI 1640 배지와 같은 통상의 표준 배양 배지이다.
시험관내 제조는 비교적 순수한 항체 제제를 제공하며 목적하는 항체를 대량으로 제조하기 위해 규모를 증가시킬 수 있다. 세균 세포, 효모 및 포유동물 세포 배양 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 폭기 반응기 또는 연속 교반 반응기중의 균질한 현탁 배양, 또는 예를 들어 아가로스 미세비이드 또는 세라믹 카트리지 상의 공동(hollow) 섬유, 미세캡슐중에 고정 또는 포획 세포 배양 등이 포함된다.
본 발명의 목적하는 재구성 사람 항체는 또한 포유동물 세포를 생체내에서 증식시켜 대량으로 제조할 수도 있다. 이러한 목적으로, 목적하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 조직적합 포유동물에 주입시켜 항체-생성 종양의 성장을 유발시킨다. 임의로, 주입 전에 동물에 탄화수소, 특히 프리스탄(태트라메틸 펜타데칸)과 같은 광유를 주입한다. 1 내지 3주후, 항체를 포유동물 체액으로부터 분리한다. 예를 들어, 목적하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 Sp2/0으로부터 유래하는 형질감염된 세포를, 임의로 프리스탄으로 전처리한 Balb/c 마우스 복강내로 주사하고, 1 내지 2주후 동물로부터 복수액을 채취한다.
세포 배양 상층액은, 항원으로서 사람 IgE를 사용하여, 바람직하게는 효소면역분석(예: 샌드위치 분석 또는 도트-분석) 또는 방사선면역분석으로 목적하는 재구성 사람 항체에 대해 스크리닝한다. 예를 들어, 샌드위치 효소 면역분석은 정확하게 어셈블링된 면역글로불린이 세포 배양 상층액중에 존재하는지를 결정하여 이로써 사람 경쇄 불변 영역 λ 또는 κ(적절하다면)에 대한 항체 및 중쇄 사람 불변 영역에 대한 다른 항체(예: 목적하는 아부류의 g)가 사용되었는지를 결정하는데 사용할 수 있으며, 이들 항체중 하나는 고상 지지체에 피복되어 있고 다른 하나는 효소와 접합되어 있어 적절한 효소 기질 검출을 가능하게 한다. 이와 같은 면역분석은, 예를 들어 효소-결합 면역흡착분석(ELISA)이며, 이때 적절한 담체(예: 플라스틱 미세역가 플레이트)는 면역글로불린 E로 피복시키고 시험할 배양 상층액과 배양한다. 결합된 모노클로날 항체는 상층액중에서 항-IgE 항체를 인지하는 효소-표지된 항체와 배양한 다음, 적절한 효소 기질 용액을 가하여 검출한다. 이 효소 기질 반응으로, 예를 들어 눈으로 관찰할 수 있거나 광학 측정 장치로 확인할 수 있는 색깔 변화가 나타난다.
재구성 사람 항체를 분리하기 위해, 배양 상층액 또는 복수액중의 면역글로불린은, 황산알루미늄을 사용한 침전, PEG와 같은 흡수성 물질에 대한 투석, 선택성 막을 통한 여과 등으로 농축할 수 있다. 필요에 따라, 항체는 통상적인 크로마토그래피법, 예를 들어, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피(예: 면역친화성 크로마토그래피)로 정제한다. 바람직하게는, 재구성 사람 항체는, 이 항체를 함유하는 세포 상층액으로부터 크로마토그래피적 정제 단계, 예를 들어 단백질 A를 사용하는 친화성 크로마토그래피(본 발명의 항체가 Fc부를 함유하는 경우), 이온-교환 크로마토그래피 및/또는 겔 여과를 포함하는 방법으로 분리한다.
본 발명의 재구성 사람 항체 유도체는 공지된 방법, 예를 들어, 재구성 사람 항체를 다른 화합물에 흡착시키거나 커플링시켜 제조하여 화학적으로 결합된 접합체를 제공할 수 있다. 단백질(예: 효소)과 본 발명의 항체와의 접합체는, 상기한 바와 같이 제조한 항체를 커플링제, 예를 들어 글루타르알데하이드, 과요오드화물, N,N'-o-페닐렌디말레이미드, N-(m-말레이미도벤조일옥시)-숙신이미드, N-(3-[2'-피리딜티오]-프로피온옥시)-숙신이미드, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 등의 존재하에 단백질과 반응시켜 제조한다. 바이오틴과의 접합체는, 예를 들어, 항체를 활성화시킨 바이오틴의 에스테르(예: 바이오틴 N-하이드록시-숙신이미드 에스테르)와 반응시켜 제조한다. 형광성 또는 화학발광성 마커와의 접합체는, 예를 들어 상술한 것과 같은 커플링제의 존재하에 제조하거나, 이소티오시아네이트, 바람직하게는 플루오레세인-이소티오시아네이트와 반응시켜 제조한다.
요오드(123I,125I,131I)로 방사능 표지한 재구성 항체는, 공지된 방법 자체, 예를 들어, 방사능 요오드화나트륨 또는 요오드화칼륨 및 화학적 산화제(예: 차아염소산나트륨, 클로르아민 T 등) 또는 효소적 산화제(예: 락토퍼옥시다제 또는 글루코스 옥시다제) 및 글루코스를 사용하여 요오드화시켜 본 발명의 항체로부터 수득한다. 본 발명의 항체 또는 단편은, 예를 들어 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DPTA)-킬레이트화로 이트륨(90Y)과 커플링시킨다. 테크네튬-99m 표지한 항체 또는 단편은, 리간드 교환 방법, 예를 들어, 퍼테크네이트(TcO4 -)를 주석산 이온 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 칼럼상에서 킬레이트화시키고 이 칼럼에 항체를 적용시키거나, 또는 예를 들어 퍼테크네이트, 환원제(예: SnCl2), 완충 용액(예: 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액) 및 본 발명의 항체를 배양하여 직접 표지화시키는 기술로 제조할 수 있다.
단백질에 대한 본 발명 항체의 접합체는, 또한 예를 들어 하기하는 바와 같은 재조합 DNA 기술로 직접 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 재구성 사람 항체, 직접적인 등가물 또는 유도체의 제조방법은 친화도 및 특이성을 측정하기에 충분한 양으로 목적하는 단백질을 생성해야만 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 재구성 사람 항체 및 이의 직접적인 등가물을 암호화하는 재조합 DNA에 관한 것이다. 매우 일반적인 방법에서, 본 발명의 단일 도메인 재구성 사람 항체를 암호화하는 DNA 분자, 본 발명의 단쇄 재구성 사람 항체 및 본 발명의 재구성 사람 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 단편이 제공된다. 정의에 따르면, 이와 같은 DNA는 일본쇄 DNA, 이러한 암호화 DNA 및 이에 대한 상보적 DNA로 구성된 이본쇄 DNA, 또는 이의 상보적(단일쇄) DNA 자체를 포함한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 하기에는 바와 같은 제1 및 제2 DNA 작제물에 관한 것이다.
제1 DNA 작제물은 중쇄 또는 이의 단편을 암호화하며, a) 교대로 FR과 CDR을 포함하는 가변 영역을 암호화하는 제1 부분(여기에서, CDR은 CDR1H, CDR2H및 CDR3H의 순서이고 서열 1중의 이의 아미노산 서열은 각각 위치 13 내지 35, 50 내지 66 및 99 내지 112에 걸쳐 있으며, 제1 부분는 가변 도메인의 제1 아미노산을 암호화하는 코돈으로 시작하여 가변 도메인의 최종 아미노산을 암호화하는 코돈으로 종결된다) 및 임의로, b) 중쇄의 불변 부분의 제1 아미노산을 암호화하는 코돈으로 시작하고 불변 부분 또는 이의 단편의 최종 아미노산을 암호화하는 코돈으로 종결되는, 사람 중쇄 불변 부분 또는 이의 단편을 암호화하는 제2 부분을 포함한다. 바람직하게는, 이 제1 부분은, 서열 13의 아미노산 위치 1에서 시작하고 아미노산 위치 123에서 종결되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 암호화한다. 보다 바람직하게는, 제1 부분은 서열 13의 뉴클레오타이드 위치 79에서 시작하여 뉴클레오타이드 위치 447에서 종결되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 제2 부분은 게놈 기원의 DNA 단편(인트론 포함) 또는 cDNA 단편(인트론 없음)일 수 있다. 제2 부분이 존재한다면, gl 쇄의 불변 부분을 암호화하는 제2 부분이 바람직하다.
제2 DNA 작제물은 경쇄 또는 이의 단편을 암호화하며, a) 교대로 FR과 CDR을 포함하는 가변 도메인을 암호화하는 제1 부분(여기에서, CDR은 CDR1L, CDR2L및 CDR3L의 순서이고 서열 3에서 이의 아미노산 서열은 각각 위치 24 내지 34, 50 내지 56 및 89 내지 97에 걸쳐 있으며, 제1 부분은 가변 도메인의 제1 아미노산을 암호화하는 코돈으로 시작하고 가변 도메인의 최종 아미노산을 암호화하는 코돈으로 종결된다) 및 임의로, b) 경쇄의 불변 부분의 제1 아미노산을 암호화하는 코돈으로 시작하고 불변 부분 또는 이의 단편의 최종 아미노산을 암호화하는 코돈으로 종결되며, 이 다음에 넌센스 코돈이 있는 사람 경쇄 불변 부분 또는 이의 단편을 암호화하는 제2 부분을 포함한다. 바람직하게는, 이 제1 부분은, 서열 5에 나타낸 아미노산 위치 1에서 시작하고 아미노산 위치 107에서 종결되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 암호화한다. 보다 바람직하게는, 제1 부분은 서열 5에 나타낸 뉴클레오타이드 위치 82에서 시작하여 뉴클레오타이드 위치 403에서 종결되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 제2 부분은 게놈 기원의 DNA 단편(인트론 포함) 또는 cDNA 단편(인트론 없음)일 수 있다. 제2 부분이 존재한다면, κ 쇄의 불변 부분을 암호화하는 제2 부분이 바람직하다.
제1 및 제2 부분을 모두 포함하는 제1 및 제2 DNA 작제물이 바람직하다. 이경우, 제1 및 제2 부분은 인트론 서열에 의해 분리될 수 있다.
유리하게도, 제1 및 제2 DNA 작제물은, 제1 부분의 상부스트림에 위치해 있으며 리더(leader) 펩타이드를 암호화하는 제3 부분을 포함하는데, 이 제3 부분은 리더 펩타이드의 제1 아미노산을 암호화하는 코돈으로 출발하고 최종 아미노산을 암호화하는 코돈으로 종결된다. 적절한 리더 펩타이드는, 숙주내에서 발현되고 종국적으로 숙주에 의해 제거되는, 숙주 유기체에 의한 쇄 분비가 요구되는 펩타이드이다. 바람직하게는, 제1 및 제2 DNA 작제물의 제3 부분은 면역글로불린 유전자의 리더 펩타이드를 암호화한다. 가장 바람직하게는, 제1 DNA 작제물의 제3 부분은 서열 13에 나타낸 서열의 아미노산 위치 -19에서 시작하여 아미노산 위치 -1에서 종결되는 서열과 실질적으로 동일한 아미노산을 갖는 리더 펩타이드를 암호화한다. 또한, 가장 바람직하게는, 제2 DNA 작제물의 제3 부분은, 서열 5에 나타낸 아미노산 위치 -20에서 출발하고 아미노산 위치 -1에서 종결되는 서열과 실질적으로 동일한 아미노산을 갖는 리더 펩타이드를 암호화한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재구성 사람 항체의 직접적인 등가물 및 본 발명 항체의 단백질에 대한 접합체를 암호화하는 재조합 DNA에 관한 것이다.
당해 분야의 현재 상태는, 당해 분야의 일반적인 숙련가라면, 본원에 제공되어 있는 소정의 정보, 즉, CDR의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 DNA 서열(서열 1 내지 3)로부터 본 발명의 아미노산 서열을 합성할 수 있을 것이다. 본 발명의 재구성 사람 항체의 가변 도메인을 암호화하는 DNA 작제물을 수득하기 위한 적절한 방법은 다수의 올리고뉴클레오타이드 합성, PCR법에 의한 이의 증폭 및 이를 스플라이싱(splicing)시켜 목적하는 DNA 서열을 제공함을 포함한다.
가변 도메인 유전자를 작제하기 위한 다른 방법은
- 어떠한 특이성이라도 갖는 사람 모노클로날 항체를 암호화하는 유전자 클로닝,
- FR 및 CDR을 암호화하는 DNA 단편 결정,
- CDR을 암호화하는 DNA 단편을 제거함으로써, FR을 암호화하는 DNA 단편을 접합점에서 적절한 제한 부위와 함께 융합,
- 스티키 말단(sticky end)을 갖는, 상기 동정된 서열 1 내지 3에 따른 이본쇄 합성 CDR 카세트 제조,
- FR의 접합점에 카세트 연결[참조: 유럽 특허원 제239,400호]을 포함한다.
필요할 경우, 본 발명의 DNA 작제물을 널리 공지된 다수의 표준 방법, 예를 들어 랜덤 돌연변이 유도 또는 위치-지정 돌연변이유발에 의해 돌연변이시킬 수 있다. 본 발명의 재구성 사람 항체를 암호화하는 DNA 작제물에서, 돌연변이유발이 CDR내에 위치한 어떠한 아미노산의 변화도 유발시키지 않을 수 있다. 본 발명의 재구성 항체의 직접적인 등가물을 암호화하는 DNA 작제물에서, 하나의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 치환시키는 것이 하나 이상의 CDR내의 아미노산 서열을 변화시킬 수도 있다.
본 발명의 재구성 항체의 직접적인 등가물을 암호화하는 DNA는 당해분야에 공지된 방법, 예를 들어, 본 발명에 따른 재구성 항체를 암호화하는 DNA의 랜덤 돌연변이유발 또는 위치-지정 돌연변이유발로 제조할 수 있다. 침묵 돌연변이가 아니고, CDR내에 위치한 하나 이상의 아미노산 잔기의 대체로 나타나는 돌연변이는, 이로써 제조하는 단백질이 상기 언급한 기준에 부합되면 본 발명의 재구성 항체의 직접적인 등가물을 암호화하는 DNA를 생성할 수 있다.
다음에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 재구성 사람 항체는 이의 직접적인 등가물을 포함함을 의미한다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 상기 DNA 작제물, 예를 들어 경쇄 가변 도메인 및/또는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 삽입체를 포함하는 하이브리드 벡터인 재조합 DNA에 관한 것이며, 이때 벡터는 원핵 및/또는 진핵 숙주에서 복제 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 하이브리드 벡터는 전술한 바와 같은 경쇄를 암호화하는 삽입체 및/또는 전술한 바와 같은 중쇄를 암호화하는 삽입체를 포함한다.
본 발명의 하이브리드 벡터는 복제 오리진 또는 자발적으로 복제되는 서열, 하나 이상의 우성 마커 서열 및, 임의의 발현 조절 서열, 시그날 서열 및 추가의 제한 부위를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 하이브리드 벡터는, 특히 이후에 기술될 발현 조절 서열에 작동가능하게 결합시킨 상기 기술한 삽입체를 포함한다.
벡터는 전형적으로 친화성 숙주 세포와 협력하여 2가지 기능을 수행한다. 그 하나의 기능은 면역글로불린 쇄를 암호화하는 핵산 클로닝을 용이하게 하는 것, 다시 말해서, 유용한 양의 핵산(클로닝 벡터)을 생성하는 것이다. 다른 기능은 적절한 숙주 중에서 염색체외의 요소로서 유지하거나 또는 숙주 염색체에 통합시켜 유전자 작제물의 복제 및 발현을 제공하는 것이다(발현 벡터). 클로닝 벡터는 상기한 바와 같은 유전자 작제물, 복제 오리진 또는 자발적으로 복제되는 서열, 선별성 마커 서열 및, 임의로 추가의 제한 부위를 포함한다. 발현 벡터는 유전자의 전사와 해독에 필수적인 발현 조절 서열을 추가로 포함한다.
복제 오리진 또는 자발적으로 복제되는 서열은 원숭이 바이러스 40(SV 40)으로부터 유래된 것과 같은 왜래 기원을 포함하도록 벡터를 작제하여 제공하거나 또는 숙주 세포 염색체 기전에 의해 제공할 수 있다.
마커는 벡터를 포함하는 숙주 세포의 선별을 가능케한다. 선별 마커는 구리와 같은 중금속 또는 테트라사이클린, 암피실린, 케네티신(G-418), 네오마이신, 카나마이신 또는 하이그로마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자, 또는 티미딘 키나제, 하이크산틴 포스포릴 트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제 등이 없는 숙주 세포의 유전적 장애를 보충해주는 유전자를 포함한다.
시그날 서열은, 예를 들어, 항체, 스플라이싱 시그날 등의 분비를 지시하는 리더 펩타이드를 암호화하는 프리서열(presequence) 또는 분비 리더일 수 있다.
발현 조절 서열로서, 벡터 DNA는 프로모터, 전사의 개시 및 종료와 mRNA의 안정화에 필요한 서열, 임의의 인핸서 및 추가의 조절 서열을 포함한다. 숙주 세포의 특성에 따라서, 다양한 프로모터 서열이 사용될 수 있다. 강력하면서 동시에 조절이 용이한 프로모터가 가장 유용하다. 해독 개시를 위한 서열은, 예를 들어 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열이다. 전사의 개시와 종료 및 mRNA 안정화에 필요한 서열은 일반적으로 각각 바이러스 또는 진핵 cDNA(예를 들어, 발현 숙주로부터의 것)의 비암호화 5'-영역 및 3'-영역으로부터 수득할 수 있다. 인핸서는, 예를 들어, 원숭이 바이러스, 폴리오마 바이러스, 소 유두종 바이러스, 몰로니(Moloney) 바이러스, 또는 특히 사람 사이토메갈로 바이러스로부터 유래한 게놈 또는 바이러스 기원의 전사-촉진 DNA 서열이다.
벡터 DNA의 다양한 DNA 단편을 작동가능하게 결합시키는데, 다시말해서 이들이 인접하고 상호간에 기능적 관련을 갖도록 위치시킨다.
이. 콜라이 균주에서 복제시키고 발현시키기에 적합한 벡터의 예로는 박테리오파아지, 예를 들어 λ 박테리오파아지의 유도체 또는 플라스미드가 있다. 적절한 벡터는 완전한 리플리콘(replicon), 마커 유전자, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 서열 등을 포함하며, 외래 DNA 및 필요할 경우, 발현 조절 서열을 상기한 위치에 삽입시킬 수 있으며, 임의로 시그날 서열 및 인핸서에 삽입시킬 수도 있다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 상기 정의한 바와 같은 적절한 프로모터 및 DNA 작제물을 포함하는 발현 카세트를 포함하며, 이때 DNA는 상기 프로모터로 조절된다.
예를 들어, 미생물 프로모터는 온도 민감성 리프레서에 의해 조절되는 강력한 좌향성의 박테리오파아지 λ의 프로모터 PL이다. 또한 적절한 것은 lac 리프레서로 조절되고 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드로 유발되는 lac(락토스) 프로모터와 같은 이. 콜라이 프로모터, trp 리프레서로 조절되고, 예를 들어 트립토판 고갈로 유발되는 trp(트립토판) 프로모터 및 lac 리프레서로 조절되는 tac(하이브리드 trp-lac 프로모터) 이다.
효모에서 복제시키고 발현시키에 적합한 벡터는 효모 복제 출발점 및 효모에 대한 선별성 유전자 마커를 포함한다. 이러한 벡터의 한 그룹은 복제 오리진으로서 소위 ars 서열(자발적 복제 서열: autonomous replication sequence)을 포함한다. 이들 벡터들은 형질전환 후에 효모 세포내에 염색체외적으로 보유되고 자발적으로 복제된다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 2μ(2마이크론) 플라스미드 DNA 전체 또는 일부를 함유하는 벡터가 사용될 수도 있다. 이와 같은 벡터는 세포내에 이미 존재하는 2μ 의 플라스미드와 재조합되어 통합되거나 또는 자발적으로 복제한다. 2μ의 서열은 특히 형질전환 빈도가 높고 다수의 복제수가 성취되어야할때 적합하다.
효모내에서 발현시키에 적합한 발현 조절 서열은, 예를 들어, 고도로 발현된 효모 유전자의 서열이다. 따라서, TRP1 유전자, ADHI 또는 ADHII 유전자, 산 포스파타제(PH03 또는 PH05) 유전자, 이소사이토크롬 유전자에 대한 프로모터, 또는 당분해 경로에 관련된 프로모터(예: 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 키나제(PGK), 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제 유전자의 프로모터)가 사용될 수 있다.
포유동물 숙주 세포에 적합한 프로모터는 사람 면역글로블린 유전자 또는 바이러스, 예를 들어, 원숭이 바이러스 40(SV 40), 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV), 아데노바이러스 2, 소 유두종 바이러스(BPV), 파포바바이러스 BK 돌연변이체(BKV), 또는 마우스 또는 사람 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터 수득할 수 있다. 사람 CMV 프로모터가 바람직하다. 선택적으로, 벡터는 예를 들어 액틴, 콜라겐, 마이오신 등과 같은 포유동물 발현 생성물로부터의 프로모터, 또는 일반적으로 면역글로불린 유전자 서열과 관련된 천연 프로모터 및 조절 서열을 포함할 수도 있다.
벡터는 원핵 또는 진핵 숙주 모두에 적합할 수 있다. 일단 본 발명의 DNA 분자가 제조되면, 이를 적절한 발현 벡터내로 통상적으로 이전시킬 수 있다. 적절한 프로모터 또는 중쇄 또는 경쇄 불변 부분을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터는 입수 용이하다.
경쇄 및 중쇄에 대한 유전자 작제물은 순차적으로 또는 동시에 두 벡터의 도움을 받아 숙주 세포내로 이전시킨다. 선택적으로, 중쇄 및 경쇄 모두를 동일한 하이브리드 벡터내로 클로닝하고 단일 작제물로서 1단계 방법으로 숙주 세포내로 혼입시킨다. 제3의 또다른 방법은 결합되지 않은 DNA 단편을 함께 형질감염시키는 것이다.
목적하는 재구성 사람 항체를 암호화하는 재조합 DNA는, 예를 들어 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 제조할 수 있다.
특히, 이와 같은 DNA는,
a) IgE에 대해 특이적인 재구성 사람 항체의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 DNA를 제조하고;
b) 예를 들어, 게놈 라이브러리로부터 DNA를 분리하고 DNA 프로브를 사용하여 상기 불변 영역을 암호화하는 목적하는 DNA를 선별함으로써 사람 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA를 제조하며;
c) 단계 a)의 DNA 또는 단계 a)와 b)의 DNA를 적절한 하이브리드 벡터로 혼입시키고;
d) 이로써 수득된 하이브리드 벡터를 수용체 숙주 세포내로 이전시키거나, 또는 목적하는 유전자를 암호화하는 DNA를 수거하고 결합되지 않은 DNA를 적절한 수용체 숙주 세포로 이전시키며;
e) 형질전환된 숙주 세포를 선별 및 배양하고; 임의로
f) 목적하는 DNA를 분리함을 포함하는 방법으로 제조할 수 있다.
상기 기술한 방법의 단계 b)에 따른 게놈성 사람 DNA는, 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 적절한 사람 조직, 바람직하게는 사람 태반 또는 사람 태아 간 세포로부터 분리한다. 게놈성 DNA 라이브러리는 확립된 방법에 따라 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 한정된 분해로 작제한다. 이러한 게놈성 DNA 라이브러리는, 예를 들어 니트로셀룰로스 막상에 복제되며, 문제의 DNA 서열에 대한 DNA 프로브를 사용하여 이를 스크리닝한다. 목적하는 DNA는 PCR 기술을 사용하여 증폭시킬 수 있다.
재조합 DNA의 이전, 예를 들어 하이브리드 벡터의 이전 및 형질전환 세포의 선별은 다음에서 기술한다.
또한, 본 발명은 상기 기술한 재조합 DNA로 형질전환시킨 적절한 숙주 세포, 즉, 본 발명의 목적하는 재구성 사람 항체의 경쇄를 암호화하는 DNA 및/또는 중쇄를 암호화하는 DNA로 형질전환시킨 숙주 세포에 관한 것이다. 세포당 다수의 벡터 복제물을 함유하는 숙주 세포가 바람직하다.
본 발명의 숙주 세포는 시험관내 배양이 가능하다. 적절한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 기원일 수 있고, 세균 세포, 특히, 이. 콜라이, 효모(예: 사카로마이세스 세레비지애) 또는 포유동물 세포를 포함한다. 기능적인 4량체 항체 제조에 적합한 환경을 제공하기 위해, 진핵 숙주 세포, 특히 포유동물 또는 효모 기원의 세포가 바람직한데, 이는 기능적인 4량체 항체 분자의 생합성이 정확한 신생 폴리 펩타이드 쇄 폴딩 및 어셈블리를 필요로하기 때문이다. 원핵 숙주, 특히, 이. 콜라이를 본 발명의 항체 단편, 예를 들어 Fab- 및 Fv-단편을 제조하는데 사용할 수 있다.
적절한 숙주의 예는 제한 또는 변형 효소가 없거나 빈약한 미생물, 예를 들어, 세균, 특히, 이. 콜라이 균주 및 효모(예: 사카로마이세스 세레비지애)이다.
본 발명에 따른 바람직한 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, COS-7 세포, 보우스(Bowes) 흑색종 세포, 차이니스 헴스터 난소(CHO) 세포, 배아 폐 세포 L-132 및 림프양 기원의 포유동물 세포(예: 림프종, 골수종, 하이브리도마, 트리오마(trioma) 또는 쿼드로마(quadroma) 세포) 등이다. 가장 바람직한 것은 마우스 골수종 NSO 세포이다.
이들 숙주 세포들은, 두개의 개별적인 벡터의 도움으로 순차적으로 또는 동시에, 또는 전술한 바와 같은 이중-작제물(L-쇄/H-쇄) 벡터를 사용하는 1단계 방법으로, 경(L)쇄-유전자 작제물 단독 또는 중(H-)쇄-유전자 작제물 단독, 또는 두가지 모두를 사용하여 형질감염시킨다. 다른 방법에서, 결합되지 않은 유전자 작제물을 순차적으로 또는 동시에 숙주 세포내로 형질감염시킬 수 있다.
바람직한 것은, 숙주 세포를 전술한 바와 같은 재구성 사람 항체를 분비하는 두 유전자 작제물 모두로 형질감염시킨 것, 특히 세포주 EH 31.8이다. 본 발명의 숙주 세포의 추가의 예로는, 본 발명의 항체가 고도로 발현하는 것을 촉진시키기 위해 추가의 DNA 요소를 혼입시킨, H- 및 L-쇄 유전자 작제물의 엇갈리는 배향을 함유하는 유사한 재조합 플라스미드로 형질감염시킨 세포이다.
본 발명의 숙주 세포는 유전적으로 안정하고, 일정 특이성의 본 발명의 재구성 사람 항체를 제조하고 바람직하게는 분비하며, 해동 및 재클로닝으로 급냉동 배양물로부터 활성화시킬 수 있다.
형질전환 숙주 세포는 당해 분야에 공지된 방법으로 동화가능한 탄소원(예: 글루코스 또는 락토오스와 같은 탄수화물), 질소원(예: 아미노산, 펩타이드, 단백질 또는 이의 분해 생성물, 예를 들어, 펩톤, 암모늄염 등) 및 무기염(예: 황산, 인산 및/또는 탄산 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘을 함유하는 액체 배지중에서 배양할 수 있다. 배지는 추가로, 예를 들어 성장-촉진 성분, 예를 들어, 철, 아연, 망간 등과 같은 미량 원소를 함유한다.
배지는 선별 압력을 가하거나, 형질전환되지 않았거나 하이브리드 벡터를 상실한 세포의 성장을 억제하도록 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 예를 들어 하이브리드 벡터가 마커로서 항생제 내성 유전자를 함유한 경우, 배지에 항생제를 가한다. 예를 들어, 숙주 세포가 필수 아미노산에 대해 영양요구성이지만 하이브리드 벡터가 숙주의 결점을 보완할 수 있는 효소를 암호화하는 유전자를 함유한다면, 형질전환 세포를 배양하는데 상기 아미노산이 결핍된 최소 배지를 사용한다.
배양은 당해 분야에 공지된 방법으로 수행한다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, 배지의 pH 및 발효 시간은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 유도체의 체내 역가가 수득되도록 선택한다. 따라서, 이. 콜라이 또는 효모 균주는, 호기성 조건하에 바람직하게는 약 20 내지 40℃, 바람직하게는 약 30℃에서 4 내지 8의 pH, 바람직하게는 약 pH 7에서, 약 4 내지 30시간 동안, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 유도체의 최대 수율에 도달될 때까지, 진탕시키거나 교반시키면서 침지 배양시켜 배양한다.
세포 밀도가 충분한 값에 도달하게 되면, 배양을 중지시키고 폴리펩타이드 또는 유도체를 분리할 수 있다. 만일 하이브리드 벡터가 적절한 분비 시그날 서열을 함유한다면, 폴리펩타이드 또는 유도체는 형질전환 세포에 의해 배양 배지내로 직접 분비된다. 다르게는, 예를 들어 SDS, NP-40TM, 트리톤TM또는 데옥시콜산과 같은 세정제로 처리하여 세포를 파괴하고 라이소자임 또는 유사 작용 효소로 용해시키거나, 삼투압성 쇼크 또는 초음파로 파괴시킨다. 만일 목적하는 단백질이 주변 세포질로 분비되도록 시그날 서열이 지시한다면, 세포의 파괴가 요구될 수도 있다. 숙주 미생물로서 효모가 사용된다면, 세포 벽은 글루코시다제를 사용하여 효소적으로 분해시켜 제거할 수 있다. 선택적으로 또는 추가로, 세포를 파괴하기 위해 전단력(예: 프렌치프레스(French press), 다이노 밀(Dyno mill) 등) 또는 유리 비이드 또는 산화알루미늄과의 진탕과 같은 물리적인 힘, 또는 교대 냉각(예를 들어 액체 질소내에서) 및 해동(30℃ 내지 40℃에서)뿐만 아니라 초음파와 같은 방법이 사용될 수 있다.
세포 파괴후 수득한 혼합물을 원심분리한 후, 수득된 세포 상층액 또는 용액(이는 단백질, 핵산 및 기타 세포 구성성분을 함유)은 자체가 공지된 방법에 의해 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 단백질에 대해 농축시킨다. 따라서, 예를 들어 대부분의 비-단백질성 성분들은 폴리에틸렌이민 처리로 제거할 수 있으며, 본 발명의 폴리펩타이드 및 유도체를 포함하는 단백질은 상기 기술한 방법으로 분리한다.
본 발명은 또한, 전술한 바와 같은 적절한 수용체 숙주 세포를 본 발명에 따른 1개 또는 2개의 벡터로 형질전환시키고 형질전환된 세포를 선택함을 특징으로 하여, 형질전환 숙주 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
미생물의 형질전환은 문헌에 기술된 바와 같이, 예를 들어 에스. 세레비지애[참조: A. Hinnen et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 75; 1929, 1978] 및 이. 콜라이[참조: M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53; 159, 1970]에 대해 수행한다.
따라서, 이. 콜라이 세포의 형질전환 방법은, 예를 들어, DNA 흡수가 일어나도록 세포를 Ca2+로 전처리하고 이를 하이브리드 벡터와 배양함을 포함한다. 이후의 형질전환된 세포의 선별은, 예를 들어, 세포를 벡터 DNA의 마커 서열 특성에 따라, 모 세포로부터 형질전환세포를 분리시킬 수 있는 선별 성장 배지에 이전시켜 수행한다. 바람직하게는, 벡터를 함유하지 않는 세포의 성장을 허용하지 않는 성장 배지가 사용된다. 효모의 형질전환은, 예를 들어, 글루코시다제로 효모 세포벽을 효소적으로 제거하는 단계, 수득된 스페로플라스트를 폴리에틸렌 글리콜 및 Ca2+이온 존재하에 벡터로 처리하는 단계, 스페로플라스트를 한천중에 함침시켜 세포 벽을 재생시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 재생 한천은 전술한 바와 같이 형질전환된 세포의 재생 및 선별을 동시에 허용하는 방식으로 제조한다.
포유동물 세포주와 같은 고등 진핵생물 기원 세포의 형질전환은 바람직하게는 형질감염에 의해 수행한다. 형질감염은 통상적인 기술, 즉 인산칼슘 침전, 세포핵내로의 미세주입, 원형질체 융합, 전기천공, 즉, 세포막의 투과성을 일시적으로 증가시키는 짧은 전기적 펄스에 의한 DNA 도입 등으로 수행한다. 형질감염은 헬퍼(helper) 화합물(예: 디에틸아미노에틸덱스트란, 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 등)의 존재하에 또는 벡터 DNA와 인산칼슘의 동시침전으로 수행할 수 있다.
형질감염 과정후, 형질감염된 세포는 형질감염에 사용된 DNA의 선별 마커와 매칭시키는 선별 방법의 도움으로 동정하고 선별한다. 선별 마커로는 중금속(예: 구리) 또는 항생제(예: G-418(제네티신, 네오마이신 유도체) 또는 하이그로마이신)에 대한 내성을 부여하는 유전자, 또는 티미딘 키나제, 하이포크산틴 포스포라이보실 트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제 등의 부재와 같은 숙주 세포의 유전적 장애를 보충하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, 형질감염용으로 사용된 DNA가 제네티신 내성에 대한 마커를 포함한다면, 형질전환 세포를 항생제 제네티신의 존재하에 배양시켜 형질전환되지 않은 세포로부터 동정하고 분리한다.
본 발명에 따른 재구성 사람 항체 또는 이의 유도체는 시험관내 및 생체내에서 특히 체액, 예를 들어 혈청중에서 IgE를 정량적 및 정성적으로 측정하는데 유용하다.
예를 들어, 재구성 사람 항체 또는 이의 유도체는 IgE의 항원 결정기와 상기 항체의 파라토프(paratope)간 결합 상호작용에 의존하는, 임의의 공지된 면역분석에 사용될 수 있다. 이러한 검정의 예로는 방사선면역분석(RIA), 효소, 면역형광, 화학발광, 면역침전, 라텍스 응집 또는 헤마글루틴화 면역분석이 있다.
본 발명에 따른 재구성 사람 항체는 그 자체로서 사용하거나 방사선면역분석(RIA)중에 방사능 표지된 유도체 형태로 사용할 수 있다. 공지된 임의의 RIA의 변형, 예를 들어, 가용성 상(균질성) RIA, 고체 상(비균질성) RIA, 직접적 또는 간접적(경쟁적)으로 IgE를 측정하는 단일 RIA 또는 이중(샌드위치) RIA가 사용될 수 있다.
이와 같은 방사선면역분석의 예는 샌드위치 RIA인데, 여기에서, 적절한 담체, 예를 들어 미세역가 플레이트 또는 시험관의 가요성 표면(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌 또는 폴리비닐클로라이드, 유리 또는 플라스틱 비이드, 필터 페이퍼, 덱스트란 등, 셀룰로스 아세테이트 또는 니트로셀룰로스 시트, 마그네틱 입자 등)의 플라스틱 표면은, 본 발명의 항체를 단순히 흡착시켜 피복시키거나 임의로 담체를 활성화시킨 후에 본 발명의 항체로 피복시킨다. 이어서, IgE 및 항체와 반응하고, 예를 들어125I로 방사능 표지시킨 최종적인 재구성 항체를 포함하는 시험 용액을 가한다. 시험 용액중 IgE의 양은 결합된 재구성 항체의 양에 직접적으로 비례하며, 이의 양은 담체에 결합한 방사능을 측정함으로써 결정한다.
본 발명에 따른 사람 재구성 항체는 그 자체로 사용할 수 있거나 또는 효소 면역분석중에서 효소-접합 유도체 형태로 사용할 수 있다. 방사선면역분석에 대해 상기 기술한 바와 같이, 효소 면역분석의 공지된 어떠한 변형도 사용될 수 있다.
이 시험은 방사능 표지 대신에 효소 표지를 사용하여 상기 기술한 방사선면 역분석과 유사한 방법으로 수행한다. 시험 용액중에 존재하는 IgE의 양에 상응하는, 형성된 면역복합체의 양은 효소 기질 용액을 가하여 측정한다. 이 효소 기질 반응은, 예를 들어, 나안이나 광학 측정 장치로 측정할 수 있는 색변화로 나타난다.
본 발명에 따른 재구성 항체는 그 자체로 사용할 수 있거나 또는 화학발광분석중에서 화학발광성 마커와 접합된 유도체 형태로 사용할 수 있다. 방사선면역분석에 대해 상기 기술한 바와 같이, 화학발광 분석에 대한 공지된 어떠한 변형도 사용할 수 있다.
이 시험은 방사능 표지 대신에 화학발광성 표지를 사용하여 상기한 방사선면역분석과 유사한 방법으로 수행한다. 시험 용액중에 존재하는 IgE의 양에 상응하는, 형성된 면역 복합체의 양은 발광을 촉발시키는 화합물(예: H2O2및 NaOH)를 가하고 광학 측정 장치로 발광을 측정하여 결정한다.
IgE의 측정용으로 전술한 바와 같은 재구성 사람 항체 또는 이의 유도체의 본 발명에 따른 용도는 또한 그 자체가 공지된 다른 면역분석, 예를 들어, 면역형광분석, 항체-피복된 또는 항원-피복된 라텍스 입자와의 라텍스 응집, 항체-피복된 또는 항원-피복된 적혈구 소체와의 헤마글루틴화, 및 항체-피복된 광섬유 및 결합자체를 전기적 또는 광학적 시그날로 전환시키는 기타 직접-작용하는 면역감지기를 이용한 소멸광분석 등을 포함한다.
본 발명에 따른 재구성 사람 항체 또는 이의 유도체는 바람직하게는 플라그 형성 세포(PFC: plaque forming cell) 분석에서 IgE-생산 세포를 측정하는데 또한 유용하다.
본 발명에 따른 플라그 형성 세포 분석은 고체 상 면역분석의 원리에 기초한 것이다. 고체상 면역분석의 임의의 공지된 변형, 예를 들어, 방사선면역분석, 효소, 면역형광성 또는 화학발광성 면역분석 등이 사용될 수 있다.
이와 같은 플라그 형성 세포 분석의 예는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 기초한 PFC 분석이다. 전체적인 IgE-생산 세포의 양을 측정하기 위해, 상기한 바와 같이 샌드위치 RIA에 적합한 담체를 본 발명의 항체로 피복시킨다. 체액으로부터 원심분리, 여과 등에 의해 수득할 수 있는 IgE-생산 세포의 현탁액과, IgE에 특이적인 제2의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 예를 들어, 효소(예: 알칼리 포스파타제)와 접합시킨, 제1 항체와는 상이한 IgE의 에피토프를 인지하는 본 발명의 항체를 가한다. 시험 현탁액중 IgE-생산 세포의 양은 결합된 제2 항체의 양에 직접적으로 비례하며, 적절한 기질 용액을 가하면 예를 들어, 발색 반응 생성물이 나타나며 이 발색점(플라그)을 계수하여 이의 양을 측정한다. 특이적인 알레르겐에 대한 IgE를 생산하는 IgE-생산 세포의 분획을 측정하기 위해, 세포 현탁액을 가하기 전에 상기한 바와 같이 담체를 먼저 알레르겐 또는 알레르겐의 흡착성 접합체로 피복시킨다. 시험 현탁액중의 알레르겐에 대한 IgE의 분획은 표면-결합 알레르겐에 결합하고, 효소와 접합된 본 발명의 항체 및 적절한 기질 용액을 가하여, 예를 들어, 발색 반응 생성물을 발생시키고 발색점(플라그)을 계수하여 측정한다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 모노클로날 항체 및/또는 이의 유도체를 포함하고, 임의로 다른 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 및/또는 보조제를 포함하는, IgE 및/또는 IgE 생산 세포를 정량적 및 정성적으로 측정하기 위한 시험 키트에 관한 것이다.
방사선면역분석을 위한 본 발명에 따른 시험 키트는, 예를 들어, 적절한 담체, 임의로 동결-건조시키거나 농축시킨 하나 이상의 모노클로날 항체 용액, 방사능 표지한 모노클로날 항체 또는 방사능 표지한 IgE 용액, IgE의 표준 용액, 완충 용액 및 임의로 비-특이적 흡착 및 응집체 형성을 방지하는 세정제, 피펫, 반응 용기, 보정 곡선 등을 포함한다. 시험 키트의 하나 이상의 모노클로날 항체는 본 발명의 모노클로날 항체이다. 특이적 알레르겐에 대한 IgE를 생성하는 IgE-생산 세포를 측정하기 위한 시험 키트는 추가로 알레르겐 용액 또는 알레르겐의 흡착성 접합체 용액을 추가로 함유한다.
효소면역분석을 위한 본 발명에 따른 시험 키트는, 예를 들어, 적절한 담체, 임의로 동결-건조시키거나 농축시킨 하나 이상의 모노클로날 항체 용액, 임의로 동결건조시키거나 농축시킨 효소-표지된 모노클로날 항체 용액, 효소-표지된 IgE의 용액, 폴리클로날 항-IgE 혈청 및/또는 항-IgE 항체를 인지하고 결합하는, 효소-표지된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 용액, 고체 또는 용해된 형태의 효소 기질, IgE의 표준 용액, 완충 용액, 세정제, 피펫, 반응 용기, 보정 곡선, 색 도표 등을 함유한다. 시험 키트의 하나 이상의 모노클로날 항체는 본 발명의 모노클로날 항체이다. 특이적 알레르겐에 대한 IgE를 생성하는 IgE-생산 세포를 측정하기 위한 시험 키트는 추가로 알레르겐 또는 알레르겐의 흡착성 접합체를 함유한다.
또한, 본 발명에 따른 재구성 사람 항체 및 이의 유도체는 어떠한 공지된 통상적인 염색 기술, 예를 들어, 유동 세포계수 분석에 의해 표면 IgE 양성(sIgE+) B 세포를 정성적 및 정량적으로 측정하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 모노클로날 항체 및/또는 이의 유도체는 알레르기의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
치료 효과는 본 발명에 따른 재구성 사람 항체 및 이의 유도체의 특징에 기인하는 IgE 면역 반응의 하향조절에 의해 성취된다:
· 이들은 유리 IgE와 결합하고 Fcε수용체 Ⅰ 또는 Ⅱ를 갖는 세포, 특히 비만 세포 및 호염구에 대한 IgE의 결합을 억제함으로써 형성된 IgE를 중화시킬 수 있다.
· 이들은 표면 IgE 양성 B 세포(sIgE+B 세포)의 표면에서 발현되는 IgE를 인지하고 결합하므로, 알레르겐에 대한 2차 노출후 "기억 풀"을 형성하여 IgE를 생성하는 상기한 세포군을 고갈시키는데 유용하다. 선택된 면역글로불린 (아)부류의 재구성 사람 항체를 생성하는 가능성은, 숙주 면역계의 세포성 기작을 활성화시켜 sIgE+B 세포를 특이적으로 사멸시킨다. 이는 또한 본 발명의 모노클로날 항체와 이러한 약제를 표적 세포에 전달하는 세포독성 약제의 접합체에 의해 수행될 수 있다.
· 본 발명의 재구성 사람 항체 및 이의 유도체는 Fcε수용체 Ⅰ 또는 Ⅱ를 갖는 세포, 예를 들어 비만 세포 또는 호염구상의 세포친화성 IgE를 인지하지 않으므로, 이러한 세포에 의한 매개체 방출을 유도하지 않는다.
· 본 발명의 모노클로날 항체 및 이의 유도체는 또한 면역 반응시 IgE의 형성에 대해 상당한 억제 효과를 가지므로 장기간 치료 효과가 지속된다.
따라서, 본 발명의 재구성 사람 항체 및 이들의 유도체는 증상을 치료하기 보다는, 예를 들면 IgE 항체 및 표면 IgE 양성 B 세포를 제거시켜 알레르기 반응에 대한 잠재성을 제거하고 IgE 형성을 억제시킴으로써 알레르기 주 원인에 실제 영향을 미치는 치료를 제공한다. 치료시 증가되는 반복 용량이 필요하지 않으며, 본 발명의 재구성된 사람 항체 및 이들의 유도체는 알레르기 증상이 검출되기 전에 투여하여 예방적으로 치료하는데 사용될 수 있다는 점이 특히 유리하다.
본 발명에 따른 재구성 사람 항체 및 이의 유도체는 사람에게 투여되었을때 단지 약한 면역원성 또는 비-면역원성이므로, 생체내 진단, 치료 적용 및 예방에 특히 유용하다. 바람직하게는, 재구성 사람 항체는 치료용으로 투여되었을때 단백질 자체로서 사람에게 허용된다.
포유동물에 대한 치료적 일일 용량은 환자의 상태 및 적용 방식에 따라, 체중 kg당 약 0.1mg 내지 10mg이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 재구성 사람 항체 및/또는 유도체를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다. 약제학적 제제는, 예를 들어 무기 또는 유기의 고체 또는 액체 약제학적 담체와 함께 또는 이와의 혼합물로서 재구성 사람 항체 및/또는 이의 유도체를 치료학적 유효량으로 포함한다.
비경구 적용 및 흡입용 약제학적 제제가 바람직하다. 근육내, 피하 또는 정맥내 적용 또는 흡입용 제제는, 예를 들어 등장성 수용액제 또는 현탁제이며, 이들은 사용 직전에 동결건조 또는 농축된 제제로부터 제조한다. 약제학적 제제는 멸균시킬 수 있고, 보조제, 예를 들어 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제 또는 가용화제, 삼투압 조절용 염, 완충제 및/또는 점도 조절 화합물(예: 나트륨 카복시셀룰로즈, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴)을 포함할 수 있다. 이들은 공지된 방법, 예를 들어 통상의 혼합, 용해 또는 동결에 의해 제조되며, 약 0.01% 내지 약 50%의 활성 성분을 포함한다. 주사용 제제는 당 분야의 공지된 방법에 따라 처리되어 앰플, 바이알 또는 일회용 주사기에 충전된 후에 무균 조건하에 밀봉시킨다.
본 발명의 약제학적 제제는 사람에서 알레르기 반응, 특히 예를 들어 알레르기성 천식, 알레르기성 비염 및 아토피성 엑제마와 관련된 전형적인 즉시형 과민반응의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 특히 재구성 사람 항체, 재조합 DNA, 형질전환 숙주 세포, 실시예에 기술된 바와 같은 이들의 제조방법에 관한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하며 본 발명이 이로써 제한되지는 않는다.
약어 설명: VL=경쇄 가변 영역; VH=중쇄 가변 영역; CDR=상보성 결정 영역; FR=골격 영역; HCMV=사람 사이토메갈로바이러스.
[재료]
κ 경쇄를 갖고 사람 혈장으로부터 정제된 사람 IgG(IgG1: I-3889, IgG2: I-4139, IgG3: I-4389 및 IgG4: I-4639)는 모두 시그마(Sigma; Buchs, Switzerland)로부터 구입하였다. 사람 흑색종 혈청으로부터의 사람 IgM(Cat. No. PHP003) 및 사람 IgD(Cat. No. PHP005)는 세로텍(Serotec)으로부터 수득하였다. 사람 혈장으로부터의 IgA(IgA1: 400105: IgA2: 400108)는 칼바이오켐(Calbiochem; Laufelfingen, Switzerland)로부터 구입하였다.
[실시예 1] mAb C21 VL및 VH의 분자 모델링
사람 IgE를 인지하는 마우스 모노클로날 항체 C21의 VL(서열 1) 및 VH(서열 3)의 분자 모델을 작제한다: VL에 대해서는 고도의 상동성 마우스 항-라이소자임 항체 HyHEL-10의 해독된 구조를 기본으로 하고[참조: Padlan, E. A., Silverton, E.W., Sheriff, S., Cohen, G.H., Smith-Gill and Davies, D.R., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:5938; Brookhaven Database에서는 서열 3 HFM으로 언급됨; Bernstein et al., J. Mol. Biol 112, 535-542(1977)], VH에 대해서는 마우스 항-라이소자임 항체 HyHEL-5의 구조를 기본으로 한다[참조: Sheriff, S., Silverton, E.W., Padlan, E.A., Cohen, G.H., Smith-Gill, S.J., Binzel, B.C. and Davies, D.R., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:8075; Brookhaven Database에서는 서열 2 HFL로 언급됨; 상기 참조]. mAb C21의 경쇄 및 중쇄 가변 영역과 HyHEL-100 또는 HyHEL-5는 각각 91% 및 90%의 아미노산 동일성을 갖는다. 유닉스(UNIX) 운영 시스템하에 작동하고 분자 모델링 패키지 QUANTA(Palygen Corp., USA)를 이용하는 실리콘 그래픽스(Silicon Graphics) IRIS 4D 워크스테이션 상에서 모델을 만든다. 골격에서 동일한 잔기가 보유된다: 동일하지 않은 잔기는 QUANTA 단백질 모델링 설비로 삽입되는 최대 중복 과정[참조: Snow, M. E. and Amzel, L. M., 1986, Proteins 1:267]을 이용하여 대체시킨다.
마우스 C21 항체로부터의 VL영역의 상보성 결정 영역 CDR1(L1), CDR2(L2) 및 CDR3(L3)과 VH영역의 CDR1(H1) 및 CDR2(H2)는 이전에 가정된 표준 형태에 상응한다[참조: Chothia, C., Lesk, A.M., Tramontano, A., Levitt, M., Smith-Gill, S. J., Air, G., Sherrif, S., Padlan, E. A., Davies, D., Tulip, W. R., Colman, P. M., Spinelli, S., Alzari, P. M. and Poljak, R. J., 1989, Nature, 342:877]. 이들 루프의 주쇄 비틀림 각도는 최초 항체 구조에서와 같이 유지시킨다(L1-L3의 경우 HyHEL-10, H1-H2의 경우 HyHEL-5). VH영역의 CDR3(H3)를 위한 표준 구조는 존재하지 않으므로 모델링이 어렵다. 제3의 후보 루프는 QUANTA에서 이행되는 바와 같이 공개된 알고리즘을 이용하는 91개의 고분해 단백질 구조로부터 알아내고[참조: Jones, T. A. and Thirup, S., 1986, EMBO J., 5: 819-822], 최상의 것을 눈으로 선별한다. 루프는 H3 CDR의 측면상의 3개의 골격 잔기에 결합시킨다. 따라서, VH영역의 H3는 잔기 87 내지 106의 영역내의 벤스-존스(Bence-Jones) 단백질 RHE[참조: Furey, W., Wang, B.c., Yoo, C.S. and San, M., 1983, J. Mol. Biol., 167: 661-692]에 대해 모델링되며, 이는 CDR3에 대략적으로 상응한다.
바람직하지 못한 원자 접촉을 경감시키고 반 데르 발스(Van der Waals) 및 정전기적 상호작용을 극대화하기 위해서, QUANTA에서 이행되는 바와 같이 CHARM 포텐셜[참조: Brooks, B.R., Bruccoleri, R.E., Olafson, B.D., States, D.J., Swaminathan, S. and Karplus, M., 1983, J. Comp. Chem, 4:187]을 이용하여 모델을 급격하게 하강시키고 접합체 경사 에너지를 최소화한다.
[실시예 2] 재구성 C21 VL및 VH영역의 디자인
재구성 사람 C21 VL및 VH영역의 디자인은 일차적으로 KABAT 데이타베이스에서 찾을 수 있는 바와 같이 사람 VL및 VH영역의 컨센서스 서열을 기본으로 한다 (C21-L1, C21-L2, C21-L3, C21-H1 및 C21-H3)[참조: Kabat, E. A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. and Gottesman, K.S., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office]. 또한 2개 이상의 재구성 C21 VH영역(C21-Hay1 및 C21-Hay3)은 각각의 사람 항체의 골격 영역(FR)을 기본으로 한다.
컨센서스-기본의 재구성 사람 C21 가변 영역의 디자인을 위해, 마우스 C21 항체로부터의 VL및 VH영역의 아미노산 서열을, KABAT 데이타베이스로부터의 사람 항체의 VL및 VH영역에 대한 컨센서스 서열과 비교한다. 이러한 분석은 마우스 C21 VL영역 및 마우스 C21 VH영역이 각각 사람 κVL아그룹 Ⅲ 컨센서스 서열(아미노산 서열 77% 동일) 및 사람 VH아그룹 Ⅰ 컨센서스 서열(아미노산 서열 71% 동일)와 가장 유사하다는 것을 나타낸다. 이러한 사람 컨센서스 서열을 사용하여 각각의 컨센서스 서열의 사람 FR 및 쥐 C21 CDR을 포함하는, 재구성 사람 C21 경쇄 및 중쇄 가변 영역 C21-LO 및 C21-HO을 디자인한다. 마우스 C21 가변 영역의 분자 모델(실시예 1)을 사용하여, 우수한 항원 결합을 이루는데 잠재적으로 중요하고 VL/VH패키징에 중요할 수 있는 골격 잔기를 확인한다. 이러한 그래픽 분석 결과, FR내에서 주목된 사람 컨센서스 아미노산 서열중 일부가 이들의 상응하는 마우스 C21 잔기로 교환된다. 이들 교환은 단지 이들이 하기 범주에 포함되지 않는 경우 사람 골격 영역내에서 고려된다:
[1] 사람 컨센서스 서열(사람 아그룹 1; HSG 1)은 이 위치에서 뚜렷한 아미노산 선호를 나타내지 않으나, 최초 마우스 C21 서열에서 밝혀진 바와 같은 아미노산이 각각의 사람 면역글로불린 가변 영역 아그룹의 하나 이상의 개별적인 서열에 존재한다. 예를 들어, 몇몇 사람 항체가 이 위치에 Lys 잔기를 갖고 있으나, HSG1은 아미노산 잔기 19위치에 컨센서스 서열을 전혀 갖고 있지 않는 것으로 기술되어 있다[참조: 상기한 Kabat et al.]. Lys가 C21 서열중에서도 나타나기 때문에, 이는 재구성 모노클로날 항체중에 보유된다.
[2] 골격 위치에서 아미노산은 CDR 또는 초가변 루프의 구조를 결정하는데 중요한, 가정된 표준 구조의 일부분이며, 이에 따라 항원 결합 부위의 형태와 완전성을 유지시키는데 필수 불가결한 것으로 여겨진다[참조: Chothia, C. and Lesk, A.M., 1987, J. Mol. Biol., 196: 901; 상기한 Chothia, C. et al., 1989].
이런 규칙에 따라서, 재구성 사람 경쇄 및 중쇄 가변 영역 C21-L0 및 C21-H0 내의 4개 내지 6개 아미노산은 사람 컨센서스 서열과 비교시 교환되어 C21-L1' 및 C21-H1을 생성하게 된다. 교환된 아미노산의 위치는 C21-L1'와 하기에서 확인되는 이의 변형된 C21-L1(서열 11)에서 1, 3, 49 및 60이다. C21-H1(서열 11)에서, 교환된 아미노산의 위치는 38, 40, 67, 68, 70 및 87이다. 상기 언급한 규칙에 대한 예외는 재구성 사람 C21 VH영역의 위치 76이며, 본 발명자들은 사람 VH컨센서스 서열에서 발견되는 것과 같이 이 위치(Thr)에 대해 가장 빈번한 사람 아미노산을 선택하였다.
VL및 VH의 추가의 신규 버젼은 다음의 변경내용(각각 C21-L1 및 C21-H1과 비교)을 포함한다:
C21-L2(서열 7): 위치 60에서 아스팔트산(세린 대신);
C21-L3(서열 9): 위치 1에서 글루탐산(아스팔트산 대신); 위치 3에서 발린(류신 대신);
C21-H3(서열 13); 위치 38에서 아르기닌(라이신 대신); 위치 40에서 알라닌(아르기닌 대신); 위치 67에서 아르기닌(라이신 대신); 위치 87에서 아르기닌(트레오닌 대신).
C21-L1' 및 C21-H1을 사용한 데이터베이스 조사는, 재구성 사람 C21 VL버젼 C21-L1'가 사람 κ 경쇄 가변 영역 HUMIG KAF와 가장 유사(91% 서열 동일)하며[참조: EMBL database, Heidelberg, Germany; Newkirk, M.M., Gram, H., Heinrich G. F., Oestberg, L., Capra, J.D. and Isserman, R.L., 1988, J. Clin, Invest., 81: 1511-1518], 재구성 사람 C21 VH버젼 C21-H1은 사람 중쇄 가변 영역 HUMIG KAY와 가장 유사(78% 서열 동일)함을 나타낸다[참조: 상기한 EMBL database; Dersimonian, H., Schwartz, R.S., Barrett, K.J. and Stollar, B.D., 1987, J. Immunol., 139: 2496-2501]. 이들 서열은 각각 하기에서 KAF 및 HAY로 부른다. KAF의 FR 및 사람 VL아그룹 Ⅲ 컨센서스 서열은 위치 49 및 85에서만 상이하다. 위치 49에서, 상응하는 마우스 C21 아미노산(라이신)은 이의 추정 항원 결합으로 유지되고 있으며, 한편 위치 85에서 사람 VLⅢ 컨센서스 아미노산 발린은 KAF에서 발견되는 것과 같이 메티오닌으로 변화되었다. 따라서, C21-L1(서열 5)로 나타낸 변형된 버젼 C21-L1'은 개별적인 사람 경쇄 가변 영역 KAF에 기초한 것이다[참조: 상기한 Newkirk, M. M. et al., 1988]. 위치 85에서 발린 대신에 메티오닌이 있다는 것이 제1 버젼 C21-L1'와 구별된다. 재구성 버젼 C21-L2(서열 7) 및 C21-L3(서열 9)는 또한 위치 85에서 메티오닌을 갖는다.
이와 달리, 사람 중쇄 가변 영역 HAY 및 사람 VH아그룹 Ⅰ 컨센서스 서열의 FR은 여러 위치에서 상이하다. 이러한 개개의 사람 항체에 대해 고도의 유사성을 나타내는 재구성 사람 C21 VH영역을 작제하기 위해, 사람 중쇄 가변 영역 HAY의 중쇄 가변 영역으로부터의 FR을 기초로 하여 재구성 사람 C21 VH영역의 2개 이상의 버젼을 디자인하였다. HAY-기본 재구성 사람 C21 VH버젼의 작제는 재구성 사람 C21 버젼 C21-H1 및 C21-H3의 FR2 및 FR3 중의 각각의 위치 43, 44, 48, 76 및 77에서 5개의 변화를 필요로 한다. 이런 HAY-기본 버젼은 각각 C21-Hay1(서열 15) 및 C21-Hay3(서열 17)으로 불린다. 위치 30 및 72에서 HAY의 FR과 사람 VH아그룹 Ⅰ컨센서스 서열간의 두가지 추가 차이점은 마우스 C21 VH영역에서도 보유되고 있지만, 이들이 CDR의 구조를 규정하는 표준 잔기이기 때문에 변화로 간주되지는 않는다[참조: 상기한 Chothia, C. et al., 1989].
[실시예 3] 사람화 항체 유전자의 디자인 및 작제
사람화 항체 유전자 카세트를 디자인하기 위해, 효율적 발현 및 클로닝에 요구되는 추가 서열을 생성된 암호화 영역의 5'- 및 3'-말단에 가한다. 재구성 사람 C21 항체의 효율적 발현을 위한 진핵성 리더 서열은 디자인된 사람화 가변 영역에 프레임 크기로 가한다. 재구성 사람 C21 VL영역에 대한 리더 서열은 사람 항체 KAF의 κ 경쇄에서 발견되는 리더 서열로부터 유래하며[참조: 상기한 Newkirk, M.M. et al., 1988] 이로부터의 가변 영역은 C21 VL영역을 재구성하는데 사용된다. 재구성 사람 C21 VH영역에 대한 리더 서열은, 사람 VH아그룹[참조: Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. and Gottesman, K.S., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office]의 구성원인 사람 항체 HG3 CL의 중쇄에서 발견되는 리더 서열[참조: Rechavi, G., Ram, D., Glazer, L., Zakut, R. and Givol, D., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80: 855-859]로부터 유래한다. 이어서, 재구성 사람 C21 VL/VH영역에 대해 수득한 단백질 서열은, 미국 위스콘신대 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 서열 분석 소프트웨어 패키지 중에서 찾을 수 있는, 마우스 서열에 대한 코돈 사용표를 사용하여 DNA 서열로 역으로 해독한다. 디자인된 DNA 단편에 3'-말단에 진핵성 해독 시그날[참조: Kozak, M., 1987. J. Mol. Biol., 196; 947-950], 3'-말단의 공여 스플라이스 부위[참조: Breathnach, R., Benoist, C., O'Hare, K., Gannon, F. and Chambon, P., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 4853-4857], 및 지정된 포유동물 발현 벡터내로 서브클로닝하기에 편리한 Hind Ⅲ(5'-말단), BamHI 및 XbaI(3'-말단) DNA 제한 부위를 가한다.
이어서, 재구성 사람 C21 VL및 VH영역 C21-L1 및 C21-H1을 암호화하는 디자인된 사람화 항체 유전자 카세트를, 합성 DNA 폴리뉴클레오타이드를 사용하는 유전자 합성에 의해 작제한다. 전체 DNA 단편은 서로 20개의 뉴클레오타이드가 중복되는 6개 영역으로 다시 나눈다. 각각의 재구성 사람 C21 가변 영역 유전자 카세트에 대해, C21-LA(서열 19), C21-LB(서열 20), C21-LC(서열 21), C21-LD(서열 22), C21-LE(서열 23), C21-LF(서열 24), C21-HA(서열 25), C21-HB(서열 26), C21-HC(서열 27), C21-HD(서열 28), C21-HE(서열 29), HF(서열 30)로 나타낸, 6개의 5'인산화되고 PAGE-정제된 폴리뉴클레오타이드를, 미국 텍사스주 휴스턴 소재의 제노시스 바이오테크놀러지(Genosys Biotechnologies)로부터 구입한다. 그후 이들을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)-기본 유전자 합성법으로 어셈블리한다. 먼저 각 폴리뉴클레오타이드(LA 내지 LF) 5pmol을 어닐링시키고, 10mM 트리스-HCl pH 8.3, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 10mM β-머캅토에탄올, 0.05%(w/v) 트윈-20, 0.05% NP-40(Merck, Zurich), 200μ M dNTP(N=G, A, T 또는 C) 및 5U의 벤트TMDNA 폴리머라제(New England Biolabs)를 함유하는 100μ 1 반응물중에서 신장시킨다. 온도 단계는 테크네(Techne) PHC-2 온도 사이클러를 사용하여 95℃/1분, 50℃/2분 및 72℃/4분이다. 이 첫번째 사이클 후, 목적하는 완전한 길이 DNA 단편의 5'- 및 3'-말단에 하이브리드화하는 50pmol의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 C21-5'(서열 31) 및 C21-L3'(서열 33) 또는 C21-H3'(서열 32)를 가하고, 완전한 길이의 DNA 단편은 다음의 사이클링 변수를 사용하여 약 20사이클의 PCR 반응으로 증폭시킨다: 95℃/1분, 60℃/2분 및 72℃/2분. 이어서, PCR 혼합물을 1용적의 클로로포름으로 1회 추출하고, DNA는 1/10용적의 8M LiCl과 3용적의 에탄올을 가하여 침전시킨다. 침전된 DNA를 H2O중에 재용해시키고 공급자(Boehringer, Mannheim, Germany)가 제시한 조건하에서 HindⅢ 및 BamHI 제한 엔도뉴클레아제로 분해시킨다. 예측되는 크기(C21-L1=416bp 및 C21-H1=459bp)의 DNA 단편을 1% 아가로즈/TBE 중에서 전기영동적으로 정제하고 겔로부터 절단한다. 겔 단편을 작은 조각으로 절단하고 액체질소중에서 5분간 동결시킨 후, 미세원심분리기 중에서 원심분리시켜(136,000 x g, 30분) 유리솜을 통해 용출시킨다. 실온에서 페놀-클로로포름 추출 및 LiCl/에탄올 침전 후, 정제된 HindⅢ-BamHI 제한 단편을 pBluescript KS Ⅱ M13+(Stratagen)내로 서브클로닝시키고, 수용성 이. 콜라이 세포(HB101 균주, GIBCO-BRL)내로 형질감염시킨다. 정확한 크기의 DNA 삽입체를 함유하는 KS+C21/L1 또는 KS+C21/H1의 다수의 플라스미드 클론을 시쿼나제(Sequenase; USB)를 사용하여 서열화한다. DNA 서열내의 점 돌연변이 및/또는 결실은, 공개된 방법[참조: Kammann, M., Laufs, J., Schell J. and Gronenborn B., 1989, Nucl. Acids. Res., 17: 5404]에 따라 상이한 클론 및/또는 PCR 돌연변이유발 올리고뉴클레오타이드 사이에 있는 DNA 제한 효소 단편을 교환시켜 교정한다. 이어서, 정확한 DNA 서열을 나타내는 HindⅢ-BamHI 단편을 경쇄 또는 중쇄 발현 벡터로 서브클로닝시켜 플라스미드 HCMV-κ-C21/L1 및 HCMV-γ 1-C21/H1(제1도 참조)을 제조하는데, 이때 재구성 사람 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 HindⅢ-BamHI 단편을 각각 사람 κ 및 γ 1 불변 영역을 암호화하는 DNA와 결합시킨다. 두 플라스미드는 원숭이 바이러스 40(SV 40)의 오리진, HCMV 인핸서 도메인, HCMV 프로모터, 및 암피실린 선별 유전자를 포함한다[참조: 상기한 Kettleborough et al.].
재구성 사람 C21 VL영역 버젼 C21-L2 및 C21-L3은, PCR 반응 동안에 발생하는 재조합 반응을 이용하는, 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이유발에 의해 생성한다[참조: Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G. and Ehrlich, H., 1986, Cold Spring Harbour Symp., 51: 263 and Yolov, A. A. and Shabarova, Z, A., 1990, Nucl. Acids Res., 18:3983]. 2개의 경쇄 가변 영역 버젼 각각에 대한 2개의 DNA 단편을 PCR 증폭시켜 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 C21-5'(서열 31), L/D60SL(서열 35), L/D60S-SL(서열 36)(C21-L2의 경우), RSP(서열 34), L/E1D-V3L(서열 37), L/E1D-V3L-SL(서열 38)(C21L3의 경우) 및 C21-L3'(서열 33)(C21-L2 및 -L3의 경우)를 합성한다. 말단 올리고뉴클레오타이드 프라이머(C21-5', RSP 및 C21-L3')를 제외하고, 목적하는 코돈 변화에 필요한 올리고뉴클레오타이드 서열을 삽입시킨다. 프라이머 쌍 RSP 및 L/E1D-V3L를 제외하고, 각각의 적합한 프라이머 쌍 약 50mg을 KS+C21/L1로부터의 XhoI-NotI 단편 10ng 및 벤트TMDNA 폴리머라제 3단위와 혼합하고, 25회 PCR 증폭 사이클을 사용한다(60℃/25초, 72℃/40초 및 93℃/25초). 프라이머 쌍 RSP 및 L/E1D-V3L의 경우, KS+C21/L1 플라스미드 DNA 약 150ng이 주형으로서 사용되고, 목적하는 단편을 35사이클을 사용하여 PCR 증폭시킨다(40℃/30초, 72℃/1분 및 93℃/30초). 아가로스겔 전기영동으로 정제된 이들 반응의 생성물을 먼저 혼합하고, 각각의 DNA 단편 약 5 내지 30ng을 벤트TMDNA 폴리머라제 5단위로 신장시킨다(95℃/1분, 50℃/2분 및 72℃/4분). 이어서 말단 올리고뉴클레오타이드 프라이머 C21-5' 및 C21-L3'을 가하고, 혼합된 완전한 길이의 DNA 단편을 25사이클을 사용하여 PCR 증폭시킨다(95℃/1분, 50℃/2분 및 72℃/2분). 이어서 C21-L2 및 C21-L3에 대한 PCR 증폭된 DNA를 DNA 제한 엔도뉴클레아제 HindⅢ 및 BamHI을 사용하여 분해시킨 후, pBluescript KS Ⅱ M13+(Stratagene)으로 서브클로닝시킨다. 이어서, 정확한 서열을 상술한 바와 같이 MCM-γ 1-발현 벡터로 옮긴다.
재구성 사람 C21 VH영역 버젼 C21-H3, C21-Hay1 C21-Hay3을 C21-L1 및 C21-L2에 대해 기술한 바와 같이 유사한 방법으로 제조한다. 이들 C21 VH영역 버젼을 수득하기 위해서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 C21-5', H/R38K-A40R-L(서열 39), H/R38K-A40R-SL(서열 40), H/R67K-L(서열 41), H/R67K-SL(서열 42), H/R87T-L(서열 43), H/R87T-S(서열 44), HayFR2(서열 45), HayFR2-S(서열 47), HayFR3(서열 48), HayFR3S(서열 49) 및 C21-H3'을 사용하고 DNA 주형으로서 C21-H1(C21-H3 및 C21-Hay1의 경우) 또는 C21-H3(C21-Hay3의 경우)을 사용하여 PCR 증폭시켜, 상이한 재구성 사람 C21 VH버젼에 대한 목적하는 코돈을 포함하는 이본쇄 DNA 단편을 수득한다. 이어서, 아가로스 겔-정제된 단편을 PCR 재조합으로 어셈블리하여 상술한 바와 같이 완전한 길이의 DNA 단편을 수득한다. DNA 제한 엔도 뉴클아제 HindⅢ 및 BamHI으로 분해시킨 후, 상술한 바와 같이 pBluescript KS Ⅱ M13+(Stratagene)으로 클로닝시키고, HCMV-γ 1-발현 벡터로 클로닝시키기 전에 플라스미드 클론이 정확한 서열인가를 확인한다.
[실시예 4] COS 세포에서 재조합 플라스미드의 일시적 발현
COS 세포는 재구성 사람 C21 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자를 갖는 HCMV 발현 벡터 10μ g을 사용하여 전기천공시킨다. H-쇄 및 L-쇄 발현 플라스미드 10μ g을 PBS/o(Ca2+및 Mg2+가 결핍된 PBS: GIBCO-BRL, Basel, Switzerland; cat. no. 041-0490M) 중의 COS 세포의 1 x 107세포/ml 현탁액 0.8ml에 가한다. 이어서 바이오-래드 진 펄서(Bio-Rad Gene Pulser)를 사용하여 현탁된 세포에 25μ F 용량의 1900V 펄스를 전달한다. 세포는, 5% v/v 감마글로불린 비함유 및 열-불활성화된 태 송아지 혈청을 함유하는 DMEM(GIBCO-BRL, Basel, Switzerland; cat. no. 063-06510H) 10ml에 플레이팅하기 10분전에 회수한다. 72시간 동안 배양 후, 배지를 수집하고 원심분리시켜 세포 및 세포 파편을 제거한다. COS 세포 상층액을 0.45μ m 막을 통해 여과시킨 후, ELISA에 의해 사람 γ 1/κ 아유형의 어셈블리된 항체의 존재 여부를 분석한다. 사람화 항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 추가로 정제한다.
[실시예 5] 사람 IgG/κ 생성에 대한 ELISA 분석
96-웰 미세역가 플레이트(Nunc MaxiSorb, cat. no. 439454)는, PBS/o, pH 7.2중의 염소 항-사람 IgG(Fc 특이적; Dianova, # 109-005-098)의 1:1000 희석액 50μ 1로 밤새 피복시킨다. 이러한 단계 및 후속 단계 후, 플레이트를 PBST(PBS/o pH 7.2, 0.05% 트윈-20 함유) 200μ 1로 3회 세척한다. 유리 결합 부위를 RIA-완충액(PBST 중의 1% 소 혈청 알부민) 100μ 1로 37℃에서 1시간 동안 차단시킨다. 샘플 50μ 1, 및 RIA-완충액중의 이의 희석액을 가하고, 혼합물은 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 고도로 정제된 재조합 사람 항체 F5-444(사람 γ 1/κ 아유형, 유럽 특허원 제498767호)를 표준물로서 사용한다. RIA-완충액중의 서양고추냉이 퍼옥시다제와 결합된 친화성의 정제된 염소 항-사람 κ-경쇄 항혈청(Sigma, Buchs, Switzerland; cat. no. A-7164)의 1:1,000 희석액 50μ 1를 적용시키고 37℃에서 1시간 동안 배양한다. ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산),기질 용액(BioRad, Glattbrugg, Switzerland; #172-1064) 100μ 1를 현상을 위해 사용한다. 적당히 배양시킨 후, 효소 반응을 2%(w/v) 옥살산 등용적(100μ 1)을 사용하여 정지시킨다. 415nm에서의 흡광도를 사용하여, 결합되고 완전히 어셈블리된 사람항체를 정량화한다.
[실시예 6] COS 세포 상층액으로부터 사람화 항체의 단백질 A 정제
일시적으로 발현된 사람화 항체를, HR 5/5 FPLC 칼럼(Pharmacia, Uppsala, Sweden)으로 충전시킨 1ml 프리셉(Presep) A 칼럼(Bioprocessing, Durham, England)상에서 친화성 크로마토그래피로 정제한다. 칼럼을 FPLC 시스템(Pharmacia, Uppsala, Sweden)상에서 2ml/분의 일정 유속으로 전개시키고, 칼럼으로부터 용출된 단백질을 280nm에서의 U.V. 흡광도에 의해 유동 셀에서 검출한다. 칼럼을 PBS/o pH 8.0(20mM 인산나트륨, 150mM NaCl) 10칼럼 용적으로 세척하여 준비하고, pH 3.0의 100mM 나트륨 시트레이트 완충액 10칼럼 용적으로 예비 용출시킨 후, PBS/o pH 8.0 COS 세포 상층액(20 내지 50ml) 10 칼럼 용적으로 재평형화시키며, 0.45μ m 막을 통해 여과시켜 청정화한 후, 연동 펌프가 장착된 칼럼상에 직접 로딩시킨다. 이어서 칼럼을 U.V.-흡광도가 기저선으로 반환될 때까지 PBS/o pH 8.0으로 세척한다. 기저선이 0이 될 때까지 소 IgG를 100mM 나트륨 시트레이트 완충액 pH 5.0으로 세척하여 용출시킨다. 마지막으로 사람화 항체를 100mM 나트륨 시트레이트 완충액 pH 3.0을 사용하여 용출시키고, 용출물은 1M 트리즈마-염기(Trizma-Base; Sigma, Buchs, Switzerland)를 가하여 pH 7.0으로 조절한다. 사람화 항체의 순도를 쿠마시 블루 염색(참조: Laemmli, U.K., 1970, Nature, 227: 680-685)을 사용하는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한다. 바이오센서 분석의 경우, 중화된 단백질 A 용출물을 센트리콘(Centricon)-10 미세농축기(Amicon제조) 중에 농축시키고, 완충액을 PBS/o pH 7.2로 교환한다. 항체 제재의 순도에 따라서, 단백질 농도는 280nm에서의 U.V.-흡광도 또는 표준물로서 일치된 아유형의 공지의 정제된 재조합 키메릭 항체 F5-444를 사용하는 사람 γ/κ ELISA에 의해 정량화한다.
[실시예 7] 생체특이적 상호작용 분석(BIA)에 의한 마우스 및 재구성 사람 C21 항체의 결합력 및 특이성 분석
재구성 사람 C21 가변 경쇄 및 중쇄의 상이한 혼합물의 결합력 및 특이성을 실시간 생체특이적 상호작용 분석을 이용하여 분석한다[참조: Jonsson, U., Fagerstam, L., Ivarsson, B., Johnsson, B., Karlsson, R., Lundh, K., Lofas, S., Persson, B., Roos, H, Ronnberg, I., Sjolander, S., Stenberg, E., Stahlberg, R., Urbaniczky, C., Ostlin, H. and Malmqvist, M., 1991, BioTechniques, 11:620-627]
모든 실험은 CM5 센서 칩을 사용하는 BIAcoreTM시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)상에서 수행한다. 포획 항체로서, 11,000RU(11ng/mm2)의 폴리 클로날 토끼 항-마우스 IgG1(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden, cat. no. BR-1000-55) 또는 토기 항-사람 IgG(Pharmacia Biosensor AB)를, 이들의 아미노 그룹과 전술한 바와 같이 필수적으로 EDC/NHS 화학[참조: 상기한 Jonsson, U. et al., 1991]을 사용하여 센서 칩 표면상에 고정시킨다. 각각의 항체에 대해 4회의 실험을 수행하여 사람 IgE에 대한 결합의 결합율을 측정한다. 각각의 사이클은, 일정량의 시험 항체를 각각의 포획 항체에 결합시키고, 이 시험 항체를 고정 농도의 항원(사람 IgE; 모노클로날 항체 SE44; 3.125, 6.25, 12.5 및 25nM)과 상호작용 시킨 다음, 최종적으로 40mM HCl을 사용하여 표면을 재생시키는 것으로 이루어진다. 상세한 실험 내용은 다음과 같다:
[1] 유량은 분당 5μ 1;
[2] 전개 완충액으로서 HBS(10mM Hepes, 3.4mM EDTA, 150mM NaCl, 0.05% BIA 계면 활성제, pH 7.4)를 사용;
[3] 시험 항체(PBS/o pH 7.2중)를 HBS중에 5 내지 10μg/ml의 최종 농도로 희석하고 포획 항체에 결합시켜 결합 시험 항체의 1,300 내지 2,200 RU(1.3-2.2ng/mm2)수득;
[4] 사람 모노클로날 IgE(SE44)를 9분간 결합 시험 항체상으로 통과;
[5] 항체-항원 복합체를 제거하기 위해 40mM HCl 4μ 1을 사용하고 다음 사이클을 위해 표면을 준비;
[6] 분석 온도는 25℃.
그후 항체-항원 상호작용의 결합 상수를 BiocoreTM시스템의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 계산한다.
해리율 상수를 측정하기 위해, 해리상 단계를 포함시키는 것을 제외하고 유사한 프로토콜을 사용한다. 분석 조건은 상기 기술한 바와 같다. 먼저 시험 항체를 고정화시킨 포획 항체를 통해 센서 칩 표면에 결합시킨다. 최고 농도(25nM)에서 IgE(SE44)를 항체와 결합하게 한다. 결합 후, HBS 완충액을 5μ 1/분의 일정 유량으로 센서 칩 표면으로 통과시키고, 15 내지 25분에 걸쳐 공명 시그날 감소를 모니터링한다. 최종적으로 40nM HCl 용액 4μ 1으로 세척하여 센서 칩을 재생시킨다. 항체:IgE 복합체의 해리가 제1 반응이므로 센서그램의 선형 부분을 택하여 BIACORTM시스템내의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 해리율 상수를 계산한다.
재구성 사람 C21 항체의 동역학 상수 Kass(항체-항원 결합 속도 상수) 및 Kdiss(항체-항원 복합체의 해리 속도 상수) 및 결합력(평형상수 Kaff로 나타냄)은 표 1과 같다.
재구성 사람 C21 항체의 동역학 상수 및 결합력-kass의 경우, 독립된 실험수는 괄호에 나타냈으며(n), 각각의 kdiss는 두번의 독립된 실험으로 측정한다.
이들 모든 재구성 사람 C-21 항체는 거의 유사한 결합율을 갖는다. 결합력 감소는 주로 높은 해리율에 의해 유발된다. 재구성 사람 C21 경쇄의 상이한 버젼은 아미노 말단에서의 위치 1 및 3의 중요성에 대해 분석된다. 항원에 대한 양호한 결합은, 이들 위치에서의 아미노산이 C21 경쇄중 존재하는 것과 동일한 경우에 수득된다. 완전한 사람 KAF FR1을 사용하는 것은 중쇄 파트너와 무관하게 결합을 감소시킨다.
재구성 사람 C21 항체는 또한 생체특이적 상호작용 분석에 의해 모든 사람 면역글로불린의 모든 아유형에 대한 결합에 대해 시험한다. 먼저, 시험 항체를 상술한 바와 같이 센서 칩상의 고정화시킨 포획 항체에 별도로 결합시킨다. 이들 고정화시킨 토끼 항-사람 IgG 및 토끼 항-마우스 IgG1 항체의 교차-반응성은, 5μ g/ml의 사람 면역글로불린의 모든 아유형 IgM, IgD, IgA1, IgA2, IgG4, IgG3, IgG2, IgG1 및 IgE(SE44)를 연속적으로 전처리된 표면에 각각 5분간씩 통과시키기전에, 키메라성 항-CEA 항체 10μ g/ml ReK.41을 5부간 사용하여 차단한다(사람 γ 1/κ, 유럽 특허원 제323806호 참조). 최종적으로, 40mM HCl을 사용하여 표면을 재생시킨다. 유속, 온도 및 기타 조건은 전술한 바와 동일하다. 센서그램은 BIAcoreTM시스템으로 기록한다. 재구성 사람 C21 항체는 사람 IgE 아유형에 대해 특이적이다.
[실시예 8] 영구세포주 제조
형질감염용 재구성 TESC-21 사람 CMV H-쇄 및 L-쇄 발현 벡터의 플라스미드 DNA를 염화세슘 구배중에서 평형이 될 때까지 2회 원심분리하여 정제한다. 재조합 면역글로불린 유전자를 진 펄서 장치(BioRad, Richmond, CA)를 사용하여 전기천공에 의해 마우스 골수종 NSO 세포내로 도입한다. NSO 세포(2 내지 3 x 107)를 인산염 완충된 염수(PBS)로 세척하고, 각각 10μ g의 BspCI-선형화 H-쇄 및 L-쇄 플라스미드 DNA를 함유하는 0.8ml의 PBS 중에 재현탁시킨다. 전기천공은 210V의 전기장 및 960μ FD의 용량에서 수행한다. 회수한 세포를 2% FBS(태 송아지 혈청)를 함유하는 단백질 비함유 하이브리도마 배지(PFHM, Gibco)에 희석시키고, 웰당 104세포로 96-웰 미세역가 플레이트에 플레이팅시킨다. 48시간 배양후, 0.7mg/ml G418(Giboco) 및 2% FCS(태 송아지 혈청)를 함유하는 PFHM 중에서 형질감염체를 선별한다. 2주후, ELISA를 사용하여 약제 내성 콜로니를 함유하는 웰을 사람 IgG의 생성에 대해 스크리닝한다. ELISA는 배양 상층액중에 발현된 재조합 사람 IgG/κ 항체를 정량화하기 위해 전개시킨다. 이뮬론 2(Dynatech Labs) 96-웰 플레이트를 실온에서 PBS 중 0.5μ g/ml 염소 항-사람 κ 항체 100μ 1(Southern Biotech)로 밤새 피복시킨다. 그후 웰을 Blotto(PBS중 5% 분유)로 1시간 동안 차단하고, 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS(PBST)로 세척한다. 배양 상층액(50μ 1)을 피복 웰에 가하고 1시간 동안 배양한다. PBST로 세척한 후, Blotto중에 1/50,000로 희석시킨의 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-사람 IgG(Fc) 항체(Jackson ImmunoResearch Lab) 100μ 1를 각 웰에 가하고, 플레이트를 1시간 동안 배양한다. 0.1%의 3',3",5',5"-테트라메틸 벤지딘(Sigma) 및 0.003% 과산화수소(Sigma)를 함유하는 퍼옥시다제 기질 용액을 웰당 100μ 1로 가하고 실온에서 0.5시간 동안 배양한다. 2M 황산 50μ 1를 가하여 반응을 정지시키고, 각 웰에서의 반응 혼합물의 흡광도(0.D.)를 다이나테크(Dynatech) MR5000 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 판독한다. NSO 세포를 형질감염시키기 위해, 재구성 TESC-21 사람 CMV 발현 플라스미드 H1, H3, L1 및 L3을 4가지 조합 H3L1, H3L3, H1L1 및 H1L3으로 사용한다. 각각 총 142, 122, 68 및 64웰의 H3L1, H3L3, H1L1 및 H1L3가 0.01 미만의 배경 판독을 가지면서 0.05를 초과하는 0.D. 판독값을 나타낸다. 각각의 조합에 대해, IgG 분비 수준에 근거하여 하나의 세포주를 선정한다: EH31.8, H3L1 항체 분비; EH33.16, H3L3 항체 분비; EH11.13, H1L1 항체 분비; 및 EH13.5, H1L3 항체 분비.
[기탁 데이터]
다음의 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, U.S.A; 1992년 9월 23일자 기탁, 기탁 번호는 괄호안에 표시)에 기탁하였다.
· 재구성 사람 항체 H3L1을 생산하는 세포주 EH31.8(HB 11130)
· 재구성 사람 항체 H1L1을 생산하는 세포주 EH11.13(HB 11132)
· 쥐 모노클로날 항체 TES-C21을 생산하는 세포주 TES-C21(HB 11133)
· 재구성 사람 항체 H3L3을 생산하는 세포주 EH33.16(HB 11131)
· 재구성 사람 항체 H1L3을 생산하는 세포주 EH13.5(HB 11134).
[서열 목록]
(1) 일반정보
(ⅰ) 출원인
(A) 성명: 시바-가이기 에이지
(B) 거리: 클리벡슈트라세 141
(C) 시: 바즐
(E) 국적: 스위스
(F) 우편번호: 4002
(G) 전화번호: +41 61 69 11 11
(H) 팩스번호: +41 61 696 79 76
(I) 텔렉스: 962 991
(A) 성명: 타녹스 바이오시스템스, 인코포레이티드.
(B) 거리: 스텔라 링크 10301
(C) 시: 휴스턴
(D) 주: 텍사스
(E) 국적: 미국
(F) 우편번호: 77025
(ⅱ) 발명의 명칭: 면역글로불린 이소타입에 대한 재구성된 모노클로날 항체
(ⅲ) 서열수: 49
(ⅳ) 컴퓨터 판독형태:
(A) 매체 타입: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.25(EPO)
(2) 서열 1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 370개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 1..369
(D) 다른 정보: /생성물="항체 TES-C21의 중쇄 가변 도메인"
(xi) 서열 기술: 서열 1
(2) 서열 2에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 123개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 기술: 서열 2
(2) 서열 3에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 322개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 1..321
(D) 다른 정보: /생성물="쥐 항체 TES-C21의 경쇄 가변 도메인"
(xi) 서열 기술: 서열 3
(2) 서열 4에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 107개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 기술: 서열 4
(2) 서열 5에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 424개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 22..402
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: mat_펩타이드
(B) 위치: 82..402
(D) 다른 정보: /생성물="경쇄 가변 도메인 C21-L1"
(xi) 서열 기술: 서열 5
(2) 서열 6에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 127개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 기술: 서열 6
(2) 서열 7에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 424개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 22..402
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: mat_펩타이드
(B) 위치: 82..402
(D) 다른 정보: /생성물="경쇄 가변 영역 C21-L2"
(xi) 서열 기술: 서열 7
(2) 서열 8에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 127개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 기술: 서열 8
(2) 서열 9에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 424개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 22..402
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: mat_펩타이드
(B) 위치: 82..402
(D) 다른 정보: /생성물="경쇄 가변 영역 C21-L3"
(xi) 서열 기술: 서열 9
(2) 서열 10에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 127개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 기술: 서열 10
(2) 서열 11에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 468개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 22..447
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: mat_펩타이드
(B) 위치: 79..447
(D) 다른 정보: /생성물="중쇄 가변 영역 C21-H1"
(xi) 서열 기술: 서열 11
(2) 서열 12에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 142개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 기술: 서열 12
(2) 서열 13에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 468개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 22..447
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: mat_펩타이드
(B) 위치: 79.447
(D) 다른 정보: /생성물="중쇄 가변 영역 C21-H3"
(xi) 서열 기술: 서열 13
(2) 서열 14에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 142개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 기술: 서열 14
(2) 서열 15에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 467개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 22..447
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: mat_펩타이드
(B) 위치: 79.447
(D) 다른 정보: /생성물="중쇄 가변 영역 C21-Hay1"
(xi) 서열 기술: 서열 15
(2) 서열 16에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 142개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 기술: 서열 16
(2) 서열 17에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 467개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 22..447
(ⅸ) 특성:
(A) 명칭/키: mat_펩타이드
(B) 위치: 79..447
(D) 다른 정보: /생성물="중쇄 가변 영역 C21-Hay3"
(xi) 서열 기술: 서열 17
(2) 서열 18에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 142개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 기술: 서열 18
(2) 서열 19에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 105개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 19
(2) 서열 20에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 95개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 20
(2) 서열 21에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 75개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 21
(2) 서열 22에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 87개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 22
(2) 서열 23에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 84개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 23
(2) 서열 24에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 82개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 24
(2) 서열 25에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 97개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 25
(2) 서열 26에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 103개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 26
(2) 서열 27에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 105개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 27
(2) 서열 28에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 107개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 28
(2) 서열 29에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 83개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 29
(2) 서열 30에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 83개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 30
(2) 서열 31에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 31
(2) 서열 32에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 23개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 32
(2) 서열 33에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 24개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 33
(2) 서열 34에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 16개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 34
(2) 서열 35에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 30개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 35
(2) 서열 36에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 25개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 36
(2) 서열 37에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 22개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 37
(2) 서열 38에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 27개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 38
(2) 서열 39에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 28개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 39
(2) 서열 40에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 29개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 40
(2) 서열 41에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 34개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 41
(2) 서열 42에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 28개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 42
(2) 서열 43에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 31개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 43
(2) 서열 44에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 44
(2) 서열 45에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 27개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 45
(2) 서열 46에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 33개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 46
(2) 서열 47에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 27개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 47
(2) 서열 48에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 20개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 48
(2) 서열 49에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 기술: 서열 49

Claims (19)

  1. 사람-형 골격과, 세포주 HB11133에 의해 생산된 쥐의 CDR-공여 항체로부터 유래된 초가변 영역인, Met-Tyr-Trp-Leu-Glu의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 차례로 포함하는 항원 결합 부위를 갖고, 세포주 HB11133에 의해 생산된 쥐의 CDR-공여 항체의 항원 결합 친화도와 적어도 동일한 항원 결합 친화도를 갖는, IgE에 대해 특이적인 재구성 사람 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, a) 초가변 영역인, Met-Tyr-Trp-Leu-Glu의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 차례로 포함하는 제1 도메인 및
    b) 초가변 영역인, Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 차례로 포함하는 제2 도메인을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하고, 세포주 HB11133에 의해 생산된 쥐의 CDR-공여 항체의 항원 결합 친화도와 적어도 동일한 항원 결합 친화도를 갖는 재구성 사람 항체.
  3. 제2항에 있어서, a) 초가변 영역인, Met-Tyr-Trp-Leu-Glu의 아미노산 서열을 갖는 CDR1H, Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala의 아미노산 서열을 갖는 CDR2H및 Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr의 아미노산 서열을 갖는 CDR3H를 차례로 포함하는 가변 도메인 및 사람 중쇄의 불변부 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편 및
    b) 초가변 영역인, Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His의 아미노산 서열을 갖는 CDR1L, Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser의 아미노산 서열을 갖는 CDR2L및 Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr의 아미노산 서열을 갖는 CDR3L를 차례로 포함하는 경쇄의 가변 도메인 및 사람 경쇄의 불변부 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 포함하며, 이때 중쇄에 있어 서열 1의 아미노산 31 내지 35번, 50 내지 66번 또는 99 내지 112번 및 경쇄에 있어 서열 3의 아미노산 24 내지 34번, 50 내지 56번 또는 89 내지 97번 내에서 임의로 4개 이하의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있는 CDR 서열을 포함하는 재구성 항체.
  4. 제2항에 있어서, a) 서열 11의 아미노산 위치 1에서 시작하여 위치 123의 아미노산에서 종결되는 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 사람 중쇄의 불변부를 포함하는 중쇄 및
    b) 서열 5의 아미노산 위치 1에서 시작하여 위치 107의 아미노산에서 종결되는 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 사람 경쇄의 불변부를 포함하는 경쇄를 포함하는 재구성 사람 항체.
  5. 제2항에 있어서, a) 서열 13의 아미노산 위치 1에서 시작하여 위치 123의 아미노산에서 종결되는 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 사람 중쇄의 불변부를 포함하는 중쇄 및
    b) 서열 5의 아미노산 위치 1에서 시작하여 위치 107의 아미노산에서 종결되는 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 사람 경쇄의 불변부를 포함하는 경쇄를 포함하는 재구성 사람 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 사람 중쇄 불변 영역 γ 1을 포함하는 재구성 사람 항체.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄가 사람 경쇄 불변 영역 κ를 포함하는 재구성 사람 항체.
  8. 제5항에 있어서, 세포주 HB11130에 의해 생산되는, H3L1로 명명된 재구성 사람 항체.
  9. 제4항에 있어서, 세포주 HB11132에 의해 생산되는, H1L1로 명명된 재구성 사람 항체.
  10. 제1항에 따른 재구성 사람 항체 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 분자를 포함하는 접합체.
  11. 본 발명의 단백질을 생산하는 적합한 숙주를 배양하고, 필요에 따라 이 단백질을 분리하며, 임의로 이를 접합체로 전환시킴을 포함하여, 제1항에 따른 재구성 사람 항체 또는 제10항에 따른 접합체를 제조하는 방법.
  12. a) 제3항에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1H, CDR2H및 CDR3H를 순서대로 포함하는 CDR과 FR을 교대로 포함하는 가변 도메인을 암호화하는 제1 부분 및, 임의로
    b) 사람 중쇄 불변부 또는 이의 단편을 암호화하는 제2 부분을 포함하는 중쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA 작제물.
  13. a) 제3항에서 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1L, CDR2L및 CDR3L을 순서대로 포함하는 CDR과 FR을 교대로 포함하는 가변 도메인을 암호화하는 제1 부분 및, 임의로
    b) 사람 중쇄 불변부 또는 이의 단편을 암호화하는 제2 부분을 포함하는 경쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA 작제물.
  14. 제12항에 따른 DNA 작제물, 제13항에 따른 DNA 작제물 또는 이들 둘다를 포함하는 하이브리드 벡터.
  15. 제14항에 따른 하이브리드 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 세포주 HB11132인 숙주 세포.
  17. 제15항에 있어서, 세포주 HB11130인 숙주 세포.
  18. 제1항에 따른 항체 또는 제10항에 따른 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 알레르기 반응의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  19. 제1항에 따른 항체 또는 제10항에 따른 접합체를 포함하는, IgE를 정량적 또는 정성적으로 측정하기 위한 시험 키트.
KR1019930019631A 1992-09-24 1993-09-24 면역글로불린이소타입에대한재구성된모노클로날항체 KR100298608B1 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB929220228A GB9220228D0 (en) 1992-09-24 1992-09-24 Reshaped monoclonal antibodies against an immunologlobulin isotype
US9220228.2 1992-09-24
GB9220228.2 1992-09-24
US95280292A 1992-09-25 1992-09-25
US07/952,802 1992-09-25
US7/952,802 1992-09-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR940006602A KR940006602A (ko) 1994-04-25
KR100298608B1 true KR100298608B1 (ko) 2001-11-22

Family

ID=26301683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019930019631A KR100298608B1 (ko) 1992-09-24 1993-09-24 면역글로불린이소타입에대한재구성된모노클로날항체

Country Status (18)

Country Link
EP (2) EP0589840B1 (ko)
JP (2) JP3636737B2 (ko)
KR (1) KR100298608B1 (ko)
CN (2) CN1078250C (ko)
AT (1) ATE264388T1 (ko)
AU (1) AU675449B2 (ko)
CA (1) CA2106719C (ko)
CY (1) CY2583B2 (ko)
DE (1) DE69333484T2 (ko)
DK (1) DK0589840T3 (ko)
ES (1) ES2219640T3 (ko)
FI (2) FI114550B (ko)
HK (1) HK1056182A1 (ko)
IL (2) IL173988A0 (ko)
MX (1) MX9305920A (ko)
NO (1) NO318210B1 (ko)
NZ (1) NZ248743A (ko)
PT (1) PT589840E (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
ZA966075B (en) * 1995-07-27 1998-01-19 Genentech Inc Protein formulation.
AU7156996A (en) * 1995-09-13 1997-04-01 Genentech Inc. Methods for treatment of interstitial cystitis
US6127524A (en) * 1996-10-18 2000-10-03 Dade Behring Inc. Binding molecules and computer-based methods of increasing the binding affinity thereof
WO1999038531A1 (en) * 1998-01-29 1999-08-05 Tanox, Inc. TREATING ATOPIC DERMATITIS WITH IgE ANTAGONISTS
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
MXPA05004955A (es) 2002-11-08 2005-11-17 Ablynx Nv Anticuerpos de region unica dirigidos contra el factor-alfa de necrosis de tumor y usos de estos.
AU2003286004A1 (en) * 2002-11-08 2004-06-07 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses therefor
DK2407485T3 (en) * 2003-02-01 2016-03-21 Tanox Inc Anti-human IgE antibodies with high affinity
EP1718669A4 (en) * 2004-02-02 2007-10-10 Tanox Inc IDENTIFICATION OF NEW IGE EPITOPES
BR122018013284B1 (pt) 2008-10-29 2022-03-03 Ablynx N.V Formulações de moléculas de ligação ao antígeno de domínio único, seu método de formulação e seu uso, kit ou artigo de fabricação, bem como método para preparar uma formulação reconstituída contendo uma molécula de sdab
MX2011004558A (es) 2008-10-29 2011-06-01 Wyeth Llc Procedimientos para la purificacion de moleculas de union a antigeno de un unico dominio.

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU618317B2 (en) * 1987-12-31 1991-12-19 Tanox Biosystems, Inc. Unique antigenic epitopes on ige-bearing b lymphocytes
US5104604A (en) * 1989-10-05 1992-04-14 Dexter Electronic Materials Div. Of Dexter Corp. Flame retardant epoxy molding compound, method and encapsulated device method of encapsulating a semiconductor device with a flame retardant epoxy molding compound
JP2988635B2 (ja) * 1990-09-18 1999-12-13 塩野義製薬株式会社 ヒトＩｇＥに対するモノクローナル抗体
WO1992017207A1 (en) * 1991-03-26 1992-10-15 Tanox Biosystems, Inc. MONOCLONAL ANTIBODIES WHICH BIND TO SECRETED AND MEMBRANE-BOUND IgE, BUT NOT TO IgE ON BASOPHILS
DK1260521T3 (da) * 1991-08-14 2008-03-25 Genentech Inc Immunoglobulinvarianter af specifikke Fc-epsilonreceptorer

Also Published As

Publication number Publication date
DE69333484T2 (de) 2005-03-24
HK1056182A1 (en) 2004-02-06
CN1428352A (zh) 2003-07-09
NO318210B1 (no) 2005-02-21
CN1078250C (zh) 2002-01-23
EP0589840A1 (en) 1994-03-30
JP3636737B2 (ja) 2005-04-06
DE69333484D1 (de) 2004-05-19
NO933394D0 (no) 1993-09-23
NZ248743A (en) 1995-04-27
JPH06225788A (ja) 1994-08-16
CA2106719A1 (en) 1994-03-25
FI20040696A (fi) 2004-05-19
CA2106719C (en) 2006-03-28
DK0589840T3 (da) 2004-07-26
FI934145A (fi) 1994-03-25
EP0589840B1 (en) 2004-04-14
PT589840E (pt) 2004-08-31
KR940006602A (ko) 1994-04-25
JP3718214B2 (ja) 2005-11-24
IL107049A (en) 2006-07-05
EP1452542A3 (en) 2007-05-02
FI934145A0 (fi) 1993-09-22
EP1452542A2 (en) 2004-09-01
IL173988A0 (en) 2006-07-05
FI114550B (fi) 2004-11-15
FI115838B (fi) 2005-07-29
NO933394L (no) 1994-03-25
CN1254487C (zh) 2006-05-03
JP2004357712A (ja) 2004-12-24
AU675449B2 (en) 1997-02-06
IL107049A0 (en) 1993-12-28
CN1088986A (zh) 1994-07-06
CY2583B2 (en) 2009-11-04
MX9305920A (es) 1994-05-31
AU4748893A (en) 1994-03-31
ATE264388T1 (de) 2004-04-15
ES2219640T3 (es) 2004-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6072035A (en) Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
US5958708A (en) Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
JP2912618B2 (ja) 組換えｄｎａ生産物及び製造法
JP3457962B2 (ja) 特定Ｆｃεレセプターのための免疫グロブリン変異体
Kolbinger et al. Humanization of a mouse anti-human IgE antibody: a potential therapeutic for IgE-mediated allergies
KR101276596B1 (ko) 면역억제 특성을 가진 인간화 항-ｃｄ4 항체
US5705154A (en) Humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4
JPH10509876A (ja) Ｃｄ３８に対する擬人化抗体
JP2004073210A (ja) 変性された抗体、それに関連する生成物及び方法
HU228159B1 (en) Antibodies to human il-1beta
JPH08507680A (ja) 組換え抗ｖｌａ４抗体分子
JP2011042654A (ja) 新規のＩｇＥエピトープの同定
KR100298608B1 (ko) 면역글로불린이소타입에대한재구성된모노클로날항체
US20230138315A1 (en) Anti-angptl3 antibody and use thereof
JP2004536605A (ja) インターロイキン１β抗体
JP2000515494A (ja) Ｉｌ―５介在障害を治療および診断するための改良方法
JPH09510095A (ja) ヒトインターロイキン−４に対するヒト化モノクローナル抗体
Park et al. Generation and characterization of a novel tetravalent bispecific antibody that binds to hepatitis B virus surface antigens
JP2019509254A (ja) Ｐｃｓｋ９抗体、その抗原結合フラグメント及び医薬用途
RU2656160C2 (ru) Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с рецептором интерлейкина-6 человека
JP2001510329A (ja) ヒトモノクローナル抗体
JP2007527703A (ja) 肺炎球菌表面付着因子Ａタンパク質（ＰｓａＡ）に関する結合メンバー
EP1079856B1 (en) Humanized antibodies that recognize verotoxin ii and cell line producing same
TW202409093A (zh) 融合蛋白
MXPA06008690A (es) Identificacion de epitopos ige novedosos

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20090525

Year of fee payment: 9

LAPS Lapse due to unpaid annual fee