KR20090113340A

KR20090113340A - 안정한 항체 제제

Info

Publication number: KR20090113340A
Application number: KR1020097019642A
Authority: KR
Inventors: 아르빈드 스리바스타바; 조엘 골드스테인
Original assignee: 임클론 엘엘씨
Priority date: 2007-03-22
Filing date: 2008-03-20
Publication date: 2009-10-29
Also published as: UA96473C2; US20100260766A1; IL200321A0; EP2136839A2; CA2681743A1; DOP2009000222A; CR11005A; JP2010522208A; WO2008116103A3; ZA200905636B; WO2008116103A2; EP2136839A4; TN2009000382A1; CN101668540A; EA200970880A1; MX2009010179A; BRPI0809112A2; ECSP099642A; AU2008228823A1

Abstract

본 발명은 항체의 안정화를 위한 제제 및 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 인슐린-유사 성장 인자-I 수용체에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체의 안정한 용액 제제를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 항체의 수성 제제를 동결건조시키는 것을 포함하는, 인슐린-유사 성장 인자-I 수용체에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체의 안정화 방법을 제공한다. 제제는 처리 및 저장 동안 항체를 안정화하도록 동결건조될 수 있으며, 이어서 제약 투여를 위해 재구성될 수 있다.

IgG1 항체, 인슐린-유사 성장 인자-I 수용체, 안정화, 동결건조

Description

안정한 항체 제제{STABLE ANTIBODY FORMULATIONS}

<상호 참조>

본 출원은 2007년 3월 22일에 출원된 미국 가특허출원 일련번호 제60/919744호 (이의 내용은 전문으로 본원에 참조로 포함됨)의 이익을 주장한다.

본 발명은 인슐린-유사 성장 인자-I 수용체에 결합하는 항체의 안정화를 위한 방법 및 제제에 관한 것이다.

액체 제제 중의 항체는 가수분해, 응집, 산화, 탈아미드화 및 힌지 영역에서의 단편화를 비롯한 각종 화학적 및 물리적 과정에 영향받기 쉽다. 이러한 과정은 기능성 항체의 이용가능성을 감소시키고 그의 항원 결합 특성을 감소 또는 제거함으로써 치료 항체의 임상 효능을 변경 또는 제거할 수 있다. 본 발명은 인슐린-유사 성장 인자 수용체 (IGF-IR)에 인도되는 IgG1 하위부류의 모노클로날 항체의 안정한 제제에 대한 필요성을 다루며, 이들 항체에 대한 안정한 용액 제제 및 안정한 동결건조 제제를 제공한다.

IGF-IR은 통상적인 태아 및 출생후 성장 및 발달에 필수적인 편재하는 막횡단 티로신 키나제 수용체이다. IGF-IR은 세포 증식, 세포 분화, 세포 크기 변화를 자극할 수 있으며, 세포를 아팝토시스로부터 보호할 수 있다. 또한, 세포 형질전환에 대해 준-의무적이라고 간주되었다 (문헌 [Adams et al., Cell. Mol. Life Sci. 57:1050-93 (2000); Baserga, Oncogene 19:5574-81 (2000)]에서 검토됨). IGF-IR은 대부분의 세포 유형의 세포 표면 상에 위치하며, 성장 인자 IGF-I 및 IGF-II (이하에서 IGF라고 집합적으로 지칭됨)에 대한 신호전달 분자로서의 역할을 한다. IGF-IR은 또한 IGF에 결합하는 경우보다 3배 정도 낮은 친화도로 인슐린에 결합한다. IGF-IR은 디술피드 결합에 의해 공유결합으로 연결된 2개의 알파 및 2개의 베타 사슬을 함유하는 예비형성 이종-사량체이다. 수용체 서브유닛은 180kd의 단일 폴리펩티드 사슬의 일부로서 합성되며, 이어서 알파 (130kd) 및 베타 (95kd) 서브유닛으로 단백질 가수분해 처리된다. 전체 알파 사슬은 세포외에 존재하며, 리간드 결합을 위한 부위를 함유한다. 베타 사슬은 막횡단 도메인, 티로신 키나제 도메인, 및 세포 분화와 형질전환에는 필요하지만 유사분열촉진인자(mitogen) 신호전달과 아팝토시스로부터의 보호에는 필요하지 않은 C-말단 연장부를 함유한다.

IGF-IR은 인슐린 수용체 (IR), 특히 베타 사슬 서열 내에서 매우 유사하다 (70％ 상동성). 이러한 상동성 때문에, 최근의 연구는 상기 수용체가 1개의 IR 이량체 및 1개의 IGF-IR 이량체를 함유하는 하이브리드를 형성할 수 있다고 입증하였다 (문헌 [Pandini et al., Clin. Canc. Res. 5:1935-19 (1999)] 참조). 하이브리드의 형성은 통상적인 세포 및 형질전환된 세포 둘 다에서 발생하며, 하이브리드 함량은 세포 내의 2개의 동종이량체 수용체 (IR 및 IGF-IR)의 농도에 좌우된다. 39개의 유방암 시편에 대한 한 연구에서, 비록 IR 및 IGF-IR 둘 다가 모든 종양 샘플에서 과발현되었지만, 하이브리드 수용체 함량은 일관되게 두 동종수용체의 수준을 대략 3배 초과하였다 (문헌 [Pandini et al., Clin. Canc. Res. 5:1935-44 (1999)] 참조). 비록 하이브리드 수용체가 IR 및 IGF-IR 쌍으로 구성되지만, 하이브리드는 IGF-IR의 친화도와 유사한 친화도로 IGF에 선택적으로 결합하며, 인슐린에는 단지 약하게만 결합한다 (문헌 [Siddle and Soos, The IGF System. Humana Press. pp. 199-225. 1999] 참조). 따라서 이러한 하이브리드는 IFG에 결합하여 통상적인 세포 및 형질전환된 세포 둘 다에서 신호를 도입할 수 있다.

제2 IGF 수용체인 IGF-IIR 또는 만노스-6-포스페이트 (M6P) 수용체가 또한 IGF-II 리간드에 고친화도로 결합하지만, 티로신 키나제 활성이 결핍되어 있다 (문헌 [Oates et al., Breast Cancer Res. Treat. 47:269-81 (1998)] 참조). 이는 IGF-II를 분해시키기 때문에, IGF-II 리간드의 성장 촉진 효과에 대해 길항작용을 하는 IGF-II의 싱크(sink)라고 간주된다. 종양 세포에서 IGF-IIR의 손실은 IGF-II와 IGF-IR의 결합에 대해 길항작용 효과를 면제시켜 성장 잠재력을 증진시킬 수 있다 (문헌 [Byrd et al., J. Biol. Chem. 274:24408-16 (1999)] 참조).

IGF-I의 내분비 발현은 주로 성장 호르몬에 의해 조절되며, 간에서 생성되지만, 최근의 증거는 다수의 다른 조직 유형도 IGF-I을 발현할 수 있다는 것을 제시한다. 따라서, 이 리간드는 내분비 및 국소분비 조절될 뿐만 아니라 여러 유형의 종양 세포에서 자가분비된다 (문헌 [Yu, H. and Rohan, J., J. Natl. Cancer Inst. 92:1472-89 (2000)] 참조).

IGF에 대한 특정 결합 친화도를 갖는 6개의 IGF 결합 단백질 (IGFBP)이 혈청 중에서 확인되었다 (문헌 [Yu, H. and Rohan, J., J. Natl. Cancer Inst. 92:1472- 89 (2000)] 참조). IGFBP는 번역후 변형의 결과로서 결합 단백질의 분자 구조에 의해 측정된 바와 같이, IGF의 작용을 증진 또는 억제시킬 수 있다. 이들의 주요 역할은 IGF의 전달, 단백질 가수분해로부터 IGF의 보호, 및 IGF와 IGF-IR의 상호작용의 조절이다. 단지 약 1％의 혈청 IGF-I만이 유리 리간드로서 존재하며, 나머지는 IGFBP와 결합한다 (문헌 [Yu, H. and Rohan, J., J. Natl. Cancer Inst. 92:1472-89 (2000)] 참조).

리간드 (IGF)의 결합시, IGF-IR은 베타 사슬의 촉매 도메인 내 보존된 티로신 잔기에서 자가인산화된다. 베타 사슬 내 추가의 티로신 잔기에서 후속 인산화는 신호전달 케스케이드에 중요한 하류 분자의 동원을 위해 도킹(docking) 부위를 제공한다. IGF 신호의 도입을 위한 주요 경로는 유사분열촉진인자 활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 및 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)이다 (문헌 [Blakesley et al. In: The IGF System. Humana Press. 143-163 (1999)]에서 검토됨). MAPK 경로는 주로 IGF 자극 후 유도된 유사분열촉진 신호를 담당하고, PI3K는 항-아팝토시스 또는 생존 과정의 IGF-의존성 유도를 담당한다.

IGF-IR 신호전달의 중요 역할은 그의 항-아팝토시스 또는 생존 기능이다. 활성화된 IGF-IR은 PI3K 및 Akt의 하류 인산화, 또는 단백질 키나제 B에 신호를 전달한다. Akt는 인산화를 통해, 프로그래밍된 세포 사멸의 억제에 필수적인 BAD와 같은 분자를 효과적으로 차단할 수 있으며, 아팝토시스의 개시를 억제할 수 있다 (문헌 [Datta et al., Cell 91:231-41 (1997)] 참조). 아팝토시스는 통상적인 발달 과정에 결정적인 중요한 세포 메카니즘이다 (문헌 [Oppenheim, Annu. Rev. Neurosci. 14:453-501 (1991)] 참조). 심하게 손상된 세포의 제거를 수행하고 종양형성을 촉진할 수 있는 돌연변이성 병변의 잠재적 지속성을 감소시키는 중요 메카니즘이다. 이를 위해, 마우스 트랜스제닉 모델에서 IGF 신호전달의 활성화가 자발적 종양의 형성을 촉진할 수 있다는 것이 입증되었다 (문헌 [DiGiovanni et al., Cancer Res. 60:1561-70 (2000)] 참조). 또한, IGF 과발현은 화학요법 유도된 세포 사멸로부터 세포를 구제할 수 있으며, 종양 세포 약물 내성에 중요한 인자일 수 있다 (문헌 [Gooch et al., Breast Cancer Res. Treat. 56:1-10 (1999)] 참조). 결과적으로, IGF 신호전달 경로의 조절은 화학치료제에 대한 종양 세포의 감수성을 증가시킨다고 밝혀졌다 (문헌 [Benini et al., Clinical Cancer Res. 7:1790-97 (2001)] 참조).

다수의 조사 및 임상 연구는 암의 발달, 유지 및 진행에 IGF-IR 및 이의 리간드 (IGF)를 포함시켰다. 종양 세포에서, 종종 IGF 리간드의 과발현과 함께 수용체의 과발현은 이들 신호의 강화작용을 유도하며, 그 결과 세포 증식 및 생존을 증진시킨다. IGF-I 및 IGF-II는 전립선 (문헌 [Nickerson et al., Cancer Res. 61:6276-80 (2001); Hellawell et al., Cancer Res. 62:2942-50 (2002)] 참조), 유방 (문헌 [Gooch et al., Breast Cancer Res. Treat. 56:1-10 (1999)] 참조), 폐, 대장 (문헌 [Hassan and Macaulay, Ann. Oncol. 13:349-56 (2002)] 참조), 위, 백혈병, 췌장, 뇌, 골수종 (문헌 [Ge and Rudikoff, Blood 96:2856-61 (2000] 참조), 흑색종 (문헌 [All-Ericsson et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43:1-8 (2002)] 참조), 및 난소 (문헌 [Macaulay, Br. J. Cancer 65:311-20 (1990)]에서 검토됨)를 비롯한 각종 암 세포주의 강력한 유사분열촉진인자라고 밝혀졌으며, 이러한 효과는 IGF-IR을 통해 매개된다. 혈청 중 IGF-I의 높은 순환 수준은 유방암, 전립선암 및 대장암의 증가된 위험과 연관되어 있었다 (문헌 [Pollak, Eur. J. Cancer 36:1224-28 (2000)] 참조). 대장암의 마우스 모델에서, 생체내에서 순환하는 IGF-I 수준의 증가는 종양 성장 및 전이의 발생률을 유의하게 증가시켰다 (문헌 [Wu et al., Cancer Res. 62: 1030-35 (2002)] 참조). 트랜스제닉 마우스의 표피 기저 세포에서 IGF-I의 구조적 발현은 자발적 종양 형성을 촉진한다고 밝혀졌다 (문헌 [DiGiovanni et al., Cancer Res. 60:1561-1570 (2000; Bol et al., Oncogene 14:1725-1734 (1997)] 참조). 세포주 및 종양에서 IGF-II의 과발현은 높은 빈도로 발생하며, IGF-II 유전자의 게놈 각인의 손실로부터 초래될 수 있다 (문헌 [Yaginuma et al., Oncology 54:502-7 (1997)] 참조). 수용체 과발현은 폐 (문헌 [Quinn et al., J. Biol. Chem. 271:11477-83 (1996)] 참조), 유방 (문헌 [Cullen et al., Cancer Res. 50: 48-53 (1990); Peyrat and Bonneterre, Cancer Res. 22:59-67 (1992); Lee and Yee, Biomed. Pharmacother. 49:415-21 (1995)] 참조), 육종 (문헌 [van Valen et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 118:269-75 (1992); Scotlandi et al., Cancer Res. 56:4570-74 (1996)] 참조), 전립선 (문헌 [Nickerson et al., Cancer Res. 61:6276-80 (2001)] 참조), 및 대장 (문헌 [Hassan and Macaulay, Ann. Oncol. 13:349-56 (2002)] 참조)을 비롯한 다수의 다 양한 인간 종양 유형에서 입증되었다. 또한, 고도 전이성 암세포는 전이하기 덜 용이한 종양 세포보다 더 많이 발현된 IGF-II 및 IGF-IR을 갖는다고 밝혀졌다 (문헌 [Guerra et al., Int. J. Cancer 65:812-20 (1996)] 참조). 세포 증식 및 형질전환에서 IGF-IR의 중요한 역할은 IGF-IR 넉아웃(knockout) 유래된 마우스 배아 섬유모세포의 실험에서 입증되었다. 이들 주요 세포는 10％ 혈청을 함유하는 배지에서 유의하게 감소된 비율로 성장하며, SV40 거대 T를 비롯한 각종 종양유전자에 의해 형질전환되지 못한다 (문헌 [Sell et al., Mol. Cell. Biol. 3604-12 (1994)] 참조). 최근에 일부 형태의 유방암에서 약물 허셉틴(Herceptin)에 대한 내성은 그 암에서의 IGF-IR 신호전달의 활성화에 기인할 수 있다는 것이 입증되었다 (문헌 [Lu et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:1852-57 (2001)] 참조). 따라서, IGF-IR의 과발현 또는 활성화는 종양형성에서 뿐만 아니라 종양 세포 약물 내성에서도 주요한 결정자일 수 있다.

IGF계의 활성화는 또한 말단비대증 (문헌 [Drange and Melmed. In: The IGF System. Humana Press. 699-720 (1999)] 참조), 망막 신혈관신생 (문헌 [Smith et al., Nature Med. 12:1390-95 (1999)] 참조), 및 건선 (문헌 [Wraight et al., Nature Biotech. 18:521-26 (2000)] 참조)을 비롯한, 암 이외의 여러 병리학적 상태와 관련될 수 있다. 근래의 연구에서, IGF-IR을 표적화하는 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드 제조는 마우스 모델에서 인간 건선성 피부 이식물 중 표피 세포의 과증식을 유의하게 억제하는데 효과적이었으며, 이는 항-IGF-IR 요법이 이러한 만성 장애를 위한 유효한 치료법일 수 있다는 것을 제시한다.

세포에서 IGF-IR 신호전달 경로를 억제하는 각종 전략이 개발되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 건선에 대해 상기에서 나타낸 바와 같이, 시험관내 및 실험 마우스 모델에서 효과적이었다. 또한, IGF-IR을 표적화하며 시험관내 및 생체내 항-증식 활성을 갖는 억제성 펩티드가 생성되었다 (문헌 [Pietrzkowski et al., Cancer Res. 52:6447-51 (1992); Haylor et al., J. Am. Soc. Nephrol. 11:2027-35 (2000)] 참조). IGF-IR의 C-말단으로부터의 합성 펩티드 서열은 아팝토시스를 유도하며 종양 성장을 유의하게 억제한다고 밝혀졌다 (문헌 [Reiss et al., J. Cell. Phys. 181:124-35 (1999)] 참조). 또한, 종양 세포주에서의 과발현시 리간드에 대한 야생형 IGF-IR과 경쟁하여 시험관내 및 생체내 종양 세포 성장을 효과적으로 억제하는 IGF-IR의 여러 우세한 음성 돌연변이체가 생성되었다 (문헌 [Scotlandi et al., Int. J. Cancer 101:11-6 (2002); Seely et al., BMC Cancer 2:15 (2002)] 참조). 또한, 가용성 형태의 IGF-IR도 생체내 종양 성장을 억제한다고 입증되었다 (문헌 [D'Ambrosio et al., Cancer Res. 56:4013-20 (1996)] 참조). 또한, 인간 IGF-IR에 인도된 항체도 유방암 (문헌 [Artega and Osborne, Cancer Res. 49:6237-41 (1989)] 참조), 에윙(Ewing) 골육종 (문헌 [Scotlandi et al., Cancer Res. 58:4127-31 (1998)] 참조), 및 흑색종 (문헌 [Furlanetto et al., Cancer Res. 53:2522-26 (1993)] 참조)으로부터 유래된 세포주를 비롯하여 시험관내 종양 세포 증식 및 생체내 종양형성을 억제한다고 밝혀졌다. 항체는 주로 1) 특정 단백질 항원에 대한 높은 선택성을 가질수 있고, 2) 항원에 대해 고친화도 결합을 나타낼 수 있고, 3) 생체내 긴 반감기를 갖고, 천연 면역 생성물이므로 4) 낮 은 생체내 독성을 나타내기 때문에 매력적인 치료제이다 (문헌 [Park and Smolen. In: Advances in Protein Chemistry. Academic Press. pp:360-421 (2001)] 참조). 그러나, 비인간 공급원, 예를 들어 마우스로부터 유래된 항체는 반복된 적용 후 치료 항체에 대해 지시된 면역 반응을 수행하여 항체의 유효성을 중화시킬 수 있다. 완전 인간 항체는 뮤린 또는 자연발생 면역-반응성 항체와 유사한 인간에서의 키메릭 항체보다 덜 면역성일 것이므로 인간 치료제로서의 성공을 위해 최대 잠재력을 제공한다. 이를 위해, 치료 용도의 고친화도 인간 항-IGF-IR 모노클로날 항체의 안정한 제제를 개발할 필요가 있다.

<발명의 개요>

본 발명은 항체 제조의 안정화를 위한 제제 및 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 인슐린-유사 성장 인자-I 수용체에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체 및 완충액을 포함하는 안정한 용액 (또는 액체) 제제를 제공한다. 다른 실시양태에서, 액체 제제 중 항체 농도는 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/ml 범위이다. 바람직하게, 항체는 IMC-A12 또는 IMC-2F8이다. 보다 바람직하게, 항체는 IMC-A12이다.

한 실시양태에서, 안정한 항체 용액 제제는 시트레이트 완충액을 함유한다. 다른 실시양태에서, 시트레이트 완충액은 농도가 약 5 내지 약 50 mM이다. 다른 실시양태에서, 시트레이트 완충액은 농도가 약 10 mM이다.

한 실시양태에서, 안정한 항체 용액 제제는 글리신을 함유한다. 다른 실시양태에서, 글리신 농도는 약 75 mM 내지 약 150 mM이다. 다른 실시양태에서, 글리 신 농도는 약 100 mM이다.

한 실시양태에서, 안정한 항체 용액 제제는 NaCl을 함유한다. 다른 실시양태에서, NaCl은 농도가 약 75 내지 약 150 mM이다. 다른 실시양태에서, NaCl은 농도가 약 100 mM이다.

한 실시양태에서, 안정한 항체 용액 제제는 계면활성제를 함유한다. 다른 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 (트윈(TWEEN), a/k/a 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜), 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 다른 실시양태에서, 계면활성제는 농도 약 0.001％ 내지 약 1.0％ (중량/부피)의 폴리소르베이트 80 (트윈 80)이다. 다른 실시양태에서, 트윈 80은 농도가 약 0.01％ (중량/부피)이다.

한 실시양태에서, 안정한 항체 용액 제제의 pH는 약 6.0 내지 약 7.0이다. 다른 실시양태에서, pH는 약 6.0 내지 약 6.5이다. 다른 실시양태에서, pH는 약 6.5이다.

한 실시양태에서, 안정한 항체 용액 제제는 약 5 mg/ml IMC-A12, 약 10 mM 시트르산나트륨, 약 100 mM 글리신, 약 100 mM NaCl 및 약 0.01 ％ 트윈 80을 포함하며, 상기 제제는 pH가 약 6.5이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 인슐린-유사 성장 인자-I 수용체에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체를 포함하는 안정한 동결건조 항체 제제를 제공하며, 상기 제제는 동결건조된다. 한 실시양태에서, 항체는 IMC-A12이다. 다른 실시양태에서, IMC-A12 농도는 동결건조 전에 30 mg/ml이다.

한 실시양태에서, 안정한 동결건조 항체 제제는 히스티딘 완충액을 함유한다. 다른 실시양태에서, 히스티딘 농도는 동결건조 전에 약 10 mM 내지 약 50 mM이다. 다른 실시양태에서, 히스티딘 농도는 동결건조 전에 약 10 mM이다. 다른 실시양태에서, 완충액은 동결건조 전에 pH 약 6.5이다.

한 실시양태에서, 안정한 동결건조 항체 제제는 동결건조 보호제를 함유한다. 다른 실시양태에서, 동결건조 보호제는 당이다. 다른 실시양태에서, 동결건조 보호제는 트레할로스이다. 다른 실시양태에서, 트레할로스 농도는 동결건조 전에 약 4.6％이다. 한 실시양태에서, 트레할로스 농도 대 항체 농도의 비는 동결건조 전에 약 200 내지 약 1000이다. 다른 실시양태에서, 트레할로스 농도 대 항체 농도의 비는 동결건조 전에 약 600이다.

한 실시양태에서, 안정한 동결건조 항체 제제는 증량제(bulking agent)를 함유한다. 다른 실시양태에서, 증량제는 만니톨 또는 글리신이다.

한 실시양태에서, 안정한 동결건조 항체 제제는 약 30 mg/ml IMC-A12, 약 10 mM 히스티딘 및 약 4.6 ％ 트레할로스 (중량/부피)를 포함하고, pH가 약 6.5이며, 상기 농도 및 pH는 동결건조 전의 것이다.

도 1은 IMC-A12의 용액 제제 중 pH의 함수로서 용융 온도 (Tm1)의 변화를 도시한다. (표 2로부터의) 실험 제제 중 IMC-A12에 대한 열 용융 곡선을 시차 주사 열량측정법 (DSC)에 의해 분석하여 시험 조건에서 IMC-A12에 대한 전이 온도 (Tm)를 평가하였다.

도 2는 IMC-A12의 용액 제제 중 pH의 함수로서 불용성 응집물의 형성으로 인한 손실(％)의 변화를 도시한다. 27.5 mL 유리 바이알 내 5 mg/mL의 IMC-A12 5 mL를 포함하는 표 2에 기재된 바와 같은 샘플을 300 RPM으로 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 손실(％)을 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 3은 IMC-A12의 용액 제제 중 pH의 함수로서 단량체(％)의 변화를 도시한다. 27.5 mL 유리 바이알 내 5 mg/mL의 IMC-A12 5 mL를 포함하는 표 2에 기재된 바와 같은 샘플을 300 RPM으로 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 4는 IMC-A12의 용액 제제 중 40℃에서의 pH의 함수로서 단량체(％)의 변화를 도시한다. (표 2에 나열된) 다양한 pH 완충액 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 40℃에서 3주 동안 인큐베이션하였다. 단량체(％)에 대한 pH의 효과를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 5는 IMC-A12의 용액 제제 중 50℃에서의 pH의 함수로서 단량체(％)의 변화를 도시한다. (표 2의) 다양한 pH 완충액 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 50℃에서 1주 동안 인큐베이션하였다. 단량체(％)에 대한 pH의 효과를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 6은 IMC-A12의 용액 제제 중 -20℃ 및 -70℃에서의 pH의 함수로서 단량체(％)의 변화를 도시한다. (표 2에 나열된) 다양한 pH 완충액 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 -20℃ 및 -70℃에서 3주 동안 인큐베이션하였다. 단량체(％)에 대한 pH의 효과를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 7은 IMC-A12의 용액 제제의 DSC 연구에 대한 예상 프로파일러(profiler)를 도시한다. 전이 온도에 대한 완충액 유형, pH, 트윈 80 농도, NaCl 농도 및 글리신 농도의 효과의 예상 프로파일러를 연구하였다. 단백질 농도는 5 mg/mL이었고, 온도 경사는 1.5℃/분의 주사율로 5℃에서 95℃였다. 주요 전이 피크에 상응하는 용융 온도를 선형 회귀 모델에 적합시켜 시험 변수의 효과를 평가하였다.

도 8은 IMC-A12의 용액 제제의 교반 연구에 대한 예상 프로파일러를 도시한다. 27.5 mL 유리 바이알 내 5 mg/mL의 IMC-A12 5 mL를 갖는 표 3에 기재된 샘플을 플랫폼 진탕기 상에서 300 RPM으로 교반하였다. 연구를 실온에서 72시간 이하 동안 수행하였다. 용액 탁도 및 단량체(％)를 교반 시간의 함수로서 결정하였다. JMP 소프트웨어를 사용하여 반응을 선형 회귀 모델에 적합시킴으로써 탁도 및 단량체(％)에 대한 시험 변수의 효과를 평가하였다.

도 9는 40℃에서 4주 인큐베이션 후 IMC-A12의 용액 제제 중에 남아있는 단량체(％)를 도시한다. 표 3 제제 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 40℃에서 4주 동안 인큐베이션하였다. 40℃에서 4주 인큐베이션 후 출발 물질 및 시험 제제의 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 10은 50℃에서 2주 인큐베이션 후 IMC-A12의 용액 제제 중에 남아있는 단량체(％)를 도시한다. 표 3 제제 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 50℃에서 2주 동안 인큐베이션하였다. 50℃에서 2주 인큐베이션 후 출발 물질 및 시험 제제의 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 11은 IMC-A12의 용액 제제의 실시간 가속 온도 안정성에 대한 예상 프로 파일러를 도시한다. 단량체(％), 응집물(％) 및 분해물(％)에 대한 pH, NaCl 농도, 글리신 농도, 시간 및 온도의 효과의 예상 프로파일러를 연구하였다.

도 12는 교반 시간의 함수로서 IMC-A12의 시트레이트 및 PBS 제제의 용액 탁도의 비교를 도시한다. 27.5 mL 유리 바이알 내 5 mg/mL의 IMC-A12를 함유하는 샘플을 플랫폼 진탕기 상에서 300 RPM으로 교반하였다. 연구를 실온에서 72시간 이하 동안 수행하였다. 시마추(Shimatzu) 1601 바이오스펙 분광광도계를 사용하여 350 nm에서의 흡광도에 의해 탁도를 분석하였다.

도 13은 교반 시간의 함수로서 시트레이트 및 PBS 제제 중 IMC-A12 손실(％)의 비교를 도시한다. 27.5 mL 유리 바이알 내 5 mg/mL의 IMC-A12를 함유하는 샘플을 플랫폼 진탕기 상에서 300 RPM으로 교반하였다. 연구를 실온에서 72시간 이하 동안 수행하였다. (불용성 응집물의 형성으로 인한) 물질 손실(％)을 SEC-HPLC에 의해 측정하였다.

도 14는 교반 시간의 함수로서 시트레이트 및 PBS 제제 중 IMC-A12 단량체(％)의 비교를 도시한다. 27.5 mL 유리 바이알 내 5 mg/mL의 IMC-A12를 함유하는 샘플을 플랫폼 진탕기 상에서 300 RPM으로 교반하였다. 연구를 실온에서 72시간 이하 동안 수행하였다. 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 15는 40℃에서의 인큐베이션 시간의 함수로서 PBS 및 시트레이트 제제 중 IMC-A12 단량체(％)의 비교를 도시한다. 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 16은 40℃에서의 인큐베이션 시간의 함수로서 PBS 및 시트레이트 용액 제 제 중 IMC-A12 응집물(％)의 비교를 도시한다. 응집물(％)을 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 17은 40℃에서의 인큐베이션 시간의 함수로서 PBS 및 시트레이트 용액 제제 중 IMC-A12 분해물(％)의 비교를 도시한다. 분해물(％)을 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 18은 40℃에서 3개월 인큐베이션 후, PBS 및 시트레이트 용액 제제 중 IMC-A12에 대한 SDS-PAGE (환원)를 도시한다. 환원 SDS-PAGE를 4 내지 20％의 트리스-글리신 구배 겔 상에서 진행시켰다. 샘플 10 ㎍을 10 ㎕ 부피로 레인마다 로딩하였다. 겔을 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하였다. 레인 4의 "시트레이트"는 5 mg/mL IMC-A12, 10 mM 시트레이트, 100 mM 글리신, 100 mM NaCl, 0.01％ 트윈 80, pH 6.5이다. 레인 2 및 3의 "PBS"는 포스페이트 완충 식염수이다 (하기 표 3 및 4 참조).

도 19는 40℃에서 3개월 인큐베이션 후, PBS 및 시트레이트 용액 제제 중 IMC-A12에 대한 SDS-PAGE (비환원)를 도시한다. 비환원 SDS-PAGE를 4 내지 20％ 트리스-글리신 구배 겔을 사용하여 진행시켰다. 샘플 10 ㎍을 10 ㎕ 부피로 로딩하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다. 레인 4의 "시트레이트"는 5 mg/mL IMC-A12, 10 mM 시트레이트, 100 mM 글리신, 100 mM NaCl, 0.01％ 트윈 80, pH 6.5이다. 레인 2 및 3의 "PBS"는 포스페이트 완충 식염수이다 (하기 표 3 및 4 참조).

도 20은 40℃에서 3개월 인큐베이션 후, PBS 및 시트레이트 용액 제제 중 IMC-A12에 대한 등전점 전기영동 (IEF) 겔을 도시한다. IEF는 pH 범위 6.0 내지 10.5의 이소겔(IsoGel)^® 아가로스 IEF 플레이트를 사용하여 수행하였다. 시험 샘플을 0.5％ 트윈 80을 함유하는 밀리큐(milliQ) 워터로 완충액 교환하였다. 10 ㎍ 샘플을 10 ㎕ 부피로 로딩하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다. 레인 4의 "시트레이트"는 5 mg/mL IMC-A12, 10 mM 시트레이트, 100 mM 글리신, 100 mM NaCl, 0.01％ 트윈 80, pH 6.5이다. 레인 2 및 3의 "PBS"는 포스페이트 완충 식염수이다 (하기 표 3 및 4 참조).

표 21은 -20℃에서의 시간의 함수로서 단량체(％)의 변화를 도시한다. PBS 또는 시트레이트 용액 제제 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 -20℃에서 3개월 이하 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 22는 -70℃에서의 인큐베이션 시간의 함수로서 단량체(％)의 변화를 도시한다. PBS 또는 시트레이트 용액 제제 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 -70℃에서 3개월 이하 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 23은 -20℃에서 냉동-해동 주기 수의 함수로서 단량체(％)의 변화를 도시한다. 시험 샘플을 냉동-건조기에서 1℃/분의 경사율로 -20℃로 냉동시켜 IMC-A12의 냉동-해동 안정성을 평가하였다. 샘플을 1시간 동안 인큐베이션하고, 1℃/분의 경사율로 4℃에서 해동시켰다. 냉동-해동 과정을 15회 이하 반복하고, 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 24는 -70℃에서 냉동-해동 주기 수의 함수로서 단량체(％)의 변화를 도시 한다. 시험 샘플을 냉동-건조기에서 1℃/분의 경사율로 -70℃로 냉동시켜 IMC-A12의 냉동-해동 안정성을 평가하였다. 샘플을 1시간 동안 인큐베이션하고, 1℃/분의 경사율로 4℃에서 해동시켰다. 냉동-해동 과정을 15회 이하 반복하고, 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 25는 완충액 유형, 냉동 보호제 및 동결건조 보호제, 증량제, 시간 및 온도의 함수로서 단량체(％)의 변화를 도시한다.

도 26은 완충액 유형, 냉동 보호제 및 동결건조 보호제, 증량제, 시간 및 온도의 함수로서 응집물(％)의 변화를 도시한다.

도 27은 완충액 유형, 냉동 보호제 및 동결건조 보호제, 증량제, 시간 및 온도의 함수로서 분해물(％)의 변화를 도시한다.

도 28은 완충액 유형, 냉동 보호제 및 동결건조 보호제, 증량제, 시간 및 온도의 함수로서 용액 탁도의 변화를 도시한다.

도 29는 IMC-A12의 동결건조 제제에 대한 단량체(％)의 변화를 도시한다. 표 6에서 동결건조 제제 5, 6, 9 및 10 중 단량체(％)에 대한 3개월 동안의 40℃ 및 50℃에서의 인큐베이션의 효과를 조사하였다. 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 30은 IMC-A12의 동결건조 제제에 대한 응집물(％)의 변화를 도시한다. 표 6에서 동결건조 제제 5, 6, 9 및 10 중 응집물(％)에 대한 3개월 동안의 40℃ 및 50℃에서의 인큐베이션의 효과를 분석하였다. 응집물(％)을 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 31은 IMC-A12의 동결건조 제제에 대한 분해물(％)의 변화를 도시한다. 표 6에서 동결건조 제제 5, 6, 9 및 10 중 분해물(％)에 대한 3개월 동안의 40℃ 및 50℃에서의 인큐베이션의 효과를 분석하였다. 분해물(％)을 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 32는 IMC-A12의 동결건조 제제에 대한 용액 탁도의 변화를 도시한다. 표 6에서 동결건조 제제 5, 6, 9 및 10의 탁도에 대한 3개월 동안의 40℃ 및 50℃에서의 인큐베이션의 효과를 밀리큐 워터에 의해 5 mg/mL로 재구성한 후 분석하였다. 시마추 1601 바이오스펙 분광광도계를 사용하여 350 nm에서의 흡광도에 의해 탁도를 평가하였다.

도 33은 인큐베이션 4개월 후 남아있는 단량체(％)의 변화를 도시한다. 표 7로부터의 동결건조 IMC-A12 제제를 4℃, 40℃ 및 50℃에서 4개월 이하 동안 인큐베이션하였다. 동결건조 샘플을 밀리큐 워터에 의해 5 mg/mL로 재구성하고, SEC-HPLC에 의해 분석하여 남아있는 단량체(％)를 결정하였다.

도 34는 동결건조 전 (점선) 및 동결건조 후 (실선) IMC-A12의 원편광 이색성 스펙트럼을 도시한다. 동결건조 공정이 A12의 2차 구조를 변경시키지 않는다는 것을 보장하기 위해, 동결건조 전 및 후 IMC-A12의 2차 구조를 원편광 이색성에 의해 조사하였다. IMC-A12를 밀리큐 워터에 의해 0.1 mg/mL로 희석 또는 재구성하고, 원편광 이색성 스펙트럼을 자스코(Jasco) 810 원편광 이색성 분광광도계를 사용하여 수집하였다.

도 35는 40℃에서의 시간의 함수로서 단량체(％)의 변화를 도시한다. PBS 및 시트레이트 완충액 중 IMC-A12 용액 제제 및 바람직한 동결건조 제제 중 IMC-A12를 40℃에서 4개월 동안 인큐베이션하였다. 동결건조 샘플을 밀리큐 워터 중에서 재구성하고, 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 36은 50℃에서의 시간의 함수로서 단량체(％)의 변화를 도시한다. PBS 및 시트레이트 완충액 중 IMC-A12 용액 제제 및 바람직한 동결건조 제제 중 IMC-A12를 50℃에서 4개월 동안 인큐베이션하였다. 동결건조 샘플을 밀리큐 워터 중에서 재구성하고, 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 37은 40℃에서의 시간의 함수로서 응집물(％)의 변화를 도시한다. PBS 및 시트레이트 완충액 중 IMC-A12 용액 제제 및 바람직한 동결건조 제제 중 IMC-A12를 40℃에서 4개월 동안 인큐베이션하였다. 동결건조 샘플을 밀리큐 워터 중에서 재구성하고, 응집물(％)을 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 38은 50℃에서의 시간의 함수로서 응집물(％)의 변화를 도시한다. PBS 및 시트레이트 완충액 중 IMC-A12 용액 제제 및 바람직한 동결건조 제제 중 IMC-A12를 50℃에서 4개월 동안 인큐베이션하였다. 동결건조 샘플을 밀리큐 워터 중에서 재구성하고, 응집물(％)을 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 39는 40℃에서의 시간의 함수로서 분해물(％)의 변화를 도시한다. PBS 및 시트레이트 완충액 중 IMC-A12 용액 제제 및 바람직한 동결건조 제제 중 IMC-A12를 40℃에서 4개월 동안 인큐베이션하였다. 동결건조 샘플을 밀리큐 워터 중에서 재구성하고, 분해물(％)을 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 40은 50℃에서의 시간의 함수로서 분해물(％)의 변화를 도시한다. PBS 및 시트레이트 완충액 중 IMC-A12 용액 제제 및 바람직한 동결건조 제제 중 IMC-A12를 40℃ 및 50℃에서 4개월 동안 인큐베이션하였다. 동결건조 샘플을 밀리큐 워터 중에서 재구성하고, 분해물(％)을 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.

도 41은 4개월 인큐베이션된 샘플의 SDS-PAGE (환원) 분석을 도시한다. PBS 및 시트레이트 완충액 중 IMC-A12 용액 제제 및 바람직한 동결건조 제제 중 IMC-A12를 4℃, 40℃ 및 50℃에서 4개월 동안 인큐베이션하였다. 동결건조 샘플을 밀리큐 워터 중에서 재구성하고, 10 ㎍을 4 내지 20％ 트리스-글리신 겔에 로딩하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다.

액체 제제 중의 항체는 가수분해, 응집, 산화, 탈아미드화 및 힌지 영역에서의 단편화를 비롯한 각종 화학적 및 물리적 과정에 영향받기 쉽다. 이러한 과정은 기능성 항체의 이용가능성을 감소시키고 그의 항원 결합 특성을 감소 또는 제거함으로써 치료 항체의 임상 효능을 변경 또는 제거할 수 있다. 본 발명은 모노클로날 항체의 안정한 제제에 대한 필요성을 다루며, 이들 항체를 동결건조시키기 위한 방법 및 제제를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 인슐린-유사 성장 인자-I 수용체에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체 및 완충액을 포함하는 안정한 용액 제제 (본원에서 "액체 제제"라고도 지칭됨)를 제공한다. 다른 실시양태에서, 항체는 IMC-A12이다. 또다른 실시양태에서, 항체는 IMC-2F8이다.

IMC-A12는 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 (IGF-1R)에 인도되는 IgG₁ 하위부류의 완전 인간 모노클로날 항체이다. IMC-A12 항체는 본원에 전문이 참조로 포함된 PCT 공개공보 WO/2005/016970호에 개시되어 있다. IMC-A12에 대한 중쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 1 및 서열 2로 표시된다. IMC-A12에 대한 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 3 및 서열 4로 표시된다. IMC-A12를 사용하는 골암의 치료 방법은 본원에 전문이 참조로 포함된 PCT 공개공보 WO/2006/138729호에 개시되어 있다.

IMC-2F8은 또한 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 (IGF-1R)에 인도되는 IgG₁ 하위부류의 완전 인간 모노클로날 항체이다. IMC-A12 항체는 본원에 전문이 참조로 포함된 PCT 공개공보 WO/2005/016970호에 개시되어 있다. IMC-2F8에 대한 중쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 1 및 서열 2로 표시된다. IMC-2F8에 대한 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 5 및 서열 6으로 표시된다.

제제 선별(screening)을 수행하여 초기 제제인 포스페이트 완충 식염수 (PBS) (pH 7.2)의 견고성(robustness)을 결정하였다. 선별 연구로부터 PBS 중 IMC-A12가 응집, 침전, 분해, 가수분해 및 광에 감수성이라는 것을 결정하였다. 이외에도, 소량의 주사가능물질에 대한 미립자 물질 시험을 통과할 수 없었다. pH 6.5에서 5 mg/mL IMC-A12, 10 mM 시트르산나트륨, 100 mM 글리신, 100 mM NaCl 및 0.01％ 트윈 80으로 이루어진 개선된 용액 제제를 개발하였다. PBS 제제와 달리 시트레이트 제제는 미립자를 함유하지 않으며, 안정성을 개선시켰다.

다른 실시양태에서, 30 mg/mL IMC-A12, 10 mM 히스티딘 (pH 6.5) 및 4.6％ 트레할로스를 함유하는 냉동-건조 제제는 힌지 영역에서 발생하는 가수분해를 최소화하였다. 가수분해는 냉동-건조 제제 중 IMC-A12에 대해 중단되었다.

본 발명은 항체의 분해를 감소시키거나 제거하는 용액 제제를 제공한다. 제제는 특정 pH의 완충액, 염, 계면활성제, 안정화제, 보존제, 환원제 및 킬레이팅제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명은 비효소적으로 절단되기 쉬운 항체 및 이의 기능성 단편을 냉동-건조시키기 위한 제제를 제공한다. 제제는 안정화제, 계면활성제, 환원제, 담체, 보존제, 아미노산 및 킬레이트제와 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 항체의 수성 제제를 동결건조 보호제의 존재 하에서 동결건조시키는 것을 포함하는, 항체 조성물의 안정화 방법을 제공한다. 제제는 처리 및 저장 동안 항체의 안정화를 위해 동결건조될 수 있으며, 이후 약제 투여 전에 재구성될 수 있다. 바람직하게, 항체는 실질적으로 제조에서 투여에 이르기까지 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 보전성을 보유한다. 완충액, 계면활성제, 당, 당 알콜, 당 유도체 및 아미노산을 비롯한 다양한 제제 성분이 본 발명에 따른 안정성을 증진시키는데 적합할 수 있다. pH 및 제제 성분의 농도를 비롯한 다양한 제제 성질이 본 발명에 따른 안정성을 증진시키는데 적합할 수 있다.

본 발명에 따라, 완충액이 제제의 pH를 유지하기 위해 사용될 수 있다. 완충액은 외부 변화로 인한 pH 변동을 최소화한다. 본 발명의 제제는 제제에 적합한 pH, 바람직하게는 약 6.0 내지 약 7.0, 보다 바람직하게는 약 6.0 내지 약 6.5, 가장 바람직하게는 약 6.5를 제공하도록 1종 이상의 완충액을 함유한다. 예시적인 완충액에는 일반적으로 히스티딘, 시트레이트, 말레이트, 타르트레이트, 숙시네이트 및 아세테이트와 같은 유기 완충액이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 완충액 농도는 약 5 mM 내지 약 50 mM이다. 다른 실시양태에서, 완충액 농도는 약 10 mM이다.

본 발명의 제제는 항체의 응집 및 분해 방지를 도울 수 있는 1종 이상의 안정화제를 함유할 수 있다. 적합한 안정화제에는 다가 당, 당 알콜, 당 유도체 및 아미노산이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 바람직한 안정화제에는 아스파르트산, 락토비온산, 글리신, 트레할로스, 만니톨 및 수크로스가 포함되나 이들로 한정되지 않는다.

본 발명의 제제는 1종 이상의 계면활성제를 함유할 수 있다. 항체 용액은 공기-물 계면에서 높은 표면장력을 갖는다. 이러한 표면장력을 감소시키기 위해, 항체는 공기-물 계면에서 응집하려는 경향이 있다. 계면활성제는 공기-물 계면에서 항체 응집을 최소화함으로써 용액 중의 항체의 생물학적 활성을 유지하도록 돕는다. 예를 들어, 0.01％ 트윈 80을 첨가함으로써 용액 중의 항체 응집을 감소시킬 수 있다. 제제가 동결건조되는 경우, 계면활성제는 또한 재구성 제제에서 미립자의 형성을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 동결건조 제제에서, 계면활성제가 1종 이상의 예비-동결건조 제제, 동결건조 제제 및 재구성 제제, 바람직하게는 예비-동결건조 제제에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 0.01％ 트윈 80이 동결건조 전에 항체 용액에 첨가될 수 있다. 계면활성제에는 폴리소르베이트 20 (트윈 20), 폴리소르베이트 80 (트윈 80), 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 (플루로닉(PLURONIC) F-68, CAS # 9003-11-6) 및 담즙산염이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 계면활성제 농도는 약 0.001％ 내지 약 1.0％이다.

동결건조 공정은 단백질 또는 폴리펩티드를 변성시킬 수 있는 각종 스트레스를 생성할 수 있다. 이러한 스트레스에는 온도 감소, 얼음 결정 형성, 이온 농도 증가, pH 변화, 상 분리, 수화껍질 제거 및 농도 변화가 포함된다. 냉동 및/또는 건조 공정의 스트레스에 감수성인 항체는 1종 이상의 동결건조 보호제를 첨가함으로써 안정화될 수 있다. 동결건조 보호제는 동결건조와 관련된 스트레스로부터 보호작용을 하는 화합물이다. 따라서, 동결건조 보호제의 한 부류로서 냉동 공정으로부터 보호하는 냉동 보호제가 포함된다. 1종 이상의 동결건조 보호제는 동결건조와 관련된 스트레스로부터 보호하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 수크로스 또는 트레할로스와 같은 당; 글루탐산일나트륨 또는 히스티딘과 같은 아미노산; 베타인과 같은 메틸아민; 황산마그네슘과 같은 이액성(lyotropic) 염; 3가 또는 고가 당 알콜과 같은 폴리올, 예를 들어 글리세린, 에리쓰리톨, 글리세롤, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨; 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉; 및 이들의 조합물을 들 수 있다. 바람직한 동결건조 보호제의 예에는 상기한 바와 같은 안정화제 및 계면활성제가 포함되나 이들로 한정되지 않는다.

본 발명은 동결건조 공정을 통해 제조될 수 있는 안정화 제제를 제공한다. 동결건조는 먼저 물질을 냉동시킨 후, 용매의 양을 우선 승화 (1차 건조 공정) 및 이어서 탈착 (2차 건조 공정)에 의해 생물학적 활성 또는 화학 반응을 더 이상 유지할 수 없는 값으로 감소시키는 안정화 공정이다. 동결건조 제제에서, 용액과 관련된 가수분해, 탈아미드화, 산화 및 단편화 반응은 방지되거나 유의하게 느려질 수 있다. 동결건조 제제는 또한 선적 동안 단기 온도 변동으로 인한 손상을 방지할 수 있으며, 실온 저장을 가능케 한다. 본 발명의 제제는 또한 분무 건조 및 버블 건조와 같은 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 건조될 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 제제는 동결건조 전 제제에서 측정된 그의 성분 농도의 견지에서 기재된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 힌지 영역에서 일어날 수 있는 비효소적 분해가 용이한 항체를 안정화하기 위한 방법 및 제제를 제공한다. 항체가 비효소적으로 절단될 수 있도록 하는 인자에는 아미노산 서열, 형태 및 번역후 처리가 포함된다.

항체가 가수분해, 응집, 산화, 탈아미드화, 침전, 및/또는 힌지 영역에서 단편화된다는 결정은 수용액 중 항체의 인큐베이션에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, 인큐베이션은 연구 기간을 단축시키기 위해 승온에서 수행된다. 예를 들어, 40℃ 또는 50℃에서 3개월 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 크기 배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피 (SEC-HPLC)를 사용하여 분해 생성물을 분석할 수 있다.

또한, 항체 제제를 교반하여 항체의 기계 응력-유도된 분해, 응집 및 침전에 대한 제제 성분의 보호 효과를 조사할 수 있다.

당업계에 공지된 다양한 분석 기술은 용액 제제 또는 재구성된 동결건조 제제의 항체 안정성을 결정할 수 있다. 이러한 기술에는 예를 들어 (i) 주요 용융 온도 (Tm)를 결정하기 위해 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 이용한 열 안정성; (ii) 실온에서 교반 제어를 이용한 기계적 안정성; (iii) 약 -20℃, 약 4℃, 실온 (약 23℃ 내지 27℃), 약 40℃ 및 약 50℃의 온도에서 실시간 등온 가속 온도 안정성; (iv) 약 350 nm에서의 흡광도 모니터링에 의한 용액 탁도; 및 (v) SEC-HPLC를 이용한 단량체, 응집물 및 분해물의 양 결정이 포함된다. 안정성은 선택된 온도에서 선택된 시간 동안 측정될 수 있다.

한 실시양태에서, 동결건조 제제는 재구성시 고농도의 항체를 제공한다. 다른 실시양태에서, 안정한 동결건조 제제는 항체 농도가 동결건조 전 제제의 항체 농도보다 약 1 내지 10배 더 높은 용액을 형성하도록 액체로 재구성된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 동결건조 제제를 1 mL 이하의 물로 재구성하여 항체 농도 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 입자-무함유 재구성 제제를 수득한다.

자연발생 항체는 전형적으로 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 가지며, 각 경쇄는 사슬간 디술피드 결합에 의해 중쇄에 공유결합으로 연결된다. 다중 디술피드 결합이 2개의 중쇄를 서로 추가 연결한다. 개별 사슬은, 크기 (110 내지 125개의 아미노산) 및 구조는 유사하나 기능이 상이한 도메인으로 폴딩될 수 있다. 경쇄는 하나의 가변 도메인 (V_L) 및/또는 하나의 불변 도메인 (C_L)을 포함할 수 있다. 중쇄는 또한 하나의 가변 도메인 (V_H) 및/또는, 항체의 부류 또는 이소타입(isotype)에 따라, 3개 또는 4개의 불변 도메인 (CH₁, CH₂, CH₃ 및 CH₄)을 포함할 수 있다. 인간에서, 이소타입은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이며, IgA 및 IgG는 하위부류 또는 하위유형 (IgA_1-2 및 IgG_1-4)으로 더 세분된다.

일반적으로, 가변 도메인은 항체간, 특히 항원-결합 부위의 위치에서 상당한 아미노산 서열 가변성을 나타낸다. 골격 가변성 영역으로 불리는 덜 가변성인 영역에 의해 지지되는, 초가변성 또는 상보성-결정 영역 (CDR)으로 불리는 세 영역이 V_L 및 V_H에서 각각 발견된다.

V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 항체 부분은 Fv (가변성 단편)로 지칭되며 항원-결합 부위를 구성한다. 단일쇄 Fv (scFv)는, 하나의 폴리펩티드 사슬 상에 V_L 도메인 및 V_H 도메인을 함유하며 한 도메인의 N 말단 및 다른 도메인의 C 말단이 가요성 링커(linker)에 의해 연결된 항체 단편이다 (예를 들어 미국 특허 제4,946,778호 (Ladner 등); WO 88/09344호 (Huston 등) 참조). WO 92/01047호 (McCafferty 등)에는 박테리오파지와 같은 가용성 재조합 유전 디스플레이 패키지의 표면 상에 scFv 단편의 디스플레이가 기재되어 있다.

단일쇄 항체는 이들이 유래된 전체 항체의 불변 도메인 중 일부 또는 전부가 결핍되어 있다. 따라서, 이들은 전체 항체의 사용과 관련된 일부 문제를 해결할 수 있다. 예를 들어, 단일쇄 항체는 중쇄 불변 영역과 다른 생물학적 분자 사이의 바람직하지 않은 특정 상호작용이 없는 경향을 보인다. 또한, 단일쇄 항체는 전체 항체보다 상당히 작으며, 전체 항체에 비해 큰 투과성을 가지므로 단일쇄 항체를 보다 효율적으로 표적 항원-결합 부위에 편재화 및 결합시킬 수 있다. 게다가, 비교적 작은 크기의 단일쇄 항체는 전체 항체보다 수용자에서 원치않는 면역 반응을 덜 일으키도록 한다.

각 단일쇄가 제1 펩티드 링커에 의해 공유결합으로 연결된 하나의 V_H 및 하나의 V_L 도메인을 갖는 다중 단일쇄 항체는 적어도 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 공유결합으로 연결되어 단일특이적 또는 다중특이적일 수 있는 다가 단일쇄 항체를 형성할 수 있다. 다가 단일쇄 항체의 각 사슬은 가변성 경쇄 단편 및 가변성 중쇄 단편을 포함하며, 펩티드 링커에 의해 하나 이상의 다른 사슬에 연결된다. 펩티드 링커는 15개 이상의 아미노산 잔기로 구성된다. 아미노산 잔기의 최대수는 약 100개이다.

2개의 단일쇄 항체를 조합하여 2가 이량체로도 알려져 있는 디아바디(diabody)를 형성할 수 있다. 디아바디는 2개의 사슬 및 2개의 결합 부위를 가지며, 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디의 각 사슬은 V_L 도메인에 연결된 V_H 도메인을 포함한다. 도메인은 동일한 사슬 상에서 도메인간 짝짓기를 방지하기에 충분히 짧은 링커로 연결되며, 그에 따라 상이한 사슬 상에서 상보성 도메인간 짝짓기를 유도함으로써 2개의 항원-결합 부위를 재생성한다.

3개의 단일쇄 항체를 조합하여 3가 삼량체로도 알려져 있는 트리아바디(triabody)를 형성할 수 있다. 트리아바디는 V_L 또는 V_H도메인의 아미노산 말단이 V_L 또는 V_H 도메인의 카르복실 말단에 직접 융합되도록, 즉 어떠한 링커 서열도 없이 제작된다. 트리아바디는 폴리펩티드가 환형의 머리-대-꼬리 방식으로 배열된 3개의 Fv 헤드를 갖는다. 트리아바디의 가능한 형태는 세 결합 부위가 면에 서로 120도 각도로 위치한 평면이다. 트리아바디는 단일특이성, 이중특이성 또는 삼중특이성일 수 있다.

Fab (단편, 항원 결합)는 V_L C_L V_H 및 C_H1 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다. 파파인 소화후 생성된 것은 간단히 Fab로 칭해지며, 중쇄 힌지 영역을 보유하지 않는다. 펩신 소화후, 중쇄 힌지를 보유하는 다양한 Fab가 생성된다. 본래의 사슬간 디술피드 결합을 갖는 2가 단편은 F(ab')₂로 칭해지며, 디술피드 결합을 보유하지 않는 경우 1가 Fab'가 생성된다. F(ab')₂ 단편은 1가 Fab 단편에 비해 항원에 고 결합활성(avidity)이다.

Fc (단편 결정화)는 짝지어진 중쇄 불변 도메인을 포함하는 항체 부분 또는 단편으로 지칭된다. IgG 항체에서, 예를 들어, Fc는 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함한다. IgA 또는 IgM 항체의 Fc는 C_H4 도메인을 추가로 포함한다. Fc는 Fc 수용체 결합, 보체-매개된 세포독성의 활성화, 및 항체-의존성 세포-세포독성 (ADCC)과 관련된다. 다중 IgG 유사 단백질의 복합체인 IgA 및 IgM과 같은 항체의 경우, 복합체 형성은 Fc 불변 도메인을 필요로 한다.

마지막으로, 힌지 영역은 항체의 Fab 및 Fc 부분을 분리하여 두 중쇄의 공유결합을 위한 다중 디술피드 결합을 포함할 뿐만 아니라 서로에 대해 및 Fc에 대해 Fab의 이동성을 제공한다.

따라서, 본 발명의 항체에는 자연발생 항체, 2가 단편, 예컨대 (Fab')₂, 1가 단편, 예컨대 Fab, 단일쇄 항체, 단일쇄 Fv(scFv), 단일 도메인 항체, 다가 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 및 항원에 특이적으로 결합하는 것 등이 포함되나 이들로 한정되지 않는다.

본 발명의 항체 또는 그의 단편은 예를 들어 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 이중특이적 항체 (BsAb)는 2개의 상이한 항원-결합 특이성 또는 부위를 갖는 항체이다. 항체가 다중 특이성을 갖는 경우, 인식된 에피토프가 단일 항원 또는 다중 항원과 관련될 수 있다. 따라서, 본 발명은 2개의 상이한 항원에 결합하는 이중특이적 항체 또는 그의 단편을 제공한다.

항체 또는 그의 단편의 특이성은 친화성 및/또는 결합활성을 기준으로 결정될 수 있다. 항원과 항체의 해리에 대한 평형 상수 (K_d)로 나타내어지는 친화성은 항원 결정자와 항체-결합 부위간 결합 강도의 척도이다. 결합활성은 항체와 그의 항원간 결합 강도의 척도이다. 결합활성은 에피토프와 그의 항체 상의 항원 결합 부위간 친화성 및 특정 에피토프의 항원 결합 부위 수를 나타내는 항체 결합가(valence) 둘 다와 관련된다. 항체는 전형적으로 10^-5 내지 10^-11 ℓ/몰의 해리 상수 (K_d)로 결합한다. 10^-4 ℓ/몰 미만의 임의의 K_d가 일반적으로 비특이적 결합을 제시하는 것으로 간주된다. K_d 값이 낮을수록 항원 결정자와 항체 결합 부위간 결합 강도가 세다.

본원에 사용된 "항체" 및 "항체 단편"은 특정 항원에 대한 특이성을 보유하는 변형을 포함한다. 이러한 변형에는 화학치료제 (예를 들어, 시스플라틴, 탁솔, 독소루비신) 또는 세포독소 (예를 들어, 단백질 또는 비단백질 유기 화학치료제)와 같은 이펙터(effector) 분자에 대한 접합이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 항체는 검출가능한 리포터 잔기에 접합하여 변형될 수 있다. 또한, 반감기와 같은 비결합 특성에 영향을 미치는 변경 (예를 들어, 페길화)을 갖는 항체도 포함된다.

단백질 및 비단백질 작용제가 당업계에 공지된 방법에 의해 항체에 접합될 수 있다. 접합 방법은 직접 연결, 공유결합으로 부착된 링커를 통한 연결 및 특이적 결합 쌍 멤버 (예를 들어, 아비딘-비오틴)를 포함한다. 이러한 방법에는, 예를 들어, 독소루비신 접합에 대해 문헌 [Greenfield et al., Cancer Research 50, 6600-6607 (1990)]에 기재된 것, 및 백금 화합물 접합에 대해 문헌 [Arnon et al., Adv. Exp. Med. Biol. 303, 79-90 (1991)] 및 [Kiseleva et al., Mol. Biol. (USSR)25, 508-514 (1991)]에 기재된 것이 포함된다.

본 발명의 항체는 직접적 돌연변이, 친화성 성숙 방법, 파지 디스플레이 또는 사슬 셔플링(shuffling)에 의해 결합 특성이 개선된 것을 추가로 포함한다. 친화성 및 특이성은 CDR의 돌연변이화 및 목적하는 특성을 갖는 항원 결합 부위의 선별에 의해 변형 또는 개선될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Yang et al., J. Mol. Biol., 254:392-403 (1995)] 참조). CDR은 다양한 방법으로 돌연변이화될 수 있다. 한가지 방법은 동일한 항원 결합 부위군에서 20개의 모든 아미노산이 특정 위치에서 발견되도록 개별 잔기 또는 잔기 조합을 무작위화하는 것이다. 별법으로, 돌연변이는 실수 유발 (error prone) PCR 방법에 의해 일정 범위의 CDR 잔기에 걸쳐 유도된다 (예를 들어, 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)] 참조). 예를 들어, 중쇄 및 경쇄 가변성 영역 유전자를 함유하는 파지 디스플레이 벡터를 이. 콜라이(E. coli)의 돌연변이 균주에서 증식시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Low et al., J. Mol. Biol., 250:359-368 (1996)] 참조). 이러한 돌연변이유발 방법은 당업자에게 공지된 여러 방법의 예시이다.

항체는 또한 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하도록 변형되어 Fc 수용체에 대한 결합을 변경함으로써 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 및 보체-의존성 세포독성과 같은 이펙터 기능을 증가 또는 감소시킬 수 있다.

본 발명의 항체의 각 도메인은 완전 면역글로불린 도메인 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 가변 또는 불변 도메인)일 수 있거나, 또는 자연발생 도메인의 기능성 동등물 또는 돌연변이체 또는 유도체일 수 있거나, 또는 예를 들어 WO 93/11236호 (Griffiths 등)에 기재된 것과 같은 기술을 사용하여 시험관내에서 제작된 합성 도메인일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 결여된 항체 가변 도메인에 상응하는 도메인을 함께 결합시킬 수 있다. 항체의 중요한 특징은 항원 결합 부위가 존재한다는 것이다. 용어 가변 중쇄 및 경쇄 단편은 특이성에 중요한 영향을 미치지 않는 변이체를 배제한다고 해석되어서는 안된다.

본 발명의 항체 및 항체 단편은, 예를 들어 자연발생 항체로부터 얻을 수 있거나, Fab 또는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리로부터 얻을 수 있다. V_H 및 V_L 도메인을 포함하는 항체로부터 단일 도메인 항체를 제조하는데 있어서, CDR 외부의 특정 아미노산 치환이 결합, 발현 또는 용해성을 증진시키는데 바람직할 수 있다고 이해된다. 예를 들어, V_H-V_L 계면에 내입된 아미노산 잔기를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 인간 면역글로불린 감마 중쇄 및 카파 경쇄를 생성하는 트랜스제닉 마우스 (예를 들어, 캘리포니아주 산호세 소재 메다렉스(Medarex)의 KM 마우스)를 사용하여 표준 하이드리도마 기술 (본원에 참조로 포함된 문헌 [Harlow ＆ Lane, ed., Antibodies: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998)] 참조)에 의해 얻을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상당 부분의 인간 항체 생성 게놈을 마우스의 게놈에 삽입하여, 내인성 뮤린 항체가 생성되지 못하도록 한다. 이러한 마우스를 완전 프로인트(Freund) 보조제 중 표적 분자의 일부 또는 전부로 피하 (s.c.) 면역화할 수 있다.

본 발명은 또한 재구성 제제를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 재구성 제제는 본 발명의 동결건조 제제를, 예를 들어 1 mL 물로 재구성하여 제조된다. 재구성 시간은 바람직하게는 1분 미만이다. 농축 재구성 제제는 투여시 유연성을 허용한다. 예를 들어, 재구성 제제는 희석 형태로 정맥내 투여될 수 있거나, 보다 농축된 형태로 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 농축 재구성 제제는 특정 대상체 및/또는 특정 투여 경로에 적합한 농도로 희석될 수 있다. 따라서, 본 발명은 치료적 유효량의 항체를 이를 필요로 하는 포유동물, 특히 인간에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 본원에 사용된 용어 투여는 추구하는 결과를 달성할 수 있는 임의의 방법에 의해 포유동물에게 본 발명의 항체 조성물을 전달하는 것을 의미한다. 재구성 제제는, 예를 들어 정맥내 또는 근육내 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 농축 재구성 제제는 주사에 의해 투여된다.

본 발명의 제제 중 항체는 바람직하게는 인간의 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 고형 및 비고형 종양을 비롯한 신생물성 질환, 과증식성 장애, 비만을 치료하는데 사용될 수 있다.

치료적 유효량은 포유동물에게 투여되는 경우, 예컨대 IGF-IR 활성의 감소 또는 중화, 종양 성장의 억제, 또는 비암성 과증식성 질환의 치료, 비만의 치료와 같은 목적하는 치료 효과를 제공하는데 유효한 본 발명의 항체의 양을 의미한다. 상기한 바와 같은 항체의 투여는 다른 항체의 투여 또는 임의의 통상적인 치료제, 예컨대 항신생물제와 조합될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 항신생물제와 조합되어 투여될 수 있다. 화학치료제, 방사선 또는 이들의 조합과 같은 임의의 적합한 항신생물제가 사용될 수 있다. 항신생물제는 알킬화제 또는 항대사물질일 수 있다. 알킬화제의 예에는 시스플라틴, 시클로포스파미드, 멜팔란 및 다카르바진이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 항대사물질의 예에는 독소루비신, 다우노루비신, 파클리탁셀, 이리노테칸 (CPT-11) 및 토포테칸이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 항신생물제가 방사선인 경우, 방사선 공급원은 치료될 환자에 외부적 (외부 빔 방사선 치료 - EBRT) 또는 내부적 (근접치료 - BT)인 것일 수 있다. 투여되는 항신생물제의 투여량은 예를 들어 작용제의 유형, 치료될 종양의 유형 및 중증도, 및 작용제의 투여 경로를 비롯한 다수의 인자에 좌우된다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 투여량으로 제한되지 않는다는 것이 강조되어야 한다.

본 발명의 항체의 동등물 또는 그의 단편도 또한 본원에 제공된 전체-길이 IMC-A12 항체의 가변 또는 초가변 영역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 피어슨 및 리프만(Pearson and Lipman)의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-8 (1988)]에 따른 FASTA 조사 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 70％ 이상, 바람직하게는 약 80％ 이상, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 상동성을 갖는 서열로 본원에서 정의된다.

하기 실시예는 본 발명을 더 예시하지만, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 단백질 분석에 사용된 것과 같은 통상적인 방법의 상세한 설명은 문헌 [Current Protocols in Immunology] (John Wiley ＆ Sons에 의해 출판됨)과 같은 다수의 공개문헌으로부터 획득할 수 있다. 본원에 언급된 모든 참고문헌은 그 전문이 포함된다.

모든 액체 제제 선별 연구에서, 단백질 농도를 5 mg/mL로 고정시켰다. 10 mM 인산나트륨, 10 mM 시트르산나트륨, 10 mM 아세트산나트륨, 10 mM L-히스티딘 및 125 mM 염화나트륨으로 이루어진 다성분 완충액을 사용하여 최적 pH에 대해 선별하였다. 한 실험 방법 설계 (DOE, JMP 소프트웨어)를 사용하여 완충액 유형, 트윈 80에 대한 요건, 글리신 농도 및 NaCl 농도를 조사하였다. 선형 회귀 분석을 수행하여 시험 변수의 유의성을 결정하였다. 전형적인 일시일원 (one-factor-at-a-time) 방법을 사용하여 예상 제제를 확인하였다. 시차 주사 열량측정법 (DSC) 및 실시간 등온 연구를 사용하여 열 안정성에 대한 시험 변수의 효과를 조사하였다. 기계 안정성에 대한 시험으로서 실온에서 300 rpm으로 교반 제어를 이용하였다. ICH 지침에 따라 액체 제제의 광 안정성을 조사하였다. 시험 샘플을 -20℃ 및 -70℃로 냉동시키고 4℃에서 해동시켜 냉동-해동 안정성을 측정하였다.

동결건조 IMC-A12 제제에 대해, 20 mg/mL의 A12 농도에서 실험 부분 인자 모델 설계를 사용하여 완충액 유형, 안정화제 및 증량제를 조사하였다. 혼합 설계 모델을 사용하여 IMC-A12 농도, 트레할로스 농도 대 IMC-A12 농도의 비, 및 트윈 80 농도를 최적화하였다. 일시일원 방법을 사용하여 예상된 최적의 냉동-건조 제제를 PBS 및 시트레이트 용액 제제와 비교하였다. 열 안정성에 대한 변수의 효과를 실시간 등온 연구에 의해 조사하였다. 동결건조 제제의 광 안정성을 ICH 지침에 따라 조사하였다.

선별 연구에 사용하기 위한 IMC-A12를 50K 컷-오프 (YM 50) 센트리프렙 원심분리 여과 장치 및 알레그라(Allegra) 원심분리기 (베크만(Beckman))를 사용하여 실험 완충액으로의 완충액 교환에 의해 제조하였다. 단백질 농도를 1.50의 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정하고, 적절한 완충액을 사용하여 5 mg/mL로 조정하였다. 단백질 농도 조정 후 10％ (w/v) 모액으로부터 트윈 80을 첨가하였다. 대조군으로서 PBS 제제 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 사용하였다. 모든 샘플을 시린지 필터 (듀라포어(Durapore) PVDF 막)를 통해 0.22 ㎛ 여과하였다.

리오스타(Lyostar) II 냉동-건조기를 사용하여 냉동-건조 공정을 수행하였다. 생성물을 실온에서 동결건조기 내로 로딩하였다. 선반 온도를 0.5℃/분의 냉각률로 -50℃로 냉각시켰다. -50℃에서의 침액 시간은 2시간이었다. 1차 건조 및 2차 건조를 각각 -30℃ 및 20℃에서 12시간 동안 수행하였다. 온도 경사는 0.5℃/분이었다. 1차 및 2차 건조 동안 챔버 압력은 50 mT이었다. 동결건조가 완료된 후, 동결건조기 챔버를 N₂에 의해 절반-대기압으로 다시 채우고, 캡핑하였다.

실시예 1. pH 최적화 연구

10 mM 인산나트륨, 10 mM 시트르산나트륨, 10 mM 아세트산나트륨, 10 mM L-히스티딘 및 125 mM 염화나트륨으로 이루어진 다성분 완충액 (MCB)을 사용하여 최적 pH를 결정하였다. 이 완충계는 pH 단독 보다 더 큰 효과를 나타낼 수 있는 반대이온 (염 효과)을 최소화하도록 의도되었다. pH 선별 설계 매트릭스를 하기 표 2에 나타내었다. IMC-A12 농도를 5 mg/mL로 유지하였다. 조사된 pH 범위는 0.5 pH 단위 간격으로 5.0 내지 8.0이었다. 열 및 기계 안정성에 대한 pH의 효과를 연구하고, 결과를 하기에 제공하였다.

시차 주사 열량측정법 (DSC) 연구

(표 2에 나타낸) 실험 제제 중 IMC-A12에 대한 열 용융 곡선을 시차 주사 열량측정법 (DSC)에 의해 분석하여 시험 조건에서 IMC-A12에 대한 전이 온도 (Tm)를 평가하였다. 단백질 농도는 5 mg/mL이고, 온도 경사는 1.5℃/분의 주사율로 5℃에서 95℃이었다. 용융 곡선을 3개의 Tm의 합에 적합시켰다. pH의 함수로서 제1 전이 피크에 상응하는 용융 온도 Tm1을 도 1에 도시하였다. Tm1은 pH 6.5 내지 8.0에서 비슷하였다.

교반 연구

플랫폼 진탕기 상에서 교반에 의해 샘플에 응력을 가하였다. 27.5 mL 유리 바이알 내 5 mg/mL의 IMC-A12 5 mL를 포함하는 표 2에 기재된 바와 같은 샘플을 81.8％가 되도록 헤드스페이스(Headspace) 세트를 이용하여 300 RPM으로 교반하였다. 연구를 실온에서 72시간 동안 수행하였다. pH의 함수로서 불용성 응집물의 형성으로 인한 손실(％) 및 남아있는 단량체(％)를 각각 도 2 및 3에 도시하였다. pH 6.0 내지 7.0에서 손실(％)은 최저이고 단량체(％)는 최고이었다.

40℃ 및 50℃에서의 실시간 가속 온도 안정성

다양한 pH 완충액 중 5 mg/mL의 IMC-A12 (표 2)를 40℃에서 3주 동안 및 50℃에서 1주 동안 인큐베이션하였다. 단량체(％)에 대한 pH의 효과를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. 40℃에서 3주 인큐베이션 (도 4) 및 50℃에서 1주 인큐베이션 (도 5) 후 pH의 함수로서 남아있는 단량체(％)의 변화를 도시하였다. 남아있는 단량체(％)는 pH 6.0 내지 6.5에서 최대였다.

-20℃ 및 -70℃에서의 실시간 냉동 온도 안정성

(표 2에 나열된) 다양한 pH 완충액 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 -20℃ 및 -70℃에서 3주 동안 인큐베이션하였다. 단량체(％)에 대한 pH의 효과를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. 3주 인큐베이션 후 pH의 함수로서 단량체(％)의 변화를 도 6에 도시하였다. pH는 -20℃ 또는 -70℃에서 단량체(％)에 대해 유의한 효과를 나타내지 않았다.

pH 최적화의 요약

5 mg/mL의 IMC-A12에 대한 최적 pH는 6.0 내지 6.5인 것으로 밝혀졌다.

실시예 2. 용액 제제에 대한 부형제 선별 연구

실시예 1에서의 pH 최적화 연구는 IMC-A12가 pH 6.0 내지 6.5에서 가장 큰 안정성을 나타낸다는 것을 입증하였다. 이 실시예에서, 본 발명자들은 pH 6.0 및 6.5에서 IMC-A12의 안정성에 대한 완충액 유형, 시트레이트 및 히스티딘의 효과를 연구하였다. 트윈 80에 대한 요건 및 NaCl 및 글리신 농도도 조사하였다. 단백질 농도를 5 mg/mL로 유지하였다. 부형제 선별을 위한 설계 매트릭스를 하기 표 3에 나타내었다.

삼투질농도(Osmolality) 측정

표 3 제제의 삼투질농도를 웨스코 증기압 삼투압측정기(Wescor Vapor Pressure Osmometer)를 사용하여 측정하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 시험 제제의 삼투질농도는 260 내지 320 mOsmole/Kg의 목적하는 범위 내에 있었다.

시차 주사 열량측정법 연구

(표 3에 나열된) 실험 제제 중 IMC-A12에 대한 열 용융 곡선을 DSC에 의해 분석하여 시험 조건에서 IMC-A12에 대한 전이 온도 (Tm)를 평가하였다. 단백질 농도는 5 mg/mL이고, 온도 경사는 1.5℃/분의 주사율로 5℃에서 95℃이었다. 주요 전이 피크에 상응하는 용융 온도를 선형 회귀 모델에 적합시켜 시험 변수의 효과를 평가하였다. 적합화를 위한 p 및 R_sq는 각각 0.003 및 0.99이었다. 전이 온도에 대한 완충액 유형, pH, 트윈 80 농도, NaCl 농도, 글리신 농도의 효과의 예상 프로파일러를 도 7에 도시하였다. 최적 완충액은 pH 6.5의 시트레이트의 완충액으로 결정되었다. 글리신은 용융 온도를 증가시키고, 트윈 80은 용융 온도를 약간 감소시켰다. NaCl은 용융 온도에 대해 유의한 효과를 나타내지 않았다.

교반 연구

플랫폼 진탕기 상에서 교반에 의해 샘플에 응력을 가하였다. 27.5 mL 유리 바이알 내 5 mg/mL의 IMC-A12 5 mL를 갖는 표 3에 기재된 샘플을 300 RPM으로 교반하였다. 연구를 실온에서 72시간 이하 동안 수행하였다. 용액 탁도 및 단량체(％)를 교반 시간의 함수로서 결정하였다. JMP 소프트웨어를 사용하여 반응을 선형 회귀 모델에 적합시킴으로써 탁도 및 단량체(％)에 대한 시험 변수의 효과를 평가하였다. 탁도 및 단량체(％) 둘 다에 대한 실제 대 예상 플롯의 p 값은 0.001 미만이었다. 통계적으로 유의한 변수는 완충액, 트윈 및 시간이었다. 탁도 및 단량체(％)에 대한 완충액, 트윈 80 및 시간의 효과의 예상 프로파일러를 도 8에 도시하였다. 0.01％ 트윈을 갖는 시트레이트 완충액이 최저 탁도 및 최고 단량체 함량을 나타내었다.

40℃ 및 50℃에서의 실시간 가속 온도 안정성

표 3 제제 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 40℃에서 4주 동안 및 50℃에서 2주 동안 인큐베이션하였다. 40℃에서 4주 인큐베이션 및 50℃에서 2주 인큐베이션 후 출발 물질 및 시험 제제에 대한 단량체(％)를 각각 도 9 및 10에 도시하였다. 온도 스트레스 샘플의 DOE 분석을 또한 도 11에 도시하였다. 40℃에서, 시험 제제 대부분에 대한 단량체(％)가 비슷하였으나 PBS보다는 우수하였다. 50℃에서, 시트레이트 완충액 중의 제제 (제제 6 내지 10)는 히스티딘 완충액 중의 제제 (제제 1 내지 5)보다 우수하였다. 도 11에서의 DOE 분석은, IMC-A12가 pH 6.0 내지 6.5에서 비슷한 안정성을 나타내고, NaCl이 불안정화 효과를 나타내는 반면, 글리신은 비교적 적은 효과를 나타낸다는 것을 보여주었다. 제제 9 및 10은 비슷한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 제제 10은 보다 적은 글리신 농도 (생리학적 조건에 보다 근접함)를 갖기 때문에 바람직하였다.

부형제 선별 연구의 요약

DSC 연구는 시트레이트 완충액, 글리신 및 pH 6.5가 증가된 IMC-A12 열 안정성을 나타낸다는 것을 보여주었다. 트윈-80은 안정성을 약간 감소시킨 반면, NaCl은 많은 효과를 나타내지 않았다. IMC-A12는 기계 응력에 감수성이었다. 따라서, 트윈 80이 기계 응력에 대해 안정화시키는데 필요하였다. IMC-A12는 가속 온도에서 히스티딘 제제 중에서 보다 시트레이트 제제 중에서 우수한 안정성을 나타내었다. 히스티딘 및 시트레이트 완충액 둘 다 PBS 제제보다 우수하였다. 5 mg/mL IMC-A12, 10 mM 시트레이트, 100 mM 글리신, 100 mM NaCl, 0.01％ 트윈 80 (pH 6.5)을 함유하는 제제 10 (시트레이트)을 최적 제제로서 선택하였다.

실시예 3. PBS와 시트레이트 용액 제제의 비교

상기에서 논의한 바와 같이, 본 발명자들은 pH 6.5의 5 mg/mL IMC-A12, 10 mM 시트르산나트륨, 100 mM 글리신, 100 mM NaCl, 0.01％ 트윈 80을 함유하는 IMC-A12에 대한 신규 용액 제제 (시트레이트)를 개발하였다. 이 실시예에서, 본 발명자들은 시트레이트 제제와 PBS 제제 중에서 IMC-A12의 안정성을 비교하였다.

교반 연구

플랫폼 진탕기 상에서 교반에 의해 샘플에 응력을 가하였다. 27.5 mL 유리 바이알 내 5 mg/mL의 IMC-A12를 함유하는 샘플을 300 RPM으로 교반하였다. 연구를 실온에서 72시간 이하 동안 수행하였다. 시마추 1601 바이오스펙 분광광도계를 사용하여 농도 및 탁도 측정을 수행하였다. 1.5의 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서의 흡광도로부터 IMC-A12 용액의 농도를 계산하였다. 350 nm에서의 흡광도에 의해 용액 탁도를 측정하였다. 교반 시간의 함수로서 용액 탁도, 물질 손실(％) (불용성 응집물의 형성으로 인함) 및 남아있는 단량체(％)를 각각 도 12, 13 및 14에 도시하였다. IMC-A12의 PBS 제제의 경우, 용액 탁도 및 손실(％)은 교반 시간과 함께 증가한 반면, 단량체(％)는 감소하였다. 시트레이트 제제의 경우, 탁도, 손실(％) 및 단량체(％)는 모두 변화되지 않은 채로 있었다.

40℃에서의 실시간 가속 온도 안정성

PBS 또는 시트레이트 제제 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 40℃에서 3개월 이하 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 SEC-HPLC, SDS-PAGE 및 IEF에 의해 분석하였다. 결과를 하기에 나타내었다.

SEC-HPLC 분석: 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 LC 크로마토그래프 및 토소 바이오셉(Tosoh Biosep) G3000SWXL 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 이동상은 10 mM 인산나트륨, 0.5M CsCl (pH 7.0)이었다. 샘플 50 ㎍을 10 ㎕ 부피로 주입하였다. 인큐베이션 시간의 함수로서 단량체(％), 응집물(％) 및 분해물(％)의 변화를 각각 도 15, 16 및 17에 도시하였다. 두 제제에서 단량체(％)는 감소하고 응집물(％) 및 분해물(％)은 증가하였으나, 그 속도는 PBS 제제에 비해 시트레이트 제제가 더 느렸다.

SDS-PAGE 분석: 40℃에서 3개월 인큐베이션 후 PBS 및 시트레이트 제제 중 IMC-A12를 4 내지 20％ 트리스-글리신 구배 겔 상의 환원 및 비환원 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 샘플 10 ㎍을 10 ㎕ 부피로 로딩하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다. 결과를 각각 도 18 및 19에 도시하였다. 비교시, 시트레이트 제제에서보다 PBS 제제에서 더 진한 불순물 밴드가 검출되었다.

IEF 분석: pH 범위 6.0 내지 10.5의 이소겔^® 아가로스 IEF 플레이트를 사용하여 등전점 전기영동 (IEF)을 수행하였다. 시험 샘플을 0.5％ 트윈 80을 함유하는 밀리큐 워터로 완충액 교환하였다. 10 ㎍ 샘플을 10 ㎕ 부피로 로딩하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다. 40℃에서 3개월 인큐베이션 후 PBS 및 시트레이트 제제 중 IMC-A12를 IEF에 의해 분석하였다. 결과를 도 20에 도시하였다. 비교시, 시트레이트 제제에서 보다 PBS 제제에서 더 확산되고 덜 한정된 밴드가 검출되었다.

-20℃ 및 -70℃에서 IMC-A12의 냉동 온도 안정성

PBS 및 시트레이트 제제 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 -20℃ 및 -70℃에서 3개월 이하 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. -20℃ 및 -70℃에서 시간의 함수로서 단량체(％)의 변화를 각각 도 21 및 22에 도시하였다. 단량체(％)는 두 제제 모두에서 시간에 따라 변화하지 않았다.

-20℃ 및 -70℃에서 IMC-A12의 냉동-해동 안정성

시험 샘플을 냉동-건조기 (FTS에서 제조한 리오스타 II)에서 1℃/분의 경사율로 -20℃ 또는 -70℃로 냉동시켜 IMC-A12의 냉동-해동 안정성을 평가하였다. 샘플을 1시간 동안 인큐베이션하고, 1℃/분의 경사율로 4℃에서 해동시켰다. 냉동-해동 공정을 15회 이하 반복하였다. -20℃ 및 -70℃에서 냉동-해동 주기 수의 함수로서 단량체(％)의 변화를 각각 도 23 및 24에 도시하였다. 도시된 바와 같이, 시트레이트 제제 중의 IMC-A12가 PBS 제제 중의 IMC-A12보다 우수한 냉동-해동 안정성을 나타내었다. PBS 제제의 경우 단량체(％) 감소는 주로 응집물(％) 증가에 기인하였다.

IMC-A12 용액 제제의 광 안정성

IMC-A12에 대한 광 안정성 연구를 ICH 지침에 따라 수행하였다. PBS 및 시트레이트 제제 중 5 mg/mL의 IMC-A12를 실온에서 광 노출시켰다. 총 광 노출은 200 와트·시간/m² 근자외선 + 1.2백만 럭스·시간 형광이었다. 대조군 샘플을 흑색 종이로 감싸 광 차단하였다. 대조군 및 시험 샘플을 광 안정성 챔버 (카론(Caron) 6500 시리즈, 오하이오주 마리에타 소재의 카론) 내부에 위치시켰다. 광 노출 후, 대조군 및 시험 샘플 둘 다를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. 대조군 및 광 노출 샘플에 대한 단량체(％), 응집물(％) 및 분해물(％)을 하기 표 5에 제공하였다. IMC-A12는 두 제제 모두에서 광 감수성인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 광 안정성은 PBS 제제에서보다 시트레이트 제제에서 유의하게 개선되었다.

PBS와 시트레이트 제제 비교의 요약

IMC-A12는 PBS 제제에서보다 10 mM 시트르산나트륨, 100 mM 글리신, 100 mM NaCl, 0.01％ 트윈 80, pH 6.5 (시트레이트) 제제에서 훨씬 우수한 안정성을 나타내었다. 시트레이트는 미립자가 없는 등장성 제제이고, 기계 유도된 응집 또는 침전에 대해 안정하고, 온도 유도된 응집 및 분해를 최소화하고, 냉동-해동 불안정성에 대해 안정화되고, 증진된 광 안정성을 나타낸다.

실시예 4 . 동결건조 제제에 대한 완충액, 냉동 보호제 및 동결건조 보호제, 및 증량제의 선별

냉동-건조 제제에 대한 완충액 유형, 안정화제 및 증량제를 20 mg/mL의 IMC-A12 농도에서 조사하였다. 설계 매트릭스를 하기 표 6에 나타내었으며, 부분 인자 설계 모델을 사용하였다. IMC-A12 농도, 트레할로스 농도 대 IMC-A12 농도의 비, 및 트윈 80 농도의 최적화를 위한 설계 매트릭스를 하기 표 7에 나타내었다. 혼합 설계 모델을 사용하였다.

동결건조를 위해, IMC-A12를 실험실용 TFF 및 펠리콘(Pellicon)^® XL 필터, 50K 컷-오프 필터 (밀리포어 코퍼레이션(Millipore Corporation))를 사용하여 pH 6.5의 순 10 mM 히스티딘, 또는 pH 6.5의 10 mM 시트레이트로 완충액 교환하였다. 완충액 교환을 수행한 후, 농축된 모액으로부터 동결건조 보호제 및 냉동 보호제를 첨가하였다. 1.50의 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서의 흡광도에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 단백질 농도 조정 후, 10％ (w/v, 탈이온수 중) 모액으로부터 트윈 80을 첨가하였다. 모든 샘플을 0.22 ㎛ 컷오프 (듀라포어 PVDF 막) 시린지 필터를 통해 여과하였다.

완충액 유형, 냉동 보호제 및 동결건조 보호제, 및 증량제를 표 6에 나타낸 제제 중 20 mg/mL IMC-A12의 단량체, 응집물, 분해물 및 탁도에 대한 효과에 관하여 선별하였다. 동결건조 약물 생성물을 40℃ 및 50℃에서 3개월 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 동결건조 약물 생성물을 5 mg/mL가 되도록 밀리큐 워터로 재구성하였다. 재구성된 생성물을 SEC-HPLC 및 탁도에 의해 분석하였다. 통계적 소프트웨어 JMP를 사용하여 결과를 적합화하였다. 결과를 하기에 요약하였다.

예상 단량체, 응집물, 분해물 및 탁도에 대한 변수의 효과

재구성된 약물 생성물을 SEC-HPLC 및 탁도 분석에 의해 분석하였다. 완충액 유형, 냉동 보호제 및 동결건조 보호제, 및 증량제의 함수로서 단량체(％), 응집물(％), 분해물(％) 및 탁도의 변화를 각각 도 25, 26, 27 및 28에 도시하였다. 결과는 (1) 히스티딘 완충액이 시트레이트 완충액보다 많은 단량체 및 적은 응집물을 야기한다는 것을 입증하였다. (2) 트레할로스 및 수크로스는 단량체 함량을 증가시키고 응집을 감소시켰다. (3) 증량제인 만니톨 및 글리신은 단량체(％) 또는 응집물(％)의 유의한 효과를 나타내지 않았다. 시험 변수 모두 분해물에 대한 유의한 효과를 나타내지 않았다.

일시일원 방법에 의한 예상 결과의 확인

통계적 예상 결과를 확인하기 위해, 표 6의 제제 5, 6, 9 및 10을 일시일원 방법으로 분석하였다. 단량체(％), 응집물(％), 분해물(％) 및 탁도에 대한 3개월 이하 동안 40℃ 및 50℃에서의 인큐베이션의 효과를 각각 도 29, 30, 31 및 32에 도시하였다. 결과는 (1) 히스티딘이 시트레이트보다 우수한 완충액이라는 것 및 (2) 트레할로스가 수크로스보다 우수한 안정화제라는 것을 확인시켰다.

완충액 유형, 냉동 보호제 및 동결건조 보호제, 및 증량제 선별의 요약

냉동-건조 IMC-A12 제제는 시트레이트 완충액에서보다 히스티딘 완충액에서 더 큰 안정성을 나타내었다. 트레할로스는 수크로스보다 우수한 안정화 효과를 나타내었다. 증량제인 만니톨 및 글리신의 존재는 안정성에 유의한 영향을 미치지 않았다.

실시예 5. 최적의 냉동-건조 제제를 위한 IMC-A12, 트레할로스 및 트윈 80 농도의 최적화

혼합 설계 모델을 사용하여 최적의 제제를 위한 IMC-A12 농도, 트레할로스:IMC-A12 비, 및 트윈 80 농도를 최적화하였다. 실험 설계 매트릭스를 표 7에 나타내었다. 동결건조 IMC-A12를 4℃, 40℃ 및 50℃에서 4개월 이하 동안 인큐베이션하였다. 결과를 하기에서 논의하였다.

제제의 함수로서 단량체(％)의 변화

표 7로부터의 동결건조 IMC-A12 제제를 4℃, 40℃ 및 50℃에서 4개월 이하 동안 인큐베이션하였다. 동결건조 샘플을 5 mg/mL가 되도록 밀리큐 워터로 재구성하였다. 재구성된 샘플을 SEC-HPLC에 의해 분석하여 남아있는 단량체(％)를 결정하였다. 결과를 도 33에 도시하였다.

단량체 변화율에 대한 IMC-A12 농도, 트레할로스:A12 비 및 트윈 80 농도의 효과

단량체 변화율을 시간의 함수로서 단량체 변화의 기울기로서 정의하였다. 엑셀(Excel) 소프트웨어를 사용하여 기울기를 계산하였다. 단량체 변화율은 최저 IMC-A12 농도 및 최고 트레할로스:IMC-A12 비에서 가장 작았다. 트윈 80은 유의한 효과를 나타내지 않았다.

최적화 연구의 요약

예상 단량체 함량은 IMC-A12 농도가 감소하고 트레할로스:IMC-A12 비가 증가함에 따라 증가하였다. 고정된 IMC-A12 농도에서, 단량체 함량은 트레할로스:IMC-A12 비가 증가함에 따라 증가하였다. 트윈 80은 단량체(％)에 대해 최소한의 효과를 나타내었다. 30 mg/mL IMC-A12 및 600의 트레할로스:IMC-A12 비를 갖는 제제 4를 바람직한 제제로서 선택하였다.

실시예 6. 냉동-건조 IMC-A12의 특성화

칼-피셔(Karl-Fisher) 분석에 의해 결정된 바와 같은 동결건조 생성물의 수분 함량은 약 1.0％인 것으로 밝혀졌다. 냉동-건조 IMC-A12를 밀리큐 워터를 이용하여 5 mg/mL로 재구성하였다. 재구성 시간은 약 1 내지 2분이었다.

IMC-A12 안정성에 대한 동결건조의 효과

동결건조 공정이 IMC-A12 안정성을 변화시키지 않는다는 것을 보장하기 위해, IMC-A12를 동결건조 전 및 후 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. 동결건조 IMC-A12를 SEC-HPLC 분석 전에 재구성하였다. 동결건조 전 및 후 A12에 대한 단량체(％), 응집물(％) 및 분해물(％)을 하기 표 8에 나타내었다.

IMC-A12의 형태 안정성에 대한 동결건조의 효과

동결건조 공정이 A12의 2차 구조를 변경하지 않는다는 것을 보장하기 위해, 동결건조 전 및 후 IMC-A12의 2차 구조를 원편광 이색성에 의해 조사하였다. 원편광 이색성 스펙트럼을 자스코 810 원편광 이색성 분광광도계를 사용하여 수집하였고, IMC-A12 농도는 0.1 mg/mL이었다. 동결건조 전 및 동결건조와 재구성 후 원편광 이색성 스펙트럼을 도 34에 도시하였다. IMC-A12의 2차 구조는 동결건조로 인해 변경되지 않았다.

IMC-A12에서 미립자 수에 대한 동결건조의 효과

IMC-A12에서 미립자 함량에 대한 동결건조의 효과를 HIAC ROYCO MODEL 9703 액체 입자 시스템을 사용하여 측정하였다. 동결건조 전 및 후 IMC-A12를 5 mg/mL가 되도록 희석/재구성하였다. 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 미립자 함량은 유의하게 변하지 않았다.

실시예 7. 용액 및 동결건조 IMC-A12 제제의 비교

하기 제제를 비교하였다:

(1) PBS 용액 제제, PBS 중 5 mg/mL IMC-A12

(2) 시트레이트 용액 제제, 10 mM 시트르산나트륨, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신, 0.01％ 트윈 80 (w/v) (pH 6.5) 중 5 mg/mL IMC-A12

(3) 동결건조 제제, 30 mg/mL IMC-A12, 10 mM L-히스티딘, 4.6％ 트레할로스 (pH 6.5)

실시간 가속 온도 안정성

PBS 및 시트레이트 용액 제제, 및 동결건조 제제를 4℃, 40℃, 50℃에서 인큐베이션하였다. 동결건조 IMC-A12를 분석 전에 밀리큐 워터를 이용하여 5 mg/mL로 재구성하였다. 용액 및 재구성된 동결건조 제제를 SEC-HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.

PBS 및 시트레이트 완충액 중의 IMC-A12 용액 제제, 및 바람직한 동결건조 제제 중의 IMC-A12를 40℃ 및 50℃에서 4개월 동안 인큐베이션하였다. 동결건조 샘플을 밀리큐 워터 중에서 재구성하고, 단량체(％)를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. 40℃ 및 50℃에서 4개월 인큐베이션 후 단량체(％)를 각각 도 35 및 36에 도시하였다. 40℃ 및 50℃에서 4개월 인큐베이션 후 응집물(％)을 각각 도 37 및 38에 도시하였다. 40℃ 및 50℃에서 4개월 인큐베이션 후 분해물(％)을 각각 도 39 및 40에 도시하였다.

4℃, 40℃ 및 50℃에서 4개월 동안 인큐베이션 후 샘플의 SDS-PAGE (환원) 분석을 도 41에 도시하였다. PBS 및 시트레이트 완충액 중의 IMC-A12 용액 제제, 및 바람직한 동결건조 제제 중의 IMC-A12를 4℃, 40℃ 및 50℃에서 4개월 동안 인큐베이션하였다. 동결건조 샘플을 밀리큐 워터 중에서 재구성하고, 10 ㎍을 4 내지 20％ 트리스-글리신 겔에 로딩하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다.

동결건조 제제의 광 안정성

광 안정성을 상기한 바와 같이 수행하였다. 동결건조 IMC-A12 및 용액 제제 PBS 및 시트레이트를 실온에서 광 노출시켰다. 총 광 노출은 200 와트·시간/m² 근자외선 + 1.2백만 럭스·시간 형광이었다. 대조군 샘플을 흑색 종이로 감싸 광 차단하였다. 대조군 및 시험 샘플을 광 안정성 챔버 (카론 6500 시리즈, 오하이오주 마리에타 소재의 카론) 내부에 위치시켰다. 광 노출 후, 대조군 및 시험 샘플 둘 다를 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. 대조군 및 광 노출 샘플에 대한 단량체(％), 응집물(％) 및 분해물(％)을 하기 표 10에 제공하였다. IMC-A12는 두 제제 모두에서 광 감수성인 것으로 밝혀졌으나, 광 안정성은 PBS 제제에서보다 시트레이트 제제에서 훨씬 우수하였다.

SEQUENCE LISTING <110> IMCLONE LLC Srivastava, Arvind Goldstein, Joel <120> Stable Antibody Formulations <130> 11245/55201 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1383 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1383) <400> 1 gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc 192 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aaa tcc acg agc aca gcc tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gcg cca tta cga ttt ttg gag tgg tcc acc caa gac cac tac 336 Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr 100 105 110 tac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc 384 Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125 tca agc gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc 432 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 130 135 140 tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag 480 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 145 150 155 160 gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg 528 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 165 170 175 acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc 576 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 180 185 190 tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc 624 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 195 200 205 cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg 672 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 210 215 220 gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca 720 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 225 230 235 240 ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc 768 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245 250 255 ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc 816 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc 864 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 275 280 285 aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg 912 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300 cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc 960 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 1008 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 330 335 tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc 1056 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 340 345 350 aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 1104 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 355 360 365 gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 1152 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 370 375 380 ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg 1200 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 1248 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag 1296 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420 425 430 ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac 1344 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1383 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 2 <211> 460 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 130 135 140 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 145 150 155 160 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 165 170 175 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 195 200 205 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 210 215 220 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 225 230 235 240 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 275 280 285 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 330 335 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 340 345 350 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 355 360 365 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420 425 430 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 3 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(645) <400> 3 tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag 48 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca 96 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 acc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct att ctt gtc atc tat 144 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr 35 40 45 ggt gaa aat aag cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc 192 Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gca gaa 240 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 gat gag gct gac tac tat tgt aaa tct cgg gat ggc agt ggt caa cat 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His 85 90 95 ctg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc aag 336 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 gct gcc ccc tcg gtc act ctg ttc ccg ccc tcc tct gag gag ctt caa 384 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 gcc aac aag gcc aca ctg gtg tgt ctc ata agt gac ttc tac ccg gga 432 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 gcc gtg aca gtg gcc tgg aag gca gat agc agc ccc gtc aag gcg gga 480 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa agc aac aac aag tac gcg gcc 528 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 agc agc tat ctg agc ctg acg cct gag cag tgg aag tcc cac aga agc 576 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 tac agc tgc cag gtc acg cat gaa ggg agc acc gtg gag aag aca gtg 624 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 gcc cct gca gaa tgc tct tga 645 Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 <210> 5 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(645) <400> 5 tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag 48 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca 96 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat 144 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc 192 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa 240 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac aac agt gat aac cgt 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg 85 90 95 ctg ata ttt ggc ggc ggg acc aag ctg acc gtc ctc agt cag ccc aag 336 Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys 100 105 110 gct gcc ccc tcg gtc act ctg ttc ccg ccc tcc tct gag gag ctt caa 384 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 gcc aac aag gcc aca ctg gtg tgt ctc ata agt gac ttc tac ccg gga 432 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 gcc gtg aca gtg gcc tgg aag gca gat agc agc ccc gtc aag gcg gga 480 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa agc aac aac aag tac gcg gcc 528 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 agc agc tat ctg agc ctg acg cct gag cag tgg aag tcc cac aga agc 576 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 tac agc tgc cag gtc acg cat gaa ggg agc acc gtg gag aag aca gtg 624 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 gcc cct gca gaa tgc tct tga 645 Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg 85 90 95 Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 NY01 1326432 v1 - 1 -

Claims

인슐린-유사 성장 인자-I 수용체에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체, pH 범위 약 6.0 내지 약 7.0의 제약상 허용되는 완충액, 제약상 허용되는 염, 제약상 허용되는 안정화제, 및 제약상 허용되는 계면활성제를 포함하는 액체 제제.
제2항에 있어서, IgG1 항체 농도가 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/ml 범위인 액체 제제.
제1항에 있어서, IgG1이 IMC-A12 또는 IMC-2F8인 액체 제제.
제1항에 있어서, 완충액이 농도 범위 약 5 mM 내지 약 50 mM의 히스티딘, 시트레이트, 말레이트, 타르트레이트, 숙시네이트 및 아세테이트 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 완충액인 액체 제제.
제4항에 있어서, 완충액의 농도가 약 10 mM인 액체 제제.
제1항에 있어서, 안정화제가 아스파르트산, 락토비온산, 글리신, 트레할로스, 만니톨 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 액체 제제.
제6항에 있어서, 안정화제의 농도가 약 75 mM 내지 약 150 mM 범위인 액체 제제.
제7항에 있어서, 안정화제의 농도가 약 100 mM인 액체 제제.
제6항에 있어서, 안정화제가 트레할로스인 액체 제제.
제6항에 있어서, 안정화제가 히스티딘인 액체 제제.
제1항에 있어서, 염이 농도 범위 약 75 내지 약 150 mM의 NaCl인 액체 제제.
제11항에 있어서, NaCl의 농도가 약 100 mM인 액체 제제.
제1항에 있어서, 계면활성제가 농도 범위 약 0.001％ 내지 약 1.0％ (중량/부피)의 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 및 담즙산염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 액체 제제.
제13항에 있어서, 계면활성제의 농도가 약 0.01％ (중량/부피)인 액체 제제.
제1항에 있어서, pH가 약 6.0 내지 약 6.5 범위인 액체 제제.
제13항에 있어서, pH가 약 6.5인 액체 제제.
제1항에 있어서, 약 5 mg/ml IMC-A12 항체, 약 10 mM 시트르산나트륨 완충액, 약 100 mM 글리신 안정화제, 약 100 mM NaCl 및 약 0.01 ％ 폴리소르베이트 80을 포함하며, pH가 약 6.5인 액체 제제.
제1항에 있어서, 동결건조 제제를 형성하기 위해 동결건조되는 액체 제제.
제18항에 있어서, 증량제를 더 포함하는 동결건조 제제.
제19항에 있어서, 증량제가 만니톨 또는 글리신인 동결건조 제제.