KR20130105749A - 단일 도메인 항원 결합 분자의 제형 - Google Patents

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제이슨 이. 페르난데스
다니엘 에이. 딕손
안드레아 폴슨
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아블린쓰 엔.브이.
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Abstract

본 발명은 단일 도메인 항원 결합 분자, 예를 들어, 나노바디 분자의 제형, 특히 TNF-결합 나노바디 분자의 제형에 관한 것이다. 단일 도메인 항원 결합 분자는 하나 이상의 표적 단백질과 상호작용하는, 예를 들어, 이에 결합하는 하나 이상의 단일 결합 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 제형은, 예를 들어, 제약 제형으로서 유용하다. 본원에 기술된 제형을 제조하고, 예를 들어 TNF-관련 장애를 치료하기 위해 이를 사용하는 방법이 또한 개시된다.

Description

단일 도메인 항원 결합 분자의 제형{FORMULATIONS OF SINGLE DOMAIN ANTIGEN BINDING MOLECULES}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2008년 10월 29일 출원된 미국 일련 번호 61/109,474를 우선권으로 청구하고, 이의 전문은 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 제출되었고 전체적으로 본원에 참고로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2009년 10월 27일에 생성된 상기 ASCII 복사본의 명칭은 W22373WO.txt이고, 이의 크기는 8,343 바이트이다.
배경기술
생명공학의 진보는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제약 용도를 위한 다양한 단백질을 생산하는 것을 가능하게 하였다. 단백질은 전통적인 유기 및 무기 약물보다 더 크고 더욱 복합적인 경향이 있기 때문에, 이같은 단백질의 제형에는 특수한 문제들이 있다. 단백질이 계속 생물학적으로 활성이기 위해, 제형이 적어도 단백질 아미노산의 핵심 서열의 형상 완전성(integrity)을 보존하는 한편, 동시에 단백질의 여러 관능기를 분해로부터 보호하여야 한다. 단백질에 대한 분해 경로는 화학적 불안정성 (즉, 새로운 화학 물질(chemical entity)을 초래하는 결합 형성 또는 절단에 의한 단백질의 변형을 수반하는 임의의 프로세스) 또는 물리적 불안정성 (즉, 단백질의 더 고차원적인 구조에서의 변화)을 수반할 수 있다. 화학적 불안정성은, 예를 들어, 탈아미드화, 라세미화, 가수분해, 산화, 베타 제거 또는 디설피드 교환으로부터 초래될 수 있다. 물리적 불안정성은, 예를 들어, 변성, 응집, 침전 또는 흡착으로부터 초래될 수 있다. 3가지 통상적인 단백질 분해 경로는 단백질 응집, 탈아미드화 및 산화이다 ([Cleland et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993)]).
동결-건조(freeze-drying)는 관심 단백질 제제로부터 물을 제거하는 역할을 하는, 단백질을 보존하기 위한 통상적으로 사용되는 기술이다. 동결-건조, 또는 동결건조(lyophilization)는 건조시킬 물질을 먼저 동결시킨 후, 진공 환경에서의 승화에 의해 얼음 또는 동결 용매를 제거하는 공정이다. 동결-건조 공정 동안 안정성을 강화하기 위해 및/또는 동결건조된 생성물의 보관 시의 안정성을 개선하기 위해 예비-동결건조 제형 내에 부형제가 포함될 수 있다 ([Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990)] 및 [Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)]).
따라서, 장기 보관 및 운송에 대해 안정적인 단백질 제형, 특히 피하 투여를 위한 제형이 여전히 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 단일 도메인 항원 결합 분자 (본원에서 "SDAB 분자"로 또한 지칭됨) (예를 들어, 나노바디(nanobody) 분자, 특히 TNF-결합 나노바디 분자의 제형)에 관한 것이다. SDAB 분자는 하나 이상의 표적 단백질과 상호작용하는, 예를 들어, 이에 결합하는 하나 이상의 단일 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 제형은 대상체, 예를 들어, 인간에게 투여하기 위한 제약 제형으로서 유용하다. 본원에 기술된 제형을 제조하고, 예를 들어 TNF-관련 장애를 치료 또는 예방하기 위해 이를 사용하는 방법이 또한 개시된다.
[주: 나노바디 ( Nanobody )™ 및 나노바디즈 ( Nanobodies )™은 애블링스 엔. 브이.(Ablynx N.V.)의 등록 상표이다]
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 (a) SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자 (예를 들어, TNF-결합 나노바디 분자); (b) 동결보호제; (c) (임의적인) 계면활성제; (d) (임의적인) 벌크화제(bulking agent); (e) (임의적인) 등장성 조정제; (f) (임의적인) 안정화제; (g) (임의적인) 보존제, 및 (h) 제형의 pH가 약 5.0 내지 7.5이도록 하는 완충제를 포함하는 제형을 특색으로 한다. 일부 실시양태에서, 제형은 액체 제형, 동결건조 제형, 재구성된 동결건조 제형, 에어로졸 제형, 또는 벌크 저장 제형 (예를 들어, 동결된 벌크 저장 제형)이다. 특정 실시양태에서, 주사 (예를 들어, 피하, 혈관내, 근육내 또는 복강내)에 의해 또는 흡입에 의해 대상체에게 제형이 투여된다.
특정 실시양태에서, 제형 내의 SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자 (예를 들어, TNF-결합 나노바디 분자)의 농도는 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 350 ㎎/㎖, 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 300 ㎎/㎖, 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 250 ㎎/㎖, 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 150 ㎎/㎖, 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 130 ㎎/㎖, 약 10 ㎎/㎖ 내지 약 130 ㎎/㎖, 약 50 ㎎/㎖ 내지 약 120 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖ 내지 약 120 ㎎/㎖, 약 88 ㎎/㎖ 내지 약 100 ㎎/㎖, 또는 약 10 ㎎/㎖, 약 25 ㎎/㎖, 약 50 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖, 약 100 ㎎/㎖, 약 130 ㎎/㎖, 약 150 ㎎/㎖, 약 200 ㎎/㎖, 약 250 ㎎/㎖ 또는 약 300 ㎎/㎖이다.
또 다른 실시양태에서, 제형의 동결보호제는 당, 예를 들어, 수크로스, 소르비톨, 또는 트레할로스이다. 예를 들어, 동결보호제는 약 2.5％ 내지 약 10％, 약 5％ 내지 약 10％, 약 5％ 내지 약 8％, 또는 약 4％, 약 4.5％, 약 5％, 약 5.5％, 약 6％, 약 6.5％, 약 7％, 약 7.5％, 약 8％, 약 8.5％, 또는 약 9％ (중량/부피) 농도의 수크로스, 소르비톨, 또는 트레할로스일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제형 내의 완충제는 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 40 mM, 약 5 mM 내지 약 30 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 10 mM, 약 20 mM, 또는 약 30 mM 농도의 히스티딘 완충제이다. 또 다른 실시양태에서, 제형 내의 완충제는 약 5 mM 미만 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 40 mM, 약 5 mM 내지 약 30 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 10 mM, 약 20 mM, 또는 약 30 mM 농도로 존재하는 트리스(Tris) 완충제이다. 제형의 완충제의 pH는 일반적으로 약 5 내지 7 사이이다. 일부 구체적인 실시양태에서, 제형의 완충제의 pH는 약 5 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.2이다. 예를 들어, 완충제의 pH는 약 5, 5.5, 5.8-6.1, 6, 6.1, 6.5 또는 7일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제형은 약 0.001％ 내지 0.6％, 예를 들어, 약 0.01％ 내지 0.6％, 약 0.1％ 내지 0.6％, 약 0.1％ 내지 0.5％, 약 0.1％ 내지 0.4％, 약 0.1％ 내지 0.3％, 약 0.1％ 내지 0.2％, 또는 약 0.01％ 내지 0.02％ 농도의 계면활성제를 (임의적으로) 포함한다. 일부 경우에, 제형은 0％ 초과, 약 0.6％ 이하 (예를 들어, 약 0.1％ 내지 0.2％)의 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-65, 폴리소르베이트-80, 폴리소르베이트-85, 폴록사머-188, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 트리라우레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 트리올레에이트, 또는 이들의 조합물을 함유한다. 구체적인 실시양태에서, 제형은 약 0.001％, 0.002％, 0.003％, 0.004％, 0.005％, 0.006％, 0.007％, 0.008％, 0.009％, 0.01％ 내지 0.02％, 0.01％, 0.02％, 0.03％, 0.04％, 0.05％, 0.06％, 0.07％, 0.08％, 0.09％, 0.1％, 0.1％ 내지 0.2％, 0.11％, 0.12％, 0.13％, 0.14％, 0.15％, 0.16％, 0.17％, 0.18％, 0.19％ 또는 0.2％의 폴리소르베이트-80을 함유한다. 별법적으로, 제형은 약 0.01％ 내지 0.6％, 약 0.1％ 내지 0.6％, 약 0.1％ 내지 0.5％, 약 0.1％ 내지 0.4％, 약 0.1％ 내지 0.3％, 또는 약 0.1％ 내지 0.2％의 폴록사머-188을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 제형은 약 10 내지 약 200 mM, 약 25 내지 약 175 mM, 약 50 내지 약 150 mM, 약 75 내지 약 125 mM, 또는 약 100 mM 농도의 벌크화제, 예를 들어, 글리신을 (임의적으로) 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제형은 등장성 조정제, 예를 들어, 제형을 인간 혈액과 실질적으로 등장성 또는 등삼투압성이게 하는 분자를 (임의적으로) 추가로 포함한다. 예시적인 등장성 조정제에는 수크로스, 소르비톨, 글리신, 메티오닌, 만니톨, 덱스트로스, 이노시톨, 염화나트륨, 아르기닌 및 아르기닌 히드로클로라이드가 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 제형은 안정화제, 예를 들어, 관심 단백질 (예를 들어, SDAB 분자)와 조합되는 경우 동결건조, 액체 또는 저장 형태의 관심 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 실질적으로 방지하거나 감소시키는 분자를 (임의적으로) 추가적으로 포함한다. 예시적인 안정화제에는 수크로스, 소르비톨, 글리신, 이노시톨, 염화나트륨, 메티오닌, 아르기닌, 및 아르기닌 히드로클로라이드가 포함된다. 특정 실시양태에서, 제형은 하기 범위들 중 하나 이상으로 안정화제를 포함한다: 약 1％ 내지 약 12％ (예를 들어, 약 5％, 약 7.5％, 약 8％ 또는 약 10％)의 수크로스; 약 1％ 내지 약 7％ (예를 들어, 약 3％, 약 4％, 약 5％)의 소르비톨; 약 1％ 내지 약 5％의 이노시톨; 약 10 mM 내지 약 125 mM (예를 들어, 약 25 mM 내지 100 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 또는 약 100 mM)의 글리신; 약 10 mM 내지 150 mM (예를 들어, 약 25 mM 내지 100 mM, 약 55 mM)의 염화나트륨; 약 10 mM 내지 약 100 mM (예를 들어, 약 10 mM, 약 20 mM, 약 100 mM)의 메티오닌; 약 10 mM 내지 약 125 mM (예를 들어, 약 25 mM 내지 약 120 mM, 또는 약 100 mM)의 아르기닌; 약 10 mM 내지 약 70 mM (예를 들어, 약 10 mM 내지 약 65 mM, 또는 약 55 mM)의 아르기닌 히드로클로라이드.
또 다른 실시양태에서, 제형은 약 10 내지 약 200 mM, 약 25 내지 약 175 mM, 약 50 내지 약 150 mM, 약 75 내지 약 125 mM, 또는 약 100 mM의 농도로 메티오닌을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 제형의 성분이 동결보호제, 등장성 조정제 및/또는 안정화제 중 하나 이상으로서 기능할 수 있다. 예를 들면, 성분, 예를 들어, 수크로스의 농도에 따라, 이는 동결보호제, 등장성 조정제 및/또는 안정화제 중 하나 이상으로서의 역할을 할 수 있다. 여러 성분들이 제형에서 요구되는 또 다른 실시양태에서, 상이한 성분들이 사용된다. 예를 들어, 동결보호제, 등장성 조정제 및 안정화제가 제형에서 요구되는 경우, 상이한 성분들이 사용된다 (예를 들어, 수크로스, 글리신 및 이노시톨이 조합되어 사용되어, 각각 동결보호제, 등장성 조정제 및 안정화제의 조합물이 초래될 수 있다).
한 실시양태에서, 제형은 (a) 약 0.5 내지 약 300 ㎎/㎖, 예를 들어, 약 1 ㎎/㎖, 약 10 ㎎/㎖, 약 25 ㎎/㎖, 약 50 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖, 약 88 ㎎/㎖, 약 100 ㎎/㎖, 약 118 ㎎/㎖, 약 130 ㎎/㎖, 약 150 ㎎/㎖, 또는 약 250 ㎎/㎖ 농도의 SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자 (예를 들어, TNF-결합 나노바디 분자); (b) 약 5％ 내지 약 10％, 예를 들어, 약 5％, 약 6％, 약 6.5％, 약 7％, 약 7.5％, 약 8％, 약 10％ 농도의 수크로스; (c) 약 0 내지 약 0.6％, 예를 들어, 0.01％, 0.02％, 0.05％, 0.1％, 0.2％, 0.3％, 0.4％, 0.5％, 또는 0.6％ 농도의 폴리소르베이트-80; (d) (임의적인) 약 0 내지 약 100 mM, 예를 들어, 100 mM 농도의 글리신; (e) (임의적인) 약 0 내지 약 100 mM, 예를 들어, 100 mM 농도의 메티오닌; 및 (f) 제형의 pH가 약 5.0 내지 7.5, 예를 들어, 5, 5.5, 5.8-6.1, 6, 6.1, 6.5, 또는 7이도록 하는 히스티딘 완충제 (약 10 mM 내지 약 20 mM의 농도) 또는 트리스 완충제 (약 20 mM의 농도).
한 실시양태에서, 제형은 액체 제형이다. 한 대표적인 실시양태에서, 액체 제형은 a) 약 10 내지 약 150 ㎎/㎖, 예를 들어, 약 25 ㎎/㎖, 약 50 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖, 약 88 ㎎/㎖, 약 100 ㎎/㎖, 약 118 ㎎/㎖, 약 130 ㎎/㎖ 농도의 SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자 (예를 들어, TNF-결합 나노바디 분자); (b) 약 5％ 내지 약 10％, 예를 들어, 약 7％ 내지 약 8％, 예를 들어, 7.5％ 농도의 수크로스; 또는 약 1％ 내지 약 7％ (예를 들어, 약 3％, 약 4％, 약 5％)의 소르비톨; (c) 대략적으로, 예를 들어, 약 0.01％ 내지 0.02％ (예를 들어, 0.01％) 농도의 폴리소르베이트-80; (d) (임의적인) 약 0 내지 약 100 mM, 예를 들어, 100 mM 농도의 글리신; (e) (임의적인) 약 0 내지 약 100 mM, 예를 들어, 100 mM 농도의 메티오닌; 및 (f) 제형의 pH가 약 5 내지 7.5, 예를 들어, 5, 5.5, 5.8-6.1, 6, 6.1, 6.5, 또는 7이도록 하는 히스티딘 완충제 (약 10 mM 내지 약 20 mM의 농도) 또는 트리스 완충제 (약 20 mM의 농도)를 포함한다. 액체 제형은 사용 설명서와 함께 제조품, 예컨대 기구, 주사기 또는 바이알(vial) 내에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 주사기 또는 바이알은 유리, 플라스틱, 또는 고리형 올레핀 중합체 또는 공중합체와 같은 중합체성 물질로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 제형은 주사용 기구 (예를 들어, 주사용 주사기, 예를 들어, 사전충전(prefilled) 주사용 주사기) 내에 존재할 수 있다. 주사기는 개별적인 투여용으로, 예를 들어, 자가주사기 (예를 들어, 펜(pen)-주입기 기구) 및/또는 사용 설명서를 포함하는 단일 바이알 시스템으로서 개조될 수 있다. 주사, 예를 들어, 말초 투여 (예를 들어, 피하, 혈관내, 근육내 또는 복강내 투여)에 의해 대상체, 예를 들어, 환자에게 제형이 투여될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제형은 동결건조 제형이다. 한 대표적인 실시양태에서, 동결건조 제형은 a) 약 10 내지 약 150 ㎎/㎖, 예를 들어, 약 25 ㎎/㎖, 약 50 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖, 약 88 ㎎/㎖, 약 100 ㎎/㎖, 약 118 ㎎/㎖, 약 130 ㎎/㎖ 농도의 SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자 (예를 들어, TNF-결합 나노바디 분자); (b) 약 5％ 내지 약 10％, 예를 들어, 약 4％ 내지 약 7％, 예를 들어, 5％ 농도의 수크로스; (c) 대략적으로, 예를 들어, 0.01％ 내지 0.02％ (예를 들어, 0.01％) 농도의 폴리소르베이트-80; (d) (임의적인) 약 0 내지 약 100 mM, 예를 들어, 100 mM 농도의 글리신; (e) (임의적인) 약 0 내지 약 100 mM, 예를 들어, 100 mM 농도의 메티오닌; 및 (f) 제형의 pH가 약 5 내지 7.5, 예를 들어, 5, 5.5, 5.8-6.1, 6, 6.1, 6.5 또는 7이도록 하는 히스티딘 완충제 (약 10 mM 내지 약 20 mM, 예를 들어, 약 20 mM의 농도) 또는 트리스 완충제 (약 20 mM의 농도)를 포함한다. 동결건조 제형은 동결건조물을 적절한 수성 조성물과 혼합함으로써 재구성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제형은 벌크 저장 제형이다. 한 대표적인 실시양태에서, 벌크 저장 제형은 a) 약 80 ㎎/㎖ 내지 300 ㎎/㎖, 예를 들어, 약 150 ㎎/㎖, 약 175 ㎎/㎖, 약 200 ㎎/㎖, 약 250 ㎎/㎖, 약 275 ㎎/㎖, 또는 약 300 ㎎/㎖ 농도의 SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자 (예를 들어, TNF-결합 나노바디 분자); (b) 약 5％ 내지 약 10％, 예를 들어, 약 4％ 내지 약 8％, 예를 들어, 5％, 또는 7.5％ 농도의 수크로스; (c) 대략적으로, 예를 들어, 0.01％ 내지 0.02％ 농도의 폴리소르베이트-80; (d) (임의적인) 약 0 내지 약 100 mM, 예를 들어, 100 mM 농도의 글리신; (e) (임의적인) 약 0 내지 약 100 mM, 예를 들어, 100 mM 농도의 메티오닌; 및 (f) 제형의 pH가 약 5 내지 7.5, 예를 들어, 5, 5.5, 5.8-6.1, 6, 6.1, 6.5 또는 7이도록 하는 히스티딘 완충제 (약 10 mM 내지 약 20 mM의 농도) 또는 트리스 완충제 (약 20 mM의 농도)를 포함한다. 벌크 저장 제형이 동결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 벌크 저장 제형은 대규모로, 예를 들어, 10 ℓ, 50 ℓ, 100 ℓ, 150 ℓ, 200ℓ 또는 그를 초과하여 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 제형의 SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자 (예를 들어, TNF-결합 나노바디 분자)는 하나 이상의 단일 결합 도메인 (예를 들어, 하나 이상의 나노바디)를 포함한다. 예를 들어, 나노바디 분자는 1개 이상의 면역글로불린 가변 도메인 (1개, 2개 또는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR) 포함)을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 단일 사슬 폴리펩티드를 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다. SDAB 분자의 예로는 천연적으로 경쇄가 없는 분자 (예를 들어, VHH, 나노바디, 또는 낙타류(camelid) 유래 항체)가 포함된다. 이같은 SDAB 분자는 낙타, 라마, 단봉낙타, 알파카 및 과나코와 같은 낙타류로부터 유래 또는 수득될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, SDAB 분자는 또 다른 천연 발생 단일 도메인 분자, 예컨대 상어 단일 도메인 폴리펩티드 (IgNAR); 및 단일 도메인 스캐폴드(scaffold) (예를 들어, 피브로넥틴 스캐폴드)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 단일 도메인 분자를 포함할 수 있다. 상어로부터 단일 도메인 분자가 유래될 수 있다.
한 실시양태에서, 제형의 SDAB 분자는 하나 이상의 단일 도메인 분자로 구성된 단일 사슬 폴리펩티드이다. 실시양태들에서, 나노바디 분자는 1가 또는 다가 (예를 들어, 2가, 3가, 또는 4가)이다. 또 다른 실시양태에서, 나노바디 분자는 단일특이적 또는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적)이다. SDAB 분자는 재조합 분자, CDR-그래프트(grafted) 분자, 인간화 분자, 낙타화 분자, 탈면역화 분자 및/또는 시험관 내에서 생성된 (예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 선별된) 분자인 하나 이상의 단일 도메인 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, SDAB 분자는 하나 이상의 표적 항원에 결합하는 하나 이상의 단일 도메인 분자를 포함하는 단일 사슬 융합 폴리펩티드일 수 있다. 전형적으로, 표적 항원은 포유류, 예를 들어, 인간의 단백질이다. 특정 실시양태에서, SDAB 분자는 혈청 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민 (인간 혈청 알부민 (HSA)), 피브린, 피브리노겐 또는 트랜스페린 중 하나 이상으로부터 선택된 인간 혈청 단백질에 결합한다.
한 예시적인 실시양태에서, 제형의 SDAB 분자는 표적 항원, 예를 들어, 종양 괴사 인자 α (TNFα)에 결합하는 2개의 단일 도메인 분자 (예를 들어, 2개의 낙타류 가변 영역), 및 혈청 단백질, 예를 들어, HSA에 결합하는 1개의 단일 도메인 분자 (예를 들어, 낙타류 가변 영역)의 단일 사슬 폴리펩티드 융합물로 구성된 3가의 이중특이적 분자이다. SDAB 분자의 단일 도메인 분자들은 N-말단에서 C-말단으로 하기의 순서로 배열될 수 있다: TNFα-결합 단일 도메인 분자 - HSA-결합 단일 도메인 분자 - TNFα-결합 단일 도메인 분자. 하나 이상의 표적에 대한 단일 도메인 분자들의 임의의 순서 또는 조합이 본원에 기술된 바와 같이 제형될 수 있음이 이해될 것이다.
한 실시양태에서, 제형의 SDAB 분자는 본원에서 "ATN-103"으로 지칭되고, 도 30에 제시된 아미노산 서열 (서열 1), 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열 (예를 들어, 도 30에 제시된 아미노산 서열에 비해 적어도 85％, 90％, 95％ 또는 이를 초과하여 동일하거나 최대 20개, 15개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개의 아미노산 변화 (예를 들어, 결실, 삽입 또는 치환 (예를 들어, 보존적 치환))가 있는 아미노산 서열)을 포함하거나, 이러한 서열로 구성된다. 본원에 기술된 바와 같이 제형될 수 있는 추가적인 3가의 이중특이적 나노바디 분자의 예로는 WO 2006/122786의 표 29에 개시된 TNF24, TNF25, TNF26, TNF27, TNF28, TNF60 및 TNF62가 포함된다.
특정 실시양태에서, 제형의 SDAB 분자의 단일 도메인 분자 1개 이상이 TNFα에 결합하고, DYWMY (서열 2) (CDR1), EINTNGLITKYPDSVKG (서열 3) (CDR2) 및/또는 SPSGFN (서열 4) (CDR3)의 아미노 서열을 갖거나 또는 3개, 2개 또는 1개 미만의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 치환)에 의해 상기 CDR들 중 하나와 상이한 CDR을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단일 도메인 분자는 도 30의 대략 아미노산 1 내지 115의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열 (예를 들어, 도 30에 제시된 아미노산 서열에 비해 적어도 85％, 90％, 95％ 또는 이를 초과하여 동일하거나 최대 20개, 15개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개의 아미노산 변화 (예를 들어, 결실, 삽입 또는 치환 (예를 들어, 보존적 치환))가 있는 아미노산 서열)을 갖는 가변 영역을 포함한다. 실시양태들에서, TNFα-결합 단일 도메인 분자는 도 30에 제시된 TNFα-결합 단일 도메인 항체 분자의 하나 이상의 생물학적 활성을 지닌다. 예를 들어, TNFα-결합 단일 도메인 분자는 도 30에 제시된 TNFα-결합 단일 도메인 분자가 인식하는 에피토프와 동일하거나 유사한 에피토프에 결합한다 (예를 들어, 삼량체성 형태의 TNFα에 결합함; TNF 수용체에 접촉하는 TNFα 부위에 결합함; 제1 TNF 단량체 (단량체 A) 상의 위치 88의 Gln 및 위치 90의 Lys 및 제2 TNF 단량체 (단량체 B) 상의 위치 146의 Glu를 포함하는 TNFα 삼량체 내의 에피토프, 또는 WO 06/122786에 개시된 바와 같은 에피토프에 결합함). 또 다른 실시양태에서, TNFα-결합 단일 도메인 분자는 WO 06/122786에 개시된 임의의 TNFα-결합 단일 도메인 분자와 유사한 활성 (예를 들어, 결합 친화력, 해리 상수, 결합 특이성, TNF-억제 활성)을 지닌다.
또 다른 실시양태에서, TNFα-결합 나노바디 분자는 WO 2006/122786에 개시된 나노분자들 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, TNFα-결합 나노바디 분자는 WO 2006/122786에 개시된 1가, 2가, 3가 TNFα-결합 나노바디 분자일 수 있다. 예시적인 TNFα-결합 나노바디에는 TNF1, TNF2, TNF3, 이들의 인간화 형태 (예를 들어, TNF29, TNF30, TNF31, TNF32, TNF33)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 1가 TNFα-결합 나노바디의 추가적인 예가 WO 2006/122786의 표 8에 개시되어 있다. 예시적인 2가 TNFα-결합 나노바디 분자에는 단일 융합 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 링커를 통해 연결된 2개의 TNF30 나노바디를 포함하는 TNF55 및 TNF56가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다 (WO 2006/122786에 개시되어 있음). 2가 TNFα-결합 나노바디 분자의 추가적인 예가 WO 2006/122786의 표 19에 TNF4, TNF5, TNF6, TNF7, TNF8로서 개시되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 제형의 SDAB 분자의 단일 도메인 분자 1개 이상이 HSA에 결합하고, SFGMS (서열 5) (CDR1), SISGSGSDTLYADSVKG (서열 6) (CDR2) 및/또는 GGSLSR (서열 7) (CDR3)의 아미노 서열을 갖거나 또는 3개, 2개 또는 1개 미만의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 치환)에 의해 상기 CDR들 중 하나와 상이한 CDR을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단일 도메인 분자는 도 30 (서열 1)의 대략 아미노산 125 내지 239의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열 (예를 들어, 도 30에 제시된 아미노산 서열 (서열 1)에 비해 적어도 85％, 90％, 95％ 또는 이를 초과하여 동일하거나 최대 20개, 15개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개의 아미노산 변화 (예를 들어, 결실, 삽입 또는 치환 (예를 들어, 보존적 치환))가 있는 아미노산 서열)을 갖는 가변 영역을 포함한다. 실시양태들에서, HSA-결합 단일 도메인 분자는 도 30 (서열 1)에 제시된 HSA-결합 단일 도메인 분자의 하나 이상의 생물학적 활성을 지닌다. 예를 들어, HSA-결합 단일 도메인 분자는 도 30 (서열 1)에 제시된 HSA-결합 단일 도메인 분자가 인식하는 에피토프와 동일하거나 유사한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, HSA-결합 단일 도메인 분자는 WO 06/122786에 개시된 임의의 HSA-결합 단일 도메인 분자와 유사한 활성 (예를 들어, 결합 친화력, 해리 상수, 결합 특이성)을 지닌다.
또 다른 실시양태에서, HSA-결합 SDAB 분자는 WO 2006/122786에 개시된 나노분자들 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, HSA-결합 SDAB 분자는 WO 2006/122786에 개시된 1가, 2가, 3가 HSA-결합 나노바디 분자일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, HSA-결합 SDAB 분자는 HSA에 대한 결합 특이성들 중 하나 이상이 있는 단일특이적 또는 다중특이적 분자일 수 있다. 예시적인 TNFα-결합 나노바디에는 WO 06/122786에 개시된 ALB1, 이의 인간화 형태 (예를 들어, ALB6, ALB7, ALB8, ALB9, ALB10)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
또 다른 실시양태에서, SDAB 분자의 단일 도메인 분자들 중 2개 이상이, 연결 기와 함께 또는 연결 기 없이, 유전적 또는 폴리펩티드 융합물로서 융합된다. 연결 기는 당업자에게 명백한 임의의 연결 기일 수 있다. 예를 들어, 연결 기는 원자 1개 내지 100개 길이의 생체적합성 중합체일 수 있다. 한 실시양태에서, 연결 기는 폴리글리신, 폴리세린, 폴리라이신, 폴리글루타메이트, 폴리이소류신 또는 폴리아르기닌 잔기, 또는 이들의 조합물을 포함하거나, 이들로 구성된다. 예를 들어, 폴리글리신 또는 폴리세린 링커가 적어도 5개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 20개, 30개, 35개 및 40개의 글리신 및 세린 잔기를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 링커에는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 이를 초과하는 개수의 반복물의 Gly-Ser 반복물, 예를 들어, (Gly)4-Ser (서열 8) 반복물이 포함된다. 실시양태들에서, 링커의 서열이 하기와 같을 수 있다: (Gly)4-Ser-(Gly)3-Ser (서열 9) 또는 ((Gly)4-Ser)n (서열 10) [식중, n은 4, 5, 또는 6이다].
본 발명의 제형은 예를 들어 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 제2 모이어티(moiety)에 회합됨으로써 변형된 SDAB 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 나노바디 분자는 적절한 약리학적으로 허용가능한 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜) (PEG) 또는 이의 유도체 (예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 mPEG)에 공유결합에 의해 부착될 수 있다. PEG화 나노바디 분자의 예가 WO 06/122786에 TNF55-PEG40, TNF55-PEG60, TNF56-PEG40 및 TNF56-PEG60으로서 개시되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 제형은 약 2℃ 내지 약 25℃ (예를 들어, 약 4℃ 또는 25℃)의 온도에서 적어도 3개월, 6개월, 9개월, 12개월 (예를 들어, 적어도 24개월, 30개월, 36개월) 동안 안정적이다. 특정 실시양태에서, 약 2℃ 내지 약 25℃ (예를 들어, 약 4℃ 또는 25℃)의 온도에서 적어도 3개월, 6개월, 9개월, 12개월 (예를 들어, 적어도 24개월, 30개월, 36개월) 동안 제형 내에서 보관된 후 SDAB 분자의 완전성이 유지된다. 예를 들어, 제형 내의 SDAB 분자는 약 2℃ 내지 약 25℃ (예를 들어, 약 4℃ 또는 25℃)의 온도에서의 보관 후 SDAB 분자의 생물학적 활성, 예를 들어, 결합 활성의 적어도 50％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 100％까지를 유지한다. 일부 실시양태에서, 약 2℃ 내지 약 25℃ (예를 들어, 약 4℃ 또는 25℃)의 온도에서 적어도 3개월, 6개월, 9개월, 12개월 (예를 들어, 적어도 24개월, 30개월, 36개월) 동안 제형 내에서 보관된 후, 제형은 10％, 9％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％ 또는 그 미만보다 낮은 양의 고분자량 (HMW) 종을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약 2℃ 내지 약 25℃ (예를 들어, 약 4℃ 또는 25℃)의 온도에서 적어도 3개월, 6개월, 9개월, 12개월 (예를 들어, 적어도 24개월, 30개월, 36개월) 동안 제형 내에서 보관된 후, 제형은 10％, 9％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％ 또는 그 미만보다 낮은 양의 저분자량 (HMW) 종을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약 2℃ 내지 약 25℃ (예를 들어, 약 4℃ 또는 25℃)의 온도에서 적어도 3개월, 6개월, 9개월, 12개월 (예를 들어, 적어도 24개월, 30개월, 36개월) 동안 제형 내에서 보관된 후, 제형은 10％, 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％ 또는 그 미만보다 낮은 양의 산성 종을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약 2℃ 내지 약 25℃ (예를 들어, 약 4℃ 또는 25℃)의 온도에서 적어도 3개월, 6개월, 9개월, 12개월 (예를 들어, 적어도 24개월, 30개월, 36개월) 동안 제형 내에서 보관된 후, 제형은 10％, 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％ 또는 그 미만보다 낮은 양의 염기성 종을 포함한다. 표준 기술, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 크기 배제-고성능 액체 크로마토그래피 (SEC-HPLC) 등을 사용하여 제형 내에서 HMW 종, LMW 종, 산성 종 및 염기성 종을 검출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 동결건조된 SDAB 제형의 재구성 시, 제형은 동결건조 전의 제형에 비교하여 SDAB 구조의 적어도 80％, 90％, 95％ 또는 이보다 높은 ％를 유지한다. 예를 들어, 결합 분석법, 바이오어세이(bioassay), 또는 HMW 종 대 LMW 종의 비율에 의해 SDAB 구조가 결정된다.
본 발명의 제형은 류머티스성 관절염 (RA) (예를 들어, 중등도 내지 중증 류머티스성 관절염), 관절염성 상태 (예를 들어, 건선성 관절염, 다관절형 소아 특발성 관절염 (JIA), 강직성 척추염 (AS), 건선, 궤양성 결장염, 크론병, 염증성 장 질환, 및/또는 다발성 경화증을 포함하지만 이에 한정되지 않는 TNF-α 관련 장애, 예를 들어, 염증성 또는 자가면역 장애를 치료하는데 유용한 제2 작용제, 예를 들어, 제2의 치료적으로 또는 약리학적으로 활성인 작용제를 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 작용제는 항-TNF 항체 또는 이의 TNF 결합 단편일 수 있고, 이때 제2 TNF 항체는 제형의 TNF-결합 SDAB 분자와 상이한 에피토프에 결합한다. TNF-결합 SDAB 분자와 공동-제형될 수 있는 작용제들의 또 다른 비-제한적인 예로는 시토카인 억제제, 성장 인자 억제제, 면역억제제, 항염증제, 대사 억제제, 효소 억제제, 세포독성제, 및 세포증식억제제가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 추가적인 작용제는 비-스테로이드성 항염증제 (NSAID); 프레드니솔론, 프레드니손, 코르티손 및 트리암시놀론이 포함되는 코르티코스테로이드; 및 질환 변형 항-류머티스성 약물 (DMARD), 예컨대 메토트렉세이트, 히드록시클로로퀸 (Plaquenil) 및 설파살라진, 레플루노미드 (Arava®), 이태너셉트 (Enbrel®), 인플릭시맵 (Remicade®) (메토트렉세이트와 함께 또는 메토트렉세이트 없이) 및 아달리무맵 (Humira®)이 포함되는 종양 괴사 인자 억제제, 항-CD20 항체 (예를 들어, Rituxan®), 가용성 인터류킨-1 수용체, 예컨대 아나킨라 (Kineret®), 금, 미노사이클린 (Minocin®), 페니실라민, 및 아자티오프린, 시클로포스파미드 및 시클로스포린이 포함되는 세포독성제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 관절염에 대한 표준 치료제이다. 이같은 조합 요법은 투여되는 치료제들을 더 낮은 투여량으로 유리하게 사용할 수 있고, 따라서 다양한 단독요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
본원에서 제공되는 지침을 따라 부형제 및/또는 제2 치료제의 별법적인 조합을 확인하고 테스트할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 제형은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체 (예를 들어, TNFα 관련 장애에 걸린 환자)에게 투여하기에 적절하다. 주사 (예를 들어, 피하, 혈관내, 근육내 또는 복강내)에 의해 또는 흡입에 의해 제형이 대상체에게 투여될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 제형을 제조하는 방법 또는 공정을 특색으로 한다. 이러한 방법 또는 공정은 세포 배양물에서 SDAB 분자를 발현시키는 단계; 예를 들어, SDAB 분자를 크로마토그래피 정제 단계, 한외여과/정용여과 단계 중 하나 이상을 통과시킴으로써, SDAB 분자를 정제하는 단계; 본원에 기술된 바와 같은 동결보호제, 계면활성제 및 완충제, 예를 들어, 약 5％ 내지 약 10％, 예를 들어, 약 5％, 약 10％ 농도의 수크로스; 약 0 내지 약 0.02％, 예를 들어, 0.01％, 0.02％ 농도의 폴리소르베이트-80; (임의적인) 약 0 내지 약 100 mM, 예를 들어, 100 mM 농도의 글리신; (임의적인) 약 0 내지 약 100 mM, 예를 들어, 100 mM 농도의 메티오닌; 및 (f) 제형의 pH가 약 5 내지 7.5, 예를 들어, 5, 5.5, 5.8-6.1, 6, 6.1, 6.5 또는 7이도록 하는 히스티딘 (약 10 내지 약 20 mM 농도) 또는 트리스 완충제 (약 20 mM 농도)을 함유하는 제형에서 SDAB 분자의 농도를, 예를 들어, 약 10 내지 250 ㎎/㎖로 조정하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 SDAB 분자, 예를 들어, TNF-결합 SDAB 분자를 함유하는 재구성된 제형을 제조하는 방법 또는 공정을 특색으로 한다. 이러한 방법은 SDAB 분자, 동결보호제, 계면활성제 및 완충제의 혼합물을 동결건조시킴으로써, 동결건조된 혼합물을 형성시키는 단계; 및 동결건조된 혼합물을 희석제에서 재구성시킴으로써, 본원에 기술된 바와 같은 제형을 제조하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 제형은 (a) 약 0.5 내지 약 200 ㎎/㎖, 예를 들어, 약 1 ㎎/㎖, 약 50 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖, 약 88 ㎎/㎖, 약 100 ㎎/㎖, 약 118 ㎎/㎖ 농도의 SDAB 분자, 예를 들어, TNF-결합 나노바디 분자; (b) 약 5％ 내지 약 10％, 예를 들어, 약 5％, 약 10％ 농도의 수크로스; (c) 약 0 내지 약 0.02％, 예를 들어, 0.01％, 0.02％ 농도의 폴리소르베이트-80; (d) (임의적인) 약 0 내지 약 100 mM, 예를 들어, 100 mM 농도의 글리신; (e) (임의적인) 약 0 내지 약 100 mM, 예를 들어, 100 mM 농도의 메티오닌; 및 (f) 제형의 pH가 약 5 내지 7.5, 예를 들어, 5, 5.5, 5.8-6.1, 6, 6.1, 6.5 또는 7이도록 하는 히스티딘 (약 10 내지 약 20 mM 농도) 또는 트리스 완충제 (약 20 mM 농도)를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에서 류머티스성 관절염 (RA) (예를 들어, 중등도 내지 중증 류머티스성 관절염), 관절염성 상태 (예를 들어, 건선성 관절염, 다관절형 소아 특발성 관절염 (JIA), 강직성 척추염 (AS), 건선, 궤양성 결장염, 크론병, 염증성 장 질환, 및/또는 다발성 경화증을 포함하지만 이에 한정되지 않는 TNFα 관련 장애, 예를 들어, 염증성 또는 자가면역 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 대상체, 예를 들어, 인간 환자에게 본원에 기술된 바와 같은 TNF-결합 SDAB 제형, 예를 들어, TNF-결합 SDAB 분자를 함유하는 제형을 포함하는 제약 조성물을, 단독으로 또는 본원에 기술된 조합 요법들 중 어느 하나와 조합하여, TNFα 관련 장애의 증상들 중 하나 이상이 감소되도록 하는 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 제형을 함유하는 기구, 주사기 또는 바이알을 포함하는 키트 또는 제조품을 특색으로 한다. 이러한 키트 또는 제조품은 사용 설명서를 임의적으로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 주사기 또는 바이알은 유리, 플라스틱, 또는 중합체성 물질 예컨대 고리형 올레핀 중합체 또는 공중합체로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 제형은 주사용 기구 (예를 들어, 주사용 주사기, 예를 들어, 사전충전 주사용 주사기) 내에 존재할 수 있다. 주사기는 개별적인 투여용으로, 예를 들어, 자가주입기 (예를 들어, 펜-주입기 기구) 및/또는 사용 설명서를 포함하는 단일 바이알 시스템으로서 개조될 수 있다. 한 실시양태에서, 주사용 기구는 임의적으로 사용 및 투여 설명서가 있는, 사전충전 펜 또는 기타 적절한 자가주입용 기구이다.
특정 실시양태에서, 키트 또는 제조품 (예를 들어, 단일 또는 다중 용량 단위가 있는 사전충전 펜 또는 주사기)가 주사 (예를 들어, 피하, 혈관내, 근육내 또는 복강내)에 의한 투여 (예를 들어, 자가-투여)를 위한 설명서와 함께 사전포장되어 대상체, 예를 들어, 환자 또는 건강관리 제공자에게 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 제형이 제공되는 비강, 경피, 정맥내 투여를 위한 기구를 특색으로 한다. 예를 들어, 본원에 기술된 제형의 투여를 위한 경피 패치(patch)가 제공된다. 또 다른 경우에서, 본원에 기술된 제형의 투여를 위한 정맥내 백이 제공된다. 실시양태들에서, 생리식염수 또는 5％ 덱스트로스가 정맥내 백에 공급된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 SDAB 분자, 예를 들어, TNFα 나노바디 분자를 필요로 하는 환자 (예를 들어, 인간 환자)에게 어떻게 본원에 기술된 제형을 투여하는지를 지시하는 방법을 특색으로 한다. 이러한 방법은 (i) 환자에게 본원에 기술된 SDAB 분자의 제형의 1개 이상의 단위 용량을 제공하는 단계; 및 (ii) 1개 이상의 단위 용량을, 예를 들어, 주사 (예를 들어, 피하, 혈관내, 근육내 또는 복강내)에 의해, 자가 투여하도록 환자를 지시하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 환자는 본원에 기술된 바와 같은 TNFα 관련 장애, 예를 들어, 염증성 또는 자가면역 장애에 걸린 환자이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 TNFα 나노바디 분자의 제형의 투여에 대해 수용자를 지시하는 방법을 특색으로 한다. 이러한 방법은 수용자 (예를 들어, 최종 사용자, 환자, 의사, 소매 또는 도매 약국, 유통업자, 또는 병원, 요양소 또는 HMO의 약국 부서)에게 어떻게 제형이 환자에게 투여되어야 하는지를 지시하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기술된 SDAB 분자, 예를 들어, TNFα 나노바디 분자의 제형을 배포하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 수용자 (예를 들어, 최종 사용자, 환자, 의사, 소매 또는 도매 약국, 유통업자, 또는 병원, 요양소 또는 HMO의 약국 부서)에게 적어도 6개월, 12개월, 24개월 또는 36개월 동안 환자를 치료하는데 충분한 단위 투여량의 SDAB 분자, 예를 들어, TNFα 나노바디 분자를 함유하는 패키지를 제공하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 SDAB 분자, 예를 들어, TNFα 나노바디 분자를 함유하는 본원에 기술된 제형의 패키지 또는 다수의 패키지의 품질을 (예를 들어, 만료되었는지를 결정하기 위해) 평가하는 방법 또는 공정을 특색으로 한다. 이러한 방법은 패키지가 만료되었는지 여부를 평가하는 단계를 포함한다. 만료일은 미리 선택된 이벤트, 예컨대 제조, 분석 또는 포장 이벤트로부터 적어도 6개월, 12개월, 24개월, 36개월, 또는 48개월, 예를 들어, 24개월 또는 36개월 초과이다. 일부 실시양태에서, 분석 결과로서 결정 또는 단계가 취해지고, 예를 들어, 제품이 만료되었는지 여부에 따라, 패키지 내의 SDAB 분자가 사용 또는 폐기되거나, 분류되거나, 선택되거나, 발매 또는 보류되거나, 선적되거나, 새로운 위치로 이동되거나, 시판되거나, 판매되거나, 판매용으로 제공되거나, 시판이 취소되거나, 또는 더이상 판매용으로 제공되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 SDAB 분자, 예를 들어, TNF 나노바디 분자의 제형을 보관, 배포 또는 사용하는 방법을 특색으로 한다. 이러한 방법은 소정의 온도, 예를 들어, 25℃ 미만, 예를 들어, 빙점 미만 또는 15℃, 10℃, 또는 4℃ 미만에서 일정 기간 동안 제형을 보관하는 단계를 포함한다. 실시양태들에서, 이러한 방법은 유사한 조건 또는 상이한 조건 (예를 들어, 최초의 보관 기간보다 높은 온도) 하에서의 보관을 위해 수용자, 예를 들어, 최종 사용자, 예를 들어, 환자 또는 건강관리 제공자에게 제형을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 제형은 액체 제형, 동결건조 제형 또는 재구성된 제형일 수 있다.
*또 다른 측면에서, 본 발명은 제품 또는 공정, 예를 들어, 제조 공정을 분석하는 방법을 특색으로 한다. 이러한 방법은 본원에 기술된 SDAB 분자, 예를 들어, TNF 나노바디 분자의 제형을 제공하는 단계, 및 본원에 기술된 바와 같이, 제형의 파라메터, 예컨대 색 (예를 들어, 무색 내지 담황색, 또는 무색 내지 황색), 투명도 (예를 들어, 투명 내지 약간 유백색 또는 투명 내지 유백색), 또는 점도 (예를 들어, 주위 온도, 예컨대 20℃-30℃, 예를 들어, 25℃에서 측정 시 약 1 내지 5 cP), 하나 이상의 HMW 종, LMW 종, 산성 종 및/또는 염기성 종의 양을 평가하는 단계를 포함한다. 평가는 하나 이상의 파라메터의 평가를 포함할 수 있다. 임의적으로, 파라메터가 미리 선택된 기준을 충족시키는지 여부가 결정되고, 예를 들어, 미리 선택된 기준이 존재하는지, 또는 미리 선택된 범위 내에 존재하는지 여부를 결정함으로써, 공정이 분석된다.
한 실시양태에서, 공정의 평가는 SDAB 분자 제형의 안정성의 측정을 포함한다. 항체 제형의 안정성을, 예를 들어, 응집물 형성 (예를 들어, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 의해 분석됨)에 의해, 본원에 기술된 바와 같이 색, 투명도 또는 점도에 의해 측정할 수 있다. 미리 설정된 기간에 걸쳐, 그리고 임의적으로 소정의 온도에서, 분석 파라메터에서의 변화가 약 10％, 5％, 3％, 2％, 1％, 0.5％, 0.05％, 또는 0.005％ 또는 이보다 낮은 ％ 미만이면, 제형이 안정적인 것으로 결정될 수 있고, 따라서 추가적인 가공 또는 배포에 대해 허용가능하다.
한 실시양태에서, 이러한 방법은 결정된 값을 기준값과 비교함으로써, 제조 공정을 분석하는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 이러한 방법은 분석에 적어도 부분적으로 의존하여 제조 공정을 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 분석을 기초로 제조 공정을 변경하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 방법은 본원에 기술된 방법 또는 분석을 기초로 공정에 관한 결정을 내리는 단계를 포함하는, 선택된 공정에 의해 제조된 SDAB 분자, 예를 들어, TNF 나노바디 분자의 제형의 공정, 예를 들어, 제조 공정을 평가하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 방법 또는 분석을 적어도 부분적으로 기초로 하여 제조 공정을 유지하거나 변경하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 평가 관계자는 본원에 기술된 방법 또는 분석을 실행하지 않고, 단지 본원에 기술된 방법 또는 분석에 의해 수득된 결과에 의존한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 방법은 배치(batch)-대-배치 변동을 모니터링 또는 제어하는 방법에서 또는 제제를 기준 표준물과 비교하기 위해 2개 이상의 제제를 비교하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 방법은 결정을 적어도 부분적으로 기초로 하여, 예를 들어, 제제를 분류하거나, 선택하거나, 허용 또는 폐기하거나, 발매 또는 보류하거나, 약물 제품으로 가공하거나, 선적하거나, 상이한 위치로 이동시키거나, 제형하거나, 표지하거나, 포장하거나, 시판하거나, 판매하거나 또는 판매용으로 제공하는 결정을 내리는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 예를 들어, 품질 제어 또는 발매 기준(release specification) 분석에서, 본원에 기술된 바와 같은 SDAB 분자, 예를 들어, TNF 나노바디 분자의 제형의 품질을 평가하는 방법을 특색으로 한다. 이러한 방법은 색 (예를 들어, 무색 내지 담황색, 또는 무색 내지 황색), 투명도 (예를 들어, 투명 내지 약간 유백색 또는 투명 내지 유백색), 또는 점도 (예를 들어, 주위 온도, 예컨대 20℃ 내지 30℃, 예를 들어, 25℃에서 측정 시 약 1 내지 5 cP)와 같은 파라메터에 대한 SDAB 분자 제형의 평가를 제공하는 단계를 포함한다. 평가는 상기 파라메터들 중 하나 이상의 평가를 포함할 수 있다. 이러한 방법은, 임의적으로, 용액 파라메터가 미리 선택된 기준을 충족시키는지 여부, 예를 들어, 미리 선택된 기준이 존재하는지, 또는 미리 선택된 범위 내에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 또한 포함한다. 관찰된 용액 파라메터가 미리 선택된 범위의 값 이내에 있거나 또는 미리 선택된 표준 기준을 충족시키면, 제제가 예컨대 포장, 사용, 판매, 시판, 폐기 등을 위해 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 규제 요건, 예를 들어, 규제 기관, 예를 들어, FDA의 승인후 요건에 따르는 방법을 특색으로 한다. 이러한 방법은 본원에 기술된 바와 같은 파라메터들에 대한 항체 제형의 평가를 제공하는 단계를 포함한다. 승인후 요건은 상기 파라메터들 중 하나 이상의 측정을 포함할 수 있다. 이러한 방법은, 임의적으로, 관찰된 용액 파라메터가 미리 선택된 기준을 충족시키는지 여부 또는 파라메터가 미리 선택된 범위 내에 있는지 여부를 결정하는 단계; 임의적으로, 예를 들어, 값 또는 결과를 규제 기관에 전송함으로써, 분석 값 또는 결과를 제출하거나 기관과 소통하는 단계를 또한 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 미리 선택된 성질을 지니는, 예를 들어, 발매 기준, 표지 요건 또는 개론 요건, 예를 들어, 본원에 기술된 성질을 충족시키는 SDAB 분자, 예를 들어, TNF 나노바디 분자의 제형의 배치를 제조하는 방법을 특색으로 한다. 이러한 방법은 테스트 제형을 제공하는 단계; 테스트 제형을 본원에 기술된 방법에 따라 분석하는 단계; 테스트 제형이 미리 선택된 기준을 만족시키는지 여부, 예를 들어, 기준 값, 예를 들어 본원에 기술된 하나 이상의 기준 값과의 미리 선택된 관계를 지니는지를 결정하는 단계, 및 테스트 항체 제제를 선택하여 제품 배치를 제조하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 각각의 배치에 대한 하나 이상의 파라메터 (예를 들어, 본원에 기술된 방법에 의해 결정된 값 또는 용액 파라메터)가 미리 선택된 원하는 기준 값 또는 기준, 예를 들어, 본원에 기술된 범위 또는 기준과 미리 선택된 범위 미만으로 다른, SDAB 분자, 예를 들어, TNF 나노바디 분자의 제형의 다중 배치를 특색으로 한다. 일부 실시양태에서, 제형의 하나 이상의 배치에 대한 하나 이상의 파라메터가 결정되고, 결정 결과로서 배치 또는 배치들이 선택된다. 일부 실시양태는 결정 결과를 미리 선택된 값 또는 기준, 예를 들어, 기준 규격과 비교하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태는, 예를 들어, 값 또는 파라메터의 결정 결과를 기초로, 투여되는 배치의 용량을 조정하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 보고서-수신 단체에게 보고서를 제공함, SDAB 분자, 예를 들어, TNF 나노바디 분자의 제형의 샘플을 기준 규격, 예를 들어, FDA 요건의 준수에 대해 평가함, SDAB 분자의 제제가 일부 미리 규정된 요건을 충족시킨다는 지시를 또 다른 관계인으로부터 조사함, 또는 SDAB 분자의 제제에 관한 정보를 또 다른 관계자에게 제출함 중 하나 이상의 방법을 특색으로 한다. 예시적인 수신 단체 또는 또 다른 관계자에는 정부, 예를 들어, 미국 연방 정부, 예를 들어, 정부 기관, 예를 들어, FDA가 포함된다. 이러한 방법은 하기 단계들 중 하나 이상 (또는 모두)를 포함한다; 제1 국가, 예를 들어, 미국에서 SDAB 분자의 수성 제형을 제조 및/또는 테스트하는 단계; 제1 국가 밖으로 분취량의 샘플을 보내는 단계, 예를 들어, 이를 미국 밖의 제2 국가로 보내는 단계; SDAB 분자의 제제의 구조에 관한 데이터, 예를 들어, 본원에 기술된 구조 및/또는 사슬에 관한 데이터, 예를 들어, 본원에 기술된 방법들 중 하나 이상에 의해 생성된 데이터를 포함하는 보고서를 제조하거나 수신하는 단계; 및 상기 보고서를 보고서 수신 단체에게 제공하는 단계.
한 실시양태에서, 보고서-수신 단체는 데이터에 의해 미리 결정된 요건 또는 기준 값이 충족되는지 여부를 결정할 수 있고, 임의적으로, 예를 들어, SDAB 분자의 제형의 제조업자, 유통업자 또는 판매자가 보고서-수신 단체로부터의 응답을 수신한다. 한 실시양태에서, 보고서 수신 단체의 허가 시, SDAB 분자의 제형의 제제가 선택, 포장 또는 시판된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 SDAB 분자의 제형을 평가하는 방법을 특색으로 한다. 이러한 방법은 SDAB 분자의 존재 또는 수준에 관한 데이터를 수신하고, 예를 들어, 이때 데이터가 본원에 기술된 하나 이상의 방법에 의해 제조되는 단계; 상기 데이터를 포함하고, SDAB 분자의 배치에 대한 식별물을 임의적으로 포함하는 기록물을 제공하는 단계; 상기 기록물을 결정자, 예를 들어, 정부 기관, 예를 들어, FDA에게 제출하는 단계; 임의적으로, 상기 결정자로부터 통신을 수신하는 단계; 임의적으로, 결정자로부터의 통신을 기초로 SDAB 분자의 배치를 발매 또는 판매할지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 샘플을 방출하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특히 및 기타 참고문헌은 그의 전문이 참고로 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 의미가 동일하다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 모든 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 테스트에서 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질이 하기에 기술된다. 또한, 이러한 물질, 방법 및 예들은 단지 설명적일 뿐이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 또 다른 특색 및 장점이 상세한 설명, 도면 및 청구항으로부터 명백할 것이다.
도 1은 건조 분말 (DP) 제제로서 6개월까지 보관된 106 U/㎎의 TNF-결합 나노바디 (ATN-103)의 동결건조 제형의 생물학적 활성의 결과를 도해한다. 제형이 지시된 온도에서 보관되었다.
도 2는 TNF-결합 나노바디 (ATN-103)의 동결건조 제형의 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합 활성의 결과를 도해한다. TNF-결합 나노바디 기준 표준물의 백분율 (％)로서 결과가 제시된다.
도 3은 동결건조 제형에 대한 고분자량 (HMW) 종의 ％의 관점에서의 크기 배제-HPLC (SE-HPLC)의 결과를 도해한다.
도 4는 동결건조 제형에 대한 ％ TNF-결합 나노바디의 관점에서의 SDS-모세관 전기영동 (SDS-CE)의 결과를 도해한다.
도 5는 대조군 및 완건성(robustness) 동결건조 사이클에 적용된 제형에 대한 ％ HMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 6은 고농도 액체 제형에서 6개월까지의 보관 후의 106 U/㎎ TNF-결합 나노바디의 생물학적 활성의 결과를 도해한다.
도 7은 지시된 온도에서 6개월까지 보관된 고농도 액체 제형의 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합 활성 (TNF-결합 나노바디 기준 표준물의 백분율)의 결과를 도해한다.
도 8은 지시된 온도에서 6개월까지의 보관 후의 고농도 액체 제형의 ％ HMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 9는 지시된 온도에서 6개월까지의 보관 후의 고농도 액체 제형의 ％ LMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 10은 지시된 온도에서 6개월까지의 보관 후의 고농도 액체 제형의 ％ ATN-103에 대한 SDS-CE 결과를 도해한다.
도 11은 사전충전 주사기 내의 고농도 액체 제형의 ％ HMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 12는 사전충전 주사기 내의 고농도 액체 제형의 ％ LMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 13은 사전충전 주사기 내의 고농도 액체 제형의 CEX-HPLC에 의한 ％ 산성 종에 대한 결과를 도해한다.
도 14는 사전충전 주사기 내의 고농도 액체 제형의 CEX-HPLC에 의한 ％ 염기성 종에 대한 결과를 도해한다.
도 15는 고농도 액체 제형 - 또 다른 제형들의 ％ HMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다 (또 다른 안정화 및 불안정화 부형제의 확인).
도 16은 TNF-결합 나노바디 고농도 액체에 대한 ％ HMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 17은 TNF-결합 나노바디 고농도 액체에 대한 ％ LMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 18은 TNF-결합 나노바디 고농도 액체에 대한 ％ 산성 종에 대한 CEX-HPLC 결과를 도해한다.
도 19는 TNF-결합 나노바디 고농도 액체에 대한 ％ 염기성 종에 대한 CEX-HPLC 결과를 도해한다.
도 20은 10× 동결-해동 사이클 후의 TNF-결합 나노바디 고농도 액체에 대한 ％ HMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 21은 10× 동결-해동 사이클 후의 TNF-결합 나노바디 고농도 액체에 대한 ％ LMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 22는 10× 동결-해동 사이클 후의 TNF-결합 나노바디 고농도 액체에 대한 혼탁도 (455 nm에서의 흡광도) 결과를 도해한다.
도 23은 10× 동결-해동 사이클 후의 TNF-결합 나노바디 고농도 액체에 대한 농도 (280 nm에서의 UV 흡광도에 의한 농도) 결과를 도해한다.
도 24는 TNF-결합 나노바디의 고농도 액체 제형을 도해한다: 제조 공정에서 잠재적으로 마주치는 단기 열 스트레스 후의 SE-HPLC에 의한 ％ HMW.
도 25는 pH 및 제형 (40℃)의 함수로서의 저농도 액체 제형의 ％ HMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 26은 pH 및 제형 (40℃)의 함수로서의 저농도 액체 제형의 ％ LMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 27은 pH 및 제형 (4℃)의 함수로서의 저농도 액체 제형의 ％ HMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 28은 pH 및 진탕 후 제형의 함수로서의 저농도 액체 제형의 ％ HMW 종에 대한 SE-HPLC 결과를 도해한다.
도 29는 ATN-103의 예상 구조의 개략도를 도해한다.
도 30은 ATN-103 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열 (서열 1)을 도해한다.
도 31은 지시된 조건 하에 보관된 약 100 ㎎/㎖의 ATN-103을 함유하는 지시된 제형 (HST, HSGT, HSGMT, HSorb 및 대조군)의 SE-HPLC에 의해 검출된 HMW 종의 ％를 도해하는 막대 그래프이다.
도 32는 지시된 조건 하에 보관된 약 100 ㎎/㎖의 ATN-103을 함유하는 지시된 제형 (HST, HSGT, HSGMT, HSorb 및 대조군)의 SE-HPLC에 의해 검출된 LMW 종의 ％를 도해하는 막대 그래프이다. 초기 시점에 또는 4℃에서의 2주 후 LMW 종이 검출되지 않았다.
고농도 및 저농도의 SDAB 분자 ("제형")의 보관에 적절한, SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자 (예를 들어, TNF-결합 나노바디 분자)를 포함하는 안정적인 제형이 확인되었다. 제형되는 SDAB 분자는 바람직하게는 본질적으로 순수하고, 바람직하게는 본질적으로 균질하다 (즉, 오염 단백질 등이 없다). "본질적으로 순수한" 단백질은 조성물의 전체 중량을 기초로 약 90 중량％ 이상의 단백질, 바람직하게는 약 95 중량％ 이상을 포함하는 조성물을 의미한다. "본질적으로 균질한" 단백질은 조성물의 전체 중량을 기초로 약 99 중량％ 이상의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다.
다양한 조건 하에 액체로서 또는 동결건조 제품으로서 장기 보관 후 제형 내의 SDAB 분자의 완전성이 일반적으로 유지된다. 예를 들어, 광범위한 보관 온도 (예를 들어, -80℃ 내지 40℃), 전단 응력 (예를 들어, 진탕) 및 계면 응력 (동결-해동 사이클)에 대한 노출 후 SDAB 분자의 완전성이 적합하게 유지된다.
추가적으로, 동결건조 물질에 대해, 재구성 공정 동안 SDAB 분자의 완전성이 적합하게 유지된다. 또한, 다양한 온도 (예를 들어, -80℃ 내지 40℃)에서의 장기간 보관 (예를 들어, 12개월까지의 보관) 후 LMW 종 및 HMW 종의 비교적 낮은 축적, 시험관내 생활성(bioactivity), 시험관내 결합 활성에 의해 실연되는 바와 같이 의약으로서 사용하기 위해 SDAB 분자 완전성이 충분히 유지된다.
본 발명이 더욱 용이하게 이해될 수 있기 위해, 특정 용어들이 먼저 정의된다. 추가적인 정의가 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재된다.
본원에서 사용된 관사("a" 및 "an")는 관사의 문법적 목적어 1개 또는 1개 초과 (즉, 1개 이상)을 지칭한다.
용어 "또는"은, 문맥적으로 명확하게 다르게 지시되지 않는 한, 용어 "및/또는"을 의미하도록 본원에서 사용되고, 이와 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
"약" 및 "대략적으로"는 측정의 정확성 또는 성질을 고려했을 때 측정된 양에 대한 허용가능한 정도의 오차를 일반적으로 의미할 것이다. 예시적인 오차 정도는 소정의 값 또는 값들의 범위의 20 퍼센트 (％) 이내, 전형적으로는 10％ 이내, 더욱 전형적으로는 5％ 이내이다.
SDAB 분자의 "안정적인" 제형은 장기간, 예를 들어, 6개월, 12개월, 24개월, 36개월 또는 그 초과에 걸쳐 응집, 단편화, 탈아미드화, 산화, 또는 생물학적 활성 변화 중 임의의 하나 이상의 징후를 거의 나타내지 않거나 나타내지 않는다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 10％ 미만의 SDAB 분자가 응집, 단편화 또는 산화된다. 응집, 침전 및/또는 변성을 공지된 방법, 예컨대 색 및/또는 투명도의 시각적 검사에 의해, 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가할 수 있다. 자신의 생물학적 활성을 유지하는 단백질의 능력을 항체의 화학적으로 변경된 형태를 검출 및 정량함으로써 평가할 수 있다. 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 SDS-PAGE를 사용하여 크기 변형 (예를 들어, 클리핑(clipping))을 평가할 수 있다. 또 다른 유형의 화학적 변경에는 전하 변경 (예를 들어, 탈아미드화의 결과로서 발생함)이 포함되고, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 이를 평가할 수 있다.
예를 들어, 항원 결합 분석법에서 결정 시, 소정의 시점의 분자의 생물학적 활성이 제약 제형이 제조된 시점에 나타나는 생물학적 활성의 약 50％ 이상 이내이면, SDAB 분자가 제약 제형 내에서 "자신의 생물학적 활성을 유지한다".
*"재구성된" 제형은 단백질이 재구성된 제형 내에 분산되도록 동결건조된 단백질 제형을 희석제에 용해시킴으로써 제조된 것이다. 재구성된 제형은 관심 단백질로 치료될 환자에게 투여 (예를 들어, 비경구 또는 경구 투여)하는데 적절하고, 본 발명의 일부 실시양태에서는, 피하 투여에 적절한 것일 수 있다.
"등장성" 또는 "등삼투압성"은 관심 제형의 삼투압이 인간 혈액과 유사하거나 또는 본질적으로 동일하다는 것을 의미한다. 등장성 또는 등삼투압성 제형은 일반적으로 삼투압이 약 250 내지 350 mOsm일 것이다. 예를 들어, 증기압 또는 빙냉 유형 삼투압측정기를 사용하여 등장성을 측정할 수 있다.
"등장성 조정제"는 제형이 인간 혈액과 실질적으로 등장성 또는 등삼투압성이도록 하는 화합물을 지칭한다. 예시적인 등장성 조정제는 수크로스, 소르비톨, 글리신, 메티오닌, 만니톨, 덱스트로스, 이노시톨, 염화나트륨, 아르기닌, 또는 아르기닌 히드로클로라이드이다. 전형적으로, 등장성 조정제는 전체적인 제형이 인간 혈액의 삼투압 강도와 유사한 삼투압 강도를 발휘하도록 하는 양으로 첨가된다. 예를 들어, 인간 혈액은 약 300 mM 용질을 함유한다. 전형적으로, 제약 제품은 300 mM의 전체 몰농도를 표적으로 한다. 이는 약 300 내지 310 mOsm의 삼투압에 상응하고, 전형적인 범위는 250 mOsm 내지 350 mOsm이다. 필요한 등장성 조정제의 양을 계산을 통해 초기에 추정할 수 있다. 부형제 분자의 분자량, 및 분자의 공지된 성질, 예를 들어, 분자가 2개의 이온 종으로 해리되는지 또는 분자가 비-이온성인지 (해리되지 않는지)로부터 전체 몰농도에 대한 기여를 추정할 수 있다. 추가적으로, 단백질 농도의 함수로서 특정 단백질 분자의 삼투압 기여를 이해하는 것이 필요하다. 이러한 파라메터를 실험적으로 결정할 수 있다.
예를 들어, 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01 ％ 폴리소르베이트 80 + 100 ㎎/㎖의 항-TNF 나노바디 단백질 농도의 제형 (등장성 수정되지 않음)으로 시작하여, 첫번째 단계로서, 출발 제형의 추정 몰농도를 하기와 같이 계산할 수 있다:
10 mM 히스티딘 = 10 mM
5％ 수크로스는 약 146 mM에 상응한다
5％ = 5 g/100 ㎖ = 50 g/ℓ → (50 g/ℓ) / (342.3 g/몰) = 0.146 몰/ℓ = 146 mM
0.01 ％ 폴리소르베이트 80는 본질적으로 몰농도 0을 발휘하고, 무시될 수 있다.
100 ㎎/㎖ 단백질: 실험을 통해, 100 ㎎/㎖ 항-TNF 나노바디 단백질이 약 48 mM에 상응하는 삼투압을 발휘하는 것으로 결정되었다.
따라서, 몰농도에 대한 모든 기여를 합하면 하기와 같다:
10 mM + 146 mM + 48 mM = 204 mM.
표적 몰농도가 310 mM이면, 표적의 나머지를 보충하기 위한 상응하는 몰농도 양은 하기와 같다:
310 mM - 204 mM = 106 mM.
따라서, 등장성 조정제의 권장량은 106 mM의 비-이온성 등장성 조정제, 또는 53 mM의 2개의 이온 종으로 완전히 해리되는 이온성 등장성 조정제이다.
등장성 조정제의 초기 추정치를 결정한 후, 제형을 실험적으로 테스트하는 것이 권장된다. 따라서, 제공된 예에서, 100 mM 글리신을 초기 제형에 첨가하였다. (권장된 106 mM을 간단히 하기 위해 100 mM로 절사하였다). 예상되는 삼투몰농도는 하기와 같을 것이다:
10 mM 히스티딘 + 146 mM 수크로스 + 48 mM 단백질 + 100 mM 글리신 = 304 mM
제형의 실험적 삼투압 값 = 305 mOsm.
"동결보호제"는 관심 단백질과 조합되는 경우 동결건조 및 이어지는 보관 시 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 유의하게 방지하거나 감소시키는 분자이다. 예시적인 동결보호제에는 당 예컨대 수크로스, 소르비톨, 또는 트레할로스; 아미노산 예컨대 모노소듐 글루타메이트 또는 히스티딘; 메틸아민 예컨대 베타인; 친액성 염 예컨대 황산마그네슘; 폴리올 예컨대 3가 이상의 당 알코올, 예를 들어, 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 및 만니톨; 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉(Pluronic); 및 이들의 조합물이 포함된다. 전형적으로, 동결보호제는 비-환원 당, 예컨대 트레할로스 또는 수크로스이다. 동결보호제는 동결보호 양의 동결보호제의 존재 하에서의 단백질의 동결건조 후 단백질이 동결건조 및 보관 시 자신의 물리적 및 화학적 안정성 및 완전성을 유지한다는 것을 의미하는 "동결보호 양"으로 동결건조 전의 제형에 첨가된다.
"안정화제"는 관심 단백질 (예를 들어, SDAB 분자)와 조합되는 경우, 동결건조 형태, 재구성된 형태, 액체 형태 또는 보관 형태의 관심 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 실질적으로 방지하거나 감소시키는 분자를 지칭한다. 예시적인 안정화제에는 수크로스, 소르비톨, 글리신, 이노시톨, 염화나트륨, 메티오닌, 아르기닌, 및 아르기닌 히드로클로라이드가 포함된다.
본원에서 관심있는 "희석제"는 제약상 허용가능하고 (인간에게 투여하기 위해 안전하고 비-독성이고), 재구성된 제형의 제조에 유용한 것이다. 예시적인 희석제에는 무균수, 주사용 정균수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어 포스페이트-완충 염수), 무균성 염수 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 덱스트로스 용액이 포함된다.
"보존제"는 재구성된 제형에서의 박테리아 작용을 본질적으로 감소시키기 위해 희석제에 첨가될 수 있는 화합물이고, 따라서, 예를 들어, 다중 사용 재구성 제형의 생산을 용이한다. 가능한 보존제의 예로는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬기들이 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드들의 혼합물), 및 벤즈에토늄 클로라이드가 포함된다. 또 다른 유형의 보존제에는 방향족 알코올 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알코올, 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀, 3-펜타놀, 및 m-크레졸이 포함된다. 본원에서 가장 바람직한 보존제는 벤질 알코올이다.
"벌크화제"는 동결건조된 혼합물에 부피를 부가하고 동결건조된 케이크의 물리적 구조에 기여하는 (예를 들어, 개구 구조를 유지하는 본질적으로 균일한 동결건조 케이크의 생산을 용이하게 하는) 화합물이다. 예시적인 벌크화제에는 만니톨, 글리신, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비톨이 포함된다.
본 발명의 방법 및 조성물은 특정된 서열, 또는 이와 실질적으로 동일하거나 유사한 서열, 예를 들어, 특정된 서열에 대해 적어도 85％, 90％, 95％ 또는 이를 초과하는 ％로 동일한 서열의 폴리펩티드 및 핵산을 포함한다. 아미노산 서열의 맥락에서, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열이 공통된 구조적 도메인 및/또는 공통된 기능적 활성을 가질 수 있도록 i) 제2 아미노산 서열 내의 정렬된 아미노산 잔기와 동일하거나 또는 ii) 이의 보존적 치환인 충분한 개수 또는 최소 개수의 아미노산 잔기를 함유하는 제1 아미노산을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, 기준 서열에 대한 동일성이 적어도 약 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％인, 공통된 구조적 도메인을 함유하는 아미노산 서열. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 기준 서열에 대해 적어도 약 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일성의 백분율 동일성이 달성되도록 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환 (예를 들어, 보존적 치환)을 함유할 수 있다.
뉴클레오티드 서열의 맥락에서, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열이 공통된 기능 활성을 지니는 폴리펩티드를 코딩하거나 또는 공통된 구조적 폴리펩티드 도메인 또는 공통된 기능적 폴리펩티드 활성을 코딩하도록 제2 핵산 서열 내의 정렬된 뉴클레오티드와 동일한 충분한 개수 또는 최소 개수의 뉴클레오티드를 함유하는 제1 핵산 서열을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, 기준 서열에 대한 동일성이 적어도 약 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％인 뉴클레오티드 서열.
상기 폴리펩티드들의 단편, 유도체, 유사체, 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합이 본 발명의 폴리펩티드로서 또한 포함된다. 본 발명의 단백질을 지칭할 때의 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 상응하는 천연 항체 또는 폴리펩티드의 기능성 성질들 중 적어도 일부를 유지하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편에는, 본원의 다른 곳에서 논의된 특이적 항체 단편에 더하여, 단백질분해성 단편, 뿐만 아니라 결실 단편이 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드의 변이체에는 상기 기술된 바와 같은 단편이 포함되고, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 아미노산 서열이 변경된 폴리펩티드가 또한 포함된다. 변이체는 천연적으로 발생할 수 있거나, 또는 비-천연 발생 변이체일 수 있다. 당업계에 공지된 돌연변이유발 기술을 사용하여 비-천연 발생 변이체가 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 본 발명의 단편의 유도체는 천연 폴리펩티드 상에서 발견되지 않는 추가적인 특색을 나타내도록 변경된 폴리펩티드이다. 예로는 융합 단백질이 포함된다. 변이체 폴리펩티드는 본원에서 "폴리펩티드 유사체"로 또한 지칭될 수 있다. 본원에서 사용된, 폴리펩티드의 "유도체"는 하나 이상의 잔기가 측쇄 관능기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 대상 폴리펩티드를 지칭한다. 20개의 표준 아미노산의 하나 이상의 천연 발생 아미노산 유도체를 함유하는 폴리펩티드가 "유도체"로서 또한 포함된다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린이 프롤린을 치환할 수 있고; 5-히드록시라이신이 라이신을 치환할 수 있으며; 3-메틸히스티딘이 히스티딘을 치환할 수 있고; 호모세린이 세린을 치환할 수 있고; 오르니틴이 라이신을 치환할 수 있다.
용어 "기능적 변이체"는 아미노산 서열이 천연 발생 서열과 실질적으로 동일하거나, 또는 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 천연 발생 서열의 하나 이상의 활성을 지닐 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다.
서열들 간의 상동성 또는 서열 동일성 (이러한 용어들은 본원에서 상호교환가능하게 사용됨)의 계산은 하기와 같이 수행된다.
2개의 아미노산 서열, 또는 2개의 핵산 서열의 백분율 동일성을 결정하기 위해, 서열들을 최적의 비교 목적을 위해 정렬한다 (예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 양쪽 모두에 갭(gap)이 도입될 수 있고, 비교 목적을 위해 비-상동성 서열이 무시될 수 있다). 바람직한 실시양태에서, 비교 목적을 위해 정렬되는 기준 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 적어도 30％, 바람직하게는 적어도 40％, 더욱 바람직하게는 적어도 50％, 60％, 더욱 더 바람직하게는 적어도 70％, 80％, 90％, 100％이다. 그후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드들을 비교한다. 제1 서열 내의 위치를 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 차지하면, 분자들이 이러한 위치에서 동일하다 (본원에서 사용된 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 등가이다).
2개의 서열 간의 백분율 동일성은 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 개수 및 각각의 갭의 길이를 고려했을 때 서열들이 공유하는 동일한 위치의 개수의 함수이다.
서열들의 비교 및 2개의 서열 간의 백분율 동일성의 결정을 수학 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 블라섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 웨이트(weight) 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 웨이트 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능) 내의 GAP 프로그램 내로 혼입된 [Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453]의 알고리즘을 사용하여 2개의 아미노산 서열 간의 백분율 동일성을 결정할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 갭 웨이트 40, 50, 60, 70, 또는 80 및 길이 웨이트 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능) 내의 GAP 프로그램을 사용하여 2개의 뉴클레오티드 서열 간의 백분율 동일성이 결정된다. 파라메터들의 특히 바람직한 세트 (그리고 달리 특정되지 않는 한 사용되어야 하는 세트)는 갭 페널티 12, 갭 확장 패널티 4, 및 프레임쉬프트(frameshift) 갭 페널티 5의 블라섬 62 채점 매트릭스이다.
PAM120 웨이트 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버젼 2.0) 내로 혼입된 [E. Meyers and W. Miller (1989) CABIOS, 4:11-17]의 알고리즘을 사용하여 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 간의 백분율 동일성을 결정할 수 있다.
본원에 기술된 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어, 다른 패밀리 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해, 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로 추가로 사용될 수 있다. [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버젼 2.0)을 사용하여 이같은 검색을 수행할 수 있다. 본 발명의 핵산 (서열 1) 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행할 수 있다. 본 발명의 단백질 (서열 1) 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 BLAST 단백질 검색을 수행할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭(Gapped) BLAST가 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 파라메터를 사용할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄가 있는 아미노산 잔기로 교체되는 것이다. 유사한 측쇄가 있는 아미노산 잔기들의 패밀리가 당업계에 공지되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비-극성 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다.
본 발명의 다양한 측면들이 하기에서 추가로 상세하게 기술된다.
단일 도메인 항원 결합 ( SDAB ) 분자
단일 도메인 항원 결합 (SDAB) 분자는 이의 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부분인 분자를 포함한다. 예로는 중쇄 가변 도메인, 본래 경쇄가 없는 결합 분자, 통상적인 4쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인, 조작된 도메인, 및 항체로부터 유래된 것들 이외의 단일 도메인 스캐폴드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. SDAB 분자는 당업계의 임의의 것일 수 있거나, 또는 임의의 장래의 단일 도메인 분자일 수 있다. SDAB 분자는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 어류, 상어, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 이러한 용어는 낙타과(Camelidae) 및 상어 이외의 종으로부터의 천연 발생 단일 도메인 항체 분자를 또한 포함한다.
본 발명의 한 측면에서, SDAB 분자는 어류에서 발견되는 면역글로불린의 가변 영역, 예를 들어, 상어의 혈청에서 발견되는 신규 항원 수용체 (NAR: Novel Antigen Receptor)로서 공지된 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래된 것으로부터 유래될 수 있다. NAR의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 분자 ("IgNAR")의 제조 방법이 WO 03/014161 및 [Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909]에 기술되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, SDAB 분자는 경쇄가 없는 중쇄로 공지된 천연 발생 단일 도메인 항원 결합 분자이다. 예를 들어, WO 9404678 및 [Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448]에 이같은 단일 도메인 분자가 개시되어 있다. 명확성을 위해, 경쇄가 본래 없는 중쇄 분자로부터 유래된 이러한 가변 도메인은 이를 4쇄 면역글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위해 본원에서 VHH 또는 나노바디로서 공지된다. 이같은 VHH 분자는 낙타과 종으로부터, 예를 들어, 낙타, 라마, 단봉낙타, 알파카 및 과나코에서 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 또 다른 종이 경쇄가 본래 없는 중쇄 분자를 생산할 수 있다; 이같은 VHH는 본 발명의 범주 내에 속한다.
SDAB 분자는, 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 재조합 분자, CDR-그래프트 분자, 인간화 분자, 낙타화 분자, 탈면역화 분자 및/또는 시험관 내에서 생성된 (예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 선별된) 분자일 수 있다.
용어 "항원 결합"은 표적 항원 또는 이의 에피토프에 결합하는 계면을 형성하는 결정자를 포함하는, 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 기술된 단일 도메인 분자의 일부분을 포함하도록 의도된다. 단백질 (또는 단백질 모방체)와 관련하여, 항원 결합 부위는 표적 항원에 결합하는 계면을 형성하는 하나 이상의 루프(loop) (4개 이상의 아미노산 또는 아미노산 모방체의 루프)를 전형적으로 포함한다. 전형적으로, 폴리펩티드, 예를 들어, 단일 도메인 항체 분자의 항원 결합 부위는 적어도 1개 또는 2개의 CDR, 더욱 전형적으로는 적어도 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR을 포함한다.
용어 "면역글로불린 가변 도메인"은 인간 또는 동물 기원의 VL 또는 VH 도메인과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 것으로 당업계에서 종종 이해된다. 면역글로불린 가변 도메인이 특정 종, 예를 들어, 상어 및 라마에서 발달되어, 인간 또는 포유류 VL 또는 VH과 아미노산 서열이 상이할 수 있음을 이해하여야 한다. 그러나, 이러한 도메인들은 항원 결합에서 주로 수반된다. 용어 "면역글로불린 가변 도메인"은 전형적으로 적어도 1개 또는 2개의 CDR, 더욱 전형적으로는 적어도 3개의 CDR을 포함한다.
"불변 면역글로불린 도메인" 또는 "불변 영역"은 인간 또는 동물 기원의 CL, CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인과 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 면역글로불린 도메인을 포함하도록 의도된다. 예를 들어, [Charles A Hasemann and J. Donald Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, Second Edition, 209, 210-218 (1989)] 참조. 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 도메인 CH2 및 CH3 또는 이와 실질적으로 유사한 면역글로불린 도메인을 포함하는 불변 면역글로불린 도메인의 Fc 부분을 지칭한다.
특정 실시양태에서, SDAB 분자는 1가 또는 다중특이적 분자 (예를 들어, 2가, 3가, 또는 4가 분자)이다. 또 다른 실시양태에서, SDAB 분자는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적 분자이다. 분자가 "단일특이적" 또는 "다중특이적", 예를 들어, "이중특이적"인지 여부는 결합 폴리펩티드가 반응하는 상이한 에피토프의 개수를 지칭한다. 다중특이적 분자는 본원에 기술된 표적 폴리펩티드의 상이한 에피토프들에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 표적 폴리펩티드뿐만 아니라 이종성 에피토프, 예컨대 이종성 폴리펩티드 또는 고체 지지체 물질에 대해 특이적일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "결합가(valency)"는 SDAB 분자 내에 존재하는 잠재적인 결합 도메인, 예를 들어, 항원 결합 도메인의 개수를 지칭한다. 각각의 결합 도메인은 1개의 에피토프에 특이적으로 결합한다. SDAB 분자가 1개를 초과하는 결합 도메인을 포함하는 경우, 각각의 결합 도메인은 "2가 단일특이적"으로 칭해지는, 2개의 결합 도메인이 있는 항체에 대해서 동일한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 "2가 이중특이적"으로 칭해지는, 2개의 결합 도메인이 있는 SDAB 분자에 대해서 상이한 에피토프들에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한 SDAB 분자는 이중특이적이고 각각의 특이성에 대해 2가일 수 있다 ("이중특이적 4가 분자"로 칭해짐). 이중특이적 2가 분자, 및 이의 제조 방법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333; 및 미국 출원 공개 번호 2003/020734 및 2002/0155537에 기술되어 있고, 이들 모두의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 이중특이적 4가 분자, 및 이의 제조 방법이, 예를 들어, WO 02/096948 및 WO 00/44788에 기술되어 있고, 이들 모두의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 일반적으로, PCT 공개 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; [Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991)]; 미국 특허 번호 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; [Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)] 참조.
특정 실시양태에서, SDAB 분자는 상보적 가변 도메인 또는 면역글로불린 불변 영역, 예를 들어, Fc 영역이 없는, 하나 이상의 단일 도메인 분자 (예를 들어, 나노바디)를 포함하는 단일 사슬 융합 폴리펩티드이고, 이는 하나 이상의 표적 항원에 결합한다. 항원 결합 폴리펩티드가 인식하는 예시적인 표적 항원에는 종양 괴사 인자 α (TNFα)가 포함된다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단일 도메인 분자는 혈청 알부민 (인간 혈청 알부민 (HSA)) 또는 트랜스페린 중 하나 이상으로부터 선택된 혈청 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 단백질에 결합한다.
TNF α
종양 괴사 인자 알파는 염증성 장애 예컨대 류머티스성 관절염, 크론병, 궤양성 결장염 및 다발성 경화증과 관련되는 것으로 당업계에 공지되어 있다. TNFa 및 수용체 (CD120a 및 CD120b) 양쪽 모두 매우 상세하게 연구되어 있다. 생활성 형태의 TNFa는 삼량체이다. 항-TNFa 항체를 사용하여 TNFa의 작용을 길항하기 위한 여러 전략이 개발되었고, 레미케이드(Remicade)® 및 휴미라(Humira)®과 같이 현재 시판되고 있다. TNFa에 대한 항체 분자들이 공지되어 있다. TNFa-결합 단일 도메인 항원 결합 분자 (예를 들어, 나노바디)의 수많은 예가 WO 2004/041862, WO 2004/041865, WO 2006/122786에 개시되어 있고, 이들 모두의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 단일 도메인 항원 결합 분자의 추가적인 예가 US 2006/286066, US 2008/0260757, WO 06/003388, US 05/0271663, US 06/0106203에 개시되어 있고, 이들 모두의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 또 다른 실시양태에서, TNFa 및 혈청 단백질, 예를 들어, HSA에 대한 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 및 또 다른 다중특이적 단일 도메인 항체들이 이러한 참고문헌들에 개시되어 있다.
구체적인 실시양태에서, TNFα-결합 나노바디 분자는 WO 2006/122786에 개시된 나노바디들 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, TNFα-결합 나노바디 분자는 WO 2006/122786에 개시된 1가, 2가, 3가 TNFα-결합 나노바디 분자일 수 있다. 예시적인 TNFα-결합 나노바디에는 TNF1, TNF2, TNF3, 이들의 인간화 형태 (예를 들어, TNF29, TNF30, TNF31, TNF32, TNF33)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 1가 TNFα-결합 나노바디의 추가적인 예가 WO 2006/122786의 표 8에 개시되어 있다. 예시적인 2가 TNFα-결합 나노바디 분자에는 단일 융합 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 링커를 통해 연결된 2개의 TNF30 나노바디를 포함하는 TNF55 및 TNF56가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다 (WO 2006/122786에 개시되어 있음). 2가 TNFα-결합 나노바디 분자의 추가적인 예가 WO 2006/122786의 표 19에 TNF4, TNF5, TNF6, TNF7, TNF8로서 개시되어 있다.
또 다른 실시양태에서, HSA-결합 나노바디 분자는 WO 2006/122786에 개시된 나노바디들 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, HSA-결합 나노바디 분자는 WO 2006/122786에 개시된 1가, 2가, 3가 HSA-결합 나노바디 분자일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, HSA-결합 나노바디 분자는 HSA에 대한 결합 특이성들 중 하나 이상을 갖는 단일특이적 또는 다중특이적 분자일 수 있다. 예시적인 TNFα-결합 나노바디에는 WO 06/122786에 개시된 ALB1, 이의 인간화 형태 (예를 들어, ALB6, ALB7, ALB8, ALB9, ALB10)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
다른 실시양태에서, 나노바디 분자의 단일 도메인 분자들 중 2개 이상이, 연결 기와 함께 또는 연결 기 없이, 유전적 또는 폴리펩티드 융합물로서 융합된다. 연결 기는 당업자에게 명백한 임의의 연결 기일 수 있다. 예를 들어, 연결 기는 원자 1개 내지 100개 길이의 생체적합성 중합체일 수 있다. 한 실시양태에서, 연결 기는 폴리글리신, 폴리세린, 폴리라이신, 폴리글루타메이트, 폴리이소류신 또는 폴리아르기닌 잔기, 또는 이들의 조합물을 포함하거나, 이들로 구성된다. 예를 들어, 폴리글리신 또는 폴리세린 링커가 적어도 5개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 20개, 30개, 35개 및 40개의 글리신 및 세린 잔기를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 링커에는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 이를 초과하는 개수의 반복물의 Gly-Ser 반복물, 예를 들어, (Gly)4-Ser (서열 8) 반복물이 포함된다. 실시양태들에서, 링커의 서열이 하기와 같을 수 있다: (Gly)4-Ser-(Gly)3-Ser (서열 9) 또는 ((Gly)4-Ser)n (서열 10) [식중, n은 4, 5, 또는 6이다].
한 예시적인 실시양태에서, 본원에서 "ATN-103"으로 지칭되는, 표적 항원, 예를 들어, 종양 괴사 인자 알파 (TNFa)에 결합하는 2개의 단일 도메인 항체 분자 (예를 들어, 2개의 낙타류 가변 영역), 및 혈청 단백질, 예를 들어, HSA에 결합하는 1개의 단일 도메인 항체 분자 (예를 들어, 낙타류 가변 영역)의 단일 사슬 폴리펩티드 융합물로 구성된 항원 결합 폴리펩티드가 단백질 A 또는 이의 기능적 변이체에 결합하는 것으로 나타났다. ATN-103은 인간화된 3가의 이중특이적 TNFa-억제 융합 단백질이다. 이러한 단백질에 대한 항원은 종양 괴사 인자-알파 (TNF)이다. 도 29는 ATN-103의 예상 구조의 개략도를 제공한다. 이러한 융합 단백질은 낙타류로부터 유래되고, 인간 면역글로불린 VH 도메인에 대한 서열 및 구조적 상동성의 정도가 높다. 이의 단일 폴리펩티드 사슬은 TNFα에 대한 2개의 결합 도메인 및 인간 혈청 알부민 (HSA)에 대한 1개의 결합 도메인으로 구성되고, 이때 아미노산 9개의 G-S 링커 2개가 도메인들을 연결한다. ATN-103의 상세한 설명이 WO 06/122786에서 제공된다.
상응하는 발현 벡터의 DNA 서열로부터 예상된 ATN-103 폴리펩티드 사슬의 완전한 아미노산 서열이 도 30에서 제시된다 (잔기들은 서열 1의 잔기 번호 1로서의 NH2-말단에서 시작하여 번호가 매겨진다). DNA 서열에 의해 코딩되는 마지막 아미노산 잔기는 S363이고, 단백질의 COOH-말단을 구성한다. 디설피드-결합 ATN-103 (번역후 변형 없음)에 대한 예상 분자량은 38434.7 Da이다. ATN-103은 N-연결 글리코실화 컨센서스(consensus) 서열을 함유하지 않는다. 나노전기분무 이온화 사중극자 비행 시간 질량 분광법에 의해 우세한 이소형(isoform)에 대해 관찰된 분자량은 38433.9 Da에 상응하고, 이는 번역후 변형의 부재를 증명한다.
도 30에서, 상보성 결정 영역 (CDR)에 밑줄이 그어진다. 예상되는 분자내 디설피드 결합이 수반되는 시스테인 잔기들의 연결에 의해 표시된다. TNF에 대한 결합 도메인은 볼드체로 표시되고, HSA에 대한 결합 도메인은 이탤릭 볼드체로 표시된다. 이러한 결합 도메인들을 연결하는 아미노산 링커는 이탤릭체로 표시된다. 폴리펩티드 사슬에 대해 신호 펩티드 (-19MGW...VHS-1)가 또한 제시된다.
SDAB 분자의 제조
SDAB 분자는 재조합 분자, CDR-그래프트 분자, 인간화 분자, 낙타화 분자, 탈면역화 분자 및/또는 시험관 내에서 생성된 (예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 선별된) 분자인 하나 이상의 단일 도메인 분자 (예를 들어, 나노바디)로 구성될 수 있다. 항체 및 SDAB 분자를 생성시키고, 이들을 재조합적으로 변형시키기 위한 기술들이 당업계에 공지되어 있고, 하기에서 상세하게 기술된다.
당업자에게 공지된 수많은 방법이 항체를 수득하는데 이용가능하다. 예를 들어, 공지된 방법에 따른 하이브리도마의 생성에 의해 모노클로날 항체를 생산할 수 있다. 그후, 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마를 표준 방법, 예컨대 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 및 표면 플라즈몬 공명 (BIACORE™) 분석을 사용하여 스크리닝하여, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 나노바디를 생산하는 하나 이상의 하이브리도마를 확인한다. 임의 형태의 특정 항원, 예를 들어, 재조합 항원, 천연 발생 형태, 임의의 변이체 또는 이들의 단편, 뿐만 아니라 이들의 항원성 펩티드가 면역원으로서 사용될 수 있다.
항체 및 SDAB 분자를 제조하는 한 예시적인 방법은 단백질 발현 라이브러리, 예를 들어, 파지 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리의 스크리닝을 포함한다. 파지 디스플레이가, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,223,409 (래드너(Ladner) 등); [Smith (1985) Science 228:1315-1317]; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; 및 WO 90/02809에 기술되어 있다.
디스플레이 라이브러리의 사용에 더하여, 특정 항원을 사용하여 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스, 햄스터 또는 래트를 면역화시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 비-인간 동물은 인간 면역글로불린 유전자의 적어도 일부분을 포함한다. 예를 들어, 마우스 항체 생산이 결핍된 마우스 계통을 인간 Ig 유전자좌의 대형 단편으로 조작하는 것이 가능하다. 하이브리도마 기술을 사용하여, 원하는 특이성이 있는 유전자로부터 유래된 항원-특이적 모노클로날 항체를 생산 및 선택할 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)™, [Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21], US 2003-0070185, WO 96/34096 (1996년 10월 31일 공개), 및 PCT 출원 번호 PCT/US96/05928 (1996년 4월 29일 출원) 참조.
또 다른 실시양태에서, SDAB 분자가 비-인간 동물로부터 수득된 후, 변형되고, 예를 들어, 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 인간화, 탈면역화, 키메라 분자가 생산될 수 있다. 키메라 항체 및 SDAB 분자를 제조하기 위한 다양한 접근법들이 기술되어 있다. 예를 들어, [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985]; [Takeda et al., Nature 314:452, 1985], 미국 특허 번호 4,816,567 (캐빌리(Cabilly) 등); 미국 특허 번호 4,816,397 (보스(Boss) 등); 유럽 특허 공개 EP171496 (타나구치(Tanaguchi) 등); 유럽 특허 공개 0173494, 영국 특허 GB 2177096B 참조. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현하지만 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현할 수 없는 트랜스제닉(transgenic) 마우스를 사용하여, 인간화 항체 및 SDAB 분자를 또한 생산할 수 있다. 본원에 기술된 인간화 항체 및 SDAB 분자를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 CDR-그래프트 방법이 윈터(Winter)에 의해 기술되었다 (미국 특허 번호 5,225,539). 특정 인간 항체의 모든 CDR이 비-인간 CDR의 적어도 일부분으로 교체될 수 있거나, 또는 일부 CDR만 비-인간 CDR로 교체될 수 있다. 미리 결정된 항원에 대한 인간화 항체 및 SDAB 분자의 결합에 필요한 CDR의 개수를 교체하는 것만이 필요하다.
항원 결합에 직접적으로 수반되지 않는 Fv 가변 도메인의 서열을 인간 Fv 가변 도메인으로부터의 등가의 서열로 교체함으로써 인간화 항체가 생성될 수 있다. 인간화 항체 또는 이의 단편을 생성시키기 위한 예시적인 방법이 [Morrison (1985) Science 229:1202-1207]; [Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214]; 및 US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,205; 및 US 6,407,213에서 제공된다. 이러한 방법들은 중쇄 또는 경쇄 중 하나 이상으로부터 면역글로불린 Fv 가변 도메인 전체 또는 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 단리하고, 조작하고, 발현시키는 것을 포함한다. 상기 기술된 바와 같이 미리 결정된 표적에 대한 나노바디를 생산하는 하이브리도마로부터, 뿐만 아니라 또 다른 공급원으로부터 이같은 핵산을 수득할 수 있다. 그후, 인간화 SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자를 코딩하는 재조합 DNA를 적합한 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다.
특정 실시양태에서, 인간화 SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자가 보존적 치환, 컨센서스 서열 치환, 생식계열 치환 및/또는 역돌연변이의 도입에 의해 최적화된다. 이같은 변경된 면역글로불린 분자를 당업계에 공지된 여러 기술 (예를 들어, [Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983]; [Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983]; [Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982]) 중 임의의 기술에 의해 제조할 수 있고, PCT 공개 WO92/06193 또는 EP 0239400의 교시에 따라 제조할 수 있다.
SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자를 인간화시키는 기술이 WO 06/122786에 개시되어 있다.
인간 T 세포 에피토프의 특이적 결실 또는 WO 98/52976 및 WO 00/34317에 개시된 방법에 의한 "탈면역화"에 의해 SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자가 또한 변형될 수 있다. 간략하게, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인, 예를 들어, 나노바디의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 MHC 클래스 II에 결합하는 펩티드에 대해 분석할 수 있다; 이러한 펩티드들은 잠재적인 T-세포 에피토프를 나타낸다 (WO 98/52976 및 WO 00/34317에 개시된 바와 같음). WO 98/52976 및 WO 00/34317에 기술된 바와 같이, 잠재적인 T-세포 에피토프의 검출을 위해, "펩티드 쓰레딩(threading)"으로 칭해지는 컴퓨터 모델링 접근법을 적용할 수 있고, 또한 인간 MHC 클래스 II 결합 펩티드의 데이터베이스를 VH 및 VL 서열 내에 존재하는 모티프들에 대해 검색할 수 있다. 이러한 모티프들은 18개의 주요 MHC 클래스 II DR 동종이형 중 임의의 동종이형에 결합하고, 따라서 잠재적인 T 세포 에피토프를 구성한다. 검출된 잠재적인 T-세포 에피토프를 가변 도메인 내의 소수의 아미노산 잔기를 치환함으로써, 또는 바람직하게는 단일 아미노산 치환에 의해 제거할 수 있다. 전형적으로, 보존적 치환이 이루어진다. 종종, 배타적이지는 않지만, 인간 생식계열 항체 서열들 내의 한 위치에 공통적인 아미노산이 사용될 수 있다. 인간 생식계열 서열이, 예를 들어, [Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798]; [Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242]; [Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817]; 및 [Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638]에 개시되어 있다. V BASE 디렉토리가 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 종합적인 디렉토리를 제공한다 ([Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK]에 의해 구축됨). 이러한 서열들이, 예를 들어, 프레임워크 영역 및 CDR에 대해, 인간 서열의 출처로 사용될 수 있다. 예를 들어, U.S. 6,300,064에 기술된 바와 같이, 컨센서스 인간 프레임워크 영역이 또한 사용될 수 있다.
단백질을 생산하도록 유전자 조작된 살아 있는 숙주 세포에 의해 SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자를 생산할 수 있다. 단백질을 생산하도록 세포를 유전자 조작하는 방법이 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, [Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)] 참조. 이같은 방법은 단백질을 코딩하고 이의 발현을 허용하는 핵산을 살아 있는 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 이러한 숙주 세포는 배양물에서 성장된 박테리아 세포, 진균 세포, 또는, 바람직하게는, 동물 세포일 수 있다. 박테리아 숙주 세포에는 대장균 세포가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 적절한 대장균 균주의 예로는 HB101, DH5a, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, 및 외래 DNA를 절단하지 못하는 임의의 대장균 균주가 포함된다. 사용될 수 있는 진균 숙주 세포에는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 아스페르길루스(Aspergillus) 세포가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 사용될 수 있는 동물 세포의 몇몇 예는 CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, 및 WI38이다. 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 (예를 들어, 형질전환, 바이러스 감염 및/또는 선별에 의해) 새로운 동물 세포주가 확립될 수 있다. 임의적으로, 숙주 세포가 단백질을 배지 내로 분비할 수 있다.
변형된 SDAB 분자
본 발명의 제형은 프레임워크 영역들 중 하나 내의 1개 이상의 아미노산 위치에서 천연 발생 도메인, 예를 들어, VH 도메인의 아미노산 서열과 아미노산 서열이 상이한 SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자를 1개 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 SDAB 분자들, 예컨대 인간화 SDAB 분자들 중 일부의 아미노산 서열이 프레임워크 영역들 중 1개 이상 내의 1개 이상의 아미노산 위치에서 천연 발생 도메인, 예를 들어, 천연 발생 VHI-I 도메인의 아미노산 서열과 상이할 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명은 SDAB 분자의 유도체의 제형을 또한 포함한다. SDAB 분자 및/또는 본원에 개시된 SDAB 분자를 형성하는 아미노산 잔기들 중 하나 이상의 변형에 의해, 특히 화학적 및/또는 생물학적 (예를 들어, 효소에 의한) 변형에 의해 이같은 유도체를 일반적으로 수득할 수 있다.
이같은 변형의 예, 뿐만 아니라 이같은 방식으로 변형될 수 있는 SDAB 분자 서열 내의 아미노산 잔기 (즉, 단백질 골격 또는 측쇄 상의 잔기, 바람직하게는 측쇄 상의 잔기)의 예, 이같은 변형을 도입하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 기술, 및 이같은 변형의 잠재적인 용도 및 장점이 당업자에게 명백할 것이다.
예를 들어, 이같은 변형은 하나 이상의 관능기, 잔기 또는 모이어티, 특히 SDAB 분자에 하나 이상의 원하는 성질 또는 기능성을 부여하는 하나 이상의 관능기, 잔기 또는 모이어티를 SDAB 분자 내로 또는 분자 상에 (예를 들어, 공유결합 연결에 의해 또는 또 다른 적절한 방식으로) 도입하는 것을 수반할 수 있다. 이같은 관능기의 예는 당업자에게 명백할 것이다.
예를 들어, 이같은 변형은 SDAB 분자의 반감기, 용해도 및/또는 흡수를 증가시키고/시키거나, SDAB 분자의 면역원성 및/또는 독성을 감소시키고/시키거나, SDAB 분자의 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 약화시키고/시키거나, SDAB 분자에게 또 다른 유리한 성질을 부여하고/하거나 이의 원치 않는 성질을 감소시키거나, 또는 상기 중 2가지 이상이 임의로 조합된 하나 이상의 관능기를 (예를 들어, 공유결합 연결에 의해 또는 또 다른 적절한 방식으로) 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이같은 관능기 및 이를 도입하기 위한 기술의 예가 당업자에게 명백할 것이고, 이러한 예는 상기 본원에서 인용된 일반적인 배경 기술에서 언급된 모든 관능기 및 기술, 뿐만 아니라 제약 단백질의 변형, 특히 항체 또는 항체 단편 (ScFv 및 148-단일 도메인 항체 포함)의 변형에 대해 공지되어 있는 관능기 및 기술을 포함할 것이며, 이에 대해 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)]을 예를 들어 참조한다. 이같은 관능기는, 당업자에게 또한 명백할 바와 같이, 본 발명의 나노바디에 직접적으로 (예를 들어, 공유결합에 의해), 또는 임의적으로는 적절한 링커 또는 스페이서를 통해 연결될 수 있다.
제약 단백질의 반감기를 증가시키고/시키거나 면역원성을 감소시키기 위한 한 광범위하게 사용되는 기술은 적절한 약리학적으로 허용가능한 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜) (PEG) 또는 이의 유도체 (예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 mPEG)의 부착을 포함한다. 일반적으로, 임의의 적절한 형태의 PEG화, 예컨대 항체 및 항체 단편 ((단일) 도메인 항체 및 ScFv를 포함하지만 이에 한정되지 않음)에 대해 당업계에서 사용되는 PEG화를 사용할 수 있다; 예를 들어 [Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002)]; [Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003)], [Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003)] 및 WO 04/060965를 참조한다. 단백질의 PEG화를 위한 다양한 시약이, 예를 들어, <Nektar Therapeutics> (USA)로부터, 또한 시판된다.
바람직하게는, 특히 시스테인 잔기를 통해, 부위-지정 PEG화가 사용된다 (예를 들어 [Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)] 참조). 예를 들어, 이러한 목적을 위해, PEG가 SDAB 분자에서 천연적으로 발생하는 시스테인 잔기에 부착될 수 있거나, PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 적절하게 도입하도록 SDAB 분자가 변형될 수 있거나, 또는 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열이 본 발명의 나노바디의 N- 및/또는 C-말단에 융합될 수 있고, 이들 모두는 당업자에게 공지되어 있는 단백질 조작 기술을 사용한다.
바람직하게는, SDAB 분자에 대해, 분자량이 5000 초과, 예컨대 10,000 초과이고, 200,000 미만, 예컨대 100,000 미만; 예를 들어 20,000-80,000 범위인 PEG가 사용된다.
PEG화와 관련하여, 일반적으로, 본 발명이 하나 이상의 아미노산 위치에서 PEG화된 임의의 SDAB 분자를 또한 포함하고, 이때 바람직하게는 상기 PEG화가 (1) 생체내 반감기를 증가시키고/시키거나; (2) 면역원성을 감소시키고/시키거나; (3) PEG화에 대해 공지된 하나 이상의 추가적인 이로운 성질을 제공하고/하거나; (4) SDAB 분자의 친화력에 본질적으로 영향을 미치지 않고/않거나 (예를 들어, 적절한 분석법, 예컨대 하기 실시예에 기술된 것들에 의해 결정 시, 상기 친화력을 90％ 초과만큼, 바람직하게는 50％ 초과만큼, 10％ 초과만큼 감소시키지 않음); (4) SDAB 분자의 어떠한 또 다른 바람직한 성질에도 영향을 미치지 않는 방식으로 PEG화되었음을 주지하여야 한다. 적절한 PEG 기 및 이를 특이적으로 또는 비-특이적으로 부착시키는 방법이 당업자에게 명백할 것이다.
일반적으로 덜 선호되는 또 다른 변형에는 N-연결 또는 0-연결 글리코실화가 포함되고, 일반적으로 이는 SDAB 분자를 발현시키는데 사용되는 숙주 세포에 따라, 번역과 동시의 변형 및/또는 번역후 변형의 일부이다.
제형
SDAB 분자, 예를 들어, 나노바디 분자의 제형은 SDAB 분자, 동결보호제로서 작용할 수 있는 화합물, 및 완충제를 포함한다. 제형의 pH는 일반적으로 pH 5.5 - 7.0이다. 일부 실시양태에서, 액체로서 제형이 보관된다. 또 다른 실시양태에서, 제형이 액체로서 제조되고 나서, 예를 들어, 동결건조 또는 분무-건조에 의해 건조된 후, 보관된다. 건조 제형은 건조 화합물, 예를 들어, 에어로졸 또는 분말로서 사용될 수 있거나, 또는 예를 들어 물, 완충제 또는 기타 적합한 액체를 사용하여, 이를 원래의 농도 또는 또 다른 농도로 재구성시킬 수 있다.
동결 액체로서의 장기 보관에 적절하고, 이어서 동결-건조에 적절한 제형 (예를 들어, 히스티딘/수크로스 제형을 사용함) 내로의 SDAB 분자의 전달을 허용하도록 SDAB 분자 정제 공정이 디자인된다. 특정 농도의 단백질과 함께 제형이 동결건조된다. 그후, 원래의 제형 성분을 원하는 농도, 일반적으로는 동결건조 전의 농도와 비교하여 동일하거나 더 높은 농도로 재용해시키는 적절한 희석제 (예를 들어, 물)로 동결건조 제형이 필요에 따라 재구성될 수 있다.
원래 동결-건조된 액체의 부피와 비교하여 동결건조물에 첨가되는 물 또는 희석제의 양에 따라, 원래의 농도 (즉, 동결건조의 농도)와 농도가 상이한 제형이 생산되도록 동결건조 제형이 재구성될 수 있다. 적절한 제형을 항체 완전성의 하나 이상의 파라메터를 분석함으로써 확인할 수 있다. 분석되는 파라메터는 일반적으로 HMW 종의 백분율 또는 LMW 종의 백분율이다.
HMW 종 또는 LMW 종의 백분율은 제형 내의 전체 단백질 함량의 백분율로서 또는 시간에 따른 (즉, 보관 동안의) 백분율 증가에서의 변화로서 결정된다. 허용가능한 제형 내의 HMW 종의 전체 백분율은 적어도 1년 동안 -20℃ 내지 40℃ (예를 들어, -20℃ 내지 25℃, -20℃ 내지 15℃, 2℃ 내지 8℃, 약 2℃, 또는 약 25℃)에서 동결건조물 또는 액체로서 보관 후 10％ 이하의 HMW 종, 또는 적어도 1년 동안 -20℃ 내지 40℃에서 동결건조물 또는 액체로서 보관 후 약 10％ 이하의 LMW 종이다. "약"은 언급된 수치의 ±20％를 의미한다. 따라서, "약 20℃"는 16℃ 내지 24℃를 의미한다.
전형적으로, 안정성 프로파일은 냉동 제품에 대한 2℃ - 8℃, 및 실온 제품에 대한 25℃에서 10％ 미만의 HMW/LMW이다. 동결건조물로서 보관된 제형에서 HMW 종 또는 LMW 종은 동결건조물이 재구성된 후 분석된다. 40℃는, 예를 들어, 선적 동안의 제품 운송 동안 일어날 수 있는, 비-보관 조건에의 단기 노출에 대해 안정성을 테스트하고 안정성을 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 가속 조건이다.
분석된 파라메터가 HMW 종 또는 LMW 종에서의 백분율 변화인 경우, 보관 후의 하나의 종 또는 양쪽 모두의 종에서의 전체 단백질의 백분율을 보관 전 (예를 들어, 제형 제조 시)의 하나의 종 또는 양쪽 모두의 종에서의 전체 단백질 백분율과 비교한다. 백분율에서의 차이를 결정한다. 일반적으로, 약 18개월 내지 24개월 동안의 2℃ - 8℃ 또는 25℃에서의 보관 후 액체 제형 내의 HMW 종 또는 LMW 종에서의 단백질의 백분율 변화는 10％ 이하, 예를 들어, 약 8％ 이하, 약 7％ 이하, 약 6％ 이하, 약 5％ 이하, 약 4％ 이하, 또는 약 3％ 이하이다. "약"은 언급된 수치의 ±20％, 전형적으로는 소정의 값 또는 값들의 범위의 10％ 이내, 더욱 전형적으로 5％ 이내를 의미한다. 따라서, 약 10％는 8％ 내지 12％를 의미한다. 일반적으로, 동결건조 제품으로서 보관된 제형에는 -30℃ - 8℃ (예를 들어, 4℃, 또는 -20℃)에서의 약 6개월, 9개월, 10개월, 12개월, 15개월, 18개월 내지 24개월 동안의 보관 후, 재구성 후 또는 액체 제형에서, 약 5％ 미만, 약 4％ 미만, 약 3％ 미만, 약 2％ 미만 또는 약 1％ 미만의 HMW 종, 또는 약 5％ 미만, 약 4％ 미만, 약 3％ 미만, 약 2％ 미만 또는 약 1％ 미만의 LMW 종이 있다.
SDAB 분자 (예를 들어, TNF-결합 나노바디 분자)의 제형은, 예를 들어, 적어도 6개월, 9개월, 10개월, 12개월, 또는 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년 또는 적어도 5년 동안, 동결된 액체 제형 또는 동결건조물로서 보관될 수 있다. 한 예에서, TNF-결합 나노바디 분자 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 50 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, TNF-결합 나노바디 분자 제형은 20 mM 히스티딘, 7.5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 50 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 20 mM 히스티딘, 10％ 수크로스, 0.02％ 폴리소르베이트 80, 100 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 50 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 20 mM 히스티딘, 10％ 수크로스, 100 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 약 80 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 100 mM 아르기닌 (염기), 88 내지 100 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 5.8이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 55 mM NaCl, 88 내지 100 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.1이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 55 mM 아르기닌 HCl, 88 내지 100 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.1이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 100 mM 글리신, 88 내지 100 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 100 mM 메티오닌, 88 내지 100 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 8％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 88 내지 100 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 88 내지 100 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 20 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 118 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 20 mM 트리스, 5％ 수크로스, 117 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 7.2이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 약 80 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 약 50 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 한 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈(Tween)-80, 약 1 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 5.5이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 150 mM 아르기닌 HCl, 약 1 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 5.5이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 75 mM 염화나트륨, 약 1 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 5.5이다. 한 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 약 1 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 150 mM 아르기닌 HCl, 약 1 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디를 함유하고, pH가 6.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 75 mM 염화나트륨, 약 1 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다. 한 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 약 1 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.5이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 150 mM 아르기닌 HCl, 약 1 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.5이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 75 mM 염화나트륨, 약 1 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.5이다. 한 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 약 1 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 7.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 150 mM 아르기닌 HCl, 약 1 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 7.0이다. 또 다른 예에서, 제형은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 75 mM 염화나트륨, 약 1 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 7.0이다. 또 다른 예에서, TNF-결합 나노바디 분자 제형은 20 mM 히스티딘, 7.5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 250 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디 분자를 함유하고, pH가 6.0이다.
제형의 성분, 및 제형 내의 SDAB 분자, 예를 들어, TNF-결합 나노바디 분자의 완전성을 분석하는 방법의 추가적인 상세사항이 하기에서 제공된다.
제형 내의 SDAB 분자 농도는 일반적으로 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 350 ㎎/㎖ 사이, 예를 들어, 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 350 ㎎/㎖, 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 300 ㎎/㎖, 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 250 ㎎/㎖, 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 150 ㎎/㎖, 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 130 ㎎/㎖, 약 10 ㎎/㎖ 내지 약 130 ㎎/㎖, 약 50 ㎎/㎖ 내지 약 120 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖ 내지 약 120 ㎎/㎖, 약 88 ㎎/㎖ 내지 약 100 ㎎/㎖, 또는 약 10 ㎎/㎖, 약 25 ㎎/㎖, 약 50 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖, 약 100 ㎎/㎖, 약 130 ㎎/㎖, 약 150 ㎎/㎖, 약 200 ㎎/㎖, 약 250 ㎎/㎖ 또는 약 300 ㎎/㎖이다. 범위의 맥락에서, "약"은 이러한 범위의 낮은 수치의 -20％ 및 이러한 범위의 높은 수치의 +20％를 의미한다. 범위, 예를 들어, 약 10 ㎎/㎖ 내지 약 100 ㎎/㎖의 맥락에서, 이는 8 ㎎/㎖ 내지 120 ㎎/㎖을 의미한다. 일부 경우에, 제형 내의 SDAB 분자 농도는, 예를 들어, 0.1 ㎎/㎖ 내지 200 ㎎/㎖, 예를 들어, 0.5 ㎎/㎖ 내지 100 ㎎/㎖, 0.5 ㎎/㎖ 내지 1.0 ㎎/㎖, 0.5 ㎎/㎖ 내지 45 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖ 내지 40 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖ 내지 50 ㎎/㎖, 50 ㎎/㎖ 내지 100 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖ 내지 200 ㎎/㎖ 사이일 수 있다. 이같은 SDAB 분자 제형은 치료제로서 사용될 수 있다. 따라서, 제형 내의 SDAB 분자의 농도는 치료되는 대상체가 허용하고 투여 방법에 적합한 투여량을 제형 부피 내에 제공하는데 충분하다. 하나의 비-제한적인 예에서, 부피 한계 (예를 들어, 주사 당 약 1 ㎖ 내지 1.2 ㎖)가 작은 피하 투여로 높은 투여량을 공급하기 위해, SDAB 분자의 농도는 일반적으로 적어도 100 ㎎/㎖ 이상, 예를 들어, 100 ㎎/㎖ 내지 500 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖ 내지 250 ㎎/㎖, 또는 100 ㎎/㎖ 내지 150 ㎎/㎖이다. 예를 들어, 동결건조 제형을 적합한 부피의 희석제 (예를 들어, 주사용 무균수, 완충 염수)에서 재구성시킴으로써, 이같은 높은 농도가 달성될 수 있다. 일부 경우에, 재구성된 제형의 농도는 약 100 ㎎/㎖ 내지 300 ㎎/㎖ 사이 (예를 들어, 100 ㎎/㎖, 125 ㎎/㎖, 150 ㎎/㎖, 175 ㎎/㎖, 200 ㎎/㎖, 250 ㎎/㎖, 275 ㎎/㎖, 300 ㎎/㎖)이다. 높은 농도, 예를 들어, 250 ㎎/㎖까지의 농도가 SDAB 분자의 대형 제제의 장기 보관, 예를 들어, 동결 보관에 사용될 수 있다.
흡입을 통한 전달을 위해, 제한된 부피의 흡기용 에어로졸 내에 충분한 용량을 제공하도록 일반적으로 제형이 다소 농축된다 (예를 들어, 약 100 ㎎/㎖ 내지 500 ㎎/㎖ 사이). 일부 경우에, 낮은 농도 (예를 들어, 약 0.05 ㎎/㎖ 내지 1 ㎎/㎖ 사이)가 사용된다. 전달되는 투여량을 전달 방법, 예를 들어, 제트 연무기 또는 계량형 에어로졸에 맞게 개조하는 방법들이 당업계에 공지되어 있다.
완충제 및 동결보호제
본원에 기술된 바와 같은 제형의 pH는 일반적으로 pH 약 5.0 내지 약 7.0, 예를 들어, pH 약 5.5 내지 약 6.5, pH 약 5.5 내지 약 6.0, pH 약 6.0 내지 약 6.5, pH 5.5, pH 6.0, 또는 pH 6.5이다. 일반적으로, 용액을 pH 5.5 내지 6.5로 유지시킬 수 있는 완충제, 예를 들어, pKA가 약 6.0인 완충제가 제형을 제조하는데 사용된다. 적절한 완충제에는 히스티딘 완충제, TRIS, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES), 카코딜레이트, 포스페이트, 아세테이트, 숙시네이트 및 시트레이트가 비제한적으로 포함된다. 완충제의 농도는 약 4 mM 내지 약 60 mM 사이, 예를 들어, 약 5 mM 내지 약 25 mM이고, 예를 들어, 히스티딘은 일반적으로 60 mM 이하의 농도로 사용된다. 일부 경우에, 히스티딘 완충제는 약 5 mM, 약 10 mM 또는 약 20 mM의 농도로 사용된다. 또 다른 경우에서, 아세테이트 또는 숙시네이트 완충제가 약 5 mM 또는 약 10 mM의 농도로 사용된다.
동결보호제는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 수크로스, 트레할로스, 및 글리세롤이 이에 포함된다. 생물학적 시스템에서 낮은 독성을 나타내는 동결보호제가 일반적으로 사용된다. 동결보호제는 약 0.5％ 내지 15％, 약 0.5％ 내지 2％, 약 2％ 내지 5％, 약 5％ 내지 10％, 약 10％ 내지 15％, 및 약 5％ (중량/부피)의 농도로 제형에 포함된다.
TNF-결합 나노바디 제형에서 완충제로 사용될 수 있는 히스티딘 완충제가 동결보호제 성질을 지닐 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 히스티딘 완충제가 당, 예를 들어, 수크로스와 같은 동결보호제와 함께 사용된다. 본 발명의 제형은임의의 실질적인 양으로 히스티딘을 사용하는 것을 명확하게 배제할 수 있고, 예를 들어, 제형의 완충제 또는 동결보호제 성분이 히스티딘이 아니다.
일반적으로 제형의 점도는 제형의 투여 경로와 양립성인 점도이다. 일부 실시양태에서, 제형의 점도는 1 cP 내지 4 cP 사이, 예를 들어, 약 2 cP 내지 3.5 cP이다. 또 다른 실시양태에서, 제형의 점도는 약 5 cP 내지 약 40 cP 사이이다. 구체적인 실시양태에서, 제형의 점도는 약 1 cP, 2 cP, 2.4 cP 내지 2.8 cP, 3 cP, 3.1 cP 내지 3.2 cP, 4 cP, 5 cP, 10 cP, 15 cP, 20 cP, 25 cP, 30 cP, 35 cP, 또는 40 cP이다.
계면활성제
특정 실시양태에서, 계면활성제가 제형 내에 포함된다. 계면활성제의 예로는, 비-제한적으로, 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-65, 폴리소르베이트-80, 또는 폴리소르베이트-85); 트리톤(Triton)™; 소듐 도데실 설페이트 (SDS); 소듐 라우렐 설페이트; 소듐 옥실 글리코시드; 라우릴-설포베타인, 미리스틸-설포베타인, 리놀레일-설포베타인, 스테아릴-설포베타인, 라우릴-사르코신, 미리스틸-사르코신, 리놀레일-사르코신, 스테아릴-사르코신, 리놀레일-베타인, 미리스틸-베타인, 세틸-베타인, 라우로아미도프로필-베타인, 코카미도프로필-베타인, 리놀레아미도프로필-베타인, 미리스타미도프로필-베타인, 팔미도프로필-베타인, 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어 라우로아미도프로필), 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필- 디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 모나쿼트(Monaquat)™ 시리즈 (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 예를 들어, 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188)가 포함된다.
계면활성제의 첨가량은 HMW 종 또는 LMW 종의 SEC-HPLC를 예를 들어 사용하여 분석했을 때 재구성된 단백질의 응집을 허용가능한 수준으로 감소시키고, TNF-결합 나노바디 제형의 동결건조물의 재구성 후 입상물질의 형성을 최소화하는 양이다. 계면활성제의 첨가는 TNF-결합 항체의 동결건조 제형의 재구성 시간을 감소시키고 용액의 가스 제거를 돕는 것으로 또한 나타났다. 예를 들어, 계면활성제는 제형 (액체 제형 또는 동결건조 전의 제형) 내에 약 0.001％ 내지 0.6％, 예를 들어, 약 0.005％ 내지 0.05％, 약 0.005％ 내지 약 0.2％, 및 약 0.01％ 내지 0.2％의 양으로 존재할 수 있다.
제형에 대한 첨가물
무균성 용액 또는 무균성 동결건조물로서 제형이 보관된다. 하나 이상의 항균 및/또는 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등을 제형 내에 포함함으로써 제형 내의 미생물의 작용을 또한 방지할 수 있다. 일부 경우에, 정균수 (예를 들어, 0.9％ 벤질 알코올을 함유하는 물)로 동결건조물이 재구성된다. 제형 내에 보존제를 포함하는 것에 대한 고려사항들이 당업계에 공지되어 있고, 특정 제형 및 전달 방법과 양립성인 보존제를 확인하는 방법도 공지되어 있다 (예를 들어, [Gupta, et al. (2003), AAPS Pharm. Sci. 5:article 8, p. 1-9] 참조).
일부 경우에, 제형은 등장성이다. 일반적으로, 용액 삼투몰농도/등장성에 기여하는, 당업계에 공지된 임의의 성분이 제형에 첨가될 수 있다 (예를 들어, 염, 당, 폴리알코올, 또는 이들의 조합물). 등장성 농도의 기본 제형의 성분 (예컨대 수크로스)를 사용하여, 또는 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 또는 염 예컨대 염화나트륨과 같은 추가적인 성분을 첨가함으로써, 등장성이 일반적으로 달성된다.
일부 경우에, 예를 들어, 등장성을 달성하기 위해 또는 제형의 TNF-결합 나노바디의 완전성을 증가시키기 위해, TNF-결합 나노바디 제형에서 염이 사용된다. 사용하기에 적절한 염이 상기에 논의되어 있다. 염 농도는 0 mM 내지 약 300 mM일 수 있다.
특정 경우에서, 제형이 계면 분해를 감소시키기 위해 트윈 (예를 들어, 트윈® 20, 트윈® 80)과 함께 제형된다. 트윈 농도는 약 0.001％ 내지 약 0.05％일 수 있다. 한 예에서, 트윈 80이 0.01％의 농도로 제형에서 사용된다.
또 다른 특정 경우에서, 제형이 아르기닌과 함께 제조된다. 제형 내의 아르기닌 농도는 약 0.01％ 내지 약 5％일 수 있다. 한 예에서, 아르기닌이 제형에서 2％의 농도로 사용된다. 일부 경우에, 트윈 및 아르기닌 양쪽 모두가 본원에 기술된 TNF-결합 제형에 첨가된다.
또 다른 특정 경우에서, 제형이 소르비톨, 글리신, 메티오닌, 또는 염화나트륨 중 하나 이상과 함께 제조될 수 있다. 소르비톨이 제형에 포함되는 경우, 이는 약 1％ 내지 약 10％ 사이의 농도로 첨가될 수 있다. 한 예에서, 소르비톨이 5％의 농도로 제형에서 확인된다. 글리신이 제형에 포함되는 경우, 이는 약 0.1％ 내지 약 2％ 사이의 농도로 첨가될 수 있다. 한 예에서, 글리신이 1％의 농도로 제형에서 확인된다. 메티오닌이 제형에 포함되는 경우, 이는 약 5 mM 내지 약 150 mM 사이의 농도로 첨가될 수 있다. 한 예에서, 메티오닌이 100 mM의 농도로 제형에 첨가된다. 또 다른 예에서, 메티오닌이 약 10 mM, 약 20 mM 또는 약 70 mM의 농도로 제형에 첨가된다. 염화나트륨이 제형에 포함되는 경우, 이는 약 5 mM 내지 약 100 mM 사이의 농도로 첨가될 수 있다. 한 예에서, 염화나트륨이 55 mM의 농도로 제형에 첨가된다.
보관 및 제조 방법
동결
일부 경우에, 항체를 함유하는 제형이 보관을 위해 동결된다. 따라서, 제형이 동결-해동 사이클을 포함하는 이같은 조건 하에 비교적 안정적인 것이 바람직하다. 제형의 적절성을 결정하는 한 방법은 샘플 제형을 적어도 2회, 예를 들어, 3회, 4회, 5회, 8회, 10회 또는 이를 초과하는 횟수의 사이클의 동결 (예를 들어 -20℃ 또는 -80℃에서의 동결) 및 해동 (예를 들어, 37℃ 수조에서의 급속 해동 또는 2℃ - 8℃에서의 저속 해동)에 적용하고, 동결-해동 사이클 후에 축적되는 LMW 종 및/또는 HMW 종의 양을 결정하고, 이를 동결-해동 절차 전에 샘플 내에 존재하는 LMW 종 또는 HMW 종의 양과 비교하는 것이다. LMW 또는 HMW 종의 증가는 감소된 안전성을 지시한다.
동결건조
제형을 동결건조 후에 보관할 수 있다. 따라서, 동결건조 후 제형의 단백질 성분의 안정성에 대해 제형을 테스트하는 것이 제형의 적절성을 결정하는데 유용하다. 이러한 방법은 동결에 대해 상기 기술된 것과 유사하고, 단 샘플 제형을 동결 대신 동결건조시키고, 이의 원래 부피로 재구성시키고, LMW 종 및/또는 HMW 종의 존재에 대해 테스트한다. 동결건조된 샘플 제형을 상응하는 동결건조되지 않은 샘플 제형과 비교한다. 상응하는 샘플과 비교하여 동결건조된 샘플에서의 LMW 또는 HMW 종의 증가는 동결건조된 샘플에서의 감소된 안전성을 지시한다.
일반적으로, 동결건조 프로토콜은 샘플을 동결건조기 내로 로딩하는 단계, 예비 냉각 기간, 동결, 진공 개시, 1차 건조 온도로의 램핑(ramping), 1차 건조, 2차 건조 온도로의 램핑, 2차 건조, 및 샘플 막기(stoppering)를 포함한다. 동결건조 프로토콜에 대해 선택될 수 있는 추가적인 파라메터에는 진공 (예를 들어, 마이크로미터 단위) 및 응축기 온도가 포함된다. 온도에 대한 적절한 램핑 속도는 약 0.1℃/분 내지 2℃/분 사이, 예를 들어 0.1℃/분 내지 1.0℃/분, 0.1℃/분 내지 0.5℃/분, 0.2℃/분 내지 0.5℃/분, 0.1℃/분, 0.2℃/분, 0.3℃/분, 0.4℃/분, 0.5℃/분, 0.6℃/분, 0.7℃/분, 0.8℃/분, 0.9℃/분, 및 1.0℃/분이다. 동결건조 사이클을 위한 동결 동안 적절한 선반(shelf) 온도는 일반적으로 약 -55℃ 내지 -5℃, -25℃ 내지 -5℃, -20℃ 내지 -5℃, -15℃ 내지 -5℃, -10℃ 내지 -5℃, -10℃, -11℃, -12℃, -13℃, -14℃, -15℃, -16℃, -17℃, -18℃, -19℃, -20℃, -21℃, -22℃, -23℃, -24℃, 또는 -25℃이다. 선반 온도는 1차 건조와 2차 건조에 대해 상이할 수 있고, 예를 들어, 1차 건조가 2차 건조보다 낮은 온도에서 수행될 수 있다. 비-제한적인 예에서, 1차 건조는 0℃에서, 2차 건조는 25℃에서 실행될 수 있다.
일부 경우에, 어닐링(annealing) 프로토콜이 동결 동안, 그리고 진공 개시 전에 사용된다. 이같은 경우에, 어닐링 시간이 선택되어야 하고, 온도는 일반적으로 조성물의 유리 전이 온도보다 높다. 일반적으로, 어닐링 시간은 약 2시간 내지 15시간, 약 3시간 내지 12시간, 약 2시간 내지 10시간, 약 3시간 내지 5시간, 약 3시간 내지 4시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 5시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 또는 약 15시간이다. 어닐링 온도는 일반적으로 약 -35℃ 내지 약 -5℃, 예를 들어 약 -25℃ 내지 약 -8℃, 약 -20℃ 내지 약 -10℃, 약 -25℃, 약 -20℃, 약 -15℃, 약 0℃, 또는 약 -5℃이다. 일부 경우에, 어닐링 온도는 일반적으로 -35℃ 내지 0℃, 예를 들어 -25℃ 내지 -8℃, -20℃ 내지 -10℃, -25℃, -20℃, -15℃, 0℃이다.
본원에 기술된 제형의 안전성을 -25℃ 내지 30℃의 1차 건조 선반 온도, 및 0℃ 내지 30℃에서의 2시간 내지 9시간 기간의 2차 건조 기간이 포함되는 다양한 동결건조 파라메터를 사용하여 테스트할 수 있다.
하나의 비-제한적인 예에서, 단백질 농도가 50 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디인 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, pH 6.0의 제형을 대량으로 제형하고 동결건조시켰다. 동결건조 후, 제품을 100 ㎎/㎖의 단백질이 전달되도록 충전 부피의 약 절반으로 재구성시킨다. TNF 항체는 극단적인 제품 온도에 대해 동결건조 후 완건한 것으로 실연되었다. 4주 동안 50℃에서 보관했을 때의 안전성 프로파일이 다양한 동결-건조 사이클을 사용하여 제조된 물질에 대해 동일하였고 (예를 들어, 도 16-20 참조), 이러한 사이클들 중 일부는 1차 건조 동안의 제품 온도에서의 차이가 거의 10℃였다 (예를 들어, 도 13). 일반적으로, 동결건조 사이클을 10시간 내지 100시간, 예를 들어, 20시간 내지 80시간, 30시간 내지 60시간, 40시간 내지 60시간, 45시간 내지 50시간, 50시간 내지 65시간 동안 실행할 수 있다.
항체 제형의 보관을 위한 온도 범위의 비-제한적인 예는 약 -20℃ 내지 약 50℃, 예를 들어, 약 -15℃ 내지 약 30℃, 약 -15℃ 내지 약 20℃, 약 5℃ 내지 약 25℃, 약 5℃ 내지 약 20℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 2℃ 내지 약 12℃, 약 2℃ 내지 약 10℃, 약 2℃ 내지 약 8℃, 약 2℃ 내지 약 6℃, 또는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 10℃, 15℃, 25℃, 또는 30℃이다. 보관 온도에도 불구하고, 특정 경우에서, 이같은 조성물에 대해 예상될 수 있는 보관 및 운송 조건 동안 일시적으로 일어날 수 있는 온도 변화 하에 제형이 안정적이다.
분무-건조
일부 경우에, 제형이 분무-건조된 후, 보관된다. 분무-건조는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행되고, 액체 또는 동결 분무 건조를 사용하도록 변형될 수 있다 (예를 들어, <Niro Inc.> (Madison, WI), <Upperton Particle Technologies> (Nottingham, England), 또는 <Buchi> (Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY), 또는 미국 특허 공개 번호 20030072718 및 20030082276으로부터의 방법과 같은 방법들을 사용함).
SDAB 분자 완전성의 결정
LMW 종 및 HMW 종의 축적은 항체 안전성의 유용한 척도이다. 제형 내의 LMW 또는 HMW의 축적은 제형의 일부분으로서 보관된 단백질의 불안정성의 지표이다. 크기 배제 크로마토그래피 + HPLC가 LMW 및 HMW 종의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다. 이같은 측정을 위한 적절한 시스템, 예를 들어, HPLC 시스템 (Waters, Milford, MA)이 당업계에 공지되어 있다. 당업계에 공지된 또 다른 시스템, 예를 들어, SDS-PAGE (HMW 및 LMW 종을 모니터링하기 위한 목적), 항체 활성의 바이오어세이, 효소-결합 면역흡착 분석법, 정제된 표적 단백질 (예를 들어, TNFα)에 결합하는 능력, 및 양이온 교환-HPLC (CEX- HPLC; 변이체를 검출하고 표면 전하를 모니터링하기 위한 목적)를 사용하여 제형 내의 항체의 완전성을 평가할 수 있다. 한 예에서, 바이오어세이는 TNFα-의존적 활성의 억제를 여러 농도의 제형된 나노바디 분자의 존재 하에 시험하여 생물학적 활성을 실연하는 세포-기반 분석법이다.
제조품
본 출원은 본원에 기술된 바와 같은 제형을 포함하고 제형의 사용 설명서를 제공하는 제조품을 또한 제공한다.
예를 들어 약품으로서 대상체에게 투여하기 위해 사용되는 제형은 무균성이어야 한다. 이는 액체의 제형 또는 동결건조 및 재구성 전 또는 후에, 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 무균성 여과막을 통한 여과에 의해 달성된다. 별법적으로, 구조를 손상시키지 않을 경우에, 제형의 성분이 오토클레이빙(autoclaving)에 의해 멸균된 후, 필터 또는 방사선조사 살균 성분과 조합됨으로써 제형이 생산될 수 있다.
피하 또는 멀티챔버(multichamber) 주사기가 포함되는 주사기와 같은 경피 전달 기구로 제약 제형이 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 기구는 부착형 또는 통합형 바늘이 있는 사전충전 주사기이다. 또 다른 실시양태에서, 기구는 바늘이 부착되어 있지 않은 사전충전 주사기이다. 바늘이 사전충전 주사기와 함께 포장될 수 있다. 한 실시양태에서, 기구는 자가-주입 기구, 예를 들어, 자가-주입 주사기이다. 또 다른 실시양태에서, 주입 기구는 펜-주입기이다. 또 다른 실시양태에서, 주사기는 스테이크형(staked) 바늘 주사기, 루어 락(luer lock) 주사기, 또는 루어 슬립(luer slip) 주사기이다. 또 다른 적절한 전달 기구에는 스텐트, 카테터, 미세바늘, 및 이식형(implantable) 제어 방출 기구가 포함된다. 인-라인(in-line) 필터가 있는 또는 이러한 필터가 없는, IV 튜빙이 예를 들어 포함되는 표준 IV 장치로 조성물이 정맥내로 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 주사기가 자가주입기 기구와 함께 사용하기에 적절하다. 예를 들어, 자가주입기 기구에는 단일 바이알 시스템, 예컨대 용액의 전달을 위한 펜-주입기 기구가 포함된다. 예를 들어, <Becton Dickensen> (Franklin Lakes, N.J.), <Ypsomed> (Burgdorf, Switzerland, www.ypsomed.com); <Bioject> (Portland, Oreg.), <National Medical Products>, <Weston Medical> (Peterborough, UK), <Medi-Ject Corp> (Minneapolis, Minn.), 및 <Zogenix, Inc> (Emeryville, CA)가 제조 또는 개발한, BD 펜(Pen), BD 오토젝터(Autojector)®, 휴매젝트(Humaject)®, 노보펜(NovoPen)®, B-D®펜(Pen), 오토펜(AutoPen)®, 및 옵티펜(OptiPen)®, 제노트로핀펜(GenotropinPen)®, 제노트로놈 펜(Genotronorm Pen)®, 휴매트로 펜(Humatro Pen)®, 레코-펜(Reco-Pen)®, 로페론 펜(Roferon Pen)®, 바이오젝터(Biojector)®, 아이젝트(Iject)®, J-팁 니들-프리 인젝터(J-tip Needle-Free Injector)®, 도스프로(DosePro)®, 메디-젝트(Medi-Ject)®와 같은 기구들이 제조사들로부터 시판된다. 이중 바이알 시스템을 포함하는 승인된 기구에는 HumatroPen®과 같은 재구성된 용액의 전달을 위한 카트리지 내의 동결건조된 약물의 재구성을 위한 펜-주입기 시스템이 포함된다.
제조품은 제형을 함유하는데 적절한 용기를 포함할 수 있다. 적절한 용기에는, 비-제한적으로, 기구, 병, 바이알, 주사기, 시험관, 연무기 (예를 들어, 초음파 또는 진동 메시(vibrating mesh) 연무기), 정맥내 용액 백, 또는 흡입기 (예를 들어, 계량 용량 흡입기 (MDI) 또는 건식 분말 흡입기 (DPI))가 포함된다. 용기는 임의의 적절한 물질 예컨대 유리, 금속, 또는 폴리카르보네이트, 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌과 같은 플라스틱으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 용기 (예를 들어, 주사기 또는 바이알)는 유리, 플라스틱, 고리형 올리펜 공중합체, 또는 고리형 올레핀 중합체로 형성될 수 있다. 임의적으로, 용기 (예를 들어, 주사기 또는 바이알)에 마개, 예를 들어, 고무 마개가 있다. 본 발명의 제형을 보관하기 위한 용기의 특정 예로는 (i) 고무 마개가 있는 유리 바이알 내의 액체; (ii) 고무 플런저가 있는 사전충전형(prefillable) 유리 주사기 내의 액체; 및 (iii) 고무 플런저가 있는 사전충전형 중합체성 주사기, 예를 들어, 고리형 올레핀 공중합체 (COC), 또는 고리형 올레핀 중합체 (COP) 내의 액체가 포함된다.
일반적으로, 용기는 제형으로부터 유의한 양의 단백질을 흡착하지 않고 제형 내의 성분과 반응성이지 않은 물질로 제조된 용기이다.
일부 실시양태에서, 용기는 마개, 예를 들어, 웨스트(West) 4432/50 1319 실리콘화 회색 마개 또는 웨스터 4023 듀라플루오르(Durafluor) 마개가 있는 투명한 유리 바이알이다. 일부 실시양태에서, 용기는 주사기이다. 구체적인 실시양태에서, 제형은 사전충전 주사기 내에 100 ㎎/㎖의 TNF-결합 나노바디, 20 mM 히스티딘, 7.5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트-80, pH 6.0을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제형은 사전충전형 고리형 올레핀 주사기 및 웨스트 4432/50 실리콘화 회색 고무 플런저 내에 약 10 ㎎/㎖, 약 100 ㎎/㎖의 TNF-결합 나노바디, 20 mM 히스티딘, 7.5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트-80, pH 6을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제형은 사전충전형 유리 주사기 및 웨스트 4432/50 실리콘화 회색 고무 플런저 또는 웨스트 4023/50 다이쿄 플루오로텍(Daikyo Flourotec)/B2 코팅 고무 플런저 내에 약 10 ㎎/㎖, 약 50 ㎎/㎖, 약 100 ㎎/㎖의 TNF-결합 나노바디, 20 mM 히스티딘, 7.5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트-80, pH 6을 포함한다.
본원에 기술된 제조품은 포장재를 추가로 포함할 수 있다. 포장재는, 사용 또는 투여를 위한 정보에 더하여, 제품이 사용될 수 있는 상태에 관하여 규제 기관이 요구하는 정보를 예를 들어 제공한다. 예를 들어, 포장재는 본원에 기술된 제형을 함유하는 사전충전 주사기를 주입하는 방법 또는 특정 기간 내에, 예를 들어, 2-24시간 또는 그 초과의 기간에 걸쳐 용액을 형성하도록 동결건조 제형을 수성 희석제에서 재구성시키는 방법에 관하여 환자에게 지침을 제공할 수 있다. 본 발명에서 청구된 제형은 인간 제약 제품 용도에 유용하다.
특정 실시양태에서, 제형이 연무제로서 투여될 수 있다. 비-제한적인 예에서, 연무제의 예로는 제트 연무제, 초음파 연무제, 및 진동 메시 연무기기 포함된다. 이러한 부류들은 상이한 방법을 사용하여 액체로부터 에어로졸을 생성시킨다. 일반적으로, 이러한 제형 내의 단백질의 완전성을 유지시킬 수 있는 임의의 에어로졸-생성 기구가 본원에 기술된 바와 같은 제형의 전달에 적절하다.
또 다른 실시양태에서, 의학 기구로 제약 조성물이 투여될 수 있다. 예를 들어, 무침 피하 주사 기구, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, 또는 4,596,556에 개시된 기구로 제약 조성물이 투여될 수 있다. 주지된 이식물 및 모듈의 예로는 제어된 속도로 의약을 분배하기 위한 이식형 미세주입 펌프가 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 기구가 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프가 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,447,233; 연속적인 약물 전달을 위한 이식형 가변성 유량 주입 장치가 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,447,224; 멀티챔버 구획이 있는 삼투성 약물 전달 시스템이 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투성 약물 전달 시스템이 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,475,196이 포함된다. 또한 치료 조성물은 피하 또는 근육내 투여를 위한 생체분해성 또는 비-생체분해성 지속 방출 제형의 형태일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 3,773,919 및 4,767,628, 및 PCT 출원 번호 WO 94/15587 참조. 이식형 펌프 또는 외부 펌프를 사용하여 연속 투여가 또한 달성될 수 있다. 투여는 간헐적으로, 예를 들어, 1일 1회 주사로, 또는 저용량으로 연속적으로, 예를 들어, 지속 방출 제형으로 또한 수행될 수 있다. SDAB 분자의 투여에 최적으로 적절하도록 전달 기구가 변형될 수 있다. 예를 들어, SDAB 분자의 보관 및 전달에 최적인 정도로 주사기가 실리콘화될 수 있다. 물론, 다수의 또 다른 이같은 이식물, 전달 시스템, 및 모듈이 또한 공지되어 있다. 본 발명은 제1 작용제 및 제2 작용제를 투여하기 위한 기구를 또한 특색으로 한다. 이러한 기구는, 예를 들어, 제약 제제들을 보관하기 위한 하나 이상의 하우징(housing)을 포함할 수 있고, 단위 용량의 제1 작용제 및 제2 작용제를 전달하도록 형상화될 수 있다. 제1 작용제 및 제2 작용제는 동일한 구획 또는 별도의 구획 내에 보관될 수 있다. 예를 들어, 기구에서 투여 전에 작용제들이 조합될 수 있다. 상이한 기구를 사용하여 제1 작용제와 제2 작용제를 투여하는 것이 또한 가능하다.
투여 및 치료 방법
본 발명의 제형은 TNFα 관련 장애, 예를 들어, 염증성 또는 자가면역 장애를 치료 또는 예방하기 위해 (예를 들어, 이와 관련된 하나 이상의 증상을 감소 또는 완화시키기 위해) 단독으로 또는 제2 작용제, 예를 들어, 제2의 치료적으로 또는 약리학적으로 활성인 작용제와 함께 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에게 투여될 수 있다. 용어 "치료하기"는 통계학적으로 유의한 정도로 또는 당업자가 검출가능한 정도로, 장애와 관련된 상태, 증상 또는 파라메터를 개선하는데 또는 장애의 진행을 방지하는데 효과적인 양, 방식 및/또는 양식으로 치료법을 투여하는 것을 지칭한다. 효과적인 양, 방식 또는 양식은 대상체에 따라 변할 수 있고, 대상체에 맞춰질 수 있다.
치료될 수 있는 면역 장애의 비-제한적인 예로는 자가면역 장애, 예를 들어, 관절염 (류머티스성 관절염, 소아 류머티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 루푸스-관련 관절염 또는 강직성 척추염 포함), 피부경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 혈관염, 다발성 경화증, 자가면역 갑상선염, 피부염 (아토피 피부염 및 습진 피부염 포함), 중증 근무력증, 염증성 장 질환 (IBD), 크론병, 결장염, 진성 당뇨병 (제I형); 예를 들어 피부의 염증성 상태 (예를 들어, 건선); 급성 염증성 상태 (예를 들어, 내독소혈증, 패혈증, 독성 쇼크 증후군 및 감염성 질환); 이식 거부 및 알러지가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, TNFα 관련 장애는 관절염성 장애, 예를 들어, 류머티스성 관절염, 소아 류머티스성 관절염 (RA) (예를 들어, 중등도 내지 중증 류머티스성 관절염), 골관절염, 건선성 관절염, 또는 강직성 척추염, 다관절형 소아 특발성 관절염 (JIA) 중 하나 이상으로부터 선택된 장애; 또는 건선, 궤양성 결장염, 크론병, 염증성 장 질환, 및/또는 다발성 경화증이다.
특정 실시양태에서, 제형은 제2 치료제를 포함한다. 예를 들어, TNF-나노바디에 대해, 제2 작용제는 항-TNF 항체 또는 이의 TNF 결합 단편일 수 있고, 이때 제2 TNF 항체는 제형의 TNF-결합 SDAB 분자와 에피토프 특이성이 상이하다. TNF-결합 SDAB와 함께 공동-제형될 수 있는 작용제의 또 다른 비-제한적인 예로는, 예를 들어, 시토카인 억제제, 성장 인자 억제제, 면역억제제, 항염증제, 대사 억제제, 효소 억제제, 세포독성제, 및 세포증식억제제가 포함된다. 한 실시양태에서, 추가적인 작용제는 비-스테로이드성 항염증제 (NSAID); 프레드니솔론, 프레드니손, 코르티손 및 트리암시놀론이 포함되는 코르티코스테로이드; 및 질환 변형 항-류머티스성 약물 (DMARD), 예컨대 메토트렉세이트, 히드록시클로로퀸 (Plaquenil) 및 설파살라진, 레플루노미드 (Arava®), 이태너셉트 (Enbrel®), 인플릭시맵 (Remicade®) (메토트렉세이트와 함께 또는 메토트렉세이트 없이) 및 아달리무맵 (Humira®)이 포함되는 종양 괴사 인자 억제제, 항-CD20 항체 (예를 들어, Rituxan®), 가용성 인터류킨-1 수용체, 예컨대 아나킨라 (Kineret), 금, 미노사이클린 (Minocin®), 페니실라민, 및 아자티오프린, 시클로포스파미드 및 시클로스포린이 포함되는 세포독성제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 관절염에 대한 표준 치료제이다. 이같은 조합 요법은 투여되는 치료제들을 더 낮은 투여량으로 유리하게 사용할 수 있고, 따라서 다양한 단독요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
본 발명의 제형은 액체 용액 (예를 들어, 주사용 및 주입용 용액)의 형태일 수 있다. 이같은 조성물은 비경구 방식 (예를 들어, 피하, 복강내 또는 근육내 주사)에 의해 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여"라는 구절은 일반적으로 주사에 의한, 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 피하 또는 근육내 투여, 뿐만 아니라 정맥내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 제형은 피하 투여된다.
제약 제형은 무균성이고, 제조 및 보관 조건 하에 안정적이다. 투여를 위한 규제 기준 및 산업 기준을 충족시키는지를 확실히 하기 위해 제약 조성물을 또한 테스트할 수 있다.
제약 제형은 용액, 마이크로에멀션, 분산액, 리포솜, 또는 높은 단백질 농도에 적절한 기타 고급 구조물로서 제형될 수 있다. 필요한 양의 본원에 기술된 작용제를 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 적합한 용매 내에 혼입시킨 후 여과 살균시킴으로써 무균성 주사용 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 본원에 기술된 작용제를 기본적인 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 또 다른 성분을 함유하는 무균성 비히클 내로 혼입시킴으로서 분산액이 제조된다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 용액의 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다. 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함함으로써 주사용 조성물의 장기 흡수가 초래될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제형을 기술하는 파라메터, 예를 들어, 제품 표지 상에 나타날 수 있는 파라메터가 특성화된다. 이같은 파라메터에는, 예를 들어, 색 (전형적으로, 무색 내지 담황색, 또는 무색 내지 황색), 투명도 (전형적으로, 투명 내지 약간 유백색 또는 투명 내지 유백색), 및 점도 (전형적으로, 주위 온도, 예컨대 20℃-30℃에서 측정 시 약 1 내지 5 cP 사이)가 포함된다. 당업계에 공지된 방법에 의해 이같은 파라메터들을 측정할 수 있다. 예를 들어, 시판되는 유백색 표준물 (예를 들어, <Hach Company> (Loveland, CO 80539)로부터 입수가능)을 사용하여 투명도를 측정할 수 있다.
실시예
하기의 실시예들에 의해 본 발명이 추가로 설명된다. 이러한 실시예들은 설명의 목적을 위해서만 제공된다. 이는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주 또는 내용을 제한하는 것으로 구성되지 않아야 한다.
실시예 1: ATN -103의 고농도 동결건조 제형의 안정성 (6개월 기간)
치료 용도에 예를 들어 사용될 항체를 보관하는 한 방법은 동결건조에 의해 제조된 건조 분말로서 보관한 것이다. 따라서, 동결건조된 TNF-결합 제형의 장기 안정성을 연구하였다.
간략하게, 인간화된 TNF-결합 나노바디 (50 ㎎/㎖), 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스 (중량/부피), 0.01％ 폴리소르베이트 80, pH 6.0을 함유하는 제형을 멸균 여과에 의해 제조하고, 5 ㎖의 발열원-제거 유리 튜빙 바이알에 분배한 후, 동결건조시켰다. 제형을 4℃, 25℃ 또는 40℃에서 1개월, 3개월 및 6개월 동안 보관한 후, 무균수 (USP)에서 재구성시켜, 제형이 100 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디, 20 mM 히스티딘, 10％ 수크로스, 0.02％ 폴리소르베이트 80, pH 6.0이도록 재구성된 제형을 생성시켰다.
고농도 액체의 안정성을 생물학적 활성, 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합, SE-HPLC에 의한 HMW의 백분율 및 LMW의 백분율, SDS-CE에 의한 TNF-결합 나노바디의 백분율 및 비-생성물 불순물의 백분율, 및 TNF-결합 나노바디 기준 표준물에 대한 상대적인 체류 시간 및 용출 프로파일의 필적성의 CEX-HPLC 평가에 의해 평가하였다.
동결건조된 TNF-결합 나노바디 제형을 WO 2006/122786에 개시된 분석법을 사용하여 생물학적 활성에 대해 분석하였다. 도 1은 이같은 바이오어세이 세트로부터의 데이터를 도해한다. 데이터는 유닛/㎎으로서 표현되었다. 샘플은 보관 전에 약 5 - 5.5 × 106 U/㎎이었고, 인큐베이션 후 약 4.5 - 5.5 × 106 U/㎎이었다. 전체적으로, 어떠한 샘플에서도 6개월 보관 후 생활성 양이 실질적으로 변화되지 않았다. 따라서, 생물학적 활성에 의해 결정 시, 제형이 적어도 6개월 동안 동결건조 제형의 보관에 적절하였다.
동결건조된 TNF-결합 나노바디 제형을 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합 활성에 대해 또한 분석하였다. 도 2는 이같은 결합 분석법 세트로부터의 데이터를 도해한다. 제형의 초기 결합 활성은 기준 샘플의 약 100％였고, 6개월의 테스트 기간에 걸쳐 어떠한 샘플에 대해서도 실질적으로 변하지 않았다. 따라서, HSA 결합 활성에 의해 결정 시, 제형이 적어도 6개월 동안 동결건조 제형의 보관에 적절하였다.
HMW 종의 백분율을 SE-HPLC를 사용하여 분석하였다. 동결건조 및 재구성 전의 제형 내의 HMW 종의 백분율은 제형 내의 전체 단백질의 약 0.1％였고, 4℃ 및 25℃에서 보관된 모든 샘플에서 또한 약 0.1％ - 0.2％ 사이였다 (도 3). 40℃에서의 6개월 보관 후, 제형의 HMW 종이 약 0.35％였다 (도 3). 따라서, 4℃ 및 25℃에서 6개월 동안 보관된 샘플에서 HMW 종의 수준이 실질적으로 증가되지 않았다.
LMW 종의 백분율을 SE-HPLC를 사용하여 분석하였다. 제형 내의 LMW 종의 백분율은 6개월까지 4℃, 25℃ 및 40℃의 온도에서 검출 한계 (즉 0.0％) 미만이었다.
TNF-결합 나노바디의 백분율을 SDS-CE를 사용하여 분석하였다. 제형 내의 TNF-결합 나노바디의 초기 백분율은 약 100％였고, 6개월의 테스트 기간에 걸쳐 어떠한 샘플에 대해서도 실질적으로 변하지 않았다 (도 4).
비-생성물 불순물의 백분율을 SDS-CE를 사용하여 분석하였다. 6개월까지 4℃, 25℃ 및 40℃의 온도에서 제형에 대해 SDS-CE에 의해 무시할만한 비-생성물 불순물이 관찰되었다.
동결건조된 TNF-결합 나노바디 제형을 CEX-HPLC를 사용하여 신원에 대해 또한 테스트하였다. 제형에 대한 용출 프로파일이 6개월까지 4℃, 25℃ 및 40℃의 온도에서 기준 표준물에 필적하였다. 지정된 피크의 상대적인 체류 시간이 6개월까지 4℃, 25℃ 및 40℃의 온도에서 1.00 표준에서 변하지 않았다.
동결건조된 TNF-결합 나노바디 제형에 대한 재구성 성질에 대한 폴리소르베이트-80의 첨가 효과를 또한 테스트하였다. 동결건조된 제품에의 폴리소르베이트 80 첨가는 하기 표에서 볼 수 있는 바와 같이 동결건조된 분말의 외관 및 용해를 개선함으로써 제품의 품질을 개선하였다.
<표 1>
Figure pat00001
본원에 기술된 데이터는 다양한 온도에서의 보관 시간의 함수로서 분해 생성물에서의 한정된 변화를 나타낸다.
실시예 2: 동결건조에 대한 TNF -결합 나노바디 제형의 완건성
표적 동결건조 사이클 (실시예 1)을 적용함으로써 동결건조된 제형에 더하여, 2가지 추가적인 "완건성" 동결건조 사이클을 동일한 제형에 적용함으로써 약물 제품의 2개의 추가적인 로트를 제조하였다. 2가지 "완건성" 동결건조 사이클은 제조 환경에서 일어날 수 있는 유의한 공정 편차를 모방한다. 표적 (대조군) 동결건조 사이클 연구와 동일한 약물 제품 제형이 완건성 연구에서 사용되었다: 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 50 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디, pH 6.0. 재구성 시 (동결건조 전의 충전된 제품의 부피의 대략적으로 절반인 재구성 희석제 부피를 사용함), ATN-103 제형은 하기와 같았다: 20 mM 히스티딘, 10％ 수크로스, 0.02％ 폴리소르베이트 80, 100 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디, pH 6.0.
유의한 공정 편차를 모방하는 2가지 완건성 동결건조 사이클은 "고습" 및 "공격적"으로 명명되었다. 도 5는 완건성 동결건조 사이클에 적용된 제형이 표적 (대조군) 사이클의 안정성에 필적하는 안정성을 나타낸다는 것을 실연한다. 동결건조 완건성 제형 바이알을 가속화된 안정성에 대조군 동결건조 사이클과 나란히 놓고 , SE-HPLC에 의해 분석하였다.
이러한 데이터는 ATN-103 동결건조 제형이 제품에 대한 영향 없이 유의한 공정 편차에 대해 완건하다는 것을 실연한다.
대조군 및 완건성 동결건조 사이클에 적용된 제형에 대한 LMW 종의 백분율을 SE-HPLC를 사용하여 분석하였다. 동결건조된 TNF-결합 나노바디에 대한 SE-HPLC에 의한 LMW 종의 백분율은 3가지 사이클 모두에 대해 t0에서 및 50℃에서 1개월까지 검출 한계 (즉 0.0％) 미만이었다
동결건조 관례
모든 실행에서, 문 앞의 알루미늄 호일 차폐물 및 63 mm의 선반 높이를 사용하여 동결건조기 내의 복사를 최소화하였다. 모든 실행에서, 1개의 트레이가 동결건조기 상의 일관된 로드를 유지하도록 전적으로 충전되었다. 마개를 오토클레이빙하고, 모든 단백질 바이알에 대해 건조하였다. 단백질 샘플에 대한 모든 바이알을 탈이온수로 헹구고, 발열원을 제거하였다. 나머지 트레이를 충전하도록 사용된 바이알 및 마개는 처리되지 않았다.
TNF-결합 나노바디 제형이 시딩된 바이알을 생물안전(biosafety) 캐비넷에서 160 ㎎/바이알의 표적으로 무균적으로 제조하였다. 안정성 연구를 위한 바이알에 각각의 실행 전의 3.2 ㎖의 신선한 제형 (미리 동결건조되지 않은 물질)을 충전하였다. 동결건조 동안, 추가적인 바이알에 표적 동결건조 사이클과 양립성인 적절한 완충제를 충전하여 동결건조기 상의 일정한 로드를 유지하였다. 단백질 어레이 내의 열전대를 사용하여 동결건조를 모니터링하였다.
변형 시차 주사 열량계 ( mDSC )
mDSC에 대한 모든 샘플을 0.5℃의 진폭 및 100초의 기간으로 변형 모드에서 실행시켰다. 동결건조 후 분말에 대해, 샘플을 2℃/분으로 150℃로 가열하였다. 모든 분말 샘플을 질소-퍼징(purged) 글러브 박스를 사용하여 제조하였다. 액체 샘플에 대해, 모든 온도 램프(ramp)를 0.5℃/분으로 수행하였고, 온도를 동결건조 사이클에서 사용되는 온도에 매칭시켰다. 최종 가열 램프를 2℃/분으로 수행하여, 유리 전이를 확대시켰다. 실험 벤치에서 액체 샘플을 제조하였다.
수분 분석
동결건조된 샘플 내의 수분을 칼 피셔(Karl Fischer) 적정을 사용하여 분석하였다. 동결건조된 샘플을 3 ㎖ 메탄올로 재구성시켰다.
500 ㎕의 이중 또는 삼중 주입을 수행하였다. 1％ 물 표준물을 사용 후 적절성 점검물로서 주입하였다.
푸리에 변환 적외선 분광법 ( FTIR )
FTIR로 건조 분말 상태의 항체의 2차 구조를 측정하였다. 300 mg KBr 내에 분산된, 제형된 건조 단백질 약 1 ㎎을 함유하는 펠렛을 가압하고, 200회 스캐닝하였다. 데이터 수집 후, 분석은 수크로스 플라시보의 스펙트럼 차감, 기준선 수정, 스무딩(smoothing), 2차 미분, 및 면적 표준화를 수반하였다.
안정성
제형 내의 동결건조된 항체의 안정성을 보관 시간 및 온도의 함수로서 평가하였다. 동결건조된 TNF-결합 나노바디의 샘플을 동결건조 후에 2℃ - 8℃에서의 4주 보관 및 50℃에서의 2주 및 4주 보관 후 분석하였다. 냉장된 샘플은 대형(walk-in) 냉장 저온실에서 보관하였다. 고온 샘플은 50℃로 설정된 <Lab Line Imperial Incubator> 세트에서 보관하였다. 적합한 시점에, 샘플을 저장소에서 제거하고, 실온으로 가온 또는 냉각되도록 한 후 분석하였다.
재구성 및 시각적인 외관
동결건조후 분석 및 보관 안정성 분석 양쪽 모두로부터의 동결건조 제형의 바이알을 1.3 ㎖의 주사용 무균수로의 재구성 전, 동안 및 후에 시각적으로 검사하였다. 바이알을 케이크 색, 완전성, 수분, 입상물질, 및 재구성 전의 결함에 대해 라이트 박스에서 흑색 및 백색 양쪽 모두의 배경에 대해 검사하였다. 동결건조된 케이크를 시각적으로 검사한 후, 캡 및 크림프 씰(crimp seal)을 크림프제거기(de-crimper)를 사용하여 제거하였다. 마개를 제거하고, 주사용 무균수를 적합한 피펫을 사용하여 바이알 내로 천천히 분배하였다. 소용돌이 운동을 사용하여 케이크가 충분히 습윤화되도록 확실히 하면서 희석제를 분배하였다. 희석제가 완전히 분배되면, 표준 실험실 타이머로 재구성 시점이 시작되었고, 바이알을 다시 막았다. 최종 고체 조각이 용해되었을 때 재구성이 완료되었다. 손 사이에서 바이알을 굴려 재구성을 촉진하였다. 동결건조된 케이크가 재구성 과정 중에 있을 때, 용해 용액의 상태 예컨대 투명도, 거품형성, 및 발포에 관한 관찰을 기록하였다. 재구성이 완료되면, 재구성 시간을 기록하고, 생성된 용액이 침강될 수 있고 재구성 동안 형성된 대부분의 거품이 사라질 수 있도록 바이알을 수분 동안 벤치 상에 놓아 두었다. 그후, 재구성된 용액을 색, 투명도 및 입상물질에 대해 라이트 박스에서 흑색 및 백색 양쪽 모두의 배경에 대해 검사하였다.
고성능 크기 배제 크로마토그래피 ( SEC - HPLC )
TNF-결합 나노바디 제형의 순수한 샘플 2 ㎕를 G3000swxl 칼럼 + 가드 칼럼 (TosoHaas Part # 08541 & 08543) 상에 주입하였다. 이동상은 250 mM 염화나트륨이 첨가된 포스페이트 완충 염수 (PBS)였다. 유속은 0.75 ㎖/분이었고, 러닝(running) 시간은 30분이었다. 자외선 흡광도를 280 nm의 파장에서 모니터링하였다. 워터스 엠파워(Waters Empower)™ 소프트웨어를 사용하여 고분자량 종 및 저분자량 종으로부터 주요 TNF-결합 나노바디 피크를 분리하기 위해 크로마토그램을 통합하였다.
농도 결정을 위한 자외선-가시광선 흡광도 분광법 (A 280 )
100 ㎎/㎖ 농도의 항체가 있는 제형의 샘플을 10 ㎕의 샘플을 1990 ㎕ 및 3990 ㎕의 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, pH 6.0에 각각 첨가함으로써 약 0.5 ㎎/㎖ 및 0.25 ㎎/㎖로 희석하였다. 생성된 용액 200 ㎕를 완충제 블랭크(blank)와 함께 96웰 마이크로플레이트 내의 개별적인 웰 내에 놓았다. 플레이트를 280 nm 및 320 nm의 파장에서 자외선 흡광도에 대해 스펙트라맥스® 플러스(Spectramax® Plus) 플레이트 판독기에서 판독하였다. 320 nm 흡광도를 280 nm 흡광도에서 차감하고, 흡광 계수 (1.405 ㎖/㎎-cm)로 나누고, 경로 길이 (1 cm)를 곱하여, 각각의 웰 내의 용액의 단백질 농도를 결정하였다. 적합한 희석 인자를 적용하였고, 평균 단백질 농도를 결정하였다.
광 산란을 위한 자외선-가시광선 흡광도 분광법 (A 420 )
분석할 각각의 TNF-결합 나노바디 샘플 200 ㎕를 96웰 마이크로플레이트 상의 개별적인 웰 내로 분취하였다. 완충제 블랭크가 대조군으로서 작용하였다. 플레이트를 420 nm의 파장에서 가시광선 흡광도에 대해 스펙트라맥스 플러스 플레이트 판독기에서 판독하였다.
사이클 개발 전략
일련의 순차적인 단계들 (하기 기술됨)을 사용하여 동결건조 사이클을 개발하였다.
임계 제품 온도 확인
TNF-결합 나노바디에 대한 임계 제품 온도를 변형 시자 주사 열량계 (mDSC)에 의해 확인하였다. 이러한 방법은 동결된 제품의 유리 전이 온도를 확인하는데 사용된다 (mDSC). 1차 건조 동안 이러한 온도 미만으로 제품을 유지하는 동결건조 사이클에서 무손상 케이크 구조가 산출되어야 한다. 적절한 최저 온도는 -25℃인 것으로 가정되었고, 따라서 이러한 온도가 본원에 기술된 바와 같은 항체의 동결건조를 위한 제형 및 방법을 개발할 때 조건 및 제형을 테스트하기 위해 디자인된 절차에 일반적으로 포함된다.
동결건조 사이클 실행
상기 기술된 연구로부터의 결과를 기초로, 3가지 상이한 동결건조 사이클을 수행하여, 보관에 적절한 동결건조 제형을 제조하기 위한 적절한 동결건조 절차 또는 기타 절차를 개발하는데 있어서 3가지 관심 파라메터를 시험하였다. 시험된 첫번째 파라메터는 기존의 안정성 연구로부터의 사이클을 반복하는 대조군 사이클이었다. 모든 기존의 개발적인 안정성 사이클이 이러한 사이클을 사용하였고, 따라서 이는 이러한 분석을 위한 출발점으로서 작용하였다.
테스트된 두번째 파라메터는 잔류 수분 함량이 높은 동결건조 케이크를 생성시키기 위해 2차 건조 단계를 수행하지 않는 것의 효과였다. 이러한 동결건조 사이클은 높은 잔류 수분 함량에 대한 TNF-결합 나노바디 제형의 민감성의 평가로서 작용하고, 정식 동결건조 완건성 연구의 실행 이전의 초기 임상 로트들 동안의 제조 편차의 평가에서 사용될 수 있다.
테스트된 세번째 파라메터는 공격적 사이클이었다. 1차 건조 온도를 대조군 사이클 설정점보다 유의하게 높게 증가시키는 것은 1차 건조 동안 TNF-결합 나노바디 제형 제품 온도를 유의하게 증가시킬 수 있다. 이러한 동결건조 사이클은 동결건조 동안의 제품 온도에 대한 TNF-결합 나노바디 제형의 민감성의 평가로서 작용할 수 있고, 정식 동결건조 완건성 연구의 실행 이전의 초기 임상 로트들 동안의 제조 편차의 평가에서 사용될 수 있다.
동결건조 사이클의 평가
TNF-결합 나노바디 제형에 대한 선택된 동결건조 사이클의 평가를 2가지 측면으로 분할하였다: 동결건조 후 수행된 테스트를 기초로 하는 즉각적인 비교, 및 가속화된 조건 하에서의 인큐베이션 후 잠재적인 가능한 장기 영향.
임계 제품 온도 확인
TNF-결합 나노바디 제형 제품은 거의 50％의 단백질을 함유하였다. 따라서, 단백질이 동결 및 동결건조 상태의 물리적 상태를 좌우할 것으로 예상되었다. 동결건조 전에, 준-주위(sub-ambient) 변형 시차 주사 열량계 (mDSC)로 제형의 동결-농축 무정형 상의 유리 전이 온도를 검색하였다. 공격적 동결건조 개발 사이클로부터의 데이터를 기초로, -12℃의 제품 온도가 동결건조 동안 이보다 낮게 유지되어야 하는 임계 온도로서 선택되었다.
실시예 3: TNF -결합 나노바디의 고농도 액체 제형의 안정성 (6개월 기간)
일부 경우에, TNF-결합 나노바디 제형을 액체 양식으로 보관하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 비교적 높은 농도의 TNF-결합 나노바디를 함유하는 액체 TNF-결합 제형의 장기 안정성을 연구하였다. 간략하게, 인간화된 TNF-결합 나노바디 (약 80 ㎎/㎖), 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, pH 6.0을 함유하는 제형을 발열원이 제거된 스테인레스 스틸 용기에서 제형을 멸균 여과함으로써 보관용으로 제조하였다. 제형을 약 3개월 및 6개월 동안 -20℃ 또는 4℃에서 보관하였다. 고농도 액체의 안정성을 생물학적 활성, 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합, SE-HPLC에 의한 HMW의 백분율 및 LMW의 백분율, SDS-CE에 의한 ATN-103의 백분율 및 비-생성물 불순물의 백분율, 및 TNF-결합 나노바디 기준 표준물에 대한 상대적인 체류 시간 및 용출 프로파일의 필적성의 CEX-HPLC 평가에 의해 평가하였다.
생물학적 활성 분석법이 고농도 액체 TNF-결합 나노바디 제형에 대한 안정성 파라메터로서 사용되었다. 실시예 1에서 상기 기술된 바와 같이 분석법을 수행하였다. 샘플을 -20℃ 및 4℃에서 약 3개월 및 6개월 동안 보관하였다. 데이터는 유닛/㎎으로 표현되었다 (도 6). 샘플은 보관 전에 약 6 × 106 U/㎎이었고, 인큐베이션 후 약 4.5 - 5 × 106 U/㎎이었다. 이는 보관 동안 샘플의 생활성에서 실질적인 변화가 없음을 반영한다. 값의 변동성은 분석법에 고유한 변동성을 반영한다. 샘플에서 생물학적 활성의 양이 감소하지 않았기 때문에, 이러한 데이터는 TNF-결합의 보관에 대한 제형의 적절성에 대한 추가적인 지지를 제공한다.
또 다른 안정성 파라메터를 고농도 액체 TNF-결합 나노바디 제형을 사용하여 시험하였다: 결합 활성의 안정성. 이러한 실험에서, 제형의 결합 활성의 백분율을 6개월 동안 -20℃ 및 4℃에서의 보관 후 대조군과 비교하여 결정하였다. 이러한 분석법은 인간 혈청 알부민 (HSA)에 대한 TNF-결합의 결합 친화력을 특이적으로 모니터링하였다. 제형의 초기 결합 활성은 기준 샘플의 약 100％였고, 6개월 테스트 기간에 걸쳐 어떠한 샘플에 대해서도 실질적으로 변하지 않았다 (도 7). 측정된 결합 활성은 기준물의 약 110％ 이하였고, 이는, 이러한 분석법에서 일반적으로 관찰되는 오차를 고려하여, 샘플의 결합 활성에서의 실질적인 변화가 없음을 반영하며, 결합 결과에서 온도-관련 경향이 없었다.
HMW 종의 백분율을 SEC-HPLC를 사용하여 분석하였다. 보관 전의 고농도 액체 제형 내의 고분자량 종의 백분율은 제형 내의 전체 단백질의 0.1％ - 0.15％ 사이였고, 6개월 보관까지 -20℃에서 보관된 샘플에서는 약 0.1％, 4℃에서 보관된 샘플에서는 약 0.2％였다 (도 8). 따라서, 적어도 6개월 동안 -20℃ 및 4℃에서 보관된 샘플에서 HMW 종의 수준이 실질적으로 증가되지 않았다.
고농도 액체 TNF-결합 나노바디 제형 내의 LMW 종의 백분율을 TNF-결합 나노바디 액체 제형에서 또한 분석하였다. 6개월까지 제형 내의 LMW 종의 백분율은 -20℃의 온도에서 검출 한계 (즉, 0.0％) 미만이었고, 4℃에서 보관된 샘플에서는 약 0.1％였다 (도 9). 따라서, 적어도 6개월 동안 -20℃ 및 4℃에서 보관된 샘플에서 LMW 종의 수준이 실질적으로 증가되지 않았다.
LMW 종의 백분율을 SE-HPLC를 사용하여 분석하였다. 고농도 액체 제형 내의 LMW 종의 백분율은 6개월까지 4℃, 25℃ 및 40℃의 온도에서 검출 한계 (즉, 0.0％) 미만이었다.
TNF-결합 나노바디의 백분율을 SDS-CE를 사용하여 분석하였다. 고농도 액체 제형 내의 TNF-결합 나노바디의 초기 백분율은 약 100％였고, 6개월 테스트 기간에 걸쳐 어떠한 샘플에 대해서도 실질적으로 변하지 않았다 (도 10).
비-생성물 불순물의 백분율을 SDS-CE를 사용하여 분석하였다. 6개월까지 -20℃ 및 4℃의 온도에서 액체 고농도 TNF-결합 나노바디 제형에 대해 무시할만한 비-생성물 불순물이 SDS-CE에 의해 관찰되었다.
고농도 액체 제형을 CEX-HPLC를 사용하여 신원에 대해 또한 테스트하였다. CEX-HPLC가 신원 테스트로서 사용된다. 고농도 액체 제형의 TNF-결합에 대한 용출 프로파일이 6개월까지 -20℃ 및 4℃의 온도에서 기준 표준물에 필적하였다. 지정된 피크의 상대적인 체류 시간이 6개월까지 -20℃ 및 4℃의 온도에서 1.00 표준에서 변하지 않았다.
본원에 기술된 데이터는 다양한 온도에서의 보관 시간의 함수로서 분해 생성물에서의 한정된 변화를 나타낸다.
실시예 4: 액체 사전충전 주사기 내의 TNF -결합 나노바디의 고농도 액체 제형의 안정성 (12개월 기간)
하기의 제형으로 사전충전 주사기 내로 충전된 TNF-결합 나노바디 고농도 액체의 안정성을 SE-HPLC에 의한 HMW의 백분율 및 LMW의 백분율 및 CEX-HPLC에 의한 산성 종 및 염기성 종의 백분율, 및 TNF-결합 나노바디 기준 표준물에 대한 상대적인 체류 시간 및 용출 프로파일의 필적성의 평가에 의해 평가하였다: 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, 약 80 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디, pH 6.0. 제형을 4℃에서 12개월, 25℃에서 3개월, 및 40℃에서 2개월 동안 보관하였다.
초기 시점에, 약 0.7％ HMW 종이 있었다. 4℃에서 12개월 후, 약 0.8％ HMW 종으로의 최소 증가가 있었다. 25℃에서 3개월 후, HMW 종이 약 1.8％로 증가하였다. 40℃에서 2개월 후, HMW 종이 경시적으로 약 27％로 증가하였다 (도 11).
초기 시점에, 약 0.1％ LMW 종이 있었다. 4℃에서 12개월 후, 0.25％ LMW 종으로의 최소 증가가 있었다. 25℃에서 3개월 후, 약 0.5％ LMW로의 약간의 증가가 있었다. 40℃에서 2개월 후, 경시적으로 약 1.4％ LMW 종으로 분해가 증가되었다 (도 12).
초기 시점에, 약 6％ 산성 종이 있었다. 4℃에서 12개월 후, 약 7.5％ 산성 종이 있었다. 25℃에서 3개월 후, 약 7.3％ 산성 종이 있었고, 이때 경시적으로 산성 종이 증가하였다. 40℃에서 2개월 후, 산성 종이 경시적으로 약 8.3％로 증가하였다 (도 13).
초기 시점에, 약 1.7％ 염기성 종이 있었다. 4℃에서 12개월 후, 약 2.9％ 염기성 종이 있었다. 25℃에서 3개월 후, 약 2.9％ 염기성 종이 있었고, 이때 경시적으로 염기성 종이 증가하였다. 40℃에서 2개월 후, 염기성 종이 경시적으로 약 27％로 증가하였다 (도 14).
모든 샘플의 상대적인 체류 시간 및 용출 프로파일이 TNF-결합 나노바디 기준 표준물에 필적하였다.
데이터는 4℃ 및 25℃에서의 보관 시간의 함수로서 분해 생성물에서의 한정된 변화를 나타내고, 이는 제형이 사전충전 주사기 내의 액체로서 적절하다는 것을 가리킨다. 액체에 대한 스트레스 조건인 40℃에서 분해 생성물에서의 약간의 눈에 띄는 변화가 관찰되었다.
실시예 5: ATN -103 고농도 액체의 안정성 - 또 다른 제형 (또 다른 안정화 및 탈안정화 부형제의 확인)
TNF-결합 나노바디 액체 제형에 대한 가능한 부형제를 스크리닝하기 위해, 또 다른 고농도 TNF-결합 나노바디 액체 제형들의 안정성을 시험하였다. 추가적인 안정성을 제공하고 제형을 등장성이게 만들도록 (인간 대상체에서의 주사에 적절함), 다양한 부형제를 사용하여 보충 작업을 수행하였다. TNF-결합 나노바디 농도는 88 ㎎/㎖ 내지 100 ㎎/㎖ 범위였다.
시험된 제형은 하기와 같았다:
1. 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트-80, 100 mM 아르기닌 (베이스), pH 5.8
2. 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트-80, 55 mM NaCl, pH 6.1
3. 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트-80, 55 mM 아르기닌 HCl, pH 6.1
4. 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트-80, 100 mM 글리신, pH 6.0
5. 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트-80, 100 mM 메티오닌, pH 6.0
6. 10 mM 히스티딘, 8％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트-80, pH 6.0
CTL: 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트-80, pH 6.0
초기 용액 성질을 pH, 삼투몰농도, 농도, 혼탁도 및 점도에 대해 분석하였다. 모든 제형에서 등장성 용액이 초래되었고, A455 측정을 통한 허용가능한 투명도 및 낮은 점도 (2.4 cP 내지 3.1 cP)를 나타냈으며, 이는 사전충전 주사기 및 자가-주입기 실행가능성을 나타낸다.
<표 2>
Figure pat00002
고농도 액체의 안정성을 SE-HPLC에 의한 HMW의 백분율 및 LMW의 백분율에 의해 평가하였다. 이러한 물질들을 3개월 동안 5℃, 25℃ 및 40℃에서 안정성을 평가하였다. 40℃, 2주로부터의 데이터가 도 15에서 제시된다.
액체에 대한 스트레스 조건인 40℃에서 분해 생성물에서의 약간의 눈에 띄는 변화가 관찰되었다. 간략한 가속화된 안정성 (40℃에서 2주)은 제형 4, 5 및 6이 대조군 (10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트-80, pH 6.0)과 비교하여 필적하는 또는 개선된 안정성을 제공함을 나타냈다. 제형 1, 2 및 3은 안정성에서 대한 영향이 음성인 것으로 나타났다.
데이터는 글리신, 메티오닌, 및 증가된 수크로스가 고농도 TNF-결합 나노바디 액체 제형을 안정화시킴을 나타낸다. 데이터는 아르기닌 베이스, 아르기닌 히드로클로라이드 및 염화나트륨이 일부 조건 하에 고농도 TNF-결합 나노바디 액체 제형을 탈안정화시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 6: 고농도 액체 제형, 단기 (2주 기간), 히스티딘 및 트리스 완충제의 TNF-결합 나노바디의 안정성
액체로서의 TNF-결합 나노바디의 안정성이 하기의 도면 16-19에서 예시된다. 2개의 제형을 시험하였다: 20 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, pH 6.0 내의 118 ㎎/㎖의 ATN-103; 및 20 mM 트리스, 5％ 수크로스, pH 7.2 내의 117 ㎎/㎖의 ATN-103. 제형의 안정성을 SE-HPLC에 의한 HMW의 백분율 및 LMW의 백분율, 및 CEX-HPLC에 의한 산성 종의 백분율 및 염기성 종의 백분율에 의해 평가하였다. 데이터는 4℃에서의 보관 시간의 함수로서 분해 생성물에서의 한정된 변화를 나타낸다. 액체에 대한 스트레스 조건인 40℃에서 분해 생성물에서의 약간의 눈에 띄는 변화가 관찰되었다. 데이터는 히스티딘 및 트리스 완충제 내의 TNF-결합 나노바디의 안정성이 이러한 제형 조건들 하에 본질적으로 유사하고, 히스티딘이 약간 더 유리하게 수행된다는 것을 나타낸다 (약간 더 적은 LMW). 상승된 pH (7 이상)는 더 큰 정도의 LMW 형성을 초래한다는 것이 제형전(pre-formulation) 활성에서 나중에 결정될 것이고, 이는 하기 관찰된 장점을 설명한다.
실시예 7: TNF -결합 나노바디의 고농도 액체 제형의 안정성: 계면 스트레스의 평가 (동결/해동)
도 20-23은 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, pH 6.0 내의 약 80 ㎎/㎖의 액체 TNF-결합 나노바디 제형의 안정성을 도해한다. 평가는 -80℃ 및 37℃로부터의 다중 동결-해동 사이클링 후의 크기 배제-HPLC, 혼탁도, 및 농도 평가를 기초로 하였다.
데이터는 -80℃ 및 37℃로부터의 다중 동결-해동 사이클링의 함수로서의 안정성에서의 한정된 변화를 나타낸다.
실시예 8: TNF -결합 나노바디의 고농도 액체 제형의 안정성: 제조 공정 중에 잠재적으로 마주치는 단기 열 스트레스의 평가
도 24는 액체 TNF-결합 나노바디가 약물 물질 및 약물 제품 제조 공정 동안 잠재적으로 마주칠 수 있는 단기 열 스트레스에 대해 완건하다는 것을 나타낸다. 고농도 액체를 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80, pH 6.0에서 약 80 ㎎/㎖ 및 50 ㎎/㎖로 연구하였다. 평가는 40℃에서 8시간 동안, 25℃에서 7일 동안, 및 5℃에서 29일 동안의 노출 후의 크기 배제-HPLC에 의한 HMW의 백분율 및 LMW의 백분율을 기초로 하였다. 데이터는 5℃ 및 25℃에서의 보관 시간의 함수로서의 응집물에서의 한정된 변화를 나타낸다. 액체에 대한 스트레스 조건인 40℃에서 응집물에서의 약간의 변화가 관찰되었다.
*TNF-결합 나노바디 고농도 액체에 대한 SE-HPLC에 의한 LMW 종의 백분율은 지시된 온도 및 기간에서 검출 한계 (즉, 0.0％) 미만이었다.
실시예 9: ATN -103의 저농도 액체 제형의 안정성: 최적 pH 및 제형의 평가
도 25-28은 pH 5.5, 6.0, 6.5, 및 7.0으로 완충된 저농도 (약 1 ㎎/㎖)의 액체 TNF-결합 나노바디 제형의 안정성을 나타낸다. 스트레스 예컨대 40℃ 온도에 대한 노출 (도 25 및 26), 진탕 (도 28), 및 동결/해동에 응답하여, 저농도 액체 TNF-결합 나노바디의 안정성을 제형 및 pH의 함수로서 시험하였다. 4가지 pH를 하기의 3가지 제형 각각에 대해 평가하였다: 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80; 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 150 mM 아르기닌 HCl; 및 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 75 mM 염화나트륨. 이러한 데이터 세트에서, 트윈-80은 폴리소르베이트-80에 대한 동의어로서 사용된다. 연구 샘플을 SE-HPLC 및 UV를 사용하여 평가하였다 (농도 및 혼탁도 양쪽에 대해 - A455에 의해 측정).
도면 코드:
HST: 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80
HSTA: 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 150 mM 아르기닌 HCl
HSTS: 10 mM 히스티딘, 5％ 수크로스, 0.01％ 트윈-80, 75 mM 염화나트륨
결과는 5.5 - 7.0의 pH 범위가 제형에 적절하다는 것을 나타낸다. 데이터는 일부 조건 하에, pH 7.0이 약간의 불리한 효과 (저분자량 종 증가)를 나타낼 수 있음을 나타낸다. 데이터는 아르기닌 HCl 또는 염화나트륨을 약물 물질 제형에 첨가하는 것에 유의한 이점이 없고, 일부 경우에는 제형을 불안정화시킬 수 있음을 나타낸다.
도 27은 4℃에서의 보관 후 TNF-결합 나노바디에 대한 SE-HPLC에 의한 HMW 종의 백분율을 나타내고, 이때 4주 후 본질적으로 변화가 관찰되지 않았다. TNF-결합 나노바디 저농도에 대한 SE-HPLC에 의한 LMW 종의 백분율은 테스트된 모든 용액 조건에 대해 4℃에서 검출 한계 (즉, 0.0％) 미만이었다. 다중 동결-해동 사이클의 결과로서, SE-HPLC에 의한 HMW 또는 LMW 종, 또는 UV A280, 또는 A455에서 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 10: 저농도 TNF -결합 나노바디 액체: pH 및 제형의 함수로서의 진탕의 효과의 평가
이러한 pH 범위에 걸쳐 (15℃에서의) 4시간 동안의 300 rpm에서의 진탕에 대해 TNF-결합 나노바디가 민감하다는 것을 나타내는 데이터가 또한 제시된다 (도 28). 염화나트륨 및 아르기닌을 함유하는 제형은 본질적으로 진탕에 대해 민감하다. 히스티딘, 수크로스, 트윈-80 제형이 각각의 pH 군에서 최소 고분자량 분해를 나타냈다. pH 6.0 및 7.0의 히스티딘, 수크로스, 트윈-80 제형이 최소 HMW 분해를 나타냈다.
진탕 후의 저농도 TNF-결합 나노바디의 UV 흡광도를 280 nm (농도 모니터링용) 및 455 nm (혼탁도 모니터링용)에서 모니터링하였다. 진탕의 결과로서 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
저농도 TNF-결합 나노바디 용액을 다중 동결-해동 사이클 후 SE-HPLC 및 280 nm (농도 모니터링용) 및 455 nm (혼탁도 모니터링용)에서의 UV 분석에 의해 시험하였다. 다중 동결-해동 사이클의 결과로서 SE-HPLC 또는 UV A280 또는 A455에서 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 11: 고농도 액체 제형, 단기 (2주 기간)의 TNF -결합 나노바디의 안정성: 등장성 조정제 시험
액체로서의 TNF-결합 나노바디의 안정성이 하기에서 예시된다:
도 31 및 32에 제시된 바와 같이 본원에서 HST, HSGT, HSGMT, HSorb 및 대조군으로 지칭되는 5개의 제형을 시험하였다. 시험관 각각의 제형이 하기에 기술된다.
Figure pat00003
폴리프로필렌 튜브에서, 및 고무 플런저가 있는 고리형 올레핀 공중합체 사전충전 주사기에서 4℃ 및 40℃ (스트레스 조건)에서 2주 동안 액체로서 제형을 보관하였다.
도 31 및 32에 도해된 바와 같이 SE-HPLC에 의한 HMW의 백분율 및 LMW의 백분율에 의해 제형의 안정성을 평가하였다. 데이터는 4℃에서의 보관 시간의 함수로서 분해 생성물에서의 한정된 변화를 나타낸다. 도 32에 제시된 샘플에서, 초기 시점에 또는 4℃에서의 2주 후에 LMW가 검출되지 않았다. LMW는 40℃ (스트레스) 샘플에서만 검출되었다. 데이터는 5개의 제형 모두가 스트레스 조건 40℃에서의 보관 시간의 함수로서 분해 생성물에서의 유사한 변화를 나타낸다는 것을 나타낸다. 따라서, 데이터는 모든 제형이 액체 투약 형태에 적절하다는 것을 나타낸다.
실시예 12: 저농도 및 고농도 액체 제형에서의 TNF -결합 나노바디의 안정성: 표적 제형의 확인, 및 1차 포장 용기의 시험
액체로서의 TNF-결합 나노바디의 안정성이 하기에서 예시된다: 3가지 제형을 시험하였다:
(a) 10 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디, 20 mM 히스티딘, 7.5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80;
(b) 50 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디, 20 mM 히스티딘, 7.5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80;
(c) 100 ㎎/㎖ TNF-결합 나노바디, 20 mM 히스티딘, 7.5％ 수크로스, 0.01％ 폴리소르베이트 80.
제형을 하기의 1차 포장 용기에서 제조하였다:
(a) 제1 판매자로부터의 사전충전형 제I형 제약 등급 유리 주사기 및 웨스트(West) 4432 실리콘화 회색 고무 플런저
(b) 제2 판매자로부터의 사전충전형 제I형 제약 등급 유리 주사기 및 웨스트 4432 실리콘화 회색 고무 플런저
(c) 사전충전형 고리형 올레핀 공중합체 및 웨스트 4432 실리콘화 회색 고무 플런저
t=0에 제형을 분석하였고, 제형이 만족스러운 것으로 발견되었다. 제형을 3개월 동안 4℃, 25℃ 및 40℃에서 보관하였다.
등가물
본원에서 언급된 모든 참고문헌은 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 포함되는 것으로 명확하게 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 본원에 기술된 구체적인 실시양태들에 의해 범주가 한정되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 상기의 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이같은 변형이 첨부된 청구항의 범주 내에 속하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> WYETH <120> FORMULATIONS OF SINGLE DOMAIN ANTIGEN BINDING MOLECULES <130> W2023-7039WO <140> <141> <150> 61/109,474 <151> 2008-10-29 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 382 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> signal <222> (1)..(19) <220> <221> mat_peptide <222> (20)..(382) <400> 1 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -15 -10 -5 Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln -1 1 5 10 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 Ser Asp Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 Glu Trp Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro 50 55 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 65 70 75 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly 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Claims (31)

  1. (a) 하나 이상의 단일 도메인 분자가 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합하는, 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 350 ㎎/㎖ 농도의 단일 도메인 항원 결합(SDAB) 분자;
    (b) 동결보호제; 및
    (c) 제형의 pH가 약 5.0 내지 7.5이도록 하는, 약 5 내지 약 50 mM 농도의 히스티딘(Histidine) 완충제
    를 포함하는 제형.
  2. 제1항에 있어서, 히스티딘 완충제가 약 5mM 내지 약 50mM, 약 5mM 내지 약 40mM, 약 5mM 내지 약 30mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 또는 약 10mM, 약 20mM, 또는 약 30mM의 농도인 제형.
  3. 제1항에 있어서, 제형의 pH가 5, 5.5, 5.8-6.1, 6.0, 6.1, 6.5, 7, 7.2 및 7.5로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제형.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보호제가 당, 아미노산, 메틸아민(예를 들어, 베타인), 친액성 염(예를 들어, 황산마그네슘), 폴리올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 플루로닉(Pluronic), 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제형.
  5. 제4항에 있어서, 당이 수크로스, 소르비톨 및 트레할로스로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제형.
  6. 제4항에 있어서, 아미노산이 모노소듐 글루타메이트 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제형.
  7. 제4항에 있어서, 폴리올이 3가 이상의 당 알코올(예를 들어, 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 및 만니톨)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제형.
  8. 제5항에 있어서, 상기 수크로스, 소르비톨 또는 트레할로스가 약 2.5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 8%, 또는 약 4%, 약 4.5%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 또는 약 9%(중량/부피)의 농도인 제형.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, SDAB 분자가 단일 쇄 폴리펩티드인 제형.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, SDAB 분자가 1가 또는 다가(예를 들어, 2가, 3가, 또는 4가)인 것인 제형.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, SDAB 분자가 단일특이적 또는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적)인 것인 제형.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 단일 도메인 분자가 CDR-그래프트(grafted) 분자, 인간화 분자, 낙타화 분자, 탈면역화 분자, 또는 파지 디스플레이에 의해 선별된 분자인 제형.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HSA에 결합하는 하나 이상의 단일 도메인 분자가 CDR1로서 SFGMS(서열 5), CDR2로서 SISGSGSDTLYADSVKG(서열 6) 및 CDR3으로서 GGSLSR(서열 7)의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하거나, 상기 CDR 중 하나와 3개, 2개 또는 1개 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 치환)보다 적은 수로 상이한, 예를 들어, 상기 CDR 중 하나와 1개의 보존적 치환으로 상이한 CDR을 갖는 것인 제형.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HSA에 결합하는 하나 이상의 단일 도메인 분자가 도 30의 대략 아미노산 125 내지 239의 아미노산 서열을 갖는 가변 영역, 또는 상기 가변 영역과 10개 이하의 아미노산이 상이한 가변 영역, 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 도 30에 제시된 아미노산 서열(서열 1)에 비해 적어도 85％, 90％, 95％ 또는 이를 초과하여 동일하거나 최대 20개, 15개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개의 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 삽입 또는 치환(예를 들어, 보존적 치환))가 있는 아미노산 서열)을 갖는 가변 영역을 포함하는 것인 제형.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HSA에 결합하는 하나 이상의 단일 도메인 분자가 국제공개공보 WO06/122786에 개시된 ALB1 또는 그의 인간화 형태(예를 들어, ALB6, ALB7, ALB8, ALB9, ALB10)인 제형.
  16. 제1항에 있어서, HSA에 결합하는 하나 이상의 단일 도메인 분자가 도 30에 개시된 HSA-결합 단일 도메인 분자(서열 1)의 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는 것인 제형.
  17. 제16항에 있어서, HSA에 결합하는 하나 이상의 단일 도메인 분자가 도 30에 개시된 HSA-결합 단일 도메인 분자(서열 1)에 의해 인지되는 에피토프와 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하는 것인 제형.
  18. 제16항에 있어서, HSA에 결합하는 하나 이상의 단일 도메인 분자가 WO06/122786에 개시된 HSA-결합 단일 도메인 분자와 유사한 활성(예를 들어, 결합 친화도, 해리 상수, 결합 특이성)을 갖는 것인 제형.
  19. 제1항 내지 제3항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, HSA에 결합하는 하나 이상의 단일 도메인 분자가 WO06/122786에 개시된 하나 이상의 나노바디, 예를 들어 WO06/122786에 개시된 1가, 2가, 3가 HSA-결합 나노바디 분자를 포함하는 것인 제형.
  20. 제1항 내지 제3항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, SDAB 분자가 종양 괴사 인자 α(TNF α)에 결합하는 1개 이상, 바람직하게는 2개의 단일 도메인 분자를 포함하는 것인 제형.
  21. 제1항 내지 제3항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, SDAB 분자가 자가면역 장애, 예를 들어, 관절염 (류머티스성 관절염, 소아 류머티스성 관절염, 골관절염, 다관절형 소아 특발성 관절염(JIA), 건선성 관절염, 루푸스-관련 관절염 또는 강직성 척추염 포함), 피부경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 혈관염, 다발성 경화증, 자가면역 갑상선염, 피부염 (아토피 피부염 및 습진 피부염 포함), 중증 근무력증, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, (궤양성) 결장염, 진성 당뇨병(제I형); 피부의 염증성 상태(예를 들어, 건선); 급성 염증성 상태(예를 들어, 내독소혈증, 패혈증, 독성 쇼크 증후군 및 감염성 질환); 이식 거부 또는 알러지의 치료에 유용한 하나 이상의 단일 도메인 분자를 포함하는 것인 제형.
  22. 세포 배양물에서 SDAB 분자를 발현시키는 단계;
    SDAB 분자를 크로마토그래피 정제 단계 또는 한외여과/정용여과 단계 중 하나 이상을 통과시킴으로써 SDAB 분자를 정제하는 단계; 및
    약 5％ 내지 약 10％ 농도의 수크로스; 및 제형의 pH가 약 5 내지 7.5이도록 하는 약 5 내지 50 mM 농도의 히스티딘 완충제를 함유하는 제형에서 SDAB 분자의 농도를 약 0.1 내지 350 ㎎/㎖로 조정하는 단계
    를 포함하는, SDAB 분자의 제형을 제조하는 방법 또는 공정.
  23. SDAB 분자와 동결보호제의 혼합물, 및 완충제를 동결건조시킴으로써, 동결건조된 혼합물을 형성시키는 단계; 및
    동결건조된 혼합물을 희석제에서 재구성시킴으로써, 제형을 제조하고, 이때 재구성된 제형이 (a) 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 350 ㎎/㎖ 농도의 SDAB 분자; (b) 약 5％ 내지 약 10％ 농도의 수크로스 또는 트레할로스로 구성된 군으로부터 선택된 동결보호제; 및 (c) 제형의 pH가 약 5 내지 7.5이도록 하는 약 5 내지 약 50 mM 농도의 히스티딘 완충제를 포함하는 것인 단계
    를 포함하는, SDAB 분자를 함유하는 재구성된 제형을 제조하는 방법.
  24. 제1항 내지 제3항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 제형을 함유하는 용기 및 사용 설명서를 포함하는 키트 또는 제조품.
  25. 제24항에 있어서, 제형이 바이알(vial) 또는 주사용 주사기 내에 존재하는 것인 키트 또는 제조품.
  26. 제24항에 있어서, 제형이 사전충전(prefilled) 주사용 주사기 내에 존재하는 것인 키트 또는 제조품.
  27. 제25항에 있어서, 주사기 또는 바이알이 유리, 플라스틱, 또는 고리형 올레핀 중합체 또는 공중합체로부터 선택된 중합체성 물질로 구성된 것인 키트 또는 제조품.
  28. 제1항 내지 제3항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 제형의 샘플을 제공하는 단계;
    색, 투명도, 점도, 또는 하나 이상의 HMW 종, LMW 종, 산성 종 또는 염기성 종의 양으로부터 선택된 제형 파라미터를 평가하는 단계; 및
    이러한 파라미터들이 미리 선택된 기준을 충족시키는지 여부를 결정함으로써, 공정을 분석하는 단계
    를 포함하는, 제조 공정을 분석하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 배치(batch)-대-배치 변동을 모니터링 또는 제어하는 방법에서 또는 샘플을 기준 표준물과 비교하기 위해, 2개 이상의 샘플 제형을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 비교를 기초로 하는, 제형의 분류, 선택, 허용 또는 폐기, 발매 또는 보류, 약물 제품으로의 가공, 선적, 상이한 위치로의 이동, 제형, 표지, 포장 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 평가된 제형 파라미터에 관한 데이터를 포함하고, 제형 배치에 대한 식별물을 임의적으로 포함하는 기록물을 제공하는 단계; 상기 기록물을 결정자에게 제출하는 단계; 임의적으로, 상기 결정자로부터 통신을 수신하는 단계; 임의적으로, 결정자로부터의 통신을 기초로 제형 배치를 발매 또는 판매할지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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