CN106659785A - 包含gm‑csf中和化合物的液体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种水性制剂，其包含浓度为至少约20mg/ml的中和GM‑CSF的化合物、张力调节剂、缓冲剂，并且包含表面活性剂、氨基酸、抗氧化剂和/或螯合剂中的一种或多种，其中所述组合物是稳定的。考虑到长期储存，所述制剂的成分优选为中和GM‑CSF的化合物提供稳定性。在一个优选的方面，所述制剂用于治疗，优选用于治疗炎性和自身免疫性疾病，优选包括过敏性和银屑病性疾病，以及关节炎性和哮喘性疾病。此外，提供了一种包含本发明所述制剂的试剂盒。

Description

包含GM-CSF中和化合物的液体制剂
本发明涉及包含中和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolony stimulating factor,GM-CSF)的化合物的稳定液体制剂。所述制剂的成分优选提供在长期存储和冻融循环下的稳定性。在一个优选方面，所述制剂用于治疗，优选用于炎性和自身免疫性疾病的治疗，优选包括过敏性和银屑病性疾病，以及关节炎性和哮喘性疾病。此外，提供了包含本发明制剂的试剂盒。
蛋白质在药品、兽医产品、化妆品和其他消费品、食品、饲料、诊断、工业化学和去污领域中的广泛应用中使用。有时，这些用途被蛋白质自身的固有约束所限制，或被它们所应用的环境或介质所迫。这些约束可能导致蛋白质的稳定性差，性能变化或高成本。由于生物技术的出现，可以生产各种用于治疗应用的蛋白质。蛋白质药物在它们被生产后通常在使用前被储存。由于蛋白质通常比“传统”药物更大更复杂这一事实，适合于储存的蛋白质药物的配制和加工可能特别具有挑战性。关于蛋白质药物制剂和加工设计的综述，参见Carpenter等人(1997)，Pharm.Res.14:969-975；Wang(2000)，Int.J.Pharmaceutics 203:1-60；以及Tang和Pikal(2004)，Pharm.Res.21:191-200。
有几个因素可在设计蛋白质药物生产的制剂和工艺中予以考虑。首要问题是蛋白质在经过制造、运输和处理的任意或所有步骤的稳定性，这可以包括所述组合物的制备、冷冻、冻干、干燥、储存、运输、重构、冻/融循环，以及最终用户对其重构后的存储。其它潜在的考虑事项包括制造、处理和分配的简易性和经济性；用于患者施用的最终产品的组成；最终用户使用的简易性，其包括冻干制剂在重构时的溶解度。
液体制剂可满足特定目的。液体制剂的潜在优势包括制造的简易性和经济性，以及最终用户的便利性。通常，当长时间储存时，多肽在溶液中不稳定(Manning等人(1989)，Pham.Res.6:903-918)。因此，已开发额外的加工步骤以允许较长的保质期，包括干燥例如冻干。冻干制剂还可提供某些优势。冻干的潜在益处包括蛋白质稳定性的改善以及运输和储存的简易性和经济性的提高。然而，冻干药物组合物可能对最终用户不太便利。
除了选择组合物基本形式(如冻干的、液体的、冷冻的等)之外，对蛋白质制剂的最优化通常涉及改变制剂的组分及其各自的浓度以使蛋白质稳定性最大化。多种因素可能影响蛋白质的稳定性，包括离子强度、pH、温度、冻/融循环、剪切力、冷冻、冻干、干燥、搅拌以及重构。蛋白质的不稳定性可能由物理降解(例如变性、聚集或沉淀)或化学降解(例如脱酰胺作用、氧化或水解)而引起。制剂组分和浓度的最优化仅基于实证研究和/或克服不稳定性来源的合理方法。
有时，在含有多肽的药物组合物(包括水性和冻干制剂)的长期储存中，活性多肽可能由于聚集和/或降解而丢失。
因此，改善多肽稳定性的典型做法可通过改变制剂中要素的浓度或通过加入辅料以改变制剂(美国专利号5,580,856和6,171,586和美国专利申请号US 2003/0202972，US2003/0180287)来解决。US 5,580,856为公开了可在复水期间或之后添加以稳定干燥蛋白质的试剂的原型专利，所述试剂诸如天然聚合物、表面活性剂、硫酸多糖、蛋白质和缓冲剂。然而，美国专利5,580,856除了给出许多选择之外，并没有教导应当为哪种蛋白质添加哪种稳定剂。因此，虽然本领域读者知道这些选择，他或她将必须在US5,580,856所描述的许多选项中找出用于他/她的蛋白质的最佳条件。美国专利申请2003/0202972描述了一种抗Her2抗体的稳定的冻干制剂，其中所述稳定剂为糖、海藻糖或缓冲剂。然而，尽管这些稳定剂对抗体可能有用，但它们不能类推至其它蛋白质。美国专利申请2003/0180287类似于US2003/0202972，因为它也描述了一种免疫球蛋白样蛋白的稳定溶液，即含有Fc结构域的蛋白质。所述稳定剂可以是磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠或钾、马来酸、乙酸铵、Tris-缓冲剂、乙酸盐、二乙醇胺、组氨酸、赖氨酸或半胱氨酸。在本领域读者可以选择的这些化学上不同的稳定剂中，赖氨酸被证明是适合的。然而，如同US2003/0202972，特定稳定剂仅仅适用于特定的蛋白质，在这里是指含Fc结构域的蛋白质，并且本身不能被类推到另一种蛋白质。因此，添加剂的使用不能从特定蛋白质类推到另一种不相关的蛋白质。事实上，添加剂的使用—尽管改善了储存—仍可导致无活性的多肽。此外，在冻干的情况下，复水步骤可引入通过例如聚集或变性导致多肽失活的条件(Hora等人(1992)，Pharm.Res.，9:33-36；Liu等人(1991)，Biotechnol.Bioeng.，37:177-184)。实际上，多肽的聚集是不希望的，因为它可能引起免疫原性(Cleland等人(1993)，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems，10:307-377；以及Robbins等人(1987)，Diabetes，36:838-845)。
在药物产品的开发和制造过程中，生物活性的维持取决于大分子的固有稳定性，以及所采用的稳定技术。存在一系列的蛋白质稳定技术；包括向蛋白质水溶液或悬浮液中添加化学“稳定剂”。例如，美国专利4,297,344披露了通过添加选定的氨基酸使凝血因子II和VIII、抗凝血酶III、血纤维蛋白溶酶原对热具有稳定性。美国专利4,783,441披露了一种通过添加表面活性物质来稳定蛋白质的方法。美国专利4,812,557披露了一种通过使用人血清白蛋白来稳定白细胞介素-2的方法。将制备物与冷冻保护剂混合并于非常低的温度下储存的冻/融法是稳定蛋白质的另一种选择。然而，并非所有的蛋白质会在冻/融循环中存活。使用冷冻保护添加剂通常是甘油的冷藏室另一个选择。还可以采用如美国专利5,098,893所描述的以玻璃形式储存。这种情况下，蛋白质溶解于无定型态或玻璃态的水溶性或水膨胀性物质中。应用最广泛的稳定蛋白质的方法是冷冻干燥法或冻干法。每当在水溶液中不能获得足够的蛋白质稳定性时，冻干提供了最可行的选择。冻干法的一个缺点是它需要复杂的加工，耗时且昂贵。此外，如果冷冻干燥不能谨慎实施，大多数制备物通过该技术的冷冻和脱水步骤会至少部分变性。结果是蛋白质分子的一部分经常不可逆聚集，致使制剂对于肠胃外施用上不可接受的。
通常而言，文献中已经详细描述了蛋白质降解，但是没有描述中和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(另称为GM-CSF)的化合物，特别是多肽和抗GM-CSF抗体的储存和可溶性。
此外，尽管本领域已知蛋白质稳定剂以及允许高浓度蛋白质同时保持稳定的试剂有众多选择，但直至本发明，在本领域中没有意识到包含以高浓度中和GM-CSF的化合物的制剂可能不稳定而因此需要改善。
在制备包含蛋白质诸如抗体如单克隆抗体的药物组合物中，目的在于开发高浓度的液体制剂，这是由于皮下施用具有能使患者更便利的潜力。然而，存在普遍共识，即开发高浓度抗体特别是单克隆抗体制剂对单克隆抗体的物理和化学稳定性提出了严峻的挑战，诸如可溶性以及不溶性聚集体或颗粒的形成的增加会提高免疫源应答的概率并导致低生物活性。
液体药物组合物储存期间多肽聚集体或颗粒的形成可能会对该多肽的生物活性产生不利影响，导致该药物组合物治疗功效的丧失。此外，聚集体或颗粒的形成可引起其它挑战，诸如当通过使用输注系统来施用包含多肽的药物组合物时造成导管、膜或泵的堵塞。
此外，已报道高浓度抗体制剂会导致粘度增加由此给可制造性和注射性造成严峻挑战。高粘度制剂难以制造、吸入注射器和注射。在操作粘性制剂中所使用的力导致过度起沫，这可引起单克隆抗体的变性和失活。
因此，非常需要一种稳定的高浓度蛋白质药物组合物，其包含中和GM-CSF的化合物例如抗体，并具有适合于皮下施用的、低的且可行的粘度，诸如在即用型装置中。此外，从患者角度看，将非常需要室温下稳定的产品。目前，尤其是不可能有市售抗体制剂能在药物产品的整个保质期内于室温下储存。典型地，增加的蛋白质聚集的出现导致不可接受的高水平聚集体和蛋白质相关的杂质，这可能引起免疫源性反应。
最初被鉴定为造血生长因子的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，最近已经被证明是在炎症和自身免疫中的重要细胞因子。在各种炎症部位，包括在过敏和银屑病患者、关节炎和哮喘患者中，测量到GM-CSF mRNA或蛋白质的水平升高。许多体内研究已经表明，在过去几年中，经由中和抗体来阻断GM-CSF，可以在多种炎症模型中预防或甚至治愈促炎性疾病，包括关节炎实验性自身免疫性脑炎、银屑病和肺部疾病的模型。因此，非常需要获得一种含有GM-CSF中和化合物的制剂，即特别是稳定的、包含高含量的GM-CSF中和化合物和/或可以通过皮下途径施用的制剂。
因此，本发明的技术挑战符合上述需要。
本发明满足了这些需要，并且因此提供了关于制剂以及将这些制剂用于治疗患病受试者(将得益于中和GM-CSF的化合物的施用)的方法和用途的实施方案，作为该技术挑战的一种解决方案。这些实施方案在本文中进行表征并描述，在实施例中阐述并反映在权利要求中。
必须注意的是，除非上下文另有明确说明，如本文所用的单数形式“一个”、“一种”以及“该”包括复数指代。因此，例如提及“一种抗体”包括此类不同抗体的一种或多种，提及“该方法”包括指代本领域普通技术人员所公知的可以被修改或替换本文所描述方法的等同步骤和方法。
除非另有说明，一系列要素之前的术语“至少”应被理解为是指该系列中的每一个要素。本领域技术人员仅使用常规实验，将认识到或能够确定本文所述发明的特定实施方案的许多等同方案。这些等同方案旨在被本发明所涵盖。
贯穿于本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包含”及其变体诸如“包括”和“含有”将被理解为暗示包括所述整数或步骤、或整数或步骤的集合，但并不排除任何其它的整数或步骤、或整数或步骤的集合。当在本文中使用时，术语“包含”可被术语“含有”替代，或有时在本文使用时会以术语“具有”替代，或甚至可能被“由…组成”所取代。
当在本文中使用时，“由…组成”排除了权利要求要素中未明确提出的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时“基本上由…组成”并不排除实质上不影响权利要求的基本特征和新颖性特征的材料或步骤。在本文的每一个实例中，术语“基本上由…组成”和“由…组成”可互相替换。
如本文所使用的在多个所述要素之间的连接术语“和/或”被理解为既包含单独选项也包含组合选项。例如，当两个要素通过“和/或”连接时，第一种选项是指不包含第二种要素的第一种元素的适用性。第二种选项是指不包含第一种要素的第二种要素的适用性。第三种选项是指第一种要素和第二种要素结合的适用性。这些选项中的任意一种都被理解为落入该含义内，并因此满足本文所使用术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落入该含义内，因此满足本文所使用的术语“和/或”的要求。
本说明书全文引用了多个文件。本文所引用的每一个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指导书等)，无论是上文还是下文，都通过引用整体并入本文。在通过引用并入的材料或与本说明书矛盾或不一致的情况下，本说明书将取代任何这样的材料。本文中的任何内容不应被解释为由于在先发明就承认本发明没有早于此种公开物的权利。
考虑到要以提供一种具有高浓度中和GM-CSF的化合物的制剂为目标，本发明人认识到中和GM-CSF的化合物在高浓度下可能不稳定，在长时间储存中也可能不稳定。
实际上，存在很多中和GM-CSF的化合物如蛋白质可能不稳定的方式。例如，蛋白质不稳定性可能由蛋白质聚集或降解造成，也可能由于脱氨基作用、脱酰胺基作用、氧化、二硫键断裂和形成、水解作用、琥珀亚酰胺化、非二硫化物交联、去糖基化或“酶促褐变”(美拉德反应)或这些现象的任意组合所导致的化学不稳定性造成；参见例如Wang等人(1999)，Int.J.Pharm.185:129-188。此外，理化参数诸如温度、pH值、表面吸附、盐、金属离子、螯合剂、物理力如剪切力、蛋白变性剂、非水溶剂、蛋白质浓度、蛋白质来源和纯度、蛋白质形态或压力可影响蛋白质的稳定性。
但是，尽管很多因素可影响蛋白质的稳定性，但也可采取很多措施来稳定蛋白质。例如，可以在内部(通过改变氨基酸)或外部稳定蛋白质。外部稳定可以通过添加螯合剂、金属离子、还原剂、聚合物、聚乙二醇/多元醇、血清白蛋白、表面活性剂、糖和多元醇、脂肪酸和磷脂、氨基酸、缓冲剂等来实现；参见例如Wang，Y和Hanson M(1988)，J.Parental Sci.&Technology，42，Supplement:4-26；Wang等人(1999)Int.J.Pharm.185:129-188。总之，为了稳定制剂中的GM-CSF中和化合物诸如抗体，技术人员会获得多种选择。
在本发明的情况下，本发明人观察到中和GM-CSF的化合物可显示出聚集和/或可能不以更高的浓度溶解。许多不同因素可引起制剂中蛋白质的聚集。典型的纯化和储存过程可使蛋白质制剂暴露于导致蛋白质聚集成蛋白二聚体、三聚体或多聚体、较大的亚可见颗粒和可见颗粒的条件和组分中。例如，制剂中的蛋白质可由于下述的一种或多种情况而聚集：储存、暴露于升高的温度、制剂的pH值、制剂的离子强度、某些表面活性剂和乳化剂的存在。类似地，当暴露于剪切应力如在溶液中重构冻干蛋白质饼、过滤纯化蛋白质样品、冻融、振动或经由注射器转移蛋白质溶液时，蛋白质可以聚集。聚集还可能由于溶液中和存储瓶内液态-空气界面处多肽分子间的相互作用而发生。构象变化可在由于运输期间的搅动所引起的界面压缩或延伸的过程中被吸附到空气-液体、固体-液体界面的多肽中发生。这种搅动还可导致制剂的蛋白质聚集并最终与其它被吸附的蛋白质一起沉淀。亚可见粒子的增长可表明可见粒子的形成趋势。通常，不同类型聚集体和颗粒的形成可通过不同的测量系统根据聚集体或颗粒的尺寸来进行分析。例如，SEC、DLS、AUC测量纳米尺寸范围内的二聚体、三聚体、多聚体；不透光度、显微镜检查、动态影像、流式细胞术和库尔特(Coulter)测量大于1μm的亚可见颗粒和小的可见颗粒。
此外，将蛋白质制剂暴露于光下可引起蛋白质聚集。因此本发明提供了能实现高浓度的中和GM-CSF的化合物，并减少这些化合物聚集的制剂。在不受理论的束缚下，聚集的减少被认为是通过控制一种或多种上述聚集机制来实现。这可以引起例如改进的产品稳定性，以及制造过程中和储存条件下的更大的灵活性。
本发明人旨在提供一种含有高浓度的中和GM-CSF的化合物的制剂，以便例如实现较低的注射体积而适于减少由于高注射量引起的副作用如疼痛，或允许以低体积进行皮下施用。
因为如此，本发明人在他们研究期间已经观察到了中和GM-CSF的化合物的某种不稳定性，并因此旨在改善这种不希望的观察结果。因此，他们旨在浓缩中和GM-CSF的化合物，而同时将其保持在溶液中，即处于溶解状态。在这样做时，他们有很多种选择和替代，然而没有任何迹象显示这些选择和替代中的任何一个将适用于解决这个目标问题。
“溶解状态”意指中和GM-CSF的化合物是在溶液中，优选浓度至少为约20mg/ml，也就是说其直接溶解和/或分散在制剂的水溶液中(即在水相中)。优选地，中和GM-CSF的化合物是均质地溶解和/或分散的。“均质地”意指溶解和/或分散于水性制剂中的中和GM-CSF的化合物几乎是均匀地，优选均匀地分布于水性制剂中，这样使得在该水溶液体积(“v”)下(或中)的中和GM-CSF的化合物的浓度(“c”)(在摩尔质量的情况下为“n”或在质量的情况下为“m”)是几乎完全相同的，优选完全相同的，即c＝n/v或c＝m/v分别是几乎恒定的，优选为恒定的。优选地，所述制剂中不存在浓度梯度。
因此，本发明所述包含中和GM-CSF的化合物的稳定制剂可优选地被认为是一种水溶液，其中中和GM-CSF的化合物直接溶解和/或分散于该水溶液中。
“溶液”是两种或多种物质/组分的均质混合物。在这样的混合物中，一种溶质(在本发明中是中和GM-CSF的化合物)溶解于(如上所述)另一种物质(本在发明中优选为水性制剂)中，也被称为溶剂。
鉴于以上所述，中和GM-CSF的化合物优选非异质地溶解和/或分散在水溶液中。术语“溶解状态”还包括中和GM-CSF的化合物优选为在水溶液中是基本上不乳化的，或更优选为是完全不乳化的。
此外，术语“溶解状态”包括中和GM-CSF的化合物优选为例如在脂质体、多层脂质体或诸如此类中是基本上不封装和/或包埋的(优选少于2％、1％或0.5％的中和GM-CSF的化合物可被封装和/或包埋)，或更优选为完全不封装和/或包埋的。
因此，本发明的一个优选实施方案是含有中和GM-CSF的化合物的液体制剂，其在长期储存中是稳定的并且没有形成缀合物/聚集体/颗粒或片段/降解产品，适合于皮下施用。
具体而言，在测试过多种不同稳定剂后，本发明人发现如果将张力调节剂添加至待储存的溶液中，可以稳定中和GM-CSF的化合物。张力调节剂的实例包括但不限于糖和糖醇。简单的糖类被称为单糖，包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖、甘露糖、乳果糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、阿拉伯糖和来苏糖。本发明更优选二糖，其包括例如蔗糖、麦芽糖、乳糖、异麦芽糖、海藻糖和纤维二糖。糖醇包括山梨醇、甘露醇、甘油、赤藓糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、聚葡萄糖醇(polyglycitol)。在一个优选实施方案中，所述糖是非还原糖诸如蔗糖或海藻糖。非还原糖的特征在于不存在开链结构，因此它们不易受到氧化还原反应的影响。因此，一种或多种非还原糖诸如蔗糖或海藻糖，或一种或多种糖醇诸如甘露醇或山梨醇，可以加入至包含中和GM-CSF的化合物的制剂中。非还原糖和糖醇的组合也可以加入至该溶液中，诸如蔗糖和甘露醇、蔗糖和山梨醇、海藻糖和甘露醇，或海藻糖和山梨醇。更优选加入糖醇甘露醇和/或山梨醇，优选其D-型，最优选将山梨醇加入至该溶液。张力调节剂优选山梨醇的浓度为约1％和约15％(w/v)之间，优选为约2％和约10％(w/v)之间，更优选为约3％至约7％(w/v)之间，优选为4％和约6％(w/v)之间，最优选为约5％(w/v)。
另一种用来在长期储存时稳定高浓度的中和GM-CSF的化合物的具体优选物质为缓冲体系，其pH为约4和约10之间，优选为约4和约7之间，更优选为约4和约6之间或约5和约7之间，甚至更优选为约5.5和约6.5之间，最优选pH为约5.8。缓冲液可优选地选自组氨酸缓冲液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。当文本提及氨基酸时，其意为L-氨基酸或D-氨基酸，其中优选L-氨基酸。优选组氨酸及其盐用于缓冲体系。优选地，所述盐是氯化物、磷酸盐、乙酸盐或硫酸盐，更优选地，所述盐是氯化物。组氨酸缓冲体系的pH为约5和约7之间，优选为约5.5和约6.5之间，更优选pH为约5.8或正好5.8。可以通过使用常规使用的碱和酸来调节pH，优选地，可以使用NaOH或组氨酸和组氨酸盐的混合物，这样剂不需要调节pH。缓冲体系优选组氨酸缓冲体系的浓度为约10mM和约50mM之间，优选为约20mM和约40mM之间，更优选为约30mM。
此外，本发明人发现，如果向待储存的溶液中添加表面活性剂、氨基酸、抗氧化剂和/或螯合剂中的一种或多种，可以稳定中和GM-CSF的化合物。
根据优选的实施方案，为了在长期储存和/或一个或多个冻/融循环中预防聚集并使该试剂足够稳定，将缓冲剂体系、张力调节剂、表面活性剂和/或泊洛沙姆的组合用于稳定溶液中的中和GM-CSF的化合物，其中所述缓冲体系优选组氨酸缓冲剂；所述张力调节剂优选糖醇，更优选甘露醇或甚至更优选山梨醇；所述表面活性剂优选聚山梨醇酯20(PS20；20)、聚山梨醇酯80(PS80；80)。已经表明，就稳定性而言，所述制剂中优选具有约6％(w/v)和更高的糖醇，优选山梨醇。然而，将所述制剂的渗透压上限设定为约500mOsm/kg，其仍然是高渗的，但是类似于批准产品(Synagis；Lm.administration)的渗透压。正如本发明实施例所描述的，发现了中和GM-CSF的化合物的最佳稳定性、张力和浓度之间的折中。因此，糖醇优选山梨醇的优选浓度在约3％和约7％(w/v)之间，更优选在约4％和约6％(w/v)之间，最优选约5％(w/v)。
本发明的一些实施方案中，本发明的包含中和GM-CSF的化合物的制剂或组合物不含或基本上不含氯化钠。“基本上不含”意指氯化钠的浓度为或非常接近0(零)mM，例如低于约50mM，优选低于约20mM，更优选低于约10mM，甚至更优选为低于约5mM，最优选低于约2mM，或甚至低于约1mM。
在待储存、冷冻/解冻和/或即可使用的液体制剂中，所使用的中和GM-CSF的各化合物的浓度为至少约20mg/ml，优选至少约50mg/ml，更优选为至少约60mg/ml。本发明所使用的浓度为约20mg/ml至约200mg/ml，优选约40mg/ml至约200mg/ml，更优选约50mg/ml至约180mg/ml，甚至更优选约70mg/ml至约170mg/ml，甚至更优选约75mg/ml至约165mg/ml，最优选约80mg/ml或约150mg/ml。
所生产的液体制剂的保质期的优选最低要求为2-8℃下24个月，优选2-8℃下36个月，更优选2-8℃下48个月，最优选2-8℃下60个月，或室温下(25℃±2℃)至少28天。
本发明涉及稳定的制剂，优选稳定的液体制剂，该制剂令人惊讶地允许中和GM-CSF的化合物的长期储存。该制剂部分是有用的，因为其更便于对患者使用，该制剂的中和GM-CSF的化合物是高度浓缩的从而减少了由于高体积注射所引起的类似疼痛的副作用。
因此，本发明的一个方面是基于发现包含以下项的制剂对于长期储存和/或冻/融循环和/或剪切应力(振动/搅拌稳定性)具有足够的稳定性：
-中和GM-CSF的化合物，
-缓冲体系，其优选自pH优选为5和7之间的组氨酸缓冲液、乙酸盐缓冲液和/或柠檬酸盐缓冲液，
-张力调节剂，其优选自非还原糖诸如蔗糖或海藻糖，或糖醇诸如甘露醇或山梨醇，
-以及表面活性剂、氨基酸、抗氧化剂和/或螯合剂中的一种或多种，优选表面活性剂，所述表面活性剂优选为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或泊洛沙姆中的一种或多种。
本发明的制剂相对于标准缓冲制剂具有许多优点。一方面，该制剂显示出经长期储存后最小的聚集行为，并且没有对高蛋白制剂所预期的有害作用。根据本发明，该制剂的其它优点在于：所述中和GM-CSF的化合物的片段化最少；长期储存后所述中和GM-CSF的化合物的生物活性没有显著影响；所述组合物的粘度低。
本发明第一方面的优选实施方案如下：根据本发明所述的制剂，其中所述中和GM-CSF的化合物是多肽、拟肽、核酸或小分子。
在一个优选的实施方案中，所述中和GM-CSF的化合物(优选为多肽，更优选为抗体或其功能片段)与GM-CSF或GM-CSF受体结合或特异性结合。据设想，所述GM-CSF或GM-CSF受体是动物的，包括但不限于哺乳动物诸如实验动物(啮齿类诸如大鼠、豚鼠、仓鼠或小鼠；非人灵长类动物诸如食蟹猴(cynomolgus monkey)或猕猴(macaque monkey)、家养或宠物动物(例如狗和猫)、农场或农业动物(例如牛、绵羊、山羊和猪的动物)和/或人。优选地，所述GM-CSF或GM-CSF受体分别为人GM-CSF(智人，Homo sapiens)或人GM-CSF受体，或分别为非人灵长类GM-CSF或非人灵长类GM-CSF受体。非人灵长类GM-CSF或非人灵长类GM-CSF受体的特别优选的变体(同源物)包括长臂猿(Nomascus concolor，也称为西部黑冠长臂猿)的变体、猕猴科的猴子例如恒河猴(Macaca mulatta)和食蟹猴(Macaca fascicularis)的变体。根据本发明的一个特别优选的实施方案，与GM-CSF或GM-CSF受体结合的化合物(优选抗体或其片段)表现出对人和至少一种上述猴种两者的交叉反应性。例如，抗体或其片段能够结合(并且中和)人GM-CSF和食蟹猴(Macaca fascicularis)两者。这对于旨在用于人类受试者的治疗性施用的抗体分子是特别有利的，因为这样的抗体通常必须在获得监管批准之前经过大量试验，其中某些早期试验涉及非人动物物种。在进行这样的试验中，通常期望使用与人具有高度遗传相似性的物种作为非人物种(例如，非人灵长类动诸如食蟹猴)，因为如此获得的结果通常将是对人施用相同分子时可预期的相应结果的高度预测。然而，此种基于动物试验的预测能力至少部分取决于分子的可比性，由于种间反应性，当同样的治疗分子可被施用于人和动物模型时，该预测能力非常高。如在本发明这个实施方案中，当抗体分子对人类和另一个紧密相关物种的同一种抗原具有交叉反应性时，可使用人和所述另一个紧密相关物种(例如上述猴种中的一种)的同一种抗体分子进行试验。这提高了试验本身的效率以及由这种关于人类(从治疗的立场看最终感兴趣的物种)中这种抗体行为的试验所提供的预测能力。优选地，与GM-CSF或GM-CSF受体结合的抗体或其功能片段是单克隆抗体或其功能片段。这同样适用于中和GM-CSF的化合物的替代实施方案，该化合物不是抗体或不是衍生自抗体。
优选地，该中和GM-CSF的化合物是人单克隆抗体或其功能片段。
中和GM-CSF的化合物可以是与人和非人灵长类GM-CSF的表位结合的抗体或其功能片段。所述表位优选包含第23-27位氨基酸(RRLLN)和/或第65-77位氨基酸(GLR/QGSLTKLKGPL)。第65-77位氨基酸序列延伸中第67位上的变异性反应了这部分GM-CSF在一方面是人和长臂猿GM-CSF(其中第67位为R)和另一方面是猕猴科的猴诸如猕猴和恒河猴(其中第67位为Q)之间的异质性。如果表位包含两个非相邻的氨基酸序列延伸，诸如第23-27位(RRLLN)和第35-77位(GLR/QGSLTKLKGPL)，那么该表位还可称为“不连续”表位。所述GM-CSF表位或所述GM-CSF不连续表位可进一步包含第28-31位氨基酸(LSRD)、第32-33位氨基酸(TA)和/或第21-22位氨基酸(EA)。
所述人单克隆抗体或其功能片段优选在其重链可变区包含含有选自如SEQ IDNO:1-13和56所示氨基酸序列的CDR3；优选地，所述重链可变区CDR3包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
任意的所述重链可变区CDR3序列可进一步与包含如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链可变区CDR1以及包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的重链可变区CDR2一起存在于重链可变区。
进一步地，所述人单克隆抗体或其功能片段可在其轻链可变区包含含有如SEQ IDNO:16所示氨基酸序列的CDR1、含有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR2和含有如SEQID NO:18所示氨基酸序列的CDR3。
在本发明特别优选的一个方面，所述人单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变区包含含有如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR1、含有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR2和含有如SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的CDR3；在其重链可变区包含含有如SEQ IDNO:14所示氨基酸序列的CDR1、含有如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的CDR2和含有选自如SEQ ID NO:1-13和56所示、最优选为如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的CDR3。
根据一个优选的实施方案，所述人单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变区包含选自如SEQ ID NO:19、54和55所示的氨基酸序列。根据另一个优选的实施方案，所述人单克隆抗体或其功能片段在其重链可变区包含选自如SEQ ID NO:20-33、52和53所示的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述人单克隆抗体或其功能片段包含如SEQ ID NO:34所示的轻链氨基酸序列，和/或如SEQ ID NO:35-48任一项所示的、最优选为如SEQ ID NO:35所示的重链氨基酸序列。
所述人单克隆抗体或其功能片段可包含一个或多个与如SEQ ID NO:1-48和52-56的任一项所示的相应氨基酸序列、优选如SEQ ID NO:1-18和56中的任一项所示的相应氨基酸序列、和/或如SEQ ID NO:19-48和52-55中的任一项所示的氨基酸序列中框架区(FR)氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。因此，在一个优选的实施方案中，所述人单克隆抗体或其功能片段可包含一个或多个与如SEQ ID NO:1-18和56中的任一项所示的相应氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。
可选择地，在如SEQ ID NO:1-18和56中任一项所示的CDR的任一氨基酸序列中，一个、两个、三个、四个、五个、七个、八个、九个或十个氨基酸可被取代。优选地，这种具有取代的CDR仍然能够与本文所述GM-CSF结合。
或者或另外，优选地，所述人单克隆抗体或其功能片段可包含一个或多个分别与如SEQ ID NO:19-48和52-55中任一项所示的VH、VL、H或L区的相应氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。优选地，所述同源性是相对于整个VH、VL、H或L氨基酸序列。更优选地，所述同源性在前述CDR内，或者所述同源性在如SEQID NO:19-48和52-55中的任一项所示的VH、VL、H或L区的FR(或非CDR)内。因此，在每一个FR中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸可被取代。这样的FR取代型变体仍然能够结合本文所述的GM-CSF。
由于SEQ ID NO:1-18和56示出了一个或多个如SEQ ID NO:19-48和52-55所示的VH、VL、H或L序列中包含的CDR序列，因此技术人员可容易地确定SEQ ID NO:19-48和52-55中的FR(或非CDR)。也就是说，序列表在序列标识符<223>中提供了每一个氨基酸序列的名称。相同的名称表明这些氨基酸序列是“属于”一起的，意指CDR被包含在VH、VL、H或L区中，例如SEQ ID NO:16、17、18是被包含在如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列中的CDR氨基酸序列(因为它们均被称为(5-306))。
作为进一步的说明，如果重链和/或轻链的一个或多个或所有CDR或FR中的氨基酸被替代，那么优选随后获得的“取代”序列与“原始”CDR或FR序列有至少70％、更优选80％、甚至更优选90％、特别优选95％、更特别优选98％或99％的同一性。这意味着其与“取代”序列的同源性程度取决于CDR或FR的长度。
同源性通过标准序列比对程序来确定，诸如Vector NTI(InforMaxTM，Maryland，USA)，或更优选通过程序BLASTP来确定，优选版本blastp 2.2.5(2002年11月16日；参见Altschul，S.F.等人(1997)Nucl.Acids Res.25，3389-3402)。同源性百分比基于对整个多肽序列的比对(矩阵：BLOSUM 62；空位罚分：11.1；临界值设为10-3)，使用CDR、VH、VL、H或L氨基酸序列中的任一个作为成对比较的参照。计算BLASTP程序输出中表示为“正数”(同源氨基酸)的数量除以比对程序所选的氨基酸总数的百分比。
当在本文中使用时，氨基酸或核苷酸序列的同源性可以与术语“同一性”互换使用。本发明所使用的术语“同源性”意为成对相同残基—在对本发明的氨基酸序列或核苷酸序列的序列与所讨论的序列进行同源性比对之后—相对于这两个序列中较长者的残基数量的百分比。如上所述，用于确定同源性(或同一性)的程序对在一个氨基酸接着一个氨基酸的基础上比对的序列进行比较，并且可被设置成不同的严格性水平用于比较(例如相同氨基酸、保守氨基酸取代等)。如本文所使用的术语，如果所讨论的两个氨基酸的每一个属于相同的化学种类，即酸性、非极性/疏水性、不带电的极性和碱性，它们就被视为是彼此“保守取代”。作为非限制性实例，属于非极性氨基酸种类的两个不同氨基酸会被视为彼此的“保守取代”，即使这两个氨基酸不是同一种，然而，一方面的非极性氨基酸和另一方面的碱性氨基酸则不会被视为彼此的“保守取代”。Alberts，Johnson，Lewis，Raff，Roberts和Walter所著的“Molecular Biology of the Cell”，第四版(2002)，第3.1面板中将氨基酸分成四个主要类型：酸性、非极性、不带电的极性和碱性。本发明上下文中，这种分类可用于确定特定氨基酸是否是所讨论的另一个氨基酸的保守取代的目的。上述的主要类型可进一步被细分为例如小非极性和大非极性氨基酸、大芳香族氨基酸等。术语“保守氨基酸取代”还指给定氨基酸残基的任意氨基酸取代，其中所述取代残基在化学上非常类似于所给定的残基，以致于并未导致多肽功能(例如结合)的实质性降低。
中和GM-CSF的化合物通常地被配制成用于向受试者肠胃外施用的药物组合物，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、外用或皮内施用，其中优选皮下施用。在某些实施方案中，所述药物组合物为液体组合物，优选水性组合物。
在一个实施方案中，在待储存、冻/融和/或即可使用的液体制剂中，液体药物组合中所述中和GM-CSF的化合物的浓度至少20mg/ml，优选至少约50mg/ml，更优选至少约60mg/ml。本发明所使用的浓度为约20mg/ml至约200mg/ml，优选约40mg/ml至约200mg/ml，更优选为约50mg/ml至约180mg/ml，甚至更优选为约70mg/ml至约170mg/ml，甚至更优选为约75mg/ml至约165mg/ml，最优选约80mg/ml或约150mg/ml。在一些实施方案中，例如当所述组合物旨在用于皮下递送时，可以使用更高浓度的中和GM-CSF的化合物。
如上所述，本发明所述组合物包含缓冲液。如本文使用的术语“缓冲液”是指添加的允许液体制剂抵抗pH变化的组合物。在某些实施方案中，所添加的缓冲液通过其酸碱共轭组分的作用允许液体制剂抵抗pH的变化。合适的缓冲液的实例包括但不限于：缓冲的组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐系统。
如本文所使用的术语“特异性地结合”或相关表达诸如“特异性的结合”、“特异性结合”、“特异性结合剂”等是指所述GM-CSF-中和化合物，优选(人)(单克隆)抗体或其功能片段对其标靶(例如GM-CSF或GM-CSF受体)与任意其它不同于GM-CSF或GM-CSF受体的潜在抗原进行区别到这种程度的能力，即从多种不同的抗原作为潜在的结合配偶体中，只有GM-CSF/GM-CSF受体被结合或被显著结合。在本发明的含义内，从等同可接近的作为潜在结合配偶体的多种不同抗原中，当靶标比任意其它不同于该靶标的抗原频繁(在动力学意义上)至少10倍、优选至少50倍、最优选至少100倍或更频繁地被结合时，靶标是被“显著”结合的。可以通过例如使用SPR技术诸如Biacore仪器来进行这种动力学测量。如本文所使用的术语“与……(特异性)结合”或相关术语诸如“(特异性)识别”、“针对”、“(特异性地)相互作用”以及“(特异性地)与...…发生反应”意指根据本发明，中和GM-CSF的化合物(例如抗体)表现出对其靶标(例如GM-CSF或该GM-CSF受体)有可观的亲和力，而通常不表现出与除前述靶标以外的蛋白质或抗原有显著反应性。“可观的亲和力”包括以约10-6M(KD)或更强，诸如10-7M或更强的结合亲和力结合。优选地，当结合亲和力为约10-11至10-8M、优选约10-11至10-9M、更优选约10-11至10-10M时，认为结合是特异性的。通过尤其是将所述化合物与其靶蛋白或抗原的反应和所述化合物与除其标靶之外的蛋白或抗原的反应进行比较，可很容易检测出化合物(例如抗体)与其靶标是否发生特异性反应或结合。优选地，根据本发明所述的化合物基本上不结合或不能够结合除GM-CSF或GM-CSF受体之外的蛋白质或抗原。术语“基本上不结合”或“不能够结合”意指本发明的化合物显示出与除GM-CSF或GM-CSF受体之外的蛋白质或抗原的反应性不多于30％，优选不多于20％，更优选不多于10％，特别优选不多于9％、8％、7％、6％或5％。
如本文所使用的，“中和作用”、“中和剂”、“中和”及其语法相关变形是指GM-CSF生物效应的部分或完全衰减。GM-CSF生物学效应的这种部分或完全衰减是由修饰、中断和/或消除GM-CSF介导的过程造成的，诸如信号转导，例如在细胞内信号传导、细胞增殖、可溶性物质释放、细胞内基因激活的上调或下调所显示的，这引起例如除GM-CSF之外的配体的表面受体表达。正如本领域技术人员所理解的，存在多种模式可确定化合物例如抗体或其功能片段是否会被归类为中和剂。作为一个实例，这可以通过通常如下进行的标准体外测试来实现：在第一次增殖实验中，将已知其增殖程度取决于GM-CSF活性的细胞系与不同浓度的GM-CSF的一系列样品一起孵育，随后测量其孵育后的细胞系增殖程度。从该测量中，确定允许细胞最大半数增殖的GM-CSF的浓度。然后进行第二次增殖实验，该实验所使用的一系列样品中的每一个使用与第一次增殖实验相同数量的细胞，使用上述确定的GM-CSF浓度，但这次试验中使用不同浓度的疑似为GM-CSF的中和剂的化合物。再次测量细胞增殖来确定所分析的化合物足以引起最大半数生长抑制的浓度。如果所得到的相对于所分析的化合物浓度的生长抑制图是S形状，导致细胞增殖随着所分析的化合物浓度升高而减少，那么生长抑制已在一定程度上受到了影响，即GM-CSF活性在一定程度上被中和。在这个情况下，所讨论的化合物可被视为本发明意义上的“中和剂”。已知增殖程度取决于GM-CSF活性的细胞系的一个实例是TF-1细胞系，正如Kitamura,T.等人(1989).J Cell Physiol 140，323-34中所描述。
正如本领域普通技术人员所理解的，细胞增殖的程度不是可确定GM-CSF中和能力的唯一参数。例如对信号分子水平(例如细胞因子)的测量、其分泌水平取决于GM-CSF，可被用于识别疑似的GM-CSF中和剂/GM-CSF抑制化合物。
可用于确定所讨论的化合物诸如抗体或其功能片段是否是GM-CSD活性中和剂的细胞系的其它实例包括AML-193(Lange,B.等人(1987).Blood 70,192-9)、GF-D8(Rambaldi,A.等人(1993).Blood 81,1376-83)、GM/SO(Oez，S.等人(1990),ExperimentalHematology 18,1108-11)、MO7E(Avanzi,G.C.等人(1990).Journal of CellularPhysiology 145,458-64)、TALL-103(Valtieri,M.等人(1987).Journal of Immunology138,4042-50)以及UT-7(Komatsu,N.等人(1991).Cancer Research 51,341-8)。
应当理解，根据本发明，GM-CSF的中和可在带有GM-CSF受体的细胞外或者在所述细胞内进行。因此，化合物对GM-CSF的中和，可以是抑制或预防GM-CSF与其特异性受体的结合，或者抑制由细胞因子与其受体的结合所诱导的细胞内信号。中和GM-CSF的化合物可以例如与GM-CSF直接结合或与GM-CSF受体结合，由此在两种情况下干扰GM-CSF的生物学效应。
如上文所定义，GM-CSF的抑制剂可选自多肽、拟肽、核酸分子和小分子。
本文使用的术语“多肽”描述了一组分子，其通常由至少30个经共价肽键相互耦合的氨基酸组成。根据本发明，该组多肽包含由单一多肽或多于一个多肽所组成的“蛋白质”。术语“多肽”还描述蛋白质片段，只要这些片段是由至少30个氨基酸组成的。本领域众所周知，多肽可形成多聚体诸如二聚体、三聚体和更高的低聚体，即由多于一个多肽分子组成的。这样的多聚体也包括在术语“多肽”的定义中。形成这样的二聚体、三聚体等的多肽分子可以相同或不同。这样的多聚体的相应更高级结构因此被称为同二聚体或异二聚体、同三聚体或异三聚体等。异多聚体的实例为抗体分子，其以天然存在的形式是由两个相同的轻多肽链和两个相同的重多肽链组成。术语“多肽”和“蛋白质”也指天然或非天然修饰的多肽/蛋白质，其中所述修饰的实现是例如通过翻译后修饰如糖基化、乙酰化、磷酸化、二硫键形成诸如此类或通过化学修饰如聚乙二醇化。这样的修饰是本领域熟知的。
术语“核酸”或“多核苷酸”在本发明上下文中限定了由磷酸、糖、嘌呤和嘧啶碱基的多个重复单元组成的聚合大分子。这些分子的实施方案包括DNA、RNA和PNA。核酸可以是单链或双链、线性或环状的。本发明上下文中，核酸的特别优选实施方案为适体。核酸适体是从基于其结合其它分子能力的随机池中选择的DNA或RNA分子。已经选择了结合核酸、蛋白质、小的有机化合物和甚至整个生物体的适体。它们通常由短链寡核苷酸组成，通常为50个碱基或更少。
术语“小分子”限定了一组具有分子量小于1000道尔顿、优选高达800道尔顿、更优选300-700道尔顿的有机药物化合物。小分子的分子量上限允许快速扩散穿过细胞膜的可能性，使得它们可以到达细胞内作用位点。相应的小分子可以源自至少是部分随机化的肽文库。根据本发明所述的合适的小分子文库是本领域所熟知的，和/或可以从商业分销商处购买。
术语“拟肽”描述了设计用于模拟肽的小蛋白样链。这种类型的分子是通过修饰现有的肽以改变分子的性质从而人工衍生的。例如，对亲本存在的肽进行修饰以改变分子的稳定性或生物活性。这些修饰包括主链的改变和非天然氨基酸的掺入。
术语“GM-CSF受体”是指GM-CSF的生理学细胞表面受体，其在本领域被描述为α链(CD116)和共同β(β-c)亚基的异聚体。
中和多肽的一个优选实施方案是抗体或其功能片段，更优选人抗体或其功能片段。用于抗体生产的技术是本领域熟知，并在例如Harlow和Lane的“Antibodies,ALaboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988，Harlow和Lane“Using Antibodies:A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999中有所描述。
术语“抗体”的定义包括诸如单克隆的、嵌合的、单链的、人源化的和人抗体的实施方案。除了全长抗体之外，该定义还包括抗体衍生物和抗体抗体片段，例如尤其是Fab片段。抗体片段或衍生物进一步包括F(ab')2、Fv、scFv片段或单结构域抗体，例如结构域抗体、纳米抗体、单可变结构域抗体或免疫球蛋白单可变结构域，所述单结构域抗体包含仅一个可能是VHH、VH或VL的可变结构域，其不依赖于其它V区或结构域地与抗原或表位特异性结合；参见，例如如上文所述的Harlow和Lane(1988)和(1999)；Kontermann和Dübel，AntibodyEngineering，Springer，第二版，2010和Little，Recombinant Antibodies forImmunotherapy,Cambridge University Press 2009。该术语也包括双抗体(diabody)或双亲和性重新靶向(Dual-Affinity Re-Targeting,DART)抗体。进一步设想，(双特异性)单链双特意抗体、串联双抗体(Tandab)，“微抗体”的例证为如下结构：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2或(scFv-CH3-scFv)2、“Fc DART”和“IgG DART”，多抗体诸如三链抗体。免疫球蛋白单可变结构域不仅包括分离抗体单可变结构域多肽，还包括较大多肽，该大多肽包含抗体单可变结构域多肽序列的一个或多个单体。
此外，本文所使用的术语“抗体”还涉及本文所述抗体的衍生物或变体，其显示出与所述抗体相同的特异性。“抗体变体”的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟的”抗体(参见例如Hawkins等人J.Mol.Biol.254，889-896(1992)和Lowman等人，Biochemistry 30，10832-10837(1991))和具有改变的效应子功能的抗体突变体(参见例如美国专利5,648,260、如上文所述的Kontermann和Dübel(2010)以及如上文所述的Little(2009))。
术语“抗体”还包括不同类的免疫球蛋白(Ig’s)(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和不同亚类的的免疫球蛋白(Ig’s)(诸如IgG1、IgG2等)。抗体衍生物也属于本发明含义中的术语抗体的定义，包括例如糖基化、乙酰化、磷酸化、二硫键形成、法尼基化、羟基化、甲基化或酯化的分子的修饰。
抗体的功能片段包括F(ab’)2片段、Fab片段、scFv或含有单个免疫球蛋白可变域或单域抗体多肽构建体的结构域，例如单重链可变域或单轻链可变域结构域以及如上文所述的其它抗体片段。F(ab')2或Fab可被工程化以最小化或完全去除CH1和CL结构域之间发生的分子间二硫键相互作用。
本文所使用的术语“人”抗体被理解为意指抗体或其功能片段包含人种系全套抗体库所含的氨基酸序列。出于本文定义的目的，如果抗体或其片段由这样的人种系氨基酸序列组成，即如果所讨论的抗体或其功能片段的氨基酸序列与所表达的人种系氨基酸序列相同，那么该抗体或其功能片段可以由此被视为是人的。如果抗体或其功能片段是由与其最近的人种系序列偏离不超过由于体细胞超变印记而预期的序列所组成，那么该抗体或其功能片段也可被认为是人的。此外，很多非人哺乳类的抗体(例如啮齿类如小鼠和大鼠)包含VH CDR3氨基酸序列，其也可预期存在于所表达的人全套抗体库中。出于本发明的目的，可预期存在于所表达的人源库中的任何这样的人或非人源序列也可被认为是“人”的。因此术语“人抗体”包括具有基本上与本领域公知的人种系免疫球蛋白序列相对应的可变区和恒定区的抗体，其包括例如那些如Kabat等人(参见如上文所述的Kabat等人(1991))所描述的抗体。本发明的人抗体例如在CDR中特别是CDR3中可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)。所述人抗体可具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个位点被替换成不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基。
所述非人和人抗体或其功能片段优选是单克隆的。制备单克隆的人抗体特别困难。与鼠B细胞和无限增殖化细胞的融合相反，人B细胞和无限增殖化细胞的融合是不可行的。因此，人单克隆抗体是克服了通常公认为存在于抗体技术领域的重大技术障碍的结果。抗体的单克隆性质使得它们非常适合用作治疗剂，因为这样的抗体将会以可以被充分表征并且可重复地制备和纯化的单一同质分子种类存在。这些因素导致产品的生物活性可以以高精度水平预测，如果这样的分子获得用于人的治疗性施用的监管批准，那么这将是非常重要的。本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本同质的抗体群中获得的抗体，即构成该群的单个抗体是完全相同的，除了可少量存在的可能自然发生的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)。单克隆抗体是针对单个抗原位点的高度特异性抗体。此外，与包括通常针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们是通过杂交瘤培养物合成的，不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆的”表明抗体的特征在于其是从基本同质的抗体群中获得的，其不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明所使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)制备。所述“单克隆抗体”也可通过使用在例如Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中所描述的技术从噬菌体抗体库中分离出来。
特别优选地，单克隆抗体或相应的功能片段是人抗体或相应的功能片段。在考虑旨在用于治疗性施用于对人的抗体试剂时，非常有利的是，所述抗体是人源的。在向人患者施用后，人抗体或其抗体片段将很有可能不会引起患者免疫系统的强烈的免疫源应答，即其将不被认为是非人蛋白质的外来物。这意味着不会产生针对治疗性抗体的宿主即患者抗体，否则这将阻断治疗性抗体的活性和/或加速治疗性抗体从患者体内的消除，从而阻止其发挥所期望的治疗效果。
根据本发明的一个优选实施方案，用于药物用途的人单克隆抗体或其功能片段表现出对人和至少一个猴物种之间的反应性。对于所有其它非抗体或非抗体衍生的GM-CSF中和/抑制化合物，相同的种间反应性也是优选的。
根据本发明的另一个实施方案，抗体可以是IgG抗体。IgG同种型不仅包含负责高度辨别性抗原识别和结合的重链和轻链的可变抗体区，还包含重抗体多肽链和轻抗体多肽链的恒定区，其通常存在于“自然”产生的抗体中，甚至在某些情况下在一个或多个位点经糖修饰。这种糖基化通常是IgG形式的标志且位于恒定区，该恒定区包含所谓已知在体内引起各种效应子功能的完整抗体的Fc区。此外，Fc区介导IgG与Fc受体的结合，以及促进IgG归巢到Fc受体存在增多的位置—例如，发炎的组织。有利的是，所述IgG抗体是IgG1抗体或IgG4抗体，这是优选的形式，因为其体内作用机制是特别好理解并表征的。对于IgG1抗体尤其如此。
根据本发明的另一个实施方案，抗体的功能片段可优选为scFV、单域抗体、Fv、VHH抗体、双抗体、串联双抗体、Fab、Fab'或F(ab)2。这些形式通常可以分为两个亚类，即那些由单个多肽链组成的，以及那些包含至少两个多肽链的。前一亚类的成员包括scFv(包含一个VH区和一个VL区通过多肽接头连接成单个多肽链)、单域抗体(包含单个抗体可变区)诸如VHH抗体(包含单个VH区)。后一亚类的成员包括Fv(包含作为单独多肽链的一个VH区和一个VL区，其彼此非共价相连)、双抗体(包含两个非共价相连的多肽链，其中每个多肽链包含两个抗体可变区—通常是每个多肽链包含一个VH和一个VL—这两个多肽链以头-尾构象排列，结果得到二价抗体分子)、串联双抗体(双特异性单链Fv抗体，其包含共价连接的四个具有两种不同特异性的免疫球蛋白可变区—VH区和VL区，这形成为上述双抗体的两倍大的同源二聚体)、Fab(包含其本身含有VL区和整个轻链恒定区的完整抗体轻链作为一个多肽链，以及含有完整VH区和部分重链恒定区的抗体重链的一部分作为另一个多肽，所述两条多肽链通过链间二硫键而分子间连接)、Fab'(如上所述的Fab，除了包含在抗体重链上的额外的还原二硫键)和F(ab)2(包含两个Fab'分子，每个Fab'分子通过链间二硫键与相应的另一个Fab'分子连接)。一般而言，本文以上所描述类型的功能抗体片段允许在调整例如即将发生的特别紧急情况下治疗性施用中所需的抗体的药代动力学性质方面具有很大的灵活性。例如，可能希望减小所施用的抗体尺寸，以便在治疗已知是血管化较差的组织(例如关节)时增加组织穿透的程度。在某些情况下，还可能需要增加从体内消除治疗性抗体的速率，所述速率通常可通过减小所施用抗体的尺寸来加速。在本发明的上下文中，抗体片段被限定为功能性抗体片段，只要该片段保持对亲本抗体的表位/靶标的特异性结合特征，即只要其特异性结合GM-CSF或GM-CSF受体。
根据本发明的另一个实施方案，所述抗体或其功能片段可以以下形式存在：单价单特异性；多价单特异性，特别是二价单特异性；或多价多特异性的，特别是二价双特异性。一般而言，多价单特异性的，特别是二价单特异性的抗体，诸如上文所述的完整人IgG，可给其带来治疗优势，即由这种抗体实现的中和作用通过亲合效应加强，即通过相同抗体结合多个相同抗原分子，在此是GM-CSF或GM-CSF受体。上文已描述了抗体片段的几种单价单特异性形式(例如scFv、Fv、VHH或单域抗体)。抗体的多价多特异性形式，特别是二价双特异性形式可包括完整的IgG，其中一个结合臂与灵长类动物的GM-CSF/GM-CSF受体结合，而另一个结合臂与另一种不同于GM-CSF/GM-CSF受体的抗原结合。另一种多价多特异性形式，特别是二价双特异性形式可以有利地是人单链双特异性抗体，即包含两个如上所述的scFv实体的重组人抗体构建体，其通过本领域公知的短插入多肽间隔区而连接成一个连续多肽链(参见例如针对抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体的WO 99/54440)。在此，包含于双特异性单链抗体内的双特异性单链抗体的一个scFv部分将如上所述地与GM-CSF/GM-CSF受体特异性结合，而该双特异性单链抗体的相应其它scFv部分将与被确定为具有治疗益处的另一抗原结合。
根据另一个的实施方案，抗体或其功能片段可以例如用有机聚合物衍生化，例如用一个或多个聚乙二醇(“PEG”)和/或聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)分子。如本领域已知的，这种衍生化可有利于调节抗体或其功能片段的药效学特性。特别优选的是PEG分子衍生化为PEG-马来酰亚胺，这使得能够通过半胱氨酸的巯基基团以位点特异性方式与抗体或其功能片段缀合。其中，特别优选的是支链或者直链形式的20kD和/或40kD的PEG-马来酰亚胺。通过使后者与一个或多个PEG分子特别是PEG-马来酰亚胺偶联来增加较小的人抗GM-CSF抗体片段(诸如scFV片段)的有效分子量，可能是特别有利的。
本发明的抗体还包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白类)，其中一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种的或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，上述链的其余部分与下列抗体中的相应序列相同或同源：衍生自另一物种的抗体，或者属于另一抗体类或亚类的抗体，以及此类抗体的片段，只要它们显示出所期望的生物活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长源化的”抗体，其包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是主要是人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受者高变区(也是CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(诸如小鼠、大鼠或兔)高变区(供体抗体)的残基替换。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，本文所使用的“人源化抗体”还可以包含受体抗体和供体抗体中均未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。最佳地，所述人源化抗体还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。
如本文所用，人和非人灵长类GM-CSF的氨基酸残基或位点的编号是指成熟GM-CSF的编号，即没有其17个氨基酸信号序列的GM-CSF的编号(上述人和非人灵长类物种中成熟GM-CSF的总长度是127个氨基酸)。人GM-CSF和长臂猿GM-CSF的序列如下：
SEQ ID NO：49
APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV EVISEMFDLQ
EPTCLQTRLELYKQGLRGSL TKLKGPLTMMASHYKQHCPP TPETSCATQI
ITFESFKENL KDFLLVIPFDCWEPVQE
猕猴科的某些成员例如恒河猴和食蟹猴中GM-CSF的序列如下：
SEQ ID NO：50
APARSPSPGT QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNKTV EVVSEMFDLQ
EPSCLQTRLE LYKQGLQGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI
ITFQSFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE
人GM-CSF的序列也在SEQ ID NO：57中示出。长臂猿GM-CSF的序列也在SEQ ID NO：58中示出：
(SEQ ID NO：57和58)
猕猴科的某些成员例如恒河猴(SEQ ID NO：59)和食蟹猴(SEQ ID NO：60)中GM-CSF的序列也如下：
(SEQ ID NO：59和60)
与抗体结合的最小表位，有利地是如本文所述的不连续表位，优选人单克隆抗体(或其功能片段)在上述GM-CSF序列以粗体示出。
根据一个优选的实施方案，所述中和GM-CSF的化合物是与GM-CSF结合的抗体(优选人单克隆抗体)或其功能片段。更优选地，它与优选包含第23-27位氨基酸(RRLLN)和/或第65-77位氨基酸(GLR/QGSLTKLKGPL)的GM-CSF的表位结合。这些氨基酸序列延伸在上述GM-CSF序列中以粗体显示。术语“表位”是指抗原或靶标(例如GM-CSF)上与化合物例如抗体或其功能片段特异性结合的位点。所述结合/相互作用也被理解为定义了“特异性识别”。“表位”可以由连续的氨基酸形成，或由蛋白质三级折叠并置的不连续氨基酸形成。“线性表位”是其中氨基酸一级序列包含所识别表位的表位。线性表位在独特的序列中通常包括至少3个或至少4个、更通常为至少5个或至少6个和或至少7个氨基酸，例如约8个至约10个或更多个氨基酸。在本发明的上下文中，优选GM-CSF表位是不连续表位。在抗体与第23-27位和第65-77位两个序列延伸结合的情况下，所述表位可被称为“不连续的”。在人GM-CSF的二级结构中，第15-35位氨基酸位于螺旋A中，而于第65-77位相对应的残基是位于螺旋C和D之间的环状结构的一部分。分子折叠的三维模型显示这些位点相对于彼此紧密空间接近(也参见WO 2006/111353)。如本文所用的术语“不连续表位”应理解为给定多肽链内的至少两个非相邻氨基酸序列延伸，这里是指成熟的人和非人灵长类GM-CSF，其同时与抗体特异性结合。根据该定义，这种同时特异性结合可能是线性形式的GM-CSF多肽。在这里，可以想象成熟的GM-CSF多肽形成延伸的环，在其一个区域中，上述粗体显示的两个序列例如或多或少地平行且彼此接近地排列在一起。在这种状态下，它们特异性地并同时与抗体片段结合。根据该定义，如上所示成熟GM-CSF的两个序列延伸的同时特异性结合也可采取抗体与构象表位结合的形式。在这里，成熟的GM-CSF已经形成了其通常存在于体内的三级构象。在这种三级构象中，成熟GM-CSF的多肽链以这样的方式折叠，即，使得如上所示的两个序列延在空间上接近，例如在成熟的折叠GM-CSF的特定区域的外表面上，其中它们然后凭借其在周围多肽序列环境中的三维构象而被识别。
在一个进一步优选的实施方案中，GM-CSF的上述表位或上述不连续表位进一步包括：
●第28-31位氨基酸(LSRD)，如上述人和非人灵长类GM-CSF的序列中斜体所示；
●第32-33位氨基酸(TA)，如上述人和非人灵长类GM-CSF的序列中下划线所示；和/或
●第21-22位氨基酸(EA)，如上述人和非人灵长类GM-CSF的序列中下划线所示。
优选的人单克隆抗GM-CSF抗体或其功能片段是如WO2006/111353中所具体公开的那些，引用了SEQ ID NO:1至48和52至56，其示出了重链和轻链互补决定区(complementarydetermining regions,CDRs)1-3、以及重链和轻链的可变区和全长重链和轻链的氨基酸序列。
特别优选的是包含以下项的抗GM-CSF抗体或其功能片段：如包含SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:4所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:5所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ IDNO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQID NO:6所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:7所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:8所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:9所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ IDNO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:10所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:11所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:12所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:13所示的重链可变区CDR3序列；或包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列，如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ IDNO:56所示的重链可变区CDR3序列。
更加优选地，重链CDR1、CDR2和CDR3序列的上述14种组合中的任一种存在于其轻链可变区中进一步下列项的抗体或其功能片段中：包含如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR1、包含如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR2和包含如SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的CDR3。
特别优选的抗GM-CSF抗体或其功能片段包含如SEQ ID NO:14所示的重链可变区CDR1序列、如SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR3序列，并且在其轻链可变区中还进一步包含包含如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR1、包含如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR2和包含如SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的CDR3。该抗GM-CSF抗体是用于中和GM-CSF的最优选化合物，而且也在WO 2006/111353有所描述。
根据另一个实施方案，抗GM-CSF抗体或其片段在其轻链可变区包含如SEQ IDNO.19所示的氨基酸序列。优选的是抗体或其片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ IDNO:21所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQID NO.19所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
根据另一个实施方案，所述抗GM-CSF抗体或其功能片段在其轻链可变区包含如SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列。优选的是抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQID NO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ IDNO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ IDNO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ IDNO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ IDNO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ IDNO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ IDNO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ IDNO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
根据另一个实施方案，抗GM-CSF抗体或其功能片段在其轻链可变区包含如SEQ IDNO.55所示的氨基酸序列。优选的是抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQID NO:21所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；或抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列，且重链可变区包含如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
优选的抗GM-CSF抗体或其功能片段在其轻链可变区含有包含如SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的CDR1、包含如SEQ ID NO.17所示氨基酸序列的CDR2和包含如SEQ ID NO.18所示氨基酸序列的CDR3，并且在其重链可变区含有包含如SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列的CDR1、包含如SEQ ID NO.15所示氨基酸序列的CDR2和包含如SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或56中任一所示的氨基酸序列的CDR3。
在进一步优选的实施方案中，所述抗体在其轻链包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ IDNO:38所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ IDNO:43所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；或在其轻链包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且在其重链包含如SEQ IDNO:48所示的氨基酸序列。在其轻链包含如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列、并且在其重链包含如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的抗GM-CSF抗体是用于中和GM-CSF的最优选化合物，其在WO 2006/111353中也有所描述。
上述优选的实施方案提供了抗体分子和/或其功能片段，优选人单克隆抗体分子和/或其功能片段，其作为灵长类和人GM-CSF的活性的中和剂是特别有利的。根据这些特别优选的实施方案的抗体或其功能片段出于几个原因是非常有利的。
首先，它们以高特异性识别灵长类和人GM-CSF。也就是说，从灵长类GM-CSF和其他灵长类集落刺激因子(例如灵长类动物G-CSF和M-CSF)的混合物中，根据这些特别优选的实施方案所述的结合分子对于灵长类GM-CSF是高度识别的，而在相同环境中其它集落刺激因子不被识别。这同样适用于人GM-CSF。这意味着根据这些实施方案所述的抗体或其功能片段，当施用于人时，将预期其仅特异性结合并中和所期望的靶标，而其它不期望的靶标既不被结合也不被中和。最终，这导致关于体内治疗作用方式具有高度可预测性。
其次，根据这些特别优选的实施方案所述的结合物以可观的亲和力与灵长类和人GM-CSF结合。“可观的亲和力”包括以约10-6M(KD)或更强的亲和力的结合。优选地，当结合亲和力为约10-12至10-8M、10-12至10-9M、10-12至10-10M、10-11至10-8M，优选约10-11至10-9M时，其被视为是可观的(或高的或特异性的)。因此，本发明的结合物优选具有在上述范围内的KD。鉴于已经观察到本发明所述的抗体分子的KD值为约4×10-9M至低至约0.04×10-9M的事实，后者对应于约40pM，本发明的抗体分子优选具有该范围内的KD。然而，本发明的抗体分子还优选具有如上文所述的KD。由于这样的分子在水性介质中的动力学结合速率主要是受扩散控制，因此不能高过生理条件下局部扩散条件所允许的，所以低KD的升高主要是动力学解离速率(即koff)的结果，对于最高亲和力的抗体结合物而言，其为约10-5s-1。这意味着，一旦形成一方面是根据这些实施方案中任一个所述的人单克隆抗体或其功能片段与另一方面是GM-CSF之间的复合物，其不容易或至少不快速分离。对于旨在作为生物活性中和剂的结合分子而言，这些特性是非常有利的，这是由于通常只有当待中和生物活性的分子(此处为灵长类和人GM-CSF)与中和结合分子保持结合时所期望的中和效应才能持续。因此，长时间保持与其预定靶标结合的中和分子将继续中和相应长的时间。
抗体或其功能片段对灵长类和人GM-CSF的高结合亲和力具有另外的优点。通常，抗体或其功能片段将以尺度依赖性方式从患者的血流中消除，较小分子在较大分子之前被排出和消除。由于所述两个多肽(抗体或抗体片段和所结合的GM-CSF)的复合物明显大于单独的抗体，因此上述低koff具有这样的效果，即治疗中和剂从患者体内排出和消除的速率比其不与GM-CSF结合的情况更慢。因此，不仅中和活性的大小增加了，而且其在体内的持续时间也增加了。
根据上述实施方案所述的结合物，其经确定的中和活性惊人地高。如下文更详细描述的，GM-CSF中和活性在体外用TF-1生长抑制试验进行测量(Kitamura，T.等人(1989).J.Cell Physiol.140，323-34)。作为中和潜能的指征，测量了IC50值，IC50表示根据这些实施方案中任一个所述的抗体或其功能片段引起TF-1细胞增殖所需的最大半数抑制的浓度。对于上文详述的人单克隆抗GM-CSF抗体或其功能片段，测定其IC50值为大约3×10-10M或约0.3nM。因此，所述结合分子是灵长类和人GM-CSF活性的高度有效的中和剂。
中和抗GM-CSF抗体的其它实例是如Li等人,(2006)PNAS 103(10):3557-3562中所描述的人E10抗体和人G9抗体。E10和G9是IgG类抗体。E10对GM-CSF具有870pM的结合亲和力，G9对GM-CSF具有14pM的亲和力。两种抗体对于结合人GM-CSF是特异性的，并且显示出了很强的中和活性，正如用TF-1细胞增殖试验所评估的。其它实例是如WO2006/122797中所公开的人抗GM-CSF抗体。
作为抗GM-CSF受体抗体的GM-CSF拮抗剂或中和剂也可以用于本发明。这样的GM-CSF拮抗剂包括对GM-CSF受体α链或β链的抗体。用于本发明的抗GM-CSF受体抗体可以是如上说明的任何抗体形式，例如完整的、嵌合的、单克隆的、多克隆的、抗体片段或衍生物、单链、人源化的、人造的，诸如此类。适用于本发明的抗GM-CSF受体抗体的实例，例如中和高亲和力抗体是本领域已知的(参见例如，美国专利5,747,032和Nicola等人，Blood 82:151724,1993)。
在申请中提供了合适抗体的另外的序列，其通过引用整体并入本文。WO2006/122797、WO2007/049472、WO2007/092939、WO2009/134805、WO2009/064399、WO2009/038760中提供了抗GM-CSF抗体。WO2007/110631中提供了针对GM-CSF受体的抗体。
总之，抗GM-CSF抗体或其功能片段显示出其对所期望抗原的高度识别力，其极其紧密并长时间地与该抗原结合，并在其保持结合的长时间内表现出高度有效的中和活性。同时，结合物-抗原复合物的长持久性使该结合物从体内消除减缓，由此延长了所期望的体内治疗效果的持续时间。如上所述，所述相同的特征优选也适用于识别GM-CSF受体的抗体。
根据本发明所述的组合物优选为药物组合物。根据本发明的实施方案，术语“药物组合物”涉及向患者施用的组合物，优选人患者。药物组合物或制剂通常是这样的允许活性成分的生物活性起作用的形式，因此可以出于如本文所述的治疗用途向受试者施用。通常药物组合物包含载体、稳定剂和/或赋形剂的合适(即药学上可接受的)制剂。在一个优选的实施方案中，药物组合物是用于肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中的组合物。特别设想的是，所述组合物通过输注或注射向患者施用。合适的组合物的施用可以通过不同的方式实现，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、外用或皮内施用。本发明的组合物可进一步包含药学上可接受的载体。合适的药物载体的实例是本领域众所周知的，其包括缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的湿润剂、无菌溶液、脂质体等。包含这种载体的组合物可以通过公知的常规方法配制。
根据本发明的实施方案，术语“有效量”是指用于有效治疗与GM-CSF相关的疾病(如炎性和自身免疫性疾病)的中和GM-CSF的化合物的量。
优选的剂量和优选的施用方法为使得施用后中和GM-CSF的化合物以有效剂量存在于血液中。施用方案可以通过观察疾病状况并在实验室试验中分析中和GM-CSF的化合物的血清水平来进行调整，随后或者是延长使用间隔如从每周两次或每周一次延长至每两周一次、每三周一次、每四周一次等，或者是相应地缩短施用间隔。
药物组合物可以以合适的剂量向受试者施用。该剂量方案将由主治医师和临床因素确定。如医学领域中众所周知的，对任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况以及同时施用的其它药物。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可注射的有机酯类如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如那些基于林格氏葡萄糖的)诸如此类。还可以存在防腐剂和其它添加剂，诸如抗菌剂、抗氧化剂、螯合试剂、惰性气体等。此外，根据本发明的药物组合物可包含蛋白质载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人源的。设想根据本发明的药物组合物除了上述化合物之外还可进一步包含另外的生物活性剂，这取决于该药物组合物的预期用途。这些试剂可以是作用于胃肠系统的药物、作为细胞抑制剂的药物、预防高尿酸血症的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节调节炎症反应的药物、作用于循环系统的药物和/或本领域已知的例如细胞因子的试剂。
为了分析GM-CSF中和化合物对例如类风湿性关节炎(RA)的作用，结果度量可选自例如药代动力学、免疫原性、经DAS28、ACR20/50/70和/或EULAR反应标准所测量的改善RA临床体征和症状的潜力、滑膜炎和骨水肿的MRI成像以及患者报告的结果。ACR是一种度量，其汇总了软弱和肿胀关节数量的改善、疼痛等级、患者和医生对改善的评估以及某些实验室检测指标。ACR 20描述了在临床体征和症状方面有20％改善的研究参与者的百分比，例如，软弱和肿胀关节数改善了20％以及其他三个疾病相关标准改善了20％。
在开发诸如根据本发明药物组合物的药物中的另一个主要挑战是药代动力学特性的可预测调节。为此，建立了候选药物的药代动力学谱，即影响特定药物治疗给定病状的能力的药代动力学参数谱。影响药物治疗某种疾病实体的能力的药物药代动力学参数包括但不限于：半衰期、分布体积、肝首过代谢和血清结合程度。给定的药物试剂的功效可以受到上述每一个参数的影响。“半衰期”意指50％的所施用药物通过生物过程例如新陈代谢、排泄等而被消除的时间。“肝首过代谢”意指药物首次与肝接触即在其首次通过肝脏期间被代谢的倾向。“分布体积”是指药物在整个身体各个区室(例如细胞内和细胞外空间、组织和器官等)中的保留程度以及药物在这些区室内的分布。“血清结合程度”意指药物与血清蛋白(例如白蛋白)相互作用并结合的倾向，这导致药物生物活性的降低或丧失。
药代动力学参数还包括给定量的所施用药物的生物利用度、滞后时间(Tlag)、Tmax、吸收速率和/或Cmax。“生物利用度”意指血液区室中的药物量。“滞后时间”意指药物施用和其在血液或血浆中的检测和可测量性之间的时间延迟。“Tmax”是达到药物的最大血液浓度之后的时间，“吸收”被定义为药物从施用位点移动到体循环中，“Cmax”是使用给定药物所获得的最大血液浓度。达到其生物学效应所需的药物血液或组织浓度(药物的)的时间受所有参数的影响。
本文所用的术语“毒性”是指在不良事件或严重不良事件中表现出的药物的毒性作用。这些负面事件可能是指在施用后药物一般缺乏耐受性和/或缺乏局部耐受性。毒性还可包括由药物引起的致畸或致癌作用。
本文所用的术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义了这样的药物施用，即并没有直接在施用后(局部耐受性)以及药物应用的较长时期内引起严重不良事件。“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”可在例如治疗和随访期间定期进行评价。测量包括临床评价，例如器官表现以及实验室异常情况筛查。可进行临床评价，其可能偏离于根据NCI-CTC和/或MedDRA标准所记录/编码的常规发现。器官临床表现可包括例如过敏/免疫、血液/骨髓、心律失常、凝血等的标准，如在不良事件通用术语标准(Common Terminology Criteriafor adverse events,CTCAE)v3.0中所述。可检测的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝血分布和尿液分析以及其它体液如血清、血浆、淋巴液或脊髓液、液体等的检查。因此可通过例如体格检查、成像技术(即超声、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI))、采用技术装置的其它测量(即心电图)、生命体征，通过测量实验室参数和记录不良事件来评估安全性。本文所用的术语“有效且无毒的剂量”是指中和GM-CSF的化合物(优选如本文所定义的抗体)的可耐受剂量，其足够高以治愈或稳定感兴趣的疾病而没有或基本上没有主要的毒性作用。这种有效且无毒的剂量可以通过例如本领域描述的剂量递增研究来确定，并且应当低于引起严重不良负面事件的剂量(剂量限制性毒性，DLT)。
本发明的制剂(本文中有时也称为“物质组合物”或“组合物”或“溶液”)可优选处于各种物理状态，诸如液体、冷冻、冻干、冷冻干燥、喷雾干燥和重构制剂，其中优选液体和冷冻制剂。
本文所使用的“液体制剂”是指为被发现为液体的物质组合物，其特征在于室温下所述构成分子自身之间的自由移动但没有分离倾向。液体制剂包括水性和非水性的液体，优选水性制剂。水性制剂是一种其溶剂或主要溶剂是水优选是注射用水(WFI)的制剂。中和GM-CSF的化合物在制剂中的溶解可以是均质的或异质的，如上所述优选是均质的。
可以使用任何合适的非水性液体，只要其为本发明的制剂提供稳定性即可。优选地，非水性液体是亲水性液体。合适的非水液体的示例性实例包括：甘油；二甲亚砜(DMSO)；聚二甲基硅氧烷(PMS)；乙二醇类，诸如乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(“PEG”)200、PEG 300和PEG 400；丙二醇，诸如二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇(“PPG”)425和PPG 725。
本文所用的“混合的水性/非水性液体制剂”是指含有水(优选WFI)和另外液体组合物的混合物的液体制剂。
当在本文中使用时，“制剂”或“组合物”是中和GM-CSF的化合物(即，活性药物/物质)与优选为液体状的药物产品所需的其它化学物质和/或添加剂的混合物。本发明的制剂包括药物制剂。
所述制剂的制备包括将不同的化学物质包括活性药物进行组合以产生最终药用产品例如药物组合物的过程。本发明制剂的活性药物是中和GM-CSF的化合物。
在某些实施方案中，待配制的中和GM-CSF的化合物基本上是纯的和/或基本上是均质的(即基本上不含污染物质如蛋白质等，该污染物质可以是产品相关的和/或过程相关的杂质)。术语“基本上是纯的”意指组合物包含至少约80％、优选约90％重量的化合物，优选至少约95％重量的化合物，更优选至少约97％重量的化合物，或最优选至少约98％重量的化合物，优选单体状态的化合物。术语“基本上均质的”意为组合物包含至少约99％重量的化合物，优选单体状态的化合物，其中排除溶液中各种稳定剂和水的质量。
当在本文中使用时，术语“约”应理解为意指可以在各自的值或范围(例如pH、浓度、百分比、摩尔浓度、氨基酸数、时间等)内存在变化，其可以比给定数值的高至5％、高至10％、高至15％或高至且包括20％。例如，如果制剂包含约5mg/ml的化合物，那么这被理解为意指制剂可具有在4mg/ml和6mg/ml之间的化合物，优选在4.25mg/ml和5.75mg/ml之间，更优选在4.5mg/ml和5.5mg之间/ml之间，甚至更优选在4.75mg/ml和5.25mg/ml之间，最优选为5mg/ml。如本文所使用的，定义为“(从)X到Y”的间隔等同于定义为“X和Y之间”的间隔。这两个间隔具体包括上限以及下限。这意味着例如“5mg/ml至10mg/ml”或“5mg/ml和10mg/ml之间”的间隔包括5、6、7、8、9和10mg/ml的浓度以及任意给定的中间值。
“稳定的”制剂是一种制剂，其中的中和GM-CSF的化合物在储存时基本保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性，和/或与对照样品相比未显先出聚集、沉淀、破碎、降解和/或变性的显著迹象，优选通过肉眼检查颜色和/或透明度，或者通过UV光散射或通过尺寸排阻色谱法测量。用于测量蛋白质稳定性的各种其他分析技术是本领域中可获得的，并且在Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中进行了综述。
本文所用的“储存期间”意指制备却不立即使用的制剂；而是在制备之后将包装储存，或是以冷冻状态的液体形式，或是以用于以后重构成液体形式或其它形式的干燥形式。
设想中和GM-CSF的化合物优选是稳定的，因为其在储存期间、和/或在冻/融期间或之后、和/或在剪切应力(例如来自振荡或来自过滤步骤)期间或之后基本不形成聚集体或亚可见/可见颗粒或片段/降解产物(例如，由于一种或多种上述原因)。因此，优选设想，相对于在储存开始时或在进行一个或多个冻/融循环之前或在进行振荡研究之前的所述中和GM-CSF化合物的量，不超过10％的中和GM-CSF的化合物，更优选不超过8％、甚至更优选不超过5％、特别优选不超过2％的中和GM-CSF的化合物形成聚集体、颗粒和/或片段。该稳定性优选适用于至少1个月的时间范围、至少2个月或至少3个月；优选至少4个月、至少5个月或至少6个月；更优选至少9个月或至少12个月；甚至更优选至少18个月或至少24个月；最优选至少30个月或至少36个月或至少48个月或至少54个月或至少60个月。优选的储存温度条件为高达室温(约20℃至约25℃)，更优选约2-8℃，最优选的时间范围为至少3年或甚至至少4年。在一些实施方案中，中和GM-CSF的化合物在温暖气候中的室温(例如约30℃)下是稳定的。冻/融循环期间所述化合物根据上述参数优选是稳定的，这样的冻/融循环的次数为至少一个循环，优选至少2、3或4个循环，更优选至少5、6或7个循环，最优选至少8、9或10个循环中。振荡(例如在运输中和GM-CSF的化合物期间的振荡)期间所述化合物根据上述参数(例如在+5℃±3℃的温度下，也参见实施例12d)优选是稳定的，这样的振荡的天数为至少1天，优选至少2、3或4天，更优选至少5、6或7天，甚至更优选至少8、9、10或11天，最优选至少12、13或14天。
在替代方案中，设想中和GM-CSF的化合物优选在其不形成二聚体、寡聚物或片段的情况下是稳定的。换句话说，中和GM-CSF的化合物的稳定性可根据溶液中单体蛋白质的百分比确定，其中降解的(例如，片段化的)、颗粒的(例如，具有可见和/或亚可见颗粒)和/或聚集的蛋白质的百分比低。例如，包含GM-CSF中和化合物例如抗体的本发明制剂可包含至少90％、更优选至少92％、甚至更优选至少95％、特别优选至少98％、最优选至少99％的中和GM-CSF的化合物的单体。
“聚集体”意指蛋白质分子之间的物理相互作用，其导致形成可能保持可溶性的共价或非共价二聚体或寡聚物(即高分子量实体，诸如三聚体或多聚体)。“聚集体”还包括降解的和/或片段化的蛋白质。聚集体例如可溶性聚集体的尺寸一般小于1μm。
“亚可见颗粒”意指蛋白质分子(包括降解的或片段化的蛋白质)的物理相互作用，其形成导致尺寸大于1μm并且尺寸高达大约100μm的可逆或不可逆蛋白颗粒。可溶性聚集体和/或蛋白质分子(包括降解的或片段化的蛋白质)可接合在一起形成亚可见颗粒。
“可见颗粒”在尺寸上通常大于100μm，并且可以是例如由较小亚可见颗粒、聚集体或蛋白质分子(包括降解的或片段化的蛋白质)形成的内在蛋白质可见颗粒，又或者是例如包含如来自储存容器或运输装置的外来物质的外来可见颗粒。一些源自组合产品(例如硅胶滴)的外来或内在颗粒是液体而不是颗粒，但在一些试验中可能被检测为颗粒。
如上文所述，许多不同的分析方法能够用于检测包含中和GM-CSF的化合物的制剂中聚集体的存在及其水平。这些包括但不限于，例如天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、毛细管凝胶电泳(CGE)、尺寸排阻色谱(SEC)、分析超速离心(AUC)、场流分级(FFF)、沉降速度、UV光谱、差示扫描量热法、比浊法、浊度法、尺寸排阻-高效液相色谱法(SE-HPLC)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、电喷雾离子化串联质谱(ESI-MS)和串联RP-HPLC/ESI-MS、流场流分离技术(flow field-flow fractionation technique)和静态和/或动态光散射。这些方法可以单独使用，也可以组合使用。优选地，检测包含中和GM-CSF的化合物的制剂中的聚集体和/或片段的存在和水平的分析方法是诸如SE-HPLC的尺寸排阻色谱法、分析超速离心法和不对称场流分级法。测定中和GM-CSF化合物生物活性的方法是例如对结合(固定的)GM-CSF(或GM-CSF受体)的程度的测量，其是所谓的表面等离子体共振(SPR)。
包含蛋白质的制剂的常见挑战是聚集体随时间、热量或剪切应力的不可逆积累。通常，当聚集体沉淀时，它们形成容易检测的大颗粒。然而，较小的非共价可溶性聚集体，其通常是沉淀形成大颗粒的前体，更难以检测和量化。因此，对蛋白制剂中蛋白质的聚集进行检测和量化的方法需要基于所评估的聚集体的种类。
在上述方法中，确定蛋白制剂中可溶性共价聚集体的存在和/或其量的建议方法是：SEC/光散射、SDS-PAGE、CGE、RP-HPLC/ESI-MS、FFF和AUC。确定蛋白制剂中可溶性非共价聚集体的存在和/或其量的建议方法是：SEC、PAGE、SDS-PAGE、CGE、FFF、AUC和动态光散射。确定蛋白制剂中不溶性非共价聚集体的存在和/或其量的建议方法是：UV光谱、比浊法、浊度法、显微镜法、AUC、不对称场流分级和动态光散射。
亚可见颗粒也可以由降解的蛋白质、聚集体或更小的亚可见颗粒形成。确定亚可见颗粒的存在和/或其量的建议方法是：光散射例如静态的(例如通过多角度激光散射)或动态的(例如通过光子相关光谱法)、纳米颗粒跟踪分析(NTA例如来自MalvernInstruments,Malvern,UK)、不透光度或其它液体粒子计数系统例如显微镜、动态影像(微流成像，例如Brightwell(Cell Biosciences,Ottawa,CA)或Fluid Imaging Technologies(Yarmouth，ME)的 Image颗粒分析仪等)、流式细胞术和电子阻抗(Coulter)计数。
此外，本发明的制剂优选提供改进长期储存，这样使得以液体形式或以冷冻形式、优选液体形式存在的中和GM-CSF的化合物在储存过程中是稳定的。本文所使用的短语“长期”储存应理解为意指制剂可储存至少一个月、两个月或三个月或更多、六个月或更多，优选一年和更多，或甚至2年、3年或4年或5年及更多。长期储存也被理解为意指药物组合物或在2-8℃或在环境温度下、优选在2-8℃下储存，由此该制剂优选不失去其生物活性至如本文所述的程度，和/或不形成聚集体如本文所述的程度，和/或包含单体至本文所述的程度。这些特性的检测在本文其他地方进行描述。
在本发明的一方面，制剂中的中和GM-CSF的化合物以液体形式稳定至少1个月、2个月、3个月；至少4个月、至少5个月；至少6个月；至少12个月；至少24个月；至少36个月；至少48个月、至少60个月。上述时间段之间的范围也意在是本发明的一部分，例如9个月，诸如此类。另外，也意在包括使用任一上述值的组合作为上限和/或下限的数值范围。优选地，制剂在室温(约20℃至25℃)下稳定至少1个月，和/或在约2-8℃下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或更优选在约2-8℃下稳定至少2年、至少3年、至少4年或甚至至少5年。
稳定性的另一个重要方面是根据本发明所述的组合物内的中和GM-CSF的化合物在储存期间和储存条件内(特别是温度和可能的温度变化)保持其生物活性或效力。活性或效力由例如化合物中和能力本身(其可在如上文所述基于细胞的试验中进行测量)反映，或由GM-CSF中和化合物与GM-CSF或GM-CSF受体结合的能力反映。结合亲和力可以通过SPR或本领域熟知的其它方法来评估，例如Biacore或Scatchard测定。
通过将本文所述的中和GM-CSF的化合物添加到例如水溶液、缓冲液、张力调节剂，以及表面活性剂、氨基酸、抗氧化剂和/或螯合剂中的一种或多种、其中优选表面活性剂中来制备本发明的制剂。本领域普通技术人员会理解将各种组分的组合包括到制剂中可以以任何适当的顺序进行。例如，缓冲液可最先、在中间或最后加入，张力调节剂可最先、在中间或最后加入，表面活性剂、氨基酸、抗氧化剂和/或螯合剂中的一种或多种可最先、在中间或最后加入。本领域普通技术人员还应当理解，这些化学物质中的某一些可能在某些组合中是不相容的，于是容易用具有相似特性但在相关混合物中相容的不同化学物质所替代。
在本发明的一个优选方面，所述制剂包含缓冲液。本文所用的术语“缓冲液”或“缓冲剂”，包括那些将pH保持在所需范围内的试剂。缓冲液是由弱酸及其共轭碱、或弱碱及其共轭酸的混合物组成的水溶液。它具有这种特性，即当加入少量强酸或强碱时溶液的pH变化非常小。在各种化学应用中，缓冲溶液被用作将pH保持接近恒定值的手段。一般而言，当在本发明的制剂中应用时缓冲液优选稳定中和GM-CSF的化合物。
当在本文中使用时，“氨基酸缓冲剂”包括例如氨基酸碱基，例如组氨酸及其共轭盐。氨基酸缓冲剂的一个实例是组氨酸/组氨酸氯化物。此实例优选应用于本发明。
本文所述制剂的优选pH可选自以下范围：约4至约10，优选约4至约6或约5至约7，更优选约5.5至约6.5。最优选地，pH约为5.8或正好5.8。因此，优选使用可将溶液保持在pH5-7的缓冲液。当在上下文的pH值/范围使用时，术语“约”优选意指具有所述值上下±20％范围的数值。当药物组合物的pH设定为或接近生理水平时，施用时患者的舒适度最大。应当理解，可以根据需要调节pH以使特定制剂中的中和GM-CSF的化合物的稳定性和溶解度最大化，因此，在生理范围之外的、但优选患者可耐受的pH在本发明的范围内。
可在本文所述制剂中使用的缓冲剂的非限制性实例包括：组氨酸、琥珀酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、Tris(氨基丁三醇)、Bis-Tris、MOPS、ACES、TES、HEPES、EPPS、乙二胺、磷酸、马来酸/磷酸盐、2-吗啉乙磺酸(MES)、磷酸盐、乙酸盐和二乙醇胺。
优选的缓冲液为组氨酸、乙酸盐和柠檬酸盐缓冲液。更优选地，在本发明的制剂中应用组氨酸缓冲液，优选pH在5和7之间，更优选pH在5.5和6.5之间，甚至更优选pH为5.8。在本发明中应用的缓冲液是本领域所熟知的，并且通过已知方法制造且可从商业供应商处获得。在一些实施方案中，在没有氢氧化钠(0mM NaOH)的情况下制备缓冲液的pH。在一个实施方案中，缓冲液是氨基酸及其盐的混合物，例如组氨酸及组氨酸盐的混合物，其可按比例预先测量，这样在制备缓冲液期间不需要使用单独的酸或碱来调节pH。
在一些实施方案中，所述制剂进一步包含氢氧化钠(NaOH)。在特定的实施方案中，所述制剂包含1-200mM，或少于50mM、少于40mM、少于35mM、少于30mM、少于25mM、少于20mM，或少于15mM，例如10mM的NaOH或更低，例如5mM或1mM的氢氧化钠。
除了中和GM-CSF的化合物和缓冲液之外，根据本发明所述的制剂还可包含其它物质，包括但不限于稳定试剂(稳定剂)。
因此，在一个优选的方面，所述制剂包含也可用作张力调节剂的稳定剂。术语“稳定剂”是指改善或以其它方式增强制剂稳定性、特别是中和GM-CSF的化合物的稳定性的试剂。作为张力调节剂的稳定剂可以是非还原糖、糖醇或其组合。本发明所述液体组合物中的张力调节剂确保溶液的张力(即渗透压)与正常生理流体基本相同，从而防止组合物施用后由于组合物与生理流体之间的离子浓度差异而引起的肿胀或快速吸收。通常，本文所述制剂的性质是这样的，即所述制剂的渗透压为约240至约500mOsmol/kg，更优选为约300至约450mOsmol/kg，甚至更优选为约350至约450mOsmol/kg，最优选为约400mOsmol/kg。
优选地，稳定剂/张力调节剂可以是一种或多种非还原糖，诸如蔗糖或海藻糖；或一种或多种糖醇，诸如甘露醇或山梨醇，此外，还优选非还原糖和糖醇的组合。在某些实施方案中，组合物中的稳定剂/张力调节剂的浓度选自以下范围：1-15％(w/v)、2-10％(w/v)、3-8％(w/v)、4-6.5％(w/w)、4.5-6％(w/v)。在特定的实施方案中，浓度为约5-6％(w/v)。在本发明制剂中应用的优选稳定剂/张力调节剂为山梨醇，优选其浓度5％(w/v)。
在优选的实施方案中，本文所述制剂包含一种或多种额外的辅料。优选地，所述辅料选自表面活性剂、氨基酸、抗氧化剂、螯合剂及其组合
可在本发明所述制剂中添加辅料，也称为化学添加剂、共溶质或共溶剂，其优选使溶液(还以干燥或冷冻形式)中的中和GM-CSF的化合物稳定。优选地，辅料有助于稳定中和GM-CSF的化合物，但是应当理解，辅料可以另外有助于所述制剂的物理、化学和生物学特性。辅料是本领域所熟知的，并且其通过已知方法制备并可从商业供应商处获得。
优选的辅料是表面活性剂。术语“表面活性剂”一般包括那些屏蔽中和GM-CSF的化合物免受空气/溶液界面诱导应力和溶液/表面诱导应力的试剂。这些界面应力可诱使蛋白质聚集和颗粒形成，导致不可接受的产品质量。界面应力的实例可以是蛋白质与以下项的接触：i)空气；ii)容器封闭材料，如橡胶柱塞、活塞、玻璃、载药注射器；iii)生产相关材料，如钢罐、管和泵；iv)冰，在冻/融期间等。向制剂中添加表面活性剂将减少蛋白质与疏水界面的相互作用，包括液体/空气界面和冰/液体界面，以及蛋白质-蛋白质的相互作用。表面活性剂将减少在诸如冷冻、混合、过滤和泵送的操作期间所产生的亚可见和可见颗粒的量。
表面活性剂的实例包括但不限于：非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80(PS80)或聚山梨醇酯20(PS20)(聚山梨醇酯通常也已知为商品名吐温ICI Americas)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton、十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠(sodium laurel sulfate)；钠辛基糖苷(sodium octyl glycoside)；月桂基-磺基甜菜碱(sulfobetaine)、肉豆蔻基-磺基甜菜碱、亚油基(linoleyl)-磺基甜菜碱、硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸；亚油基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、十六烷基-甜菜碱、月桂酰胺丙基-甜菜碱、椰油酰胺丙基-甜菜碱、亚油酰氨丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基-甜菜碱、棕榈酰胺丙基(palmidopropyl)-甜菜碱、异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰氨丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油烯基牛磺酸二钠(disodium methyl ofeyl-taurate)；Monaquat系列(Mona Industries，Inc.，Paterson，NJ)、聚乙二醇、聚丙二醇和乙烯与丙二醇的共聚物(例如，普朗尼克(pluronics)，PF68)。优选地，本文所述制剂中所用的表面活性剂选自以聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆及其组合中的一种或多种。
所添加的表面活性剂的量使得蛋白质的聚集保持在可接受的水平(正如使用例如SEC-HPLC所测定的)，同时还减少了在储存、制造、冷冻/解冻、运输等期间形成的亚可见或可见颗粒的量(正如通过光遮蔽、显微镜和基于动态成像的粒子计数系统如微流成像或FlowCAM所测量的)。
在一些实施方案中，基于临界聚集浓度(CAC)来确定制剂中表面活性剂的量。CAC是表面活性剂开始与蛋白质相互作用的浓度。表面张力测量值，例如来自张力计的测量值，可绘制在图上以获得与图7类似的曲线。在第一不连续点处的表面活性剂浓度是CAC。在一些实施方案中，制剂中表面活性剂的量是高于CAC的量。在一些实施方案中，表面活性剂的量高于CAC但小于临界胶束浓度(CMC)。
在优选的实施方案中，对于高达200mg/mL的蛋白质浓度而言，本发明所述制剂包含浓度为约0.001％(w/v)至约1％(w/v)的、选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆及其组合的一种或多种表面活性剂。
在一个更优选的实施方案中，聚山梨醇酯20与蛋白质的比例为约0.01:1至约3:1，优选约0.05:1至约2:1，更优选约0.1:1和约1.5:1之间，甚至更优选约0.1:1至约0.8:1，最优选约0.1:1至约0.2:1。对于80mg/mL的蛋白质浓度，聚山梨醇酯20的浓度为约0.001％(w/v)和约0.2％(w/v)之间，优选约0.005％和约0.15％(w/v)之间，更优选约0.007％(w/v)和约0.1％(w/v)之间，甚至更优选约0.007％(w/v)和约0.06％(w/v)之间，最优选约0.01％(w/v)。对于150mg/mL的蛋白质浓度，聚山梨醇酯20的浓度为约0.001％(w/v)和约0.4％(w/v)之间，优选约0.006％和约0.25％(w/v)之间，更优选约0.01％(w/v)和约0.18％(w/v)之间，甚至更优选约0.01％(w/v)和约0.1％(w/v)之间，最优选约0.02％(w/v)。
在另一个实施方案中，聚山梨醇酯20与蛋白质的比例为约0.3:1至约3:1，优选约0.5:1至约2.0:1，更优选约0.5:1和约1.5:1之间，甚至更优选在约0.8:1至约1.2:1之间，最优选约1:1。对于80mg/mL的蛋白质浓度，聚山梨醇酯20的浓度为约0.02％(w/v)和约0.2％(w/v)之间，优选约0.03％(w/v)和约0.13％(w/v)之间，更优选约0.05％(w/v)和约0.08％(w/v)之间，最优选约0.07％(w/v)。对于150mg/mL的蛋白质浓度，聚山梨醇酯20的浓度为约0.04％(w/v)和约0.4％(w/v)之间，优选约0.06％(w/v)和约0.25％(w/v)之间，更优选约0.1％(w/v)和约0.15％(w/v)之间，最优选约0.13％(w/v)。
在另一个更优选的实施方案中，聚山梨醇酯80与蛋白质的比例为约0.01:1至约3:1，优选约0.05:1至约2:1，更优选约0.1:1和约1.5:1之间，甚至更优选在约0.1:1至约0.6:1之间，最优选约0.3:1至约0.6:1。对于80mg/mL的蛋白质浓度，聚山梨醇酯80的浓度在约0.001％(w/v)和约0.2％(w/v)之间，优选在约0.004％(w/v)和约0.14％(w/v)之间，更优选约0.007％(w/v)和约0.1％(w/v)之间，甚至更优选约0.007％(w/v)至约0.05％(w/v)之间，最优选约0.04％(w/v)。对于150mg/mL的蛋白质浓度，聚山梨醇酯80的浓度为约0.001％(w/v)和约0.4％(w/v)之间，优选约0.007％(w/v)和约0.26％(w/v)之间，更优选约0.01％(w/v)和约0.2％(w/v)之间，甚至更优选约0.01％(w/v)和约0.08％(w/v)之间，最优选约0.04％(w/v)。
在另一个实施方案中，聚山梨醇酯80与蛋白质的比例为约0.3:1至约3:1，优选约0.5:1至约2.0:1，更优选约0.5:1和约1.5:1之间，甚至更优选在约0.8:1至约1.2:1之间，最优选约1:1。对于80mg/mL的蛋白质浓度，聚山梨醇酯80的浓度为约0.02％(w/v)和约0.2％(w/v)之间，优选约0.04％(w/v)和约0.14％(w/v)之间，更优选约0.06％(w/v)和约0.09％(w/v)之间，最优选约0.07％(w/v)。对于150mg/mL的蛋白质浓度，聚山梨醇酯80的浓度为约0.04％(w/v)和约0.4％(w/v)之间，优选约0.06％(w/v)和约0.27％(w/v)之间，更优选约0.1％(w/v)和约0.16％(w/v)之间，最优选约0.13％(w/v)。
其它优选的辅料可以是抗氧化剂或螯合剂。如本文所用，“抗氧化剂”是一种能够减缓或防止其它分子氧化的分子。氧化是将电子从物质转移到氧化剂的化学反应。抗氧化剂或螯合剂可用于减少由添加表面活性剂引入的氧化效应，该表面活性剂诸如聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，其可在溶液中形成过氧化物。可在制剂中添加抗氧化剂和/或螯合剂诸如抗坏血酸(维生素C)、硫辛酸、褪黑激素、尿酸、胡萝卜素、视黄醇、生育酚和生育三烯酚(例如α-生育酚(维生素E))、泛醌(辅酶Q)甲硫氨酸、半胱氨酸、柠檬酸、EDTA或DTPA。更优选地，以约3:1至约156:1的抗氧化剂:表面活性剂的摩尔比或以约1:1至约150:1的抗氧化剂:蛋白质的摩尔比添加甲硫氨酸、半胱氨酸或柠檬酸。更优选地，抗氧化剂:蛋白质的比例为约2:1至约100:1，甚至更优选约3:1至约20:1，最优选约3:1至约8:1。
另一种可添加以稳定制剂中蛋白质的辅料为氨基酸。例如，本发明组合物所使用的氨基酸选自苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、色氨酸、酪氨酸及其组合。更优选地，氨基酸选自精氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、甘氨酸及其组合。
本发明所述组合物中所使用的氨基酸的浓度范围优选为约10mM至约100mM，更优选约50mM至约100mM。
其他辅料的实例包括但不限于糖/多元醇，诸如蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖；聚合物，诸如血清白蛋白(牛血清白蛋白(BSA)、人SA或重组HA)、葡聚糖、PVA、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基纤维素(HEC)、羟乙基淀粉(HES)；非水溶剂，诸如多元醇(例如PEG、乙二醇和甘油)、二甲亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)；以及各种辅料如磷酸钾、乙酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、金属离子(例如锌、铜、钙、锰和镁)、CHAPS、单月桂酸酯、2-O-β-甘露糖酸甘油酯(mannoglycerate)或上述的任意组合。
“冷冻保护剂”包括在生产、冷冻、储存、处理、分配、重构或使用期间为冷冻蛋白质提供稳定性的物质。在一个特定的方面，“冷冻保护剂”包括保护蛋白质免受冷冻过程所诱发的应力的物质。冷冻保护剂可具有冻干保护作用。冷冻保护剂的非限制性实例包括糖，诸如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘露糖和乳糖；聚合物，诸如葡聚糖、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇；表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(例如PS-20或PS-80)；以及氨基酸，诸如甘氨酸、精氨酸、亮氨酸和丝氨酸。一般使用在生物系统中显示低毒性的冷冻保护剂。
如本文所述的二糖可以用作冻干保护剂或冷冻保护剂。“冻干保护剂”包括在冻干和随后储存期间防止或减少蛋白质化学或物理不稳定性的物质。一方面，由于干燥过程中水从组合物中被去除，冻干保护剂防止或减少蛋白质中的化学或物理不稳定性。在另一方面，冻干保护剂通过氢键结合帮助维持蛋白质的适当构象来稳定该蛋白质。
因此，一方面，本文所述的二糖可用于在冷冻期间稳定中和GM-CSF的化合物。由于在冷冻期间的保护作用可能取决于二糖的绝对浓度(Carpenter等人，Pharm.Res.(1997),14:969-975)，因此可能需要大于5％的浓度以最大化稳定性。
在一个实施方案中，将冻干保护剂加入至本文所述的制剂中。本文使用的术语“冻干保护剂”包括在冷冻干燥或脱水过程(初级和次级冷冻-干燥循环)期间为蛋白质提供稳定性的试剂，其通过提供无定形玻璃状基质并通过经氢键与蛋白质的结合，替代在干燥过程中除去的水分子。这有助于保持蛋白质构象，使冻干循环期间的蛋白质降解最小化，并提高产品的长期稳定性。将冻干保护剂以“冻干保护的量”添加到预冻干制剂中，这意味着在冻干保护量的冻干保护剂存在下冻干中和GM-CSF的化合物后，该化合物在冻干和储存时基本上保持了其物理和化学的稳定性和完整性。
冻干保护剂的非限制性实例包括糖，如蔗糖或海藻糖；氨基酸，如谷氨酸单钠、甘氨酸或组氨酸；甲胺，如甜菜碱；溶致盐，如硫酸镁；多元醇，如三元或更高级糖醇，例如阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；聚乙二醇；普朗尼克(pluronics)；以及上述的组合。优选地，冻干保护剂如上所述用于稳定剂。添加到制剂中的冻干保护剂的量，一般是当蛋白质制剂冻干时不会导致不可接受的蛋白质降解/聚集程度的量。
另一优选的辅料可以是填充剂。本文所用的术语“填充剂”包括提供冻干产品的结构而不直接与药物产品相互作用的试剂。除了提供药学上优质的饼状物之外，填充剂还可以赋予长期储存时在改变崩解温度、提供冻融保护和增强蛋白质稳定性方面有用的性质。填充剂的非限制性实例包括甘露醇、甘氨酸、乳糖和蔗糖。填充剂可以是结晶的(诸如甘氨酸、甘露醇或氯化钠)或无定形的(诸如葡聚糖、羟乙基淀粉)，并且通常以0.5％至10％的量用于蛋白质制剂中。
优选地，本发明所述制剂中应用的填充剂促进了在美学上可接受的、均匀的或机械强度好的饼状物的形成。填充剂还优选促进开孔结构的形成和提高重构的便捷性和速度。填充剂还优选减少或防止饼状物崩解、共晶熔化或残留水分的滞留。在另一方面，填充剂优选有助于保护中和GM-CSF的化合物抵抗应力(例如，物理和化学应力)并有助于维持蛋白质的活性。
在一些实施方案中，制剂可任选地含有防腐剂。“防腐剂”是一种可以添加到本文所述制剂中以降低细菌活性的化合物。添加防腐剂可以例如促进多次使用(多剂量)制剂的生产。潜在防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵(hexamethoniumchloride)、苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基为长链化合物)和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇，诸如苯酚、丁醇和苄醇；尼泊金烷基酯，诸如尼泊金甲酯或尼泊金丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。本文最优选的防腐剂是苄醇。
因此，在更优选的实施方案中，本发明的制剂是用于长期储存的液体制剂，优选水性制剂，其包含约50mg/ml和约200mg/ml之间的中和GM-CSF的化合物，以及选自组氨酸、乙酸盐和柠檬酸盐的缓冲液，pH为约5至约7，所述制剂可另外包含蔗糖、海藻糖、甘露醇和/或山梨醇中的一种或多种作为稳定剂/张力调节剂，以及一种或多种选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆的表面活性剂。
在特别优选的实施方案中，本发明的制剂是用于长期储存的液体制剂，优选水性制剂，其包含约50mg/ml和约200mg/ml之间的中和GM-CSF的化合物，更优选约80mg/ml或约150mg/ml；以及浓度为约20mM至约40mM、优选约30mM的组氨酸缓冲液，pH为约5.5至约6.5，更优选pH5.8；并且所述制剂可另外包含约4％至约6％、更优选约5％(w/v)的山梨醇以及聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，其浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)，优选约0.01％(w/v)至约0.04％(w/v)。
如果在上述优选制剂中使用聚山梨醇酯20和约80mg/mL的蛋白质浓度，那么聚山梨醇酯20的浓度为约0.001％(w/v)和约0.2％(w/v)之间，优选约0.007％(w/v)和约0.11％(w/v)之间，更优选约0.007％(w/v)和约0.06％(w/v)之间，最优选约0.01％(w/v)。如果所用的蛋白质浓度为约150mg/mL，那么聚山梨醇酯20的浓度为约0.001％(w/v)至约0.4％(w/v)之间，优选约0.006％(w/v)和约0.25％(w/v)之间，更优选约0.01％(w/v)和约0.18％(w/v)之间，甚至更优选约0.01％(w/v)至约0.1％(w/v)，最优选约0.02％(w/v)。
在另一个实施方案中，如果在上述优选制剂中使用聚山梨醇酯20和约80mg/mL的蛋白质浓度，那么聚山梨醇酯20的浓度为约0.02％(w/v)和约0.2％(w/v)之间，优选约0.03％(w/v)和约0.13％(w/v)之间，更优选约0.05％(w/v)和约0.08％(w/v)之间，最优选约0.07％(w/v)。如果所用的蛋白质浓度为约150mg/mL，那么聚山梨醇酯20的浓度为约0.04％(w/v)和约0.4％(w/v)之间，优选约0.06％(w/v)和约0.25％(w/v)之间，更优选约0.1％(w/v)和约0.15％(w/v)之间，最优选约0.13％(w/v)。
如果在上述优选制剂中使用聚山梨醇酯80和约80mg/mL的蛋白质浓度，那么聚山梨醇酯80的浓度为约0.001％(w/v)和约0.2％(w/v)之间，优选约0.004％(w/v)和约0.14％(w/v)之间，更优选约0.007％(w/v)和约0.1％(w/v)之间，甚至更优选约0.007％(w/v)和约0.05％(w/v)之间，最优选约0.04％(w/v)。如果所用的蛋白质浓度为约150mg/mL，那么聚山梨醇酯80的浓度为约0.001％(w/v)和约0.4％(w/v)之间，优选约0.007％(w/v)和约0.26％(w/v)之间，更优选约0.01％(w/v)和约0.2％(w/v)之间，甚至更优选约0.01％(w/v)和约0.08％(w/v)之间，最优选约0.04％(w/v)。
在另一个实施方案中，如果在上述优选制剂中使用聚山梨醇酯80和约80mg/mL的蛋白质浓度，那么聚山梨醇酯80的浓度为约0.02％(w/v)和约0.2％(w/v)之间，优选约0.04％(w/v)和约0.14％(w/v)之间，更优选约0.06％(w/v)和约0.09％(w/v)之间，最优选约0.07％(w/v)。如果所使用的蛋白质浓度为约150mg/mL，那么聚山梨醇酯80的浓度为约0.04％(w/v)和约0.4％(w/v)之间，优选约0.06％(w/v)和约0.27％(w/v)之间，更优选约0.1％(w/v)和约0.16％(w/v)之间，最优选约0.13％(w/v)。
此外，在一个实施方案中，本发明所述的中和抗GM-CSF抗体或其功能片段的制剂包含中和抗体约80mg/ml至约150mg/ml、山梨醇约5％(w/v)、L-组氨酸约30mM、聚山梨醇酯80约0.02％(w/v)至约0.04％(w/v)，pH为约5.8。
此外，在一个实施方案中，本发明所述的中和抗GM-CSF抗体或其功能片段的制剂包含中和抗体约80mg/ml，山梨醇约5％(w/v)，L-组氨酸约30mM，聚山梨醇酯80约0.04％(w/v)，pH为约5.8。
此外，在一个实施方案中，本发明所述的中和抗GM-CSF抗体或其功能片段的制剂包含中和抗体约150mg/ml，山梨醇约5％(w/v)，L-组氨酸约30mM，聚山梨醇酯80约0.04％(w/v)，pH为约5.8。
应当理解，所述组合物的某些组分可以与本领域已知的替代物互换。然而，本领域技术人员还将理解，包含某些组分将排除其它组分、浓度或该制剂制备方法的使用，原因包括但不限于化学相容性、pH、张力和稳定性。
有益的是，本发明的液体制剂具有低且可行的粘度，其适合于皮下施用，诸如在即用型装置中。由此，在约50和约1000[1/sec]之间的的剪切速率和约20℃的温度下，根据本发明所述的制剂的粘度优选低于20mPa*s，更优选地在上述条件下低于15mPa*s。
在一些实施方案中，本发明的液体制剂的粘度和/或稳定性随时间保持低注射力。例如载药注射器中制剂的力的测量在机器上进行，例如通用压缩测试系统(Norwood，MA)，其具有适于测试机构以保持注射器的附件。本文所述的制剂提供了既可通过手动装置也可通过自动(例如，机械辅助)装置进行皮下施用的可能性。在一个实施方案中，注射力是滑动力。在一些实施方案中，滑动力小于25N。在其它实施方案中，滑动力为0-20N、2-15N或4-11N。所述制剂在装入注射器后可保持低注射力的时间为至少3个月、至少6个月、至少12个月、3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、24个月、3-6个月、3-9个月、6-9个月、6-12个月、9-15个月、12-18个月、18-30个月或24-36个月。所述制剂可以储存在冰箱中，例如2-8℃或5℃，或在室温下，例如18-25℃或25℃。
如本文所述，本申请大体涉及一个发现，即向包含中和GM-CSF的化合物的制剂中添加几种物质可以减少制剂中这些化合物的聚集和/或降解/片段化。无论什么原因导致制剂中中和GM-CSF的化合物聚集或被降解，添加如本文所述的物质减少了制剂中中和GM-CSF的化合物的聚集/片段化。在某些实施方案中，添加所述物质减少了例如由储存、暴露于升高的温度、暴露于光、暴露于剪切应力、pH和离子条件及其任意组合而引起的制剂中的聚集/降解。
本发明人发现的措施可用于减少中和GM-CSF的化合物、特别是配制成液体和冷冻形式的该化合物的聚集和/或降解/断裂。因此，所减少的聚集/断裂优选在液体制剂中观察到。假定当直接以液体形式储存并用于以后使用时，以冷冻状态储存并在使用前融化时，或者以干燥形式(诸如冻干、风干或喷雾干燥形式)制备并用于以后在使用前重构成液体形式或其它形式时，也可以观察到聚集/降解的减少。
因此，设想本文所述制剂可以通过本领域技术人员已知的任何方法储存。非限制性的实例包括对制剂进行冷却、冷冻、冻干和喷雾干燥，其中优选通过冷却储存。
在一些情况下，将蛋白质制剂冷冻储存。因此，期望所述制剂在这样的条件包括在冻融循环下是相对稳定的。确定制剂的这种适应性的一种方法是使制剂样品经历至少一个，例如一个、三个、五个、七个和多达十个的冻融循环(例如通过在约-80℃±10℃下冷冻过夜，并在室温下快速解冻，或在冰上缓慢解冻例如6小时)，测定在冻融循环后积聚的低分子量/剪切(LMW)种类和/或高分子量/聚集(HMW)种类的量，并将其与冻融步骤之前样品中存在的LMW种类或HMW种类的量进行比较。LMW或HMW种类的增加表明作为制剂一部分储存的蛋白质的稳定性降低。尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)能用于确定LMW和HMW种类的存在。
优选地，蛋白质制剂可以作为液体储存。因此，如本文所述，期望液体制剂在这样的条件下包括在各种温度下是稳定的。例如，确定制剂适用性的一种方法是在若干温度(例如2-8℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和50℃)下储存样品制剂，并监测随时间所积聚的HMW和/或LMW种类的量。随时间所积聚的HMW和/或LMW种类的量越小，所述储存条件对制剂越好。此外，蛋白质的电荷分布可以通过阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)来监测。或者，制剂可以在冻干后储存。进一步期望制剂在剪切应力的条件下是稳定的。确定制剂适用性的一种方法是在所期望的温度(例如2-8℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和50℃，优选+5℃±3℃)下，在振荡器例如垂直振荡器上轻晃容器中制剂。该容器(例如小瓶)在振荡器上存储一段期望的时间段，例如多达14天或更长时间，与在相同温度下但未振荡储存的对照进行比较。数据点收集可在例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14和14天后进行。振荡储存后积聚的低分子量(LMW)种类和/或高分子量(HMW)种类的量可以确定，并与未振荡样品中存在的LMW种类或HMW种类的量进行比较。LMW或HMW种类的增加表明作为制剂一部分储存的蛋白质的稳定性降低。尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)可用于确定LMW和HMW种类的存在。
在一些情况下，将制剂喷雾干燥，然后储存。对于喷雾干燥，在干燥气流的存在下将液体制剂雾化。水从制剂液滴中被除去到气流中，得到药物制剂的干燥颗粒。辅料可被包括在所述制剂中以(i)在喷雾干燥脱水期间保护蛋白质，(ii)在喷雾干燥后的储存期间保护蛋白质，和/或(iii)赋予该溶液适于雾化特性。该方法与上述用于冷冻的方法类似，除了该样品制剂是喷雾干燥而不是冷冻，在稀释剂中重构，并且检测重构的制剂中LMW种类和/或HMW种类的存在之外。与未冻干的相应样品制剂相比，喷雾干燥样品中LMW或HMW种类的增加表明喷雾干燥样品的稳定性降低。
术语“冻干的”或“冷冻干燥的”包括已经经历干燥步骤如冻干的物质状态，其中至少90％、优选95％、最优选98％的水分已被去除。因此，本文使用的术语“冻干”是指这样的过程，通过该过程首先冷冻待干燥的材料，然后通过在真空环境中升华作用去除冰或冷冻的溶剂。辅料(例如冻干保护剂)可以包括在待冻干的制剂中，以便增强冻干产品在储存时的稳定性。本文使用的术语“重构制剂”是指通过将冻干的蛋白制剂在稀释剂中溶解以使中和GM-CSF的化合物分散在稀释剂中而制备的制剂。
本文使用的术语“稀释剂”是药学上可接受的(对人施用是安全和无毒的)物质，并且可用于制备液体制剂，例如在冻干后重构的制剂。稀释剂的非限制性实例包括无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液、葡萄糖溶液或盐和/或缓冲剂的水溶液。
在本发明的另一方面，设想所述制剂用于治疗。因此，本发明设想的药物组合物(或药物)包含本文所述制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者的方法，其包括施用治疗有效量的本文所述制剂，其中所述受试者患有可以用中和GM-CSF的化合物进行有益治疗的疾病或病症。
优选地，本文所述制剂用于预防和/或治疗可以使用中和GM-CSF的化合物进行预防和/或治疗和/或改善的疾病。
术语“受试者”意在包括活的生物体。受试者的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在本发明的优选实施方案中，受试者是人。
术语“有效剂量(dose)”或“有效用量(dosage)”被定义为足以实现或至少部分实现所期望效果的量。术语“治疗有效剂量”被定义为足以治愈或至少部分阻止已经患有疾病的患者的疾病及其并发症的量。该用途的有效量将取决于医学病状的严重性和受试者自身免疫系统的总体状态。术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
制剂的适当剂量或治疗有效量将取决于待治疗的病状、治疗前病状的严重性以及患者的临床病史和对治疗剂的反应。可根据主治医师的判断来调整适当的剂量，以使得其可以一次或一系列施用于患者。所述药物组合物可以作为单独的治疗剂施用或根据需要与其它治疗方法组合施用。
本发明的药物组合物特别用于肠胃外施用，即皮下、肌内、静脉内、关节内和/或滑膜内，其中优选皮下施用。肠胃外施用可以通过团注或连续输注进行。
用于注射的药物组合物可以以添加有防腐剂的单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中。此外，已经开发了许多新的药物递送方法，本发明的药物组合物适用于使用这些新方法进行施用，例如Inject-ease、Genject、注射笔诸如Genen，以及无针装置诸如MediJector和BioJector。本发明药物组合物也可以调整以适用于尚待发现的施用方法。参见Langer,1990,Science,249:1527-1533。
冻干药物组合物可优选存在于含有活性成分的小瓶中。在一个实施方案中，所述药物组合物另外包含用于重构的溶液。
所述药物组合物可以进一步包含额外的药学上可接受的组分。其它药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，诸如在Osol,A.所编著的第16版Remington's PharmaceuticalSciences(1980)中所描述的那些，也可被包括在本文所述的蛋白质制剂中，条件是它们不会对制剂的预期特性造成不利影响。如本文所用的“药学上可接受的载体”意指与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。这样的用于药物活性物质的介质和试剂的用途是本领域所熟知的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的，其包括：张力调节剂；额外的缓冲试剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂如EDTA；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；可生物降解的聚合物，诸如聚酯；成盐抗衡离子，诸如钠、多元糖醇；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、2-苯丙氨酸和苏氨酸；糖或糖醇，诸如乳糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖(myoinisitose)、肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，诸如谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；以及亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮。
本文所述的制剂可用作治疗和/或预防和/或改善有需要的患者的疾病或病症的药物组合物。术语“治疗”是指治疗性的治疗和预防，或预防性措施。治疗包括向患有疾病/病症、具有疾病/病症的症状或对疾病/病症具有易感性的患者的身体、分离的组织或细胞应用或施用所述制剂，其目的是治疗、治愈、减轻、解除、改变、补救、缓解、改善或影响疾病、疾病症状或对疾病易感性。
那些“需要治疗的”包括那些已经患有该病症的，以及那些其中需要预防该病症的。术语“病症”是任何受益于使用本文所述蛋白质制剂进行治疗的状况。这包括慢性和急性的病症或疾病，其包括那些使哺乳动物易患所述病症的病理状况。本文待治疗的病症的非限制性实例包括炎性和自身免疫性疾病，优选包括过敏性和银屑病性疾病，以及关节炎性和哮喘性疾病，例如关节炎、类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性脑炎、银屑病、多发性硬化、肺病如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；克罗恩病、特发性肺纤维化(IPF)、炎性肠病(IBD)、葡萄膜炎、黄斑变性、结肠炎、华勒变性、抗磷脂综合征(APS)、急性冠状动脉综合征、再狭窄、动脉粥样硬化、复发性多软骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失效骨科植入物、肾小球肾炎、狼疮、特应性皮炎和炎症、关节炎和骨关节炎疼痛。
过敏性病症是由过敏或过敏反应引起的任意病症。过敏是免疫系统的超敏性病症。过敏在人免疫系统对通常无害的外来物质(过敏原)如食物、花粉、霉菌、室尘、动物皮屑、尘螨等产生反应或过度反应时发生。
银屑病是主要影响皮肤的自身免疫性疾病。皮肤细胞的生长周期由于免疫系统发出的错误信号而加速。存在五种类型的银屑病：斑块状、滴状、皮褶、脓疱性和红皮性。最常见的形式，即斑块状银屑病，通常被看作是出现在表皮(皮肤)的顶部最上层上的红色和白色色调的鳞片状斑块。然而，一些患者没有皮肤病征兆或症状。该病症是一种慢性复发性病状，其严重程度不同，从轻微的局部斑块到全身覆盖。手指甲和脚趾甲经常受到影响(银屑病性甲营养不良)，可以看作是一个孤立的迹象。银屑病还可导致被称为银屑病关节炎的关节炎症。
关节炎是涉及一个或多个关节的炎症的关节病症形式。存在超过100种不同形式的关节炎。最常见的形式，即骨关节炎(退行性关节病)是关节创伤、关节感染或衰老的结果。其它关节炎形式是类风湿性关节炎、银屑病关节炎和其它相关的自身免疫性疾病。脓毒性关节炎是由关节感染引起的。
哮喘是常见气道慢性炎性病症，其中许多细胞和细胞元件起作用。哮喘与气道高反应性相关，导致反复发作的喘息、咳嗽、胸闷和呼吸短促。这些发作通常与肺内分布广泛单独但可变的气流阻塞相关联，所述气流阻塞通常是自发性可逆的或通过治疗可逆的。哮喘可以根据症状的频率、一秒内强制呼气量和呼气峰流速来分类。哮喘还可以分类为特应性(外源性)或非特应性(内源性)。
除中和GM-CSF的化合物之外，本发明的药物组合物可包含另外的治疗剂或生物活性剂。例如，可以存在用于治疗特定适应症诸如骨关节炎的治疗因子(例如参与破坏关节软骨或滑液组分的一种或多种抑制剂，选自但不限于抗金属蛋白酶、环化素化合物、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、TNF抑制剂、IL-抑制剂、抗血管生成物质、聚蛋白多糖酶(aggrecanase)抑制剂、p38激酶抑制剂、细胞凋亡抑制剂、透明质酸酶抑制剂和蛋白水解酶抑制剂)。控制炎症的因子包括英夫利昔单抗、依那西普(etanercerpt)、阿达木单抗(adalimulab)、nerelimonmab、lenercerpt等或其组合也可以是所述组合物的一部分。还设想所述药物组合物可包括细胞外基质组分，例如透明质酸或其衍生物，包括其盐、酯、内酯和硫酸盐衍生物，优选透明质酸的偏酯。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明制剂的试剂盒(或制品)或容器。所述制剂可优选已经处于液体状态。然而，可替代的，其可优选处于冻干状态。其也可以是冷冻、冻干、冷冻干燥或喷雾干燥的状态。因此，如果所述制剂处于除液体之外的状态，其可由医生制备成(液体)水性药物组合物。例如，所述制剂可以是冻干的，然后必须重构。因此，所述试剂盒可以进一步包括用于重构冷冻、冻干、冷冻干燥或喷雾干燥的制剂的工具和/或用于稀释制剂的工具和/或用于分别施用制剂或药物组合物的工具，例如注射器、泵、浸渍器、针等。所述试剂盒可以包含一个或多个含有本发明制剂的小瓶。所述试剂盒还可附带使用说明。
因此，提供了一种含有本文所述制剂的制品，并优选提供其使用说明书。所述制品包括适于容纳制剂的容器。合适的容器包括但不限于瓶、小瓶(例如双室小瓶)、注射器(例如单室或双室注射器)、试管、雾化器、吸入器(例如定量吸入器或干粉吸入器)或储藏器。所述容器可由各种材料形成，诸如玻璃、金属或塑料(例如，聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚烯烃)。所述容器容纳制剂，容器上的标签或与容器相联的标签可以标明对重构和/或使用的指示。该标签还可以标明所述制剂用于或旨在用于皮下施用。所述容纳制剂的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如，2-6次施用)所述制剂。所述制品还可以包括含有合适稀释剂(例如WFI、0.9％NaCl、BWFI、磷酸盐缓冲盐水)的第二容器。当所述制品包含冻干形式的中和GM-CSF化合物制剂时，稀释剂与冻干制剂的混合将在重构制剂中提供所期望的最终蛋白质浓度。所述制品可以进一步包括从商业和用户角度来说所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装说明书。
本发明还包括可以用于递送本发明制剂的装置。这样的装置的实例包括但不限于注射器例如载药注射器、笔、植入物、无针注射装置、吸入装置和贴片。
本发明的组合物对于多方面是稳定的，包括由于它们在例如玻璃载药注射器和药筒中使用而产生的界面应力。已经确定橡胶配方、硅酮、钨和固化剂与蛋白质溶液此消彼长地相互作用以形成聚集体、亚可见颗粒和可见颗粒。本发明的蛋白质制剂与载药注射器/药筒系统(包括封闭系统)中的组分相容。
本发明通过附图和实施例进行进一步说明，所述附图和实施例仅仅是说明性的，而不构成对本发明范围的限制。
附图说明
图1：储存时间、储存温度和蛋白质浓度对抗GM-CSF抗体的单体水平的影响；
图2：以渗透压[mOsmol/kg]为变量的标准化效果的帕累托图；
图3：含80mg/mL抗GM-CSF抗体、5％山梨醇、30mM组氨酸和不同量的吐温20的制剂中2-10μm颗粒的形成；
图4：含80mg/mL抗GM-CSF抗体、5％山梨醇、30mM组氨酸和不同量的吐温80的制剂中2-10μm颗粒的形成；
图5：含150mg/mL抗GM-CSF抗体、5％山梨醇、30mM组氨酸和不同量的吐温20的制剂中2-10μm颗粒的形成；
图6：含150mg/mL抗GM-CSF抗体、5％山梨醇、30mM的组氨酸和不同量的吐温80的制剂中2-10μm颗粒的形成；
图7：抗GM-CSF抗体与表面活性剂的代表性表面张力曲线；
图8：在含有不同浓度的吐温20或吐温80的30mM组氨酸、5％山梨醇中80mg/mL抗GM-CSF抗体的≥10μm颗粒浓度随冻/融循环次数的增加；
图9：在含有不同浓度的吐温20或吐温80的30mM组氨酸、5％山梨醇中150mg/mL抗GM-CSF抗体的≥10μm颗粒浓度随冻/融循环次数的增加。
下列项目也表征了本发明：
1.一种组合物，其包含浓度为至少约20mg/ml的中和GM-CSF的化合物、张力调节剂、缓冲剂，并且包含表面活性剂、氨基酸、抗氧化剂和/或螯合剂中的一种或多种，其中所述组合物是稳定的。
2.根据项目1所述的组合物，其包含中和GM-CSF的化合物、张力调节剂、缓冲剂和表面活性剂。
3.根据项目1或2所述的组合物，其中所述中和GM-CSF的化合物以至少约50mg/ml的浓度存在，所述张力调节剂以约1％至约15％(w/v)的浓度存在，所述缓冲剂以约10mM至约50mM的浓度存在。
4.根据项目1至3中任一项所述的组合物，其中所述张力调节剂选自甘露醇、山梨醇、蔗糖和/或海藻糖。
5.根据项目1至4中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂选自组氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐缓冲剂。
6.根据项目1至5中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆以及组合中的一种或多种。
7.根据项目1至6中任一项所述的组合物，其中所述中和GM-CSF的化合物以至少约50mg/ml且小于约200mg/ml的浓度存在，所述张力调节剂以约3％至约7％(w/v)的浓度存在，所述缓冲剂以约20mM至约40mM的浓度存在，并且所述表面活性剂以约0.001％至约1％(w/v)的浓度存在。
8.根据项目1至7中任一项所述的组合物，其中所述pH为约5和约7之间。
9.根据项目1至8中任一项所述的组合物，其中所述张力调节剂为山梨醇，并且所述缓冲剂为组氨酸缓冲剂。
10.根据项目2至9中任一项所述的组合物，其进一步包含抗氧化剂。
11.根据项目1至10中任一项所述的组合物，其中所述中和GM-CSF的化合物选自多肽、拟肽、核酸和小分子。
12.根据项目11所述的组合物，其中所述多肽是与GM-CSF或GM-CSF受体结合的抗体或其功能片段。
13.根据项目12所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段是人单克隆抗体或其功能片段。
14.根据项目12或13所述的组合物，其中所述抗体是IgG、IgG1或IgG4抗体。
15.根据项目12至14中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段与GM-CSF的表位结合，所述表位优选包含第23-27位氨基酸(RRLLN)和/或第65-77位氨基酸(GLR/QGSLTKLKGPL)。
16.根据项目15所述的组合物，其中所述表位进一步包含:
(i)第28-31位氨基酸(LSRD)；
(ii)第32-33位氨基酸(TA)和/或
(iii)第21-22位氨基酸(EA)。
17.根据项目15或16所述的组合物，其中所述表位是不连续的表位。
18.根据项目12至17中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段在其重链可变区中含有包含选自如SEQ ID NO:1-13和56中任一项所示氨基酸序列的CDR3。
19.根据项目18所述的组合物，其中所述重链可变区CDR3序列中的任一项和包含如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链可变区CDR1以及包含如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变区CDR2一起存在于重链可变区中。
20.根据项目12至19中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段在其轻链可变区中含有包含如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR1、包含如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR2和包含如SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的CDR3。
21.根据项目12至20中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段在其轻链可变区中包含如SEQ ID NO:19、54和55中任一项所示的氨基酸序列。
22.根据项目12至21中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段在其重链可变区中包含如SEQ ID NO:20-33、52和53中任一项所示的氨基酸序列。
23.根据项目12至22中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段在其轻链可变区中含有包含如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR1、包含如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR2和包含如SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列的CDR3；并且在其重链可变区中含有包含如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的CDR1、包含如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的CDR2和包含如SEQ ID NO:1-13和56中任一项所示氨基酸序列的CDR3。
24.根据项目12至23中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段在其轻链可变区中含有包含如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR1、包含如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR2和包含如SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列的CDR3；并且在其重链可变区中含有包含如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的CDR1、包含如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的CDR2和包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的CDR3。
25.根据项目12至24中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段包含如SEQ ID NO:34所示的轻链氨基酸序列，以及选自如SEQ ID NO:35-48中任一项所示的那些的重链氨基酸序列。
26.根据项目12至25中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段包含如SEQ ID NO:34所示的轻链氨基酸序列以及如SEQ ID NO:35所示的重链氨基酸序列。
27.根据项目12至26中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段包含与如SEQ ID NO:1-48和52-56中任一项所示的相应氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列，优选包含与如SEQ ID NO:1-18和56中任一项所示的相应氨基酸序列、和/或与如SEQID NO:19-48和52-55中任一项所示氨基酸序列中的框架区氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。
28.根据前述项目中任一项所述的组合物，其包含：
i)约50mg/ml至约180mg/ml的中和GM-CSF的化合物，
ii)约5％(w/v)山梨醇，
iii)约30mM L-组氨酸，
iv)约0.001％至约1％(w/v)表面活性剂，以及
v)pH为约5.8。
29.根据项目28所述的组合物，其包含约80mg/ml或约150mg/ml的中和GM-CSF的化合物。
30.根据前述项目中任一项所述的组合物，其为液体，优选为水性组合物。
31.根据前述项目中任一项所述的组合物，其在约2-8℃下稳定至少24个月，或在室温下稳定至少28天。
32.根据前述项目中任一项所述的组合物，其用于治疗。
33.根据前述项目中任一项所述的组合物，其用于静脉内和/或皮下施用。
34.根据前述项目中任一项所述的组合物，其用于治疗炎性和自身免疫性疾病，优选包括过敏性和银屑病性疾病，以及关节炎性和哮喘性疾病。
35.一种试剂盒，其包含前述项目中任一项所述的组合物。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其包括载药注射器、药筒或自动注射器。
应当理解，本文所公开的发明不限于特定的方法、方案或试剂，因而它们是可以变化的。本文所提供的讨论和实施例仅出于描述特定实施方案的目的而给出，其不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。以下实施例将阐述本发明。
实施例1：材料
以下实施例用人单克隆IgG1抗体(下文中以“抗体”表示)进行，该抗体与高亲和力的特异性人GM-CSF结合并中和，其在WO 2006/111353中有描述。它的产生在WO 2006/111353的实施例2中有描述。更具体地，该抗体包含如SEQ ID NO:16、17、18、14、15和2中所示的轻链和重链CDR序列。这些CDR序列分别包含在重链和轻链可变结构域中，并分别在SEQID NO:34和35中示出。GM-CSF在多种促炎症和自身免疫性人类疾病中异常地过度产生，并且发现添加重组的GM-CSF会加重这些疾病。用GM-CSF中和抗体治疗的可能的疾病适应症包括类风湿性关节炎(RA)、哮喘和其它形式的肺部炎症、多发性硬化(MS)和银屑病。
使用无血清和无蛋白质的培养基在生物反应器中产生抗体。由单个小瓶的抗体产生克隆制备生产发酵罐的接种物。在发酵过程完成后，通过过滤来对含有分泌抗体的收获物进行处理，以将细胞和碎片从上清液中分离。基于常见的色谱方法对收获物进行纯化，以减少HCP、DNA和潜在的病毒。整体病毒灭活步骤是下游过程的另一附加部分。对于制剂，进行浓缩和缓冲液的更换步骤。
实施例2：检测方法
建立尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)以确定抗体的聚集程度(HPLC：Agilent1100Chemstation；柱：Tosoh Biosep TSKgel G4000SWXL)。通过进行九点范围检测来验证SE-HPLC方法，从中确定并测试精度(六次重复注射)和线性度(三标准曲线)。所有试验都使用100mM KH2PO4、200mM Na2SO4，pH 6.6作为运行缓冲液进行。
建立表面等离子体共振(SPR)方法以确定抗体与固定的GM-CSF的结合活性的程度(Biacore 3000/CM5传感器芯片/HBS-EP运行缓冲液)。通过进行九点范围检测来验证SPR方法，从中确定并测试精度(六次重复注射)和线性度(三标准曲线)。
进行还原和非还原SDS-PAGE以检测抗体的降解产物(片段)和聚集体。
对溶液中尺寸为约2-100μm的颗粒进行微流成像(MFI，Brightwell，Ottawa，CA)以量化内在和外部亚可见颗粒的量。
使用WCX-10柱和TRIS/咪唑/哌嗪运行缓冲液中的pH梯度进行阳离子交换层析(CEX)以评估带电荷的异构体。酸性异构体在主要异构体之前洗脱，碱性异构体在主要异构体之后洗脱。
使用配有用于保持注射器的转接器的通用压缩测试系统来测试注射器滑动力。
实施例3：pH和温度应激的影响
进行研究以评估抗体在pH值从3到10范围内的低离子强度筛选缓冲液(LISSB：2mM甘氨酸、2mM柠檬酸、2mM HEPES、2mM MES和2mM Tris)中的稳定性。将抗体样品在各自的溶液中在55℃下储存14天的时间。在T0、T7和T14(天)时分析样品。SPR分析表明所述抗体在pH4-7下最稳定。当通过SE-HPLC分析时，发现所述抗体单体在pH 4-6(T14)下最稳定。T14样品的非还原和还原SDS-PAGE仅在pH 4-6下显示出最小的降解产物和聚集体的形成。
实施例4：离子强度和温度应激的影响
进行研究以评估所述抗体在0、10、100和500mM NaCl存在下在低离子强度筛选缓冲液(LISSB)中的稳定性。将抗体样品透析至含有额外NaCl的LISSB溶液(pH 4.5和pH 7.5)中，达到约1mg/ml的浓度，并在55℃下储存14天的时间。在T0、T7和T14(天)时，通过SE-HPLC和SPR分析样品。
HPLC和SPR研究表明，添加盐会使所述抗体的稳定性变差，并且此影响在pH 4.5下比在pH7.5下更加显著。此外，SE-HPLC数据显示，在pH 4.5下具有升高的盐浓度(≥100mM)的抗体不稳定性主要导致所述抗体聚集体的积聚。在pH 7.5下具有升高的盐浓度(500mM)的抗体不稳定性主要导致抗体降解产物的积聚。在LISSB pH 4.5、500mM NaCl中，抗体的沉淀水平(T7和T14)非常高。
实施例5：缓冲液的影响
进行研究以评估所述抗体在各种pH 5-7的缓冲液中的稳定性。将抗体样品透析至pH 5、6和7的20mM柠檬酸盐缓冲液；pH 6和pH 7的20mM磷酸盐缓冲液；pH 6和pH 7的20mM琥珀酸盐缓冲液；pH 6和pH 7的20mM组氨酸缓冲液；以及pH 5和pH 6的20mM乙酸盐缓冲液中，达到约1mg/ml的浓度，并在55℃下储存14天的时间。在T0、T7和T14(天)时，通过SE-HPLC、SPR以及还原和非还原SDS-PAGE分析样品。
SPR研究、HPLC单体和聚集体数据以及还原和非还原的SDS-PAGE表明，所述抗体在pH 5的乙酸盐缓冲液、pH 6的组氨酸缓冲液和pH 5、6和7的柠檬酸盐缓冲液中最稳定(T14的数据)。
实施例6：氨基酸的影响
进行研究以评估所述抗体在添加有不同氨基酸的低离子强度筛选缓冲液(LISSB)中的稳定性。将抗体样品在pH 6的、含有250mM相应氨基酸的溶液中在55℃下储存14天的时间。在T0、T7和T14(天)时分析样品。SPR研究表明特别是谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸和缬氨酸(T14)的轻微稳定作用。HPLC数据表明，与没有添加任何氨基酸的参照相比，谷氨酸、苏氨酸和丙氨酸的稳定化和显著效果分别导致增多了约2-3％的完整单体和减少了约30％、31％和20％的聚集体。
实施例7：糖和表面活性剂的影响
进行研究以评估所述抗体在添加有各种糖或表面活性剂的低离子强度筛选缓冲液(LISSB)中的稳定性。将抗体样品用额外的6％(w/v)的糖(D-甘露醇、D-山梨醇、蔗糖，D-甘露糖、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-葡萄糖)、0.05％(v/v)吐温20或0.02％(v/v)吐温80透析到pH 6.0的LISSB溶液中，达到约1mg/ml的浓度，并在55℃下储存14天的时间。在T0、T7和T14(天)时，通过SE-HPLC、SPR和还原和非还原SDS-PAGE分析样品。
SPR和HPLC研究表明D-山梨醇和D-甘露醇使所述抗体的稳定性分别提高约20％/3％(SPR/HPLC数据，T14)和14％/4％(SPR/HPLC数据，T14)。海藻糖和蔗糖均具有分别为7％/0.7％(SPR/HPLC数据，T14)和6％/2％(SPR/HPLC数据，T14)的降低作用。此外，HPLC数据表明，D-山梨醇和D-甘露醇使所述抗体聚集体的形成分别减少了43％和50％，这也得到了SDS-PAGE所得了数据的支持。如通过SE-HPLC、SPR和SDS-PAGE所测，0.05％(v/v)吐温20和0.02％(v/v)吐温80都不影响稳定性。
实施例8：缓冲液、氨基酸和糖的组合的影响
基于先前的研究，进行研究以评估在缓冲液、氨基酸和糖的组合中配制的1mg/ml抗体的稳定性。先前的研究表明了pH 5的20mM乙酸盐；pH 6的20mM组氨酸；250mM的谷氨酸；250mM的苏氨酸，6％(w/v)山梨醇和6％(w/v)的甘露醇的稳定作用。将所述抗体以5.4mg/ml的浓度配制成如表1所示的20mM的缓冲液、250mM的氨基酸和6％(v/v)的糖类的组合的溶液，并在55℃下储存14天的时间。将1×PBS中的抗体作为对照。在T0、T7和T14(天)时，通过SE-HPLC和SPR分析样品。
此外，检测包含1×PBS中的所述抗体(5.4mg/ml)的T0样品对冻融易感性。将存储小瓶在冷冻器中-20℃下缓慢冷冻。冷冻完成后，将样品在室温下融化。重复该过程直到完成五个冻融循环。在两个和五个循环后检查每一个样品的SPR和SE-HPLC回收。
表1：缓冲液、糖和氨基酸的组合(Ac＝乙酸盐缓冲液；His＝组氨酸缓冲液；M＝甘露醇；S＝山梨醇)
SPR数据显示，相对于T0，在T14/55℃下样品5-16中的结合活性>93％。对于1×PBS(样品17)和样品1-4(全部不含甘露醇或山梨醇)中的抗体，数值分别为62％、19％、26％、91％和85％。因此，SPR数据表明，添加甘露醇或山梨醇改善了结合活性的稳定性。此外，样品1-4在T7和T14处呈黄色，这表明氧化。SE-HPLC数据显示，在样品5-8、11-12和15-16中发现最低水平的聚集体(3.5％-5.6％)和降解产物(4.2％-5.4％)(T14/55℃数据)，这支持甘露醇和山梨醇对抗体单体的稳定作用，并表明添加250mM苏氨酸的影响可能较小。然而，通过样品5-8、11-12和15-16中发现的单体水平(分别为91.2％、89.8％、91.5％、90.8％、89.8％、89.0％、91.4％和90.9％)——对于样品17(PBS)，数值为80.3％(T14/55℃数据)——来判断苏氨酸的影响至少是最小的。250mM谷氨酸和山梨醇或甘露醇一起对抗体单体的稳定性有负面影响，特别是在乙酸盐缓冲液中。总之，所述抗体单体似乎在pH 5的20mM乙酸盐缓冲液或pH 6的20mM组氨酸缓冲液和6％(w/v)山梨醇或6％(w/v)甘露醇的组合中是最稳定的。
来自冻/融实验的SE-HPLC数据表明，在稳定抗体单体方面山梨醇的作用稍优于甘露醇。在5轮冻/融后，与样品5和7中的单体含量为96.9％和96.0％相比，样品6和8中单体的含量分别为98.6％和98.4％。
实施例9：组氨酸或乙酸盐缓冲液、山梨醇或甘露醇和吐温20或吐温80的组合的影响
基于来自先前研究的稳定性数据(显示稳定作用的，特别是pH 5的20mM乙酸盐、pH6的20mM的组氨酸、6％(w/v)山梨醇和6％(w/v)甘露醇的稳定作用)，进行了新的研究以评估在组氨酸或乙酸盐缓冲液、山梨醇或甘露醇、吐温20或吐温80的组合中配制的10mg/ml抗体的稳定性。由于抗体浓度为10mg/ml，还通过SE-HPLC检测了添加0.02％(w/v)吐温20和0.02％(w/v)吐温80对聚集的影响。
将所述抗体以10mg/ml的浓度配制到pH 5.0的20mM乙酸盐缓冲液或pH 6.0的2mM组氨基酸缓冲液、并含如表2所示添加剂的溶液中，在55℃下储存14天的时间。在T0、T7和T14(天)时，通过SE-HPLC和SPR分析样品。
另外，检测抗体样品对冻融的易感性。所述抗体以10mg/ml的浓度在-20℃下在冰箱中缓慢冷冻。冷冻完成后，将样品在室温下融化。重复该过程直到完成三个和/或五个冻融循环。在三个和/或五个冻融循环后，检测每个样品的SPR和SE-HPLC回收。
表2：缓冲液、糖和洗涤剂的组合(Ac＝乙酸盐缓冲液；His＝组氨酸缓冲液；M＝甘露醇；S＝山梨醇；T20＝吐温20；T80＝吐温80)
HPLC数据显示，尽管乙酸盐和组氨酸之间存在微小差异，但组氨酸似乎至少与乙酸盐一样好。1周后，与不含表面活性剂的相应制剂相比，含有乙酸盐、山梨醇和吐温80，以及含有组氨酸、山梨醇和吐温20的制剂具有相似的降解。
冻融实验表明，在五轮冻融后，洗涤剂对抗体单体的水平至少没有影响。然而，与6％(w/v)甘露醇相比，当向所述试剂中添加6％(w/v)山梨醇时，所述抗体单体更稳定。加入甘露醇后，所述抗体单体在5轮冻融后聚集到更高程度。来自冻融实验的HPLC数据显示，使用乙酸盐和组氨酸之间没有差异。
总之，通过HPLC测定，含有pH 6.0的20mM组氨酸和6％(w/v)山梨醇的预制剂对于抗体单体的稳定性似乎是最佳的。
实施例10：20mM组氨酸、6％(w/v)D-山梨醇的预制剂的短期稳定性评估
在确定pH 6.0的20mM组氨酸和6％(w/v)山梨醇作为最佳预制剂的基础上，进行短期稳定性试验以评价较高抗体浓度的预制剂。
将所述抗体以约22、36、42、83和118mg/ml的浓度配制到上述溶液中。将配制的抗体在5℃和25℃下储存长达4周的时间。在T0、T14和T28(天)时，通过SE-HPLC分析样品。
SE-HPLC数据清楚地显示所述抗体在pH 6.0的20mM组氨酸、6％(w/v)山梨醇中是稳定的。在5℃或25℃下储存28天后，检测到的抗体单体浓度总是高于97％，除了在25℃下测试的最高抗体浓度(118mg/ml)，其中抗体单体浓度为约96.5％。结果在图1中示出。
实施例11：最终辅料的微调
基于先前实验中产生的数据，已经选择山梨醇和组氨酸用于稳定抗体。在下一步中，使用“实验设计”(Design of Experiment，DOE)，针对10-100mg/ml的抗体浓度，对辅料的量以及pH值进行微调，这包括3个中心点，得到30个单独运行。随机实验计划使用以下参数进行：
抗体：10-55-100mg/ml，
pH：5-6-7，
组氨酸：10-30-50mM，
山梨醇：2-6-10％(w/v)。
为允许短期评价，将样品在50℃的加速条件下应激14天。此外，进行三个冻融循环(-20℃)以模拟抗体储存。
结果：
确定渗透压以确保制剂的生理条件。对于所述抗体的静脉或皮下应用，在250和450mOsmol/kg之间的渗透压是可接受的范围。如图2所示，渗透压主要由制剂中山梨醇的量控制。低浓度(10-50mM)下的组氨酸和所述抗体本身均对渗透压具有最小的影响。
渗透压对山梨醇和组氨酸的浓度的依赖性可在等高线中描述。该等高线显示，为将渗透压维持在生理区间中，山梨醇的浓度在3％和7％(w/v)之间是必需的。所产生的数据表明山梨醇的最佳浓度为约6％，这导致相当高的渗透压值。由于山梨醇一定程度的减少不影响所述抗体的稳定性，因此山梨醇浓度可以降低至5％以达到约400mOsmol/kg的渗透压，由此增加患者的方便性。
基于所产生的数据，将组氨酸的最佳浓度设定为30mM。通过SE-HPLC测量，在组氨酸浓度范围在10mM和50mM之间时，没有检测到其对聚集或片段化有影响。
所述抗体的聚集主要取决于浓度。抗体浓度的增加导致在冻/融期间和加速的温度应激条件下聚集水平较高和澄清度值增加。此外，pH值影响抗体的单体含量。鉴于pH<6下的加速应激导致抗体片段化增多，在冻/融期间的稳定性不受影响，相反观察到了稍好的稳定性。在pH>6的pH值下，针对加速温度和冻/融处理两者，可以使用SE-HPLC和澄清度分析来测量单体含量的减少。为了抵消相反的效果，pH 5.8似乎最适合于所述抗体制剂。
得到具有以下参数的制剂：
此组合物的条件或参数也可以适用于具有更高抗体浓度的组合物，如以下实施例所示。
实施例12：稳定性研究
长期研究
此研究被设计用于长达60个月的测试期。在此期间，抗体样品在5℃±3℃下储存在DIN R2玻璃小瓶中。此外，25℃±2℃下的加速研究和40℃±2℃下的应激研究在DIN R2玻璃小瓶中进行分别长达12个月和6个月。使用浓度为106mg/ml和145mg/ml的抗体，在含30mM组氨酸单盐酸盐和5％(w/v)山梨醇的制剂中在pH5.8下进行测试。
测量以下参数：pH，渗透压，浓度(OD 280)，单体、聚集体和片段的百分比(通过SE-HPLC)，效力(基于细胞分析)。结果在以下表3-8中示出。
表3：+5℃±3℃下的稳定性测试(106mg/ml抗体)
表4：+5℃±3℃下的稳定性测试(145mg/ml抗体)
表5：+25℃±2℃下的稳定性测试(106mg/ml抗体)
表6：+25℃±2℃下的稳定性测试(145mg/ml抗体)
表7：+40℃±2℃下的稳定性测试(106mg/ml抗体)
表8：+40℃±2℃下的稳定性测试(145mg/ml抗体)
加速/应激研究
为了证明药物物质的可比性，因此，抗体增长后，使用两批在30mM组氨酸、5％山梨醇、pH 5.8的溶液中配制的抗体浓度为165mg/ml和171mg/ml的药物物质，在加速(25℃)和应激(40℃)条件下进行稳定性研究。
测量了以下参数：pH，渗透压，浓度(OD 280)，单体、聚集体和片段的百分比(通过SE-HPLC)，效力(基于细胞分析)。抗体浓度为171mg/ml的结果在以下表9和10中示出。
表9：+25℃±2℃下的稳定性测试(171mg/ml抗体)
表10：+40℃±2℃下的稳定性测试(171mg/ml抗体)
冻/融研究
测试在30mM组氨酸(pH 5.8)、5％山梨醇的溶液中配制的浓度为106mg/ml和145mg/ml的抗体的冻/融稳定性。所述抗体在-80℃±10℃下冷冻至少过夜。在室温下进行融化≥6小时。进行0、1、3、5、7和10个冻/融循环。
测量了以下参数：pH，渗透压，浓度(OD 280)，单体、聚集体和片段的百分比(通过SE-HPLC)，效力(基于细胞分析)。结果在以下表11和12中示出。
表11：-80℃±10℃下的冻/融稳定性测试(106mg/ml抗体)
表12：-80℃±10℃下的冻/融稳定性测试(145mg/ml抗体)
结果和结论
针对30mM组氨酸、5％山梨醇(pH 5.8)的制剂中为约106mg/ml和约145mg/ml的抗体浓度，进行了长达60个月的长期稳定性研究，包括在加速和应激条件下。在加速和应激条件下，针对在30mM组氨酸、5％山梨醇(pH 5.8)中高达约171mg/ml的抗体浓度进行另外的稳定性研究。
在60个月期间，在+5℃±3℃下储存的两种浓度的样品显示出小于2％的聚集，并且与参照相比具有相同的效力。
在加速条件(+25℃±2℃)下储存12个月后，两种浓度(106mg/ml和145mg/ml)均显示出小于2％的聚集，并且与参照相比具有相同的效力。在应激条件(+40℃±2℃)下储存6个月后，两种浓度均显示出小于5％的聚集，并且与参照相比具有大致相同的效力。
另外的加速/应激研究的数据显示在25℃和40℃下分别有3个月和1个月的稳定性。这表明，可以预期2-8℃下的稳定性与如上所述106mg/ml和145mg/ml的抗体浓度所获得的稳定性相当。
此外，30mM组氨酸、5％山梨醇、pH5.8中的抗体在两个测试抗体浓度约106mg/ml和约145mg/ml下，在至少10个-80℃±10℃的冻/融循环期间是稳定的。
实施例13：粘度评价
使用流变仪测定在30mM组氨酸(pH 5.8)和5％山梨醇溶液中所配制的浓度为150mg/ml的抗体的粘度。流变仪用于不能通过单一粘度值定义而因此需要比粘度计设置并测量更多参数的那些流体。
对于一些流体而言，粘度在剪切速率很宽的范围内是恒定的(牛顿流体)。不具有恒定粘度的流体(非牛顿流体)不能由单一数值描述。非牛顿流体显现出剪切应力和剪切速率之间各种不同的相关性。因此，对于非牛顿流体，粘度取决于温度以及剪切速率。在给定温度和给定剪切速率[1/sec]下，粘度以毫帕斯卡*秒(mPas*s)表示。
在20℃的温度和约50和约1000[1/sec]之间的剪切速率下，含约150mg/ml抗体的制剂的粘度低于12mPas*s。
在5℃的温度和约50和约1000[1/sec]之间的剪切速率下，含约150mg/ml抗体的制剂的粘度低于20mPas*s。
实施例14：搅拌/剪切应力下的稳定性
用0、0.01、0.05、0.1％的吐温20制备含5％山梨醇、30mM组氨酸、pH 5.8的抗体浓度为80mg/mL的制剂，并用0、0.01、0.05、0.1和0.15％的吐温20(20)(PS20)制备含5％山梨醇、30mM组氨酸(pH 5.8)的蛋白质浓度为150mg/mL的制剂。这些制剂在剪切室或混合器中搅拌长达24小时，并在0、4、8和24小时时通过MFI测量亚可见颗粒。与不含吐温的制剂相比，添加至少0.01％的20降低了亚可见颗粒形成的速率。
用0、0.01、0.05、0.1％的80(PS80)制备含5％山梨醇、30mM组氨酸(pH5.8)的抗体浓度为150mg/mL的制剂，并用0、0.01、0.05、0.1和0.15％的80制备含5％山梨醇、30mM组氨酸(pH 5.8)的蛋白质浓度为150mg/mL的制剂。将这些制剂在剪切室或混合器中搅拌长达8小时，并在0、4、6和8小时时通过MFI测量亚可见颗粒。与不含的制剂相比，添加至少0.01％的80降低了亚可见颗粒形成的速率。
图3-6示出了(作为每ml颗粒数乘以稀释系数)针对在添加了20或80(％w/v)的30mM组氨酸、5％山梨醇、pH 5.8中的80mg/mL和150mg/mL蛋白质(抗体)进行的附加测试的初步结果。对这些制剂进行剪切/搅拌以检查其在溶液中形成亚可见颗粒的倾向，发现表面活性剂减少了亚可见颗粒的形成。因此，在制造和储存期间需要表面活性剂来防止亚可见颗粒的形成，或减少亚可见颗粒的形成。
实施例15：表面活性剂相互作用的评价
进行表面张力测量以表征20和80与在5％山梨醇、30mM组氨酸、pH5.8中的80mg/mL和150mg/mL蛋白质的相互作用。得到类似于图7的表面张力曲线。测定了临界聚集浓度(CAC)，其是表面活性剂开始与蛋白质相互作用的浓度。此外，还测定了临界胶束浓度——表面活性剂胶束形成的浓度，其表明与蛋白质的相互作用处于平衡。表13总结了这些结果。对于两种浓度，20和80以相似的CAC表面活性剂:蛋白质摩尔比与蛋白质发生相似相互作用。CMC在较高的蛋白质浓度下较高，但对于表面活性剂:蛋白质摩尔比，其在两种蛋白质浓度下相似。20的CMC表面活性剂:蛋白质摩尔比80低。从表面张力测量看，表面活性剂与蛋白质相互作用的范围是从CAC直至CMC。对于20，所述摩尔比范围为大约0.004至2.6，而对于80，所述摩尔比范围为大约0.003至3.3。蛋白质制剂中表面活性剂的最佳水平高于CAC。
表13.表面张力曲线数据的总结
CAC＝临界聚集浓度
CMC＝临界胶束浓度
实施例16：冻融稳定性
在20(PS20)和80(PS80)浓度为0％、0.01％和0.1％的30mM组氨酸、5％山梨醇、pH 5.8中的80mg/mL抗GM-CSF抗体制剂经过10个冻融循环后通过MFI来表征。如图8所示，对于不含表面活性剂的制剂而言，≥10μm的颗粒随冻融循环次数而明显增加。从0.01％直至0.1％的20或80，颗粒没有明显增加。
在20和80浓度为0％、0.05％和0.15％的30mM组氨酸、5％山梨醇、pH 5.8中的150mg/mL抗GM-CSF抗体制剂经过10个冻融循环后通过MFI来表征。如图9所示，对于不含表面活性剂的制剂中的一种，尺寸≥10μm的颗粒明显增加。从0.05％直至0.15％的20或80，颗粒没有明显增加。
实施例17：加速稳定性
在20(PS20)和80(PS80)浓度为0％、0.05％和0.1％的30mM组氨酸、5％山梨醇、pH 5.8中的80mg/mL抗GM-CSF抗体制剂，在40℃下加速稳定1周。所述样品通过MFI(表14)和SE-HPLC(表15)进行表征。
如MFI所测量，≥10μm的颗粒浓度在40℃下1周没有增长。然而，如SE-HPLC所测量，多聚集体(HMW)增加。7天后，对于含有表面活性剂的制剂而言，HMW种类的量略高，但不显著高于不含表面活性剂的制剂。此外，HMW浓度的增长不依赖于表面活性剂的量或表面活性剂的两种不同类型。
表14：80mg/mL抗GM-CSF抗体、30mM组氨酸、5％山梨醇、pH 5.8在40℃下经过7天后颗粒浓度的增长
NA＝无法获得
表15：80mg/mL抗GM-CSF抗体、30mM组氨酸、5％山梨醇、pH 5.8在40℃下经过7天的SE-HPLC结果
20(PS20)和80(PS80)浓度为0％、0.1％和0.15％的30mM组氨酸、5％山梨醇、pH 5.8中的150mg/mL抗GM-CSF抗体的制剂，在40℃下加速稳定1周。所述样品通过MFI和SE-HPLC进行表征。
如MFI所测量，≥10μm的颗粒浓度在40℃下1周没有增长(表16)。然而，如SE-HPLC所测量(表17)，可溶性聚集体(HMW)增加。HMW种类的增加速率在150mg/mL抗体时高于80mg/mL的抗体，但其不受制剂中表面活性剂的量或表面活性剂的类型影响。与不含表面活性剂的制剂相比，通过添加表面活性剂，7天后HMW种类的量略有增加，但没有统计学上的显著性。
表16：150mg/mL抗GM-CSF抗体、30mM组氨酸、5％山梨醇、pH 5.8在40℃下经过7天的颗粒增长
表17：150mg/mL抗GM-CSF抗体、30mM组氨酸、5％山梨醇、pH 5.8在40℃下经过7天的SE-HPLC结果
实施例18：载药注射器中的稳定性
用来自3个不同制造商的具有不同的硅酮量、橡胶组分等的载药注射器研究各种制剂的稳定性。此外，研究了安慰剂制剂。将制剂置于2-8℃和25℃下长达12个月。含有蛋白质、抗体(Ab)的制剂通过视觉外观、SE-HPLC、阳离子交换层析和MFI进行表征，而安慰剂制剂通过视觉外观和MFI进行表征。
所研究的制剂在表18中示出。
表18：用于稳定性分析的载药注射器的情况
制剂# 组合物 注射器制造商
1 150mg/mL Ab、30mM组氨酸、5％山梨醇、0.04％PS80 A
2 150mg/mL Ab、30mM组氨酸、5％山梨醇、0.04％PS80 B
3 150mg/mL Ab、30mM组氨酸、5％山梨醇、0.04％PS80 C
4 80mg/mL Ab、30mM组氨酸、5％山梨醇、0.04％PS80 A
5 80mg/mL Ab、30mM组氨酸、5％山梨醇、0.04％PS80 B
6 80mg/mL Ab、30mM组氨酸、5％山梨醇、0.04％PS80 C
7 80mg/mL Ab、30mM组氨酸、5％山梨醇、0.02％PS80 A
8 150mg/mL Ab、30mM组氨酸、5％山梨醇、0.02％PS80 A
9 30mM组氨酸、5％山梨醇、0.02％PS80 A
10 30mM组氨酸、5％山梨醇、0.04％PS80 A
实施例19：载药注射器中的稳定性
用来自3个不同制造商的、具有不同硅酮油量和橡胶配方用于针罩的载药注射器，其均是用于皮下施用的典型注射器，来对含有不同抗体浓度和聚山梨醇酯量的各种制剂的稳定性进行研究。这3个注射器制造商均使用相同的塞/柱塞配方。所选择的聚山梨醇酯的量高于CAC，并且处于表面张力曲线中相当平坦的部分。此外，研究了安慰剂制剂。将制剂置于2-8℃和25℃下用于长期取样。含有蛋白质的制剂通过视觉外观、SE-HPLC、阳离子交换层析和MFI进行表征，而安慰剂制剂通过视觉外观和MFI进行表征。
所研究的制剂在表19示出，结果在表20-26中示出。对于80mg/mL的抗体制剂，对所有制剂和注射器类型而言，视觉外观是无色，无可见颗粒，并且不随时间改变。对于150mg/mL的抗体制剂，对所有制剂和注射器类型而言，视觉外观是淡黄色，无可见颗粒，并且不随时间改变。150mg/mL制剂的通过SE-HPLC所得的聚集体增加速率高于80mg/mL，表面活性剂的量并不影响聚集的速率。所检测的所有制剂和注射器类型的电荷分布随时间的变化是相同的。
表19：用于稳定性分析的载药注射器的情况
表20：+5℃±3℃下储存的载药注射器制剂的SE-HPLC结果
表21：+25℃/60％RH下储存的载药注射器制剂的SE-HPLC结果
表22：+5℃±3℃下储存的载药注射器制剂的CEX结果
表23：+25℃/60％RH下储存的载药注射器制剂的CEX结果
表24：+5℃±3℃下储存的载药注射器制剂的注射力结果
表25：+25℃/60％RH下储存的载药注射器制剂的注射力结果
注射力结果显示，对于所检测的每种制剂和每个注射器，平均滑动力为约4-11N。该力的范围给出了提供本文所描述的制剂中的抗GM-CSF抗体用于手工使用和自动注射器使用的可能性。
表26：+5℃±3℃下储存的载药注射器制剂的MFI结果(颗粒/mL)
NV—结果无效，因为流动池中存在气泡，且无其他样品可用。
表27：+25℃/60％RH下储存的载药注射器制剂的MFI结果(颗粒/mL)
NV—结果无效，因为流动池中存在气泡，且无其他样品可用。
序列表
<110> 武田有限公司
<120> 包含GM-CSF中和化合物的液体制剂
<130> 1749
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 7A-701
<400> 1
Ser Gly Leu Ile Ala Asn His Met Thr Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 7B1-502
<400> 2
Thr Thr Leu Ile Ser Val Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 L38-A1
<400> 3
Ser Gly Leu Ile Phe Asp Tyr Trp Leu Asp
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 L38-A12
<400> 4
Ser Gly Leu Ile Ile Asp Ala Leu Ser Pro
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 L38-G7
<400> 5
Thr Ser Leu Met Ser Ile Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 L39-D11
<400> 6
Ser Gly Leu Leu Phe Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 E1-37-E7
<400> 7
Ser Gly Leu Ile Asn Leu Gly Met His Pro
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 M1_3-82
<400> 8
Ser Gly Leu Ile Phe Asp Ala Leu Arg Asp
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 Ln4p-23
<400> 9
Ser Gly Leu Ile Phe Asp Lys Leu Thr Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 Ln4p-28
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Ser Gly Leu Ile Asn Leu His Phe Asp Thr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 Ln4p-50
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Ser Thr His Phe Ser Ala Tyr Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 Ln4p-65
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Ser Gly Leu Ile Met Asp Lys Leu Asp Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 Ln4p-90
<400> 13
Ser Gly Leu Ile Ile Asp Asn Leu Asn Pro
1 5 10
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1 7B1-502
<400> 14
Asp Tyr Leu Leu His
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2 7B1-502
<400> 15
Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1 5-306
<400> 16
Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile Leu Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2 5-306
<400> 17
Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L3 5-306
<400> 18
Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg Thr
1 5
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL 5-306* L-version
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = 7A-701
<400> 20
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Gly Leu Ile Ala Asn His Met Thr Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = 7B1-502*
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Thr Thr Leu Ile Ser Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = 3077*
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = L38-A1
<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Phe Asp Tyr Trp Leu Asp Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = L38-A12
<400> 24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Ile Asp Ala Leu Ser Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = L38-G7
<400> 25
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Thr Ser Leu Met Ser Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = L39-D11
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Gly Leu Leu Phe Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = E1-37-E7
<400> 27
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Asn Leu Gly Met His Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = M1_3-82
<400> 28
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Phe Asp Ala Leu Arg Asp Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = Ln4p-23
<400> 29
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Phe Asp Lys Leu Thr Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = Ln4p-28
<400> 30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Asn Leu His Phe Asp Thr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = Ln4p-50
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Thr His Phe Ser Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = Ln4p-65
<400> 32
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Met Asp Lys Leu Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH = Ln4p-90
<400> 33
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Ile Asp Asn Leu Asn Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Light Chain 5-306* L-version
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 35
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = 7B1-502*
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Thr Thr Leu Ile Ser Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 36
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 =7A-701*
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Gly Leu Ile Ala Asn His Met Thr Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 37
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = L38-A1*
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Phe Asp Tyr Trp Leu Asp Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 38
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = L38-A12*
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Ile Asp Ala Leu Ser Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 39
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = L38-G7*
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Thr Ser Leu Met Ser Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 40
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = L39-D11*
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Gly Leu Leu Phe Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 41
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = E1-37-E7*
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Asn Leu Gly Met His Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 42
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = M1_3-82*
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Phe Asp Ala Leu Arg Asp Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 43
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = Ln4p-23*
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Phe Asp Lys Leu Thr Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 44
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = Ln4p-28*
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Asn Leu His Phe Asp Thr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 45
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = Ln4p-50*
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Thr His Phe Ser Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 46
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = Ln4p-65*
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Met Asp Lys Leu Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 47
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = Ln4p-90*
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Leu Ile Ile Asp Asn Leu Asn Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 48
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的重链 = 3077*
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 49
<211> 127
<212> PRT
<213> 人 GM-CSF
<400> 49
Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val
1 5 10 15
Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr
20 25 30
Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp
35 40 45
Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln
50 55 60
Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met
65 70 75 80
Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys
85 90 95
Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp
100 105 110
Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
115 120 125
<210> 50
<211> 127
<212> PRT
<213> 猕猴 GM-CSF
<400> 50
Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Gly Thr Gln Pro Trp Glu His Val
1 5 10 15
Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr
20 25 30
Ala Ala Glu Met Asn Lys Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe Asp
35 40 45
Leu Gln Glu Pro Ser Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln
50 55 60
Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met
65 70 75 80
Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys
85 90 95
Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Gln Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp
100 105 110
Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
115 120 125
<210> 51
<211> 127
<212> PRT
<213> 长臂猿 GM-CSF
<400> 51
Ala Pro Ser Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val
1 5 10 15
Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr
20 25 30
Ala Ala Glu Ile Asn Glu Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe Asp
35 40 45
Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln
50 55 60
Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met
65 70 75 80
Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys
85 90 95
Ala Thr Gln Ile Ile Ile Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp
100 105 110
Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Gly
115 120 125
<210> 52
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH 7B1-502
<400> 52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Thr Thr Leu Ile Ser Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3的VH 3077
<400> 53
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL 5-306
<400> 54
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 55
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL 5-306* V-version
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 3077
<400> 56
Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 127
<212> PRT
<213> 人
<400> 57
Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val
1 5 10 15
Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr
20 25 30
Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp
35 40 45
Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln
50 55 60
Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met
65 70 75 80
Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys
85 90 95
Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp
100 105 110
Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
115 120 125
<210> 58
<211> 127
<212> PRT
<213> 长臂猿
<400> 58
Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val
1 5 10 15
Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr
20 25 30
Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp
35 40 45
Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln
50 55 60
Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met
65 70 75 80
Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys
85 90 95
Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp
100 105 110
Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
115 120 125
<210> 59
<211> 127
<212> PRT
<213> 猕猴
<400> 59
Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Gly Thr Gln Pro Trp Glu His Val
1 5 10 15
Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr
20 25 30
Ala Ala Glu Met Asn Lys Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe Asp
35 40 45
Leu Gln Glu Pro Ser Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln
50 55 60
Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met
65 70 75 80
Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys
85 90 95
Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Gln Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp
100 105 110
Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
115 120 125
<210> 60
<211> 127
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 60
Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Gly Thr Gln Pro Trp Glu His Val
1 5 10 15
Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr
20 25 30
Ala Ala Glu Met Asn Lys Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe Asp
35 40 45
Leu Gln Glu Pro Ser Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln
50 55 60
Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met
65 70 75 80
Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys
85 90 95
Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Gln Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp
100 105 110
Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
115 120 125

Claims (26)

1.一种组合物，其包含浓度为至少约20mg/ml的中和GM-CSF的化合物、张力调节剂、缓冲剂，并且包含表面活性剂、氨基酸、抗氧化剂和/或螯合剂中的一种或多种，其中所述组合物是稳定的。
2.根据权利要求1所述的组合物，其包含所述中和GM-CSF的化合物、所述张力调节剂、所述缓冲剂以及表面活性剂。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述中和GM-CSF的化合物以至少约50mg/ml的浓度存在，所述张力调节剂以约1％(w/v)至约15％(w/v)的浓度存在，所述缓冲剂以约10至约50mM的浓度存在。
4.根据权利要求1至3所述的组合物，其中所述张力调节剂选自甘露醇、山梨醇、蔗糖和/或海藻糖。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂选自组氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐缓冲剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆及其组合中的一种或多种。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述中和GM-CSF的化合物以至少约50mg/ml并低于约200mg/ml的浓度存在，所述张力调节剂以约3％(w/v)至约7％(w/v)的浓度存在，所述缓冲剂以约20mM至约40mM的浓度存在，所述表面活性剂以约0.001％(w/v)至约1％(w/v)的浓度存在。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述pH为约5和约7。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述张力调节剂为山梨醇，所述缓冲剂为组氨酸缓冲剂。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的组合物，其进一步包含抗氧化剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯80。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述聚山梨醇酯80的用量高于CAC。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述聚山梨醇酯80的浓度为约0.01％(w/v)至约0.08％(w/v)。
14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述聚山梨醇酯80与蛋白质的比例为约0.3:1至约0.6:1。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述中和GM-CSF的化合物选自多肽、拟肽、核酸以及小分子。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述多肽为与GM-CSF或GM-CSF受体结合的抗体或其功能片段。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段是人单克隆抗体或其功能片段。
18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含:
i)约50mg/ml至约180mg/ml的中和GM-CSF的化合物，
ii)约5％(w/v)山梨醇，
iii)约30mM L-组氨酸，以及
iv)约0.001％(w/v)至约1％(w/v)表面活性剂，并且
v)pH为约5.8。
19.根据权利要求18所述的组合物，其包含约80mg/ml或150mg/ml的中和GM-CSF的化合物。
20.根据权利要求18或19所述的组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯80。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述聚山梨醇酯80的浓度为约0.01％(w/v)至约0.08％(w/v)。
22.根据权利要求20所述的组合物，其中所述聚山梨醇酯80与蛋白质的比例为约0.3:1至约0.6:1。
23.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其为液体，优选为水性组合物。
24.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其在约2-8℃下稳定至少24个月，或在室温下稳定至少28天。
25.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其被包装在载药注射器中。
26.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于治疗。
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