BR122018013284B1 - Formulações de moléculas de ligação ao antígeno de domínio único, seu método de formulação e seu uso, kit ou artigo de fabricação, bem como método para preparar uma formulação reconstituída contendo uma molécula de sdab - Google Patents

Formulações de moléculas de ligação ao antígeno de domínio único, seu método de formulação e seu uso, kit ou artigo de fabricação, bem como método para preparar uma formulação reconstituída contendo uma molécula de sdab Download PDF

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Jason E. Fernandez
Daniel A. Dixon
Andrea Paulson
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Ablynx N.V
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Abstract

a invenção refere-se a formulações de moléculas de ligação de antígeno de domínio único, por exemplo, moléculas de nanocorpo, em particular formulações de moléculas de nanocorpo de ligação de tnf. as moléculas de ligação de antígeno de domínio único podem incluir um ou mais domínios de ligação únicos que interagem com, por exemplo, se ligam a, uma ou mais proteínas-alvos. as formulações são úteis, por exemplo, como formulações farmacêuticas. são também descritos métodos para preparar e usar as formulações descritas aqui, para tratar, por exemplo, distúrbios associado a tnf.

Description

[0001] Dividido do PI0919979-9, depositado em 29.10.2009.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0002] Este pedido reivindica a prioridade do pedido US 61/109.474, depositado em 29 de abril de 2008, cujo teor inteiro é aqui incorporado, a título de referência, na íntegra.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0003] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida via EFS-Web e é aqui incorporada a título de referência na íntegra. A dita cópia de ASCII, criada em 27 de outubro de 2009, é designada W22373WO.txt., e o tamanho é de 8.343 bytes.
ANTECEDENTES
[0004] Avanços na biotecnologia tornaram possível produzir uma variedade de proteínas para aplicações farmacêuticas usando técnicas de DNA recombinante. Devido ao fato de as proteínas terem uma tendência a serem maiores e mais complexas que os fármacos orgânicos e inorgânicos tradicionais, a formulação de tais proteínas apresentam problemas especiais. Para que uma proteína permaneça biologicamente ativa, a formulação deve conservar a integridade conformacio- nal de pelo menos uma sequência de núcleo dos aminoácidos da proteína, enquanto que ao mesmo protege os grupos funcionais múltiplos da proteína da degradação. Vias de degradação para proteínas podem envolver instabilidade química (isto é, qualquer processo que envolva modificação da proteína por formação de ligação ou clivagem que resulta em uma nova entidade química) ou instabilidade física (isto é, alterações na estrutura de ordem mais alta da proteína). A instabilidade química pode resultar de, por exemplo, desamidação, racemização, hidrólise, beta-eliminação ou troca com dissulfeto. A instabilidade física pode resultar de, por exemplo, desnaturação, agregação, precipitação ou adsorção. Três vias de degradação de proteína comuns são agregação, desamidação e oxidação de proteína (Cleland et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993)).
[0005] Liofilização é uma técnica comumente empregada para conservar proteínas, que serve para remover água da preparação de proteína de interesse. Liofilização é um processo por meio do qual o material a ser secado é primeiramente congelado e então o gelo ou solvente congelado é removido por sublimação em ambiente sob vácuo. Um excipiente pode ser incluído em formulações pré-liofilizadas para intensificar a estabilidade durante o processo de liofilização e/ou para aperfeiçoar a estabilidade do produto liofilizado mediante armazenagem (Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) and Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)).
[0006] Portanto, ainda há necessidade de desenvolver formula ções de proteína, particularmente para administração subcutânea, que são para armazenagem de longo prazo e distribuição.
SUMÁRIO
[0007] A invenção se refere a formulações de moléculas de ligação de antígeno de domínio único (também denominadas aqui como "moléculas SDAB" (por exemplo, moléculas de nanocorpo, em particular de formulações de moléculas de nanocorpo de ligação de TNF). A molécula SDAB pode incluir um ou mais domínios de ligação de antí- geno únicos que interagem com, por exemplo, se ligam a uma ou mais proteínas-alvos. As formulações são úteis, por exemplo, como formulações farmacêuticas, para administração a um paciente, por exemplo, um ser humano. Método de preparação e uso das formulações descri- tas aqui, para tratar ou prevenir, por exemplo, distúrbios associados ao TNF, são também descritos.
[0008] [Nota: Nanocorpo® e Nanocorpos® são marcas registradas da Ablynx N.V.]
[0009] Por conseguinte, em um aspecto, a invenção caracteriza a formulação que inclui (a) uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo (por exemplo, uma molécula de nanocorpo de ligação de TNF); (b) um lioprotetor; (c) um agente tensoativo (opcionalmente); (d) um agente de avolumamento (opcionalmente); (e) um agente de ajuste de tonicidade (opcionalmente); (f) um estabilizador (opcionalmente); (g) um conservante (opcionalmente), e (h) um tampão, de modo que o pH da formulação seja de cerca de 5, 0 a 7,5. Em algumas modalidades, a formulação é uma formulação líquida, uma formulação de aerossol, uma formulação de armazenagem a granel (por exemplo, formulação de armazenagem a granel congelada). Em certas modalidades, a formulação é administrada ao paciente por injeção (por exemplo, subcutânea, intravascular, intramuscular ou intraperitoneal) ou por inalação.
[00010] Em certas modalidades, a molécula SDAB, por exemplo, a molécula de nanocorpo (por exemplo, a molécula de nanocorpo de ligação de TNF), na formulação está em uma concentração de cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 350 mg/mL, cerca de 0,5 mg/mL, a cerca de 300 mg/mL, cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 350 mg/mL a cerca de 300 mg/mL, cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 250 mg/mL, cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 150 mg/mL, cerca de 1 mg/mL a cerca de 130 mg/mL, cerca de 10 mg/mL a cerca de 130 mg/mL, cerca de 50 mg/mL a cerca de 120 mg/mL, cerca de 80 mg/mL a cerca de 120 mg/mL, cerca de 88 mg/mL a cerca de 100 mg/mL ou cerca de 10 mg/mL, cerca de 25 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 0 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 130 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, cerca de 200 mg/mL, cerca de 250 mg/mL ou cerca de 300 mg/mL.
[00011] Em outras modalidades, o lioprotetor da formulação é um açúcar, por exemplo, sacarose, sorbitol, ou trealose. Por exemplo, o lioprotetor pode ser sacarose, sorbitol ou trealose em uma concentração de cerca de 2,5% a cerca de 10%, cerca de 5% a cerca de 10%, cerca de 5% a cerca de 8%, ou cerca de 4%, cerca de 4 ,5%, cerca de 5%, cerca de 5,5%, cerca de 6%, cerca de 6 ,5%, cerca de 7%, cerca de 7 ,5%, cerca de 8%, cerca de 8,5%, ou cerca de 9% (peso/volume).
[00012] Em ainda outras modalidades, o tampão na formulação é um tampão de histidina em uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 50 mM, cerca de 5 mM a cerca de 40 mM, cerca de 5 mM a cerca de 30 mM, cerca de 10 mM a cerca de 20 mM, ou cerca de 10 mM, cerca de 20 mM, ou cerca de 30 mM. Em outras modalidades, o tampão na formulação é um tampão de Tris presente em uma concentração de menos que cerca de 5 mM a cerca de 50 mM, cerca de 5 mM a cerca de 40 mM, cerca de 5 mM a cerca de 30 mM, cerca de 10 mM a cerca de 20 mM, ou cerca de 10 mM, cerca de 20 mM, ou cerca de 30 mM. O pH dos tampões da formulação está geralmente entre cerca de 5 e 7. Em algumas modalidades específicas, o pH do tampão da formulação é de cerca de 5 a cerca de 7,5, cerca de 5,5 a cerca de 7,2. Por exemplo, o pH do tampão pode ser cerca de 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 ou 7.
[00013] Em algumas modalidades, a formulação inclui (opcionalmente) um agente tensoativo em uma concentração de cerca de 0,001% a 0,6%, por exemplo, cerca de 0,01% a 0.6%, cerca de 0,1% a 0,6%, cerca de 0,1% a 0,5%, cerca de 0,1% a 0,4%, cerca de 0,1% a 0,3%, cerca de 0,1% a 0,2%, ou cerca de 0., 1% a 0,02%. Em alguns casos, a formulação contém mais que 0% e até cerca de 0,6% (por exemplo, cerca de 0,1% a 0,2% de polissorbato -20, polissorbato-40, polissorbato-60, polissorbato-65, polissorbato-80, polissorbato-85, po- loxâmero-188, monolaurato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano, monoestearato de sorbitano, mono-oleato de sorbitano, trilaurato de sorbitano, triestearato de sorbitano, trioleato de sorbitano, ou uma combinação destes. Em modalidades específicas, a formulação contém cerca de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01% a 0,02%, 0,01%, 0,02%, 0,03%,0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,1% a 0,2%, 0,11%, 0,12%, 0,13%, 0,14%, 0,15%, 0,16%, 0,17%, 0,18%, 019% ou 0,2% de polissorbato-80. Alternativamente, a formulação pode incluir poloxâmero-188 em cerca de 0,01% a 0,6%, cerca de 0,1% a 0,6%, cerca de 0,1% a 0,5%, cerca de 0,1% a 0,4%, cerca de 0,1% a 0,3%, ou cerca de 0,1% a 0,2%.
[00014] Em certas modalidades, a formulação inclui (opcionalmente) um agente de avolumamento, por exemplo, glicina, em uma concentração de cerca de 10 a cerca de 200 mM, de cerca de 25 a cerca de 175 mM, de cerca de 50 a cerca de 150 mM, de cerca de 75 a cerca de 125 mM, ou cerca de 100 mM.
[00015] Em outras modalidades, a formulação inclui ainda (opcionalmente) um agente de ajuste de tonicidade, por exemplo, uma molécula que rende a formulação substancialmente isotônica ou isso- osmótica com sangue humano. Agentes de ajuste de tonicidade incluem sacarose, sorbitol, glicina, metionina, manitol, dextrose, inositol, cloreto de sódio, arginina e cloridrato de arginina.
[00016] Em ainda outras modalidades, a formulação inclui ainda (opcionalmente) um estabilizador, por exemplo, uma molécula que, quando combinada com uma proteína de interesse (por exemplo, a molécula SDAB) previne ou reduz substancialmente a instabilidade química e/ou física da proteína de interesse na forma liofilizada, líquida ou de armazenagem. Estabilizadores exemplares incluem sacarose, sorbitol, glicina, inositol, cloreto de sódio, metionina, arginina, e clori- drato de arginina. Em certas modalidades, a formulação inclui um estabilizador em uma ou mais das seguintes faixas: Sacarose de cerca de 1% a cerca de 12% (por exemplo, cerca de 5%, cerca de 7,5%, cerca de 8% ou cerca de 10%); sorbitol de cerca de 1% a cerca de 7% (por exemplo, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%); inositol de cerca de 1% a cerca de 5%; glicina de cerca de 10 mM a cerca de 125 mM (por exemplo, cerca de 25 mM a 100mM, cerca de 80 mM, cerca de 90 mM, ou cerca de 10 mM); cloreto de sódio de cerca de 10 mM a 150 mM (por exemplo, cerca de 25 mM a 100 mM, cerca de 55 mM); metionina de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM (por exemplo, cerca de 10 mM, cerca de 20 mM, cerca de 100 mM); arginina de cerca de 10 mM a cerca de 125 mM (por exemplo, cerca de 25 mM a cerca de 120 mM, ou cerca de 100 mM); cloridrato de arginina de cerca de 10 mM a cerca de 70 mM (por exemplo, cerca de 10 mM a cerca de 65 mM, ou cerca de 55 mM).
[00017] Em outras modalidades, a formulação pode incluir ainda metionina, em uma concentração de cerca de 10 a cerca de 200 mM, de cerca de 25 a cerca de 175 mM, de cerca de 50 a cerca de 150 mM, de cerca de 75 a cerca de 125 mM, ou cerca de 100 mM.
[00018] Em uma modalidade, um componente da formulação pode funcionar como um ou mais de um lioprotetor, um agente de ajuste de tonicidade e/ou um estabilizador. Por exemplo, dependendo da concentração de um componente, por exemplo, sacarose, ele pode servir como um ou mais de um lioprotetor, um agente de ajuste de tonicidade e/ou um estabilizador. Em outras modalidades, onde vários dos componentes são requeridos em uma formulação, componentes diferentes são usados. Por exemplo, se a formulação requer um lioprote- tor, um agente de ajuste de tonicidade e um estabilizador, componentes diferentes são usados (por exemplo, sacarose, glicina e inositol podem ser usados em combinação resultando em uma combinação de um lioprotetor, um agente de ajuste de tonicidade e um estabilizador, respectivamente).
[00019] Em uma modalidade, a formulação inclui (a) uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo (por exemplo, uma molécula de ligação de nanocorpo de ligação de TNF) em uma concentração de cerca de 0,5 a cerca de 300 mg/mL, por exemplo, em cerca de 1 mg/mL, cerca de 10 mg/mL, cerca de 25 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 80 mg/mL, cerca de 88 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 118 mg/mL, cerca de 130 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, ou cerca de 250 mg/mL; (b) sacarose em uma concentração de cerca de 5% a cerca de 10%, por exemplo, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 6,5%, cerca de 7%, cerca de 7,5%, cerca de 8%, cerca de 10%; (c) polissorbato-80 em uma concentração de cerca de 0,6%, por exemplo, 0,01%, 0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5% ou 0,6%; (d) (opcionalmente) glicina em uma concentração de cerca de 0 a cerca de 100 mM, por exemplo, 100 mM; e (f) uma tampão de histidina (em uma concentração de cerca de 10 nM a cerca de 20 mM) ou um tampão Tris (em uma concentração de cerca de 20 mM), de modo que o pH da formulação seja de cerca de 5,0 a 7,5, por exemplo, 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5, ou 7.
[00020] Em uma modalidade, a formulação é uma formulação líquida. Em uma modalidade representativa, a formulação líquida inclui (a) uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo (por exemplo, uma molécula de nanocorpo de ligação de TNF) em uma concentração de cerca de 10 a cerca de 150 mg/mL, por exemplo, cerca de 25 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 80 mg/mL, cerca de 88 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 130 mg/mL; (b) sacarose em uma concentração de cerca de 5% a cerca de 10%, por exemplo, cerca de 7% a cerca de 8%, por exemplo, 7,5%; ou sorbitol de cerca de 1% a cerca de 7% (por exemplo, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%) (5) polissorbato-80 em uma concentração de cerca de, por exemplo, 0,01% a 0,02% (por exemplo, 0,01%); (d) (opcionalmente) glicina em uma concentração de cerca de 0 a cerca de 100 mM, por exemplo, 100mM; (e) (opcionalmente) metionina em uma concentração de cerca de 0 a cerca de 100 mM, por exemplo, 100 mM; e (f) um tampão de histidina (em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 20 mM) ou um tampão de Tris (em uma concentração de cerca de 20 mM), de modo que o pH da formulação seja de cerca de 5 a 75, por exemplo, 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 ou 7. A formulação líquida pode estar presente em um artigo de fabricação, tal como um dispositivo, um seringa ou um frasco com instruções de use. Em certas modalidades, a seringa ou frasco é composto de vidro, plástico, ou material po- limérico, tal como polímero de olefina cíclica ou copolímero. Em outras modalidades, a formulação pode estar presente em um dispositivo injetável (por exemplo, uma seringa injetável, por exemplo, uma seringa injetável preenchida). A seringa pode ser adaptada para administração individual, por exemplo, um sistema de frasco único incluindo um auto- injetor (por exemplo, um dispositivo de caneta injetora), e/ou instruções para uso. A formulação pode ser administrada a um paciente, por exemplo, um paciente, por injeção, por exemplo, administração periférica (por exemplo, administração subcutânea, intravascular, intramuscular ou intraperitoneal).
[00021] Em outras modalidades, a formulação é uma formulação liofilizada. Em uma modalidade representativa, a formulação liofilizada inclui a) uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nano- corpo (por exemplo, uma molécula de nanocorpo de ligação de TNF) em uma concentração de cerca de 10 a cerca de 150 mg/mL, por exemplo, cerca de 25 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 80 mg/mL, cerca de 88 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca 118 mg/mL, cerca de 130 mg/mL; (b) sacarose em uma concentração de cerca de 5% a cer- ca de 10%, por exemplo, cerca de 4% a cerca de 7%, por exemplo, 5%; (c) polissorbato-80 em uma concentração de cerca de, por exemplo, 0,01% a 0,02% (por exemplo, 0,01%); (d) (opcionalmente) glicina em uma concentração de cerca de 0 a cerca de 100 mM, por exemplo, 100 mM; (e) (opcionalmente) metionina em uma concentração de cerca de 0 a cerca de 100 mM, por exemplo, 100 mM; e (f) um tampão de histidina (em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 20 mM, por exemplo, cerca de 20 mM0, ou um tampão de Tris (em uma concentração de cerca de 20 mM), de modo que o pH de formulação seja de cerca de 5 a 7,5, por exemplo, 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 ou 7. A formulação liofilizada pode ser reconstituída misturando-se o liofilizado com uma composição aquosa adequada.
[00022] Em ainda outras modalidades, a formulação é uma formulação de armazenagem a granel. Em uma modalidade representativa, a fórmula de armazenagem a granel inclui (a) uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo (por exemplo, uma molécula de nanocorpo de ligação de TNF) em uma concentração de cerca de 80mg/mL a 300 mg/mL, por exemplo, cerca de 150 mg/mL, cerca de 175 mg/mL, cerca de 200 mg/mL, cerca de 250 mg/mL, cerca de 275 mg/mL, ou cerca de 300 mg/mL; (b) sacarose em uma concentração de cerca de 5% a cerca de 10%, por exemplo, cerca de 4% a cerca de 8%, por exemplo, 5%, ou 7,5%; (c) polissorbato-80 em uma concentração de cerca de, por exemplo, 0,01% a 0,02%; (d) (opcionalmente) glicina em uma concentração de cerca de 0 a cerca de 100 mM, por exemplo, 100 mM; (e) (opcionalmente) metionina em uma concentra-ção de cerca de 0 a cerca de 100 mM, por exemplo, 100 mM; e (f) um tampão de histidina (em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 20 mM) ou um tampão de Tris (em uma concentração de cerca de 20 mM), de modo que o pH da formulação é de cerca de 5 a 6,5, por exemplo, 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 ou 7. A formulação de armazena- gem a granel pode ser congelada. Em certas modalidades, a formulação de armazenagem a granel pode ser preparada em larga escala, por exemplo, maior que 10 litros, 50 litros, 100, 150, 200 ou mais litros.
[00023] Em certas modalidades, a molécula SDAB, por exemplo, a molécula de nanocorpo (por exemplo, a molécula de nanocorpo de ligação de TNF) da formulação inclui um ou mais domínios de ligação única (por exemplo, um ou mais nanocorpos), Por exemplo, a molécula de nanocorpo pode compreender, ou consistir em, um polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo de cadeia simples, que compreende pelo menos um domínio variável de imunoglobulina (incluindo uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRSs)). Exemplos de moléculas SDAB incluem moléculas naturalmente isentas de cadeias leves (por exemplo, VHH, nanocorpos, ou anticorpos derivados de camelídeos). Tais moléculas SDAB podem ser derivadas ou obtidas de camelídeos tais como camelo, lhama, dromedário, alpaca e guanaco. Em outras modalidades, a molécula SDAB pode incluir moléculas de domínio único incluindo, mas sem limitação, outras moléculas de domínio único naturais, tais como polipeptídeos de domínio único de tubarão (IgNAR); e arcabouços de domínio único (por exemplo, arcabouços de fibronectina). Moléculas de domínio único podem ser derivadas de tubarão.
[00024] Em uma modalidade, a molécula SDAB da formulação é um polipeptídeo de cadeia simples contendo uma ou mais moléculas de domínio único. Em modalidades, a molécula de nanocorpo é monovalente ou multivalente (por exemplo, bivalente, trivalente, ou tetravalente). Em outras modalidades, a molécula de nanocorpo é monoespecífi- ca ou multiespecífica (por exemplo, biespecífica, triespecífica ou tetra- específica). A molécula de SDAB pode compreender uma ou mais moléculas de domínio único que são recombinantes, enxertadas com CDR, humanizadas, camelizadas, desimunizadas, e/ou geradas in vi tro (por exemplo, selecionadas por exibição de fago). Por exemplo, a molécula de SDAB pode ser um polipeptídeo de fusão de cadeia simples que compreende um ou mais moléculas de domínio único que se ligam a um ou mais antígenos-alvos. Tipicamente, o antígeno-alvo é uma proteína de mamífero, por exemplo, de ser humano. Em certas modalidades, a molécula SDAB se liga a uma proteína sérica, por exemplo, proteínas séricas humanas, selecionada de um ou mais de albumina sérica (HSA)), fibrina, fibrinogênio, ou transferrina.
[00025] Em uma modalidade exemplar, a molécula SDAB da formulação é uma molécula biespecífica, trivalente, composta de uma fusão de polipeptídeo de cadeia simples de duas moléculas de domínio único (por exemplo, duas regiões variáveis de camelídeo) que se ligam a um antígeno-alvo, por exemplo, fator-α de necrose tumoral (TNF-α), e uma molécula de domínio único (por exemplo, uma região variável de camelídeo) que se liga a uma proteína sérica, por exemplo, HSA. As moléculas de domínio único da molécula SDAB podem ser dispostas na seguinte ordem de terminação N a C: molécula de domínio único de ligação de TNF-α - molécula de domínio único de ligação de TNF-α - molécula de domínio único de ligação de HSA - molécula de domínio único de ligação de TNF-α. Será apreciado que qualquer ordem ou combinação de moléculas de domínio único contra um ou mais alvos pode ser formulada conforme descrição aqui.
[00026] Em uma modalidade, a molécula SDAB da formulação, referida aqui como "ATN-103", compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos mostrada na figurafigura 30 (SEQ ID NO: 1), ou uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mesma (por exemplo, uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais, idêntica a ou tendo até 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 alteração de aminoácidos (por exemplo, deleções, inserções ou substituições (por exemplo, substituições conservativas) com relação à sequência de aminoácidos mostrada na figurafigura 30). Exemplos de moléculas de nanocorpo biespecíficas, trivalentes, adicionais, que podem ser formuladas conforme descritas aqui incluem TNF24, TNF25, TNF26, TNF27, TNF28, TNF60 e TNF62 descritas na Tabela 29 de WO 2006/122786.
[00027] Em certas modalidades, pelo menos uma molécula de domínio único da molécula SDAB da formulação que se liga ao TNF-a inclui uma, duas ou três CDRs tendo a sequência de aminoácidos: DYWMY (SEQ ID NO:2) (CDR1), EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO:3) (CDR2) e/ou SPSGFN (SEQ ID NO:4) (CDR3), ou tendo uma CDR que difere por menos que 3, 2 ou 1 substituição de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas) de uma das ditas CDRs. Em outras modalidades, a molécula de domínio simples compreende uma região variável tendo a sequência de aminoácidos de cerca de 1 a 115 aminoácidos da figurafigura 30 ou uma sequência de aminoáci- dos substancialmente idêntica à mesma (por exemplo, uma sequência de aminoácidos de pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idênticas a, ou tendo até 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 alteração de aminoácido (por exemplo, deleções, inserções ou substituições (por exemplo, substituições conservativas) com relação à sequência de aminoácidos mostrada na figurafigura 30). Em modalidades, a molécula de domínio único de ligação de TNF-a tem uma ou mais atividades biológicas da molécula de anticorpo de domínio único de ligação de TNF-a mostrada na figurafigura 30. Por exemplo, a molécula de domínio único de ligação de TNF-a se liga ao mesmo ou a um epítopo similar que o epítopo reconhecido pela molécula de domínio único de ligação de TNF-a mostrado na figurafigura 30 (por exemplo, se liga ao TNF-a em sua forma intrínseca; se liga ao sítio de TNF-a em sua forma trimérica; se liga ao sítio de TNF-a contatando o receptor de TNF-a; se liga a um epítopo no trímero de TNF-a que compreende Gln na posição 88 e Lys na posição 90 no primeiro monômero de TNF (monômero A), e Glu na posi ção 146 no segundo monômero de TNF (monômero B), ou um epítopo conforme descrito no WO 06/122786). Em outra modalidade, a molécula de domínio único de ligação de TNF-α tem uma atividade (por exemplo, afinidade de ligação, constante de dissociação, especificidade de ligação, atividade inibidora de TNF) similar àquela da molécula de domínio único de ligação de TNF-a descrita no WO 06/122786.
[00028] Em outras modalidades, a molécula de nanocorpo de ligação de TNF-a compreende um ou mais dos anticorpos descritos no WO 2006/12786. Por exemplo, a molécula de nanocorpo de ligação de TNF-a pode ser uma molécula de nanocorpo de ligação de TNF-a monovalente, bivalente e trivalente descrita no WO 2006/122786. Exemplos de nanocorpos de ligação de TNF-a incluem, mas sem limitação, TNF1, TNF2, TNF3, e formas humanizadas destes (por exemplo, TNF29, TNF30, TNF31, TNF32, TNF33). Exemplos adicionais de na- nocorpos de ligação de TNF-a monovalente estão descritos na Tabela 8 do WO 2006/122786. Exemplos de moléculas de nanocorpos de ligação de TNF-a bivalentes incluem, mas sem limitação, TNF55 e TNF56, que compreendem dois nanocorpos de TNF30 ligados via um ligante de peptídeo para formar um polipeptídeo de fusão simples (descrito no WO 2006/122786). Exemplos adicionais de moléculas de nanocorpos de ligação de TNF-a bivalente são descritos na Tabela 19 do WO 2006/122786 como TNF4, TNF5, TNF6, TNF7, TNF8.
[00029] Em outras modalidades, pelo menos uma molécula de domínio único da molécula SDAB da formulação que se liga a HSA inclui uma, duas ou três CDRs tendo a sequência de aminoácidos: SFGMS (SEQ ID NO:5) (CDR1), SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:6)(CDR2) e/ou GGSLSR (SEQ ID NO:7) (CDR3), ou tendo uma CDR que difere de menos que 3, 2 ou 1 substituição de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas) de uma das ditas CDRs. Em outras modalidades, a molécula de domínio único compreende uma região variável tendo a sequência de aminoácidos de cerca de 125 a 239 aminoácidos da figurafigura 30 (SEQ ID NO:1), ou uma sequência de aminoácidos substancialmente similar à mesma (por exemplo, uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica a, ou tendo até, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 alteração de aminoácidos (por exemplo, deleções, inserções ou substituições (por exemplo, substituições conservativas) com relação à sequência de aminoácidos mostrada na figura 30 (SEQ ID No: 11)). Em modalidades, a molécula de domínio único de HSA tem uma ou mais atividades biológicas da molécula de domínio único de ligação de HSA mostrada na figurafigura 30 (SEQ ID NO:1). Por exemplo, a molécula de domínio único de ligação de HSA se liga ao mesmo ou a um epítopo similar reconhecido pela molécula de domínio único de ligação de HSA mostrada na figura- figura 30 (SEQ ID NO:1). Em outras modalidades, a molécula de do-mínio único de ligação de HSA tem uma atividade (por exemplo, afinidade de ligação, constante de dissociação, especificidade de ligação) similar a qualquer uma de a molécula de domínio único de ligação de HSA descrita no WO 06/122786.
[00030] Em outras modalidades, a molécula SDAB de ligação de HSA compreende um ou mais dos nanocorpos descritos no WO 2006/122786. Por exemplo, a molécula SDAB de ligação de HSA pode ser uma molécula de nanocorpo de ligação de HSA monovalente, bivalente, trivalente descrita no WO 2006/122786. Em outras modalidades, a molécula SDAB de ligação de HSA pode ser uma molécula monoes- pecífica ou multiespecífica tendo pelo menos uma das especificidades de ligação que se liga a HSA. Exemplos de nanocorpos de ligação de TNF-α incluem, mas sem limitação, ALBI, formas humanizadas deste (por exemplo, ALB6, ALB7, ALB8, ALB9, ALB10) descritas no EO 06/122786.
[00031] Em outras modalidades, duas ou mais das moléculas de domínio único das moléculas SDAB são fundidas com ou sem um grupo de ligação, como uma fusão genética ou de polipeptídeo. O grupo de ligação pode ser qualquer grupo de ligação aparente para aqueles versados na técnica. Por exemplo, o grupo de ligação pode ser um polímero biocompatível com um comprimento de 1 a 100 átomos. Em uma modalidade, o grupo de ligação inclui ou consiste em poliglicina, polisserina, polilisina, poliglutamato, poli-isoleucina, ou resíduos de poliarginina, ou combinações destes. Por exemplo, os ligantes de poli- glicina ou de polisserina podem incluir pelo menos cindo, sete, oito, nove, dez, doze, quinze, vinte, trinta, trinta e cinco e quarenta resíduos de glicina e de serina. Exemplos de ligantes, que podem ser usados, incluem repetições de Gly-Ser, por exemplo, repetições de (Gly)4-Ser (SEQ ID NO:8) em um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais re-petições. Em modalidades, o ligante tem as seguintes sequências; (Gly)4-Ser-(Gly)3-Ser (SEQ ID NO: 9) or ((Gly)4-Ser)n (SEQ ID NO: 10), em que n é 4, 5, ou 6.
[00032] As formulações da invenção podem incluir uma molécula SDAB que é modificada por associação, por exemplo, covalente ou não-covalente com uma segunda fração. Por exemplo, a molécula de nanocorpo pode ser covalentemente ligada a um polímero farmacolo- gicamente aceitável, adequado, tal como polietileno glicol (PEG) ou um derivado deste (tal como metoxipoli(etilenoglicol) ou mPEG). Exemplos de molécula de nanocorpo peguiladas estão descritas como TNF55-PEG40, TNF55-PEG60, TNF56-PEG40 e TNF56-PEG60 no WO 06/122786.
[00033] Em outra modalidade, as formulações da invenção são estáveis para pelo menos 3, 6, 9, 12 meses (por exemplo, pelo menos 24, 30, 36 meses), em uma temperatura de cerca de 2oC até cerca de 25oC (por exemplo, cerca de 4oC ou 25oC). Em certas modalidades, a integridade da molécula SDAB é mantida depois da armazenagem na formulação para pelo menos 3, 6, 9, 12 meses (por exemplo, cerca de 4oC ou 25oC). Por exemplo, a molécula SDAB na formulação retém pelo menos 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou até 100% de uma atividade biológica, por exemplo, atividade de ligação de molécula SDAB depois da armazenagem a uma temperatura de cerca de 2oC a cerca de 25oC (por exemplo, cerca de 4oC ou 25oC). Em algumas modalidades, a formulação inclui menos que 10%, 9%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos espécies de alto peso molecular (HMW) depois da armazenagem na formulação por cerca de pelo menos 3, 6, 9, 12 meses (por exemplo, pelo menos 24, 30, 36 meses), a uma temperatura de cerca de 2oC a cerca de 25oC (por exemplo, cerca de 4oC ou 25oC). Em outras modalidades, a formulação inclui menos que 10%, 9%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos espécies de baixo peso molecular após a armazenagem na formulação por pelo menos 3, 6, 9, 12 meses (por exemplo, pelo menos 24, 30, 36 meses), a uma temperatura de cerca de 2oC a cerca de 25oC (por exemplo, cerca de 4oC ou 25oC). Em ainda outras modalidades, a formulação inclui menos que 10%, 9%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos espécies ácidas após armazenagem na formulação por pelo menos cerca de 3, 6, 9, 12 meses (por exemplo, pelo menos 24, 30, 36 meses), a uma temperatura de cerca de 2oC a cerca de 25oC (por exemplo, cerca de 4oC ou 25oC). Em ainda outras modalidades, a formulação inclui 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos espécies depois da armazenagem na formulação por pelo menos 3, 6, 9, 12 meses (por exemplo, por pelo menos 24, 30, 36 meses), a uma temperatura de cerca de 2oC a cerca de 25oC (por exemplo, cerca de 4oC ou 25oC). As espécies de HMW, LMW, ácidas e básicas podem ser detectadas em formulações usando técnicas padrão, tal como cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão de tamanho (SEC-HPLC) e similar conforme descrita aqui.
[00034] Em algumas modalidades, mediante reconstituição da formulação SDAB liofilizada, a formulação retém pelo menos 80%, 90%, 95% ou mais da estrutura de SDAB em comparação à formulação antes da liofilização. Estrutura de SDAB é determinada, por exemplo, por ensaio de ligação, bioensaio, ou a razão das espécies de HMS para as espécies de LMW.
[00035] As formulações da invenção podem ser também um segundo agente, por exemplo, um segundo agente terapeuticamente ou far- macologicamente ativa que é útil no tratamento de um distúrbio associado ao TNF-α, por exemplo, distúrbios inflamatórios ou autoimunes, incluindo, mas sem limitação, artrite reumatoide (RA) (por exemplo, artrite moderada a grave), condições artríticas (por exemplo, artrite psoriática, artrite idiopática juvenil poliarticular (JIA), espondilite anqui- losante (AS), psoríase, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença do intestino inflamatório, e/ou esclerose múltipla. Por exemplo, o segundo agente pode ser um anticorpo anti-TNF ou um fragmento de ligação de TNF deste, em que o segundo anticorpo de TNF de liga a um epítopo diferente da molécula SDAB de ligação de TNF da formulação. Outros exemplos não limitativos de agentes que podem coformulados com a molécula SDAB de ligação de TNF, incluem, mas sem limitação, um inibidor de citocina, um inibidor de fator de crescimento, um imunossu- pressor, um agente antiinflamatório, um inibidor metabólico, um inibidor de enzima, um agente citotóxico, e um agente citostático. Em uma modalidade, o agente adicional é um tratamento padrão para artrite, incluindo, mas sem limitação, agentes antiinflamatórios não-esteroides (NSAIDs); corticosteroides, incluindo predinisolona, prednisona, corti- sona, e triancinolona; e fármacos antirreumáticos modificador de doença (DMARDs), tais como metotrexato, hidroxicloroquina (Plaquenil) e sulfasalazina, leflunomida (Arava®), inibidores de fator de necrose tumoral, incluindo etanercepte (Enbrel)R)), infliximabe (Remicade®) (com ou sem metotrexato), e adalimumabe (Humira®), anticorpo anti- CD20 (por exemplo, Rituxan®), receptor de interleucina-1 solúvel, tais como anaquira (Kineret®), ouro, minociclina (Minocin®), penicilamina, e agentes citotóxicos. Tais terapias de combinação podem utilizar vantajosamente utilizam dosagens inferiores dos agentes terapêuticos administrados, evitando, assim, toxicidades e complicações possíveis associadas às várias monoterapias.
[00036] A combinação alternativa de excipientes e/ou segundos agentes terapêuticos pode ser identificada e testada seguindo as instruções proporcionadas aqui.
[00037] Em ainda outra modalidade, as formulações descritas aqui são adequadas para administração a um paciente, por exemplo, um paciente humano (por exemplo, um paciente com distúrbio associado ao TNF-α). A formulação pode ser administrada ao paciente por injeção (por exemplo, subcutânea, intravascular, intramuscular ou intraperitoneal) ou por inalação.
[00038] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método ou processo para preparar as formulações descritas aqui. O método ou processo inclui: expressar a molécula em uma cultura de células; purificar a molécula SDAB, por exemplo, submetendo a molécula SDAB a pelo menos uma de uma etapa de purificação por cromatografia, etapas de ultrafiltração/diafiltração; ajustar a concentração da molécula SDAB, por exemplo, para cerca de 10 a 250 mg/mL em uma formulação contendo um lioprotetor, um agente tensoativo e um tampão conforme descrição aqui, por exemplo, sacarose em uma concentração de cerca de 5% a cerca de 10%, por exemplo, cerca de 5%, cerca de 10%; polissorbato-80 em uma concentração de cerca de 0 a cerca de 0,02%, por exemplo, 0,01%, 0,02%; (opcionalmente) glicina em uma concentração de cerca de 0 a cerca de 100 mM, por exemplo, 100 mM; (opcionalmente) metionina em uma concentração de cerca de 0 a cerca de 100 mM. Por exemplo, 100 mM; e (f) uma histidina (em uma concentração de cerca de 10 a cerca de 20 mM) ou um tampão de Tris (em uma concentração de cerca de 20 mM), de modo que o pH da formulação é de cerca de 5 a 7,5, por exemplo, 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 ou 7.
[00039] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método ou processo para preparar uma formulação reconstituída que contém uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula SDAB conforme descrita aqui. O método inclui: liofilizar uma mistura de uma molécula SDAB, um lioprotetor, um agente tensoativo, e um tampão, formando, assim, uma mistura liofilizada; e reconstituir a mistura liofilizada em um diluen- te, preparando, assim, uma formulação conforme descrita aqui. Em uma modalidade, a formulação inclui (a) uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo de ligação de TNF em uma concentração de cerca de 0,5 a cerca de 200 mg/mL, por exemplo, em cerca de 1 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 80 mg/mL, cerca de 88 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 118 mg/mL; (b) sacarose em uma concentração de cerca de 5% a cerca de 10%, por exemplo, cerca de 5%, cerca de 10%; (c) polissorbato-80 em uma concentração de cerca de 0 a cerca de 0,02%, por exemplo, 0,01%, 0,02%; (d) (opcionalmente) glicina em uma concentração de cerca de 0 a cerca de 100 mM, por exemplo, 100 mM; (e) (opcionalmente) metionina em uma concentração de cerca de 0 a cerca de 100 mM, por exemplo, 100 mM; e (f) uma histidina (em uma concentração de cerca 10 a cerca de 20 mM) ou um tampão de Tris (em uma concentração de cerca de 20 mM), de modo que pH da formulação é de cerca de 5 a 7,5, por exemplo, 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 ou 7.
[00040] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para tratar ou prevenir um paciente (por exemplo, um paciente humano) contra doença associada ao TNF-a, por exemplo, distúrbios inflamató- rios ou autoimunes, incluindo, mas sem limitação, artrite reumatoide (RA) (por exemplo, artrite de moderada à grave), condições artríticas (por exemplo, artrite psoriática, artrite idiopática juvenil poliarticular (JIA), espondilite anquilosante (AS), psoríase, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, e/ou esclerose múltipla. O método inclui administrar a um paciente, por exemplo, um paciente humano, uma composição farmacêutica que inclui uma formulação de SDAB de ligação de TNF conforme descrita aqui, por exemplo, uma formulação contendo uma molécula SDAB de ligação de TNF, sozinha ou em combinação com qualquer uma das terapias descritas aqui, em uma quantidade tal que um ou mais dos sintomas do distúrbio associado ao TNF-α sejam reduzidos.
[00041] Em outro aspecto, a invenção se refere a um kit ou artigo de fabricação que inclui um dispositivo, seringa ou ampola contendo as formulações descritas aqui. O kit ou artigo podem incluir, opcionalmente, instruções para uso. Em certas modalidades, a seringa ou ampola é composta de material de vidro, de plástico ou polimérico, tal como um polímero ou copolímero de olefina cíclica. Em outras modalidades, a formulação pode estar presente em um dispositivo injetável (por exemplo, uma seringa injetável, por exemplo, uma seringa injetável preenchida). A seringa pode ser adaptada para administração individual, por exemplo, um sistema de ampola simples que inclui um au- toinjetor (por exemplo, um dispositivo de caneta injetora), e/ou instruções para uso. Em uma modalidade, o dispositivo injetável é uma caneta preenchida ou outro dispositivo autoinjetável adequado, opcionalmente com instruções para uso de administração.
[00042] Em certas modalidades, o kit ou artigo de fabricação (por exemplo, a caneta ou seringa preenchida com uma unidade de dose única ou múltipla) é fornecido a um paciente, por exemplo, um paciente ou um provedor de assistência médica, pré-embalado com instruções para administração (por exemplo, autoadministração) por injeção (por exemplo, subcutânea, intravascular, intramuscular ou intraperitoneal).
[00043] Em outras modalidades, a invenção se refere a um dispositivo para administração nasal, transdérmica, intravenosa das formulações descritas aqui. Por exemplo, é proporcionado um adesivo trans- dérmico para administração das formulações descritas aqui. Em outros casos, uma bolsa intravenosa para administração das formulações descritas aqui é proporcionada. Em modalidades, a bolsa intravenosa é provida de solução salina normal ou dextrose a 5%.
[00044] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para instruir um paciente (por exemplo, um paciente humano) que necessite de uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo de TNF-a, a administrar uma formulação descrita aqui. O método inclui: (i) fornecer ao paciente pelo menos uma dose unitária de uma formulação da molécula SDAB descrita aqui; e (ii) instruir o paciente a auto- administrar a pelo menos uma dose unitária, por exemplo, por injeção (por exemplo, subcutânea, intravascular, intramuscular ou intraperitoneal). Em uma modalidade, o paciente tem um distúrbio associado ao TNF-a, por exemplo, distúrbios inflamatórios ou autoimunes conforme descritos aqui.
[00045] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para instruir um recipiente sobre a administração de uma formulação de molécula de nanocorpo de TNF-a conforme descrita aqui. O método inclui instruir o recipiente (por exemplo, um usuário final, paciente, clínico, farmácia de venda a varejo ou de atacado, distribuidor, ou departamento de farmácia em um hospital, clínica de assistência a idosos ou HMO) sobre como a formulação deve ser administrada ao paciente.
[00046] Em outro aspecto, é proporcionado um método de distribuir uma formulação de uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo de TNF-a, conforme descrita aqui. O método incluir pro- porcionar um recipiente (por exemplo, um usuário final, paciente, clínico, farmácia de venda a varejo ou de atacado, distribuidor, ou departamento de farmácia em um hospital, clínica de assistência a idosos ou HMO) com uma embalagem contendo doses unitárias suficientes da molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo de TNF-a, para tratar um paciente por pelo menos 6, 12, 24, ou 36 meses.
[00047] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método ou processo para avaliar a qualidade de uma embalagem ou de um lote de embalagens (por exemplo, para determinar se expirou) de uma formulação descrita aqui contendo uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo de TNF-a. O método inclui avaliar se a embalagem expirou. A data de validade é de pelo menos 6, 12, 24, 36, ou 48 meses, por exemplo, mais que 24 ou 36 meses, de um evento pré-selecionado, tal como fabricar, ensaiar, ou embalar. Em algumas modalidades, uma decisão ou etapa é tomada como resultado da análise, por exemplo, a molécula SDAB na embalagem é usada ou descartada, classificada, selecionada, liberada ou retirada, expedida, movida para um novo local, liberada para comercialização, vendia, oferecida a venda, retirada do comércio ou não mais oferecida à venda, dependendo de se o produto expirou.
[00048] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para armazenar, distribuir, ou usar uma formulação de uma molécula de SDAB, por exemplo, uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo de TNF, descrita aqui. O método inclui: armazenar a formulação por um período em uma dada temperatura, por exemplo, menos que 25oC, por exemplo, abaixo de ponto de congelamento ou abaixo de 15oC, ou 4oC. Em modalidades, o método inclui ainda proporcionar a formulação a um recipiente, por exemplo, um usuário final, por exemplo, um paciente ou um assistente de saúde, para armazenagem sob condições similares ou diferentes (por exemplo, uma tempe- ratura mais alta que a do primeiro período de armazenagem. A formulação pode ser uma formulação líquida, liofilizada ou reconstituída.
[00049] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para analisar um produto ou um processo, por exemplo, processo de fabricação. O método inclui proporcionar uma formulação de uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo de TNF, conforme descrita aqui, e avaliar um parâmetro da formulação, tais como cor (por exemplo, de incolor até levemente amarela, ou de incolor até amarela), claridade (por exemplo, clara até levemente opalescente ou clara até opalescente), ou viscosidade (por exemplo, entre aproximadamente 1 a 5 cP quando medida na temperatura ambiente, tal como 20oC-30oC, por exemplo, 25oC), quantidade de uma ou mais espécies de HMW, LMW, ácidas e/ou básicas, conforme descritas aqui. A avaliação pode incluir a avaliação de um ou mais parâmetros. Opcionalmente, a determinação de se o parâmetro satisfaz um critério pré- selecionado, por exemplo, se os critérios pré-selecionados estão presentes, ou estão presentes em uma faixa pré-selecionada, são determinados, analisando, assim, o processo.
[00050] Em uma modalidade, a avaliação do processo inclui a medição da estabilidade da formulação da molécula SDAB. A estabilidade da formulação de anticorpo pode ser medida, por exemplo, por formação de agregados, que é ensaiado, por exemplo, por cromatografia líquida de alta pressão de exclusão de tamanho (SE-HPLC), por cor, claridade, viscosidade, conforme descrição aqui. Uma formulação pode ser determinada para ser estável, e, portanto, aceitável para posterior processamento ou distribuição, se a alteração é um parâmetro de ensaio for menor que cerca de 10%, 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,05% ou 0,005% ou menos, em um período de tempo pré-selecionado, e, opcionalmente, em uma dada temperatura.
[00051] Em uma modalidade, o método inclui ainda comparar o va- lor determinado com um valor de referência, para, assim, analisar o processo de fabricação.
[00052] Em uma modalidade, o método inclui ainda manter o processo de fabricação baseado, pelo menos em parte, na análise. Em uma modalidade, o método inclui ainda alterar o processo de fabricação com base na análise.
[00053] Em uma outra modalidade, o método inclui avaliar um processo, por exemplo, processo de fabricação, de uma formulação de molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo de TNF, feita por um processo selecionado, que inclui fazer a determinação sobre o processo com base no método ou análise descrita aqui. Em uma modalidade, o método inclui ainda manter ou alterar o processo de fabricação com base, pelo menos em parte, no método ou análise. Assim, em outra modalidade, a parte que faz a avaliação não pratica o método ou análise descrita aqui, mas simplesmente confia nos resultados que são obtidos pelo método ou análise descrito aqui.
[00054] Em uma outra modalidade, o método inclui comparar duas ou mais preparações em um método para monitorar ou controlar a variação de batelada para batelada ou para comparar uma preparação com um padrão de referência.
[00055] Em ainda outra modalidade, o método pode incluir ainda tomar uma decisão, por exemplo, para classificar, selecionar, aceitar ou descartar, liberar ou manter, um processo para um fármaco, expedir, mover para um local diferente, formular, etiquetar, embalar, liberar para o comércio, vender ou oferecer para venda a preparação, com base, pelo menos em parte, mediante a determinação.
[00056] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para avaliar a qualidade de uma formulação de uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo de TNF, conforme descrita aqui, por exemplo, em uma análise de controle de qualidade ou de especifi- cação de liberação. O método inclui proporcionar avaliação de uma formulação da molécula SDAB quanto a um parâmetro, tal como cor (por exemplo, de incolor para levemente amarelo, ou incolor para amarelo), claridade (por exemplo, claro para levemente opalescente ou claro para opalescente), ou viscosidade (por exemplo, entre aproximadamente 1 e 5 cP quando medida na temperatura ambiente, tal como a 20oC-30oC, por exemplo, a 25oC). A avaliação pode incluir a avaliação de um ou mais dos parâmetros acima. O método inclui, também, opcionalmente, determinar se o parâmetro da solução satisfaz um critério pré-selecionado, por exemplo, se o critério pré-selecionado está presente, ou se está presente em uma faixa pré-selecionada. Se o parâmetro da solução observado está dentro de uma faixa pré-selecio- nada de valores, ou satisfaz os critérios padrão pré-selecionados, então a preparação é selecionada, tal como para embalar, usar, vender, liberar para o comércio, descartar, etc.
[00057] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para cumprir com uma exigência reguladora, por exemplo, exigência pós- aprovação de agência reguladora, por exemplo, o FDA. O método inclui proporcionar a avaliação de uma formulação de anticorpo para um parâmetro, conforme descrito aqui. A exigência pós-aprovação pode incluir a medição de um ou mais dos parâmetros acima. O método inclui também, opcionalmente, determinar se o parâmetro observado acima satisfaz um critério pré-selecionado ou se o parâmetro está em uma faixa pré-selecionada; materializar opcionalmente o valor ou o resultado da análise, ou comunicar com a agência, por exemplo, por transmissão do valor ou do resultado para a agência reguladora.
[00058] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para preparar uma batelada de uma formulação da molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo de TNF, com uma propriedade pré-selecionada, por exemplo, satisfazer uma especificação de libera- ção, exigência de etiqueta, ou exigência compendial, por exemplo, uma propriedade descrita aqui. O método inclui proporcionar uma formulação de teste; analisar a formulação de teste de acordo com um método descrito aqui; determinar se a formulação de teste satisfaz o critério pré-selecionado, por exemplo, ter uma relação pré-selecionada com o valor de referência, por exemplo, um ou mais valores de referência descritos aqui, e selecionar a preparação de anticorpo de teste para preparar a batelada do produto.
[00059] Em outro aspecto, a invenção se refere a bateladas múltiplas de uma formulação de uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo de TNF, em que um ou mais parâmetros (por exemplo, um valor ou parâmetro de solução determinado por um método descrito aqui), para cada batelada varia menos que uma faixa pré-selecionada de um valor de referência desejado, pré-selecionado, por exemplo, uma faixa ou critérios descrito aqui. Em algumas modalidades, um ou mais parâmetros para uma ou mais bateladas da formulação são determinados e uma batelada ou bateladas selecionadas como resultado da determinação. Algumas modalidades incluem comparar os resultados da determinação para um valor ou critérios pré- selecionados, por exemplo, um padrão de referência. Outras modalidades incluem ajuste da dose da batelada a ser administrada, por exemplo, com base no resultado da determinação do valor ou parâmetro.
[00060] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método de um ou mais de: proporcionar um relatório para uma entidade receptora de relatórios, avaliar a amostra de uma formulação de uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo de TNF, para cumprir com um padrão de referência, por exemplo, uma exigência do FDA, procura indicação de outra parte de que a preparação da molécula de SDAB satisfaz alguma exigência pré-definida, ou submeter informação sobre uma preparação de uma molécula SDAB para outra parte. Exemplos de entidades receptoras ou outras partes incluem governo, por exemplo, o governo federal norte-americano, por exemplo, uma agência do governo, por exemplo, o FDA. O método inclui uma ou mais (ou todas) das seguintes etapas para preparar e/ou testar uma formulação aquosa da molécula SDAB em um primeiro país, por exemplo, nos Estados Unidos; enviar pelo menos uma alíquota da amostra para fora do país, por exemplo, enviá-la para fora dos Estados Unidos, para um segundo país; preparar, ou receber, um relatório que inclui dados sobre a estrutura da preparação da molécula SDAB, por exemplo, dados relacionados a uma estrutura e/ou cadeia descrita aqui, por exemplo, dados gerados por um ou mais dos métodos descritos aqui; e proporcionar o dito relatório para uma entidade receptora de relatório.
[00061] Em uma modalidade, a entidade receptora de relatório pode determinar se a exigência predeterminada ou valor de referência é satisfeita pelos dados e, opcionalmente, uma resposta da entidade receptora de relatório é recebida, por exemplo, por um fabricante, distribuídos ou vendedor de uma formulação de uma molécula SDAB. Em uma modalidade, mediante recibo de aprovação da entidade receptora de relatório, a preparação da formulação de molécula SDAB é selecionada, embalada, ou colocada no comércio.
[00062] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para avaliar uma formulação de uma molécula SDAB. O método inclui receber dados com respeito à presença ou nível da molécula SDAB, por exemplo, em que os dados foram preparados por um ou mais métodos descritos aqui; proporcionar um registro que inclua os ditos dados e que inclua opcionalmente um identificador para a batelada da molécula SDAB; submeter o dito registro ao responsável pela tomada de decisões, por exemplo, uma agência do governo, por exemplo, o FDA; rever, opcionalmente, uma comunicação do responsável pela tomada de decisões; decidir, opcionalmente, se libera ou comercializa a batelada de molécula SDAB com base na comunicação do responsável pela tomada de decisões. Em uma modalidade, o método inclui ainda liberar a amostra;
[00063] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporados, a título de referência, na íntegra.
[00064] A menos que indicado de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme co- mumente entendido por aquele versado na técnica à qual essa invenção pertence. Embora os métodos e materiais ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou testes da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos aqui. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos somente e não são limitativos.
[00065] Outras características e vantagens da invenção tornar-se- ão aparentes da descrição detalhada, desenhos, e das reivindicações.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00066] A figura 1 mostra os resultados da atividade biológica de uma formulação liofilizada de 106 U/mg do nanocorpo de ligação de TNF (ATN-103) armazenada como uma preparação em pó seco (DP) por até 6 meses. A formulação foi armazenada nas temperaturas indicadas.
[00067] A figura 2 mostra os resultados da atividade de ligação de Albumina Sérica Humana (HSA) de uma formulação liofilizada de na- nocorpo da ligação de TNF (ATN-103). Os resultados são mostrados como percentagem (%) do padrão de referência de nanocorpo de ligação de TNF.
[00068] A figura 3 mostra os resultados para a HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC) em termos de % de espécies de alto peso molecular (HMW) para a formulação liofilizada.
[00069] A figura 4 mostra os resultados de eletroforese capilar com SDS (SDS-CE) em termos de % de nanocorpo de ligação de TNF para formulação liofilizada.
[00070] A figura 5 mostra os resultados de SE-HPLC para % de espécies de HMW para formulação submetida aos ciclos de controle e robustez de liofilização.
[00071] A figura 6 mostra os resultados da atividade biológica de 106 U/mg de nanocorpo de ligação de TNF depois da armazenagem por até seis meses em uma formulação líquida de alta concentração.
[00072] A figura 7 mostra os resultados da atividade de ligação da Albumina Sérica Humana (HSA) (percentagem do Padrão de Referência de nanocorpo de ligação de TNF) de formulação líquida de alta concentração, por até seis meses nas temperaturas indicadas.
[00073] A figura 8 mostra os resultados de SE-HPLC para espécies de HMW de formulação líquida de alta concentração depois da armazenagem por até seis meses nas temperaturas indicadas.
[00074] A figura 9 mostra os resultados de SE-HPLC para % de espécies de LMW de formulação líquida de alta concentração após a armazenagem por até seis meses nas temperaturas indicadas.
[00075] A figura 10 mostra os resultados de SDC-CE para % de ATN-103 da formulação líquida de alta concentração por até seis meses nas temperaturas indicadas.
[00076] A figura 11 mostra os resultados de SE-HPLC para % de espécies de HMW de formulação líquida de alta concentração em uma seringa preenchida.
[00077] A figura 12 mostra os resultados para % de espécies de LMW de formulação líquida de alta concentração em uma seringa preenchida.
[00078] A figura 13 mostras os resultados para a % de espécies ácidas por formulação líquida de alta concentração em uma seringa preenchida.
[00079] A figura 14 mostra os resultados para % de espécies básicas por formulação líquida de alta concentração em uma seringa preenchida.
[00080] A figura 15 mostra os resultados de SE-HPLC para % de espécies de HMW de formulações líquidas de alta concentração - Outras Formulações (identificação de outros excipientes estabilizadores e desestabilizadores).
[00081] A figura 16 mostra os resultados de SE-HPLC para % de espécies de HMW para líquido de alta concentração de nanocorpo de ligação de TNF.
[00082] A figura 17 mostra os resultados de SE-HPLC para % de espécies de LMW para líquido da alta concentração de nanocorpo de ligação de TNF.
[00083] A figura 18 mostra os resultados de CEX-HPLC para % de espécies ácidas para líquido de alta concentração de nanocorpo de ligação de TNF.
[00084] A figura 19 mostra os resultados de CEX-HPLC para % de espécies básicas para líquido de alta concentração de nanocorpo de ligação de TNF.
[00085] A figura 20 mostra os resultados de SE-HPLC para % de espécies de HMW para líquido de alta concentração de nanocorpo de ligação de TNF depois de 10X ciclos de congelamento-desconge- lamento.
[00086] A figura 21 mostra os resultados de SE-HPLCA para % de espécies de LMW para líquido de alta concentração de nanocorpo de ligação de TNF.
[00087] A figura 22 mostra os resultados de Turbidez (Absorbância em 455 nm) para líquido de alta concentração de nanocorpo de ligação de TNF depois de 10X ciclos de congelamento-descongelamento.
[00088] A figura 23 mostra resultados de Concentração (por absor- bância no UV em 280 nm) para líquido de alta concentração de nano- corpo de ligação de TNF depois de 10X ciclos de congelamento- descongelamento.
[00089] A figura 24 mostra Formulação Líquida de Alta Concentração da nanocorpo de ligação de TNF: % de HMW por SE-HPLC depois de estresses térmicos de curto prazo encontrados nos processos de fabricação.
[00090] A figura 25 mostra resultados de SE-HPLC para % de espécies de HMW de formulação líquida de baixa concentração como uma função de pH e formulação (40oC);
[00091] A figura 26 mostra os resultados de SE-HPLC para % de espécies de LMW de formulação líquida de baixa concentração como uma função de pH e formulação (40oC).
[00092] A figura 27 mostra os resultados de SE-HPLC para % de espécies de formulação líquida de baixa concentração como uma função de pH e formulação (4oC).
[00093] A figura 28 mostra os resultados de SE-HPLC para % de espécies de HMW de formulação líquida de baixa concentração como uma função de pH e formulação depois de agitação.
[00094] A figura 29 mostra um diagrama esquemático da estrutura prevista de ATN-103.
[00095] A figura 30 mostra a sequência de aminoácidos de cadeia de polipeptídeo de ATN-103 (SEQ ID NO:1).
[00096] A figura 31 são gráficos em barras que mostram a % de espécies de HMW detectadas por SE-HPLC das formulações pretendidas contendo aproximadamente 100 mg/mL de ATN-103 (HST, HSGT, HSGMT, HSorb e controle) armazenadas sob as condições indicadas.
[00097] A figura 32 são gráficos que mostram a % de espécies de LMW detectadas por SE-HPLC das formulações indicadas contendo aproximadamente 100 mg/mL de ATN-103 (HST, HSGT, HSGMT, HSorb e controle) armazenadas sob as condições indicadas. Nenhuma espécie de LMW foi detectada no ponto de tempo inicial ou depois de duas semanas a 4oC.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00098] Formulações estáveis, que incluem uma molécula SDAB, por exemplo, uma molécula de nanocorpo (por exemplo, uma molécula de nanocorpo de ligação de TNF), foram identificadas como adequadas para armazenagem e baixas concentrações da molécula SDAB (uma "formulação"). A molécula SDAB que é formulada é preferivelmente e essencialmente pura e desejavelmente e essencialmente homogênea (ou seja, isenta de proteínas contaminantes, etc.). Proteína "essencialmente pura" significa uma composição que compreende pelo menos cerca de 90% em peso da proteína, com base no peso total da composição, preferivelmente pelo menos cerca de 95% em peso. Proteína "essencialmente homogênea" significa uma composição que compreende pelo menos cerca de 99% em peso de proteína, com base no peso total da composição.
[00099] A integridade da molécula SDAB na formulação é geralmente mantida seguinte à armazenagem de longo prazo como um líquido ou como um produto liofilizado sob várias condições. Por exemplo, a integridade da molécula SDAB é adequadamente mantida após exposição a uma faixa ampla de temperaturas de embalagem (por exemplo, -80oC a 40oC), estresse de cisalhamento (por exemplo, agitação) e estresse interfacial (ciclos de congelamento-descongelamento).
[000100] Adicionalmente, para material liofilizado, a integridade da molécula SDAB é adequadamente mantida durante o processo de reconstituição. Além disso, a integridade da molécula SDAB é suficien-temente mantida para uso como um medicamento conforme demonstrado por acumulações relativamente baixas de espécies de LMW e espécies de HMW, bioatividade in vitro, atividade de ligação in vitro, depois de armazenagem de longo prazo (por exemplo, até 12 meses) em várias temperaturas (por exemplo, -80oC a 40oC).
[000101] De modo que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, certos termos são primeiramente definidos. Definições adicionais são estabelecidas em toda a descrição detalhada.
[000102] Como usados aqui, os artigos "um" e "uma" se referem a um ou mais que um (por exemplo, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo.
[000103] O termo "ou" é usado aqui para significar, e é usado inter- cambiavelmente com, o termo "e/ou" a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[000104] Os termos "proteínas" e "polipeptídeos" são usados inter- cambiavelmente aqui.
[000105] "Cerca" e "aproximadamente" significará, geralmente, um grau aceitável de erro para a quantidade medida dada a natureza ou precisão das medições. Exemplos de graus de erros estão dentro de 20 porcento (%), tipicamente dentro de 10%, mais tipicamente, dentro de 5% de um dado valor ou faixa de valores.
[000106] Uma formulação "estável" de uma molécula SDAB exibe pouco ou nenhum sinal de qualquer um ou mais de agregação, fragmentação, desamidação, oxidação, ou alteração na atividade biológica por um período prolongado de tempo, por exemplo, 6 meses, 12 meses, 24 meses, 36 meses ou mais. Por exemplo, em uma modalidade, pelo menos 10% da molécula SDAB são agregadas, fragmentadas, ou oxidadas. Agregação, precipitação e/ou desnaturação podem ser avaliadas por métodos conhecidos, tais como exame visual de cor e/ou claridade, ou por dispersão de luz UV ou cromatografia de exclusão de tamanho. A capacidade da proteína em reter sua atividade biológica pode ser avaliada detectando-se e quantificando-se quimicamente as formas alteradas do anticorpo. A modificação de tamanho (por exemplo, corte), que pode ser avaliada usando-se cromatografia de exclusão de tamanho, e/ou SDS-PAGE, por exemplo, Outros tipos de alteração química incluem alteração química (por exemplo, ocorrendo em consequência da desamidação), que pode ser avaliada por cromato- grafia de troca iônica, por exemplo.
[000107] Uma molécula SDAB "retém sua atividade biológica" em uma formulação farmacêutica, se a atividade biológica da molécula, em um dado tempo está dentro de cerca de 50% ou mais alta da atividade biológica, exibida no momento que a formulação farmacêutica foi preparada conforme determinado em um ensaio de ligação de antíge- no, por exemplo.
[000108] Uma formulação "reconstituída" é aquela que foi preparada dissolvendo-se uma formulação de proteína liofilizada em um diluente de modo que a proteína seja dispersa na formulação reconstituída, A formulação reconstituída adequada para administração (por exemplo, administração parenteral ou periférica) a um paciente a ser tratado com a proteína de interesse e, em certas modalidades da invenção, pode ser uma que seja adequada para administração subcutânea.
[000109] Por "isotônica" ou "isosmótica" deve ser entendido que a formulação de interesse tem similar ou essencialmente a mesma pressão osmótica que a do sangue humano. Formulações isotônicas ou isosmóticas terão geralmente uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsm. Isotonicidade pode ser medida usando-se uma pressão de vapor ou osmômetro do tipo congelamento com gelo, por exemplo.
[000110] Um "agente de ajuste de tonicidade" se refere a um composto que torna a formulação substancialmente isotônica ou isosmótica com sangue humano. Agentes de ajuste de tonicidade são: sacarose, sorbitol, glicina, metionina, manitol, dextrose, inositol, cloreto de sódio, arginina, ou cloridrato de arginina. Tipicamente, agentes de ajuste de tonicidade são adicionados em uma quantidade tal que a formulação total exerça uma resistência osmótica similar à do sangue humano. Por exemplo, o sangue humano contém aproximadamente 300 mM de solutos. Tipicamente, os produtos farmacêuticos alvejam uma molari- dade total de 300 mM. Isso corresponde a uma pressão osmótica de aproximadamente 300 a 310 mOsm, com uma faixa típica de 250 mOsm a 350 mOsm. A quantidade de agente de ajuste de tonicidade requerida pode ser inicialmente estimada via cálculo. A contribuição para a molaridade total pode ser estimada a partir do peso molecular da molécula do excipiente, e partículas conhecidas da molécula, por exemplo, se a molécula se dissocia em duas espécies iônicas, ou se a molécula é não-iônica (não se dissocia). Adicionalmente, é necessário entender a contribuição osmótica da molécula de proteína específica como uma função da concentração de proteína. Esse parâmetro pode ser determinado experimentalmente.
[000111] Por exemplo, começando com uma formulação (tonicidade não corrigida) de 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de polis- sorbato-80, com uma concentração de proteína de nanocorpo anti- TNF de 100 mg/mL, como uma primeira etapa, a molaridade estimada da formulação de partida podem ser calculada como a seguir: 10 mM de histidina = 10 mM 5% de sacarose correspondem a aproximadamente 146 mM 5% = 5 g/100 mL = 50 g/L ^ (50 g/L) / (342,3 g/mol) = 0,146 mol/L = 146 mM 0,01% de polissorbato-80 exerce molaridade essencialmente zero e pode ser desconsiderada.
[000112] 100 mg/mL de proteína: Foi determinado através da experimentação que 100 mg/mL de proteína de nanocorpo anti-TNF exerce uma pressão osmótica que corresponde a aproximadamente 48 mM.
[000113] Portanto, somando-se todas as contribuições para a mola- ridade na formulação inicial: 10 mM + 146 mM + 48 mM = 204 mM Se a molaridade alvo for 310 mM, então a molaridade em quantidade correspondente para perfazer o restante do alvo é: 310 mM - 204 mM = 106 mM
[000114] Assim, a quantidade recomendada de agente de ajuste de tonicidade é de 106 mM de um agente de ajuste tonicidade iônica, ou 53 mM de agente de ajuste de tonicidade iônica que se dissocia completamente em duas espécies iônicas.
[000115] Depois que a estimativa inicial do agente de ajuste de tonicidade é determinada, é recomendado testar a formulação experimentalmente. Assim, no exemplo proporcionado, 100 mM de glicina foram adicionados à formulação inicial. (Os 106 mM recomendados forma arredondados para 100 mM, por questões de simplicidade). A osmola- ridade esperada seria: 10 mM de histidina + 146 mM de sacarose + 48 mM de proteína + 100 mM de glicina = 304 mM. O valor da pressão osmótica experimental da formulação = 304 mOsm.
[000116] Um "lioprotetor" é uma molécula que, quando combinada com uma proteína de interesse, previne ou reduz significantemente a instabilidade química e/ou física da proteína mediante a liofilização e subsequente armazenagem. Exemplos de lioprotetores incluem açúcares tal como sacarose, sorbitol, ou trealose; um aminoácido tal como glutamato monossódico ou histidina; uma metilamina tal como betaína; um sal liotrópico tal como sulfato de magnésio; um poliol tal como al- coóis de açúcares triídricos ou superiores, por exemplo, glicerina, eri- tritol, gliclerol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol; propileno glicol; Pluro- nics; e combinações destes. Tipicamente, o lioprotetor é um açúcar não redutor, tal como trealose ou sacarose. O lioprotetor é adicionado à formulação pré-liofilizada em uma "quantidade lioprotetora" que significa que, seguinte à liofilização da proteína na presença da quantida- de lioprotetora do lioprotetor, a proteína retém essencialmente sua estabilidade física e química e integridade mediante liofilização e armazenagem.
[000117] Um "estabilizante" se refere a uma molécula que, quando combinada com uma proteína de interesse (por exemplo, a molécula SDAB) previne ou reduz substancialmente a instabilidade química e/ou física da proteína de interesse na forma liofilizada, reconstituída, líquida ou de armazenagem. Exemplos de estabilizantes incluem sacarose, sorbitol, glicina, inositol, cloreto de sódio, metionina, arginina, e clori- drato de arginina.
[000118] O "diluente" de interesse aqui é um que seja farmaceutica- mente aceitável (administração segura e atóxica a um ser humano) e que seja útil na preparação de uma formulação reconstituída. Exemplos de diluentes incluem água estéril, água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada para pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução Ringer ou solução de dextrose.
[000119] Um "conservante" é um composto que pode ser adicionado ao diluente para reduzir essencialmente a ação bacteriana na formulação reconstituída, facilitando assim a produção da formulação reconstituída de multiuso, por exemplo, Exemplos de conservantes potenciais incluem cloreto de octadezildimetilbenzil amônio, cloreto de hexametô- nio, cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildi- metilamônio, em que os grupos alquila são compostos de cadeia longa), e cloreto de benzalcônio. Outros tipos de conservantes incluem alcoóis aromáticos, álcool butílico e benzílico, alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, 3-pentanol, e m- cresol. O conservante mais preferido aqui é álcool benzílico.
[000120] O "agente de avolumamento" é um composto que adiciona massa à mistura liofilizada e contribui para a estrutura física da torta liofilizada (por exemplo, facilita a produção de uma torta liofilizada es-sencialmente uniforme, que mantém uma estrutura de poro aberta). Exemplos de agentes de avolumamento incluem manitol, glicina, polie- tileno glicol e sorbitol.
[000121] Os métodos e composições da presente invenção englobam polipeptídeos e ácidos nucleicos tendo as sequências especificadas, ou sequências substancialmente idênticas ou similares às mesmas, por exemplo, sequências pelo menos 85%, 90%, 95% idênticas ou mais à sequência especificada. No contexto de uma sequência de aminoácidos, a expressão "substancialmente idêntica" é usada aqui com referência a uma primeira sequência de aminoácidos que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos que são i) idênticos a, ou ii) substituições conservativas de resíduos de amino- ácidos alinhados em uma segunda sequência de aminoácidos de modo que a primeira e a segunda sequências de aminoácidos podem ter um domínio estrutural comum e/ou atividade funcional comum. Por exemplo, as sequências de aminoácidos contendo um domínio estrutural comum tendo pelo menos cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência de referência. Em outras modalidades, a sequência de aminoácidos pode conter uma ou mais inserções, deleções, ou substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas) para chegar a uma identidade percentual de pelo menos cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência de referência.
[000122] No contexto da sequência de nucleotídeos, a expressão "substancialmente idêntica" é usada aqui para se referir a uma primeira sequência de ácidos nucleicos que contêm um número suficiente ou mínimo e nucleotídeos que são idênticos a nucleotídeos alinhados em uma segunda sequência de ácidos nucleicos de modo que a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos codifiquem um polipeptídeo tendo atividade funcional comum, ou codifiquem um domínio de poli- peptídeo estrutural comum ou uma atividade de polipeptídeo funcional comum. Por exemplo, sequências de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência de referência.
[000123] Também incluídos como polipeptídeos da presente invenção estão fragmentos, derivados, análogos, ou variantes dos polipep- tídeos acima, e qualquer combinação destes. Os termos "fragmento", "variante", "derivado" e "análogo" quando se referem às proteínas da presente invenção incluem quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos algumas das propriedades funcionais do anticorpo ou polipep- tídeo nativo. Fragmentos de polipeptídeos da presente invenção incluem fragmentos proteolíticos, bem como fragmentos de deleção, além dos fragmentos de anticorpos específicos discutidos em algum lugar aqui. Variantes dos polipeptídeos da presente invenção incluem fragmentos conforme descritos acima, e também peptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. As variantes podem ocorrer naturalmente ou podem não ocorrer naturalmente. Variantes que não ocorrem naturalmente podem ser produzidas usando-se técnicas de mutagênese conhecidas da tecnologia. Polipeptídeos variantes podem compreender substituições conservativas, deleções ou adições de aminoácidos. Derivados dos fragmentos da presente invenção são polipeptídeos que foram alterados de modo a exibir características adicionais não encontradas no polipeptídeo nativo. Exemplos incluem proteínas de fusão. Polipeptídeos variantes podem ser também referidos aqui como "análogos de polipeptídeo". Como usado aqui, "derivado" de um polipeptí- deo em questão se refere a um polipeptídeo que tem um ou mais resíduos quimicamente derivatizados por reação de um grupo lateral fun- cional. Também incluídos como "derivados" são aqueles polipeptídeos que contêm um ou mais derivados de aminoácidos que ocorrem naturalmente dos aminoácidos padrão. Por exemplo, 4-hidroxiprolina pode ser usada no lugar de prolina; 5-hidroxilisina pode ser usada no lugar de lisina; 3-metilhistidina pode ser usada no lugar de histidina; homos- serina pode ser usada no lugar de serina; e ornitina pode ser usada no lugar de lisina.
[000124] A expressão "variante funcional" se refere a polipeptídeos que têm uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à sequência de ocorrência natural, ou são codificados por uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica, e são capazes de terem uma ou mais atividades da sequência de ocorrência natural.
[000125] Cálculos de homologia ou identidade de sequência entre sequências (os termos são usados intercambiavelmente aqui) são realizados como a seguir.
[000126] Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácidos, ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas em uma ou ambas de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos para alinhamento ótimo e sequências não homólogas podem ser desconsideradas para fins da comparação). Em uma modalidade preferida, o comprimento de uma sequência de referência alinhada para fins de comparação é de pelo menos 30%, preferivelmente 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, 60%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 70%, 80%, 90%, 100% do comprimento da sequência de referência. Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição (como usado aqui, "identidade" de aminoácido ou de ácido nucleico é equivalente à "homologia" de aminoácido ou de ácido nucleico).
[000127] A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em consideração o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que necessitam ser introduzidas para alinhamento ótico das duas sequências.
[000128] A comparação das sequências e determinação da identidade percentual entre as duas sequências podem ser obtidas usando-se um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferida, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando-se o algoritmo de Needleman e Wunch ((1970)) J. Mol. Biol. 48:444-453) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando ou uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Em ainda outra modalidade, a identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeos é determinada usando-se o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando- se uma matriz NWSgapdna,CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60, 70, ou 0 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Um grupo de parâmetros particularmente preferido (e aquele que deve ser usado a menos que de outro modo especificado) é a matriz de escore Blossum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma penalidade de extensão de lacuna de 4, e uma penalidade de lacuna de deslocamento de quadro de 5.
[000129] A identidade percentual entre duas sequências de aminoá- cidos ou de nucleotídeos pode ser determinada usando-se o algoritmo de E. Meyers E W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), usando-se uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4.
[000130] As sequências de ácidos nucleicos e de proteínas descritas aqui podem ser usadas como uma "sequência de interrogação" para realizar uma busca contra bases de dados públicas para, por exemplo, identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais buscas podem ser realizadas usando-se os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Buscas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, escore = 100, comprimento da palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas a uma molécula de ácido nuclei- co (SEQ ID NO:1) da invenção. As buscas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, comprimento da palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma proteína (SEQ ID NO:1), moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos lacunados com finalidade de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito por Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Quando estão sendo utilizados programas BLAST e Gapped BLAST, podem ser usados os parâmetros padrão dos programas respectivos (por exemplo, XBLAST e NBLAST).
[000131] Uma "substituição conservativa de aminoácidos" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de amino- ácido que tem uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de ami- noácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na tecnológica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, trip- tofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
[000132] Vários aspectos da invenção são descritos em mais detalhes abaixo.
Moléculas (SDAB) de Ligação de Antígeno de Domínio Único
[000133] Moléculas (SDAB) de ligação de antígeno de domínio único incluem moléculas cujas regiões determinantes de complementaridade são parte de um polipeptídeo de domínio único. Exemplos incluem, mas sem limitação, domínios variáveis de cadeia pesada, moléculas de ligação naturalmente isentas de cadeias leves, domínios únicos derivados de anticorpos de 4 cadeias convencionais, domínios engenhei- rados e arcabouços de domínio único diferentes daqueles derivados de anticorpos. Moléculas SDAB podem ser qualquer uma da técnica, ou quaisquer moléculas de domínio único futuras. Moléculas SDAB podem ser derivadas de quaisquer espécies incluindo, mas sem limitação, camundongo, ser humano, camelo, lhama, peixe, tubarão, cabra, coelhos e bovino. Esse termo inclui também moléculas de anticorpo de domínio único de ocorrência natural de espécies diferentes de camelídeos e tubarões.
[000134] Em um aspecto da invenção, uma molécula SDAB pode ser derivada de uma região variável da imunoglobulina encontrada no peixe, tal como, por exemplo, aquela que é derivada do isótipo de imuno- globulina conhecido como Receptor de Antígeno Novo (NAR) encontrado no soro de tubarão. Métodos para produzir moléculas de domínio único derivadas de uma região variável de NAR ("IgNARs") são descritos no WO 03/014161 e por Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901- 2909.De acordo com um outro aspecto da invenção, a molécula SDAB é uma molécula de antígeno de domínio único de ocorrência natural conhecida como uma cadeia pesada isenta de cadeias leves. Tais moléculas de domínio único estão descritas no WO 9404678 e por Ha- mers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448, por exemplo. Por razões de entendimento, esse domínio variável derivado de uma molécula de cadeia pesada naturalmente isenta de cadeia leve é conhecida aqui como um VHH ou nanocorpo para sua distinção do VH convencional de quatro imunoglobulinas de cadeia. Tal molécula de VHH pode ser derivada de espécies de camelídeos, por exemplo, em camelo, lhama, dromedário, alpaca e guanaco. Outras espécies além de camelídeos podem produzir moléculas de cadeia pesada naturalmente isentas de cadeia leve; tais VHHs estão dentro do escopo da invenção.
[000135] As moléculas SDAB podem ser recombinantes, enxertadas com CDR, humanizadas, camelizadas, desimunizadas e/ou geradas in vitro (por exemplo, selecionadas por exibição de fago), conforme descrição mais detalhada abaixo.
[000136] A expressão "ligação de antígeno" significa incluir a parte de um polipeptídeo, por exemplo, uma molécula de domínio único descrita aqui, que compreende determinantes que formam uma interface que se liga a um antígeno-alvo, ou a um epítopo deste. Com respeito às proteínas (ou miméticos de proteína), o sítio de ligação de an- tígeno inclui, tipicamente, uma ou mais alças (de pelo menos quatro aminoácidos ou miméticos de aminoácidos) que formam uma interface que se liga ao antígeno-alvo. Tipicamente, o sítio de ligação de antí- geno do polipeptídeo, por exemplo, a molécula de anticorpo de domínio único, inclui pelo menos uma ou duas CDRs, ou mais tipicamente pelo menos três, quatro, cinco ou seis CDRs.
[000137] A expressão "domínio variável de imunoglobulina" é frequentemente entendida na técnica como sendo idêntica ou substancialmente idêntica a um domínio de VL ou de VH de origem humana ou animal. Deve ser reconhecido que o domínio variável de imunoglobuli- na pode ser desenvolvido em certas espécies, por exemplo, tubarões e lhama, para diferirem em sequência de aminoácidos de VL ou VH humano ou mamífero. Contudo, esses domínios estão principalmente envolvidos em ligação de antígeno. A expressão "domínio variável de imunoglobulina" inclui tipicamente pelo menos uma ou mais CDRs, ou mais tipicamente pelo menos três CDRs.
[000138] Um "domínio de imunoglobulina constante" ou "região constante" tem por objetivo incluir um domínio de imunoglobulina que é idêntico a ou substancialmente similar a um domínio CL, CH1, CH2, CH3 ou CH4 de origem humana ou animal. Vide, por exemplo, Charles A Hasemann e J. Donald Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, e William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, 2a Edição, 209, 210-218 (1989). A expressão "região Fc" se refere à porção Fc do domínio constante de imunoglobulina que inclui os domínios CH2 e CH3 de imunoglobulina ou domínios de imunoglobulina substancialmente similares a estes.
[000139] Em certas modalidades, a molécula SDAB é uma molécula monovalente ou multiespecífica (por exemplo, uma molécula bivalente, trivalente, ou tetravalente). Em outras modalidades, a molécula SDAB é uma molécula monoespecífica, biespecífica, triespecífica ou tetraes- pecífica. Se uma molécula é "monoespecífica" ou "multiespecífica", por exemplo, "biespecífica" se refere ao número de epítopos diferentes com os quais um polipeptídeo de ligação reage. Moléculas multiespe- cíficas podem ser específicas para diferentes epítopos de um polipep- tídeo-alvo descrito aqui ou podem ser específicas para um polipeptí- deo-alvo bem como para um epítopo heterólogo, tal como um polipep- tídeo heterólogo ou material de suporte sólido.
[000140] Como usado aqui o termo "valência" se refere a um número de domínios de ligação potencial, por exemplo, domínios de ligação de antígeno, presentes em uma molécula SDAB. Cada domínio de ligação se liga especificamente a um epítopo. Quando uma molécula SDAB compreende mais que um domínio de ligação, cada domínio de ligação pode se ligar especificamente ao mesmo epítopo, para um anticorpo com dois domínios de ligação, denominados "monoespecíficos bivalentes", ou a epítopos diferentes, para uma molécula SDAB com dois domínios de ligação, denominados "biespecíficos bivalentes". Uma molécula SDAB pode ser também biespecífica e bivalente para cada especificidade (com denominação de "moléculas tetravalentes biespecíficas"). Moléculas bivalentes biespecíficas e métodos para prepará-las estão presentes, por exemplo, nas Patentes US 5.731.168; US 5.807.706; US 5.821.333; e nos Pedidos de Patente Publicados US 2003/020734 e US 2002/0155537, cujo teor destes está aqui incorporado a título de referência. Moléculas tetravalentes biespecíficas e métodos para prepará-las estão descritos, por exemplo, no WO 02/096948 e WO 00/44788, cujo teor destes é aqui incorporado a título de referência. Vide, em geral, as Publicações de PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); Patente US 4.474.893; US 4.714.681; US 4.925.648; US 5.5 73.920; 5.601.819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).
[000141] Em certas modalidades, a molécula SDAB é um polipeptí- deo de fusão de cadeia única, que compreende uma ou mais moléculas de domínio único (por exemplo, nanocorpos), isento de domínio variável complementar ou uma constante de imunoglobulina, por exemplo, Fc, região que se liga a um ou mais antígenos-alvos. Exemplo de antígeno-alvo reconhecido pelos polipeptídeos de ligação de antígeno inclui fator-α de necrose tumoral (TNF-α). Em certas modalidades, a molécula de domínio único de ligação de antígeno se liga a uma proteína sérica, por exemplo, proteínas séricas humanas selecionadas de uma ou mais de albumina sérica (albumina sérica humana (HSA)) ou transferina.
TNF-α
[000142] Fator alfa de necrose tumoral é conhecido da técnica como associado à distúrbios inflamatórios tais como artrite reumatoide, doença de Crohn, colite ulcerativa e esclerose múltipla. Tanto o TNF-α como os receptores (CD120a e CD120b) foram estudados detalhadamente. TNF-α em sua forma bioativa é um trímero. Várias estratégicas para antagonizar a ação de TNF-α usando anticorpos anti-TNF-α foram desenvolvidos e estão correntemente comercialmente disponíveis, tais como Remicade® e Humira®. Moléculas de anticorpos contra TNF- α são conhecidas. Numerosos exemplos de moléculas de ligação de antígeno de domínio único de ligação de TNF-α (por exemplo, nano- corpos) são descritos nos WO 2004/041862, WO 2004/041865, WO 2006/122786, cujo teor destes é aqui incorporado a título de referência, na íntegra. Exemplos adicionais de moléculas de ligação de antí- geno de domínio único estão descritos nos US 2006/286066, US 2008/0260757, WO 06/003388, US 05/0271663, US 06/0106203, cujo teor destes é aqui incorporado a título de referência na íntegra. Em outras modalidades, anticorpos de domínio único mono, bi, tri e outros multiespecíficos contra TNF-α e uma proteína sérica, por exemplo, HSA, são descritos nessas.
[000143] Em modalidades específicas, a molécula de nanocorpo de ligação de TNF-α compreende um ou mais nanocorpos descritos no WO 2006/122786. Por exemplo, a molécula de nanocorpo de ligação de TNF-α pode ser uma molécula de nanocorpo de ligação de TNF-α monovalente, bivalente, trivalente descrita no WO 2006/122786. Exemplos de nanocorpos de ligação de TNF-α incluem, mas sem limitação, TNF1, TNF2, TNF3, formas humanizadas destes (por exemplo, TNF29, TNF30, TNF31, TNF32, TNF33). Exemplos adicionais de na- nocorpos de ligação de TNF-α estão descritos na Tabela 8 do WO 2006/122786. Exemplos de moléculas de nanocorpos de ligação de TNF-α bivalentes incluem, mas sem limitação, TNF55 e TNF56, que compreendem dois nanocorpos TNF30 ligados via um ligante de pep- tídeo para formar um polipeptídeo de fusão simples (descrito no WO 2006/122786). Exemplos adicionais de moléculas de nanocorpos de ligação de TNF-α bivalentes estão descritos na Tabela 19 do WO 2006/122786 como TNF4, TNF5, TNF6, TNF7, TNF8.
[000144] Em outras modalidades, a molécula de nanocorpo de ligação de HSA compreende um ou mais dos nanocorpos descritos no WO 2006/122786. Por exemplo, a molécula de nanocorpo de ligação de HSA pode ser uma molécula de nanocorpo de ligação de HSA monovalente, bivalente, trivalente descrita no WO 2006/122786. Em outras modalidades, a moléculas de nanocorpo de ligação de HSA pode ser uma molécula monoespecífica ou multiespecífica tendo pelo menos uma das especificidades de ligação que se liga a HSA. Exemplos de nanocorpos de ligação de TNF-α incluem, mas sem limitação, ALB1, suas formas humanizadas (por exemplo, ALB6, ALB7, ALB8, ALB9, ALB10), descritas no WO 06/122786.
[000145] Em outras modalidades, duas ou mais das moléculas de domínio simples das moléculas de nanocorpos são fundidas, com ou sem um grupo de ligação, como uma fusão genética ou polipeptídica. O grupo de ligação pode ser qualquer grupo de ligação aparente para aqueles versados na técnica. Por exemplo, o grupo de ligação pode ser um polímero biocompatível com comprimento de 1 a 100 átomos. Em uma modalidade, o grupo de ligação inclui ou consiste em resíduos de poliglicina, polisserina, polilisina, poliglutamato, poli-isoleu- cina, ou de poliarginina, ou uma combinação destes. Por exemplo, os ligantes de poliglicina ou de polisserina podem incluir pelo menos cinco, sete, oito, nove, dez, doze, quinze, vinte, trinta, trinta e cinco, e quarenta resíduos de glicina e de serina. Exemplos de ligantes que podem ser usados incluem repetições de Gly-Ser, por exemplo, repetições de (Gly)4-Ser (SEQ ID NO: 8) de em uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais repetições. Em modalidades, o ligante tem as seguintes sequências: (Gly)4-Ser-(Gly)3-Ser (SEQ ID NO: 9) ou ((Gly)4- Ser)n (SEQ ID NO: 10), em que n é 4, 5, ou 6.
[000146] Em uma modalidade exemplar, um polipeptídeo de ligação de antígeno de uma fusão de polipeptídeo de cadeia única de duas moléculas de anticorpo de domínio único (por exemplo, duas regiões variáveis de camelídeos) que se liga a um antígeno-alvo, por exemplo, um fator alfa de necrose tumoral. (TNF-α), e uma molécula de anticorpo de domínio único (por exemplo, uma região variável de camelídeo) que se liga a uma proteína sérica, por exemplo, HSA, referida aqui como "ATN-103", mostrou que se liga à Proteína A, ou uma sua variante funcional. ATN-103 é uma proteína de fusão que inibe TNF-α, bi- específica, trivalente, humanizada. O antígeno para essa proteína é o fator alfa de necrose tumoral (TNF). A figura 29 proporciona uma representação esquemática da estrutura prevista de ATN-103. Essa proteína de fusão é derivada de camelídeos e tem camelídeos e tem um alto grau de sequência de homologia estrutural com os domínios VH de imunoglobulina humana. Sua cadeia de polipeptídeo simples é composta de dois domínios de ligação para TNF-α e uma para albumina sérica humana (HSA), com dois ligantes de G-S de nove aminoáci- dos se conectando os domínios. Uma descrição detalhada de ATN- 103 é fornecida no WO 06/122786.
[000147] A sequência de aminoácidos completa da cadeia prevista de polipeptídeo de ATN-103 a partir da sequência de DNA do vetor de expressão correspondente é mostrada na figura 30 (resíduos são numerados começando com a terminação NH2 como Número de Resíduo 1 da SEQ ID NO:1). O último resíduo de aminoácido codificado pela sequência de DNA é S363 e constitui a terminação de COOH da proteí- na. A massa molecular prevista para ATN-103 ligada a dissulfeto (sem modificações pós-traducionais) é 38434,7 Da. ATN-103 não contém nenhuma sequência de consenso de glicosilação ligada a N. A massa molecular observada quanto à isoforma predominante por espectrome- tria de massa por tempo de voo quadrupolar corresponde a 38433,9 Da confirmando a ausência de modificações pós-traducionais.
[000148] Na figura 30, regiões determinantes de complementaridade estão sublinhadas. As pontes de dissulfeto intramoleculares previstas estão ilustradas por conexões dos resíduos de cisteína envolvidos. Os domínios de ligação para TNF são mostrados em negrito e o domínio de ligação a HSA é mostrado em itálico negritado. Os ligantes de ami- noácidos que conectam esses domínios de ligação estão em itálico. O peptídeo de sinal (19MGW...VHS-1) é também mostrado para a cadeia de polipeptídeo.
Preparação de Moléculas SDAB
[000149] As moléculas SDAB podem ser compreendidas de uma ou mais moléculas de domínio único (por exemplo, nanocorpos) que são recombinantes, enxertados com CDR, humanizados, camelizados, de- simunizados, e/ou gerados in vitro (por exemplo, selecionadas por phage display). Técnicas para gerar anticorpos e moléculas SDAB, e modificá-las recombinantemente são conhecidas da técnica e são descritas em detalhes abaixo.
[000150] Inúmeros métodos conhecidos daqueles versados na técnica estão disponíveis para obter anticorpos. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos por geração de hibridomas de acordo com métodos conhecidos. Hibridomas formados deste modo são então selecionados usando-se métodos padrão, tal ensaio imu- nossorbente ligado à enzima (ELISA) e análise de ressonância de plasmônio de superfície (BIACORE®), para identificar um ou mais hi- bridomas que produzem um nanocorpo que se liga especificamente a um antígeno especificado. Qualquer forma do antígeno especificado pode ser usada como o imunógeno, por exemplo, antígeno recombi- nante, formas de ocorrência natural, quaisquer variantes ou fragmentos destas, bem como peptídeo antigênico destes.
[000151] Um método exemplar para preparar anticorpos e moléculas SDAB inclui selecionar bibliotecas de expressão de proteína, por exemplo, bibliotecas de exibição de fago ou ribossomo . Exibição de fago é descrito, por exemplo, por Ladner et al. Patente US 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; e WO 90/02809.
[000152] Além do uso de bibliotecas display, o antígeno especificado pode ser usado para imunizar um animal não humano, por exemplo, um roedor, por exemplo, um camundongo, hamster, ou rato. Em uma modalidade, o animal não humano inclui pelo menos uma parte de um gene de imunoglobulina humana. Por exemplo, é possível engenheirar raças de camundongo deficientes na produção de anticorpo de camundongo com fragmentos grandes dos locais de Ig humanos. Usando-se a tecnologia de hibridoma, anticorpos monoclonais específicos de antígeno derivados dos genes com a especificidade desejada podem ser produzidos e selecionados. Vide, por exemplo, XENOMOUSE®, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, Pedido de Patente US 2003-0070185, WO 96/34096, publicado em 31 de outubro de 1996, e Pedido de PCT, PCT/US96/05928, depositado em 29 de abril de 1996.
[000153] Em outra modalidade, uma molécula SDAB que é obtida do animal não humano, e então modificada, por exemplo, humanizada, desimunizada, quimérica, pode ser produzida usando técnicas de DNA recombinante conhecidas da tecnologia. Uma variedade de abordagens para preparar anticorpos quiméricos e moléculas SDAB foi descrita. Vide, por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., Patente US 4.816.567; Boss et al., Patente US 4.816.397; Tanaguchi et al., Patente EP171496; Patente EP 0173494, Patente GB 2177096B. Anticorpos humanizados e moléculas SDAB podem ser também produzidos, por exemplo, usando camundongos transgênicos que expressam genes de cadeias pesadas e leves humanos, mas são incapazes de expressarem os genes de cadeias leves e pesadas de imunoglobu- lina de camundongo. Winter descreve um método de enxertar CDR exemplar que pode ser usado para preparar os anticorpos humanizados e a molécula SDAB descrita aqui (Patente US 5.225.539). Todas as CDRs de um anticorpo humano particular podem ser substituídas com pelo menos uma porção da uma CDR não humana, ou somente algumas das CDRs podem ser substituídas com CDRs humanas. É somente necessário substituir o número de CDRs requerido para ligação do anticorpo humanizado e molécula SDAB a um antígeno predeterminado.
[000154] Anticorpos humanizados podem ser gerados por substituição de sequências do domínio variável de FV que não estão diretamente envolvidas em ligação de antígenos com sequências equivalentes dos domínios variáveis de Fv humanos. Exemplos de métodos para gerar anticorpos humanizados ou fragmentos destes são proporcionados por Morrison (1985) Science 229:1202-1207; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; e nas Patentes US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; e US 6.407.213. Esses métodos incluem isolar, manipular, e expressar as sequências de ácidos nucleicos que codificam todos ou parte dos domínios variáveis de Fv de imunoglobu- lina de pelo menos uma de uma cadeia pesada ou leve. Tais ácidos nucleicos podem ser obtidos de um hibridoma que produz um nano- corpo contra um alvo predeterminado, conforme descrição acima, bem como de outras fontes. O DNA recombinante, que codifica a molécula SDAB humanizada, por exemplo, molécula de nanocorpo, pode ser clonado em um vetor de expressão apropriado.
[000155] Em certas modalidades, uma molécula SDAB humanizada, por exemplo, molécula de anticorpo, é otimizada pela introdução de substituições conservativas, substituições de sequência de consenso, substituições de linha germinativa e/ou retromutações. Tais moléculas de imunoglobulina alteradas podem ser feitas por quaisquer de várias técnicas conhecidas da tecnologia (por exemplo, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982), e podem ser feitas de acordo com os ensinamentos da Publicação de PCT WO 92/06193 ou EP 0239400).
[000156] Técnicas para humanizar moléculas SDAB, por exemplo, moléculas de nanocorpo, são descritas no WO 06/122786.
[000157] Uma molécula SDAB, por exemplo, molécula de nanocorpo, pode ser também modificada por deleção específica de epítopos de células T humanas ou "desimunização" pelos métodos descritos nos WO 98/52976 e WO 00/34317. Em resumo, os domínios variáveis de cadeias pesadas ou leves de, por exemplo, um nanocorpo pode ser analisado quanto a peptídeos que se ligam à Classe II de MHC; estes peptídeos representam epítopos de células T potenciais (conforme definidas nos WO 98/52976 e WO 00/34317). Para detecção de epítopos de células T potenciais, uma abordagem sobre modelagem de computados denominada "peptide threading" pode ser aplicado, e, além disso, uma base de dados de peptídeos de ligação da classe II de MHC humana pode ser pesquisada quanto aos motivos presentes nas se-quências de VH e de VL, conforme descrição nos WO 98/52976 e WO 00/34317. Esses motivos se ligam a qualquer um dos alótipos DR da classe II de MHC, e assim constituem epítopos de células T potenciais. Os epítopos de células T potenciais detectados podem ser eliminados substituindo-se pequenos números de resíduos de aminoácidos nos domínios variáveis, ou, preferivelmente, substituições de aminoácidos simples. Tipicamente, são feitas substituições conservativas. Frequentemente, mas não exclusivamente, um aminoácido comum a uma posição nas sequências de anticorpo de linha germinativa humana pode ser usada. Sequências da linha germinativa humana são descritas, por exemplo, por Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; e Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638. O diretório V BASE proporciona um diretório compreensivo das sequências de região variável de imunoglobulina imune (compilada por Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, GB). Essas sequências podem ser usadas como uma fonte de sequência humana, por exemplo, para regiões de estrutura e CDRs. As regiões de estrutura de consenso humanas podem ser também usadas conforme descrição na Patente US 6.300.064.
[000158] As moléculas SDAB, por exemplo, moléculas de nanocor- po, podem ser produzidas por células hospedeiras vivas que tenham sido geneticamente engenheiradas para produzir a proteína. Métodos para engenheirar células geneticamente para produzir proteínas são bem conhecidos da técnica (vide, por exemplo, Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York). Tais métodos incluem introduzir ácidos nucleicos que codificam e possibilitam a expressão da proteína em células hospedeiras vivas. Essas células hospedeiras podem ser células bacterianas, células fúngicas, ou, preferivelmente, células animais crescidas na cultura. Células hospedeiras bacterianas incluem, mas sem limitação, células de Escherichia coli. Exemplos de cepas de E. coli adequadas incluem: HB101, DH5a, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539 e qualquer cepa de E. coli que falhe em clivar DNA estranho. Células hospedeiras fúngicas que podem ser usadas incluem, mas sem limitação, células de Saccharomyces ce- revisiae, Pichia pastoris e Aspergillus. Alguns poucos exemplos de linhagens de células animais que podem ser usadas são CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, e WI38. Linhagens de células animais novas podem ser estabelecidas usando-se métodos bem conhecidos daqueles versados na técnica (por exemplo, por transformação, infecção viral, e/ou seleção). Opcionalmente, a proteína pode ser se- cretada pelas células hospedeiras no meio.
Moléculas SDAB modificadas
[000159] As formulações da invenção podem conter pelo menos uma molécula SDAB, por exemplo, molécula de nanocorpo, tendo uma sequência de aminoácidos que difere pelo menos em uma posição de aminoácido em uma das regiões de estrutura da sequência de amino- ácidos de domínio de ocorrência natural, por exemplo, domínio VH.
[000160] Deve ser entendido que as sequências de aminoácidos de algumas das moléculas SDAB da invenção, tais como as moléculas SDAB humanizadas, podem diferir em pelo menos uma posição de aminoácido em pelo menos uma das regiões de quadro das sequências de aminoácidos de domínio de ocorrência natural, por exemplo, domínios VHI-I.
[000161] A invenção inclui também formulações de derivados das moléculas SDAB. Tais derivados podem ser geralmente obtidos por modificação, e, em particular, por modificação química e/ou biológica (por exemplo, enzimática), das moléculas SDAB e/ou de um ou mais dos resíduos de aminoácidos que formam as moléculas SDAB descritas aqui.
[000162] Exemplos de tais modificações, bem como exemplos de resíduos de aminoácidos dentro da sequência da molécula SDAB que pode ser modificada de tal modo (ou seja, na cadeia principal da proteína, mas preferivelmente em uma cadeia lateral), métodos e técnicas que podem ser usados para introdução de tais modificações e os usos potenciais e vantagens de tais modificações tornar-se-ão claras para aqueles versados na técnica.
[000163] Por exemplo, tal modificação pode envolver a introdução (por exemplo, por ligação covalente ou em um outro modo adequado) de um ou mais grupos funcionais, resíduos ou frações na ou sobre a molécula SDAB, e, em particular, de um ou mais grupos funcionais, resíduos ou frações que conferem uma ou mais propriedades desejadas ou funcionalidades às moléculas SDAB. Exemplos de tais grupos funcionais tornar-se-ão claros para aquele versado na técnica.
[000164] Por exemplo, tal modificação pode compreender a introdução (por exemplo, por ligação covalente ou de qualquer outro modo adequado) de um ou mais grupos funcionais que aumentam a meia- vida, a solubilidade e/ou a absorção da molécula SDAB, que reduzem a imunogenicidade e/ou a toxidez da molécula SDAB, que eliminam ou atenuam quais efeitos colaterais indesejáveis das moléculas SDAB, e/ou que conferem outras propriedades vantajosas e/ou reduzem as propriedades indesejadas da molécula SDAB; ou qualquer combinação de dois ou mais dos acima. Exemplos de tais grupos funcionais e de técnica para introdução dos mesmos tornar-se-ão claros para aquele versado na técnica, e podem compreender, geralmente, todos os grupos funcionais e técnicas mencionadas acima na seção de antecedentes da técnica anterior bem como grupos funcionais e técnicas conhecidas por si para a modificação de proteínas farmacêuticas, e, em particular, para a modificação de anticorpos ou de fragmentos de anticorpos (incluindo ScFv’s e 148 anticorpos de domínio único), em que referência é feita, por exemplo, a Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Edição., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Tais grupos funcionais podem ser, por exemplo, ligados diretamente (por exemplo, covalentemente) a um Nanocorpo da invenção, ou opcionalmente via um ligante ou espaçador adequado, como, de novo, ficará claro para aquele versado na técnica.
[000165] Uma técnica largamente usada para aumentar a meia-vida e/ou a imunogenicidade das proteínas farmacêuticas compreende a ligação de um polímero farmacologicamente aceitável, adequado, tal como polietileno glicol (PEG) ou derivados deste (tal como metoxipo- lietileno glicol ou mPEG). Geralmente, qualquer forma adequada de peguilação pode ser usada, tal como a peguilação usada na técnica para anticorpos e fragmentos de anticorpos (incluindo, mas sem limitação, anticorpos de domínio (único) e ScFv’s; referência é feita, por exemplo, a Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese e Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), Harris e Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) e no WO 04/060965. Vários reagen-tes para peguilação de proteínas estão também comercialmente disponíveis, por exemplo, da Nektar Therapeutics, US.
[000166] Preferivelmente, peguilação sítio-direcionada é usada, em particular via resíduo de cisteína (vide, por exemplo, Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)). Por exemplo, para essa finalidade, PEG pode ser ligado a um resíduo de cisteína que ocorre naturalmente em uma molécula SDAB, uma molécula SDAB pode ser modificada de modo a introduzir adequadamente um ou mais resíduos de cisteína para ligação de PEF, ou uma sequência de aminoácidos que compreende um ou mais resíduos de cisteína para ligação de PEG pode ser fundida à terminação N e/ou C de um Nanocorpo da invenção, todos usando técnicas de engenharia de proteína conhecidas por si daquele versado na técnica.
[000167] Preferivelmente, para a molécula SDAB, PEG é usado com um peso molecular de mais que 5.000, tal como mais que 10.000 e menos que 200.000, tal como menos que 100.000; por exemplo, na faixa de 20.000-80.000.
[000168] Com respeito à peguilação, deve ser observado que, em geral, a invenção também engloba qualquer molécula SDAB que tenha sido peguilada em uma ou mais posições de aminoácido, preferivelmente de tal modo que a dita peguilação (1) ou aumente a meia-vida in vivo; (2) reduza a imunogenicidade; (3) proporcione uma ou mais propriedades benéficas adicionais conhecidas por si para peguilação; (4) não afete essencialmente a afinidade da molécula SDAB (por exemplo, não reduza a dita afinidade de mais que 90%, preferivelmente de não mais que 50%, e de não mais que 10%, conforme determinada por ensaio adequado, tais como aqueles descritos nos Exemplos abaixo); e/ou (4) não afete nenhuma das outras propriedades desejadas da molécula SDAB. Grupos PEG adequados e métodos para anexá-los, ou especificamente ou não especificamente, tornar-se-ão claros para aquele versado na técnica.
[000169] Outra, usualmente menos preferida modificação, compreende glicosilação N-ligada ou O-ligada, normalmente como parte da modificação co-traducional ou pós-traducional, dependendo da célula hospedeira usada para expressar a molécula SDAB.
Formulações
[000170] Uma formulação de uma molécula SDAB, por exemplo, molécula de nanocorpo, inclui uma molécula SDAB, um composto que serve como crioprotetor, e um tampão. O pH da formulação é geralmente pH 5,,5 a 7,0. Em algumas modalidades, a formulação é armazenada como líquido. Em outras modalidades, a formulação é preparada como um líquido e é então secada, por exemplo, por liofilização ou secagem por pulverização antes da armazenagem. A formulação seca pode ser usada como um composto seco, por exemplo, como aerossol ou pós, ou reconstituída para seu original ou para outra con-centração, por exemplo, usando-se água, tampão ou outro líquido apropriado.
[000171] O processo de purificação da molécula SDAB é desenhado para permitir a transferência de uma molécula SDAB para uma formulação adequada para armazenagem de longo prazo como líquido congelado e para subsequente secagem por liofilização (por exemplo, usando-se formulação de histidina/sacarose). A formulação é liofilizada com a proteína em uma concentração específica. A formulação liofili- zada pode ser então reconstituída conforme necessário com um dilu- ente adequado (por exemplo, água) para ressolubilizar os componentes da formulação original para a concentração desejada, geralmente a mesma concentração ou mais alta em comparação com a concentração antes da liofilização.
[000172] A formulação liofilizada pode ser reconstituída para produzir uma formulação que tem uma concentração que difere da concentração original (isto é, antes da liofilização), dependendo da quantidade de água ou de diluente adicionada ao liofilizado com relação ao volume de líquido que foi originalmente liofilizado. Formulações adequadas podem ser identificadas por ensaio de um ou mais parâmetros de integridade do anticorpo. Os parâmetros ensaiados são geralmente a percentagem de espécies de HMW ou da percentagem de espécies de LMW.
[000173] A percentagem de espécies de HMW ou espécies de LMW é determinada ou como a percentagem do teor total de proteína na formulação ou como alteração no aumento da percentagem com o tempo (ou seja, durante armazenagem). A percentagem total de espécies de HMW em uma formulação aceitável não é maior que 10% de espécies de HMW depois da armazenagem como um liofilizado ou líquido a -20oC (por exemplo, a -20oC a 25oC a 15oC, a 2oC a 8oC, a cerca de 2oC, ou a cerca de 25oC) por pelo menos um ano ou mais que cerca de 10% de espécies de LMW depois da armazenagem como um liofilizado ou líquido a -20oC a 40oC, por pelo menos um ano. O termo "cerca de" significa ±20% do valor numérico citado. Assim, "cer- ca de 20oC" significa 16oC a 24oC.
[000174] Tipicamente, o perfil de estabilidade é menor que 10% de HMW/LMW a 2o - 8oC para um produto refrigerado, e 25oC, para um produto à temperatura ambiente, Espécies de HMW ou espécies de LMW são ensaiadas em uma formulação armazenada como um liofili- zado depois do liofilizado ser reconstituído. 40oC é uma condição acelerada que é geralmente usada para testar a estabilidade e determinar a estabilidade para exposições de longo prazo sob condições de não- armazenagem, por exemplo, como pode ocorrer durante a transferência de um produto durante expedição.
[000175] Quando o parâmetro ensaiado é a alteração percentual nas espécies de HMW ou espécies de LMW, a percentagem da proteína total em uma ou em ambas as espécies depois da armazenagem é comparada à proteína total percentual em uma ou em ambas as espécies antes da armazenagem (por exemplo, mediante a preparação da formulação). A diferença nas percentagens é determinada. Em geral, a alteração na percentagem de proteína nas espécies de HMW ou nas espécies de LMW em formulações líquidas não é maior que 10%, por exemplo, não maior que cerca de 8%, não maior que cerca de 7%, não maior que cerca de 6%, não maior que cerca de 5%, não maior que cerca de 4%, ou não maior que cerca de 3% após armazenagem a 2oC - 8oC ou a 25oC por cerca de dezoito a vinte e quatro meses. "Cerca de" significa ±20% de um valor numérico citado, tipicamente, dentro de 10%, e, mais tipicamente, dentro de 5% de um dado valor ou faixa de valores. Assim, cerca de 10% significa de 8% a 12%. As formulações armazenadas como produto liofilizado têm geralmente menos que cerca de 5%, menos que cerca de 4%, menos que cerca de 3%, menos que cerca de 2%, ou menos que cerca de 1% de espécies de HMW ou menos que cerca de 5%, menos que cerca de 4%, menos que cerca de 3%, ou menos que cerca de 2%, ou menos que cerca de 1% de es- pécies de LMW após a reconstituição, ou em uma formulação líquida, seguinte à armazenagem a -30oC a 8oC (por exemplo, 4oC ou -20oC), por cerca de seis, nove, dez, doze, quinze, dezoito a vinte e quatro meses.
[000176] As formulações das moléculas SDAB (por exemplo, moléculas de nanocorpo de ligação de TNF) podem ser armazenadas como uma formulação líquida congelada ou um liofilizado por, por exemplo, pelo menos seis, nove, dez, doze meses, ou pelo menos dois anos, pelo menos três anos, pelo menos quatro anos, ou pelo menos cinco anos. Em um exemplo, uma formulação de molécula de nanocorpo de ligação de TNF contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, 50 mg/mL de moléculas de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Em outro exemplo, a formulação de moléculas de nanocorpo de ligação de TNF contém 20 mM de histidina, 7,5% de sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, 50 mg/mL de moléculas de nanocorpo de ligação de TNF, e tem pH de 6,0. Em outro exemplo, a formulação contém 20 mM de histidina, 10% de sacarose, 0,02% de Polissorbato-80, 100 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Em outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 50 mg/mL de molécula de nanocor- po de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Ainda em outra modalidade, a formulação contém 20 mM de histidina, 10% de sacarose, 100 mg/mL de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Em outra modalidade, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, aproximadamente 80 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Ainda em outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, 100 mM de Arginina (Bse), 88 a 100 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 5,8. Em outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, 55 mM de NaCl, 88 a 10 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,1. Em ainda outra modalidade, a formulação contém 10 mM de histi- dina, 5% de sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, 55 mM de cloridrato de arginina, 88 a 100 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,1. Em outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, 100 mM de Glicina, 88 a 100 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Ainda, em outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, 100 mM de Metionina, 88 a 100 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Em outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 8% de sacarose, 0,01% de Polissorbato- 80, 88 a 100 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Ainda em outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, 88 a 100 mg/mL, molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Em outro exemplo, a formulação contém 20 mM de histidina, 5% de Sacarose, 118 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem pH de 6,0. Em ainda outro exemplo, a formulação contém 20 mM de Tris, 5% de Sacarose, 117 mg/mL de molécula de nanocor- po de ligação de TNF, tem um pH de 7,2. Em outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Polissor- bato-80, aproximadamente de 80 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Em ainda outra modalidade, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Po- lissorbato-80, aproximadamente 50 mg/mL, e tem um pH de 6,0. Em um exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, aproximadamente 1 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 5,5. Em outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 150 mM de cloridrato de arginina, aproximadamente 1 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 5,5. Em ainda outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidi- na, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 75 mM de cloreto de sódio, aproximadamente 1 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 5,5. Em um exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, aproximadamente 1 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Em outro exemplo, a formulação contém 10 mM de his- tidina, 55 de sacarose, 0,01% de Tween-80, 10 mM de cloridrato de arginina, aproximadamente 1 mg/mL de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Em ainda outra modalidade, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 75 mM de cloreto de sódio, aproximadamente 1 mg/mL de molécula de nanocor- po de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0. Em um exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween- 80, aproximadamente 1 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,5. Em outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 150 mM de cloridrato de arginina, aproximadamente 1 mg/mL de molécula de na- nocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,5. Em ainda outra modalidade, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 75 mM de cloreto de sódio, aproximadamente 1 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,5. Em um exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, aproximadamente 1 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 7,0. Em outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 150 mM de cloridrato de arginina, aproximada- mente 1 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 7,0. Em ainda outro exemplo, a formulação contém 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 75 mM de cloreto de sódio, aproximadamente 1 mg/mL de molécula de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 7,0. Em ainda outra modalidade, a formulação de molécula de nanocorpo de ligação de TNF contém 20 mM de histidina, 7,5% de sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, 250 mg/mL de moléculas de nanocorpo de ligação de TNF, e tem um pH de 6,0.
[000177] Detalhes adicionais relacionados aos componentes de formulações e métodos de ensaio da integridade da molécula SDAB, por exemplo, a molécula de nanocorpo de ligação de TNF, em uma formulação são proporcionados abaixo.
[000178] Concentrações de moléculas SDAB nas formulações estão geralmente entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 350 mg/mL, por exemplo,, 0,5 mg/mL a cerca de 350 mg/mL, cerca de 0.5 mg/mL a cerca de 300 mg/mL, cerca de 0.5 mg/mL a cerca de 250 mg/mL, cerca de 0.5 mg/mL a cerca de 150 mg/mL, cerca de 1 mg/mL a cerca de 130 mg/mL, cerca de 10 mg/mL a cerca de 130 mg/mL, cerca de 50 mg/mL a cerca de 120 mg/mL, cerca de 80 mg/mL a cerca de 120 mg/mL, cerca de 88 mg/mL a cerca de 100 mg/mL ou cerca de 10 mg/mL, cerca de 25 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 80 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 130 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, cerca de 200 mg/mL, cerca de 250 mg/mL ou cerca de 300 mg/mL. No con-texto de faixas, "cerca de" significa -20% do valor numérico inferior citado da faixa e +20% do valor numérico superior citado da faixa. No contexto de faixas, por exemplo, cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL, isso significa entre 8 mg/mL e 120 mg/mL. Em alguns casos, as concentrações das moléculas SDAB nas formulações podem estar, por exemplo, entre 0,1 mg/mL e 200 mg/mL, por exemplo, 0,5 mg/mL e 100 mg/mL, 0,5 mg/mL e 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL e 45 mg/mL, 1mg/mL e 10 mg/mL, 10 mg/mL e 40 mg/mL, 10 mg/mL e 50 mg/mL, 50 mg/mL e 100 mg/mL, 100 mg/mL e 200 mg/mL. Tais formulações de moléculas SDAB podem ser usadas como agentes terapêuticos. Por conseguinte, a concentração da molécula SDAB em uma formulação é suficiente para proporcionar tais doses em um volume da formulação que é tolerado por um paciente que está sendo tratado e é apropriado para o método de administração. Em um exemplo não limitativo, para suprir uma alta dose subcutaneamente, na qual a limitação de volume é pequena (por exemplo, cerca de 1 mL a 1,2 mL por injeção), a concentração de molécula SDAB é de, geralmente, pelo menos 100 mg/mL ou mais, por exemplo, 100 mg/mL a 500 mg/mL, 100 mg/mL a 250 mg/mL, ou 100 mg/mL. Tais concentrações altas podem ser obtidas, por exemplo, por reconstituição de uma formulação liofilizada em um volume apropriado de diluente (por exemplo, água esterilizada para injeção, solução salina tamponada). Em alguns casos, a formulação reconstituída tem uma concentração de entre cerca de 10° mg/mL e 300 mg/mL (por exemplo, 100 mg/mL, 125 mg/mL, 150 mg/mL, 175 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 275 mg/mL, 300 mg/mL). Concentrações altas, por exemplo, de até 250 mg/mL, podem ser usadas em armazenagem de longo prazo, por exemplo, armazenagem congelada de preparações grandes da molécula SDAB.
[000179] Para administração via inalação, a formulação está geralmente um pouco concentrada (por exemplo, entre cerca de 100 mg/mL e 500 mg/mL) para proporcionar uma dose suficiente em um volume limitado da aerossol para inspiração. Em alguns casos, baixas concentrações (por exemplo, entre cerca de 0,05 mg/mL e 1 mg/mL) são usadas. Métodos são conhecidos na técnica para adaptar a dosagem administrada ao método de distribuição, por exemplo, nebulizador de jato ou aerossol com dosador.
Tampões de Crioprotetores
[000180] O pH de uma formulação conforme descrita aqui é geralmente de cerca de pH 5,0 e cerca de pH 7,0, por exemplo, cerca de pH 5,5 a cerca de 6,5, cerca de pH 5,5 a cerca de 6,0, cerca de pH 6,0 a cerca de 6,5, pH 5,5, pH 6,0, ou pH 6,5. Em geral, um tampão que pode manter uma solução em pH 5,5 a 6,5 é usada para preparar uma formulação, por exemplo, um tampão tendo um pKA de cerca de 6,0. Tampões adequados incluem, sem limitação, tampão de histidina, TRIS, ácido 2-(N-morofolino)etanossulfônico (MES), cacodilato, fosfato, succinato, e citrato. A concentração do tampão está entre cerca de 4 mM e cerca de 60 mM, por exemplo, cerca de 5 mM a cerca de 25 mM, por exemplo, histidina é, geralmente, usada em uma concentração de até 60 mM. Em alguns casos, o tampão de histidina é usada em uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 10 mM ou cerca de 20 mM. Em outros casos, tampão de acetato ou succinato é usado em uma concentração de cerca de 5 mM ou cerca de 10 mM.
[000181] Crioprotetores são conhecidos da técnica e incluem, por exemplo, sacarose, trealose, e glicerol. Um crioprotetor que exibe baixa toxidez em sistemas biológicos é geralmente usado. O crioprotetor está incluído na formulação em uma concentração de cerca de 0,5% e 15%, cerca de 0,5% a 2%, cerca de 2% a 5%, cerca de 5% a 10%, cerca de 10% a 15%, e cerca de 5% (peso/volume).
[000182] Tampão de histidina, que pode ser usado como tampão em uma formulação de nanocorpo de ligação de TNF pode ter propriedades crioprotetoras. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de histidina pode excluir especificamente o uso de histidina em qualquer quantidade substancial, por exemplo, nem o tampão nem o componente crioprotetor da formulação é uma histidina.
[000183] A viscosidade da formulação é, geralmente, uma que seja compatível com a via de administração da formulação. Em algumas modalidades, a viscosidade da formulação está entre 1cP e 4 cP, por exemplo, cerca de 2cP a 3,5 cP. Em outras modalidades, a viscosidade da formulação está entre cerca de 5 cP e cerca de 40 cP. Em modalidades específicas, a viscosidade da formulação é de cerca de 1 cP, 2 cP, 2,4 cP a 2,8 cP, 3 cP, 3,1 cP a 3,2 cP, 4 cP, 5 cP, 10 cP, 15 cP, 20 cP, 25 cP, 30 cP, 35 cP, ou 40 cP.
Tensoativos
[000184] Em certas modalidades, um tensoativo é incluído na formulação. Exemplos de tensoativos incluem, sem limitação, tensoativos não iônicos, tais como polissorbatos (por exemplo, polissorbato-20, polissorbato-40, polissorbato-60, polissorbato-65, polissorbato-80, ou polissorbato-85); TritonTM; dodecil sulfato de sódio (SDS); lauril sulfato de sódio; octil glicosídeo sódico; lauril-sulfobetaína, miristil-sulfobe- taína, linoleil-sulfobetaína, estearil-sulfobetaína, lauril-sarcosina, miris- til-sarcosina, linoleil-sarcosina, estearil-sarcosina, linoleil-betaína, mi- ristil-betaína, cetil-betaína, lauroamidopropil-betaína, cocamidopropil- betaína, linoleamidopropil-betaína, miristamidopropil-betaína, palmido- propil-betaína, isostearamidopropil-betaína (por exemplo, lauroamido- propil), miristarnidopropil-, palmidopropil-, ou isoestearamidopropil- di- metilamina; metil cocoil taurato de sódio-, ou metil oleil-taurato dissódi- co e a série Monaquat® (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietil- glicol, polipropilglicol, e copolímeros de etileno e propileno glicol, por exemplo, poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188).
[000185] A quantidade de tensoativo adicionada é tal que reduz a agregação da proteína reconstituída para um nível aceitável conforme ensaiado usando-se, por exemplo, SEC-HPLC de espécies de HMW ou espécies de LMW, e minimiza a formação de particulados depois da reconstituição de um liofilizado de uma formulação de nanocorpo de ligação de TNF. A adição de tensoativo mostrou que reduz o tempo de reconstituição de uma formulação liofilizada de anticorpos de liga- ção de TNF, e auxilia na degaseificação da solução. Por exemplo, o tensoativo pode estar presente na formulação (líquida ou antes da liofi- lização) em uma quantidade de cerca de 0,001% a 0,6%, por exemplo, de cerca de 0,005% a 0,05%m cerca de 0,05%, cerca de 0,05% a cerca de 0,2%, e cerca de 0,01% a 0,2%.
Adições às Formulações
[000186] As formulações são armazenadas como soluções estéreis ou liofilizadas estéreis. Prevenção da ação dos microorganismos nas formulações pode ser também obtida por inclusão de pelo menos um agente antibacteriano e/ou antifúngico na formulação, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerossal, e similares. Em alguns casos, um liofilizado é reconstituído com água bacteri- ostática (por exemplo, água contendo álcool benzílico a 0,9%). Considerações para a inclusão de um conservante em uma formulação são conhecidas da técnica bem como são os métodos para identificar conservantes, os quais são compatíveis com uma formulação específica e método de distribuição (vide, por exemplo, Gupta, et al. (2003), AAPS Pharm. Sci. 5:Artigo 8, pp. 1-9).
[000187] Em alguns casos, a formulação é isotônica. Em geral, qualquer componente conhecido da técnica que contribui para a osmolari- dade da solução/tonicidade pode ser adicionada a uma formulação (por exemplo, sais, açúcares, poliálcoois, ou uma combinação destes). A isotonicidade é geralmente obtida usando-se ou um componente de uma formulação básica (tal como sacarose) em uma concentração iso- tônica ou por adição de um componente adicional tal como açúcar, po- liálcool tal como manitol ou sorbitol, ou um sal de cloreto de sódio.
[000188] Em alguns casos, o sal é usado na formulação de nanocor- po de ligação de TNF, por exemplo, para obter isotonicidade ou para aumentar a integridade do nanocorpo de ligação de TNF da formulação. Sais adequados para uso são discutidos acima. A concentração de sal pode ser de 0 mM a cerca de 300 mM.
[000189] Em certos casos, a formulação é preparada com Tween (por exemplo, Tween® 20, Tween® 80) para diminuir a degradação interfacial. A concentração de Tween pode ser de cerca de 0,001% a cerca de 0,05%. Em um exemplo, Tween-80 é usado em uma concentração de 0,01% na formulação.
[000190] Em outros casos, a formulação é preparada com arginina. A concentração de arginina na formulação pode ser de cerca de 0,01% a cerca de 5%. Em um exemplo, a arginina é usada em uma concentração de 2% na formulação. Em alguns casos, tanto Tween como argini- na são adicionadas à formulações de ligação de TNF descritas acima.
[000191] Em ainda outros casos, a formulação pode ser preparada com pelo menos um de: sorbitol, glicina, metionina, ou cloreto de sódio. Se sorbitol é incluído na formulação, ele pode ser adicionado para uma concentração de entre cerca de 1% e cerca de 10%. Em um exemplo, o sorbitol é encontrado na formulação em uma concentração de 5%. Se glicina é incluída na formulação, ele pode ser adicionada para uma concentração de entre cerca de 0,1% e cerca de 25. Em um exemplo, a glicina é encontrada na formulação em uma concentração de 1%. Se metionina é incluída na formulação, ela pode ser adicionada a uma concentração de entre cerca de 5 mM e cerca de 150 mM. Em um exemplo, a metionina é adicionada à formulação em uma concentração de 100 mM. Em outro exemplo, a metionina é adicionada à formulação em uma concentração de cerca de 10 mM, cerca de 20 mM ou cerca de 70 mM. Se cloreto de sódio é incluído na formulação. Ela pode ser adicionada para uma concentração de entre de cerca de 5 mM e cerca de 100 mM. Em um exemplo, o cloreto de sódio é adicionado à formulação em uma concentração de 55 mM.
Armazenagem e Métodos de Preparação Congelamento
[000192] Em alguns casos, as formulações contendo anticorpos são congeladas para armazenagem. Por conseguinte, é desejável que a formulação seja relativamente estável sob tais condições, inclusive sob ciclos de congelamento-descongelamento. Um método para determinar a adequabilidade de uma formulação é submeter uma amostra da formulação a pelo menos dois, por exemplo, três, quatro, cinco, oito, dez, ou mais ciclos de congelamento (por exemplo, a -20oC ou -80oC) e descongelamento (por exemplo, por descongelamento rápido em banho de água a 37oC ou descongelamento lento a 2o - 8oC, determinando a quantidade de espécies de LMW e/ou espécies de HMW que se acumulam depois dos ciclos de congelamento/descongelamento e comparar esta à quantidade de espécies de LMW ou espécies de HMW presentes na amostra antes do procedimento de congelamento- descongelamento. Um aumento nas espécies de LMW ou de HMW indica solubilidade diminuída.
Liofilização
[000193] As formulações podem ser armazenadas após a liofilização. Portanto, testar uma formulação quanto à estabilidade do componente de proteína da formulação depois da liofilização é útil para determinar a adequabilidade de uma formulação. O método é similar àquele descrito acima para congelamento, exceto pelo fato que a amostra de formulação é liofilizada em vez de congelada, reconstituída para seu volume original, e testada quanto à presença de espécies de LMW e/ou espécies de HMW. A formulação de amostra liofilizada é comparada a uma formulação de amostra correspondente que não foi liofili- zada. Um aumento das espécies de LMW ou de HMW na amostra liofi- lizada comparado à amostra correspondente indica estabilidade aumentada na amostra liofilizada.
[000194] Em geral, o protocolo de liofilização inclui carregar uma amostra no liofilizador, um período de pré-resfriamento, congelamento, iniciação de vácuo, subindo para a temperatura primária, secagem primária, subindo para a temperatura de secagem secundária, secagem secundária, e arrolhamento da amostra. Parâmetros adicionais que podem ser selecionados para um protocolo de liofilização incluem vácuo (por exemplo, em micra) e temperatura do condensador. Velocidades de elevação de temperaturas adequadas estão entre cerca de 0,1oC/mim a 2oC/min, 0.1°C/ min a 0,5°C/ min, 0,2°C/ min a 0,5°C/ min, 0,1°C/ min., 0,2°C/ min, 0,3°C/ min, 0,4°C/ min, 0,5°C/ min, 0,6°C/ min, 0,7°C/ min, 0,8°C/ min, 0,9°C/ min, e 1,0°C/ min. Temperaturas de prateleira adequadas durante o congelamento para um ciclo de liofilização são, geralmente, de cerca de 55°C a -5°C, -25°C a-5°C, -20°C a -5°C, -15°C a -5°C, -10 C a -5°C, -10°C, -11°C, -12°C, -13°C, -14°C, -15°C, - 16°C, -17°C, -18°C, -19°C, -20°C, -21°C, -22°C, -23°C, -24°C, ou - 25°C. Temperaturas de prateleira podem ser diferentes para secagem primária e secagem secundária, por exemplo, a secagem primária pode ser realizada em uma temperatura mais baixa que a secagem secundária. Em um exemplo não limitativo, a secagem primária pode ser executada a 0oC e a secagem secundária a 25oC.
[000195] Em alguns casos, um protocolo de recozimento é usado durante o congelamento e antes da iniciação de vácuo. Em tais casos, o tempo de recozimento deve ser selecionado e a temperatura fica geralmente acima da temperatura de transição vítrea da composição. Em geral, o tempo de recozimento é de cerca de 2 a 15 horas, cerca de 3 a 12 horas, cerca de 2 a 10 horas, cerca de 3 a 5 horas, cerca de 3 a 4 horas, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 5 horas, cerca de 8 horas, cerca de 10 horas, cerca de 12 horas, ou cerca de 15 horas. A temperatura de recozimento é, geralmente, de cerca de -35oC a cerca de -5oC, por exemplo, de cerca de -25oC a cerca de -8oC, cerca de - 20oC a cerca de -10oC, cerca de -25oC, cerca de -20oC, cerca de - 15oC, cerca de 0oC, ou cerca de -5oC. Em alguns casos, a temperatura de recozimento é, geralmente, de -35oC a 0oC, por exemplo, de 25oC a -8oC, -20oC a -10oC, -25oC, -20oC, -15oC, 0oC.
[000196] A estabilidade das formulações descritas aqui pode ser testada usando-se uma variedade de parâmetros de liofilização incluindo: as temperaturas de prateleira de secagem primária de -25oC a 30oC e secagem secundária com durações de 2 horas a 9 horas a 0oC a 30oC.
[000197] Em um exemplo não limitativo, uma formulação de 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, pH 6,0, em uma concentração de proteína de 50 mg/mL de nanocorpo de ligação de TNF foi formulada a granel e liofilizada. Depois da liofilização, o produto é reconstituído com aproximadamente metade do volume de preenchimento para distribuir proteína a 100 mg/mL. O anticorpo de TNF mostrou estar robusto após a liofilização para extremos de temperatura do produto. O perfil de estabilidade na armazenagem a 50oC, por quatro semanas era idêntico para o material que havia sido preparado usando-se uma variedade de ciclos de liofilização (por exemplo, vide figuras 16-20), alguns do quais apresentaram quase 10oC de diferença na temperatura do produto durante a secagem primária (por exemplo, figura 13). Em geral, o ciclo de liofilização pode ser operado por 10 horas a 100 horas, por exemplo, 20 horas a 80 horas, 30 horas a 60 horas, 40 horas a 60 horas, 45 horas a 50 horas, 50 horas a 65 horas.
[000198] Exemplos não-limitativos da faixa de temperatura para armazenagem de um formulação de anticorpo são de cerca de -20°C a cerca de 50°C, e.g., cerca de -15°C a cerca de 30°C, cerca de -15°C a cerca de 20°C, cerca de 5°C a cerca de 25°C, cerca de 5°C a cerca de 20°C, cerca de 5°C a cerca de 15°C, cerca de 2°C a cerca de 12°C, cerca de 2°C a cerca de 10°C, cerca de 2°C a cerca de 8°C, cerca de 2°C a cerca de 6°C, ou cerca de 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 10°C, 15°C, 25°C, ou 30°C. A despeito das temperaturas de armazenagem, as amostras, em certo caso, são estáveis sob mudanças de temperatura que podem ocorrer transitoriamente durante as condições de armazenagem e transporte que podem ser antecipadas para tais condições.
Secagem por pulverização
[000199] Em alguns casos, uma formulação é secada por pulverização e então armazenada, A secagem por pulverização é conduzida por métodos conhecidos da técnica, e pode ser modificada para usar secagem por pulverização de líquido ou de congelado (por exemplo, usando-se métodos tais como aqueles da Niro Inc. (Madison, WI), Upperton Particle Technologies (Nottingham, Inglaterra), ou Buchi (Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY), ou Pedidos de Patentes Publicados US 20030072718 e US 20030082276).
Determinação da Integridade da Molécula SDAB
[000200] A acumulação das espécies de LMW e de HMW são medições úteis da estabilidade do anticorpo. Acumulação seja de LMW ou seja de HMW em uma formulação é indicativa da instabilidade de uma proteína armazenada como parte da formulação. Cromatografia de exclusão de tamanho com HPLC pode ser usada para determinar a presença de espécies de LMW e de HMW. Sistemas adequados para tais medições são conhecidos da técnica, por exemplo, sistemas de HPLC (Waters, Milford, MA), Outros sistemas conhecidos da técnica podem ser usados para avaliar a integridade do anticorpo em uma formulação, por exemplo, SDS-PAGE (monitorar espécies HMW e LMW), bio- ensaios da atividade do anticorpo, ensaio imunossorbente ligado à enzima, capacidade de se ligar à proteína-alvo purificada (por exemplo, TNF-α) HPLC com troca iônica (CEX-HPLCO, para detectar variantes e monitorar a carga da superfície). Em um exemplo, um bioensaio é um ensaio baseado em células em que a inibição da atividade dependente de TNF-α é examinada em presença de concentrações diferentes de molécula de nanocorpo formulada para demonstrar a atividade biológica.
Artigos de Fabricação
[000201] A presente invenção proporciona também um artigo de fabricação que inclui uma formulação conforme descrita aqui e fornece instruções para uso da formulação.
[000202] As formulações a serem usadas para administração a um paciente, por exemplo, tal como um produto farmacêutico devem ser estéreis. Isso é conseguido usando-se métodos conhecidos da técnica, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis, antes de ou seguinte à formulação de um líquido ou liofilização e reconstituição. Alternativamente, quando isso não danifica a estrutura, os componentes da formulação podem ser esterilizados por autocliva- gem e então combinados com filtro ou componentes esterilizados por radiação para produzir a formulação.
[000203] A formulação farmacêutica pode ser administrada com um dispositivo de distribuição transcutânea, tal como uma seringa, incluindo uma seringa hipodérmica ou de multicâmara. Em uma modalidade, o dispositivo é uma seringa preenchida com uma agulha anexada ou integral. Em outras modalidades, o dispositivo é uma seringa preenchida em agulha anexada. A agulha pode ser embalada com a seringa preenchida. Em uma modalidade, o dispositivo é um dispositivo de au- toinjeção, por exemplo, uma seringa autoinjetora. Em outra modalidade, o dispositivo de injeção é uma caneta injetora. E ainda outra modalidade, a seringa é uma seringa de agulha embutida, ou uma seringa com bico Luer lock, ou seringa com Luer slip. Outros dispositivos de distribuição adequados incluem stents, cateteres, microagulhas, e dispositivos de liberação controlada implantáveis. A composição pode ser administrada intravenosamente com equipamento IV padrão, incluindo, por exemplo, tubos IV, com ou sem filtros na linha.
[000204] Em certas modalidades, a seringa é adequada para uso com um dispositivo autoinjetor. Por exemplo, o dispositivo autoinjetor pode incluir um sistema de frasco simples, tal como um dispositivo de caneta injetora para distribuição de uma solução. Tais dispositivos estão comercialmente disponíveis de fabricantes tais como BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen®, e OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Rofe- ron Pen®, Biojector®, Iject®, J-tip Needle-Free Injector®, DosePro®, Me- di-Ject®, por exemplo, feitos ou desenvolvidos por Becton Dickensen (Franklin Lakes, N.J.), Ypsomed (Burgdorf, Suíça, www.ypsomed.com; Bioject, Portland, Oreg.; National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK), Medi-Ject Corp (Minneapolis, Minn.), e Zogenix, Inc, Emeryville, CA.
[000205] O artigo de fabricação pode incluir um recipiente adequado para conter a formulação. O recipiente pode ser, sem limitação, um dispositivo, garrafa, frasco, seringa, tubo de ensaio, nebulizador (por exemplo, nebulizadores com tela ultrassônicos ou vibradores), bolsa de solução i.v., ou inalador (por exemplo, um inalador do medidor de dosagem (MDI) ou inalador de pó seco (DPI)). O recipiente pode ser formado de qualquer material adequado tais como vidro, metal, ou plástico tal como policarbonato, poliestireno, ou polipropileno. Por exemplo, o recipiente (por exemplo, seringa ou frasco) pode ser feito de vidro, plástico, copolímero de olefina cíclica, ou polímero de olefina cíclica. Opcionalmente, o recipiente (por exemplo, seringa ou frasco) tem uma rolha, por exemplo, uma rolha de borracha. Modalidades específicas de recipientes para armazenar as presentes formulações incluem: (i) líquido em um frasco de vidro com uma rolha de borracha; (ii) líquido em uma seringa de vidro preenchível com um êmbolo de borracha; e (iii) líquido em uma seringa polimérica preenchível, por exemplo, copolímero de olefina cíclica (COC), ou polímero de olefina cíclica (COP), com êmbolo de borracha.
[000206] Em geral, o recipiente é de material que não adsorve quantidades significativas de proteína da formulação e não é reativo com os componentes da formulação.
[000207] Em algumas modalidades, o recipiente é um frasco de vidro transparente com uma rolha, por exemplo, uma rolha cinza siliconiza- da West 4432/50 1319 ou uma rolha West 4023. Em algumas modalidades, o recipiente é uma seringa. Em modalidades específicas, a formulação compreende 100 mg/mL do nanocorpo de ligação de TNF, 20 mM de histidina, 7,5% de sacarose, 0,01% de polissorbato-80, pH 6,0 em uma seringa preenchida. Em outra modalidade, a formulação compreende cerca de 10 mg/mL, cerca de 100 mg/M do nanocorpo de ligação de TNF, 20 mM de histidina, 7,5% de sacarose, 0,01% de po- lissorbaato-80, pH 6 em uma seringa de olefina cíclica preenchível e um êmbolo de borracha cinza siliconizada West 4432/50. Em outras modalidades, as formulações incluem cerca de 10 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 100 mg/mL do nanocorpo de ligação de TNF, 20 mM de histidina, 7,5% de sacarose, 0,01% de polissorbato-80, pH 6, em uma seringa de vidro preenchível e um êmbolo de borracha cinza sili- conizada ou êmbolo de borracha revestido West 4023/50 Daikyo Flou- rotec/B2.
[000208] Os artigos de fabricação descritos aqui podem ainda incluir um material de embalagem. O material de embalagem fornece, além da informação para uso ou administração, por exemplo, informação requerida por uma agência reguladora concernente às condições sob as quais o produto pode ser usado. Por exemplo, o material de embalagem pode proporcionar instruções ao paciente sobre como injetar uma seringa preenchida contendo as formulações descritas aqui, ou como reconstituir a formulação liofilizada em um diluente aquoso para formar uma solução dentro de um período especificado, por exemplo, por um período de 2-24 horas ou mais. As formulações presentemente reivindicadas são úteis para uso em produto farmacêutico humano.
[000209] Em certas modalidades, as formulações podem ser administradas como nebulizadores. Exemplos de nebulizadores incluem, sem limitação, nebulizadores de jato, nebulizadores ultrassônicos, e nebulizadores vibradores com tela. Essas classes usam métodos diferentes para criar um aerossol a partir de um líquido. Em geral, qualquer dispositivo gerador de aerossol que pode manter a integridade da proteína nessas formulações é adequado para distribuir as formulações conforme descrição aqui.
[000210] Em outras modalidades, as composições farmacêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser administradas com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tais como os dispositivos descritos nas Patentes US 5.399.163, US 5.383.851, US 5.321.335, US 5.064.413, US 4.941.880, US 4.790.824, ou US 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos incluem: a Patente US 4.486.603, que descreve uma bomba de microinfusão implantável para dispensar medicamento em uma taxa controlada; a Patente US 4.486.194, que descreve um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; a Patente US 4.447.233, que descreve uma bomba de infusão de medicamento para distribuir medicamento em uma taxa de infusão precisa; a Patente US 4.447.224, que descreve um aparelho de infusão, implantável, de fluxo variável para distribuição contínua do fármaco; a Patente US 4.439.196, que descreve um sistema distribuidor de fármaco osmótico que tem compartimentos de multicâmara; e a Patente US 4.475.196, que descreve um sistema distribuidor de fármaco osmótico. A composição terapêutica pode também estar na forma de uma formulação de liberação constante, biodegradável ou não-biodegradável, para administração subcutânea ou intramuscular. Vide, por exemplo, as Patentes US 3.773.919 e US 4.767.628 e o Pedido PCT WO 94/15587. A administração contínua pode ser também obtida usando-se uma bomba implantável ou externa. A administração pode ser também conduzida intermitentemente, por exemplo, injeção diária única, ou continuamente em uma dose baixa, por exemplo, formulação de liberação constante. O dispositivo de tratamento pode ser modificado para ser ajustado otimamente para administração da molécula SDAB. Por exemplo, uma seringa pode ser siliconizada até onde seja ótima para armazenagem e distribuição da molécula SDAB. Naturalmente, muitos outros de tais implantes, sistemas distribuidores, e moléculas são também conhecidos. A invenção também se refere a um dispositivo para administrar um primeiro e segundo agentes. O dispositivo pode incluir, por exemplo, um ou mais gabinetes para armazenagem de preparações farmacêuticas, e pode ser configurado para distribuir doses unitárias de o primeiro e o segundo agentes. Os primeiro e segundo agentes podem ser armazenados nos mesmos compartimentos ou separados. Por exemplo, o dispositivo pode combinar os agentes antes da administração. É também possível usar dispositivos diferentes para administrar o primeiro e o segundo agente.
Administração e Método de Tratamento
[000211] As formulações da invenção podem ser administradas a um paciente (por exemplo, um paciente humano) sozinhas ou em combinação com um segundo agente, por exemplo, um segundo agente terapêutica ou farmacologicamente ativo, para tratar ou prevenir (por exemplo, reduzir ou atenuar um ou mais sintomas associados a) um distúrbio associado a TNF-a, por exemplo, doenças inflamatórias ou autoimunes. O termo "tratar" se refere a administrar uma terapia em uma quantidade, maneira, e/ou modo eficaz para atenuar uma condição, sintoma, ou parâmetro associado a um distúrbio ou para prevenir a progressão de um distúrbio, em um grau estatisticamente significan- te ou em um grau detectável por aquele versado na técnica. Uma quantidade, maneira ou modo eficaz pode variar dependendo do paciente e pode ser ajustado ao paciente.
[000212] Exemplos não limitativos de distúrbios imunes que podem ser tratados incluem, mas sem limitação, distúrbios autoimunes, por exemplo, artrite (incluindo artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática, artrite associada a lúpus ou espondilite anquilosante), escleroderma, eritematose do lúpus sistêmico, síndro- me de Sjogren, vasculite, esclerose múltipla, tireoidite autoimune, dermatite (incluindo dermatite atópica e dermatite eczematose), mias- tenia grave, doença inflamatória intestinal (IBD), doença de Crohn, colite, diabetes melito (tipo I); condições inflamatórias de, por exemplo, a pele (por exemplo, psoríase); condições inflamatórias agudas (por exemplo, endotoxemia, sepse e septicemia, síndrome de choque tóxico e doença infecciosa); rejeição a transplante e alergia. Em uma modalidade, o distúrbio associado a TNF-a é um distúrbio artrítico, por exemplo, um distúrbio selecionado de uma ou mais de artrite reuma- toide, artrite reumatoide juvenil (RA) (por exemplo, artrite reumatoide de moderada a agra), osteoartrite, artrite psoriática, ou espondilite an- quilosante, artrite idiopática juvenil poliarticular (JIA); psoríase, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença inflamatória intestinal; e/ou esclerose múltipla.
[000213] Em certas modalidades, as formulações incluem um segundo agente terapêutico. Por exemplo, nanocorpos de TNF, o segundo agente pode ser um anticorpo anti-TNF ou fragmento de ligação de TNF, em que o segundo anticorpo de TNF tem uma especificidade de epítopo diferente que a molécula SDAB de ligação de TNF da formulação. Outros exemplos não limitativos que podem ser coformulados com a molécula SDAB de ligação de TNF incluem, por exemplo, um inibidor de citocina, um inibidor de fator de crescimento, um imunossu- pressor, um agente antiinflamatório, um inibidor metabólico, um inibidor de enzima, um agente citotóxico, e um agente citostático. Em uma modalidade, o agente adicional é um tratamento padrão para artrite, incluindo, mas sem limitação, agentes anti-inflamatórios não-esteroides (NSAIDs); corticosteroides, incluindo prednisolona, prednisona, cortisona, e trianci- nolona; e fármacos antirreumáticos modificadores de doença (DMARDs), tais como metotrexato, hidroxicloroquina (plaquenil) e sulfasalazina, le- flunomida (Arava®), inibidores de fator de necrose tumoral, incluindo etanercepte (Enbrel®, infliximabe (Remicade®) (com ou sem metotrexa- to), e adalimumabe (Humira®), anticorpo anti-CD20 (por exemplo, Ritu- xan®), receptor de interleucina-1 solúvel, tais como anaquinra (Kine- ret), ouro, minociclina (Minocin®), penicilamina, e agentes citotóxicos, incluindo azatioprina, ciclofosfamida, e ciclosporina. Tais terapias de combinação podem utilizar vantajosamente utilizar dosagens inferiores dos agentes terapêuticos administrados, evitando, assim, possível to- xidez ou complicações associadas a várias monoterapias.
[000214] As formulações da invenção podem estar na forma de uma solução líquida (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis). Tais composições podem ser administradas por modo parenteral (por exemplo, injeção subcutânea, intraperitoneal, ou intramuscular), ou por inalação. As frases "administração parenteral" e "administrado paren- teralmente", como usadas aqui, significam modos de administração diferentes de administração enteral e tópica, usualmente por injeção, e incluem administração subcutânea ou intramuscular bem como injeção intravenosa, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal, subcuticular, subaracnoide, epidural e in- trasternal e infusão. Em uma modalidade, as formulações descritas aqui são administradas subcutaneamente.
[000215] Formulações farmacêuticas são estéreis e estáveis sob condições de fabricação e armazenagem. Uma composição farmacêu- tica pode ser também testada para assegurar que ela satisfaça os padrões reguladores e industriais para administração.
[000216] Uma formulação farmacêutica pode ser formulada como solução, microemulsão, dispersão, lipossomo, ou outra estrutura desejada adequada para alta concentração de proteína. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se um agente descrito aqui na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por esterilização filtrada. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando-se um agente descrito aqui em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. A fluidez própria de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Absorção prolongada de composições injetáveis pode ser preparada por inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de mo- noesterato e gelatina.
[000217] Em algumas modalidades, os parâmetros que descrevem as formulações, por exemplo, parâmetros que podem aparecer na etiqueta do produto, são caracterizados. Tais parâmetros incluem, por exemplo, cor (tipicamente de incolor para ligeiramente amarelo), e viscosidade (tipicamente entre cerca de 1 a 5 cP, quando medida na temperatura ambiente), tal como de 20oC a 30oC). Tais parâmetros podem ser medidos por métodos conhecidos da técnica. Por exemplo, a claridade pode ser medida usando-se padrões de opalescência comercialmente disponíveis (disponíveis da, por exemplo, Hach Company, Loveland, CO 80539).
EXEMPLOS
[000218] A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos. Os exemplos são proporcionados somente para fins ilustrativos. Eles não devem, de modo algum, ser interpretados como limitativos do escopo da invenção.
Exemplo 1: Estabilidade de Formulação Liofilizada de Alta Concentração de ATN-103 (6 meses de duração)
[000219] Método de armazenagem de anticorpo a ser usado para, por exemplo, aplicações terapêuticas é com um pó seco preparado por liofilização. Por conseguinte, a estabilidade de longo prazo de uma formulação de ligação de TNF liofilizada foi estudada.
[000220] Em resumo, uma formulação contendo um nanocorpo de ligação de TNF humanizado (50 mg/mL), 10 mM de histidina, 5% de sacarose (peso/volume), 0,01% de Polissorbato-80, pH 6,0, foi preparada por filtração estéril e foi dispensada em um frasco de tubo de vidro despirogenado de 5 mL, e então liofilizada. A formulação foi armazenada a 4oC, 25oC, ou 40oC por um mês, três meses, e seis meses, então reconstituída em água estéril (USP) para produzir a formulação reconstituída de modo que a formulação fosse 100 mg/mL de nano- corpo de ligação de TNF, 20 mM de histidina, 10% de sacarose, 0,02% de Polissorbato-80, pH 6,0.
[000221] A estabilidade do líquido em alta concentração foi avaliada por atividade biológica, ligação de albumina sérica humana (HSA), percentagem de HMW e percentagem de LMW por SE-HPLC, percentagem de nanocorpo de ligação de TNF e percentagem de impureza de não produto por SDS-CE, e avaliação por CEX-HPLO de tempo de retenção relativa e comparabilidade do perfil de eluição para o padrão de referência de ligação de TNF.
[000222] As formulações de nanocorpo de ligação de TNF liofilizadas foram ensaiadas quanto à atividade biológica usando um ensaio descrito em WO 2006/122786, A figura 1 ilustra os dados de tal conjunto de bioensaios. Os dados foram expressos como unidades por miligra- ma, As amostras eram de cerca de 5 - 5,5 x 106 U/mg antes da armazenagem e eram cerca de 4,5 - 5,5 x 106 U/mg depois de incubação. No total, não houve alteração substancial na quantidade de bioativida- de depois de seis meses de armazenagem em nenhuma das amostras. Assim, a formulação é, conforme determinado por atividade biológica, adequada para armazenagem da formulação liofilizada por pelo menos seis meses.
[000223] As formulações de nanocorpo de ligação de TNF liofilizadas foram também ensaiadas quanto à atividade de ligação de Albumina Sérica Humana (HSA). A figura 2 ilustra os dados de tal conjunto de ensaios de ligação. A atividade de ligação inicial da formulação era de cerca de 100% da amostra de referência e não alterou substancialmente em nenhuma das amostras no período de seis meses de teste. Assim, a formulação é, conforme determinação ou atividade de ligação de HSA, adequada para armazenagem da formulação liofilizada, por pelo menos seis meses.
[000224] A percentagem de espécies de HMW foi ensaiada usando- se SE-HPLC. A percentagem de espécies de HMW na formulação antes da liofilização e reconstituição foi de cerca de 0,1% da proteína total na formulação e estava também entre cerca de 0,1% - 0,2% em todas as amostras armazenadas a 4oC e 25oC (figura 3). Depois de seis meses de armazenagem a 40oC, as formulações eram cerca de 0,35% de espécies de HMW (figura 3). Assim, não houve aumento substancial do nível das espécies de HMW nas amostras armazenadas a 4oC e a 25oC, por seis meses.
[000225] A percentagem de espécies de LMW foi ensaiada usando- se SE-HPLC. A percentagem de espécies de LMW na formulação estava abaixo do limite de detecção (isto é, 0,0%) em temperaturas de 4oC, 25oC e 40oC, por até seis meses.
[000226] A percentagem de nanocorpo de ligação de TNF foi ensai- ada usando-se SDS-CE. A percentagem inicial de nanocorpo de ligação de TNF na formulação era de cerca de 100% e não se alterou substancialmente em nenhuma das amostras no período de seis meses de teste (figura 4).
[000227] A percentagem de impureza de não produto foi ensaiada usando-se SDS-CE. A impureza do não produto foi observada por SDS-CE para formulação em temperaturas de 4oC, 25oC e 40oC, por até seis meses.
[000228] As formulações de nanocorpo de ligação de TNF liofilizadas foram também testadas quanto à identidade, usando-se CEX-HPLC. O perfil de eluição para a formulação foi comparável ao padrão de referência em temperaturas de 4oC, 25oC e 40oC, por até seis meses. O tempo de retenção relativo do pico designado ficou inalterado em padrão 1,00 a temperaturas de 4oC, 25oC e 40oC, por até seis meses.
[000229] O efeito de adição de Polissorbato-80 nas propriedades de reconstituição para formulação de nanocorpo de ligação de TNF liofili- zada foi também testado. A adição de polissorbato-80 ao produto liofi- lizado aperfeiçoa a qualidade do produto por aperfeiçoamento da aparência e dissolução do pó liofilizado como pode ser visto na Tabela abaixo.Tabela 1.
Figure img0001
[000230] Os dados descritos aqui mostram alterações limitadas em produtos de degradação em função do tempo de armazenagem em várias temperaturas.
Exemplo 2: Robustez da formulação de nanocorpo de ligação de TNF para liofilização
[000231] Além da formulação liofilizada por aplicação do ciclo de liofi- lização alvo (Exemplo 1), dois lotes adicionais do produto de fármaco foram preparados por aplicação de dois ciclos de liofilização de "robustez" adicional. Os dois ciclos de liofilização de "robustez" mimetizam desvios dos processos significantes que poderiam ocorrer no local de fabricação. A mesma formulação de produto de fármaco foi usada no estudo de robustez conforme no estudo de ciclo de liofilização (de controle) alvo: 10 MM de Histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Polissorba- to-80, 50 mg/mL de nanocorpo de ligação de TNF, em pH 6,0. Mediante reconstituição (usando-se um volume de diluente de reconstituição de aproximadamente metade daquele do produto preenchido antes da liofilização) a formulação de ATN-103 é como a seguir: 20 mM de His- tidina, 10% de sacarose, 0,02% de Polissorbato-80, 100 mg/mL de na- nocorpo de ligação de TNF, no pH 6,0.
[000232] Os dois ciclos de liofilização de robustez que mimetizam os desvios processuais significantes são denominados "de alta umidade" e "agressivo". A figura 5 demonstra que a formulação submetida aos ciclos de liofilização de robustez mostra estabilidade comparável àquela do ciclo (controle) alvo. Os frascos de formulação de robustez de liofilização foram colocados em estabilidade acelerada lado a lado com o ciclo de liofilização de controle, e analisados por SE-HPLC.
[000233] Esses dados demonstram que a formulação liofilizada de ATN-103 é robusta para desvios processuais significantes sem impacto do produto.
[000234] A percentagem de espécies de LMW para formulação submetida a ciclos de liofilização de controle e robustez foi ensaiada usando-se SE-HPLC. A percentagem de espécies de LMW por SE- HPLC para nanocorpo de ligação de TNF liofilizado estava abaixo do limite de detecção (isto é, 0,0%) em t0 e a 50oC por até um mês, para todos os três ciclos.
Práticas de Liofilização
[000235] Em todas as corridas, uma proteção de folha de alumínio em frente à porta e uma altura de prateleira de 63 mm foi usada para minimizar a radiação dentro do liofilizador. Em todas as corridas, uma bandeja foi totalmente preenchida para manter uma carga consistente no liofilizador. As rolhas foram autoclavadas e secadas para todos os frascos de proteína. Todos os frascos de proteína foram rinsados com água deionizada e despirogenada. Os frascos e rolhas que foram usados para preencher o restante da bandeja não estavam tratados.
[000236] Os frascos semeados com a formulação de nanocorpo de ligação de TNF foram preparados assepticamente em um compartimento de biossegurança em um alvo de 160 mg/frasco, Os frascos para estudos de estabilidade foram preenchidos com 3,2 mL de formulação fresca antes de cada corrida (o material que não havia sido previamente liofilizado). Durante a liofilização, frascos adicionais foram preenchidos com tampões adequados que eram compatíveis com o ciclo de liofilização alvo para manter uma carga consistente no liofili- zador. A liofilização foi monitorada através do uso de termopares dentro da série de proteína.
Calorimetria por Varredura Diferencial Modulada (mDSC)
[000237] Todas as amostras para mDSC foram operadas em modo modulado com uma amplitude de 0,5% e um período de 100 segundos. Para pós de pós-liofilização, as amostras foram aquecidas e 2oC/min para 150oC, Todas as amostras em pó foram preparadas usando-se uma caixa de luva purgada com nitrogênio. Para amostras líquidas, todas as elevações de temperatura foram realizadas a 0,5%/C/min e as temperaturas corresponderam àquelas usadas nos ciclos de liofilização. A elevação de aquecimento final foi realizada a 2oC/min, para aumentar a transição vítrea. Amostras líquidas foram preparadas em escala laboratorial.
Análise da Umidade
[000238] Foi usada a titulação de Karl Fischer nas amostras liofilizadas. As amostras liofilizadas foram reconstituídas com 3 mL de metanol.
[000239] Injeções em duplicata ou triplicata de 500 μL foram realizadas. Um padrão de água a 1% foi injetado pós-uso com checagem de adequabilidade.
Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR)
[000240] Estrutura secundária do anticorpo no estado de pó seco medida por FTIR. Um precipitado contendo aproximadamente 1 mg de proteína secada formulada dentro de 300 mg de KBr e escaneada 200 vezes. Depois da coleta de dados, a análise envolveu subtração espectral do placebo de sacarose, correção da linha de base, amacia- mento, segundo derivado e normalização da área.
Estabilidade
[000241] A estabilidade do anticorpo liofilizado em formulações foi avaliada como uma função do tempo e temperatura de armazenagem. Amostras de nanocorpo de ligação de TNF liofilizado foram ensaiadas pós-liofilização, após quatro semanas a 2oC - 8oC e depois de duas semanas ou quatro semanas de armazenagem a 50oC. Amostras refrigeradas foram armazenadas em uma câmara frigorífica. Amostras em alta temperatura foram armazenadas em uma Incubadora Imperial Lab Line, ajustada para 50oC. Nos pontos de tempo apropriados, as amostras foram removidas da armazenagem e deixadas esquentarem ou resfriarem até a temperatura ambiente antes do ensaio.
Reconstituição de Aparência Visual
[000242] Frascos de formulações tanto da análise pós-liofilização como da análise de estabilidade na armazenagem foram inspecionados visualmente antes, durante e depois de reconstituídas com 1,3 mL de água estéril para injeção. Os frascos foram inspecionados em uma caixa luminosa contra tanto um fundo branco e um fundo preto para cor da torta, integridade, umidade, particulados, e falhas na reconstituição. Depois da inspeção visual, a torta liofilizada, a tampa e lacre foram removidos do frasco usando um descrimpador, A rolha foi removida e a água estéril para injeção foi lentamente dispensada no frasco usando uma pipeta apropriada. O diluente foi dispensado usando-se um movimento de turbilhonamento para assegurar que a torta fique inteiramente molhada. Uma vez que o diluente havia sido dispensado completamente, a cronometragem da reconstituição foi iniciada com um cronômetro de laboratório padrão e o frasco foi novamente arrolhado. A reconstituição estava completada quando o pedaço final de sólido se dissolveu. Rolando-se o frasco entre as mãos facilitou a reconstituição. Como a torta liofilizada estava no processo de reconstituição, observações feitas sobre o estado da solução em dissolução tais como claridade, formação de bolhas e de espuma foram registradas. Uma vez completada a reconstituição, o tempo de reconstituição foi registrado e os frascos foram deixados na bancada por vários minutos de modo que a solução resultante pudesse se sedimentar e a maioria das bolhas formadas durante a reconstituição pudesse se dissipar. A solução reconstituída foi então inspecionada em uma caixa iluminada com um fundo preto e um fundo branco para cor, claridade e parti- culados.
Cromatografia de Alto Desempenho com Exclusão de Tamanho (SEC- HPLC)
[000243] Dois microlitros de amostras puras da formulação de nano- corpo de ligação de TNF foram injetadas em uma coluna G3000swxl com uma coluna com anteparo (TosoHaas Part Nos 08541 e 08543). A fase móvel era solução salina tamponada com fosfato (PBS) com cloreto de sódio 250 mM adicionado. A vazão era de 0,75 mL/min, e o tempo de corrida foi de 30 minutos. A absorbância no ultravioleta foi monitorado em um comprimento de onda de 280 nm. O cromatograma foi integrado para separar o pico principal do nanocorpo de ligação de TNF de espécies de alto peso molecular e baixo peso molecular usando o software Waters Empower®.
Espectroscopia de Absorbância no Ultravioleta-Visível para Determinação de Concentração (A280)
[000244] Amostras da formulação tendo anticorpo em uma concentração de 100 mg/mL foram diluídos para aproximadamente 0,5 mg/mL e 0,25 mg/mL por adição de 10 μL da amostra a 1.990 μL e 3.990 μL de 10 mM de histidina, 5% de sacarose, pH 6,0, respectivamente. Duzentos microlitros das soluções resultantes foram colocados em poços individuais em uma microplaca de 96 poços juntamente com um branco de tampão. A placa foi lida em uma leitora de placa Spectramax® Plus para absorbância no ultravioleta em comprimentos de onda de 280 nm e 320 nm. Subtraindo-se 320 nm de absorbância de 280 nm de absorbância e dividindo-se pelo coeficiente de extinção (1,405 mL/mg-cm) multiplicado pelas concentrações de proteína determinadas no comprimentos de percurso (1 cm) da solução em cada poço, O fator de diluição apropriado foi aplicado, e uma concentração de proteína média foi determinada.
Espectroscopia de Absorbância no Ultravioleta-Visível para Dispersor de Luz (A420)
[000245] Duzentos microlitros de cada amostra de nanocorpo de ligação de TNF a ser analisada foram feitos em alíquotas em poços individuais em uma microplaca de 96 poços. Um branco de tampão serviu como controle. A placa foi lida em uma leitora de placa Spectramax Plus para absorbância no visível em um comprimento de onda de 420 nm. Estratégia de Desenvolvimento do Ciclo
[000246] Uma série de etapas seqüenciais (descritas abaixo) foim usada para desenvolver um ciclo de liofilização.
Identificação da Temperatura do Produto Crítico
[000247] A temperatura do produto crítico para um nanocorpo de ligação de TNF foi identificado por Calorimetria de Varredura Diferencial modulada (Mdsc). Esse método é usado para identificar a temperatura de transição vítrea do produto congelado (mDSC). Um ciclo de liofili- zação que mantém o produto abaixo desta temperatura durante a secagem primária deveria render uma estrutura de torta intacta. A temperatura mais baixa adequada foi assumida como sendo 25oC, e assim essa temperatura é geralmente incluída em procedimentos projetados para testar condições e formulações quando do desenvolvimento de uma formulação e de métodos para liofilização de um anticorpo conforme descrito aqui.
Execução do Ciclo de Liofilização
[000248] Com base nos resultados dos estudos descritos acima, foram efetuados três ciclos de liofilização diferentes para examinar três parâmetros de interesse no desenvolvimento de um procedimento de liofilização adequados para preparar uma formulação liofilizada adequada para armazenagem ou outros procedimentos. O primeiro parâmetro examinado foi o ciclo de controle, que repete ciclos de estudos de estabilidade anteriores. Todos os ciclos de estabilidade desenvol- vimentais utilizaram este ciclo, assim ele serviu como ponto de partida para esta análise.
[000249] O segundo parâmetro testado foi o impacto de não se realizar a etapa de secagem secundária para gerar tortas liofilizadas com alto teor de umidade residual. Esse ciclo de liofilização serve como avaliação da sensitividade de uma formulação de nanocorpo de ligação de TNF para alto teor residual de umidade, e pode ser usado na avaliação de desvios de fabricação durante os lotes clínicos iniciais antes da execução dos estudos sobre a robustez da liofilização formal.
[000250] O terceiro parâmetro testado foi um ciclo agressivo. Aumento da temperatura da primeira secagem significantemente acima do ponto de regulação do ciclo de controle pode aumentar significante- mente a temperatura do produto de formulação de nanocorpo de ligação de TNF durante a secagem primária. Esse ciclo de liofilização serve como uma avaliação da sensitividade de uma formulação de nano- corpo de ligação de TNF à temperatura do produto durante a liofiliza- ção, e pode ser usado na avaliação de desvios de fabricação durante lotes clínicos iniciais antes da execução dos estudos sobre a robustez da liofilização formal.
Avaliação dos Ciclos de Liofilização
[000251] A avaliação dos ciclos de liofilização selecionados nas formulações de nanocorpo de ligação de TNF foi dividida em dois aspectos: comparação imediata com base em testes de pós-liofilização realizados, e impacto potencial de prazo mais longo causado após incubação sob condições aceleradas.
Identificação da Temperatura do Produto Crítico
[000252] O produto de formulação de nanocorpo de ligação de TNF continha cerca de 50% de proteína. Como tal, a proteína foi antecipada para dominar as propriedades físicas dos estados congelados e liofilizados. Antes da liofilização, Calorimetria de Varredura Diferencial modulada (mDSC), subambiente, pesquisou a temperatura de transição vítrea da fase amorfa concentrada por congelamento da formulação. Com base nos dados do ciclo de desenvolvimento da liofilização agressiva, uma temperatura de produto de -12oC foi selecionada como a temperatura crítica para permanecer inferior durante a liofilização.
Exemplo 3: Estabilidade da Formulação Líquida em Alta Concentração de nanocorpo de ligação de TNF (6 meses de duração)
[000253] Em alguns casos, é desejável armazenar uma formulação de nanocorpo de ligação de TNF em um formato líquido. Por conseguinte, a estabilidade de longo prazo de uma formulação de ligação de TNF líquida contendo uma concentração relativamente alta de nano- corpo de ligação de TNF foi estudada. Em resumo, uma formulação contendo um anticorpo de ligação de TNF humanizado (aproximadamente 0 mg/mL), 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Po- lissorbato-80, pH 6,0, foi preparada para armazenagem por filtragem estéril da formulação em vasos de aço inoxidável desidrogenados. A formulação foi armazenada a -20oC ou 4oC, por cerca de três meses e seis meses. A estabilidade do líquido de alta concentração foi avaliada por atividade biológica, ligação de Albumina Sérica Humana (HSA), percentagem de HMW e percentagem de LMW por SE-HPLC, percentagem de ATN-103 e percentagem de impureza de não-produto por SDS-CE, e avaliação por CEX-HPLC de tempo de retenção relativa e comparabilidade do perfil de eluição para o padrão de referência do nanocorpo de ligação de TNF.
[000254] Um ensaio de atividade biológica foi usado como parâmetro de estabilidade para a formulação de nanocorpo de ligação de TNF, líquida, de alta concentração. O ensaio foi conduzido conforme descrito acima, no Exemplo 1. As amostras foram armazenadas a -20oC e 4oC, por cerca de três meses e seis meses. Os dados foram expressos como unidades por miligrama (figura 6). As amostras eram de cerca de 6 x 106 U/mg antes da armazenagem e eram cerca de 4,5 x 106 U/mg depois da incubação. Isso não reflete essencialmente nenhuma alteração da bioatividade das amostras durante a armazenagem. A variabilidade dos valores reflete a variabilidade inerente ao ensaio. Devido ao fato de não haver decréscimo da quantidade de atividade biológica nas amostras, esses dados proporcionam suporte adicional à adequabili- dade da formulação para armazenagem da ligação de TNF.
[000255] Ainda outro parâmetro da estabilidade foi examinado usando-se formulação de nanocorpo de ligação de TNF, líquida, de alta concentração: aquele da atividade de ligação. Nesses experimentos, a percentagem da atividade de ligação da formulação foi determinada em comparação com um controle depois da armazenagem a -20oC e 4oC, por seis meses. O ensaio monitora especificamente a afinidade de ligação de TNF para Albumina Sérica Humana (HSA). A atividade de ligação inicial da formulação foi de cerca de 100% da amostra de referência e não se alterou substancialmente em qualquer uma das amostras durante o período de teste de seis meses (figura 7). A atividade de ligação medida foi de até cerca de 110% da referência, que dado o erro geralmente observado, genericamente, neste ensaio, não reflete essencialmente nenhuma alteração na atividade de ligação das amostras com o tempo, e não houve tendências relativas à temperatura nos resultados de ligação.
[000256] A percentagem de espécies de HMW foi ensaiada usando- se SEC-HPLC. A percentagem de espécies de alto peso molecular na formulação líquida de alta concentração antes da armazenagem era de entre 0,1% e 0,5% da proteína total na formulação e era de cerca de 0,1% nas amostras armazenadas a -20oC, e cerca de 0,2% nas amostras armazenadas a 4oC até 6 meses de armazenagem (figura 8). Assim, não houve aumento substancial do nível de espécies de HMW nas amostras armazenadas a -20oC e 4oC, por pelo menos seis meses.
[000257] A percentagem de espécies de LMW na formulação de na- nocorpo de ligação de TNF, líquida, de alta concentração, foi também ensaiada na formulação líquida de nanocorpo de ligação de TNF. A percentagem de espécies de LMW na formulação foi abaixo do limite de detecção (isto é, 0,0%) à temperatura de -20oC, e era de cerca de 0,1% nas amostras armazenadas a 4oC por até seis meses (figura 9). Assim, não houve aumento substancial do nível de espécies de LMW nas amostras armazenadas a -20oC, por pelo menos seis meses.
[000258] A percentagem de espécies de LMW foi ensaiada usando- se SE-HPLC. A percentagem das espécies de LMW na formulação líquida de alta concentração estava abaixo do limite de detecção (isto é, 0,0%) em temperaturas de 4oC, 25oC e 40oC, por até seis meses.
[000259] A percentagem do nanocorpo de ligação de TNF foi ensaiado usando-se SDS-CE. A percentagem inicial de nanocorpo de ligação de TNF na formulação líquida de alta concentração foi de 100% e não houve alteração substancial em qualquer uma das amostras pelo período de seis meses de teste (figura 10).
[000260] A percentagem da impureza de não produto foi ensaiada usando-se SDS-CE. Foi observada impureza de não-produto por SDS- CE para formulação de nanocorpo de ligação de TNF, líquida, de alta concentração de -20oC e 4oC por até seis meses.
[000261] As formulações líquidas de alta concentração foram também testadas quanto à identidade usando-se CEX-HPLC. CEX-HPLC é empregada como um teste de identidade. O perfil de eluição para ligação de TNF da formulação líquida de alta concentração era comparável ao padrão de referência em temperaturas de -20oC e 4oC por até seis meses. O tempo de retenção relativo do pico designado estava inalterado no padrão 1,00, em temperaturas de -20oC e 4oC por até seis meses.
[000262] Os dados descritos aqui mostram alterações limitadas nos produtos em degradação como uma função do tempo de armazenagem em várias temperaturas.
Exemplo 4: Estabilidade de Formulação Líquida de Alta Concentração de nanocorpo de ligação de TNF em uma seringa preenchida com líquido (duração de 12 meses)
[000263] A estabilidade de um líquido com alta concentração de na- nocorpo de ligação de TNF preenchido em uma seringa preenchida na seguinte formulação: 10 mM de Histidina. 5% de Sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, aproximadamente 80 mg/mL de nanocorpo de ligação de TNF, em pH 6,0 foi avaliada por percentagem de HMW e percentagem de LMW por SE-HPLC e percentagem de espécies ácidas e bási- cas por CEX-HPLC, e avaliação de tempo de retenção relativo e com- parabilidade do perfil de eluição para o padrão de referência de nano- corpo de ligação de TNF. A formulação foi armazenada a 4oC, por doze meses, a 25oC, por três meses, e a 40oC por dois meses.
[000264] No ponto de tempo inicial, havia cerca de 0,7% de espécies de HMW. Depois de doze meses a 4oC, houve um decréscimo mínimo para cerca de 0,8% de espécies de HMW. Depois de três meses a 25oC, as espécies de HMW aumentaram para cerca de 1,8%. Depois de dois meses a 40oC, as espécies de HMW aumentaram com o tempo para cerca de 27% (figura 11).
[000265] No ponto de tempo inicial, havia cerca de o,1% de espécies de LMW. Depois de dozes meses a 4oC, houve um aumento mínimo para 0,25% de espécies de LMW. Após três meses a 25oC, houve um pequeno aumento para cerca de 0,5% de LMW. Depois de dois meses a 40oC, a degradação aumentou com o tempo para cerca de 1,4% de espécies de LMW (figura 12).
[000266] No ponto de tempo inicial, havia cerca de 6% de espécies ácidas. Depois de doze meses a 4oC, havia cerca de 7,5% de espécies ácidas. Depois de três meses, a 25oC, havia cerca de 7,3% de espécies ácidas, com as espécies ácidas aumentando com o tempo. Depois de dois meses a 40oC, as espécies ácidas aumentaram com o tempo para cerca de 8,3% (figura 13).
[000267] No ponto inicial, havia cerca de 1,7% de espécies básicas. Depois de doze meses a 4oC, havia cerca de 2,9% de espécies básicas. Depois de três meses a 25oC, havia cerca de 2,9% de espécies básicas, em que as espécies básicas aumentavam com o tempo. Depois de dois meses a 40oC, as espécies básicas aumentaram com o tempo para cerca de 27% (figura 14).
[000268] Os tempos de retenção relativa e perfis de eluição de todas as amostras eram comparáveis ao padrão de referência de nanocorpo de ligação de TNF.
[000269] Os dados mostraram alteração dos produtos de degradação como uma função de tempo de armazenagem a 4oC e 25oC, indicando que a formulação é adequada como um líquido em uma seringa preenchida. Algumas alterações perceptíveis nos produtos de degradação foram observadas a 40oC, que é uma condição de estresse para o líquido.
Exemplo 5: Estabilidade dos Líquidos de Alta Concentração de ATN- 103 - Outras Formulações (identificação de outros excipientes estabi- lizantes e desestabilizantes)
[000270] Para selecionar possíveis excipientes para uma formulação líquida de nanocorpo de ligação de TNF, a estabilidade de outras formulações líquida de nanocorpo de ligação de TNF de alta concentração foi examinada. Foi realizado trabalho suplementar usando-se vários excipientes para proporcionar mais estabilidade e para fazer com que a formulação ficasse isotônica, (adequada para injeção em pacientes humanos). A concentração de nanocorpo de ligação de TNF é variada de 88 mg/mL a 100 mg/mL.
[000271] As formulações examinadas eram: 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de polissorba- to-80, 100 mM Arginina (base), pH 5.8 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de polissorba- to-80, 55 mM de NaCl, pH 6.1 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de polissorba- to-80, 55 mM de Arginina HCl, pH 6.1 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de polissorba- to-80, 100 mM de Glicina, pH 6.0 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de polissorba- to-80, 100 mM de Metionina, pH 6.0 10mM de histidina, 8% de sacarose, 0,01% de polissorbato- 80, pH 6.0 CTL: 10mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de polis- sorbato-80, pH 6.0
[000272] As propriedades da solução inicial foram analisadas quanto ao pH, osmolaridade, concentração, turbidez, e viscosidade. Todas as formulações resultaram em soluções isotônicas e mostraram claridade aceitável via medição A455 e baixa viscosidade (2,4 cP a 3,1 cP), mostrando a seringa preenchida e a exequibilidade do autoinjetor.Tabela 2.
Figure img0002
[000273] 23A estabilidade do líquido de alta concentração foi avaliada por percentagem de HMW e percentagem de LMW por SE-HPLC. Esses materiais foram colocados em estabilidade a 5oC, 25oC, 25oC e 40oC, por 3 meses. Dados de 2 semanas a 40oC são mostrados na figura 15.
[000274] Algumas alterações perceptíveis em produtos de degradação foram observadas a 40oC, que é uma condição de estresse por um líquido. Em resumo, a estabilidade acelerada (2 semanas a 40oC) mostra que as formulações 4, 5 e 6 oferecem estabilidade comparável ou aperfeiçoada em comparação com o controle (10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de polissorbato-80, pH 6,0). As formulações 1, 2 e 3 parecem ter um impacto negativo na estabilidade.
[000275] Os dados mostram que glicina, metionina, e sacarose aumentada são estabilizadores para formulações líquidas de nanocorpo de ligação de TNF de alta concentração. Os dados mostram que a base de arginina, cloridrato de arginina e cloreto de sódio podem ser de- sestabilizadores para formulações líquidas de nanocorpo de ligação de TNF de alta concentração sob algumas condições.
Exempo 6: Estabilidade de nanocorpo de ligação de TNF de Formulação Líquida de Alta Concentração
[000276] A estabilidade do nanocorpo de ligação de TNF como um líquido está exemplificada nas seguintes figuras 16-19. Duas formulações foram examinadas: ATN-103 a 118 mg/mL em 20 mM de Histidi- na, 5% de Sacarose, pH 6,0; e ATN-103 a 117 mg/mL em 20 mM de Tris, 5% de Sacarose, pH 7,2. A estabilidade das formulações foi avaliada por percentagem de HMW e percentagem de LMW por SE- HPLC, e a percentagem de espécies ácidas e percentagem de espécies básicas por CEX-HPLC. Os dados mostram alterações limitadas nos produtos de degradação como função do tempo de armazenagem a 4oC, Algumas alterações perceptíveis nos produtos de degradação foram observadas a 40oC, que é uma condição de estresse para um líquido. Os dados mostram que a estabilidade de nanocorpo de ligação de TNF em tampões de histidina e tris são essencialmente similares sob essas condições de formulação, com a histidina funcionando de forma levemente mais favorável (ligeiramente menos LMW). As atividades da pré-formulação determinariam mais tarde que pH elevado (7 ou mais) resulta em um grau maior de formação de LMW, explicando a vantagem observada abaixo.
Exemplo 7: Estabilidade da Formulação Líquida de Alta Concentração de nanocorpo de ligação de TNF: Avaliação de estresses interfaciais (congelamento/descongelamento)
[000277] As figuras 20-23 demonstram a estabilidade da formulação líquida de nanocorpo de ligação de TNF em aproximadamente 80 mg/mL em 10 mM de Histidina, 5% de Sacadores, 0,01% de Polissor- bato-80, pH 6,0. A avaliação foi baseada e ES-HPLC, turbidez e avaliação de concentração seguindo o ciclo múltiplo de congelamento- descongelamento de -80oC e 37oC.
[000278] Os dados mostram alteração limitada da estabilidade como uma função de ciclo múltiplo de congelamento-descongelamento de - 80oC e 37oC.
Exemplo 8: Estabilidade de Formulação Líquida de Alta Concentração de nanocorpo de ligação de TNF: Avaliação de estresses de longo prazo potencialmente encontrados em processos de fabricação
[000279] A figura 24 demonstra que o nanocorpo de ligação de TNF líquido é robusto para estresses térmicos de curto prazo que podem ser potencialmente encontrados durante os processos de fabricação das substâncias de fármacos e produtos de fármacos. O líquido de alta concentração foi estudado em 10 mM de Histidina, 5% de Sacarose, 0,01% de Polissorbato-80, pH 6,0, em aproximadamente 80 mg/mL e 50 mg/mL. A avaliação foi baseada na percentagem de HMW e a percentagem de LMW por SE-HPLC, após exposição por 8 horas a 40oC, 7 dias a 25oC, e 29 dias a 5oC. Os dados mostram alterações limitadas em agregados como uma função de tempo de armazenagem a 5oC e a 25oC. Algumas alterações nos agregados foram observados a 40oC, que é uma condição de estresse para líquido.
[000280] A percentagem de espécies de LMW por SE-HPLC para líquido com alta concentração de nanocorpo de ligação de TNF estava abaixo do limite de detecção (isto é, 0,0%) nas temperaturas e durações indicadas.
Exemplo 9: Estabilidade da Formulação Líquida com Baixa Concentração de ATN-103: Avaliação do pH Ótimo e Formulação
[000281] As figuras 25-28 demonstram a estabilidade de formulações líquidas de nanocorpo de ligação de TNF em baixa concentração (aproximadamente 1 mg/mL) tamponadas em pH 5,5, 6,0, 6,5 e 7,0. A estabilidade do nanocorpo de ligação de TNF líquido em baixa concentração foi examinada como uma função da formulação de pH, em resposta ao estresse tal como exposição à temperatura de 40oC (figuras 25 e 26), agitação (figura 28) e congelamento/descongelamento. Quatros valores de pH foram avaliados para cada uma das três formulações a seguir: 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween- 80; 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 150 mM de Arginina HCl; e 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 75 mM de cloreto de sódio. Nesse conjunto de dados, o Tween-80 é usado como sinônimo de Polissorbato-80. Amostras em estudos foram avaliadas usando-se SE-HPLC e UV (tanto para concentração como para turbidez - medição feita por A455). Códigos nas figuras: HST: 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80 HSTA: 10 mM de Histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 150 mM de arginina HCl HSTS: 10 mM de histidina, 5% de sacarose, 0,01% de Tween-80, 75 mM de cloreto de sódio
[000282] Os resultados mostram que a faixa de pH de 5,5 - 7,0 está adequada para a formulação. Os dados mostram que sob algumas condições, o pH 7,0 pode mostrar alguns efeitos prejudiciais (espécies de baixo peso molecular aumentadas). Os dados mostram que não há benefício significante em adicionar arginina HCl ou cloreto de sódio à formulação da substância de fármaco, e, em alguns casos, pode ser desestabilizadora.
[000283] A figura 27 mostra a percentagem de espécies de HMW por SE-HPLC para nanocorpo de ligação de TNF depois da armazenagem a 4oC, onde nenhuma alteração essencial foi observada após 4 semanas. A percentagem de espécies LMW por SE-HPLC para concentra- ções de nanocorpo de ligação de TNF foi abaixo do limite de detecção (isto é, 0,0%) a 4oC, para todas as condições de solução testadas. Não foram observadas alterações significantes em espécies de HMW e de LMW por SE-HPLC, ou UV A280, ou A455, como resultado de ciclos múltiplos de congelamento-descongelamento.
Exemplo 10: Líquido de Nanocorpo de Ligação de TNF de Baixa Con-centração: Avaliação do Efeito de Agitação como uma Função do pH na Formulação
[000284] Os dados são também apresentados para mostrar que o nanocorpo de ligação de TNF é sensível à agitação a 300 rpm por 4 horas (a 15oC) durante esta faixa de pH (figura 28). As formulações contendo cloreto de sódio e arginina são especialmente sensíveis à agitação. A formulação de histidina, sacarose, tween-80 mostrou o mínimo de degradação de peso molecular dentro de cada grupo de pH. A formulação de histidina, sacarose, e tween-80 em pH 6,0 e 7,0 mostrou o mínimo de degradação de HMW.
[000285] A absorbância no UV de nanocorpo de ligação de TNF de baixa concentração depois da agitação foi monitorada a 280 nm (para monitorar a concentração) e 455 nm (para monitorar a turbidez). Não foram observadas alterações significantes como resultado da agitação.
[000286] As soluções de nanocorpo de ligação de TNF de baixa concentração foram examinadas após ciclos múltiplos de congelamento- descongelamento por SE-HPLC e análise de UV em 280 nm (para monitorar a concentração) e 455 nm (para monitorar a turbidez). Não foram observadas alterações significantes em SE-HPLC ou UV A280 ou A455 como resultado de ciclos múltiplos de congelamento- descongelamento.
Exemplo 11: Estabilidade do nanocorpo de ligação de TNF de Formulação Líquida de Alta Concentração, curto prazo (2 semanas de duração), examinando agentes de ajuste de tonicidade
[000287] A estabilidade do nanocorpo de ligação de TNF como um líquido está exemplificada a seguir:
[000288] Foram examinadas cinco formulações conforme mostradas nas figuras 31 e 32 referidas aqui como HST, HSGT, HSGMT, HSorb e Controle. Cada uma das formulações examinadas está descrita abaixo.
Figure img0003
[000289] As formulações foram armazenadas como um líquido por duas semanas a 4oC e 40oC (condição de estresse), em tubos de poli- propileno em seringa preenchida de copolímero de olefina cíclica com um êmbolo de borracha.
[000290] A estabilidade das formulações foi avaliada por percentagem de HMW e a percentagem de LMW por SE-HPLC conforme ilustração nas figuras 31 e 32. Os dados mostram alterações limitadas em produtos de degradação como uma função de tempo de armazenagem a 4oC. Quanto às amostras mostradas na figura 32, nenhuma LMW foi detectada no ponto de tempo inicial, ou depois de duas semanas a 4oC. LMW foi somente detectado nas amostras a 40oC (estressadas). Os dados mostram que todas as cinco formulações exibem alterações comparáveis em produtos de degradação como uma função do tempo de armazenagem na condição de estresse a 40oC. Assim, os dados mostram que todas as formulações são adequadas para forma de dosagem líquida.
Exemplo 12: Estabilidade de nanocorpo de ligação de TNF em Formulação Líquida de Baixa Concentração e de Alta Concentração, confirmando a formulação alvo, e examinando os recipientes de embalagem primários
[000291] A estabilidade do nanocorpo de ligação de TNF como um líquido está exemplificada a seguir: 10 mg/mL de nanocorpo de ligação de TNF, 20 mM de his- tidina, 7,5% de sacadores, 0,01% de polissorbato-80; 50 mg/mL de nanocorpo de ligação de TNF, 20 mM de his- tidina, 7,5% de sacarose, 0,01% de polissorbato 80; 100 mg/mL de nanocorpo de ligação de RNF, 20 mM de histidina, 7,5% de sacarose, 0,01% de polissorbato 80.
[000292] A formulação foi preparada nos seguintes recipientes de embalagem primária: seringa de vidro, de grau farmacêutico, do Tipo I, preenchí- vel, de um fornecedor e um êmbolo de borracha cinza, siliconizada, West 4432 seringa de vidro, de grau farmacêutico do Tipo I, preenchí- vel de um fornecedor e um êmbolo de borracha cinza, siliconizada, West 4432 copolímero de olefina cíclica preenchível e um êmbolo de borracha cinza, siliconizada, West 4432
[000293] As borrachas foram analisadas em t = 0 e consideradas satisfatórias. A formulação foi armazenada a 4oC, 25oC e 40oC, por três meses.
Equivalentes
[000294] Todas as referências citadas aqui são incorporadas a títu- lo de referência, na íntegra e para todas as finalidades na mesma extensão como se cada publicação individual ou patente ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado a título de referência, na íntegra, para todos os fins.
[000295] A presente invenção não é limitada, em escopo, pelas modalidades específicas descritas aqui. Na verdade, várias modificações da invenção, além daquelas descritas aqui, tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição e figuras anexas. Tais modificações têm por objetivo se enquadrar no escopo das reivindicações apensas.

Claims (21)

1. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma molécula de ligação ao anticorpo de domínio único (SDAB) em uma concentração de 10 mg/mL a 250 mg/mL, compreendendo moléculas de domínio único, em que pelo menos uma das moléculas de domínio único se liga à albumina sérica humana (HSA) e compreende três CDRs com a sequência de aminoácidos: SFGMS (SEQ ID NO: 5) (CDR1), SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 6) (CDR2) e GGSLSR (SEQ ID NO: 7) (CDR3); (b) um lioprotetor, escolhido a partir do grupo que consiste em sacarose, sorbitol e trealose; e (c) um tampão de Histidina em uma concentração de 5 a 50 mM, de modo que o pH da formulação seja de 5,0 a 7,5, em que a molécula de SDAB é derivada de uma região variável de camelídeo, com a ressalva de que a formulação não contém arginina, cloridrato de arginina ou cloreto de sódio.
2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tampão de Histidina está em uma concentração de 5 mM a 50 mM, 5 mM a 40 mM, 5 mM a 30 mM, 10 mM a 20 mM, ou 10 mM, 20 mM ou 30 mM.
3. Formulação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca-racterizada pelo fato de que o pH da formulação é selecionado a partir do grupo que consiste em 5, 5,5, 5,8-6,1, 6,0, 6,1, 6,5, 7, 7,2 e 7,5.
4. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a referida sacarose, sorbitol ou trealose está em uma concentração de 2,5% a 10%, 5% a 10%, 5% a 8%, ou 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, ou 9% (peso/volume).
5. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a molécula de SDAB é um polipeptídeo de cadeia simples.
6. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a molécula de SDAB é monovalente ou multivalente.
7. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de SDAB é monoespecífica ou multiespecífica.
8. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que uma ou mais moléculas de domínio único são enxertadas com CDR, humanizadas, cameliza- das, desimunizadas, ou selecionadas por phage display.
9. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma molécula de domínio único que se liga à HSA compreende uma região variável tendo a sequência de aminoácidos 125 a 239 da SEQ ID NO:1.
10. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma molécula de domínio único que se liga à HSA é ALB1: AVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFG- MSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKT- TLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS; ou suas formas humanizadas: ALB6 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFG- MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKT- TLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS; ALB7 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFG- MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKT- TLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS; ALB8 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG- MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKT- TLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS; ALB9 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG- MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRD- NAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS; ou ALB10 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG- MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRD- NAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSGQGTLVTVSS.
11. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma molécula de domínio único que se liga à HSA possui uma ou mais atividades biológicas da molécula de domínio único de ligação à HSA da SEQ ID NO: 1.
12. Formulação, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma molécula de domínio único que se liga à HSA se liga ao mesmo epítopo que o epítopo reconhecido pela molécula de domínio único de ligação à HSA da SEQ ID NO: 1.
13. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a molécula de SDAB compreende duas moléculas de domínio único que se ligam ao fator de necrose tumoral α (TNFα).
14. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a molécula de SDAB compreende moléculas de domínio único para a preparação de um medicamento para o tratamento de desordens autoimunes, por exemplo, artrite (incluindo artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, os- teoartrite, artrite idiopática juvenil poliarticular(JIA), artrite psoriática, artrite associada ao lúpus ou espondilite anquilosante), esclerodermia, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjogren, vasculite, esclerose múltipla, tireoidite autoimune, dermatite (incluindo dermatite atópica e dermatite eczematosa), miastenia grave, doença inflamatória intestinal (IBD), Doença de Crohn, colite (ulcerativa), diabetes mellitus (tipo I); estados inflamatórios de, por exemplo, pele (por exemplo, psoríase); estados inflamatórios agudos (por exemplo, endotoxemia, sepse e septicemia, síndrome de choque tóxico e doença infecciosa); rejeição de transplante e alergia.
15. Método ou processo para preparar uma formulação de uma molécula de SDAB, caracterizado pelo fato de que compreende: expressar a molécula de SDAB em uma cultura de células; purificar a molécula de SDAB passando-se a molécula de SDAB através de pelo menos uma de uma etapa de purificação de cromatografia, ou etapas de ultrafiltração/diafiltração; ajustar a concentração da molécula de SDAB para 10 a 250 mg/mL em uma formulação que contém sacarose em uma concentração de 5% a 10%; e tampão de Histidina em uma concentração de 5 a 50 mM, de modo que o pH da formulação seja de 5 a 7,5, sendo que a molécula de SDAB compreende moléculas de domínio único, pelo menos uma molécula de domínio único que se liga à HSA e compreende três CDRs com a sequência de aminoácidos: SFGMS (SEQ ID NO: 5) (CDR1), SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 6) (CDR2) e GGSLSR (SEQ ID NO: 7) (CDR3), e a molécula de SDAB é derivada da região variável de camelídeo, com a ressalva de que a formulação não contém arginina, cloridrato de arginina ou cloreto de sódio.
16. Método para preparar uma formulação reconstituída contendo uma molécula de SDAB, caracterizado pelo fato de que compreende: liofilizar uma mistura de uma molécula de SDAB e um lio- protetor, e um tampão, formando, assim, uma mistura liofilizada; e reconstituir a mistura liofilizada em um diluente, preparando, assim, a formulação, em que a formulação reconstituída compreende (a) uma molécula de SDAB em uma concentração de 10 mg/mL a 250 mg/mL; (b) um lioprotetor selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose ou trealose, em uma concentração de 5% a 10%; (c) um tampão de Histidina em uma concentração de 5 a 50 mM, de modo que o pH da formulação seja de 5,0 a 7,5, sendo que a molécula de SDAB compreende moléculas de domínio único, pelo menos uma molécula de domínio único que se liga à HSA e compreende três CDRs com a sequência de aminoácidos: SFGMS (SEQ ID NO: 5) (CDR1), SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 6) (CDR2) e GGSLSR (SEQ ID NO: 7) (CDR3), e a molécula de SDAB é derivada da região variável de camelídeo, com a ressalva de que a formulação não contém arginina, cloridrato de arginina ou cloreto de sódio.
17. Kit ou artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente contendo a formulação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
18. Kit ou artigo de fabricação, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a formulação está presente em um frasco ou uma seringa injetável.
19. Kit ou artigo de fabricação, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a formulação está presente em uma seringa injetável preenchida previamente.
20. Kit ou artigo de fabricação, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a seringa ou frasco é feito de vidro, plástico, ou material polimérico selecionado de um polímero ou copolímero de olefina cíclica.
21. Uso de uma formulação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir artrite reumatoide (AR).
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