CN101970489B - 与hGM-CSF结合的单克隆抗体及包含它的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
在此公开的是抗hGM-CSF单克隆抗体和这样的抗体的抗原结合片段，具有改善的中和hGM-CSF活性的能力。还提供了包含这样的抗体或抗原结合片段的药物组合物。本发明对于治疗与hGM-CSF异常表达相关的多种疾病是有用的。
Description
发明领域
本发明涉及结合人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(也称为“hGM-CSF”)并中和hGM-CSF活性的单克隆抗体，包含一种或多种这类单克隆抗体的组合物和这类单克隆抗体及组合物的使用方法。
发明背景
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)被鉴定为一种促进骨髓粒细胞和巨噬细胞祖细胞增殖，并促进粒细胞和巨噬细胞体外集落形成的体液因子。
现在知道GM-CSF是多种细胞类型的刺激因子。它诱导粒细胞-巨噬细胞谱系血细胞的分化和增殖，提升抗原呈递细胞的功能，维持一些种类上皮细胞的功能并诱导肺泡巨噬细胞的功能(如，增强表面活性剂分解代谢，杀菌功能，和Fc受体表达)。The Cytokine Handbook，第4版，Thomson，A.等(编)，Academic Press，2003.
已知GM-CSF引起多种疾病，包括1)变应性疾病如哮喘、特应性和花粉症，2)移植物排斥，和移植物抗宿主病(GVHD)，和3)自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎。
例如，人GM-CSF(hGM-CSF)在变应性患者的肺部中和在类风湿性关节炎患者的关节中过表达；hGM-CSF mRNA在变应性患者的皮肤过表达。还报道的是，GM-CSF的产生增强单核细胞的存活，而单核细胞是特应性皮炎的炎症诱导细胞。Bratton，D.L.等.，Granulocyte macrophage colony-stimulating factorcontributes to enhanced monocyte survival in chronic atopic dermatitis.J.Clin.Invest.，95：211-218，1995。
另外，已经表明GM-CSF刺激白血病细胞的增殖，因此，GM-CSF被认为是一种引起白血病的因子。
获得治疗人GM-CSF引起的疾病和状况的方法是有用的。治疗这类疾病和状况的一种方法是结合hGM-CSF，并抑制它的生物活性。例如，这可以通过施用抗hGM-CSF单克隆抗体来实现，所述单克隆抗体具有针对hGM-CSF的高亲和力和充分中和活性，但不诱导免疫学反应。
然而，目前报道的hGM-CSF抑制抗体都没有针对hGM-CSF的充分中和活性。并且，看来非常可能的是，现有的抗hGM-CSF单克隆抗体会在接受者中引起不希望的免疫应答。多克隆抗体和单克隆抗体通常衍生自实验动物，比如小鼠、家兔和公山羊。然而，获得的抗体具有用于产生它们的动物的序列特征。如果将它们施用给人，人的免疫系统可能视这些抗体为外来物，可能引起人抗动物抗体应答(即抗体产生了它自身的抗体)。
另外，长期施药对于治疗这类疾病来说是必要的，结果可能产生问题，比如，可能由施用药物中少量的杂质引起的安全问题。从有效性、安全性和医疗费用的角度考虑，比现有抗体中和活性更好的抗体作为治疗剂会很有价值。
发明概述
本发明至少部分基于发明人对某些特征为针对hGM-CSF的极高中和活性的抗人GM-CSF单克隆抗体的开发。这些抗体的中和活性令人惊讶地高出基于它们对hGM-CSF的结合亲和力所作出的预期。其中的两个抗hGM-CSF单克隆抗体在此被称作EV1018和EV1019。
一方面，本发明提供了结合和中和hGM-CSF的抗hGM-CSF抗体及其片段。
在一个实施方式中，提供了一个分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段识别hGM-CSF中的ELYK(SEQ IDNO：2)和TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)，hGM-CSF氨基酸序列如SEQID NO：1所示。在一个实施方式中，所述抗体包含：
(a)重链，其包含含有VH-CDR1的共有序列，含有VH-CDR2的共有序列和含有VH-CDR3的共有序列，其中：
(i)含有VH-CDR1的共有序列是FTFSX1X2MH(SEQ ID NO：314)，其中X1是Y或H，X2是G或A，
(ii)含有VH-CDR2的共有序列是X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO：315)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，X8是R或K，且
(iii)含有VH-CDR3的共有序列是EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，X10是A或G，和，
(b)轻链，其包含含有VL-CDR1的共有序列，含有VL-CDR2的共有序列和含有VL-CDR3的共有序列，其中：
(i)含有VL-CDR1的共有序列是XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO：317)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X11是H或Y，
(ii)含有VL-CDR2的共有序列是GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，X13是A或P，且
(iii)含有VL-CDR3的共有序列是STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，其中X14是R或S，X15是V或L；并且所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合hGM-CSF。
在一个实施方式中，所述抗体包含：
(a)包含VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3的重链，其中：
(i)VH-CDR1具有选自SYGMH(SEQ ID NO：10)和SHAMH(SEQID NO 333)的氨基酸序列，
(ii)VH-CDR2具有选自LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO：5)和VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO：334)的氨基酸序列，且
(iii)VH-CDR3具有选自ESMGAINDN(SEQ ID NO：6)和EWVGGTCDS(SEQ ID NO：335)的氨基酸序列；和
(b)包含VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3的轻链，其中：
(i)VL-CDR1具有选自IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO：7)和SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO：330)的氨基酸序列，
(ii)VL-CDR2具有选自GRSPPS(SEQ ID NO：8)和GKSPAS(SEQID NO：331)的氨基酸序列，且
(iii)VL-CDR3具有选自STWDSSLSAVV(SEQ ID NO：9)和STWDSRLSAVL(SEQ ID NO：332)的氨基酸序列，并且所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合hGM-CSF。
例如，如上所述的抗体或其抗原结合片段结合人GM-CSF的KD小于400pM，更优选地，KD小于160pM。
在此描述的抗体或其抗原结合片段中和hGM-CSF的活性，使得如在此描述的TF-1增殖分析中，ED80时测定的抗体或其抗原结合片段IC50值小于100pM(例如，小于30pM，小于20pM)。
在任一实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段可包含重链，所述的重链为伽玛1(γ1)，伽玛2(γ2)，伽玛3(γ3)或伽玛4(γ4)。重链可以选自SEQID NO：10-33，38-80，以及160-183和222-245。
在任一实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段可包含轻链，所述的轻链为λ轻链。在一些实施方式中，λ轻链与野生型序列相比，可以含有R100G或A153G中一个或者两个氨基酸取代。在一个实施方式中，轻链可以选自SEQID NO：34-37和202-221。轻链可以是λ轻链或κ轻链。在一些实施方式中，重链是伽玛1(γ1)，伽玛2(γ2)，伽玛3(γ3)或伽玛4(γ4)，轻链是λ轻链。在任一实施方式中，重链与野生型序列相比，可以含有下述氨基酸取代中的一个或更多个：Q3E，T97A，T97V，N95D，N95E，N95K，N95Q，N93Q/N95T，K144R，L164A，和L165A。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链含有选自下述组成的组的一个或更多个氨基酸取代：Q3E，T97A，T97V，N95D，N95E，N95K，N95Q，N93Q/N95T，K144R，L164A，和L165A，所述轻链含有下述氨基酸取代中的一个或两个：R100G和A153G。
在此描述的抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列SYGMH(SEQID NO：4)或SHAMH(SEQ ID NO：333)的VH-CDR1。在此描述的抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ IDNO：5)或VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO：334)的VH-CDR2。在此描述的抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列ESMGAINDN(SEQID NO：6)或EWVGGTCDS(SEQ ID NO：335)的VH-CDR3。在此描述的抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列IGNNNNIGSHAVG(SEQ IDNO：7)或SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO：330)的VL-CDR1。在此描述的抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列GRSPPS(SEQ ID NO：8)或GKSPAS(SEQ ID NO：331)的VL-CDR2。在此描述的抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列STWDSSLSAVV(SEQ ID NO：9)或STWDSRLSAVL(SEQ ID NO：332)的VL-CDR3。
在一些实施方式中，所述特异性结合hGM-CSF的抗体或其抗原结合片段包含6个不同的CDR，其序列如SEQ ID NO：4-9所示。
在一些实施方式中，所述特异性结合hGM-CSF的抗体或其抗原结合片段包含6个不同的CDR，其序列如SEQ ID NO：330-335所示。
在此提供的任一实施方式中，抗体可以包括重链，其是伽玛1(γ1)，伽玛2(γ2)，伽玛3(γ3)或伽玛4(γ4)，和轻链，其是κ或λ。
在一些实施方式中，在此描述的抗体或其抗原结合片段可以进一步包含信号序列，例如SEQ ID NO：324，325和326所示的信号序列。
涉及野生型和野生型的变体的实施方式也包括在本发明中。在一些实施方式中，抗体或其片段包含重链，重链为SEQ ID NO：10或选自SEQ ID NO：11-33，38-80的其变体，还包含轻链，轻链为SEQ ID NO：34或选自SEQ ID NO：35-37的其变体。在一些实施方式中，重链是SEQ ID NO：160或选自SEQ ID NO：161-245的其变体，轻链是SEQ ID NO：202或选自SEQ ID NO：203-221的其变体。
在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其中重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：152，或选自由SEQ ID NO：153-158和159组成的组的其变体，和轻链可变区，其中轻链可变区的氨基酸序列是SEQID NO：184，或选自由SEQ ID NO：185-200和201组成的组的其变体。
在一个实施方式中，重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：152。在一个实施方式中，轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：184。在一个实施方式中，重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：152，并且其中轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：184。在一个实施方式中，抗体属于IgG1(λ)类(亚类)。
在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其中重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：348，或选自由SEQ ID NO：349-362和363组成的组的其变体，和轻链可变区，其中轻链可变区的氨基酸序列是SEQID NO：364或SEQ ID NO：365。
在一个实施方式中，重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：348。在一个实施方式中，轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：364。在一个实施方式中，轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：365。在一个实施方式中，抗体属于IgG1(λ)类(亚类)。
在一个实施方式中，在此公开的能够结合hGM-CSF(hGM-CSF)并中和hGM-CSF生物活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于：它具有由选自由SEQ ID NO：4-9和SEQ ID NO：330-335组成的组的一个或更多个氨基酸序列所示的互补决定区(CDR)。在一些实施方式中，CDR中的一个或更多个氨基酸可以被取代、缺失、插入或增加。在此描述的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分可以特征在于，当TF-1细胞被hGM-CSF诱导增殖时，在浓度约14pM下，抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分抑制TF-1细胞增殖达约50％。在一些实施方式中，抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分抑制外周血树突状细胞的增殖。
在一个实施方式中，在此描述的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分对hGM-CSF具有高的亲和力，KD值为4×10-10M或更低。
在一些实施方式中，在此描述的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分属于IgG1(λ)类(亚类)。在一些实施方式中，本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体是人单克隆抗体。
本发明进一步包括核酸及包含所述核酸的载体。在一个实施方式中，本发明是编码在此公开的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。在一个实施方式中，所述核酸是DNA。在一个实施方式中，本发明是载体，所述载体包含编码在此公开的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段的DNA。
本发明进一步提供了包含表达载体的宿主细胞，所述载体包含本发明的DNA载体。
本发明还涵盖试剂盒，其包含：(a)本发明的抗体或其抗原结合片段；和(b)含有抗体或其抗原结合片段的一个或更多个容器。
在一个实施方式中，本发明是依照本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于药物中。
本发明提供了包含结合并中和hGM-CSF的抗hGM-CSF抗体或其片段的组合物。这类组合物可以是药物组合物(如药剂)，其包含抗hGM-CSF抗体和/或其片段(或其组合)和药学上可接受的载体。上述任一实施方式中的抗体或其抗原结合片段被包含在其中。
在进一步实施方式中，组合物包含了超过一种的抗GM-CSF抗体、片段或其组合，每一种是在此提供的。例如，所述组合物可以进一步包含第二种分离的结合hGM-CSF的抗体或其抗原结合片段，使得所述组合物包含超过一种/型的抗体、其抗原结合片段或其组合，每一种均结合GM-CSF。在一些实施方式中，上述多种结合hGM-CSF的抗体、其抗原结合片段或其组合中的至少一个是选自由SEQ ID NO：10-80，152-245，320-323和348-365组成的组的多肽。
本发明也涉及适用于治疗hGM-CSF引起的疾病的药物组合物，其包含根据在此的任一实施方式的抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。由hGM-CSF过量产生引起的疾病的例子包括：(a)变应性疾病(allergic diseases)，如哮喘(asthma)，特应性(atopy)和花粉症(pollinosis)(变应性鼻炎(allergic rhinitis)，枯草热(hay fever))；(b)移植物排斥(graft rejection)，移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)(GVHD)；和(c)自身免疫性疾病(autoimmunediseases)如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)。
这样的组合物或兽药组合物可以包含特异于同一特定抗原的多种抗hGM-CSF单克隆抗体或它们的抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，药用组合物或兽药组合物的特征在于，多种抗hGM-CSF单克隆抗体或它们的抗原结合部分包含两型(type)或更多型的抗体或它们的抗原结合部分，可以选自下述的(a)和(b)：
(a)具有由SEQ ID NO：4-9，SEQ ID NO：330-335，SEQ ID NO：336-341，或SEQ ID NO：342-347的氨基酸序列表示的CDR，特异于hGM-CSF的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分；
(b)(a)的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其氨基酸序列中有一个或更多个氨基酸被取代、缺失、插入或添加，且特异于hGM-CSF。
当hGM-CSF诱导TF-1细胞增殖时，在各自约55pM的浓度下，这样的药用组合物或兽药组合物可抑制TF-1细胞增殖达80％或更多。
本发明的方面还涵盖试剂盒，其包含在此涵盖的任一组合物和一个或更多个容器。在一些实施方式中，试剂盒进一步包含说明书。在一些实施方式中，试剂盒进一步包含标签、说明书或者标签和说明书二者。
还提供了在此描述的抗体或其抗原结合片段，或者包含这样的抗体或其片段的组合物的用途。在此描述的任何抗hGM-CSF抗体或其抗原结合片段或组合物可用于生产或制备药物，用于治疗受试者中与hGM-CSF过表达相关的疾病或病症，其中所述抗体或其抗原结合片段结合hGM-CSF并能够中和hGM-CSF活性。在一些实施方式中，疾病或病症选自由慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructivepulmonary disease)(COPD)、哮喘(asthma)、囊性纤维化病(cystic fibrosis)、间质性肺病(interstitial lung disease)、鼻炎(rhinitis)、关节炎(arthritis)及相关关节病(arthropathies)、银屑病(psoriasis)、髓系白血病(myeloid leukemia，)、多发性硬化(multiple sclerosis)组成的组。
对于所描述的用途，抗体或抗原结合片段以不超过最大耐受剂量施用给受试者，其中，最大耐受剂量为每剂约500mg。
本发明的一个方面包括任一实施方式描述的抗体或其抗原结合片段或组合物在治疗受试者中与hGM-CSF过表达相关的疾病或病症中的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段结合hGM-CSF并能够中和hGM-CSF活性。例如，疾病或病症可以是慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、囊性纤维化病、间质性肺病、鼻炎、关节炎及相关关节病、银屑病、髓系白血病或多发性硬化。所述的用途包括给患者施用不超过最大耐受剂量本发明描述的抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物，其中最大耐受剂量为每剂约500mg。
本发明还提供了用抗hGM-CSF抗体或其片段治疗患有hGM-CSF异常表达相关疾病或病症的受试者的方法。所述方法包括向被诊断患有或存在风险患有hGM-CSF异常表达(如，过表达)相关疾病或病症的受试者以有效获得受试者中至少一种治疗效果的量施用包含体内中和hGS-CSF活性的抗hGM-CSF抗体或其抗原结合片段的组合物。
本发明还包括增强抗hGM-CSF抗体介导的hGM-CSF中和活性的方法，其特征在于多种特异于同一特定抗原的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分同时被施用。在一些实施方式，两种或更多种的抗体或其抗原结合部分选自下面的(a)和(b)：
(a)具有SEQ ID NO：4-9，SEQ ID NO：330-335，SEQ ID NO：336-341，或SEQ ID NO：342-347的氨基酸序列所示的CDR，特异于hGM-CSF的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分；和
(b)(a)的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其中一个或更多个氨基酸被取代、缺失、插入或添加，且特异于hGM-CSF。
本发明还包括增强活性的方法，其特征在于，当hGM-CSF诱导TF-1细胞增殖时，在各自约55pM的浓度下，两种或更多种的抗体或其抗原结合部分抑制TF-1细胞增殖达80％或以上。
本发明还提供了被在此描述的抗体或其抗原结合片段识别的hGM-CSF表位。多肽中hGM-CSF的表位在SEQ ID NO：2和3中列出，其中该本文被根据本发明公开内容的抗体或其抗原结合片段识别，且其中所述多肽序列代表hGM-CSF(基于SEQ ID NO：1)的不连续的区段。所述表位是人GM-CSF的不连续的区段，其中所述表位包含人GM-CSF(SEQ ID NO：1)的77-80位氨基酸残基和人GM-CSF(SEQ ID NO：1)的95-104位氨基酸残基的全部或一部分，且所述表位被包含如SEQ ID NO：4-9或SEQ ID NO：330-335所示的6个不同CDR的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段识别。
本发明还提供了本发明的表位的用途。本发明还包括特异性结合在此描述的表位的分子的筛选和/或鉴定方法，所述表位被在此提供的抗体或其抗原结合片段识别。一些实施方式涉及结合在此描述的表位的分子的鉴定方法，包括：(i)使用包含表位的探针筛选生物样品或肽库；(ii)分离特异性结合探针的分子；及(iii)鉴定所述分子。结合所述表位的分子可以是，例如，抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段。一些实施方式涵盖进一步包含可检测的标记的探针。在一些实施方式中，所述方法包括被固定的探针。
本发明还提供了生产抗hGM-CSF抗体或其抗原结合片段的方法或过程。本发明包括在宿主细胞中生产结合hGM-CSF的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段至少包含含有VH-CDR1的共有序列，含有VH-CDR2的共有序列，含有VH-CDR3的共有序列，含有VL-CDR1的共有序列，含有VL-CDR2的共有序列，和含有VL-CDR3的共有序列。所述方法包含步骤：
(i)获得包含至少一个DNA序列的宿主细胞，所述序列至少编码含有VH-CDR1的共有序列，含有VH-CDR2的共有序列，含有VH-CDR3的共有序列，含有VL-CDR1的共有序列，含有VL-CDR2的共有序列，和含有VL-CDR3的共有序列，其中：
(a)含有VH-CDR1的共有序列是FTFSX1X2MH(SEQ ID NO：314)，其中X1是Y或H，且X2是G或A，
(b)含有VH-CDR2的共有序列是X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO：315)，其中每个Xn互相独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K，
(c)含有VH-CDR3的共有序列是EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn互相独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G，
(d)含有VL-CDR1的共有序列是XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO：317)，其中每个Xn互相独立地是任何天然存在的氨基酸，且X11是H或Y，
(e)含有VL-CDR2的共有序列是GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，且X13是A或P，且
(f)含有VL-CDR3的共有序列是STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，其中X14是R或S，且X15是V或L；
(ii)在宿主细胞中表达所述DNA；和
(iii)在适合DNA表达并和抗体或其抗原结合片段生成的条件下培养宿主细胞。
在一些实施方式中，至少一个DNA编码重链或其部分和轻链或其部分，其中所述的重链或其部分选自由SEQ ID NO：10-33，38-80，152-183，222-245，348-362和363组成的组，且其中所述的轻链或其部分具有选自由SEQ ID NO：34-37，184-221，364和365组成的组的序列。
上述过程可以进一步包括分离抗体或其抗原结合片段。
上述过程可以进一步包括制备组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
还提供了载体，所述载体包含编码在此描述的抗体或其抗原结合片段的至少部分的DNA。还提供了表达这样的载体的宿主细胞。
在一些实施方式中，载体包含编码VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3的DNA，其中：
VH-CDR1是SYGMH(SEQ ID NO：4)或SHAMH(SEQ ID NO：333)，
VH-CDR2是LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO：5)或VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO：334)，且
VH-CDR3是ESMGAINDN(SEQ ID NO：6)或EWVGGTCDS(SEQ ID NO：335)。
在一些实施方式中，载体包含编码VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3的DNA，其中：
VL-CDR1是IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO：7)或SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO：330)，
VL-CDR2是GRSPPSG(SEQ ID NO：8)或GKSPASG(SEQ ID NO：331)，且
VL-CDR3是STWDSSLSAVV(SEQ ID NO：9)或STWDSRLSAVL(SEQID NO：332)。
在本发明的一些实施方式中，分离的DNA编码能够结合hGM-CSF并中和hGM-CSF生物活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于分离的DNA编码包含选自由SEQ ID NO：4至9组成的组的至少一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离的DNA编码能够结合hGM-CSF并中和hGM-CSF生物活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于分离的DNA编码包含选自由SEQ ID NO：330至335组成的组的至少一个的氨基酸序列。分离的DNA可以在严紧条件下能够与上述的DNA杂交。包含任何这样的DNA的载体，和表达重组表达载体的宿主细胞也包括在本发明的方面中。
附图的简要说明
图1显示了分离抗体产生细胞克隆的流程图。
图2显示了抗GM-CSF单克隆抗体的亲和力分析方案。
图3显示了在GM-CSF存在条件下，抗GM-CSF单克隆抗体对外周血树突状细胞增殖抑制效果的评价。
图4显示了在酵母hGM-CSF(Leukine)存在条件下，抗GM-CSF单克隆抗体对TF-1细胞增殖抑制效果的评价。
图5显示了在大肠杆菌hGM-CSF(Peprotech)存在条件下，抗GM-CSF单克隆抗体对TF-1细胞增殖抑制效果的评价。
图6显示了在酵母hGM-CSF(Leukine)存在条件下，组合使用两种抗GM-CSF单克隆抗体对TF-1细胞增殖抑制效果的评价。
图7显示了在大肠杆菌hGM-CSF(Peprotech)存在条件下，组合使用两种抗GM-CSF单克隆抗体对TF-1细胞增殖抑制效果的评价。
图8是表示人GM-CSF(8A)和恒河猴GM-CSF(8B)的剂量依赖性抑制的两个图。
图9A是从来自暴露于香烟烟雾的小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)团粒测得的髓过氧化物酶(MPO)活性条形图。-CS：用媒介处理的小鼠(在第1天和第3天腹膜内300μl媒介)，未暴露于香烟烟雾。+CS，同种型抗体：在第1天和第3天腹膜内用300μl同种型抗体处理，暴露于香烟烟雾的小鼠。+CS，抗GM-CSF抗体：在第1天和第3天腹膜内用300μl抗GM-CSF抗体处理，暴露于香烟烟雾的小鼠。n＝10只每组，均值±SEM，*p＜0.05，***p＜0.001。
图9B是两幅表示BALF上清液中测定的细胞因子的条形图。左侧：MCP-1水平的测定。右侧：MIP-1α水平的测定。-CS：用媒介处理的小鼠(在第1天和第3天腹膜内300μl媒介)，未暴露于香烟烟雾。+CS，同种型抗体：在第1天和第3天腹膜内用300μl同种型抗体处理，暴露于香烟烟雾的小鼠。+CS，抗GM-CSF抗体：在第1天和第3天腹膜内用300μl抗GM-CSF抗体处理，暴露于香烟烟雾的小鼠。n＝10只每组，均值±SEM，*p＜0.05，***p＜0.001。
发明详述
如在此描述的，抗hGM-CSF单克隆抗体是自抗体产生细胞获得的，所述的抗体产生细胞衍生自特发性肺泡蛋白沉积症患者的血液。在一个实施方式中，本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分是自衍生自特发性肺泡蛋白沉积症患者血液的抗体产生细胞获得的。因而，在本发明的一个实施方式中，抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段是完全人的单克隆抗体。因此，当抗体制品施用给人体时，将触发免疫原性的风险降至最低。
本发明要解决的问题如下：本发明旨在提供展现提高的针对hGM-CSF的中和能力或活性的GM-CSF结合单克隆抗体及其GM-CSF结合片段，和包括至少一种或型这样的抗体或其片段的组合物，以及与hGM-CSF过表达(在患有状况、疾病或病症的个体中，hGM-CSF水平高于不患有所述状况、疾病或病症的个体中的)相关的状况或疾病的治疗方法。
本发明公开内容中描述的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段特异地结合hGM-CSF，并降低或消除(中和)其生物活性，hGM-CSF的异常表达能引起各种疾病。抗hGM-CSF单克隆抗体展现了(针对hGM-CSF的)中和活性，其高于以前存在的抗hGM-CSF单克隆抗体。特别是，本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体是人单克隆抗体，不具有免疫原性，不诱导免疫反应。
所谓“特异结合”是指抗体高亲合力(avidity)和/或高亲和力(affinity)结合特定的多肽，例如，蛋白如人GM-CSF蛋白的表位。抗体对这种特定多肽上的表位的结合优选地强于所述抗体对任何其他表位的结合，尤其是那些可能存在于与同一样品相关的或在同一样品中的分子中，因为例如，感兴趣的多肽更强地结合蛋白如GM-CSF上的表位片段，以至于通过调节结合条件，抗体几乎专门结合目标蛋白上的表位位点或片段，如通过处理GM-CSF而暴露的表位片段，且所述表位片段在同一亚家族的相关因子上不暴露。本发明的分离的抗体优选地与特定的物种是免疫反应性的并对特定物种具有免疫特异性。比如，本发明的抗体识别人GM-CSF，可以识别恒河猴GM-CSF和/或狨猴GM-CSF，但一般不识别鼠对应物。应该理解本发明这个方面公开的抗体及其抗原结合片段识别天然构象的或充分接近天然构象的抗原上的表位，在结构研究中观察到抗原的不连续片段聚集在一起，在完整抗原(如，hGM-CSF)的背景内极其接近，从而协作形成被本发明的抗体识别的表位(例如，抗原表面上的″口袋″)。因此，本发明这个方面所述的抗体或其抗原结合片段不与包含形成上述表位的两个多肽序列、不是GM-CSF的蛋白交叉反应。应该理解，在抗体-抗原结合的上下文中，结合被认为是“特异的”，其由相互作用性质决定的。因此，“结合GM-CSF的抗体”应解释为特异性结合抗原(即GM-CSF)。
此处使用的术语“抗体”表示4条多肽链，2个重链和2个轻链通过二硫键互相连接的免疫球蛋白分子。单克隆抗体可以通过单克隆或重组技术产生。所述技术在本领域是熟悉的。术语″抗原结合部分″和″抗原结合片段″可互换使用，描述抗体的任何缩短的变体，其优选地展现与抗原(如hGM-CSF)的特异的抗原结合活性。特别地，本发明的片段是指与相应的单克隆抗体在相同的表位结合hGM-CSF的片段。片段可以是，比如说，展现上述特点的Fab片段或任何其他片段。此外，抗体片段还包括单链抗体(scFV)，双特异性抗体，和多特异性抗体，单链抗体中掺入了抗体可变区和互补决定区(CDR)。
此处使用的“生物活性”是生物学活性的同义词。因此，“hGM-CSF生物活性”是如本文所述的体内或基于细胞的分析确定或测定的hGM-CSF的生物学功能。更具体地说，hGM-CSF的生物活性，可以从细胞增殖分析中测得。使用了已知的对hGM-CSF作出反应的细胞系。典型地，对于人细胞系统，将人红白血病细胞系TF-1用于进行增殖分析。TF-1是从红白血病病人建立的细胞系。所述分析在本领域已较好地确立，其基于对GM-CSF刺激的TF-1细胞的细胞增殖的抑制作用。其他细胞系也可能适用。本领域的普通技术人员能够选择合适的分析体系或条件。
TF-1细胞增殖分析在不同浓度的野生型重组人GM-CSF(称作rhGM-CSF)存在下进行。根据这些数据，可以得到剂量-依赖性曲线。在TF-1细胞增殖中，引起80％最大生物学应答所需的GM-CSF浓度在本文中被定义为ED80或ED80。因此，ED80代表最大应答的“80％时的有效剂量”。类似地，在生物分析中，引起一半最大应答所需的GM-CSF浓度表示为ED50或ED50。典型地，利用人GM-CSF依赖的TF-1细胞系，在细胞增殖分析中测得的GM-CSF ED50值为0.02-1ng/ml。
所述分析体系或其他任何类似的分析体系可以用来鉴别或测定hGM-CSF抑制剂或拮抗剂的活性。例如，增殖分析体系可以被用来测定抗hGM-CSF抗体的中和能力。其他测定GM-CSF生物功能的分析例子包括IL-8分泌分析与诱导表面CD11b/Macl分析。
术语“中和作用”，“中和”，“中和的”和类似词语，指对生物活性因子如hGM-CSF的生物活性的抑制作用。因此，具有中和能力或中和活性的抗hGM-CSF抗体是指抗体在生物系统中能够与hGM-CSF结合并拮抗或抵消hGM-CSF的生物活性，比如hGM-CSF在生物系统中如TF-1细胞中的增殖作用，从而实质性抑制或消除hGM-CSF的生物学活性。
术语例如“抑制作用”，“抑制”，“能抑制”和“抑制”意指抑制目标抗原引起的生物活性的5％至100％，但不受它的来源限制。理想情况下，用于治疗目的，对hGM-CSF生物活性的抑制作用应在50％到100％之间。
一般来说，IC50是化合物抑制生物学或生物化学功能的有效性的一个度量。这个定量的度量表明特定的药物或其他制剂(抑制剂)抑制指定的生物过程(或过程中的成分，如酶、细胞、细胞受体或微生物)的一半所需的量。换言之，它是物质最大抑制浓度(IC)的一半(50％)(50％IC，或IC50)。它通常在药理研究中用来作为拮抗药物效力的度量。根据美国食品和药物管理局采用的准则，IC50代表了体外50％抑制所需的药物浓度。
因此，针对hGM-CSF的中和抗体的IC50可以通过构建剂量-反应曲线并检测不同浓度的中和抗体对hGM-CSF增殖活性的抵消作用来测定。对于给定的拮抗剂，IC50值可以通过测定抑制激动剂最大生物反应的一半所需要的浓度计算出。
根据不同的实施方式，每个情况下如在ED80的TF-1的增殖分析中测定的，抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段具有小于20pM，小于25pM，小于30pM，小于40pM，小于50pM，小于60pM，小于70pM，小于80pM，小于90pM或小于100pM。在特定的实施方式中，如在ED80的TF-1的增殖分析中测定的，该抗体或其抗原结合片段具有小于20pM，小于25pM，小于30pM或小于40pM的IC50值。
本发明公开的抗hGM-CSF单克隆抗体包括包含2条重链和2条轻链的免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(简称″HCVR″或″VH″)和重链恒定区(重链恒定区有3个结构域，简称″CH1″、″CH2″和″CH3″)。每条轻链包含轻链可变区(简称″LCVR″或″VL″)和轻链恒定区(轻链恒定区有1个结构域，简称″CL″)。HCVR和LCVR对于抗体的结合特异性特别重要。
可变区的氨基酸序列负责抗体与抗原之间大部分的相互作用。因此，当构建的表达载体在来自具有不同性质的其他抗体的框架序列中具有来自天然抗体的可变区序列时，产生的载体能够表达模拟天然抗体性质的重组抗体。因此，当生产与原抗体具有类似结合特性的完整重组抗体时，没有必要获得特定抗体的全部序列。涵盖可变区的重链和轻链部分序列有时足以实现所述目的。
抗体与目标抗原的相互作用主要是通过LCVR和HCVR的氨基酸残基。因此，可变区氨基酸序列在不同抗体间的变化远多于可变区外的。HCVR和LCVR进一步细分为相对稳定的“框架区(FR)”和超变的“互补决定区(CDR)”。每个HCVR和LCVR各由3个CDR和4个FR组成。从氨基端到羧基端，它们的顺序是FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。
与抗体每个结构域包括超变区，如CDR相对应的氨基酸残基的确定或预测方法是本领域熟知的。常用的方法包括Chothia，AbM和Kabat。
一般来说，抗体与抗原结合的亲和力至少约1×10-7M，并且抗体结合某些抗原的亲和力至少是相比其对非特异抗原(如BSA和酪蛋白)的亲和力的两倍。
对于某一IgG抗体，术语″高亲和力″是指抗体的结合亲和力为至少约1×10-7M，优选至少约1×10-8M，更优选至少1×10-9M，特别优选至少1×10-10M。
″高亲和力″的定义在抗体的同种型间是不同的。例如，IgM同种型具有至少1×10-7M的结合亲和力即定义为高亲和力。
本发明的抗体
正如本文所述，本发明涉及抗人GM-CSF(抗hGM-CSF)单克隆抗体及其片段，其中和hGM-CSF的能力超过针对hGM-CSFB的现有的单克隆抗体(超过目前可利用的单克隆抗体)。可以使用或施用在此描述的所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其片段的一型(type)或种(kind)。
作为选择，超过一型(type)或种(kind)的抗hGM-CSF单克隆抗体可以一起使用或施用。发明人发现，当超过一型或种的抗GM-CSF单克隆抗体一起使用时，它们提供更高的中和活性(例如，更高的细胞生长抑制活性)。此外，一或更多型或种的抗hGM-CSF单克隆抗体或其片段可以与一种或更多种其他的非抗体治疗剂，如小分子，RNAi或肽联合使用或施用。
一方面，提供了识别并特异结合hGM-CSF的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段。此处所述的是与hGM-CSF结合，且展现对hGM-CSF生物活性的中和能力或中和活性的分离的抗hGM-CSF单克隆抗体及其抗原结合片段(与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体及其与hGM-CSF结合的抗原结合片段)。在一个实施方式中是分离的抗hGM-CSF单克隆抗体及其抗原结合片段，其与hGM-CSF结合并展现针对hGM-CSF的中和能力或活性，其中所述单克隆抗体及其抗原结合片段识别：hGM-CSF(SEQ ID NO：1)中的ELYK(SEQ IDNO：2)和TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)。与hGM-CSF结合的分离的抗hGM-CSF单克隆抗体及其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体及其抗原结合片段识别hGM-CSF中的ELYK(SEQ ID NO：2)和TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)，展现对hGM-CSF活性的中和能力或活性且对治疗和预防hGM-CSF过表达相关的疾病、状况或病症是有用的。一个特定的实施方式是与hGM-CSF结合的分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段识别hGM-CSF中的下列不连续的表位，如所定义的(SEQ ID NO：1)，相应于氨基酸：hGM-CSF的77-80位ELYK(SEQ ID NO：2)和hGM-CSF的95-104位TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)。此处所述的分离的抗hGM-CSF单克隆抗体及其抗原结合片段特异地结合hGM-CSF。他们不与GM-CSF以外的蛋白交叉反应。
更特异地，在此描述的是特异地结合hGM-CSF并具有能力中和hGM-CSF的生物活性的单克隆抗体。在此描述的四种这样的抗体被命名为EV1018，EV1019，EV1003和EV1007，总结在实施例的表1和2中。因此，EV1018，EV1019，EV1003和EV1007结合hGM-CSF并能中和hGM-CSF的促生长作用。更详细地显示，EV1018和EV1019抗体识别hGM-CSF蛋白中相同或实质上重叠的表位。
本发明进一步包括抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分具有一氨基酸序列，其中在互补决定区(CDR)中一个或更多个氨基酸被替代、缺失、插入或添加。
在进一步的方面，提供了编码能够结合hGM-CSF并中和hGM-CSF生物活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分的分离的脱氧核糖核酸(DNA)，其特征在于所述分离的DNA编码一氨基酸序列，其包含选自由SEQ ID NO：4-9组成的组的至少一个。
本发明的一个实施方式涉及能够结合hGM-CSF(hGM-CSF)并中和hGM-CSF(hGM-CSF)生物活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于所述抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合部分具有互补决定区(CDR)，其由选自由SEQ ID NO：4-9组成的组的至少一个氨基酸序列表示。
本发明的另一个实施方式涉及能够结合hGM-CSF并中和hGM-CSF生物活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合部分，特征在于所述的抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合部分具有互补决定区(CDR)，其由选自由SEQ ID NO：330-335组成的组中的至少一个氨基酸序列表示。
本发明中，具有由选自由SEQ ID NO：4-9组成的组的一种或更多种氨基酸序列表示的互补决定区(CDR)的抗hGM-CSF单克隆抗体，以及，具有由选自由SEQ ID NO：330-335组成的组的一种或各种氨基酸序列表示的互补决定区(CDR)的抗hGM-CSF单克隆抗体，被认为是不同种的抗hGM-CSF单克隆抗体。
互补决定区(CDR)中一个或更多个氨基酸缺失、取代、插入或增加的单克隆抗体或其抗原结合部分，只要特异结合hGM-CSF并中和其生物活性，会被包括在本发明中。
本发明包括能够结合hGM-CSF并中和hGM-CSF生物活性的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分具有选自下面的组的CDR：
(a)轻链(L链)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：7，
(b)轻链(L链)CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：8，和
(c)轻链(L链)CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：9。
同样地，本发明包括能够结合hGM-CSF并中和hGM-CSF生物活性的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分具有选自下面的组的CDR：
(d)轻链(L链)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：330，
(e)轻链(L链)CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：331，和
(f)轻链(L链)CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：332。
下面的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，当特异结合hGM-CSF并中和其生物活性时，也包括在本发明中：抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其中上述的轻链互补决定区(CDRs)被一个或更多个氨基酸的缺失、替代、插入或添加修饰。
本发明包括能够结合hGM-CSF并中和hGM-CSF生物活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分具有选自下面的组的CDR：
(a)重链(H链)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：4，
(b)重链(H链)CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：5，和
(c)重链(H链)CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：6。
同样地，本发明包括能够结合hGM-CSF并中和hGM-CSF生物活性的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分具有选自下面的组的CDR：
(a)重链(H链)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：333
(b)重链(H链)CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：334，和
(c)重链(H链)CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：335。
下面的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分特异结合hGM-CSF并中和其生物活性时，也包括在本发明中：
抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其中上述的重链互补决定区(CDR)被一个或更多个氨基酸的缺失、替代、插入或添加修饰。
GM-CSF表位
也是此处的主题的是hGM-CSF的表位，所述表位是人GM-CSF的不连续区段，其中所述表位包含人GM-CSF(SEQ ID NO：1)的77-80位氨基酸残基和人GM-CSF(SEQ ID NO：1)的95-104位氨基酸残基，定义为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中所列的多肽序列，被包含SEQ ID NO：4-9或SEQ ID NO：330-335所示的6个不同CDR的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段识别。
如实施例中更详细的描述，单克隆抗体EV1018和EV1019识别的hGM-CSF表位已通过表位作图研究确定。发现，EV1018和EV1019二者识别相同(或实质上重叠)的hGM-CSF抗原位点，其对应于GenBank登录号：NP_000749所确定的77-80和95-104位氨基酸残基。结构研究表明，虽然这两个区段在一级序列上是不连续，但是多肽的两个区段折叠时相互靠近，共同形成构象表位。EV1018和EV1019的CDR序列分析显示出实质的相似性，这与EV1018和EV1019识别相同或实质上重叠的表位的观察结果一致。比较这两个抗体的CDR的肽序列，得到下面的共有序列(如，公式)，代表构成每个CDR的重叠(如，共有)残基：
对于VH-CDR1：FTFSX1X2MH(SEQ ID NO：314)，其中X1是Y或H，且X2是G或A；
对于VH-CDR2：X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO：315)，其中每个Xn互相独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K；
对于VH-CDR3：EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn互相独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G；
对于VL-CDR1：XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO：317)，其中每个Xn互相独立地是任何天然存在的氨基酸，且X11是H或Y；
对于VL-CDR2：GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，且X13是A或P；且
对于VL-CDR3：STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，其中X14是R或S，且X15是V或L。
每个共有公式中，构成相应CDR的氨基酸残基以常用的单字母形式表示。EV1018和EV1019共享的相同残基也被表示出来。
相应地，此处的另一个实施方式是与hGM-CSF结合并展现对hGM-CSF的中和能力或活性的分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含(a)重链或，当为抗体片段时，重链的一部分，其包含(i)含有VH-CDR1的共有序列FTFSX1X2MH(SEQ ID NO：314)，其中X1是Y或H，且X2是G或A，(ii)含有VH-CDR2的共有序列X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO：315)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K，和(iii)含有VH-CDR3的共有序列EXnX9GX10QXnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G；和(b)轻链或，当为抗体片段时，轻链或其一部分，其包含(i)含有VL-CDR1的共有序列XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO：317)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，且X11是H或Y，(ii)含有VL-CDR2的共有序列GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，且X13是A或P，和(iii)含有VL-CDR3的共有序列STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，其中X14是R或S，且X15是V或L；且其中所述的抗体或其片段识别hGM-CSF中的ELYK(SEQ IDNO：2)和TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)。在一个特定的实施方式中，抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段结合hGM-CSF(SEQ ID NO：1)中的下述不连续的表位：ELYK(SEQ ID NO：2)和TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)。
在此描述的另一个实施方式是分离的与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其与hGM-CSF结合的抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含(a)重链，或为抗体片段时，重链的一部分，其包含(i)含有VH-CDR1的共有序列FTFSX1X2MH(SEQ ID NO：314)，其中X1是Y或H，且X2是G或A，(ii)含有VH-CDR2的共有序列X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO：315)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K，和(iii)含有VH-CDR3的共有序列EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G；和(b)轻链，或为抗体片段时，轻链或其一部分，其包含(i)含有VL-CDR1的共有序列XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO：317)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，且X11是H或Y，(ii)含有VL-CDR2的共有序列GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，且X13是A或P，和(iii)含有VL-CDR3的共有序列STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，其中X14是R或S，且X15是V或L；且其中实施抗体或其片段结合hGM-CSF的KD不超过400pM，在另一个实施方式中KD小于160pM，KD是根据实施例11描述的技术测定的。
另一个实施方式中，抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段特征在于，抗hGM-CSF单克隆抗体或它的抗原结合抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段抑制外周血树突状细胞的增殖。因而，进一步的实施方式是分离的与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其与hGM-CSF结合的抗原结合片段，所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其片段包含重链或其一部分和轻链或其一部分。重链或，当为抗体片段时，重链的一部分，可以包含VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3。在一些实施方式中，共有序列表示为式子FTFSX1X2MH(SEQ IDNO：314)，其中X1是Y或H，且X2是G或A，其构成VH-CDR1。类似地，式子X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO：315)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K，表示构成VH-CDR2的共有序列；而式子EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G，表示构成VH-CDR3的共有序列。轻链或，当为抗体片段时，轻链或其一部分可以包含VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3。在所述实施方式中，式子XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQID NO：317)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，且X11是H或Y，表示构成VL-CDR1的共有序列；式子GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，且X13是A或P，表示构成VL-CDR2的共有序列；而式子STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，表示构成VL-CDR3的共有序列。
在任一实施方式中，抗体或其片段中和hGM-CSF活性。在特定的实施方式中，抗hGM-CSF单克隆抗体或其片段中和hGM-CSF活性，使得在如实施例12中所述的TF-1增殖分析的每个例子中，ED80时实施测定的所述抗体或片段在增殖抑制分析中的IC50值小于20pM，小于30pM，小于40pM，小于50pM，小于60pM，小于70pM，小于80pM，小于90pM或小于100pM。在特定的实施方式中，所述的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段在所述的TF-1增殖分析中ED80时测定的IC50值小于40pM或小于30pM。在特定的实施方式中，所述的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段在所述的TF-1增殖分析中ED80时测定的IC50值小于25pM或小于20pM。在进一步的实施方式中，本发明提供了抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段在浓度为约14pM时，当TF-1细胞由hGM-CSF的诱导增殖时，抑制约50％的TF-1细胞增殖。
如实施例中更详细的说明，EV1018和EV1019都有效地中和hGM-CSF生物活性。由于这些抗体实质上共享相同的上述构象表位，有可能使用该表位去筛选识别该表位的其他分子，如单克隆抗体或片段。因此，本发明还涵盖筛选方法，其中如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示多肽序列限定的，被EV1018，EV1019或其变体识别的hGM-CSF表位。这样的方法包括(i)用包含表位的探针筛选生物样品或肽库；(ii)分离特异结合探针的分子；和(iii)鉴定所述分子。在一个实施方式中，所述方法进一步包括生产分子的步骤。一些实施方式中，用所述方法鉴定的分子是抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，探针可以进一步包含可检测的标记，包括但不限于标记物，染料，亲和标签等。根据一些实施方式，例如为了筛选结合分子，探针可固定化。筛选的方法是通常可以获得的，且是技术人员公知的。
在此处所述的任一实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是免疫球蛋白的任何亚型，例如IgG类，如IgG1，IgG2和IgG4。因此，在此处所述的任一实施方式中，重链可以是，例如，属于伽玛类，例如伽玛1(γ1)，伽玛2(γ2)，伽玛3(γ3)，或伽玛4(γ4)。在上述的实施方式中，重链可以选自(重链的氨基酸残基选自)由SEQ ID NO：10-33，38-80和152-245和348-363所示的多肽组成的组。在一些实施方式中，可以用重链的部分，包括重链可变区。本发明所述的重链可变区的非限制性例子在SEQ ID NO：152-159和348-363中提供。
在抗hGM-CSF单克隆抗体及其抗原结合片段中，轻链可以是λ轻链或其部分，或κ轻链或其部分。在特定的实施方式中，λ轻链含有一个或两个下列氨基酸取代：R100G和A153G(含有取代R100G，取代A153G，或取代R100G和A153G)。需要注意的是，抗体链的氨基酸序列中的取代在这里是参照合适的参考氨基酸序列来描述的，从而任何轻链或其片段中位置100和153的指定，应当根据本发明通过比较SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：34来决定，这些氨基酸位置分别相当于与SEQ ID 34序列比较时，SEQ ID NO：35上R被G取代，A被G取代的氨基酸位置。例如，在上述λ轻链可以包含一个或两个所述的氨基酸取代的情况中，参考氨基酸序列是EV1018轻链(EV1018-wt-original；SEQID NO：34)。R100G表示EV1018轻链上第100位的R(精氨酸)被G(甘氨酸)取代；A153G表示EV1018轻链上第153位的A(丙氨酸)被G(甘氨酸)取代。
在特定的实施方式中，轻链选自由(氨基酸残基表示为)SEQ ID NO：34-37和184-221和364-365所列的多肽组成的组。此处所述的轻链可变区的例子提供在SEQ ID NO：184-201和364-365。
轻链可以包含一个所述的氨基酸取代或两个及更多个所述氨基酸取代的组合，以及不实质性损害抗体或其抗原结合片段与hGM-CSF结合并中和其活性的能力的其他氨基酸取代。在一个实施方式中，轻链包含第100位和153位中的一个或全部氨基酸取代，使得这两个位点中的一个或全部糖基化是不可能的。
与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可以包含一个或更多个氨基酸取代，如T97A、T97V、N95D、N95E、N95K、N95Q、N93Q/N95T、K144R、L164A和L165A。需要注意的是，抗体链的氨基酸序列中的取代在这里是参照合适的参考氨基酸序列来描述的。位置决定的原则与上述的R100G和A153G取代的位置决定原则相同。例如，在上述重链可以包含一个或更多个所述的氨基酸取代的情况中，参考氨基酸序列是EV1018重链(EV1018；SEQ ID NO：10)。例如，T97A表示EV1018重链上第97位上的T(苏氨酸)被A(丙氨酸)取代；L164A表示EV1018重链上第164位上的L(亮氨酸)被A(丙氨酸)取代。
重链可以包含一个氨基酸取代或两个及更多个氨基酸取代的组合，以及不实质性损害抗体或其抗原结合片段结合hGM-CSF并中和其活性的能力的其他氨基酸取代。
关于本发明实施方式的进一步的细节概述如下：
在一个实施方式中，重链含有选自以下组成的组的氨基酸取代中一个或更多个，或者一个或组合：Q3E、T97A、T97V、N95D、N95E、N95K、N95Q、N93Q/N95T、K144R、L164A和L165A。在进一步的实施方式中，重链含有一个多个氨基酸取代，选自由Q3E、T97A、T97V、N95D、N95E、N95K、N95Q、N93Q/N95T、K144R、L164A和L165A组成的组，并且轻链含有氨基酸取代R100G和A153G中的一个或两个。
进一步的实施方式是与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其与hGM-CSF结合的抗原结合片段，其中VH-CDR1包含氨基酸残基SYGMH(SEQID NO：4)或SHAMH(SEQ ID NO：333)。
进一步的实施方式是与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其与hGM-CSF结合的抗原结合片段，其中VH-CDR2包含氨基酸残基LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO：5)或VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQID NO：334)。
进一步的实施方式是与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其与hGM-CSF结合的抗原结合片段，其中VH-CDR3包含氨基酸残基ESMGAINDN(SEQ ID NO：6)或EWVGGTCDS(SEQ ID NO：335)。
本发明进一步的实施例如下：
与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其与hGM-CSF结合的抗原结合片段，其中VL-CDR1包含氨基酸残基IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO：7)或SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO：330)；
与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其与hGM-CSF结合的抗原结合片段，其中VL-CDR2包含氨基酸残基GRSPPS(SEQ ID NO：8)或GKSPAS(SEQ ID NO：331)；和
与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其与hGM-CSF结合的抗原结合片段，其中VL-CDR3包含氨基酸残基STWDSSLSAVV(SEQ ID NO：9)或STWDSRLSAVL(SEQ ID NO：332)。
本发明另外的实施方式涉及与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其与hGM-CSF结合的抗原结合片段，其进一步包含信号序列。
信号序列可以是本领域技术人员知道的多种信号序列中的任一个。比如有助于允许或增强编码产物表达和/或传递出产生它的细胞的任何信号序列，包括但不限于选自SEQ ID NO：324，325和326组成的组的信号序列。
在所有的实施方式中，抗hGM-CSF单克隆抗体可以是人抗体，人源化抗体，或单链抗体。
抗体的结合活性
在一个方面中以及意外地，如本公开内容的实施例所示，测得的抗体与抗原(hGM-CSF)的结合亲和力不是与中和能力(如中和hGM-CSF生物活性的能力)线性相关的。这个结果与一般认为的较高的亲和力对应于较高的中和能力是相反的。例如，发现的是，此处公开的抗体即用所述的CDR识别此处所述的表位的抗体，如EV1018，在TF-1分析中，如表7所述，显示出高于现有抗体100倍以上的抑制作用，但是结合亲和力不足现有抗体的50％。这与WO2006/122797中的教导形成对比，WO2006/122797显示抗体越高的亲和力在TF-1分析中有越高的活性。
抗体的中和活性
人外周血单核细胞和肿瘤细胞系TF-1可响应hGM-CSF的刺激而增殖。通过测定对它们增殖的抑制效果，确认抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段的中和活性。众所周知，人外周血单核细胞和TF-1细胞培养在hGM-CSF存在的条件下可增殖。在培养系统中加入本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，或首先使hGM-CSF与本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段反应，然后将其添加至培养系统可抑制这种增殖。例如，与阴性对照(31pg/ml的hlgG)比较，本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，浓度大约2ng/ml(大约14pM)时，作为中和hGM-CSF诱导的TF-1细胞增殖的活性，具有细胞抑制率40-60％(大约50％)。
本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段具有对hGM-CSF的中和能力，所述能力高于现有的抗hGM-CSF单克隆抗体。因此，它有望作为治疗药物，适用于较小量或剂量治疗由hGM-CSF引起的各种疾病，比如变应性皮炎，自身免疫性疾病，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，哮喘，囊性纤维化病，间质性肺病，鼻炎，关节炎和相关关节疾病如类风湿性关节炎，银屑病，髓系白血病，和多发性硬化。
治疗组合物，试剂盒和治疗用途
此处公开的抗hGM-CSF抗体和抗原结合片段中和hGM-CSF的生物活性是有效的，因此，对于治疗受试者中与hGM-CSF异常表达相关(如，由其引起的)医学状况(例如，疾病或病症)是有用的。因此，这些治疗用途也包括在本发明中。
本发明在某些实施方式中提供了治疗在此所述的疾病或状况的方法，包括给患者施用在此描述的抗体或其抗原结合片段，或在此描述的组合物。
此处所用的术语“与hGM-CSF过表达相关的疾病或病症”一般是指“由hGM-CSF引起的疾病”。所述术语应该包含受试者具有GM-CSF时引起和加重病理学的任何疾病。所述术语还包括引起和加重病理生理学的其他疾病。预期抑制GM-CSF的生物学活性可以缓解与升高的GM-CSF相关的疾病症状，和/或可以减缓疾病发展。
此处所用的术语″疾病″、″病症″和″状况″是可以互换的。这些包括但不限于：呼吸道疾病，各种起因的阻塞性肺疾病，各种起因的肺气肿，限制性肺疾病，间质性肺疾病，间质性肺部疾病，囊性纤维化，各种起因的支气管炎，支气管扩张症，成人呼吸窘迫综合征(ARDS)和所有形式的肺水肿；选自下述的阻塞性肺疾病，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，哮喘，支气管哮喘，小儿哮喘，严重哮喘，急性哮喘发作和慢性支气管炎；源于下述的肺气肿，慢性阻塞性肺疾病(COPD)或α1-蛋白酶抑制剂缺陷；限制性肺疾病选自变应性肺泡炎、工作有关的有毒物质所引发的限制性肺疾病如石棉沉着病或硅沉着病、肺部肿瘤所造成的限制，如癌性淋巴管疾病(lymphangiosis carcinomatosa)，细支气管肺泡癌和淋巴瘤；感染引起的肺炎，例如病毒、细菌、真菌、原生动物，蠕虫或其他病原体感染，各种因素如吸入和左心功能不全引起的肺炎，辐射诱发的肺炎或纤维化，胶原性疾病，如红斑狼疮，系统性硬皮病或结节病，肉芽肿病，如Boec氏病，特发性间质性肺炎或特发性肺纤维化(IPF)；粘液粘稠病，细菌或病毒感染引起的支气管炎，变应性支气管炎和毒性支气管炎；支气管扩张；肺水肿，如，吸入有毒物质和外来物后的毒性肺水肿；鼻炎，关节炎及相关关节病，银屑病，髓系白血病，多发性硬化，阿尔茨海默氏症，肾小球肾炎，和慢性特应性皮炎。
这里使用的术语“治疗”通常是指向受试者施用治疗剂，试图获得全部或任何以下结果：施用一种或多种疗法(如GM-CSF抗体)降低或改善人GM-CSF异常表达和/或活性相关的疾病、病症或状况的发展、严重性和/或持续时间，或者改善其一个或更多个症状。
这里使用的术语“治疗有效量”是指疗法(例如，免疫特异地与人GM-CSF结合的抗体)的量，所述量足以降低与人GM-CSF异常表达和/或活性相关联的病症的严重性，缩短人GM-CSF异常表达和/或活性相关联的病症的持续时间，改善人GM-CSF异常表达和/或活性相关联的病症的一个或更多个症状，阻止人GM-CSF异常表达和/或活性相关联的病症的发展，促使人GM-CSF异常表达和/或活性相关联的病症的消退，或增强或促进其他疗法对人GM-CSF异常表达和/或活性相关联的病症的治疗效果。
施用抗hGM-CSF单克隆抗体如施用在此所述的组合物的量，将根据所治疗的状况、疾病或病症，所治疗的受试者(个体)的年龄、性别、健康状况，所治疗的状况、疾病或病症的严重性或发展程度而变化。可以利用已知的方法，并根据受试者的需要凭经验来确定合适的剂量。通常情况下，抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合片段以不超过500毫克/剂的剂量施用给受试者。也可以施用较小的剂量。
在其他实施方式，上面列出的任何抗GM-CSF抗体和片段可以组合。在一些实施方式，2，3，4，5，或者更多种的所述抗GM-CSF抗体，片段或其组合可以被组合。
在一些实施方式中，上述任何的实施方式可以进一步组合一或更多种过去已知的抗GM-CSF的抗体，片段，或其组合。
另一个实施方式是包含(一种，至少一种)在此所述的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。在一个实施方式中，治疗组合物包含一种或更多种抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合片段，和药学上可接受的载体，所述的单克隆抗体或抗原结合片段识别hGM-CSF上的ELYK(SEQ ID NO：2)和TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)。治疗组合物可以个别地(一种治疗用组合物中包含一种或一型抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段)或组合地包含任何在此描述的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，如两种/型或多种/型抗hGM-CSF单克隆抗体的组合；两种/型或多种/型其抗原结合片段的组合；一种/型或多种/型抗hGM-CSF单克隆抗体和一种/型或多种/型其抗原结合片段的组合；一种/型或多种/型抗hGM-CSF单克隆抗体和两种/型或多种/型其抗原结合片段的组合；或两种/型或多种/型抗hGM-CSF单克隆抗体和一种/型或多种/型其抗原结合片段的组合。
特定的实施方式是包含(一种或超过一种)与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的治疗组合物，抗体或其抗原结合片段包含(a)重链或，当为抗体片段时，重链的一部分，其包含(i)含有VH-CDR1的共有序列FTFSX1X2MH(SEQ ID NO：314)，其中X1是Y或H，且X2是G或A，(ii)含有VH-CDR2的共有序列X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO：315)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K，和(iii)含有VH-CDR3的共有序列EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G；和(b)轻链或，当为抗体片段时，轻链或其一部分，其包含(i)含有VL-CDR1的共有序列XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO：317)其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，且X11是H或Y，(ii)含有VL-CDR2的共有序列GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，且X13是A或P，和(iii)含有VL-CDR3的共有序列STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，其中X14是R或S，且X15是V或L，其中所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其片识别hGM-CSF中的ELYK(SEQ ID NO：2)和TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)。
此处所述的组合物包含两种或更多种与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体，两种或更多种其与hGM-CSF结合的抗原结合片段，或者它们的组合，以及药学上可接受的载体，其中一种或多种抗hGM-CSF单克隆抗体或一种或多种其抗原结合片段识别hGM-CSF中的不连续表位ELYK(SEQ ID NO：2)和TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)。
此处所述的进一步的实施方式是包含两种或更多种与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体，两种或更多种其抗原结合片段或者其它们的组合，和药学上可接受载体的组合物，其中一种或多种抗体或一种或多种其抗原结合片段包含：(a)重链或，当为抗体片段时，重链的一部分，其包含(i)含有VH-CDR1的共有序列FTFSX1X2MH(SEQ ID NO：314)，其中X1是Y或H，且X2是G或A，(ii)含有VH-CDR2的共有序列X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQID NO：315)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K，和(iii)含有VH-CDR3的共有序列EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G；和(b)轻链或，当为抗体片段时，轻链或其一部分，其包含(i)含有VL-CDR1的共有序列XnGNXnXnNIGSXnAVG(SEQ ID NO：317)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，且Xn是H或Y，(ii)含有VL-CDR2的共有序列GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，且X13是A或P，且(iii)含有VL-CDR3的共有序列STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，其中X14是R或S，且X15是V或L，其中所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其片段识别hGM-CSF中的ELYK(SEQ ID NO：2)和TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)。
在此描述的进一步的主题是组合物，其中两种或更多种与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体中的至少一种包含选自SEQ ID NO：10-33，38-80，152-183，34-37，184-221，222-245，320-323和348-365组成的组中的多肽。组合物除了包括一种或多种在此描述的抗hGM-CSF单克隆抗体外，可包括其他的抗hGM-CSF单克隆抗体，例如以前被描述过的抗hGM-CSF单克隆抗体。参见：例如，PCT申请，国际公开号WO2006/122797；PCT申请，国际公开号WO2007/092939；和PCT申请，国际公开号WO 2006/11353。
试剂盒
此处公开的抗hGM-CSF抗体或其抗原结合片段及包含这样的抗体的组合物，可以作为试剂盒提供，也包括在本发明中。试剂盒，可以以各种形式提供，除了药物(治疗组合物)，还可以包括药物或设备的包装和/或标签，所述标签信息通常来自于医生的处方。试剂盒通常包括印制的使用说明书。在一些实施方式中，配制的组合物(如，药剂)在一个或更多个容器里提供。在一些实施方式中，容器可以是用来分发药剂以进行施用的装置。例如，在本发明的药物可预先测量(例如，等分)入单次使用分配器中并以试剂盒的形式提供。在某些情况下，容器是注射器。注射器可选地是预装的。在某些情况下，单次使用的容器是预装的，预封的和一次性的。根据特定药物的施药途径和施药方式，试剂盒可包括合适的组件。
药剂
此处使用的“药剂可接受的载体”包括任何或所有的生理相容溶液，分散介质，涂层剂，抗菌剂或抗真菌剂，渗透压调节剂，和吸收延缓剂。药剂可接受的载体的例子包括一种或多种制剂诸如水，盐溶液，磷酸盐缓冲盐水，葡萄糖，甘油和乙醇及其组合。在许多情况下，渗透压调节剂，如糖，多元醇或氯化钠优选地包含在组合物中。所述多元醇可以包括甘露醇或山梨醇。此外药剂可接受的载体可以包括少量的辅助物质，如保湿剂，乳化剂，防腐剂，和缓冲剂。所述辅助物质可增强组合物中抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段的保存或有效性。
适合胃肠外施用的药物组合物可以在其中掺入本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合片段。优选地，当施用一种抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段时，所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段被调整成含有浓度为0.1-250mg/mL的抗体的可注射溶液。另一方面，当多种抗体被混合并应用时，抗体优选地调整为含有浓度为0.001-10mg/mL的抗体的注射液。此外，多种抗体，可按任何比例任意混合。
液体剂型或冻干剂型形成的可注射溶液可以在火石或琥珀管形瓶，安瓿，或预装式注射器中制备。可以使用pH 15.0-7.0(pH值6.0最合适)的L-组氨酸缓冲试剂。L-组氨酸的浓度为5-10mM可能是最适合的。适用于缓冲试剂的其他试剂，可以是琥珀酸钠，柠檬酸钠，磷酸钠，或磷酸钾，但不限于它们。在0-300mM的浓度下，氯化钠可用于缓冲剂，以去除溶液的毒性(对于液体中形成的剂型，150mM是最合适的浓度)。冻干剂型可包括冷冻保护剂，主要是比例为0-10％的蔗糖(比例为0.5-1.0％可能是最合适的)。其他合适的冷冻保护剂，可以是海藻糖和乳糖。冻干剂型可包括膨胀剂，主要包括比例为1-10％(2-4％的比例可能是最适合)的甘露醇。主要是L-甲硫氨酸，在1-50mM(5-10mM可能最适合)，可应用于液体或冻干两种剂型作为稳定剂。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸和精氨酸。可以包含比例为0-0.05％(0.005-0.01％的比例可能是最合适的)的聚山梨醇酯80，作为表面活性剂。其他表面活性剂包括聚山梨醇酯20和BRJJ表面活性剂，但不限于它们。
各种剂型可用于本发明的组合物。例如，组合物的剂型可以有液态，半固态，固态。溶液(例如，可注射或可输液溶液)，分散液，悬浮液，片剂，丸剂，粉剂，脂质体和栓剂均包括在内。优选地，剂型取决于施用方法和治疗实例。优选地，组合物具有能够注射和输液的液体剂型。所述组合物优选地可以用于胃肠外施用(例如，静脉内施用，皮下施用，腹部施用和肌肉内施用)。在优选的实施方式中，抗体通过静脉输液或静脉注射施用。在另一优选的实施方式中，抗体通过肌肉注射或皮下注射施用。
所述治疗用组合物通常应该在经灭菌的稳定条件下生产和储存。组合物可以以溶液，微乳液，分散液，脂质体或适合于高药物浓度的其他结构来开处方。可注射的经灭菌溶液通过以下程序制备。所需量的活性化合物(特别地，抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段)混合于合适的溶剂中。如果需要，上述化合物中的一种或其组合与活性化合物一起混合在合适的溶剂中，然后通过过滤灭菌，从而制备出溶液。通常，基本分散介质和活性化合物混合在经灭菌的媒介中，所述媒介包括来自上述介质的其他所需化合物。当用经灭菌的冻干粉来制备经灭菌的注射溶液时，优选使用真空干燥法和喷雾干燥法作为制备方法。通过所述制备方法，由活性成分粉末和用于过滤的经灭菌的溶液得到需要的其他任何组合物。溶液的流动性通过以下方式适当地维持。所述方法为，例如，采用涂层材料如卵磷脂保持分散液所需的颗粒大小，以及使用表面活性剂。组合物中还包括药用吸收延缓剂，如单硬脂酸和明胶，藉此可注射组合物在人体内可以维持较长的吸收时间。
本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段可以通过本领域已知的多种方法施用。如皮下注射、静脉注射或输液等施药途径/方法优选地应用于各种疗法中。施药途径/方法取决于期望的结果。本领域技术人员理解植入物、皮肤敷贴和药物投递系统包含在所述的施用途径/方法中。在一个实施方式中，抗体如控制释放试剂，其可以控制化合物的释放，也与制品中的活性化合物一起应用。生物相容聚合物具有生物可降解性。所述制品可包括生物相容聚合物如乙烯醋酸乙烯，聚酸酐，聚羟基乙酸，胶原蛋白，聚原酸酯(polyortito esters)，和聚乳酸。制备这些药剂的多种方法已被授予专利权，且被本领域技术人员公知。
在一个实施方式中抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段是与，例如，没有活性的稀释剂或可食用且可吸收的载体一起口服施用的。化合物(如果需要，其他成分)也可以被封装在硬或软胶囊中，压缩在片剂中，或直接混合在给患者的食品中。治疗中口服施用时，所述化合物可混合在赋形剂中，然后以片剂，含片，糖锭，胶囊剂，酏剂，悬浮液，糖浆和扁丸(oblate)等可摄食的形式使用。为了通过胃肠外途径以外的途径施用本发明的化合物，有必要用阻止其失活的材料包被所述化合物，并同时施用化合物和所述材料。
联合疗法
也可以在组合物中补充掺入另外的活性成分，所述另外的活性成分不包括针对非GM-CSF的抗原的抗体。在一个实施方式中，本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段与一种或多种其他的用于治疗升高水平GM-CSF相关疾病的治疗剂一起处方，或者与其他治疗剂同时施用，其中所述其他治疗剂不是针对GM-CSF以外的蛋白质的抗体。例如，本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段与一种或多种其他抗GM-CSF抗体共同处方。所述联合疗法的优点在于少量治疗剂即有效。这种治疗剂能避免单药治疗中可能伴随的毒性或并发症。
此处所用的″同时施用″应该被广义地理解。比如，当两种或更多种抗GM-CSF单克隆抗体或抗原结合片段施用给患者时，每一种或一些所述抗体或其片段可以或可以不以单一药剂(如，组合物)的形式提供。在一些实施方式中，单一药剂(如，组合物)包含施用给受试者的所有的不同种类的抗GM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，从而使得所述抗体或其抗原结合片段以混合物同时提供给患者。然而，在一些实施方式中，包含一种或多种抗体或抗原结合片段的两种或更多种药剂(如，组合物)分别施用给受试者。当“分别”施用时，药剂可按顺序如一种接一种的施用。只要第一次施药和接下来施药(第二、第三次)在受试者中药效的时间重叠，靶向组织/细胞重叠，从而实现了增强的(如协同的)结果，就可以被认为是“同时”施用。
特别地，当施用超过一种本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体时，它可能提供细胞生长抑制活性(中和活性)，其远高于药用组合物中一种单克隆抗体提供的活性。因此，可能以更小的量提供所需的治疗剂。
相应地，提供了增强活性的方法，其特征在于两种或更多种抗GM-CSF单克隆抗体同时施用，或药用组合物或兽药组合物，其特征在于包含了两种或更多种抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，所述两种或更多种抗体选自以下(a)和(b)：
(a)抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异于hGM-CSF，具有SEQ ID NO：4至9，SEQ ID NO：330至335，SEQ ID NO：336至341，或SEQ ID NO：342至347的氨基酸序列所示互补决定区(CDR)
(b)(a)的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其具有其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且所述抗体或其抗原结合片段特异于hGM-CSF。
同样地，本发明也包括增强活性的方法，其特征在于多种不同(此后描述为多种)的本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体被同时施用，或者包含多种本发明的抗hGM-CSF抗体的药用组合物或兽药组合物。
在任何实施方式中，所述组合物可以包含一种或型能够中和hGM-CSF活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段。作为选择，在任何实施方式中，所述组合物可以包含两种或型或者更多种或型能够中和hGM-CSF活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段。这样的组合物中的单克隆抗体和/或其片段除了包括此处公开的一种或多种抗体或其片段外，还可以包括先前公开的抗hGM-CSF单克隆抗体和/或其片段。抗hGM-CSF单克隆抗体及其抗原结合片段，和包含这样的抗体和/或其抗原结合片段的治疗组合物，药用组合物和药物组合物可以用来治疗或预防由hGM-CSF引起和/或与其过表达(相对于对照——例如，没有状况、疾病或病症的个体——的hGM-CSF的表达水平)相关的疾病、病症或状况。
在抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段中包含药学上可接受的载体的药用组合物被认为对于hGM-CSF引起的疾病是有效的。可列举hGM-CSF过量产生引起的疾病，如：
(a)变应性疾病，如哮喘，特应性，和花粉症，
(b)移植物排斥，移植物抗宿主病(GVHD)和
(c)自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎。
无意将其限制到任何特定的机制，相信GM-CSF的过表达至少部分地引起一系列疾病或病症，例如在此列出的那些。不过，这样的临床状况也可能是其他相关的生物途径受损引起的，如相应受体的上调，或一种或多种效应物途径中的突变。因此，“hGM-CSF过表达相关疾病或病症”应包括导致与hGM-CSF的过表达结果相同的状况。
制造/制备
在一个实施方式中本发明是在此公开用于药物的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段。
抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，如在此描述的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，在制造或制备用于治疗hGM-CSF过表达(GM-CSF引起的水平)相关疾病或病症的药物中的用途，也是本发明的实施方式，其中所述抗体或其抗原结合片段结合hGM-CSF并能够中和hGM-CSF活性。这样的抗hGM-CSF单克隆抗体和其抗原结合片段可以是在此描述的任何抗hGM-CSF单克隆抗体和其抗原结合片段。
进一步的实施方式是识别hGM-CSF中的ELYK(SEQ ID NO：2)和TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)的抗体或其抗原结合片段在制造或制备药物中的用途。
进一步的实施方式是抗hGM-CSF单克隆抗体和/或其抗原结合片段生产或制备药物的用途，其中，所述抗体或其片段包含(a)重链或，当为抗体片段时，重链的一部分，其包含(i)含有VH-CDR1的共有序列FTFSX1X2MH(SEQ IDNO：314)，其中X1是Y或H，且X2是G或A，(ii)含有VH-CDR2的共有序列X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO：315)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K，和(iii)含有VH-CDR3的共有序列EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G；和(b)轻链或，当为抗体片段时，轻链或其一部分，其包含(i)含有VL-CDR1的共有序列XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO：317)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，且X11是H或Y，(ii)含有VL-CDR2的共有序列GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，且X13是A或P，和(iii)含有VL-CDR3的共有序列STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，其中X14是R或S，且X15是V或L。
进一步的方面，本发明提供了分离的可用于制备药物的抗hGM-CSF抗体或该抗体的抗原结合片段。这些药物可用于治疗与hGM-CSF异常表达(如过表达)相关的疾病、状况或病症。在此描述的任何抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段可以用于制备所述治疗目的的药物。
所述抗体或抗原结合片段识别hGM-CSF中的ELYK(SEQ ID NO：2)和TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含(a)重链或，当为抗体片段时，重链的一部分，其包含(i)含有VH-CDR1的共有序列FTFSX1X2MH(SEQ ID NO：314)，其中X1是Y或H，且X2是G或A，(ii)含有VH-CDR2的共有序列X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO：315)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K，和(iii)含有VH-CDR3的共有序列EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G；和(b)轻链或，当为抗体片段时，轻链或其一部分，其包含(i)含有VL-CDR1的共有序列XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO：317)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，且X11是H或Y，(ii)含有VL-CDR2的共有序列GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，且X13是A或P，和(iii)含有VL-CDR3的共有序列STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，其中X14是R或S，且X15是V或L。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合hGM-CSF，其KD不超过400pM，在另一个实施方式中小于约160pM(如EV1018或EV1019)，其中KD根据实施例中描述的技术测定。
在其他实施方式中，上文所列的任何抗GM-CSF抗体和片段可以组合。在一些实施方式中，2，3，4，5种或更多这样的抗GM-CSF抗体、其片段或其组合可以组合。
抗体和片段、DNA和载体的产生
下面描述的是识别本发明提供的不连续表位的初始抗体(originator antibody)的产生；但不应该理解为限制到所述特定的方法。所述的特征在本技术领域可以被取代，而不超出本发明的范围。
本发明的抗hGM-CSF单克隆抗体和其抗原结合部分是经过以下步骤，从来自特发性肺泡蛋白沉积症患者的血液中得到：分离细胞克隆以产生抗体，从得到的抗体产生细胞库中选择抗体阳性细胞，并通过亲和纯化来纯化从抗体阳性细胞上清液中获得的抗体。
1)分离抗hGM-CSF的完全人抗体产生细胞克隆
B淋巴细胞是从患有特发性肺泡蛋白沉积症(IPAP)且血清中存在高水平的抗hGM-CSF单克隆抗体的病人血液中分离出来的。然后，诱导B淋巴细胞增殖。诱导其增殖的方法是公知的。例如，在转化方法中(D.Kozbor等)用癌症的诱导因子，“EB病毒”(以下简称为EBV)来诱导细胞增殖。更具体地，EBV感染B淋巴细胞并诱导其增殖。保存增殖的细胞作为抗体产生细胞库。
2)从抗体产生细胞库分离单克隆抗体。
用生产单克隆抗体中已知的常用方法，将单克隆细胞从诱导增殖的细胞中筛选出来。
从抗体产生细胞库中选出淋巴细胞，以生产结合hGM-CSF的抗体。更具体地说，通过有限稀释法选择细胞群(克隆)，所述细胞群(克隆)产生结合hGM-CSF的抗体。优选的是采用ELISA法使用hGM-CSF和标记的小鼠抗hlgG抗体检测结合hGM-CSF的片段。通过培养选定的抗体阳性细胞并且对它们进行反复筛选，获得只产生所需抗体的细胞群(克隆)。“分离抗体产生细胞克隆”之前的步骤显示在图1的流程图中。
3)使用蛋白A或蛋白G亲和纯化
当纯化抗hGM-CSF单克隆抗体时，可以将选出的永生化细胞培养于滚瓶(roller bottle)，2升旋转瓶(spinner flask)，或其他培养系统。过滤并浓缩上清液。然后，用蛋白A-琼脂糖凝胶或蛋白G-琼脂糖凝胶等(New Jersey，Piscataway，Pharmacia Corp.)，亲和层析纯化蛋白质。将缓冲溶液交换为PBS后，通过280nm下测定OD确定蛋白质的浓度，或者优选用比浊计分析。抗体的同种型通过其对不同同种型抗原的抗原特异性方法来检验。
得到的抗hGM-CSF单克隆抗体是由人体内敏化的B淋巴细胞产生的纯粹的人抗体，因而所述抗hGM-CSF单克隆抗体很少表现出对抗体的免疫反应。当抗体生产细胞被克隆时，B淋巴细胞用EB病毒感染，通过EB病毒活性诱导其增殖。因此，其特征在于，抗体产生细胞通过利用这样的EB病毒活性来克隆。EB病毒方法的优势在于在人体内生产天然抗体，优势还在于获得高亲和力的抗体。例如，抗hGM-CSF单克隆抗体的亲和力是人工免疫的小鼠产生的抗体亲和力的10-100倍。文库包括通过EB病毒感染增殖的一组B淋巴细胞。有可能从文库中分离出特定的抗体生成细胞克隆，并获得人抗体。
如上所述，描述的特征在本领域可以被取代或改变，而不超出本发明的范围。核酸，载体以及宿主细胞可以表达本发明中的重组抗体或其抗原结合部分。这些也包括在本发明中。
下面的表中显示的是EV1018的重链变体和轻链变体以及EV1019的重链变体和轻链变体。表中分别提供了EV1018的重链变体和轻链变体以及EV1019的重链变体和轻链变体，使得鉴定EV1018和EV1019每一个的重链和轻链的所有可能的组合成为可能。本领域普通技术人员使用本领域已知的方法和此处提供的信息，能够产生任一组合。
在进一步的方面，此处公开了产生抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段的过程(方法)。通常，产生抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段的方法包括得到或产生DNA，所述DNA基本上由编码免疫球蛋白的DNA组成，所述免疫球蛋白由重链和轻链或Fab区组成；产生的DNA以可操作地连接到合适启动子的方式，插入可复制的表达载体，从而产生出载体，所述载体包含可操作地连接到合适启动子的DNA；将所述载体导入宿主细胞，从而生产出包含所述载体的宿主细胞；在适合DNA表达及其编码的肽和抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合片段产生的条件下培养宿主细胞。得到的抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合片段可以用本领域已知的方法从宿主细胞或宿主细胞培养物回收出来。
更具体地，所述过程包括在宿主细胞中至少产生VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3，以及VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3。所述方法包括将编码VH-CDR1，VH-CDR2，VH-CDR3，VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3的DNA导入合适的宿主细胞，将得到的宿主细胞(含有编码VH-CDR1，VH-CDR2，VH-CDR3，VL-CDR1，VL-CDR2，VL-CDR3的DNA的宿主细胞)维持在适合DNA表达(编码的肽产生)以及抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合片段形成和装配的条件下，从而产生抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合片段。在特定的实施方式中，抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段包括(a)重链或，当为抗体片段时，重链的一部分，其包含(i)含有VH-CDR1的共有序列FTFSX1X2MH(SEQ ID NO：314)，其中X1是Y或H，且X2是G或A，(ii)含有VH-CDR2的共有序列X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO：315)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K，和(iii)含有VH-CDR3的共有序列EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G；和(b)轻链或，当为抗体片段时，轻链或其一部分，其包含(i)含有VL-CDR1的共有序列XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO：317)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，且X11是H或Y，(ii)含有VL-CDR2的共有序列GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，且X13是A或P，和(iii)含有VL-CDR3的共有序列STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，其中X14是R或S，且X15是V或L；且产生的抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合片段结合hGM-CSF。编码VH-CDR1，VH-CDR2，VH-CDR3，VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3的DNA可以是一个或多个单元(如，一个DNA编码所有的VH/VL元件，不同的DNA编码一些或所有的元件)。
例如，第一DNA可编码完整的重链重链，第二DNA可编码完整的轻链。完整的重链可以选自SEQ ID NO：10-33，38-80和160-183；222-245，320和322组成的组，而完整的轻链可以选自SEQ ID NO：34-37，202-221，321和323组成的组。在一个实施方式中，完整的重链选自SEQ ID NO：10-33，38-80和160-183；222-245，320和322组成的组，完整的轻链选自SEQ ID NO：34-37，202-221，321和323组成的组。
所述过程进一步包括分离抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段。
下述载体也是此处的主题，所述载体包含编码VH-CDR1，和/或VH-CDR2，和/或VH-CDR3的DNA。VH-CDR1是SYGMH(SEQ ID NO：4)或SHAMH(SEQ ID NO：333)，VH-CDR2是LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO：5)或VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO：334)，而VH-CDR3是ESMGATNDN(SEQ ID NO：6)或EWVGGTCDS(SEQ ID NO：335)。
下述载体也是此处的主题，所述载体包含编码VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3的DNA，其中VL-CDR1是IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO：7)或SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO：330)，VL-CDR2是GRSPPS(SEQ ID NO：8)或GKSPAS(SEQ ID NO：331)，而VL-CDR3是STWDSSLSAVV(SEQ ID NO：9)或STWDSRLSAVL(SEQ ID NO：332)。
例如，在蛋白成熟过程中重链和轻链的前导序列被切掉。切掉的前导序列对最终的抗体性质没有影响。为了补足缺失的序列，克隆的cDNA通过连接或PCR扩增的方法与合成的寡核苷酸整合。术语″前导序列″和″信号序列″此处可以互换。
在另外一个过程中，整个可变区是用一对短的重叠寡核苷酸合成的，然后通过PCR扩增方法扩增由此得到的核苷酸，从而完整获得可变区的人工克隆。
本发明的另一方面涉及分离的脱氧核糖核酸(DNA)，其编码能够结合hGM-CSF并中和hGM-CSF活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的DNA包含编码氨基酸的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含选自SEQ ID NO：4至9中的至少一个。本发明还包括分离的DNA，其中核苷酸序列编码氨基酸序列，其至少包含选自SEQ ID NO：330至335组成的组中的一个。
当分离的脱氧核糖核酸(DNA)编码能够结合hGM-CSF并中和hGM-CSF生物活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段时，下面的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段也包含在本发明中：
能够在严格条件下与上述DNA杂交的分离的DNA。
下面的载体和宿主细胞也包括在本发明中：
1)掺有分离的DNA的载体。
2)有重组表达载体整合的宿主细胞。
此外，还可能通过表达多种scFv(可变区单链片段)抗体获得特定抗体，所述scFv抗体通过人工改组(shuffling)VH和VL基因以噬菌体融合蛋白形式制备，利用最近开发的噬菌体展示技术，所述技术利用遗传工程技术在噬菌体表面表达重组抗体。
可以通过本领域技术人员知道的任何方法得到本发明的抗体片段，例如，片段的重组表达，所述片段由编码抗体的DNA的截短的形式编码，或通过蛋白水解抗体氨基酸链，本领域技术人员藉由应用标准的生物学分析，如本发明所述的分析，来确定哪些片段维持了抗原结合功能或中和活性。
本发明的特定抗体
本发明提供了EV1018抗体本身和EV1018抗体的多种变化(如，变体)，总结在表A中。在某些实施方式中，重链含有相对于野生型重链序列一处或多处氨基酸取代。在一些实施方式中，轻链含有相对于野生型EV1018轻链序列一处或多处氨基酸取代。在一些实施方式中，重链和轻链各自含有一处或多处氨基酸取代。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，EV1018-wt-original(SEQ ID NO：34)，和下述的重链变体之一：EV1018(SEQ ID NO：10)，EV1018-wt-IgG1KO(SEQ ID NO：11)，EV1018-T97A-IgG1KO(SEQ ID NO：12)，EV1018-T97V-IgG1KO(SEQ ID NO：13)，EV1018-N95D-IgG1KO(SEQID NO：14)，EV1018-N95E IgG1KO(SEQ ID NO：15)，EV1018-N95K IgG1KO(SEQ ID NO：16)，EV1018-N95Q IgG1KO(SEQ ID NO：17)，EV1018-N93Q-N95T IgG1KO(SEQ ID NO：18)，EV1018-wt IgG1-BI(SEQ IDNO：19)，EV1018-T97A IgG1-BI(SEQ ID NO：20)，EV1018-T97V IgG1-BI(SEQ ID NO：21)，EV1018-N95D IgG1-BI(SEQ ID NO：22)，EV1018-N95EIgG1-BI(SEQ ID NO：23)，EV1018-N95K IgG1-BI(SEQ ID NO：24)，EV1018-N95Q IgG1-BI(SEQ ID NO：25)，EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI(SEQID NO：26)，EV1018-T97A IgG1-original-constant(SEQ ID NO：27)，EV1018-T97V IgG1-original-constant(SEQ ID NO：28)，EV1018-N95DIgG1-original-constant(SEQ ID NO：29)，EV1018-N95E IgG1-original-constant(SEQ ID NO：30)，EV1018-N95K IgG1-original-constant(SEQ ID NO：31)，EV1018-N95Q IgG1-original-constant(SEQ ID NO：32)，EV1018-N93Q-N95TIgG1-original-constant(SEQ ID NO：33)，EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL(SEQ IDNO：38)，EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：39)，EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：40)，EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：41)EV1018-N95EIgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：42)，EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：43)，EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：44)，EV1018-N93Q-N95TIgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：45)，EV1018-wt IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：46)，EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：47)，EV1018-T97VIgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：48)，EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：49)，EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：50)，EV1018-N95KIgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：51)，EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：52)，EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：53)，EV1018-IgG2(SEQID NO：54)，EV1018-wt-IgG2(SEQ ID NO：55)，EV1018-T97A-IgG2(SEQ IDNO：56)，EV1018-T97V-IgG2(SEQ ID NO：57)，EV1018-N95D-IgG2(SEQ IDNO：58)，EV1018-N95E-IgG2(SEQ ID NO：59)，EV1018-N95K-IgG2(SEQ IDNO：60)，EV1018-N95Q-IgG2(SEQ ID NO：61)，EV1018-N93Q-N95T-IgG2(SEQ ID NO：62)，EV1018-IgG4(SEQ ID NO：63)，EV1018-wt-IgG4(SEQ IDNO：64)，EV1018-T97A-IgG4(SEQ ID NO：65)，EV1018-T97V-IgG4(SEQ IDNO：66)，EV1018-N95D-IgG4(SEQ ID NO：67)，EV1018-N95E-IgG4(SEQID NO：68)，EV1018-N95K-IgG4(SEQ ID NO：69)，EV1018-N95Q-IgG4(SEQID NO：70)，EV1018-N93Q-N95T-IgG4(SEQ ID NO：71)，EV1018-IgG4-SP(SEQ ID NO：72)，EV1018-wt-IgG4-SP(SEQ ID NO：73)，EV1018-T97A-IgG4-SP(SEQ ID NO：74)，EV1018-T97V-IgG4-SP(SEQ ID NO：75)，EV1018-N95D-IgG4-SP(SEQ ID NO：76)，EV1018-N95E-IgG4-SP(SEQ ID NO：77)，EV1018-N95K-IgG4-SP(SEQ ID NO：78)，EV1018-N95Q-IgG4-SP(SEQID NO：79)和EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP(SEQ ID NO：80)。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，EV1018-wt-BI(SEQID NO：35)，和下面的重链变体之一：EV1018(SEQ ID NO：10)，EV1018-wt-IgG1KO(SEQ ID NO：11)，EV1018-T97A-IgG1KO(SEQ ID NO：12)，EV1018-T97V-IgG1KO(SEQ ID NO：13)，EV1018-N95D-IgG1KO(SEQID NO：14)，EV1018-N95E IgG1KO(SEQ ID NO：15)，EV1018-N95K IgG1KO(SEQ ID NO：16)，EV1018-N95Q IgG1KO(SEQ ID NO：17)，EV1018-N93Q-N95T IgG1KO(SEQ ID NO：18)，EV1018-wtIgG1-BI(SEQ IDNO：19)，EV1018-T97A IgG1-BI(SEQ ID NO：20)，EV1018-T97V IgG1-BI(SEQ ID NO：21)，EV1018-N95D IgG1-BI(SEQ ID NO：22)，EV1018-N95EIgG1-BI(SEQ ID NO：23)，EV1018-N95K IgG1-BI(SEQ ID NO：24)，EV1018-N95Q IgG1-BI(SEQ ID NO：25)，EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI(SEQID NO：26)，EV1018-T97A IgG1-original-constant(SEQ ID NO：27)，EV1018-T97V IgG1-original-constant(SEQ ID NO：28)，EV1018-N95DIgG1-original-constant(SEQ ID NO：29)，EV1018-N95E IgG1-original-constant(SEQ ID NO：30)，EV1018-N95K IgG1-original-constant(SEQ ID NO：31)，EV1018-N95Q IgG1-original-constant(SEQ ID NO：32)，EV1018-N93Q-N95TIgG1-original-constant(SEQ ID NO：33)，EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL(SEQ IDNO：38)，EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：39)，EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：40)，EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL(SEQ IDNO：41)，EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：42)，EV1018-N95KIgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：43)，EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：44)，EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：45)，EV1018-wtIgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：46)，EV1018-T97AIgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：47)，EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：48)，EV1018-N95DIgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：49)，EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：50)，EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：51)，EV1018-N95QIgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：52)，EV1018-N93Q-N95TIgG1-QVQL-BI(SEQID NO：53)，EV1018-IgG2(SEQ ID NO：54)，EV1018-wt-IgG2(SEQ ID NO：55)，EV1018-T97A-IgG2(SEQ ID NO：56)，EV1018-T97V-IgG2(SEQ ID NO：57)，EV1018-N95D-IgG2(SEQ ID NO：58)，EV1018-N95E-IgG2(SEQ ID NO：59)，EV1018-N95K-IgG2(SEQ ID NO：60)，EV1018-N95Q-IgG2(SEQ ID NO：61)，EV1018-N93Q-N95T-IgG2(SEQ ID NO：62)，EV1018-IgG4(SEQ ID NO：63)，EV1018-wt-IgG4(SEQ ID NO：64)，EV1018-T97A-IgG4(SEQ ID NO：65)，EV1018-T97V-IgG4(SEQ ID NO：66)，EV1018-N95D-IgG4(SEQ ID NO：67)，EV1018-N95E-IgG4(SEQ ID NO：68)，EV1018-N95K-IgG4(SEQ ID NO：69)，EV1018-N95Q-IgG4(SEQ ID NO：70)，EV1018-N93Q-N95T-IgG4(SEQID NO：71)，EV1018-IgG4-SP(SEQ ID NO：72)，EV1018-wt-IgG4-SP(SEQ IDNO：73)，EV1018-T97A-IgG4-SP(SEQ ID NO：74)，EV1018-T97V-IgG4-SP(SEQ ID NO：75)，EV1018-N95D-IgG4-SP(SEQ ID NO：76)，EV1018-N95E-IgG4-SP(SEQ ID NO：77)，EV1018-N95K-IgG4-SP(SEQ ID NO：78)，EV1018-N95Q-IgG4-SP(SEQ ID NO：79)和EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP(SEQ ID NO：80)。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，EV1018-wt-BI2(G1)(SEQ ID NO：36)，和下述重链变体之一：EV1018(SEQ ID NO：10)，EV1018-wt-IgG1KO(SEQ ID NO：11)，EV1018-T97A-IgG1KO(SEQ ID NO：12)，EV1018-T97V-IgG1KO(SEQ ID NO：13)，EV1018-N95D-IgG1KO(SEQID NO：14)，EV1018-N95E IgG1KO(SEQ ID NO：15)，EV1018-N95K IgG1KO(SEQ ID NO：16)，EV1018-N95Q IgG1KO(SEQ ID NO：17)，EV1018-N93Q-N95T IgG1KO(SEQ ID NO：18)，EV1018-wt IgG1-BI(SEQ IDNO：19)，EV1018-T97A IgG1-BI(SEQ ID NO：20)，EV1018-T97V IgG1-BI(SEQ ID NO：21)，EV1018-N95D IgG1-BI(SEQ ID NO：22)，EV1018-N95EIgG1-BI(SEQ ID NO：23)，EV1018-N95K IgG1-BI(SEQ ID NO：24)，EV1018-N95Q IgG1-BI(SEQ ID NO：25)，EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI(SEQID NO：26)，EV1018-T97A IgG1-original-constant(SEQ ID NO：27)，EV1018-T97V IgG1-original-constant(SEQ ID NO：28)，EV1018-N95DIgG1-original-constant(SEQ ID NO：29)，EV1018-N95E IgG1-original-constant(SEQ ID NO：30)，EV1018-N95K IgG1-original-constant(SEQ ID NO：31)，EV1018-N95Q IgG1-original-constant(SEQ ID NO：32)，EV1018-N93Q-N95TIgG1-original-constant(SEQ ID NO：33)，EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL(SEQ IDNO：38)，EV1018-T97 A-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：39)，EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：40)，EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：41)，EV1018-N95EIgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：42)，EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：43)，EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：44)，EV1018-N93Q-N95TIgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：45)，EV1018-wt IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：46)，EV1018-T97 A IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：47)，EV1018-T97 VIgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：48)，EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：49)，EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：50)，EV1018-N95KIgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：51)，EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：52)，EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：53)，EV1018-IgG2(SEQID NO：54)，EV1018-wt-IgG2(SEQ ID NO：55)，EV1018-T97A-IgG2(SEQ IDNO：56)，EV1018-T97V-IgG2(SEQ ID NO：57)，EV1018-N95D-IgG2(SEQ IDNO：58)，EV1018-N95E-IgG2(SEQ ID NO：59)，EV1018-N95K-IgG2(SEQ IDNO：60)，EV1018-N95Q-IgG2(SEQ ID NO：61)，EV1018-N93Q-N95T-IgG2(SEQ ID NO：62)，EV1018-IgG4(SEQ ID NO：63)，EV1018-wt-IgG4(SEQ IDNO：64)，EV1018-T97A-IgG4(SEQ ID NO：65)，EV1018-T97V-IgG4(SEQ IDNO：66)，EV1018-N95D-IgG4(SEQ ID NO：67)，EV1018-N95E-IgG4(SEQID NO：68)，EV1018-N95K-IgG4(SEQ ID NO：69)，EV1018-N95Q-IgG4(SEQID NO：70)，EV1018-N93Q-N95T-IgG4(SEQ ID NO：71)，EV1018-IgG4-SP(SEQ ID NO：72)，EV1018-wt-IgG4-SP(SEQ ID NO：73)，EV1018-T97A-IgG4-SP(SEQ ID NO：74)，EV1018-T97V-IgG4-SP(SEQ ID NO：75)，EV1018-N95D-IgG4-SP(SEQ ID NO：76)，EV1018-N95E-IgG4-SP(SEQ ID NO：77)，EV1018-N95K-IgG4-SP(SEQ ID NO：78)，EV1018-N95Q-IgG4-SP(SEQID NO：79)和EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP(SEQ ID NO：80)。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，EV1018-wt-original-constant(SEQ ID NO：37)，和下述重链变体之一：EV1018(SEQ ID NO：10)，EV1018-wt-IgG1KO(SEQ ID NO：11)，EV1018-T97A-IgG1KO(SEQ ID NO：12)，EV1018-T97V-IgG1KO(SEQ ID NO：13)，EV1018-N95D-IgG1KO(SEQ ID NO：14)，EV1018-N95E IgG1KO(SEQ ID NO：15)，EV1018-N95K IgG1KO(SEQ ID NO：16)，EV1018-N95Q IgG1KO(SEQID NO：17)，EV1018-N93Q-N95T IgG1KO(SEQ ID NO：18)，EV1018-wt IgG1-BI(SEQ ID NO：19)，EV1018-T97AIgG1-BI(SEQ ID NO：20)，EV1018-T97VIgG1-BI(SEQ ID NO：21)，EV1018-N95D IgG1-BI(SEQ ID NO：22)，EV1018-N95E IgG1-BI(SEQ ID NO：23)，EV1018-N95K IgG1-BI(SEQ ID NO：24)，EV1018-N95Q IgG1-BI(SEQ ID NO：25)，EV1018-N93Q-N95TIgG1-BI(SEQ ID NO：26)，EV1018-T97A IgG1-original-constant (SEQ ID NO：27)，EV1018-T97V IgG1-original-constant(SEQ ID NO：28)，EV1018-N95DIgG1-original-constant(SEQ ID NO：29)，EV1018-N95E IgG1-original-constant(SEQ ID NO：30)，EV1018-N95K IgG1-original-constant(SEQ ID NO：31)，EV1018-N95Q IgG1-original-constant(SEQ ID NO：32)，EV1018-N93Q-N95TIgG1-original-constant(SEQ ID NO：33)，EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL(SEQ IDNO：38)，EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：39)，EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：40)，EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：41)，EV1018-N95EIgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：42)，EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：43)，EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：44)，EV1018-N93Q-N95TIgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO：45)，EV1018-wt IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：46)，EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：47)，EV1018-T97VIgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：48)，EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：49)，EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：50)，EV1018-N95KIgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：51)，EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：52)，EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO：53)，EV1018-IgG2(SEQID NO：54)，EV1018-wt-IgG2(SEQ ID NO：55)，EV1018-T97A-IgG2(SEQ IDNO：56)，EV1018-T97V-IgG2(SEQ ID NO：57)，EV1018-N95D-IgG2(SEQ IDNO：58)，EV1018-N95E-IgG2(SEQ ID NO：59)，EV1018-N95K-IgG2(SEQ IDNO：60)，EV1018-N95Q-IgG2(SEQ ID NO：61)，EV1018-N93Q-N95T-IgG2(SEQ ID NO：62)，EV1018-IgG4(SEQ ID NO：63)，EV1018-wt-IgG4(SEQ IDNO：64)，EV1018-T97A-IgG4(SEQ ID NO：65)，EV1018-T97V-IgG4(SEQ IDNO：66)，EV1018-N95D-IgG4(SEQ ID NO：67)，EV1018-N95E-IgG4(SEQID NO：68)，EV1018-N95K-IgG4(SEQ ID NO：69)，EV1018-N95Q-IgG4(SEQID NO：70)，EV1018-N93Q-N95T-IgG4(SEQ ID NO：71)，EV1018-IgG4-SP(SEQ ID NO：72)，EV1018-wt-IgG4-SP(SEQ ID NO：73)，EV1018-T97A-IgG4-SP(SEQ ID NO：74)，EV1018-T97V-IgG4-SP(SEQ ID NO：75)，EV1018-N95D-IgG4-SP(SEQ ID NO：76)，EV1018-N95E-IgG4-SP(SEQ ID NO：77)，EV1018-N95K-IgG4-SP(SEQ ID NO：78)，EV1018-N95Q-IgG4-SP(SEQID NO：79)和EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP(SEQ ID NO：80)。
本发明提供了多种抗体：EV1019本身和EV1019抗体的变化，总结在表B中。在某些实施方式中，重链含有相对于野生型重链序列的一处或多处氨基酸取代。在一些实施方式中，轻链含有相对于野生型EV1019轻链序列的一处或多处氨基酸取代。在一些实施方式中，重链和轻链各自含有一处或多处氨基酸取代。
在本发明的一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链，EV1019(SEQ ID NO：160)，和选自下面的组的轻链EV1019-wt-original(SEQ ID NO：202)，EV1019-wt-BI(SEQ ID NO：203)，EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO：204)，EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO：205)，EV1019-N25S(SEQ ID NO：206)，EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO：207)，EV1019-N25G(SEQ ID NO：208)，EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO：209)，EV1019-N25T(SEQ ID NO：210)，EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO：211)，EV1019-N25R(SEQ ID NO：212)，EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO：213)，EV1019-N25Q(SEQ ID NO：214)，EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO：215)，EV1019-S27N(SEQ ID NO：216)，EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO：217)，EV1019-S27G(SEQ ID NO：218)，EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO：219)，EV1019-S27A(SEQ ID NO：220)和EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO：221)。
在本发明的一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链，EV1019-wt-IgG1-BI(SEQ ID NO：161)，和选自下面的组的轻链EV1019-wt-original(SEQ ID NO：202)，EV1019-wt-BI(SEQ ID NO：203)，EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO：204)，EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO：205)，EV1019-N25S(SEQ ID NO：206)，EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO：207)，EV1019-N25G(SEQ ID NO：208)，EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO：209)，EV1019-N25T(SEQ ID NO：210)，EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO：211)，EV1019-N25R(SEQ ID NO：212)，EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO：213)，EV1019-N25Q(SEQ ID NO：214)，EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO：215)，EV1019-S27N(SEQ ID NO：216)，EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO：217)，EV1019-S27G(SEQ ID NO：218)，EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO：219)，EV1019-S27A(SEQ ID NO：220)和EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO：221)。
在本发明的一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链，EV1019-wt-IgG1KO(SEQ ID NO：162)，和选自下面的组的轻链EV1019-wt-original(SEQ ID NO：202)，EV1019-wt-BI(SEQ ID NO：203)，EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO：204)，EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO：205)，EV1019-N25S(SEQ ID NO：206)，EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO：207)，EV1019-N25G(SEQ ID NO：208)，EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO：209)，EV1019-N25T(SEQ ID NO：210)，EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO：211)，EV1019-N25R(SEQ ID NO：212)，EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO：213)，EV1019-N25Q(SEQ ID NO：214)，EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO：215)，EV1019-S27N(SEQ ID NO：216)，EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO：217)，EV1019-S27G(SEQ ID NO：218)，EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO：219)，EV1019-S27A(SEQ ID NO：220)和EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO：221)。
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此外，重链可变区和轻链可变区可以组合得到结合抗原的Fab片段。这样的组合保留了相同或等效的抗原结合亲和力，可用于产生多种版本的抗原结合片段，如单链可变片段(scFv)。scFv是免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区的融合物，二者通过短的(通常是丝氨酸，甘氨酸)接头连接在一起，这在本领域是公知的。
相应地，EV1018重链可变区可以与EV1018轻链可变区组合。在一些实施方式中，重链和/或轻链可变区可以是变体，所述变体与链的野生型序列相比包含一处或多处氨基酸改变。类似地，EV1019重链可变区可以与EV1019轻链可变区组合。在一些实施方式中，重链和/或轻链可变区可以是变体，所述变体与链的野生型序列相比包含一处或多处氨基酸改变。
在一些实施方式中，下列EV1018重链可变区中的任一个(如，野生型及其变体)可以与轻链可变区EV1018-VL-wt-original(SEQ ID NO：364)组合形成与hGM-CSF结合的抗原结合片段：EV1018-VH(SEQ ID NO：348)，EV1018-VH-wt(SEQ ID NO：349)，EV1018-VH-T97A(SEQ ID NO：350)，EV1018-VH-T97V(SEQ ID NO：351)，EV1018-VH-N95D(SEQ ID NO：352)，EV1018-VH-N95E(SEQ ID NO：353)，EV1018-VH-N95K(SEQ ID NO：354)，EV1018-VH-N95Q(SEQ ID NO：355)，EV1018-VH-N93Q-N95T(SEQ ID NO：356)，EV1018-VH-T97A IgG1-original-constant(SEQ ID NO：357)，EV1018-VH-T97V IgG1-original-constant(SEQ ID NO：358)，EV1018-VH-N95DIgG1-original-constant(SEQ ID NO：359)，EV1018-VH-N95EIgG1-original-constant(SEQ ID NO：360)，EV1018-VH-N95KIgG1-original-constant(SEQ ID NO：361)，EV1018-VH-N95QIgG1-original-constant(SEQ ID NO：362)，和EV1018-VH-N93Q-N95TIgG1-original-constant(SEQ ID NO：363)。
在一些实施方式中，下列EV1018重链可变区中的任一个(如，野生型及其变体)可以与轻链可变区EV1018-VL-wt-BI(SEQ ID NO：365)组合，形成与hGM-CSF结合的抗原结合片段：EV1018-VH(SEQ ID NO：348)，EV1018-VH-wt(SEQ ID NO：349)，EV1018-VH-T97A(SEQ ID NO：350)，EV1018-VH-T97V(SEQ ID NO：351)，EV1018-VH-N95D(SEQ ID NO：352)，EV1018-VH-N95E(SEQ ID NO：353)，EV1018-VH-N95K(SEQ ID NO：354)，EV1018-VH-N95Q(SEQ ID NO：355)，EV1018-VH-N93Q-N95T(SEQ ID NO：356)，EV1018-VH-T97A IgG1-original-constant(SEQ ID NO：357)，EV1018-VH-T97V IgG1-original-constant(SEQ ID NO：358)，EV1018-VH-N95DIgG1-original-constant(SEQ ID NO：359)，EV1018-VH-N95EIgG1-original-constant(SEQ ID NO：360)，EV1018-VH-N95KIgG1-original-constant(SEQ ID NO：361)，EV1018-VH-N95QIgG1-original-constant(SEQ ID NO：362)，和EV1018-VH-N93Q-N95TIgG1-original-constant(SEQ ID NO：363)。
同样地，在一些实施方式中，EV1019的抗原结合片段包含重链可变区，EV1019-VH-wt(SEQ ID NO：152)和选自下面的组的轻链可变区：EV1019-VL-wt(SEQ ID NO：184)，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO：185)，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO：186)，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO：187)，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO：188)，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO：189)，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO：190)，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO：191)，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO：192)，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO：193)，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO：194)，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO：195)，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO：196)，EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO：197)，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO：198)，EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO：199)，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO：200)，EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO：201)。
在一些实施方式中，EV1019的抗原结合片段包含重链可变区，EV1019-VH-C105G(SEQ ID NO：153)和选自下面的组的轻链可变区：EV1019-VL-wt(SEQ ID NO：184)，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO：185)，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO：186)，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO：187)，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO：188)，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO：189)，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO：190)，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO：191)，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO：192)，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO：193)，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO：194)，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO：195)，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO：196)，EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO：197)，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO：198)，EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO：199)，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO：200)，EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO：201)。
在一些实施方式中，EV1019的抗原结合片段包含重链可变区，EV1019-VH-C105S(SEQ ID NO：154)和选自下面的组的轻链可变区：EV1019-VL-wt(SEQ ID NO：184)，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO：185)，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO：186)，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO：187)，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO：188)，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO：189)，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO：190)，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO：191)，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO：192)，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO：193)，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO：194)，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO：195)，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO：196)，EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO：197)，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO：198)，EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO：199)，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO：200)，EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO：201)。
在一些实施方式中，EV1019的抗原结合片段包含重链可变区，EV1019-VH-C105A(SEQ ID NO：155)和选自下面的组的轻链可变区：EV1019-VL-wt(SEQ ID NO：184)，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO：185)，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO：186)，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO：187)，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO：188)，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO：189)，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO：190)，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO：191)，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO：192)，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO：193)，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO：194)，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO：195)，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO：196)，EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO：197)，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO：198)，EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO：199)，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO：200)，EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO：201)。
在一些实施方式中，EV1019的抗原结合片段包含重链可变区，EV1019-VH-C105T(SEQ ID NO：156)和选自下面的组的轻链可变区：EV1019-VL-wt(SEQ ID NO：184)，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO：185)，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO：186)，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO：187)，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO：188)，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO：189)，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO：190)，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO：191)，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO：192)，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO：193)，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO：194)，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO：195)，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO：196)，EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO：197)，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO：198)，EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO：199)，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO：200)，EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO：201)。
在一些实施方式中，EV1019的抗原结合片段包含重链可变区，EV1019-VH-C105M(SEQ ID NO：157)和选自下面的组的轻链可变区：EV1019-VL-wt(SEQ ID NO：184)，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO：185)，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO：186)，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO：187)，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO：188)，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO：189)，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO：190)，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO：191)，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO：192)，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO：193)，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO：194)，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO：195)，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO：196)，EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO：197)，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO：198)，EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO：199)，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO：200)，EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO：201)。
在一些实施方式中，EV1019的抗原结合片段包含重链可变区，EV1019-VH-C105Q(SEQ ID NO：158)和选自下面的组的轻链可变区：EV1019-VL-wt(SEQ ID NO：184)，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO：185)，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO：186)，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO：187)，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO：188)，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO：189)，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO：190)，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO：191)，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO：192)，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO：193)，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO：194)，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO：195)，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO：196)，EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO：197)，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO：198)，EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO：199)，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO：200)，EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO：201)。
在一些实施方式中，EV1019的抗原结合片段包含重链可变区，EV1019-VH-C105L(SEQ ID NO：159)和选自下面的组的轻链可变区：EV1019-VL-wt(SEQ ID NO：184)，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO：185)，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO：186)，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO：187)，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO：188)，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO：189)，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO：190)，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO：191)，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO：192)，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO：193)，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO：194)，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO：195)，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO：196)，EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO：197)，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO：198)，EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO：199)，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO：200)，EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO：201)。
本发明的变体
当两种或更多种全长抗hGM-CSF抗体或其抗原结合部分，或抗hGM-CSF抗体的一部分同时施用时，它们也包括本发明中。因此，识别hGM-CSF的双特异性抗体，和多特异性抗体也包括在本发明中。
上面的描述中解释了抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分的变化，但是描述的特征在本领域可以被取代或改变，而不背离本发明的范围。
也就是说，下列抗体或其抗原结合部分包括在本发明的范围内：
(I)全长抗体及其抗原结合部分
(II)抗体的一部分，和
(III)能够特异结合hGM-CSF并中和其生物活性的重组人单克隆抗体，单克隆抗体(包括嵌合抗体和人源化抗体)，或其抗原结合部分，其中所述重组人单克隆抗体是通过任何公知的技术得到的，基于SEQ ID NO：4-9和330-335，SEQ ID NO：364和365，以及SEQ ID NO：348-363，SEQ ID NO：184-201和SEQ ID NO：152-159的氨基酸序列，其代表可变区和CDR。
当按上述方法产生的特定的抗体或其抗原结合部分基于选自在此描述的SEQ ID NO：4-9，或330-335组成的每个组中的至少一种氨基酸序列来应用时，所述抗体或其抗原结合部分也包括在本发明中。
抗体变体列表
下面的表分别提供了EV1018和EV1019抗体有用的抗体链和片段的列表。
表A：EV1018抗体的重链和轻链变体以及可变区列表
表B：EV1019抗体的重链和轻链变体以及可变区列表
本发明的各种实施方式
下面详细介绍本发明的实施方式。所述实施方式的描述是以专利权利要求撰写的方式整理的，因为看起来它在例示说明书中的教导方面是有用的，根据所述教导，可以得出本专利申请赋予的保护范围。
项1.一个实施方式是分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段识别hGM-CSF(SEQ ID NO：1)中的ELYK(SEQID NO：2)和TMMASHYKQH(SEQ ID NO：3)。
项2.另一实施方式是分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体包含：
(a)重链，其包含含有VH-CDR1的共有序列，含有VH-CDR2的共有序列，和有VH-CDR3含的共有序列，其中：
(i)含有VH-CDR1的共有序列是FTFSX1X2MH(SEQ ID NO：314)，其中X1是Y或H，且X2是G或A，
(ii)含有VH-CDR2的共有序列是X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQID NO：315)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K，且
(iii)含有VH-CDR3的共有序列是EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G；和
(b)轻链，其包含含有VL-CDR1的共有序列，含有VL-CDR2的共有序列，和含有VL-CDR3的共有序列，其中：
(i)含有VL-CDR1的共有序列是XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO：317)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，且X11是H或Y，
(ii)含有VL-CDR2的共有序列是GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，且X13是A或P，和
(iii)含有VL-CDR3的共有序列是STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，其中X14是R或S，且X15是V或L。在进一步的实施方式中，项1或2的抗体或抗原结合片段特异结合hGM-CSF，优选地KD小于450pM。
项3.另一实施方式是项1或2公开的抗体或其抗原结合片段，除了项1和2提供的特征之外，其结合人GM-CSF的KD小于400pM。
项4.另一实施方式是项3公开的抗体或其抗原结合片段，其中KD小于160pM。
项5.另一实施方式是项1-4中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段中和hGM-CSF活性，从而使得在TF-1增殖分析中ED80时确定的抗体或其抗原结合片段IC50值小于100pM。
项6.另一实施方式是项5公开的抗体或其抗原结合片段，其中所述IC50值小于40pM或小于30pM或小于25pM。进一步优选的本发明的抗体或其抗原结合片段，在TF-1增殖分析中ED80时确定的IC50值确实小于20pM，小于25pM，小于30pM，或小于40pM。
项7.另一实施方式是项5公开的抗体或其抗原结合片段，其中所述IC50值小于20pM。
项8.另一实施方式是项1至7中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中重链选自伽玛1(γ1)，伽玛2(γ2)，伽玛3(γ3)，和伽玛4(γ4)组成的组。
项9.另一实施方式是项1至8中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中重链具有选自SEQ ID NO：10-33，38-80，160-183，222-244和245组成的组的氨基酸序列。
项10.另一实施方式是项1至9中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中轻链是λ轻链。
项11.另一实施方式是项10中公开的抗体或其抗原结合片段，其中λ轻链包含下列氨基酸取代：R100G或A153G中的至少一个或两个。
项12.另一实施方式是项1至11中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中轻链具有选自SEQ ID NO：34-37，202-220和221组成的组的氨基酸序列。
项13.另一实施方式是项1至9中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中轻链是κ轻链。
项14.另一实施方式是项1至13中任一项公开的抗体，其中重链选自伽玛伽玛1(γ1)，伽玛2(γ2)，伽玛3(γ3)，和伽玛4(γ4)组成的组，且其中轻链是λ轻链。
项15.另一实施方式是项1至13中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中重链包含选自Q3E，T97A，T97V，N95D，N95E，N95K，N95Q，N93Q/N95T，K144R，L164A，和L165A组成的组的一处或多处氨基酸取代。
项16.另一实施方式是项1至15中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中VH-CDR1包含氨基酸序列SYGMH(SEQ ID NO：4)或SHAMH(SEQ IDNO：333)。
项17.另一实施方式是项1至16中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中VH-CDR2包含氨基酸序列LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO：5)或VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO：334)。
项18.另一实施方式是项1至17中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中VH-CDR3包含氨基酸序列ESMGAINDN(SEQ ID NO：6)或EWVGGTCDS(SEQ ID NO：335)。
项19.另一实施方式是项1至18中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中VL-CDR1包含氨基酸序列IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO：7)或SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO：330)。
项20.另一实施方式是项1至19中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中VL-CDR2包含氨基酸序列GRSPPS(SEQ ID NO：8)或GKSPAS(SEQ IDNO：331)。
项21.另一实施方式是项1至20中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中VL-CDR3包含氨基酸序列STWDSSLSAVV(SEQ ID NO：9)或STWDSRLSAVL(SEQ ID NO：332)。
项22.另一实施方式是分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含6个不同的CDR，其中6个CDR的序列是SEQ ID NO：4-9。在进一步的实施方式中，项22所述的抗体或抗原结合片段确实特异结合hGM-CSF，优选地KD小于450pM，优选为400pM或160pM。
项22A.另一实施方式是如项1公开的分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，与项2-22中任一项公开的分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段组合。
项23.另一实施方式是项22公开的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体包含(i)选自伽玛1(γ1)，伽玛2(γ2)，伽玛3(γ3)，和伽玛4(γ4)组成的组的重链或其片段，和(ii)轻链，其是κ轻链。
项24.另一实施方式是项22公开的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体包含(i)选自伽玛1(γ1)，伽玛2(γ2)，伽玛3(γ3)，和伽玛4(γ4)组成的组的重链或其片段，和(ii)轻链，其是λ轻链。
项25.另一实施方式是分离的特异结合于hGM-CSF的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含6个不同的CDR，其中6个CDR的序列是SEQ ID NO：330-335。
项26.另一实施方式是项25公开的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体包含(i)选自伽玛1(γ1)，伽玛2(γ2)，伽玛3(γ3)，和伽玛4(γ4)组成的组的重链或其片段，和(ii)轻链，其是κ轻链。
项27.另一实施方式是项25公开的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体包含(i)选自伽玛1(γ1)，伽玛2(γ2)，伽玛3(γ3)，和伽玛4(γ4)组成的组的重链，和(ii)轻链，其是λ轻链。
项28.另一实施方式是项1至27中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，进一步包含信号序列。
项29.另一实施方式是项28公开的抗体或其抗原结合片段，其中信号序列选自SEQ ID NO：324，325和326组成的组。
项30.另一实施方式是分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，所述的抗体包含具有重链序列的重链和具有轻链序列的轻链，其中所述重链序列是SEQ ID NO：10或其选自SEQ ID NO：11-33，38-79和80组成的组的变体，且其中所述轻链序列是SEQ ID NO：34。
项31.另一实施方式是分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，所述的抗体包含具有重链序列的重链和具有轻链序列的轻链，其中所述重链序列是SEQ ID NO：10或其选自SEQ ID NO：11-33，38-79和80组成的组的变体，且其中所述轻链序列是SEQ ID NO：35。
项32.另一实施方式是分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，所述的抗体包含具有重链序列的重链和具有轻链序列的轻链，其中所述重链序列是SEQ ID NO：10或其选自SEQ ID NO：11-33，38-79和80组成的组的变体，且其中所述轻链序列是SEQ ID NO：36。
项33.另一实施方式是分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，所述的抗体包含具有重链序列的重链和具有轻链序列的轻链，其中所述重链序列是SEQ ID NO：10或其选自SEQ ID NO：11-33，38-79和80组成的组的变体，且其中所述轻链序列是SEQ ID NO：37。
项34.另一实施方式是分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，所述的抗体包含具有重链序列的重链和具有轻链序列的轻链，其中所述重链序列是SEQ ID NO：160或其选自SEQ ID NO：161-244和SEQ ID NO：245组成的组的变体，且其中所述轻链序列是SEQ ID NO：202或其选自SEQ ID NO：203-220和SEQ ID NO：221组成的组的变体。
项35.另一实施方式是分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，所述的抗体包含重链可变区，其中所述重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：152或其选自SEQ ID NO：153-158和SEQ ID NO：159组成的组的变体，和轻链可变区，其中所述轻链可变区的的氨基酸序列是SEQ ID NO：184或其选自SEQ ID NO：185-200和SEQ ID NO：201组成的组的变体。
项36.另一实施方式是如项35公开的抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：152。
项37.另一实施方式是如项35公开的抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：184。
项38.另一实施方式是如项35公开的抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：152，且其中轻链可变区的氨基酸序列是SEQID NO：184。
项39.另一实施方式是项35-38中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体属于IgG1(λ)类(亚类)。
项40.另一实施方式是分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，所述的抗体包含重链可变区，其中所述重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：348或其选自SEQ ID NO：349-362和SEQ ID NO：363组成的组的变体，和轻链可变区，其中所述轻链可变区的的氨基酸序列是SEQ ID NO：364或SEQ IDNO：365。
项41.另一实施方式是如项40公开的抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：348。
项42.另一实施方式是如项40公开的抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：364。
项43.另一实施方式是如项40公开的抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：365。
项44.另一实施方式是项40-43中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体属于IgG1(λ)类(亚类)。
项45.另一实施方式是分离的核酸，其编码项1-44中任一项公开的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段。
项46.另一实施方式是项45中公开的核酸，其中所述核酸是DNA。
项47.另一实施方式是包含项46中公开的DNA的载体。
项48.另一实施方式是包含项47中公开的载体的宿主细胞，其中所述载体是表达载体。
项49.另一实施方式是试剂盒，包含：(a)项1-44中任一项公开的抗体或其抗原结合片段；和(b)含有所述抗体或其抗原结合片段的一个或多个容器。
项50.另一实施方式是项1-44中任一项公开的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，用于药物。
项51.另一实施方式是组合物，包含项1-44中任一项公开的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体.
项52.另一实施方式是项51中公开的组合物，进一步包含第二种结合hGM-CSF的分离的抗体或其抗原结合片段，从而使得所述组合物包含多种所述的抗体，多种所述的抗原结合片段，或至少一种所述的抗体和至少一种所述的抗原结合片段，他们中的每一个均结合hGM-CSF。
项53.另一实施方式是项52中公开的组合物，其中至少一种抗体或其抗原结合片段是具有选自SEQ ID NO：10-80，152-245，320-323，348-364和365组成的组的序列的多肽。
项54.另一实施方式是试剂盒，包含项51-53中任一项公开的组合物，和一个或多个包含所述组合物的容器。
项55.另一实施方式是项49或项54公开的试剂盒，进一步包含说明书。
项56.另一实施方式是项1-44和51-53中任一项公开的抗体或其抗原结合片段或组合物，用于制造或制备治疗与受试者hGM-CSF过表达相关的疾病或病症的药物，其中所述抗体或其抗原结合片段结合hGM-CSF并能够中和hGM-CSF活性。
项57.另一实施方式是项56公开的用途，其中疾病或病症选自慢性阻塞性肺疾病(COPD)，哮喘，囊性纤维化病，间质性肺病，鼻炎，关节炎及相关关节病，银屑病，髓系白血病和多发性硬化组成的组。
项58.另一实施方式是项56或57公开的用途，其中抗体或抗原结合片段以不超过500mg的剂量施用给受试者。
项59.另一实施方式是项1-44和51-53中任一项公开的抗体或其抗原结合片段或其组合物在治疗与受试者hGM-CSF过表达相关的疾病或病症中的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段结合hGM-CSF并能够中和hGM-CSF活性。
项60.另一实施方式是项59公开的用途，其中疾病或病症选自慢性阻塞性肺疾病(COPD)，哮喘，囊性纤维化病，间质性肺病，鼻炎，关节炎及相关关节病，银屑病，髓系白血病和多发性硬化组成的组。
项61.另一实施方式是项59或60公开的用途，其中抗体或抗原结合片段以不超过500mg的剂量施用给受试者。
项62.另一实施方式是如SEQ ID NO：2和3所示的多肽中hGM-CSF的表位，其中所述表位被项22或25公开的抗体或其抗原结合片段识别，且其中所述多肽序列表示hGM-CSF(SEQ ID NO：1)的不连续的片段。
项63.另一实施方式是表位，所述表位是人GM-CSF的不连续的片段，其中所述表位包含人GM-CSF(SEQ ID NO：1)77-80氨基酸残基和人GM-CSF(SEQ ID NO：1)95-104氨基酸残基，被抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段识别，所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：4-9或SEQ ID NO：330-335所示的6个不同的CDR。
项64.另一实施方式是在宿主细胞中产生与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段至少含有含有VH-CDR1的共有序列，含有VH-CDR2的共有序列，含有VH-CDR3的共有序列，含有VL-CDR1的共有序列，含有VL-CDR2的共有序列，和含有VL-CDR3的共有序列，，所述方法包括：
(i)获得包含至少一种DNA序列的宿主细胞，所述DNA序列至少编码含有VH-CDR1的共有序列，含有VH-CDR2的共有序列，含有VH-CDR3的共有序列，含有VL-CDR1的共有序列，含有VL-CDR2的共有序列，和含有VL-CDR3的共有序列，其中：
(a)含有VH-CDR1的共有序列是FTFSX1X2MH(SEQ ID NO：314)，其中X1是Y或H，且X2是G或A，
(b)含有VH-CDR2的共有序列是X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQID NO：315)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K，
(c)含有VH-CDR3的共有序列是EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO：316)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G，
(d)含有VL-CDR1的共有序列是XnGNXnXnNIGSXnAVG(SEQ ID NO：317)，其中每个Xn相互独立地是任何天然存在的氨基酸，且Xn是H或Y，
(e)含有VL-CDR2的共有序列是GX12SPX13SG(SEQ ID NO：318)，其中X12是R或K，且X13是A或P，且
(f)含有VL-CDR3的共有序列是STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO：319)，其中X14是R或S，且X15是V或L；和
(ii)在适合所述DNA表达和产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述宿主细胞。
项65.另一实施方式是项64公开的方法，其中至少一种DNA编码重链或其部分和轻链或其部分，其中重链或其部分具有选自SEQ ID NO：10-33，38-80，152-183，222-245，348-362和363组成的组的序列，且其中轻链或其部分具有选自SEQ ID NO：34-37，184-221，364和365组成的组的序列。
项66.另一实施方式是项64或65公开的方法，进一步包括分离抗体或其抗原结合片段。
项67.另一实施方式是项64-66中任一项公开的方法，进一步包括制备包含所述抗体或其抗原结合片段和药学上可接受载体的组合物。
项68.另一实施方式是载体，其包含编码VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3的DNA序列，其中：
VH-CDR1是SYGMH(SEQ ID NO：4)或SHAMH(SEQ ID NO：333)，VH-CDR2是LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO：5)或VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO：334)，且
VH-CDR3是ESMGAINDN(SEQ ID NO：6)或EWVGGTCDS(SEQ ID NO：335)。
项69.另一实施方式是载体，其包含编码VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3的DNA序列，其中：
VL-CDR1是IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO：7)或SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO：330)；
VL-CDR2是GRSPPSG(SEQ ID NO：8)或GKSPASG(SEQ ID NO：331)；且
VL-CDR3是STWDSSLSAVV(SEQ ID NO：9)或STWDSRLSAVL(SEQID NO：332)。
项70.另一实施方式是鉴定与项62或63公开的表位结合的分子的方法，包括
(i)用包含所述表位的探针接触生物样品或肽库；
(ii)分离特异结合所述探针的分子；以及
(iii)鉴定所述分子。
项71.另一实施方式是项70公开的方法，进一步包括
(iv)产生(iii)的分子。
项72.另一实施方式是项70或71公开的方法，其中所述分子是抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段.
项73.另一实施方式是项70-72中任一项公开的方法，其中所述探针进一步包含可检测的标记。
项74.另一实施方式是项70-73中任一项公开的方法，其中所述探针经固定化。
项75.另一实施方式是能够结合hGM-CSF(hGM-CSF)并中和hGM-CSF(hGM-CSF)生物活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分具有互补决定区(CDR)，其由选自SEQ ID NO：4至9组成的组的一种或多种氨基酸序列表示。
项76.另一实施方式是能够结合hGM-CSF(hGM-CSF)并中和hGM-CSF(hGM-CSF)生物活性的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分具有互补决定区(CDR)，其由选自SEQ ID NO：330至335组成的组的一种或多种氨基酸序列表示。
项77.另一实施方式是项75或76公开的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分具有氨基酸序列，其中互补决定区(CDR)中的一个或多个氨基酸被取代，缺失，插入或添加。
项78.另一实施方式是项75-77中任一项公开的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于当TF-1细胞通过hGM-CSF的诱导增殖时，所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分在浓度约为14pM时，抑制约50％的TF-1细胞增殖。
项79.另一实施方式是项78中公开的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分抑制外周血树突细胞的增殖。
项80.另一实施方式是项78中公开的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分具有对hGM-CSF的高亲和力，KD值为4×10-10M或更低。
项81.另一实施方式是项75-80中任一项公开的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于所述抗体属于IgG1(λ)类(亚类)。
项82.另一实施方式是项75-81中任一项公开的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于所述抗hGM-CSF单克隆抗体是人单克隆抗体。
项83.另一实施方式是用于hGM-CSF引起的疾病的药物组合物，包含：项75-82中任一项公开的抗hGM-CSF单克隆抗体或抗原结合部分，和药学上可接受的载体。
项84.另一实施方式是项83公开的药物组合物，其特征在于由hGM-CS过量产生导致的疾病选自下面的组：
(a)变应性疾病，如哮喘，特应性和花粉症，
(b)移植物排斥，移植物抗宿主病(GVHD)，和
(c)自身免疫性疾病如类风湿性关节炎。
项85.另一实施方式是编码抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分的分离的脱氧核糖核酸(DNA)，所述的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分能够结合hGM-CSF并中和hGM-CSF生物活性，其特征在于所述分离的DNA编码氨基酸序列，其包含选自SEQ ID NO：4至9组成的组的至少一个。
项86.另一实施方式是编码抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分的分离的DNA，所述抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分能够与hGM-CSF结合并中和hGM-CSF生物活性，其特征在于所述分离的DNA编码氨基酸序列，其包含选自SEQ ID NO：330至335组成的组的至少一个。
项87.另一实施方式是一种分离的DNA，所述DNA能够在严格条件下与项85或86公开的DNA杂交。
项88.另一实施方式是载体，特征在于其中掺入项85-87中任一项公开的分离的DNA。
项89.另一实施方式是宿主细胞，特征在于其中导入了项88公开的重组表达载体。
项90.另一实施方式是增强活性的方法，其特征在于特异于同一特定抗原的多种抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分同时施用。
项91.另一实施方式是项90所述的增强活性的方法，其特征在于所述多种抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分包含选自下列(a)和(b)的两型或以上的抗体或其抗原结合部分：
(a)抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其具有由SEQ ID NO：4至9，SEQ ID NO：330至335，SEQ ID NO：336至341，或SEQ ID NO：342至347的氨基酸序列表示的互补决定区(CDR)，且其特异于hGM-CSF，
(b)(a)中的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其具有氨基酸序列序列，其中一个或多个氨基酸被取代，缺失，插入，或添加，且其特异于hGM-CSF。
项92.另一实施方式是项91公开的增强活性的方法，其特征在于当TF-1细胞通过hGM-CSF诱导增殖时，所述两型或以上的抗体或其抗原结合部分在各自浓度约55pM时抑制80％或以上的TF-1细胞增殖。
项93.另一实施方式是药用组合物或兽药组合物，包含：多种特异于同一特定抗原的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，和药学上可接受的载体。
项94.另一实施方式是如项93公开的药用组合物或兽药组合物，其特征在于，所述多种抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分包含选自下列(a)和(b)的两型或以上的抗体或其抗原结合部分：
(a)抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其具有由SEQ ID NO：4至9，SEQ ID NO：330至335，SEQ ID NO：336至341，或SEQ ID NO：342至347的氨基酸序列表示的互补决定区(CDR)，且其特异于hGM-CSF，
(b)(a)的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分，其具有氨基酸序列序列，其中一个或多个氨基酸被取代，缺失，插入，或添加，且其特异于hGM-CSF。
项95.另一实施方式是如项94公开的药用组合物或兽药组合物，其特征在于当TF-1细胞通过hGM-CSF的诱导增殖时，所述两型或以上的抗体或其抗原结合部分在各自浓度约55pM时抑制80％或以上的TF-1细胞增殖。
以下，本发明的实施例将描述得更具体，但是实施例并不限制本申请的请求范围。
实施例
实施例1产生抗hGM-CSF(hGM-CSF)的完全人的抗体的细胞克隆的分离。
图1显示了分离抗体产生细胞克隆的流程图。B细胞分离自血清中有高抗GM-CSF单克隆抗体滴度的捐赠者血液，然后用EBV感染。这些被EBV感染而增殖的细胞用作抗体产生细胞库。
将抗体产生细胞库的细胞分散于96孔板，培养3到4周。筛选每个孔的培养上清液是否存在抗hGM-CSF单克隆抗体。筛选通过ELISA进行，使用包被重组hGM-CSF(rhGM-CSF)的96孔板。将抗体产生阳性孔中的细胞接种于新的96孔板，培养3到4周，然后对每个孔的培养上清液进行第二次抗hGM-CSF单克隆抗体的筛选。对抗体产生阳性孔中的细胞在96孔板中有限稀释培养3到5周，此后，对每个孔的培养上清液进行抗体检测，最终从每孔植入一个细胞的孔中得到抗体产生细胞克隆。
实施例2抗体同种型和亚类的鉴定。
我们鉴定了三个抗体产生细胞克隆，EV1007、EV1018和EV1019(表1)产生的抗体的同种型和亚类。鉴定通过ELISA进行，所述方法基本上与培养上清液中抗体产生的筛选方法相同，以培养上清液作为一抗，同种型和亚型特异的抗体作为二抗。
表1表示新获得的三种抗hGM-CSF单克隆抗体和单克隆抗体J1584C(下文称为EV1003)的抗体名称和它们的亚类。它们已经在国际PCT公布文本WO07/049472中报道。
表1
| 抗体 | 亚类 |
| EV1007 | IgG1λ |
| EV1018 | IgG1λ |
| EV1019 | IgG1λ |
| EV1003 | IgG1λ |
实施例3从抗体产生细胞中克隆抗体基因
抗体基因是从抗体产生细胞中克隆的。从抗体产生细胞提取总RNA，用寡dT引物和逆转录酶合成其cDNA。
使用cDNA为模板，通过PCR扩增出编码人抗体的基因。引物是基于抗体基因DNA序列数据库设计的，从而使得5′端含有转录起始位点，3′端包含翻译终止位点。
实施例4基于核酸序列确定抗体的氨基酸序列
抗体基因[EV1007、EV1018和EV1019，均由重(H)链和轻(L)链基因组成]的cDNA被克隆到质粒载体，通过测序仪(ABI)分析它们的核酸序列。基于获得的核苷酸序列确定其氨基酸序列。采用Kabat的方法分析抗体(EV1007、EV1018、EV1019和EV1003)的互补决定区(CDR)。四种抗体的CDR序列由SEQ ID NO：4到9和330到347表示。特别地，EV1018的L链CDR1，L链CDR2，L链CDR3，H链CDR1，H链CDR2，和H链CDR3分别展示于SEQ ID NO：4至9。EV1019的L链CDR1，L链CDR2，L链CDR3，H链CDR1，H链CDR2，和H链CDR3分别展示于SEQ ID NO：330至335。EV1003的L链CDR1，L链CDR2，L链CDR3，H链CDR1，H链CDR2，和H链CDR3分别展示于SEQ ID NO：336至341。EV1007的L链CDR1，L链CDR2，L链CDR3，H链CDR1，H链CDR2，和H链CDR3分别展示于SEQID NO：342至347。
实施例5获得的编码抗hGM-CSF单克隆抗体的抗体基因的确认
将编码三种抗体(每个均由L链和H链组成)的基因插入到表达载体中。编码每种抗体的L和H链基因的质粒，采用Lipofectamine and Plus试剂(Invitrogen)瞬时转染到293T细胞，并检测瞬时抗体表达。
转染两天后，收集包含分泌的抗体的培养细胞培养物上清液。通过ELISA检测培养上清液中的人类IgG和抗GM-CSF的单克隆抗体以证实人类IgG和抗GM-CSF的单克隆抗体的瞬时表达。
实施例6表达抗hGM-CSF单克隆抗体的稳定的CHO转染细胞的构建。
如上所述将编码抗GM-CSF单克隆抗体的表达载体转染到CHO-K1细胞中。转染两天后，将细胞接种到96孔板上，然后在含有合适的选择标记的选择培养基中培养两周。每个孔的培养上清液用ELISA筛选抗hGM-CSF的单克隆抗体。将抗体表达阳性孔中的单个细胞接种到96孔板的孔中。对生长在选择性培养基中的单细胞克隆筛选抗GM-CSF单克隆抗体的表达，获得稳定表达抗GM-CSF单克隆抗体的细胞克隆。
实施例7抗体的纯化
在无血清培养基中培养稳定表达抗GM-CSF单克隆抗体的CHO细胞克隆。在各自的表达期之后，收集培养上清液，按照生产商的说明，用HiTrap rProteinA FF预装柱(Amersham)进行亲和层析，分离抗体。通过ELISA证实纯化的抗体具有结合hGM-CSF的活性，通过SDS-PAGE确定抗体由约50kDa的抗体H链和约25kDa的抗体L链组成。
实施例8抗GM-CSF单克隆抗体的亲和力分析
采用Biacore SystemTM的表面等离子体共振(SRP)计算重组hGM-CSF结合抗hGM-CSF单克隆抗体的亲和常数(图2)。
在所述分析抗体和抗原相互作用的方法中，纯化的抗体通过与固定在传感器芯片表面的G蛋白相互作用，被传感器芯片捕获，然后将重组抗原注入到传感器芯片。使用纯化的抗体，重组hGM-CSF被用作抗原。
来自酵母(Leukine Berlex)和大肠杆菌(Peprotech)的重组hGM-CSF与抗hGM-CSF单克隆抗体的平衡解离常数(KD)列在表2中。
表2
所述分析中，对于EV1007与酵母GM-CSF(Leukine)的KD值是1.2x10-9M，对于EV1018是2.3x10-10M，对于EV1019是3.6x10-10M。对于之前产生的单克隆抗体EV1003，KD值是2.3x10-10M。
对于EV1007与大肠杆菌(Peprotech)的KD值是9.3x10-10M，对于EV1018是1.5x10-10M，对于EV1019是1.5x10-10M，而对于EV1003是9.5x10-10M。产生的所有这四种hGM-CSF单克隆抗体均以高亲和力结合到重组hGM-CSF。
实施例9抗GM-CSF单克隆抗体对外周血树突细胞增殖的抑制作用。
利用人血树突细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotech)从7×107个人单个核细胞中获得含有浆细胞样树突细胞(DC)和髓系树突细胞(DC)的5×105个树突细胞(DC)。
将获得的树突状细胞悬浮于RPMI 1640培养基(Gibco)，所述培养基中补充了10％的FCS，rhGM-CSF(1ng/mL，Peprotech)，TNF-α(10ng/mL)和抗GM-CSF单克隆抗体(1μg/mL)，按每孔2×104个细胞的浓度接种到96孔平底板上，温育10天。
以由我们生成的抗GM-CSF多克隆抗体(抗GM-CSF pAbs，R&D)(1μg/mL)和人抗人巨细胞病毒单克隆抗体(hIgG)(1μg/mL)作为对照。结果展示在图3中。
如图3所示，EV1003、EV1018和EV1019抑制GM-CSF依赖性DC增殖。相比之下，EV1007没有显示出抑制作用。另一方面，抗GM-CSF pAb抑制GM-CSF依赖性DC增殖，但是hIgG不具有该作用。
EV1003、EV1018和EV1019能独立阻断GM-CSF依赖性DC增殖。
实施例10使用TF-1细胞评估抗GM-CSF单克隆抗体的中和能力
我们测试了纯化的抗hGM-CSF单克隆抗体(EV1007、EV1018和EV1019)和EV1003的中和能力，如图4和图5所示，EV1003先前利用TF-1细胞产生，TF-1细胞增值依赖于hGM-CSF的存在。
将纯化的抗体与重组hGM-CSF预温育，并将混合物加入TF-1细胞培养物中。培养2天后，通过比色法测定TF-1细胞增殖情况。具有GM-CSF中和活性的抗体可以阻断添加的重组GM-CSF的活性，导致GM-CSF依赖性TF-1细胞生长的抑制。
图4和图5分别表示抗体对酵母(Leukine)hGM-CSF和大肠杆菌(Peprotech)hGM-CSF刺激的TF-1细胞增殖的抑制作用(中和活性)。
如实施例9中所述用抗GM-CSF pAb和hlgG作为对照，独立评价每种抗体的抑制作用。
测试经4倍系列稀释，浓度范围从2μg/mL到31pg/mL的抗体。所有测试都使用终浓度为0.5ng/mL的rhGM-CSF。温育40小时后，使用细胞计数试剂盒(WST-1assay，DOJIN)，通过A450/参照A495颜色强度来估计TF-1细胞的存活率。
在图4和图5的y轴上，将经31pg/mL对照hIgG处理的TF-1细胞存活率设为100％，，未经rhGM-CSF处理的TF-1细胞存活率设为0％。测试的抗体标示在图下面，其浓度标示在图的右侧。
0.5ng/mL的酵母rhGM-CSF(Leukine)用来刺激TF-1细胞的增殖，每种抗hGM-CSF单克隆抗体中和活性的结果显示在图4中。虽然以hlgG作为阴性对照，其在2μg/mL的高浓度下显示出对细胞生长的非特异抑制，其浓度低于2μg/mL时不表现抑制作用。抗hGM-CSF多克隆抗体(抗GM-CSF pAbs)的抗体浓度在125ng/mL或高于125ng/mL时显示细胞生长抑制作用。
在纯化的单克隆抗体中，EV1003在31ng/mL浓度时抑制TF-1细胞生长，使其存活率为阳性对照的60％，在31ng/mL或大于31ng/mL时观察到浓度依赖性生长抑制。EV1018和EV1019在浓度分别为0.5ng/mL或大于0.5ng/mL时以及2ng/mL或大于2ng/mL时显示出约50％的抑制。证实EV1018和EV1019对hGM-CSF具有极高的中和活性。EV1007在浓度为0.5μg/mL或大于0.5μg/mL时显示明显的细胞生长抑制作用，表明它的中和能力很低。
0.5ng/mL大肠杆菌rhGM-CSF(Peprotech)被用来刺激TF-1细胞的增殖，每种抗hGM-CSF单克隆抗体的中和能力结果显示在图5中。在这个分析中，作为阴性对照的hIgG在2μg/mL的高浓度下显示对细胞生长的非特异抑制作用，但是在浓度低于2μg/mL时不表现抑制作用。抗hGM-CSF多克隆抗体(抗GM-CSF pAb)在抗体浓度为31ng/mL或大于31ng/mL时显示出细胞生长抑制作用。
在纯化的单克隆抗体中，EV1003在31ng/mL或大于31ng/mL浓度时表现出明显的对TF-1细胞增殖的浓度依赖性抑制。EV1018和EV1019在浓度分别为0.5ng/mL或大于0.5ng/mL时以及2ng/mL或大于2ng/mL时显示出高于50％的抑制作用。证实EV1018和EV1019的中和活性极高。
EV1007浓度为0.5μg/mL或大于0.5μg/mL时明显地表现出细胞生长抑制作用，表明与EV1018和EV1019相比，它的中和能力很低。
评估了两种抗体的组合的中和活性(图6和7)。表3中列出混合抗体的五种组合。
表3
| 混合物-1 | EV1003+hIgG |
| 混合物-2 | EV1003+EV1007 |
| 混合物-3 | EV1003+EV1018 |
| 混合物-4 | EV1003+EV1019 |
| 混合物-5 | EV1018+EV1019 |
每种抗体的测试溶液以四倍系列稀释配制，浓度范围从4μg/mL到62pg/mL，将相同浓度的两种抗体混合起来(终浓度如图6和7所示)。使用细胞计数试剂盒(WST-1assay，DOJIN)，通过A450/参照A495颜色强度来估计TF-1细胞的存活率。
在图6和图7的y轴上，经对照31pg/mL hIgG处理的TF-1细胞存活率设为100％，未经rhGM-CSF处理的TF-1细胞存活率设为0％，如图4和5所示。经对照31pg/mL hIgG处理的TF-1细胞存活率的结果显示在图4和5中，而不是图6和7。混合抗体的组合标示在图下面，且其浓度在图右侧指示。
在这些组合中，混合物-2：EV1003+1007，混合物-3：EV1003+1018和混合物-4：EV1003+1019的抑制作用与单独使用每种抗体相比极度增加。例如，如图6所示，混合物-4：EV1003+1019在每种抗体浓度8ng/mL(约55pM)时抑制TF-1细胞生长，使其存活率为阳性对照的10％。
如图4所示，EV1003在浓度为8ng/mL时，单独不表现出对TF-1细胞增殖的抑制，EV1019在浓度为8ng/mL时，单独表现出仅50％的抑制。这些结果表明两种抗体的组合显示极高的中和活性。
虽然EV1007单独使用的抑制作用很低，但是混合物-2：EV1003+1007在每种抗体8ng/mL(约55pM)的浓度时抑制TF-1细胞生长至阳性对照组的10％，如图6和7所示。
如图7所示，当使用大肠杆菌rhGM-CSF(Peprotech)刺激TF-1细胞增殖时，细胞生长几乎完全被每种抗体浓度均为31ng/mL或大于31ng/mL的混合物-2：EV1003+1007，混合物-3：EV1003+1018和混合物-4：EV1003+1019抑制。证实抗体的组合添加显示极强的中和活性。
另一方面，与图4和5所示的抗体单独使用相比，混合物-5：EV1018+1019抑制活性以浓度依赖性的方式增加。但是，比混合物-2至4增加的幅度小。
对于混合物-5：EV1018+1019，其混合物效果不显著，每种抗体单独使用的剂量依赖性曲线(中和作用模式)相似。
如图4和5所示，在四种抗体(EV1003、EV1007、EV1018和EV1019)中，EV1003在2μg/ml浓度下单独使用时显示最强的抑制作用，但是即使在这样高浓度时，大约20％细胞仍然存活。与此相反，混合物-2、混合物-3和混合物-4在31至125ng/mL的浓度范围几乎完全抑制细胞生长。表明这三种组合(混合物-2，混合物-3和混合物-4)显示极高的中和活性。
抗GM-CSF单克隆抗体(EV1003)和抗CMV抗体(hIgG)的组合使用，混合物-1，与它们单独使用相比不增强抗体的抑制作用。
在本发明获得的三种抗体中，两种抗体(EV1018和EV1019)在单独和组合使用时显示极高的中和活性。在表3列出的抗体组合中，某些组合比两种抗体累加效应显示更高的抑制活性。
以上产生的抗GM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分能够与引起多种疾病的hGM-CSF特异结合，并灭活(中和)hGM-CSF的生物活性。因此，所述抗体或其抗原结合部分比目前为止制备的(当前可得到的)抗hGM-CSF单克隆抗体有更高的hGM-CSF中和活性。由于所述抗体或其抗原结合部分是人类单克隆抗体，所以没有免疫原性，不会引起免疫反应。
另外，与单独使用相比，同时组合使用抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分对细胞生长显示极高的抑制作用(如，中和活性)。
考虑到这些特性，本发明所述的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合部分在低剂量时可作为与GM-CSF升高相关疾病的有效预防或治疗药物，与GM-CSF升高相关的疾病包括但不限于变应性疾病如哮喘，COPD，囊性纤维化病，间质性肺病，鼻炎，特应性，花粉症，移植物排斥，移植物抗宿主病(GVHD)，关节炎及相关的关节疾病，银屑病，髓系白血病，多发性硬化，Alzheimer氏症和类风湿性关节炎。
实施例11用Biacore hGM-CSF测定抗GM-CSF单克隆抗体的亲和力
小鼠抗人Biacore芯片(GE Healthcare)用于固定每种抗体，并且任可溶的可市购的纯化GM-CSF(Biomol)与其结合。这些实验中使用的hGM-CSF与下述生物检定中使用的相同。结合亲和力用Biacore软件确定，结果概括于表4。
表4
| 抗体 | Ka | Kd | KD |
| EV1003 | 1.05×106±0.01 | 2.15×10-4±0.01 | 203±2pM |
| EV1019 | 8.13×106±0.19 | 1.21×10-4±0.01 | 152±1pM |
| EV1018 | 1.11×106±0.03 | 1.44×10-4±0.37 | 112±6pM |
EV1018比EV1019的结合亲和力高，比EV1003的结合亲和力更高。所有EV1018的变体与野生型具有相等的亲和力。
与其他种(恒河猴，小鼠，狨猴)GM-CSF的交叉反应性
公共数据库中有恒河猴GM-CSF序列(例如，GenBank登录号NP_001028121)，所述序列被用来设计一个作为Fc融合蛋白的表达克隆。引入蛋白酶切割位点来使释放不带标签的恒河猴GM-CSF蛋白成为可能。所得的蛋白具有极佳的生物学活性(参见下一部分)，并且在Western blots中可被所有抗GM-CSF单克隆抗体(EV1018，EV1019，EV1003)识别(数据未显示)。进行Biacore测定(使用的设置与上面1.1描述的相同)，结果如表5所示。
表5恒河猴GM-CSF单克隆抗GM-CSF单克隆抗体结合研究
| 抗体 | Ka | Kd | KD |
| EV1003 | 5.39×105±0.06 | 3.56×10-4±0.04 | 661±14pM |
| EV1019批次1 | 2.91×105±0.23 | 2.14×10-4±0.01 | 739±57pM |
| EV1019批次2 | 3.04×105±0.13 | 1.65×10-4±0.17 | 543±34pM |
| EV1018 | 5.56×105±0.52 | 2.11×10-4±0.06 | 381±16pM |
在所有情况下，与恒河猴GM-CSF的交叉反应性都良好(所有的抗GM-CSF单克隆抗体识别恒河猴GM-CSF蛋白的识别情况均比hGM-CSF差约2-3倍)。由此，恒河猴为此处公开的抗GM-CSF单克隆抗体的发展提供了一个很好的非人灵长类模型。
用小鼠的GM-CSF进行测定(PeproTech和Biomol，GeneBank登录号：NP_034009)，结果总结在表6中。
表6小鼠GM-CSF单克隆抗GM-CSF单克隆抗体结合研究
| 抗体 | Ka | Kd | KD |
| EV1003 | n.d. | n.d. | n.d. |
| EV1019 | 1.1×105±0.1 | 6×10-3±2 | 62±27nM |
| EV1018 | 1.9×105±0.2 | 3.4×10-2±1.7 | 193±60nM |
在所有情况下，与小鼠GM-CSF的交叉反应性都很弱。这个数据为抗GM-CSF单克隆抗体结合的hGM-CSF表位的鉴定实验提供了基础，其中小鼠和人类之间的GM-CSF蛋白的杂交已经被证实。
生成了一个与上述恒河猴GM-CSF表达克隆相似的狨猴GM-CSF(例如，GenBank登录号：B0KWQ4，第53位是甲硫氨酸，第109位是脯氨酸)表达克隆。纯化的蛋白用于Biacore测定，其结果总结在表7中。
表7狨猴GM-CSF抗GM-CSF单克隆抗体结合研究
| 抗体 | Ka | Kd | KD |
| EV1003 | n.d. | n.d. | n.d. |
| EV1019 | 2.1×105±0.1 | 2.14×10-4±0.01 | 1.4±0.1nM |
| EV1018 | 3.64×105±0.01 | 7.6×10-4±0.3 | 2.1±0.1nM |
与狨猴GM-CSF的交叉反应性是显著的。所有的抗GM-CSF单克隆抗体都可识别狨猴GM-CSF蛋白，识别情况比hGM-CSF差约18-19倍。像恒河猴一样，狨猴为开发所述公开的抗GM-CSF单克隆抗体提供了一个良好的动物模型。
实施例12生物学活性：对GM-CSF生物活性的中和作用
TF-1增殖分析(人类，恒河猴，狨猴的GM-CSF)
TF-1人细胞系的增值依赖于生长因子。这个细胞系是本领域公知的研究生长因子生物作用的良好基础。
此处，我们使用不同物种的重组GM-CSF(rGM-CSF)，例如(i)在大肠杆菌中(Fa.Biomol #2514)表达的hGM-CSF的重组hGM-CSF(rhGM-CSF)通过使用本领域公知的标准技术，或(ii)恒河猴GM-CSF(如GenBank登录号：NP_001028121)的重组恒河猴GM-CSF(rrGM-CSF)或(ii)狨猴GM-CSF(如GenBank登录号：B0KWQ4，第53位是甲硫氨酸，第109位是脯氨酸)的重组狨猴GM-CSF(rmGM-CSF)，后两种均采用本领域公知的标准技术在HEK293中表达。
将TF-1在细胞培养基(RPMI1640(Cat.31870，Fa.Gibco)，1×Glutamax 100×(Cat.35050-038，Fa.Gibco)，1mM Sodium Pyrovat 100mM，(Cat.11360-039，Fa.Gibco)，10mM Hepes 1M(Cat.15690-056，Fa.Gibco)，10％FCS(Cat.10500-064，Fa.Gibco)，2ng/ml rGM-CSF，(Cat.200-005L Fa.Reliatech GmbH)中生长。细胞用PBS洗三次，然后以1E5个/ml的浓度接种到96孔板(Cat.167008-056，Fa.Nunc)中，培养基是实验培养基(Assay Medium)(不含rGM-CSF的细胞培养基)。在稀释培养基(不含FCS和rGM-CSF的细胞培养基)中稀释抗体溶液和GM-CSF溶液，然后分别以10μl的体积添加。在湿室(humidified chamber)内以37℃，5％CO2将细胞温育3天。根据试剂盒(CellTiter 96 Aqueous One Solution CellProliferation Assay，Fa.Promega，Cat.No.G3581)的说明，通过加入20μl的MTS，测定492nm时的光密度，测得细胞存活率。阴性对照是在不含rGM-CSF的培养基中生长的TF-1细胞，阳性对照是在含浓度为ED80的rGM-CSF的细胞培养基中生长的TF-1细胞。
在检测抗体中和活性之前，需确定人，恒河猴，狨猴GM-CSF刺激增殖作用的ED80(表8)。人和恒河猴的GM-CSF能够非常有效地刺激TF-1细胞的增殖(ED80[人]：1-5ng/ml；ED80[恒河猴]：7ng/ml)，但是狨猴的GM-CSF刺激TF-1增殖的效果非常低下。因此，人TF-1细胞系适合测试人和恒河猴GM-CSF的中和活性，但是不适合测试来自狨猴的GM-CSF。
表8TF-1细胞增殖分析中人类，恒河猴和狨猴GM-CSF的ED80
| 物种 | GM-CSF | ED80 |
| 人类 | rhGM-CSF(来自大肠杆菌) | 1.5ng/ml |
| 恒河猴 | rrGM-CSF(来自HEK细胞) | 7ng/ml |
| 狨猴 | rmGM-CSF(来自HEK细胞) | 1μg/ml |
抗体IC50的测定在ED80浓度下进行。
在图8A和8B的y轴上，阳性对照的TF-1细胞存活率设为100％，阴性对照的TF-1细胞存活率设为0％。
具有已知的中和活性的抗体，可市购的大鼠抗hGM-CSF IgG2a抗体也被使用(BVD2-23B6，Fa.BD Pharmingen#554501)(表9)。同种型对照抗体大鼠IgG2a没有表现出细胞增殖抑制作用(数据未显示)。
EV1018和EV1019具有良好的对重组人GM-CSF的中和活性。EV1018超过了BVD2-23B6的中和活性。
EV1018的重链天然地在框架3中含有N-糖基化位点。这在例如SEQ IDNO：10中表示出来，对应第95-97残基。因此生产了EV1018重链变体并检测了其中和活性。如表9中所示，结果表明在去除了重链框架3中N连接的糖基化位点后，EV1018的生物学活性仍然保留。表9显示了与重链包含N-糖基化位点的WT EV1018相比较，两种糖基化位点序列变体(EV1018变体1和2)的IC50值，这两种变体分别命名为N95K和T97A。每种纯化的IgG的IC50值，基本上如描述的那样，在TF-1实验中测定。对更多的EV1018变体的实验得到了与EV1018相似的结果。
表9TF-1细胞增殖分析中IC50的比较
结果用ng/ml和pM给出(假设抗体的分子量为150kDa)
在使用重组恒河猴GM-CSF单克隆抗体的实验中，EV1018、EV1019和EV1003，与从大鼠获得的BVD2-23B6相比，具有更高的中和活性。但是，在这两个实验中，EV1018均比所有测试的抗体显著更好。所有的EV1018变体与野生型EV1018具有相同的中和活性。
在设定的给出表9中结果的实验中，不可能使用可市购的大鼠抗人GM-CSFIgG2a BVD2-21C11(Fa.BD，#554503)，因为低于给出的ED80浓度，例如1.5ng/ml rGM-CSF的剂量，不能获得可靠的结果。为了测定抗体21C11，需要更低剂量的rGM-CSF，如下表10所示。
通过简单地比较IC50值从而比较不同实验室的抗体的有效性，是不可能的，因为IC50值强烈依赖于实验条件，比如说使用的刺激物的量。一个更可靠的比较可为比较标准抗体与感兴趣的抗体的比值，例如获自使用所示不同rGM-CSF量的上述TF-1分析中获得的IC50值的比值。例如，WO2006/122797(表8，第56页和57页)公开了其最好的抗体比可市购的抗体，大鼠抗人GM-CSF，克隆BVD2-21C11好35倍。可市购的抗人GM-CSF单克隆抗体克隆，克隆BVD2-21C11与EV1018的IC50值的比值是413。因此，基于与商品标准的比较，如表10所示，EV1018的中和活性是其十倍高。这是令人惊讶的，因为WO2006/122797教导本领域技术人员抗GM-CSF单克隆抗体的中和活性与其与GM-CSF的结合亲和力强烈地相关(WO2006/122797，50页的表3中显示的改善的结合亲和力与相应改善了的中和能力相关，中和能力显示在第52-54页表6和7)。
比较MOR04357(WO2006/122797，第50页，表4：MOR04357-Fab的结合亲和力是7pM)与EV1018的结合亲和力我们意识到，与MOR04357相比，EV1018与GM-CSF的结合低16倍。但是，与MOR04357相比，EV1018的中和活性高十倍，表明中和活性不必然与GM-CSF的结合亲和力相关联。
表10.TF-1分析中EV1018和现有技术抗体的相对中和活性
第1和2行：来自WO2006/122797第56和57页，表8的数据，第3和4行：我们的数据
在U937细胞中的IL-8分泌分析(人类和恒河猴GM-CSF)
IL-8是促炎症细胞因子，它是嗜中性粒细胞性炎症的关键因子，参与大部分的炎症反应。GM-CSF活性的靶细胞是髓样细胞谱系的细胞。前单核细胞系U937起源于骨髓，在GM-CSF刺激下分泌促炎症细胞因子IL-8。
U937(ATCC：CRL-1593.2)在细胞培养培养基(RPMI 1640(Cat.31870Fa.Gibco)，1×Glutamax 100x(Cat.35050-038Fa.Gibco)，10％FCS(Cat.10500-064Fa.Gibco)，1％PenStrep)中生长。接种100μl浓度为1E5个/ml的细胞悬液，添加10μl的抗体溶液和10μl的GM-CSF溶液。在湿室内，以37℃，5％CO2温育24小时。使用OptEIA Human IL-8 Elisa Set(Fa.BD Bioscience，Cat.No.555244)确定IL-8细胞因子水平。
阴性对照是在未添加抗体和GM-CSF的细胞培养培养基中生长的U937细胞，阳性对照是在含ED80的rGM-CSF但未添加抗体溶液的细胞培养培养基中生长的U937细胞。人和恒河猴GM-CSF的ED80浓度已确定(表9)，所述浓度用于确定不同抗GM-CSF单克隆抗体的IC50(表11)。
表11 U937中IL-8分泌的ED80测定
| GM-CSF | ED80 |
| 人(来自大肠杆菌Fa.Biomol #2514) | 1.2ng/ml |
| 恒河猴(来自HEK细胞，本实验室) | 5.0ng/ml |
表12 U937IL-8分泌分析中IC50的比较。结果用ng/ml和pM给出(假设抗体的分子量为150kDa)
在细胞分析中，三种抗体均非常有效地中和人以及恒河猴的GM-CSF。EV1018的中和活性比EV1019的高，远较EV1003的为高。所有EV1018的变体与野生型EV1018显示等同的中和活性。
实施例13表面CD11b/Mac1的诱导
粒细胞是髓样谱系的细胞亚群，是GM-CSF生物活性的靶细胞。除了其他的效应物功能外，GM-CSF诱导粒细胞表面的粘附分子CD11b/Mac1。髓样细胞谱系细胞表面CD11b/Mac1的诱导是细胞从外周血向炎症组织迁移的必要步骤。患有慢性炎性气道疾病如COPD和哮喘的病人痰和支气管肺泡灌洗液中的粒细胞数增多。因此，抗GM-CSF抗体的有效性通过GM-CSF介导的原代人粒细胞上的粘附标记物CD11b/Mac1的诱导来测定。
80μl健康捐献者的经抗凝血处理的外周血与抗GM-CSF单克隆抗体或同种型抗体(人类IgG，#I-2511；Fa.Sigma-Aldrich)(阳性对照)在37℃下共同温育15分钟，所述同种型抗体先与rhGM-CSF(终浓度30pM)(Fa Biomol，#2514)预温育20分钟。阴性对照为经抗凝血处理的外周血在37℃与同种型抗体温育15分钟，所述同种型抗体先用PBS，0.1％BSA预温育20分钟。
为了定量测定CD11b/Mac1的表达，根据供应商的指导，使用藻红蛋白标记的抗CD11b抗体(Fa：Pharmingen；Cat：333142)。简要地说，将20μl的抗CD11b抗体溶液加到细胞中，避光室温温育30分钟。加入2ml裂解溶液(Fa：BD；Cat 349202)裂解红细胞(红细胞)，避光室温再温育10分钟。用PBS，0.1％BSA洗涤两次后，将白细胞悬浮于500μl Cellfix(Fa：BD；Cat 340181)中。LSRII流式细胞仪和分析FACS的DIVA6.1.1软件(二者均来自Fa：BD)被用于分析数据。在前散射和侧散射二维Dotplot图中，划出(gate)粒细胞，并将其设定为100％。30pM的rhGM-CSF被用于刺激粒细胞表面的CD11b/Mac1。67pM的EV1018足以完全阻止GM-CSF诱导的CD11b/Mac1。
这些数据表明EV1018有效地中和GM-CSF生物学活性，这在涉及粒细胞数目增多的炎症过程如COPD和哮喘中具有重要意义。
实施例14C57BL/6J小鼠暴露于香烟烟雾后的肺部炎症
香烟烟雾是引发COPD的最重要的因素。诸如小鼠大鼠等动物长期暴露于香烟烟雾后会导致许多类似于人类疾病，在病理生理学上相关的解剖损害(anatomic lesion)(Fujita和Nakanishi 2007)。COPD一个重要的参数是慢性支气管炎，慢性支气管炎包括肺中嗜中性粒细胞和巨噬细胞的增多。为了证明GM-CSF在烟雾诱导的细胞向肺部聚集中发挥着重要的作用，抗GM-CSF单克隆抗体被用在小鼠长期香烟烟雾模型中。
将小鼠(C57BL/6J系，18-23g)暴露于香烟烟雾4天。第1，2天暴露于6支香烟中，第3天8支，第4天10支。暴露于每支香烟的时间持续16分钟，接着暴露于新鲜空气8分钟。每两支香烟后有24分钟暴露于新鲜空气的额外时间。没有暴露于香烟烟雾的小鼠作为阴性对照。
在第一天和第三天暴露之前两小时腹膜内施用(i.p.)300μg大鼠抗小鼠GM-CSF抗体IgG2a(克隆MPI-22E9，Fa.eBioScienses，#16-7331)，或300μg合适的同种型抗体(大鼠IgG2a，Fa.eBioSciences，#16-4321)，或是300μl媒介(PBS，10mM NaCl)。最后一次暴露18小时后对受试动物处以安乐死，肺部用含EDTA的2×0.8ml Hanks溶液灌洗。将支气管肺泡灌洗液(BALF)离心分离为细胞团与上清液。检测团中髓过氧化物酶(MPO)活性作为髓样细胞流入的参数。在4℃，485×g低速离心500μl灌洗液样品10分钟。用200μl 0.5％的十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)重悬细胞团。将50μl悬浮液转至96孔微滴定板上。每孔加250μl底物溶液(50mM KH2PO4，5mM Na2HPO4，0.2mg/ml邻联茴香胺二盐酸盐(o-dianisidin dihydrochloride)，0.2μl/ml H2O2)以起始酶促反应。测定450nm处的90秒消光(extinction)。髓过氧化物酶(MPO)活性在酶促反应的稳定期计算。活性以毫活性单位每分钟(mAU/分钟)形式给出。
使用流式细胞仪(LSR II，Becton Dickinson)进行多重分析物检测(multipleanalyte detection)测定BALF上清液中的细胞因子MCP-1和MIP-1α。实验参照Bender MedSystems(Flow Cytomix)的说明书进行。简要地说，将25μl BALF上清液与25μl×测定缓冲液(Basic试剂盒BMS8440FF)，25μl Bead混合物(MCP-1和MIP-1a混合物Simplex试剂盒，BMS86005FF，BMS86013FF)，50μl生物素偶联的混合物混合(包括在Simplex试剂盒中)，并于室温在微孔板振荡器上500rpm温育2小时。用测定缓冲液洗两次后，将珠子溶解到100μl的测定缓冲液中，加入50μl链霉亲合素-PE-溶液(包括在Basic试剂盒中)。将珠子于室温在微孔板振荡器上500rpm保温1小时，珠子用测定缓冲液洗两次。将珠子溶于500μl测定缓冲液，然后用Bender MedSystems提供的FlowCytomix Pro 2.2软件进行流式细胞术分析。定量分析时，按照供应商(Bender MedSystems)的说明书准备标准品(包括在Simplex试剂盒中)的系列稀释物。细胞因子的浓度基于标准品确定。
在用抗GM-CSF抗体预处理小鼠时，MPO活性降低了约25％(图9A)。与这个结果一致，细胞因子MCP-I和MIP-Iα分别降低了约18％和23％(图9B)。
图9A和9B中的结果表明在香烟烟雾引发的炎症中，GM-CSF发挥了重要作用，GM-CSF的中和可以显著降低小鼠长期香烟烟雾暴露后诱导的细胞浸润和炎症性的细胞因子。
实施例15GM-CSF表位作图
测试包括小鼠、人类、恒河猴和狨猴的GM-CSF的肽阵列以确定GM-CSF中特定的线性序列是否可以作为表位被所讨论的抗体识别。
以下的抗体被测试：BIBH1(一种识别FAP的非相关的人源化IgG1阴性对照抗体(参见US20030103968 Use of FAP alpha specific antibody BIBH1 in thetreatment of cancer(http://www.asco.org/ASCO/Abstracts+&+Virtual+Meeting/Abstracts？&vmview＝abst_detail_view&conflD＝10&abstractID＝1028)，EV1018，EV1019和EV1003。
肽阵列的结果表明与阴性对照抗体没有高于特异性结合的水平，而经固定化的GM-CSF和人类IgG阳性对照有强信号。由于正确折叠的GM-CSF可被识别，但是来自GM-CSF衍生出的多肽不被识别，我们得出结论：受试的抗GM-CSF抗体识别非线性或构象特异性的表位。这与文献(如WO2007/092939)中已知的其它几种抗GM-CSF抗体不同。
采用以下的方法：
定制的阵列在JPT(德国柏林)被合成并印制到载玻片上，室温下用PBS+1％BSA+0.1％Tween 20封闭阵列3小时，并轻轻摇动。用探针缓冲液(PBS，5mM MgCl2，0.5mM DTT，0.05％Triton X-100，5％甘油，1％BSA)稀释抗体至5μg/ml，然后于4℃在阵列上温育1-2小时。然后用探针缓冲液洗涤阵列三次(每次在冰上洗涤一分钟)，接着用Cy5标记的山羊抗人IgG(0.5μg/ml)4℃温育1小时，如上所述再次洗涤，离心干燥(800x g)，以Cy5滤镜，在恒定PMT下，用Perkin-Elmer ProScan微阵列扫描仪扫描。
还通过直向同源取代(orthologous replacement)进行表位作图。由于受试的抗体识别构象或非连续表位，只能在正确折叠的GM-CSF背景下才能识别各自的表位。如上描述的Biacore结果表明，即使有结合，所述的抗体与小鼠GM-CSF的结合也很微弱。因此，我们设计了嵌合版本的GM-CSF，其中人类GM-CSF的选定区域被相应的小鼠序列所代替。由于推定人类和小鼠的GM-CSF具有相似的三维结构，但是仅有73％的同一性(identity)，嵌合蛋白应该保持正确的GM-CSF折叠，这与可能影响蛋白折叠的丙氨酸扫描方法不同(用连续的聚丙氨酸取代)。其中的表位或其部分被小鼠序列取代的嵌合体，不再与所讨论的抗体结合(或显示降低的结合)。将序列作图回已知的人类GM-CSF三维结构，容许重建构成表位的氨基酸的空间定位。在人类和小鼠间保守的GM-CSF氨基酸无法用这种方法分析。
十一种不同的嵌合体被设计出来，其中七种线性多肽序列分别或组合被取代。对于每一种嵌合体，小鼠的GM-CSF氨基酸用粗体标出。预测的各嵌合体间不同的N-连接的糖基化位点用下划线标出。每一种嵌合体都在HEK293细胞作为家兔Fc融合蛋白来表达，以容许通过家兔Fc部分来进行纯化和定量。使用抗家兔Fc抗体进行的融合蛋白的对照Western印迹显示相同量的各种GM-CSF嵌合融合蛋白加载在凝胶中。不同嵌合体迁移率变动(mobility shift)的不同是由于人和小鼠GM-CSF糖基化不同导致的。
GM-CSF嵌合体与EV1003的Western印迹显示嵌合体3、6、9和10显示微弱结合或不结合。嵌合体9是嵌合体3和6的组合，而嵌合体10是嵌合体2和6的组合。因此，在嵌合体3和6或包含一个或全部两个这些区域的组合所代表的位置上包含小鼠氨基酸的所有嵌合体不再被EV1003识别。因此这些代表EV1003的表位。将嵌合体3和6空间作图到GM-CSF三维晶体结构上显示，这些嵌合体在GM-CSF分子的一个面上相互邻接，与这些发现吻合得很好。这个面代表被EV1003识别的不连续的表位。
用EV1019对GM-CSF嵌合体的Western印迹显示，嵌合体4、5和11显示微弱结合而嵌合体8几乎不结合。嵌合体11是嵌合体1和5的组合，而嵌合体8是嵌合体4和5的结合。因此，在嵌合体4或5所代表的位置上包含小鼠氨基酸的所有嵌合体显示与EV1019的微弱结合。嵌合体8，其包含了嵌合体4和5所代表的位置上小鼠氨基酸的组合，不再被EV1019识别。因此嵌合体4和5的组合代表EV1019的表位。将嵌合体4和5的空间作图到GM-CSF三维晶体结构上显示，这些嵌合体在GM-CSF分子的一个面上相互邻接，与这些发现吻合得很好。这个表面代表被EV1019识别的不连续的表位。因为这两个区域均对EV1019的高亲和力结合是必要的，所述不连续的表位必须由变体4和5的氨基酸组成，这两个变体彼此非常靠近，并且位于或靠近GM-CSF的表面(因此影响表面暴露的氨基酸残基)。这些分别是氨基酸60-63(ELYK)和78-87(TMMASHYKQH)(SEQ ID NO：3)。76(P)位氨基酸可能有作用。嵌合体4的68-69(SL)位氨基酸不太可能在结合的表位中发挥重要作用，因为其与嵌合体4和5接触面的距离较远，但是，这不能完全排除。
GM-CSF嵌合体与EV1018的Western印迹显示，嵌合体4、5和11表现微弱结合而嵌合体8几乎不结合。嵌合体11是1和5的结合，而嵌合体8是4和5的结合。因此，在嵌合体4或5所代表的位置上包含小鼠氨基酸的所有嵌合体与EV1018微弱结合。嵌合体8，其包含了嵌合体4和5所代表的位置上小鼠氨基酸的组合，不再被EV1018识别。因此嵌合体4和5的组合代表EV1018的表位。将嵌合体4和5空间作图到GM-CSF三维晶体结构上显示，这些嵌合体在GM-CSF分子的一个面上相互邻接，与这些发现吻合得很好。这个表面代表被EV1018识别的不连续的表位。因为这两个区域均对EV1018的高亲和力结合是必要的，所述不连续的表位必须由变体4和5的氨基酸组成，这两个变体彼此非常靠近，并且位于或靠近GM-CSF的表面(因此影响表面暴露的氨基酸残基)。这些分别为氨基酸″ELYK″和″TMMASHYKQH″。
这些结果表明EV1018和EV1019识别GM-CSF分子的相同的不连续表位，然而EV1003识别的GM-CSF分子表位与EV1018和EV1019识别的表位不同。
序列表
全长hGM-CSF
MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEP
TCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDC
WEPVQE
(SEQ ID NO：1)
EV1018和EV1019的不连续表位
＞残基77-80
ELYK
(SEQ ID NO：2)
残基95-104
TMMASHYKQH
(SEQ ID NO：3)
EV1018 CDR
＞EV1018 HC CDR1
SYGMH
(SEQ ID NO：4)
＞EV1018 HC CDR2
LTYHHGNRKFYADSVRG
(SEQ ID NO：5)
＞EV1018 HC CDR3
ESMGAINDN
(SEQ ID NO：6)
＞EV1018 LC CDR1
IGNNNNIGSHAVG
(SEQ ID NO：7)
＞EV1018 LC CDR2
GRSPPS
(SEQ ID NO：8)
＞EV1018 LC CDR3
STWDSSLSAVV
(SEQ ID NO：9)
不带信号序列的EV1018重链
不带信号序列的EV1018轻链
不带信号序列的EV1018重链
带信号序列的EV1018重链
带信号序列的EV1018轻链
带信号序列的EV1018重链
不带信号序列的EV1019重链可变区
不带信号序列的EV1019重链
不带信号序列的EV1019轻链可变区
不带信号序列的EV1019轻链
不带信号序列的EV1019重链
带信号序列的EV1019重链
带信号序列的EV1019轻链
带信号序列的EV1019重链
(SEQ ID NO：313)
EV1018和EV1019的共有序列
＞VH-CDR1
FTFSX1X2MH
X1是Y或H，且X2是G或A
(SEQ ID NO：314)
＞VH-CDR2
X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G
每个Xn独立地是任何天然存在的氨基酸，X3是L或V，X4是T或I，X5是Y或W，X6是R或K，X7是F或Y，且X8是R或K
(SEQ ID NO：315)
＞VH-CDR3
EXnX9GX10XnXnDXn
每个Xn独立地是任何天然存在的氨基酸，X9是M或V，且X10是A或G
(SEQ ID NO：316)
＞VL-CDR1
XnGNXnXnNIGSX11AVG
每个Xn独立地是任何天然存在的氨基酸，且X11是H或Y
(SEQ ID NO：317)
＞VL-CDR2
GX12SPX13SG
X12是R或K，且X13是A或P
(SEQ ID NO：318)
＞VL-CDR3
STWDSX14LSAVX15
X14是R或S，且X15是V或L
(SEQ ID NO：319)
EV1003和EV1007序列
信号序列和别的序列
＞EV1018
MEFGLIWVFLVTLLRGVQC
(SEQ ID NO：324)
＞EV1018-wt IgG1KO
MGWSCIILFLVATATGVHS
(SEQ ID NO：325)
＞EV1018 wt-original
MAWTPLLLQLLTLCSGSWA
(SEQ ID NO：326)
TGTSSDVENYNLVS
(SEQ ID NO：327)
EGSKRPS
(SEQ ID NO：328)
CSYAGSSVVV
(SEQ ID NO：329)
SGNSSNIGSYAVG
(SEQ ID NO：330)
GKSPAS
(SEQ ID NO：331)
STWDSRLSAVL
(SEQ ID NO：332)
SHAMH
(SEQ ID N0：333)
VIWHDGSKKYYADSVKG
(SEQ ID NO：334)
EWVGGTCDS
(SEQ ID NO：335)
SGSSSNIGNSYVY
(SEQ ID NO：336)
RNNRRPS
(SEQ ID NO：337)
ATWDDSLSGRL
(SEQ ID NO：338)
RYGIK
(SEQ ID NO：339)
WINTRSGVPAYAQGFTG
(SEQ ID NO：340)
RPPRFYDKTEYWEDGFDV
(SEQ ID NO：341)
RASHRVSSNYLA
(SEQ ID NO：342)
GASNRAT
(SEQ ID NO：343)
QQYASSPVT
(SEQ ID NO：344)
TFALH
(SEQ ID NO：345)
SINTASGKTKFSTKFQD
(SEQ ID NO：346)
DRFQNIMATILDV
(SEQ ID NO：347)
EV1018重链可变区
EV1018轻链可变区
＞EV1018-VL-wt-original
QSALTQETSVSGTVGQKVTLSCIGNNNNIGSHAVGWYQQISRGAPKMVLFGRSPPSGVPDRFSGSKSGT
TASLIISGLQPEDEADYYCSTWDSSLSAVVFGGGTKLTVLR
(SEQ ID NO：364)
＞EV1018-VL-wt-BI
QSALTQETSVSGTVGQKVTLSCIGNNNNIGSHAVGWYQQISRGAPKMVLFGRSpPSGVPDRFSGSKSGT
TASLIISGLQPEDEADYYCSTWDSSLSAWFGGGTKLTVLG
(SEQ ID NO：365)
Claims (30)
1.分离的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含：
(a)重链，其包含VH-CDR1序列，VH-CDR2序列和VH-CDR3序列，其中：
(i)VH-CDR1序列是SYGMH(SEQ IDNO：4)，
(ii)VH-CDR2序列是LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO：5)，且
(iii)VH-CDR3序列是ESMGAINDN(SEQ ID NO：6)；和
(b)轻链，其包含VL-CDR1序列，VL-CDR2序列和VL-CDR3序列，其中：
(i)VL-CDR1序列是IGNNNNIGSHAVG(SEQ IDNO：7)，
(ii)VL-CDR2序列是GRSPPS(SEQ IDNO：8)，且
(iii)VL-CDR3序列是STWDSSLSAVV(SEQ ID NO：9)，
其中所述抗原结合片段是Fab、scFv或双特异性抗体。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人GM-CSF的KD小于400pM。
3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段中和hGM-CSF活性，从而在TF-1增殖分析中ED80时测得的抗体或其抗原结合片段IC50值小于100pM。
4.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链选自伽玛1(γ1)，伽玛2(γ2)，伽玛3(γ3)，和伽玛4(γ4)组成的组。
5.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链选自伽玛1(γ1)，伽玛2(γ2)，伽玛3(γ3)，和伽玛4(γ4)组成的组。
6.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链是伽玛1(γ1)。
7.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链是伽玛1(γ1)。
8.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链是λ轻链。
9.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链是λ轻链。
10.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链是λ轻链。
11.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链是λ轻链。
12.如权利要求1至11中任一权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链具有氨基酸序列SEQ ID NO：46或SEQ IDNO ：51。
13.如权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链具有氨基酸序列SEQ ID NO：51。
14.如权利要求1至11和13中任一权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO：36。
15.如权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO：36。
16.如权利要求1至11中任一权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区序列是SEQ ID NO：348或SEQ ID NO：361，且其中所述轻链可变区序列是SEQ ID NO：365。
17.如权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区序列是SEQ ID NO：361。
18.如权利要求1至11中任一权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链序列是SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：51，且其中所述轻链序列是SEQ ID NO：36。
19.如权利要求18所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链序列是SEQ ID NO：51。
20.包含权利要求1—19中任一权利要求所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受载体的药用组合物。
21.试剂盒，其包含：(a)权利要求1-19中任一权利要求所述的抗体或其抗原结合片段；和(b)含有所述抗体或其抗原结合片段的一个或更多个容器。
22.分离的核酸，其编码权利要求1—19中任一权利要求所述的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段。
23.如权利要求22所述的核酸，其中所述核酸是DNA。
24.包含权利要求23的DNA的载体。
25.包含权利要求24的载体的宿主细胞，其中所述载体是表达载体。
26.用于药物的权利要求1-19中任一权利要求所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求20所述的药用组合物。
27.用于治疗受试者中选自下组的疾病或病症的权利要求1-19中任一权利要求所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求20所述的药用组合物：慢性阻塞性肺疾病(COPD)，哮喘，囊性纤维化病，间质性肺病，鼻炎，关节炎，银屑病，髓系白血病和多发性硬化。
28.如权利要求27所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述疾病或病症选自支气管哮喘，小儿哮喘，严重哮喘，急性哮喘发作，和类风湿性关节炎。
29.如权利要求27或28所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原 结合片段以不超过500mg的剂量施用给所述受试者。
30.在宿主细胞中生产与hGM-CSF结合的抗hGM-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段至少包含VH-CDR1序列，VH-CDR2序列，VH-CDR3序列，VL-CDR1序列，VL-CDR2序列和VL-CDR3序列，所述方法包括：
(i)获得包含至少一种DNA序列的宿主细胞，所述DNA序列至少编码VH-CDR1序列，VH-CDR2序列，VH-CDR3序列，VL-CDR1序列，VL-CDR2序列和VL-CDR3序列，其中：
(a)VH-CDR1序列是SYGMH(SEQ ID NO：4)，
(b)VH-CDR2序列是LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO：5)，
(c)VH-CDR3序列是ESMGAINDN(SEQ ID NO：6)，
(d)VL-CDR1序列是IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO：7)，
(e)VL-CDR2序列是GRSPPS(SEQ ID NO：8)，且
(f)VL-CDR3序列是STWDSSLSAVV(SEQ ID NO：9)；并
(ii)在适合DNA表达和产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述宿主细胞。
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| UY32030A (es) | 2008-08-06 | 2010-03-26 | Boehringer Ingelheim Int | "tratamiento para diabetes en pacientes inapropiados para terapia con metformina" |
| BRPI0919288A2 (pt) | 2008-09-10 | 2015-12-15 | Boehring Ingelheim Internat Gmbh | teriapia de combinação para tratamento de diabetes e condições relacionadas. |
| CA2746827C (en) | 2008-12-22 | 2018-01-23 | The University Of Melbourne | Osteoarthritis treatment |
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| EP3124041A1 (en) | 2010-06-24 | 2017-02-01 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Diabetes therapy |
| AR083878A1 (es) | 2010-11-15 | 2013-03-27 | Boehringer Ingelheim Int | Terapia antidiabetica vasoprotectora y cardioprotectora, linagliptina, metodo de tratamiento |
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| WO2014068029A1 (en) | 2012-10-31 | 2014-05-08 | Takeda Gmbh | Lyophilized formulation comprising gm-csf neutralizing compound |
| AR093297A1 (es) | 2012-10-31 | 2015-05-27 | Amgen Res (Munich) Gmbh | Formulacion liquida que comprende un compuesto neutralizante de gm-csf |
| US20160024200A1 (en) * | 2013-03-14 | 2016-01-28 | John Schrader | Human monoclonal antibodies that neutralize bioactivity of granulocyte macrophage colony-stimulating factor and methods and uses thereof |
| KR20220045064A (ko) | 2013-08-30 | 2022-04-12 | 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 | 류마티스성 관절염의 치료에서 또는 진통제로서 사용하기 위한 gm-csf 중화 항체 |
| CA2946230A1 (en) | 2014-05-07 | 2015-11-12 | Takeda Gmbh | Liquid formulation comprising gm-csf neutralizing compound |
| JP6920293B2 (ja) * | 2015-10-30 | 2021-08-18 | メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ | ＩｇＧ軽鎖におけるＮ末端切断の防止 |
| US10647767B2 (en) | 2016-09-19 | 2020-05-12 | I-Mab Biopharma Co., Ltd. | Anti-GM-CSF antibodies and uses thereof |
| CN116948035A (zh) * | 2017-06-25 | 2023-10-27 | 西雅图免疫公司 | 多特异性抗体及其制备和使用方法 |
| CA3078849A1 (en) * | 2017-12-28 | 2019-07-04 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Antibodies and variants thereof against pd-l1 |
| US11655293B2 (en) * | 2018-02-22 | 2023-05-23 | Universitat Zurich | Ligands to GM-CSF or GM-CSF-receptor for use in leukemia in a patient having undergone allo-HCT |
| EP3623382A1 (en) * | 2018-09-14 | 2020-03-18 | Universität Zürich | Ligands to gm-csf or gm-csf-receptor for use in leukemia in a patient having undergone allo-hct |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0265384A2 (en) * | 1986-10-17 | 1988-04-27 | Sandoz Ag | Monoclonal antibodies to a colony stimulating factor |
Family Cites Families (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989011864A1 (en) * | 1988-05-31 | 1989-12-14 | Schering Biotech Corporation | Method of treating myeloid leukemias |
| AU630496B2 (en) | 1989-07-14 | 1992-10-29 | Schering Corporation | Antagonists of gm-csf derived from the carboxyl terminus |
| GB8925590D0 (en) * | 1989-11-13 | 1990-01-04 | Central Blood Lab Authority | Monoclonal antibodies |
| US6713610B1 (en) * | 1990-01-12 | 2004-03-30 | Raju Kucherlapati | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| WO1992008474A2 (en) | 1990-11-20 | 1992-05-29 | The National Heart & Lung Institute | Treatment of lung diseases |
| CA2060741A1 (en) | 1991-02-11 | 1992-08-12 | Robert S. Greenfield | Gm-csf inhibiting oligopeptides |
| US5833987A (en) * | 1995-06-07 | 1998-11-10 | Trustees Of Dartmouth College | Treatment of T cell mediated autoimmune disorders |
| EP0799244A1 (en) * | 1995-10-16 | 1997-10-08 | Unilever N.V. | A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue |
| US5662138A (en) * | 1996-06-12 | 1997-09-02 | Wang; Wen-Hsing | Drop head structure |
| US7455836B2 (en) * | 2000-05-08 | 2008-11-25 | The University Of Melbourne | Method of treatment and agents useful for same |
| AU2001268427B2 (en) * | 2000-06-16 | 2007-03-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that immunospecifically bind to blys |
| EP1409530A2 (en) * | 2000-09-19 | 2004-04-21 | Microbia, Inc. | Modulation of secondary metabolite production by zinc binuclear cluster proteins |
| PE20021080A1 (es) * | 2001-04-12 | 2003-02-12 | Boehringer Ingelheim Int | Un anticuerpo especifico fapo bibh1 en el tratamiento del cancer |
| US7084257B2 (en) * | 2001-10-05 | 2006-08-01 | Amgen Inc. | Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity |
| WO2003040341A2 (en) * | 2001-11-07 | 2003-05-15 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Anti-hepatitis a virus antibodies |
| WO2003068924A2 (en) | 2002-02-13 | 2003-08-21 | Ludwig Institute For Cancer Research | Fusion proteins of humanized g250 specific antibodies and uses thereof |
| US7193069B2 (en) * | 2002-03-22 | 2007-03-20 | Research Association For Biotechnology | Full-length cDNA |
| US7361740B2 (en) * | 2002-10-15 | 2008-04-22 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
| AR045563A1 (es) * | 2003-09-10 | 2005-11-02 | Warner Lambert Co | Anticuerpos dirigidos a m-csf |
| US20070254836A1 (en) | 2003-12-03 | 2007-11-01 | Defrees Shawn | Glycopegylated Granulocyte Colony Stimulating Factor |
| UA89364C2 (en) | 2003-12-03 | 2010-01-25 | Биодженерикс Аг | Granulocyte colony stimulating factor peptide conjugate (g-csf) |
| EP1593690B1 (en) | 2004-05-05 | 2009-07-01 | Micromet AG | Preparation of ScFv antibody fragments |
| WO2006011353A1 (ja) | 2004-07-30 | 2006-02-02 | Thk Co., Ltd. | ねじ溝加工方法 |
| RS54127B1 (en) * | 2005-04-18 | 2015-12-31 | Amgen Research (Munich) Gmbh | ANTIBODIES NEUTRALIZERS OF THE HUMAN FACTOR OF STIMULATION OF THE COLONIA OF THE GRANULLocyte MACROPHAGUS |
| BRPI0610796B8 (pt) * | 2005-05-18 | 2021-05-25 | Morphosys Ag | anticorpo humano ou humanizado isolado, ou um fragmento fab ou scfv do mesmo, sequência de ácidos nucleicos, vetor, e, uso de um anticorpo |
| JP4736037B2 (ja) * | 2005-10-26 | 2011-07-27 | 株式会社イーベック | ヒトｇｍ−ｃｓｆに結合するヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原結合部分 |
| HUE032584T2 (en) * | 2006-02-08 | 2017-09-28 | Morphotek Inc | Antigen GM-CSF peptides and GM-CSF antibodies |
| US8398972B2 (en) * | 2006-11-21 | 2013-03-19 | Kalobios Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating dementia using a GM-CSF antagonist |
| WO2008064321A2 (en) | 2006-11-21 | 2008-05-29 | Kalobios Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating chronic inflammatory diseases using a gm-csf antagonist |
| TW200918553A (en) | 2007-09-18 | 2009-05-01 | Amgen Inc | Human GM-CSF antigen binding proteins |
| MX2010005291A (es) | 2007-11-13 | 2010-11-12 | Evec Inc | Anticuerpos monoclonales que se unen a hgm-csf y composiciones medicas que comprenden los mismos. |
-
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-
2010
- 2010-05-06 IL IL205576A patent/IL205576A0/en unknown
- 2010-05-12 TN TN2010000210A patent/TN2010000210A1/fr unknown
- 2010-05-17 ZA ZA2010/03467A patent/ZA201003467B/en unknown
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- 2010-06-11 CO CO10070935A patent/CO6382188A2/es active IP Right Grant
- 2010-06-14 EC EC2010010251A patent/ECSP10010251A/es unknown
-
2011
- 2011-01-27 HK HK11100827.6A patent/HK1146729A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-03-08 HR HRP20130204AT patent/HRP20130204T1/hr unknown
- 2013-09-09 RU RU2013141223/10A patent/RU2013141223A/ru not_active Application Discontinuation
-
2014
- 2014-01-28 US US14/166,803 patent/US20140205611A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0265384A2 (en) * | 1986-10-17 | 1988-04-27 | Sandoz Ag | Monoclonal antibodies to a colony stimulating factor |
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