UA123661C2 - Водна композиція для використання в терапії, яка містить людське моноклональне антитіло, що зв'язується з гм-ксф - Google Patents

Abstract

Винахід стосується водної композиції для використання в терапії, що включає людське моноклональне антитіло, що зв'язується з ГМ-КСФ, модифікатор тонічності, яким є сорбіт, гістидиновий буфер, поверхнево-активну речовину - полісорбат 80 і де рН становить від 5 до 7.

Description

Винахід стосується стійких рідких композицій, які містять сполуку, що нейтралізує гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (ГМ-КСФ). Інгредієнти цих композицій переважно забезпечують її стійкість протягом довготривалого зберігання та циклів заморожування-відтавання. У переважному аспекті ці композиції призначено для застосування у терапевтичному лікуванні, переважно для застосування у лікуванні запальних та автоїмунних розладів, переважно включаючи алергічні та псоріатичні розлади, а також артрит та астматичні розлади. Крім того, передбачено набір, який містить ці композиції за винаходом.

Застосування білків дуже поширено у фармацевтичній галузі, у виробництві ветеринарних, косметичних та інших споживчих продуктів, харчових продуктів, тваринних кормів, діагностичних засобів, а також у промисловій хімії та у галузі усунення забруднень. Час від часу ці застосування є обмеженими через притаманні білкам певні обмеження або вимоги зовнішніх факторів або середовища, в якому їх вживають. Ці обмеження можуть призвести до поганої стійкості цих білків, мінливості їх властивостей або до високої вартості, хоча зараз, завдяки появі біотехнології стає можливим отримати широкий ряд білків для терапевтичного застосування. Звичайно після отримання білкові фармацевтичні засоби зберігають перед застосуванням. Завдяки тому, що звичайно білки є більш великими та більш складними, ніж "традиційні" фармацевтичні препарати, процес отримання та обробки прийнятних для зберігання білююових фармацевтичних препаратів може бути особливо складним. Огляд білкових фармацевтичних композицій та схем їх отримання див. у виданнях Сагрепіег еї аї. (1997),

Ріпапт. Нез. 14: 969-975; Мапд (2000), Іпі. У. Рнаптасешісв 203: 1-60; апа Тапд апа Рікаї (2004),

Ріагт. Незв. 21: 191-200.

Кілька факторів може бути розглянуто у розробці композицій та процесів отримання білкового фармацевтичного препарату. Головною проблемою є стійкість білка протягом будь- якої або всіх операцій його промислового виробництва, доставляння та кінцевої обробки, які можуть включати отримання композиції, її заморожування, ліофілізацію, сушіння, зберігання, доставляння, відновлення, цикли заморожування/відтавання та зберігання після відновлення до кінця застосування. Інші можливі фактори, які треба прийняти до уваги включають легкість та економічність виробництва, перевезення та постачання; склад кінцевого продукту, призначеного для введення пацієнту та зручність його застосування кінцевим користувачем, включаючи

Зо розчинність ліофілізованої композиції після відновлення.

Рідка композиція може задовольняти певним вимогам. Можливі переваги рідкої композиції включають легкість та економічність виробництва та зручність для кінцевого користувача. Часто поліпептиди, які зберігають протягом тривалого часу є нестійкими у розчині (Маппіпу еї аї (1989), Рпат. Невз. 6: 903-918). Відповідно було розроблено додаткові операції їх обробки, призначені для збільшення строку зберігання, як-то операції сушіння, наприклад, ліофілізації.

Ліофілізовані композиції також можуть надати певні переваги. Можливі переваги від застосування ліофілізації включають покращену стійкість білка, а також зручність та економічність його доставляння та зберігання. Однак ліофілізовані фармацевтичні композиції можуть бути менш зручними для кінцевого користувача.

На додачу до вибору основної форми для композиції (наприклад, ліофілізованої, рідкої, замороженої тощо), оптимізація білкових композицій звичайно полягає у зміненні компонентів композицій та їх відповідних концентрацій для максимального збільшення стійкості білка. На стійкість білків може впливати ряд факторів, включаючи іонну силу, рН, температуру, цикли заморожування / відтавання, сили зсуву, заморожування, ліофілізацію, сушіння, струшування та відновлення. Порушення стійкості білків може бути наслідком фізичної деградації (наприклад, денатурації, агрегації або преципітації) або хімічної деградації (наприклад, дезамідування, окислення або гідролізу). Оптимізація компонентів та концентрації композиції існує виключно на основі емпіричних досліджень та / або раціональних підходів до подолання джерел нестабільності.

Інколи у випадках довготривалого зберігання фармацевтичних композицій, які містять поліпептиди, включаючи водні та ліофілізовані композиції може відбуватися втрата активних поліпептидів через їх агрегацію та/або руйнування.

Відповідно, типові практичні заходи по покращенню стійкості поліпептиду може бути спрямовано до змінення концентрації елементів у складі композиції або до додавання наповнювачів для її модифікації (Патенти США МоМо 5580856 та 6171586 та патентні заявки

США МоМо 05 2003/0202972, 05 2003/0180287). Патент США Мо 5580856 є прототипним патентом, який присвячено певним засобам, як-то природні полімери, поверхнево-активні речовини, сульфатовані полісахариди, білюи та буфери, прийнятні для додавання з метою надання стійкості висушеному білку під час або після регідратації. Однак, крім зазначення 60 багатьох варіантів, у Патенті США Мо 5580856 не повідомлено, який стабілізатор треба додати до якого білка. Відповідно, в той час, як досвідчений читач буде обізнаним про існування багатьох зазначених варіантів, йому чи їй буде потрібно ще виявити найкращі умови для певного досліджуваного білка серед багатьох варіантів, описаних у Патенті США Мо 5580856. У патентній заявці США 2003/0202972 описано стійку ліофілізовану композицію анти-Нег2 антитіл, в якій стабілізатором є цукор, трегалоза або буфер. Однак, хоча ці стабілізатори може бути застосовано до антитіл, це застосування може й не бути поширено на інших білків. Патентна заявка США 2003/0180287 є подібною до патентної заявки 05 2003/0202972, в якій також описано стійкий розчин білка, подібного до імуноглобуліну, тобто білка, який містить Ес - домен та стабілізатор може бути фосфатом натрію, фосфатом калію, цитратом натрію або калію, малеїновою кислотою, ацетатом амонію, буфером Тгі5, ацетатом, діетаноламіном, гістидином, лізином або цистеїном. Серед цих хімічно різних стабілізаторів, які може вибрати досвідчений читач, прийнятним виявився лізин. Однак, як і у разі 05 2003/0202972, певний стабілізатор є прийнятним лише для певного білка, як-то у цьому випадку для білка, що містить Ес - домен та його дію може не бути поширено на інший білок. Відповідно застосування додатків може не бути екстрапольовано від одного певного білка до іншого неспорідненого білка, отже застосування додатків з одночасним покращенням зберігання може призводити до інактивування поліпептидів. Крім того, у разі ліофілізації, операція регідратації може викликати умови, які призведуть до інактивування поліпептиду шляхом, наприклад, агрегації або денатурації (Нога єї аІ. (1992), Рпапт. Нез., 9: 33-36; іш еї аї. (1991), Віоїесппої. Віоепд., 37: 177-184). Фактично, агрегація поліпептидів є небажаною, оскільки вона може призвести до імуногенності (Сіеїапа еї аім. (1993), Стї. Вем. Тнегарешіс Огид Сатіег Зувзієтв, 10: 307-377; апа ВобБбіпз еї аї. (1987), ріабеїез, 36: 838-845).

Збереження біологічної активності протягом розробки та виробництва фармацевтичних продуктів залежить від власної стійкості макромолекул, а також від застосованих способів стабілізації. Зараз існує ряд способів стабілізації білків, включаючи додавання хімічних "стабілізаторів" до водного розчину або суспензії білка. Наприклад, Патент США Мо 4297344 присвячено наданню стійкості факторам коагуляції ІІ та МІ, антитромбіну І та плазміногену до нагрівання додаванням вибраних амінокислот. Патент США Мо 4783441 присвячено способу стабілізації білків додаванням поверхнево-активних речовин. Патент США Мо 4812557

Зо присвячено способу стабілізації інтерлейкіну-2 із застосуванням людського сироваткового альбуміну. Іншим варіантом стабілізації білків є способи заморожування / відтавання, які полягають у змішуванні препарату з кріопротектором та зберіганні його з дуже низькими температурами, проте не всі білюом можуть вижити після циклу заморожування / відтавання.

Додатковим варіантом також є зберігання на холоді з доданим кріопротектором, яким звичайно є гліцерин. Також може бути здійснено зберігання у скляній формі, як описано у Патенті США Мо 5098893. У цьому випадку, білки розчинюють у речовинах, які мають здатність до набухання у воді або є водорозчинними та які знаходяться у аморфному чи склоподібному стані. Більш розповсюдженим способом стабілізації білків є заморожування-сушіння або ліофілізація, яка надає більше життєздатних альтернативних варіантів у разі неможливості досягнення прийнятної стійкості білка у водному розчині. Одним з недоліків ліофилизації є те, що вона вимагає складної обробки, вимагає великих витрат часу та дорого коштує. Крім того, у разі необережної ліофилизації відбувається принаймні часткова денатурація більшості препаратів, спричинена здійсненням операцій заморожування та зневоднення, які є складовою частиною цього способу. Наслідком цього є часто незворотні випадки агрегації частини білкових молекул, що робить композицію неприйнятною для парентерального введення.

Як правило, явище деградації білків є добре описаним у науковій літературі, а інформація про зберігання та розчинність сполук, які нейтралізують гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (також позначений, як ГМ-КСФ), зокрема поліпептидів та антитіл до ГМ-КСФ є відсутньою.

Слід також додати, що хоча у цій галузі відомо існування великої кількості варіантів засобів стабілізації білків, а також засобів, застосування яких дозволяє досягнути високих концентрацій цих білків з одночасним збереженням їх стійкості, однак до появи цього винаходу у цій галузі не було визнано, що відповідна композиція, яка містить сполуки, що нейтралізують ГМ-КСФ з високими концентраціями може бути нестійкою та через те потребує покращення.

Отримання фармацевтичної композиції, яка містить білок, як-то антитіло, наприклад, моноклональне антитіло було здійснено з метою розробки рідких препаратів з високими концентраціями, обумовлених високою ефективністю підшкірного введення, яке призводить до підвищення зручності для пацієнта. Однак існує загальний консенсус у розробці композицій антитіл, зокрема моноклональних антитіл з великими концентраціями, обумовлений серйозними бо проблемами щодо фізичної та хімічної стійкості моноклональних антитіл, як--о підвищеним утворенням розчинних та нерозчинних агрегатів або частинок, які збільшують ймовірність імунної відповіді, а також призводять до низької біологічної активності.

Утворення поліпептидом агрегатів або частинок під час зберігання рідкої фармацевтичної композиції може задавати шкоди біологічній активності цього поліпептиду, що призводить до втрати терапевтичної ефективності фармацевтичної композиції. Крім того, утворення агрегатів або частинок може викликати інші проблеми як-то закупорювання трубочок, мембран або помп у разі введення фармацевтичної композиції з цим поліпептидом із застосуванням інфузійної системи.

Крім того, було повідомлено, що застосування композицій антитіл з великими концентраціями призводить до збільшення в'язкості, що створює серйозні проблеми для можливості їх виробництва та ін'єкційного застосування. Композиції з високим рівнем в'язкості є важкими у виробництві, їх важко закачати у шприц та застосувати шляхом ін'єкції. Застосування сили у маніпулюванні з в'язкими композиціями веде до надмірного спінювання, що може привести до денатурації та інактивації активних моноклональних антитіл.

Отже, залишається велика потреба у стійкій висококонцентрованій білковій рбрармацевтичній композиції, яка містить нейтралізуючу ГМ-КСФ сполуку, наприклад антитіло та яка має низький та практично досяжний рівень в'язкості, який є прийнятним для підшкірного введення, як-то у готовому до застосування пристрої. Крім того, з точки зору пацієнтів було б дуже бажано отримати продукти, які є стійкими в умовах кімнатної температури. Зокрема на цей момент не на ринку ще не існує композицій антитіл, зберігання яких при кімнатній температурі є можливим протягом терміну придатності лікарського продукту. Звичайно збільшення агрегації білків призводить до появи неприйнятно високого рівня агрегатів та пов'язаних з білком домішок, що може призвести до появи імуногенних реакцій.

Нещодавно було виявлено, що гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (ГМ-КСФ), якій спочатку було визначено, як кровотворний фактор росту, є важливим цитокіном, залученим до процесів запалення та автоімунності. Підвищені рівні білеюеа ГМ-КСФ або його мРНК було виміряно у різних місцях запалень, включаючи запалення у пацієнтів з алергією, псоріазом, артритом та бронхіальною астмою. Здійснені за останні кілька років численні дослідження іп мімо виявили, що блокування ГМ-КСФ нейтралізуючими антитілами

Зо може запобігати або навіть лікувати прозапальні захворювання в різних моделях запалень, включаючи моделі артриту, експериментального автоїмунного енцефаліту, псоріазу та легеневих захворювань. Отже, дуже бажаним є отримання прийнятної композиції зі сполукою, яка нейтралізує ГМ-КСОФ, композиції, яка, зокрема, є стійкою та містить високі кількості сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСФ та/або яку може бути введено підшкірним шляхом.

Отже, технічним завданням цього винаходу є дотримання описаних вище потреб.

Винахід стосується вирішення цих потреб, отже він надає рішення технічного здійснення втілень, які стосуються цих композицій, а також способів та застосування цих композицій у лікуванні суб'єктів, які страждають від хвороб, для яких буде корисним введення сполук, які нейтралізують ГМ-КСФ. Характеристику та опис цих втілень надано тут, ілюстровано у

Прикладах та відображено у Формулі Винаходу.

Слід зазначити, що застосовані тут одиничні форми також включають посилання на множину, якщо тільки в тексті чітко не визначено іншого. Отже, наприклад, посилання на "антитіло" включають одне або декілька цих різних антитіл та посилання на "спосіб" включають посилання на еквіваленті відомі фахівцям у цій галузі операції та способи, які може бути модифіковано або застосовано замість описаних тут способів.

Якщо не зазначено іншого, то слід розуміти, що термін "цонайменше" передує серії елементів, які призначено для позначення кожного елементу у серіях. Фахівцю у цій галузі буде зрозуміло або він буде здатним встановити, із застосуванням не більш, ніж рутинних експериментів існування багатьох еквівалентів певних описаних в цьому документі втілень винаходу та ці еквіваленти також призначено бути охопленими винаходом.

Якщо у контексті не зазначено іншого, то під словом "містить" та його варіаціями, як-то "включає" та "входить до складу", слід розуміти включення зазначеного цілого числа або операції або групи цілих чисел або операцій, але без виключення будь-якого іншого цілого числа або операції або групи цілих чисел або операцій. У разі застосування тут терміну "що включає", його може бути заміщено терміном "що містить" або інколи застосовано тут разом з терміном "що має" або навіть може бути заміщено терміном "складається з".

У разі застосування тут терміну "складається з" він виключає застосування будь-якого елементу, операції або інгредієнту, не зазначеного у елементі Формули Винаходу. У разі застосування тут терміну "суттєво складається з" він не виключає матеріали або операції, які не бо істотно не впливають на основні та нові характеристики Формули Винаходу. У кожному зазначеному випадку будь-який термін "суттєво складається з" може бути заміщено терміном "складається з" та навпаки.

Як тут застосовано, слід розуміти, що кон'юнктивний термін "та/або", який знаходиться між численними переліченими елементами охоплює як окремі та к і поєднані варіанти. Наприклад, коли два елементи з'єднано між собою з допомогою терміну "та/або", то перший варіант має відношення до застосування першого елементу без другого, другий варіант має відношення до застосування другого елементу без першого, третій варіант має відношення до застосування першого та другого елементів між собою та розуміється, що будь-який з цих варіантів підпадає у це значення, отже, задовольняє умовам застосування у цій заявці терміну "та/або". Також зрозуміло, що паралельна застосовність більш, ніж одного з цих варіантів теж підпадає під це значення, отже також задовольняє застосованим в цьому описі вимогами терміну "та/або".

У тексті цієї заявки наведено посилання на різні окремі документи, кожен з яких (включаючи всі патенти, патентні заявки, наукові публікації, специфікації виробника, інструкції тощо), як-то зазначені у попередньому тексті або нижче включено сюди, як посилання у всій їх повноті. У тих випадках, якщо наведений в якості посилання матеріал буде або суперечити або не узгоджуватися з цією специфікацією, то ця специфікація буде замінювати собою будь-який такий матеріал. Ніщо не повинно тут бути витлумачено як допущення того, що якщо винахід без датування, це відкриття заднім числом на підставі попереднього винаходу.

Враховуючи завдання, яке полягає у отриманні композиції, яка буде містити високу концентрацію сполуки, що нейтралізує ГМ-КСФ, винахідники визнали, що сполуки, які нейтралізують ГМ-КСФ можуть бути нестійкими у разі їх застосування з високими концентраціями, а також можуть втрачати стійкість протягом тривалого строку зберігання.

Дійсно, існує багато причин нестійкості сполук, які нейтралізують ГМ-КСФ, як-то білків. Ця нестійкість може бути наслідком агрегації або деградації білків, а також може виникати через дезамінування, дезамідування, окислення, розриву та утворення дисульфідних зв'язків, гідролізу, сукцинімідування, утворення інших, ніж дисульфідні, перехресних зв'язків, деглікозилування, "ферментативного потемніння" (реакції Майяра) або виникати за рахунок будь-якого поєднання цих явищ; див., наприклад, Умапо еї аї. (1999), Іпі. У. Ріапт. 185: 129-188.

Крім того, на стійкість білка можуть впливати різні фізико-хімічні параметри, як-то температура, значення рН, тиск, поверхневе поглинання, вплив солей, іонів металів, хелатуючих засобів, фізичних сил, як-то сил зсуву, речовин, які викликають денатурацію білка, неводних розчинників, концентрація, джерело походження та чистота або морфізм білка.

Однак, в той час, як багато факторів можуть впливати на стійкість білка, також може бути вжито багато заходів, спрямованих до надання йому стійкості. Наприклад, білок може бути стабілізовано внутрішнім (заміщенням амінокислот) або зовнішнім чином. Зовнішньої стабілізації може бути досягнуто додаванням хелатуючих засобів, іонів металів, відновників, полімерів, поліетиленгліколів / поліолів, сироваткового альбуміну, поверхнево-активних речовин, цукрів та поліолів, жирних кислот та фосфоліпідів, амінокислот, буферів, тощо.; див., наприклад, УМапуд, У апа Напзоп М (1988), 9. Рагепіа! 5сі. 5 ТесппоїІоду, 42, Зирріетепі: 4-26;

Мапа еї аї. (1999), Іпі. У. Рнагт. 185: 129-188. В цілому, фахівець може мати багато варіантів стабілізації сполук, які нейтралізують ГМ-КСФ, як-то антитіл, у композиції.

У даному випадку винахідники зазначили, що сполуки, які нейтралізують ГМ-КСФ можуть утворювати агрегати та/або можуть бути нерозчинними з підвищеними концентраціями. Багато різних факторів можуть викликати агрегацію білків у композиції. Типові процедури очищення та зберігання можуть призвести до появи таких умов та компонентів білкових композицій, які викликають агрегацію білків з утворенням білкових димерів, тримерів або мультимерів та видимих та невидимих неозброєним оком частинок більшого розміру. Наприклад, агрегація білків у композиції може виникати внаслідок будь-якого одного або кількох наступних факторів, як-то зберігання, вплив підвищених температур, показник рН композиції, іонна сила композиції та наявність певних поверхнево-активних речовин та емульгаторів. Так само білки можуть утворювати агрегати під дією сили зсуву, як-то під час відновлення ліофілізованого білкового осаду у розчині, очищення фільтрацією білкового зразка, заморожування - відтавання, струшування або перенесення білкового розчину шприцем. Також агрегація може траплятися внаслідок взаємодій молекул поліпептидів у розчині та на поверхні розділу рідини та повітря всередині посудини протягом зберігання. Конформаційні змінення поліпептидів також можуть виникати у разі їх поглинання на поверхнях розділу повітря та рідини та повітря та твердої сполуки під час пресування або у разі збільшення цих поверхонь розділу, яке виникає внаслідок струшування під час перевезення. Це струшування може викликати агрегацію білка у складі композиції та зрештою призводити до його преципітації з іншими поглиненими білками. Ріст 60 кількості частинок, яких не можна побачити неозброєним оком може вказувати на тенденцію до появи частинок, які вже можна буде побачити. Взагалі утворення різних типів агрегатів та частинок може бути піддано аналізу із застосуванням різних систем вимірювання на основі розміру цих агрегатів або частинок, наприклад, із застосуванням ексклюзійної хроматографії (ЗЕС), способу динамічного розсіювання світла (015), або вимірювання площини під фармакокінетичною кривою (АС) можна виміряти димери, тримери, мультимери, розмір яких знаходиться в нанометричному діапазоні та із застосуванням способу підрахунку частинок в режимі світлотіні, мікроскопії побудови зображень в реальному масштабі часу, проточної цитометрії та лічильника Коултера можна виміряти частинки, яких не можна побачити неозброєним оком з розміром, який перевищує 1 мкм та малі видимі частинки.

Крім того, агрегацію білків може викликати дія світла на білкову композицію, отже винаходом передбачено композиції, які допускають наявність високих концентрацій сполук, що нейтралізують ГМ-КСФ та зменшення агрегації цих сполук. Без теоретичної прив'язки вважають, що цього зменшення досягають за рахунок керування одним або кількома із зазначених вище механізмів агрегації та це може привести до, наприклад, поліпшеної стійкості продукту та забезпечить більшу гнучкість у виробничих процесах та в умовах зберігання.

Винахід стосується отримання композиції з високою концентрацією сполук, які нейтралізують ГМ-КСФ для того, щоб, наприклад, зменшити об'єм ін'єкції до розміру, прийнятного для зменшення побічних проявів, як-то болю, викликаних великим об'ємом ін'єкції або для того, щоб дозволити здійснити підшкірне введення з низьким об'ємом.

Протягом досліджень винахідники спостерігали певну нестійкість сполуки, яка нейтралізує

ГМ-КСОФ, отже їх метою було покращення результатів цих небажаних спостережень. Відповідно їх зусилля були спрямовані до концентрування сполук, нейтралізуючих ГМ-КСФ з одночасним збереженням їх у розчині, тобто у розчиненому стані. Таким чином, вони мали безліч доступних варіантів та альтернатив, проте не мали жодної вказівки на те, що будь-який з них буде прийнятним для розв'язання цієї об'єктивної проблеми. "Розчинений стан" означає, що сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ, знаходиться переважно в концентрації принаймні приблизно 20 мг/мл у розчині, тобто вона є безпосередньо розчиненою та/або розсіяною з утворенням дисперсної системи у водному розчині (тобто у водній фазі) композиції. Переважно сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ є гомогенно розчиненою та/або

Зо розсіяною з утворенням дисперсної системи. Під гомогенністю мається на увазі, що сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ є розчиненою та/або розсіяною з утворенням дисперсної системи у водній композиції майже рівномірно та переважно є рівномірно розповсюдженою у цій водній композиції таким чином, що концентрація ("с") цієї сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСФ ("п" у випадку молярної маси або "т" у випадку маси) є майже однаковою, переважно однаковою у (або у всіх ділянках) об'ємі ("у") водного розчину, тобто, величина с-п/му або с-т/м, відповідно, є майже сталою, переважно сталою. У самій композиції переважно немає градієнта концентрації.

Відповідно стійку композицію за винаходом, яка містить нейтралізуючу ГМ-КСФ сполуку переважно може бути розглянуто у вигляді водного розчину, в якому сполуку, що нейтралізує

ГМ-КСФ безпосередньо розчинено та/або розсіяно з утворенням дисперсної системи. "Розчин" є гомогенною сумішшю двох або більше речовин/компонентів. У цій суміші розчинений компонент (який за винаходом є сполукою, що нейтралізує ГМ-КСФ) розчинено (як описано вище) у іншій речовині (за винаходом це переважно водна композиція), яка також відома, як розчинник.

Враховуючи вищезазначене слід вказати, що сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ переважно не є гетерогенно розчиненою та/або розсіяною з утворенням дисперсної системи у водному розчині. Термін "розчинений стан" також стосується того, що сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ переважно суттєво не є емульгованою або більш переважно зовсім не є емульгованою у водному розчині.

Термін "розчинений стан" також стосується того, що сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ переважно не є суттєво інкапсульованою та/або захопленою (переважно може бути інкапсульовано та/або захоплено менш, ніж 2 95, 1 95 або 0,5 95 цієї сполуки, яка нейтралізує ГІМ-

КСФ або більш переважно вона зовсім не є інкапсульованою та/або захопленою, наприклад, у ліпосомах, мультиламелярних ліпосомах тощо.

Відповідно, одним бажаним втіленням за винаходом є рідка композиція, яка містить сполуку, що нейтралізує ГМ-КСФ та яка є стійкою та не піддається утворенню кон'югатів /агрегатів/ частинок або фрагментів / продуктів деградації протягом тривалого періоду зберігання та зазначена композиція є прийнятною для підшкірного введення.

Точніше кажучи, після перевірки багатьох різних стабілізаторів, винахідники виявили, що сполукам, які нейтралізують ГМ-КСФ може бути надано стійкості у разі додавання регулятора бо тонічності до призначеного для зберігання розчину. Приклади регуляторів тонічності включають,

але без обмеження, цукри та цукроспирти. Прості цукри мають назву моносахаридів та включають глюкозу, фруктозу, галактозу, ксилозу, рибозу, манозу, лактулозу, алозу, альтрозу, гулозу, ідозу, талозу, арабінозу та ліксозу. Більш бажаними для цього винаходу є дисахариди, які включають, наприклад, сахарозу, мальтозу, лактозу, изомальтозу, трегалозу та целюлозу.

Цукроспирти включають сорбіт, манітол, гліцерин, еритрит, мальтит, ксиліт та полігліцитол. У бажаному втіленні цукор є невідновлювальним цукром, як-то цукрозою або трегалозою.

Невідновлювальні цукри відрізняються відсутністю відкритої ланцюгової структури, отже вони є несприйнятливими до окислювально-відновних реакцій. Отже, один або декілька невідновлювальних цукрів, як-то цукрозу або трегалозу або один або декілька цукроспиртів, як- то маніт або сорбіт може бути додано до композиції, яка містить сполуку, що нейтралізує ГМ-

КСФ. Також до цього розчину може бути додано комбінації невідновлювальних цукрів та цукроспиртів, як-то цукрози та маніту, цукрози та сорбіту, трегалози та маніту або трегалози та сорбіту. Більш переважним є додавання до розчину цукроспиртів маніту та/або сорбіту, переважно у їх Ю-формі, найбільш бажаним є додавання сорбіту. Концентрація регулятора тонічності, переважно сорбіту, складає приблизно 1-15 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 2-1095 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 3-7 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 4-6 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 5 95 (маса / об'єм).

Іншою особливо бажаною речовиною, призначеною для надання стійкості сполукам, які нейтралізують ГМ-КСФ з високою концентрацію з точки зору довготривалого зберігання є буферна система, рН якої знаходиться в межах приблизно 4-10, переважно приблизно 4-7, більш переважно приблизно 4-6 або приблизно 5-7, більш переважно приблизно 5,5-6,5 та більш переважно він складає приблизно 5,8. Цей буфер переважно може бути вибрано від гістидинового буфера, ацетатного буфера та цитратного буфера. Згаданий тут термін "амінокислота" має відношення до 1- або ЮО-амінокислот, але тут бажаним є застосування І - амінокислоти. Для зазначеної буферної системи переважним є застосування гістидину або його солі та переважно така сіль є хлоридом, фосфатом, ацетатом або сульфатом та більш переважно вона є хлоридом. рН гістидинової буферної системи знаходиться в межах приблизно 5-7, переважно приблизно 5,5-6,5, більш переважно рН приблизно або точно дорівнює 5,8.

Показник рН може бути доведено до потрібного значення з допомогою традиційно застосованих

Зо основ та кислот, переважно для регулювання рН застосовують МаОН або може бути застосовано суміш гістидину та солі гістидину у разі, якщо регулювання рН не потрібно.

Концентрація буферної системи, переважно гістидинової буферної системи складає приблизно 10-50 мМ, переважно приблизно 20-40 мМ, більш переважно приблизно ЗОмМ.

Також винахідниками було виявлено, що сполукам, які нейтралізують ГМ-КСФ може бути надано стійкості у разі додавання до призначеного для зберігання розчину однієї або кількох поверхнево-активних речовин, амінокислот, антиоксидантів та/або хелатуючих засобів.

Відповідно за бажаним втіленням для надання стійкості сполуці, яка нейтралізує ГМ-КСФ у розчині з метою запобігання агрегації та для отримання досить стійкої композиції для довгострокового зберігання та / або для одного або кількох циклів заморожування / відтавання застосовують комбінацію з буферної системи, переважно системи з гістидиновим буфером, регулятором тонічності, переважно цукроспиртом, більш переважно манітом або більш переважно сорбітом та поверхнево-активною речовиною, переважно полісорбатом 20 (РБЗ20;

ТМ/ЕЕМФ 20), полісорбатом 80 (РБ8О; ТМУЕЕМФ 80) та/або полоксамерами. Було виявлено, що с точки зору стійкості бажаний вміст цукроспирту, переважно сорбіту, у композиції складає приблизно б 95 (маса / об'єм) та вище, проте верхня межа осмоляльності знаходиться на позначці приблизно 500 мОсм/кг, яка ще є гіперосмотичною, але все ж є подібною до осмоляльності затвердженого продукту (Зупадіб; Пт.?? внутрішньом'язове введення). Отже, як описано у Прикладах за винаходом, було знайдено компроміс між оптимальною стійкістю, тонічністю та концентрацією цієї сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСФ, тому бажана концентрація цукроспирту, переважно сорбіту, складає приблизно 3-7 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 4-6 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 5 95 (маса / об'єм).

У певних втіленнях за винаходом, препарати або композиції за винаходом, які містять сполуку, що нейтралізує ГМ-КСОФ є вільними або суттєво вільними від хлориду натрію. Під "суттєво вільними" мається на увазі, що концентрація хлориду натрію складає або сильно наближається до 0 мМ, наприклад, є меншою, ніж приблизно 50 мМ, переважно є меншою, ніж приблизно 20 мМ, більш переважно є меншою, ніж приблизно 10 мМ, більш переважно є меншою, ніж приблизно 5 мМ та більш переважно є меншою, ніж приблизно 2 мМ або навіть меншою, ніж приблизно 1 мМ.

Застосована концентрація відповідних сполук, які нейтралізують ГМ-КСФ складає принаймні бо приблизно 20 мг/мл, переважно принаймні приблизно 50 мг/мл, більш переважно принаймні приблизно 60 мг/мл у рідкому препараті, призначеному для зберігання, заморожування /відтавання та/або який вже є готовим до застосування. У цьому винаході застосовано концентрації, які складають приблизно 20-200 мг/мл, переважно приблизно 40-200 мг/мл, більш переважно приблизно 50-180 мг/мл, більш переважно приблизно 70-170 мг/мл, більш переважно приблизно 75-165 мг/мл та більш переважно приблизно 80 мг/мл або приблизно 150 мг/мл.

Термін придатності отриманої рідкої композиції переважно має мінімальні вимоги у 24 міс. при температурі 2-8 "С, переважно 36 міс. при температурі 2-8 "С, більш переважно 48 міс. при температурі 2-8 "С та більш переважно 60 міс. при температурі 2-8 "С або принаймні 28 днів при температурі навколишнього середовища (25 "С ж 270).

Винахід стосується стійкої композиції, переважно стійкої рідкої композиції, яка неочікувано дозволяє здійснити довготривале зберігання сполук, які нейтралізують ГМ-КСФ. Ця композиція є зокрема корисною тому, що вона є більш зручною для її застосування пацієнтом, оскільки сполуки, які нейтралізують ГМ-КСФ та входять до складу цієї композиції є високо концентрованими, отже їх застосування призводить до зменшення побічних проявів, як-то болю, які виникають через великий об'єм ін'єкції.

Відповідно, один аспект винаходу має за основу виявлення того, що композиції, які містять: - сполуку, яка нейтралізує ГМ-КСФ, - буферну систему, переважно вибрану з гістидинового буфера, ацетатного буфера та/або цитратного буфера з рН переважно в межах 5-7, - регулятор тонічності, який переважно вибрано від невідновлювальних цукрів, як-то цукрози або трегалози або цукроспиртів, як-то маніту або сорбіту. - та одну або більше поверхнево-активних речовин, амінокислот, антиоксидантів та/або хелатуючих агентів, переважно поверхнево-активних речовин, які переважно вибрано від одного або кількох з наступного: полісорбат 20, полісорбат 80 або полоксамери. виявляються досить стійкими до довготривалого зберігання та/або до циклів заморожування / відтавання та/або до дії сил зсуву (стійкість в умовах струшування /перемішування. Композиція за винаходом має багато переваг у порівнянні зі стандартними буферизованими композиціями.

У одному аспекті, ця композиція виявляє мінімальну здатність до утворення агрегатів після

Зо довготривалого зберігання без шкідливих проявів, які можуть очікуватися у разі застосування композицій з високим вмістом білка. Інша перевага композиції за винаходом полягає у її низької в'язкості, у мінімальній фрагментації сполуки, яка нейтралізує ГМ-КОФ та у відсутності суттєвого впливу на біологічну активність цієї сполуки протягом тривалого зберігання.

Переважні втілення першого аспекту за винаходом стосуються композицій за винаходом, в яких сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ є поліпептидом, пептидоміметиком, нуклеїновою кислотою або малою молекулою.

У переважному втіленні, сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ (яка є переважно поліпептидом та більш переважно антитілом або його функціональним фрагментом) зв'язується або специфічно зв'язується з ГМ-КСФ або з рецептором ГМ-КСФ. Передбачається, що ГМ-КСФ або рецептор ГМ-КСФ є тваринного походження, включаючи, але не обмеження, ссавців, як-то лабораторних тварин (гризунів, як-то щурів, морських свинок, хом'яків або мишей, нелюдиноподібних приматів, як-то макаки-крабоїда або інших представників роду макак), свійських або хатніх тварин (як-то собак або кішок), сільськогосподарських тварин (наприклад, велику рогату худобу, овець, кіз та свиней), та / або людину. Переважно ГМ-КСФ або рецептор

ГМ-КСФф є, відповідно, ГМ-КСФ людини (Ното зарієп5) або рецептором ГМ-КСФ людини або, відповідно, ГМ-КСОФ нелюдиноподібного примату або рецептором ГМ-КСОФ нелюдиноподібного примату. Особливо бажаними варіантами (гомологами) ГМ-КСОФ нелюдиноподібного примату або рецептора ГМ-КСФ нелюдиноподібного примату є ГМ-КСФ або його рецептор гібона (Мотазсив сопсоЇог (Номаскус чорночубий), відомий також, як західний чорний чубатий гібон) та мавп роду макак, наприклад макаки-резуса (Масаса тиаца) та макаки-крабоїда (Масаса

Тазсісціагіб5). У відповідності з особливо бажаним втіленням винаходу, сполука, яка зв'язується з

ГМ-КСФ або з рецептором ГМ-КСФ (переважно антитіло або його фрагмент) виявляє перехресну специфічність до людини та принаймні до одного із зазначених тут видів мавп.

Наприклад, антитіло або його фрагмент є здатним до зв'язування (або до нейтралізації) як з ГМ-

КСФ людини, так і з ГМ-КСФ макаки-крабоїда (Масаса газсісціагіз). Це є особливо корисним для молекули антитіла, призначеної для терапевтичного введення пацієнту-людині, оскільки таке антитіло звичайно повинно пройти безліч досліджень, які передують нормативному затвердженню та деякі початкові перевірки з цих досліджень включають дослідження із застосуванням нелюдиноподібних тварин. Як види, відмінні від людини, , у разі проведення 60 таких досліджень бажано, як правило, застосовувати тварин, які мають високу ступінь генетичної схожості до людини (наприклад, нелюдиноподібних приматів, як-то макак), оскільки отримані таким чином результати звичайно дозволять з високим ступенем впевненості прогнозувати також відповідні результати, які можна очікувати у разі введення тієї ж молекули людині. Однак така отримана на основі досліджень на тваринах прогнозуюча спроможність принаймні частково залежить від ступеня порівнянності цих молекул та є дуже високою, якщо завдяки міжвидовій реактивності однакову терапевтичну молекулу може бути введено тваринним моделям та людині. Як у цьому втіленні винаходу, якщо молекула антитіла здатна до взаємодії з однаковим антигеном в організмі людини та інших близькоспоріднених видів, то може бути здійснено дослідження із застосуванням такої саме молекули антитіла людини та із застосуванням цих саме близькоспоріднених видів, наприклад, одного з зазначених вище видів мавп. Це призведе до збільшення як ефективності самих досліджень, так і ефективності наданої з допомогою цих тестів прогнозуючої спроможності стосовно поведінки цих антитіл в організмі людини, тобто кінцевого виду, який представляє інтерес з терапевтичної точки зору. Бажано, щоб антитіло або його функціональний фрагмент, який зв'язується з ГМ-КСФ або з рецептором

ГМ-КСФ було моноклональним антитілом або його функціональним фрагментом. Те ж саме вірно й для альтернативних варіантів зі сполуками, які нейтралізують ГМ-КСФ та не належать до антитіл або не походять від антитіл.

Переважно сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ є моноклональним антитілом людини або його функціональним фрагментом.

Сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ може бути антитілом або його функціональним фрагментом, який зв'язується з епітопом ГМ-КСФ людини та нелюдиноподібного примату та цей епітоп переважно містить амінокислоти 23-27 (ККІІЇМ) та/або амінокислоти 65-77 (СГ К/ОО5І ТКІ КО РІ). Мінливість у положенні 67 в межах відрізка амінокислотної послідовності 65-77 є відображенням гетерогенності у цій частині ГМ-КСОФ між, з одного боку, ГМ-КСФ людини та гібону (в якому в положенні 67 знаходиться ЕК) та, з іншого боку, ГМ-КСФ мавп роду макак, наприклад макаки-крабоїда та макаки-резуса (в якому в положенні 67 знаходиться 0). Якщо зазначений епітоп включає два несуміжних відрізки амінокислотної послідовності, як-то 23-27 (КАС-М) та 65-77 (БІ К/0051 ТКІ КОРІ), то цей епітоп також може мати назву "переривчастого" епітопу. Цей епітоп ГМ-КСОФ або цей переривчастий епітоп ГМ-КСФ може також містити

Зо амінокислоти 28-31 (І ЗК), амінокислоти 32-33 (ТА) та /або амінокислоти 21-22 (ЕА).

Моноклональне антитіло людини або його функціональний фрагмент переважно містить ділянку СОКЗ у складі власної змінної ділянки важкого ланцюга, яка містить амінокислоту послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо 1-13 та 56; переважно змінна ділянка важкого ланцюга ділянки СОКЗ включає амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо: 2.

Будь-яка з цих послідовностей ділянки СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга також може існувати разом у змінній ділянці важкого ланцюга з ділянкою СОКІ1 змінної ділянки важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо 14 та з ділянкою

СОН змінної ділянки важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у

ЗЕО ІЮ Мо 15.

Також моноклональне антитіло людини або його функціональний фрагмент може містити ділянку СОКІ у власній змінній ділянці легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Мо 16, ділянку СОК2, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО І Мо 17 та ділянку СОКЗ, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо 18.

У особливо бажаному аспекті винаходу, моноклональне антитіло людини або його функціональний фрагмент містить ділянку СОК!І у власній змінній ділянці легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо 16, ділянку СОК2, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕБО ІО Мо 17 та ділянку СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮО Мо 18 та ділянку СОК!І1 у власній змінній ділянці важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мое14, ділянку СОК2, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮО Мо 15 та ділянку

СОМКЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо: 1-13 та 56, більш переважно 5ЕО ІЮО Мо 2.

Відповідно за бажаним втіленням, моноклональне антитіло людини або його функціональний фрагмент містить амінокислотну послідовність у власній змінній ділянці легкого ланцюга, яку вибрано з групи, що складається з послідовностей 5ЕО ІЮ МоМо: 19, 54 та 55.

Відповідно за іншим бажаним втіленням, моноклональне антитіло людини або його функціональний фрагмент містить у власній змінній ділянці важкого ланцюга амінокислотну 60 послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей 5ЕО ІЮ МоМо 20-33, 52 та 53. У додатковому втіленні, моноклональне антитіло людини або його функціональний фрагмент може також містити легколанцюгову амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо34 та/або важколанцюгову амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей, як наведено у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо 35-48, більш переважно

ЗЕО ІЮО Мо 35.

Моноклональне антитіло людини або його функціональний фрагмент може містити одну або декілька амінокислотних послідовностей, які мають принаймні 70 9», 80 95, 90 Фо, 95 У», 98 95 або 9995 подібності до відповідної амінокислотної послідовності, як зазначено у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮО МоМо 1-48 та 52-56 та переважно до відповідної амінокислотної послідовності, як зазначено у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо 1-18 та 56 та/або до амінокислотної послідовності каркасних ділянок (ЕК) в межах амінокислотної послідовності, як зазначено у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо 19-48 та 52-55. Отже, у бажаному втіленні моноклональне антитіло людини або його функціональний фрагмент може містити одну або декілька амінокислотних послідовностей, які мають 70 95, 80 95, 90 95, 95 95, 98 95 або 99 95 подібності до відповідної амінокислотної послідовності, як зазначено у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо 1-18 та 56.

Як варіант, у будь-якій з амінокислотних послідовностей ЗЕО ІЮО МоМо 1-18 та 56 у складі ділянки СОК може бути заміщено одну, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або десять амінокислот. Переважно така ділянка СОК, що має заміщення, як тут описано, зберігає власну здатність до зв'язування з ГМ-КСФ.

Як варіант, або на додачу до цього, бажаним є, щоб моноклональне антитіло людини або його функціональний фрагмент могло містити одну або декілька амінокислотних послідовностей, які мають 70 95, 80 95, 90 95, 95 95, 98 95 або 99 95 подібності до відповідної амінокислотної послідовності ділянок МН, М, Н або Г, тобто як відповідно наведено у будь-якій з послідовностей 5ЕО ІЮ МоМо 19-48 та 52-55. Переважно, ця подібність існує по всій довжині амінокислотної послідовності ділянок МН, МІ, Н або Ї. Більше переважно, ця подібність знаходиться в межах ділянок СОК, як було описано раніше або ця подібність знаходиться в межах каркасних ділянок (ЕК або не-СОК ділянок) у складі такої ділянки МН, МІ, Н або Її, як наведено у будь-якій з послідовностей 5ЕО ІЮ МоМо 19-48 та 52-55. Відповідно, у кожній з каркасних ділянок може бути заміщено 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або 25 амінокислот. Як тут описано, такий ЕК - заміщений варіант зберігає здатність до зв'язування з ГМ-КСФ.

Фахівець може легко виявити каркасні ділянки (ЕК або не-СОК ділянки) в межах послідовностей 5ЕО ІЮ МоМо 19-48 та 52-55, оскільки у послідовностях 5ЕО ІЮ МоМо 1-18 та 56 було виявлено послідовності СОК, які входять до складу однієї або кількох МН, МІ, Н або І- ділянок, виявлених у послідовностях ЗЕС ІЮ МоМо 19-48 та 52-55. Зокрема, перелік цих послідовностей надано у ідентифікаторі послідовностей «223» з позначенням кожної з цих амінокислотних послідовностей. Однакові позначення вказують, що ці амінокислотні послідовності "належать" до спільної групи, тобто з СОМ -ділянкою, розташованою у ділянці МН,

МІ, Н або Ї. Наприклад, послідовності 5ЕБЕО ОО МоМо 16, 17, 18 є амінокислотними послідовностями, СОК-ділянки яких знаходяться у амінокислотній послідовності «ЕС ІЮО Мо 19 (оскільки всі з них позначено, як "5-306").

Як додаткову ілюстрацію слід зазначити, що у разі заміщення амінокислот в одній або у кількох або у всіх СОК- або ЕК- ділянках важкого та/або легкого ланцюга, бажаним є отримання таким чином "заміщеної" послідовності, яка буде мати принаймні 70 95, більш переважно 80 95, навіть більш переважно 9095, більш переважно 9595, більш переважно 9895 або 9995 ідентичності до "оригінальної" СОМК- або ЕК-послідовності. Це означає, що вона є настільки залежною від довжини СОК- або ЕК-ділянки, наскільки ця ділянка є гомологічною "заміщеній" послідовності.

Подібність визначають із застосуванням стандартних програм вирівнювання послідовностей, як-то Месіог МТІ (Іп'огМахтМ, Магуїапа, ОБА) або переважніше з допомогою програми ВГАБТР, переважно із застосуванням версії ріабір 2,2,5 (Мометрег 16, 2002; сії.

АБспиї, 5. Е. єї а. (1997) Мисі. Асідз Вев. 25, 3389-3402). Відсоток подібності визначають на основі вирівнювання послідовностей всього поліпептиду (матриця: ВГОБОИМ 62; ціна пролому: 11,1; набір граничного значення до 10-3) із застосуванням будь-якої з амінокислотних послідовностей СОР, МН, МІ, Н або І з посиланням на попарне порівняння. Його обчислюють у вигляді відсотка кількості "позитивних значень" (гомологічних амінокислот), визначеного поділом значення, отриманого з допомогою програми ВГАБЗТР, розділеного на загальну кількість амінокислот, вибраних із застосуванням програми для вирівнювання.

Як тут застосовано, термін "подібність" стосовно амінокислотних або нуклеотидних послідовностей може бути застосовано взаємозамінно з терміном "ідентичність". Застосований у винаході термін "подібність" означає відсоток однакових парних залишків, отриманий після гомологічного вирівнювання амінокислотної послідовності або нуклеотидної послідовності за винаходом з досліджуваною послідовністю по відношенню до кількості залишків по всій довжині цих двох послідовностей. Як описано вище, програми, призначені для визначення подібності (або ідентичності) порівнюють вирівняні послідовності на основі зіставлення амінокислот з амінокислотами та може бути встановлено різні рівні жорсткості для цього порівняння (наприклад, однакових амінокислот, консервативних амінокислотних заміщень тощо). У контексті застосованого тут терміну дві досліджувані амінокислоти будуть вважатися між собою "консервативними заміщеннями", якщо кожна з них належить до однакового хімічного класу, тобто до класу кислих; неполярних / гідрофобних; незаряджених полярних та лужних амінокислот. Як необмежений приклад, дві різні амінокислоти, що належать до класу неполярних амінокислот може бути розглянуто, як "консервативні заміщення" навіть якщо вони не є однаковими, тоді як неполярну амінокислоту з одного боку та основну амінокислоту з іншого не може бути розглянуто "консервативно заміщуючими" одна одну. У книзі "МоїІесшіаг

Віоіоду ої Ше Сеї" ("Молекулярна біологія клітини"), 44п Едйіоп (2002), Бу АІрегів, доппзоп, І ем/ів,

Кай, Кобрегпі5 апа Умаїйег (Рапе! 3,1) амінокислоти розділено на чотири головні групи: кислі, неполярні, незаряджені полярні та основні. Таке розподілення може бути застосовано також для визначення у контексті винаходу, буде чи не буде певна амінокислота являти собою консервативне заміщення іншої, досліджуваної амінокислоти. Вищезазначені головні групи амінокислот також може бути розділено на підкласи, як-то, наприклад, на малі та великі неполярні амінокислоти, велик ароматичні амінокислоти тощо. Під терміном "консервативне амінокислотне заміщення" також мається на увазі будь-яке амінокислотне заміщення для вибраного амінокислотного залишку, в якому призначений для заміщення залишок є настільки хімічно подібним до вибраного залишку та це заміщення не призведе до суттєвого зниження функції поліпептиду (наприклад, зв'язування).

Сполуку, яка нейтралізує ГМ-КСФ звичайно отримують, як фармацевтичну композицію для парентерального, наприклад, внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньоочеревинного,

Зо внутрішньом'язового, місцевого або внутрішньошкірного введення суб'єкту, з яких бажаним є підшкірне введення. У деяких втіленнях фармацевтична композиція є рідкою, переважно водною композицією.

У одному втіленні концентрація сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСФ у рідкій фармацевтичній композиції, призначеної для зберігання, заморожування / відтавання та/або готової до застосування складає принаймні 20 мг/мл, переважно принаймні приблизно 50 мг/мл, переважно принаймні приблизно 60 мг/мл. У винаході застосовано концентрації, які складають приблизно 20-200 мг/мг, переважно приблизно 40-200 мг/мл, більш переважно приблизно 50- 180 мг/мл, більш переважно приблизно 70-170 мг/мл, більш переважно приблизно 75-165 мг/мл та більш переважно приблизно 80 мг/мл або приблизно 150 мг/мл. У певних втіленнях, наприклад, коли композицію призначено для підшкірного введення, може бути застосовано ще більші концентрації сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСОФ.

Як зазначено вище, композиції за винаходом містять буфер. Термін "буфер", як тут застосовано, має відношення до доданої композиції, яка дозволить рідкому препарату бути стійким до змінень рН. У певних втіленнях доданий буфер дозволяє рідкому препарату бути стійким до змінень рН дією його кислотно-лужних кон'югатних компонентів. Приклади прийнятних буферів включають, але без обмеження, буферизовану гістидинову, ацетатну або цитратну систему.

Як тут застосовано, термін "специфічно зв'язується" або пов'язані з ним терміни, як-то "специфічне зв'язування", "зв'язування специфічним чином", "специфічний зв'язуючий засіб" тощо має відношення до здатності сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСФ та переважно (людського) (моноклонального) антитіла або його функціонального фрагмента розрізняти свою мішень (наприклад, ГМ-КСФ або рецептор ГМ-КСФ) та будь-який інший потенційний антиген, який відрізняється від ГМ-КСФ або рецептора ГМ-КОФ до такої міри, що з безлічі різних антигенів, як потенційних партнерів зв'язування, з нею зв'язується або суттєво зв'язується лише ГМ-КСФф / рецептор ГМ-КСФ. В межах винаходу, мішень є "суттєво" зв'язаною, коли з численних однаково доступних різних антигенів, як потенційних партнерів зв'язування, ця мішень частіше зв'язується принаймні в 10 разів, переважно принаймні в 50 разів, більш переважно принаймні в 100 разів або більше (в кінетичному сенсі), ніж будь-який інший антиген, який відрізняється від мішені.

Такі кінетичні вимірювання може бути здійснено, наприклад, із застосуванням технології ЗРК бо (поверхневого плазмонного резонансу), як-то, як тут застосовано, із застосуванням системи

Віасоге. Термін "(специфічне) зв'язування з" або пов'язані з ним терміни, як-то "(специфічне) впізнавання", "спрямовано до", "(специфічно) взаємодіє з" та "(специфічно) реагує з" відповідно за винаходом означає, що сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ (наприклад, антитіло) виявляє помітну спордненість до своєї мішені (наприклад, до ГМ-КСФ або до рецептора ГМ-КСФ) та звичайно не виявляє суттєвої реакційної активності з іншими, ніж зазначені мішені білками або антигенами. "Помітна спорідненість" стосується зв'язування зі спорідненістю приблизно у 10-6 М (КО) або ще сильнішою, як-то 10-7 М або сильнішою. Переважно, зв'язування вважається специфічним, коли зв'язувальна спорідненість складає приблизно 10-11-10-8 М, переважно приблизно 10-11-10-9 М, більш переважно приблизно 10-11-10-10 М. Спроможність сполуки (наприклад, антитіла) специфічно реагувати з або зв'язуватися з мішенню може бути легко перевірено, зокрема порівнянням реакції цієї сполуки з власним білком-мішенню або антигеном з реакцією цієї сполуки з іншими, ніж ця мішень, білками або антигенами. Переважно сполука за винаходом суттєво не зв'язується або зовсім не здатна до зв'язування з білками або антигенами, відмінними від ГМ-КСФ або рецептора ГМ-КСФ. Термін "суттєво не зв'язується" або "є нездатною до зв'язування" означає, що ці сполуки за винаходом не виявляють реакційної активності, яка є більшою, ніж 30 95, переважно більшою, ніж 20 95, більш переважно більшою, ніж 10 95, зокрема переважно більшою, ніж 9 о, 8 Ус, 7 У, б Уо або 5 95 та яку спрямовано до інших, ніж ГМ-КСФ або рецептор ГМ-КСФ білків або антигенів.

Як тут застосовано, терміни "нейтралізація", "нейтралізатор", "нейтралізуючий" та їх граматично споріднені варіанти мають відношення до часткового зменшення або повного припинення біологічної дії (дій) ГМ-КСФ, яке може бути наслідком змінення, переривання та/або скасування ГМ-КСФ-опосередкованих процесів, як-то сигнальної трансдукції, проявами якої є, наприклад, внутрішньоклітинне сигналування, клітинна проліферація або вивільнення розчинних речовин, посилення або пригнічення активування внутрішньоклітинної експресії генів, яка, наприклад, призводить до експресії поверхневих рецепторів інших, ніж ГМ-КСФ лігандів.

Фахівцям зрозуміло, що існують численні способи визначення того, чи може та чи інша сполука, наприклад антитіло або його функціональний фрагмент, бути класифікована, як нейтралізатор.

Наприклад, це може бути виконано з допомогою стандартної перевірки іп міго, яку звичайно здійснюють, як наведено нижче. У перших дослідженнях проліферації здійснюють інкубування клітинної лінії, ступінь проліферації якої, як відомо, залежить від активності ГМ-КСФ, з серіями зразків зі змінними концентраціями ГМ-КСФ, після якого вимірюють рівень проліферації клітинної лінії. Ці вимірювання дозволяють визначити концентрацію ГМ-КСФ, яка призводить до напівмаксимальної проліферації клітин. Далі здійснюють другі дослідження проліферації із застосуванням в кожній із серій зразків тієї ж кількості клітин, яку було застосовано в перших дослідженнях проліферації, визначеної вище концентрації ГМ-КСФ та цього разу здійснюють дослідження змінних концентрацій сполуки, яка, як підозрюють, є нейтралізатором ГМ-КОФ.

Потім знову вимірюють клітинну проліферацію для визначення концентрації досліджуваної сполуки, якої достатньо для викликання напівмаксимального пригнічення росту. Якщо отриманий графік залежності пригнічення росту до концентрації досліджуваної сполуки буде мати сигмоїдальну форму, то це є наслідком зниження клітинної проліферації зі збільшенням концентрації досліджуваної сполуки та досягненням в такому разі певного рівня пригнічення росту, тобто певної нейтралізації активності ГМ-КСФ. У такому разі досліджувану сполуку може бути розглянуто, як "нейтралізатор" у сенсі цього винаходу. Одним прикладом клітинної лінії, ступінь проліферації якої, як відомо, залежить від активності ГМ-КСФ, є клітинна лінія ТЕ-1, як описано у Кіатига, Т. еї а. (1989). У СеїІ Рпузіої. 140, 323-34.

Будь-якому фахівцеві у цій галузі буде зрозуміло, що ступінь клітинної проліферації є не єдиним параметром визначення нейтралізуючої здатності ГМ-КСФ. Наприклад, для визначення можливого нейтралізатора / пригнічувача ГМ-КСФ може бути застосовано вимірювання концентрації сигнальних молекул (наприклад, цитокінів), рівень секреції яких як залежить від

ГМ-КОФ.

Інші приклади клітинних ліній, які може бути застосовано для визначення того, чи буде досліджувана сполука, як-то антитіло або його функціональний фрагмент нейтралізатором активності ГМ-КСФ, включають клітинні лінії АМІ--193 (І апде, В. єї аї. (1987). Віоса 70, 192-9); аЕ-08 (Батрвагїйаі, А. еї а!. (1993). Віоса 81, 1376-83); М/5О (Об7, 5. вї а. (1990). Ехрегітепіа!

Нетаїйоіоаду 18, 1108-11); МО7Е (Амап?і, С. 0. єї а). (1990). доштпаї ої СеІШіаг Рнузіоіоду 145, 458- 64); ТАТІ -103 (МаїНе!ї, М. еї аї. (1987). Уоитаї ої Іттипоїоду 138, 4042-50); та ОТ-7 (Котаїви, М. еї а. (1991). Сапсег Везвєагсй 51, 341-8).

Зрозуміло, що нейтралізацію ГМ-КСФ за винаходом може бути здійснено або поза клітинами, які мають рецептори ГМ-КСФ або всередині цих клітин. Отже, нейтралізація 60 сполукою ГМ-КСФ може полягати або у пригніченні або у запобіганні зв'язування ГМ-КОФф зі своїм специфічним рецептором або у пригніченні внутрішньоклітиного сигналу, викликаного зв'язуванням цитокінів з їх рецепторами. Сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ може, наприклад, безпосередньо зв'язуватися з ГМ-КСФ або з рецептором ГМ-КСФ, що в обох випадках перешкоджає біологічним діям ГМ-КОФ.

Як визначено вище, інгібітори ГМ-КСФ може бути вибрано з групи, яка складається з поліпептиду, пептидоміметика, молекули нуклеїнової кислоти та малої молекули.

Термін "поліпептид", як тут застосовано, стосується групи молекул, яка звичайно складається з принаймні 30 амінокислот, з'єднаних між собою з допомогою ковалентного пептидного зв'язку. Відповідно за винаходом, група поліпептидів включає "білки", які складаються з одиночного поліпептиду або з більш, ніж одного поліпептиду. Терміном "поліпептид" також можна позначити фрагменти білків, допоки вони будуть складатися принаймні з 30 амінокислот. У цій галузі добре відомо, що поліпептиди можуть утворювати мультимери як-то димери, тримери та олігомери більш високого порядку, тобто які складаються з більш, ніж однієї поліпептидної молекули. Такі мультимери також охоплюються визначенням терміну "поліпептид". Поліпептидні молекули, які утворюють такі димери, тримери тощо можуть бути однаковими або різними. Відповідні структури високого порядку цих мультимерів тому мають назву гомо- або гетеродимерів, гомо- або гетеротримерів тощо. Прикладом гетеромультимеру є молекула антитіла, яка у власній природній формі складається з двох однакових легких поліпептидних ланцюгів та двох однакових важких поліпептидних ланцюгів.

Терміни "поліпептид" та "білок' також мають відношення до природних або до штучно модифікованих поліпептидів / білків, модифікація яких полягає, наприклад, у пост-трансляційних зміненнях, як-то у глікозилуванні, ацетилуванні, фосфорилюванні, утворенні дисульфідних місткових зв'язків тощо або у хімічних зміненнях, як-то ПЕГілування. Такі модифікації добре відомі у цій галузі.

Терміном "нуклеїнова кислота" або "полінуклеотид" у контексті за винаходом визначено полімерні макромолекули, які складаються з численних повторюючихся одиниць фосфорної кислоти, цукру та пуринових та піримідинових основ. Втілення цих молекул включають ДНК,

РНК та ПНК. Нуклеїнова кислота може бути одноланцюговою або дволанцюговою, лінійною або кільцевою. У окремому переважному втіленні нуклеїнова кислота в контексті за винаходом є

Зо аптамером. Аптамери нуклеїнових кислот є молекулами ДНК або РНК, які було вибрано з випадкових пулів на основі їх здатності зв'язувати інші молекули. Було вибрано аптамери, які зв'язують нуклеїнові кислоти, білки, невеликі органічні сполуки та навіть цілі організми. Вони, як правило, складаються з коротких відрізків олігонуклеотидів, звичайно у 50 основ або менше.

Термін "мала молекула" є визначенням групи природних лікарських сполук з молекулярною масою, меншою, ніж 1000 Да, переважно до 800 Да та більш переважно 300-700 Да. Верхня межа молекулярної маси для малих молекул надає їм можливість швидко проходити крізь клітинні мембрани, отже таким чином вони можуть досягнути призначених внутрішньоклітинних місць дії. Малі молекули може бути отримано від принаймні частково рандомізованої пептидної бібліотеки. Бібліотеки прийнятних для винаходу малих молекул добре відомі у цій галузі та/або їх можна придбати у комерційних дистриб'юторів.

Термін "пептидоміметик" стосується малого білковоподібного ланцюга, розробленого для імітації пептидної молекули. Цей тип молекул отримують штучним шляхом із застосуванням модифікації існуючого пептиду з метою змінення його молекулярних властивостей. Наприклад, існуючий "батьківський" пептид модифікують для змінення його молекулярної стійкості або біологічної активності. До цих модифікацій належить змінення їх каркасної основи та введення штучних амінокислот.

Термін "рецептор, ГМ-КСФ" має відношення до фізіологічного клітинно-поверхневого рецептора ГМ-КСФ, який описано у цій галузі, як гетеромер, що складається з альфа-ланцюга (СО116) та звичайної бета (бета-с) субодиниці.

У бажаному втіленні нейтралізуючий поліпептид є антитілом або його функціональними фрагментами, більш переважно антитілом людини або його функціональними фрагментами.

Способи отримання антитіл добре відомі у цій галузі та опис їх надано, наприклад у книгах

Напохм апа Гапе "Апііродіев, А Гарогаїогу Мапиа!" ("Практикум по антитілам"), Соїд Зргіпд Нагрог

І арогафогу Ргез5, 1988 та Нагіоуг апа Гапе "Овіпуд Апіїродіє5: А І арогаїгу Мапиа!" ("Практикум по застосуванню антитіл") Со Зргіпуд Нагбог І арогаїогу Ргез5, 1999.

Визначення терміну "антитіло" включає такі втілення антитіл, як моноклональні, химерні, одноланцюгові, гуманізовані антитіла, а також антитіла людини. На додачу до повнорозмірних антитіл, це визначення також охоплює похідні та фрагменти антитіл, як-то, зокрема, Еаб - фрагменти. До фрагментів або похідних антитіл також належать фрагменти К(ар)2, Ем, зсЕм або 60 однодоменні антитіла, як-то доменні антитіла або нанотіла, антитіла з одиничним змінним доменом або одиничний змінний домен імуноглобуліну, який містить лише один змінний домен, який може бути доменом МНН, МН або Мі та який специфічно зв'язує антиген або епітоп незалежно від інших змінних ділянок або доменів; див., наприклад, Нагом апа І апе (1988) апа (1999), Іос. сії.; Копіегтапп апа Юабеї, Апібоду Епдіпеегіпд (Інженерія антитіл"), Зргіпдег, 2па ей. 2010 апа Гіше, Кесотрбіпапі Апіїбодіе5 юЮг Іттипоїпегару ("Застосування рекомбінантних антитіл у імунотерапії"), Сатьгідде Опімегейу Рге55 2009. Також цей термін охоплює діатіла або антитіла з подвійною спорідненістю та зміненням спрямованості (так звані САВТ-антитіла).

Також цим терміном передбачено існування (біспецифічних) одноланцюгових діатіл, тандемних діатіл (ТапдаБб), "мінітіл", наприклад, які мають наступну структуру: (МН-МІ-СНЗ)2, (всЕхм-СНЗ)2 або (5сЕм-СНЗ-5сЕм)2, "Ес БАКТ" та "дб АКТ", а також мультитіл, як-то тріатіл. Одиничні змінні домени імуноглобуліну охоплюють не лише виділений поліпептид одиничного змінного домену антитіла, але й також великі поліпептиди, які містять один або декілька мономерів послідовності поліпептиду одиничного змінного домену антитіла.

Крім того, як тут застосовано, термін "антитіло" також стосується похідних або варіантів описаних тут антитіл, які виявляють таку ж саме специфічність, як і описані антитіла. Приклади "варіантів антитіл" включають гуманізовані варіанти антитіл, які не належать людині, "антитіла з дозрілою спорідненістю" (див., наприклад Нам/Кіп5 еї аїЇ. У. Мої. ВіоЇ. 254, 889-896 (1992) та

І ом/тап сеї а!., Віоспетівігу 30, 10832-10837 (1991)) та мутанні антитіла зі зміненою ефекторною функцією (функціями) (див., наприклад, Патент США Мо 5 648260, Копіегтапп апа рабеї (2010),

Іос. сії. апа ГП ІШе(2009), ос. сії.).

Термін "антитіло" також включає імуноглобуліни (Ід'5) різних класів (тобто ІдДА, Ід, ІЗ9М, дО та ІЗЕ) та підкласів (як-то дДСО1, Ідс2 тощо). Похідні антитіл, які також підпадають під визначення терміну "антитіло" за винаходом включають також модифікації цих молекул, як-то, наприклад, глікозилування, ацетилування, фосфорилювання, утворення дисульфідних зв'язків, фарнезилування, гідроксилування, метилування або естерифікацію.

Функціональний фрагмент антитіл включає домен фрагменту Е(аб")2, фрагмент Раб, 5сЕмМ або конструкції, які містять одиничні змінні домени імуноглобуліну або поліпептиди одиничних доменів антитіл, наприклад одиничні змінні домени важкого ланцюга або одиничні змінні домени легкого ланцюга, а також інші фрагменти антитіл, як тут описано вище. Фрагменти

Зо Каь")2 або Раб може бути перебудовано таким чином, щоб мінімізувати або повністю усунути внутрішньомолекулярні дисульфідні взаємодії, які виникають між доменами СНІ та СІ.

Під застосованим тут терміном "людське" антитіло слід розуміти антитіло або його функціональний фрагмент, що містить амінокислотну послідовність (послідовності) з набору послідовностей антитіла зародкової лінії людини. Отже, для цілей цього визначення, антитіло або його фрагмент можуть вважатися людськими, якщо вони складаються з цих амінокислотних послідовностей(послідовності) зародкової ліні людини, тобто, якщо амінокислотна послідовність (послідовності) досліджуваних антитіл або її функціональний фрагмент є однаковим з отриманою експресією амінокислотною послідовністю (послідовностями) зародкової лінії людини. Антитіло або його функціональний фрагмент також може бути розглянуто, як людське, якщо воно складається з послідовності (послідовностей), яка (які) відрізняється (відрізняються) від близької до неї (до них) послідовності (послідовностей) зародкової лінії людини на не більш, ніж буде очікуватися внаслідок впливу соматичної гіпермутації. Також у отриманому експресією сироватковому спектрі людських антитіл можна очікувати існування антитіл багатьох нелюдиноподібних видів ссавців, наприклад гризунів, як-то мишей та щурів, які містять амінокислотні послідовності МН СОКЗ. Будь-яку таку послідовність (послідовності) людського або тваринного походження, яка, як може очікуватися, буде існувати у отриманому внаслідок експресії сироватковому спектрі людських антитіл також може бути розглянуто, як "людську" для цілей цього винаходу. Отже термін "антитіло людини" включає антитіла, які мають змінні та сталі ділянки, які є суттєво відповідними відомим у цій галузі послідовностям імуноглобуліну зародкової лінії людини, включаючи, наприклад, описані у Кабаї еї аіІ. (див. Кабраї еї а). (1991) ос. сй.). Людські антитіла за винаходом можуть містити амінокислотні залишки, не закодовані у послідовностях імуноглобуліну зародкової лінії людини (наприклад, через мутації, які було введено шляхом випадкового або сайт-специфічного мутагенезу іп міго або соматичної мутації іп мімо), наприклад, у ділянках СОК. та, зокрема, у ділянці СОКЗ. Антитіло людини може мати принаймні 1,2,3,4,5, або більше положень, амінокислотні залишки в яких заміщено іншими амінокислотними залишками, не закодованими у послідовностях імуноглобуліну зародкової лінії людини.

Антитіла нелюдинного походження та антитіла людини або їх функціональні фрагменти переважно є моноклональними та зокрема досить важким є отримання моноклональних 60 людських антитіл. На відміну до злитих мишачих В - клітин з іморталізованих клітинних ліній,

злиті людські В - клітини з іморталізованих клітинних ліній є нежиттєздатними, отже отримання моноклональних людських антитіл є результатом подолання суттєвих технічних перешкод, які за загальним визнанням існують у галузі технології отримання антитіл. Моноклональна природа антитіл зокрема робить їх добре прийнятними для застосування в якості терапевтичних засобів, оскільки такі антитіла будуть існувати у вигляді єдиних гомогенних видів молекул, які може бути добре описано, відтворено та очищено. Ці фактори призводять до отримання продуктів, активні біологічні властивості яких може бути передбачено з високим рівнем точності та є дуже важливим, коли такі молекули отримують дозвіл контролюючих установ на їх терапевтичне застосування у людини. Як тут застосовано, термін "моноклональне антитіло" має відношення до антитіла, отриманого з популяції суттєво гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, які складають цю популяцію є однаковими за виключенням можливих природно трапляючихся мутацій та/або пост-трансляційних модифікацій (наприклад, ізомеризацій, амідування), які можуть бути присутніми у незначній кількості. Моноклональні антитіла є високоспецифічними, оскільки вони є спрямованими проти одиничного антигенного сайту. Крім того, на відміну до традиційних (поліклональних) антитіл, препарати яких звичайно включають різні антитіла, спрямовані проти різних ділянок зв'язування (епітопів), кожне моноклональне антитіло спрямовано лише проти одиничної ділянки зв'язування антигену. Окрім їх специфічності, перевага моноклональних антитіл полягає в тому, що їх можна синтезувати із застосуванням гібридомної культури, незабрудненої іншими імуноглобулінами. Модифікатор "моноклональне" вказує на характер антитіла, як на отримане від суттєво гомогенної популяції антитіл та не може тлумачитися, як вимога отримання антитіл із застосуванням будь-якого певного способу.

Наприклад, моноклональні антитіла для застосування за винаходом може бути отримано з допомогою гібридомного способу, вперше описаного у КопПіег єї аї., Майиге, 256: 495 (1975) або може бути отримано із застосуванням технологій рекомбінантних ДНК (див., наприклад, Патент

США Мо 4816567). "Моноклональні антитіла" також може бути отримано з фагових бібліотек антитіл із застосуванням способів, описаних, наприклад, у Сіаскзхоп еї аї., Майте, 352: 624-628 (1991) та Магкз еї аї., у. Мої. Віої., 222: 581-597 (1991).

Особливо бажано, щоб моноклональне антитіло або відповідні функціональні фрагменти було антитілом або відповідними функціональними фрагментами людини. Дуже бажаним є

Зо застосування антитіл людського походження у передбачених засобах антитіл, призначених для терапевтичного введення людині. Наступне введення пацієнту-людині антитіла людини або його функціонального фрагменту більш ймовірно не викличе сильної імуногенної відповіді імунної системи цього пацієнту, тобто вона його не буде впізнавати, як чужорідний білок, який не є людським. Це означає відсутність майбутнього вироблення антитіл, які належать хазяїну, тобто пацієнту, які буде спрямовано проти застосованих терапевтичних антитіл та дія яких у іншому випадку була б спрямована на блокування активності цих терапевтичних антитіл та/або прискорення швидкості їх усунення з організму пацієнта, тим самим запобігаючи викликання їх бажаної терапевтичної дії.

У відповідності з бажаним втіленням винаходу, моноклональне антитіло людини або його функціональний фрагмент, призначене для застосування з фармацевтичною метою виявляє реакційну здатність в організмі людини та принаймні одного з видів мавп. Така перехресна міжвидова реактивність також є бажаною для всіх інших не-антитіл або отриманих з них сполук, які нейтралізують / пригнічують ГМ-КСФ.

Відповідно за додатковим втіленням винаходу, антитіло може бути антитілом ізотипу до.

Антитіла цього ізотопу містять не лише змінні ділянки важкого та легкого ланцюгів, відповідні за високоспецифічне впізнавання та зв'язування антигену, але й також і сталі ділянки важкого та легкого поліпептидного ланцюгів антитіл, які звичайно присутні у антитілах "природного" вироблення та, у певних випадках, навіть вуглеводну модифікацію в одному або кількох місцях.

Таке глікозилування звичайно є відмінною рисою формату дс та воно має місце у сталих ділянках, які містять так звану Ес - ділянку повного антитіла, яка, як відомо, виявляє різні ефекторні функції іп мімо. Крім того, Ес - ділянка опосередковує зв'язування антитіла Ідс з Ес - рецептором, а також сприяння його націлювання до ділянок зі збільшеною присутністю Ес - рецепторів, наприклад, до запаленої тканини. Переважним чином, антитіла до є антитілами

ІДОС1 або Ідсяі, які є бажаними, оскільки механізм їх дії іп мімо є детально та добре зрозумілим та описаним, що особливо стосується антитіл Ідос1.

Відповідно за додатковим втіленням винаходу, функціональний фрагмент антитіл може переважно бути фрагментом 5сЕм, однодоменним антитілом, Ем, антитілом УНН, діатілом, тандемним діатілом, Раб, Бар" або Р(ар)2. Ці формати звичайно може бути розділено на два підкласи, а саме на ті, які складаються з одного поліпептидного ланцюга та ті, які містять бо принаймні два поліпептидних ланцюги. До членів першого підкласу належить злитий білок 5СЕм

(який містить одну УН - ділянку та одну МІ. - ділянку, об'єднані в єдиний поліпептидний ланцюг з допомогою поліпептидного лінкера) та однодоменне антитіло (яке містить одиничну змінну ділянку антитіла), як-то антитіло МНН (яке містить одиничну МН - ділянку). До членів другого підкласу належить конструкція Ем (яка містить одну МН - ділянку та одну МІ. - ділянку у вигляді окремих поліпептидних ланцюгів, нековалентно зв'язаних між собою); діатіло (яке містить два нековалентно зв'язаних поліпептидні ланцюги, кожен з яких містить дві змінні ділянки антитіла, тобто звичайно по одній МН- та Мі-ділянці на поліпептидний ланцюг та ці два поліпептидні ланцюги розташовано у конформації "голова до хвосту" з отриманням таким чином бівалентної молекули антитіла); тандемне діатіло (біспецифічне одноланцюгове антитіло Ем, яке містить чотири ковалентно зв'язані змінні МН - та МІ - ділянки імуноглобуліну з двома різними специфічностями, утворюючи гомодимер розміром вдвічі більше, ніж описане вище діатіло); конструкцію Бар (одним поліпептидним ланцюгом цієї конструкції є повний легкий ланцюг антитіла, який містить Мі - ділянку та повну сталу ділянку легкого ланцюга, другим поліпептидним ланцюгом є частина важкого ланцюга антитіла, яка містить повну МН - ділянку та частину сталої ділянки важкого ланцюга та ці два поліпептидні ланцюги є міжмолекулярно зв'язаними з допомогою міжланцюгового дисульфідного зв'язку); конструкцію Бар" (подібну до вищенаведеної конструкції Раб за виключенням додаткових відновлених дисульфідних зв'язків, які входять до складу важкого ланцюга антитіла); та Е(ар)2 (яка містить дві молекули Еар", зв'язаних між собою міжланцюговими дисульфідними зв'язками). Головним чином, функціональні фрагменти антитіл вищезазначеного типу дозволяють дуже гнучко оптимізувати, наприклад, фармакокінетичні властивості бажаних антитіл для терапевтичного введення до певного існуючого випадку. Наприклад, у разі, коли відомо про погану васкуляризацію призначених для лікування тканин (наприклад, суглобів) може бути бажаним зменшення розміру введених антитіл з метою підвищення ступеню їх проникнення у ці тканини. У певних обставинах також може бути бажаним підвищення швидкості усунення терапевтичних антитіл з організму, яку можна збільшити шляхом зменшення розміру введених антитіл. Фрагмент антитіла у контексті за винаходом визначено, як функціональний фрагмент антитіла допоки він зберігає характеристики специфічного зв'язування батьківського антитіла з епітопом / мішенню, тобто допоки він специфічно зв'язується з ГМ-КСФ або з рецептором ГМ-КОФ.

Відповідно за додатковим втіленням винаходу, зазначене антитіло або його функціональний фрагмент може бути присутнім у моновалентній моноспецифічній; мультивалентній моноспецифічній, зокрема у бівалентній моноспецифічній або мультивалентній мультиспецифічній, зокрема бівалентній біспецифічній формах. Взагалі застосування мультивалентного моноспецифічного, зокрема бівалентного моноспецифіч- ного антитіла, як-то повнорозмірного людського антитіла до, як описано вище, може бути терапевтично корисним, тому що здійснена через дію такого антитіла нейтралізація є підсиленою за рахунок дії авидності, тобто зв'язування одним і тим же антитілом численних молекул однакового антигену, тобто у цьому разі ГМ-КСФ або рецептора ГМ-КСФ. Деякі моноваленті моноспецифічні форми фрагментів антитіл описано вище (наприклад, 5сСЕм, Ем, МНН або однодоменне антитіло).

Мультивалентні мультиспецифічні, зокрема бівалентні біспецифічні форми антитіл можуть включати повнорозмірні антитіла дО, в яких одна зв'язувальна група зв'язується з ГМ-КОФ / рецептором ГМ-КСФ приматів, тоді, як інша зв'язувальна група зв'язується з іншим антигеном, відмінними від ГМ-КСФ / рецептора ГМ-КСФ. Також мультивалентна мультиспецифічна, зокрема бівалентна біспецифічна формою може переважно бути людським одноланцюговим біспецифічним антитілом, тобто рекомбінантною конструкцією на основі антитіла людини, що містить дві структурні одиниці 5СсЕм, як описано вище, з'єднані в один безперервний поліпептидний ланцюг коротким вставленим поліпептидним спейсером, як звичайно відомо в цій галузі (стосовно анти-СО19 х анти-СОЗ біспецифічних одноланцюгових антитіл див., наприклад, М/О 99/54440). У цьому разі одна частина 5сЕм біспецифічного одноланцюгового антитіла у складі біспецифічного одноланцюгового антитіла буде специфічно зв'язувати ГМ-

КСФ / рецептор ГМ-КСФ як зазначено вище, тоді як відповідна інша частина 5сЕм цього біспецифічного одноланцюгового антитіла буде зв'язувати інший антиген, визначений бути терапевтично корисним.

У відповідності з додатковим втіленням антитіло або його функціональні фрагменти може бути дериватизовано, наприклад з органічним полімером, наприклад з одним або кількома молекулами поліетиленгліколю ("ПЕГ") та/або полівінілпіролідону ("ПВП"). Як відомо у цій галузі, така дериватизація може бути корисною у модулюванні фармакодинамічних властивостей антитіла або його функціональних фрагментів. Особливо бажаними є ПеЕГ-молекули, дериватизовані, як ПЕГ-малеіїмід, що дозволяє здійснити сайт-специфічну кон'югацію з бо антитілом або його функціональним фрагментом з допомогою сульфгідрильної групи цистеїнової амінокислоти. З цих молекул найбільш бажаним є застосування ПЕГ-малеїіміду розміром 20 та/або 40 кД розгалуженої або лінійної форми. Особливо корисним є підвищення ефективної молекулярної маси малих фрагментів анти-ГМ-КСФ антитіл людини, як-то фрагментів 5сЕм шляхом їх з'єднання з однією або кількома молекулами ПЕГ, особливо ПЕГ- малеїімідом.

Антитіла за винаходом також включають "химерні" антитіла (імуноглобуліни), в яких частина важкого та/або легкого ланцюга є такою ж саме або гомологічною відповідним послідовностям антитіл, отриманих від певних видів або які належать до певного класу або підкласу антитіл, в той час, як залишок ланцюга (ланцюгів) є однаковим або гомологічним відповідним послідовностям антитіл, отриманих від інших видів або які належать до іншого класу або підкласу антитіл, допоки вони будуть виявляти бажану біологічну активність (Патент США Мо 4816567; Моггтізоп еї аїЇ., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА, 81: 6851-6855 (1984)). Інтересуючі химерні антитіла тут включають "приматизовані" антитіла, які містять змінні доменні антиген-зв'язуючі послідовності, отримані від примату, який не є людиною (наприклад, людиноподібні мавпи, мавпи родини мавпових тощо) та послідовності сталої ділянки людини. "Гуманізовані" форми антитіл, які не є людськими (наприклад, мишачими) є химерними імуноглобулінами, імуноглобуліновими ланцюгами або їх фрагментами (як-то Ем, Раб, Раб,

Е(авф)2 або іншими антиген-зв'язуючими субпослідовностями антитіл) та здебільшого є людськими послідовностями, які містять мінімальні послідовності, отримані від імуноглобуліну, який не є імуноглобуліном людини. Здебільшого гуманізовані антитіла є людськими імуноглобулінами (реціпієнтні антитіла), в яких здійснено заміну залишків гіперзмінної ділянки (а також СОК) реципієнта на залишки гіперзмінної ділянки, яка не має людського походження (донорне антитіло), як-то її може бути отримано з мишей, щурів або кролів та вона має бажану специфічність, спорідненість та властивості. У певних випадках, залишки каркасної ділянки Ем (ЕК) людського імуноглобуліну замінюють відповідними залишками нелюдинного походження.

Крім того, "гуманізовані антитіла", як тут застосовано, також можуть містити залишки, які є відсутніми як у реципієнтних, так і у донорних антитілах та ці модифікації здійснено для подальшого вдосконалення та оптимізування активних властивостей антитіл. Оптимально, гуманізоване антитіло також буде містити принаймні частину сталої ділянки імуноглобуліну (Ес), звичайно імуноглобуліну людини. Детальний огляд див. у ЧУопев еї аї., Маїиге, 321: 522-525 (1986); Неісптапп есеї а!., Маїшге, 332: 323-329 (1988); та Ргевіа, Сшт. Ор. зігисі. Віої!., 2: 593-596 (1992).

Як тут застосовано, нумерація амінокислотних залишків або положень у ГМ-КСФ людини та нелюдиноподібного примату має відношення до нумерації зрілого ГМ-КСФ, тобто ГМ-КСФ без власної сигнальної послідовності у 17 амінокислот (загальна довжина зрілого ГМ-КСФ, як людини, так і описаних вище видів нелюдиноподібних приматів складає 127 амінокислот).

Послідовності ГМ-КСФ людини та гібону є такими, як наведено нижче:

ЗЕО ІЮ МО: 49

АРАВО5РБОРБОТ ОРМЕНММАІ ЕАВНВІЇМІ 5ЄА ОТААЕММЕТМ ЕМІБЕМЕОГО ЕРТСГОТВІ Е

ІМКОСІВОаБІ ТКкІКОРІТММ АЗБНУКОНСРР ТРЕТ5САТОЇ ТЕРЕБЕКЕМІ КОР МІРЕО

СМЕРМОЕ

Послідовність ГМ-КСФ деяких членів мавп роду макака, як-то, наприклад, макаки-резуса та макак-крабоїда наведено нижче:

ЗЕО ІЮ Ме50

АРАВО5РОРОТ ОРМЕНММАІ ЕАВВІЇМ ЗА ОТААЕММКТМ ЕММ5ЕМЕОГО ЕРБСІ ОТВІ Е

ІУКОСіОс5І ТКкІКОаРІТММ АЗБНУКОНСРР ТРЕТБСАТОЇ ІТРО5БЕКЕМІ КОРП МІРЕО

СМЕРМОЕ

Послідовність ГМ-КСОФ людини наведено у 5ЗЕО ІЮ МО:57. Послідовність ГМ-КСФ гібону наведено у ЗЕО ІЮ Мо58:

АРАВЗРБеРВТ ОРМЕНУМАТО БАВЕБЬМИсА ОТААЛЕММЕТУ ЕУЇБЕМиОО

КеРТССОТВЬе уко КОе5і. ТАКТКОРІ.ТМИ дЕНниКОоНерР ТЕВЕТБСАТОЇ

БО ТЕБЕ КОБООУТВКО СИБеТОБ (ЗЕО ІО Мое57 та 58)

Послідовність ГМ-КСФ деяких членів мавп роду макака, як-то, наприклад, макаки-резуса (ЗЕО ІО Мое:59) та макаки-крабоїда (ЗЕО ІО МО:60) є такими, як наведено нижче:

АРАКВБЕОРОТ ОРЖЕНУМАТО ЕАВЕШЬМНЕОА ОХААЕММКТУ ЕУУВЕМЕОІО

ЕСБОСТОТВОЮ сУКОоСЬОСВЕ ТКОКОоРЕБІММ АсВжйОВСее ТРЕТВСАТОЇ

ІТКЕОБЕКЕМІ КОКО УТеЕО САБРУСЕ (5ЕО І Ме59 та 60).

Існуючий у послідовності (послідовностях) ГМ-КСФ мінімальний епітоп, який, як описано тут, переважно є переривчастим та з яким зв'язується антитіло, переважно людське моноклональне антитіло (або його функціональний фрагмент) позначено вище напівжирним шрифтом.

Відповідно за бажаним втіленням, сполука, яка нейтралізує ГМ-КОФ є антитілом (переважно моноклональним антитілом людини) або його функціональним фрагментом, якій зв'язується з

ГМ-КСФ. Більш переважно він зв'язується з епітопом ГМ-КСФ, який переважно містить амінокислоти 23-27 (ЕК ЇМ) та/або амінокислоти 65-77 (СІ Б/005 5ІТКІКОРІ). Ці відрізки амінокислотної послідовності у складі наведеної вище послідовності ГМ-КСФ позначено напівжирним шрифтом. Термін "епітоп" має відношення до ділянки антигену або мішені (наприклад, ГМ-КСФ), з якою специфічно зв'язується сполука, як-то антитіло або його функціональний фрагмент. Під цим зв'язуванням / взаємодією також слід розуміти визначення "специфічне впізнавання". "Епітопи" може бути отримано шляхом зіставлення суміжних або несуміжних амінокислот з допомогою третинного фолдингу протеїну. "Лінійний епітоп" є епітопом, в якому амінокислотна послідовність первинної кислоти містить розпізнаний епітоп.

Також "лінійний епітоп" звичайно містить унікальну послідовність, яка складається принаймні з З або принаймні 4 та частіше принаймні 5 або принаймні б або принаймні 7, наприклад, приблизно 8-10 амінокислот або більше. У контексті цього винаходу епітоп ГМ-КСФ переважно є переривчастим епітопом. У випадку, якщо антитіло зв'язується з обома відрізками послідовності 23-27 та 65-77 цей епітоп може отримати назву "переривчастого". У вторинній структурі людського ГМ-КСФ, амінокислоти 15-35 розташовано у спіралі, тоді як залишки у положеннях 65-77 є частиною петельної структури, розташованої між спіралями С та 0. Тривимірна модель згортання (фолдингу) молекули виявила наявність тісної стеричної близькості цих ділянок між собою (див. також УМО 2006/111353). Під застосованим тут терміном "переривчастий епітоп" слід розуміти, як принаймні два несуміжних відрізки амінокислотної послідовності в межах вибраного поліпептидного ланцюга, у даному випадку поліпептидного ланцюга зрілого ГМ-КСФ людини та нелюдиноподібних приматів, які одночасно та специфічно зв'язуються антитілом.

Відповідно за цим визначенням, це одночасне специфічне зв'язування може також відбуватися,

Зо якщо поліпептид ГМ-КСФ знаходиться у лінійній формі. Будь-хто може уявити утворення зрілим поліпептидом ГМ-КСФ довгастої петельної структури, у одній ділянці якої дві позначені вище жирним шрифтом послідовності є лінійно розташованими, наприклад, більш-менш паралельно та у близькості між собою та у цьому стані вони специфічно та одночасно зв'язуються з фрагментом антитіла. Відповідно за цим визначенням, зазначене вище одночасне специфічне зв'язування цих двох відрізків послідовності зрілого ГМ-КСФ також може приймати форму зв'язування антитіла з конфірмаційним епітопом. У такому випадку зрілий ГМ-КСФ вже має готову власну третинну структуру, з якою він звичайно існує іп ммо та поліпептидний ланцюг зрілого ГМ-КСФ у цій третинній структурі згорнуто таким чином, що вищезазначені два відрізки послідовності стають піднесеними у просторовій близькості, наприклад на зовнішній поверхні певної ділянки зрілого, згорнутого ГМ-КОФ, де їх потім впізнають завдяки власній тривимірної конформації у контексті оточуючих поліпептидних послідовностей.

У додатковому бажаному втіленні вищезазначений епітоп або вищезазначений переривчастий епітоп ГМ-КСФ також містить: - амінокислоти 28-31 (І ЗК), позначені курсивом у вищезазначених послідовностях ГМ-КСФ людини та нелюдиноподібного примату; - амінокислоти 32-33 (ТА), підкреслені у вищезазначених послідовностях ГМ-КСФ людини та нелюдиноподібного примату ГМ-КОФ; та/або - амінокислоти 21-22 (ЕА), підкреслені у вищезазначених послідовностях ГМ-КСФ людини та нелюдиноподібного примату ГМ-КСФ.

Бажаними моноклональними антитілами людини до ГМ-КСФ або їх функціональними фрагментами є такі, які специфічно зазначено у ММО2006/111353, як БЕО ІЮ МоМо 1-48 та 52 - 56 та які є відображенням амінокислотних послідовностей ділянок визначення комплементарності важкого та легкого ланцюгів (СОК) 1-3, а також змінних ділянок важкого та легкого ланцюгів та повнорозмірних важкого та легкого ланцюгів.

Особливо бажаними є антитіла до ГМ-КСФ або їх функціональні фрагменти, які містять послідовність СОК'1 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у ЗЕО ІЮ Мое14, послідовність

СОКО2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме1; або які містять послідовність СОК1 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Мое14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5БЕО ІЮ Ме15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у ЗЕО ІО Ме2; або які містять послідовність СОКІ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме3; або які містять послідовність СОКІ1 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у

ЗЕО ІЮ Ме15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо4; або які містять послідовність СОКІ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у ЗЕО ІЮ

Мо14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо5; або які містять послідовність СОК'1 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у ЗЕО ІЮ Мое14, послідовність

СОКО2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Ме15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Моб; або які містять послідовність СОК1 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Мое14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Ме15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у ЗЕО ІО Моео7; або які містять послідовність СОКІ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Ме14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Ме15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Мов; або які містять послідовність СОКІ1 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у

ЗЕО ІО Ме15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме9; або які містять послідовність СОКІ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у ЗЕО ІЮ

Мо14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Ме10; або які містять послідовність СОКІ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Мо14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Мо15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Ме11; або які містять послідовність СОКІ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Мо14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Мо15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Ме12; або які містять послідовність СОКІ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Мо14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Мо15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме13; або які містять послідовність СОКІ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Мо14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Мо15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо56.

Ще більш бажаним є, щоб існуюча у антитілі або у його функціональному фрагменті будь- яка з вищезазначених 14 комбінації послідовностей СОКІ, СОК2 та СОКЗ важкого ланцюга додатково містила у власній змінній ділянці легкого ланцюга ще ділянку СОК!1 з амінокислотною послідовністю, наведеною у 5ЕО ІО Мо 16, ділянку СОК2 з амінокислотною послідовністю, наведеною у ЗЕО ІЮО Мо 17 та ділянку СОКЗ з амінокислотною послідовністю, наведеною у 5ЗЕО

ІО Мо 18.

Особливо бажане анти-ГМ-КСФф антитіло або його функціональний фрагмент містить змінну ділянку важкого ланцюга послідовності СОКІ, як наведено у 5ЕО ІЮ Мое14, послідовність СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме15 та послідовність СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга, як наведено у 5ЕО ІЮО Ме2, а також містить у власній змінній ділянці легкого ланцюга ділянку СОКІ з амінокислотною послідовністю, наведеною у ЗЕО ІЮ Мо 16, ділянку СОК2 з амінокислотною послідовністю, наведеною у ЗЕО ІЮ Мо 17 та ділянку СОКЗ з амінокислотною послідовністю, наведеною у 5ЕО ІЮ Мо 18. Це анти-ГМ-КСФ антитіло є більш бажаною сполукою для нейтралізації ГМ-КСОФ та її також описано у УМО 2006/111353.

Відповідно до додаткового втілення, анти-ГМ-КСОФ антитіло або його функціональний фрагмент містить у власній змінній ділянці легкого ланцюга амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме19. Бажаним є антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮО Ме19 та змінна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ

Мо20; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме19 та змінна ділянка важкого 60 ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо21; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо22; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме23; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Ме19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо24; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО

ІЮО Ме19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме25; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО

ІО Ме26; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо27; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме28; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо29; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Ме19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме30; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО

ІЮО Ме19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме31; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО

ІО Ме32; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме33; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо52; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо19 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо53.

Відповідно до додаткового втілення, анти-ГМ-КСОФ антитіло або його функціональний фрагмент містить у власній змінній ділянці легкого ланцюга амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо54. Бажаним є антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у

ЗЕО ІЮ Мо20; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо21; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо22; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме23; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо24; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО

ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як бо наведено у 5ЕО ІЮ Ме25; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕ

ІО Ме26; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо27; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо28; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо29; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме30; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО

ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме31; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕ

ІО Ме32; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме33; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо52; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо54 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мео53.

Відповідно до додаткового втілення, анти-ГМ-КСОФ антитіло або його функціональний

Зо фрагмент містить у власній змінній ділянці легкого ланцюга амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме55. Бажаним є антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у

ЗЕО ІЮ Мо20; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме21; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мое22; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо23; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо24; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО

ІЮ Мео55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме25; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕ

ІО Ме26; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо27; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо28; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо29; або антитіло або його функціональний 60 фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме30; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО

ІЮ Мео55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме31; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕ

ІО Ме32; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме33; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо52; або антитіло або його функціональний фрагмент, змінна ділянка легкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо55 та змінна ділянка важкого ланцюга якого містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мео53.

Бажане анти-ГМ-КСФ антитіло або його функціональний фрагмент містить у власній змінній ділянці легкого ланцюга ділянку СОКІ, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у

ЗЕО ІЮ Ме16, ділянку СОК2, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ

Ме17 та ділянку СОКЗ, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮО Ме18 та містить у власній змінній ділянці важкого ланцюга ділянку СОКІ, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Мо14, ділянку СОК2, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕБО ІЮ Ме15 та ділянку СОКЗ, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у будь-якій з послідовностей 5ЕО ІЮ МоМо. 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 або 56.

У додатковому бажаному втіленні, антитіло, яке містить у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Ме34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме35; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо34 та у власному важкому ланцюзі

Зо амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо3б; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме37; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Ме34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме38; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо39; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо40; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Ме34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо41; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо42; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо43; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Ме34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо44; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо45; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо46б; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Ме34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Мо47; або у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме48. Анти-ГМ-КСФ антитіло що містить у власному легкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІО Мо34 та у власному важкому ланцюзі амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ Ме35 є більш бажаною сполукою для нейтралізації ГМ-КСФ та його також описано у МО 2006/111353.

У вищезазначених бажаних втіленнях передбачено молекули антитіл та/або їх функціональні фрагменти, переважно молекули моноклональних антитіл людини та/або його їх бо функціональні фрагменти, які є особливо корисними, як нейтралізатори активності ГМ-КСФ людини та приматів. Антитіла або їх функціональні фрагменти за цими втіленнями є дуже корисними з кількох причин.

По-перше, вони мають високу специфічність впізнавання ГМ-КСФ людини та приматів. Це означає, що з суміші ГМ-КСФ приматів з іншими колонієсєтимулюючими факторами приматів (наприклад 5-СЗЕ та М-С5Е приматів), зв'язуючі молекули відповідно за цими особливо бажаними втіленнями мають здатність до дуже високого розпізнавання ГМ-КСФ приматів та не розпізнають інші колонієстимулюючі фактори з того ж саме середовища. Також їх можна застосувати (з додаванням відповідних змінень) й до ГМ-КСФ людини. Це означає, що у разі введення в організм людини антитіл або їх функціональних фрагментів за цими втіленнями слід очікувати, що вони будуть специфічно зв'язувати та нейтралізувати тільки бажану ціль, тоді як інші небажані цілі ніколи не будуть ними ані зв'язаними, ані нейтралізованими. Зрештою це призведе до появи високого ступеню передбачуваності щодо терапевтичного способу дії іп мімо.

По-друге, зв'язуючі засоби відповідно за цими бажаними втіленнями зв'язуються з ГМ-КСФ людини та приматів з суттєвою спорідненістю, під якою тут мається на увазі зв'язувальна спорідненість приблизно у 10-6 М (КО) або сильніше. Переважно, зв'язування вважається суттєвим (або високим або специфічним), коли зв'язувальна спорідненість складає приблизно 10-12-10-8 М, 10-12-10-9 М, 10-12-10-10 М, 10-11-10-8 М, переважно приблизно 10-11-10-9 М.

Відповідно, зв'язуючий засіб за винаходом переважно має КО в цих межах. Враховуючи той факт, що спостережені значення КО для молекул описаних тут антитіл коливаються в межах приблизно 4 х 10-9 М-0,04 х 10-9 М, це значення останнє складає приблизно 40 пМ та було б бажаним, щоб молекули антитіл за винаходом мали КО в цих межах, хоча також було б бажаним, щоб молекули антитіл за винаходом мали зазначені тут значення КО. Оскільки кінетична швидкість асоціації цих молекул у водному середовищі в значній мірі контролюється дифузією, отже її не може бути покращено за межам дозволених у фізіологічних умовах місцевих умов дифузії, низьке значення КО виникає головним чином внаслідок кінетичної швидкості дисоціації, Коїй, яка для найвищої спорідненості зв'язувального засобу антитіла складає приблизно 310-5 5-1. Це означає, що як тільки утворюється комплекс між моноклональним антитілом людини або його функціональним фрагментом відповідно за будь- як з цих втілень з одного боку та ГМ-КСФ з іншого, то відокремити його складові буде не дуже

Зо легко або принаймні не дуже швидко. Для зв'язування молекул, призначених як нейтралізаторів біологічної активності ці характеристики є дуже корисними, оскільки бажана нейтралізуюча дія звичайно триватиме лише до тих пір, доки молекула, біологічну активність якої треба буде нейтралізувати (у цьому разі ГМ-КСФ приматів та людини) буде залишатися зв'язаною нейтралізуючою молекулою. Отже нейтралізуюча молекула, яка залишається тривалий час зв'язаною з мішенню, до якої її призначено буде продовжувати її нейтралізовувати протягом відповідного тривалого часу.

Висока спорідненість зв'язуючих антитіл або їх функціональних фрагментів до ГМ-КСФ людини та приматів має додаткову перевагу. Звичайно, антитіла або їх функціональні фрагменти будуть усуватися з кровотоку пацієнта в залежності від їх розміру, тобто з виведенням та усуненням спочатку маленьких, а потім більш великих молекул. Оскільки очевидно, що комплекс двох поліпептидів - антитіла або його фрагмента та зв'язаного ГМ-КСФ буде мати більший розмір, ніж окреме антитіло, то вплив зазначеного вище низького значення

КОП буде полягати в тому, що виведення та усунення терапевтичного нейтралізатора з організму пацієнта буде більше повільним, ніж воно було б у разі відсутності зв'язування з ГМ-

КСФ. Отже, збільшується не тільки величина нейтралізуючої активності, але й також тривалість її дії іп мімо.

Визначена для зв'язуючих засобів за вищенаведеними втіленнями нейтралізуюча активність є неочікувано високою. Як буде більш детально описано нижче, нейтралізуючу активність для

ГМ-КОФ було виміряно іп міїго із застосуванням аналізу пригнічення росту клітин ТЕ-1 (Каіатига,

Т. еігаї. (1989). 9. СеїІ Рнузіо!. 140, 323-34). Як ознаку нейтралізуючого потенціалу було виміряно значення ІС50, які відображають концентрацію антитіл або їх функціональних фрагментів за будь-яким з цих втілень, потрібну для досягнення напівмаксимального пригнічення проліферації клітин ТЕ-1. Для моноклональних антитіл людини до ГМ-КСФ або їх функціональних фрагментів було визначено зазначені вище значення ІС5О, які складали приблизно 3 х 10-10 М або приблизно 0,3 нМ, тому ці зв'язуючі молекули є високоефективними нейтралізаторами активності ГМ-КСФ людини та приматів.

Іншими прикладами нейтралізуючих антитіл до ГМ-КСФ є людські антитіла Е10О та с9, описані у Гі еї аї., (2006) РМАБ5 103(10):3557-3562. Антитіла Е10 та 9 є антитілами класу до.

Антитіло Е10 має зв'язувальну спорідненість до ГМ-КСФ, яка складає 870 пМ та спорідненість бо антитіла 59 до ГМ-КСФ складає 14 пМ. З допомогою аналізу проліферації клітин ТЕ-1 було виявлено, що обидва антитіла специфічно зв'язуються з людським ГМ-КСФ та виявляють сильну нейтралізуючу активність. Іншими прикладами таких антитіл є зазначені у УМО 2006/122797 антитіла до людського ГМ-КСФ.

Також винаходом може бути передбачено застосування антагоністів ГМ-КСФ або нейтралізаторів, які є антитілами до рецептора ГМ-КСФ. Такі антагоністи ГМ-КСФ включають антитіла до альфа- або бета- ланцюга рецептора ГМ-КСФ. Застосовані у винаході антитіла до рецептора ГМ-КСФ можуть бути антитілами у будь-якій формі, як пояснено вище, наприклад, вони можуть бути інтактними, химерними, моноклональними, поліклональними, фрагментами або похідними антитіл, одноланцюговими, гуманізованими або отриманими із застосуванням технології НитапеегедФф тощо. Також у цій галузі відомі прийнятні для застосування у винаході приклади антитіл до рецептора ГМ-КСФ, наприклад, нейтралізуючі високоспоріднені антитіла (див., наприклад, Патент США 5747032 та Місоїа єї а!., Віоса 82:15 1724, 1993).

Додаткові послідовності прийнятних антитіл надано у заявках та включено сюди повністю посиланням. Опис антитіл до ГМ-КСФ наведено у М/О02006/122797, УМО2007/049472,

УМО2007/092939, ММО2009/134805, УМО2009/064399, УМО2009/038760. Опис антитіл до рецептора

ГМ-КСФ наведено у УУО2007/110631.

Отже, антитіла до ГМ-КСФ або їх функціональні фрагменти виявляють високий рівень розпізнавання бажаного антигену, надзвичайно щільно та протягом тривалого часу зв'язують цей антиген та виявляють високоефективну нейтралізуючу активність, залишаючись зв'язаними дуже довгий час. Водночас тривала стійкість комплексу, утвореного зв'язуючим засобом та антигеном знижує виведення цього зв'язуючого засобу з організму, тим самим подовжуючи тривалість бажаного терапевтичного ефекту іп мімо. Такі саме характеристики також переважно є застосованими для антитіл, які впізнають рецептор ГМ-КСФ, як описано вище.

Композиція за винаходом переважно є фармацевтичною композицією. Відповідно за наведеними втіленнями термін "фармацевтична композиція" стосується композиції, призначеної для введення пацієнту, переважно пацієнту-людині. Фармацевтичні композиції або препарати звичайно існують у такій формі, яка забезпечує ефективність біологічної активності активного інгредієнта та їх може бути введено суб'єкту для терапевтичного застосування, як тут описано.

Звичайно фармацевтична композиція включає прийнятні (тобто фармацевтично прийнятні)

Зо композиції носіїв, стабілізаторів та/або наповнювачів. У переважному втіленні, фармацевтичною композицією є композиція, призначена для парентерального, трансдермального, внутрішньопорожнинного, внутрішньоартеріального, інтратекального та/або інтраназального введення або для безпосередньої ін'єкції у тканину. Зокрема передбачено введення цих композицій пацієнту шляхом інфузії або ін'єкції. Введення прийнятних композицій може бути здійснено різними шляхами, наприклад, шляхом внутрішньовенного, внутрішньочеревинного, підшкірного, місцевого або внутрішньошкірного введення. Також композиції за винаходом можуть містити фармацевтично прийнятний носій. Приклади прийнятних фармацевтичних носіїв добре відомі у цій галузі та включають буферизовані сольові розчини, воду, емульсії, як-то емульсії типу "олія / вода", різні типи змочувальних засобів, стерильні розчини, ліпосоми тощо.

Композиції, які містять такі носії може бути отримано із застосуванням добре відомих традиційних способів.

Відповідно за цими втіленнями, термін "ефективна кількість" має відношення до кількості сполуки, що нейтралізує ГМ-КСФ, ефективної для лікування захворювання, пов'язаного з ГМ-

КОФ, як-то запальних та автоїмунних розладів.

Бажані дозування та способи введення є такими, що забезпечують після введення присутність у крові сполуки, що нейтралізує ГМ-КСФ у ефективних кількостях. План введення може бути скориговано шляхом спостереження стану хвороби та аналізу сироваткових рівнів сполуки, що нейтралізує ГМ-КСФ у лабораторних дослідженнях з наступним або збільшенням інтервалу введення, наприклад, від двох разів або одного разу на тиждень до разу на два тижні, разу на три тижні, разу на чотири тижні тощо або, як варіант, з відповідним зменшенням інтервалу введення.

Фармацевтичні композиції може бути введено суб'єкту з прийнятною дозою та схема дозування буде визначатися лікарем та клінічними факторами. Як добре відомо у медичній галузі, схеми дозування для будь-якого окремого пацієнта залежать від багатьох факторів, включаючи розмір пацієнта, площу поверхні тіла, вік, ту чи іншу певну призначену для введення сполуку, стать, час та шлях введення, загальний стан здоров'я та одночасне застосування інших лікарських засобів.

Препарати для парентерального введення включають стерильні водні або безводні розчини, суспензії та емульсії. Прикладами безводних розчинників є пропіленгліколь, бо поліетиленгліколь, рослинні олії, як-то оливкова олія та ін'єкційні органічні естери, як-то етилолеат. Водні носії включають воду, спиртові / водні розчини, емульсії або суспензії, включаючи сольові та буферизовані середовища. Носії для парентерального введення включають розчин хлориду натрію, декстрозу Рінгера, декстрозу та хлорид натрію, розчин

Рінгера з лактатом та нелеткі олії. Носії для внутрішньовенного введення включають рідкі та поживні додатки, електролітичні додатки (як-то такі додатки на основі декстрози Рингера) тощо.

Також у складі цих препаратів можуть бути присутніми консерванти та інші додатки, як-то, наприклад, протимікробні засоби, антиоксиданти, хелатуючі засоби, інертні гази тощо. Крім того, фармацевтична композиція за винаходом може містити білкові носії, як-то, наприклад, сироватковий альбумін або імуноглобулін, переважно людського походження. Передбачається, що окрім вищезазначених описаних сполук фармацевтична композиція за винаходом може також містити біологічно активні засоби в залежності від її призначеного застосування. Такі засоби можуть бути лікарськими засобами, які діють на шлунково-кишкову систему, цитостатичними лікарськими засобами, лікарськими засобами, запобігаючими розвиток гіперглікемії, пригнічуючими імунологічні реакції (як-то, наприклад, кортикостероїди), лікарськими засобами, які змінюють запальну відповідь, які впливають на систему кровообігу та/або такими відомими в цій галузі засобами, як цитокіни.

Критерії ефективності для аналізу дії сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСФ, наприклад, у разі ревматоїдного артриту (КА), може бути вибрано, наприклад, від фармакокінетичних показників, імуногенності та можливості покращувати клінічні ознаки та симптоми КА, як було виміряно із застосуванням відповідних критеріїв ЮА5Б28, АСТК20/50/70 та/"або ЕІ АК, МРТ-сканування синовіальної оболонки та набряку кісток, а також від повідомлених пацієнтом результатів лікування. Критерій ефективності лікарських засобів від Американської колегії ревматології (АСК) є системою вимірювань, яка узагальнює зменшення кількості хворобливих та опухлих суглобів, результати, отримані із застосуванням шкали оцінки болю, надану лікарем та пацієнтом оцінку покращення та певні лабораторні маркери. У АСЕ 20 надано опис відсотка учасників досліджень, які досягнули 20-відсоткового покращення клінічних ознак та симптомів, наприклад, 20-відсоткового зменшення кількості хворобливих та опухлих суглобів, а також 20 відсоткового покращення у трьох інших пов'язаних з хворобою критеріях.

Ще однією серйозною проблемою в розробці лікарських засобів, як--о фармацевтична

Зо композиція за винаходом є передбачуване змінення фармакокінетичних властивостей. З цією метою створюють фармакокінетичний профіль потенційного лікарського засобу, тобто профіль фармакокінетичних параметрів, які впливають на здатність певного лікарського засобу лікувати вибраний стан. Фармакокінетичні параметри лікарських засобів, які впливають на їх здатність до лікування певної нозологічної форми включають, але без обмеження: час напіввиведення, обсяг розповсюдження, пресистемний метаболізм у печінці та ступінь зв'язування сироваткою крові.

Ефективність вибраного лікарського засобу може залежати від кожного з вищезазначених параметрів. "Час напіввиведення" є часом виведення 5095 введеного лікарського засобу, здійсненого завдяки біологічним процесам, наприклад, метаболізму, екскреції тощо. Під "пресистемним метаболізмом у печінці" мається на увазі здатність лікарського засобу до метаболізації після першого контакту з печінкою, тобто протягом його першого проходу крізь печінку. "Об'єм розповсюдження" означає ступінь утримання лікарського засобу у всіх частинах відділів організму, як-то, наприклад, у внутрішньоклітиних та позаклітинних порожнинах, тканинах та органах тощо та розподілення лікарського засобу у цих відділах. "Ступінь зв'язування сироваткою крові" означає здатність лікарського засобу до взаємодії та до зв'язування з білками сироватки крові, як-то альбуміном, що призводить до зниження або до втрати біологічної активності лікарського засобу.

До фармакокінетичних параметрів також відносяться біодоступність, час затримки (Тіад),

Ттах, темпи поглинання та/"або Стах для вибраної кількості введеного лікарського засобу. "Біодоступність" означає кількість лікарського засобу у відділах крові. "Час затримки" означає час затримки між введенням лікарського засобу та його визначенням та можливістю його виміряти у крові або плазмі. "Ттах" є часом, після якого досягнуто максимальної концентрації лікарського засобу у крові, поглинання тут визначено, як рух лікарського засобу від ділянки введення до системного кровотоку та "Стах" є максимальною отриманою концентрацією вибраного лікарського засобу в крові. Ці всі параметри впливають на час, потрібний для досягнення такої концентрації лікарського засобу в крові або в тканинах, якої буде достатньо для його біологічного дії.

Термін "токсичність", як тут застосовано, має відношення до токсичних дій лікарського засобу у вигляді несприятливих подій або важких несприятливих подій. Ці побічні явища можуть мати відношення до втрати толерантності до препарату в цілому та / або до відсутності місцевої толерантності до нього після введення. Токсичність може також включати в себе викликані лікарським засобом тератогенні або канцерогенні дії.

Терміни "безпечність", "безпечність іп мімо" або "толерантність", як тут застосовано, є визначеннями введення лікарського засобу без викликання важких несприятливих подій безпосередньо після введення (місцева толерантність) та протягом тривалого періоду застосування лікарського засобу. "Безпечність", "безпечність іп мімо" або "толерантність" може бути оцінено, наприклад, через регулярні інтервали часу протягом лікування та періоду подальшого спостереження. Вимірювання включають клінічну оцінку, наприклад прояв хвороби у органах пацієнта та скринінг відхилень лабораторних показників від норми. Клінічну оцінку може бути здійснено із записом / кодуванням відхилень від звичайних результатів відповідно за стандартами МСІ-СТС та/або МеаОКА. Дослідження прояв хвороби у органах можуть включати такі критерії, як- як-то алергія / імунологія, кров / кістковий мозок, серцева аритмія, коагуляція тощо, як наведено, наприклад, у набор загальних критеріїв термінології для несприятливих подій м3,0 (СТСАЕ). Лабораторні параметри, як може бути перевірено, включають, наприклад, гематологію, клінічну хімію, профіль коагуляції, аналіз сечі та перевірку інших речовин організму, як-то сироватки, плазми крові, лімфи або рідини спинного мозку, ліквору тощо. Отже, безпечність може бути оцінено наприклад, шляхом фізичної перевірки, із застосуванням способів візуалізації (тобто УЗД, рентгеноскопії, комп'ютерної томографії, магнітно-резонансної томографії (МРТ) інших вимірювань з допомогою технічних пристроїв (як-то електрокардіограма), шляхом дослідження життєво-важливих ознак та шляхом вимірювання лабораторних параметрів із записом несприятливих подій. Термін "ефективна та нетоксична доза", як тут застосовано, має відношення до прийнятної дози сполуки, що нейтралізує ГМ-КОСФ, яка, як тут визначено, переважно є антитілом, дози, яка є достатньо високою для лікування або пригнічення інтересуючого захворювання без або суттєво без виникнення основних токсичних ефектів. Такі ефективні та нетоксичні дози може бути визначено, наприклад, з допомогою описаних в цій галузі досліджень зі збільшенням дози та повинні бути нижчими, ніж доза, яка викликає важкі несприятливі побічні дії (дозообмежуюча токсичність, І Т).

Композиція за винаходом (інколи також позначена тут, як "хімічна сполука"; "композиція" або "розчин" переважно може знаходитися в різному фізичному стані, як-то у рідкому,

Зо замороженому, ліофілізованому, підданому заморожуванню-сушінню, сушінню розпиленням та у вигляді відновлених композицій, бажаними з яких є рідкі та заморожені. "Рідка композиція", як тут застосовано, має відношення до композиції, виявленою у вигляді рідини, яка відрізняється вільним рухом складаючих її молекул між собою, але без тенденції до відокремлення в умовах кімнатної температури. Рідкі композиції включають водну та неводну рідину та більш бажаними є водні композиції. Водна композиція є композицією, в якій розчинник або головний розчинник є водою, переважно водою для ін'єкцій (МУРІ). Розчинення сполуки, що нейтралізує ГМ-КОФ у цій композиції може бути гомогенним або гетерогенним та більш бажаним є гомогенне, як описано вище.

Може бути застосовано будь-яку прийнятну неводну рідину за умови, що вона буде забезпечувати стійкість композиції за винаходом. Переважно ця неводна рідина є гідрофільною рідиною. Ілюстративні приклади прийнятної неводної рідини включають: гліцерин; диметилсульфоксид (ОМ50); полідиметилсилоксан (РМ5); етиленгліколі, як-то етиленгліколь, диетиленгліколь, триетиленгліколь, поліетиленгліколь ("ПЕГ") 200, ПЕГ 300 та ПЕГ 400; та пропіленгліколі, як-то дипропіленгліколь, трипропіленгліколь, поліпропіленгліколь ("ППГ") 425 та

ПП 725. "Змішана водна /неводні рідка композиція", як тут застосовано, має відношення до рідкої композиції, яка містить суміш води, переважно МУ/РІ та додаткову рідку композицію.

Як тут застосовано, "препарат" або "композиція" є сумішшю сполуки, яка нейтралізує ГМ-

КСФ (тобто активного лікарського засобу /речовини), а також хімічних речовин та/або додатків, необхідних для отримання цього медичного продукту, які переважно знаходяться у рідкому стані. Композиції за винаходом також включають фармацевтичні композиції.

Отримання композиції полягає у застосуванні процесу, в якому різні хімічні речовини, включаючи активний лікарський засіб поєднують з утворенням кінцевого медичного продукту, як-то фармацевтичної композиції. Активний лікарський засіб композиції за винаходом є сполукою, що нейтралізує ГМ-КСФ.

У деяких втіленнях призначена для отримання сполука, що нейтралізує ГМ-КСФ є суттєво чистою та/або суттєво гомогенною (тобто суттєво вільною від забруднюючих речовин, наприклад білків тощо, які можуть бути домішками, пов'язаними з продуктом та/або з процесом отримання). Термін "суттєво чиста" означає композицію, яка містить масову частку сполуки у бо мономерному стані, яка складає принаймні приблизно 80 95, переважно приблизно 90 95,

переважно приблизно 95 95, більш переважно принаймні приблизно 97 95 або більш переважно принаймні приблизно 98 95. Термін "суттєво гомогенна" означає композицію, яка містить масову частку сполуки, яка складає принаймні приблизно 99595 та переважно знаходиться у мономерному стані за виключенням маси різних стабілізаторів та води у розчині.

Як тут застосовано, під терміном "приблизно" слід розуміти існування варіацій відповідної величини або діапазону (як-то рН, концентрації, відсотка, молярності, кількості амінокислот, часу тощо.), відсоткова частка яких може сягати до 5 9б, до 10 95, до 15 95 або до 20 95 включно від вибраного значення. Наприклад, якщо композиція містить приблизно 5 мг/мл сполуки, то слід розуміти, що композиція може містити 4-6 мг/мл, переважно 4,25 - 5,75 мг/мл, більш переважно 4,5-5,5 мг/мл, більш переважно 4,75 - 5,25 мг/мл з більш переважним значенням у 5 мг/мл. Як тут застосовано, інтервал, який тут визначено, як "(від) Х до У" дорівнюється інтервалу, визначеному, як "між Х та У". Точніше кажучи, обидва інтервали включають верхню та нижню межу, що означає, що, наприклад, до інтервалу у "від 5 до 10 мг/мл" або "5-10 мг/мл" включено концентрації у 5, 6, 7, 8, 9 та 10 мг/мл, а також будь-які вибрані проміжні значення. "Стійкою" композицією є така композиція, в якій сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ суттєво зберігає власну фізичну та/або хімічну стійкість та/або біологічну активність після зберігання та/або не виявляє суттєвих ознак агрегації, преципітації, фрагментації, деградації та/або денатурації у порівнянні з контрольним зразком, переважно після візуальної перевірки кольору та/або прозорості або перевірки шляхом світлорозсіювання Уф-світла чи ексклюзійної хроматографії. Також у цій галузі є доступними різні інші прийнятні аналітичні способи вимірювання стійкості білка, огляд яких наведено, наприклад, у книзі Реріїде апа Ргоївіп Огид

Оеїїмегу ("Доставляння пептидних та білкових лікарських засобів"), 247-301, Міпсепі Їеє Ед.,

Магсеї! ОеккКег, Іпс., Мем мок, М.У., Рибв. (1991) апа удопез, А. Аду. Огид ОевїЇїмегу Нем. 10: 29-90 (1993). "Протягом зберігання", як тут застосовано, означає препарат, який колись було отримано, але не було негайно застосовано та скоріше після отримання його було запаковано для зберігання або у рідкій формі, у замороженому стані або у висушеному стані для пізнішого відновлення у рідкій або у іншій формі.

Передбачається, що сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФф є переважно стійкою, оскільки вона

Зо суттєво не утворює агрегатів або видимих / невидимих неозброєним оком частинок або фрагментів / продуктів деградації (наприклад, через одну або декількох зазначених вище причин) протягом зберігання та/"або протягом або після заморожування /відтавання та/або протягом або після дії сил зсуву (наприклад, операцій фільтрації або струшування). Відповідно, переважно передбачено, що не більш, ніж 10 95 сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСФ, більш переважно не більш, ніж 8 95, більш переважно не більш, ніж 5 95, переважно не більш, ніж 2 95 від кількості цієї сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСФ на початку зберігання або перед здійсненням одного або кількох циклів заморожування / відтавання або перед здійсненням досліджень зі струшуванням утворює агрегати, частинки та/або фрагменти. Ця стійкість переважно є застосованою протягом періоду у часі, який складає принаймні 1 міс., принаймні 2 міс. або принаймні З міс.; переважно принаймні 4 міс., принаймні 5 міс. або принаймні 6 міс.; більш переважно принаймні 9 міс. або принаймні 12 міс.; більш переважно принаймні 18 міс. або принаймні 24 міс.; та більш переважно принаймні 30 міс. або принаймні 36 міс. або принаймні 48 міс. або принаймні 54 міс. або принаймні 60 міс. Бажані температурні умови зберігання відповідають кімнатній температурі (приблизно 20-25 "С), більш переважно приблизно 2-8 С та більш бажаний строк зберігання складає принаймні З або навіть принаймні 4 роки. У певних втіленнях, сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ є стійкою в умовах кімнатної температури у теплому кліматі (наприклад, приблизно 30 "С). Кількість циклів заморожування / відтавання, протягом яких сполука є переважно стійкою відповідно за вищезазначеними параметрами є принаймні одним циклом, переважно принаймні 2, З або 4 циклами, більш переважно принаймні 5, 6 або 7 циклами та більш переважно принаймні 8, 9 або 10 циклами. Кількість днів, протягом яких сполуку, що нейтралізує ГМ-КСФ може бути піддано струшуванню, як-то струшуванню під час її доставляння та протягом яких ця сполука переважно зберігає власну стійкість відповідно за вищезазначеними параметрами (наприклад, при температурі -5"С т З3"С, див. також

Приклад 124) складає принаймні 1 день, переважно принаймні 2, З або 4 днів, більш переважно принаймні 5, 6 або 7 днів, навіть більш переважно принаймні 8, 9, 10 або 11 днів та більш переважно принаймні 12, 13 або 14 днів.

Як варіант, передбачається, що сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ є переважно стійкою, оскільки вона не утворює димерів, олігомерів або фрагментів. Іншими словами, стійкість сполуки, що нейтралізує ГМ-КСФ може бути визначено відповідно за відсотковим вмістом бо мономерного білка в розчині, з низьким відсотком зруйнованого білка (наприклад, через дію ферментів), частинок (наприклад, видимих неозброєним оком /невидимих частинок) та/або білкових агрегатів. Наприклад, композиція за винаходом, яка містить сполуку, що нейтралізує

ГМ-КСОФ, як-то антитіло може містити принаймні 90 95, більш переважно принаймні 92 95, більш переважно принаймні 95 95, переважно принаймні 98 95 та більш переважно принаймні 99 95 мономерів цієї сполуки.

Під "агрегатом" тут маються на увазі фізичні взаємодії між білюювими молекулами, які призводять до утворення ковалентних або нековалентних димерів або олігомерів (тобто сполук з високою молекулярною масою, як-то тримерів або мультимерів) які можуть лишатися розчинними. "Агрегати" також включають зруйновані та/або фрагментовані білки. Розмір агрегату, наприклад, розчинного агрегату, звичайно є меншим, ніж 1 мкм.

Під "невидимою частинкою" маються на увазі фізичні взаємодії білкових молекул (включаючи зруйновані або фрагментовані білки), які призводять до утворення частинок білків або оборотного або необоротного типу розміром 1-100 мкм. Розчинні агрегати та/або білкові молекули (включаючи зруйновані або фрагментовані білки) можуть з'єднуватися з утворенням невидимих частинок. "Видимі (неозброєним оком) частинки" звичайно мають розмір, який перевищує 100 мкм та можуть бути або частинками, які можна побачити та які є характерними для білка, наприклад, утвореними з більш малих невидимих частинок, агрегатів або білкових молекул (включаючи зруйновані або фрагментовані білки) або частинками, які можна побачити, але які мають стороннє походження, наприклад, які містять чужорідний матеріал, як-то матеріал контейнера для зберігання або пристрою для доставляння. Деякі отримані з комбінованого лікарського засобу частинки внутрішнього або зовнішнього походження, як-то силіконові краплинки, є не твердими частинками, а рідиною, але їх також може бути визначено, як частинки у певних аналізах.

Як було зазначено вище, для визначення наявності та концентрацій агрегатів у композиції, яка містить нейтралізуючу ГМ-КСФ сполуку може бути застосовано кілька різних аналітичних способів, які включають, але без обмеження, наприклад, класичний електрофорез у поліакриламідному гелі (РАСЕ), електрофорез у поліакриламідному гелі з додаванням додецилсульфату натрію (5205-РАСЕ), часо-пролітну мас-спектрометрію з лазерною іонізацією

Зо та десорбцією з рідкої матриці (МАГОІ-ТОЕ М5), капілярний гель- електрофорез (СОЕ), ексклюзійну хроматографію (5ЗЕС), аналітичне ультрацентрифугування (АШС), поточне фракціонування у полі (БЕРЕ), дослідження швидкості седиментації, Уф-спектроскопію, диференційну скануючу калориметрію, нефелометрію, турбідиметрію, ексклюзійну ВЕРХ- хроматографію (ЗЕ-НРІ С), ВЕРХ-хроматографію з оборотною фазою (ЕР-НРІ С), тандемну мас-спектрометрію з іонізацією електророзпиленням (Е5БІ-М5) та їх тандемне поєднання (тандемну КР-НРІ С/Е5БІ-М5), спосіб поточного фракціонування пілд впливом асиметричного силового поля та спосіб дослідження статичного та/або динамічного розсіювання світла. Ці способи може бути застосовано або окремо або у комбінації. Переважно аналітичними способами визначення наявності та концентрацій агрегатів та/або фрагментів у композиції, яка містить нейтралізуючу ГМ-КСФ сполуку є ексклюзійна ВЕРХ-хроматографія, як-то ЗБЕ-НРІ С, аналітичне ультрацентрифугування та асиметричне поточне фракціонування у полі. Способом визначення біологічної активності сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСФ, наприклад шляхом вимірювання ступеня її зв'язування з (імобілізованим) ГМ-КСФ (або його рецептором) є так званий поверхневий плазмонний резонанс (ЗРК).

Частою проблемою білкової композиції є незворотне накопичення агрегатів, які ууворюються протягом часу та внаслідок дії температури або сил зсуву. Як правило, у разі преципітації агрегатів вони утворюють великі частинки, які легко виявити. Проте нековалентні розчинні агрегати меншого розміру, які часто є попередниками преципітації великих частинок є більш важкими для визначення та кількісного аналізу. Отже, способи визначення та кількісного аналізу агрегації білків у білковій композиції мають залежати від типу досліджуваного агрегату.

Серед вищезазначених способів, запропонованими способами визначення наявності та/або кількості розчинних ковалентних агрегатів у білковій композиції є ексклюзійна хроматографія (ЗЕС) / дослідження світлорозсіювання, 505-РАСЕ, СОЕ, ВР-НРІ С/ЕБІ-М5, ЕГЕЕ та АОС.

Запропонованими способами визначення наявності та/або кількості розчинних нековалентних агрегатів у білковій композиції є БЗЕС, РАСЕ, 505-РАСЕ, СОБЕ, ЕРЕЕ, АС та спосіб дослідження динамічного розсіювання світла. Запропонованими способами визначення наявності та/або кількості нерозчинних, нековалентних агрегатів у білковій композиції є Уф-спектроскопія, нефелометрія, турбідиметрія, мікроскопія, дослідження площини під кривою залежності від часу (АОС), асиметричне поточне фракціонування у полі та спосіб дослідження динамічного бо розсіювання світла.

Частинки, які не можна побачити неозброєним оком також можуть утворюватися зі зруйнованих білків, агрегатів або більш дрібних невидимих частинок. Запропонованими способами визначення наявності та/або кількості частинок, яких не можна побачити неозброєним оком є: спосіб дослідження розсіювання світла, наприклад, статичного (наприклад, дослідження багаторакурсного розсіювання лазерного випромінювання) або динамічного (наприклад, фотонно-кореляційна спектроскопія), аналіз траєкторій наночастинок (МТА, наприклад від Маїмегп Іпзігитепі5, Маїмегп, ШК), підрахунок кількості частинок в режимі світлотіні або застосування іншої системи підрахунку рідких частинок, як-то мікроскопії, динамічної обробки зображень (спосіб обробки мікропотокових зображень, наприклад, від

Вгіднемеї! Тесппоїодієз (Сеї! Віозсіепсе5, Обама, СА) або застосування портативного проточного цитометру з модулем візуалізації об'єктів Р ОУУСАМО від Ріцід Ітадіпуд Тесппоіодіє5 (Магтошій,

МЕ), тощо.) та проточної цитометрії та підрахунку електричного імпедансу (спосіб Култера).

Отже, композиція за винаходом переважно має покращене довготривале зберігання, внаслідок чого сполука, що нейтралізує ГМ-КСФ є стійкою протягом періоду зберігання або у рідкому або у замороженому стані, переважно у рідкій формі. Як тут застосовано, під фразою "довготривале зберігання" слід розуміти, що композиція може зберігатися протягом принаймні 1, 2 або З міс. або більше, 6 міс. або більше та переважно 1 рік та більше або навіть 2, З або 4 або 5 років та більше. Під довготривалим зберіганням також слід розуміти зберігання фармацевтичної композиції при температурі або 2-8 "С або при температурі навколишнього середовища, переважно при температурі 2-8 "С, протягом якого ця композиція переважно не втрачає власної біологічної активності до описаного тут рівня та /або не утворює агрегатів до описаного тут рівня та/або містить мономери, рівень яких не перевищує описаного тут рівня.

Опис перевірок цих властивостей наведено тут в іншому місці.

У одному аспекті винаходу, сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ у цій композиції є стійкою у рідкій формі протягом принаймні 1 міс., 2 міс., З міс.; принаймні 4 міс., принаймні 5 мібс.; принаймні 6 міс.; принаймні 12 міс.; принаймні 24 міс.; принаймні 36 міс.; принаймні 48 міс., принаймні 6О міс. Проміжні межі зазначених вище періодів часу також призначено бути частиною цього винаходу, наприклад, 9 міс. тощо. Крім того, сюди призначені бути включеними діапазони значень, отримані із застосуванням комбінації будь-яких зазначених вище значень,

Зо як-то верхні та/або нижні межі цих діапазонів. Переважно ця композиці є стійкою при кімнатній температурі (приблизно 20-25 "С) протягом принаймні 1 міс. та/або стійкою при температурі приблизно 2-8 "С протягом принаймні 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 міс. або більш переважно вона є стійкою при температурі приблизно 2-8 "С протягом принаймні 2, принаймні 3, принаймні 4 або навіть принаймні 5 років.

Іншим важливим аспектом стійкості є те, що сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ в межах композиції за винаходом підтримує її біологічну активність або ефективність протягом періоду зберігання та в межах її умов зберігання, що особливо стосується температури та можливих її змінень. Активність або ефективність, наприклад, є відображенням нейтралізуючої здатності самої сполуки, (як може бути було виміряно з допомогою аналізів із застосуванням клітин, як тут описано вище) або здатності сполуки, що нейтралізує ГМ-КСФ зв'язуватися з ГМ-КСФ або з рецептором ГМ-КСФ. Зв'язувальну спорідненість може бути оцінено з допомогою поверхневого плазмонного резонансу або інших добре відомих в цій галузі способів, наприклад із застосуванням системи Віасоге або аналізу Скетчарда.

Композицію за винаходом отримано додаванням до сполуки, яка, як тут описано, нейтралізує ГМ-КСФ та знаходиться, наприклад, у водному розчині, буфера, регулятора тонічності та одного або кількох поверхнево-активних речовин, амінокислот, антиоксидантів та/або хелатуючих агентів, з яких бажаними є поверхнево-активні речовини. Пересічним фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що поєднання різних призначених до включення до складу композиції компонентів може бути здійснено будь-яким відповідним чином. Наприклад, буфер може бути додано спочатку, між іншими додаваннями або у кінці, регулятор тонічності може бути додано спочатку, між іншими додаваннями або у кінці та одну або декілька поверхнево- активних речовин, амінокислот, антиоксидантів тал"або хелатуючих агентів може також бути додано спочатку, між іншими додаваннями або у кінці. Також будь-якому фахівцеві у цій галузі слід розуміти, що ці хімічні сполуки у певних комбінаціях можуть бути несумісними та відповідно, їх можна легко замінити іншими хімічними сполуками, які мають подібні властивості, але є сумісними у відповідній суміші.

У бажаному аспекті винаходу композиція містить буфер. Термін "буфер" або "буферний засіб", як тут застосовано, стосується засобів, які підтримують значення рН у бажаних межах.

Буфер є водним розчином, який складається з суміші слабкої кислоти та спряженої з нею 60 основи або слабкої основи та спряженої з нею кислоти. Властивість буфера полягає в тому, що рН розчину дуже незначно змінюється у разі додавання маленьких кількостей сильної кислоти або основи. Буферні розчини широко застосовують, як засіб підтримки рН з майже сталим значенням. Взагалі кажучи, у разі застосування у композиції за винаходом буфер переважно надає стійкості сполуці, яка нейтралізує ГМ-КСФ. "Амінокислотні буфери", як тут застосовано, включають, наприклад, амінокислотну основу, наприклад, гістидин та спряжену з нею сіль. Прикладом амінокислотного буфера, який є переважно застосованим у винаході є гістидин/хлорид гістидину.

Бажане значення рН композиції, як тут описано, може бути вибрано з наступних меж: приблизно 4-10, переважно приблизно 4-6 або приблизно 5-7, більш переважно приблизно 5,5- 6,5. Більш бажане значення рН приблизно або точно складає 5,8. Відповідно, бажаним є застосування буфера, який може підтримувати рН розчину в межах 5-7. Термін "приблизно", у разі застосування у контексті значення / діапазону рН переважно означає численні значення, які знаходяться в межах приблизно -/- 20 95 від зазначеного значення. Якщо рН фармацевтичної композиції встановлено в межах або близько до фізіологічної норми, то після введення досягають максимального комфорту для пацієнта. Зрозуміло, що у разі необхідності значення рН може бути скориговано для максимізації стійкості та розчинності сполуки, яка нейтралізує

ГМ-КСФ у певному препараті та у зв'язку з цим, значення рнН, які будуть знаходитися поза межами фізіологічної норми, але переважно є прийнятними для пацієнта також мають відношення до цього винаходу.

Необмежені приклади буферів, прийнятних для застосування в описаній тут композиції включають, гістидин, сукцинат, глюконат, цитрат, аргінін, лізин, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, Тгі5 (трометамол), Вібє-Гі5, МОРБ5, АСЕ5, ТЕ5, НЕРЕБ5, ЕРРБ, етилендіамін, фосфорну кислоту, малеїнову кислоту / фосфат, 2-морфоліно- етансульфонову кислоту (МЕ5), фосфат, ацетат та дієтаноламін.

Бажаними буферами є гістидинові, ацетатні та цитратні буфери. Більш переважно у композиції винаходу застосовують гістидиновий буфер зі значенням рН переважно в межах 5-7, більш переважно 5,5-6,5 та більш переважно рН складає 5,8. Застосовані у винаході буфери є добре відомими у цій галузі, їх отримують із застосуванням відомих способів та можна придбати у приватних постачальників. У певних втіленнях рН такого буфера отримують без застосування

Зо гідроксиду натрію (0 мМ Маон). У втіленні буфер є сумішшю амінокислоти та її солі, наприклад, суміші гістидину та солі гістидину, відсоток якої може бути попередньо виміряно таким чином, щоб не було потреби у коригуванні РН окремою кислотою або основою під час отримання буфера.

У особливому втіленні композиція також містить гідроксид натрію (Маон). У окремих втіленнях, композиція містить 1-200 мМ або менш, ніж 50 мМ, менш, ніж 40 мМ, менш, ніж 35

ММ, менш, ніж 30 мМ, менш, ніж 25 мМ, менш, ніж 20 мМ або менш, ніж 15 мМ, наприклад 10

ММ Ммаон або менше, як-то 5 мМ або 1 мМ гідроксиду натрію.

Окрім сполуки, що нейтралізує ГМ-КСФ та буфера, композиція за винаходом може також містити інші речовини, які включають, але без обмеження, стабілізуючі засоби (стабілізатори).

Відповідно, у бажаному аспекті, композиція містить стабілізатор, який також може діяти, як регулятор тонічності. Термін "стабілізатор" має відношення до засобу, який покращує або іншим чином підвищує стійкість композиції, зокрема сполук, які нейтралізують ГМ-КСФ. Стабілізатор, який є регулятором тонічності може бути невідновлювальним цукром, цукроспиртом або їх комбінацією. Регулятори тонічності у рідкій композиції за винаходом гарантують, щоб тонічність, тобто осмолярність розчину, суттєво була такою ж саме, як і тонічність звичайних фізіологічних рідин, тим самим запобігаючи швидкому поглинанню або набуханню композиції після її введення, викликаному різними іонними концентраціями між цією композицією та фізіологічними рідинами. Звичайно, природа описаної композиції є такою, що її осмоляльність складає приблизно 240-500 мОсмол/кг, більш переважно приблизно 300-450 мОсмол/кг, більш переважно приблизно 350-450 мОсмол/кг, більш переважно приблизно 400 мОсмол/кг.

Переважно стабілізатор/регулятор тонічності може бути одним або кількома невідновлювальними цукрами, як-то цукрозою або трегалозою, одним або кількома цукроспиртами, як-то манітом або сорбітом та бажаним також є застосування комбінацій невідновлювальних цукрів та цукроспиртів. У певних втіленнях концентрацію стабілізатора/ регулятора тонічності у композиції вибрано з наступного: 1-15 95 (маса / об'єм), 2-10 95 (маса / об'єм), 3-8 95 (маса / об'єм), 4-6,5 95 (маса / об'єм) та 4,5-6 95 (маса / об'єм). У окремих втіленнях ця концентрація складає приблизно 5-695 (маса / об'єм). Переважним застосованим у композиції за винаходом стабілізатором / регулятором тонічності є сорбіт, переважно в концентрації у 5 95 (маса / об'єм).

У переважних втіленнях описана тут композиція містить один або декілька додаткових наповнювачів. Переважно наповнювач вибрано з групи, яка складається з поверхнево-активних речовин, амінокислот, антиоксидантів, хелатуючих агентів та їх комбінацій.

Наповнювачі, які також позначено, як хімічні додатки, співрозчинені компоненти або співрозчинники у разі їх додавання у розчин (також у висушеній або замороженій формі) композиції винаходу переважно надають стійкості сполукам, що нейтралізують ГМ-КОФ.

Переважно наповнювачі сприяють наданню стійкості сполукам, що нейтралізують ГМ-КСФ, але зрозуміло, що вони також можуть іншим чином впливати на фізичні, хімічні та біологічні властивості композиції. Наповнювачі є добре відомими у цій галузі, їх виробництво здійснюють із застосуванням відомих в цій галузі способів та їх можна придбати у приватних постачальників.

Бажаним наповнювачем є поверхнево-активна речовина. Термін "поверхнево-активна речовина" звичайно стосується тих засобів, які захищають сполуки, що нейтралізують ГМ-КСФ від стресового впливу поверхні розділу повітря / розчину та розчину / поверхні. Ці поверхневі стресові дії можуть викликати агрегацію білків та утворення частинок, що призведе до неприйнятної якості продукту. Прикладами поверхневих стресових дій може бути контакт білка з ї) повітрям ії) матеріалами ємності контейнера, як-то гумовий плунжер, поршень, скло, попередньо заповнені шприці ії) матеріалами, пов'язаними з отриманням продукту, як-то сталеві резервуари, труби та помпи ім) льодом протягом заморожування / відтавання тощо.

Додавання поверхнево-активних речовин до цієї композиції буде зменшувати взаємодію білка з гідрофобними поверхнями розділу, включаючи поверхню розділу рідини та повітря, льоду та рідини та білково - білююових взаємодій. Поверхнево-активні речовини будуть зменшувати кількість частинок, які можна та не можна побачити неозброєним оком, утворених протягом таких операцій, як заморожування, змішування, фільтрація та відкачування із застосуванням помпи.

Приклади поверхнево-активних речовин включають, але без обмеження, неїіонні поверхнево-активні речовини, як-то полісорбати (наприклад, полісорбат 80 (РБЗ8О) або полісорбат 20 (РБЗ20) (полісорбат звичайно також є відомим під торгівельною маркою ТУУЕЕМФ),

ІСІ Атегіса5х); полоксамери (наприклад, полоксамер 188); Тійоп, додецилсульфат натрію (505);

Зо лаурилсульфат натрію; октилглікозид натрію; лаурил-сульфобетаїн, міристил-сульфобетаїн, лінолеїл-сульфобетаїн, стеарил-сульфобетаїн, лаурил-саркозин, міристил-саркозин, лінолеїл- саркозин, стеарил-саркозин, лінолеїл-бетаїн, міристил-бетаїн, цетил-бетаїн, лауроамідопропіл- бетаїн, кокамідопропіл-бетаїн, лінолеамідопропіл-бетаїн, міристамідопропіл-бетаїн, пальмідопропіл-бетаїн, ізостеарамідопропіл-бетаїн (наприклад, лауроамідопропіл), міристарнідопропіл-, пальмідопропіл- або ізостеарамідопропілдиметиламін; натрію метил кокоїл- або динатрію метил офеїл-таурат; та сполуки під торгівельною маркою Мопадиаї (Мопа

Іпаивігіе5, Іпс., Раїег5оп, МУ.), поліетилгліколь, поліпропілгліколь та кополімери етилену та пропіленгліколю (наприклад, плюроніки, РЕ68). Переважно застосовані у описаній тут композиції поверхнево-активні речовини вибрано з однієї або кількох груп, що складаються з полісорбату 80, полісорбату 20, полоксамерів та їх комбінацій.

Кількість доданої поверхнево-активної речовини є такою, що вона буде підтримувати агрегацію білка на прийнятному рівні, як було досліджено із застосуванням, наприклад, ексклюзійної ВЕРХ-хроматографії (ЗЕС-НРІ С), а також зменшувати кількість частинок, яких можна та не можна побачити неозброєним оком, утворених протягом зберігання, виробництва, заморожування / відтавання, доставляння тощо, як було виміряно шляхом дослідження частинок в режимі світлотіні, мікроскопії та динамічної обробки зображень із застосуванням систем підрахунку частинок, як-то шляхом візуалізації у мікропотоці або із застосуванням системи РіомСАМ.

У особливому втіленні, кількість поверхнево-активної речовини у композиції визначають на основі концентрації критичної агрегації (САС). САС є концентрацією, з якою поверхнево-активна речовина починає взаємодіяти з білком. Результати вимірювань поверхневого натягнення, отримані, наприклад, з допомогою тензіометру, може бути нанесено на графік з отриманням кривих, подібних до Фіг.7. У цьому разі САС буде являти собою концентрацію поверхнево- активної речовини в першій точці розриву. У певних втіленнях, кількість поверхнево-активної речовини у композиції є кількістю, яка буде більшою, САС. У певних втіленнях, кількість поверхнево-активної речовини є більшою, ніж САС, але меншою, ніж критична концентрація міцелоутворення (СМС).

У переважних втіленнях композиція за винаходом містить одну або декілька поверхнево- активних речовин, вибраних з групи, яка складається з полісорбату 80, полісорбату 20,

Зо полоксамерів та їх комбінацій з концентраціями приблизно 0,001-1 95 (маса / об'єм) для концентрацій білків до 200 мг/мл.

У більш бажаному втіленні відношення полісорбату 20 до білка складає приблизно 0,01:1- 31, переважно приблизно 0,05:1-211, більш переважно приблизно 0,1:11 та приблизно 1,571, більш переважно приблизно 0,1:1-0,8:1 та більш переважно приблизно 0,1:1-0,2:1. Для концентрації білка у 80 мг/мл, концентрація полісорбату 20 складає приблизно 0,001-0,2 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,005-0,15 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,007-0,1 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,007-0,06 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 0,01 95 (маса / об'єм). Для концентрації білка у 150 мг/мл, концентрація полісорбату 20 складає приблизно 0,001-0,4 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,006- 0,25 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,01-0,18 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,01-0,1 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 0,02 95 (маса / об'єм).

У іншому втіленні, відношення полісорбату 20 до білка складає приблизно 0,3:1-3:1, переважно приблизно 0,5:1-2,0:1, більш переважно приблизно 0,5:1 та приблизно 1,5:1, більш переважно приблизно 0,8:1-1,2:1 та більш переважно приблизно 11. Для концентрації білка у 80 мг/мл, концентрація полісорбату 20 складає приблизно 0,02-0,2 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,03-0,13 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,05-0,08 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 0,07 95 (маса / об'єм). Для концентрації білка у 150 мг/мл, концентрація полісорбату 20 складає приблизно 0,04-0,4 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,06-0,25 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,1-0,15 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 0,13 95 (маса / об'єм).

У іншому більш бажаному втіленні відношення полісорбату 80 до білка складає приблизно 0,01:1-3:1, переважно приблизно 0,05:1-21, більш переважно приблизно 0,111 та приблизно 1,5:1, більш переважно приблизно 0,1:1-0,6:1 та більш переважно приблизно 0,3:1-0,6:1. Для концентрації білка у 80 мг/мл, концентрація полісорбату 80 складає приблизно 0,001-0,2 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,004-0,14 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,007-0,1 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,007-0,05 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 0,04 95 (маса / об'єм). Для концентрації білка у 150 мг/мл, концентрація полісорбату 80 складає приблизно 0,001-0,4 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,007-

Зо 0,26 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,01-0,2 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,01-0,08 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,04 95 (маса / об'єм).

У іншому втіленні, відношення полісорбату 80 до білка складає приблизно 0,3:1-3:1, переважно приблизно 0,5:1-2,0:1, більш переважно приблизно 0,5:1 та приблизно 1,5:1, більш переважно приблизно 0,8:1-1,2:1 та більш переважно приблизно 1:1. Для концентрації білка у 80 мг/мл, концентрація полісорбату 80 складає приблизно 0,02-0,2 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,04-0,14 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,06-0,09 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,07 95 (маса / об'єм). Для концентрації білка у 150 мг/мл, концентрація полісорбату 80 складає приблизно 0,04-0,4 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,06-0,27 95 (маса / об'єм), білош переважно приблизно 0,1-0,16 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,13 95 (маса / об'єм).

Іншими бажаними наповнювачами можуть бути антиоксиданти або хелатуючі засоби. Як тут застосовано, "антиоксидант" є молекулою, здатною знижувати або запобігати окиснення інших молекул. Окиснення є хімічною реакцією, в ході якої відбувається перенесення електронів з речовини до окиснювача. Антиоксиданти або хелатуючі агенти може бути застосовано для зменшення дій окиснення, викликаних додаванням поверхнево-активних речовин, як-то полісорбату 80 або полісорбату 20, які можуть утворювати пероксиди у розчині. До композиції за винаходом може бути додано такі антиоксиданти та/або хелатуючі агенти, як аскорбінова кислота (вітамін С), ліпоєва кислота, мелатонін, сечова кислота, каротини, ретиноли, токофероли та токотрієноли, наприклад а-токоферол (вітамін Е), убіхінон (кофермент ОС), метіонін, цистеїн, лимонна кислота, ЕДТА або ДТПА. Більш переважно до композиції додають метіонін, цистеїн або лимонну кислоту з молярними відношеннями антиоксиданту до поверхнево-активної речовини, які складають приблизно 3:1-156:11 або з молярними відношеннями антиоксиданту до білка, які складають приблизно 1:1-150:1, білош переважно приблизно 2:1-10071, більш переважно приблизно 3:1-20:1 та білош переважно приблизно 3:1- 87.

Іншими наповнювачами, які може бути додано для надання стійкості білкам у композиції є амінокислоти. Наприклад, амінокислоти, застосовані у композиції за винаходом вибрано з групи, яка складається з треоніну, серину, проліну, аланіну, валіну, глютамину, метіоніну, цистеїну, ізолейцину, аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, аргініну, гліцину, гістидину, бо лізину, фенілаланіну, лейцину, аспарагіну, триптофану, тирозину та їх комбінацій. Більше переважно амінокислоту вибрано з групи, яка складається з аргініну, треоніну, серину, аланіну, глютамину, метіоніну, гліцину та їх комбінацій.

Концентрації амінокислот, застосованих у композиції за винаходом переважно коливаються в межах приблизно 10-100 мМ, більш переважно приблизно 50-100 мМ.

Приклади додаткових наповнювачів включають, але без обмеження цукри/поліоли, як-то цукрозу, лактозу, гліцерин, ксиліт, сорбіт, маніт, мальтозу, інозит, трегалозу, глюкозу; полімери, як-то: сироватковий альбумін (бичачий сироватковий альбумін (ВБА), людський ЗА або рекомбінантний НА), декстран, РМА, гідроксипропілметилцелюлозу (НРМС), поліетиленімін, желатин, полівінілпіролідон (РУР), гідроксиетилцелюлозу (НЕС), гідроксиетилкрохмаль (НЕЗ5); неводні розчинники, як-то багатоатомні спирти (наприклад, ПЕГ, етиленгліколь та гліцерин), диметилсульфоксид (0М5О) та диметилформамід (ОМЕ); та різноманітні наповнювачі, як-то фосфат калію, ацетат натрію, сульфат амонію, сульфат магнію, сульфат натрію, триметиламін

М-оксид, бетаїн, іони металів (наприклад, цинку, міді, кальцію, марганцю та магнію), СНАР5, монолаурат, 2-О-бета-маногліцерат або будь-які комбінації вищезазначеного. "Кріопротектори" включають речовини, які надають стійкості замороженим білкам протягом отримання, заморожування, зберігання, перевезення, розподілення, відновлення або застосування. У окремому аспекті "кріопротектори" включають речовину, яка захищає білок від стресових станів, викликаних процесом заморожування. Кріопротектори також можуть мати ліопротекторну дію. Необмежені приклади кріопротекторів включають цукри, як-то цукрозу, глюкозу, трегалозу, маніт, сорбіт, манозу та лактозу; полімери, як-то декстран, гідроксиетилкрохмаль, полівінілліролідон (РМР) та поліетиленгліколь; поверхнево-активні речовини, як-то полісорбати (наприклад, РО-20 або РБ-80); та амінокислоти, як-то гліцин, аргінін, лейцин та серин. Звичайно застосовують кріопротектор, який має низький рівень токсичності у біологічних системах.

Як тут описано, дисахарид може діяти, як ліопротектор або кріопротектор. "Ліопротектори" включають речовини, які запобігають або зменшують хімічну або фізичну нестійкість білків після ліофілізації та протягом наступного зберігання. У одному аспекті, ліопротектор запобігає або зменшує хімічні або фізичні порушення стійкості білка у разі видалення з композиції води під час процесу сушіння. У додатковому аспекті ліопротектор

Зо надає білку стійкості, допомагаючи підтримувати його належну конформацію з допомогою водневих зв'язків.

Відповідно, у одному аспекті, дисахарид, як тут описано, може бути застосовано для надання стійкості сполукам, які нейтралізують ГМ-КСФ протягом заморожування. Оскільки цей захист під час заморожування може залежати від абсолютної концентрації дисахариду (Сагрепієї єї аЇ., Ріапт. Вев. (1997), 14:969-975 та для максимізації стійкості може бути необхідно застосування концентрацій, які перевищують 5 95.

У одному втіленні до описаної тут композиції додають ліопротектор. Термін "ліопротектор", як тут застосовано, стосується засобів, які надають стійкості білкам протягом процесу заморожування-сушіння або дегідратації (головний та додатковий цикли заморожування - сушіння) шляхом утворення аморфної склоподібної матричної структури та зв'язування з білком з допомогою водневих зв'язків, замінюючи собою молекули води, вилучені під час процесу сушіння. Це допомагає підтримувати конформації білків, зводить до мінімуму деградації білка протягом циклу ліофілізації та покращує довготривалу стійкість продукту. Ліопротектор додають до попередньо ліофілізованої композиції у "ліопротекторній кількості", яка означає, що після ліофілізації нейтралізуючих ГМ-КСФ сполук у присутності цієї кількості ліопротектора, ці сполуки суттєво збережуть власну фізичну та хімічну стійкість та цілісність після ліофілізації та зберігання.

Необмежені приклади ліопротекторів включають цукри, як-то цукрозу або трегалозу; амінокислоти, як-то мононатрію глютамат, гліцин або гістидин; метиламін, як-то бетаїн; ліотропну сіль, як-то сульфат магнію; поліол, як-то трьохатомні або вищі цукроспирти, наприклад, арабіт, ксиліт, сорбіт та маніт; поліетиленгліколь; плюроніки; та їх комбінації.

Переважно ліопротектори є такими, як описано вище для стабілізаторів. Кількість доданого до композиції ліопротектора є звичайно кількістю, яка не призводить до появи неприйнятного рівню деградації / агрегації білка під час, коли білкова композиція знаходиться у ліофілізованому стані.

Додатковим бажаним наповнювачем може бути наповнювач. Термін "наповнювач", як тут застосовано, охоплює засоби, які створюють структуру продукту, отриманого шляхом заморожування - сушіння без безпосередньої взаємодії з фармацевтичним продуктом. Окрім отримання фармацевтично елегантної маси продукту, ці засоби також можуть надавати корисні бо властивості щодо зміни температури деформації, забезпечуючи захист при заморожуванні-

відтаванні та посилювати стійкість білка протягом тривалого зберігання... Необмежені приклади наповнювачів включають маніт, гліцин, лактозу та цукрозу. Ці засоби можуть бути кристалічними (як-то гліцин, маніт або хлорид натрію) або аморфними (як-то декстран, гідроксиетилкрохмаль) та їх звичайно застосовують у білкових композиціях в кількості 0,5-10 9.

Переважно, застосований у композиції за винаходом наповнювач сприяє утворенню маси продукту, яка є естетично прийнятною, однорідною або механічно стійкою. Наповнювачі також переважно сприяють утворенню відкритопористих структур та зручності та швидкості відновлення. Також наповнювачі переважно зменшують або запобігають руйнуванню отриманої маси продукту, евтектичному плавленню або зберіганню залишкової вологи. У іншому аспекті наповнювачі переважно допомагають захистити сполуки, що нейтралізують ГМ-КСФ від стресових становищ (наприклад, викликаних фізичними та хімічними факторами) та допомагають зберігати активність білків.

У особливому втіленні композиція може вибірково містити консервант. "Консервант" є сполукою, яку може бути додано до цих композицій для зменшення бактеріальної активності.

Додавання консерванту може, наприклад, сприяти отриманню композиції, призначеної для багаторазового (тобто з багаторазовою дозою) застосування. Приклади потенційних консервантів включають хлорид октадецил-диметил-бензил-амонію, хлорид гексаметонію, хлорид бензалконію (суміш хлоридів алкіл-бензил-диметил-амонію, в якій алкільні групи є довголанцюговими сполуками) та хлорид бензетонію. Інші типи консервантів включають ароматичні спирти, як-то фенол, бутиловий та бензиловий спирт, алкілпарабени, як-то метил- або пропілпарабен, катехол, резорцин, циклогексанол, З-пентанол та т-крезол. Більш бажаним консервантом тут є бензиловий спирт.

Відповідно, у більше переважних втіленнях, композиція за винаходом є рідкою, переважно водною композицією, призначеною для довготривалого зберігання, яка містить приблизно 50- 200 мг/мл сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСФ та буфер, вибраний з групи, яка складається з гістидину, ацетату та цитрату з рН приблизно 5-7 та ця композиція може додатково містити один або декілька з наступних компонентів, як-то цукрозу, трегалозу, маніт та/або сорбіт як стабілізатор/регулятор тонічності та одну або декілька поверхнево-активних речовин, вибрану з групи, яка містить полісорбат 20, полісорбат 80 та полоксамери.

У певних бажаних втіленнях композиція за винаходом є рідкою, переважно водною композицією, призначеною для довготривалого зберігання, яка містить приблизно 50-200 мг/мл сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСФ, більш переважно приблизно 80 мг/мл або приблизно 150 мг/мл та гістидиновий буфер в концентрації приблизно 20-40 мМ, більш переважно приблизно 30 мМ, з рН приблизно 5,5-6,5, більш переважно 5,8 та може додатково включати приблизно 495 - 695, більш переважно приблизно 595 (маса / об'єм) сорбіту, а також полісорбат, наприклад, полісорбат 20 або полісорбат 80, в концентрації приблизно 0,005-0,5 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,01-0,04 95 (маса / об'єм).

Якщо у вищезазначеній бажаній композиції застосовано полісорбат 20 та концентрація білка складає приблизно 80 мг/мл, то концентрація полісорбату 20 буде складати приблизно 0,001- 0,2 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,007-0,11 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,007-0,06 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 0,01 95 (маса / об'єм).

Якщо застосовано концентрацію білка, яка складає 150 мг/мл, то концентрації полісорбату 20 будуть складати приблизно 0,001-0,4 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,006-0,25 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,01-0,18 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,01 95 (маса / об'єм) - 0,1 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 0,02 95 (маса / об'єм).

У іншому втіленні, якщо у вищезазначеній бажаній композиції застосовано полісорбат 20 та концентрація білка складає приблизно 80 мг/мл, то концентрація полісорбату 20 складає приблизно 0,02-0,2 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,03-0,13 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,05-0,08 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 0,07 95 (маса / об'єм). Якщо застосовано концентрацію білка, яка складає 150 мг/мл, то концентрації полісорбату 20 будуть складати приблизно 0,04-0,4 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,06-0,25 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,1-0,15 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 0,13 95 (маса / об'єм).

Якщо у вищезазначеній бажаній композиції застосовано полісорбат 80 та концентрація білка складає приблизно 80 мг/мл, то концентрація полісорбату 80 у цій композиції буде складати приблизно 0,001-0,2 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,004-0,14 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,007-0,1 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,007-0,05 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 0,04 95 (маса / об'єм). Якщо застосовано концентрацію білка, яка складає 150 мг/мл, то концентрація полісорбату 80 буде складати 60 приблизно 0,001-0,4 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,007-0,26 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,01-0,2 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,01-0,08 95 (маса / об'єм) та більш переважно приблизно 0,04 95 (маса / об'єм).

У іншому втіленні, якщо у вищезазначеній бажаній композиції застосовано полісорбат 80 та концентрація білка складає приблизно 80 мг/мл, то концентрація полісорбату 80 буде складати приблизно 0,02-0,2 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,04-0,14 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,06-0,09 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,07 95 (маса / об'єм). Якщо застосовано концентрацію білка, яка складає 150 мг/мл, то концентрація полісорбату 80 буде складати приблизно 0,04-0,4 95 (маса / об'єм), переважно приблизно 0,06- 0,27 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,1-0,16 95 (маса / об'єм), більш переважно приблизно 0,13 95 (маса / об'єм).

Крім того, у одному втіленні, заявлена композиція нейтралізуючого антитіла до ГМ-КСФ або його функціональних фрагментів містить приблизно 80-150 мг/мл нейтралізуючих антитіл, приблизно 5 95 (маса / об'єм) сорбіту, приблизно 30 мМ І-гістидину, приблизно 0,02-0,04 95 (маса / об'єм) полісорбату 80 та має рН приблизно 5,8.

Крім того, у одному втіленні, заявлена композиція нейтралізуючого антитіла до ГМ-КСФ або його функціональних фрагментів містить приблизно 80 мг/мл нейтралізуючих антитіл, приблизно 5 95 (маса / об'єм) сорбіту, приблизно 30 мМ І-гістидину, приблизно 0,04 95 (маса / об'єм) полісорбату 80 та має рН приблизно 5,8.

Крім того, у одному втіленні, заявлена композиція нейтралізуючого антитіла до ГМ-КСФ або його функціональних фрагментів містить приблизно 150 мг/мл нейтралізуючих антитіл, приблизно 5 95 (маса / об'єм) сорбіту, приблизно 30 мМ Г- гістидину, приблизно 0,04 95 (маса / об'єм) полісорбату 80 та має рН приблизно 5,8.

Зрозуміло, що певні компоненти композиції можуть бути взаємозамінними з відомими в цій галузі альтернативними варіантами. Однак, будь-якому фахівцеві у цій галузі також буде зрозуміло, що включення певних компонентів буде виключати застосування інших компонентів, концентрацій або способів отримання композиції через певні причини, які включають, але без обмеження, хімічну сумісність, рН, тонічність та стійкість.

Для рідкої композиції за винаходом бажано мати низьку та прийнятну в'язкість, яка буде прийнятною для підшкірного введення, як-то у готовому для застосування пристрої. Отже

Зо в'язкість композиції за винаходом є переважно нижчою, ніж 20 мПа:с зі швидкістю зсуву приблизно у 50-1000 |1/сек.| та температурою приблизно 20 "С. Більш переважно ця в'язкість є нижчою, ніж 15 мПа:с у вищезазначених умовах.

У особливому втіленні, в'язкість та/або стійкість рідкої композиції за винаходом зберігає протягом довгого часу низьку силу ін'єкції. Вимірювання сили, наприклад, із застосуванням препаратів у попередньо заповнених шприцах здійснюють з допомогою відповідного приладу, як-то універсальної розривної машини ІМ5ТКОМФ (Могмосда, МА) з додатковим обладнанням для закріплення шприців у випробувальній машині. Ці описані тут композиції надають можливість підшкірного введення з допомогою як ручних, так і автоматичних (наприклад, механічних) пристроїв. Силою ін'єкції у втіленні є сила тертя ковзання. У певних втіленнях, сила тертя ковзання є меншою, ніж 25 Н. У інших втіленнях, сила тертя ковзання складає 0-20 Н, 2-15

Н або 4-11 Н. Час, протягом якого композиція може зберігати низьку силу ін'єкції складає принаймні З міс., принаймні Є міс., принаймні 12 міс., З міс., 6 міс., 9 міс., 12 міс., 15 міс., 18 міс., 24 міс., 3-6 міс., 3-9 міс., 6-9 міс., 6-12 міс., 9-15 міс., 12-18 міс., 18-30 міс. або 24-36 міс. після завантаження композиції у шприц. Композицію можна зберігати в холодильнику при температурі, наприклад, 2-8 "С або 5 "С або при кімнатній температурі, наприклад, 18-25 "С або 2576.

Як тут зазначено, ця заявка головним чином присвячена виявленню того, що додавання деяких речовин до композиції, яка містить нейтралізуючі ГМ-КСФ сполуки може зменшити агрегацію та/або руйнування/фрагментацію цих сполук у композиції. Також слід зазначити, що додавання описаних тут речовин зменшує агрегацію / фрагментацію сполук, які нейтралізують

ГМ-КСФ у композиції незалежно від причини агрегації та/або деградації цих сполук. У певних втіленнях додавання описаних речовин зменшує агрегацію / деградації цих сполук у композиції, викликане, наприклад, зберіганням, впливом підвищених температур, світла, сил зсуву, рн, іонних умов та будь-якими їх комбінаціями.

Виявлені винахідниками заходи може бути застосовано для зменшення агрегації та/або деградації/фрагментації сполуки, яка нейтралізує ГМ-КСФ та яку отримано, зокрема, у рідкій та у замороженій формі, отже зменшення агрегаційфрагментації переважно спостерігають саме у рідкій композиції. Передбачено, що зменшення агрегації/ деградації може також бути спостережено у разі безпосереднього зберігання у рідкій формі для пізнішого застосування, бо зберігання у замороженому стані та відтавання перед застосуванням або отримання композиції у висушеній формі, як-то у формі, отриманої після ліофільного сушіння, повітряного сушіння або сушіння розпиленням для пізнішого відновлення рідкої або іншої форми перед застосуванням.

Отже, передбачається, що описану тут композицію може бути збережено із застосуванням будь-якого відомого фахівцям у цій галузі способу. Необмежені приклади включають охолодження, заморожування, ліофілізацію та сушіння композиції розпиленням, з яких бажаним є зберігання шляхом охолодження.

У деяких випадках білкові композиції є замороженими для зберігання. Відповідно, бажаним є досягнення відносної стійкості композиції у цих умовах, включаючи стійкість під час здійснення циклів заморожування-відтавання. Одним способом визначення цієї прийнятності композиції є піддавання зразкової композиції дії принаймні одного, наприклад, одного, трьох, п'яти, семи та до десяти циклів заморожування та відтавання (наприклад, заморожування протягом ночі при температурі приблизно -80 "С ж 10 "С та наступне швидке відтавання при кімнатній температурі або швидке відтавання на льоді, наприклад протягом б год.), визначення кількості видів молекул з малою молекулярною масою / усічених (МУМ) та/або з великою молекулярною масою /агрегатів (НМУ), які накопичуються після здійснення циклів заморожування-відтавання та порівняння її з кількостями ГМУМ або НММУМ, присутніми у зразку перед початком процедури заморожування - відтавання. Зростання кількості ІМУМ або НМУМ свідчить про зниження стійкості білка, який зберігається, як частина композиції. Для визначення наявності видів (ММ та НММУ може бути застосовано ексклюзійну ВЕРХ-хроматографію (ЗБ-НРІ С).

Переважно білкові композиції можуть зберігати у рідкому вигляді. Відповідно, як тут описано, бажаним є досягнення стійкості рідких композицій у цих умовах, включаючи стійкість з різними температурами. Наприклад, один спосіб визначення прийнятності композиції полягає у зберіганні зразкової композиції з різними температурами (як-то 2-8 "С, 15 С,207С,2570, 30 С, 35"С, 40 С та 50 С) та у перевірці кількостей видів НМУМ та/або І МУУ, які накопичуються протягом часу. Чим ці кількості будуть меншими, тим краще будуть умови зберігання композиції.

Додатково також можна контролювати профіль заряду білка із застосуванням катіонообмінної

ВЕРХ-хроматографії (СЕХ-НРІ С). Як варіант, композиції також може бути збережено після ліофілізації. Крім того, бажано, щоб досліджувані композиції були стійкими в умовах дії сил зсуву. Одним способом визначення прийнятності композиції є її струшування у відповідній

Зо ємності на мішалці, наприклад на вертикальній мішалці, з бажаною температурою (як-то 2-8 С, 157С,20"С, 25", 30, 35"С, 40"С та 50С, переважно 5"С ж 3"С). Цю ємність (наприклад, флакон) можуть зберігати на мішалці протягом бажаного періоду часу, наприклад, до 14 днів або більше, порівнюючи її з контролем, який зберігають без струшування з тією ж саме температурою. Збір даних у проміжки часу може бути проведено, наприклад, через 0, 1,2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 14 та 14 днів. Кількість видів молекул з низькою молекулярною масою (МУ) та/або молекул з високою молекулярною масою (НММІ), які накопичуються після зберігання зі струшуванням може бути визначено та порівняно з кількістю видів молекул І МУМ або НММУУ, присутніх у контрольному зразку, який не струшували. Зростання кількості видів молекул ГМУМУ або НМУМ свідчить про зниження стійкості білка, як частини композиції протягом зберігання. Для визначення наявності молекул І!ММУУ та НМУМ може бути застосовано ексклюзійну ВЕРХ-хроматографію.

У певних випадках композицію висушують розпиленням, а потім зберігають. Для сушіння розпиленням, рідку композицію розпилюють у вигляді аерозолю за наявністю сухого газового потоку. В результаті цього сушіння відбувається відокремлення води з крапель композиції у газовий потік, що призводить до появи висушених частинок композиції лікарського засобу.

Також до складу такої композиції може бути включено наповнювачі з метою (ії) захисту білка під час сушіння розпиленням від деградації (ії) захисту білка під час зберігання після сушіння розпиленням та /або ії) надання розчину аерозольних властивостей. Цей спосіб є подібним до способу, описаного вище для заморожування за виключенням того, що у цьому разі замість заморожування композицію зразка піддають сушінню розпиленням, відновлюють у розчиннику та відновлену композицію перевіряють на наявність видів молекул І! МУМ та/або НММУ. Зростання видів молекул Ї/МУМ або НМУМ у висушеному розпиленням зразку порівняно до відповідного неліофілізованого зразка композиції свідчить про зниження стійкості у зразку, висушеному розпиленням.

Термін "ліофілізований" або "висушений заморожуванням" стосується стану речовини, яку було піддано процедурі сушіння, як-то ліофілізації з усуненням принаймні 90 95 переважно 95 95, більш переважно 9895 вологи. Відповідно, термін "ліофілізація" як тут застосовано, має відношення до процесу, в ході якого призначений для сушіння матеріал спочатку заморожують з наступним усуненням льоду або замороженого розчинника шляхом сублімації в вакуумному бо середовищі. До складу призначених для ліофілізації композицій може бути включено наповнювач (наприклад, ліопротектор) з метою підвищення стійкості ліофілізованого продукту після зберігання. Термін "відновлена композиція", як тут застосовано, має відношення до композиції, яку було отримано шляхом розчинення ліофілізованої білкової композиції у розчиннику таким чином, що сполука, яка нейтралізує ГМ-КСФ стає розсіяною у розчиннику з утворенням дисперсної системи.

Термін "розчинник", як тут застосовано, стосується речовини, яка є фармацевтично прийнятною (безпечною та нетоксичною для введення людині) та корисною для отримання рідкої композиції, як-то композиції, відновленої після ліофілізації. Необмежені приклади розчинників включають стерильну воду, бактеріостатичну воду для ін'єкцій ВУМЕЇ), буферний розчин з доведеним рН (наприклад, фізіологічний розчин з фосфатним буфером), стерильний фізіологічний розчин, розчин Рингера, розчин декстрози або водні сольові та/або буферні розчини.

У іншому аспекті винаходу зазначену композицію передбачено для застосування у терапевтичному лікуванні. Відповідно, винаходом передбачено фармацевтичний препарат (або лікарський засіб), який містить описану тут композицію.

У іншому втіленні винаходом передбачено спосіб лікування суб'єкту, який полягає у введенні терапевтично ефективної кількості описаної тут композиції у разі, якщо суб'єкт має захворювання або розлад, який може бути піддано дієвому лікуванню зі сполукою, яка нейтралізує ГМ-КСФ.

Переважно описану тут композицію застосовують у профілактиці та/або лікуванні захворювання, розвитку якого можна запобігти та/або його послабити та/або лікувати зі сполуками, які нейтралізують ГМ-КСФ.

Термін "суб'єкт" призначено охоплювати живі організми. Приклади суб'єктів включають ссавців, наприклад, людину, собак, корів, коней, свиней, овець, кіз, кішок, мишей, кролів, щурів та трансгенних тварин. У бажаних втіленнях винаходу суб'єкт є людиною.

Термін "ефективна доза" або "ефективне дозування" є визначенням кількості, прийнятної для досягнення або принаймні часткового досягнення бажаної дії. Термін "терапевтично ефективна доза" є визначенням кількості, прийнятної для лікування або принаймні часткового затримання захворювання та викликаних цим захворюванням ускладнень у пацієнта, який вже

Зо страждає від цього захворювання. Кількості, які будуть ефективними для цього застосування будуть залежати від тяжкості стану хвороби та від загального стану імунної системи пацієнта.

Термін "пацієнт" охоплює людину та інших суб'єктів-ссавців, які отримують або профілактичне або терапевтичне лікування.

Прийнятне дозування або терапевтично ефективна кількість композиції буде залежати від стану, який підлягає лікуванню, тяжкості цього стану перед початком терапевтичного лікування, історії хвороби пацієнта та від відповіді на терапевтичний засіб. Належну дозу може бути скориговано відповідно до рішення лікаря таким чином, щоб її можна було вводити пацієнтові одноразово або шляхом серійних введень. Цю фармацевтичну композицію може бути введено у вигляді одиничного терапевтичного засобу або, у разі потреби, у комбінації з додатковими терапевтичними засобами.

Фармацевтичні композиції цього винаходу зокрема є корисними для парентерального введення, тобто для підшкірного, внутрішньом'язового, внутрішньовенного введення, введення у суглоб та / або у синовіальну рідину, причому бажаним є підшкірне введення. Парентеральне введення може бути здійснено шляхом болюсної ін'єкції або безперервної інфузії.

Фармацевтичні композиції для ін'єкції можуть бути присутніми у стандартній лікарській формі з додаванням консерванту, наприклад, в ампулах або в багатодозових контейнерах. Крім того, було розроблено кілька сучасних способів доставляння лікарського засобу та фармацевтичні композиції за винаходом є прийнятними для введення із застосуванням цих нових способів доставляння, наприклад, із застосуванням автоматичних ін'єкторів Іпіесі-єаве,

Сепіесі, шприців-ручок, як-то бепеп та безголкових ін'єкторів, як--о Меайесіог та Віоуесіог.

Зазначену фармацевтичну композицію також може бути пристосовано для ще не відкритих способів введення. Див. також І апдег, 1990, Зсіепсе, 249: 1527-1533.

Ліофілізовані фармацевтичні композиції переважно може бути надано у флаконі, що містить активний інгредієнт. У одному втіленні ці фармацевтичні композиції додатково містять ще розчин для відновлення.

Фармацевтична композиція також може містити додаткові фармацевтично прийнятні компоненти. Інші фармацевтично прийнятні носії, наповнювачі або стабілізатори, як-то описані у

Ветіпдюп'в РНаптасецшіїса! бсіепсе5 161п еййіоп, О5ої, А. Еа. (1980) також може бути включено до складу описаної тут білкової композиції за умови, що вони не будуть шкідливо впливати на бо бажані характеристики композиції. Як тут застосовано, "фармацевтично прийнятний носій"

означає будь-які та всі прийнятні для фармацевтичного введення розчинники, дисперсні середовища, покриття, протимікробні та протигрибкові засоби, ізотонічні засоби та засоби, які уповільнюють поглинання. Застосування цих середовищ та засобів для фармацевтично активних речовин є добре відомим у цій галузі. Прийнятні носії, наповнювачі або стабілізатори є нетоксичними до реціпієнтів з застосованими дозуваннями та концентраціями та включають регулятори тонічності; додаткові буферні засоби; консерванти; співрозчинники; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту та метіонін; хелатуючі засоби, як-то ЕОТА; комплекси металів (наприклад, комплекси 2п-білок); біорозкладані полімери, як-то поліестери; протиіони, які утворюють солі, як-то іони натрію, багатоатомні цукроспирти; амінокислоти, як-то аланін, гліцин, аспарагін, 2-фенілаланін, треонін; цукри або цукрові спирти, як-то лактит, стахіоза, маноза, сорбоза, ксилоза, рибоза, рибит, міоінозитоза, міоінозитол, галактоза, галактит, гліцерин, циклітоли (наприклад, інозитол), поліетиленгліколь; сірковмісні відновники, як-то глутатіон, ліпоєва кислота, тіогліколят натрію, тіогліцерин, (альфа|-монотіогліцерин та тіосульфат натрію; білки з малою молекулярною масою, як-то людський сироватковий альбумін, бичачий сироватковий альбумін, желатин або інші імуноглобуліни; та гідрофільні полімери, як-то полівінілпіролідон.

Ці описані тут композиції є корисними, як фармацевтичні композиції для лікування та/або запобігання та/або ослаблення перебігу захворювання або розладу у пацієнта у разі потреби.

Термін "лікування" має відношення як до терапевтичного лікування, так і до профілактичних або запобіжних заходів. Лікування полягає у застосуванні або введенні ккомпозиції в організм, у виділенні тканин або клітин з пацієнта, який має захворювання /розлад, симптом захворювання /розладу або схильність до захворювання /розладу, з метою лікування, загоєння, пом'якшення, полегшення, змінення, усунення, покращення, виправлення або впливу на захворювання, симптом захворювання або схильність до захворювання.

Термін "потребують лікування" включає осіб, які вже мають розлад, а також які потребують його запобігання. Термін "розлад" є будь-яким станом, для якого було б корисним лікування із застосуванням описаної тут білкової композиції та охоплює хронічні та гострі розлади або захворювання, включаючи ті патологічні стани, які призводять до появи у ссавця цього розладу.

Необмежені приклади розладів, які у цьому разі підлягають лікуванню включають з запальні та

Зо автоїмунні розлади, переважно включаючи алергічні та псоріатичні розлади, а також артрит та астматичні розлади, наприклад артрит, ревматоїдний артрит (РА), автоїмунний енцефаліт, псоріаз, множинний склероз, захворювання легенів, як-то бронхіальну астму, хронічне обструктивне захворювання легень (ХОЗЛ), гострий респіраторний дистрес-синдром (ГРДС); хворобу Крона, синдром Хамена-Річа (ІРЕ), запальне захворювання ккишечника (ІВО), увеїт, дегенерацію жовтої плями, коліт, Валлерову дегенерацію, антифосфоліпідний синдром (АФС), гострий коронарний синдром, ретиноз, атеросклероз, рецидивуючий поліхондрит (КР), гострий або хронічний гепатит, відторгнення ортопедичних імплантатів, гломерулонефрит, вовчак, атопічний дерматит та біль, викликаний запаленням, артритом.

Алергічним розладом є будь-який розлад, викликаний алергією або алергічною реакцією.

Алергією є розлад гіперчутливості імунної системи, який виникає у разі реакції або надмірної реакції імунної системи особи на звичайно нешкідливі сторонні речовини (алергени), як-то на їжу, пилок, цвіль, хатній пил, тваринну вовну та пилових кліщів.

Псоріаз є автоїімунним захворюванням, яке головним чином уражає шкіру. Під час цієї хвороби відбувається прискорення циклу росту клітин шкіри через хибні сигнали, які надходять з імунної системи. Існує п'ять типів псоріазу: бляшкоподібний, краплеподібний, зворотний (псоріаз складок), пустульозний та псоріатична еритродермія. Найбільш поширеною формою є бляшкоподібний псоріаз, прояви якого звичайно можна побачити у вигляді лускатих плям різних відтінків червоного та білого кольору, які з'являються на першому верхньому шарі епідермісу (шкіри), хоча деякі пацієнти не мають жодних дерматологічних ознак або симптомів цього захворювання. Цей розлад є хронічним повторюючимся станом, тяжкість якого може змінюватися від незначних місцевих плям на шкірі до повного покриття поверхні тіла. Внаслідок цієї хвороби часто виникають ураження нігтів на пальцях ніг та рук (псоріатична дистрофія нігтів) та це можна розглядати, як окрему ознаку цього захворювання. Псоріаз може також викликати запалення суглобів, також відоме, як псоріатичний артрит.

Артрит є формою розладу суглобів, який призводить до запалення одного або кількох суглобів. Існує понад 100 різних форм артриту. Найбільш поширена форма остеоартриту (дегенеративного захворювання суглобів) виникає внаслідок травми суглобів, інфекції суглобів або вікових змінень. Іншими формами артриту є ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит та інші споріднені автоїмунні захворювання. Септичний артрит виникає внаслідок інфекції суглобів.

Бронхіальна астма є звичайним хронічним запальним розладом дихальних шляхів, до якого залучено багато клітин та клітинних елементів. Бронхіальна астма є пов'язаною з надмірною реактивністю дихальних шляхів, яка призводить до появи повторюючихся епізодів хрипу, кашлю, стиснення у грудях та задишки. Ці епізоди звичайно пов'язані з розповсюдженою, але змінної обструкцією дихальних шляхів у легенях, яка часто є оборотною або спонтанною або з лікуванням. Бронхіальну астму можна класифікувати відповідно за частотою симптомів, обсягом форсованого видиху за одну секунду та піковою швидкістю видиху. Також бронхіальну астму можна класифікувати, як атопічну (зовнішню) або неатопічну (внутрішню).

Окрім сполук, нейтралізуючих ГПМ-КСФ фармацевтична композиція за винаходом може містити додаткові терапевтичні або біологічно активні засоби, наприклад, терапевтичні фактори, які є корисними у лікуванні певних показань, як-то остеоартриту (наприклад, може бути присутнім один або декілька інгібіторів сполук?, залучених до процесу руйнування суглобового хряща або синовіальних компонентів, вибраних з групи, яка складається з, але без обмеження, анти-металопротеїназ, циклинових сполук, цитокинових антагоністів, кортикостероїдів, інгібіторів ФНП, інгібіторів інтерлейкінів, антиангіогенних речовин, інгібіторів агреканази, інгібіторів кінази р38, інгібіторів апоптозу, інгібіторів гіалуронідази та інгібіторів протеолітичних ферментів). Також частиною цієї композиції можуть бути фактори, які контролюють запалення, включаючи інфліксимаб, етанерцерпт, адалімулаб, нерелімонмаб, ленерцерпт тощо або їх комбінації. Також передбачено, що ця фармацевтична композиція може містити компоненти позаклітинного матриксу, як-то гіалуронову кислоту або їх похідні, включаючи солі, естери, внутрішні естери та сульфатні похідні, переважно неповний естер гіалуронової кислоти.

У іншому втіленні винаходом передбачено набір (або промисловий виріб) або контейнер, який містить препарат за винаходом, який переважно може вже знаходитися в рідкому стані або, як варіант, він також переважно може бути у ліофілізованому стані. Також він може знаходитися у замороженому стані або його може бути отримано після заморожування - сушіння або сушіння розпиленням. Відповідно, якщо цей препарат існує у іншому, окрім рідкого, стані то його може бути отримано практикуючим лікарем у вигляді (рідкої) водної фармацевтичної композиції. Наприклад, препарат може бути ліофілізовано та потім його треба буде відновити. Відповідно, зазначений набір також може містити засоби для відновлення

Зо замороженого, ліофілізованого, отриманого після заморожування - сушіння або сушіння розпиленням препарату та/(або засоби для його розведення та/або засоби для введення препарату або, відповідно, фармацевтичної композиції, як--о шприц, голка, помпа, інфузійна помпа тощо. Цей набір може містити один або декілька флаконів, які містять препарат за винаходом. Також до набору може бути додано інструкції по застосуванню.

Отже, винаходом передбачено промисловий виріб, який містить описаний тут препарат та переважно також містить інструкції по його застосуванню. Цей промисловий виріб також включає контейнер, прийнятний для розміщення препарату. Прийнятні контейнери включають, але без обмеження, пляшки, флакони (наприклад, двокамерні флакони), шприці (наприклад, одно- або двокамерні шприці), пробірки, небулайзери, інгалятори (наприклад, дозуючі або порошкові інгалятори) або накопичувачі. Контейнер може бути зроблено з ряду матеріалів, як-то зі скла, металу або пластику (це може, наприклад, бути полікарбонат, полістирол, поліпропілен, поліолефін). Такий контейнер містить препарат та інформацію про цей препарат на етикетці або він може містити вказівки на інструкції по його відновленню та/або застосуванню. На етикетці може бути також зазначено, що препарат є корисним або призначеним для підшкірного введення. Контейнер, який містить цей препарат може бути флаконом, призначеним для багаторазового застосування, який дозволяє здійснювати повторні введення (наприклад, від 2 до 6 введень) препарату. Зазначений промисловий виріб також може містити другий контейнер з прийнятним розчинником (наприклад, МУРІ, 0,995 Масі, ВУМУРїЇ, фізіологічний розчин з фосфатним буфером). Якщо цей промисловий виріб включає ліофілізовану версію препарату зі сполукою, яка нейтралізує ГМ-КСФ, то бажаної кінцевої концентрації білка у відновленій композиції можна буде досягти шляхом змішування цієї ліофілізованої композиції з розчинником. Також цей промисловий виріб може містити інші матеріали, які є бажаними з комерційної та споживчої точки зору, включаючи інші буфери, розчинники, фільтри, голки, шприці та додані до пакування листівки з інструкціями по застосуванню.

Винахід також стосується пристроїв, які може бути застосовано для доставляння препарату за винаходом. Приклади цих пристроїв включають, але без обмеження, шприц, наприклад, попередньо заповнений шприц, ручку-дозатор, імплантат, безголковий ін'єкційний пристрій, пристрій для інгаляції та пластир.

Композиції за винаходом є стійкими до багатьох факторів, включаючи поверхневе 60 навантаження, яке виникає від їх застосування у, наприклад, скляному попередньо заповненому шприці та у картриджі. Було визначено, що гумові матеріали, засоби, які містять силікон, вольфрам та вулканізуючі реагенти здатні до негативної взаємодії з білковими розчинами з утворенням агрегатів та частинок, яких можна та не можна побачити неозброєним оком. Білкові композиції за винаходом є сумісними з компонентами у попередньо заповненому шприці / картриджній системі, включаючи їх систему закупорювання.

Додаткові ілюстрації винаходу наведено у Прикладах та Фігурах, які мають лише ілюстративний характер та не є побудованими для обмеження обсягу цього винаходу.

Стислий опис креслень.

Фіг. 1: Вплив часу зберігання, температури зберігання та концентрації білка на кількість мономерів анти-ГМ-КОФ антитіл.

Фіг. 2: Діаграма Парето стандартизованої дії з осмоляльністю ІмОсмол/кг|, як змінною величиною.

Фіг. 3: Утворення частинок розміром 2-10 мкм у композиціях, які містять 80 мг/мл анти-ГМ-

КСФ антитіл, 5 95 сорбіт, 30 мМ гістидин та змінні кількості ТММЕЕМФ 20.

Фіг. 4: Утворення 2-10 мкМ частинок у композиціях, які містять 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ антитіл, 5 95 сорбіт, 30 мМ гістидин та змінні кількості ТМУЕЕМФО 80.

Фіг. 5: Утворення частинок розміром 2-10 мкм у композиціях, які містять 150 мг/мл анти-ГМ-

КСФ антитіл, 5 95 сорбіт, 30 мМ гістидин та змінні кількості ТМУЕЕМФО 20.

Фіг. 6: Утворення частинок розміром 2-10 мкм у композиціях, які містять 150 мг/мл анти-ГМ-

КСФ антитіл, 5 95 сорбіт, 30 мМ гістидин та змінні кількості ТММЕЕМФ 80.

Фіг. 7: Характерна крива поверхневого натягу анти-ГМ-КСФ антитіл та поверхнево-активної речовини.

Фіг. 8: Ріст концентрації частинок розміром ( 10 мкм, як функція кількості циклів заморожування / відтавання композицій, які містять 80 мг/мл анти-ГМ-КОФ антитіл у розчині з 30

ММ гістидином, 5 95 сорбітом та змінними концентраціями ТУ/ЕЕМФ 20 або ТМУЕЕМФ 80.

Фіг. 9: Ріст концентрації частинок розміром ( 10 мкм, як функція кількості циклів заморожування / відтавання композицій, які містять 150 мг/мл анти-ГМ-КОФ антитіл у розчині з мМ гістидином, 5 95 сорбітом та змінними концентраціями ТУУЕЄЕЕМФ 20 або ТУМЕЕМФО 80.

Характеристику цього винаходу також надано у наступних пунктах:

Зо 1. Стійка композиція, яка містить сполуку, що нейтралізує ГМ-КСФ в концентрації принаймні приблизно 20 мг/мл, регулятор тонічності, буфер та один або декілька поверхнево-активних речовин, амінокислот, антиоксидантів та/або хелатуючих агентів... 2. Композиція за п.1, яка містить сполуку, що нейтралізує ГМ-КСФ, регулятор тонічності, буфер та поверхнево-активну речовину.

З. Композиція за п.ї або 2, в якій сполука, що нейтралізує ГМ-КСФ є присутньою в концентрації принаймні приблизно 50 мг/мл, регулятор тонічності є присутнім в концентрації приблизно 1-15 95 (маса / об'єм) та буфер є присутнім в концентрації приблизно 10-50 мМ. 4. Композиція за будь-яким з пп.1-3, в якій регулятор тонічності вибрано з маніту, сорбіту, цукрози та/або трегалози. 5. Композиція за будь-яким з пп.1-4, в якій буфер вибрано з гістидинового, ацетатного та/або цитратного буфера. 6. Композиція за будь-яким з пп.1-5, в якій поверхнево-активну речовину вибрано з одного або кількох з наступного: полісорбат 20, полісорбат 80, полоксамери та їх комбінації. 7. Композиція за будь-яким з пп.1-6, в якій нейтралізуюча ГМ-КСФ сполука є присутньою в концентрації принаймні приблизно 50 мг/мл та меншою, ніж приблизно 200 мг/мл, регулятор тонічності є присутнім в концентрації приблизно 3-7 95 (маса / об'єм), буфер є присутнім в концентрації приблизно 20-40 мМ та поверхнево-активна речовина є присутньою в концентрації приблизно 0,001-1 95 (маса / об'єм). 8. Композиція за будь-яким з пп.1-7, яка має рН приблизно 5-7. 9. Композиція за будь-яким з пп.1-8, в якій регулятором тонічності є сорбіт та буфером є гістидиновий буфер. 10. Композиція за будь-яким з пп.2-9, яка також містить антиоксидант. 11. Композиція за будь-яким з пп.1-10, в якій сполуку, яка нейтралізує ГМ-КСФ вибрано з групи, що складається з поліпептиду, пептидоміметика, нуклеїнової кислоти та малої молекули. 12. Композиція за п.11, в якій поліпептид є антитілом або його функціональним фрагментом, який зв'язується з ГМ-КСФ або з рецептором ГМ-КОФ. 13. Композиція за п.12, в якій антитіло або його функціональний фрагмент є моноклональним антитілом людини або його функціональним фрагментом. 14. Композиція за п.12 або 13, в якій антитіло є антитілом Ідс, яке належить до підкласів 60 ІЧО1 або Ідса4.

15. Композиція за будь-яким з пп.12-14, в якій антитіло або його функціональний фрагмент зв'язується з епітопом ГМ-КСФ та цей епітоп переважно містить амінокислоти 23-27 (АНІ М) та/або амінокислоти 65-77 (СІ В/0ОС5І -ТКІ Ка РІ. 16. Композиція за п.15, в якій цей епітоп також включає: () амінокислоти 28-31 (І ЗАВ); (ії) амінокислоти 32-33 (ТА) та/або (ії) амінокислоти 21-22 (ЕА). 17. Композиція за п.15 або п.16, в якій цей епітоп є переривчастим епітопом. 18. Композиція за будь-яким з пп.12-17, в якій зазначене антитіло або його функціональний фрагмент містить у власній змінній ділянці важкого ланцюга ділянку СОКЗ, яка містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з будь-яких послідовностей 5ЕО

ІО МоМе1-13 та 56. 19. Композиція за п.18, в якій будь-яка з зазначених послідовностей ділянки СОКЗ змінної ділянки важкого ланцюга існує у змінній ділянці важкого ланцюга разом з ділянкою СОК'1 змінної ділянки важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮО Мо 14 та з ділянкою СОК2 змінної ділянки важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІО Мо 15. 20. Композиція за будь-яким з пп.12-19, в якій зазначене антитіло або його функціональний фрагмент містить ділянку СОКІ у власній змінній ділянці легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕБО ІЮ Мо 16, ділянку СОК2, яка містить амінокислотну послідовність як наведено у 5ЕО ІО Мо 17 та ділянку СОКЗ, яка містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мо 18. 21. Композиція за будь-яким з пп.12-20, в якій зазначене антитіло або його функціональний фрагмент містить у власній змінній ділянці легкого ланцюга амінокислотну послідовність, як наведено у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо. 19, 54 та 55. 22. Композиція за будь-яким з пп.12-21, в якій зазначене антитіло або його функціональний фрагмент містить у власній змінній ділянці важкого ланцюга амінокислотну послідовність, як наведено у будь-якій з послідовностей 5ЕО ІЮ МоМо20-33, 52 та 53. 23. Композиція за будь-яким з пп.12-22, в якій зазначене антитіло або його функціональний

Зо фрагмент містить ділянку СОКІ у власній змінній ділянці легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме16, ділянку СОК2, що містить амінокислотну послідовність як наведено у 5ЕО ІЮ Мео17 та ділянку СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме18; та містить у власній змінній ділянці важкого ланцюга ділянку СОКІ, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ

Мо14, ділянку СОК2, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮО Ме15 та ділянку СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо 1-13 та 56. 24. Композиція за будь-яким з пп.12-23, в якій зазначене антитіло або його функціональний фрагмент містить ділянку СОКІ у власній змінній ділянці легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕБО ІО Мо16, ділянку СОК2 що містить амінокислотну послідовність як наведено у 5ЕО ІЮО Мо17 та ділянку СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме18; та містить у власній змінній ділянці важкого ланцюга ділянку СОКІ, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у ЗЕО ІЮ

Мо14, ділянку СОК2, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Мое15 та ділянку СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮ Ме2. 25. Композиція за будь-яким з пп.12-24, в якій зазначене антитіло або його функціональний фрагмент містить легколанцюгову амінокислотну послідовність, як наведено у БЕО ІЮ Мо34 та важколанцюгову амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей, як наведено у будь-якій з послідовностей 5ЕО ІЮ МоМо 35-48. 26. Композиція за будь-яким з пп.12-25, в якій зазначене антитіло або його функціональний фрагмент містить легколанцюгову амінокислот послідовність, як наведено у 5ЕО ІЮО Мо34 та важколанцюгову амінокислотну послідовність, як наведено у БЕО ІЮ Мо35. 27. Композиція за будь-яким з пп. 12-26, в якій зазначене антитіло або його функціональний фрагмент містить амінокислотну послідовність, яка має 7095 подібності до відповідної амінокислотної послідовності, як зазначено у будь-якій з послідовностей 5ЕО 10. МоМое1-48 та 52- 56, переважно до відповідної амінокислотної послідовності, як зазначено у будь-якій з послідовностей ЗЕО ІЮ МоМо1-18 та 56 та/або до амінокислотної послідовності каркасних ділянок в межах амінокислотної послідовності, як зазначено у будь-якій з послідовностей 5ЕО

ІО МоМо19-48 та 52-55. бо 28. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, яка містить:

ї) приблизно 50-180 мг/мл сполуки, що нейтралізує ГМ-КОФ, ії) приблизно 5 95 (маса / об'єм) сорбіту, ії) приблизно 30 мМ Г-гістидину їм) приблизно 0,001-1 95 (маса / об'єм) поверхнево-активної речовини та м) має рН приблизно 5,8. 29. Композиція за п.28, яка містить приблизно 80 або приблизно 150 мг/мл сполуки, що нейтралізує ГМ-КСФ 30. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, яка є рідкою, переважно водною. 31. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, як є стійкою протягом принаймні 24 міс. при температурі приблизно 2-8 "С або принаймні 28 днів при кімнатній температурі. 32. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, призначена для застосування у терапевтичному лікуванні. 33. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, призначена для внутрішньовенного та/або підшкірного введення. 34. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, призначена для застосування у лікуванні запальних та автоїмунних розладів, переважно включаючи алергічні та псоріатичні розлади, а також артрит та астматичні розлади. 35. Набір, який містить композицію за будь-яким з попередніх пунктів. 36. Набір за п. 35, який містить попередньо заповнений шприц, картридж або автоін'єктор.

Слід розуміти, що зазначені тут винаходи не обмежуються певною методологією, схемами або реагентами та в силу цього їх може бути змінено. Присутні тут приклади та обговорення наведено лише з метою опису певних втілень та вони не призначені обмежувати обсяг цього винаходу, визначений виключно Формулою Винаходу. Наступні Приклади є ілюстраціями заявленого винаходу.

Приклад 1: Матеріали.

Наступні приклади було здійснено із застосуванням людських моноклональних антитіл Ідс1 (далі позначено, як "антитіла"), які з високою спорідненістю та специфічністю зв'язуються з ГМ-

КСФ людини та нейтралізують його, як описано у ММО 2006/111353. Отримання цих антитіл описано у МО 2006/111353 (Приклад 2). Точніше кажучи, це антитіло містить легко- та важколанцюгові послідовності СОК, як наведено у 5ЕО ІЮО МоМо16, 17, 18, 14, 15 та 2. Ці послідовності СОК, які знаходяться у змінному домені важкого та легкого ланцюгів наведено, відповідно, у ЗЕО ІЮ МоМо 34 та 35. В багатьох випадках прозапальних та автоїмунних хвороб людини відбувається помилкова надлишкова експресія ГМ-КСФ та було виявлено, що додавання рекомбінантного ГМ-КСОФ лише посилює ці захворювання. Можливі показання для лікування із застосуванням антитіл, які нейтралізують ГМ-КСФ включають ревматоїдний артрит (КА), бронхіальну астму та інші форми легеневих запалень, множинний склероз (М5) та псоріаз.

Вироблення антитіл було здійснено у біореакторі із застосуванням безсироваткового та безбілкового середовища. Інокулят для цього ферментеру було отримано з одного флакону з клоном, який виробляв ці антитіла. Після закінчення процесу ферментації, отриманий продукт, який містив секретовані антитіла було відфільтровано для відокремлення клітин та клітинних уламків від супернатанту. Очищення цього продукту було здійснено на основі хроматографічних підходів до зменшення кількості білків клітини-хазяїна (НСР), ДНК та потенційних вірусів.

Складовою частиною нижченаведеного процесу була операція вірусної інактивації. Також для цієї композиції було здійснено операції концентрування та заміни буфера.

Приклад 2: Способи перевірки.

Для визначення ступеню агрегації антитіл було застосовано ексклюзійну високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ-хроматографія: програмне забезпечення Адієпі 1100

Спетеайоп; колонка ТозоП Віозер Т5Каєї! (з40005МУУХІ). Перевірку способу ексклюзійної ВЕРХ- хроматографії було здійснено з допомогою дев'ятиточкової перевірки інтервалу значень, що надало змогу визначити та перевірити точність (шість повторень ін'єкцій) та лінійність (потрійні стандартні криві). Всі аналізи було здійснено із застосуванням рухливого буфера, який містив 100 мМ КН2РОХЯ, 200 мМ Ма259054, рН 6,6.

Для визначення ступеню зв'язуючої активності антитіл до імобілізованого ГМ-КСФ було застосовано технологію поверхневого плазмонного резонансу (5РК) (система Віасоге 3000 / сенсорний чіп СМ5 / рухливий буфер НВ5-ЕР). Перевірку способу ЗРЕ було здійснено з допомогою дев'ятиточкової перевірки інтервалу значень, що надало змогу визначити та перевірити точність (шість повторень ін'єкцій) та лінійність (потрійні стандартні криві).

Для визначення продуктів деградації (фрагментів) та агрегатів антитіл було застосовано електрофорез в полиакриламидному гелі у присутності додецилсульфату натрію у 60 відновлювальних та невідновлювальних умовах (ЗО5-РАСЕ).

Для кількісного аналізу у розчині невидимих частинок ендогенного та екзогенного походження розміром приблизно 2-100 мкм було застосовано спосіб візуалізації у мікропотоці (МЕ, Віїдпемеїї, Обама, СА).

Аналіз заряджених ізоформ було здійснено із застосуванням катіонообмінної хроматографії на колонці УУСХ-10 з градієнтом рН у рухливому буфері ТКІЗ/мідазол/піперазин. Елюювання кислих ізоформ відбувалося перед елююванням головної ізоформи та елюювання основних ізоформ відбувалося після елюювання головної ізоформи.

Перевірку сили тертя ковзання шприца було здійснено із застосуванням універсальної випробувальної машини для дослідження стиснення від ІпбігопФ), обладнаної пристосуваннями для тримання шприців.

Приклад 3: Дія рН та температурного стресу.

Метою цих досліджень була оцінка стійкості антитіл у перевірочному буфері з низькою іонною силою (ГІЗЗВ: 2 мМ гліцин, 2 мМ лимонна кислота, 2 мМ НЕРЕЗ5, 2 ММ МЕЗ та 2 мМ Ттіз) з показником рН, який коливався в межах 3-10. Зразки антитіл зберігали у відповідних розчинах при температурі 55 "С протягом 14 днів. Дослідження зразків було здійснено у 0, 7 та на 14 день експерименту (ТО, Т7 та Т14). Шляхом поверхневого плазмонного резонансу (5РЕ) було виявлено, що антитіла є більш стійкими з рН 4-7. Аналіз мономерів антитіл шляхом ексклюзійної

ВЕРХ-хроматографії (ЗЕ-НРІ С) виявив їх найбільшу стійкість з рН 4-6 (Т14). Аналіз зразка Т14 з допомогою 505-РАСЕ у відновлювальних та невідновлювальних умовах виявив лише мінімальне утворення продуктів деградації та агрегатів з рН 4-6.

Приклад 4: Дія іонної сили та температурного стресу.

Метою цих досліджень була оцінка стійкості антитіл у перевірочному буфері з низькою іонною силою (ГІ55В) у присутності 0, 10, 100 та 500 мМ Масі. Зразки антитіл діалізували у розчині ГІ55В (рН 4,5 та рН 7,5) з додаванням додаткового Масі до концентрації приблизно 1 мг/мл та зберігали при температурі 55 "С протягом 14 днів. Дослідження зразків було здійснено у 0, 7 та на 14 день експерименту (ТО, 17 та 114) із застосуванням 5Е-НРІ С та 5РЕ. еРезультатиРррРезультати ВЕРХ-хроматографії (НРІС) та 5РК-аналізу виявили, що додавання солі погіршує стійкість антитіл та ця дія є більш вираженою з рН 4,5 ніж з рН 7,5. Крім того, результати ексклюзійної ВЕРХ-хроматографії (ЗЕ-НРІ С) виявили, що дестабілізація

Зо антитіл в умовах підвищених концентрацій солі (2100 мМ) з рН 4,5 здебільшого призводить до накопичення агрегатів цих антитіл. З рН 7,5 дестабілізація антитіл в умовах підвищених концентрацій солі (5200 мМ) здебільшого призводить вже до накопичення продуктів деградації цих антитіл. Рівень преципітації антитіл (77 та Т14) у буфері ГІЗ5В з рН 4,5 та 500 мМ Масі був дуже високим.

Приклад 5: Дія буферів.

Метою цих досліджень була оцінка стійкості антитіл у різних буферах з рН 5-7. Зразки антитіл було діалізовано у розчини 20 мМ цитратного буфера з рн 5, 6 та 7; 20 мМ фосфатного буфера з рН 6 та рН 7; 20 мм сукцинатного буфера з рн 6 та рН 7, 20 мМ гістидинового буфера з рН 6 та рН 7; та 20 мМ ацетатного буфера з рН 5 та рН 6 до концентрації приблизно 1 мг/мл, після чого їх зберігали при температурі 55 "С протягом 14 днів. Дослідження зразків було здійснено у 0, 7 та на 14 день експерименту (ТО, 17 та 114) із застосуванням 5Е-НРІ С, 5РЕ та 5О5-РАСЕ у відновлювальних та невідновлювальних умовах.

Результати 5РЕ-аналізу, ВЕРХ-хроматографії (НРІ С) мономерів та агрегатів та ХО5-РАСЕ у відновлювальних та невідновлювальних умовах виявили, що ці антитіла є більш стійкими у ацетатному буфері з рН 5, гістидиновому буфері з рН 6 та цитратному буфері з рН 5, 6 та 7 (дані Т14).

Приклад 6: Дія амінокислот.

Метою цих досліджень була оцінка стійкості антитіл у перевірочному буфері з низькою іонною силою (І І55В) з додаванням різних амінокислот. Зразки антитіл зберігали у розчині з рН б та 250 мМ відповідних амінокислот при температурі 55 "С протягом 14 днів. Дослідження зразків було здійснено у 0, 7 та на 14 день експерименту (ТО, Т7 та Т14). 5РК-аналіз виявив наявність легкої стабілізуючої дії головним чином глютамінової кислоти, треоніну, лізину та валіну (Т14). Результати ВЕРХ-хроматографії (НРІ С) виявили наявність суттєвої стабілізуючої дії глютамінової кислоти, треоніну та аланіну, яка призводить до появи 2-3 95 збільшення кількості інтактних мономерів та, відповідно, до приблизно 30 95, 31 9о та 20 95 зменшення кількості агрегатів в порівнянні з базовим рівнем без додавання будь-якої амінокислоти.

Приклад 7: Дія цукрів та поверхнево-активних речовин.

Метою цих досліджень була оцінка стійкості антитіл у перевірочному буфері з низькою іонною силою (1558) з додаванням різних цукрів або поверхнево-активних речовин. Зразки бо антитіл було діалізовано у розчини ГІ55ЗВ з рН 6,0 до концентрації приблизно 1 мг/мл з додатковими 6 95 (маса / об'єм) цукрами (О-маніт, ЮО-сорбіт, цукроза, О-маноза, Ю-мальтоза, О- трегалоза, Ю-глюкоза), 0,05 95 (в об'ємному відношенні) ГТМУЕЕМЕ 20 або 0,02 95 (в об'ємному відношенні) ТМ/УЕЕМЕУ 80 та зберігали при температурі 55 С протягом 14 днів. Дослідження зразків було здійснено у 0, 7 та на 14 день експерименту (ТО, 17 та Т14) шляхом ЗЕ-НРІ С, 5РА та 5О5-РАСЕ-аналізу у відновлювальних та невідновлювальних умовах.

Результати 5РК-аналізу та ВЕРХ-хроматографії (НРІ С) виявили, що О-сорбіт та Ю-маніт покращують стійкість антитіл відповідно приблизно на 20 95 / З 95 (дані 5РЕ/НРІ С, Т14) та на 14 965 / 4 95 (дані БРЕ/НРІ С, 114). Дія трегалози та цукрози є меншою та покращує стійкість антитіл, відповідно, на 7 95 / 0,7 95 (дані 5РЕ/НРІ С, Т14) та на 6 95 / 2 95 (дані 5РЕ/НРІ С, Т14).

Крім того, НРІ С-аналіз виявив, що Ю-сорбіт та ЮО-маніт зменшують утворення агрегатів антитіл відповідно на 4395 та 5095, що також підтверджується результатами 5О5-РАСЕ-аналізу.

Схоже, що дія ТМ/БЕЕМЕ 20 (0,05 95 в об'ємному відношенні) або ТУМЕЕМФ 80 (0,02 95 в об'ємному відношенні) не вплинула на стійкість, як було виміряно шляхом 5Е-НРІ С, ЗРЕ та

ЗО5-РАСЕ.

Приклад 8: Дія комбінацій, які містять буфери, амінокислоти та цукри.

Ці дослідження було здійснено на основі попередніх досліджень з метою оцінки стійкості 1 мг/мл антитіл, отриманих у комбінації буферів, амінокислот та цукрів. Попередні дослідження виявили наявність стабілізуючих дій: 20 мМ ацетатного буфера з рН 5; 20 мМ гістидинового буфера з рН 6; 250 мм глютамінової кислоти; 250 мМ треоніну, 6 95 (маса / об'єм) сорбіту та 6 95 (маса / об'єм) маніту. Антитіла було отримано в концентрації у 5,4 мг/мл у розчині комбінації 20

ММ буфера, 250 мм амінокислот та 6 95 (в об'ємному відношенні) цукру, як наведено у Таблиці 1 та цей розчин зберігали при температурі 55 С протягом 14 днів. Як контроль було застосовано розчин антитіл у їх буфері РВ5. Дослідження зразків було здійснено у 0, 7 та на 14 день експерименту (ТО, 17 та Т14) шляхом 5Е-НРІ С та 5РЕК-аналізу.

Додатково було здійснено перевірку зразків ТО, які містили антитіла (5,4 мг/мл) у їЇхРВ5 на сприйнятливість до заморожування та відтавання. Флакони для зберігання було піддано повільному заморожуванню у холодильнику при температурі -20"7С та після закінчення заморожування зразки піддали відтаванню при кімнатній температурі. Цей процес повторювали до закінчення п'яти циклів заморожування -- відтавання. Після двох та п'яти циклів відновлення

Зо у кожному зразку було перевірено із застосуванням 5РЕ та 5Е-НРІ С.

Таблиця 1

Комбінація буферів, цукрів та амінокислот (Ас - ацетатний буфер; Ні - гістидиновий буфер; М - маніт; 5 - сорбіт)

Зразок (12/34/5161 7|8Щ|9| 10/11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17

Будер с 1хЇх | хЇх) | хІЇхІЇхЇхЇ 1 1

У ГнГ 1 7х1х! 1 7х1їх!Ї 1 1 1 Їх хї1х|1 с

Аміно-| сйм їх Їх! її | | ЇхЇх! | |х/х| | | їх кислота т | |х/! їх| | | | Її 7 |х/ х| | | х | х |Рв5 цуюр -5-- - 5 - А РО 2 РУ 51 ЇЇ 11 1Їх1,х| Їх; Їх! Їх | хі

РВ5 - фосфатно-сольовий буферний розчин.

Дані 5РК - аналізу вказують на те, що активні зв'язувальні властивості зразків 5-16 на 14 день досліджень (Т14/55 "С) складали 293 95 відносно ТО. Для антитіл у 1 х РВЗ (зразок 17) та зразків 1-4 (все без маніту або сорбіту), ці значення складали, відповідно, 62 95, 19 Фо, 26 95, 9195 та 85 95. Отже, дані ЗРК - аналізу свідчать про те, що додавання маніту або сорбіту покращує стійкість зв'язувальної активності. Крім того, зразки 1-4, отримані в точках часу 17 та

Т14 виявилися жовтуватими, що вказує на наявність окислення. Дані ЗЕ-НРІ С - аналізу виявили, що найнижчі кількості агрегатів (3,5 95 - 5,6 9о) та продуктів деградації (4,2 95 - 5,4 905) було знайдено у зразках 5-8, 11-12 та 15-16 (дані Т14/5527С), що підтверджує наявність стабілізуючої дії маніту та сорбіту на мономери антитіл та вказує на можливий незначний вплив, спричинений додаванням 250 мМ треоніну, хоча цю дію треоніну було оцінено, як принаймні лише мінімальну, судячи з рівнів мономерів, знайдених у зразках 5-8, 11-12 та 15-16 (відповідно, 91,2 95, 89,8 Уо, 91,5 95, 90,8 95, 89,8 95, 89,0 95, 91,4 95 та 90,9 90) та для зразка 17 (РВ5) ця кількість складала 80,3 95 (дані Т14/55 "С). Дія 250 мМ глютамінової кислоти разом з сорбітом або манітом негативно впливала на стійкість мономерного антитіла, особливо у ацетатному буфері. На закінчення слід зазначити, що мономерне антитіло, як здається, набуває більшої стійкості у комбінації 20 мМ ацетатного буфера з рН 5 або 20 мМ гістидинового буфера з рН 6 та 6 95 (маса / об'єм) сорбіту або 6 95 (маса / об'єм) маніту.

Дані ЗЕ-НРІ С о - аналізу експериментів по заморожуванню / відтаванню вказують на наявність незначної дії сорбіту, яка перевершує дію маніту відносно стабілізації мономерів антитіл. У зразках б та 8 вміст мономерів складав, відповідно, 98,6 95 та 98,4 95, як було виміряно після п'яти циклів заморожування / відтавання та у зразках 5 та 7 вміст мономерів відповідно складав 96,9 95 та 96,0 бо.

Приклад 9: Дія комбінації гістидинового або ацетатного буферів, сорбіту або маніту та

ТУУЕЕМФ 20 або ТУУЄЕМФ 80.

На основі отриманих у попередньому дослідженні результатів стійкості (в яких було виявлено наявність стабілізуючої дії зокрема 20 мМ ацетатного буфера, рН 5, 20 мМ гістидинового буфера, рн 6, а також 6 95 (маса / об'єм) сорбіту та 6 95 (маса / об'єм) маніту) було здійснено нові дослідження з метою оцінки стійкості 10 мг/мл антитіл, отриманих у комбінації гістидинового або ацетатного буферів, сорбіту або маніту та ТУУЄЕЕМУО 20 або ТУУЕЕМФ 80.

Завдяки концентраціям антитіл, які приблизно складали 10 мг/мл, було також досліджено вплив додавання 0,02 95 (маса / об'єм) ТМ/ЕЕМФ 20 та 0,02 95 (маса / об'єм) ТУМЕЕМФ 80 на агрегацію, як було виміряно шляхом ЗБЕ-НРІ С.

Антитіла було отримано в концентрації 10 мг/мл у розчинах 20 мМ ацетатного буфера з рн 5,0 або 20 мМ гістидинового буфера з рН 6,0 разом із зазначеними у Таблиці 2 додатками, після чого їх зберігали при температурі 55 "С протягом 14 днів. Дослідження зразків було здійснено у 0, 7 та на 14 день експерименту (ТО, 17 та 714) шляхом 5Е-НРІ С та 5РЕ-аналізу.

Додатково зразки антитіл було перевірено на сприйнятливість до заморожування та відтавання. Антитіла в концентрації 10 мг/мл було піддано повільному заморожуванню у холодильнику при температурі - 20"С та після закінчення заморожування зразки піддали відтаванню при кімнатній температурі. Цей процес повторювали до завершення трьох та/або п'яти циклів заморожування - відтавання. Кожен зразок було перевірено із застосуванням 5Е-

НРІС та 5РК-аналізу на відновлення після трьох та/або п'яти циклів заморожування та відтавання.

Зо

Таблиця 2

Комбінація буферів, цукрів та детергентів (Ас - ацетатний буфер; Ні - гістидиновий буфер; М - маніт; 5 - сорбіт; Т20- ПЛ/ЕЕМФ 20; Т80- ГМУЕЕМФ 80)

Зразок. | 71 | 2 | З | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | п | 2

Буфер Їх хі | |х|х|Їх х Її ЇЇ 1

УР ГнеЇ 177 хх Щщ 1 3 |х|х|х|х

Цуюро 1-5---2--- 2-8

Р 8 їх1 їх хх 7717 1х1х 1 Детергент--18977----А-А-А--2- ин тво! ЇЇ Її ЇЇ Її Їх! хх! їх! 1 х

Дані ВЕРХ-аналізу (НРІ С) показали, що незважаючи на існування незначних відмінностей між ацетатним та гістидиновим буфером, застосування гістидинового буфера здавалося принаймні таким же добрим, як і застосування ацетатного буфера. Через один тиждень композиції, які містили ацетатний буфер, сорбіт та ТУМУЕЕМФ 80 та гістидиновий буфер, сорбіт та

ТМ/ЕЕМФ 20 мали схожій рівень деградації порівняно з відповідними композиціями без поверхнево-активних речовин.

В ході експериментів по заморожуванню та відтаванню було виявлено, що не існує принаймні жодного впливу детергентів на кількість мономерів антитіл після п'яти циклів заморожування та відтавання. Однак, мономери антитіл стають більш стійкими у разі додавання до композиції 6 95 (маса / об'єм) сорбіту у порівнянні з 6 95 (маса / об'єм) маніту та у разі додавання маніту мономери антитіл частіше утворюють агрегати після п'яти циклів заморожування та відтавання. Дані ВЕРХ-аналізу (НРІ С) експерименту по заморожуванню та відтаванню не виявили жодної різниці між застосуванням ацетатного та гістидинового буфера.

На закінчення слід відзначити, що згідно з результатами ВЕРХ-аналізу, оптимальною для стійкості мономерів антитіл композицією здається композиція-кандидат, яка містить 20 мМ гістидиновий буфер, рн 6,0 та 6 95 (маса / об'єм) сорбіту.

Приклад 10: Короткочасна оцінка стійкості композиції-кандидата, яка містить 20 мМ гістидиновий буфер та 6 95 (маса / об'єм) Ю-сорбіту.

Цю короткочасну перевірку стійкості було здійснено на основі попереднього визначення композиції, яка містила 20 мМ гістидиновий буфер, рН 6,0 та 695 (маса / об'єм) сорбіт оптимальною композицією-кандидатом. Метою цієї перевірки була оцінка поведінки цієї композиції-кандидата з більш високими концентраціями антитіл.

Антитіла було отримано у вищезазначеному розчині з концентраціями приблизно 22, 36, 42, 83 та 118 мг/мл. Отримані антитіла зберігали з температурами 5 "С та 25 "С протягом періоду до 4 тижнів. Дослідження зразків було здійснено у 0, 14 та 28 день експерименту (ТО, Т14 та

Т28) шляхом ЗЕ-НРІ С

Дані ЗБЕ-НРІ С чітко виявили стійкість антитіл у 20 мМ гістидиновому буфері з рН 6,0, який містив 6 95 (маса / об'єм) сорбіт. Концентрація мономерів антитіл, яку було визначено після 28 днів зберігання при температурі 5 "С або 25 "С завжди перевищувала 97 95 за виключенням випадку найвищої концентрації антитіл (118 мг/мл), дослідженої при температурі 25 "С, в якому концентрація мономерів антитіл складала приблизно 96,5 95. Отримані результати можна побачити на Фіг. 1.

Приклад 11: Тонке налаштування остаточно отриманих наповнювачів.

На основі результатів попередніх експериментів для стабілізації антитіл було вибрано сорбіт та гістидин. У наступній операції було здійснено тонке налаштування кількості наповнювачів, а також значення рН для антитіл з концентраціями 10-100 мг/мл із застосуванням "Плану Експерименту" (БОЕ), який містив три центральних пункти та втіленням якого було здійснення 30 окремих перебігів. Рандомізований план експерименту було здійснено з наступними параметрами:

Концентрація антитіл: 10 - 55 - 100 мг/мл рн:5-6-7

Гістидин: 10 - 30 - 50 мМ

Сорбіт: 2 - 6-10 95 (маса / об'єм)

Для здійснення короткочасної оцінки зразки було піддано прискореним 14-денним стресовим умовам при температурі 50 "С. Крім того, для імітації зберігання антитіл було також

Зо здійснено три цикли заморожування / відтавання (-20 "С).

Результати:

Для впевненості в забезпеченні фізіологічних умов для цієї композиції спочатку було визначено осмоляльність. Для внутрішньовенного або підшкірного застосування антитіл прийнятні межі осмоляльності складали 250-450 мОсмол/кг. Як видно з Фіг. 2, здебільшого контроль осмоляльності здійснювали шляхом змінення кількості сорбіту у композиції. Як низькі концентрації гістидину (10-50 мМ), так і самі по собі антитіла лише мінімально впливали на осмоляльність.

Залежність осмоляльності від концентрації сорбіту та гістидину може бути зображено у вигляді контурної діаграми. На цій діаграмі показано необхідність застосування концентрації сорбіту в межах 3-7 95 (маса / об'єм) для підтримання осмоляльності у фізіологічному інтервалі.

Отримані дані вказують на оптимальну концентрацію сорбіту приблизно у 6 95, застосування якої призводить до появи досить високого значення осмоляльності. Оскільки певне зменшення кількості сорбіту не впливає на стійкість антитіл, то концентрацію сорбіту може бути знижено до 595 з метою досягнення осмоляльності приблизно у 400 мОсмол/кг, тим самим підвищуючи зручність для пацієнта.

На основі отриманих даних було встановлено оптимальну концентрацію гістидину, яка складала 30 мМ. Як було виміряно шляхом 5Е-НРІ С, в межах концентрації гістидину у 10-50

ММ не було спостережено жодного впливу цієї сполуки на агрегацію або фрагментацію.

Агрегація антитіл здебільшого залежить від концентрації. Збільшення концентрацій антитіл призводить до появи збільшеної кількості агрегатів та до збільшених значень прозорості протягом заморожування / відтавання та у прискорених температурних стресових умовах.

Додатково на мономерний вміст антитіл впливає значення рн. Хоча прискорені стресові умови з рНеб призводять до збільшення фрагментації антитіл, це не зачіпає їх стійкості протягом заморожування / відтавання та навіть було спостережено її слабке покращення. У разі застосування рН » 6 з допомогою ЗЕ-НРІ Со Жта аналізу прозорості може бути виміряно зменшення мономерного вмісту як у прискорених тмпературних стресових умовах, так і у разі обробки шляхом заморожування / відтавання. Для отримання балансу між протилежними ефектами схоже, що більш прийнятним значенням рнН для композиції антитіл є рН 5,8.

Це призвело до появи композиції з наступними параметрами:

Концентрація антитіл: 10 мг/мл - 55 мг/мл - 100 мг/мл

О-сорбіт: 5 95 (маса / об'єм)

І -гістидиновий буфер: 30 мМ (гідрохлориду моногідрат) рН 5,8 (скориговано 2М МмМаон)

Умови або параметри цієї композиції також може бути розповсюджено й на композицію, яка має більш високі концентрації антитіл, як буде показано в наступних прикладах.

Приклад 12: Дослідження стійкості.

Довготривалі дослідження.

Ці дослідження було розроблено для періоду перевірки строком до 60 міс. Протягом цього періоду зразки антитіл зберігали при температурі 5 "С ж 3 "С у скляних флаконах (СІМ К2).

Додатково у скляних флаконах (0ОІМ 22) було здійснено прискорені 12-місячні дослідження стійкості при температурі 25 С т 2 7С та 6б-місячні дослідження у температурних стресових умовах при температурі ї40"С ж 2"С. Перевірку проводили із застосуванням антитіл в концентрації 106 мг/мл та 145 мг/мл у композиції, яка містила 30 мМ моногідрохлорид гістидину та 5 95 (маса / об'єм) сорбіту з рН 5,8.

Було виміряно наступні параметри: рН, осмоляльність, концентрація (200280 - оптична густина з довжиною хвилі 280 нм), відсоток мономерів, агрегатів та фрагментів (з допомогою

ЗЕ-НРІ С), ефективність (клітинний аналіз). Результати наведено у наступних Таблицях 3-8.

Таблиця З

Дослідження стійкості при температурі 5 "С хз 3 "С (106 мг/мл антитіл)

Мономери (М) . зберігання (00280) Фрагменти (Р) 5Е- . аналіз)

НРІС

Відносна ефективність

Іміс.| ІмОсмолрикгі |Імг/млі М'/А / Е Обі (у порівнянні з еталонним стандартом) 0 | 583 | 379 | 10651 |9920 080) 0| 083 71 | 588 | 379 | 10300 |9918 082) 0 | щ 03 73 | 590 | 379 | 10875 )|9907) 093) 0/| 123 6 | 58 | 376 | 10005 )/|9887) їз | 0 | 089 79 | 583 | 377 | 10259 |99011 099) 0| 100 12. | 586 | 387 | 70334 /9897| ї03| 01 ЮюЮ ОТ во | 590 | 379 | 70679 )|9826| 126 |048| 097 ((

Таблиця 4

Дослідження стійкості при температурі 5 "С хз З "С (145 мг/мл антитіл)

Мономери (М) . й Концентрація Агрегати (А Ефективність

Час зберігання! рН | Осмоляльність (Св). Фрагтенти (бу ве- (клітинний аналіз)

НРІС

Відносна ефективність

Іміс.| ІМОсмоОл'кг | Імг мл" М'/А / Е Обі (у порівнянні з еталонним стандартом 77015 | 392 | 14331 |9910|090| 0 | 072 (з 71.15 | 393 | 13952 )/|9906| 094) 0 | 095 73 1593 | 5 щ 385 | 13944 |9889| 111 | 0 | 106 76 1590 | 5 ющ з81 | 14566 )/|9879| 121 | 0 | 81 7.78. 1587 | 383 | 14412 |9886| 114| 0 | 107 121589 | 2 ющЦ 388 | 14052 )|9880| 120 | 0 | из 936 | 58 | 384 | 148,55 )|9835)| 139 1026| 099 60 | 50 | 386, | 14701 Щ|9794| 153 |05З3| 082

Таблиця 5

Дослідження стійкості при температурі 425 "С ж 2 70 (106 мг/мл антитіл)

Мономери (М) . й Концентрація Агрегати (А Ефективність

Час зберігання! рН | Осмоляльність (ОО2в0). Фрагтенти (бу ве- (клітинний аналіз)

НРІС ефективність

Іміс.| ІМОсмоОл'кг | Імг мл М'/А / Е Обі (у порівнянні з еталонним стандартом) 0 1583 379 | 10651 /9920| 080) 0 | 083 76 1585 Щщ 387 | 10014 |9785| 51 |064| 100 7.78 1583 374 | 10749 /9471| 149 |380| їмо

Таблиця 6

Дослідження стійкості при температурі 25 "С ж 2 70 (145 мг/мл антитіл).

Мономери (М) . й Концентрація Агрегати (А) Ефективність

Часзберігання) рН О |Осмоляльність| (30280) | Фрагменти (Р) ЗЕ- (клітинний аналіз)

НРІС

Відносна ефективність

Іміс.| ІмОсмол'кг| Імг мл М'/А / Е Гобі (у порівнянні з еталонним стандартом 770 | Бе | 392 | 14331 |8910Ї 090 0 | 072. 142,84 198,49 147,84 9842 77776 | БВ | 383 | 13473 9762) 178 1060 078 ДБ«Х 77579. | 5 | 387 | 14459 2 щ /|9446 143,42 94,36

Таблиця 7

Дослідження стійкості при температурі 40 "С ж 2 "С (106 мг/мл антитіл)

Мономери (М) . й Концентрація Агрегати (А) Ефективність

Часзберігання) рН О |Осмоляльність| (30280) | Фрагменти (Р) ЗЕ- (клітинний аналіз)

НРІС

Відносна ефективність

Іміс.| ІмОсмол'кг| Імг мл М'/А / Е Обі (у порівнянні з еталонним стандартом) 7770 | 53 | 379. | 10651 |9920Ї 0860, 0 | 083 Д ю ЖГ((К(. 102,68 194,66 то8,60 (|91,85| 206 |609 2 ї01 6 | 55 | 378 | 9975 /|8739 1015

Таблиця 8

Дослідження стійкості при температурі 40 "С ж 2 "С (145 мг/мл антитіл)

Мономери (М) . й Концентрація Агрегати (А) Ефективність

Часзберігання) рН О |Осмоляльність| (30280) | Фрагменти (Р) ЗЕ- (клітинний аналіз)

НРІС

Відносна ефективність

Іміс.| ІМОсмоОл'кг | Імг мл" М'/А / Е Обі (у порівнянні з еталонним стандартом 770 Бе | 392 | 14331 99лоЇ 090 | 0 | 072. 136,96.0ЮК 194,96 143,07. 0 92,02 6 | 5 | з88 | 13711 |вбБ6| 333

Прискорені дослідження / дослідження в стресових умовах.

Для демонстрації порівнянності активного фармацевтичного інгредієнту лікарського засобу, тобто антитіл після збільшення їх обсягу, було здійснено дослідження стійкості у прискорених (257) та у стресових (40 "С) умовах із застосуванням двох партій активного фармацевтичного інгредієнту лікарського засобу з концентраціями антитіл 165 мг/мл та 171 мг/мл, отриманих у розчині 30 мМ гістидину, 5 95 сорбіту, рН 5,8.

Було виміряно наступні параметри: рН, осмоляльність, концентрація (00280 -оптична густина з довжиною хвилі 280 нм), відсоток мономерів, агрегатів та фрагментів (з допомогою

ЗЕ-НРІ С), ефективність (клітинний аналіз). Результати для концентрації антитіл 171 мг/мл наведено у наступних Таблицях 9 та 10.

Таблиця 9

Дослідження стійкості при температурі 425 "С ж 2 70 (171 мг/мл антитіл)

Мономери (М) . й Концентрація Агрегати (А) Ефективність

Часзберігання) рН О |Осмоляльність| (30280) | Фрагменти (Р) ЗЕ- (клітинний аналіз)

НРІС

Відносна ефективність

Іміс.| ІмОсмол'кг| Імг мл М'/А / Е Обі (у порівнянні з еталонним стандартом) 770. 57 | ющющ- | 169.00 5990 06 |ст195| 097 772. .| 56 | ЮющКЗ- | 17100 983) 17 |с195| 092 73 | 57 | ЮК - | 7300 980) 20 |ст9| 114

Таблиця 10

Дослідження стійкості при температурі 440 "С ж 2 70 (171 мг/мл антитіл)

Мономери (М) . й Концентрація Агрегати (А) Ефективність

Часзберіання) рН |Осмоляльність. (2280) | Фрагменти (Р) ЗЕ- (клітинний аналіз)

НРІС

Відносна ефективність

Іміс.| ІмОсмол'кг| Імг мл" М'/А / Е Обі (у порівнянні з еталонним стандартом) 770. 57 | -- 5 юЮщ| 169.0 5990106 |-с1956| 097 772. 568 | щЮКМ-А | 770 925) 29 |«59, 090 Кк Щ 3 57 | юЮюЮКЙ- | 750 |903) 35 |с7о| бе

Дослідження заморожування / відтавання.

Перевірку стійкості антитіл в умовах заморожування / відтавання було здійснено для антитіл з концентраціями 106 мг/мл та 145 мг/мл, отриманих у розчині 30 мМ гістидину з рН 5,8 та 5 95 сорбіту. Антитіла піддали заморожуванню принаймні протягом ночі при температурі - 80 С ж 10 "С з наступним відтаванням, яке тривало г 6 год. при кімнатній температурі. Було здійснено

О, 1, 3, 5, 7 та 10 циклів заморожування / відтавання.

Було виміряно наступні параметри: рН, осмоляльність, концентрація (200280 - оптична густина з довжиною хвилі 280 нм), відсоток мономерів, агрегатів та фрагментів (з допомогою

ЗБЕ-НРІ С), ефективність (клітинний аналіз). Результати наведено у наступних Таблицях 11 та 12.

Таблиця 11

Дослідження стійкості до заморожування / відтавання при температурі -80 "С 5107 (106 мг/мл антитіл)

Кількість циклів . Мономери (М) Ефективність заморожування /| рН |Осмоляльність Концентрація Агрегати (2) (клітинний відтавання (00280) Фрагменти (РЕ) ЗЕ- аналіз)

НРІС

Відносна ефективність

ІмОсмол'кг| Імг мл М'/А / Е Обі (у порівнянні з еталонним стандартом ох |586| 373 | 9907 9905095) 0 | 084 (З ях. 15861 ющ-з81 | 9937 |з9ле 081 0 1 105 .3х 5891 юЮщЦ379 | 9823 99201080 0 | щ їм .5х 587 ющз380 | 9969 |в 085 0 | юю ли 7 5861 ющ-з380 | 9996 2 |99121 088 0 | ющ 724 лох |587| юю 378 | 9894 2 |99081092)| 0 | 083

Таблиця 12

Дослідження стійкості до заморожування / відтавання при температурі -80 "С 5107 (145 мг/мл антитіл)

Кількість циклів . Мономери (М) Ефективність заморожування /| рН )/|Осмоляльність Концентрація Агрегати (2) (клітинний відтавання (00280) Фрагменти (РЕ) ЗЕ- аналіз)

НРІС

Відносна ефективність

ІМОсмоОл'кг | Імг мл М'/А / Е Обі (у порівнянні з еталонним стандартом) ох |586| 373 | 133и3 |9894|106| 0. о8 ях. (5 ющ--379. | 13298 |9911|089| 0 щ 16

Зх |589| 380 | 13456 /|9909|091| 0 104 і .5х 50 384 | 13274 |9907|093| 0 щ 1 77 5801 щ 383 | 13454 /|9903|097| 0 104 лох | 5еї| щз85 | 13289 |9896|104| 0 | 105

Результати та висновки.

Довготривалі дослідження стійкості, включаючи стійкість в умовах прискорених досліджень та в стресових умовах було здійснено протягом періоду до 60 міс. із застосуванням концентрацій антитіл приблизно 106 мг/мл та приблизно 145 мг/мл у композиціях, які містили 30

ММ гістидин та 5 95 сорбіт, рН 5,8. Також було здійснено додаткові дослідження в умовах прискорених досліджень та в стресових умовах для антитіл з концентраціями до 171 мг/мл у розчині, який містив 30 мМ гістидин та 5 95 сорбіт, рН 5,8.

Протягом 60 - місячного періоду, у зразках, які зберігали при температурі 5 "С ж 3 "С було виявлено менш, ніж 2 95 агрегації для обох концентрацій антитіл та ці зразки мали таку ж саме ефективність у порівнянні з контрольним зразком.

Після 12 місяців зберігання при температурі за умовами прискорених досліджень (425 С х 2 "С), зразки з обома концентраціями антитіл (106 мг/мл та 145 мг/мл) виявили менш, ніж 2 95 агрегації та мали таку ж саме ефективність у порівнянні з контрольним зразком. Після 6 міс. зберігання при температурі стресових умов (440 "С ж 27С), зразки з обома концентраціями антитіл виявили менш, ніж 595 агрегації та мали приблизно таку ж саме ефективність у порівнянні з контрольним зразком. 5О0

Дані додаткових прискорених досліджень / досліджень у стресових умовах виявили наявність стійкості протягом З міс. та 1 міс., відповідно, з температурами 25 "С та 40 7с. Це свідчить про те, що у разі зберігання при температурі 2-8"С можна очікувати отримання стійкості, порівняної зі стійкістю, отриманою для антитіл з концентраціями 106 мг/мл та 145 мг/мл, як було обговорено вище.

Крім того, слід зазначити, що антитіла з обома дослідженими концентраціями (приблизно 106 мг/мл та приблизно 145 мг/мл) у розчині, якій містив 30 мМ гістидин, 5 90 сорбіт, рН 5,8 залишалися стійкими протягом принаймні 10 циклів заморожування / відтавання при температурі -80 70 ж 10 76.

Приклад 13: Оцінка в'язкості.

Визначення в'язкості для антитіл в концентрації у 150 мг/мл, які було отримано у розчині 30

ММ гістидину, рН 5,8 та 5 95 сорбіту було здійснено із застосуванням реометру. Цей прилад застосовують для тих рідин, для яких не може бути визначено лише одне значення в'язкості, отже вони вимагають визначення та вимірювання більшої кількості параметрів, ніж у разі застосування віскозиметру.

Для певних видів рідини, в'язкість є сталою величиною в широкому діапазоні швидкостей зсуву (ньютонівські рідини). Рідини без сталої в'язкості (неньютонівські рідини) не може бути описано одним числом. Неньютонівскі рідини виявляють безліч різних кореляцій між напругою зсуву та швидкістю зсуву, отже для неньютоновських рідин в'язкість залежить від температури, а також від швидкості зсуву. В'язкість визначають у міліпаскалях за секунду (мПа:с) з вибраною температурою та вибраною швидкістю зсуву У |1/сі.

В'язкість композиції, яка містить приблизно 150 мг/мл антитіл є нижчою, ніж 12 мПа:с зі швидкістю зсуву приблизно 50-1000 П1/с| та температурою 20 "С.

В'язкість композиції, яка містить приблизно 150 мг/мл антитіл є нижчою, ніж 20 мПа:с зі швидкістю зсуву приблизно 50-1000 |1/с| та температурою 5 С.

Приклад 14: Стійкість в умовах струшування / дії сил зсуву.

У цих дослідженнях було застосовано композиції, які містили 80 мг/мл антитіл з 5 95 сорбітом та 30 мМ гістидином, рн 5,8 та які було отримано 30, 0,01, 0,05, 0,1 95 ТМ/ЕЕМФ 20 та композиції, які містили 150 мг/мл білка з 5 95 сорбітом, 30 мМ гістидином, рН 5,8, які було

Зо отримано з 0, 0,01, 0,05, 0,1 та 0,15 96 ТУМЕЕМО 20 (РБЗ20). Ці композиції перемішували у відсіку приладу для визначення сили зсуву або на мішалці протягом періоду до 24 год. та для невидимих частинок стійкість було виміряно шляхом візуалізації у мікропотоці (МЕЇ) через 0, 4, 8 та 24 год. Додавання принаймні 0,01 956 ТУМЕЕМФ 20 призвело до зменшення швидкості утворення невидимих частинок у порівнянні з композицією без додавання ТУМЕЕМФ).

Також було досліджено композиції, які містили 150 мг/мл антитіл з 5 95 сорбітом та 30 мМ гістидином, рН 5,8 та які було отримано з 0, 0,01, 0,05, 0,1 96 ТУУЕЕМО 80 (РБЗ80) та композиції, які містили 150 мг/мл білка з 5 95 сорбітом, 30 мМ гістидином, рН 5,8, які було отримано з 0, 0,01, 0,05, 01 та 0,15 95 ТУ/ЕЕМО 80. Ці композиції перемішували протягом періоду до 8 год. та для невидимих частинок стійкість було виміряно шляхом візуалізації у мікропотоці (МЕ) через 0, 4,6 та 8 год. Додавання принаймні 0,01 95 ТМ/ЕЕМЕ? 80 зменшує швидкість утворення невидимих частинок у порівнянні з композицією без додавання ТУУЕЕМФ).

Попередні результати цієї додаткової перевірки білка (антитіла) з концентраціями 80 та 150 мг/мл у 30 мМ гістидині, 5 95 сорбіті, рН 5,8 з додаванням або ТМ/ЕЕМФ 20 або ТУУЕЕМФО 80 (95 маси / об'єму) наведено (у вигляді кількості частинок на мл, помноженої на фактор розведення) на Фіг. 3-6. Ці композиції було піддано деформації зсуву / збовтано для перевірки їх здатності утворювати невидимі частинки у розчині та було виявлено, що додавання поверхнево-активних речовин зменшує утворення невидимих частинок. Отже, поверхнево-активні речовини є необхідними для запобігання утворення невидимих частинок або вони будуть зменшувати утворення невидимих частинок протягом виробництва та зберігання.

Приклад 15: Оцінка взаємодій поверхнево-активних речовин.

Вимірювання поверхневого натягу було здійснено для аналізу взаємодії ТМ/ЕЕМФО 20 та

ТУМ/ЕЕМФ 80 з 80 мг/мл та 150 мг/мл білка у 5 95 сорбіті з 30 мМ гістидином, рН 5,8. В результаті досліджень було отримано криві поверхневого натягу, подібні до Фіг. 7. Також було визначено концентрацію критичної агрегації (САС), яка є концентрацією, з якою поверхнево-активна речовина починає взаємодіяти з білком та критичну концентрацію утворення міцел (СМС), тобто концентрацію, з якою поверхнево-активна речовина утворює міцели, що є ознакою її взаємодій з білком, які знаходяться у стані рівноваги. Отримані результати підсумовано у Таблиці 13.

ТУМ/ЕЕМФ 20 та ТМ/ЕЕМО 80 взаємодіє з обома концентраціями білка схожим чином зі схожими молярними співвідношеннями САС поверхнево-активної речовини до концентрації білка. 60 Значення СМС збільшується зі збільшенням концентрацій білка, але у разі молярного співвідношення поверхнево-активної речовини до білка воно є схожим для обох застосованих концентрацій білка. ТМ/ЕЕЄЕМФ 20 мав більш низьке молярне співвідношення САС поверхнево- активної речовини до концентрації білка, ніж ТУУЕЕМФ 80. У вимірюваннях поверхневого натягу було виявлено, що поверхнево-активна речовина взаємодіє з білком в межах від значення САС до значення СМС. Для ТУУЄЕЕМФ 20 ці межі молярного відношення складали приблизно 0,004- 2,6, в той час, як для ТМ/ЕЕМФ 80, вони складали приблизно 0,003-3,3. Оптимальний рівень поверхнево-активної речовини у білковій композиції перевищує значення САС.

Таблиця 13

Підсумок даних кривої поверхневого натягу

СМС молярне

САС молярне відношення

Поверхнево- Концентрація СМ відношення поверхнево- активна бі / САС (мг/мл) / Й . й речовина ілка(мг/мл) (мг/мл) поверхнево-активної активної речовини до білка речовини до білка

ТМЕЕМО2О | 80 | 00054 | 170 | 0008. | 26

ТМЕЕМО8О | 80 | 00045 | 231 | 0006 | 33

САС - концентрація критичної агрегації

СМС - критична концентрація утворення міцел

Приклад 16: Стійкість до заморожування / відтавання.

З допомогою способу візуалізації у мікропотоці (МЕЇ) було здійснено характеристичний аналіз композицій, які містили 80 мг/мл анти-ГМ-КОФ антитіл у розчині 30 мМ гістидину та 5 95 сорбіту, рН 5,8 з концентраціями ТУУЄЕМФО 20 (Р520) та ТУУЕЕМО 80 (РБ580), які складали 0 95, 0,01 95 та 0,1 95 із застосуванням 10 циклів заморожування / відтавання. Як видно на Фіг. 8, для композицій без доданої поверхнево-активної речовини було відмічено суттєве зростання кількості частинок розміром ( 10 мкм зі зростанням кількості циклів заморожування / відтавання.

У разі додавання 0,01-0,1 95 ТУМЕЕМФО 20 або 80 не було відмічено суттєвого зростання кількості частинок.

З допомогою способу візуалізації у мікропотоці (МЕЇ) було здійснено характеристичний аналіз композицій, які містили 150 мг/мл анти-ГМ-КСФ антитіл у розчині 30 мМ гістидину та 5 95 сорбіту, рН 5,8 з концентраціями ТУУМЕЕМФ 20 та ТМУЕЕМФО 80, які складали 0 95, 0,05 95 та 0,15 95 із застосуванням 10 циклів заморожування / відтавання. Як видно на Фіг. 9, для однієї композиції без доданої поверхнево-активної речовини було відмічено суттєве зростання кількості частинок розміром ( 10 мкм. У разі додавання 0,05-0,15 95 ТМУЕЕМФО 20 або 80 не було відмічено суттєвого зростання кількості частинок.

Приклад 17: Прискорені дослідження стійкості.

Композиції, які містили 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ антитіл у розчині 30 мМ гістидину та 5 95 сорбіту, рН 5,8 з концентраціями ТУУЕЕМе 20 (РБ20) та ТМУ/УБЕЕМФ 80 (РБ80), які складали 0,005 95 та 0,1 95 було піддано 1-тижневим прискореним дослідженням стійкості при температурі

Зо 40 "С. Характеристичний аналіз зразків було здійснено з допомогою МЕЇ (Таблиця 14) та 5Е-

НРІ С (Таблиця 15).

Спосіб візуалізації у мікропотоці (МЕ) не виявив зростання кількості частинок розміром ( 10 мкм протягом тижневого зберігання при температурі 40 "С, однак з допомогою ексклюзійної

ВЕРХ-хроматографії (ЗЕ-НРІ С) було відмічено зростання кількості мультимерних агрегатів (НМУМ). Для композицій, які містили поверхнево-активну речовину було відмічено слабке збільшення кількості видів НММУУ через 7 днів, але воно не суттєво перевищувало кількість видів

НМУМ у композиціях без додавання поверхнево-активної речовини. Також слід зазначити, що ріст концентрації НМУУ не залежав від кількості поверхнево-активної речовини або від двох різних типів поверхнево-активної речовини.

Таблиця 14

Ріст концентрації частинок у композиції, яка містила 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ антитіл, 30 мМ гістидин, 5 95 сорбіт, рН 5,8 після її 7-денного зберігання при температурі 40 "С

Опис композиції Концентрація частинок розміром 2.10 мкм (частинок /мл) 11111111 день | 4дні | 7днівЇ 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ антитіл 0 95 РУВО 1075... Ї69 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ антитіл 0,05 95 РОВ8ВО 80 мг/мл анти-ГМ-КСф антитіл 0,1 95 РЗВ8О 011600 Ї1183 80 мг/мл анти-ГМ-КСОФ антитіл 0 95 РО2О 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ антитіл 0,05 95 РО2О 89016901 МА 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ антитіл 0,1 95 РО2О

МА - дані відсутні

Таблиця 15

Результати досліджень композиції, яка містила 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ антитіл, 30 мМ гістидин, 95 сорбіт, рН 5,8 після її 7-денного зберігання при температурі 40 "С, отримані із застосуванням ексклюзійної ВЕРХ-хроматографії (ЗЕ-НРІ С) 777777.7.7.7юмю Й |Одень| 4дні | 7днів|Одень) 4дні | 7днів |Одень) 4дні |7днів 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ 80 мг/мл анти-ГМ-КСФ

НММУ - агрегати з високою молекулярною масою

ІГММУ - агрегати з низькою молекулярною масою

Композиції, які містили 150 мг/мл анти-ГМ-КСОФф антитіл у розчині 30 мМ гістидину та 5 95 5 сорбіту, рН 5,8 з концентраціями ТМ/ЕЕМФ 20 (РЗ20) та ТУУЕЕМФ 80 (РЗВ80) (0, 0,1 95 та 0,15 9) було піддано 1-тижневим прискореним дослідженням стійкості при температурі 40 "с.

Характеристичний аналіз зразків було здійснено із застосуванням МРЇ та ЗЕ-НРІ С.

Спосіб візуалізації у мікропотоці (МЕ) не виявив зростання кількості частинок розміром ( 10 мкм протягом тижневого зберігання при температурі 40 "С (Таблиця 16), однак з допомогою ексклюзійної ВЕРХ-хроматографії (ЗЕ-НРІ С) було відмічено зростання розчинних агрегатів (НМУМ) (Таблиця 17). Швидкість росту видів НММУ у композиції, яка містила 150 мг/мл антитіл перевищувала швидкість росту видів НМУУ у композиції, яка містила 80 мг/мл антитіл, але цей ріст не залежав від кількості або типу застосованої у композиції поверхнево-активної речовини.

З додаванням поверхнево-активної речовини було відмічено слабке підвищення кількості видів

НММУ після 7-денного періоду порівняно з композиціями без поверхнево-активної речовини, але вона не була статистично значущою.

Таблиця 16

Ріст кількості частинок у композиції, яка містила 150 мг/мл анти-ГМ-КОФ антитіл, 30 мМ гістидин та 5 95 сорбіт, рН 5,8 після її 7-денного зберігання при температурі 40 "С 2.10 мкм (частинок /мл) 11111111 одень | 4дні | 7днів.Й0 (150 мг/мланти-ГМ-КСФантитіля 015958РБ2О | 23 | 46 | 0

Таблиця 17

Результати досліджень композиції, яка містила 150 мг/мл анти-ГМ-КСФ антитіл, 30 мМ гістидин, 5 95 сорбіт, рН 5,8 після її 7-денного зберігання при температурі 40 "С, отримані із застосуванням ексклюзійної ВЕРХ-хроматографії (ЗЕ-НРІ С) 77777777171717.7.7.ю.юЮюЮ |Одень| 4дні | 7днів Одень| 4дні | 7днів Одень) 4дні |7днів 150 мг/мл анти-ГМ-

КОСФ антитіл я 0 95 0,85 1,40 | 1,53 1,6 1,7 1,9 97,6 рРБЗВ8О 150 мг/мл анти-ГМ-

КОСФ антитіл -- 0,05 95 0,81 1,49 | 1,79 1,7 1,7 2,0 97,5 96,2

РБЗВ8О 150 мг/мл анти-ГМ-

КОСФ антитіл - 0,1 95 0,85 1,54 | 1,79 1,6 1,8 21 97,6 96,7 96,1

РБЗВ8О

ДНК виз ізе зе те зве зв ж»

КОСФ антитіл я 0 95 0,97 1,41 1,55 1,6 1,8 1,68 97,4 96,8 рбЗг20 150 мг/мл анти-ГМ-

КОСФ антитіл - 0,1 95 1,37 | 1,65 1,7 1,7 2,0 97,4 97,0 96,3 рбЗг20 150 мг/мл анти-ГМ-

КОСФ антитіл я 0,15 95 0,98 1,39 | 1,73 1,6 1,4 2,2 97,4 97,0 96,1 рбЗг20

Приклад 18: Дослідження стійкості у попередньо заповнених шприцах.

Стійкість різних композицій було досліджено з попередньо заповненими шприцами від трьох різних виробників з різним вмістом силікону, гумовими компонентами тощо. Додатково було досліджено композиції плацебо. Строк зберігання досліджуваних композицій складав до 12 міс. при температурі зберігання у 2-8 "С та 25 "С. Характеристичний аналіз композицій, які містили білок, тобто антитіло було здійснено із застосуванням візуального обстеження, ексклюзійної

ВЕРХ-хроматографії (5Е-НРІ С), катіонообмінної хроматографії та способу візуалізації у мікропотоці (МЕЇ), тоді як композиції плацебо було досліджено із застосуванням візуального обстеження та МРЇ.

Ці досліджені композиції наведено у Таблиці 18.

Таблиця 18

Склад композицій, призначених для аналізу стійкості у попередньо заповнених шприцах 0,04 96 РБВО

ПИ іоівісібівсісвій ПН ЛИН 0,04 96 РБВО 0,04 96 РБВ8О 0,04 96 РБВО

ПИШЕ с ові іс ПН ЛІННЯ 0,04 96 РБВО

ПСИ с вісі ПН ИН 0,04 96 РБВО 0,02 ую РБВ8О

ПИСК т івісійосівій ПН ЗИ 0,02 ую РБВ8О 77717179 |ЗОмМтістидин,59бсорбіт,002958Р5ВО / | б А

Приклад 19: Дослідження стійкості композицій у попередньо заповнених шприцах.

Було здійснено дослідження стійкості різних композицій з різними концентраціями антитіл та кількості полісорбату у попередньо заповнених шприцах, всі з яких були типовими шприцами для підшкірного введення, отриманими від трьох різних виробників та мали різну кількість силіконового масла та різний склад гуми, з якої було зроблено ковпачок голки. Всі три виробники шприців у цих моделях застосували однаковий склад матеріалу поршня / ущільнювача поршня. Кількість полісорбату було вибрано, щоб вона перевищувала САС та вона займає досить плоску частину кривої поверхневого натягу. Додатково було досліджено композиції плацебо. Температура зберігання композицій складала 2-8 С та 25 "С у випадку тривалого терміну вибірки. Характеристичний аналіз композицій, які містили білок, було здійснено із застосуванням візуального обстеження, ексклюзійної ВЕРХ-хроматографії (5Е-

НРІ С), катіонообмінної хроматографії та способу візуалізації у мікропотоці (МЕ), тоді як композиції плацебо було досліджено із застосуванням візуального обстеження та МРЇ.

Досліджені композиції наведено у Таблиці 19 та результати надано у Таблицях 20-26.

Композиції, які містили 80 мг/мл антитіл на зовнішній вигляд були безбарвними з відсутністю у всіх композиціях частинок, яких можна побачити неозброєним оком, що не залежало від типу шприца та залишалося незмінним протягом часу. Композиції, які містили 150 мг/мл антитіл на зовнішній вигляд були трохи жовтуватими з відсутністю у всіх композиціях частинок, яких можна побачити неозброєним оком, що також не залежало від типу шприца та залишалося незмінним протягом часу. Виміряна з допомогою ексклюзійної ВЕРХ-хроматографії швидкість агрегації була більшою для композицій, які містили 150 мг/мл антитіл, ніж для композицій, які містили 80 мг/мл та кількість поверхнево-активної речовини не впливала на швидкість агрегації. Зміна профілю заряду протягом часу для всіх досліджених композицій та типів шприців була однаковою.

Таблиця 19

Склад композицій, призначених для аналізу стійкості у попередньо заповнених шприцах гістидин, 5 95 сорбіт, 0,04 95 РЗ8О

НИНІ, сне ех ИН НИ ННЯ гістидин, 5 95 сорбіт, 0,04 95 РЗ8О гістидин, 5 95 сорбіт, 0,04 95 РОВО гістидин, 5 95 сорбіт, 0,04 95 РЗ8О

ПИШЕ і ен МНН НИ ТИН гістидин, 5 95 сорбіт, 0,04 95 РЗ8О

ПИШНІ і ен НИЙ НИ гістидин, 5 95 сорбіт, 0,04 95 РЗ8О гістидин, 5 95 сорбіт, 0,02 96 РЗ8О

НИЖНІ, кі с Ех Й НИ УНН гістидин, 5 95 сорбіт, 0,02 96 РЗ8О 77771738. юю |ЗОмМгтістидин, 596сорбіт, 00296Р58О. | г (А

Таблиця 20

Результати досліджень композицій у попередньо заповнених шприцах, які зберігали при температурі 5 "С ж 3 с, здійснених із застосуванням ексклюзійної ВЕРХ-хроматографії (ЗЕ-НРІ С) о Мекомпозицїї | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 концентрація антитіл по | олово во) во вово стипшприда.ї//// | А | В | С | А | в | С | А | А 0 | 02 | 02 | 02 | 02 | 02 | 02 | 09 | 06 дь ПММ бм | 02 | 01 | 02 | 01 | 01 | 01 | 04 | 03 0 | 70 | то | 10 | 09 / 09 | 09 | 08 | и д6 НМ бм | 7,5 | 1,5 | 15 | 12 | тї2 | тї2 | 20 | 20 обмоно- 10 | 98,8 | 98,8 | 98,8 | 989 | 98,9 / 989 / 983 | 984 мерів

І бм | 98,53 | 984 | 98,3 | 98,7 | 986 | 987 | 97,7 | 97,7

Таблиця 21

Результати досліджень композицій у попередньо заповнених шприцах, які зберігали при температурі 25 "С / відносною вологістю 60 95, здійснених із застосуванням ексклюзійної ВЕРХ-хроматографії (ЗЕ-НРІ С) о Мекомпозицї | 1 | 2 | З | 4 | 5 | 6 | 7 | 8

Ша тюлю лююю юю в антитіл (мг/мл стипшпридаї/// | А | В | С | А | в | С | А / А о | 02 | 02 | 02 | 02 | 02 | 02 | 09 | 06 з6І ММ

Зм | 04 | 04 | 04 | 05 | 05 | 05 | 06 | 05 бм | 06 | 06 | 06 | 07 | 07 | 07 | 70 | 07 о | о | то | ї0 | 09 | 09 | 09 | 08 | М

ЗНМ бм | 23 | 23 | 23 | 18 | 16 | 16 | 23 | 30 о | 988 | 988 | 988 | 989 | 989 | 989 | 983 | 984 обмоно- Гм | 98 | 98 | 98 | 9853 | 984 | 984 | 985 | 979 мерів

І бм | 970 | 971 | 970 | 97,7 | 97,7 | 977 | 968 | 963

Таблиця 22

Результати досліджень композицій у попередньо заповнених шприцах, які зберігали при температурі 45 "С ж 3 с, здійснених із застосуванням катіонообмінної хроматографії 11111111 Мекомпозицїї//////// | 1 | 2 | З | 4 | 5 | 6 концентраціяантитіл(мг/мл) | 150 | 150 | 150 | 80 / 80 | 80 стипшприцаї//////777777777777/ | А | В | С | А | В с 0 | 42 | 42 | 42 | 42 | 42 | з 96 кислих сполук бм | 42 | 42 | 42 | 42 | 42 | 42 0 | 55 | 55 | 55 | 55 | 55 | 5 95 головної ізоформи бм | 5 | 54 | 55 | 55 | 55 | 5 01121 2121212 з 96 основних сполук

І бм | з | з | з | з | з | з /

Таблиця 23

Результати досліджень композицій у попередньо заповнених шприцах, які зберігали при температурі 25 "С / відносною вологістю 60 95, здійснених із застосуванням катіонообмінної хроматографії 1111111 Мекомпозицїї/////// | 1 | 2 | з | 4 | 5 | 6 концентраціяантитіл(мг/млу 150 | 150 | 150 | 80 | 80 | 80 стипшприцаї//////777777777777777/ 17171717 А ЇЇ В | С | А | в | с 0 | 42 | 42 | 42 | 42 | 42 | 83 96 кислих сполук бм | 51 | 52 | 51 | 53 | 53 | 55 0 | 55 | 55 1 55 | 55 | 55 | 53 95 головної ізоформи бм | 44 | 45 | 44 | 43 | 43 | 422 012121 2121 2 | З 95 основних сполук

І бм | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | з

Таблиця 24

Результати досліджень сили ін'єкції композицій у попередньо заповнених шприцах, які зберігали при температурі 5 С ж 3 о Мекомпозиці | 1 | 2 | З | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | то

ТМКЕМе ее те тю то о о антитіл (мг/мл) стипшприцаї | А | В / С | А | В | С | А | А | А | А макси. | 0 / 46 | 52 | 47 | 42 | 47 | 45 | 45 | 45 | 43 | 43 мальна сила, потрібна тен 111111 руху (Н середня | 0 | 96 / 71 | 74 | 54 | 44 | 50 | 50 | 101 | 46 | 42 сила тертя ковзання | Зм / 9,4 | 6,6 | 75 | 64 / 53 | 51 | 82 | 80 | 38 | 49 (н) бм! 1

Таблиця 25

Результати досліджень сили ін'єкції композицій у попередньо заповнених шприцах, які зберігали при температурі 425 "С/ відносною вологістю 60 95 о Мекомпозицї | 1 | 2 | з | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | то концентрація 1БО | 150 | 15О 150 антитіл (мг/мл) де РБ 80 лтипшприцдаї | А | В | С | А | В | С | А / А / А / А макси. | 0 | 46 | 52 | 47 | 42 | 47 | 45 | 45 | 45 | 43 | 43 мальна | їм | 50 | 60 | 46 | 42 | 53 | 48 | 49 | 45 | 43 | 50 сила, потрібна

Унів І ННІ НІ ННЯ МОН ВОНО ННЯ НОЯ Кон ВОЛЯ НОЯ рУХУ (Н) середня | 0 | 96 / 7 | 74 | 54 / 44 | 50 | 50 | 101 | 46 | 42 силатертя| їм | 8,7 / 74 | 8,9 | 53 5,7 | бе | 66 | 130 | 44 | 42 ковзання (н) Зм | 103) 6,7 124 | 65 | 56 6,7 | 79 | 79 | 96 48 бм! Її 111

Результати досліджень сили ін'єкції показали, що середня сила тертя ковзання складає приблизно 4-11 Н для кожної дослідженої композиції та шприца. Ці межі сили надають можливість застосування зазначених тут анти-ГМ-КСФ антитіл у описаних тут композиціях як з допомогою звичайних шприців, так і з допомогою автоін'єкторів.

Таблиця 26

Результати досліджень композицій у попередньо заповнених шприцах, які зберігали при температурі 5 "С ж 3 с, здійснених із застосуванням способу візуалізації у мікропотоці (МЕЇ) (частинок/мл) о Мекомпозиці | 1 | 2 | З | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 0 концентрація | 150 | ч5О | 150 150 антитіл (мг/мл) де Р 80 стипшприда | А | В | С | А | В | С | А / А | А | А 6054 | 3173 | 4680 | 5910 | 2032 | 3031 1602 | 1155 | 1309 | 1276 5 б З 5 7 8 57 11 22 (0/8) 1Мм 3998 | 5872 | 8192 | 4715 | 2470 | 6299 | 1220 | 6711 1185 |) 53912 2-10 (9) 7 5 б 2 7 36 З 16 З

МКМ 3749 | 3191 6761 1801 | 5717 | 8927 1044 | 7045 9423 | 3186 МУ 1352 | 1484 | 6834 | 1050 | 1327 | 1092 | 5411 4 4 46 7 1 23 80 08 8 0 | 869 | 297 / 1989 1852 | 3270 | 4116 | 1212 510 3771 | 6658 | 1056 2314 2596

МКМ 1825 | 1214 бм | 817 | 481 | ММ / 1275 1214 | 1397 1710 | 1262 0101000 10 | 23 | 69 0 | 183 | 46 225 їм | 0 | 506 | 168 / 31 | 38 | 8 | 252 | 8 | 115 | 46 мкм | Зм | 8 | 8 | мм | 8 | о | 23 | з8 | 8 | 46 | з

І бм | 69 | 15 | ММ | 15 | 0 | 8 | 84 | 8 | 8 | з

ММ - результати є неприйнятними через появу бульбашок повітря у проточній кюветі, додаткових зразків не отримано.

Таблиця 27

Результати досліджень композицій у попередньо заповнених шприцах, які зберігали при температурі 425 "С/ відносною вологістю 60 95, здійснених із застосуванням способу візуалізації у мікропотоці (МЕЇ) (частинок/мл) о Мекомпозиці | 1 | 2 | З | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 0 куреня твер юю тю ті ої о антитіл (мг/мл) стипшприда | А | В | С | А | В | С | А / А | А | А

Не аавача; ве ль Я ВЕ В АВ 4 (в) З 5 8 8 57 11 22 (0/8) 6570 | 6044 | 2283 | 4928 | 8956 | 3874 8581

МКМ 7 2 61 64 2 0 65 2 5 1

З 1 б 2 4 8 61 70 58 7 нс АБ: ль ЯН: ль Ася Бей 63 9 68 20 67 77 б 4 30 0 | 869 | 297 1989 137 | 91 | 366 | 1852 | 3270 | 4116 | 1212 510

МКМ о бм | 3680 | 1150 5666 / 939 | ММ | 7820 | 2260 | 519 | 909 | 1619 0101000 10 | 23 | 69 0 | 183 | 46 зов | їм | ММ | ММ | о | 23 | 0 | 84 / 69 | 8 | ММ | 99 мкм --2м ЇЇ 8 | 8 1 8 | 38 | 69 | 38 | 0 | 23 | 15 | 84

Зм | 61 | 1221 8 | 8 | 15 | зі | 0 | 46 | 31 | 191

І бм | 61 | 23 | 15 | зі | ММ | п4 | 53 | з! | 715 | 8

ММ - результати є неприйнятними через появу бульбашок повітря у проточній кюветі, додаткових зразків не отримано.

Claims (9)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Водна композиція для використання в терапії, що включає: ї людське моноклональне антитіло, що зв'язується з ГМ-КСФ, де антитіло містить амінокислотну послідовність легкого ланцюга, як викладено в ЗЕО ІЮО МО: 34, і амінокислотну послідовність важкого ланцюга, як викладено в ЗЕО ІЮО МО: 35, що присутнє в концентрації від 50 до 180 мг/мл; ії) модифікатор тонічності, присутній в концентрації від З до 7 95 (маса/об'єм), де модифікатором тонічності є сорбіт; ії) буфер, присутній в концентрації від 20 до 40 мМ, де буфер є гістидиновим буфером; їм) поверхнево-активну речовину, присутню в концентрації від 0,01 до 0,08 95 (маса/об'єм), де поверхнево-активна речовина є полісорбатом 80, і де м) рН становить від 5 до 7.

2. Композиція за п. 1, що додатково містить антиоксидант.

3. Композиція за п. 1 або 2, в якій кількість полісорбату 80 перевищує концентрацію критичної агрегації (САС).

4. Композиція за будь-яким з пп. 1-3, в якій відношення полісорбату 80 до білка складає від 0,3:1 до 0,6:1.

5. Композиція за будь-яким з пп. 1-4, що містить: ї) приблизно 50-180 мг/мл антитіла, що зв'язується з ГМ-КСФ, ії) приблизно 5 95 (маса/об'єм) сорбіту, ії) приблизно 30 мМ Г-гістидину та їм) від 0,01 до 0,08 95 (маса/об'єм) полісорбату 80, та м) має рН приблизно 5,8. бо

6. Композиція за п. 5, яка містить приблизно 80 або 150 мг/мл антитіла, що зв'язується з ГМ-

КСФ.

7. Композиція за будь-яким з пп. 1-6, що є стійкою протягом принаймні 24 міс. за температури 2- 8 "С або принаймні 28 днів за кімнатної температури.

8. Композиція за будь-яким з пп. 1-7, де зазначену композицію запаковано у попередньо заповнений шприц.

9. Композиція за будь-яким з пп. 1-8 для застосування при лікуванні запальних та аутоїмунних порушень, де розлади вибирають із алергічних, псоріатичних, артритних та астматичних розладів. 5 мономерів : ши 5 дова пе Жов ШИ поашее 00 В й В жа Е ШЕ її и : і: ви 0 ( Шш-Ї ! ши п : | ше ше щ с о 0 ШЕ ї жк. щЩ роя ре режи жо : шою й М. Зк ГА дк : : О00одрббінуйкова ут нечкя васу вісн Б рек бю пісня жкнівО: : 6 ТЕЖЕНКО часу СОВОВВІВ Зборів СК ЗВАННЯ КК ння :

Фіг.1 І «1 ВИ ОМИО НОВ ШО п оо о ВИ Місево і І ТЕКА КОХ А ПК - п ЗК ех ВН, КУ се й З в о Мосекост и ооо І мої рок З ОН ВХ тарт Пвастеднн (ННЯ 1 ї о пита 1 одна ОБ 5-ввово? З 5 Ш І! фуюя щ- ідсбін МОН ї Пковментрація ника ПЕО В б ежтаха 4 зи МОВО " ТИХЕ І: сера пре Нен 00 ЕЕ х ї Ї МОНЕ З хе тнандни (НДО є ЗВО ! З ікси зх 1 ж у ча з у. К з АК, 4 Кене ація яка р зані пе «пре 4 ОМ ! БМ морю си 4 ТЕРИЬНяХ 1 о и ан ТЕН КЕН КУ зжанити аакт іа помпи на веж нах Фіг?

ше ! Ії вай -о ; - ра ! не Її А К а й 1000000 я й : ет 3 жк, вай ГО і БД й 3 орі з див 500 рай е ци .К- с них г) г пани й Я | х МО, сен ит и Я і К снів меді ВЕ ЕТО Ем де в да дея о 5 то 15 й й за хи ок. г х Е тачка часу ГОД Н нан а а в о а о ее Я дет АЕЕВКСУ сор пря Кок ДЕН рН КІ ЛЙОоКу то месагаи ой мес В Фр ВІКУ КОНКУ ТВ дв рот пенею кт г ля МІХ ТТТМВ КНТ ДИМ Не уеНіх вих вро ; : нини ік еннни Нвкр рено: КОВІ ері зер зт !

Фіг.З вобого н- -У о с і 700000 4 4 800000 - ра ! ! я 5Обово р о ! У ШЕ «- О0000 КЗ в : ! Є | сах Е- до 300000 5 ра я рай а я я : сз рОдООЮ ра є я спін 100009 - й дн ТЯ ви ши ши он т ожини ей І Жид ПЕЧЕ синий їх а пфаканини и Ки Й ян Ко се ха квівав МАННА НИКИ о 2 Я в Б точка часу ігод.і о доро с ооо ооо за опорою ооніен кві пінні ік піні ніс нік нн ки ою зол ня ! р дня р рано Конан тва ції пеиневруть 7 ще нн ЕКО ПД ДОВ КенЦЕНВ рен нок р у ї сх КУ ря зе кв КК ТЕО КЕН МеВ СКЛ ту З зятя р кї кві кор реної Конернтрації пенте еанен ої і с и п о Кв в Ффіг.А

8000000 5 пт тент обентнннету чий 000000 5 в : я ! х Ї с Рі КО я р о о амюров- ра й ре сами в ш 23 3000000 5 р й - ЯВО0000 их й дя р т 10000004 п са Е й пд Я й АЙ ЖЬЖО КІМ Є ийн деко. я зірок Є ж сяк: Ї Й І -100000о-е-у - пиши ники нин Й й з 0 в 10 18 20 75. точка част ігодо Й кож ку сн ВО призу ютецан ці заніс ва о ШИ шення р -- Мом пух пн ценцаці пепісрйатуютаї ; оетіню сф » нню у ДЕЗр зкряеЕ казну повер атуєсниов зе Кн «ВН ор'рванн кон нтв оці полізеораатутен песо кий уся я еееео ВК ПЕВ КОН дент Чим ворів, ТВ

Фіг.5 ВЕН Шк я У . лоднннн ПМ нн Шини що яти вк х- 400000 - неза Од ре: дент ий КО дин дик тк 7 шт по ще о щих Ша :

тт. 000 і Б І «- ж Шк т ік дн дух я ЧЕ в ! сл- Шен - га я |. Фронт ій т ЙО Ні шк « я пе т ї 2 08 В. точка част тод.) ! й он в о звати по лама лав ек ій піні ній нн па пп пііні ііі піно піні піні онінінік - пиінінінінініннін пнеегененніх днеетегенноя ПІДВ НЕ ЕН КОТДеНТ оіДіЇ ПОМ т ї. п (у хек підбер пронаог коном посі тую і звестнню хе. я яння ОВЕН КОНЕМ АЦІЇ ПАМ НН туя ! п г підбор лржяєї каццентаації повер ат ї секти пдфер т рака нотні від пло неуєн о

Фіг.б

! 800 критична концентрація ! - | вгрегації плоке : ! жі поверхнево акТнЕНа ; дяк Ї па ія дії Ї З я, Шки човина; ж рзесоваовнув зе критичне кенцентриція і їх | ЗававвивоВания міцел | ! Кк фмономер зе х Її Ж Гповеруневані бе й І - фактнвної | те І Що фречавинИ | Тв | і міменни і а Я з БИ КтХ ї | ! . х Ї поверхнево-, Ж ! активної Е І речовннино концентрація поверхнеяво-яктивно сполуки о.

Фіг.7 ТО00. рення до. о ши ЩОДО, денне рт г З Ко ЩОООЯВЮЮ зн ннннннннння . | о зл кана а а и п-- хв 3000. -ї 5 жо що й 52000 детрит ж 1000. Ко зи ТО дня О о Кок ЧА ше й ее зх леюттн чпкюфЯ КУ | -ї яп а с ВИЙ ек У г В "зір ж осв них п дення м ми нн Ан и : і ОБ я ; з, що й щі 4 в й т цякл заеорожувиння 7 відтавання пенні ння ВО меми ОТОЙ - Я -ВОвоми ЗОЛОТО ' ненек ун сни ВО гм СК 0.16 ТО стнакіхюфре зежижя дО МгМИ Ж Й; То пер ВО мими СК ОО ТО шт - меми ОК ТО

Фіг.5