KR20160149210A - Gm-csf 중화 화합물을 포함하는 액체 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 20 mg/ml 이상인 농도의 GM-CSF를 중화시키는 화합물, 장성 조절제, 완충제 및 계면활성제, 아미노산, 항산화제 및/또는 킬레이트제 중 하나 이상의 것을 포함하는 수성 제제로서, 상기 조성물은 안정한 것인 수성 제제에 관한 것이다. 제제의 성분들은 바람직하게는 장기간 보관 측면에서 GM-CSF를 중화시키는 화합물에 대한 안정성을 제공한다. 바람직한 측면에서, 제제는 요법에서 사용하기 위한 것이며, 바람직하게는 알레르기 장애 및 건선 장애 뿐만 아니라, 관절염 장애 및 천식 장애를 비롯한, 염증성 장애 및 자가면역 장애의 치료에서 사용하기 위한 것이다.

Description

GM-CSF 중화 화합물을 포함하는 액체 제제 {LIQUID FORMULATION COMPRISING GM-CSF NEUTRALIZING COMPOUND}
본 발명은 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 중화시키는 화합물을 포함하는 안정한 액체 제제에 관한 것이다. 제제의 성분들은 바람직하게는 장기간 보관 및 냉동-해동 사이클에 대하여 안정성을 제공한다. 바람직한 측면에서, 제제는 요법에서 사용하기 위한 것이며, 바람직하게는 알레르기 장애 및 건선 장애 뿐만 아니라, 관절염 장애 및 천식 장애를 비롯한, 염증성 장애 및 자가면역 장애의 치료에서 사용하기 위한 것이다. 추가로, 본 발명의 제제를 포함하는 키트를 제공한다.
단백질은 제약, 수의학 제품, 화장품 및 다른 소비자 제품, 식품, 사료, 진단, 공업 화학 및 제염 분야에서 광범위한 용도로 사용되고 있다. 때때로, 이러한 사용은 단백질 자체에 내재하거나, 그가 사용되는 환경 또는 매질에 의해 부과되는 제약 조건에 의해 제한되어 왔다. 이러한 제약 조건은 단백질의 낮은 안정성, 성능 변동 또는 높은 비용을 초래할 수 있다. 생명 공학의 출현에 기인하여, 치료 학적 적용을 위해 다양한 단백질을 생산할 수 있다. 그의 생산 후, 단백질 제약은 일반적으로 그의 사용 전에 보관된다. 단백질은 일반적으로 "전통적인" 제약보다 더 크고 더 복잡하다는 사실로 인하여, 보관에 적합한 단백질 제약의 제제화 및 프로세싱은 특히 도전 과제가 될 수 있다. 단백질 제약 제제 및 프로세스 디자인 리뷰를 위해, 문헌 [Carpenter et al. (1997), Pharm. Res. 14: 969-975]; [Wang (2000), Int. J. Pharmaceutics 203: 1-60]; 및 [Tang 및 Pikal (2004), Pharm. Res. 21: 191-200]을 참조할 수 있다.
수개의 인자들이 단백질 제약 생산을 위한 제제화 및 프로세스를 디자인하는 데 고려될 수 있다. 주요 관심사는 조성물의 제조, 냉동, 동결건조, 건조, 보관, 운송, 재구성, 냉동/해동 사이클, 및 최종 사용자에 의한 재구성후 보관을 포함할 수 있는 제조, 운송 및 취급 단계들 중 임의 단계 또는 모든 단계 또는 임의 단계를 통한 단백질의 안정성이다. 다른 잠재적인 고려 사항으로는 제조, 취급 및 분배의 용이성 및 경제성; 환자 투여용 최종 제품의 조성; 및 재구성시 동결건조된 제제의 가용성을 비롯한, 최종 사용자에 의한 사용 편의성을 포함한다.
액체 제제는 특정의 목적을 충족시킬 수 있다. 액체 제제의 가능한 이점으로는 제조의 용이성 및 경제성, 및 최종 사용자 편의성을 포함한다. 빈번하게는, 장기간 동안 보관되는 경우, 폴리펩티드는 용액 중에서 불안정하다 (문헌 [Manning et al (1989), Pham. Res. 6: 903-918]). 따라서, 건조, 예컨대, 동결건조를 비롯한, 보관 수명을 장기화시킬 수 있는 추가의 프로세싱 단계가 개발되었다. 동결건조된 제제는 또한 특정의 이점을 제공할 수 있다. 동결건조의 잠재적인 이점은 단백질 안정성 개선 뿐만 아니라, 운송 및 보관의 용이성 및 경제성을 포함한다. 그러나, 동결건조된 제약 조성물은 최종 사용자에게 덜 편리할 수 있다.
(예컨대, 동결건조, 액체, 냉동 등과 같은) 기본 형태의 조성물 선택 뿐만 아니라, 단백질 제제의 최적화는 전형적으로 단백질 안정성을 최대화하기 위해 제제의 성분들 및 이들 각각의 농도를 변화시키는 것을 포함한다. 다양한 인자들은 이온 강도, pH, 온도, 냉동/해동 사이클, 전단력, 냉동, 동결건조, 건조, 교반 및 재구성을 비롯한 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 단백질의 불안정성은 물리적 분해 (예컨대, 변성, 응집 또는 침전) 또는 화학적 분해 (예컨대, 탈아미드화, 산화 또는 가수분해)에 의해 유발될 수 있다. 제제 성분 및 농도의 최적화는 오로지 불안정성의 원인을 극복하기 위한 실증 연구 및/또는 합리적인 접근법을 기반으로 한다.
때때로, 수성 및 동결건조된 제제를 비롯한, 폴리펩티드를 함유하는 제약 조성물의 장기간 보관에서 활성 폴리펩티드는 응집 및/또는 분해로 인해 손실될 수 있다.
따라서, 폴리펩티드의 안정성을 개선시키기 위한 전형적인 관행은 제제 내의 성분들의 농도를 변화시키거나, 또는 제제를 개질시키기 위해 부형제를 첨가함으로써 다루어질 수 있다 (미국 특허 번호 5,580, 856 및 6,171,586, 및 미국 특허 출원 번호 US 2003/0202972, US 2003/0180287). US 5,580,856은 예컨대, 천연 중합체, 계면활성제, 술페이트화 다당류, 단백질 및 재수화 동안 또는 후에 건조 단백질을 안정화시키기 위해 첨가될 수 있는 완충제와 같은 작용제를 개시하는 기본형 특허이다. 그러나, 많은 옵션과 별개로, 미국 특허 5,580,856은 어떠한 단백질에 어떠한 안정제가 추가되어야 하는지를 교시하지 않고 있다. 따라서, 숙련된 판독자는 많은 옵션들을 알면서도, US 5,580,856에 기술된 많은 옵션 중에서 그의 단백질에 최적인 조건을 찾아 내어야 한다. 미국 특허 출원 2003/0202972에는 안정제가 당, 트레할로스 또는 완충제인 것인, 항-HER2 항체의 안정한 동결건조된 제제가 기술되어 있다. 그러나, 이들 안정제가 항체에 유용할 수 있지만, 이들이 다른 단백질로 추정될 수는 없다. 미국 특허 출원 2003/0180287은 면역글로불린 유사 단백질, 즉, Fc 영역을 함유하는 단백질의 안정한 용액을 기술하고 있다는 점에서 US 2003/0202972와 유사하다. 안정제는 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산 나트륨 또는 시트르산 칼륨, 말레산, 아세트산 암모늄, 트리스 완충제, 아세테이트, 디에탄올아민, 히스티딘, 리신 또는 시스테인 일 수 있다. 숙련된 판독자에 의해 선택될 수 있는 이들 화학적으로 상이한 안정제들 중에서, 리신이 적합한 것으로 밝혀졌다. 그러나, US 2003/0202972와 같이, 특정 안정제는 단지 특정 단백질, 여기서, Fc 도메인 함유 단백질에 적절할 뿐이고, 그 자체가 또 다른 단백질로 추정될 수는 없다. 따라서, 첨가제의 사용은 특정 단백질로부터 또 다른 비-관련 단백질로 추정될 수 없다. 실제로, 첨가제의 사용은, 보관은 개선시키면서, 폴리펩티드를 계속해서 불활성인 상태로 유지시킬 수 있다. 추가로, 동결건조인 경우에, 재수화 단계는, 예를 들어, 응집 또는 변성에 의해 폴리펩티드를 불활성화시키는 조건을 도입할 수 있다 (문헌 [Hora et al. (1992), Pharm. Res., 9: 33-36]; [Liu et al. (1991), Biotechnol. Bioeng., 37: 177-184]). 실제로, 폴리펩티드의 응집은 면역원성을 초래할 수 있기 때문에 바람직하지 않다 (문헌 [Cleland et al. (1993), Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10: 307-377]; 및 [Robbins et al. (1987), Diabetes, 36: 838-845]).
제약 제품의 개발 및 제조 동안의 생물학적 활성의 유지는 거대분자 고유의 안정성 뿐만 아니라, 사용된 안정화 기술에 의존한다. 단백질 수용액 또는 수성 현탁액에 화학적 "안정제"를 첨가하는 것을 비롯한, 다양한 단백질 안정화 기술이 존재한다. 예를 들어, 미국 특허 4,297,344에는 선택된 아미노산을 첨가하여 열에 대하여 응고 인자 II 및 VIII, 안티트롬빈 III 및 플라스미노겐을 안정화시키는 것이 개시되어 있다. 미국 특허 4,783,441에는 표면 활성 물질을 첨가하여 단백질을 안정화시키는 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 4,812,557에는 인간 혈청 알부민을 사용하여 인터루킨-2를 안정화시키는 방법이 개시되어 있다. 제제를 동결 방지제와 혼합하고, 극저온에서 보관하는 냉동/해동 방법이 단백질을 안정화시키는 또 다른 옵션이다. 그러나, 모든 단백질이 냉동/해동 사이클에서 잔존해 있지는 않을 것이다. 동결 방지제 첨가제, 일반적으로 글리세롤에 의한 냉장 보관은 추가의 옵션이다. 미국 특허 5,098,893에 기술된 바와 같이 유리 형태로도 또한 보관될 수 있다. 이 경우, 단백질은 비정질 또는 유리질 상태인 수용성 또는 수팽윤성 물질에 용해된다. 단백질의 안정화를 위해 가장 널리 사용되는 방법은 냉동 건조 또는 동결건조이다. 충분한 단백질 안정성이 수용액 중에서 달성될 수 없는 경우에는 언제든, 동결건조가 가장 실현 가능성이 큰 대안을 제공한다. 동결건조의 한 단점은 복잡한 프로세싱을 필요로 하고, 많은 시간이 소요되고, 비싸다는 점이다. 추가로, 동결건조가 조심스럽게 수행되어 있지 않을 경우, 대부분의 제제는 상기 기술의 냉동 및 탈수 단계에 의해 적어도 부분적으로 변성된다. 그 결과, 빈번하게는 단백질 분자 중 일부가 비가역적으로 응집됨에 따라 제제는 비경구 투여에 허용되는 않는 상태가 된다.
일반적으로 말하면, 단백질의 분해는 문헌에 잘 기술되어 있지만, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (이는 추가로 CM-CSF로 지칭된다)를 중화시키는 화합물, 특히, 폴리펩티드 및 항-GM-CSF 항체의 보관 및 가용성은 기술된 바 없다.
추가로, 단백질 안정화제 뿐만 아니라, 안정적으로 유지하면서 단백질의 고농도를 허용하는 작용제에 대한 다수의 옵션들이 본 발명이 이루어진 시점까지 이용가능했던 것으로 알려져 있지만, GM-CSF를 중화시키는 화합물을 고농도로 포함하는 제제는 불안정할 수 있으므로 개선이 필요하다는 것이 당업계에서는 인식되지 않았다.
단백질, 예컨대, 항체, 예컨대, 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물의 제조에 있어서, 환자에게 더 높은 편리함을 제공하는 피하 투여의 잠재성에 기인하여 고농도의 액체 제제를 개발하는 것이 목표이다. 그러나, 항체, 특히, 모노클로날 항체의 고농도 제제의 개발은 면역원성 반응의 가능성을 증가시킬 뿐만 아니라, 낮은 생체 활성을 일으키는 가용성 및 불용성 응집체 또는 입자의 형성 증가와 같이, 모노클로날 항체의 물리적 및 화학적 안정성과 관련된 중요한 도전 과제를 제기한다는 것에 대해서는 전반적으로 의견이 일치한다.
액체 제약 조성물을 보관하는 동안 폴리펩티드의 응집체 또는 입자 형성은 폴리펩티드의 생물학적 활성에 악영향을 미칠 수 있으며, 이로써, 제약 조성물의 치료 효능은 손실될 수 있다. 추가로, 응집체 또는 입자 형성은 폴리펩티드 함유 제약 조성물이 주입 시스템을 사용하여 투여되는 경우에, 예컨대, 배관, 막, 또는 펌프의 막힘과 같은 다른 도전 과제를 일으킬 수 있다
추가로, 항체의 고농도 제제는 점도를 증가시킴으로써 제조 가능성 및 주사 가능성에 대해 중요한 도전 과제를 제기한다고 보고되었다. 점도가 높은 제제는 제조하거나, 주사기 안으로 인입하거나, 또는 주사하기가 어렵다. 점성 제제를 조작하는 데 힘을 사용하는 것은 과도한 거품 형성을 유도하고, 이는 활성 모노클로날 항체의 변성 및 불활성화를 유도할 수 있다.
그러므로, 예컨대, GM-CSF를 중화시키는 화합물, 예컨대, 항체를 포함하고, 즉시 사용이 가능한 장치에서와 같이 피하 투여에 적합한 낮은 및 실행가능한 점도를 가지는, 안정한 고농축 단백질 제약 조성물이 고도로 요구되고 있다. 추가로, 환자 관점에서 보면, 실온 안정한 제품을 갖는 것이 크게 바람직할 것이다. 현재, 특히, 약물 제품의 보관 수명 전 기반 동안 실온에서의 보관이 가능한 시판용 항체 제제는 없다. 전형적으로, 단백질 응집 증가는 허용되지 않는 정도로 높은 수준의 응집체 및 단백질 관련 불순물을 일으키면서 발생하고, 이는 면역원성 반응을 일으킬 수 있다.
초기에 조혈 성장 인자로 확인된, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)는 더욱 최근에는 염증 및 자가면역에서 중요한 시토카인이라고 밝혀졌다. GM-CSF mRNA 또는 단백질의 수준 상승은 알레르기 및 건선 환자, 관절염 및 천식 환자에서의 것을 포함하는 다양한 염증 부위에서 측정된다. 다수의 생체내 연구는 중화 항체에 의한 GM-CSF 차단이 관절염, 실험적 자가면역성 뇌염, 건선, 및 폐 질환의 모델을 비롯한 다양한 염증 모델에서 염증 유발성 (pro-inflammatory) 질환을 예방하거나, 또는 심지어도는 치료까지도 할 수 있다는 것이 지난 몇 년에 걸쳐 밝혀졌다. 그러므로, 특히, 안정하고/거나, 다량의 GM-CSF 중화 화합물을 함유하고/거나, 피하 경로를 통해 투여될 수 있는 GM-CSF 중화 화합물을 포함하는 제제를 이용하는 것이 매우 바람직하다.
그러므로, 본 발명의 기술적 도전 과제는 상기 기술된 요구에 순응하는 것이다.
본 발명은 이러한 요구를 처리하고, 이로써, 기술적 도전 과제에 대한 해결책으로서 제제에 관한 실시양태 뿐만 아니라, GM-CSF를 중화시키는 화합물의 투여가 도움이 되는 질환을 앓는 대상체의 치료에서 이들 제제를 적용시키는 방법 및 용도를 제공한다. 이들 실시양태는 본 명세서에서 특징 규명되고, 기술되며, 실시예에서 예시되고, 특허청구범위에서 반영된다.
본원에서 사용되는 바, "하나"(a, an) 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 주의하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "한 항체"에 대한 언급은 상기의 상이한 항체들 중 하나 이상의 것을 포함하고, "그 방법"에 대한 언급은 본원에 기술된 방법에 대해 변형 또는 치환될 수 있는 당업계의 숙련가에게 공지된 등가의 단계들 및 방법들에 대한 언급을 포함한다.
달리 명시하지 않는 한, 일련의 요소들 앞의 "적어도"라는 용어는 일련의 모든 요소를 언급하는 것으로 이해하여야 한다. 당업자들은 통상의 실험만을 사용하여 본원에 기술된 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 상기 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 하기의 특허청구범위 전역에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "~들을 포함한다"라는 단어 및 예컨대, "~을 포함하다" 및 "~을 포함하는"이라는 파생어는 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제시키는 것은 아님을 내포하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용될 때, "~을 포함하는"이라는 용어는 "함유하는"이라는 용어로 치환될 수 있거나, 또는 때때로 본원에서 "~을 가지는"이라는 용어로 치환될 수 있거나, 또는 심지어는 "~으로 이루어진"이라는 것으로 대체될 수도 있다.
본원에서 사용될 때, "~으로 이루어진"이라는 것은 특허청구범위 요소에서 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용될 때, "본질적으로 ~으로 이루어진"이라는 것은 특허청구범위의 기본적 및 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 본원에서 각각의 경우에, "본질적으로 ~으로 이루어진"이라는 용어 및 "~으로 이루어진"이라는 용어 중 임의의 것은 서로 대체될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 다수의 언급된 요소들 사이의 "및/또는"이라는 접속어는 개별 옵션 및 조합 옵션, 둘 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"으로 연결되어 있는 경우, 제1 옵션은 제2 요소 없이, 제1 요소의 적용가능성을 나타낸다. 제2 옵션은 제1 요소 없이, 제2 요소의 적용가능성을 나타낸다. 제3 옵션은 상기 제1 요소 및 제2 요소 모두의 적용가능성을 나타낸다. 이들 옵션 중 어느 하나가 상기 의미 내에 포함되며, 따라서, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어의 요건을 충족시키는 것으로 이해된다. 상기 옵션들 중 1 초과의 것의 동시 적용가능성 또한 상기 의미 내에 포함되며, 따라서, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어의 요건을 충족시키는 것으로 이해된다.
수개의 문헌들이 본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 인용된다. 본원에서 인용된 (모든 특허, 특허 출원, 과학 공개 문헌, 제조사의 상세 설명서, 설명서 등을 비롯한) 문헌들은 각각 위든 상기에서든, 또는 하기에서든 그 내용 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 참고로 포함된 자료가 본 명세서와 상반되거나, 불일치하는 경우, 본 명세서가 임의의 상기 자료를 대신할 것이다. 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 기술내용을 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
고농도의 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 포함하는 제제를 제공하는 것을 목표로 하여, 본 발명자들은 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 고농도에서는 불안정할 수 있고, 이는 또한 장기간 보관시 불안정할 수 있다는 것을 인식하였다.
단백질과 같이, GM-CSF를 중화시키는 화합물이 불안정할 수 있는 방식은 다수가 존재가 존재한다. 예를 들어, 단백질의 불안정성은 단백질 응집 또는 분해에 의해 유발될 수 있지만, 탈아미노화, 탈아미드화, 산화, 이황화 결합 파괴 및 형성, 가수분해, 숙신이미드화, 비-이황화 가교결합, 탈글리코실화 또는 "효소적 갈변 (enzymatic browning)" (밀라드 반응(Maillard reaction)) 또는 이들 현상들의 임의 조합에 기인한 화학적 불안정성에 의해서도 유발될 수 있다; 예를 들어, 문헌 [Wang et al. (1999), Int. J. Pharm. 185: 129-188]을 참조할 수 있다. 추가로, 물리화학적 파라미터, 예컨대, 온도, pH 값, 표면 흡착, 염, 금속 이온, 킬레이트제, 물리력, 예컨대, 전단력, 단백질 변성제, 비수성 용매, 단백질 농도, 단백질의 공급원 및 순도, 단백질 모르피즘 또는 압력이 단백질 안정성에 영향을 줄 수 있다.
그러나, 많은 인자가 단백질의 안정성에 영향을 줄 수 있지만, 단백질을 안정화시키기 위해 많은 조치들을 취할 수도 있다. 예를 들어, 단백질은 내부적으로 (아미노산을 변화시킴으로써) 또는 외부적으로 안정화시킬 수 있다. 외부 안정화는 킬레이트제, 금속 이온, 환원제, 중합체, 폴리에틸렌 글리콜/폴리올, 혈청 알부민, 계면활성제, 당 및 폴리올, 지방산 및 인지질, 아미노산, 완충제 등의 첨가에 의해 달성될 수 있다; 예를 들어, 문헌 [Wang, Y 및 Hanson M (1988), J. Parental Sci. & Technology, 42, Supplement: 4-26]; [Wang et al. (1999), Int. J. Pharm. 185: 129-188]을 참조할 수 있다. 요약하면, 제제 중 GM-CSF 중화 화합물, 예컨대, 항체를 안정화시키기 위해, 당업자들은 많은 옵션들을 이용할 수 있을 것이다.
본 경우에서, 본 발명자들은 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 응집을 보일 수 있고/거나, 더 높은 고농도에서 용해될 수 없다는 것을 관찰하였다. 많은 다른 인자들이 제제 중 단백질의 응집을 유발할 수 있다. 전형적인 정제 및 보관 절차는 단백질을 단백질 이량체, 삼량체 또는 다량체, 더 큰 육안으로 볼 수 없는 (subvisible) 입자 및 육안으로 볼 수 있는 입자로 응집시키는 조건 및 성분에 단백질 제제를 노출시킬 수 있다. 예를 들어, 제제 중의 단백질은 하기 중 임의의 하나 이상의 것의 결과로서 응집될 수 있다: 보관, 승온에의 노출, 제제의 pH, 제제의 이온 강도, 및 특정 계면활성제 및 유화제의 존재. 유사하게, 단백질은 전단력에 노출되었을 때, 예컨대, 용액 중에서 동결건조된 단백질 케이크를 재구성하거나, 단백질 샘플을 여과 정제하거나, 냉동-해동시키거나, 진탕시키거나, 또는 단백질 용액을 주사기를 통해 옮길 때 응집될 수 있다. 응집은 또한 보관 바이알 내에서의 액체-공기 계면에서 및 용액 중 폴리펩티드 분자의 상호작용의 결과로서 발생할 수 있다. 입체구조 변화는 운송 중 교반으로부터 생기는 계면의 확장 또는 압축 중에 기체-액체 및 고체-액체 계면에 흡착된 폴리펩티드에서 발생할 수 있다. 이러한 교반은 제제의 단백질을 응집시킬 수 있고, 이로써, 궁극적으로는 다른 흡착된 단백질과 함께 침전시킬 수 있다. 육안으로 볼 수 없는 입자의 성장은 육안으로 볼 수 있는 입자를 형성하는 경향을 나타낼 수 있다. 일반적으로, 상이한 유형의 응집체 및 입자의 형성은 응집체 또는 입자의 크기에 기반한 상이한 측정 시스템에 의해 분석될 수 있다. 예컨대, SEC, DLS, AUC는 크기 범위가 나노미터인 이량체, 삼량체, 다량체를 측정하고; 광 엄폐(light obscuration), 현미경 관찰, 동적 영상화, 유세포 분석법 및 콜터(Coulter)가 1 ㎛ 초과의 육안으로 볼 수 없는 입자 및 작은 육안으로 볼 수 있는 입자를 측정한다.
추가로, 빛에의 단백질 제제의 노출도 단백질의 응집을 유발할 수 있다. 따라서, 본 발명은 고농의 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 가능하게 하고, 이들 화합물의 응집을 감소시키는 제제를 제공한다. 이론으로 제한하지 않으면서, 응집 감소는 상기 언급한 응집 기전 중 하나 이상의 것을 제어함으로써 달성될 것으로 여겨진다. 이는 예를 들어, 제품 안정성을 개선시키고, 제조 공정 및 보관 조건에서 유연성을 증가시킬 수 있다.
본 발명자들은 예컨대, 높은 주사 부피에 기인하는 통증과 같은 부작용을 감소시키는 데 적합하거나, 또는 낮은 부피로 피하 투여될 수 있도록 허용하는 더 낮은 주사 부피를 가능하게 하기 위하여 고농도의 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 포함하는 제제를 제공하는 것으로 목표로 하였다.
그러한 이유에서, 본 발명자들은 그들의 연구 도중 GM-CSF를 중화시키는 화합의 특정한 불안정성을 관찰하였고, 따라서, 이러한 원치않는 관찰 결과를 개선시키는 것을 목표로 하였다. 따라서, 본 발명자들은 용액 중에, 즉, 용해 단계에서 유지시키면서, GM-CSF를 중화시키는 화합물을 농축시키는 목표로 하였다. 그렇게 함으로써, 본 발명자들은 이용가능한 다수의 옵션 및 대안을 가지고 있었지만, 그 중 임의의 것이 목적한 문제점을 해결하는 데 적합할 것이라는 것을 나타내지는 못했다.
"용해 단계"는 GM-CSF를 중화시키는 화합물이, 바람직하게는 약 20 mg/ml 이상인 농도로 용액 중에 존재하고, 즉, 제제의 수용액 중에 (즉, 수성상 중에) 직접 용해 (분해) 및/또는 분산된다는 것을 의미한다. 바람직하게는, GM-CSF를 중화시키는 화합물은 균질하게 용해 (분해) 및/또는 분산된다. 균질하게란, 수성 제제 중에 (분해) 및/또는 분산되어 있는 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 수성 제제 중에 거의 고르게, 바람직하게는 고르게, 분포되어 있고, 이로써, GM-CSF를 중화시키는 화합물의 농도 ("c") (몰 질량인 경우, "n" 또는 질량인 경우에 "m")은 수용액 부피 ("v") 중 (또는 그 전역에 걸쳐) 거의 동일하며, 바람직하게는, 동일하며, 즉, c=n/v 또는 c=m/v는 각각 거의 일정하며, 바람직하게는 일정하다는 것을 의미한다. 바람직하게, 제제 내에 농도 구배는 없다.
따라서, GM-CSF를 중화시키는 화합물을 포함하는 본 발명의 안정한 제제는 바람직하게는, GM-CSF를 중화시키는 화합물이 그 안에 직접 용해 및/또는 분산되어 있는 것인, 수용액으로 간주될 수 있다.
"용액"은 2종 이상의 물질들/성분들로 이루어진 균질 혼합물이다. 상기 혼합물에서, 용질 (본 발명에서 GM-CSF를 중화시키는 화합물)은 용매로서도 또한 알려져 있는 또 다른 물질 중에 (본 발명에서 바람직하게는 수성 제제 중에) (상기 기술된 바와 같이) 용해된다.
상기 내용을 고려해 볼 때, GM-CSF를 중화시키는 화합물은 바람직하게는 수용액 중에서는 불균질하게 용해 (분해) 및/또는 분산되지 않는다. "용해된 상태"라는 용어는 또한 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 수용액 중에서 바람직하게 본질적으로는 유화되지 않거나, 또는 더욱 바람직하게는 전혀 유화되지 않는다는 것을 포함한다.
또한, "용해된 상태"라는 용어는 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 바람직하게는 본질으로 캡슐화 및/또는 포획되어 있지 않다는 것 (바람직하게는 2%, 1%, 또는 0.5% 미만의 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 캡슐화 및/또는 포획될 수 있거나, 또는 더욱 바람직하게는, 예컨대, 리포좀, 다중막 리포좀 등에 전혀 캡슐화 및/또는 포획되지 않을 수 있다는 것)을 포함한다.
따라서, 본 발명의 한 바람직한 실시양태는 안정하고, 장기간 보관시 접합체/응집체/입자 또는 단편/분해 산물이 형성되지 않고, 제제가 피하 투여에 적합한 것인, GM-CSF를 중화시키는 화합물을 함유하는 액체 제제이다.
구체적으로, 많은 상이한 안정화제를 시험한 후, 본 발명자들은, 장성 조절제를 보관하고자 하는 용액에 첨가한다면, GM-CSF를 중화시키는 화합물이 안정화될 수 있다는 것을 발견하였다. 장성 조절제의 예로는 당 및 당 알콜을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단순 당은 단당류로 불리며, 이는 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 크실로스, 리보스, 만노스, 락툴로스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 아이도스, 탈로스, 아라비노스 및 릭소스를 포함한다. 본 발명에서는 예를 들어, 수크로스, 말토스, 락토스, 이소말토스, 트레할로스 및 셀루비오스를 포함하는 이당류가 더욱 바람직하다. 당 알콜은 소르비톨, 만닛톨, 글리세린, 에리트리톨, 말티톨, 크실리톨, 폴리글리시톨을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 당은 예컨대, 수크로스 또는 트레할로스와 같은 비환원당이다. 비환원당은 개방 쇄 구조의 부재를 특징으로 하는 바, 이에, 산화-환원 반응에 민감하지 않다. 그러므로, 예컨대, 수크로스 또는 트레할로스와 같은 비환원당 중 하나 이상의 것, 또는 예컨대, 만닛톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜 중 하나 이상의 것이 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 포함하는 제제에 첨가될 수 있다. 또한, 비환원 당과 당 알콜의 조합, 예컨대, 수크로스와 만닛톨, 수크로스와 소르비톨, 트레할로스와 만닛톨, 또는 트레할로스와 소르비톨이 용액에 첨가될 수 있다. 더욱 바람직하게, 당 알콜 만닛톨 및/또는 소르비톨은 바람직하게 그의 D-형태로 첨가되며, 가장 바람직하게, 소르비톨이 용액에 첨가된다. 장성 조절제, 바람직하게, 소르비톨의 농도는 약 1% (w/v) 내지 약 15% (w/v), 바람직하게, 약 2% (w/v) 내지 약 10% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 3% (w/v) 내지 약 7% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 4% (w/v) 내지 약 6% (w/v) 및 가장 바람직하게, 약 5% (w/v)이다.
장기간 보관과 관련하여 고농도의 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 안정화시키는 또 다른 구체적으로 바람직한 물질은 pH 약 4 내지 약 10, 바람직하게, 약 4 내지 약 7, 더욱 바람직하게, 약 4 내지 약 6 또는 약 5 내지 약 7, 더욱더 바람직하게, 약 5.5 내지 약 6.5, 및 가장 바람직하게, pH 약 5.8의 완충제 시스템이다. 완충제는 바람직하게는 히스티딘 완충제, 아세테이트 완충제 및 시트레이트 완충제로부터 선택될 수 있다. 본원에서 언급할 때, 아미노산은 L-아미노산 또는 D-아미노산인 것을 의미하며, 여기서, L-아미노산이 바람직하다. 바람직하게는 히스티딘 또는 그의 염이 완충제 시스템에 사용된다. 바람직하게는 상기 염은 클로라이드, 포스페이트, 아세테이트 또는 술페이트이며, 더욱 바람직하게, 염은 클로라이드이다. 히스티딘 완충제 시스템의 pH는 약 5 내지 약 7, 바람직하게, 약 5.5 내지 약 6.5이며, 더욱 바람직하게 pH는 약 또는 정확하게 5.8이다. pH는 통상적으로 사용되는 염기 및 산, 바람직하게, NaOH를 사용하여 조정될 수 있거나, 또는 히스티딘와 히스티딘 염의 혼합물이 사용될 수 있으며, 이로써, 어떤 pH 조정도 요구되지 않는다. 완충제 시스템, 바람직하게, 히스티딘 완충제 시스템의 농도는 약 10 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 더욱 바람직하게, 약 30 mM이다.
추가로, 본 발명자들은 계면활성제, 아미노산, 항산화제 및/또는 킬레이트제 중 하나 이상의 것을 보관하고자 하는 용액에 첨가한다면, GM-CSF를 중화시키는 화합물이 안정화될 수 있다는 것을 발견하였다.
바람직한 실시양태에 따라, 응집을 막고, 제제를 장기간 보관 및/또는 1회 이상의 냉동/해동 사이클에 충분히 안정하도록 만들기 위해 완충제 시스템, 바람직하게, 히스티딘 완충제, 및 장성 조절제, 바람직하게, 당 알콜, 더욱 바람직하게, 만닛톨 또는 더욱더 바람직하게, 소르비톨 및 계면활성제, 바람직하게 폴리소르베이트 20 (PS20; 트윈(TWEEN)® 20), 폴리소르베이트 80 (PS80; 트윈® 80) 및/또는 폴록사머의 조합을 사용하여 용액 중 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 안정화시킨다. 안정성 측면에서 제제 중에 약 6% (w/v) 이상의 당 알콜, 바람직하게, 소르비톨을 함유하는 것이 바람직한 것으로 나타났다. 그러나, 제제의 삼투압에 대한 상한은 약 500 mOsm/kg으로 설정되는데, 이는 여전히 고삼투압성이지만, 승인받은 제품의 (시나지스(Synagis); Lm. 투여)의 삼투압 몰농도와 유사하다. 그러므로, GM-CSF를 중화시키는 화합물의 최적의 안정성, 장성 및 농도간의 조화는 본 발명의 실시예에 기술된 바와 같이 나타났다. 그러므로, 당 알콜, 바람직하게, 소르비톨의 바람직한 농도는 약 3% (w/v) 내지 약 7% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 4% (w/v) 내지 약 6% (w/v) 및 가장 바람직하게, 약 5% (w/v)이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, GM-CSF를 중화시키는 화합물을 포함하는 본 발명의 제제 또는 조성물은 염화나트륨을 함유하지 않거나, 또는 본질적으로 함유하지 않는다. "본질적으로 함유하지 않는다"는 것은 염화나트륨의 농도가 예컨대, 약 50 mM 미만, 바람직하게, 약 20 mM 미만, 더욱 바람직하게, 약 10 mM 미만, 더욱더 바람직하게, 약 5 mM 미만, 및 가장 바람직하게, 약 2 mM 미만 또는 심지어는 약 1 mM 미만인 것과 같이, 0 (영) mM이거나, 또는 그에 매우 가깝다는 것을 의미한다.
사용되는 GM-CSF를 중화시키는 각 화합물의 농도는 보관, 냉동/해동 및/또는 즉시 사용되는 액체 제제 중 약 20 mg/ml 이상, 바람직하게, 약 50 mg/ml 이상, 더욱 바람직하게, 약 60 mg/ml 이상이다. 약 20 mg/ml 내지 약 200 mg/mg, 바람직하게, 약 40 mg/ml 내지 약 200 mg/ml, 더욱 바람직하게, 약 50 mg/ml 내지 약 180 mg/ml, 더욱더 바람직하게, 약 70 mg/ml 내지 약 170 mg/ml, 더욱더 바람직하게, 약 75 mg/ml 내지 약 165 mg/ml, 및 가장 바람직하게, 약 80 mg/ml 또는 약 150 mg/ml인 농도가 본 발명에서 사용된다.
제조된 액체 제제의 보관 수명은 2 내지 8℃에서 24개월, 바람직하게는 2 내지 8℃에서 36개월, 더욱 바람직하게는 2 내지 8℃에서 48개월, 가장 바람직하게는 2 내지 8℃에서 60개월, 또는 주변 온도 (25℃±2℃)에서 28일 이상이라는 바람직한 최소 요건을 가진다.
본 발명은 안정한 제제, 바람직하게는 놀랍게도 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 장기간 보관시킬 수 있는 안정한 액체 제제에 관한 것이다. 상기 제제는 부분적으로는 예컨대, 높은 주사 부피에 기인하는 통증과 같은 부작용을 감소시키기 위하여 본 제제 중의 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 고도로 농축됨에 따라 환자가 사용하는 데 더욱 편리하기 때문에 유용하다.
따라서, 본 발명의 한 측면은
- GM-CSF를 중화시키는 화합물,
- 바람직하게, 바람직하게는 pH가 5 내지 7인, 히스티딘 완충제, 아세테이트 완충제 및/또는 시트레이트 완충제로부터 선택되는 완충제 시스템,
- 바람직하게, 비환원당, 예컨대, 수크로스 또는 트레할로스, 또는 당 알콜, 예컨대, 만닛톨 또는 소르비톨로부터 선택되는 장성 조절제, 및
- 계면활성제, 아미노산, 항산화제 및/또는 킬레이트제 중 하나 이상의 것, 바람직하게, 바람직하게는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 폴록사머 중 하나 이상의 것으로부터 선택되는 계면활성제를 포함하는 제제가 장기간 보관 및/또는 냉동/해동 사이클 및/또는 전단력 (진탕/교반 안정성)에 충분히 안정하다는 발견에 기초하고 있다. 본 발명의 제제는 표준 완충처리된 제제보다 많은 이점을 가진다. 한 측면에서, 본 제제는 고단백질 제제에서 예상될 수 있는 악영향 없이 장기간 보관시 최소 응집 거동을 나타낸다. 본 발명에 따른 제제의 다른 이점은 GM-CSF를 중화시키는 화합물의 단편화가 최소로 일어난다는 점, 및 장기간 보관시 GM-CSF를 중화시키는 화합물의 생체 활성에 대하여 어떤 유의적인 영향도 미치지 않는다는 점, 및 조성물의 점도가 낮다는 점이다.
본 발명의 제1 측면의 바람직한 실시양태는 하기와 같다: GM-CSF를 중화시키는 화합물이 폴리펩티드, 펩티드 모방체, 핵산 또는 소분자인 것인 본 발명에 따른 제제.
바람직한 실시양태에서, (바람직하게, 폴리펩티드 및 더욱 바람직하게, 항체 또는 그의 기능적 단편인 것인) GM-CSF를 중화시키는 화합물은 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체에 결합하거나 특이적으로 결합한다. GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체는 포유동물, 예컨대, 실험실 동물 (설치류, 예컨대, 래트, 기니아 피그, 햄스터 또는 마우스, 비인간 영장류, 예컨대, 시노몰구스 또는 마카크 원숭이), 가축 또는 애완 동물 (예컨대, 개 또는 고양이), 농장 또는 농업 동물 (예컨대, 소, 양, 염소 및 돼지 동물) 및/또는 인간을 포함하나, 이에 한정되지 않는 동물의 것인 것으로 보여진다. 바람직하게, GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체는 인간 GM-CSF (호모 사피언스(Homo sapiens)) 또는 인간 GM-CSF 수용체, 또는 각각 비인간 영장류 GM-CSF 또는 비인간 영장류 GM-CSF 수용체이다. 비인간 영장류 GM-CSF 또는 비인간 영장류 GM-CSF 수용체의 특히 바람직한 변이체 (상동체)는 긴팔 원숭이 (gibbon) (노마스커스 콘칼라(nomascus concolor), 웨스턴 블랙 크레스티드 기브본(western black crested gibbon)으로도 알려져 있음)의 GM-CSF, 및 마카카 과의 원숭이, 예를 들어, 붉은 털 원숭이 (마카카 물라타(Macaca mulatta)) 및 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))의 GM-CSF를 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 따라, GM-CSF에 또는 GM-CSF 수용체에 (바람직하게는 항체 또는 그의 단편)에 결합하는 화합물은 인간과 상기 언급된 원숭이 종 중 적어도 하나 사이에 교차 반응성을 보인다. 예를 들어, 항체 또는 그의 단편은 인간 GM-CSF와 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)의 GM-CSF, 둘 모두에 결합할 수 있다 (그리고, 그를 중화시킬 수 있다). 이는 인간 대상체에서의 치료학적 투여용으로 의도되는 항체 분자인 경우에 특히 유리한데, 그 이유는 상기 항체가 보통은 규제 승인 이전에 다수의 시험을 거쳐야 하고, 그중 특정의 조기 시험은 비인간 동물 종을 포함하기 때문이다. 그와 같은 시험을 수행하는 경우, 인간과 고도의 유전적 유사성을 가지는 종 (예컨대, 비인간 영장류, 예컨대, 시노몰구스 원숭이)을 비인간종으로서 사용하는 것은 일반적으로 바람직한데, 그 이유는 상기와 수득되는 결과는 일반적으로 동일분자를 인간에게 투여하는 경우에 기대될 수 있는 상응하는 결과를 매우 높게 예측할 수 있기 때문이다. 그러나, 동물 시험에 기초한 그와 같은 예측 능력은 적어도 부분적으로는 분자의 비교가능성에 의존하고, 이는 또한 종간 교차반응성에 기인하여 동일한 치료 분자를 인간 및 동물 모델에게 투여할 수 있는 경우에 매우 높다. 본 발명의 상기 실시양태에서와 같이, 항체 분자가 인간에서 및 밀접하게 관련된 또 다른 종에서 동일 항원에 대해 교차반응성일 경우, 인간에서 및 상기 밀접하게 관련된 종에서, 예를 들어, 상기 언급된 원숭이 종 중 하나에서 동일한 항체 분자를 사용함으로써 시험을 수행할 수 있다. 이는 시험 그 자체의 효율성 뿐만 아니라, 치료학적 견지에서 최종의 관심의 대상이 되는 종인 인간에서의 상기 항체의 거동에 관한 상기 시험에 의해 제공되는 예측 능력을 증가시킨다. GM-CSF에 또는 GM-CSF 수용체에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편은 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편인 것이 바람직하다. 이는 항체가 아니거나, 항체로부터 유래된 것이 아닌, GM-CSF를 중화시키는 화합물에 따른 대안적 실시양태에서도 실제로 그러하다.
바람직하게 GM-CSF를 중화시키는 화합물은 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편이다.
GM-CSF를 중화시키는 화합물은 인간 및 비인간 영장류 GM-CSF의 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편일 수 있다. 상기 에피토프는 바람직하게 아미노산 23-27 (RRLLN) 및/또는 아미노산 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL)을 포함한다. 아미노산 서열 스트레치 65-77 내의 67번 위치의 가변성은 한편으로는 인간 및 긴팔 원숭이 GM-CSF (67번 위치가 R), 및 다른 한편으로는 마카카 과의 원숭이, 예를 들어, 시노몰구스 및 레서스 원숭이 (67번 위치는 Q) 사이에 GM-CSF의 상기 부분에서의 이질성을 반영한다. 에피토프가 비인접한 2개의 아미노산 서열 스트레치, 예컨대, 23-27 (RRLLN) 및 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL)을 포함하는 경우, 에피토프는 또한 "불연속" 에피토프라도 불릴 수 있다. 상기 GM-CSF 에피토프 또는 상기 GM-CSF 불연속 에피토프는 아미노산 28-31 (LSRD), 아미노산 32-33 (TA), 및/또는 아미노산 21-22 (EA)를 추가로 포함할 수 있다.
인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 바람직하게는 그의 중쇄 가변 영역에 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-13 및 56에 명시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 바람직하게, 중쇄 가변 영역 CDR3은 서열식별번호: 2에 명시된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 중쇄 가변 영역 CDR3 서열 중 임의의 것은 추가로 중쇄 가변 영역에, 서열식별번호: 14에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및 서열식별번호: 15에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2와 함께 존재할 수 있다.
추가로, 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 16에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 17에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 18에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 측면에서, 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 16에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 17에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 18에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 및 그의 중쇄 가변 영역에 서열식별번호: 14에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 15에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 1-13 및 56에 명시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 가장 바람직하게, 서열식별번호: 2에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
바람직한 실시양태에 따라, 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 19, 54 및 55에 명시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에 따라, 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 중쇄 가변 영역에 서열식별번호: 20-33, 52 및 53에 명시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열식별번호: 34에 명시된 경쇄 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 35-48 중 임의의 것에 명시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 가장 바람직하게,서열식별번호: 35에 명시된 중쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열식별번호: 1-48 및 52-56 중 임의의 것에 명시된 각각의 아미노산 서열과, 바람직하게는, 서열식별번호: 1-18 및 56 중 임의의 것에 명시된 각각의 아미노산 서열과, 및/또는 서열식별번호: 19-48 및 52-55 중 임의의 것에 명시된 아미노산 서열 내의 프레임워크 영역 (FR)의 아미노산 서열과 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 보유하는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열식별번호: 1-18 및 56 중 임의의 것에 명시된 각각의 아미노산 서열과 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 보유하는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로, 서열식별번호: 1-18 및 56 중 임의의 것에 명시된 CDR의 아미노산 중 어느 하나에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산이 치환될 수 있다. 바람직하게, 치환된 상기 CDR은 본 명세서에 기술된 바와 같이 여전히 GM-CSF에 결합할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 바람직하게는, 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 각각 서열식별번호:19-48 및 52-55 중 임의의 것에 명시된 바와 같은, VH, VL, H 또는 L 영역의 각 아미노산 서열과 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 보유하는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상동성은 전체 VH, VL, H 또는 L 아미노산 서열 전역에 걸쳐 상동성이다. 더욱 바람직하게, 상동성은 앞서 기술된 CDR 내에서 상동성이거나, 또는 상동성은 서열식별번호: 19-48 및 52-55 중 임의의 것에 명시된 바와 같은 상기 VH, VL, H 또는 L 영역의 FR (또는 비-CDR) 내에서 상동성이다. 따라서, 각 FR에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 25개의 아미노산이 치환될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 상기 FR 치환 변이체는 여전히 GM-CSF에 결합할 수 있다.
서열식별번호: 1-18 및 56이 서열식별번호: 19-48 및 52-55에 제시된 VH, VL, H 또는 L 서열 중 하나 이상의 것에 포함된 CDR 서열을 나타내는 바, 당업자는 서열식별번호: 19-48 및 52-55 내의 FR (또는 비-CDR)을 용이하게 식별할 수 있다. 즉, 서열 목록은 서열 식별자 <223>에 각 아미노산 서열의 명칭을 제공한다. 동일한 명칭은 이들 아미노산 서열이 함께 "속해 있다"는 것을 나타내며, 이는 CDR이 VH, VL, H, 또는 L 영역 내에 포함되어 있고, 예컨대, 서열식별번호: 16, 17, 18은 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열에 포함되어 있는 CDR의 아미노산 서열이다 (이들 모두 "5-306"으로 지정되기 때문이다)는 것을 의미한다.
추가 예로서, 아미노산이 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 또는 FR 중의 하나 이상의 것 또는 그 모두에서 치환되는 경우, 이후에 얻어진 "치환된" 서열은 "원래" CDR 또는 FR 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게, 80% 이상, 더욱더 바람직하게 90% 이상, 특히 바람직하게, 95% 이상, 더욱 특히 바람직하게, 98% 또는 99% 이상 동일한 것이 바람직하다. 이는 "치환된" 서열과 상동성인 정도로 CDR 또는 FR의 길이에 의존한다는 것을 의미한다.
상동성은 예컨대, 벡터 NTI (인포맥스(InforMax)TM: 미국 메릴랜드주)와 같은 표준 서열 정렬 프로그램에 의해 측정되거나, 또는 더욱 바람직하게는 프로그램 BLASTP, 바람직하게는 버전 blstp 2.2.5 (2002년 11월 16일; 문헌 [Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl . Acids Res. 25, 3389-3402] 참조)에 의해 측정된다. 상동성(%)은 쌍별 (pairwise) 비교에서 참조로서 CDR, VH, VL, H 또는 L 아미노산 서열 중 어느 하나를 사용하여 전체 폴리펩티드 서열 (매트릭스: BLOSUM 62; 갭비용: 11.1; 컷오프 값 10-3으로 설정)의 정렬에 기초한다. 이는 BLASTP 프로그램 출력 값의 결과를 정렬 프로그램에 의해 선택된 아미노산의 총 개수로 나눈 값으로 표시된 "양성 값" (상동성 아미노산)의 개수의 비율로서 계산된다.
본원에서 사용될 때, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 상동성은 "동일성"이라는 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "상동성"이라는 용어는 본 발명의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 서열을 해당 서열과 함께 상동성 정렬을 한 후 - 상기 두 서열 중 더 긴 것의 잔기의 개수 대비 쌍별 동일한 잔기의 비율을 의미한다. 상기 기술된 바와 같이, 상동성 (또는 동일성)을 측정하는 프로그램은 아미노산 대 아미노산을 기준으로 정렬된 서열을 비교하고, 비교를 위해 다양한 수준의 엄격도로 설정되어 있을 수 있다 (예컨대, 동일 아미노산, 보존적 아미노산 치환 등). 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, 해당되는 두 아미노산이 각각 동일한 화학 부류, 즉, 산성, 비극성/소수성, 비하전된 극성 및 염기성에 속할 경우, 이는 아미노산은 서로 "보존적 치환"인 것으로 간주된다. 비제한적인 예로서, 비극성 아미노산의 부류에 속하는 2개의 상이한 아미노산은 비록 동일하지 않더라도 이러한 2개의 아미노산은 서로 "보존적 치환"으로 간주되는 반면, 한편으로는 비극성 아미노산이고, 다른 한편으로는 염기성 아미노산인 것은 서로 "보존적 치환"으로 간주되지 않을 것이다. 알버츠(Alberts), 존슨(Johnson), 루이스(Lewis), 라프(Raff), 로버츠(Roberts) 및 월터(Walter)에 의한 문헌 [Panel 3.1 of "Molecular Biology of the Cell", 4th Edition (2002)]에서는 아미노산을 4개의 주요 군: 산성, 비극성, 비하전된 극성 및 염기성으로 분류한다. 상기 분류는 본 발명과 관련하여 특정 아미노산이 해당되는 또 다른 아미노산의 보존적 치환인지의 여부를 측정하는 목적으로 사용될 수 있다. 상기 언급한 주요 군은 예컨대, 작은 비극성 및 큰 비극성 아미노산, 큰 방향족 아미노산 등으로 더욱 세분될 수 있다. "보존적 아미노산 치환"이라는 용어는 또한 치환 잔기가 주어진 잔기의 것과 화학적으로 매우 유사한 바, 이에 결과상 폴리펩티드 기능 (예컨대, 결합)에서의 실질적인 감소는 없는 것인, 주어진 아미노산 잔기에 대한 임의의 아미노산 치환을 나타낸다.
GM-CSF를 중화시키는 화합물은 전형적으로 대상체에게 비경구 투여, 예컨대, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 진피내 투여용 제약 조성물로서 제제화되며, 여기서, 피하 투여가 바람직하다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 액체 조성물, 바람직하게, 수성 조성물이다.
한 실시양태에서, 액체 제약 조성물 중 GM-CSF를 중화시키는 화합물의 농도는 보관, 냉동/해동 및/또는 즉시 사용되는 액체 제제 중 20 mg/ml 이상, 바람직하게, 약 50 mg/ml 이상, 더욱 바람직하게, 약 60 mg/ml 이상이다. 약 20 mg/ml 내지 약 200 mg/mg, 바람직하게, 약 40 mg/ml 내지 약 200 mg/ml, 더욱 바람직하게, 약 50 mg/ml 내지 약 180 mg/ml, 더욱더 바람직하게, 약 70 mg/ml 내지 약 170 mg/ml, 더욱더 바람직하게, 약 75 mg/ml 내지 약 165 mg/ml, 및 가장 바람직하게, 약 80 mg/ml 또는 약 150 mg/ml의 농도가 본 발명에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 예컨대, 조성물이 피하 전달용으로 사용될 때, 더 높은 고농도의 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 사용될 수있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 완충제를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "완충제"라는 용어는 액체 제제가 pH 변화에 대하여 저항할 수 있도록 첨가되는 조성물을 의미한다. 특정 실시양태에서, 첨가되는 완충제는 그의 산-염기 접합체 성분들의 작용에 의해 액체 제제가 pH 변화에 대하여 저항할 수 있도록 한다. 적합한 완충제의 예로는 완충처리된 히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 시스템을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "특이적으로 결합한다"라는 용어 또는 예컨대, "특이 결합," "특이적으로 결합하는," "특이 결합제" 등과 같은 관련된 표현은 잠재적 결합 파트너로서 복수 개의 상이한 항원으로부터 오직 GM-CSF/GM-CSF 수용체에만 결합하거나, 또는 유의적으로 결합하는 정도로 GM-CSF/GM-SCF 수용체와 다른 임의의 다른 잠재적인 항원과 그의 표적 (예컨대, GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체)을 구별할 수 있는 GM-CSF-중화 화합물 및 바람직하게, (인간) (모노클로날) 항체 또는 그의 기능적 단편의 능력을 의미한다. 본 발명의 의미 내에서, 표적은 잠재적 결합 파트너로서 복수 개의 동일하게 접근 가능한 상이한 항원들 중에서, 상기 표적과 상이한 임의의 다른 항원보다 (동적인 면에서) 10배 이상, 바람직하게, 50배 이상, 가장 바람직하게, 100배 이상 또는 그 초과로 더욱 빈번하게 결합하는 경우, "유의적으로" 결합하는 것이다. 이러한 동적 측정은, 예컨대, 비아코어(Biacore) 장치와 같은 SPR 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "~에 (특이적으로) 결합하는"이라는 용어 또는 예컨대, "(특이적으로) 인식하는," "~에 대한," "~와 (특이적으로) 상호작용하는" 및 "~와 (특이적으로) 반응하는"이라는 관련된 용어는 본 발명에 따라 GM-CSF를 중화시키는 화합물 (예컨대, 항체)이 그의 표적 (예컨대, GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체)에 대해 뚜렷한 친화성을 보이고, 일반적으로는 상기 언급된 표적 이외의 다른 단백질 또는 항원과는 어떤 유의적인 반응성도 보이지 않는다는 것을 의미한다. "뚜렷한 친화성"은 약 10-6 M 이상으로 강력한 친화도, 예컨대, 10-7 M 이상으로 강력한 친화도로 결합하는 것을 포함한다. 바람직하게, 결합 친화도가 약 10-11 내지 10-8 M, 바람직하게, 약 10-11 내지 10-9 M, 더욱 바람직하게, 약 10-11 내지 10-10 M일 때, 결합은 특이적인 것으로 간주된다. 화합물 (예컨대, 항체)이 표적과 특이적으로 반응하는지 또는 그에 결합하는지 여부는 특히 상기 화합물과 그의 표적 단백질 또는 항원과의 반응을 상기 화합물과 그의 표적 이외의 다른 단백질 또는 항원과의 반응을 비교함으로써 용이하게 시험될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 화합물은 GM-CSF 또는 GM-SCF 수용체 이외의 다른 단백질 또는 항원에는 본질적으로 결합하지 않거나, 또는 그에 결합할 수 없다. "본질적으로 결합하지 않는다" 또는 "결합할 수 없다"라는 용어는 본 발명의 화합물이 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체 이외의 다른 단백질 또는 항원과 30% 초과, 바람직하게, 20% 초과, 더욱 바람직하게, 10% 초과, 특히 바람직하게는 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5% 초과의 반응성을 보이지 않는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "중화," "중화제," "중화하는" 및 그의 문법적으로 관련된 변형어는 GM-CSF의 생물학적 효과(들)의 부분적인 또는 완전한 약화를 의미한다. 상기 GM-CSF의 생물학적 효과(들)의 부분적인 또는 완전한 약화는 GM-CSF-매개 프로세스, 예컨대, 예를 들어, 세포내 신호전달에서 명백하게 나타나는 것과 같은 신호 전달, 세포 증식 또는 가용성 물질의 방출, GM-CSF 이외의 다른 리간다에 대한 표면 수용체의 발현을 유도하는 세포내 유전자 활성화의 상향 또는 하향조절의 변형, 간섭 및/또는 폐기로부터 발생한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 화합물, 예를 들어, 항체 또는 그의 기능적 단편이 중화제로서 분류되는지 여부를 측정하는 데에는 다중 방식이 존재한다. 한 예로서, 일반적으로 하기와 같이 수행되는 표준 시험관내 시험에 의해 달성될 수 있다: 제1 증식 실험에서, 증식 정도가 GM-CSF의 활성에 의존한다고 알려져 있는 세포주를 다양한 농도의 GM-CSF를 포함하는 일련의 샘플과 함께 인큐베이션시키고, 인큐베이션 후, 세포주의 증식 정도를 측정한다. 상기 측정으로부터, 세포 증식의 최대의 반값을 허용하는 GM-CSF의 농도를 측정한다. 이어서, 각각의 상기 일련의 샘플에서 제1 증식 실험에서 사용된 것과 동일한 개수의 세포, 상기 측정된 농도의 GM-CSF, 및 이번에는 GM-CSF의 중화제인 것으로 의심되는, 다양한 농도의 화합물을 사용하여 제2 증식 실험을 수행한다. 세포 증식을 다시 측정하여, 성장을 최대의 반값으로 억제시키는 데 충분한, 분석된 화합물의 농도를 측정한다. 성장 억제 대 분석된 화합물의 농도에 관한 결과 그래프가 S자형이고, 이로써, 분석된 화합물의 농도가 증가함에 따라, 세포 증식이 감소된다면, 이때, 성장 억제는 어느 정도 효과를 발휘한 것이며, 즉, GM-CSF의 활성은 어느 정도 중화된 것이다. 상기 경우에서, 해당 화합물은 본 발명의 의미에서 "중화제"인 것으로 간주될 수 있다. 증식 정도가 GM-CSF의 활성에 의존하는 것으로 알려져 있는 세포주의 한 예는 문헌 [Kitamura, T. et al. (1989). J Cell Physiol 140, 323-34]에 기술되어 있는 TF-1 세포주이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 세포 증식 정도가 GM-CSF 중화 능력을 확립시킬 수 있는 유일의 파라미터는 아니다. 예를 들어, 신호 분자 (예컨대, 시토카인) 의 수준, GM-CSF에 의존하는 분비 수준 측정을 사용하여 의심되는 GM-CSF 중화제 (GM-CSF를 억제하는 화합물)를 확인할 수 있다.
해당 화합물, 예컨대, 항체 또는 그의 기능적 단편이 GM-CSF 활성의 중화제인지 여부를 측정하는 데 사용될 수 있는 세포주의 다른 예로는 AML-193 (문헌 [Lange, B. et al. (1987). Blood 70, 192-9]); GF-D8 (문헌 [Rambaldi, A. et al. (1993). Blood 81, 1376-83]); GM/SO (문헌 [Oez, S. et al. (1990). Experimental Hematology 18, 1108-11]); MO7E (문헌 [Avanzi, G. C. et al. (1990). Journal of Cellular Physiology 145, 458-64]); TALL-103 (문헌 [Valtieri, M. et al. (1987). Journal of Immunology 138, 4042-50]); 및 UT-7 (문헌 [Komatsu, N. et al. (1991). Cancer Research 51, 341-8])을 포함한다.
본 발명에 따라, GM-CSF의 중화는 GM-CSF 수용체를 보유하는 세포 외부에서 또는 상기 세포 내부에서 효과를 발휘할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 화합물에 의한 GM-CSF의 중화는 그의 특이적인 수용체에의 GM-CSF의 결합의 억제 또는 방해이거나, 또는 그의 수용체에의 시토카인의 결합에 의해 유도되는 세포내 신호의 억제일 수 있다. GM-CSF를 중화시키는 화합물은, 예컨대, GM-CSF에 직접, 또는 GM-CSF 수용체에 결합함으로써 상기 두 경우에서 GM-CSF의 생물학적 효과를 방해할 수 있다.
본원 상기에서 정의된 바와 같이, GM-CSF의 억제제는 폴리펩티드, 펩티드 모방체, 핵산 분자, 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드"라는 용어는 일반적으로 공유 펩티드 결합을 통해 서로 커플링된 30개 이상의 아미노산으로 이루어진 분자의 군을 기술한다. 본 발명에 따라, 폴리펩티드의 군은 단일 폴리펩티드 또는 1 초과의 폴리펩티드로 이루어진 "단백질"을 포함한다. 또한, "폴리펩티드"라는 용어는 단백질의 단편이 30개 이상의 아미노산으로 이루어지는 한, 단백질의 단편도 기술한다. 폴리펩티드는 다량체, 예컨대, 이량체, 삼량체 및 고급 올리고머, 즉, 1 초과의 폴리펩티드 분자로 이루어진 형태를 형성할 수 있다는 것이 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 다량체는 또한 상기 "폴리펩티드"라는 용어의 정의에 포함된다. 상기 이량체, 삼량체 등을 형성하는 폴리펩티드 분자는 동일할 수도 있거나, 또는 동일하지 않을 수도 있다. 따라서, 상기 다량체의 상응하는 고차 구조는 동종 또는 이종이량체, 동종 또는 이종삼량체 등으로 명명된다. 이종다량체의 예로는 그의 천연적으로 발생된 형태로 2개의 동일한 폴리펩티드 경쇄 및 2개의 동일한 폴리펩티드 중쇄로 이루어진 항체 분자가 있다. "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 또한 예컨대, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 이황화 가교의 형성 등과 같은 번역 후 변형에 의해, 또는 예컨대, PEG화와 같은 화학적 변형에 의해 변형이 이루어진, 천연적으로 또는 비천연적으로 변형된 폴리펩티드/단백질을 의미한다. 상기 변형은 당업계에 널리 알려져 있다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 본 발명과 관련하여 인산, 당 및 푸린 및 피리미딘 염기의 다중 반복 단위로 이루어진 중합체 거대분자를 정의한다. 이들 분자의 실시양태로는 DNA, RNA 및 PNA를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥, 선형 또는 환형일 수 있다. 본 발명과 관련하여 핵산의 특히 바람직한 실시양태는 앱타머이다. 핵산 앱타머는 다른 분자에 결합할 수 있는 그의 능력에 기초하여 랜덤 풀로부터 선택되는 DNA 또는 RNA 분자이다. 핵산, 단백질, 소형 유기 화합물 및 심지어 전체 유기체에 결합하는 앱타머가 선택되었다. 이들은 일반적으로 짧은 가닥의 올리고뉴클레오티드, 전형적으로, 50개 이하의 염기로 이루어진 것이다.
"소분자"라는 용어는 분자량이 1,000 달톤 미만, 바람직하게, 최대 800 달톤, 및 더욱 바람직하게, 300 내지 700 달톤인 유기 약물 화합물의 군을 정의한다. 소분자의 분자량 상한은 세포내 작용 부위에 도달할 수 있도록 세포막을 통과하여 신속하게 분산될 수 있는 가능성을 허용한다. 상응하는 소분자는 적어도 부분적으로는 무작위화된 펩티드 라이브러리로부터 유도될 수 있다. 본 발명에 따라 적합한 소분자의 라이브러리는 당업계에 널리 알려져 있고/거나, 상업적 판매업자로부터 구입할 수 있다.
"펩티드 모방체"라는 용어는 펩티드를 모방하도록 디자인된 작은 단백질 유사 쇄를 기술한다. 이러한 유형의 분자는 분자의 특성을 변경시키기 위하여 현존 펩티드를 변형시킴으로써 인공적으로 유도된 것이다. 예를 들어, 현존 모체 펩티드는 분자의 안정성 또는 생물학적 활성에 변화를 주기 위해 변형된다. 이러한 변형은 백본의 변경 및 비천연적 아미노산의 도입을 포함한다.
"GM-CSF 수용체"라는 용어는, 당업계에서 공통 베타 (베타-c) 서브유닛 및 알파 쇄 (CD116)의 헤테로머로서 기술된, GM-CSF의 생리학적 세포 표면 수용체를 의미한다.
중화 폴리펩티드의 바람직한 실시양태는 항체 또는 그의 기능적 단편, 더욱 바람직하게, 인간 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 항체 제조 기법은 당업계에 널리 알려져 있고, 예컨대, 문헌 [Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988] 및 [Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999]에 기술되어 있다.
"항체"라는 용어의 정의는 실시양태, 예컨대, 모노클로날, 키메라, 단일 쇄, 인간화 및 인간 항체를 포함한다. 전장의 항체 이외에도, 상기 정의는 항체 유도체 및 항체 단편 등, 특히, Fab 단편 또한 포함한다. 항체 단편 또는 유도체는 F(ab')2, Fv, scFv 단편 또는 단일 도메인 항체, 예컨대, 도메인 항체 또는 나노바디, 단일 가변 도메인 항체, 또는 다른 V 영역 또는 도메인과는 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는, VHH, VH 또는 VL일 수 있는, 단지 하나의 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 추가로 포함한다; 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane (1988) and (1999), loc. cit.]; [Kontermann and Duebel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010] 및 [Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009]를 참조할 수 있다. 상기 용어는 또한 디아바디 또는 이중 친화성 재-표적화(DART: Dual-Affinity Re-Targeting) 항체를 포함한다. (이중특이적) 단일 쇄 디아바디, 탠덤 디아바디 (Tandab), 하기와 같은 구조로 예시되는 "미니바디": (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2 또는 (scFv-CH3-scFv)2, "Fc DART" 및 "IgG DART", 멀티바디, 예컨대, 트리아바디도 추가로 구상된다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 단리된 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드 뿐만 아니라, 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 단량체를 포함하는 더 큰 폴리펩티드를 포함한다.
추가로, 본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 또한 기술된 항체와 동일한 특이성을 보이는 본원에 기술된 항체의 유도체 또는 변이체에 관한 것이다. "항체 변이체"의 예로는 비인간 항체의 인간화 변이체, "친화도 성숙" 항체 (예컨대, 문헌 [Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992)] 및 [Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)] 참조) 및 이펙터 기능(들)이 변경된 항체 돌연변이체 (예컨대, 미국 특허 5,648,260, 콘테르만(Kontermann) 및 [Duebel (2010), loc. cit. 및 Little(2009), loc. cit.] 참조)를 포함한다.
"항체"라는 용어는 또한 상이한 부류 (즉, IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE) 및 서브부류 (예컨대, IgG1, IgG2 등)의 면역글로불린(Ig)을 포함한다. 본 발명의 의미에서 항체라는 용어의 정의하에 또한 포함되는 항체 유도체는 이러한 분자의 변형, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 이황화 결합 형성, 파르네실화, 히드록실화, 메틸화 또는 에스테르화를 포함한다.
항체의 기능적 단편은 F(ab')2 단편, Fab 단편, scFv의 도메인 또는 단일 면역글로불린 가변 도메인 또는 단일 도메인 항체 폴리펩티드, 예컨대, 단일 중쇄 가변 도메인 또는 단일 경쇄 가변 도메인 뿐만 아니라, 본원 상기에 기술된 다른 항체 단편을 포함하는 구축물을 포함한다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1 및 CL 도메인 사이에서 일어나는 분자간 이황화 상호작용을 최소화하거나 또는 완전히 제거하도록 조작될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "인간" 항체라는 용어는 항체 또는 그의 기능적 단편이 인간 생식계열 항체 레퍼토리에 함유되어 있는 아미노산 서열(들)을 포함한다는 것을 의미하는 것으로서 이해하여야 한다. 본원에서의 정의 목적으로, 그러므로, 항체 또는 그의 단편은 그가 상기 인간 생식계열 아미노산 서열(들)로 이루어져 있다면, 즉, 해당 항체 또는 그의 기능적 단편의 아미노산 서열(들)이 발현된 인간 생식계열 아미노산 서열(들)과 동일하다면, 인간 항체인 것으로 간주될 수 있다. 또한, 항체 또는 그의 기능적 단편은 그가 체세포 초돌연변이의 흔적에 기인되는 것으로 예상되는 정도로만 그의 (그들의) 가장 가까운 인간 생식계열 서열(들)로부터 이탈하는 서열(들)로 이루어진 경우라면, 이 또한 인간 항체인 것으로 간주될 수 있다. 추가로, 많은 비인간 포유동물, 예를 들어, 설치류 예컨대, 마우스 및 래트의 항체는 발현된 인간 항체 레퍼토리에도 존재하는 것으로 예측될 수 있는 VH CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 발현된 인간 레퍼토리에 존재하는 것으로 예측될 수 있는 인간 또는 비인간 기원의 임의의 상기 서열(들)은 본 발명의 목적을 위한 "인간" 항체로 간주될 수 있다. 따라서, "인간 항체"라는 용어는 예를 들어, 카바트(Kabat) 등에 의해 기술된 것 (문헌 [Kabat et al. (1991) loc. cit.] 참조)을 비롯한, 당업계에 공지된 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 실질적으로 상응하는 가변 및 불변 영역을 가는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어, CDR에, 및 특히 CDR3에 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (시험관내에서 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이에 의해, 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 위치에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 코딩되지 않는 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
비인간 및 인간 항체 또는 그의 기능적 단편은 바람직하게는 모노클로날이다. 모노클로날인 인간 항체를 제조하는 것은 특히 어렵다. 불멸화 세포주와 뮤린 B 세포와의 융합과 달리, 불멸화된 세포주와 인간 B 세포의 융합은 실행 불가능하다. 따라서, 인간 모노클로날 항체는 항체 기술 분야에 존재하는 것으로 일반적으로 인정되는 상당한 기술적 장애를 극복한 결과이다. 상기 항체는 잘 특징화되고, 재현 가능하게 제조 및 정제될 수 있는 단일의 균질한 분자 종으로서 존재할 수 있는 바, 이에, 항체의 모노클로날인 성질을 통해서 항체는 특히 치료제로서 사용하는 데 매우 적합한 것이 될 수 있다. 이러한 요소들을 통해서 상기 분자가 인간에서 치료학적 투여를 위한 규제 승인을 획득하고자 한다면, 매우 중요한, 생물학적 활성을 높은 수준의 정밀도로 예측할 수 있는 생성물을 얻을 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 의미하며, 즉, 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 발생된 돌연변이 및/또는 번역 후 변형 (예컨대, 이성질체화 또는 아미드화)를 제외하면, 이는 동일한 것이다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원성 부위에 대한 것이다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 종래 (폴리클로날) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다. 그의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양물에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. "모노클로날"이라는 수식어는 항체가 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되었다는 특징을 나타내는 것이며, 이는 임의의 특정 방법으로 항체를 생산하여야 한다는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 의해 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예컨대, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기술된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
모노클로날 항체 또는 상응하는 기능적 단편은 인간 항체 또는 상응하는 기능적 단편인 것이 특히 바람직하다. 인간에게로의 치료학적 투여를 목적으로 하는 항체 작용제를 고려할 때, 항체는 인간 기원인 것이 매우 유리하다. 인간 환자에게로의 투여 후, 인간 항체 또는 그의 기능적 단편은 환자의 면역계에 의한 강력한 면역원성 반응을 대부분 야기하지 않을 것이며, 즉, 비인간 단백질인 이물질로는 인식되지 않을 것이다. 이는 다르게는 치료학적 항체의 활성을 차단하고/거나, 환자 체내로부터의 치료학적 항체의 제거를 가속화시킴으로써 그의 원하는 치료학적 효과가 발휘되지 못하게 방해하는, 치료학적 항체에 대한 숙주, 즉, 환자의 항체는 생성되지 않을 것이라는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 제약 용도로 사용되는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편은 인간과 1종 이상의 원숭이 종 사이에 반응성을 보인다. 동일한 종간 교차 반응성은 GM-CSF의 모든 다른 비-항체 또는 비항체-유래된 중화/억제성 화합물의 경우에도 바람직하다.
본 발명의 추가의 실시양태에 따라, 항체는 IgG 항체일 수 있다. IgG 이소타입은 고도로 특이적인 항원 인식 및 결합을 담당하는 중쇄 및 경쇄의 가변 항체 영역 뿐만 아니라, 일반적으로 "천연적으로" 생산된 항체, 및 일부 경우에는 심지어 하나 이상의 부위에서 탄수화물로 변형이 된 항체에 존재하는 항체 폴리펩티드 중쇄 및 경쇄의 불변 영역을 포함한다. 상기 글리코실화는 일반적으로 IgG 포맷의 특징이며, 생체내에서 다양한 이펙터 기능을 유도하는 것으로 알려져 있는 완전 항체의 소위 Fc 영역이라는 영역을 포함하는 불변 영역에 위치한다. 추가로, Fc 영역은 Fc 수용체에의 IgG의 결합 뿐만 아니라, Fc 수용체 존재가 증가되어 있는 위치 - 예를 들어, 염증 부위로의 IgG의 귀소 촉진을 매개한다. 유리하게, IgG 항체는 그의 생체내 작용 기전이 특히 잘 이해되고 특징화되어 있기 때문에 바람직한 포맷인 IgG1 항체 또는 IgG4 항체이다.
본 발명의 추가의 실시양태에 따라, 항체의 기능적 단편은 바람직하게 scFv, 단일 도메인 항체, Fv, VHH 항체, 디아바디, 탠덤 디아바디, Fab, Fab' 또는 F(ab)2일 수 있다. 상기 포맷은 일반적으로 2가지 서브부류, 즉, 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 것, 및 2개 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 것으로 분류될 수 있다. 전자의 서브부류의 구성원으로는 (폴리펩티드 링커를 통해 단일 폴리펩티드 쇄로 연결된 하나의 VH 영역 및 하나의 VL 영역을 포함하는) scFv; (단일 항체 가변 영역을 포함하는) 단일 도메인 항체, 예컨대, (단일 VH 영역을 포함하는) VHH 항체를 포함한다. 후자의 서브부류의 구성원으로는 (서로 비공유적으로 회합되어 있는 별개의 폴리펩티드 쇄로서 하나의 VH 영역 및 하나의 VL 영역을 포함하는) Fv; (비공유적으로 회합되어 있는 두 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 각각은 2개의 항체 가변 영역 - 일반적으로, 폴리펩티드 쇄 1개당 하나의 VH 및 하나의 VL을 포함하며 - 두 폴리펩티드 쇄는 헤드-투-테일 입체형태로 배열되어 있으며, 이로써, 2가 항체 분자가 생성되는 것인) 디아바디; 탠덤 디아바디 (2개의 상이한 특이성을 가지는, 공유적으로 연결된 4개의 면역글로불린 가변 - VH 및 VL - 영역을 포함하며, 이로써, 상기 기술된 디아바디의 2배로 큰 동종이량체를 형성하는 것인, 이중특이적 단일 쇄 Fv 항체); (그 자체가 VL 영역 및 전체 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인 전체 항체 경쇄를 한 폴리펩티드 쇄로서, 및 완전 VH 영역 및 중쇄 불변 영역의 일부를 포함하는 항체 중쇄의 일부를 또 다른 폴리펩티드 쇄로서 포함하며, 상기 두 폴리펩티드 쇄는 쇄간 이황화 결합을 통해 분자간 연결되어 있는 것인) Fab; (상기 Fab와 동일하되, 단, 예외적으로, 항체 중쇄 상에 환원된 이황화 결합을 추가로 포함하는) Fab'; 및 (2개의 Fab' 분자를 포함하며, 각 Fab' 분자가 쇄간 이황화 결합을 통해 각각의 다른 Fab' 분자에 연결되어 있는 것인) F(ab)2를 포함한다. 일반적으로, 본원 상기 기술된 유형의 항체의 기능적 단편은 예를 들어, 직면한 긴급 사태에 맞게 치료학적 투여를 위해 요구되는 항체의 약동학적 특성을 적합화시키는 데 있는 큰 유연성을 허용한다. 예를 들어, 혈관화가 잘 일어나지 않는 것으로 알려져 있는 조직 (예를 들어, 관절)을 치료할 때, 조직의 투과 정도를 증가시키기 위해 투여되는 항체의 크기를 축소시키는 것을 바람직할 수 있다. 일부 상황에서는 또한, 일반적으로 투여되는 항체 크기 축소를 통해 가속화될 수 있는, 치료학적 항체가 신체로부터 제거되는 속도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명과 관련하여, 항체 단편은, 단편이 모체 항체의 에피토프/표적에 대해 특이적인 결합 특징을 유지하는 한, 즉, 단편이 GM-CSF에, 또는 GM-CSF 수용체에 특이적으로 결합하는 한, 기능적 항체 단편으로서 정의된다.
본 발명의 추가의 실시양태에 따라, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편은 1가 단일특이적; 다가 단일특이적, 특히, 2가 단일특이적; 또는 다가 다중특이적, 특히, 2가 이중특이적 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 다가 단일특이적, 특히, 2가 단일특이적 항체, 예컨대, 본원 상기 기술된 바와 같은 완전 인간 IgG는, 상기 항체에 의해 발휘되는 중화가 결합도 효과, 즉, 같은 항원, 여기서, 같은 항체에 의한 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체의 다중 분자에의 결합에 의해 강화된다는 치료학적 이점을 가지고 있다. 수개의 1가 단일특이적 형태의 항체 단편 (예를 들어, scFv, Fv, VHH 또는 단일 도메인 항체)이 상기 기술되어 있다. 다가 다중특이적, 특히, 2가 이중특이적 형태의 항체는, 한 결합 아암은 영장류 GM-CSF/GM-CSF 수용체에 결합하는 반면, 그의 나머지 다른 결합 아암은 GM-CSF/GM-CSF 수용체와 다른 또 다른 항원에 결합하는 것인, 완전 IgG를 포함할 수 있다. 추가의 다가 다중특이적, 특히, 2가 이중특이적 형태는 유리하게는 인간 단일 쇄 이중특이적 항체, 즉, 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같은 짧은 개재 폴리펩티드 스페이서에 의해 하나의 인접한 폴리펩티드 쇄로 연결된, 상기 기술된 바와 같은 2개의 scFv 엔지지를 포함하는 재조합 인간 항체 구축물일 수 있다 (예를 들어, 항-CD19 x 항-CD3 이중특이적 단일 쇄 항체에 대해 WO 99/54440 참조). 본원에서, 이중특이적 단일 쇄 항체 내에 포함된 이중특이적 단일 쇄 항체의 한 scFv 부분은 상기 기술된 바와 같은 GM-CSF/GM-CSF 수용체에 특이적으로 결합할 것이며, 동시에, 상기 이중특이적 단일 쇄 항체의 다른 scFv 부분은 각각 치류학상 유익한 것으로 확인된 또 다른 항원에 결합하게 될 것이다.
추가의 실시양태에 따라, 항체 또는 그의 기능적 단편은 예를 들어, 유기 중합체로, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG") 및/또는 폴리비닐 피롤리돈 ("PVP")인 하나 이상의 분자로 유도체화될 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 상기 유도체화는 항체 또는 그의 기능적 단편의 약력학적 특성을 조정하는 데 유리할 수 있다. 시스테인 아미노산의 술프히드릴 기를 통해 부위 특이적인 방식으로 항체 또는 그의 기능적 단편과 접합할 수 있는, PEG-말레이미드로 유도체화된 PEG 분자가 특히 바람직하다. 이중 분지형 또는 직쇄형 형태의 20 kD 및/또는 40 kD PEG-말레이미드가 특히 바람직하다. PEG, 특히, PEG-말레이미드 중 하나 이상의 분자에 커플링시킴으로써 더 작은 인간 항-GM-CSF 항체 단편, 예컨대, scFv 단편의 유효 분자량을 증가시키는 것이 특히 유리할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래된, 또는 특정 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나, 또는 그와 상동성인 반면, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래된, 또는 또 다른 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나, 또는 그와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라, 그가 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]). 본원에서 관심의 대상이 되는 키메라 항체로는 비인간 영장류 (예컨대, 긴꼬리 원숭이(Old World Monkey), 유인원 등) 및 인간 불변 영역 서열로부터 유도된 가변 도메인 항체 결합 서열을 포함하는 "프리마티즈드(primatized)" 항체를 포함한다.
"인간화" 형태의 비인간 (예컨대, 뮤린) 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열은 최소로 함유하고, 대부분의 인간 서열의 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예컨대, 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 다른 항원 결합 서브서열)이다. 대개, 인간화 항체는, 수령체의 초가변 영역 (또한 CDR)으로부터의 잔기가 비인간 종 (공여체 항체), 예컨대, 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 가지는 마우스, 래트 또는 토끼의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 치환된 것인, 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 치환된다. 본원에서 사용되는 바, "인간화 항체"는 또한 수령체 항체에서도, 공여체 항체에서도 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 정제하고 최적화하기 위해 이루어진다. 인간화 항체는 또한 최적으로는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로, 인간 면역 글로불린의 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 설명을 위해, 문헌 [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)]; [Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)]를 참조할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 인간 및 비인간 영장류 GM-CSF의 아미노산 잔기 또는 위치의 넘버링은 성숙한 GM-CSF, 즉, 그의 17개의 아미노산으로 이루어진 신호 서열을 포함하지 않는 GM-CSF (상기에 기술된 인간 및 비인간 영장류 종, 둘 모두에서 성숙한 GM-CSF의 총 길이는 127개 아미노산이다)의 넘버링을 나타낸다. 인간 GM-CSF 및 긴팔 원숭이 GM-CSF의 서열은 하기와 같다:
Figure pct00001
.
마카카 원숭이 과의 특정 구성원, 예컨대, 예를 들어, 레서스 원숭이 및 시노몰구스 원숭이에서의 GM-CSF의 서열은 하기와 같다:
Figure pct00002
.
인간 GM-CSF의 서열은 또한 서열식별번호: 57에 제시되어 있다. 긴팔 원숭이 GM-CSF의 서열은 또한 서열식별번호: 58에 제시되어 있다.
Figure pct00003
.
마카카 원숭이 과의 특정 구성원, 예컨대, 예를 들어, 레서스 원숭이 (서열식별번호: 59) 및 시노몰구스 원숭이 (서열식별번호: 60)의 GM-CSF의 서열은 하기와 같다:
Figure pct00004
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항체, 바람직하게, 인간 모노클로날 항체 (또는 그의 기능적 단편)이 결합하는 최소의 에피토프, 유리하게는 본원에 기술된 바와 같은 불연속 에피토프는 상기 GM-CSF 서열(들)에서 굵은체로 표시되어 있다.
바람직한 실시양태에 따라, GM-CSF를 중화시키는 화합물은 GM-CSF에 결합하는 항체 (바람직하게 인간 모노클로날 항체) 또는 그의 기능적 단편이다. 더욱 바람직하게, 이는 바람직하게는 아미노산 23-27 (RRLLN) 및/또는 아미노산 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL)을 포함하는 GM-CSF의 에피토프에 결합한다. 상기 아미노산 서열 스트레치는 상기 GM-CSF 서열에서 굵은체로 표시되어 있다. "에피토프"라는 용어는 화합물, 예컨대, 항체 또는 그의 기능적 단편이 특이적으로 결합하는 항원 또는 표적 (예컨대, GM-CSF) 상의 부위를 의미한다. 상기 결합/상호작용은 또한 "특이적 인식"을 정의하는 것으로 이해된다. "에피토프"는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산 둘 모두에 의해 형성될 수 있다. "선형 에피토프"는 아미노산 1차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 선형 에피토프는 전형적으로 독특한 서열에 3개 이상 또는 4개 이상, 및 더욱 일반적으로, 5개 이상, 또는 6개 이상, 또는 7개 이상, 예를 들어, 약 8 내지 약 10개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명과 관련하여, GM-CSF 에피토프는 불연속 에피토프인 것이 바람직하다. 항체가 서열 스트레치 23-27 및 65-77, 둘 모두에 결합하는 경우에, 에피토프는 "불연속" 에피토프로 명명될 수 있다. 인간 GM-CSF의 2차 구조에서, 아미노산 15-35는 나선 A에 위치하는 반면, 65-77번 위치에 상응하는 잔기는 나선 C와 D 사이에 위치한 루프 구조의 일부이다. 분자의 폴딩의 3차원 모델을 통하여 서로에 대하여 이들 부위의 가까운 입체 근접성이 밝혀졌다 (또한 WO 2006/111353 참조). 본원에서 사용되는 바, "불연속 에피토프"라는 용어는 주어진 폴리펩티드 쇄, 여기서, 성숙한 인간 및 비인간 영장류 GM-CSF 내의, 항체가 동시에 및 특이적으로 결합하는, 2개 이상의 비인접 아미노산 서열 스트레치로서 이해하여야 한다. 이 정의에 따르면, 이러한 동시의 특이적인 결합은 선형 형태의 GM-CSF 폴리펩티드의 결합일 수 있다. 여기서, 연장된 루프를 형성하는 성숙한 GM-CSF 폴리펩티드로서, 그의 한 영역이 상기 굵은체로 표시된 두 서열은 예를 들어, 다소 병렬로 및 서로 인접하게 정렬되어 있을 수 있다는 것을 상상할 수 있다. 이러한 상태에서, 이들은 항체 단편에 의해 특이적으로 및 동시적으로 결합된다. 이 정의에 따르면, 상기 명시된 성숙한 GM-CSF의 2개의 서열 스트레치의 동시 특이적인 결합은 또한 입체구조 에피토프에 결합하는 항체의 구조를 취할 수 있다. 여기서, 성숙한 GM-CSF는 일반적으로 생체내에서 존재하는 것과 같은 그의 3차 입체구조를 이미 형성하였다. 이러한 3차 입체구조에서, 성숙한 GM-CSF의 폴리펩티드 쇄는 예를 들어, 성숙한 폴딩된 GM-CSF의 특정 영역의 외부 표면성에서 상기 명시된 2개의 서열 스트레치가 공간상 인접하도록 폴딩되고, 이어서, 주변 폴리펩티드 서열과 관련하여 그의 3차원 입체구조에 의해 인식된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, GM-CSF의 상기 에피토프 또는 상기 불연속 에피토프는 하기의 것을 추가로 포함한다:
· 상기 인간 및 비인간 영장류 GM-CSF 서열 중 이탤릭체로 표시된, 아미노산 28-31 (LSRD);
· 상기 인간 및 비인간 영장류 GM-CSF 서열 중 밑줄로 표시된, 아미노산 32-33 (TA); 및/또는
· 상기 인간 및 비인간 영장류 GM-CSF 서열 중 밑줄로 표시된, 아미노산 21-22 (EA).
바람직한 인간 모노클로날 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 WO 2006/111353에, 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1-3 뿐만 아니라, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 전장의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타내는 것인, 참조 서열식별번호 1 내지 48 및 52 내지 56하에 구체적으로 개시되어 있는 것이다.
서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 1에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 2에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 3에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 4에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 5에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 6에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 7에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 8에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 9에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 10에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 11에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 12에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 13에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 56에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하는 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편이 특히 바람직하다.
더욱더 바람직하게, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 상기 14개의 조합 중 임의의 것은 그의 경쇄 가변 영역에, 서열식별번호: 16에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 17에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 18에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 추가로 포함하는 항체 또는 그의 기능적 단편에 존재한다.
특히 바람직한 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 서열식별번호: 14에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR1 서열, 서열식별번호: 15에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR2 서열, 및 서열식별번호: 2에 명시된 중쇄 가변 영역 CDR3 서열을 포함하고, 그의 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 16에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 17에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 18에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 추가로 포함한다. 상기 항-GM-CSF 항체가 GM-CSF를 중화시키는 데 있어 가장 바람직한 화합물이고, 이는 WO 2006/111353에도 또한 기술되어 있다.
추가의 실시양태에 따라, 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 20에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 21에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 22에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 23에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 24에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 25에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 26에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 27에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 28에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 29에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 30에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 31에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 32에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 33에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 52에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 53에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편이 바람직하다.
추가의 실시양태에 따라, 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 20에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 21에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 22에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 23에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 24에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 25에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 26에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 27에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 28에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 29에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 30에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 31에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 32에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 33에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 52에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 54에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 53에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편이 바람직하다.
추가의 실시양태에 따라, 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 20에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 21에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 22에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 23에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 24에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 25에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 26에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 27에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 28에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 29에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 30에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 31에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 32에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 33에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 52에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편; 또는 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55에 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 53에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 기능적 단편이 바람직하다.
바람직한 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 그의 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 16에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 17에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열식별번호: 18에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고, 그의 중쇄 가변 영역에 서열식별번호: 14에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 15에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 56 중 임의의 것에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 항체는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 35에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 36에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 37에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 38에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 39에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 40에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 41에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 42에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 43에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 44에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 45에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 46에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 47에 명시된 아미노산 서열; 또는 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 48에 명시된 아미노산 서열을 포함한다. 그의 경쇄에 서열식별번호: 34에 명시된 아미노산 서열 및 그의 중쇄에 서열식별번호: 35에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 항-GM-CSF 항체가 GM-CSF를 중화시키는 데 있어 가장 바람직한 화합물이고, 이는 WO 2006/111353에도 또한 기술되어 있다.
상기 바람직한 실시양태는, 특히 영장류 및 인간 GM-CSF의 활성의 중화제로서 유리한, 항체 분자 및/또는 그의 기능적 단편, 바람직하게 인간 모노클로날 항체 분자 및/또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 상기의 특히 바람직한 실시양태에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편은 여러 이유에서 매우 이롭다.
첫째, 이들은 높은 특이성으로 영장류 및 인간 GM-CSF를 인식한다. 즉, 영장류 GM-CSF와 영장류 콜로니 자극 인자 (예를 들어, 영장류 G-CSF 및 M-CSF)의 혼합물로부터, 이들 특히 바람직한 실시양태에 따른 결합 분자는 영장류 GM-CSF를 고도로 구별하는 반면, 동일한 환경에서 콜로니 자극 인자는 인식하지 못한다. 이는 필요한 부분만 약간 수정되어 인간 GM-CSF에게 동일하게 적용된다. 이는 본 실시양태에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편을 인간에게 투여할 때, 원하는 표적에만 특이적으로 결합하여 그를 중화시키는 것으로 예상되는 반면, 원하지 않는 다른 표적에는 결합하지도, 중화시키지도 않는다는 것을 의미한다. 결국, 이는 생체내에서의 치료학적 작용 모드에 관한 예측성을 고도로 부여한다.
둘째, 상기의 특히 바람직한 실시양태에 따른 결합제는 상당한 친화도로 영장류 및 인간 GM-CSF에 결합한다. "상당한 친화도"는 약 10-6M (KD) 이상의 친화도로 결합하는 것을 포함한다. 바람직하게, 결합 친화도가 약 10-12 내지 10-8 M, 10-12 내지 10-9 M, 10-12 내지 10-10 M, 10-11 내지 10-8 M, 바람직하게, 약 10-11 내지 10-9 M일 때, 결합은 상당한 (또는 높은 또는 특이적인) 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명의 결합제의 KD는 바람직하게는 상기 범위 내에 포함되어 있다. KD 값이 약 4 x 10-9 M에서부터 아래로 약 0.04 x 10-9 M (약 40 pM에 상응하는 값이다)만큼 낮은 값인 것으로 본원에 기술된 항체 분자에 대하여 관찰되었다고 고려해 볼 때, 본 발명의 항체 분자의 KD는 상기 범위 내에 포함되어 있는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 항체 분자의 KD가 상기 기술된 것보다 높은 경우에도 또한 바람직하다. 수성 매질 내에서 상기 분자의 동적 온-속도는 주로 확산에 의해 제어되는 바, 이에 생리학적 조건하에서 국소 확산 조건이 허용하는 것 이상으로 개선될 수 없기 때문에, 낮은 KD는 주로 동적 오프-속도인, k 오프의 결과로서 발생되며, 친화도가 가장 높은 항체 결합제의 경우, k 오프는 10-5 s- 1이다. 이는 일단 한쪽으로는 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편과, 및 나머지 다른 쪽으로는 GM-CSF와의 복합체가 형성되고 나면, 이들 복합체는 쉽게 분리되지 않거나, 적어도 빠르게 분리되지 않음을 의미한다. 생물학적 활성의 중화제로 의도되는 결합 분자의 경우, 이러한 특징은 매우 유리한데, 그 이유는 중화시키고자 하는 분자 (여기서, 영장류 및 인간 GM-CSF)의 생물학적 활성이 중화 결합 분자에 의해 결합되어 있는 동안에 한해서만 일반적으로 원하는 중화 효과가 지속되기 때문이다. 따라서, 오랜 시간 동안 그의 의도되는 표적에 대해 결합된 상태 그대로 유지되는 중화 분자는 그에 상응하는 오랜 시간 동안 중화가 지속될 것이다.
항체 또는 그의 기능적 단편의 영장류 및 인간 GM-CSF에의 높은 결합 친화도는 추가의 이점을 가진다. 일반적으로, 항체 또는 그의 기능적 단편은 크기 의존적 방식으로 환자의 혈류로부터 제거되며, 더 작은 분자가 더 큰 분자보다 먼저 배출 및 제거된다. 두 폴리펩티드-항체 또는 항체 단편 및 결합된 GM-CSF-의 복합체는 명백하게 단일의 항체보다 더 크기 때문에, 상기 언급한 낮은 k 오프로 인해 치료학적 중화제는 GM-CSF에 결합 되지 않은 경우보다 더 느리게 환자의 신체로부터 배출 및 제거된다. 따라서, 중화 활성의 크기 뿐만 아니라, 생체내에서의 지속 기간도 증가하게 된다.
상기 실시양태에 따른 결합제에 대해 측정된 중화 활성은 놀라울 정도로 높다. 본원 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 바, GM-CSF-중화 활성은 시험관내에서 TF-1 성장 억제 검정법을 사용하여 측정되었다 (문헌 [Kitamura, T. et al. (1989). J. Cell Physiol. 140, 323-34]). 중화력의 지표로서, IC50 값이 측정되었는데, IC50은 TF-1 세포 증식 억제 최대치의 절발을 유도하는 데 요구되는 상기 실시양태 중 어느 것에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편의 농도를 나타낸다. 상기 명시된 인간 모노클로날 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편에 대해, IC50 값은 3 x 10-10 M, 또는 약 0.3 nM인 것으로 측정되었다. 따라서, 결합 분자는 영장류 및 인간 GM-CSF의 활성의 매우 강력한 중화제이다.
중화 항-GM-CSF 항체의 다른 예로는 문헌 [Li el al., (2006) PNAS 103(10):3557-3562]에 기술되어 있는 인간 E10 항체 및 인간 G9 항체가 있다. E10 및 G9는 IgG 부류 항체이다. E10은 GM-CSF에 대해 870 pM의 결합 친화도를 가지고, G9는 GM-CSF에 대해 14 pM의 친화도를 가진다. 두 항체 모두 인간 GM-CSF에 대해 특이적이며, TF-1 세포 증식 검정법으로 평가한 바와 같이 강력한 중화 활성을 나타낸다. 다른 예는 WO 2006/122797에 개시된 바와 같은 인간 항-GM-CSF 항체이다.
또한 항-GM-CSF 수용체 항체인 GM-CSF 길항체 또는 중화제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 이러한 GM-CSF 길항제는 GM-CSF 수용체 알파 쇄 또는 베타 쇄에 대한 항체를 포함한다. 본 발명에서 사용된 항-GM-CSF 수용체 항체는 상기 설명된 바와 같은 임의의 항체 형태, 예컨대, 무손상, 키메라, 모노클로날, 폴리클로날, 항체 단편 또는 유도체, 단일 쇄, 인간화, 인간 관계된 등과 같은 형태일 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한, 항-GM-CSF 수용체 항체, 예컨대, 중화 고친화도 항체의 예는 당업계에 공지되어 있다 (예컨대, 미국 특허 5,747,032 및 문헌 [Nicola et al., Blood 82:15 1724, 1993] 참조).
적합한 항체에 대한 더욱 추가적인 서열은 출원에 제공되어 있으며, 그 전문이 참조로 포함된다. 항-GM-CSF 항체는 WO2006/122797, WO2007/049472, WO2007/092939, WO2009/134805, WO2009/064399, WO2009/038760에 제공되어 있다. GM-CSF 수용체에 대한 항체는 WO2007/110631에 제공되어 있다.
요약컨대, 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편은 원하는 항원에 대하여 고도의 식별력을 나타내고, 이 항원에 장기간 동안 극히 밀착 결합하고, 결합되어 있는 장시간 동안 매우 강력한 중화 활성을 나타낸다. 동시에, 결합제-항원 복합체는 오래 지속되므로 상기 결합제는 신체로부터 천천히 제거되고, 이에 따라, 생체내에서의 원하는 치료학적 효과의 지속 기간은 연장된다. 또한, 바람직하게는 상기 기술된 바와 같이, GM-CSF 수용체를 인식하는 항체에 대해 동일한 특징이 적용된다.
본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 제약 조성물이다. 본 실시양태에 따라, "제약 조성물"이라는 용어는 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 제약 조성물 또는 제제는 보통 활성 성분의 생리학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하며, 따라서, 이는 본원에 기술된 바와 같은 치료학적 용도로 대상체에게 투여될 수 있다. 통상적으로, 제약 조성물은 담체, 안정제 및/또는 부형제로 이루어진 적합한 (즉, 제약상 허용되는) 제제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 비경구, 경피, 강내, 동맥내, 척수강내 및/또는 비내 투여하기 위한 용도의 조성물, 또는 조직으로 직접 주사하기 위한 용도의 조성물을 포함한다. 특히, 상기 조성물은 주입 또는 주사에 의해 환자에게 투여되는 것이 구상된다. 적합한 조성물의 투여는 다양한 방식에 의해, 예컨대, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 진피내 투여에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 당업계에 널리 알려져 있고, 이는 완충처리된 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대, 오일/물 에멀젼, 각종 유형의 습윤화제, 멸균 용액, 리포솜 등을 포함한다. 상기 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 종래 방법에 의해 제제화될 수 있다.
본 실시양태 따르면, "유효량"이라는 용어는 GM-CSF와 연관된 질환, 예컨대, 염증성 및 자가면역 장애의 치료에 효과적인 GM-CSF를 중화시키는 화합물의 양을 의미한다.
투여의 바람직한 방법 및 바람직한 투여량은 투여 후 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 유효 투여량으로 혈액 내에 존재하도록 하는 것이다. 투여 계획은 질환 상태를 관찰하고, 시험실 시험에서 GM-CSF를 중화시키는 화합물의 혈청 수준을 분석한 후, 투여 간격을 예컨대, 주 2회 또는 주 1회 내지 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회 등을 연장하거나, 또는 대안적으로는 투여 간격을 상응하는 방식으로 감소시킴으로써 조정될 수 있다.
제약 조성물은 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 투여량 요법은 담당 의사 및 임상 인자에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에 널리 알려져 있는 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여하고자 하는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적 건강 상태 및 동시에 투여되는 다른 약물을 비롯한 다수의 인자에 의존한다.
비경구 투여용 제제에는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트를 포함한다. 수성 담체로는 물, 알콜/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유당화된 링거액 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 비히클로는 유체 및 영양성 보충제, 전해질 보충제 (예컨대, 링거 덱스트로스에 기초한 것들) 등을 포함한다. 또한, 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 불활성 가스 또한 존재할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 제약 조성물은 단백질성 담체 등, 예컨대, 혈청 알부민 또는 면역글로불린, 바람직하게는 인간 기원의 것을 포함한다. 본 발명에 따른 제약 조성물은 상기 기술된 화합물 이외에도, 상기 제약 조성물의 사용 용도에 따라, 생물학적으로 활성인 작용제를 추가적으로 포함할 수 있다는 것이 구상된다. 이러한 작용제는 위장관 시스템에 작용하는 약물, 세포증식억제제로서 작용하는 약물, 고뇨산혈증을 방지하는 약물, 면역반응을 억제하는 약물 (예컨대, 코르티코스테로이드제), 염증 반응을 조절하는 약물, 순환계에 작용하는 약물 및/또는 당업계에 공지된 시토카인과 같은 작용제일 수 있다.
예를 들어, 류마티스성 관절염 (RA)에서의 GM-CSF 중화 화합물의 효과를 분석하기 위해서, 결과 척도는 약동학적 성질, 면역원성, 및 DAS28, ACR20/50/70 및/또는 EULAR 반응 기준으로서 측정된 임상 징후 및 증상을 개선시는 효능, 건막염 및 골 부종에 대한 MRI 영상화 뿐만 아니라, 환자가 보고한 결과로부터 선택될 수 있다. ACR은 압통 관절 및 부은 관절의 개수, 통증 척도의 개선, 환자와 의사의 개선의 평가 및 특정 실험실 마커를 요약한 척도이다. ACR 20은 임상 징후 및 증상에서의 20% 개선, 예컨대 20, 압통 관절 또는 부은 관절 계수의 20% 개선 뿐만 아니라, 3개의 다른 질환 관련 기준에서의 20% 개선을 달성한 연구 참여자의 비율을 기술한다.
본 발명에 따른 제약 조성물과 같은 약물의 개발에서 또 다른 주요 도전 과제는 약동학적 특성의 예측가능한 조절이다. 본 목적을 위하여, 약물 후보의 약동학적 프로파일, 즉, 주어진 병태를 치료할 수 있는 특정 약물의 능력에 영향을 주는 약동학적 파라미터의 프로파일을 확립한다. 특정 질환 엔티티를 치료하기 위한 약물의 능력에 영향을 주는 약물의 약동학적 파라미터로는 반감기, 분포 부피, 간의 초회-통과 (first-pass) 대사 및 혈청 결합 정도를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 주어진 약물 작용제의 효능은 상기 언급한 각각의 파라미터에 의해 영향받을 수 있다. "반감기"란 투여된 약물의 50%가 예컨대, 대사, 배출 등과 같은 생물학적 프로세스를 통하여 제거되는 시간을 의미한다. "간의 초회-통과 대사"란, 약물이 간과의 최초 접촉시, 즉, 간을 통한 약물의 최초 통과가 이루어지는 동안에, 약물이 대사되는 성향을 의미한다. "분포 부피"란, 예컨대, 세포내 및 세포외 공간, 조직 및 기관 등과 같은 신체의 다양한 구획들을 통한 약물의 보유 정도 및 이러한 구획들 내의 약물의 분포를 의미한다. "혈청 결합 정도"란, 약물이 알부민과 같은 혈청 단백질들과 상호작용하고 이에 결합하여 약물의 생물학적 활성을 감소 또는 손실시키는 약물의 성향을 의미한다.
약동학적 파라미터는 또한 주어진 양의 투여 약물에 대한 생체이용률, 지체 시간 (Tlag), T최대, 흡수율, 및/또는 C최대를 포함한다. "생체이용률"이란, 혈액의 구획에 있는 약물의 양을 의미한다. "지체 시간"은 약물의 투여와 혈액 또는 혈장에서의 그의 검출 및 측정가능함 사이의 지연된 시간을 의미한다. "T최대"는 약물의 혈중 농도가 최대에 도달한 후의 시간이며, 흡수는 투여 부위로부터 전신 순환으로의 약물의 이동으로 정의되고, "C최대"는 주어진 약물을 사용하여 최대로 획득되는 혈중 농도이다. 생물학적 효과에 요구되는 약물의 혈중 또는 조직 농도에 도달하는 데 소요되는 시간은 모든 파라미터들에 의해 영향을 받는다.
본원에서 사용되는 바, "독성"이라는 용어는 유해 사례 또는 중증 유해 사례로 나타나는 약물의 독성 효과를 의미한다. 이러한 부작용은 일반적으로 약물의 내약성의 결핍 및/또는 투여 후 국소적 내성의 결핍을 가리킬 수 있다. 독성은 또한 약물에 의해 유발되는 기형발생 또는 발암 효과를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "안전성," "생체내 안전성" 또는 "내약성"이라는 용어는 투여 직후 (국소적 내성) 및 약물의 오랜 복용 기간 동안에 중증 유해 사례를 유도하지 않는 약물의 투여를 의미한다. "안전성," "생체내 안전성" 또는 "내약성"은 예컨대, 치료 및 후속 조치 기간 동안에 정기적인 시간 간격으로 평가될 수 있다. 측정으로는 임상 평가, 예컨대, 기관 징후 발현, 및 실험실 검사 결과 이상의 스크리닝을 포함한다. 임상 평가가 수행될 수 있으며, NCI-CTC 및/또는 MedDRA 표준에 따라 정상적인 관찰 결과에서 벗어남 편위는 기록되고/코드화될 수 있다. 기관 징후 발현으로는 예컨대, 유해 사례에 대한 공통 용어 기준(Common Terminology Criteria for adverse events) v3.0 (CTCAE)에 기술된 것과 같은, 알레르기/면역학, 혈액/골수, 심부정맥, 응고 등을 포함할 수 있다. 시험될 수 있는 실험실 파라미터로는 예를 들어, 혈액학, 임상 화학, 응집 프로파일 및 소변 분석 및 다른 체액, 혈청, 혈장, 림프구 또는 척수액, 분비액 등을 포함한다. 따라서, 안전성은, 예컨대, 신체 검사, 영상화 기술 (즉, 초음파, x선, CT 스캔, 자기 공명 영상화 (MRI)), 기술 장치를 이용한 다른 측정 (즉, 심전도), 활력 징후에 의해, 실험실 파라미터 측정에 의해, 및 유해 사례 기록에 의해 평가될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "유효한 비독성 용량"은 주요한 독성 효과 없이 또는 본질적으로 그러한 효과 없이 관심의 대상이 되는 질환을 치유하거나, 그를 안정화시키는 데 충분할 정도로 높은, GM-CSF를 중화시키는 화합물, 바람직하게, 본원에서 정의된 항체의 허용 용량을 의미한다. 상기 유효한 비독성 용량은, 예컨대, 당업계에 기술된 용량 단계적 확대 연구에 의해 측정될 수 있고, 이는 중증 유해 부작용 (용량 제한 독성, DLT)을 유도하는 용량 미만이어야 한다.
본 발명의 제제 (종종 본원에서 "물질의 조성물": "조성물," 또는 "용액"으로도 지칭된다)는 바람직하게는 다양한 물리적 상태로, 예컨대, 액체, 냉동, 동결건조, 냉동 건조, 분무 건조 및 재구성된 제제 형태일 수 있고, 액체 및 냉동된 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는 바, "액체 제제"란, 실온에서 분리되는 경향 없이 그들 사이에서 구성 분자가 자유롭게 이동하는 것을 특징으로 하는, 액체로 발견되는 물질의 조성물을 의미한다. 액체 제제는 수성 및 비수성 액체를 포함하고, 수성 제제가 바람직하다. 수성 제제는 용매 또는 주 용매가 물인, 바람직하게는 주사용수 (WFI)인 제제이다. 제제에서 GM-CSF를 중화시키는 화합물의 용해는 균질성 또는 비균질성일 수 있고, 상기 기술된 바와 같이 균질성인 것이 바람직하다.
본 발명의 제제에 대해 안정성을 제공한다면, 임의의 적합한 비수성 액체가 사용될 수 있다. 바람직하게, 비수성 액체는 친수성 액체이다. 적합한 비수성 액체의 예시적인 예로는 글리세롤; 디메틸 술폭시드 (DMSO); 폴리디메틸실록산 (PMS); 에틸렌 글리콜, 예컨대, 에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG") 200, PEG 300, 및 PEG 400; 및 프로필렌 글리콜, 예컨대, 디프로필렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 ("PPG") 425 및 PPG 725를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "혼합된 수성/비수성 액체 제제"는 물 바람직하게는 WFI 및 추가의 액체 조성물의 혼합물을 함유하는 액체 제제를 의미한다.
본원에서 사용될 때, "제제" 또는 "조성물"은 GM-CSF를 중화시키는 화합물 (즉, 활성 약물/ 물질)과 바람직하게는 액체 상태인 의료 제품에 필요한 첨가제 및/또는 화학 물질의 혼합물이다. 본 발명의 제제는 제약 제제를 포함한다.
제제의 제조는 활성 약물을 비롯한 상이한 화학 물질을 조합하여 예컨대, 제약 조성물과 같은 최종 의료 제품을 제조하는 프로세스를 포함한다. 본 발명의 제제의 활성 약물은 GM-CSF를 중화시키는 화합물이다.
특정 실시양태에서, 제제화하고자 하는 GM-CSF를 중화시키는 화합물은 본질적으로 순수하고/거나, 본질적으로 균질성이다 (즉, 생성물과 관련되고/거나, 프로세스와 관련된 불순물일 수 있는, 오염 물질, 예컨대, 단백질 등이 실질적으로 없다). "본질적으로 순수한"이라는 용어는 조성물이 약 80중량% 이상, 바람직하게, 약 90중량% 이상의 화합물, 바람직하게, 약 95중량% 이상의 화합물, 더욱 바람직하게, 약 97중량% 이상의 화합물 또는 가장 바람직하게, 약 98중량% 이상의 화합물을, 바람직하게, 화합물을 단량체 상태로 포함한다는 것을 의미한다. "본질적으로 균질한"이라는 용어는 조성물이 용액 중 각종 안정제 및 물의 질량을 제외하고, 약 99중량% 이상의 화합물, 바람직하게, 화합물을 단량체 상태로 포함한다는 것을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "약"이라는 용어는 주어진 값의 최대 5%까지, 최대 10%까지, 최대 15%까지 또는 최대 20%까지 (및 20% 포함)일 수 있는 각각의 값 또는 범위 (예컨대, pH, 농도, 백분율, 몰농도, 아미노산 개수 등)에 변화가 있을 수 있음을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 예를 들어, 제제가 약 5 mg/ml의 화합물을 포함하는 경우, 이는 제제가 4 내지 6 mg/ml, 바람직하게, 4.25 내지 5.75 mg/ml, 더욱 바람직하게, 4.5 내지 5.5 mg/ml 및 더욱더 바람직하게, 4.75 내지 5.25 mg/ml, 가장 바람직하게는, 5 mg/ml를 포함할 수 있음을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 본원에서 사용되는 바, "X(부터) 내지 Y"로서 정의되는 간격은 "X 내지 Y"로서 정의되는 간격과 동일하다. 두 간격 모두 구체적으로 상한치 및 또한 하한치를 포함한다. 이는 예를 들어, "5 mg/ml 내지 10 mg/ml" 또는 "5 mg/ml 내지 10 mg/ml"인 간격이 5, 6, 7, 8, 9, 및 10 mg/ml 뿐만 아니라, 임의의 주어진 중간 값의 농도를 포함한다는 것을 의미한다.
"안정한" 제제는 그 안의 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 보관시 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하고/거나, 바람직하게는 색상 및/또는 투명도의 시각적 검사시, 또는 UV 산란 광에 의해 측정되는 바, 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해, 대조군 샘플과 비교하였을 때 응집, 침전, 단편화, 분해 및/또는 변성에 대한 실질적 징후를 나타내지 않는 것을 의미한다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 추가의 분석 기술은 당업계에서 이용가능하고, 예를 들어, 문헌 [Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)] 및 [Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에서 리뷰된다.
본원에서 사용되는 바, "보관 동안"은 제제가 일단 제조되고 나면, 바로 사용되기보다는; 그의 제조 후, 보관을 위해 액체 형태, 냉동 상태, 또는 추후에 액체 형태 또는 다른 형태로 재구성되는 건조 형태로 포장되는 것을 의미한다.
GM-CSF를 중화시키는 화합물은 바람직하게는 보관 동안 및/또는 냉동/해동 동안 또는 그 이후에 및/또는 전단 응력 (예컨대, 진탕 또는 여과 단계로부터의 것) 동안 또는 그 이후에 (예를 들어, 상기 언급한 원인 중 하나 이상의 것으로 인해) 응집체 또는 육안으로 볼 수 없는/육안으로 볼 수 있는 입자 또는 단편/분해 생성물을 실질적으로 형성하지 않는 한, 이는 안정한 것으로 구상된다. 따라서, 보관 시작 시점 또는 1회 이상의 냉동/해동 사이클 수행 이전 또는 진탕 연구 수행 이전과 비교하였을 때, 바람직하게는 10% 이하의, 더욱 바람직하게는 8% 이하의, 더욱더 바람직하게는 5% 이하의, 특히 바람직하게는 2% 이하의 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 응집체, 입자 및/또는 단편을 형성하는 것이 구성된다. 이러한 안정성은 바람직하게는 1개월 이상, 2개월 이상, 또는 3개월 이상; 바람직하게, 4개월 이상, 5개월 이상, 또는 6개월 이상; 더욱 바람직하게, 9개월 이상, 또는 12개월 이상; 더욱더 바람직하게 18개월 이상 또는 24개월 이상; 및 가장 바람직하게, 30개월 이상 또는 36개월 이상 또는 48개월 이상 또는 54개월 이상 또는 60개월 이상의 시간 범위 동안 적용된다. 바람직한 보관 온도 조건은 최대 실온 (약 20℃ 내지 약 25℃), 더욱 바람직하게, 약 2-8℃이고, 가장 바람직한 시간 범위는 3년 이상 또는 심지어는 4년 이상이다. 일부 실시양태에서, GM-CSF를 중화시키는 화합물은 온난한 기후의 실온 (예컨대, 약 30℃)에서 안정적이다. 화합물이 그 기간 동안 상기 파라미터에 따라 바람직하게 안정적인 것인 냉동/해동 사이클 횟수는 1회 이상의 사이클, 바람직하게 2, 3, 또는 4회 이상의 사이클, 더욱 바람직하게, 5, 6 또는 7회 이상의 사이클, 및 가장 바람직하게, 8, 9 또는 10회 이상의 사이클이다. 진탕일수, 예컨대, GM-CSF를 중화시키는 화합물을 운송하는 동안, 화합물이 그 기간 동안 상기 파라미터 (예컨대, +5℃±3℃에서, 또한 실시예 12d 참조)에 따라 바람직하게 안정적인 것인 진탕일수는 1일 이상, 바람직하게 2, 3, 또는 4일 이상, 더욱 바람직하게, 5, 6 또는 7일 이상, 더욱더 바람직하게 8, 9, 10 또는 11일 이상 및 가장 바람직하게, 12, 13 또는 14일 이상이다.
대안적으로, GM-CSF를 중화시키는 화합물이 바람직하게는 이량체, 올리고머 또는 단편을 형성하지 않는 한, 안정한 것으로 구상된다. 다르게 말하면, GM-CSF를 중화시키는 화합물의 안정성은 용액 중 단량체 단백질의 비율에 따라, 여기서, 분해된 (예컨대, 단편화된), 미립자 (예컨대, 육안으로 볼 수 있는 입자 및/또는 육안으로 볼 수 없는 입자) 및/또는 응집된 단백질의 낮은 비율에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, GM-CSF 중화 화합물, 예컨대, 항체를 포함하는 본 발명의 제제는 GM-CSF를 중화시키는 화합물의 단량체를 90% 이상, 더욱 바람직하게, 92% 이상, 더욱더 바람직하게, 95% 이상, 특히 바람직하게, 98% 이상, 및 가장 바람직하게, 99% 이상을 포함할 수 있다.
"응집하다"라는 것은 가용성인 상태 그대로 유지될 수 있는 공유 또는 비공유 이량체 또는 올리고머 (즉, 높은 분자량 엔티티, 예컨대, 삼량체 또는 다량체)의 형성을 유도하는 단백질 사이의 물리적 상호작용을 의미한다. "응집체"는 또한 분해되고/거나 단편화된 단백질을 포함한다. 응집체, 예컨대, 가용성 응집체의 크기는 일반적으로 1 ㎛ 미만이다.
"육안으로 볼 수 없는 입자"란, 크기가 1 ㎛ 초과 내지 최대로는 크기가 대략 100 ㎛인, 가역적 또는 비가역적 단백질 입자의 형성을 유도하는 단백질 분자 (분해된 또는 단편화된 단백질)의 물리적 상호작용을 의미한다. 가용성 응집체 및/또는 단백질 분자 (분해된 또는 단편화된 단백질 포함)는 결합하여 육안으로 볼 수 없는 입자를 형성할 수 있다.
"육안으로 볼 수 있는 입자"는 전형적으로 크기가 100 ㎛ 초과이고, 예컨대, 내인성 단백질인 육안으로 볼 수 있는 입자, 예컨대, 더 작은 육안으로 볼 수 없는 입자, 응집체, 또는 단백질 분자 (분해된 또는 단편화된 단백질 포함)로부터 형성된 것, 또는 외인성 육안으로 볼 수 있는 입자, 예컨대, 보관 용기 또는 전달 장치로부터의 외래 물질을 포함하는 것일 수 있다. 조합 생성물, 예컨대, 실리콘 소적으로부터 유래된 일부 외인성 또는 내인성 입자는 입자가 아닌 액체이지만, 일부 검정법에서는 입자로서 검출될 수도 있다.
본원 상기에서 언급된 바와 같이, 다수의 상이한 분석 방법을 사용하여 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 포함하는 제제 중 응집체의 존재 및 수준을 검출할 수 있다. 상기 방법으로는 예를 들어, 천연 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE), 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 매트릭스 지원 레이저 탈흡수-이온화 비행 시간 질량 분광법 (MALDI-TOF MS), 모세관 겔 전기영동 (CGE), 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 분석적 초원심분리 (AUC), 장 유동 분별법 (FFF), 침강 속도, UV 분광법, 시차 주사 열량측정법, 비탁법, 혼탁측정법, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC), 역상-고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC), 전기 분무 이온화 텐덤 질량 분광법 (ESI-MS) 및 탠덤 RP-HPLC/ESI-MS, 유동 장-유동 분별법 기법 및 정적 및/또는 동적 광산란을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 바람직하게, GM-CSF를 중화시키는 화합물을 포함하는 제제 중 응집체 및/또는 단편의 존재 및 수준을 검출하는 분석 방법은 크기 배제 크로마토그래피, 예컨대, SE-HPLC, 분석적 초원심분리 및 비대칭 장 유동 분별법이다. GM-CSF를 중화시키는 화합물의 생물학적 활성을 측정하는 방법은 예컨대, 화합물의 (고정화된) GM-CSF (또는 GM-CSF 수용체)에의 결합하는 정도 측정으로, 소위 표면 플라즈몬 공명 (SPR)이라 하는 것이다.
단백질을 포함하는 제제의 경우, 그의 일반적인 도전 과제는 시간, 열, 또는 전단 응력로 인한 응집체의 비가역적 축적이다. 전형적으로, 응집체 침전시, 응집체는 쉽게 검출되는 큰 입자를 형성한다. 그러나, 종종 큰 입자로의 침전의 전구체인 것인, 더 작은 비공유 가용성 응집체는 검출 및 정량화하기가 더 어렵다. 따라서, 단백질 제제 중 단백질 응집을 검출 및 정량화하는 방법은 평가되는 응집체의 종류에 기초하여야 한다.
상기 방법들 중, 단백질 제제 중 가용성, 공유 응집체의 존재 및/또는 양을 측정하기 위해 제안되는 방법은 SEC/광 산란법, SDS-PAGE, CGE, RP-HPLC/ESI-MS, FFF 및 AUC이다. 단백질 제제 중 가용성, 비공유 응집체의 존재 및/또는 양을 측정하기 위해 제안되는 방법은 SEC, PAGE, SDS-PAGE, CGE, FFF, AUC, 및 동적 광 산란법이다. 단백질 제제 중 불용성, 비공유 응집체의 존재 및/또는 양을 측정하기 위해 제안되는 방법은 UV 분광법, 비탁법, 혼탁측정법, 현미경법, AUC, 비대칭 장 유동 분별법 및 동적 광 산란법이다.
육안으로 볼 수 없는 입자는 또한 분해된 단백질, 응집체, 또는 더 작은 육안으로 볼 수 없는 입자로부터 형성될 수 있다. 육안으로 볼 수 없는 입자의 존재 및/또는 양을 측정하기 위해 제안되는 방법은 광 산란법, 예컨대, 정적 (예컨대, 다중 각도 레이저 광 산란법에 의해) 또는 동적 (예컨대, 광자 상관 분광법에 의해), 나노입자 추적 분석 (NTA, 예컨대, 말번 인스트로먼츠(Malvern Instruments: 영국 말번)), 광 차폐, 또는 다른 액체 입자 계수 시스템, 예컨대, 현미경법, 동적 영상화 (미세유동 영상화, 예컨대, 브라이트웰(Brightwell) (셀 바이오사이언시즈(Cell Biosciences: 캐나다 오타와)) 또는 플루오CAM® 이미지(FLOWCAM® Image) 입자 분석기 (플루이드 이미징 테크놀로지즈(Fluid Imaging Technologies: 미국 메인주 야머스) 등), 유세포 분석법, 및 전자 임피이던스 (쿨터(Coulter)) 계수법이다.
또한, 본 발명의 제제는 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 바람직하게 액체 또는 냉동, 바람직하게는 액체 형태로 보관 기간에 걸쳐 안정할 수 있도록 장기간 보관을 개선시킨다. 본원에서 사용되는 바, "장기간" 보관이라는 어구는 제제가 적어도 1개월, 2 또는 3개월 이상 동안, 6개월 이상 동안, 및 바람직하게, 1년 이상 또는 심지어, 2년, 3년 또는 4년 또는 5년 이상 동안 보관될 수 있다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 장기가 보관은 또한 제약 조성물이 2-8℃에서 또는 주변 온도, 바람직하게는 2-8℃에서 보관되어, 이에 따라 상기 제제가 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 정도로 그의 생물학적 활성을 잃지 않고/않거나, 본원에 기술된 바와 같은 정도로 응집체를 형성하지 않고/거나, 본원에 기술된 바와 같은 정도로 단량체를 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 이들 특성에 대한 시험은 본원 다른 곳에 기술되어 있다.
본 발명의 한 측면에서, 제제 중 GM-CSF를 중화시키는 화합물은 액체 형태로 1개월, 2개월, 3개월 이상; 4개월 이상, 5개월 이상; 6개월 이상; 12개월 이상; 24개월 이상; 36개월 이상; 48개월 이상 동안, 또는 마지막 60개월째 안정적이다. 또한, 상기 언급된 시간 기간에 대한 중간 범위, 예컨대, 9개월 등이 본 발명의 부분인 것으로 의도된다. 추가로, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 언급된 값의 임의의 조합을 사용하는 값의 범위가 포함되는 것으로 의도된다. 바람직하게, 제제는 1개월 이상 동안 실온 (약 20℃ 내지 25℃)에서 안정적이고/거나, 약 2-8℃에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 이상 동안 안정적이거나, 또는 더욱 바라직하게, 약 2-8℃에서 2년 이상, 3년 이상, 4년 이상 또는 심지어는 5년 이상 동안 안정적이다.
안정성의 또 다른 중요한 측면은 본 발명에 따른 조성물 내의 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 보관 기간 동안 및 보관 조건, 특히, 온도 및 가능한 온도 변화 내에서 그의 생리학적 활성 및 효능을 유지한다는 것이다. 활성 또는 효능은 예컨대, (본원 상기 기술된 바와 같이, 세포 기반 검정법으로 측정될 수 있는) 화합물 그 자체의 중화 능력에 의해 또는 GM-CSF에 또는 GM-CSF 수용체에 결합할 수 있는 GM-CSF 중화 화합물의 능력에 의해 반영된다. 결합 친화성은 SPR 또는 당업계에 널리 알려져 있는 다른 방법, 예컨대, 비아코어 또는 스캐차드(Scatchard) 검정법에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 제제는 예컨대, 수용액, 완충제, 장성 조절제 및 계면활성제, 아미노산, 항산화제 및/또는 킬레이트제 중 하나 이상의 것 중 (여기서, 계면활성제가 바람직하다) 본원에 기술된 바와 같은 GM-CSF를 중화시키는 화합물에 첨가함으로써 제조된다. 당업자는 제제에 포함시키고자 하는 다양한 성분을 조합시키는 것이 임의의 적절한 순서로 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 완충제는 처음에, 중간에, 또는 마지막에 첨가될 수 있고, 장성 조절제는 처음에, 중간에, 또는 마지막에 첨가될 수 있고, 계면활성제, 아미노산, 항산화제 및/또는 킬레이트제 중 하나 이상의 것이 처음에, 중간에, 또는 마지막에 첨가될 수 있다. 또한 당업자는 이들 화학 물질 중 일부가 특정 조합에서 양립불가능할 수 있고, 따라서, 특성은 유사하지만, 관련된 혼합물에서 양립가능한 다른 화학 물질로 쉽게 치환될 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 제제는 완충제를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "완충제" 또는 "완충화제"라는 용어는 pH를 원하는 범위로 유지시키는 작용제를 포함한다. 완충제는 약산과 그의 접합된 염기 또는 약염기와 그의 접합된 산의 혼합물로 이루어진 수용액이다. 완충제는 소량의 강산 또는 강염기가 첨가되었을 때, 용액의 pH가 거의 변하지 않는 성향을 가진다. 완충제 용액은 매우 다양한 화학적 적용에서 거의 불변한 값으로 pH를 유지시키는 수단으로서 사용된다. 일반적으로, 완충제는 본 발명의 제제에서 적용되는 경우, 바람직하게 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 안정화시킨다.
본원에서 사용될 때, "아미노산 완충제"는 예를 들어, 아미노산 염기, 예컨대 히스티딘 및 그의 접합된 염을 포함한다. 아미노산 완충제의 예로는 히스티딘/히스티딘 클로라이드가 있다. 상기 예는 바람직하게 본 발명에 적용된다.
본원에 기술된 바와 같은 제제의 바람직한 pH는 하기 범위: 약 4 내지 약 10, 바람직하게, 약 4 내지 약 6 또는 약 5 내지 약 7, 더욱 바람직하게, 약 5.5 내지 약 6.5로부터 선택될 수 있다. 가장 바람직하게, pH는 약 pH 5.8 또는 정확하게 pH 5.8이다. 따라서, 바람직하게는 용액을 pH 5 내지 7로 유지시킬 수 있는 완충제가 사용된다. pH 값/범위와 관련하여 사용될 때, "약"이라는 용어는 바람직하게는 언급된 값 주변의 +/-20%의 범위를 가지는 수치값을 의미한다. 제약 조성물의 pH가 생리학적 수준으로 또는 대략적으로 가까운 생리학적 수준으로 설정되는 경우, 투여시 환자의 편안함은 최대화된다. pH는 특정 제제에서 GM-CSF를 중화시키는 화합물의 안정성 및 가용성을 최대화시키기 위해 필요에 따라 조정될 수 있고, 따라서, 생리학적 범위 바깥의 pH이지만 바람직하게는 환자에게 용인되는 것이 본 발명의 범주에 속한다는 것을 이해하여야 한다.
본원에 기술된 제제에서 사용될 수 있는 완충제의 비제한적인 예로는 히스티딘, 숙시네이트, 글루코네이트, 시트레이트, 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 트리스(트로메타몰), 비스-트리스, MOPS, ACES, TES, HEPES, EPPS, 에틸렌디아민, 인산, 말레산/포스페이트, 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 포스페이트, 아세테이트 및 디에탄올아민을 포함한다.
바람직한 완충제는 히스티딘, 아세테이트 및 시트레이트 완충제이다. 더욱 바람직하게, 히스티딘 완충제는 본 발명의 제제 중, 바람직하게, pH 5 내지 7, 더욱 바람직하게, pH 5.5 내지 6.5, 더욱더 바람직하게, pH 5.8로 적용된다. 본 발명에 적용되는 완충제는 당업계에 널리 알려져 있고, 공지된 방법에 의해 제조되고, 상업적 공급업체로부터 이용가능한다. 일부 실시양태에서, 완충제의 pH는 수산화나트륨 없이 (0 mM NaOH) 제조된다. 한 실시양태에서, 완충제는 완충제를 제조하는 동안 별개의 산 또는 염기를 이용한 pH 조정이 필요하지 않도록 하는 비율로 미리 측정될 수 있는, 아미노산 및 그의 염의 혼합물, 예컨대, 히스티딘 및 히스티딘 염의 혼합물이다.
일부 실시양태에서, 제제는 수산화나트륨 (NaOH)을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제는 1-200 mM, 또는 50 mM 미만, 40 mM 미만, 35 mM 미만, 30 mM 미만, 25 mM 미만, 20 mM 미만, 또는 15 mM 미만, 예컨대, 10 mM NaOH 이하, 예컨대, 5 mM 또는 1 mM 수산화나트륨을 포함한다.
GM-CSF를 중화시키는 화합물 및 완충제 이외에도, 본 발명에 따른 제제는 또한 안정화제 (안정제)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 물질을 함유할 수 있다.
따라서, 바람직한 측면에서, 제제는 장성 조절제로서도 또한 작용할 수 있는 안정제를 포함한다. "안정화제"라는 용어는 제제, 특히, GM-CSF를 중화시키는 화합물의 안정성을 개선시키거나, 또는 다르게는 증진시키키는 제제를 의미한다. 장성 조절제인 안정제는 비환원성 당, 당 알콜 또는 그의 조합일 수 있다. 본 발명의 액체 조성물 중 장성 조절제는 확실하게 용액의 장성, 즉, 용액의 오스몰 농도가 본질적으로 정상적인 생리학적 체액과 동일하고, 따라서, 조성물과 생리학적 체액 사이의 차등적인 이온 농도에 기인한 조성물의 빠른 흡수 또는 투여 이후 부종을 방지하게 한다. 일반적으로, 본원에 기술된 제제의 성질은 제제의 삼투압 몰농도가 약 240 내지 약 500 mOsmol/kg, 더욱 바람직하게, 약 300 내지 약 450 mOsmol/kg, 더욱더 바람직하게, 약 350 내지 약 450 mOsmol/kg, 가장 바람직하게, 약 400 mOsmol/kg이 되게 한다.
바람직하게, 안정화제/장성 조절제는 비환원당 중 하나 이상의 것, 예컨대, 수크로스 또는 트레할로스, 또는 당 알콜 중 하나 이상의 것, 예컨대, 만닛톨 또는 소르비톨일 수 있고, 비환원당 및 당 알콜의 조합 또한 바람직하다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 안정화제/장성 조절제의 농도는 하기 범위: 1 내지 15% (w/v), 2 내지 10% (w/v), 3 내지 8% (w/v), 4 내지 6.5% (w/w), 4.5 내지 6% (w/v)로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 농도는 약 5 내지 6% (w/v)이다. 본 발명의 제제에 적용되는 바람직한 안정제/장성 조절제는 바람직하게는 5% (w/v)의 소르비톨이다.
바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 제제는 하나 이상의 추가의 부형제를 포함한다. 바람직하게, 부형제는 계면활성제, 아미노산, 항산화제, 킬레이트제 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 용액 (또한 건조 또는 냉동 형태) 중에 있는 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 안정화시키는 화학 첨가제, 공용질, 또는 공용매로서 또한 지칭되는 부형제가 본 발명의 제제에 첨가될 수 있다. 바람직하게, 부형제는 GM-CSF를 중화시키는 화합물의 안정성에 기여하지만, 부형제는 다르게는 제제의 물리적, 화학적, 및 생물학적 특성에 기여할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 부형제는 당업계에 널리 알려져 있고, 공지된 방법에 의해 제조되고, 상업적 공급업체로부터 이용가능하다.
바람직한 부형제는 계면활성제이다. "계면활성제"라는 용어는 일반적으로 공기/용액 계면 유도성 응력 및 용액/표면 유도성 응력으로부터 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 보호하는 제제를 포함한다. 상기 계면 응력은 단백질 응집 및 입자 형성을 유도함으로써, 제품 품질을 허용불가능하게 만들 수 있다. 계면 응력의 예는 i) 공기, ii) 용기 봉함재, 예컨대, 고무 플런저, 피스톤, 유리, 미리 충전된 시린지, iii) 생산 관련 물질, 예컨대, 강철 탱크, 배관 및 펌프, 및 iv) 냉동/해동 중의 얼음 등과 단백질의 접촉일 수 있다. 계면활성제를 제제에 첨가하면, 액체/공기 계면, 얼음/액체 계면, 및 단백질-단백질 상호작용을 비롯한, 소수성 계면과 단백질의 상호작용은 감소될 것이다. 계면활성제는 냉동, 혼합, 여과 및 펌핑과 같은 조작 동안에 생성되는 육안으로 볼 수 없는 및 육안으로 볼 수 있는 입자의 양을 감소시킬 것이다.
계면활성제의 예로는 제한 없이, 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 (예컨대, 폴리소르베이트 80 (PS80) 또는 폴리소르베이트 20 (PS20) (폴리소르베이트는 또한 일반적으로 상품명 트윈(TWEEN)® (ICI 아메리카스(ICI Americas))로 알려져 있다); 폴록사머 (예컨대, 폴록사머 188); 트리톤(Triton) 소둠 도데실 술페이트 (SDS); 소듐 라우렐 술페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-술포베타인, 미리스틸-술포베타인, 리놀레일-술포베타인, 스테아릴-술포베타인, 라우릴-사르코신, 미리스틸-사르코신, 리놀레일-사르코신, 스테아릴-사르코신, 리놀레일-베타인, 미리스틸-베타인, 세틸-베타인, 라우로아미도프로필-베타인, 코카미도프로필-베타인, 리놀레아미도프로필-베타인, 미리스타미도프로필-베타인, 팔미도프로필-베타인, 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예컨대, 라우로아미도프로필), 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 오페일-타우레이트; 및 모타콰트(Monaquat) 시리즈 (모나 인더스트리즈, 인크.(Mona Industries, Inc.: 미국 뉴저지주 패터슨)), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예컨대, 플루로닉스, PF68)를 포함한다. 바람직하게, 본원에 기술된 제제에 사용되는 계면활성제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 및 그의 조합으로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택된다.
첨가되는 계면활성제의 양은 예컨대, SEC-HPLC를 이용하여 검정된 바와 같이, 허용되는 수준으로 단백질의 응집을 유지하고, 또한, 예컨대, 광 차폐, 현미경법, 및 동적 영상화 기반 입자 계수 시스템, 예컨대, 미세유동 영상화 또는 플로우CAM(FlowCAM)에 의해 측정되는 바와 같이, 보관, 제조, 냉동/해동, 운송 등 동안 형성되는 육안으로 볼 수 없는 입자 또는 육안으로 볼 수 있는 입자의 양을 감소시킬 수 있도록 하는 양이다.
일부 실시양태에서, 제제 중 계면활성제의 양은 임계 응집 농도 (CAC)에 기초하여 결정된다. CAC는 계면활성제가 단백질과 상호작용하기 시작하는 농도이다. 예컨대, 장력계로부터의 표면 장력 측정치를 그래프로 플롯팅하여 도 7과 유사한 곡선을 얻었다. 제1 불연속점에서의 계면활성제 농도가 CAC이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 계면활성제의 양은 CAC보다 더 높은 양이다. 일부 실시양태에서, 계면활성제의 양은 CAC보다는 높지만, 임계 미셀 농도 (CMC)보다는 적은 양이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제제는 최대 200 mg/mL인 단백질 농도에 대하여 약 0.001% (w/v) 내지 약 1% (w/v)의, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 계면활성제를 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 폴리소르베이트 20 대 단백질 비는 약 0.01:1 내지 약 3:1, 바람직하게, 약 0.05:1 내지 약 2:1, 더욱 바람직하게, 약 0.1:1 내지 약 1.5:1, 더욱더 바람직하게, 약 0.1:1 내지 약 0.8:1, 및 가장 바람직하게, 약 0.1:1 내지 약 0.2:1이다. 단백질 농도가 80 mg/mL인 경우, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.001% (w/v) 내지 약 0.2% (w/v), 바람직하게, 약 0.005% (w/v) 내지 약 0.15% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.007% (w/v) 내지 약 0.1% (w/v), 더욱더 바람직하게, 약 0.007% (w/v) 내지 약 0.06% (w/v) 및 가장 바람직하게, 약 0.01% (w/v)이다. 단백질 농도가 150 mg/mL인 경우, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.001% (w/v) 내지 약 0.4% (w/v), 바람직하게, 약 0.006% (w/v) 내지 약 0.25% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.18% (w/v), 더욱더 바람직하게, 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.1% (w/v) 및 가장 바람직하게, 약 0.02% (w/v)이다.
또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 20 대 단백질 비는 약 0.3:1 내지 약 3:1, 바람직하게, 약 0.5:1 내지 약 2.0:1, 더욱 바람직하게, 약 0.5:1 내지 약 1.5:1, 더욱더 바람직하게, 약 0.8:1 내지 약 1.2:1, 및 가장 바람직하게, 약 1:1이다. 단백질 농도가 80 mg/mL인 경우, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.02% (w/v) 내지 약 0.2% (w/v), 바람직하게, 약 0.03% (w/v) 내지 약 0.13% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.05% (w/v) 내지 약 0.08% (w/v) 및 가장 바람직하게, 약 0.07% (w/v)이다. 단백질 농도가 150 mg/mL인 경우, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.04% (w/v) 내지 약 0.4% (w/v), 바람직하게, 약 0.06% (w/v) 내지 약 0.25% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.1% (w/v) 내지 약 0.15% (w/v) 및 가장 바람직하게, 약 0.13% (w/v)이다.
또 다른 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리소르베이트 80 대 단백질 비는 약 0.01:1 내지 약 3:1, 바람직하게, 약 0.05:1 내지 약 2:1, 더욱 바람직하게, 약 0.1:1 내지 약 1.5:1, 더욱더 바람직하게, 약 0.1:1 내지 약 0.6:1, 및 가장 바람직하게, 약 0.3:1 내지 약 0.6:1이다. 단백질 농도가 80 mg/mL인 경우, 폴리소르베이트 80 농도는 약 0.001% (w/v) 내지 약 0.2% (w/v), 바람직하게, 약 0.004% (w/v) 내지 약 0.14% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.007% (w/v) 내지 약 0.1% (w/v), 더욱더 바람직하게, 약 0.007% (w/v) 내지 약 0.05% (w/v), 및 가장 바람직하게, 약 0.04% (w/v)이다. 단백질 농도가 150 mg/mL인 경우, 폴리소르베이트 80 농도는 약 0.001% (w/v) 내지 약 0.4% (w/v), 바람직하게, 약 0.007% (w/v) 내지 약 0.26% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.2% (w/v), 더욱더 바람직하게, 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.08% (w/v), 가장 바람직하게, 약 0.04% (w/v)이다.
또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80 대 단백질 비는 약 0.3:1 내지 약 3:1, 바람직하게, 약 0.5:1 내지 약 2.0:1, 더욱 바람직하게, 약 0.5:1 내지 약 1.5:1, 더욱더 바람직하게, 약 0.8:1 내지 약 1.2:1, 및 가장 바람직하게, 약 1:1이다. 단백질 농도가 80 mg/mL인 경우, 폴리소르베이트 80 농도는 약 0.02% (w/v) 내지 약 0.2% (w/v), 바람직하게, 약 0.04% (w/v) 내지 약 0.14% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.06% (w/v) 내지 약 0.09% (w/v), 가장 바람직하게, 약 0.07% (w/v)이다. 단백질 농도가 150 mg/mL인 경우, 폴리소르베이트 80 농도는 약 0.04% (w/v) 내지 약 0.4% (w/v), 바람직하게, 약 0.06% (w/v) 내지 약 0.27% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.1% (w/v) 내지 약 0.16% (w/v), 가장 바람직하게, 약 0.13% (w/v)이다.
다른 바람직한 부형제는 항산화제 또는 킬레이트제일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "항산화제"는 다른 분자의 산화를 저속화시키거나, 막을 수 있는 분자이다. 산화는 전자를 물질로부터 산화제로 전달하는 화학 반응이다. 항산화제 또는 킬레이트제는, 용액 중 퍼옥시드를 형성할 수 있는, 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20의 첨가에 의해 도입되는 산화 효과를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 항산화제 및/또는 킬레이트제, 예컨대, 아스코르브산 (비타민 C), 리포산, 멜라토닌, 요산, 카로틴, 레티놀, 토코페롤 및 토코트리에놀, 예컨대, α-토코페롤 (비타민 E), 유비퀴논 (조효소 Q) 메티오닌, 시스테인, 시트르산, EDTA, 또는 DTPA가 제제에 첨가될 수 있다. 더욱 바람직하게, 메티오닌, 시스테인, 또는 시트르산은 항산화제:계면활성제가 약 3:1 내지 약 156:1인 몰비로, 또는 약 1:1 내지 약 150:1인 항산화제:단백질 몰비로 첨가된다. 더욱 바람직하게, 항산화제:단백질인 경우, 비는 약 2:1 내지 약 100:1, 더욱더 바람직하게, 약 3:1 내지 약 20:1, 가장 바람직하게, 약 3:1 내지 약 8:1이다.
제제 중 단백질을 안정화시키는 데 첨가될 수 있는 또 다른 부형제는 아미노산이다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 중에서 사용되는 아미노산은 트레오닌, 세린, 프롤린, 알라닌, 발린, 글루타민, 메티오닌, 시스테인, 이소류신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 글리신, 히스티딘, 리신, 페닐알라닌, 류신, 아스파라긴, 트립토판, 티로신 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게, 아미노산은 아르기닌, 트레오닌, 세린, 알라닌, 글루타민, 메티오닌, 글리신 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 조성물에서 사용되는 아미노산 농도는 바람직하게 약 10 mM 내지 약 100 mM, 더욱 바람직하게, 약 50 mM 내지 약 100 mM 범위이다.
추가 부형제로의 예로는 당/폴리올, 예컨대: 수크로스, 락토스, 글리세롤, 크실리톨, 소르비톨, 만닛톨, 말토스, 이노시톨, 트레할로스, 글루코스; 중합체, 예컨대: 혈청 알부민 (소 혈청 알부민 (BSA), 인간 SA 또는 재조합 HA), 덱스트란, PVA, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 히드록시에틸셀룰로스 (HEC), 히드록시에틸 전분 (HES); 비수성 용매, 예컨대: 다가 알콜, (예컨대, PEG, 에틸렌 글리콜 및 글리세롤) 디메틸술폭시드 (DMSO) 및 디메틸포름아미드 (DMF); 및 기타 부형제, 예컨대: 인산칼륨, 아세트산나트륨, 황산암모늄, 황산마그네슘, 황산나트륨, 트리메틸아민 N-옥시드, 베타인, 금속 이온 (예컨대, 아연, 구리, 칼슘, 망간, 마그네슘), CHAPS, 모노라우레이트, 2-O-베타-만노글리세레이트 또는 상기의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"동결 방지제"는 제조, 냉동, 보관, 처리, 유통, 재구성, 또는 사용 동안 냉동 단백질에 안정성을 제공하는 물질을 포함한다. 특정 측면에서, "동결 방지제"는 냉동 프로세스에 의해 유도된 응력으로부터 단백질을 보호하는 물질을 포함한다. 동결 방지제는 동결건조보호 효과를 가질 수 있다. 동결 방지제의 비제한적인 예로는 당, 예컨대, 수크로스, 글루코스, 트레할로스, 만닛톨, 소르비톨, 만노스, 및 락토스; 중합체, 예컨대, 덱스트란, 히드록시에틸 전분, 폴리비닐피롤리돈 (PVP) 및 폴리에틸렌 글리콜; 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 (예컨대, PS-20 또는 PS-80); 및 아미노산, 예컨대, 글리신, 아르기닌, 류신, 및 세린을 포함한다. 생물학적 시스템에서 낮은 독성을 보이는 동결 방지제가 일반적으로 사용된다.
본원에 기술된 바와 같은 이당류는 동결건조보호제 또는 동결 방지제로서 작용할 수 있다. "동결건조보호제"는 동결건조 및 후속 보관시 단백질의 화학적 또는 물리적 불안정을 방지 또는 감소시키는 물질을 포함한다. 한 측면에서, 동결건조보호제는 건조 프로세스 동안 물이 조성물로부터 제거되기 때문에, 단백질에서 화학적 또는 물리적 불안정을 방지 또는 감소시킨다. 추가의 측면에서, 동결건조보호제는 수소 결합을 통해 단백질의 적절한 입체구조를 유지하는 데 도움을 줌으로써 단백질을 안정화시킨다.
따라서, 한 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 이당류는 냉동 동안 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 안정화시키는 역할을 할 수 있다. 냉동 동안 보호는 이당류의 절대 농도에 의존할 수 있기 때문에 (문헌 [Carpenter et al., Pharm. Res. (1997), 14:969-975]), 5% 초과의 농도가 안정성을 최대화시키는 데 필요할 수 있다.
한 실시양태에서, 동결건조보호제는 본원에 기술된 제제에 첨가된다. 본원에서 사용되는 바, "동결건조보호제"라는 용어는 비정질 유리질 매트릭스를 제공함으로써, 및 수소 결합을 통해 단백질과 결합함으로써, 건조 프로세스 동안 제거되는 물 분자를 교체함으로써 냉동-건조 또는 탈수 프로세스 (일차 및 이차 동결 건조 사이클) 동안 단백질에 안정성을 제공하는 작용제를 포함한다. 이는 단백질 입체구조를 유지시키고, 동결건조 사이클 동안 단백질 분해를 최소화하고, 장기간의 생성물 안전성을 개선시키는 데 도움을 준다. 동결건조보호제는, 동결건조보호량의 동결건조보호제의 존재하에서의 GM-CSF를 중화시키는 화합물의 동결건조 후, 화합물이 본질적으로 동결건조 및 보관시 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 무결성을 유지한다는 것을 의미하는 "동결건조보호량"으로 미리 동결건조되는 제제에 첨가된다.
동결건조보호제의 비제한적인 예로는 당, 예컨대, 수크로스 또는 트레할로스; 아미노산, 예컨대, 글루탐산모노나트륨, 글리신 또는 히스티딘; 메틸아민, 예컨대, 베타인; 리오트로픽 염, 예컨대, 황산마그네슘; 폴리올, 예컨대, 3가 이상의 당 알콜, 예컨대, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨, 및 만닛톨; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉스; 및 그의 조합을 포함한다. 바람직하게, 동결건조보호제는 안정화제에 대해 상기 기술된 바와 같다. 제제에 첨가되는 동결건조보호제의 양은 일반적으로 단백질 제제가 동결 건조될 때, 비허용 정도로 단백질을 분해/응집하는 것이 아닌양이다.
추가의 바람직한 부형제는 벌크화제일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "벌크화제"라는 용어는 제약 제품과 직접적으로 상호작용하지 않고, 냉동 건조된 생성물 구조를 제조하는 작용제를 포함한다. 제약상 우수한 케이크를 제공하는 것 이외에도, 벌크화제는 또한 붕괴 온도 변형, 냉동-해동 보호 제공, 및 장기간 보관 동안에 걸친 단백질 안정성 개선과 관련하여 유용한 정질을 부여할 수 있다. 벌크화제의 비제한적인 예로는 만닛톨, 글리신, 락토스, 및 수크로스를 포함한다. 벌크화제는 결정질 (예컨대, 글리신, 만닛톨, 또는 염화나트륨), 또는 비정질 (예컨대, 덱스트란, 히드록시에틸 전분)일 수 있고, 일반적으로 단백질 제제에서 0.5% 내지 10%인 양으로 사용된다.
바람직하게, 본 발명의 제제에 적용되는 벌크화제는 심미적으로 허용되거나, 균일하거나, 또는 기계적으로 강한 케이크의 형성을 촉진시킨다. 벌크화제는 또한 바람직하게 개방형 공극 구조의 형성 및 재구성의 용이성과 속도를 촉진시킨다. 벌크화제는 또한 바람직하게 케이크 붕괴, 공융, 또는 잔류 수분의 유지를 감소시키거나, 또는 방지한다. 또 다른 측면에서, 벌크화제는 바람직하게 스트레스 (예컨대, 물리적 및 화학적 스트레스)로부터 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 보호하는 것을 돕고, 단백질 활성을 유지하는 것을 돕는다.
일부 실시양태에서, 제제는 임의적으로 보존제를 함유할 수 있다. "보존제"는 박테리아 활성을 감소시키기 위해 본원의 제제에 첨가될 수 있는 화합물이다. 보존제 첨가는, 예를 들어, 다회 사용 (다용량) 제제의 제조를 용이하게 할 수 있다. 잠재적인 보존제의 예로는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬 기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 유형의 보존제로는 방향족 알콜, 예컨대, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다. 본원에서 가장 바람직한 보존제는 벤질 알콜이다.
따라서, 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제제는 약 50 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 GM-CSF를 중화시키는 화합물, 및 히스티딘, 아세테이트 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충제 (pH 약 5 내지 약 7)를 포함하는, 장기간 보관용의 액체, 바람직하게, 수성 제제이고, 제제는 안정제/장성 조절제로서 수크로스, 트레할로스, 만닛톨 및/또는 소르비톨 중 하나 이상의 것, 및 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머를 포함하는 군으로부터 선택되는 계면활성제 중 하나 이상의 것을 추가로 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제제는 약 50 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 GM-CSF를 중화시키는 화합물, 더욱 바람직하게, 약 80 mg/ml 또는 약 150 mg/ml, 및 약 20 mM 내지 약 40 mM, 더욱 바람직하게, 약 30 mM 농도의 히스티딘 완충제 (pH 약 5.5 내지 약 6.5, 더욱 바람직하게, 5.8)를 포함하는, 장기간 보관용의 액체, 바람직하게, 수성 제제이고, 제제는 약 4% (w/v) 내지 약 6% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 5% (w/v) 소르비톨 뿐만 아니라, 약 0.005% (w/v) 내지 약 0.5% (w/v), 바람직하게, 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.04% (w/v) 농도의 폴리소르베이트, 예컨대, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 추가로 포함할 수 있다.
폴리소르베이트 20, 및 약 80 mg/mL의 단백질 농도가 상기 바람직한 제제에서 사용될 경우, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.001% (w/v) 내지 약 0.2% (w/v), 바람직하게, 약 0.007% (w/v) 내지 약 0.11% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.007% (w/v) 내지 약 0.06% (w/v) 및 가장 바람직하게, 약 0.01% (w/v)이다. 사용되는 단백질 농도가 약 150 mg/mL일 경우, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.001% (w/v) 내지 약 0.4% (w/v), 바람직하게, 약 0.006% (w/v) 내지 약 0.25% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.18% (w/v), 더욱더 바람직하게, 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.1% (w/v) 및 가장 바람직하게, 약 0.02% (w/v)이다.
또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 20, 및 약 80 mg/mL의 단백질 농도가 상기 바람직한 제제에서 사용될 경우, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.02% (w/v) 내지 약 0.2% (w/v), 바람직하게, 약 0.03% (w/v) 내지 약 0.13% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.05% (w/v) 내지 약 0.08% (w/v) 및 가장 바람직하게, 약 0.07% (w/v)이다. 사용되는 단백질 농도가 약 150 mg/mL일 경우, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.04% (w/v) 내지 약 0.4% (w/v), 바람직하게, 약 0.06% (w/v) 내지 약 0.25% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.1% (w/v) 내지 약 0.15% (w/v) 및 가장 바람직하게, 약 0.13% (w/v)이다.
폴리소르베이트 80, 및 약 80 mg/mL의 단백질 농도가 상기 바람직한 제제에서 사용될 경우, 폴리소르베이트 80 농도는 약 0.001% (w/v) 내지 약 0.2% (w/v), 바람직하게, 약 0.004% (w/v) 내지 약 0.14% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.007% (w/v) 내지 약 0.1% (w/v), 더욱더 바람직하게, 약 0.007% (w/v) 내지 약 0.05% (w/v), 및 가장 바람직하게, 약 0.04% (w/v)이다. 사용되는 단백질 농도가 약 150 mg/mL일 경우, 폴리소르베이트 80 농도는 약 0.001% (w/v) 내지 약 0.4% (w/v), 바람직하게, 약 0.007% (w/v) 내지 약 0.26% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.2% (w/v), 더욱더 바람직하게, 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.08% (w/v), 및 가장 바람직하게, 약 0.04% (w/v)이다.
또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80, 및 약 80 mg/mL의 단백질 농도가 상기 바람직한 제제에서 사용될 경우, 폴리소르베이트 80 농도는 약 0.02% (w/v) 내지 약 0.2% (w/v), 바람직하게, 약 0.04% (w/v) 내지 약 0.14% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.06% (w/v) 내지 약 0.09% (w/v), 가장 바람직하게, 약 0.07% (w/v)이다. 사용되는 단백질 농도가 약 150 mg/mL일 경우, 폴리소르베이트 80 농도는 약 0.04% (w/v) 내지 약 0.4% (w/v), 바람직하게, 약 0.06% (w/v) 내지 약 0.27% (w/v), 더욱 바람직하게, 약 0.1% (w/v) 내지 약 0.16% (w/v), 가장 바람직하게, 약 0.13% (w/v)이다.
추가로, 한 실시양태에서, 중화 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편으로 이루어진 본 제제는 약 80 mg/ml 내지 약 150 mg/ml의 중화 항체, 약 5% (w/v) 소르비톨, 약 30 mM L-히스티딘, 약 0.02% (w/v) 내지 약 0.04% (w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하고, pH는 약 5.8이다.
추가로, 한 실시양태에서, 중화 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편으로 이루어진 본 제제는 약 80 mg/ml의 중화 항체, 약 5% (w/v) 소르비톨, 약 30 mM L-히스티딘, 약 0.04% (w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하고, pH는 약 5.8이다.
추가로, 한 실시양태에서, 중화 항-GM-CSF 항체 또는 그의 기능적 단편으로 이루어진 본 제제는 약 150 mg/ml의 중화 항체, 약 5% (w/v) 소르비톨, 약 30 mM L-히스티딘, 약 0.04% (w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하고, pH는 약 5.8이다.
조성물의 특정 성분은 당업계에 공지된 대안 물질로 상호 교환될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 그러나, 당업자는 또한 특정 성분을 포함하는 것이 화학적 양립성, pH, 장성, 및 안정성을 포함하나, 이에 한정되지 않는 이유로 인해 다른 성분, 농도, 또는 제제 제조 방법의 사용을 배제할 것이라는 점도 이해할 것이다.
본 발명의 액체 제제는 즉시 사용가능한 장치에서와 같이 피하 투여에 적합한 낮고, 실현 가능한 점도를 가지는 것이 유익하다. 따라서, 본 발명에 따른 제제의 점도는 바람직하게 약 50 내지 약 1,000 [1/sec]의 전단 속도 및 약 20℃의 온도에서 20 mPa*s 미만이다. 더욱 바람직하게, 점도는 상기 조건에서 15 mPa*s 미만이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 액체 제제의 점도 및/또는 안정성은 시간 경과에도 낮은 주사력을 유지시킨다. 예컨대, 미리 충전된 시린지 중의 제제의 상기 주사력 측정은 시린지를 고정시키기 위한 검사 기계 장치를 개조한 부착부가 있는 기계, 예컨대, 인스트론(INSTRON)® 범용 압축 검사 시스템 (미국 매사추세츠주 노우드) 상에서 수행한다. 본원에 기술된 제제는 수동 장치 및 자동 (예컨대, 기계식 지원) 장치, 둘 모두에 의한 피하 투여의 가능성을 제공한다. 한 실시양태에서, 주사력은 활주력 (glide-force)이다. 일부 실시양태에서, 활주력은 25 N 미만이다. 다른 실시양태에서, 활주력은 0-20 N, 2-15 N 또는 4-11 N이다. 제제가 낮은 주사력을 유지할 수 있는 기간은 시린지로의 로딩 후 3개월 이상, 6개월 이상, 12개월 이상, 3개월, 6개월, 9개월, 12개월, 15개월, 18개월, 24개월, 3-6개월, 3-9개월, 6-9개월, 6-12개월, 9-15개월, 12-18개월, 18-30개월 또는 24-36개월이다. 제제는 냉장고에서, 예컨대, 예컨대, 2-8℃ 또는 5℃에서, 또는 실온에서, 예컨대, 18-25℃ 또는 25℃에서 보관될 수 있다.
본원에서 언급된 바와 같이, 본 출원은 일반적으로 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 포함하는 제제에 수개의 물질을 첨가하는 것이 제제 중의 상기 화합물의 응집 및/또는 분해/단편화를 감소시킬 수 있다는 발견에 관한 것이다. 제제 중 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 응집시키거나, 또는 분해시키는 원인이 무엇인지에 그와는 상관없이, 본원에 기술된 바와 같은 물질을 첨가하는 것이 제제 중GM-CSF를 중화시키는 화합물의 응집/단편화를 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 기술된 물질의 첨가가 예를 들어, 보관, 승온에의 노출, 광에의 노출, 전단 응력에의 노출, pH 및 이온 상태, 및 그의 임의 조합에 의해 유발되는 제제 중의 응집/분해를 감소시킨다.
본 발명자들에 의해 밝혀진 조치 방안을 사용하여 특히 액체 및 냉동 형태로 제제화된 GM-CSF를 중화시키는 화합물의 응집 및/또는 분해/단편화를 감소시킬 수 있다. 따라서, 감소된 응집/단편화가 바람직하게 액체 제제에서 관찰된다. 추후 사용을 위해 액체 형태로 바로 보관되거나, 냉동 상태로 보관되고, 사용 전 해동되거나, 또는 사용 전에 액체 형태 또는 다른 형태로 추후에 재구성되도록 하는 건조된 형태, 예컨대, 동결건조된, 대기 건조된, 또는 분무 건조된 형태로 제조되는 경우에도 또한 감소된 응집/분해를 관찰할 수 있을 것으로 가정된다.
따라서, 본원에 기술된 제제는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 보관될 수 있다고 구상된다. 비제한적인 예로는 제제를 냉각, 냉동, 동결건조, 및 분무 건조하는 것을 포함하며, 여기서, 냉각에 의한 보관이 바람직하다.
일부 경우에서, 단백질 제제는 보관을 위해 냉동된다. 따라서, 제제는 냉동-해동 사이클을 포함하는 조건하에서 비교적 안정적인 것이 바람직하다. 제제의 이러한 적합성을 측정하는 한 가지 방법은 제제 샘플에 대하여 (예를 들어, 약 -80℃±10℃에서 밤새도록 냉동시키고, 실온에서 고속 해동, 또는 예컨대, 6시간 동안 얼음상에서 저속 해동시킴으로써) 1회 이상, 예컨대, 1, 3, 5, 7회 및 최대 10회의 냉동 및 해동 사이클을 수행하여 냉동-해동 사이클 이후에 축적되는 저분자량/클립형 (LMW) 종 및/또는 고분자량/응집체 (HMW) 종을 측정하고, 이를 냉동-해동 절차 이전에 샘플 중에 존재하는 LMW 종 또는 HMW 종의 양과 비교하는 것이다. LMW 또는 HMW 종이 증가하였다면, 이는 제제의 일부로서 보관된 단백질의 안정성이 감소되었다는 것을 나타내는 것이다. 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)를 사용하여 LMW 및 HMW 종의 존재를 측정할 수 있다.
바람직하게, 단백질 제제는 액체로서 보관될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같이, 액체 제제는 다양한 온도를 비롯한 상기 조건하에서 안정적인 것이 바람직하다. 예를 들어, 제제의 적합성을 측정하는 한 가지 방법은 샘플 제제를 수개의 온도 (예컨대, 2-8℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 및 50℃)에서 보관하고, 시간 경과에 따라 축적된 HMW 및/또는 LMW 종의 양을 모니터링하는 것이다. 시간 경과에 따라 축적된 HMW 및/또는 LMW 종의 양이 적을수록, 제제에 대한 보관 조건은 더 우수한 것이다. 추가로, 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피 (CEX-HPLC)에 의해 단백질의 전하 프로파일을 모니터링할 수 있다. 대안적으로, 제제는 동결건조 이후에 보관될 수 있다. 제제가 전단 응력 조건하에서 안정적인 것이 추가로 바람직할 수 있다. 제제의 적합성을 측정하는 한 가지 방법은 제제를 수용기 중 진탕기, 예컨대, 수직형 진탕기 상에서 원하는 온도 (예컨대, 2-8℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 및 50℃, 바람직하게 +5℃±3℃)에서 조글링하는 것이다. 수용기 (예컨대, 바이알)를 진탕기 상에서 원하는 기간 동안, 예를 들어, 최대 14일 이상까지 보관할 수 있고, 동일한 온도에서 진탕 없이 보관된 대조군과 비교할 수 있다. 예컨대, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 내0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 및 14일 후에 데이터점을 수집할 수 있다. 진탕 보관 후 축적된 저분자량 (LMW) 종 및/또는 고분자량 (HMW) 종의 양을 측정하고, 진탕하지 않은 샘플에 존재하는 LMW 종 또는 HMW 종의 양과 비교할 수 있다. LMW 또는 HMW 종이 증가하였다면, 이는 제제의 일부로서 보관된 단백질의 안정성이 감소되었다는 것을 나타내는 것이다. 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)를 사용하여 LMW 및 HMW 종의 존재를 측정할 수 있다.
일부 경우에서, 제제는 분무 건조된 후 보관된다. 분무 건조를 위해, 액체 제제를 건식 가스 기류의 존재하에서 에어로졸화한다. 제제 소적으로부터 가스 기류로 물을 제거하고 약물 제제의 건조된 입자를 수득한다. 부형제는 (i) 분무 건조 탈수 동안 단백질을 보호하고/거나, (ii) 분무 건조 후의 보관 동안 단백질을 보호하고/거나, (iii) 에어로졸화에 적합한 용액 특성을 부여하기 위해 제제에 포함될 수 있다. 상기 방법은 냉동에 대하여 상기 기술된 방법과 유사하되, 단, 예외적으로, 샘플 제제는 냉동 대신 분무 건조되고, 희석제 중에 재구성되고, 재구성된 제제는 LMW 종 및/또는 HMW 종의 존재에 대하여 시험된다. 동결건조되지 않은 상응하는 샘플 제제와 비교하였을 때, 분무 건조된 샘플 중의 LMW 또는 HMW 종이 증가하였다면, 이는 분무 건조된 샘플의 안정성이 감소되었다는 것을 나타내는 것이다.
"동결건조된" 또는 "냉동 건조된"이라는 용어는 90% 이상, 바람직하게, 95% 이상, 가장 바람직하게, 98% 이상의 수분이 제거된, 예컨대, 동결건조와 같은 건조 방법이 수행된 물질의 상태를 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, "동결건조"라는 용어는 건조시키고자 물질을 먼저 냉동시킨 후, 진공 환경에서 승화에 의해 얼음 또는 냉동 용매를 제거하는 프로세스를 의미한다. 보관시 동결건조된 생성물의 안정성을 증진시키기 위해 부형제 (예컨대, 동결건조보호제)를 동결건조시키고자 하는 제제에 포함시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "재구성된 제제"라는 용어는 GM-CSF를 중화시키는 화합물이 희석제에 분산되도록 희석제에 동결건조된 단백질 제제를 용해시킴으로써 제조된 제제를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "희석제"라는 용어는 제약상 허용되고 (인간에게 투여하는 데 안전하고, 비독성이고), 액체 제제, 예컨대, 동결건조 이후에 재구성된 제제의 제조에 유용한 물질이다. 희석제의 비제한적인 예로는 멸균수, 주사용 정균수 (BWFI), pH 완충 용액(예컨대, 포스페이트 완충처리된 염수), 멸균 염수 용액, 링거액, 덱스트로스 용액 또는 염 및/또는 완충제의 수용액을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 제제는 요법 용도로 구상된다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 제제를 포함하는 제약 조성물 (의약)을 구상한다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 치료학상 유효량의 본원에 기술된 제제를 투여하는 단계를 포함하는, GM-CSF를 중화시키는 화합물로 유익하게 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 앓는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 본원에 기술된 제제는 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 이용하여 예방 및/또는 치료 및/또는 호전될 수 있는 질환의 예방 및/또는 치료에 적용된다.
"대상체"라는 용어는 살아있는 유기체를 포함하는 것으로 한다. 대상체의 예로는 포유동물, 예컨대, 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트 및 트랜스제닉 비인간 동물을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
"유효 용량" 또는 "유효 투여량"이라는 용어는 원하는 효과를 달성하는 데, 또는 적어도 부분적으로 달성하는 충분한 양으로서 정의된다. "치료학상 유효 용량"이라는 용어는 이미 질환을 앓고 있는 환자에서 질환 및 그의 합병증을 치유 또는 적어도 부분적으로 그의 진행을 막는 데 충분한 양으로서 정의된다. 이러한 용도에 효과적인 양은 질병의 중증도 및 대상체의 면역계의 일반 상태에 의존할 것이다. "환자"라는 용어는 예방 또는 치료적 처치를 받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
제제의 적절한 투여량, 또는 치료학상 유효량은 치료하고자 하는 병태, 요법 이전의 병태의 중증도, 및 환자의 임상적 병력 및 치료제에 대한 반응에 의존할 것이다. 적절한 용량은 환자에게 1회 또는 일련의 투여를 통해 투여될 수 있도록 주치의의 판단에 따라 조정될 수 있다. 제약 조성물은 단독 치료제로서 또는 필요에 따란 추가의 요법과 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 특히, 비경구 투여, 즉, 피하로, 근육내, 정맥내, 관절내, 및/또는 활액내 투여에 유용하고, 여기서, 피하 투여가 바람직하다. 비경구 투여는 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 수행될 수 있다.
주사용 제약 조성물은 단위 투여 형태로, 예컨대, 첨가 보존제와 함께 앰플 또는 다회 투약용 용기로 제공될 수 있다. 추가로, 최근 다수의 약물 전달 접근법이 개발되었고, 본 발명의 제약 조성물은 이러한 신규 방법, 예컨대, 인젝트-이즈(Inject-ease), 겐젝트(Genject), 주사기 펜, 게넨(Genen), 및 바늘이 없는 장치, 예컨대, 메디젝터(MediJector) 및 바이오젝터(BioJector)를 사용하여 투여하는 데 적합하다. 본 발명의 제약 조성물은 또한 아직 발견되지 않은 투여 방법에도 적용될 수 있다. 또한, 문헌 [Langer, 1990, Science, 249: 1527-1533]를 참조할 수 있다.
동결건조된 제약 조성물은 바람직하게는 활성 성분을 함유하는 바이알로 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 재구성을 위한 용액을 추가로 포함한다.
제약 조성물은 추가의 제약상 허용되는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 성분이 제제의 원하는 특징에 유해한 영향을 미치지 않는 한, 다른 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제, 예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술되어 있는 것 또한 본원에 기술된 단백질 제제에 포함될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 담체"란, 제약 투여와 양립가능한, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제를 의미한다. 제약상 활성인 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 널리 알려져 있다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 이는 하기를 포함한다: 장성 조절제; 추가의 완충화제; 보존제; 공용매; 항산화제 (아스코르브산 및 메티오닌 포함); 킬레이트화제, 예컨대, EDTA; 금속 착체 (예컨대, Zn-단백질 착체); 생분해성 중합체, 예컨대, 폴리에스테르; 염 형성 반대 이온, 예컨대, 나트륨, 다가 당 알콜; 아미노산, 예컨대, 알라닌, 글리신, 아스파라긴, 2-페닐알라닌, 및 트레오닌; 당 또는 당 알콜, 예컨대, 락티올, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 크실로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이니시톨, 갈락토스, 갈락시톨, 글리세롤, 시클리톨 (예컨대, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예컨대, 글루타티온, 티옥산, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, [알파]-모노티오글리세롤, 및 소듐 티오 술페이트; 저분자 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 다른 면역글로불린; 및 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐 피롤리돈.
본원에 기술된 제제는 질환, 또는 장애의 치료 및/또는 예방 및/또는 호전을 필요로 하는 환자에서의 질환, 또는 장애의 치료 및/또는 예방 및/또는 호전에서 제약 조성물로서 유용하다. "치료"라는 용어는 치료학적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 둘 모두 의미한다. 치료는 질환, 질환의 증상, 또는 질환에 대한 소인을 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 해결, 호전, 개선시키거나, 또는 그에 영향을 주기 위한 목적으로, 질환/장애, 질환/장애의 증상, 또는 질환/장애에 대한 소인을 앓는 환자로부터의 신체, 단리된 조직, 또는 세포에 제제를 적용하거나 투여하는 것을 포함한다.
"치료를 필요로 하는" 대상으로는 이미 장애를 앓고 있는 대상 뿐만 아니라, 장애를 예방하고자 하는 대상을 포함한다. "장애"라는 용어는 본원에 기술된 단백질 제제를 이용한 치료가 유익한 임의의 병태이다. 이는 포유동물이 해당 장애에 걸리게 하는 병리적 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비제한적인 예로는 바람직하게는 알레르기 및 건선 장애 뿐만 아니라, 관절염 및 천식 장애를 비롯한, 염증성 및 자가면역 장애, 예컨대, 관절염, 류마티스성 관절염 (RA), 자가면역 뇌염, 건선, 다발성 경화증, 폐 질환, 예컨대, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 및 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS); 크론병, 특발성 폐 섬유증 (IPF), 염증성 장 질환 (IBD), 포도막염, 황반 변성, 대장염, 월러 (Wallerian) 변성, 항인지질 증후군 (APS), 급성 관상동맥 증후군, 재협착, 동맥경화증, 재발성 연골염 (RP), 급성 또는 만성 간염, 실패한 정형외과적 임플란트, 사구체 신염, 루푸스, 아토피성 피부염 및 염증성, 관절성 및 골관절 통증을 포함한다.
알레르기 장애는 알레르기 또는 알레르기 반응에 의해 유발된 임의의 장애이다. 알레르기는 면역계의 과민성 장애이다. 이는 개인의 면역계가 일반적으로, 무해한 외래 물질 (알레르기원), 예컨대, 식품, 꽃가루, 곰팡이, 집 먼지, 동물 비듬, 집먼지 진드기에 반응하거나 과민반응하는 경우 발생한다.
건선은 주로 피부를 이환시키는 자가면역 질환이다. 면역계가 잘못 보낸 신호에 기인하여 피부 세포 성장 주기가 빨라지는 것이다. 건선 유형에는 플라크, 물방울양, 역위, 농포성 및 홍피성 5가지가 있다. 가장 일반적인 형태인 플라크 건선은 표피 (피부)의 최상위 층에 나타나는 붉고 흰 색깔의 비늘로 덮인 패치로 주로 관찰된다. 그러나, 일부 환자는 어떤 피부과적 징후 또는 증상도 가지지 않는다. 상기 장애는 경미한 국소화된 패치에서부터 전신 범위까지 중증도가 다양한 만성의 재발성 병태이다. 손톱과 발톱이 흔히 이환되고 (건선성 손발톱 이영양증), 독립된 징후로서 나타날 수 있다. 또한 건선은 건선성 관절염으로 알려진 관절의 염증을 유발할 수 있다.
관절염은 하나 이상의 관절염의 염증을 수반하는 관절 장애의 형태이다. 100가지가 넘는 형태의 관절염이 존재한다. 가장 일반적인 형태인 골관절염 (퇴행성 관절 질환)은 관절의 외상, 관절의 감염, 또는 노화의 결과이다. 다른 관절염 형태는 류마티스성 관절염, 건선성 관절염 및 다른 관련된 자가면역 질환이다. 패혈성 관절염은 관절 감염에 의해 유발된다.
천식은 많은 세포와 세포내 요소가 중요한 역할을 하는 기도의 흔한 만성 염증성 장애이다. 천식은 천명, 기침, 흉통, 및 호흡곤란의 재발성 에피소드를 초래하는 기도 과민성과 연관된다. 이들 에피소드는 보통 널리 퍼져 있지만, 종종 자발적으로 또는 치료에 의해 가역성인 폐 내의 가변적 기류 폐색과 연관된다. 천식은 증상의 빈도, 1초간 노력성 호기량 및 최대 호기 유속에 따라 분류될 수 있다. 천식은 또한 아토피성 (외인성) 또는 비아토피성 (내인성)으로 분류될 수 있다.
GM-CSF를 중화시키는 화합물 이외에도, 본 발명의 제약 조성물은 추가의 치료학적 또는 생물학적 활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 적응증, 예컨대, 골관절염 치료에 유용한 치료학적 인자 (예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 항-메탈로프로테이나제, 시클린 화합물, 사이토카인 길항제, 코르티코스테로이드제, TNF 억제제, IL-억제제, 항-혈관신생 물질, 아그레카나제 억제제, p38 키나제 억제제, 아포토시스 억제제, 히알루로디나제 억제제 및 단백질 가수분해 효소로부터 선택되는 관절 연골 또는 활액 성분의 파괴에 관여하는 하나 이상의 억제제)가 존재할 수 있다. 인플릭시맙, 엔타네르셉트, 아다리무랍, 네레리몬맙, 레네르셉트 드, 또는 그의 조합을 비롯한, 염증을 제어하는 인자 또한 조성물의 일부일 수 있다. 제약 조성물은 세포외 기질 성분, 예컨대, 히알루론산 또는 그의 염, 에스테르, 내부 에스테르 및 황화 유도체를 비롯한 그의 유도체, 바람직하게는 히알루론산의 부분적 에스테르를 포함할 수 있다는 것 또한 구상된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 제제를 함유하는 키트 (또는 제조 물품) 또는 용기에 관한 것이다. 제제는 바람직하게는 이미 액체 상태일 수 있다. 그러나, 대안적으로, 이는 바람직하게는 동결건조된 상태일 수 있다. 또한, 냉동, 동결건조, 냉동 건조 또는 분무 건조된 상태일 수 있다. 따라서, 제제가 액체가 아닌 다른 상태인 경우, 이는 기술자에 의해 (액체) 수성 제약 조성물로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 제제는 동결건조 될 수 있고, 그 후 재구성되어야 할 것이다. 따라서, 키트는 각각 냉동, 동결건조, 냉동 건조 또는 분무 건조된 제제의 재구성을 위한 수단 및/또는 제제를 희석하기 위한 수단 및/또는 제제 또는 제약 조성물을 투여하기 위한 수단, 예컨대, 시린지, 펌프, 주입기, 바늘 등과 같은 수단을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 본 발명의 제제를 포함하는 하나 이상의 바이알을 포함할 수 있다. 키트는 또한 사용 설명서를 동반할 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 제제를 함유하고, 바람직하게는 그의 사용 설명서를 제공하는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품은 제제를 함유하기에 적합한 용기를 포함한다. 적합한 용기로는, 제한 없이, 병, 바이알 (예컨대, 이중 챔버 바이알), 시린지 (예컨대, 단일 또는 이중 챔버 시린지), 시험관, 뉴블라이저, 흡입기 (예컨대, 계량 흡입기 또는 건조 분말 흡입기) 또는 데포를 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리, 금속 또는 플라스틱 (예컨대, 폴리카르보네이트, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리올레핀)으로부터 형성될 수 있다. 용기는 제제를 담고 있고, 용기 상의, 또는 그와 결합된 라벨은 재구성 및/또는 사용에 관한 설명을 나타낼 수 있다. 라벨은 제제가 피하 투여용으로 유용하거나, 또는 그 용도의 것임을 추가로 나타낼 수 있다. 제제를 담고 있는 용기는 제제의 반복 투여 (예컨대, 2-6회 투여)를 가능하게 하는 다회 사용 바이알일 수 있다. 제조 물품은 적절한 희석제 (예컨대, WFI, 0.9% NaCl, BWFI, 포스페이트 완충처리된 염수)를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조 물품은 동결건조된 버전의 GM-CSF를 중화시키는 화합물 제제를 포함하는 경우, 동결건조된 제제와 희석제의 혼합이 재구성된 제제에 원하는 최종 단백질 농도를 제공할 것이다. 제조 물품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 사용 설명서를 포함하는 패키지 인서트를 비롯한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제제를 전달하는 데 사용될 수 있는 장치 또한 본 발명에 포함된다. 상기 장치의 예로는 시린지, 예컨대, 미리 충전된 시린지, 펜, 임플란트, 바늘이 없는 주사 장치, 흡입 장치, 및 패치를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 예컨대, 유리 미리 충전된 시린지 및 카트리지에서의 그의 사용으로부터 발생하는 계면 응력을 비롯한 다중 측면에 대해 안정성을 띤다. 고무 제제, 실리콘, 텅스텐, 및 경화제는 단백질 용액과 부정적인 방식으로 상호작용을 하여 응집체, 육안으로 볼 수 없는, 및 육안으로 볼 수 있는 입자를 형성하는 것으로 확인되었다. 본 발명의 단백질 제제는 그의 외함 시스템을 포함하는 미리 충전된 시린지/카트리지 중의 성분과 양립성이다.
본 발명은 단지 예시적인 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않는 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명된다.
도면의 간단한 설명
도 1: 보관 시간, 보관 온도, 및 단백질 농도가 항-GM-CSF 항체의 단량체 수준에 미치는 효과.
도 2: 변수로서 삼투압 몰농도 [mOsmol/kg]에 따른 표준화된 효과의 파레토 (pareto) 차트.
도 3: 80 mg/mL 항-GM-CSF 항체, 5% 소르비톨, 30 mM 히스티딘, 및 다양한 양의 트윈 20으로 이루어진 제제 중의 2-10 ㎛ 입자의 형성.
도 4: 80 mg/mL 항-GM-CSF 항체, 5% 소르비톨, 30 mM 히스티딘, 및 다양한 양의 트윈 80으로 이루어진 제제 중의 2-10 ㎛ 입자의 형성.
도 5: 150 mg/mL 항-GM-CSF 항체, 5% 소르비톨, 30 mM 히스티딘, 및 다양한 양의 트윈 20으로 이루어진 제제 중의 2-10 ㎛ 입자의 형성.
도 6: 도 1. 150 mg/mL 항-GM-CSF 항체, 5% 소르비톨, 30 mM 히스티딘, 및 다양한 양의 트윈 80으로 이루어진 제제 중의 2-10 ㎛ 입자의 형성.
도 7: 항-GM-CSF 항체 및 계면활성제의 대표적인 표면 장력 곡선.
도 8: 다양한 농도의 트윈 20 또는 트윈 80과 함께 30 mM 히스티딘, 5% 소르비톨 중 80 mg/mL 항-GM-CSF 항체의 냉동/해동 사이클 횟수에 따른 함수로서의 ≥ 10 ㎛ 입자 농도 성장.
도 9: 다양한 농도의 트윈 20 또는 트윈 80과 함께 30 mM 히스티딘, 5% 소르비톨 중 150 mg/mL 항-GM-CSF 항체의 냉동/해동 사이클 횟수에 따른 함수로서의 ≥ 10 ㎛ 입자 농도 성장.
하기 항 또한 본 발명을 특징화한다:
1. 약 20 mg/ml 이상인 농도의 GM-CSF를 중화시키는 화합물, 장성 조절제, 완충제 및 계면활성제, 아미노산, 항산화제 및/또는 킬레이트제 중 하나 이상의 것을 포함하는 조성물로서, 여기서, 상기 조성물은 안정한 것인 조성물.
2. 제1항에 있어서, GM-CSF를 중화시키는 화합물, 장성 조절제, 완충제 및 계면활성제를 포함하는 것인 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, GM-CSF를 중화시키는 화합물이 약 50 mg/ml 이상인 농도로 존재하고, 장성 조절제가 약 1% (w/v) 내지 약 15% (w/v)인 농도로 존재하고, 완충제가 약 10 mM 내지 약 50 mM인 농도로 존재하는 것인 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 장성 조절제가 만닛톨, 소르비톨, 수크로스 및/또는 트레할로스로부터 선택되는 것인 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 히스티딘, 아세테이트 및/또는 시트레이트 완충제로부터 선택되는 것인 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴록사머 및 그의 조합 중 하나 이상의 것으로부터 선택되는 것인 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, GM-CSF를 중화시키는 화합물이 약 50 mg/ml 이상 내지 약 200 mg/ml 미만인 농도로 존재하고, 장성 조절제가 약 3% (w/v) 내지 약 7% (w/v)인 농도로 존재하고, 완충제가 약 20 mM 내지 약 40 mM인 농도로 존재하고, 계면활성제가 약 0.001% (w/v) 내지 약 1% (w/v)인 농도로 존재하는 것인 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 약 5 내지 약 7인 것인 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 장성 조절제가 소르비톨이고, 완충제가 히스티딘 완충제인 것인 조성물.
10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, GM-CSF를 중화시키는 화합물이 폴리펩티드, 펩티드 모방체, 핵산, 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
12. 제11항에 있어서, 폴리펩티드가 GM-CSF에, 또는 GM-CSF 수용체에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편인 것인 조성물.
13. 제12항에 있어서, 항체 또는 그의 기능적 단편이 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편인 것인 조성물.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 항체가 IgG, IgG1 또는 IgG4 항체인 것인 조성물.
15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 기능적 단편이 GM-CSF의 에피토프에 결합하고, 에피토프는 바람직하게 아미노산 23-27 (RRLLN) 및/또는 아미노산 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL)을 포함하는 것인 조성물.
16. 제15항에 있어서, 상기 에피토프가
(i) 아미노산 28-31 (LSRD);
(ii) 아미노산 32-33 (TA) 및/또는
(iii) 아미노산 21-22 (EA)를 추가로 포함하는 것인 조성물.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 에피토프가 불연속 에피토프인 것인 조성물.
18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 중쇄에 가변 영역에 서열식별번호: 1-13 및 56에 명시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것인 조성물.
19. 제18항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 CDR3 서열 중 임의의 것이 함께 중쇄 가변 영역에 서열식별번호: 14에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및 서열식별번호: 15에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2와 함께 존재하는 것인 조성물.
20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 16에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 17에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 18에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것인 조성물.
21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 19, 54 및 55 중 임의의 것에 명시된 아미노산을 포함하는 것인 조성물.
22. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 중쇄 가변 영역에 서열식별번호: 20-33, 52 및 53 중 임의의 것에 명시된 아미노산을 포함하는 것인 조성물.
23. 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 16에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 17에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 18에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 그의 중쇄 가변 영역에 서열식별번호: 14에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 15에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 1-13 및 56에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것인 조성물.
24. 제12항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 그의 경쇄 가변 영역에 서열식별번호: 16에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 17에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 18에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 그의 중쇄 가변 영역에 서열식별번호: 14에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열식별번호: 15에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열식별번호: 2에 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것인 조성물.
25. 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 서열식별번호: 34에 명시된 경쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 35-48 중 임의의 것에 명시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
26. 제12항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 서열식별번호: 34에 명시된 경쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 35에 명시된 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
27. 제12항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 서열식별번호: 1-48 및 52-56 중 임의의 것에 명시된 각각의 아미노산 서열과, 바람직하게는, 서열식별번호: 1-18 및 56 중 임의의 것에 명시된 각각의 아미노산 서열과, 및/또는 서열식별번호: 19-48 및 52-55 중 임의의 것에 명시된 아미노산 서열 내의 프레임워크 영역 (FR)의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
i) 약 50 mg/ml 내지 약 180 mg/ml의 GM-CSF를 중화시키는 화합물,
ii) 약 5% (w/v) 소르비톨,
iii) 약 30 mM L-히스티딘
iv) 약 0.001% (w/v) 내지 약 1% (w/v) 계면활성제를 포함하고,
v) pH는 약 5.8인 것인 조성물.
29. 제28에 있어서, 약 80 mg/ml 또는 약 150 mg/ml의 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 포함하는 것인 조성물.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 액체, 바람직하게, 수성 조성물인 것인 조성물.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2-8℃에서 24개월 이상 동안, 또는 실온에서 28일 이상 동안 안정한 것인 조성물.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에서 사용하기 위한 것인 조성물.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내 및/또는 피하 투여용인 것인 조성물.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 알레르기 및 건선 장애 뿐만 아니라, 관절염 및 천식 장애를 비롯한, 염증성 및 자가면역 장애 치료에서 사용하기 위한 것인 조성물.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
36. 제35항에 있어서, 미리 충전된 시린지, 카트리지 또는 자동주사기를 포함하는 것인 키트.
본원에 개시된 본 발명은 이들이 변할 수 있는 바, 특정의 방법론, 프로토콜, 또는 시약으로 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 제공하는논의 및 실시예는 단지 특정의 실시양태를 기술하기 위한 목적으로 제시된 것이며, 이는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니고, 본 발명의 범주는 단지 특허청구범위에 의해서만 정의된다. 하기 실시예는 본 발명을 예시할 것이다.
실시예 1: 물질
하기 실시예는 WO 2006/111353에 기술되어 있는, 고 친화성 및 특이성 인간 GM-CSF에 결합하고, 그를 중화시키는 인간 모노클로날 IgG1 항체 (이하 "상기 항체"로 지칭된다)로 수행하였다. 그의 생성은 WO 2006/111353의 실시예 2에 기술되어 있다. 더욱 구체적으로, 상기 항체는 서열식별번호: 16, 17, 18, 14, 15 및 2에 명시되어 있는 경쇄 및 중쇄 CDR 서열을 포함한다. 이들 CDR 서열은 각각 서열식별번호: 34 및 35에 제시되어 있는, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 포함되어 있다. GM-CSF는 인간의 다양한 염증유발성 및 자가면역 질환에서 비정상적으로 과다생산되고, 재조합 GM-CSF를 첨가하면 상기 질환은 악화되는 것으로 나타났다. GM-CSF-중화 항체로 치료 가능한 질환 적응증으로는 류마티스성 관절염 (RA), 천식 및 다른 형태의 폐 염증, 다발성 경화증 (MS) 및 건선을 포함한다.
생물반응기에서 무혈청 및 단백질 무함유 배지를 사용하여 상기 항체를 제조하였다. 단일 바이알의 상기 항체 생산 클론으로부터 생산 발효기를 위한 접종물을 제조하였다. 발효 프로세스 완료시, 분비된 항체를 함유하는 수확물을 여과하여, 상청액으로부터 세포 및 파편을 분리하였다. 상기 수확물의 정제는 HCP, DNA 및 가능한 바이러스를 감소시키는 통상의 크로마토그래피 접근법을 기반으로 한다. 내재 바이러스 불활성화 단계는 하류 프로세스의 추가 부분이었다. 제제화를 위해, 농축 및 완충제 교체 단계를 수행하였다.
실시예 2: 시험 방법
상기 항체의 응집 정도를 측정하기 위해 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)를 확립하였다 (HPLC: 애질런트 1100 켐스테이션(Agilent 1100 Chemstation); 칼럼: 토소 바이오셉 TSK겔 G4000SWXL(Tosoh Biosep TSKgel G4000SWXL)). 9점 범위 테스트를 수행하여 SE-HPLC 방법을 정량화하였고, 그로부터 정밀도 (6회 반복 주사) 및 직선성 (3중 표준 곡선)을 측정하고 시험하였다. 모든 검정법은 전개 완충제로서 pH 6.6의 100 mM KH2PO4, 200 mM Na2SO4를 사용하여 수행하였다.
고정된 GM-CSF에의 항체 결합 활성 정도를 측정하기 위해 표면 플라스몬 공명 (SPR) 방법을 확립하였다 (비아코어 3000/CM5 센서 칩/HBS-EP 전개 완충제). 9점 범위 시험을 수행하여 SPR 방법을 정량화하고, 그로부터 정밀도 (6회 반복 주사) 및 직선성 (3중 표준 곡선)을 측정하고 시험하였다.
상기 항체의 분해 생성물 (단편) 및 응집체의 검출을 위해, 환원성 및 비환원성 SDS-PAGE를 수행하였다.
크기가 대략 2 내지 100 ㎛인 입자에 대한 용액 중의 내인성 및 외인성육안으로 볼 수 없는 입자의 양을 정량화하기 위해 미세유동 영상화 (MFI, 브라이트웰(Brightwell: 캐나다 오타와)를 수행하였다.
WCX-10 칼럼 및 트리스/이미다졸/피페라진 전게 완충제 중 pH 구배를 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)를 수행함으로써 하전된 이소폼을 평가하였다. 산성 이소폼은 주요 이소폼 이전에 용리되고, 염기성 이소폼은 주요 이소폼 이후에 용리된다.
시린지를 고정시키기 위한 어댑터가 부착된 인스트론® 범용 압축 검사 시스템을 사용하여 시린지 활주력을 시험하였다.
실시예 3: pH 및 온도 응력 효과
3 내지 10 범위의 pH 값에서, 낮은 이온 강도의 스크리닝 완충제 (LISSB: 2 mM 글리신, 2 mM 시트르산, 2 mM HEPES, 2 mM MES, 및 2 mM 트리스)에서 상기 항체의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 항체 샘플을 55℃에서 14일 동안 각 용액에 보관하였다. T0, T7 및 T14 (일)에, 상기 샘플을 분석하였다. SPR 분석 결과, 상기 항체는 pH 4-7에서 가장 안정하다는 것으로 나타났다. SE-HPLC에 의해 분석하였을 때, 상기 항체 단량체는 pH 4-6에서 가장 안정한 것으로 나타났다 (T14). T14 샘플의 비환원성 및 환원성 SDS-PAGE 둘 모두에서는 pH 4-6에서 분해 생성물 및 응집물이 단지 최소량으로 형성되는 것으로 나타났다.
실시예 4: 이온 강도 및 온도 응력 효과
0, 10, 100 및 500 mM NaCl의 존재하에서 낮은 이온 강도의 스크리닝 완충제 (LISSB) 중에서의 상기 항체의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 항체 샘플을 대략 1 mg/ml의 농도로 추가의 NaCl이 포함된 LISSB 용액 (pH 4.5 및 pH 7.5)으로 투석하고, 55℃에서 14일 동안 보관하였다. T0, T7 및 T14 (일)에, 샘플을 SE-HPLC 및 SPR에 의해 분석하였다.
HPLC 및 SPR 연구 결과, 염 추가가 상기 항체의 안정성을 악화시키고, 그 효과는 pH 7.5에서 보다 pH 4.5에서 더욱 현저한 것으로 나타났다. 추가로, SE-HPLC 데이터 결과, pH 4.5에서 증가된 농도의 염 (≥100 mM)으로 상기 항체를 탈안정화시킴에 따라 대개는 항체의 응집체가 축적되는 것으로 나타났다. pH 7.5에서, 증가된 농도의 염 (500 mM)으로 상기 항체를 탈안정화시킴에 따라 대개는 항체의 분해 생성물이 축적되는 것으로 나타났다. LISSB pH 4.5; 500 mM NaCl에서, 상기 항체의 침전물의 수준 (T7 및 T14)이 매우 높았다.
실시예 5: 완충제 효과
pH 5-7의 다양한 완충제 중에서의 상기 항체의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 항체 샘플을 대략 1 mg/ml의 농도로 pH 5, 6 및 7의 20 mM 시트레이트 완충제; 완충제 pH 6 및 pH 7의 20 mM 포스페이트; pH 6 및 pH 7의 20 mM 숙시네이트 완충제, pH 6 및 pH 7의 20 mM 히스티딘 완충제; 및 pH 5 및 pH 6의 20 mM 아세테이트 완충제로 이루어진 용액으로 투석하고, 55℃에서 14일 동안 보관하였다. T0, T7 및 T14 (일)에 샘플을 SE-HPLC, SPR, 및 환원성 및 비환원성 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
SPR 연구, HPLC 단량체 및 응집체 데이터 및 환원성 및 비환원성 SDS-PAGE 결과, 상기 항체는 pH 5의 아세테이트 완충제, pH　6의 히스티딘 완충제 및 pH　5, 6 및 7의 시트레이트 완충제에서 가장 안정한 것으로 나타냈다 (T14 데이터).
실시예 6: 아미노산 효과
상이한 아미노산을 첨가하여, 낮은 이온 강도의 스크리닝 완충제 (LISSB)에서 상기 항체의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 항체 샘플을 55℃에서 14일 동안 각 아미노산 250 Mm이 포함된 pH 6의 용액에 보관하였다. T0, T7 및 T14 (일)에, 상기 샘플을 분석하였다. SPR 연구 결과, 특히, 글루탐산, 트레오닌, 리신 및 발린이 약간의 안정화 효과가 있는 것으로 나타났다 (T14). HPLC 데이터는 아미노산을 첨가하지 않은 참조군과 비교하였을 때, 각각 대략 2-3%의 더욱 무손상인 단량체 및 약 30%, 31% 및 20% 미만의 응집체를 초래하는, 글루탐산, 트레오닌 및 알라닌의 현저한 안정화 효과를 나타내었다.
실시예 7: 당 및 계면활성제 효과
다양한 당 또는 계면활성제를 첨가하여, 낮은 이온 강도의 스크리닝 완충제 (LISSB)에서 상기 항체의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 항체 샘플을 대략 1 mg/ml의 농도로, 추가의 6% (w/v) 당 (D-만닛톨, D-소르비톨, 수크로스, D-만노스, D-말토스, D-트레할로스, D-글루코스), 0.05% (v/v) 트윈　20 또는 0.02% (v/v) 트윈 80을 포함하는 pH 6.0의 LISSB 용액으로 투석하고, 55℃에서 14일 동안 보관하였다. T0, T7 및 T14 (일)에, 상기 샘플을 SE-HPLC, SPR 및 환원성 및 비환원성 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
SPR 및 HPLC 연구 결과, D-소르비톨 및 D-만닛톨이 항체의 안정성을 각각 20%/3% (SPR/HPLC 데이터, T14) 및 14%/4% (SPR/HPLC 데이터, T14)만큼 개선시킨 것으로 나타났다. 트레할로스 및 수크로스, 이 둘 모두는 각각 효과를 7%/0.7% (SPR/HPLC 데이터, T14) 및 6%/2% (SPR/HPLC 데이터, T14)만큼 감소시켰다. 추가로, HPLC 데이터는, D-소르비톨 및 D-만닛톨이 항체 응집체 형성을 각각 43% 및 50%만큼 감소시켰다는 것을 나타내었고, 이는 또한 SDS-PAGE에 의해 수득된 데이터에 의해 뒷받침된다. SE-HPLC, SPR, 및 SDS-PAGE에 의해 측정된 바, 0.05% (v/v) 트윈 20 또는 0.02% (v/v) 트윈 80, 그 어느 것도 안정성에는 어떤 영향도 미치지 않는 것으로 보였다.
실시예 8: 완충제 , 아미노산 및 당 조합 효과
이전 연구에 기초하여, 완충제, 아미노산 및 당의 조합물 중 제제화된 1 mg/ml의 상기 항체의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 이전 연구에서는 pH 5의 20 mM 아세테이트; pH 6의 20 mM 히스티딘; 250 mM 글루탐산; 250 mM 트레오닌, 6% (w/v) 소르비톨 및 6% (w/v) 만닛톨이 안정화 효과가 있는 것으로 나타났다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 항체를 5.4 mg/ml의 농도로, 20 mM 완충제, 250 mM 아미노산 및 6% (v/v) 당의 조합 용액으로 제제화하고, 55℃에서 14일 동안 보관하였다. 1xPBS 중의 항체를 대조군으로서 포함시켰다. T0, T7 및 T14 (일)에, 상기 샘플을 SE-HPLC 및 SPR에 의해 분석하였다.
추가로, 1xPBS 중의 항체 (5.4 mg/ml)를 포함하는 T0 샘플을 냉동 및 해동에 대한 감수성에 대해 시험하였다. 보관 바이알을 -20℃의 냉동고에서 천천히 냉동시켰다. 냉동이 완료된 후, 상기 샘플을 실온에서 해동시켰다. 5회의 냉동-해동 사이클이 완료될 때까지 상기 프로세스를 반복하였다. 각 샘플을 2회 및 5회 사이클 후 SPR 및 SE-HPLC 회수에 대해 조사하였다.
Figure pct00005
SPR 데이터 결과, T14/55℃에서 샘플 5-16의 결합 활성이 T0 대비 >93%인 것으로 나타났다. 1xPBS (샘플 17) 및 샘플 1-4 (모두 만닛톨 또는 소르비톨 포함하지 않음) 중 항체의 경우, 그 수치는 각각 62%, 19%, 26%, 91% 및 85%였다. 그러므로, SPR 데이터는 만닛톨 또는 소르비톨의 첨가가 결합 활성의 안정성을 개선시킨다는 것을 시사한다. 추가로, 샘플 1-4는 T7 및 T14에서 노란색을 띠었고, 이는 산화되었다는 것을 나타낸다. SE-HPLC 데이터는 최소 수준의 응집체 (3.5%-5.6%) 및 분해 생성물 (4.2%-5.4%)이 샘플 5-8, 11-12 및 15-16에서 나타났음 (T14/55℃ 데이터)을 보여주며, 이는 만닛톨 및 소르비톨이 항체 단량체에 미치는 안정화 효과를 뒷받침하는 것으로서, 250 mM 트레오닌 첨가에 의한 소폭의 가능한 효과를 나타내는 것이다. 그러나, 트레오닌의 효과는 샘플 5-8, 11-12 및 15-16에서 나타난 단량체 수준에 의해 판단에 따르면, 최소한의 아주 작은 정도였고 (각각 91.2%, 89.8%, 91.5%, 90.8%, 89.8%, 89.0%, 91.4% 및 90.9%) - 샘플 17 (PBS)의 경우, 그 수치는 80.3%였다 (T14/55℃ 데이터). 250 mM 글루탐산은 소르비톨 또는 만닛톨과 함께 상기 항체 단량체의 안정성에 대해 특히 아세테이트 완충제 중에서 부정적인 효과를 미쳤다. 결론적으로, 항체 단량체는 pH 5의 20 mM 아세테이트 완충제 또는 pH 6 의 20 mM 히스티딘 완충제 및 6% (w/v) 소르비톨 또는 6% (w/v) 만닛톨의 조합에서 가장 안정한 것으로 보인다.
냉동/해동 실험으로부터 얻은 SE-HPLC 데이터는 항체 단량체의 안정화에 있어서, 만닛톨보다 소르비톨의 효과가 약간 더 우수하다는 것을 나타낸다. 5회의 냉동/해동 후, 샘플 6 및 8의 단량체 함량은, 샘플 5 및 7의 96.9% 및 96.0%인 것과 비교하여, 각각 98.6% 및 98.4%였다.
실시예 9: 히스티딘 또는 아세테이트 완충제 , 소르비톨 또는 만닛톨 , 및 트 윈 20 또는 트윈 80 조합 효과
(특히, pH 5의 20 mM 아세테이트, pH 6의 20 mM 히스티딘, 6% (w/v) 소르비톨 및 6% (w/v) 만닛톨의 안정화 효과를 보여주는) 이전 연구의 안정성 데이터에 기초하여, 히스티딘 또는 아세테이트 완충제, 소르비톨 또는 만닛톨, 및 트윈 20 또는 트윈 80의 조합에서 제제화된 항체 10 mg/ml의 안정성을 평가하기 위한 새로운 연구를 수행하였다. 10 mg/ml인 항체 농도에 기인하여, 0.02% (w/v) 트윈 20 및 0.02% (w/v) 트윈 80을 첨가함으로써 SE-HPLC에 의해 측정하여 상기 첨가가 응집에 미치는 효과에 대해서도 또한 시험하였다.
하기 표 2에 제시된 바와 같이, 첨가제와 함께 pH 5.0의 20 mM 아세테이트 완충제 또는 pH 6.0의 20 mM 히스티딘 완충제의 용액으로 상기 항체를 10 mg/ml의 농도로 제제화하고, 55℃에서 14일 동안 보관하였다. T0, T7 및 T14 (일)에, 샘플을 SE-HPLC 및 SPR에 의해 분석하였다.
추가로, 항체 샘플을 냉동 및 해동에 대한 감수성에 대하여 시험하였다. 10 mg/ml 농도의 항체를 -20℃의 냉동고에서 천천히 냉동시켰다. 냉동이 완료된 후, 상기 샘플을 실온에서 해동시켰다. 3 및/또는 5회의 냉동 및 해동 사이클이 완료될 때까지 상기 프로세스를 반복하였다. 3 및/또는 5회의 냉동 및 해동 사이클 후 각 샘플을 SPR 및 SE-HPLC 회수에 대해 조사하였다.
Figure pct00006
HPLC 데이터를 통해 비록 아세테이트와 히스티딘 사이에는 최소한의 차이만이 존재하였지만, 히스티딘이 적어도 아세테이트만큼 우수한 것으로 보인다는 결과를 얻었다. 1주 후, 아세테이트, 소르비톨 및 트윈 80, 및 히스티딘, 소르비톨, 및 트윈 20을 함유하는 제제는 계면활성제를 함유하지 않는 상응하는 제제와 비교하였을 때, 유사한 분해를 보였다.
냉동 및 해동 실험은 5회의 냉동 및 해동 후, 세정제가 항체 단량체의 수준에 대하여 최소한의 어떤 효과도 미치치 않는다는 것을 시사한다. 그러나, 6% (w/v) 소르비톨을 제제에 첨가하였을 때에는, 6% (w/v) 만닛톨의 경우와 비교하면, 항체 단량체가 더욱 안정적이었다. 만닛톨을 첨가하였을 때에는, 5회의 냉동 및 해동 후, 항체 단량체가 더 높은 정도로 응집하였다. 냉동 및 해동 실험으로부터의 HPLC 데이터는 아세테이트를 사용한 경우와 히스티딘을 사용한 경우에는 어떤 차이도 없음을 보여준다.
결론적으로, HPLC에 의해 평가된 바, pH 6.0의 20 mM 히스티딘 및 6% (w/v) 소르비톨을 함유하는 미리 제제화된 제제 (pre-formulation)가 항체 단량체의 안정성에 최적인 것으로 보인다.
실시예 10: 20 mM 히스티딘, 6% (w/v) D-소르비톨로 이루어진 미리 제제화된 제제의 단기 안정성 평가
pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 및 6% (w/v) 소르비톨이 최적인 미리 제제화된 제제인 것으로 확인한 결과에 기초하여, 더 높은 고농도의 항체에서의 상기 미리 제제화된 제제를 평가하는 단기 안정성 시험을 수행하였다.
대략 22, 36, 42, 83 및 118 mg/ml의 농도로 상기 항체를 상기 용액으로 제제화하였다. 제제화된 항체를 5℃ 및 25℃에서 최대 4주의 기간 동안 보관하였다. T0, T14 및 T28 (일)에, 샘플을 SE-HPLC에 의해 분석하였다.
SE-HPLC 데이터는 pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 6% (w/v) 소르비톨에서 항체가 안정적이라는 것을 분명하게 보여준다. 5℃ 또는 25℃에서 28일 동안의 보관 후 검출된 항체 단량체의 농도는 항상 97%보다 높았지만, 단, 예외적으로, 25℃에서 시험된 최고 농도 (118 mg/ml)의 항체의 경우, 항체 단량체의 농도는 약 96.5%였다. 결과는 도 1에 제시되어 있다.
실시예 11: 최종 부형제의 미세 조정
이전 실험에서 생성된 데이터에 기초하여, 항체 안정화를 위해 소르비톨 및 히스티딘을 선택하였다. 다음 단계에서, 3개의 중심점을 포함하고, 30회에 걸쳐 개별적으로 진행되는 "실험 디자인" (DOE: Design of Experiment)를 이용하여, 10 mg/ml 내지 100 mg/ml의 항체 농도에서 부형제의 양 뿐만 아니라, pH 값을 미세 조정 (fine-tuned)하였다. 하기 파라미터를 이용하여 무작위화된 실험 계획을 수행하였다:
항체: 10 - 55 - 100 mg/ml
pH: 5 - 6 - 7
히스티딘: 10 - 30 - 50 mM
소르비톨: 2 - 6 - 10% (w/v).
단기 평가를 위해, 50℃에서 14일 동안 가속 조건하에서 샘플에 응력을 가하였다. 추가로, 항체의 보관을 모사하기 위해, 3회에 걸쳐 냉동 해동 싸이클 (-20℃)을 수행하였다.
결과:
제제의 생리학적 상태를 확인하기 위해 삼투압 몰농도를 측정하였다. 항체를 i.v. 또는 s.c.로 적용하는 경우, 삼투압 몰농도의 허용 범위는 250 내지 450 mOsmol/kg이다. 도 2에 제시된 바와 같이, 삼투압 몰농도는 주로 제제 중 소르비톨의 양에 의해 제어된다. 저농도 (10-50 mM)의 히스티딘 및 항체 그 자체, 이 둘 모두는 삼투압 몰농도에 대하여 오직 최소한의 효과만을 미친다.
소르비톨 및 히스티딘 농도에 대한 삼투압 몰농도의 의존성은 윤곽 블롯으로 도시될 수 있다. 상기 블롯은, 생리적 간격으로 삼투압 몰농도를 유지하기 위해서는 3% (w/v) 내지 7% (w/v) 농도의 소르비톨이 필요하다는 것을 보여준다. 생성 데이터는 다소 높은 삼투압 몰농도을 초래하는 약 6%가 최적의 소르비톨 농도라는 것을 시사한다. 소르비톨이 일부 감소되는 경우, 항체의 안정성에는 영향이 없기 때문에, 삼투압 몰농도가 약 400 mOsmol/kg에 이르게 하고, 이로써, 환자 편의를 증가시키기 위해, 소르비톨 농도를 5%로 감소시킬 수 있다.
생성된 데이터에 기초하여, 최적의 히스티딘 농도를 30 mM로 설정하였다. 히스티딘 농도 범위 10 mM 내지 50 mM에서, SE-HPLC에 의해 측정된 바, 응집 또는 단편화에 대한 어떤 영향도 검출되지 않았다.
항체 응집은 대체로 농도에 의존적이다. 항체의 농도를 증가시키면, 가속 온도 응력 조건하에 냉동/해동 동안 응집체 수준은 상향되고, 투명도 값은 증가하게 된다. 추가로, pH 값이 항체의 단량체 함량에 영향을 미친다. pH<6의 가속 응력이 항체의 단편화를 증가시키는 반면, 냉동/해동 동안 안정성에는 영향을 미치지 않지만, 오히려 안정성이 약간 좋아진 것이 관찰된다. pH>6의 pH 값에서, 가속 온도 및 냉동/해동 처리, 둘 모두의 경우에서, SE-HPLC 및 투명도 분석을 이용하여, 단량체 함량 감소를 측정할 수 있다. 반대 효과와의 균형을 맞추기 위해서는 pH 5.8이 항체 제제에 가장 적합한 것으로 보인다.
이를 통해 하기 파라미터를 이용하여 제제화하였다:
항체 10 mg/ml - 55 mg/ml - 100 mg/ml
D-소르비톨 5% (w/v)
L-히스티딘 완충제 30 mM (히드로클로라이드 일수화물)
pH 5.8 (2 M 수산화나트륨으로 조정).
상기 조성물의 상태 또는 파라미터는 또한 하기 실시예에 제시되는 바와 같이, 더 높은 고농도의 항체를 포함하는 조성물에도 적용될 수 있다.
실시예 12: 안정성 연구
장기간 연구
본 연구는 최대 60개월의 검사 기간을 위한 것으로 디자인되었다. 이 기간 동안, 항체 샘플을 DIN R2 유리 바이알 중 +5℃±3℃에서 보관되었다. 추가로, DIN R2 유리 바이알에서 +25℃±2℃에서의 가속 연구 및 +40℃±2℃에서의 응력 연구를 각각 최대 12개월 및 6개월 동안 수행하였다. pH 5.8의 5%　(w/v) 소르비톨 및 30　mM 히스티딘 모노히드로클로라이드가 포함된 제제에서, 106 mg/ml 및 145 mg/ml 농도의 항체를 사용한 검사를 수행하였다.
하기 파라미터를 측정하였다: pH, 삼투압 몰농도, 농도 (OD280), SE-HPLC에 의한 단량체, 응집체 및 단편의 비율(%), 효능 (세포 기반 분석). 본 결과는 하기 표 3-8에 제시되어 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
가속/응력 연구
규모 확장 후, 약물 물질, 여기서, 항체의 비교가능성을 입증하기 위하여, 가속 (25℃) 및 응력 (40℃) 조건에서, 30 mM 히스티딘, 5% 소르비톨 (pH 5.8) 용액에서 제제화된 165 mg/ml 및 171 mg/ml 농도의 항체를 포함하는 두 약물 물질 배치를 사용하여 안정성 연구를 수행하였다.
하기 파라미터를 측정하였다: pH, 삼투압 몰농도, 농도 (OD280), SE-HPLC에 의한 단량체, 응집체 및 단편의 비율(%), 효능 (세포 기반 분석). 항체 농도 171 mg/ml에 대한 결과는 하기 표 9 및 10에 제시되어 있다.
Figure pct00013
Figure pct00014
냉동/해동 연구
pH 5.8의 30 mM 히스티딘 및 5% 소르비톨의 용액에서 제제화된 106　mg/ml 및 145　mg/ml 농도의 항체에 대해 냉동/해동 안정성을 시험하였다. 항체를 최소 밤새도록 -80℃±10℃에서 냉동시켰다. 실온에서 ≥ 6h 동안 해동시켰다. 0, 1, 3, 5, 7 및 10회 냉동/해동 사이클을 수행하였다.
하기 파라미터를 측정하였다: pH, 삼투압 몰농도, 농도 (OD280), SE-HPLC에 의한 단량체, 응집체 및 단편의 비율(%), 효능 (세포 기반 분석). 본 결과는 하기 표 11 및 12에 제시되어 있다.
Figure pct00015
Figure pct00016
결과 및 결론
30 mM 히스티딘, 5% 소르비톨 (pH 5.8)로 이루어진 제제 중 농도가 약 106 mg/ml 내지 약 145 mg/ml인 항체에 대하여 최대 60개월 동안에 가속 및 응력 조건을 포함하는 장기간 안정성 연구를 수행하였다. 또한, 가속 및 응력 조건하의 추가의 안정성 연구를 30 mM 히스티딘, 5% 소르비톨 (pH 5.8) 중의 농도가 최대 약 171 mg/ml인 항체에 대해 수행하였다.
60개월 동안 +5℃±3℃에서 보관된 샘플은 상기 두 농도 모두에서 2% 미만의 응집을 보였고, 참조와 비교하였을 때, 그와 동일한 효능을 보였다.
가속 조건 (+25℃±2℃)에서 12개월 동안 보관한 후, 두 농도 모두 (106 mg/ml 및 145 mg/ml)에서 2% 미만의 응집이 나타났고, 참조와 비교하였을 때, 그 효능은 동일하였다. 응력 조건 (+40℃±2℃)에서 6개월 동안 보관한 후, 두 농도 모두에서, 5% 미만의 응집이 나타났고, 참조와 비교하였을 때, 그 효능은 거의 동일하였다.
추가의 가속/응력 연구에 관한 데이터는 25℃ 및 40℃에서 각각 3개월 및 1개월 동안의 안정성을 나타내었다. 이는 상기에서 논의된 바와 같이, 2-8℃에서의 안정성이 106 mg/ml 및 145 mg/ml 농도의 항체에 대하여 수득된 것과 유사할 것으로 예상될 수 있음을 시사한다.
추가로, 30 mM 히스티딘, 5% 소르비톨 (pH 5.8) 중의 항체는 시험된 항체 농도, 약 106 mg/ml 내지 약 145 mg/ml, 둘 모두에 대하여 -80℃±10℃에서 10회 이상의 냉동/해동 사이클 동안 안정적이었다.
실시예 13: 점도 평가
pH 5.8의 30 mM 히스티딘 및 5% 소르비톨의 용액에서 제제화된 농도 150 mg/ml인 항체에 대한 점도를 유량계를 사용하여 측정하였다. 유량계는 단일 값의 점도에 의해 정의될 수 없고, 따라서, 점도계를 이용한 경우에서보다 더 많은 파라미터가 설정되어야 하고, 측정되어야 하는 상기 유체에 대하여 사용된다.
일부 유체의 경우, 점도는 광범위한 전단 속도에 걸쳐 상수이다 (뉴턴 유체). 일정한 점도가 없는 유체 (비뉴턴 유체)는 단일 수치로 기술될 수 없다. 비뉴턴 유체는 전단 응력과 전단 속도 사이에 다양한 다른 상관관계를 나타낸다. 따라서, 비뉴턴 유체의 경우, 점도는 온도 뿐만 아니라, 전단 속도에 의존한다. 점도는 주어진 온도 및 주어진 전단 속도 γ [1/sec]에서 밀리 파스칼 *　초 (mPas*s) 로 제시된다.
약 150 mg/ml의 항체를 포함하는 제제의 점도는 20℃의 온도에서 약 50 내지 약 1,000 [1/sec]의 전단 속도에서 12 mPas*s 미만이다.
약 150 mg/ml 항체를 포함하는 제제의 점도는 5℃의 온도에서 약 50 내지 약 1,000 [1/sec]의 전단 속도에서 20 mPas*s 미만이다.
실시예 14: 교반 /전단 응력하에서의 안정성
5% 소르비톨, 30 mM 히스티딘 (pH 5.8)과 함께 80 mg/mL의 항체로 이루어진 제제를 0, 0.01, 0.05, 0.1%의 트윈 20을 이용하여 제조하고, 5% 소르비톨, 30 mM 히스티딘 (pH 5.8)과 함께 150 mg/mL의 단백질로 이루어진 제제를 0, 0.01, 0.05, 0.1 및 0.15%의 트윈® 20 (PS20)을 이용하여 제조하였다. 상기 제제를 최대 24시간 동안 전단 셀 또는 믹서에서 교반하고, 0, 4, 8, 및 24시간째에 MFI에 의해 육안으로 볼 수 없는 입자에 대하여 측정하였다. 트윈®이 첨가되지 않은 제제와 비교하였을 때, 0.01% 이상의 트윈® 20의 첨가로 육안으로 볼 수 없는 입자의 형성률은 감소하였다.
5% 소르비톨, 30 mM 히스티딘 (pH 5.8)과 함께 150 mg/mL의 항체로 이루어진 제제를 0, 0.01, 0.05, 0.1%의 트윈® 80 (PS80)을 이용하여 제조하고, 5% 소르비톨, 30 mM 히스티딘 (pH 5.8)과 함께 150 mg/mL의 단백질로 이루어진 제제를 0, 0.01, 0.05, 0.1 및 0.15%의 트윈® 80을 이용하여 제조하였다. 상기 제제를 최대 8시간 동안 교반하고, 0, 4, 6, 및 8시간째에 MFI에 의해 육안으로 볼 수 없는 입자에 대하여 측정하였다. 트윈®이 첨가되지 않은 제제와 비교하였을 때, 0.01% 이상의 트윈® 80의 첨가로 육안으로 볼 수 없는 입자의 형성률은 감소하였다.
트윈® 20 또는 트윈® 80 (% w/v)이 첨가된 30 mM 히스티딘, 5% 소르비톨 (pH 5.8) 중 80 및 150 mg/mL 단백질 (항체)을 이용하여 수행된 상기의 추가 안정성 검사에 관한 예비 결과는 도 3-6에 (1 ml당 입자의 개수 x 희석률로서) 제시되어 있다. 상기 제제를 전단/교반하여 용액 중에서 육안으로 볼 수 없는 입자를 형성하는 그의 성향에 대해 조사하였고, 계면활성제가 육안으로 볼 수 없는 입자의 형성을 감소시킨 것으로 나타났다. 그러므로, 계면활성제는 육안으로 볼 수 없는 입자의 형성을 막는 데 요구되거나, 또는 제조 및 보관 동안 육안으로 볼 수 없는 입자의 형성을 감소시킬 것이다.
실시예 15: 계면활성제 상호작용의 평가
5% 소르비톨, 30 mM 히스티딘 (pH 5.8) 중 80 mg/mL 단백질 및 150 mg/mL 단백질과 트윈® 20 및 트윈® 80의 상호작용을 특징화하기 위해 표면 장력을 측정하였다. 도 7과 유사한 표면 장력 곡선을 수득하였다. 계면활성제가 단백질과 상호작용하기 시작하는 농도인, 임계 응집 농도를 측정하였다. 또한, 단백질과의 상호작용이 평형 상태라는 것을 나타내는 것인, 임계 미셀 농도 - 계면활성제가 미셀을 형성하는 농도 또한 측정하였다. 본 결과는 하기 표 13에 요약되어 있다. 트윈® 20 및 트윈® 80은 두 농도 모두에 대하여 유사한 CAC 계면활성제:단백질 몰비로 유사하게 단백질과 상호작용한다. 더 높은 단백질 농도에서는 CMC가 더 높지만, 계면활성제:단백질 몰비에 있어서는 두 단백질 농도 모두에 대하여 유사하다. 트윈® 20의 CMC 계면활성제:단백질 몰비는 트윈® 80보다 낮다. 표면 장력 측정치로부터, 계면활성제가 단백질과 상호작용하는 범위는 CAC에서부터 최대 CMC까지이다. 트윈® 20의 경우, 몰비 범위는 대략 0.004 내지 2.6인 반면, 트윈® 80의 경우, 몰비 범위는 대략 0.003 내지 3.3이다. 단백질 제제 중 계면활성제의 최적의 수준은 CAC보다 높다.
Figure pct00017
실시예 16: 냉도 해동 안정성
0, 0.01%, 및 0.1% 농도의 트윈® 20 (PS20) 및 트윈® 80 (PS80)과 함께 30 mM 히스티딘, 5% 소르비톨 (pH 5.8) 중 80 mg/mL 항-GM-CSF 항체로 이루어진 제제를 MFI에 의해 10회의 냉동/해동 사이클을 거쳐 특징화하였다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 그 안에 계면활성제를 포함하지 않는 제제의 경우, 냉동/해동 사이클 수행 횟수에 따라 ≥ 10 ㎛인 입자는 유의적으로 증가하였다. 0.01%에서부터 최대 0.1%의 트윈® 20 또는 80의 경우, 입자의 유의적인 증가는 없었다.
0, 0.05%, 및 0.15% 농도의 트윈® 20 및 트윈® 80과 함께 30 mM 히스티딘, 5% 소르비톨 (pH 5.8) 중 150 mg/mL 항-GM-CSF 항체로 이루어진 제제를 MFI에 의해 10회의 냉동/해동 사이클을 거쳐 특징화하였다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 그 안에 계면활성제를 포함하지 않는 제제의 경우, 크기가 ≥ 10 ㎛인 입자는 유의적으로 증가하였다. 0.05%에서부터 최대 0.15%의 트윈® 20 또는 80의 경우, 입자의 유의적인 증가는 없었다.
실시예 17: 가속 안정성
0, 0.05%, 및 0.1% 농도의 트윈® 20 (PS20) 및 트윈® 80 (PS80)과 함께 30 mM 히스티딘, 5% 소르비톨 (pH 5.8) 중 80 mg/mL 항-GM-CSF 항체로 이루어진 제제를 40℃에서 1주 동안 가속 안정성 조건하에 놓았다. 샘플을 MFI (하기 표 14) 및 SE-HPLC (하기 표 15)에 의해 특징화하였다.
40℃에서 1주 동안, MFI에 의해 측정된 바, ≥ 10 ㎛인 입자의 성장은 없었다. 그러나, SE-HPLC에 의해 측정된 바, 다량체 응집체 (HMW)는 증가하였다. 7일 후, 계면활성제를 함유하는 제제의 경우, 이는 계면활성제를 함유하지 않는 제제보다 HMW 종이 약간 더 높은 양으로 존재하기는 하였지만, 그보다 유의적으로 더 많이 존재하는 것은 아니었다. 추가로, HMW 농도 성장은 계면활성제의 양 또는 상이한 두 유형의 계면활성제에 의존하지는 않았다.
Figure pct00018
Figure pct00019
0, 0.1%, 및 0.15% 농도의 트윈® 20 (PS20) 및 트윈® 80 (PS80)과 함께 30 mM 히스티딘, 5% 소르비톨 (pH 5.8) 중 150 mg/mL 항-GM-CSF 항체로 이루어진 제제를 40℃에서 1주 동안 가속 안정성 조건하에 놓았다. 샘플을 MFI 및 SE-HPLC에 의해 특징화하였다.
40℃에서 1주 동안, MFI에 의해 측정된 바, ≥ 10 ㎛인 입자의 농도 성장은 없었다 (하기 표 16). 그러나, SE-HPLC에 의해 측정된 바, 가용성 응집체 (HMW)는 증가하였다 (하기 표 17). HMW 종의 성장률은 80 mg/mL의 항체 대비 150 mg/mL 항체에서 더 높지만, 제제 중 계면활성제의 양 또는 계면활성제의 유형에 의해서는 영향을 받지 않는다. 계면활성제를 첨가한 경우, 7일 후, 이는 계면활성제를 함유하지 않는 제제와 비교하였을 때, HMW 종의 양이 약간 증가하기는 하였지만, 통계학상 유의적인 값은 아니었다.
Figure pct00020
Figure pct00021
실시예 18: 미리 충전된 시린지 중에서의 안정성
다른 제조사 3곳으로부터 입수한, 실리콘 양, 고무 성분 등이 다른 미리 충전된 시린지를 이용하여 각종 제제의 안정성을 연구하였다. 추가로, 위약 제제를 연구하였다. 제제를 최대 12개월 동안 2-8℃ 및 25℃에 배치하였다. 시각적 외관, SE-HPLC, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 MFI에 의해 단백질인 항체 (Ab)를 함유하는 제제를 특징화하였고, 반면, 위약 제제는 시각적 외관 및 MFI에 의해 특징화하였다.
연구된 제제는 하기 표 18에 제시되어 있다.
Figure pct00022
실시예 19: 미리 충전된 시린지 중에서의 안정성
다른 제조사 3곳으로부터 입수한, 바늘 보호 덮개에 사용된 고무 제제 및 실리콘 오일 양이 다른, 모두가 피하 투여용의 전형적인 시린지인, 미리 충전된 시린지를 이용하여 항체 농도 및 폴리소르베이트 양이 다른 각종 제제의 안정성을 연구하였다. 3곳 모두의 시린지 제조사에 대하여 같은 스토퍼/플런저 제제가 사용되었다. 폴리소르베이트 양은 CAC보다 높게, 및 표면 장력 곡선 중 매우 평평한 부분에 존재하도록 선택되었다. 추가로, 위약 제제를 연구하였다. 제제를 장기간 샘플링을 위해 2-8℃ 및 25℃에 배치하였다. 시각적 외관, SE-HPLC, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 MFI에 의해 단백질을 함유하는 제제를 특징화하였고, 반면, 위약 제제는 시각적 외관 및 MFI에 의해 특징화하였다.
연구된 제제는 하기 표 19에 제시되어 있고, 결과는 하기 표 20-26에 제공되어 있다. 모든 제제 및 시린지 유형에 있어서, 시각적 외관은 무색이고, 육안으로 볼 수 있는 입자는 없었으며, 시간 경과에 따른 변화도 없었다. 150 mg/mL의 항체 제제의 경우, 모든 제제 및 시린지 유형에 있어서, 시각적 외관은 연노랑색을 띠었고, 육안으로 볼 수 있는 미립자는 없었으며, 시간 경과에 따른 변화도 없었다. SE-HPLC에 따르면, 응집체의 증가율은 80 mg/mL 제제보다는 150 mg/mL 제제에서 더 높았고, 계면활성제 양이 응집률에는 어떤 영향도 미치지 않았다. 시간 경과에 따른 전하 프로파일의 변화는 연구된 모든 제제 및 시린지 유형에 대하여 동일하였다.
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
주사력 결과, 평균 활주력은 시험된 모든 제제 및 모든 시린지에 대하여 약 약 4-11 N인 것으로 나타났다. 상기 힘 범위는 본원에 기술된 제제 중의 상기 항-GM-CSF 항체가 수동식 용도 및 자동주사기 용도, 둘 모두로 제공될 수 있도록 하는 가능성을 부여한다.
Figure pct00030
Figure pct00031
SEQUENCE LISTING <110> Takeda GmbH <120> Liquid formulation comprising GM-CSF neutralizing compound <130> IPA161423-DE <150> EP 14167405.1 <151> 2014-05-07 <150> US 61/994,319 <151> 2014-05-16 <150> US 62/043,636 <151> 2014-08-29 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 7A-701 <400> 1 Ser Gly Leu Ile Ala Asn His Met Thr Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 7B1-502 <400> 2 Thr Thr Leu Ile Ser Val Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 L38-A1 <400> 3 Ser Gly Leu Ile Phe Asp Tyr Trp Leu Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 L38-A12 <400> 4 Ser Gly Leu Ile Ile Asp Ala Leu Ser Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 L38-G7 <400> 5 Thr Ser Leu Met Ser Ile Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> 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Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 49 <211> 127 <212> PRT <213> human GM-CSF <400> 49 Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val 1 5 10 15 Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp 35 40 45 Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp 100 105 110 Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 115 120 125 <210> 50 <211> 127 <212> PRT <213> macaca GM-CSF <400> 50 Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Gly Thr Gln Pro Trp Glu His Val 1 5 10 15 Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Glu Met Asn Lys Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe Asp 35 40 45 Leu Gln Glu Pro Ser Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Gln Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp 100 105 110 Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 115 120 125 <210> 51 <211> 127 <212> PRT <213> gibbon GM-CSF <400> 51 Ala Pro Ser Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val 1 5 10 15 Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Glu Ile Asn Glu Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe Asp 35 40 45 Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Ile Ile Ile Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp 100 105 110 Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Gly 115 120 125 <210> 52 <211> 119 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> VH with CDR-H3 7B1-502 <400> 52 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Thr Leu Ile Ser Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 53 <211> 119 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> VH with CDR-H3 3077 <400> 53 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> VL 5-306 <400> 54 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 55 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> VL 5-306* V-version <400> 55 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 3077 <400> 56 Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 127 <212> PRT <213> human <400> 57 Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val 1 5 10 15 Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp 35 40 45 Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr 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100 105 110 Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 115 120 125

Claims (26)

  1. 약 20 mg/ml 이상인 농도의 GM-CSF를 중화시키는 화합물, 장성 조절제, 완충제, 및 계면활성제, 아미노산, 항산화제 및/또는 킬레이트제 중 하나 이상의 것을 포함하는 조성물로서, 여기서, 상기 조성물은 안정한 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, GM-CSF를 중화시키는 화합물, 장성 조절제, 완충제 및 계면활성제를 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, GM-CSF를 중화시키는 화합물이 약 50 mg/ml 이상인 농도로 존재하고, 장성 조절제가 약 1% (w/v) 내지 약 15% (w/v)인 농도로 존재하고, 완충제가 약 10 mM 내지 약 50 mM인 농도로 존재하는 것인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 장성 조절제가 만닛톨, 소르비톨, 수크로스 및/또는 트레할로스로부터 선택되는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 히스티딘, 아세테이트 및/또는 시트레이트 완충제로부터 선택되는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴록사머 및 그의 조합 중 하나 이상의 것으로부터 선택되는 것인 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, GM-CSF를 중화시키는 화합물이 약 50 mg/ml 이상 내지 약 200 mg/ml 미만인 농도로 존재하고, 장성 조절제가 약 3% (w/v) 내지 약 7% (w/v)인 농도로 존재하고, 완충제가 약 20 mM 내지 약 40 mM인 농도로 존재하고, 계면활성제가 약 0.001% (w/v) 내지 약 1% (w/v)인 농도로 존재하는 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 약 5 내지 약 7인 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 장성 조절제가 소르비톨이고, 완충제가 히스티딘 완충제인 것인 조성물.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 80인 것인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 폴리소르베이트 80 양이 CAC를 초과하는 것인 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 폴리소르베이트 80 농도가 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.08% (w/v)인 것인 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 폴리소르베이트 80 대 단백질 비가 약 0.3:1 내지 약 0.6:1인 것인 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, GM-CSF를 중화시키는 화합물이 폴리펩티드, 펩티드 모방체, 핵산, 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 폴리펩티드가 GM-CSF에, 또는 GM-CSF 수용체에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편인 것인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 항체 또는 그의 기능적 단편이 인간 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편인 것인 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 약 50 mg/ml 내지 약 180 mg/ml의 GM-CSF를 중화시키는 화합물,
    ii) 약 5% (w/v) 소르비톨,
    iii) 약 30 mM L-히스티딘 및
    iv) 약 0.001% (w/v) 내지 약 1% (w/v) 계면활성제를 포함하고,
    v) pH가 약 5.8인 것인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 약 80 mg/ml 또는 150 mg/ml의 GM-CSF를 중화시키는 화합물을 포함하는 것인 조성물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 80인 것인 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 폴리소르베이트 80 농도가 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.08% (w/v)인 것인 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 폴리소르베이트 80 대 단백질 비가 약 0.3:1 내지 약 0.6:1인 것인 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 액체, 바람직하게, 수성 조성물인 것인 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2-8℃에서 24개월 이상 동안, 또는 실온에서 28일 이상 동안 안정한 것인 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 충전된 시린지에 패키징된 것인 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에서 사용하기 위한 것인 조성물.
KR1020167031014A 2014-05-07 2015-05-04 Gm-csf 중화 화합물을 포함하는 액체 제제 KR102385802B1 (ko)

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EP14167405.1 2014-05-07
EP14167405 2014-05-07
US201461994319P 2014-05-16 2014-05-16
US61/994,319 2014-05-16
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