TW201622702A - 包含ｇｍ－ｃｓｆ中和化合物之液態調配物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於水性調配物，其包含濃度為至少約20mg/ml之中和GM-CSF之化合物、張力改質劑、緩衝劑及以下一或多者：界面活性劑、胺基酸、抗氧化劑及/或螯合劑，其中該組合物為穩定的。鑒於長期儲存，該調配物之成分較佳為提供該中和GM-CSF之化合物之穩定性。在一較佳態樣中，該調配物用於治療，較佳用於治療發炎性及自體免疫病症，較佳包括過敏性及牛皮癬性病症，以及關節炎及哮喘病症。此外，提供一種包含該本發明調配物之套組。

Description

包含GM-CSF中和化合物之液態調配物
本發明係關於穩定液態調配物，其包含中和顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)之化合物。該等調配物之成分較佳對長期儲存及凍融循環提供穩定性。在一較佳態樣中，該等調配物用於治療，較佳用於治療發炎性及自體免疫病症，較佳包括過敏性及牛皮癬性病症，以及關節炎及哮喘病症。此外，提供一種包含本發明調配物之套組。
蛋白質用於藥物、獸醫產品、化妝品及其他消費型產品、食品、飼料、診斷學、工業化學及去污之領域的廣泛範圍之應用中。有時，此類用途已受到蛋白質自身固有或由其中使用其之環境或介質施加之約束的限制。此類約束可導致蛋白質穩定性較差、效能變化或高成本。由於生物技術之出現，有可能生產廣泛多種蛋白質用於治療應用。在其生產之後，蛋白質藥物通常在其使用之前儲存。由於蛋白質一般比「傳統」藥物更大且更複雜，適合於儲存之蛋白質藥物之調配及加工可特別具有挑戰性。對於蛋白質醫藥調配物及製程設計之綜述，參見Carpenter等人(1997),Pharm.Res.14：969-975；Wang(2000),Int.J.Pharmaceutics 203：1-60；及Tang與Pikal(2004),Pharm.Res.21：191-200。
可在蛋白質醫藥生產之設計調配及製程中考慮幾個因素。主要關注的是蛋白質經由任何或所有的製造步驟、運送及處理步驟之穩定 性，該等步驟可包括製備組合物、冷凍、凍乾、乾燥、儲存、運送、復原、凍/融循環及由終端使用者進行的復原後儲存。其他潛在的考慮因素包括製造、處理及分配之簡易性及經濟性；患者投藥之最終產品之組成；及由終端使用者之易用性，包括在復原之後凍乾調配物之溶解性。
液態調配物可滿足某些目標。液態調配物之可能的優點包括製造之簡易性及經濟性及對於終端使用者之便利性。經常地，當長期儲存時，多肽在溶解狀態下不穩定(Manning等人(1989),Pham.Res.6：903-918)。因此，已開發額外加工步驟以允許更長存放期，該等步驟包括乾燥，例如凍乾。凍乾調配物亦可提供某些優點。凍乾之潛在益處包括蛋白質穩定性以及運送及儲存之簡易性及經濟性得到改進。然而，凍乾醫藥組合物對於終端使用者可為不太方便的。
除了選擇基本組合物形式(例如，凍乾、液態、冷凍等)之外，蛋白質調配物之最佳化通常涉及改變調配物之組分及其各別濃度以最大化蛋白質穩定性。各種因素可能影響蛋白質穩定性，包括離子強度、pH、溫度、凍/融循環、剪切力、冷凍、凍乾、乾燥、攪拌及復原。蛋白質不穩定性可由物理降解(例如，變性、聚集或沈澱)或化學降解(例如，脫醯胺、氧化或水解)引起。調配物組分及濃度之最佳化僅基於經驗研究及/或合理方法來克服不穩定性之來源。
有時，在含有多肽、包括水性及凍乾調配物之醫藥組合物之長期儲存中，活性多肽可能由於聚集及/或降解而損失。
因此，用以改進多肽穩定性之典型的實踐可藉由改變調配物內的要素之濃度或藉由添加賦形劑以改質調配物來解決(美國專利第5,580,856號及第6,171,586號及美國專利申請案第US 2003/0202972號、第US 2003/0180287號)。US 5,580,856為揭示諸如天然聚合物、界面活性劑、硫酸化多醣、蛋白質及緩衝劑之試劑的原型專利，可添加該等 試劑以在復水期間或之後穩定乾燥蛋白質。然而，除許多選項以外，美國專利5,580,856不教示何種蛋白質應添加何種穩定劑。因此，雖然熟練的讀者知曉許多選項，其亦將必須找出由US 5,580,856描述之許多選項中的對於其蛋白質之最佳條件。美國專利申請案2003/0202972描述一種抗Her2抗體之穩定凍乾調配物，其中穩定劑為糖、海藻糖或緩衝劑。然而，雖然此等穩定劑可適用於抗體，其不能外推至其他蛋白質。美國專利申請案2003/0180287類似於US 2003/0202972，因為其亦描述一種免疫球蛋白樣蛋白質，亦即含有Fc結構域之蛋白質之穩定溶液。穩定劑可為磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉或檸檬酸鉀、順丁烯二酸、乙酸銨、Tris-緩衝劑、乙酸鹽、二乙醇胺、組胺酸、離胺酸或半胱胺酸。在此等可由熟練的讀者選擇之化學上相異穩定劑中，離胺酸證明是適合的。然而，就如US 2003/0202972，特定穩定劑僅適合於特定蛋白質，此處為含有Fc結構域之蛋白質，且本身不能外推至另一蛋白質。因此，添加劑之使用不能自一特定蛋白質外推至另一不相關蛋白質。實際上，添加劑之使用雖然改進儲存但仍可導致不活化的多肽。另外，在凍乾之情況下，復水步驟可引入藉由例如聚集或變性導致多肽不活化之條件(Hora等人(1992),Pharm.Res.,9：33-36；Liu等人(1991),Biotechnol.Bioeng.,37：177-184)。實際上，多肽之聚集為不希望的，因為其可能導致免疫原性(Cleland等人(1993),Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems,10：307-377；及Robbins等人(1987),Diabetes,36：838-845)。
在醫藥產品之開發及製造期間生物活性之維持視大分子之固有穩定性以及所用的穩定技術而定。存在一系列蛋白質穩定技術；包括將化學「穩定劑」添加至蛋白質之水溶液或懸浮液。舉例而言，美國專利4,297,344揭示藉由添加所選擇之胺基酸使凝血因子II及VIII、抗凝血酶III及纖維蛋白溶酶原相對於熱而穩定。美國專利4,783,441揭示 一種藉由添加表面活性物質使蛋白質穩定之方法。美國專利4,812,557揭示一種使用人類血清白蛋白穩定介白素-2之方法。其中將製劑與低溫保護劑混合且儲存在極低溫度下之凍/融方法為穩定蛋白質之另一選項。然而，並非所有蛋白質將倖免於凍/融循環。用低溫保護劑添加劑冷儲存，通常甘油為又一選項。如美國專利5,098,893中所描述，亦可以玻璃形式進行儲存。在此情況下，將蛋白質溶解於呈非晶形或玻璃態之水可溶或水可膨脹物質中。最廣泛使用的穩定蛋白質之方法為冷凍-乾燥或凍乾。每當足夠的蛋白質穩定性不能在水溶液中實現，凍乾提供最可行的替代方案。凍乾之一個缺點為其需要複雜加工，為費時且昂貴的。另外，若不仔細進行凍乾，則大多數製劑至少部分地藉由技術之冷凍及脫水步驟變性。結果為一部分蛋白質分子之經常不可逆聚集，使調配物不為非經腸投藥可接受的。
一般而言，蛋白質之降解已很好地描述於文獻中，但並未描述中和顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(進一步稱為GM-CSF)之化合物，特定言之多肽及抗GM-CSF抗體之儲存及溶解性。
另外，雖然此項技術中已知蛋白質穩定劑以及允許蛋白質高濃度同時保持穩定之試劑之眾多選項為可獲得的，在本發明之前，並未在此項技術中認識到包含高濃度中和GM-CSF之化合物之調配物可能不穩定且因此需要改進。
在包含蛋白質，諸如抗體(例如單株抗體)之醫藥組合物之製備中，其目的為開發高濃度液態調配物，因為皮下投藥之可能性導致對於患者之更高便利性。然而，存在一般共識：抗體，特定言之單株抗體之高濃度調配物之開發在單株抗體之物理及化學穩定性方面造成嚴重挑戰，諸如增強免疫原性反應之機率以及產生低生物活性之可溶以及不可溶聚集體或粒子之形成增加。
在液態醫藥組合物儲存期間藉由多肽之聚集體或粒子形成可不利 地影響彼多肽之生物活性，導致醫藥組合物之治療功效之損失。此外，當使用輸液系統投與含多肽醫藥組合物時，聚集體或粒子形成可引起其他挑戰，諸如管、膜或泵之堵塞。
此外，已報導抗體之高濃度調配物導致黏度增加，藉此對可製造性及可注射性產生嚴重挑戰。高度黏性調配物難以製造，抽取至注射器中且注射。在操縱黏性調配物中使用力導致過度起泡，可導致活性單株抗體之變性及不活化。
因此，非常需要一種穩定的高濃縮蛋白質醫藥組合物，其包含中和GM-CSF之化合物，例如抗體，且具有適合於諸如在即用裝置中皮下投藥之低及可行的黏度。此外，自患者觀點來看，將非常需要具有室溫穩定的產品。此時，特定言之，不存在在整個藥品存放期中在室溫下儲存為可能的市售抗體調配物。通常，增加的蛋白質聚集發生，導致不可接受地高含量聚集體及蛋白質相關雜質，可能產生免疫原性反應。
顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)，最初識別為造血生長因子，最近已展示為炎症及自體免疫之重要細胞因子。在包括於過敏性及牛皮癬性患者、關節炎及哮喘患者中之各種發炎性部位中量測高含量之GM-CSF mRNA或蛋白質。許多活體內研究已展示在過去幾年，經由中和抗體阻斷GM-CSF可預防或甚至治癒各種炎症模型(包括關節炎實驗性自體免疫腦炎、牛皮癬及肺病模型)中之促發炎性疾病。因此，非常需要具有可獲得的含GM-CSF中和化合物之調配物，特定言之，其為穩定的，含有較高量之GM-CSF中和化合物及/或可經由皮下途徑投與。
因此，本發明之技術挑戰為符合上文所描述之需求。
本發明解決此等需求且因此提供關於調配物以及在患有疾病的個體(將受益於中和GM-CSF之化合物的投藥)之治療中施用此等調配物 之方法及用途之實施例作為技術挑戰之解決方案。此等實施例表徵及描述於本文中，說明於實例中，且反映於申請專利範圍中。
必須注意，如本文中所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。因此，例如提及「抗體」包括一或多種此類不同抗體，且提及「方法」包括提及一般技術者已知之可經修改或取代本文中所描述之方法之等效步驟及方法。
除非另外指示，否則在一系列要素之前的術語「至少」應理解為指系列中之每一要素。僅僅使用常規實驗，熟習此項技術者將辨識或能夠確定本文中所描述之本發明之特定實施例之許多等效物。此類等效物意欲由本發明涵蓋。
在本說明書通篇及隨後申請專利範圍中，除非上下文另外要求，否則詞語「包含(comprise)」及諸如「包含(comprises/comprising)」之變化形式應理解為暗示包括所述整數或步驟或整數或步驟之群，但不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟之群。當在本文中使用時，術語「包含」可經術語「含有」取代或有時當在本文中使用時經術語「具有」取代或可能甚至經由……組成置換。
當在本文中使用時，「由……組成」排除所主張要素中未規定之任何要素、步驟或成分。當在本文中使用時，「基本上由……組成」不排除並不實質上影響技術方案之基本及新穎特徵之材料或步驟。在本文中各情況下，術語「基本上由……組成」及「由……組成」中之任一者可彼此置換。
如本文中所用，多個所述要素之間的聯結術語「及/或」理解為涵蓋單獨及組合選項。舉例而言，當兩個要素藉由「及/或」聯結時，第一選項係指不含第二要素之第一要素之適用性。第二選項係指不含第一要素之第二要素之適用性。第三選項係指第一要素與第二要 素一起之適用性。此等選項中之任一者理解為屬於含義內，且因此滿足如本文中所用之術語「及/或」之要求。一個以上選項之同時發生的適用性亦理解為屬於含義內，且因此滿足如本文中所用之術語「及/或」之要求。
在本說明書之全文中引用幾個文件。本文中所引用之各文件(包括所有專利、專利申請案、科學公開案、製造商之說明書、指南等)，無論上文或下文，均以全文引用的方式併入本文中。在以引用的方式併入之材料與本說明書矛盾或不一致之程度上，本說明書將替代任何此類材料。不應將本文中之任何內容解釋為承認本發明無權先於憑藉先前發明之此類揭示內容。
考慮到提供一種具有高濃度中和GM-CSF之化合物之調配物之目標，本發明人認識到中和GM-CSF之化合物在較高濃度下可為不穩定的且在長時期儲存內亦可為不穩定的。
實際上，存在許多方式，其中中和GM-CSF之化合物，如蛋白質，可為不穩定的。舉例而言，蛋白質不穩定性可由蛋白質聚集或降解引起，且亦由歸因於脫胺基作用、脫醯胺、氧化、二硫鍵斷裂及形成、水解、丁二醯亞胺化、非二硫化物交聯、去糖基化或「酶褐變」(美拉德反應(Maillard reaction))或此等現象之任何組合之化學不穩定性引起；參見例如Wang等人(1999),Int.J.Pharm.185：129-188。此外，物理化學參數，諸如溫度、pH值、表面吸附、鹽、金屬離子、螯合劑、物理力(諸如剪切力)、蛋白質變性劑、非水性溶劑、蛋白質濃度、蛋白質來源及純度、蛋白質態或壓力可影響蛋白質穩定性。
然而，雖然許多因素可影響蛋白質穩定性，亦可採取許多措施來穩定蛋白質。舉例而言，蛋白質可經內部(藉由改變胺基酸)或外部穩定。外部穩定可藉由添加螯合劑、金屬離子、還原劑、聚合物、聚乙二醇/多元醇、血清白蛋白、界面活性劑、糖及多元醇、脂肪酸及磷 脂、胺基酸、緩衝劑等實現；參見例如Wang,Y及Hanson M(1988),J.Parental Sci.& Technology,42,Supplement：4-26；Wang等人(1999),Int.J.Pharm.185：129-188。總之，對於穩定調配物中之GM-CSF中和化合物(諸如抗體)，熟習此項技術者將具有許多可用的選項。
在本發明情況下，本發明人觀測到中和GM-CSF之化合物可展示聚集及/或可能在較高濃度下不溶解。許多不同因素可引起調配物中之蛋白質聚集。典型的純化及儲存程序可使蛋白質調配物暴露於使蛋白質聚集成蛋白質二聚體、三聚體或多聚體、較大的亞可見粒子及可見粒子之條件及組分。舉例而言，調配物中之蛋白質可由於以下中之任何一者或多者聚集：儲存、暴露於高溫、調配物之pH、調配物之離子強度及某些界面活性劑及乳化劑之存在。類似地，蛋白質可在暴露於剪應力時聚集，諸如復原呈溶解狀態之凍乾蛋白質濾餅、過濾-純化蛋白質樣本、凍融、振盪或經由注射器輸送蛋白質溶液。聚集亦可由於多肽分子在溶液中及在儲存小瓶內的液體-空氣界面處之相互作用而發生。在運輸期間由攪拌造成的界面之壓縮或延伸期間吸附至空氣-液體界面及固體-液體界面之多肽可能發生構形變化。此類攪拌可使調配物之蛋白質聚集且最終與其他吸附蛋白質沈澱。亞可見粒子之生長可指示形成可見粒子之傾向。一般而言，不同類型之聚集體及粒子之形成可藉由基於聚集體或粒子之尺寸之不同量測系統分析。舉例而言，SEC、DLS、AUC量測奈米尺寸範圍內之二聚體、三聚體、多聚體；光遮蔽、顯微鏡、動態成像、流動式細胞測量術及庫爾特(Coulter)量測大於1μm之亞可見粒子及較小可見粒子。
另外，使蛋白質調配物暴露於光可使蛋白質聚集。本發明因此提供使高濃度中和GM-CSF之化合物成為可能及減少此等化合物之聚集之調配物。在不受理論束縛的情況下，聚集之減少被認為藉由控制上文所提及之聚集機制中之一或多者實現。此可導致例如改進的產品穩 定性及製造方法及儲存條件之較大靈活性。
本發明人旨在提供一種具有高濃度中和GM-CSF之化合物之調配物，以便例如實現適合於減少副作用(如歸因於高注射體積之疼痛)或允許以低量進行皮下投藥之較低注射體積。
既然如此，本發明人已在其研究期間觀測到中和GM-CSF之化合物之一定不穩定性，且因此，旨在改進此不希望的觀測結果。因此，其旨在使中和GM-CSF之化合物濃縮同時保持其呈溶解狀態，亦即在溶解階段中。在此情況下，其具有眾多可用的選項及替代物，然而，無任何指示為其中任一者將適合於解決目標問題。
「溶解階段」意謂濃度較佳為至少約20mg/ml之中和GM-CSF之化合物呈溶解狀態，亦即，直接溶解及/或分散於調配物之水溶液(亦即，在水相中)中。較佳地，中和GM-CSF之化合物為均質地溶解及/或分散的。均質地意謂溶解及/或分散於水性調配物中之中和GM-CSF之化合物幾乎均勻、較佳均勻地分佈於水性調配物中，使得中和GM-CSF之化合物之濃度(「c」)(在莫耳質量之情況下為「n」，或在質量之情況下為「m」)在(或在整個)水溶液體積(「v」)中幾乎相同、較佳相同，亦即，c=n/v或c=m/v，分別為幾乎恆定、較佳恆定的。較佳地，在調配物內不存在濃度梯度。
因此，包含中和GM-CSF之化合物的本發明之穩定調配物可較佳視為水溶液，其中中和GM-CSF之化合物直接溶解及/或分散於其中。
「溶液」為兩種或兩種以上物質/組分之均質混合物。在此類混合物中，溶質(在本發明中為中和GM-CSF之化合物)溶解(如上文所描述)於另一物質(在本發明中較佳為水性調配物)中，亦稱為溶劑。
鑒於上述情況，中和GM-CSF之化合物較佳並未非均質地溶解及/或分散於水溶液中。術語「溶解狀態」亦包括中和GM-CSF之化合物較佳基本上未乳化或更佳完全未乳化於水溶液中。
此外，術語「溶解狀態」包括中和GM-CSF之化合物較佳基本上未囊封及/或截留(較佳小於2%、1%或0.5%的中和GM-CSF之化合物可囊封及/或截留)或更佳完全不囊封及/或截留於例如脂質體、多層脂質體或其類似物中。
因此，本發明之一個較佳實施例為一種含有中和GM-CSF之化合物之液態調配物，其在長時期儲存時為穩定的且不經歷共軛物/聚集體/粒子或片段/降解產物之形成，且該調配物適合於皮下投藥。
具體言之，在測試許多不同的穩定劑之後，本發明人發現若將張力改質劑添加至待儲存之溶液中，則中和GM-CSF之化合物可穩定。張力改質劑之實例包括(但不限於)糖及糖醇。簡單的糖稱為單醣且包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖、甘露糖、乳酮糖、阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、塔羅糖(talose)、阿拉伯糖(arabinose)及來蘇糖(lyxose)。對於本發明，更佳為雙糖，其包括例如蔗糖、麥芽糖、乳糖、異麥芽糖、海藻糖及纖維二糖。糖醇包括山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、赤藻糖醇、麥芽糖醇、木糖醇、聚葡萄糖醇。在一較佳實施例中，糖為非還原糖，諸如蔗糖或海藻糖。非還原糖之特徵在於不存在開鏈結構，因此其不易受氧化-還原反應。因此，一或多種非還原糖，諸如蔗糖或海藻糖，或一或多種糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇，可添加至包含中和GM-CSF之化合物之調配物中。此外，可將非還原糖與糖醇，諸如蔗糖與甘露糖醇、蔗糖與山梨糖醇、海藻糖與甘露糖醇或海藻糖與山梨糖醇之組合添加至溶液中。更佳地，添加糖醇甘露糖醇及/或山梨糖醇，較佳呈其D-形式，最佳將山梨糖醇添加至溶液中。張力改質劑(較佳山梨糖醇)之濃度在約1%與約15%(w/v)之間，較佳在約2%與約10%(w/v)之間，更佳在約3%與約7%(w/v)之間，更佳在約4%與約6%(w/v)之間且最佳為約5%(w/v)。
具體言之，對於長期儲存使呈高濃度之中和GM-CSF之化合物穩定之另一較佳物質為pH在約4與約10之間、較佳在約4與約7之間、更佳在約4與約6之間或在約5與約7之間、甚至更佳在約5.5與約6.5之間且最佳pH為約5.8之緩衝劑系統。緩衝劑較佳可選自組胺酸緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑及檸檬酸鹽緩衝劑。當在本文中提及時，胺基酸意謂為L-胺基酸或D-胺基酸，其中L-胺基較佳。較佳為組胺酸或其鹽；用於緩衝劑系統。較佳地，鹽為氯化物、磷酸鹽、乙酸鹽或硫酸鹽，更佳地，鹽為氯化物。組胺酸緩衝劑系統之pH在約5與約7之間、較佳在約5.5與約6.5之間，更佳地，pH為約或恰好5.8。可藉由使用習知地使用之鹼及酸(較佳NaOH)調整pH，或可使用組胺酸與組胺酸鹽之混合物，使得不需要pH調整。緩衝劑系統、較佳組胺酸緩衝劑系統之濃度在約10mM與約50mM之間，較佳在約20mM與約40mM之間，更佳為約30mM。
另外，本發明人發現若將界面活性劑、胺基酸、抗氧化劑及/或螯合劑中之一或多者添加至待儲存之溶液中，則中和GM-CSF之化合物可穩定。
根據一較佳實施例，以下之組合：緩衝劑系統，較佳組胺酸緩衝劑；張力改質劑，較佳糖醇、更佳甘露糖醇或甚至更佳山梨糖醇；及界面活性劑，較佳聚山梨醇酯20(PS20；TWEEN® 20)、聚山梨醇酯80(PS80；TWEEN® 80)及/或泊洛沙姆(poloxamer)用於在溶液中穩定中和GM-CSF之化合物，以便防止聚集且使調配物對長期儲存及/或一或多個凍/融循環足夠穩定。展示較佳在穩定性方面調配物中具有約6%(w/v)及更高糖醇，較佳山梨糖醇。然而，將調配物之重量莫耳滲透濃度之上限設定為約500mOsm/kg，其仍為高滲的但類似於審批通過產品(Synagis；Lm.administration)之重量莫耳滲透濃度。因此，中和GM-CSF之化合物之最佳穩定性、張力及濃度之間的綜合平衡已發 現如本發明之實例中所描述。糖醇、較佳山梨糖醇之較佳濃度因此在約3%與約7%(w/v)之間，更佳在約4%與約6%(w/v)之間且最佳為約5%(w/v)。
在本發明之一些實施例中，包含中和GM-CSF之化合物之本發明調配物或組合物不含或基本上不含氯化鈉。「基本上不含」意謂氯化鈉之濃度呈或極接近0(零)mM，例如小於約50mM，較佳小於約20mM，更佳小於約10mM，甚至更佳小於約5mM且最佳小於約2mM或甚至小於約1mM。
待儲存、凍/融及/或即用液態調配物中所用之中和GM-CSF之各別化合物之濃度為至少約20mg/ml、較佳至少約50mg/ml、更佳至少約60mg/ml。本發明中使用之濃度為約20mg/ml至約200mg/ml，較佳約40mg/ml至約200mg/ml，更佳約50mg/ml至約180mg/ml，甚至更佳約70mg/ml至約170mg/ml，甚至更佳約75mg/ml至約165mg/ml，且最佳約80mg/ml或約150mg/ml。
所產生的液態調配物之存放期之較佳最小要求為在2℃至8℃下24個月，較佳在2℃至8℃下36個月，更佳在2℃至8℃下48個月，最佳在2℃至8℃下60個月，或在環境溫度(25℃±2℃)下至少28天。
本發明係關於一種穩定調配物，較佳一種穩定液態調配物，其出人意料地允許中和GM-CSF之化合物之長期儲存。此調配物為有用的，部分地因為其對於患者而言更方便使用，因為此調配物之中和GM-CSF之化合物為高度濃縮的以便減少副作用，如歸因於高體積注射之疼痛。
因此，本發明之一個態樣係基於發現包含以下各者之調配物- 中和GM-CSF之化合物，- 緩衝劑系統，其較佳選自組胺酸緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑及/或檸檬酸鹽緩衝劑，較佳pH在5與7之間， - 張力改質劑，其較佳選自非還原糖，諸如蔗糖或海藻糖；或糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇- 及界面活性劑、胺基酸、抗氧化劑及/或螯合劑中之一或多者，較佳為界面活性劑，其較佳選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或泊洛沙姆中之一或多者
對長期儲存及/或凍/融循環及/或剪應力呈現足夠穩定(振盪/攪拌穩定性)。本發明調配物具有許多優於標準緩衝調配物之優點。在一個態樣中，調配物在長期儲存之後展示最少聚集行為而無高蛋白質調配物可能預期之有害作用。根據本發明調配物之其他優點為：中和GM-CSF之化合物之最小斷裂且對中和GM-CSF之化合物在長期儲存期間之生物活性無顯著影響，及組合物之低黏度。
本發明之第一態樣之較佳實施例為以下：根據本發明調配物，其中中和GM-CSF之化合物為多肽、肽模擬物、核酸或小分子。
在一較佳實施例中，中和GM-CSF之化合物(其較佳為多肽且更佳為抗體或其功能片段)結合或特異性結合至GM-CSF或GM-CSF受體。據設想，GM-CSF或GM-CSF受體為動物，包括(但不限於)哺乳動物，諸如實驗室動物(嚙齒動物，諸如大鼠、豚鼠、倉鼠或小鼠；非人類靈長類動物，諸如食蟹獼猴或獼猴)、家養或寵物動物(例如狗或貓)、農場或農業動物(例如牛、綿羊、山羊及豬類動物)及/或人類。較佳地，GM-CSF或GM-CSF受體分別為人類GM-CSF(智人)或人類GM-CSF受體，或分別為非人類靈長類動物GM-CSF或非人類靈長類動物GM-CSF受體。非人類靈長類動物GM-CSF或非人類靈長類動物GM-CSF受體之尤其較佳變體(同系物)包括長臂猿(黑長臂猿(nomascus concolor)，亦稱為西冠長臂猿)及獼猴科之猴(例如獼猴(rhesus monkey/Macaca mulatta)及食蟹獼猴(cynomolgous monkey/Macaca fascicularis))之彼等變體。根據本發明之一尤其較佳實施例，結合至 GM-CSF或GM-CSF受體之化合物(較佳為抗體或其片段)展現上文所提及之人類與至少一種猴物種之間的交叉反應性。舉例而言，抗體或其片段能夠結合至(且中和)人類GM-CSF及食蟹獼猴GM-CSF。此對於欲用於人類個體之治療投藥之抗體分子尤其有利，因為此類抗體在監管部門批准之前通常將必須進行眾多測試，其中某些早期測試涉及非人類動物物種。在執行此類測試中，一般需要使用含有與人類之高度遺傳相似性之物種(例如非人類靈長類動物，諸如食蟹獼猴)作為非人類物種，因為由此獲得之結果一般將高度預測在投與相同分子至人類時可預期之相應結果。然而，此基於動物測試之預測能力至少部分地視分子之可比較性而定，且在可向人類及動物模型投與相同治療分子時由於交叉物種反應性而極高。如在本發明之此實施例中，當抗體分子對人類及另一密切相關物種中之相同抗原具交叉反應性時，可使用相同抗體分子在人類及此密切相關物種中(例如在上文所提及之一種猴物種中)執行測試。此提高測試自身效率以及由自治療觀點來看關於此類抗體在人類、所關注的最終物種中之行為的此類測試提供之預測能力。較佳地，結合至GM-CSF或GM-CSF受體之抗體或其功能片段為單株抗體或其功能片段。此同樣適用於具有中和GM-CSF之化合物之替代實施例，該等化合物不為抗體或不為抗體衍生的。
較佳地，中和GM-CSF之化合物為人類單株抗體或其功能片段。
中和GM-CSF之化合物可為結合至人類及非人類靈長類動物GM-CSF之抗原決定基之抗體或其功能片段。此抗原決定基較佳包含胺基酸23-27(RRLLN)及/或胺基酸65-77(GLR/QGSLTKLKGPL)。胺基酸序列延伸段65-77內位置67處之變化反映一方面，人類及長臂猿GM-CSF(其中位置67為R)，及在另一方面，獼猴科之猴，例如食蟹獼猴及獼猴(其中位置67為Q)之間的此GM-CSF部分之異質性。若抗原決定基包含兩個不相鄰之胺基酸序列延伸段，諸如23-27(RRLLN)及65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL)，則抗原決定基亦可稱為「不連續」抗原決定基。該GM-CSF抗原決定基或該GM-CSF不連續抗原決定基可進一步包含胺基酸28-31(LSRD)、胺基酸32-33(TA)及/或胺基酸21-22(EA)。
人類單株抗體或其功能片段較佳在其重鏈可變區中包含CDR3，CDR3包含選自由SEQ ID NO：1-13及56中所陳述之彼等胺基酸序列組成之群的胺基酸序列；較佳地，重鏈可變區CDR3包含SEQ ID NO：2中所陳述之胺基酸序列。
該等重鏈可變區CDR3序列中之任一者可進一步一起存在於重鏈可變區中，其中重鏈可變區CDR1包含SEQ ID NO：14中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區CDR2包含SEQ ID NO：15中所陳述之胺基酸序列。
另外，人類單株抗體或其功能片段可在其輕鏈可變區中包含CDR1，CDR1包含SEQ ID NO：16中所陳述之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：17中所陳述之胺基酸序列，且CDR3包含SEQ ID NO：18中所陳述之胺基酸序列。
在本發明之一尤其較佳態樣中，人類單株抗體或其功能片段在其輕鏈可變區中包含CDR1，CDR1包含如SEQ ID NO：16中所陳述之胺基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：17中所陳述之胺基酸序列，且CDR3包含如SEQ ID NO：18中所陳述之胺基酸序列；且在其重鏈可變區中包含CDR1，CDR1包含如SEQ ID NO：14中所陳述之胺基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：15中所陳述之胺基酸序列，且CDR3包含選自由SEQ ID NO：1-13及56、最佳SEQ ID NO：2中所陳述之彼等胺基酸序列組成之群的胺基酸序列。
根據一較佳實施例，人類單株抗體或其功能片段在其輕鏈可變區中包含選自由SEQ ID NO：19、54及55中所陳述之彼等胺基酸序列組 成之群的胺基酸序列。根據另一較佳實施例，人類單株抗體或其功能片段在其重鏈可變區中包含選自由SEQ ID NO：20-33、52及53中所陳述之彼等胺基酸序列組成之群的胺基酸序列。人類單株抗體或其功能片段可在又一實施例中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之輕鏈胺基酸序列及/或選自由SEQ ID NO：35-48中之任一者、最佳SEQ ID NO：35中所陳述之彼等重鏈胺基酸序列組成之群的重鏈胺基酸序列。
人類單株抗體或其功能片段可包含一或多個胺基酸序列，其與如SEQ ID NO：1-48及52-56中之任一者中所陳述之各別胺基酸序列、較佳如SEQ ID NO：1-18及56中之任一者中所陳述之各別胺基酸序列及/或如SEQ ID NO：19-48及52-55中之任一者中所陳述之胺基酸序列內的構架區(FR)之胺基酸序列含有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同源性。因此，在一較佳實施例中，人類單株抗體或其功能片段可包含一或多個胺基酸序列，其對於如SEQ ID NO：1-18及56中之任一者中所陳述之各別胺基酸序列含有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同源性。
替代地，在SEQ ID NO：1-18及56中之任一者中所陳述之CDR胺基酸序列中之任一者中，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或10個胺基酸可經取代。較佳地，此類具有取代之CDR仍能夠結合至如本文中所描述之GM-CSF。
替代地或另外，較佳地，人類單株抗體或其功能片段可包含一或多個胺基酸序列，其與如SEQ ID NO：19-48及52-55中之任一者中所陳述之VH、VL、H或L區之各別胺基酸序列分別含有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同源性。較佳地，同源性在整個VH、VL、H或L胺基酸序列內。更佳地，同源性在如前所描述之CDR內或同源性在如SEQ ID NO：19-48及52-55中之任一者中所陳述之此類VH、VL、H或L區之FR(或非CDR)內。因此，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸可在各FR中經取代。此類FR取代變體仍能夠結合至如本文中所描述之GM-CSF。
熟習此項技術者可易於識別SEQ ID NO：19-48及52-55內之FR(或非CDR)，因為SEQ ID NO：1-18及56展示SEQ ID NO：19-48及52-55中所示之VH、VL、H或L序列中之一或多者中所包含的CDR序列。即，序列表在序列識別符<223>中提供各胺基酸序列之名稱。相同名稱指示此等胺基酸序列「屬於」一起，意謂CDR含於VH、VL、H或L區中，例如，SEQ ID NO：16、17、18為SEQ ID NO：19中所示之胺基酸序列中所含有之CDR胺基酸序列(因為其全部命名為「5-306」)。
藉助於進一步說明，若胺基酸在重鏈及/或輕鏈之CDR或FR之一或多者或全部中經取代，則較佳地，接著所得之「經取代」序列與「原始」CDR或FR序列至少70%、更佳80%、甚至更佳90%、尤其較佳95%、更特定言之較佳98%或99%相同。此意謂其視CDR或FR之長度達到其與「經取代」序列同源之程度而定。
同源性藉由標準序列比對程式，諸如Vector NTI(InforMaxTM，Maryland，USA)，或更佳藉由程式BLASTP，較佳blastp 2.2.5版本來確定(2002年11月16日；參見Altschul,S.F.等人(1997)Nucl.Acids Res. 25,3389-3402)。同源性百分比係基於使用CDR、VH、VL、H或L胺基酸序列中之任一者作為參考以成對比較進行整個多肽序列(基質：BLOSUM 62；缺口成本：11.1；截止值設定為10-3)之比對。其計算為：指示為BLASTP程式輸出結果之「陽性」(同源胺基酸)數量除以由程式選擇用於比對之胺基酸總數之百分比。
當在本文中使用時，胺基酸或核苷酸序列之同源性可與術語「同一性」互換使用。本發明中使用之術語「同源性」意謂成對相同殘基-在本發明之一連串胺基酸序列或核苷酸序列與所討論之序列之同源 性比對之後-相對於此兩個序列之較長者中的殘基數之百分比。如上文所描述，用於確定同源性(或同一性)之程式基於胺基酸對胺基酸比較經比對之序列，且可設定為各種水準之嚴格性用於比較(例如相同胺基酸、保守胺基酸取代等)。如該術語在本文中使用，若所討論之兩個胺基酸各屬於相同化學類別，亦即為酸性、非極性/疏水性、不帶電極性及鹼性，則其視為彼此「保守取代」。藉助於非限制性實例，屬於非極性胺基酸類別之兩個不同胺基酸將視為彼此「保守取代」，即使此兩個胺基酸不相同，然而，一方面非極性胺基酸及另一方面鹼性胺基酸將不視為彼此「保守取代」。Alberts,Johnson,Lewis,Raff,Roberts及Walter之「Molecular Biology of the Cell」，第4版(2002)之圖3.1將胺基酸分組成四個主要組：酸性、非極性、不帶電極性及鹼性。此類分組可用於在本發明之上下文中判定特定胺基酸是否為所討論之另一胺基酸之保守取代之目的。以上所提及之主要組可進一步細分成例如小的非極性及大的非極性胺基酸、大芳族胺基酸等。術語「保守胺基酸取代」亦指示給定的胺基酸殘基之任何胺基酸取代，其中取代殘基在化學上類似於給定殘基之取代殘基，使得未產生多肽功能(例如結合)之實質性降低。
通常將中和GM-CSF之化合物調配為醫藥組合物，用於非經腸，例如靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、局部或皮內投藥至個體，由此皮下投藥較佳。在某些實施例中，醫藥組合物為液態組合物，較佳為水性組合物。
在一個實施例中，中和GM-CSF之化合物在液態醫藥組合物中之濃度為至少20mg/ml、較佳至少約50mg/ml，更佳在待儲存、凍/融及/或即用液態調配物中為至少約60mg/ml。本發明中使用之濃度為約20mg/ml至約200mg/ml，較佳約40mg/ml至約200mg/ml，更佳約50mg/ml至約180mg/ml，甚至更佳約70mg/ml至約170mg/ml，甚至更 佳約75mg/ml至約165mg/ml，且最佳約80mg/ml或約150mg/ml。在一些實施例中，例如當組合物欲用於皮下遞送時，可使用較高濃度之中和GM-CSF之化合物。
如上文所指出，本發明組合物包含緩衝劑。如本文中所用，術語「緩衝劑」係指允許液態調配物抵抗pH變化之添加組合物。在某些實施例中，所添加之緩衝劑允許液態調配物藉由其酸-鹼共軛組分之作用抵抗pH變化。適合緩衝劑之實例包括(但不限於)緩衝組胺酸、乙酸鹽或檸檬酸鹽系統。
如本文中所用之術語「特異性結合(specifically binds)」或諸如「特異性結合(specific binding/binding specifically)」、「特異性結合體」等之相關表述係指GM-CSF中和化合物及較佳(人類)(單株)抗體或其功能片段辨別其靶(例如GM-CSF或GM-CSF受體)與任何其他不同於GM-CSF或GM-CSF受體之潛在抗原之能力達到此程度，使得來自複數個作為潛在結合搭配物之不同抗原，僅GM-CSF/GM-CSF受體結合或顯著結合。在本發明之含義內，當來自複數個同樣可獲得的作為潛在結合搭配物之不同抗原中時，靶「顯著」結合，靶更頻繁地(在動力學意義上)比任何其他不同於靶之抗原結合至少10倍、較佳至少50倍、最佳至少100倍或更大。此類動力學量測可例如使用SPR技術(諸如Biacore儀器)執行。如本文中所用，術語「(特異性)結合至」或諸如「(特異性)辨識」、「導引至」、「與……(特異性)相互作用」及「與……(特異性)反應」之相關術語意謂根據本發明，中和GM-CSF之化合物(例如抗體)展現對其靶(例如，GM-CSF或GM-CSF受體)之明顯親和力，且一般不展現與蛋白質或抗原(前述靶除外)之顯著反應性。「明顯親和力」包括以約10-6M(KD)或更強、諸如10-7M或更強之親和力結合。較佳地，當結合親和力為約10-11M至10-8M、較佳約10-11M至10-9M、更佳約10-11M至10-10M時，結合被視為特異性的。 化合物(例如抗體)是否與靶特異性反應或結合至靶可容易地尤其藉由比較該化合物與其靶蛋白或抗原之反應與該化合物與除其靶以外的蛋白質或抗原之反應來測試。較佳地，根據本發明之化合物基本上不結合或不能夠結合至除GM-CSF或GM-CSF受體以外之蛋白質或抗原。術語「基本上不結合」或「不能夠結合」意謂本發明化合物不展示與除GM-CSF或GM-CSF受體以外之蛋白質或抗原之反應性大於30%，較佳大於20%，更佳大於10%，尤其較佳大於9%、8%、7%、6%或5%。
如本文中所用，「中和(neutralization)」、「中和劑」、「中和(neutralizing)」及其語法上相關變體係指GM-CSF之生物效應之部分或完全衰減。GM-CSF之生物效應之此類部分或完全衰減由GM-CSF介導之過程之修改、中斷及/或廢除造成，GM-CSF介導之過程諸如信號轉導(如體現於例如細胞內信號傳導中)、細胞增殖或可溶物質之釋放、細胞內基因活化之上調或下調，導致例如配位體之表面受體(GM-CSF除外)之表現。如熟習此項技術者理解，存在多個模式判定化合物，例如抗體或其功能片段是否將被歸類為中和劑。作為一實例，此可藉由一般如下執行之標準活體外測試實現：在第一個增殖實驗中，細胞株，已知其增殖程度視GM-CSF活性而定，與一系列具有不同GM-CSF濃度之樣本一起培育，在該培育之後量測細胞株之增殖程度。根據此量測，確定允許細胞之半最大增殖之GM-CSF濃度。接著執行第二個增殖實驗，在一系列樣本中之每一者中採用與第一個增殖實驗中所用之細胞相同數量的細胞，上述確定之GM-CSF濃度，且此次，濃度改變之化合物疑似為GM-CSF之中和劑。再次量測細胞增殖以確定足以引起半最大生長抑制之所分析的化合物之濃度。若所得生長抑制相對於所分析的化合物之濃度之圖為S形形狀，導致細胞增殖隨所分析的化合物之濃度增加而減少，則已實現一定程度之生長抑制，亦即GM-CSF之活性已在一定程度上得到中和。在此情況下，所 討論之化合物可視為本發明意義上之「中和劑」。細胞株(已知其增殖程度視GM-CSF之活性而定)之一個實例為TF-1細胞株，如描述於Kitamura,T.等人(1989).J Cell Physiol 140,323-34中。
如一般技術者理解，細胞增殖程度不為可建立GM-CSF中和能力之唯一參數。舉例而言，信號傳導分子(例如細胞因子)含量(其分泌物含量視GM-CSF而定)之量測可用於識別疑似GM-CSF中和劑(GM-CSF抑制化合物)。
可用於判定所討論之化合物，諸如抗體或其功能片段是否為GM-CSF活性之中和劑之細胞株之其他實例包括AML-193(Lange,B.等人(1987).Blood 70,192-9)；GF-D8(Rambaldi,A.等人(1993).Blood 81,1376-83)；GM/SO(Oez,S.等人(1990).Experimental Hematology 18,1108-11)；MO7E(Avanzi,G.C.等人(1990).Journal of Cellular Physiology 145,458-64)；TALL-103(Valtieri,M.等人(1987).Journal of Immunology 138,4042-50)；及UT-7(Komatsu,N.等人(1991).Cancer Research 51,341-8)。
應理解，符合本發明之GM-CSF之中和可在含有GM-CSF受體之細胞外或在該等細胞內實現。因此，GM-CSF藉由化合物之中和可為抑制或防止GM-CSF結合至其特異性受體或抑制藉由細胞因子結合至其受體誘導之細胞內信號。中和GM-CSF之化合物可例如直接結合至GM-CSF或GM-CSF受體，藉此在兩種情況下均干擾GM-CSF之生物效應。
如本文中上文所定義，GM-CSF之抑制劑可選自由多肽、肽模擬物、核酸分子及小分子組成之群。
如本文中所用之術語「多肽」描述一組分子，其通常由經由共價肽鍵彼此偶合之至少30個胺基酸組成。根據本發明，該組多肽包含由單個多肽或一個以上多肽組成之「蛋白質」。術語「多肽」亦描述蛋 白質片段，只要此等片段由至少30個胺基酸組成即可。此項技術中熟知多肽可形成多聚體，諸如二聚體、三聚體及高級寡聚物，亦即由一個以上多肽分子組成。此類多聚體亦包括於術語「多肽」之定義中。形成此類二聚體、三聚體等之多肽分子可相同或不相同。此類多聚體之相應高階結構因此稱為同源二聚體或異二聚體、同源三聚體或異三聚體等。異多聚體之一實例為抗體分子，其天然存在之形式由兩個相同多肽輕鏈及兩個相同多肽重鏈組成。術語「多肽」及「蛋白質」亦指天然或非天然地修飾之多肽/蛋白質，其中修飾例如藉由如糖基化、乙醯化、磷酸化、形成二硫橋鍵及其類似者之轉譯後修飾或藉由諸如聚乙二醇化(PEGylation)之化學修飾實現。此類修飾在此項技術中為熟知的。
術語「核酸」或「多核苷酸」在本發明之上下文中定義由磷酸、糖及嘌呤與嘧啶鹼基之多個重複單元組成之聚合大分子。此等分子之實施例包括DNA、RNA及PNA。核酸可為單鏈或雙鏈、線性或環狀。核酸之一尤其較佳實施例在本發明之上下文中為適體。核酸適體為已基於其結合其他分子之能力選自隨機庫之DNA或RNA分子。已選擇結合核酸、蛋白質、小有機化合物及甚至全部生物體之適體。其通常由短鏈寡核苷酸、通常50個鹼基或50個以下鹼基組成。
術語「小分子」定義一組分子量小於1000道爾頓、較佳為至多800道爾頓且更佳為300道爾頓至700道爾頓之有機藥物化合物。小分子之分子量上限允許可能快速擴散跨越細胞膜，使得小分子可達到細胞內作用位點。相應小分子可衍生自至少部分隨機化肽庫。根據本發明之適合的小分子庫在此項技術中為熟知的及/或可購自商業經銷商。
術語「肽模擬物」描述經設計以模擬肽之小蛋白質樣鏈。此類型之分子藉由修飾現存肽以便改變分子之特性而人工地衍生。舉例而 言，親本現存肽經修飾以改變分子之穩定性或生物活性。此等修飾包含改變非天然胺基酸之主鏈及合併。
術語「GM-CSF受體」係指GM-CSF之生理細胞表面受體，其在此項技術中描述為α-鏈(CD116)及共同的β(β-c)次單元之異聚體。
中和多肽之一較佳實施例為抗體或其功能片段，更佳為人類抗體或其功能片段。生產抗體之技術在此項技術中為熟知的且描述於例如Harlow及Lane「Antibodies,A Laboratory Manual」,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988及Harlow及Lane「Using Antibodies：A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999中。
術語「抗體」之定義包括諸如單株、嵌合、單鏈、人類化及人類抗體之實施例。除了全長抗體之外，定義亦包括抗體衍生物及抗體片段，尤其如Fab片段。抗體片段或衍生物進一步包含F(ab')2、Fv、scFv片段或單域抗體，諸如包含僅一個可變域(其可為VHH、VH或VL)之域抗體或奈米抗體、單可變域抗體或免疫球蛋白單可變域，其特異性結合獨立於其他V區或域之抗原或抗原決定基；參見例如Harlow及Lane(1988)及(1999)，上述引文；Kontermann及Dübel,Antibody Engineering,Springer,2010年第二版及Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Cambridge University Press 2009。該術語亦包括雙功能抗體或雙親和性重新靶向(DART)抗體。進一步設想為(雙特異性)單鏈雙功能抗體；串聯雙功能抗體(Tandab)；「微型抗體」，由如下結構例示：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2或(scFv-CH3-scFv)2、「Fc DART」及「IgG DART」；多抗體，諸如三功能抗體。免疫球蛋白單可變域不僅涵蓋分離抗體單可變域多肽，且亦涵蓋包含抗體單可變域多肽序列之一或多個單體之較大多肽。
此外，如本文中所用之術語「抗體」亦關於本文中所描述之抗體之衍生物或變體，其顯示與所描述之抗體相同的特異性。「抗體變 體」之實例包括非人類抗體、「親和力成熟」抗體之人類化變體(參見例如Hawkins等人J.Mol.Biol.254,889-896(1992)及Lowman等人，Biochemistry 30,10832-10837(1991))及具有改變的效應功能之抗體突變體(參見例如美國專利5,648,260,Kontermann及Dübel(2010)，上述引文及Little(2009)，上述引文)。
術語「抗體」亦包含不同類別(亦即IgA、IgG、IgM、IgD及IgE)及子類(諸如IgG1、IgG2等)之免疫球蛋白(Ig)。抗體衍生物，其亦屬於本發明之含義中的術語抗體之定義內，包括此類分子之修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化、二硫鍵形成、法尼基化(farnesylation)、羥基化、甲基化或酯化。
抗體之功能片段包括F(ab')2片段、Fab片段、scFv或構築體之結構域，包含單一免疫球蛋白可變域或單域抗體多肽，例如單一重鏈可變域或單一輕鏈可變域，以及如上文中所描述之其他抗體片段。F(ab')2或Fab可經工程改造以最小化或完全移除CH1域與CL域之間發生的分子間二硫化物相互作用。
如本文中所用之術語「人類」抗體應理解為意謂抗體或其功能片段包含人類生殖系抗體譜中所含有之(一種)胺基酸序列。出於本文中定義之目的，若抗體或其片段由此類人類生殖系胺基酸序列組成，亦即若所討論之抗體或其功能片段之胺基酸序列與所表現之人類生殖系胺基酸序列相同，則抗體或其片段可因此視為人類。若抗體或其功能片段由將由於體細胞超突變之壓印僅預期偏離其最接近人類生殖系序列之序列組成，則抗體或其功能片段亦可視為人類。另外，許多非人類哺乳動物，例如嚙齒動物(諸如小鼠及大鼠)之抗體包含一個同樣可預期存在於所表現之人類抗體譜中之VH CDR3胺基酸序列。可預期存在於所表現之人類譜系中之人類或非人類來源之任何此類序列出於本發明之目的將亦視為「人類」。術語「人類抗體」因此包括具有實 質上對應於此項技術中已知之人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體，包括例如由Kabat等人(參見Kabat等人(1991)上述引文)描述之彼等抗體。本發明之人類抗體可例如在CDR且特定言之CDR3中包括未經人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或定點突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變體)。人類抗體可使至少一個、兩個、三個、四個、五個或五個以上位置經未經人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基置換。
非人類及人類抗體或其功能片段較佳為單株。特別難以製備單株人類抗體。相比於鼠類B細胞與永生化細胞株之融合，人類B細胞與永生化細胞株之融合為不可行的。因此，人類單株抗體為克服公認存在於抗體技術領域中之顯著技術障礙之結果。抗體之單株性質使其特別較適合於用作治療劑，因為此類抗體將以可充分表徵且可再現地製成並純化之單一、均質分子種類之形式存在。此等因素導致生物活性可以高水準精確度預測之產品在此類分子將獲得監管部門批准用於人類之治療投藥時極為重要。如本文中所用之術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群體獲得的抗體，亦即包含該群體之個別抗體除可能天然存在的突變體及/或可能存在的少量後轉譯修飾(例如，異構化、醯胺化)之外其他相同。單株抗體針對單一抗原位點具高度特異性。此外，相比於通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之習知(多株)抗體製劑，各單株抗體針對抗原上之單一決定子。除了其特異性之外，單株抗體為有利的，因為其藉由融合瘤培養合成，未受其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體之特徵為自實質上均質之抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，待根據本發明使用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，Nature,256：495(1975)所描述之融合瘤方法製成，或可藉由重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)製成。亦可使用例如 Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中所描述之技術使「單株抗體」與噬菌體抗體庫分離。
尤其較佳為單株抗體或相應功能片段為人類抗體或相應功能片段。在考慮欲用於向人類治療投藥之抗體劑時，非常有利的為抗體為人源。向人類患者投藥之後，人類抗體或其功能片段將最可能不由患者之免疫系統引發強免疫原性反應，亦即將不被辨識為外來的非人類蛋白質。此意謂無宿主、亦即患者抗體將針對治療抗體產生，將以其他方式阻斷治療抗體之活性及/或加快治療抗體自患者身體之消除，因此阻止其發揮其所需治療效果。
根據本發明之一較佳實施例，待用於醫藥目的之人類單株抗體或其功能片段展現人類與至少一種猴物種之間的反應性。相同交叉物種反應性對於所有其他非抗體或非抗體衍生之GM-CSF中和/抑制化合物亦為較佳的。
根據本發明之又一實施例，抗體可為IgG抗體。IgG同型不僅包含負責高度可辨別抗原辨識及結合之重鏈及輕鏈可變抗體區，且亦包含通常存在於「天然地」產生之抗體中且在一些情況下甚至在一或多個位點處經碳水化合物修飾之重及輕抗體多肽鏈恆定區。此類糖基化一般為IgG格式之標誌，且位於包含所謂的已知引發各種活體內效應功能之完整抗體之Fc區之恆定區中。另外，Fc區介導IgG結合至Fc受體，以及促進IgG復位至具有增加的Fc受體存在之位置-例如發炎組織。有利地，IgG抗體為IgG1抗體或IgG4抗體，其格式為較佳的，因為其活體內作用機制特別很好理解及表徵。此尤其為IgG1抗體之情況。
根據本發明之又一實施例，抗體之功能片段可較佳為scFv、單域抗體、Fv、VHH抗體、雙功能抗體、串聯雙功能抗體、Fab、Fab'或 F(ab)2。此等格式一般可分成兩個子類，即由單個多肽鏈組成之彼等格式及包含至少兩個多肽鏈之彼等格式。前者子類之成員包括scFv(包含經由多肽連接子接合至單個多肽鏈之一個VH區及一個VL區)；單域抗體(包含單個抗體可變區)，諸如VHH抗體(包含單個VH區)。後者子類之成員包括Fv(包含一個VH區及一個VL區作為彼此非共價連接之獨立多肽鏈)；雙功能抗體(包含兩個非共價連接之多肽鏈，其中每一者包含兩個抗體可變區-通常每個多肽鏈一個VH及一個VL-兩個多肽鏈配置於頭對尾構形中，因此產生二價抗體分子)；串聯雙功能抗體(雙特異性單鏈Fv抗體，其包含四個共價連接免疫球蛋白可變-VH及VL-兩種不同特異性之區，形成為上文所描述之雙功能抗體兩倍大之均二聚體)；Fab(包含整個抗體輕鏈作為一個多肽鏈，自身包含VL區及整個輕鏈恆定區及作為另一多肽鏈之抗體重鏈之一部分，其包含完整的VH區及一部分重鏈恆定區，該兩個多肽鏈經由鏈間二硫鍵進行分子間連接)；Fab'(如上述Fab，但另外具有包含在抗體重鏈上之還原的二硫鍵)；及F(ab)2(包含兩個Fab'分子，各Fab'分子經由鏈間二硫鍵連接至各另一個Fab'分子)。一般而言，上文所描述類型之功能抗體片段針對例如：手邊特定緊急情況的治療投藥所需抗體之藥物動力學特性方面具有較高訂製靈活性。舉例而言，可能需要減小所投與之抗體之尺寸以便在治療已知血管化差之組織(例如，關節)時增加組織穿透程度。在一些情況下，亦可能需要提高治療抗體自身體消除之速率，一般藉由縮小所投與抗體之尺寸來加快該速率。在本發明之上下文中，抗體片段定義為功能抗體片段，只要該片段維持親本抗體之抗原決定基/靶之特異性結合特徵即可，亦即只要其特異性結合至GM-CSF或GM-CSF受體即可。
本發明之又一實施例，該抗體或其功能片段可呈單價單特異性；多價單特異性，特定言之二價單特異性；或多價多特異性，特定言之 二價雙特異性之形式存在。一般而言，多價單特異性，特定言之二價單特異性抗體，諸如如上文所描述之完整人類IgG，可為其帶來治療優點：藉由親合力效應增強此類抗體執行之中和作用，亦即由相同抗體結合至相同抗原(此處為GM-CSF或GM-CSF受體)之多個分子。上文已描述抗體片段之幾個單價單特異性形式(例如，scFv、Fv、VHH或單域抗體)。抗體之多價多特異性，特定言之二價雙特異性形式可包括完整IgG，其中一個結合臂結合至靈長類動物GM-CSF/GM-CSF受體，而其另一結合臂結合至另一不同於GM-CSF/GM-CSF受體之抗原。又一多價多特異性，特定言之二價雙特異性形式可有利地為人類單鏈雙特異性抗體，亦即重組人類抗體構築體，其包含如上文所描述之藉由如此項技術中一般已知之短插入多肽間隔基連接至一個鄰接多肽鏈之兩個scFv實體(參見例如WO 99/54440關於抗-CD19×抗-CD3雙特異性單鏈抗體)。此處，包含在雙特異性單鏈抗體內之一個雙特異性單鏈抗體的scFv部分將特異性結合如上文所述之GM-CSF/GM-CSF受體，而此雙特異性單鏈抗體之各別其他scFv部分將結合確定為具治療效益之另一抗原。
根據又一實施例，抗體或其功能片段可例如用有機聚合物，例如用一或多個聚乙二醇(「PEG」)及/或聚乙烯吡咯啶酮(「PVP」)分子衍生。如此項技術中已知，此類衍生作用在調變抗體或其功能片段之藥力學特性方面可為有利的。尤其較佳為PEG分子衍生為PEG-順丁烯二醯亞胺，能夠經由半胱胺酸胺基酸之硫氫基以定點方式與抗體或其功能片段共軛。其中，尤其較佳為20kD及/或40kD PEG-順丁烯二醯亞胺，呈分支鏈或直鏈形式。可能尤其有利的為提高較小人類抗GM-CSF抗體片段(諸如scFv片段)之有效分子量，其藉由使後者與一或多個PEG(尤其PEG-順丁烯二醯亞胺)分子偶合來進行。
本發明之抗體亦包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中一部分重 鏈及/或輕鏈與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列相同或同源，而剩餘部分之鏈與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中的相應序列以及此類抗體之片段(只要其展現所需生物活性即可)相同或同源(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))。本文中所關注之嵌合抗體包括「靈長類化」抗體，其包含衍生自非人類靈長類動物(例如，舊世界猴、猿等)之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列。
非人類(例如，鼠類)抗體之「人類化」形式為大多人類序列之嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)，其含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列。在極大程度上，人類化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的高變區(亦為CDR)之殘基經來自諸如具有所需特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠或兔之非人類物種(供體抗體)的高變區之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，如本文中所用之「人類化抗體」亦可包含未在受體抗體抑或供體抗體中發現之殘基。進行此等修飾以進一步優化且最大化抗體效能。人類化抗體最佳亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常人類免疫球蛋白恆定區。進一步細節參見Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature,332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596(1992)。
如本文中所用，胺基酸殘基之編號或人類及非人類靈長類動物GM-CSF之位置係指成熟GM-CSF，亦即GM-CSF不具有其17個胺基酸信號序列(上文所描述之人類及非人類靈長類動物物種中的成熟GM-CSF之總長度為127個胺基酸)。人類GM-CSF及長臂猿GM-CSF之序列為如下： SEQ ID NO：49
某些獼猴科成員，諸如獼猴及食蟹獼猴中之GM-CSF之序列為如下：SEQ ID NO：50
人類GM-CSF之序列亦展示於SEQ ID NO：57中。長臂猿GM-CSF之序列亦展示於SEQ ID NO：58中： (SEQ ID NO：57及58)
某些獼猴科成員，諸如獼猴(SEQ ID NO：59)及食蟹獼猴(SEQ ID NO：60)中之GM-CSF之序列亦為如下： (SEQ ID NO：59及60)
受抗體、較佳人類單株抗體(或其功能片段)束縛之最小抗原決定基，有利地如本文中所描述之不連續抗原決定基，以粗體指示於上文所示之GM-CSF序列中。
根據一較佳實施例，中和GM-CSF之化合物為結合至GM-CSF之抗體(較佳為人類單株抗體)或其功能片段。更佳地其結合至GM-CSF之抗原決定基，該抗原決定基較佳包含胺基酸23-27(RRLLN)及/或胺 基酸65-77(GLR/QGSLTKLKGPL)。此等胺基酸序列延伸段以粗體指示於上述GM-CSF序列中。術語「抗原決定基」係指抗原上之位點或諸如抗體或其功能片段之化合物特異性結合之靶(例如，GM-CSF)。該結合/相互作用亦理解為定義「特異性辨識」。「抗原決定基」可由藉由蛋白質之三級摺疊並列之鄰接胺基酸或非鄰接胺基酸形成。「線性抗原決定基」為其中胺基酸一級序列包含所辨識之抗原決定基之抗原決定基。線性抗原決定基在獨特序列中通常包括至少3個或至少4個、且更通常至少5個或至少6個或至少7個、例如約8至約10個或10個以上胺基酸。在本發明之上下文中，較佳地，GM-CSF抗原決定基為不連續抗原決定基。在抗體結合至兩個序列延伸段23-27及65-77之情況下，抗原決定基可稱為「不連續」。在人類GM-CSF之二級結構中，胺基酸15-35位於螺旋A中而對應於位置65-77之殘基為位於螺旋C與D之間的環結構之一部分。分子摺疊之三維模型顯示此等位點相對於彼此之緊密空間接近(亦參見WO 2006/111353)。如本文中所用，術語「不連續抗原決定基」應理解為給定的多肽鏈內之至少兩個不相鄰胺基酸序列延伸段，此處為成熟人類及非人類靈長類動物GM-CSF，同時且特異性受抗體束縛。根據此定義，此類同時特異性結合可具有呈線性形式之GM-CSF多肽。此處，吾人可想像成熟GM-CSF多肽形成延伸環，在其中一個區中上文以粗體指示之兩個序列例如或多或少以彼此平行且接近之形式排列。在此狀態下，其特異性且同時受抗體片段束縛。根據此定義，上文所指示之成熟GM-CSF之兩個序列延伸段之同時特異性結合亦可呈抗體結合至構形抗原決定基之形式。此處，成熟GM-CSF已形成其三級構形，因為其通常存在於活體內。在此三級構形中，成熟GM-CSF之多肽鏈以一定方式摺疊，以便使上文所指示之兩個序列延伸段例如在成熟摺疊GM-CSF之特定區之外表面上空間接近，其中接著藉助於其在周圍多肽序列之情形下的三維構形 辨識其。
在又一較佳實施例中，GM-CSF之上述抗原決定基或上述不連續抗原決定基進一步包含：●胺基酸28-31(LSRD)，在上述人類及非人類靈長類動物GM-CSF之序列中為斜體；●胺基酸32-33(TA)，在上述人類及非人類靈長類動物GM-CSF之序列中為帶下劃線的；及/或●胺基酸21-22(EA)，在上述人類及非人類靈長類動物GM-CSF之序列中為帶下劃線的。
較佳人類單株抗GM-CSF抗體或其功能片段為如尤其WO2006/111353中所揭示之彼等人類單株抗GM-CSF抗體或其功能片段，WO2006/111353根據所參考之SEQ ID NO 1至48及52至56描繪重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)1至3以及重鏈及輕鏈及全長重鏈及輕鏈之可變區之胺基酸序列。
尤其較佳為抗GM-CSF抗體或其功能片段，其包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：1中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：2中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：3中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：4中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如 SEQ ID NO：5中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：6中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：7中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：8中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：9中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：10中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：11中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：12中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：13中所陳述之重鏈可變區CDR3序列；或包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：56中所陳述之重鏈可變區CDR3序列。
仍更佳地，重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之以上14個組合中之任一者存在於在其輕鏈可變區中進一步包含CDR1、CDR2及CDR3之抗體或其功能片段中，CDR1包含SEQ ID NO：16中所陳述之胺基酸序 列，CDR2包含SEQ ID NO：17中所陳述之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID NO：18中所陳述之胺基酸序列。
尤其較佳抗GM-CSF抗體或其功能片段包含如SEQ ID NO：14中所陳述之重鏈可變區CDR1序列，如SEQ ID NO：15中所陳述之重鏈可變區CDR2序列及如SEQ ID NO：2中所陳述之重鏈可變區CDR3序列，且在其輕鏈可變區中進一步包含CDR1、CDR2及CDR3，CDR1包含SEQ ID NO：16中所陳述之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：17中所陳述之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID NO：18中所陳述之胺基酸序列。此抗GM-CSF抗體為中和GM-CSF之最佳化合物且亦描述於WO 2006/111353中。
根據又一實施例，抗GM-CSF抗體或其功能片段在其輕鏈可變區中包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列。較佳為抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：20中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：21中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：22中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：23中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：24中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：25中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：26中所陳 述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：27中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：28中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：29中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：30中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：31中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：32中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：33中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：52中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.19中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：53中所陳述之胺基酸序列。
根據又一實施例，抗GM-CSF抗體或其功能片段在其輕鏈可變區中包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列。較佳為抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：20中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：21中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基 酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：22中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：23中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：24中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：25中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：26中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：27中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：28中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：29中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：30中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：31中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：32中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：33中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：52中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功 能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.54中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：53中所陳述之胺基酸序列。
根據又一實施例，抗GM-CSF抗體或其功能片段在其輕鏈可變區中包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列。較佳為抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：20中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：21中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：22中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：23中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：24中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：25中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：26中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：27中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：28中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：29中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：30中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：31中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：32中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：33中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：52中所陳述之胺基酸序列；或抗體或其功能片段之輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.55中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區包含如SEQ ID NO：53中所陳述之胺基酸序列。
較佳抗GM-CSF抗體或其功能片段在其輕鏈可變區中包含CDR1、CDR2及CDR3，CDR1包含如SEQ ID NO.16中所陳述之胺基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO.17中所陳述之胺基酸序列且CDR3包含如SEQ ID NO.18中所陳述之胺基酸序列；且在其重鏈可變區中包含CDR1、CDR2及CDR3，CDR1包含如SEQ ID NO.14中所陳述之胺基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO.15中所陳述之胺基酸序列且CDR3包含如SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或56中所陳述之胺基酸序列。
在又一較佳實施例中，抗體在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：35中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：36中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：37中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：38中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：39中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：40中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：41中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：42中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：43中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：44中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：45中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：46中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：47中所陳述之胺基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：48中所陳述之胺基酸序列。在其輕鏈中包含如SEQ ID NO：34中所陳述之胺基酸序列且在其重鏈中包含如SEQ ID NO：35中所陳述之胺基酸序列之抗GM-CSF抗體為中和GM-CSF之最佳化合物且亦描述於WO 2006/111353中。
上述較佳實施例提供抗體分子及/或其功能片段，較佳人類單株抗體分子及/或其功能片段，其作為靈長類動物及人類GM-CSF之活性之中和劑為尤其有利的。根據此等尤其較佳實施例之抗體或其功能片段出於幾個原因為非常有利的。
首先，其辨識靈長類動物及人類GM-CSF具有高特異性。換言 之，自靈長類動物GM-CSF與其他靈長類動物群落刺激因子(例如靈長類動物G-CSF及M-CSF)之混合物，高度辨別靈長類動物GM-CSF之根據此等尤其較佳實施例之結合分子，然而未辨識相同環境下之其他群落刺激因子。細節上作必要修改後同樣適用於人類GM-CSF。此意謂根據此等實施例之抗體或其功能片段，在向人類投與時，將預期特異性結合至且中和僅所需靶，然而其他不希望的靶不結合亦不中和。最終，此導致關於活體內治療作用模式之高度可預測性。
其次，根據此等尤其較佳實施例之結合體以明顯親和力結合至靈長類動物及人類GM-CSF。「明顯親和力」包括以約10-6M(KD)或更強親和力結合。較佳地，當結合親和力為約10-12M至10-8M、10-12M至10-9M、10-12M至10-10M、10-11M至10-8M，較佳約10-11M至10-9M時，結合被視為明顯(或高或特異性)的。因此，本發明之結合體較佳具有彼範圍內之KD。鑒於事實為已觀測到本文中所描述之抗體分子之KD值自約4×10-9M降至低至約0.04×10-9M，後者對應於約40pM，較佳地，本發明之抗體分子具有彼範圍內之KD。然而，亦較佳地，本發明之抗體分子具有如上文中所描述之KD。由於此類分子在水性介質中之動力學接通速率很大程度上為擴散控制的且因此不能提高至超出局部擴散條件將在生理條件下允許之速率，低KD主要由於動力學解離速率k 解離產生，最高親和力抗體結合體之解離速率為大約10-5s-1。此意謂一旦一方面根據此等實施例中之任一者之人類單株抗體或其功能片段之間的複合物及另一方面GM-CSF形成，其不容易或至少不快速分離。對於欲作為生物活性之中和劑之結合分子，此等特徵為非常有利的，因為所需中和效果通常將持續，僅僅只要生物活性待中和之分子(此處為靈長類動物及人類GM-CSF)仍受中和結合分子束縛即可。因此，仍長時間結合至其預定靶之中和分子將繼續中和相應長時間。
抗體或其功能片段與靈長類動物及人類GM-CSF之高結合親和力具有額外優點。通常，抗體或其功能片段將以尺寸依賴性方式自患者血流消除，其中較小分子在較大分子之前排泄且消除。由於兩個多肽之複合物-抗體或抗體片段及結合GM-CSF-顯然大於單獨的抗體，上文所提及之低k 解離具有以下效果：若治療中和劑不結合至GM-CSF，則其自患者之身體排泄且消除比實際情況更緩慢。因此，不僅中和活性之量值且亦其活體內持續時間增加。
根據上述實施例確定的結合體之中和活性出人意料地高。如以下本文中將更詳細地描述，使用TF-1生長抑制分析活體外量測GM-CSF中和活性(Kitamura,T.等人(1989).J.Cell Physiol.140,323-34)。作為中和潛力之指示，量測IC50值，IC50表示所需用來引發TF-1細胞增殖之半最大抑制之根據此等實施例中之任一者的抗體或其功能片段之濃度。對於以上指定之人類單株抗GM-CSF抗體或其功能片段，確定IC50值為大約3×10-10M或約0.3nM。結合分子因此為靈長類動物及人類GM-CSF活性之非常有效的中和劑。
中和抗GM-CSF抗體之其他實例為Li等人，(2006)PNAS 103(10)：3557-3562中所描述之人類E10抗體及人類G9抗體。E10及G9為IgG類抗體。E10對GM-CSF具有870pM結合親和力且G9對GM-CSF具有14pM親和力。兩種抗體均特異性結合至人類GM-CSF且展示如用TF-1細胞增殖分析評估之強中和活性。其他實例為如WO 2006/122797中所揭示之人類抗GM-CSF抗體。
亦可在本發明中採用為抗GM-CSF受體抗體之GM-CSF拮抗劑或中和劑。此類GM-CSF拮抗劑包括GM-CSF受體α鏈或β鏈之抗體。本發明中所用之抗GM-CSF受體抗體可呈如以上解釋之任何抗體形式，例如，完整、嵌合、單株、多株、抗體片段或衍生物、單鏈、人類化、人改造及其類似形式。適合用於本發明之抗GM-CSF受體抗體， 例如中和高親和力抗體之實例在此項技術中為已知的(參見例如美國專利5,747,032及Nicola等人，Blood 82：15 1724,1993)。
甚至將適合的抗體之其他序列提供於申請案中且以全文引用之方式併入。抗GM-CSF抗體提供於WO2006/122797、WO2007/049472、WO2007/092939、WO2009/134805、WO2009/064399、WO2009/038760中。針對GM-CSF受體之抗體提供於WO2007/110631中。
概言之，抗GM-CSF抗體或其功能片段展現對所需抗原之高度辨別，使此抗原極其緊密地結合且持續長時間，且對其長時間保持結合展現非常有效的中和活性。同時，結合體-抗原複合物之長持久性減緩自身體消除此結合體，藉此延長所需活體內治療效果之持續時間。相同特徵較佳亦適用於辨識GM-CSF受體之抗體，如上文所描述。
根據本發明之組合物較佳為醫藥組合物。根據本發明實施例，術語「醫藥組合物」係關於用於向患者、較佳人類患者投藥之組合物。醫藥組合物或調配物通常呈一定形式以便允許活性成分之生物活性有效且因此可向個體投與以用於如本文中所描述之治療用途。通常，醫藥組合物包含載劑、穩定劑及/或賦形劑之適合(亦即，醫藥學上可接受)調配物。在一較佳實施例中，醫藥組合物為用於非經腸、經皮、腔內、動脈內、鞘內及/或鼻內投藥或直接注射至組織中之組合物。特定言之，設想經由輸液或注射向患者投與該組合物。適合的組合物之投藥可藉由不同方式，例如，藉由靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、局部或皮內投藥實現。本發明組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑。適合醫藥載劑之實例在此項技術中為熟知的且包括緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)、各種類型之潤濕劑、無菌溶液、脂質體等。包含此類載劑之組合物可藉由熟知的習知方法調配。
根據本發明實施例，術語「有效量」係指有效用於治療與GM-CSF相關疾病、如發炎性及自體免疫病症之中和GM-CSF之化合物的 量。
投藥之較佳劑量及較佳方法使得在投藥之後，中和GM-CSF之化合物以有效劑量存在於血液中。投藥計劃表可藉由以下調整：在實驗室測試中觀測疾病條件及分析中和GM-CSF之化合物之血清含量，隨後延長投藥間隔例如自每週兩次或每週一次至每兩週一次、每三週一次、每四週一次及其類似者，或者，相應地減少投藥間隔。
可以適合劑量向個體投與醫藥組合物。給藥方案將由主治醫師及臨床因素確定。如醫學技術中所熟知，對於任何一個患者，劑量視許多因素而定，包括患者之尺寸、體表面積、年齡、待投與之特定化合物、性別、投藥時間及途徑、一般健康狀況及同時投與之其他藥物。
用於非經腸投藥之製劑包括無菌水或非水溶液、懸浮液及乳液。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油之植物油及諸如油酸乙酯之可注射有機酯。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖之彼等電解質補充劑)及其類似物。亦可存在防腐劑及其他添加劑，諸如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及其類似物。另外，根據本發明之醫藥組合物可包含蛋白質載體，例如較佳人源之血清白蛋白或免疫球蛋白。據設想，除了上文所描述之化合物之外，根據本發明之醫藥組合物視醫藥組合物之預定用途而定可包含其他生物活性劑。此類試劑可為作用於胃腸系統之藥物、充當細胞生長抑制劑之藥物、防止血尿酸過多之藥物、抑制免疫反應之藥物(例如皮質類固醇)、調變發炎性反應之藥物、作用於循環系統之藥物及/或諸如此項技術中已知的細胞因子之試劑。
為了分析GM-CSF中和化合物例如在類風濕性關節炎(RA)中之效 果，結果量測可選自例如藥物動力學、免疫原性及改善RA臨床徵象及症狀之潛力(如藉由DAS28、ACR20/50/70及/或EULAR反應標準量測)、滑膜炎之MRI成像及骨水腫以及患者報導之結果。ACR為概述觸痛及腫脹關節數、疼痛分級、患者及醫師評估改進及某些實驗室標記物之改進之量測。ACR 20描述實現臨床徵象及症狀20百分比改善之研究參與者之百分比，例如，觸痛或腫脹關節數為20百分比改善以及三種其他疾病相關標準為20百分比改善。
開發諸如根據本發明之醫藥組合物之藥物的另一主要挑戰為藥物動力學特性之可預測調變。為此目的，建立候選藥物之藥物動力學概況，亦即影響特定藥物治療給定病狀之能力的藥物動力學參數之概況。影響藥物治療一定疾病實體之能力的藥物之藥物動力學參數包括(但不限於)：半衰期、分佈體積、肝首過代謝及血清結合程度。給定藥劑之功效可受上文所提及之參數中之每一者影響。「半衰期」意謂50%投與藥物經由例如代謝、排泄等之生物過程消除之時間。由「肝首過代謝」意謂在藥物首次與肝接觸之後，亦即在其首次穿過肝期間傾向代謝。「分佈體積」意謂藥物在整個身體各種隔室，例如細胞內及細胞外空間、組織及器官等中之保留及藥物在此等隔室內之分佈之程度。「血清結合程度」意謂藥物與血清蛋白(諸如白蛋白)相互作用且結合導致藥物之生物活性降低或損失之傾向。
藥物動力學參數亦包括給定量的投與藥物之生物可用性、滯後時間(Tlag)、Tmax、吸收速率及/或Cmax。「生物可用性」意謂藥物在血液隔室中之量。「滯後時間」意謂藥物投藥與其在血液或血漿中之偵測及可測性之間的時間延遲。「Tmax」為其後達到最大藥物血液濃度之時間，吸收被定義為藥物自投藥位點運動進入全身循環，且「Cmax」為藉由給定藥物最大限度地獲得之血液濃度。達到藥物生物效果所需的藥物之血液或組織濃度之時間受所有參數影響。
如本文中所用之術語「毒性」係指體現在不良事件或嚴重不良事件中之藥物的毒性作用。此等側面事件可指一般缺乏藥物耐受性及/或投藥之後缺乏局部耐受性。毒性亦可包括由藥物引起之致畸或致癌作用。
如本文中所用之術語「安全性」、「活體內安全性」或「耐受性」定義藥物之投藥在投藥之後(局部耐受性)且在較長時期施用藥物期間不直接誘導嚴重不良事件。「安全性」、「活體內安全性」或「耐受性」可在治療期及追蹤期期間例如以規則間隔進行評估。量測包括臨床評估，例如器官表現，及實驗室異常之篩檢。臨床評估可進行且偏向根據NCI-CTC及/或MedDRA標準所記錄/編碼之正常研究結果。器官表現可包括諸如過敏/免疫學、血液/骨髓、心律不整、凝血及其類似者之標準，如闡述於例如通用不良事件術語標準(Common Terminology Criteria for adverse events；CTCAE)3.0版中。可能測試之實驗室參數包括例如血液學、臨床化學、凝血概況及尿液分析及諸如血清、血漿、淋巴或脊髓液、液體及其類似物之其他體液的檢查。因此，安全性可例如藉由物理檢驗、成像技術(亦即超音波、x射線、CT掃描、磁共振成像(MRI)、其他藉由技術裝置之量測(亦即心電圖)、生命徵象藉由量測實驗室參數及記錄不良事件來評估。如本文中所用之術語「有效且無毒劑量」係指中和GM-CSF之化合物、較佳如本文中所定義之抗體之可耐受劑量足夠高用以治癒或穩定所關注之疾病，而無或基本上無主要毒性作用。此類有效且無毒劑量可例如藉由此項技術中描述之劑量遞增研究確定且應低於誘導嚴重不良側面事件之劑量(劑量限制性毒性(dose limiting toxicity；DLT))。
本發明調配物(有時在本文中亦稱為「物質組合物」：「組合物」或「溶液」)較佳可呈各種物理狀態，諸如液態、冷凍、凍乾、冷凍乾燥、噴霧乾燥及復原調配物，其中液態及冷凍較佳。
如本文中所用之「液態調配物」係指發現為液態，特徵在於組成分子在自身之間自由運動但在室溫下無分離傾向之物質的組合物。液態調配物包括水性及非水性液體，其中水性調配物較佳。水性調配物為其中溶劑或主要溶劑為水、較佳注射用水(WFI)之調配物。中和GM-CSF之化合物在調配物中之溶解可為均質或非均質的，其中如上文所描述較佳為均質的。
可採用任何適合的非水性液體，限制條件為其為本發明調配物提供穩定性。較佳地，非水性液體為親水性液體。適合的非水性液體之說明性實例包括：甘油；二甲亞碸(DMSO)；聚二甲基矽氧烷(PMS)；乙二醇，諸如乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(「PEG」)200、PEG 300及PEG 400；及丙二醇，諸如二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇(「PPG」)425及PPG 725。
如本文中所用之「混合水性/非水性液態調配物」係指含有水、較佳WFI與額外液態組合物之混合物之液態調配物。
當在本文中使用時，「調配物」或「組合物」為中和GM-CSF之化合物與藥品所需的其他化學物質及/或添加劑之較佳呈液態之混合物。本發明調配物包括醫藥調配物。
調配物之製備包括其中組合不同化學物質(包括活性藥物)以生產諸如醫藥組合物之最終藥品之方法。本發明調配物之活性藥物為中和GM-CSF之化合物。
在某些實施例中，待調配之中和GM-CSF之化合物為基本上純及/或基本上均質的(亦即，實質上不含污染物質，例如蛋白質等，其可為產品相關及/或製程相關雜質)。術語「基本上純的」意謂組合物包含至少約80%、較佳約90重量%化合物，較佳至少約95重量%化合物，更佳至少約97重量%化合物或最佳至少約98重量%化合物、較佳呈單體狀態之化合物。術語「基本上均質的」意謂排除溶液中之各種 穩定劑及水之質量，組合物包含至少約99重量%化合物、較佳呈單體狀態之化合物。
當在本文中使用時，術語「約」理解為意謂各別值或範圍(諸如pH、濃度、百分比、莫耳濃度、胺基酸數量、時間等)可存在變化，變化可為給定值之至多5%、至多10%、至多15%或至多且包括20%。舉例而言，若調配物包含約5mg/ml化合物，則此理解為意謂調配物可具有在4mg/ml與6mg/ml之間、較佳在4.25mg/ml與5.75mg/ml之間、更佳在4.5mg/ml與5.5mg/ml之間且甚至更佳在4.75mg/ml與5.25mg/ml之間、其中最佳為5mg/ml的化合物。如本文中所用，定義為「(自)X至Y」之區間等於定義為「在X與Y之間」之區間。兩個區間尤其包括上限以及下限。此意謂例如「5mg/ml至10mg/ml」或「在5mg/ml與10mg/ml之間」之區間包括5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml及10mg/ml之濃度以及任何給定的中間值。
「穩定」調配物為如下一種調配物，其中中和GM-CSF之化合物與對照樣本相比在其中在儲存之後基本上保持其物理穩定性及/或化學穩定性及/或生物活性，及/或較佳在視覺檢查顏色及/或透明度或如藉由UV光散射或藉由尺寸排阻層析法量測之後不展示實質性聚集、沈澱、斷裂、降解及/或變性徵象。用於量測蛋白質穩定性之各種其他分析技術為此項技術中可獲得的且綜述於例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中。
如本文中所用之「在儲存期間」意謂調配物一經製備並非立即使用；確切而言，在其製備之後，將其封裝以便以液態形式、冷凍狀態或乾燥形式儲存隨後復原成液態形式或其他形式。
據設想，中和GM-CSF之化合物較佳為穩定的，以至於其在儲存 期間及/或在凍/融期間或之後及/或在剪應力(例如，來自振盪或過濾步驟)期間或之後實質上不形成聚集體或亞可見/可見粒子或片段/降解產品(例如，因為一或多個前述原因)。因此，較佳設想，相對於在儲存開始時或在進行一或多個凍/融循環之前或在進行振盪研究之前中和GM-CSF之化合物的量，不超過10%、更佳不超過8%、甚至更佳不超過5%、尤其較佳不超過2%之中和GM-CSF之化合物形成聚集體、粒子及/或片段。此穩定性較佳適用於以下時間範圍：至少1個月、至少2個月或至少3個月；較佳至少4個月、至少5個月或至少6個月；更佳至少9個月或至少12個月；甚至更佳至少18個月或至少24個月；且最佳至少30個月或至少36個月或至少48個月或至少54個月或至少60個月。較佳儲存溫度條件為高達室溫(約20℃至約25℃)、更佳約2-8℃，最佳時間範圍為至少3年或甚至至少4年。在一些實施例中，中和GM-CSF之化合物在溫熱氣候之室溫(例如約30℃)下為穩定的。根據以上參數在凍/融循環期間化合物較佳為穩定之循環次數為至少一次循環，較佳至少2、3或4次循環，更佳至少5、6或7次循環，且最佳至少8、9或10次循環。根據以上參數(例如在+5℃±3℃溫度下，亦參見實例12d)在例如運送中和GM-CSF之化合物期間的振盪期間化合物較佳為穩定之振盪天數為至少1天，較佳至少2、3或4天，更佳至少5、6或7天，甚至更佳至少8、9、10或11天且最佳至少12、13或14天。
在替代方案中，據設想，中和GM-CSF之化合物較佳為穩定的，以至於其不形成二聚體、寡聚物或片段。換言之，中和GM-CSF之化合物之穩定性可根據單體蛋白質在溶液中之百分比確定，其中降解(例如，片段化)、微粒狀(例如，具有可見及/或亞可見粒子)及/或聚集蛋白質之百分比低。舉例而言，包含GM-CSF中和化合物(諸如抗體)之本發明調配物可包括至少90%、更佳至少92%、甚至更佳至少95%、尤其較佳至少98%且最佳至少99%的中和GM-CSF之化合物之單 體。
「聚集」意謂蛋白質分子之間的物理相互作用，其導致可保持可溶之共價或非共價二聚體或寡聚物(亦即高分子量實體，諸如三聚體或多聚體)形成。「聚集體」亦包括降解及/或片段化蛋白質。聚集體，例如可溶聚集體之尺寸一般小於1μm。
「亞可見粒子」意謂蛋白質分子(包括降解或片段化蛋白質)之物理相互作用導致形成尺寸大於1μm且尺寸至多大約100μm之可逆或不可逆蛋白質粒子。可溶聚集體及/或蛋白質分子(包括降解或片段化蛋白質)可接合以形成亞可見粒子。
「可見粒子」之尺寸通常大於100μm且可為內源蛋白質可見粒子，例如由較小亞可見粒子、聚集體或蛋白質分子(包括降解或片段化蛋白質)形成，或為外源可見粒子，例如包含諸如來自儲存容器或遞送裝置之外來物質。一些來源於組合產物(諸如聚矽氧液滴)之外源或內源粒子為液體而非粒子，但在一些分析中可偵測為粒子。
如本文以上所提及，多種不同分析方法可用於偵測包含中和GM-CSF之化合物之調配物中聚集體之存在及含量。此等方法包括(但不限於)例如天然聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、基質輔助雷射脫附離子化飛行時間質譜分析(MALDI-TOF MS)、毛細管凝膠電泳(CGE)、尺寸排阻層析法(SEC)、分析超速離心(AUC)、場流分級分離法(FFF)、沈降速度、UV光譜法、差示掃描熱量測定法、比濁法、散射測濁法、尺寸排阻-高效液相層析法(SE-HPLC)、反相-高效液相層析法(RP-HPLC)、電噴霧電離串聯質譜分析(ESI-MS)及串聯RP-HPLC/ESI-MS、流場-流分級分離技術及靜態及/或動態光散射。此等方法可單獨或以組合形式使用。較佳地，偵測包含中和GM-CSF之化合物之調配物中聚集體及/或片段之存在及含量之分析方法為尺寸排阻層析法(諸如SE-HPLC)、分 析超速離心及不對稱場流分級分離法。一種測定中和GM-CSF之化合物之生物活性的方法為例如量測其結合至(固定)GM-CSF(或GM-CSF受體)之程度之所謂的表面電漿子共振(SPR)。
包含蛋白質之調配物之常見挑戰為聚集體隨時間、熱或剪應力不可逆累積。通常，當聚集體沈澱時，其形成容易偵測之大粒子。然而，較小、非共價可溶聚集體，其通常為沈澱為大粒子之前驅體，更難以偵測及定量。因此，偵測及定量蛋白質調配物中之蛋白質聚集之方法需要基於所評估的聚集體之種類。
在以上方法中，所提出的確定蛋白質調配物中之可溶、共價聚集體之存在及/或量的方法為：SEC/光散射、SDS-PAGE、CGE、RP-HPLC/ESI-MS、FFF及AUC。所提出的確定蛋白質調配物中之可溶、非共價聚集體之存在及/或量的方法為：SEC、PAGE、SDS-PAGE、CGE、FFF、AUC及動態光散射。所提出的確定蛋白質調配物中之不可溶、非共價聚集體之存在及/或量的方法為：UV光譜法、比濁法、散射測濁法、顯微法、AUC、不對稱場流分級分離法及動態光散射。
亞可見粒子亦可由降解蛋白質、聚集體或更小亞可見粒子形成。所提出的確定亞可見粒子之存在及/或量之方法為：光散射，例如靜態(例如，藉由多角度雷射光散射)或動態(例如，藉由光子關聯光譜法)；奈米粒子追蹤分析(NTA，例如來自Malvern Instruments，Malvern，UK)；光遮蔽；或其他液體粒子計數系統，諸如顯微鏡、動態成像(微流成像，例如Brightwell(Cell Biosciences，Ottawa，CA)或藉由流體成像技術之FLOWCAM®影像粒子分析器(Yarmouth，ME)等)、流動式細胞測量術及電子阻抗(Coulter)計數。
此外，本發明調配物較佳提供改進的長期儲存，使得中和GM-CSF之化合物在以液態或冷凍、較佳液態形式儲存過程中為穩定的。如本文中所用，片語「長期」儲存理解為意謂調配物可儲存至少一個 月，兩個月或三個月或三個月以上，六個月或六個月以上，且較佳一年及一年以上，或甚至2年、3年或4年或5年及5年以上。長期儲存亦理解為意謂醫藥組合物在2-8℃下抑或在環境溫度下(較佳在2-8℃下)儲存，藉此，調配物較佳不失去其生物活性至如本文中所描述之程度及/或不形成聚集體至如本文中所描述之程度及/或包含單體至如本文中所描述之程度。在本文中其他處描述此等特性之測試。
在本發明之一個態樣中，調配物中之中和GM-CSF之化合物以液態形式穩定至少1個月、2個月、3個月；至少4個月、至少5個月；至少6個月；至少12個月；至少24個月；至少36個月；至少48個月、至少60個月。上述時間段中間之範圍亦意欲為本發明之一部分，例如9個月等。另外，意欲包括使用上述值中任一者之組合作為上限及/或下限之數值範圍。較佳地，調配物在室溫(約20℃至25℃)下穩定至少1個月及/或在約2-8℃下穩定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月，或更佳在約2-8℃下穩定至少2年、至少3年、至少4年或甚至至少5年。
穩定性之另一重要態樣為根據本發明之組合物內的中和GM-CSF之化合物在儲存時間期間且在儲存條件(尤其溫度及可能的溫度變化)內維持其生物活性或效力。活性或效力例如藉由化合物自身之中和能力(其可在如上文中所描述基於細胞之分析中量測)或藉由GM-CSF中和化合物結合至GM-CSF或GM-CSF受體之能力反映。結合親和力可藉由SPR或此項技術中熟知之其他方法(例如Biacore或斯卡查德(Scatchard)分析)評估。
本發明調配物藉由例如在水溶液中向如本文中所描述之中和GM-CSF之化合物中添加緩衝劑、張力改質劑及以下一或多者來製備：界面活性劑、胺基酸、抗氧化劑及/或螯合劑，其中界面活性劑為較佳的。一般技術者應理解，將包括於調配物中之各種組分之組合可以任 何適當順序進行。舉例而言，緩衝劑可首先、在中間或最後添加，張力改質劑可首先、在中間或最後添加，且界面活性劑、胺基酸、抗氧化劑及/或螯合劑中之一或多者亦可首先、在中間或最後添加。一般技術者亦應理解，一些此等化學品在某些組合中可為不相容的，且因此，容易經具有類似特性但在相關混合物中相容的不同化學品取代。
在本發明之一較佳態樣中，調配物包含緩衝劑。如本文中所用之術語「緩衝劑(buffer/buffering agent)」包括pH維持在所需範圍內之彼等試劑。緩衝劑為由弱酸與其共軛鹼或弱鹼與其共軛酸之混合物組成之水溶液。其具有以下特性：當添加少量強酸或鹼時，溶液之pH變化極小。緩衝溶液在廣泛多種化學應用中用作將pH保持在幾乎恆定值下之手段。一般而言，緩衝劑在應用於本發明調配物中時較佳使中和GM-CSF之化合物穩定。
當在本文中使用時，「胺基酸緩衝劑」包括例如胺基酸鹼，例如組胺酸及其共軛鹽。胺基酸緩衝劑之一實例為組胺酸/組胺酸氯化物。此實例較佳應用於本發明中。
如本文中所描述之調配物之較佳pH可選自以下範圍：約4至約10，較佳約4至約6或約5至約7，更佳約5.5至約6.5。最佳地，pH為約或恰好5.8。因此，較佳使用可將溶液維持在pH 5至7下之緩衝劑。術語「約」在用於pH值/範圍之上下文中時較佳意謂具有圍繞所引用之值+/-20%範圍之數值。當醫藥組合物之pH設定在或接近生理水準時，患者在投藥之後的舒適性最大化。應理解，pH可視需要調整以最大化特定調配物中之中和GM-CSF之化合物之穩定性及溶解性，且因此，生理範圍之外但較佳患者可耐受之pH在本發明之範疇內。
可用於本文中所描述之調配物中的緩衝劑之非限制性實例包括組胺酸、丁二酸鹽、葡糖酸鹽、檸檬酸鹽、精胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、參(胺基丁三醇)、Bis-Tris、MOPS、ACES、TES、 HEPES、EPPS、乙二胺、磷酸、順丁烯二酸/磷酸鹽、2-嗎啉基乙磺酸(MES)、磷酸鹽、乙酸鹽及二乙醇胺。
較佳緩衝劑為組胺酸、乙酸鹽及檸檬酸鹽緩衝劑。更佳地，組胺酸緩衝劑應用於本發明調配物中，較佳pH在5與7之間，更佳pH在5.5與6.5之間，甚至更佳pH為5.8。應用於本發明中之緩衝劑在此項技術中為熟知的且藉由已知方法製造且可自商業供應商獲得。在一些實施例中，緩衝劑之pH經製備無氫氧化鈉(0mM NaOH)。在一實施例中，緩衝劑為胺基酸與其鹽之混合物，例如組胺酸與組胺酸鹽之混合物，其可以一定比例預先量測，使得在緩衝劑製備期間不需要藉由獨立的酸或鹼調整pH。
在一些實施例中，調配物進一步包含氫氧化鈉(NaOH)。在特定實施例中，調配物包含1-200mM，或小於50mM、小於40mM、小於35mM、小於30mM、小於25mM、小於20mM或小於15mM，例如10mM或10mM以下NaOH，諸如5mM或1mM氫氧化鈉。
除了中和GM-CSF之化合物及緩衝劑之外，根據本發明調配物亦可含有其他物質，包括(但不限於)穩定劑(stabilizing agent/stabilizer)。
因此，在一較佳態樣中，調配物包含亦可充當張力改質劑之穩定劑。術語「穩定劑」係指提高或者增強調配物、特定言之中和GM-CSF之化合物的穩定性之試劑。為張力改質劑之穩定劑可為非還原糖、糖醇或其組合。本發明液態組合物中之張力改質劑確保溶液之張力，亦即容積滲透濃度基本上與正常生理流體相同，且因此防止由於組合物與生理流體之間的差異性離子濃度，組合物之投藥後膨脹或快速吸收。一般而言，如本文中所描述之調配物之性質使得調配物之重量莫耳滲透濃度在約240mOsmol/kg與約500mOsmol/kg之間，更佳在約300mOsmol/kg與約450mOsmol/kg之間，甚至更佳在約350 mOsmol/kg與約450mOsmol/kg之間，最佳為約400mOsmol/kg。
較佳地，穩定劑/張力改質劑可為諸如蔗糖或海藻糖之非還原糖中之一或多者，或為諸如甘露糖醇或山梨糖醇之糖醇中之一或多者，較佳亦為非還原糖與糖醇之組合。在某些實施例中，組合物中之穩定劑/張力改質劑之濃度選自以下範圍：1%至15%(w/v)、2%至10%(w/v)、3%至8%(w/v)、4%至6.5%(w/v)、4.5%至6%(w/v)。在特定實施例中，濃度為約5%至6%(w/v)。應用於本發明調配物中之較佳穩定劑/張力改質劑為山梨糖醇，較佳呈5%(w/v)。
在較佳實施例中，本文中所描述之調配物包含一或多種額外賦形劑。較佳地，賦形劑選自由以下組成之群：界面活性劑、胺基酸、抗氧化劑、螯合劑及其組合。
賦形劑，亦稱為化學添加劑、共溶質或共溶劑，較佳使中和GM-CSF之化合物穩定同時可以溶解狀態(亦以乾燥或冷凍形式)添加至本發明調配物中。較佳地，賦形劑促進中和GM-CSF之化合物之穩定性，但應理解，賦形劑可以其他方式促進調配物之物理、化學及生物特性。賦形劑在此項技術中為熟知的且藉由已知方法製造且可自商業供應商獲得。
較佳賦形劑為界面活性劑。術語「界面活性劑」一般包括使中和GM-CSF之化合物免遭空氣/溶液界面誘導之應力及溶液/表面誘導之應力之彼等試劑。此等界面應力可誘導蛋白質聚集及粒子形成，導致不可接受的產品品質。界面應力之實例可為使蛋白質與以下各者接觸：i)空氣；ii)容器封閉材料，諸如橡膠柱塞、活塞、玻璃、預填充注射器；iii)生產相關材料，諸如鋼罐、管及泵；iv)凍/融期間之冰等。添加界面活性劑至調配物將減少蛋白質與疏水性界面(包括液體/空氣界面、冰/液體界面)之相互作用及蛋白質-蛋白質相互作用。界面活性劑將減少在諸如冷凍、混合、過濾及泵送之操作期間產生的亞可 見及可見粒子之量。
界面活性劑之實例包括(但不限於)非離子界面活性劑，諸如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80(PS80)或聚山梨醇酯20(PS20)(聚山梨醇酯一般亦由ICI Americas商品名TWEEN®已知)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；曲拉通(Triton)；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂基硫酸鈉；鈉辛基醣苷；月桂基-磺基甜菜鹼、肉豆蔻基-磺基甜菜鹼、亞油醇基-磺基甜菜鹼、硬脂醯基-磺基甜菜鹼、月桂基-肌胺酸、肉豆蔻基-肌胺酸、亞油醇基-肌胺酸、硬脂醯基-肌胺酸、亞油醇基-甜菜鹼、肉豆蔻基-甜菜鹼、鯨蠟基-甜菜鹼、月桂醯胺丙基-甜菜鹼、椰油醯胺丙基-甜菜鹼、亞油醇醯胺丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺丙基-甜菜鹼、棕櫚醯胺丙基-甜菜鹼、異硬脂醯胺丙基-甜菜鹼(例如，月桂醯胺丙基)，肉豆蔻醯胺丙基-二甲胺、棕櫚醯胺丙基-二甲胺或異硬脂醯胺丙基-二甲胺；甲基椰油醯基牛磺酸鈉或甲基油烯基牛磺酸二鈉；及Monaquat系列(Mona Industries,Inc.，Paterson，NJ.)、聚乙基乙二醇、聚丙基乙二醇及乙二醇與丙二醇之共聚物(例如，普朗尼克(pluronic)，PF68)。較佳地，本文中所描述之調配物中所用之界面活性劑選自由聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆及其組合組成之群中之一或多者。
所添加的界面活性劑之量使得蛋白質之聚集維持在如使用例如SEC-HPLC分析之可接受的含量下，且亦減少在儲存、製造、凍/融、運送等期間形成的如藉由光遮蔽、基於顯微鏡及動態成像之粒子計數系統(諸如微流成像或FlowCAM)量測之亞可見或可見粒子之量。
在一些實施例中，調配物中之界面活性劑之量基於臨界聚集濃度(CAC)確定。CAC為界面活性劑開始與蛋白質相互作用之濃度。表面張力量測，例如來自張力計，可標繪於圖上以獲得類似於圖7之曲線。在第一個不連續點處之界面活性劑濃度為CAC。在一些實施例 中，調配物中之界面活性劑之量為高於CAC之量。在一些實施例中，界面活性劑之量高於CAC但小於臨界微胞濃度(CMC)。
在較佳實施例中，本發明調配物包含一或多種選自由聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆及其組合組成之群的界面活性劑，對於高達200mg/mL蛋白質濃度，其濃度為約0.001%(w/v)至約1%(w/v)。
在一更佳實施例中，聚山梨醇酯20與蛋白質之比率在約0.01：1至約3：1之間，較佳在約0.05：1至約2：1之間，更佳在約0.1：1與約1.5：1之間，甚至更佳在約0.1：1至約0.8：1之間，且最佳在約0.1：1至約0.2：1之間。對於80mg/mL蛋白質濃度，聚山梨醇酯20濃度在約0.001%(w/v)與約0.2%(w/v)之間，較佳在約0.005%(w/v)與約0.15%(w/v)之間，更佳在約0.007%(w/v)與約0.1%(w/v)之間，甚至更佳在約0.007%(w/v)與約0.06%(w/v)之間，且最佳為約0.01%(w/v)。對於150mg/mL蛋白質濃度，聚山梨醇酯20濃度在約0.001%(w/v)與約0.4%(w/v)之間，較佳在約0.006%(w/v)與約0.25%(w/v)之間，更佳在約0.01%(w/v)與約0.18%(w/v)之間，甚至更佳在約0.01%(w/v)與約0.1%(w/v)之間，且最佳為約0.02%(w/v)。
在另一實施例中，聚山梨醇酯20與蛋白質之比率在約0.3：1至約3：1之間，較佳在約0.5：1至約2.0：1之間，更佳在約0.5：1與約1.5：1之間，甚至更佳在約0.8：1至約1.2：1之間，且最佳為約1：1。對於80mg/mL蛋白質濃度，聚山梨醇酯20濃度在約0.02%(w/v)與約0.2%(w/v)之間，較佳在約0.03%(w/v)與約0.13%(w/v)之間，更佳在約0.05%(w/v)與約0.08%(w/v)之間，且最佳為約0.07%(w/v)。對於150mg/mL蛋白質濃度，聚山梨醇酯20濃度在約0.04%(w/v)與約0.4%(w/v)之間，較佳在約0.06%(w/v)與約0.25%(w/v)之間，更佳在約0.1%(w/v)與約0.15%(w/v)之間，且最佳為約0.13%(w/v)。
在另一更佳實施例中，聚山梨醇酯80與蛋白質之比率在約0.01：1 至約3：1之間，較佳在約0.05：1至約2：1之間，更佳在約0.1：1與約1.5：1之間，甚至更佳在約0.1：1至約0.6：1之間，且最佳在約0.3：1至約0.6：1之間。對於80mg/mL蛋白質濃度，聚山梨醇酯80濃度在約0.001%(w/v)與約0.2%(w/v)之間，較佳在約0.004%(w/v)與約0.14%(w/v)之間，更佳在約0.007%(w/v)與約0.1%(w/v)之間，甚至更佳在約0.007%(w/v)與約0.05%(w/v)之間，且最佳為約0.04%(w/v)。對於150mg/mL蛋白質濃度，聚山梨醇酯80濃度在約0.001%(w/v)與約0.4%(w/v)之間，較佳在約0.007%(w/v)與約0.26%(w/v)之間，更佳在約0.01%(w/v)與約0.2%(w/v)之間，甚至更佳在約0.01%(w/v)與約0.08%(w/v)之間，最佳為約0.04%(w/v)。
在另一實施例中，聚山梨醇酯80與蛋白質之比率在約0.3：1至約3：1之間，較佳在約0.5：1至約2.0：1之間，更佳在約0.5：1與約1.5：1之間，甚至更佳在約0.8：1至約1.2：1之間，且最佳為約1：1。對於80mg/mL蛋白質濃度，聚山梨醇酯80濃度在約0.02%(w/v)與約0.2%(w/v)之間，較佳在約0.04%(w/v)與約0.14%(w/v)之間，更佳在約0.06%(w/v)與約0.09%(w/v)之間，最佳為約0.07%(w/v)。對於150mg/mL蛋白質濃度，聚山梨醇酯80濃度在約0.04%(w/v)與約0.4%(w/v)之間，較佳在約0.06%(w/v)與約0.27%(w/v)之間，更佳在約0.1%(w/v)與約0.16%(w/v)之間，最佳為約0.13%(w/v)。
其他較佳賦形劑可為抗氧化劑或螯合劑。如本文中所用，「抗氧化劑」為能夠減緩或防止其他分子之氧化之分子。氧化為將電子自物質輸送至氧化劑之化學反應。抗氧化劑或螯合劑可用於減少藉由添加諸如聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20之可形成呈溶解狀態之過氧化物之界面活性劑引入的氧化作用。抗氧化劑及/或螯合劑，諸如抗壞血酸(維生素C)、硫辛酸、褪黑激素、尿酸、胡蘿蔔素、視黃醇、生育酚及生育三烯酚(例如α-生育酚(維生素E))、泛醌(輔酶Q)甲硫胺酸、半 胱胺酸、檸檬酸、EDTA或DTPA，可添加至調配物中。更佳地，甲硫胺酸、半胱胺酸或檸檬酸以約3：1至約156：1之抗氧化劑：界面活性劑莫耳比或約1：1至約150：1之抗氧化劑：蛋白質莫耳比添加。更佳地，抗氧化劑：蛋白質比率為約2：1至約100：1，甚至更佳約3：1至約20：1，最佳約3：1至約8：1。
可添加以使調配物中之蛋白質穩定之另一賦形劑為胺基酸。舉例而言，本發明組合物中所用之胺基酸選自由以下組成之群：蘇胺酸、絲胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、麩醯胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、天冬醯胺酸、色胺酸、酪胺酸及其組合。更佳地，胺基酸選自由以下組成之群：精胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸及其組合。
本發明組合物中所用之胺基酸濃度較佳在約10mM至約100mM、更佳約50mM至約100mM之範圍內。
其他賦形劑之實例包括(但不限於)糖/多元醇，諸如：蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麥芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖；聚合物，諸如：血清白蛋白(牛血清白蛋白(BSA)、人類SA或重組HA)、聚葡萄糖、PVA、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙烯亞胺、明膠、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、羥乙基纖維素(HEC)、羥乙基澱粉(HES)；非水性溶劑，諸如：多元醇(例如，PEG、乙二醇及甘油)、二甲基亞碸(DMSO)及二甲基甲醯胺(DMF)；及雜項賦形劑，諸如：磷酸鉀、乙酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、三甲胺N-氧化物、甜菜鹼、金屬離子(例如，鋅、銅、鈣、錳及鎂)、CHAPS、單月桂酸鹽、2-O-β-甘露甘油酸鹽或以上各者之任何組合。
「低溫保護劑」包括在生產、冷凍、儲存、處理、分配、復原或使用期間為冷凍蛋白質提供穩定性之物質。在一特定態樣中，「低溫 保護劑」包括保護蛋白質免受由冷凍過程誘導之應力之物質。低溫保護劑可具有凍乾保護劑作用。低溫保護劑之非限制性實例包括糖，諸如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、甘露糖及乳糖；聚合物，諸如聚葡萄糖、羥乙基澱粉、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)及聚乙二醇；界面活性劑，諸如聚山梨醇酯(例如，PS-20或PS-80)；及胺基酸，諸如甘胺酸、精胺酸、白胺酸及絲胺酸。一般使用在生物系統中展現低毒性之低溫保護劑。
如本文中所描述之雙醣可充當凍乾保護劑或低溫保護劑。「凍乾保護劑」包括防止或降低蛋白質在凍乾及後續儲存之後之化學或物理不穩定性之物質。在一個態樣中，凍乾保護劑在乾燥過程期間自組合物移除水時防止或降低蛋白質之化學或物理不穩定性。在又一態樣中，凍乾保護劑藉由幫助經由氫鍵結維持蛋白質之適當構形使蛋白質穩定。
因此，在一個態樣中，如本文中所描述之雙醣可用來使中和GM-CSF之化合物在冷凍期間穩定。由於冷凍期間之保護可能視雙醣之絕對濃度而定(Carpenter等人，Pharm.Res.(1997),14：969-975，濃度大於5%可為必需的以最大化穩定性。
在一個實施例中，將凍乾保護劑添加至本文中所描述之調配物中。如本文中所用之術語「凍乾保護劑」包括在冷凍-乾燥或脫水過程(一次及二次冷凍-乾燥循環)期間藉由提供非晶形玻璃狀基質及藉由與蛋白質經由氫鍵結結合、置換在乾燥過程期間移除之水分子為蛋白質提供穩定性之試劑。此有助於維持蛋白質構形，在凍乾循環期間最小化蛋白質降解，且提高長期產品穩定性。凍乾保護劑以「凍乾保護量」添加至凍乾前調配物中，其意謂在凍乾保護量之凍乾保護劑存在下凍乾中和GM-CSF之化合物之後，化合物在凍乾及儲存之後基本上保持其物理及化學穩定性及完整性。
凍乾保護劑之非限制性實例包括糖，諸如蔗糖或海藻糖；胺基酸，諸如麩胺酸單鈉、甘胺酸或組胺酸；甲胺，諸如甜菜鹼；易溶鹽，諸如硫酸鎂；多元醇，諸如三元醇或高級糖醇，例如阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇；聚乙二醇；普朗尼克；及其組合。較佳地，凍乾保護劑如上文所描述用於穩定劑。添加至調配物的凍乾保護劑之量一般為在凍乾蛋白質調配物時不導致不可接受的蛋白質降解/聚集程度之量。
又一較佳賦形劑可為膨化劑。如本文中所用之術語「膨化劑」包括提供冷凍-乾燥產品在不直接與醫藥產品相互作用之情況下之結構之試劑。除了提供醫藥學上精緻濾餅之外，膨化劑亦可關於修改塌陷溫度、提供凍融保護及增強蛋白質在長期儲存內之穩定性賦予有用品質。膨化劑之非限制性實例包括甘露糖醇、甘胺酸、乳糖及蔗糖。膨化劑可為結晶(諸如甘胺酸、甘露糖醇或氯化鈉)或非晶形(諸如聚葡萄糖、羥乙基澱粉)且一般以0.5%至10%之量用於蛋白質調配物中。
較佳地，應用於本發明調配物中之膨化劑促進形成在美觀性上可接受、均勻或機械性強之濾餅。膨化劑亦較佳促進開孔結構形成及復原之簡易性及速度。膨化劑亦較佳減少或防止濾餅塌陷、共晶熔化或保留殘餘水分。在另一態樣中，膨化劑較佳幫助保護中和GM-CSF之化合物免於應力(例如，物理及化學應力)且幫助維持蛋白質活性。
在一些實施例中，調配物可視情況含有防腐劑。「防腐劑」為可添加至本文調配物中以降低細菌活性之化合物。防腐劑之添加可例如促進多次使用(多劑量)調配物之生產。潛在的防腐劑之實例包括十八烷基二甲基苄基氯化銨、氯化六羥季銨、氯化苯甲烴銨(烷基苄基二甲基氯化銨之混合物，其中烷基為長鏈化合物)及苄索氯銨。其他類型之防腐劑包括芳族醇(諸如苯酚)、丁醇及苄醇、對羥苯甲酸烷基酯(諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己 醇、3-戊醇及間甲酚。本文中最佳防腐劑為苄醇。
因此，在更佳實施例中，本發明調配物為長期儲存之液態、較佳水性調配物，其包含在約50mg/ml與約200mg/ml之間的中和GM-CSF之化合物及選自由組胺酸、乙酸鹽及檸檬酸鹽組成之群的pH為約5至約7之緩衝劑，且該調配物可另外包含蔗糖、海藻糖、甘露糖醇及/或山梨糖醇中之一或多者作為穩定劑/張力改質劑及選自包含聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80及泊洛沙姆之群的界面活性劑中之一或多者。
在尤其較佳實施例中，本發明調配物為長期儲存之液態、較佳水性調配物，其包含在約50mg/ml與約200mg/ml之間、更佳約80mg/ml或約150mg/ml之中和GM-CSF之化合物及濃度為約20mM至約40mM、更佳約30mM，pH為約5.5至約6.5、更佳5.8之組胺酸緩衝劑，且該調配物可另外包含約4%至約6%、更佳約5%(w/v)山梨糖醇以及濃度為約0.005%(w/v)至約0.5%(w/v)、較佳約0.01%(w/v)至約0.04%(w/v)之聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)。
若聚山梨醇酯20及約80mg/mL蛋白質濃度用於以上較佳調配物中，則聚山梨醇酯20濃度在約0.001%(w/v)與約0.2%(w/v)之間，較佳在約0.007%(w/v)與約0.11%(w/v)之間，更佳在約0.007%(w/v)與約0.06%(w/v)之間，且最佳為約0.01%(w/v)。若所用蛋白質濃度為約150mg/mL，則聚山梨醇酯20濃度在約0.001%(w/v)與約0.4%(w/v)之間，較佳在約0.006%(w/v)與約0.25%(w/v)之間，更佳在約0.01%(w/v)與約0.18%(w/v)之間，甚至更佳在約0.01%(w/v)與約0.1%(w/v)之間，且最佳為約0.02%(w/v)。
在另一實施例中，若聚山梨醇酯20及約80mg/mL蛋白質濃度用於以上較佳調配物中，則聚山梨醇酯20濃度在約0.02%(w/v)與約0.2%(w/v)之間，較佳在約0.03%(w/v)與約0.13%(w/v)之間，更佳在約0.05%(w/v)與約0.08%(w/v)之間，且最佳為約0.07%(w/v)。若所用蛋 白質濃度為約150mg/mL，則聚山梨醇酯20濃度在約0.04%(w/v)與約0.4%(w/v)之間，較佳在約0.06%(w/v)與約0.25%(w/v)之間，更佳在約0.1%(w/v)與約0.15%(w/v)之間，且最佳為約0.13%(w/v)。
若聚山梨醇酯80及約80mg/mL蛋白質濃度用於以上較佳調配物中，則聚山梨醇酯80濃度在約0.001%(w/v)與約0.2%(w/v)之間，較佳在約0.004%(w/v)與約0.14%(w/v)之間，更佳在約0.007%(w/v)與約0.1%(w/v)之間，甚至更佳在約0.007%(w/v)與約0.05%(w/v)之間，且最佳為約0.04%(w/v)。若所用蛋白質濃度為約150mg/mL，則聚山梨醇酯80濃度在約0.001%(w/v)與約0.4%(w/v)之間，較佳在約0.007%(w/v)與約0.26%(w/v)之間，更佳在約0.01%(w/v)與約0.2%(w/v)之間，甚至更佳在約0.01%(w/v)與約0.08%(w/v)之間，且最佳為約0.04%(w/v)。
在另一實施例中，若聚山梨醇酯80及約80mg/mL蛋白質濃度用於以上較佳調配物中，則聚山梨醇酯80濃度在約0.02%(w/v)與約0.2%(w/v)之間，較佳在約0.04%(w/v)與約0.14%(w/v)之間，更佳在約0.06%(w/v)與約0.09%(w/v)之間，最佳為約0.07%(w/v)。若所用蛋白質濃度為約150mg/mL，則聚山梨醇酯80濃度在約0.04%(w/v)與約0.4%(w/v)之間，較佳在約0.06%(w/v)與約0.27%(w/v)之間，更佳在約0.1%(w/v)與約0.16%(w/v)之間，最佳為約0.13%(w/v)。
此外，在一個實施例中，中和抗GM-CSF抗體或其功能片段之本發明調配物包含約80mg/ml至約150mg/ml中和抗體、約5%(w/v)山梨糖醇、約30mM L-組胺酸、約0.02%至約0.04%(w/v)聚山梨醇酯80且pH為約5.8。
此外，在一個實施例中，中和抗GM-CSF抗體或其功能片段之本發明調配物包含約80mg/ml中和抗體、約5%(w/v)山梨糖醇、約30mM L-組胺酸、約0.04%(w/v)聚山梨醇酯80且pH為約5.8。
此外，在一個實施例中，中和抗GM-CSF抗體或其功能片段之本發明調配物包含約150mg/ml中和抗體、約5%(w/v)山梨糖醇、約30mM L-組胺酸、約0.04%(w/v)聚山梨醇酯80且pH為約5.8。
應理解，組合物之某些組分可與此項技術中已知之替代物互換。然而，熟習此項技術者亦應理解，包括某些組分將排除使用其他組分、濃度或製備調配物之方法，原因包括(但不限於)化學相容性、pH、張力及穩定性。
本發明液態調配物具有適合於諸如以即用裝置皮下投藥之低且可行的黏度為有益的。根據本發明調配物之黏度因此在約50[1/sec]與約1000[1/sec]之間的剪切速率下及在約20℃溫度下較佳低於20mPa*s。更佳地，黏度在以上條件下低於15mPa*s。
在一些實施例中，本發明液態調配物之黏度及/或穩定性隨時間維持低注射力。力量測，例如調配物在預填充注射器中之力量測，在諸如具有調適測試機制以固持注射器之附件之INSTRON®通用壓縮測試系統(Norwood，MA)之機器上執行。本文中所描述之調配物藉由手動裝置及自動(例如，機械輔助)裝置提供皮下投藥之可能性。在一實施例中，注射力為滑移力。在一些實施例中，滑移力小於25N。在其他實施例中，滑移力為0-20N、2-15N或4-11N。調配物可維持低注射力之時間為載入注射器中之後至少3個月、至少6個月、至少12個月、3個月、6個月、9個月、12個月、15個月、18個月、24個月、3-6個月、3-9個月、6-9個月、6-12個月、9-15個月、12-18個月、18-30個月或24-36個月。調配物可儲存在例如2-8℃或5℃之冷凍機中或儲存在例如18-25℃或25℃之室溫下。
如本文中所提及，本申請案一般係關於以下發現：添加數種物質至包含中和GM-CSF之化合物之調配物可減少此等化合物在調配物中之聚集及/或降解/斷裂。不管什麼引起中和GM-CSF之化合物在調配 物中聚集或降解，添加如本文中所描述之物質減少中和GM-CSF之化合物在調配物中之聚集/斷裂。在某些實施例中，添加所描述之物質減少例如由儲存、暴露於高溫、暴露於光、暴露於剪應力、pH及離子條件及其任何組合引起的在調配物中之聚集/降解。
本發明人發現之措施可用於減少特定言之以液態及冷凍形式調配之中和GM-CSF之化合物之聚集及/或降解/斷裂。減少的聚集/斷裂因此較佳在液態調配物中觀測到。假定減少的聚集/降解亦可在直接以液態形式儲存以便隨後使用、以冷凍狀態儲存且在使用之前融化或以乾燥形式(諸如凍乾、風乾或噴霧乾燥形式)製備以便隨後在使用之前復原成液態形式或其他形式時觀測到。
因此，據設想，本文中所描述之調配物可藉由熟習此項技術者已知之任何方法儲存。非限制性實例包括冷卻、冷凍、凍乾及噴霧乾燥調配物，其中藉由冷卻儲存為較佳的。
在一些情況下，將蛋白質調配物冷凍儲存。因此，需要調配物在此類條件下，包括在凍融循環下相對穩定。一種確定此調配物適合性之方法為：使調配物樣本經受至少一次，例如一次、三次、五次、七次及至多十次凍融循環(例如藉由在約-80℃±10℃下冷凍隔夜且在室溫下快速融化或在冰上緩慢融化例如6小時)，測定低分子量/削減(LMW)物質及/或高分子量/聚集(HMW)物質在凍融循環之後累積之量，且將其與在凍融程序之前存在於樣本中之LMW物質或HMW物質之量進行比較。LMW或HMW物質之增加指示作為調配物之一部分儲存的蛋白質之穩定性降低。尺寸排阻高效液相層析(SE-HPLC)可用於確定LMW及HMW物質之存在。
較佳地，蛋白質調配物可以液態形式儲存。因此，如本文中所描述，需要液態調配物在此類條件下，包括在各種溫度下穩定。舉例而言，一種確定調配物之適合性之方法為將樣本調配物儲存在數種溫度 (諸如2-8℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃及50℃)下且監測HMW及/或LMW物質隨時間累積之量。HMW及/或LMW物質隨時間累積之量愈小，調配物之儲存條件愈佳。另外，蛋白質之電荷概況可藉由陽離子交換-高效液相層析(CEX-HPLC)監測。替代地，調配物可在凍乾之後儲存。此外，需要調配物在剪應力條件下穩定。一種確定調配物之適合性之方法為在所需溫度(諸如2-8℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃及50℃，較佳+5℃±3℃)下在振盪器(例如垂直振盪器)上搖動受體中之調配物。相對於在相同溫度下未振盪儲存之對照物，受體(例如小瓶)可在振盪器上儲存所需時間段，例如長達14天或更久。可例如在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14天之後進行資料點收集。可確定低分子量(LMW)物質及/或高分子量(HMW)物質在振盪儲存之後累積之量且與存在於未振盪樣本中之LMW物質或HMW物質之量進行比較。LMW或HMW物質之增加指示作為調配物之一部分儲存的蛋白質之穩定性降低。尺寸排阻高效液相層析(SE-HPLC)可用於確定LMW及HMW物質之存在。
在一些情況下，將調配物噴霧乾燥且接著儲存。對於噴霧乾燥，使液態調配物在乾燥氣流存在下霧化。將水自調配物液滴移除至氣流中，導致藥物調配物之乾燥粒子。賦形劑可包括於調配物中以(i)在噴霧乾燥脫水期間保護蛋白質，(ii)在噴霧乾燥之後儲存期間保護蛋白質及/或(iii)產生適合於霧化之溶液特性。方法類似於上文針對冷凍所描述之方法，例外為樣本調配物經噴霧乾燥而非冷凍，在稀釋劑中復原，且測試復原調配物之LMW物質及/或HMW物質之存在。噴霧乾燥樣本與相應未凍乾之樣本調配物相比LMW或HMW物質增加指示噴霧乾燥樣本之穩定性降低。
術語「凍乾」或「冷凍乾燥」包括已經受諸如凍乾之乾燥程序，其中至少90%、較佳95%、最佳98%水分已移除之物質的狀態。因 此，如本文中所用之術語「凍乾」係指待乾燥之材料首先冷凍隨後藉由在真空環境下之昇華移除冰或冷凍溶劑之過程。賦形劑(例如，凍乾保護劑)可包括於待凍乾之調配物中以便增強凍乾產品在儲存之後的穩定性。如本文中所用之術語「復原調配物」係指已藉由將凍乾蛋白質調配物溶解於稀釋劑中使得中和GM-CSF之化合物分散於稀釋劑中而製備之調配物。
如本文中所用之術語「稀釋劑」為醫藥學上可接受(對於向人類投藥安全且無毒)且適用於製備液態調配物(諸如在凍乾之後復原的調配物)之物質。稀釋劑之非限制性實例包括無菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如，磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液或鹽及/或緩衝劑之水溶液。
在本發明之另一態樣中，設想調配物用於治療。因此，本發明設想包含本文中所描述之調配物之醫藥組合物(或藥物)。
在又一實施例中，本發明提供一種治療個體之方法，其包含投與治療有效量之本文中所描述之調配物，其中該個體患有可用中和GM-CSF之化合物有益地治療之疾病或病症。
較佳地，本文中所描述之調配物應用於預防及/或治療可用中和GM-CSF之化合物預防及/或治療及/或改善之疾病。
術語「個體」意欲包括活的生物體。個體之實例包括哺乳動物，例如人類、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、小鼠、兔、大鼠，及轉殖基因非人類動物。在本發明之較佳實施例中，個體為人類。
術語「有效劑量(effective dose/effective dosage)」定義為足以實現或至少部分地實現所需效果之量。術語「治療有效劑量」定義為足以治癒或至少部分地遏止已患有疾病之患者體內之疾病及其併發症之量。對於此用途有效的量將視醫學病狀之嚴重程度及個體之自身免疫系統之一般狀態而定。術語「患者」包括接受預防性或治療性治療之 人類及其他哺乳動物個體。
調配物之適當劑量或治療有效量將視待治療之病狀、病狀在治療之前的嚴重程度及患者之臨床病史及對治療劑之反應而定。適當劑量可根據主治醫師之判斷調整，使得可一次或歷經一系列投藥向患者投與其。醫藥組合物按需要可以單獨治療劑形式或與額外治療劑組合投與。
本發明醫藥組合物特別適用於非經腸投藥，亦即皮下、肌內、靜脈內、關節內及/或滑膜內，其中皮下投藥為較佳的。非經腸投藥可藉由快速注射或連續輸液進行。
注射之醫藥組合物可以單位劑型存在於例如具有所添加之防腐劑之安瓿或多劑量容器中。另外，近期已開發多種藥物遞送方法且本發明醫藥組合物適合於使用此等新方法，例如易充式注射器(Inject-ease)、Genject、注射器筆(諸如Genen)及無針裝置(諸如MediJector及BioJector)來投藥。本發明醫藥組合物亦可適合於尚待發現之投藥方法。亦參見Langer,1990,Science,249：1527-1533。
凍乾醫藥組合物較佳可存在於含有活性成分之小瓶中。在一個實施例中，醫藥組合物另外包含用於重構之溶液。
醫藥組合物可進一步包含額外的醫藥學上可接受之組分。其他醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，諸如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980)中所描述之彼等載劑、賦形劑或穩定劑亦可包括於本文中所描述之蛋白質調配物中，限制條件為其不會不利地影響所需的調配物特徵。如本文中所用，「醫藥學上可接受之載劑」意謂與醫藥投藥相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑。此類介質及試劑用於醫藥學上活性物質之用途在此項技術中為熟知的。可接受的載劑、賦形劑或穩定劑在所用之劑量及濃度下對受體無毒性且包括：張 力改質劑；額外緩衝劑；防腐劑；共溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；螯合劑，諸如EDTA；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質錯合物)；可生物降解聚合物，諸如聚酯；成鹽抗衡離子，諸如鈉、多羥基糖醇；胺基酸，諸如丙胺酸、甘胺酸、天冬醯胺酸、2-苯丙胺酸及蘇胺酸；糖或糖醇，諸如乳糖醇、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌蛋白糖(myoinisitose)、肌蛋白糖醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環多醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，諸如麩胱甘肽、硫辛酸、氫硫乙酸鈉、硫代甘油、[α]-單硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白質，諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；及親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮。
本文中所描述之調配物適用作為有需要之患者治療及/或預防及/或改善疾病或病症之醫藥組合物。術語「治療」係指治療性處理及預防性或防治性措施。治療包括將調配物施用或投藥至來自患有疾病/病症、疾病/病症症狀或易患疾病/病症之患者之身體、分離組織或細胞，目的為治癒、癒合、緩解、減輕、改變、補救、改善、改進或影響疾病、疾病症狀或罹患疾病之傾向。
彼等「需要治療」者包括彼等已經患有病症者以及彼等待預防病症者。術語「病症」為將受益於用本文中所描述之蛋白質調配物治療之任何病狀。此病狀包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患所討論之病症之彼等病理病狀。本文中待治療之病症之非限制性實例包括發炎性及自體免疫病症，較佳包括過敏性及牛皮癬性病症以及關節炎及哮喘病症，例如關節炎、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis；RA)、自體免疫腦炎、牛皮癬、多發性硬化症、肺疾病(諸如哮喘、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease；COPD)及急性呼吸窘迫症候群(Acute Respiratory Distress Syndrome；ARDS))；克羅恩氏病(Crohn's Disease)、特發性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis；IPF)、發炎性腸道疾病(Inflammatory Bowel Disease；IBD)、葡萄膜炎、黃斑變性、結腸炎、瓦勒氏變性(Wallerian Degeneration)、抗磷脂症候群(antiphospholipid syndrome；APS)、急性冠脈症候群、再狹窄、動脈粥樣硬化、復發性多軟骨炎(relapsing polychondritis；RP)、急性或慢性肝炎、失效的矯形外科植入物、絲球體腎炎、狼瘡、異位性皮膚炎及炎症、關節炎及骨關節炎疼痛。
過敏性病症為由過敏或過敏性反應引起之任何病症。過敏為免疫系統之過敏性病症。其發生在人類免疫系統對通常無害外來物質(過敏原)，諸如食品、花粉、黴菌、屋塵、動物皮屑、塵蟎反應或過度反應時。
牛皮癬為主要影響皮膚之自體免疫疾病。由於由免疫系統發出錯誤信號而加速皮膚細胞之生長循環。存在五種類型之牛皮癬：斑狀、點狀、反轉型、膿皰型及紅皮症型。最常見形式斑狀牛皮癬通常出現在表皮(皮膚)之最上第一層上之紅色及白色色調鱗片狀斑。儘管有些患者沒有皮膚病徵象或症狀。該病症為嚴重程度自微小局部斑點變化為整個身體覆蓋之慢性復發病狀。手指甲及腳趾甲經常受影響(牛皮癬性指甲營養不良)且可被視為單獨跡象。牛皮癬亦可導致關節發炎，其稱為牛皮癬性關節炎。
關節炎為涉及一或多個關節之炎症之形式的關節病症。存在超過100種不同形式之關節炎。最常見形式骨關節炎(退化性關節病)為關節創傷、關節感染或年齡之結果。其他關節炎形式為類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎及其他相關自體免疫疾病。敗血性關節炎由關節感染引起。
哮喘為許多細胞及細胞元素起作用之氣管常見慢性發炎性病症。哮喘與導致喘息、咳嗽、胸悶及呼吸短促之反覆性發作之氣管高反應 性相關。此等發作通常與肺內之通常自發地或藉由治療可逆之普遍但可變的氣流堵塞相關。哮喘可根據症狀之頻率、一秒內用力呼氣量及峰值呼氣流動速率來分類。哮喘亦可分類為異位性(外源性)或非異位性(內源性)。
除了中和GM-CSF之化合物之外，本發明醫藥組合物可包含額外的治療劑或生物活性劑。舉例而言，適用於治療特定適應症(諸如骨關節炎)之治療因子(例如，一或多種參與破壞關節軟骨或滑膜組分之抑制劑，其選自(但不限於)抗金屬蛋白酶、週期素化合物、細胞因子拮抗劑、皮質類固醇、TNF抑制劑、IL-抑制劑、抗血管生成物質、聚集蛋白聚糖酶抑制劑、p38激酶抑制劑、細胞凋亡抑制劑、玻尿酸酶抑制劑及蛋白水解酶抑制劑)可存在。控制炎症之因子，包括英利昔單抗(infliximab)、依那西普(etanercerpt)、阿達木單抗(adalimulab)、利莫那班(nerelimonmab)、來那西普(lenercerpt)及其類似物或其組合，亦可為組合物之一部分。亦設想醫藥組合物可包括細胞外基質組分，諸如玻尿酸或其衍生物，包括鹽、酯、內酯及硫酸化衍生物，較佳玻尿酸之偏酯。
在另一實施例中，本發明係關於一種套組(或製品)或容器，其含有本發明調配物。調配物較佳可能已呈液態。然而，替代地，其較佳可能呈凍乾狀態。其亦可呈冷凍、凍乾、冷凍乾燥或噴霧乾燥狀態。因此，若調配物呈液態以外的狀態，則其可由醫師製備為(液態)水性醫藥組合物。舉例而言，調配物可經凍乾且接著將必須復原。因此，套組可進一步包含分別用於復原冷凍、凍乾、冷凍乾燥或噴霧乾燥調配物之裝置及/或用於稀釋調配物之裝置及/或用於投與調配物或醫藥組合物之裝置，諸如注射器、泵、輸液器、針或其類似者。套組可包含一或多個含有本發明調配物之小瓶。套組亦可隨附使用說明書。
因此，提供一種製品，其含有本文中所描述之調配物且較佳提供 其使用說明書。該製品包含適合於含有調配物之容器。適合容器包括(但不限於)瓶子、小瓶(例如，雙室小瓶)、注射器(例如，單室或雙室注射器)、試管、噴霧器、吸入器(例如，計量劑量吸入器或乾粉吸入器)或儲槽。容器可由各種材料，諸如玻璃、金屬或塑膠(例如，聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚烯烴)形成。容器容納調配物，且容器上或與容器相關之標籤可指示復原及/或使用方向。標籤可進一步指示調配物適用於或欲用於皮下投藥。容納調配物之容器可為多次使用的小瓶，其允許重複投藥(例如，2-6次投藥)調配物。製品可進一步包含含適合稀釋劑(例如，WFI、0.9% NaCl、BWFI、磷酸鹽緩衝鹽水)之第二容器。當製品包含凍乾形式之中和GM-CSF之化合物調配物時，稀釋劑與凍乾調配物混合將提供復原調配物中之所需最終蛋白質濃度。製品可進一步包括其他自商業及使用者觀點來看所需之材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有使用說明書之封裝插件。
本發明中亦包括可用於遞送本發明調配物之裝置。此類裝置之實例包括(但不限於)注射器(例如，預填充注射器)、筆、植入物、無針注射裝置、吸入裝置及貼片。
本發明組合物相對於多個態樣，包括由其在例如玻璃預填充注射器及濾筒中使用產生之界面應力為穩定的。已確定橡膠調配物、聚矽氧、鎢及固化劑與蛋白質溶液不利地相互作用，形成聚集體、亞可見及可見粒子。本發明之蛋白質調配物與組分在預填充注射器/濾筒系統(包括其封閉系統)中相容。
本發明進一步藉由圖式及實例說明，該等圖式及實例僅為說明性且並不構成本發明之範疇之限制。
以下各項亦表徵本發明：
1.一種組合物，其包含濃度為至少約20mg/ml之中和GM-CSF之化合物、張力改質劑、緩衝劑及以下一或多者：界面活性劑、胺基酸、抗氧化劑及/或螯合劑，其中該組合物為穩定的。
2.如第1項之組合物，其包含該中和GM-CSF之化合物、該張力改質劑、該緩衝劑及界面活性劑。
3.如第1項或第2項之組合物，其中該中和GM-CSF之化合物以至少約50mg/ml濃度存在，該張力改質劑以約1%至約15%(w/v)濃度 存在且該緩衝劑以約10mM至約50mM濃度存在。
4.如第1項至第3項中任一項之組合物，其中該張力改質劑選自甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖及/或海藻糖。
5.如第1項至第4項中任一項之組合物，其中該緩衝劑選自組胺酸、乙酸鹽及/或檸檬酸鹽緩衝劑。
6.如第1項至第5項中任一項之組合物，其中該界面活性劑選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆及其組合中之一或多者。
7.如第1項至第6項中任一項之組合物，其中該中和GM-CSF之化合物以至少約50mg/ml且小於約200mg/ml之濃度存在，該張力改質劑以約3%至約7%(w/v)濃度存在，該緩衝劑以約20mM至約40mM濃度存在，且該界面活性劑以約0.001%至約1%(w/v)濃度存在。
8.如第1項至第7項中任一項之組合物，其中pH在約5與約7之間。
9.如第1項至第8項中任一項之組合物，其中該張力改質劑為山梨糖醇且該緩衝劑為組胺酸緩衝劑。
10.如第2項至第9項中任一項之組合物，其進一步包含抗氧化劑。
11.如第1項至第10項中任一項之組合物，其中該中和GM-CSF之化合物選自由以下組成之群：多肽、肽模擬物、核酸及小分子。
12.如第11項之組合物，其中該多肽為結合至GM-CSF或該GM-CSF受體之抗體或其功能片段。
13.如第12項之組合物，其中該抗體或其功能片段為人類單株抗體或其功能片段。
14.如第12項或第13項之組合物，其中該抗體為IgG、IgG1或IgG4抗體。
15.如第12項至第14項中任一項之組合物，其中該抗體或其功 能片段結合至GM-CSF之抗原決定基，該抗原決定基較佳包含胺基酸23-27(RRLLN)及/或胺基酸65-77(GLR/QGSLTKLKGPL)。
16.如第15項之組合物，其中該抗原決定基進一步包含：(i)胺基酸28-31(LSRD)；(ii)胺基酸32-33(TA)及/或(iii)胺基酸21-22(EA)。
17.如第15項或第16項之組合物，其中該抗原決定基為不連續抗原決定基。
18.如第12項至第17項中任一項之組合物，其中該抗體或其功能片段在其重鏈可變區中包含CDR3，CDR3包含選自由SEQ ID NO：1-13及56中之任一者中所陳述的彼等胺基酸序列組成之群的胺基酸序列。
19.如第18項之組合物，其中該等重鏈可變區CDR3序列中之任一者一起存在於重鏈可變區中，其中該重鏈可變區CDR1包含SEQ ID NO：14中所陳述之胺基酸序列且重鏈可變區CDR2包含SEQ ID NO：15中所陳述之胺基酸序列。
20.如第12項至第19項中任一項之組合物，其中該抗體或其功能片段在其輕鏈可變區中包含CDR1、CDR2及CDR3，CDR1包含SEQ ID NO：16中所陳述之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：17中所陳述之胺基酸序列，且CDR3包含SEQ ID NO：18中所陳述之胺基酸序列。
21.如第12項至第20項中任一項之組合物，其中該抗體或其功能片段在其輕鏈可變區中包含如SEQ ID NO.19、54及55中之任一者中所陳述之胺基酸序列。
22.如第12項至第21項中任一項之組合物，其中該抗體或其功能片段在其重鏈可變區中包含如SEQ ID NO：20-33、52及53中之任一 者中所陳述之胺基酸序列。
23.如第12項至第22項中任一項之組合物，其中該抗體或其功能片段在其輕鏈可變區中包含CDR1、CDR2及CDR3，CDR1包含如SEQ ID NO.16中所陳述之胺基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO.17中所陳述之胺基酸序列且CDR3包含如SEQ ID NO.18中所陳述之胺基酸序列；且在其重鏈可變區中包含CDR1、CDR2及CDR3，CDR1包含如SEQ ID NO.14中所陳述之胺基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：15中所陳述之胺基酸序列且CDR3包含如SEQ ID NO.1-13及56中之任一者中所陳述之胺基酸序列。
24.如第12項至第23項中任一項之組合物，其中該抗體或其功能片段在其輕鏈可變區中包含CDR1、CDR2及CDR3，CDR1包含如SEQ ID NO.16中所陳述之胺基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO.17中所陳述之胺基酸序列且CDR3包含如SEQ ID NO.18中所陳述之胺基酸序列；且在其重鏈可變區中包含CDR1、CDR2及CDR3，CDR1包含如SEQ ID NO.14中所陳述之胺基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：15中所陳述之胺基酸序列且CDR3包含如SEQ ID NO.2中所陳述之胺基酸序列。
25.如第12項至第24項中任一項之組合物，其中該抗體或其功能片段包含如SEQ ID NO：34中所陳述之輕鏈胺基酸序列及選自由如SEQ ID NO：35-48中之任一者中所陳述之彼等重鏈胺基酸序列組成之群的重鏈胺基酸序列。
26.如第12項至第25項中任一項之組合物，其中該抗體或其功能片段包含如SEQ ID NO：34中所陳述之輕鏈胺基酸序列及如SEQ ID NO：35中所陳述之重鏈胺基酸序列。
27.如第12項至第26項中任一項之組合物，其中該抗體或其功能片段包含與如SEQ ID NO：1-48及52-56中之任一者中所陳述之各別 胺基酸序列、較佳與如SEQ ID NO：1-18及56中之任一者中所陳述之各別胺基酸序列及/或與如SEQ ID NO：19-48及52-55中之任一者中所陳述之胺基酸序列內的構架區之胺基酸序列具有至少70%同源性之胺基酸序列。
28.如前述各項中任一項之組合物，其包含i)約50mg/ml至約180mg/ml之中和GM-CSF之化合物，ii)約5%(w/v)山梨糖醇，iii)約30mM L-組胺酸iv)約0.001%至約1%(w/v)界面活性劑及v)pH為約5.8。
29.如第28項之組合物，其包含約80mg/ml或約150mg/ml之中和GM-CSF之化合物
30.如前述各項中任一項之組合物，其為液態、較佳水性組合物。
31.如前述各項中任一項之組合物，其在約2-8℃下穩定至少24個月或在室溫下穩定至少28天。
32.如前述各項中任一項之組合物，其用於治療。
33.如前述各項中任一項之組合物，其用於靜脈內及/或皮下投藥。
34.如前述各項中任一項之組合物，其用於治療炎症及自體免疫病症，較佳包括過敏性及牛皮癬性病症，以及關節炎及哮喘病症。
35.一種套組，其包含如前述各項中任一項之組合物。
36.如請求項35之套組，其包含預填充注射器、濾筒或自動注射器。
應理解，本文所揭示之本發明不限於特定方法、協定或試劑，因此可變化。本文所提供之論述及實例僅出於描述特定實施例之目的呈 現且並不意欲限制僅由申請專利範圍限定之本發明之範疇。以下實例將說明本發明。
實例1：材料
以下實例用結合至且中和高親和力及特異性人類GM-CSF及WO 2006/111353中所描述之人類單株IgG1抗體(以下表示為「抗體」)進行。其產生描述於WO 2006/111353之實例2中。更具體言之，該抗體包含如SEQ ID NO：16、17、18、14、15及2中所描繪之輕鏈及重鏈CDR序列。此等CDR序列分別包含於SEQ ID No：34及35中分別所示之重鏈及輕鏈可變域中。在眾多促發炎性及自體免疫人類疾病中異常過度產生GM-CSF，且發現重組GM-CSF之添加加重此類疾病。可能的用GM-CSF中和抗體治療之疾病適應症包括類風濕性關節炎(RA)、哮喘及其他形式之肺炎症、多發性硬化症(MS)及牛皮癬。
使用無血清及無蛋白質介質在生物反應器中產生抗體。生產醱酵槽之接種體係自單個小瓶之產生純系之抗體製備。在完成醱酵製程之後，藉由過濾處理含有分泌抗體之收集物以自上清液分離細胞及碎片。收集物之純化基於常見的層析方法以減少HCP、DNA及潛在病毒。整體的病毒不活化步驟為後續處理之額外部分。對於調配物，執行濃縮及緩衝劑交換步驟。
實例2：測試方法
建立尺寸排阻高效液相層析(SE-HPLC)來確定抗體之聚集程度(HPLC：Agilent 1100 Chemstation；管柱：Tosoh Biosep TSKgel G4000SWXL)。藉由執行九點範圍測試限定SE-HPLC方法，根據該測試確定且測試精確度(六次重複注射)及線性(一式三份標準曲線)。使用100mM KH2PO4、200mM Na2SO4(pH 6.6)作為操作緩衝液執行所有分析。
建立表面電漿子共振(SPR)方法來確定固定GM-CSF之抗體結合活 性的程度(Biacore 3000/CM5感測器晶片/HBS-EP操作緩衝液)。藉由執行九點範圍測試限定SPR方法，根據該測試確定且測試精確度(六次重複注射)及線性(一式三份標準曲線)。
執行還原性及非還原性SDS-PAGE用於偵測降解產物(片段)及抗體之聚集體。
執行微流成像(MFI，Brightwell，Ottawa，CA)以定量尺寸為大約2μm至100μm之粒子的呈溶解狀態之內源性及外源性亞可見粒子之量。
執行陽離子交換層析(CEX)以使用WCX-10管柱及TRIS/咪唑/哌嗪操作緩衝液中之pH梯度來分析帶電同功異型物。酸性同功異型物在主要同功異型物之前溶離且鹼性同功異型物在主要同功異型物之後溶離。
使用安裝有用於容納注射器之轉接器之Instron®通用壓縮測試系統測試注射器滑移力。
實例3：pH及溫度應力之影響
進行研究來評估抗體在pH值範圍為3至10之低離子強度篩檢緩衝劑(LISSB：2mM甘胺酸、2mM檸檬酸、2mM HEPES、2mM MES及2mM Tris)中之穩定性。將抗體樣本在55℃下在各別溶液中儲存14天時期。在T0、T7及T14(天)時分析樣本。SPR分析指示抗體在pH為4-7時最穩定。當藉由SE-HPLC分析時，發現抗體單體在pH為4-6(T14)時最穩定。T14樣本之非還原性及還原性SDS-PAGE均展示在pH為4-6時僅形成最少的降解產品及聚集體。
實例4：離子強度及溫度應力之影響
進行研究來評估抗體在0mM、10mM、100mM及500mM NaCl存在下在低離子強度篩檢緩衝劑(LISSB)中之穩定性。用額外NaCl將抗體樣本透析至LISSB溶液(pH 4.5及pH 7.5)中以達到大約1mg/ml濃 度且在55℃下儲存14天時期。在T0、T7及T14(天)時藉由SE-HPLC及SPR分析樣本。
HPLC及SPR研究指示鹽之添加使抗體穩定性降低且該效果在pH為4.5時比在pH為7.5時更明顯。此外，SE-HPLC資料展示抗體在高濃度鹽(100mM)之情況下在pH為4.5時不穩定主要導致抗體之聚集體累積。在pH為7.5時，抗體在高濃度鹽(500mM)之情況下不穩定主要導致抗體之降解產品累積。在pH 4.5 LISSB中；500mM NaCl，抗體之沈澱(T7及T14)含量極高。
實例5：緩衝劑之影響
進行研究來評估抗體在各種pH 5-7緩衝劑中之穩定性。將抗體樣本透析至以下各者之溶液中：20mM pH 5、6及7檸檬酸鹽緩衝劑；20mM pH 6及pH 7磷酸鹽緩衝劑；20mM pH 6及pH 7丁二酸鹽緩衝劑、20mM pH 6及pH 7組胺酸緩衝劑；及20mM pH 5及pH 6乙酸鹽緩衝劑，以達到大約1mg/ml濃度，且在55℃下儲存14天時期。在T0、T7及T14(天)時藉由SE-HPLC、SPR及還原性及非還原性SDS-PAGE分析樣本。
SPR研究、HPLC單體及聚集資料及還原性及非還原性SDS-PAGE指示抗體在pH 5乙酸鹽緩衝劑、pH 6組胺酸緩衝劑及pH 5、6及7檸檬酸鹽緩衝劑中最穩定(T14資料)。
實例6：胺基酸之影響
進行研究來評估抗體在添加不同胺基酸之情況下在低離子強度篩檢緩衝劑(LISSB)中之穩定性。將抗體樣本在具有250mM各別胺基酸之pH為6之溶液中在55℃下儲存14天時期。在T0、T7及T14(天)時分析樣本。SPR研究指示尤其麩胺酸、蘇胺酸、離胺酸及纈胺酸具有微小穩定效果(T14)。HPLC資料指示與無任何胺基酸添加相比麩胺酸、蘇胺酸及丙胺酸導致大約2-3%以上完整單體與分別約30%、31%及 20%較少聚集體之穩定及顯著效果。
實例7：糖及界面活性劑之影響
進行研究來評估抗體在添加各種糖或界面活性劑之情況下在低離子強度篩檢緩衝劑(LISSB)中之穩定性。用額外的6%(w/v)糖(D-甘露糖醇、D-山梨糖醇、蔗糖、D-甘露糖、D-麥芽糖、D-海藻糖、D-葡萄糖)、0.05%(v/v)吐溫20或0.02%(v/v)吐溫80將抗體樣本透析至pH 6.0 LISSB溶液中以達到大約1mg/ml濃度，且在55℃下儲存14天時期。在T0、T7及T14(天)時藉由SE-HPLC、SPR及還原性及非還原性SDS-PAGE分析樣本。
SPR及HPLC研究指示D-山梨糖醇及D-甘露糖醇使抗體穩定性分別提高約20%/3%(SPR/HPLC資料，T14)及14%/4%(SPR/HPLC資料，T14)海藻糖及蔗糖均具有降低效果，分別降低7%/0.7%(SPR/HPLC資料，T14)及6%/2%(SPR/HPLC資料，T14)。此外，HPLC資料指示D-山梨糖醇及D-甘露糖醇使抗體聚集體之形成分別減少43%及50%，其亦由藉由SDS-PAGE獲得之資料支持。如藉由SE-HPLC、SPR及SDS-PAGE所量測，0.05%(v/v)吐溫20抑或0.02%(v/v)吐溫80似乎對穩定性不具有影響。
實例8：緩衝劑、胺基酸及糖之組合之影響
基於先前研究，進行研究來評估以緩衝劑、胺基酸及糖之組合形式調配的1mg/ml抗體之穩定性。先前研究指示以下各者之穩定效果：20mM pH 5乙酸鹽；20mM pH 6組胺酸；250mM麩胺酸；250mM蘇胺酸、6%(w/v)山梨糖醇及6%(w/v)甘露糖醇。將抗體以5.4mg/ml濃度調配成如表1中指示之20mM緩衝劑、250mM胺基酸及6%(v/v)糖之組合之溶液，且在55℃下儲存14天時期。包括1×PBS中之抗體作為對照。在T0、T7及T14(天)時，藉由SE-HPLC及SPR分析樣本。
另外，測試包含1×PBS中之抗體(5.4mg/ml)之T0樣本對冷凍及融化之易感性。將儲存小瓶在-20℃下在冷凍器中緩慢地冷凍。在完成冷凍之後，將樣本在室溫下融化。重複此過程直至已完成五次凍融循環。在兩次及五次循環之後檢查各樣本之SPR及SE-HPLC恢復。
SPR資料展示樣本5至16在T14/55℃下之結合活性相對於T0為>93%。對於1×PBS(樣本17)及樣本1至4(所有均不含甘露糖醇或山梨糖醇)中之抗體，該等數量分別為62%、19%、26%、91%及85%。SPR資料因此指示添加甘露糖醇或山梨糖醇提高結合活性之穩定性。此外，樣本1至4在T7及T14時呈現淡黃色，指示氧化。SE-HPLC資料展示在樣本5至8、11至12及15至16中發現最低含量之聚集體(3.5%-5.6%)及降解產品(4.2%-5.4%)(T14/55℃資料)，支持甘露糖醇及山梨糖醇對抗體單體之穩定影響且指示添加250mM蘇胺酸之可能的微小效果。然而，蘇胺酸之影響至少僅最低程度藉由樣本5至8、11至12及15至16中發現之單體含量(分別為91.2%、89.8%、91.5%、90.8%、89.8%、89.0%、91.4%及90.9%)判斷，對於樣本17(PBS)，該數量為80.3%(T14/55℃資料)。250mM麩胺酸連同山梨糖醇或甘露糖醇對抗體單體尤其在乙酸鹽緩衝劑中之穩定性具有負面影響。總之，抗體單體似乎在20mM pH 5乙酸鹽緩衝劑或20mM pH 6組胺酸緩衝劑及6%(w/v)山梨糖醇或6%(w/v)甘露糖醇之組合中最穩定。
來自凍/融實驗之SE-HPLC資料指示山梨糖醇在穩定抗體單體方面優於甘露糖醇之微小的優越效果。在5輪凍/融之後，在樣本6及8中，單體含量與樣本5及7中之96.9%及96.0%單體含量相比分別為98.6%及98.4%。
實例9：組胺酸或乙酸鹽緩衝劑、山梨糖醇或甘露糖醇及吐溫20或吐溫80之組合之影響
基於來自先前研究之穩定性資料(展示特定言之20mM pH 5乙酸鹽、20mM pH 6組胺酸、6%(w/v)山梨糖醇及6%(w/v)甘露糖醇之穩定效果)，進行新的研究來評估以組胺酸或乙酸鹽緩衝劑、山梨糖醇或甘露糖醇及吐溫20或吐溫80之組合形式調配的10mg/ml抗體之穩定性。由於抗體之濃度為10mg/ml，亦測試0.02%(w/v)吐溫20及0.02%(w/v)吐溫80之添加如藉由SE-HPLC所量測之對聚集之影響。
將抗體以10mg/ml濃度調配成如表2中指示之20mM pH 5.0乙酸鹽緩衝劑或20mM pH 6.0組胺酸緩衝劑及具有添加劑之溶液，且在55℃下儲存14天時期。在T0、T7及T14(天)時藉由SE-HPLC及SPR分析樣本。
另外，測試抗體樣本對冷凍及融化之易感性。將抗體以10mg/ml濃度在-20℃下在冷凍器中緩慢地冷凍。在完成冷凍之後，將樣本在室溫下融化。重複此過程直至已完成三次及/或五次凍融循環。在三次及/或五次凍融循環之後檢查各樣本之SPR及SE-HPLC恢復。
HPLC資料展示儘管乙酸鹽與組胺酸之間存在微小差異，組胺酸似乎至少與乙酸鹽一樣好。1週之後，含有乙酸鹽、山梨糖醇及吐溫80之調配物及含有組胺酸、山梨糖醇及吐溫20之調配物與相應的不具有界面活性劑之調配物相比具有類似降解。
凍融實驗指示在五輪凍融之後清潔劑對抗體單體之含量至少無影響。然而，抗體單體在添加6%(w/v)山梨糖醇至調配物時與添加6%(w/v)甘露糖醇相比更穩定。在添加甘露糖醇之情況下，抗體單體在五輪凍融之後聚集程度較高。來自凍融實驗之HPLC資料展示在使用乙酸鹽與組胺酸之間無差異。
總之，含有20mM pH 6.0組胺酸及6%(w/v)山梨糖醇之預調配物如藉由HPLC分析似乎抗體單體之穩定性最佳。
實例10：20mM組胺酸、6%(w/v)D-山梨糖醇預調配物之短期穩定性評估
基於對20mM pH 6.0組胺酸及6%(w/v)山梨糖醇作為最佳預調配物之識別，進行短期穩定性測試來評估此呈較高抗體濃度之預調配物。
將抗體以大約22mg/ml、36mg/ml、42mg/ml、83mg/ml及118mg/ml之濃度調配成以上溶液。將所調配之抗體在5℃及25℃下儲存長達4週時期。在T0、T14及T28(天)時藉由SE-HPLC分析樣本。
SE-HPLC資料清楚地展示抗體在20mM pH 6.0組胺酸、6%(w/v)山梨糖醇中為穩定的。所偵測之抗體單體在5℃或25℃下儲存28天之後之濃度始終高於97%，在25℃下的最高抗體濃度測試(118mg/ml)除外，其中抗體單體濃度為約96.5%。結果展示於圖1中。
實例11：最終賦形劑之微調
基於在先前實驗中產生之資料，已選擇山梨糖醇及組胺酸用於穩定抗體。在下一步驟中，使用包括3個中心點且導致30個個別操作之「實驗設計」(DOE)針對10mg/ml與100mg/ml之間的抗體濃度微調賦形劑量以及pH值。藉由以下參數進行隨機化實驗計劃：
抗體：10-55-100mg/ml
pH：5-6-7
組胺酸：10-30-50mM
山梨糖醇：2-6-10%(w/v)
為了允許短期評估，使樣本在50℃加速條件下受應力14天。此外，執行三次凍融循環(-20℃)來模擬抗體之儲存。
結果：
測定重量莫耳滲透濃度以確保調配物之生理條件。對於靜脈內或皮下施用抗體，250mOsmol/kg與450mOsmol/kg之間的重量莫耳滲透濃度為可接受的範圍。如圖2中所示，重量莫耳滲透濃度主要藉由調配物中之山梨糖醇之量控制。低濃度(10-50mM)組胺酸及抗體自身均對重量莫耳滲透濃度具有僅最小影響。
重量莫耳滲透濃度對山梨糖醇及組胺酸濃度之依賴性可以等高墨點描繪。此墨點展示為了將重量莫耳滲透濃度維持在生理間隔內，3%與7%(w/v)之間的山梨糖醇濃度為必需的。所產生之資料暗示最佳山梨糖醇濃度為約6%，導致相當高的重量莫耳滲透濃度值。由於一定的山梨糖醇減少不會影響抗體穩定性，山梨糖醇濃度可降至5%以便達到約400mOsmol/kg重量莫耳滲透濃度且因此增加患者便利性。
最佳組胺酸濃度基於所產生之資料設定為30mM。在10mM與50mM之間的組胺酸濃度範圍內，如藉由SE-HPLC所量測未偵測到對聚集或斷裂之影響。
抗體之聚集主要為濃度依賴性的。在凍/融期間且在加速溫度應力條件下，增加的抗體濃度導致較高聚集含量及增加的透明度值。另外，pH值影響抗體之單體含量。然而，在pH<6時之加速應力導致抗體斷裂增加，凍/融期間之穩定性未受影響，但確切而言觀測到稍微較佳的穩定性。在pH值為pH>6時，對於加速溫度及凍/融處理，均可使用SE-HPLC及透明度分析量測降低的單體含量。為了平衡相反效果，pH 5.8似乎最適合於抗體調配物。
此導致具有以下參數之調配物：
此組合物之條件或參數亦可傳輸至具有較高抗體濃度之組合物，如以下實例中將展示。
實例12：穩定性研究
長期研究
該研究經設計用於長達60個月之測試時期。在此時期期間，將抗體樣本在+5℃±3℃下在DIN R2玻璃小瓶中儲存。另外，在DIN R2玻璃小瓶中分別執行長達12及6個月之在+25℃±2℃下之加速研究及在+40℃±2℃下之應力研究。使用濃度為106mg/ml及145mg/ml之抗體在具有30mM組胺酸單鹽酸鹽及5%(w/v)山梨糖醇之pH為5.8調配物中進行測試。
量測以下參數：pH，重量莫耳滲透濃度，濃度(OD280)，根據SE-HPLC之單體、聚集體及片段之百分比，效力(基於細胞之分析)。結果展示於以下表3至表8中。
加速/應力研究
為了展現原料藥、因此按比例擴大之後的抗體之可比較性，已使用在30mM組胺酸、5%山梨糖醇之pH為5.8溶液中調配的抗體濃度為165mg/ml及171mg/ml之兩批原料藥在加速(25℃)及受應力(40℃)條件下執行穩定性研究。
量測以下參數：pH，重量莫耳滲透濃度，濃度(OD280)，根據SE-HPLC之單體、聚集體及片段之百分比，效力(基於細胞之分析)。對於171mg/ml抗體濃度之結果展示於以下表9及表10中。
凍/融研究
測試在30mM pH 5.8組胺酸及5%山梨糖醇之溶液中調配的106mg/ml及145mg/ml抗體濃度之凍/融穩定性。將抗體在-80℃±10℃下冷凍至少隔夜。在室溫下執行融化6h。進行多個0、1、3、5、7及10次凍/融循環。
量測以下參數：pH，重量莫耳滲透濃度，濃度(OD280)，根據SE-HPLC之單體、聚集體及片段之百分比，效力(基於細胞之分析)。結果展示於以下表11及表12中。
結果及結論
針對在30mM組胺酸、5%山梨糖醇(pH 5.8)之調配物中約106mg/ml及約145mg/ml之抗體濃度進行長達60個月之長期穩定性研究，包括加速及受應力條件。亦針對在30mM組胺酸、5%山梨糖醇(pH 5.8)中高達約171mg/ml之抗體濃度在加速及受應力條件下進行額外穩定性研究。
在60個月時段期間，對於兩個濃度在+5℃±3℃下儲存之樣本均展示小於2%聚集且與參考物相比具有相同效力。
在加速條件(+25℃±2℃)下儲存12個月之後，兩個濃度(106mg/ml及145mg/ml)均展示小於2%之聚集且與參考物相比具有相同效力。在受應力條件(+40℃±2℃)下儲存6個月之後，兩個濃度均展示小於5%之聚集且與參考物相比具有大致相同的效力。
額外加速/應力研究之資料展示在25℃及40℃下分別持續3個月及1個月的穩定性。此指示可預期在2-8℃下之穩定性與如上文所論述針對106mg/ml及145mg/ml抗體濃度所獲得之穩定性相當。
此外，30mM組胺酸、5%山梨糖醇(pH 5.8)中之抗體在約106mg/ml及約145mg/ml之兩個測試抗體濃度下在-80℃±10℃下在至少10次凍/融循環期間穩定。
實例13：黏度評估
藉由流變儀測定在30mM pH 5.8組胺酸及5%山梨糖醇之溶液中調配之150mg/ml抗體濃度之黏度。流變儀用於不能由單個黏度值限定且因此與黏度計之情況相比需要設定及量測更多參數之彼等流體。
對於一些流體，黏度為廣泛範圍之剪切速率內之常數(牛頓流體(Newtonian fluid))。不含恆定黏度之流體(非牛頓流體)不能由單個數字描述。非牛頓流體展現剪應力與剪切速率之間的各種不同相關性。因此，對於非牛頓流體，黏度視溫度以及剪切速率而定。黏度在給定溫度及給定剪切速率[1/sec]下以毫帕斯卡*秒(mPas*s)指示。
具有約150mg/ml抗體之調配物之黏度在約50[1/sec]與約1000[1/sec]之間的剪切速率下在20℃溫度下低於12mPas*s。
具有約150mg/ml抗體之調配物之黏度在約50[1/sec]與約1000[1/sec]之間的剪切速率下在5℃溫度下低於20mPas*s。
實例14：在攪拌/剪應力下之穩定性
80mg/ml抗體與5%山梨糖醇、30mM組胺酸(pH 5.8)之調配物係用0%、0.01%、0.05%、0.1%吐溫20製成，且150mg/ml蛋白質與5%山梨糖醇、30mM組胺酸(pH 5.8)之調配物係用0%、0.01%、0.05%、0.1%及0.15% TWEEN® 20(PS20)製成。將此等調配物在剪切槽或混合器中攪拌長達24小時且在0、4、8及24小時藉由MFI量測亞可見粒子。添加至少0.01% TWEEN® 20與不含TWEEN®之調配物相比降低亞可見粒子形成之速率。
150mg/ml抗體與5%山梨糖醇、30mM組胺酸(pH 5.8)之調配物係用0%、0.01%、0.05%、0.1% TWEEN® 80(PS80)製成，且150mg/ml蛋白質與5%山梨糖醇、30mM組胺酸(pH 5.8)之調配物係用0%、0.01%、0.05%、0.1%及0.15% TWEEN® 80製成。將此等調配物攪拌長達8小時且在0、4、6及8小時藉由MFI量測亞可見粒子。添加至少 0.01% TWEEN® 80與不含TWEEN®之調配物相比降低亞可見粒子形成之速率。
用80mg/ml及150mg/ml蛋白質(抗體)在添加有TWEEN® 20或TWEEN® 80(% w/v)之30mM組胺酸、5%山梨糖醇(pH 5.8)中執行的此額外測試之初步結果展示(按每毫升粒子數×稀釋因子)於圖3至圖6中。此等調配物經剪切/攪拌以檢查其形成呈溶解狀態之亞可見粒子之傾向，且發現界面活性劑減少亞可見粒子之形成。因此，需要界面活性劑在製造及儲存期間防止亞可見粒子形成或將減少亞可見粒子形成。
實例15：界面活性劑相互作用之評估
執行表面張力量測以表徵TWEEN® 20及TWEEN® 80與80mg/mL蛋白質及150mg/mL蛋白質在5%山梨糖醇、30mM組胺酸(pH 5.8)中之相互作用。獲得類似於圖7之表面張力曲線。測定臨界聚集濃度(CAC)，其為界面活性劑開始與蛋白質相互作用之濃度。此外，亦測定臨界微胞濃度，即形成界面活性劑微胞之濃度，指示與蛋白質之相互作用處於平衡。結果概述於表13中。TWEEN® 20及TWEEN® 80類似地與蛋白質相互作用，兩個濃度具有類似的CAC界面活性劑：蛋白質莫耳比。CMC在較高蛋白質濃度下較高，但對於界面活性劑：蛋白質莫耳比，兩個蛋白質濃度之CMC類似。TWEEN® 20與TWEEN® 80相比具有較低CMC界面活性劑：蛋白質莫耳比。根據表面張力量測，界面活性劑與蛋白質相互作用之範圍為CAC直至CMC。對於TWEEN® 20，莫耳比範圍為大約0.004至2.6，而對於TWEEN® 80，莫耳比範圍為大約0.003至3.3。蛋白質調配物中之最佳界面活性劑含量高於CAC。
CAC=臨界聚集濃度
CMC=臨界微胞濃度
實例16：凍融穩定性
80mg/mL抗GM-CSF抗體在30mM組胺酸、5%山梨糖醇(pH 5.8)中與濃度為0%、0.01%及0.1%之TWEEN® 20(PS20)及TWEEN® 80(PS80)之調配物經由10次凍/融循環藉由MFI表徵。如圖8中可見，對於其中不含界面活性劑之調配物，10μm粒子隨凍/融循環次數顯著增加。TWEEN® 20或80為0.01%高達0.1%，粒子無顯著增加。
150mg/mL抗GM-CSF抗體在30mM組胺酸、5%山梨糖醇(pH 5.8)中與濃度為0%、0.05%及0.15%之TWEEN® 20及TWEEN® 80之調配物經由10次凍/融循環藉由MFI表徵。如圖9中可見，對於其中不含界面活性劑之調配物中之一者，尺寸10μm之粒子顯著增加。TWEEN® 20或80為0.05%高達0.15%，粒子無顯著增加。
實例17：加速穩定性
使80mg/mL抗GM-CSF抗體在30mM組胺酸、5%山梨糖醇(pH 5.8)中與濃度為0%、0.05%及0.1%之TWEEN® 20(PS20)及TWEEN® 80(PS80)之調配物在40℃下置於加速穩定性1週。樣本藉由MFI(表14)及SE-HPLC(表15)表徵。
對於在40℃下1週，如藉由MFI所量測10μm粒子未生長。然而，如藉由SE-HPLC所量測多聚體聚集體(HMW)增加。7天之後，含有界面活性劑之調配物之HMW物質的量稍微更高，但不顯著大於不 含界面活性劑之調配物。另外，HMW濃度生長並非視界面活性劑之量或兩種不同類型之界面活性劑而定。
NA=不可獲得
使150mg/mL抗GM-CSF抗體在30mM組胺酸、5%山梨糖醇(pH 5.8)中與濃度為0%、0.1%及0.15%之TWEEN® 20(PS20)及TWEEN® 80(PS80)之調配物在40℃下置於加速穩定性1週。樣本藉由MFI及SE-HPLC表徵。
對於在40℃下1週，如藉由MFI所量測10μm粒子之濃度未生長 (表16)。然而，如藉由SE-HPLC所量測可溶聚集體(HMW)增加(表17)。HMW物質之生長率在150mg/mL抗體下比在80mg/mL抗體更高，但其不受調配物中之界面活性劑量或界面活性劑類型影響。隨著界面活性劑之添加，與不含界面活性劑之調配物相比，HMW物質在七天之後的量稍微增加，但不為統計學上顯著的。
實例18：預填充注射器中之穩定性
用來自3個不同製造商之具有不同聚矽氧量、橡膠組分等之預填充注射器研究各種調配物之穩定性。另外，研究安慰劑調配物。將調配物在2-8℃及25℃下置放長達12個月。含有蛋白質、抗體(Ab)之調 配物藉由視覺外觀、SE-HPLC、陽離子交換層析及MFI表徵，而安慰劑調配物藉由視覺外觀及MFI表徵。
所研究之調配物展示於表18中。
實例19：預填充注射器中之穩定性
用來自3個不同製造商之具有用於針罩的不同聚矽氧油量及橡膠調配物之預填充注射器(用於皮下投藥之所有典型的注射器)研究具有不同抗體濃度及聚山梨醇酯量之各種調配物之穩定性。相同的塞子/柱塞調配物用於所有3個注射器製造商。聚山梨醇酯量經選擇為高於CAC且在表面張力曲線之相當平坦部分中。另外，研究安慰劑調配物。將調配物置放在2-8℃及25℃下以便長期取樣。含有蛋白質之調配物藉由視覺外觀、SE-HPLC、陽離子交換層析及MFI表徵，而安慰劑調配物藉由視覺外觀及MFI表徵。
所研究之調配物展示於表19中且結果在表20至表26中給出。對於 80mg/mL抗體之調配物，視覺外觀為無色，所有調配物及注射器類型不具有可見粒子且視覺外觀不隨時間改變。對於150mg/mL抗體之調配物，視覺外觀為淡黃色，所有調配物及注射器類型不具有可見微粒且視覺外觀不隨時間改變。根據SE-HPLC之聚集體增加速率對於150mg/mL調配物而言高於80mg/mL調配物，界面活性劑量不影響聚集速率。電荷概況隨時間之變化對於經檢查之所有調配物及注射器類型為相同的。
注射力結果展示所測試之每一調配物及每一注射器之平均滑移力為約4-11N。此力範圍賦予本文中所描述之調配物中之此抗GM-CSF抗體提供手動使用及自動注射器使用之可能性。
NV-結果由於流槽中之氣泡而不為有效的，無額外樣本可獲得。
NV-結果由於流槽中之氣泡而不為有效的，無額外樣本可獲得。
圖1：儲存時間、儲存溫度及蛋白質濃度對抗GM-CSF抗體之單 體含量之影響。
圖2：以重量莫耳滲透濃度[mOsmol/kg]作為變數之標準化效應之帕累托(Pareto)圖表。
圖3：在80mg/mL抗GM-CSF抗體、5%山梨糖醇、30mM組胺酸及不同量的吐溫(Tween)20之調配物中形成2-10μm粒子。
圖4：在80mg/mL抗GM-CSF抗體、5%山梨糖醇、30mM組胺酸及不同量的吐溫80之調配物中形成2-10μm粒子。
圖5：在150mg/mL抗GM-CSF抗體、5%山梨糖醇、30mM組胺酸及不同量的吐溫20之調配物中形成2-10μm粒子。
圖6：在150mg/mL抗GM-CSF抗體、5%山梨糖醇、30mM組胺酸及不同量的吐溫80之調配物中形成2-10μm粒子。
圖7：抗GM-CSF抗體及界面活性劑之代表性表面張力曲線。
圖8：10μm粒子濃度生長隨以80mg/mL抗GM-CSF抗體在30mM組胺酸、5%山梨糖醇中在不同吐溫20或吐溫80之濃度的情況下之凍/融循環次數而變。
圖9：10μm粒子濃度生長隨以150mg/mL抗GM-CSF抗體在30mM組胺酸、5%山梨糖醇中在不同吐溫20或吐溫80之濃度的情況下之凍/融循環次數而變。
<110> 武田公司
<120> 包含GM-CSF中和化合物之液態調配物
<130> 1749
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 7A-701
<400> 1
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 7B1-502
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<212> PRT
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<223> 具有CDR-H3=Ln4p-28之VH
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<212> PRT
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<220>
<223> 輕鏈5-306* L-形式
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<212> PRT
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<220>
<223> 具有CDR-H3=Ln4p-28*之重鏈
<400> 44
<210> 45
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3=Ln4p-50*之重鏈
<400> 45
<210> 46
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3=Ln4p-65*之重鏈
<400> 46
<210> 47
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3=Ln4p-90*之重鏈
<400> 47
<210> 48
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3=3077*之重鏈
<400> 48
<210> 49
<211> 127
<212> PRT
<213> 人類GM-CSF
<400> 49
<210> 50
<211> 127
<212> PRT
<213> 獼猴GM-CSF
<400> 50
<210> 51
<211> 127
<212> PRT
<213> 長臂猿GM-CSF
<400> 51
<210> 52
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3 7B1-502之VH
<400> 52
<210> 53
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有CDR-H3 3077之VH
<400> 53
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL 5-306
<400> 54
<210> 55
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL 5-306* V-形式
<400> 55
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3 3077
<400> 56
<210> 57
<211> 127
<212> PRT
<213> 人類
<400> 57
<210> 58
<211> 127
<212> PRT
<213> 長臂猿
<400> 58
<210> 59
<211> 127
<212> PRT
<213> 恆河猴
<400> 59
<210> 60
<211> 127
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 60

Claims (26)

  1. 一種組合物，其包含濃度為至少約20mg/ml之中和GM-CSF之化合物、張力改質劑、緩衝劑及以下一或多者：界面活性劑、胺基酸、抗氧化劑及/或螯合劑，其中該組合物為穩定的。
  2. 如請求項1之組合物，其包含該中和GM-CSF之化合物、該張力改質劑、該緩衝劑及界面活性劑。
  3. 如請求項1或2之組合物，其中該中和GM-CSF之化合物以至少約50mg/ml濃度存在，該張力改質劑以約1%至約15%(w/v)濃度存在且該緩衝劑以約10mM至約50mM濃度存在。
  4. 如請求項1至3之組合物，其中該張力改質劑選自甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖及/或海藻糖。
  5. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中該緩衝劑選自組胺酸、乙酸鹽及/或檸檬酸鹽緩衝劑。
  6. 如請求項1至5中任一項之組合物，其中該界面活性劑選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆(poloxamer)及其組合中之一或多者。
  7. 如請求項1至6中任一項之組合物，其中該中和GM-CSF之化合物以至少約50mg/ml且小於約200mg/ml之濃度存在，該張力改質劑以約3%至約7%(w/v)濃度存在，該緩衝劑以約20mM至約40mM濃度存在且該界面活性劑以約0.001%至約1%(w/v)濃度存在。
  8. 如請求項1至7中任一項之組合物，其中pH在約5與約7之間。
  9. 如請求項1至8中任一項之組合物，其中該張力改質劑為山梨糖醇且該緩衝劑為組胺酸緩衝劑。
  10. 如請求項2至9中任一項之組合物，其進一步包含抗氧化劑。
  11. 如請求項1至10中任一項之組合物，其中該界面活性劑為聚山梨醇酯80。
  12. 如請求項11之組合物，其中該聚山梨醇酯80之量高於CAC。
  13. 如請求項11之組合物，其中該聚山梨醇酯80之濃度為約0.01%(w/v)至約0.08%(w/v)。
  14. 如請求項11之組合物，其中該聚山梨醇酯80與蛋白質之比率為約0.3：1至約0.6：1。
  15. 如請求項1至14中任一項之組合物，其中該中和GM-CSF之化合物選自由以下組成之群：多肽、肽模擬物、核酸及小分子。
  16. 如請求項15之組合物，其中該多肽為結合至GM-CSF或該GM-CSF受體之抗體或其功能片段。
  17. 如請求項16之組合物，其中該抗體或其功能片段為人類單株抗體或其功能片段。
  18. 如前述請求項中任一項之組合物，其包含i)約50mg/ml至約180mg/ml之中和GM-CSF之化合物，ii)約5%(w/v)山梨糖醇，iii)約30mM L-組胺酸及iv)約0.001%至約1%(w/v)界面活性劑及v)pH為約5.8。
  19. 如請求項18之組合物，其包含約80mg/ml或150mg/ml之中和GM-CSF之化合物。
  20. 如請求項18或19之組合物，其中該界面活性劑為聚山梨醇酯80。
  21. 如請求項20之組合物，其中該聚山梨醇酯80之濃度為約0.01%(w/v)至約0.08%(w/v)。
  22. 如請求項20之組合物，其中該聚山梨醇酯80與蛋白質之比率為 約0.3：1至約0.6：1。
  23. 如前述請求項中任一項之組合物，其為液態，較佳為水性組合物。
  24. 如前述請求項中任一項之組合物，其在約2至8℃下穩定至少24個月或在室溫下穩定至少28天。
  25. 如前述請求項中任一項之組合物，其封裝於預填充注射器中。
  26. 如前述請求項中任一項之組合物，其用於治療。
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