CN101668540A - 稳定的抗体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于稳定抗体的制剂和方法。在一个实施方案中，本发明提供特异性结合胰岛素样生长因子－I受体的IgG1抗体的稳定溶液制剂。在另一个实施方案中，本发明提供稳定特异性结合胰岛素样生长因子－I受体的IgG1抗体的方法，所述方法包括冻干所述抗体的含水制剂。所述制剂可被冻干，以在加工和储存过程中稳定抗体，然后可以将所述制剂重配，用于药物学给予。

Description

稳定的抗体制剂
交叉参考
本申请要求保护2007年3月22日申请的美国临时专利申请序号60/919744的权益，该临时申请的内容通过引用整体结合到本文中。
发明领域
[0001]本发明涉及稳定结合胰岛素样生长因子-1受体的抗体的方法和制剂。
发明背景
[0002]液体制剂中的抗体容易受各种化学和物理过程的影响，这些过程包括水解、聚集、氧化、脱氨基和铰链区片段化。这些过程可以通过降低功能性抗体的利用度和通过降低或消除它们的抗原结合特征而改变或消除治疗性抗体的临床效果。本发明满足了对针对胰岛素样生长因子受体(IGF-IR)的IgG1亚型的单克隆抗体的稳定制剂的需求，提供这些抗体的稳定溶液制剂和稳定冻干制剂。
[0003]IGF-IR是一种普遍存在的跨膜酪氨酸激酶受体，其对于胚胎和产后期的正常生长和发育是必不可少的。IGF-IR可以刺激细胞增殖、细胞分化、细胞大小改变和防止细胞发生凋亡。其还被视为细胞转化的准必需因子(综述于Adams等，Cell.Mol.Life Sci.57：1050-93(2000)；Baserga，Oncogene 19：5574-81(2000))。IGF-IR位于大多数细胞类型的细胞表面，并充当生长因子IGF-I和IGF-II(以下合称IGF)的信号转导分子。IGF-IR还结合胰岛素，但亲合力比其与IGF的结合亲合力小三个数量级。IGF-IR是预形成的异型四聚体，含有以二硫键共价连接的2条α链和2条β链。受体亚基被合成为180kd的单条多肽链的一部分，该多肽链随后经蛋白质酶解加工为α(130kd)亚基和β(95kd)亚基。整条α链位于胞外，并含有配体结合位点。β链具有跨膜结构域、酪氨酸激酶结构域和C-端延伸部分，该C-端延伸部分是细胞分化和转化所必需的，但对于有丝分裂原信号转导和防止凋亡不是必需的。
[0004]IGF-IR与胰岛素受体(IR)高度相似，尤其是在β链序列内(70％同源性)。由于该同源性，最近的研究已证实，这些受体可以形成含有1个IR二聚体和1个IGF-IR二聚体的杂合体(Pandini等，Clin.Canc.Res.5：1935-19(1999))。杂合体的形成发生在正常细胞和转化细胞中，且杂合体的含量取决于两种同种二聚体受体(IR和IGF-IR)在细胞内的浓度。在一项39份乳腺癌标本的研究中，尽管IR和IGF-IR在所有肿瘤样品中均过表达，但杂合受体的含量始终比这两种同型受体的水平高大约3倍(Pandini等，Clin.Canc.Res.5：1935-44(1999))。尽管杂合受体由IR和IGF-IR对组成，但杂合体选择性结合IGF，其亲合力与IGF-IR的类似，并仅微弱地结合胰岛素(Siddle和Soos，The IGFSystem.Humana Press.199-225页，1999)。这些杂合体因此可在正常细胞和转化细胞内结合IGF，并转导信号。
[0005]第二种IGF受体IGF-IIR或甘露糖-6-磷酸(M6P)受体也高亲合力结合IGF-II配体，但没有酪氨酸激酶活性(Oates等，BreastCancer Res.Treat.47：269-81(1998))。因为其导致IGF-II降解，所以被认为是IGF-II的汇点(sink)，拮抗该配体的生长促进作用。在肿瘤细胞中，IGF-IIR的减损可以通过发挥其对IGF-II与IGF-IR结合的拮抗作用而增强生长潜力(Byrd等，J.Biol.Chem.274：24408-16(1999))。
[0006]IGF-I的内分泌表达主要受生长激素调节，并主要在肝脏中产生，但最近的证据提示，许多其它的组织类型也能够表达IGF-I。因此，该配体经受内分泌和副分泌调节，以及就许多肿瘤细胞类型而言，经受自分泌调节(Yu，H.和Rohan，J.，J.Natl.Cancer Inst.92：1472-89(2000))。
[0007]已在血清中鉴定出6种对IGF具有特异性结合亲合力的IGF结合蛋白质(IGFBP)(Yu，H.和Rohan，J.，J.Natl.Cancer Inst.92：1472-89(2000))。依据作为翻译后修饰结果的结合蛋白质的分子结构测定，IGFBP可以增强或抑制IGF的作用。它们的主要作用是运输IGF、保护IGF免于蛋白质酶降解和调节IGF与IGF-IR的相互作用。仅约1％的血清IGF-I作为游离配体存在，其余的与IGFBP结合(Yu，H.和Rohan，J.，J.Natl.Cancer Inst.92：1472-89(2000))。
[0008]在结合配体(IGF)时，IGF-IR在β链的催化结构域中的保守酪氨酸残基处经历自动磷酸化。随后在β链内的其余酪氨酸残基的磷酸化为募集对信号转导级联关键的下游分子提供了停泊位点。转导IGF信号的主要途径是有丝分裂原活化的蛋白质激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)(综述于Blakesley等，载于：The IGF System.Humana Press.143-163(1999))。MAPK途径主要负责IGF刺激后激发的促有丝分裂信号，而PI3K负责抗凋亡或存活过程的IGF依赖性诱导。
[0009]IGF-IR信号转导的关键作用是其抗凋亡或存活的功能。活化的IGF-IR向PI3K和下游的Akt磷酸化或蛋白质激酶B发信号。Akt可以通过磷酸化有效阻断诸如BAD的分子(其是启动程序化细胞死亡必需的)，并抑制凋亡启动(Datta等，Cell 91：231-41(1997))。凋亡是一种对正常发育过程非常关键的细胞机制(Oppenheim，Annu.Rev.Neurosci.14：453-501(1991))。它是一种实现消除严重受损的细胞和降低可能促进肿瘤发生的诱变损伤的潜在持久性的关键机制。为此，业已表明，IGF信号转导的活化可以在小鼠转基因模型中促进自发肿瘤的形成(DiGiovanni等，Cancer Res.60：1561-70(2000))。而且，IGF过表达可以拯救细胞免于化疗诱导的细胞死亡，并可能是肿瘤细胞抗药性的重要因素(Gooch等，Breast Cancer Res.Treat.56：1-10(1999))。因此，已表明调节IGF信号转导途径增加肿瘤细胞对化疗剂的敏感性(Benini等，Clinical Cancer Res.7：1790-97(2001))。
[0010]大量的调查和临床研究已将IGF-IR及其配体(IGF)与癌症的出现、维持和发展联系起来。在肿瘤细胞中，受体的过表达经常与IGF配体的过表达相一致，导致这些信号增强，并因此导致增强的细胞增殖和存活。已表明IGF-I和IGF-II为众多癌细胞系的强有丝分裂原，所述癌细胞系包括前列腺(Nickerson等，Cancer Res.61：6276-80(2001)；Hellawell等，Cancer Res.62：2942-50(2002))、乳腺(Gooch等，Breast Cancer Res.Treat.56：1-10(1999))、肺、结肠(Hassan和Macaulay，Ann.Oncol.13：349-56(2002))、胃、白血病、胰腺、脑、骨髓瘤(Ge和Rudikoff，Blood 96：2856-61(2000))、黑素瘤(All-Ericsson等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.43：1-8(2002))和卵巢(综述于：Macaulay，Br.J.Cancer 65：311-20(1990))，该作用通过IGF-IR介导。已经将血清中的高IGF-I循环水平与增加的乳癌、前列腺癌和结肠癌风险关联起来(Pollak，Eur.J.Cancer 36：1224-28(2000))。在结肠癌的小鼠模型中，体内循环IGF-I水平的增加导致肿瘤生长和转移的发病率显著增加(Wu等，Cancer Res.62：1030-35(2002))。业已表明，IGF-I在转基因小鼠的表皮基细胞中的组成型表达促进自发的肿瘤形成(DiGiovanni等，Cancer Res.60：1561-1570(2000)；Bol等，Oncogene 14：1725-1734(1997))。IGF-II在细胞系和肿瘤中的过表达以高频率发生，其可能起因于IGF-II基因的基因组印迹的缺失(Yaginuma等，Oncology 54：502-7(1997))。已在许多不同的人类肿瘤类型中证实了受体过表达，所述肿瘤类型包括肺(Quinn等，J.Biol.Chem.271：11477-83(1996))、乳腺(Cullen等，Cancer Res.50：48-53(1990)；Peyrat和Bonneterre，CancerRes.22：59-67(1992)；Lee和Yee，Biomed.Pharmacother.49：415-21(1995))、肉瘤(van Valen等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.118：269-75(1992)；Scotlandi等，Cancer Res.56：4570-74(1996))、前列腺(Nickerson等，Cancer Res.61：6276-80(2001))和结肠(Hassan和Macaulay，Ann.Oncol.13：349-56(2002))。另外，已表明高转移性的癌细胞具有比不大倾向于转移的肿瘤细胞高的IGF-II和IGF-IR表达(Guerra等，Int.J.Cancer 65：812-20(1996))。IGF-IR在细胞增殖和转化中的关键作用在IGF-IR敲除小鼠的胚成纤维细胞实验中被证实。这些原代细胞在含有10％血清的培养基中以显著较低的速率生长，且不能利用多种癌基因(包括SV40大T)转化(Sell等，Mol.Cell.Biol.3604-12(1994))。最近已证实，在某些形式的乳癌中对药物赫赛汀的抗性可能归因于在那些癌症中的IGF-IR信号转导的活化(Lu等，J.Natl.Cancer Inst.93：1852-57(2001))。因此，IGF-IR的过表达或活化可能不仅是致肿瘤性的主要决定因素，而且是肿瘤细胞抗药性的主要决定因素。
[0011]IGF系统的活化还已经涉及几种除癌症之外的病理状况，包括肢端肥大症(Drange和Melmed.载于：The IGF System.Humana Press.699-720(1999))、视网膜新血管生成(Smith等，NatureMed.12：1390-95(1999))和银屑病(Wraight等，Nature Biotech.18：521-26(2000))。在后一研究中，靶向IGF-IR的反义寡核苷酸制品有效地显著抑制小鼠模型中的人银屑病皮肤移植物中的表皮细胞的过度增殖，提示抗IGF-IR疗法可能是对该慢性疾病的有效治疗。
[0012]已有多种策略抑制细胞中的IGF-IR信号转导途径。反义寡核苷酸在体外和在实验小鼠模型中一直是有效的，如以上关于银屑病所述。另外，已产生了靶向IGF-IR的抑制性肽，其在体外和体内具有抗增殖活性(Pietrzkowski等，Cancer Res.52：6447-51(1992)；Haylor等，J. Am.Soc.Nephrol.11：2027-35(2000))。业已表明，得自IGF-IR的C-端的合成肽序列诱导凋亡，并显著抑制肿瘤生长(Reiss等，J.Cell.Phys.181：124-35(1999))。还已经产生了IGF-IR的几种显性负突变体，其在肿瘤细胞系中过表达时，与野生型IGF-IR竞争配体，并在体外和体内有效地抑制肿瘤细胞生长(Scotlandi等，Int.J.Cancer101：11-6(2002)；Seely等，BMC Cancer 2：15(2002))。另外，还已经证实，可溶形式的IGF-IR在体内抑制肿瘤生长(D’Ambrosio等，CancerRes.56：4013-20(1996))。还已经表明，针对人IGF-IR的抗体在体外抑制肿瘤细胞增殖，并在体内抑制肿瘤生成，包括来源于乳癌(Artega和Osborne，Cancer Res.49：6237-41(1989))、Ewing骨肉瘤(Scotlandi等，Cancer Res.58：4127-31(1998))和黑素瘤(Furlanetto等，Cancer Res.53：2522-26(1993))的细胞系。抗体成为有吸引力的治疗方式，主要是因为它们1)对特定的蛋白质抗原具有高选择性，2)能够对抗原表现出高亲合力结合，3)体内半衰期长，以及，因为它们是天然的免疫产物，其应该4)具有低体内毒性(Park和Smolen.载于：Advances in ProteinChemistry.Academic Press.360-421页，(2001))。但是，来源于非人来源如小鼠的抗体在重复施用后，可以实现对治疗性抗体的直接免疫应答，由此中和抗体的效力。全人抗体作为人治疗剂提供了最大的成功可能性，因为它们在人中可能比鼠抗体或嵌合抗体的免疫原性低，类似于天然的免疫反应性抗体。为此，需要为治疗性应用开发高亲合力的人抗IGF-IR单克隆抗体的稳定制剂。
发明概述
[0013]本发明涉及稳定抗体制品的制剂和方法。在一个实施方案中，本发明提供稳定的溶液(或液体)制剂，其含有特异性结合胰岛素样生长因子-I受体的IgG1抗体和缓冲剂。在进一步的实施方案中，液体制剂中的抗体浓度在约5mg/ml至约30mg/ml的范围内。优选地，所述抗体为IMC-A12或IMC-2F8。更优选地，所述抗体为IMC-A12。
[0014]在一个实施方案中，稳定的抗体溶液制剂包含柠檬酸盐缓冲剂。在进一步的实施方案中，所述柠檬酸盐缓冲剂处于约5mM至约50mM的浓度。在进一步的实施方案中，所述柠檬酸盐缓冲剂处于约10mM的浓度。
[0015]在一个实施方案中，稳定的抗体溶液制剂包含甘氨酸。在进一步的实施方案中，所述甘氨酸浓度为约75mM至约150mM。在进一步的实施方案中，所述甘氨酸浓度为约100mM。
[0016]在一个实施方案中，稳定的抗体溶液制剂包含NaCl。在进一步的实施方案中，所述NaCl处于约75mM至约150mM的浓度。在进一步的实施方案中，所述NaCl处于约100mM的浓度。
[0017]在一个实施方案中，稳定的抗体溶液制剂包含表面活性剂。在进一步的实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨醇酯(吐温，a/k/a聚乙烯-聚丙二醇)，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在进一步的实施方案中，所述表面活性剂为约0.001％至约1.0％(重量/体积)浓度的聚山梨醇酯80(吐温80)。在进一步的实施方案中，吐温80处于约0.01％的浓度(重量/体积)。
[0018]在一个实施方案中，稳定的抗体溶液制剂具有约6.0至约7.0的pH。在进一步的实施方案中，所述pH为约6.0至约6.5。在进一步的实施方案中，所述pH为约6.5。
[0019]在一个实施方案中，稳定的抗体溶液制剂包含约5mg/ml IMC-A12、约10mM柠檬酸钠、约100mM甘氨酸、约100mMNaCl和约0.01％吐温80，其中所述制剂处于约6.5的pH。
[0020]在一个实施方案中，本发明提供稳定的冻干抗体制剂，其含有特异性结合胰岛素样生长因子-I受体的IgG1抗体，其中所述制剂是冻干的。在一个实施方案中，所述抗体为IMC-A12。在进一步的实施方案中，所述IMC-A12浓度在冻干前为30mg/ml。
[0021]在一个实施方案中，稳定的冻干抗体制剂含有组氨酸缓冲剂。在进一步的实施方案中，所述组氨酸浓度在冻干前为约10mM至约50mM。在进一步的实施方案中，所述组氨酸浓度在冻干前为约10mM。在进一步的实施方案中，所述缓冲剂在冻干前为约pH 6.5。
[0022]在一个实施方案中，稳定的冻干抗体制剂含有冻干保护剂。在进一步的实施方案中，所述冻干保护剂为糖。在进一步的实施方案中，所述冻干保护剂为海藻糖。在进一步的实施方案中，海藻糖浓度在冻干前为约4.6％。在一个实施方案中，海藻糖浓度对抗体浓度的比率在冻干前为约200至约1000。在进一步的实施方案中，海藻糖浓度对抗体浓度的比率在冻干前为约600。
[0023]在一个实施方案中，稳定的冻干抗体制剂含有填充剂(abulking agent)。在进一步的实施方案中，所述填充剂为甘露醇或甘氨酸。
[0024]在一个实施方案中，稳定的冻干抗体制剂包含约30mg/ml IMC-A12、约10mM组氨酸和约4.6％海藻糖(重量/体积)，其中所述制剂为约6.5的pH，且其中浓度和pH为冻干前的。
附图简述
[0025]图1显示了相对于IMC-A12溶液制剂的pH的熔融温度(Tm1)变化。通过差示扫描量热法(DSC)测定实验制剂(得自表2)中的IMC-A12的热熔融曲线，以便评价测试条件下IMC-A12的转变温度(Tm)。
[0026]图2显示了相对于IMC-A12溶液制剂的pH变化，由于形成不溶性聚集体(aggregate)而产生的损失百分率的变化。将在27.5mL玻璃小瓶中的如表2所述的样品(包含5mg/mL的5mL IMC-A12)于室温以300RPM搅拌72小时。通过SEC-HPLC分析损失百分率。
[0027]图3显示了相对于IMC-A12溶液制剂pH的的单体百分率变化。将在27.5mL玻璃小瓶中的如表2所述的样品(包含5mg/mL的5mL IMC-A12)于室温以300RPM搅拌72小时。通过SEC-HPLC分析单体百分率。
[0028]图4显示了随着40℃时的IMC-A12溶液制剂pH的变化，单体百分率的变化。将在不同pH缓冲液(列于表2)中的5mg/mL的IMC-A12于40℃保温3周。通过SEC-HPLC分析pH对单体百分率的影响。
[0029]图5显示了随着50℃时的IMC-A12溶液制剂pH的变化，单体百分率的变化。将在不同pH缓冲液(列于表2)中的5mg/mL的IMC-A12于50℃保温1周。通过SEC-HPLC分析pH对单体百分率的影响。
[0030]图6显示了随着-20℃和-70℃时的IMC-A12溶液制剂pH的变化，单体百分率的变化。将在不同pH缓冲液(列于表2)中的5mg/mL的IMC-A12于-20℃和-70℃保温3周。通过SEC-HPLC分析pH对单体百分率的影响。
[0031]图7显示了用于IMC-A12溶液制剂的DSC研究的预测性变化(a prediction profiler)。针对缓冲剂类型、pH、吐温80浓度、NaCl浓度和甘氨酸浓度对转变温度的影响进行了预测性变化研究。蛋白质浓度为5mg/mL，温度变化以1.5℃/分钟的扫描速率由5℃至95℃。将对应于主转变峰的熔融温度拟合为线性回归模型，以评价所测试变量的影响。
[0032]图8显示了用于IMC-A12溶液制剂的搅拌研究的预测性变化。将在27.5mL玻璃小瓶中的表3所述样品(含5mg/mL的5mLIMC-A12)在平板摇床上以300RPM搅拌。该研究于室温进行直至72小时。测定随搅拌时间变化的溶液浊度和单体百分率。通过使用JMP软件将反应拟合为线性回归模型评价所测试变量对浊度和单体百分率的影响。
[0033]图9显示了IMC-A12溶液制剂于40℃保温4周后剩余单体的百分率。将在表3制剂中的5mg/mL的IMC-A12于40℃保温4周。通过SEC-HPLC分析于40℃保温4周后起始物质(startingmaterial)和测试制剂中的单体百分率。
[0034]图10显示了IMC-A12溶液制剂于50℃保温2周后剩余单体的百分率。将在表3制剂中的5mg/mL的IMC-A12于50℃保温2周。通过SEC-HPLC分析于50℃保温2周后起始物质和测试制剂中的单体百分率。
[0035]图11显示了用于IMC-A12溶液制剂的实时加速温度稳定性的预测性变化。研究了针对pH、NaCl浓度、甘氨酸浓度、时间和温度对单体百分率、聚集体百分率和降解物百分率的影响的预测性变化。
[0036]图12显示了随搅拌时间变化的IMC-A12的柠檬酸盐制剂和PBS制剂的溶液浊度的比较。将在27.5mL玻璃小瓶中的样品(含有5mg/mL的IMC-A12)在平板摇床上以300RPM搅拌。该研究于室温进行直至72小时。使用Shimatzu 1601biospec分光光度计依据350nm的吸光度测定浊度。
[0037]图13显示了随搅拌时间变化的柠檬酸盐制剂和PBS制剂的IMC-A12损失百分率的比较。将在27.5mL玻璃小瓶中的样品(含有5mg/mL的IMC-A12)在平板摇床上以300RPM搅拌。该研究于室温进行直至72小时。通过SEC-HPLC检测(由于形成不溶性聚集体而产生的)物质损失百分率。
[0038]图14显示了随搅拌时间变化的柠檬酸盐制剂和PBS制剂的IMC-A12单体百分率的比较。将在27.5mL玻璃小瓶中的样品(含有5mg/mL的IMC-A12)在平板摇床上以300RPM搅拌。该研究于室温进行直至72小时。通过SEC-HPLC分析单体百分率。
[0039]图15显示了随着40℃时的保温时间的变化，IMC-A12的PBS制剂和柠檬酸盐制剂的单体百分率的比较。通过SEC-HPLC分析单体百分率。
[0040]图16显示了随着40℃时的保温时间的变化，IMC-A12的PBS溶液制剂和柠檬酸盐溶液制剂的聚集体百分率的比较。通过SEC-HPLC分析聚集体百分率。
[0041]图17显示了随着40℃时的保温时间的变化，IMC-A12的PBS溶液制剂和柠檬酸盐溶液制剂的降解物百分率的比较。通过SEC-HPLC检测降解物百分率。
[0042]图18显示了于40℃保温3个月后IMC-A12的PBS溶液制剂和柠檬酸盐溶液制剂的SDS-PAGE(还原性的)。在4-20％tris-甘氨酸梯度凝胶上进行还原性SDS-PAGE。每个泳道以10μl体积加载10μg样品。凝胶用考马斯蓝染色。泳道4的“柠檬酸盐”为：5mg/mLIMC-A12、10mM柠檬酸盐、100mM甘氨酸、100mM NaCl、0.01％吐温80，pH 6.5。泳道2和3的“PBS”为磷酸缓冲盐水[参见下文的表3和4]。
[0043]图19显示了于40℃保温3个月后IMC-A12的PBS溶液制剂和柠檬酸盐溶液制剂的SDS-PAGE(非还原性的)。使用4-20％tris-甘氨酸梯度凝胶进行非还原性SDS-PAGE。以10μl体积加载10μg样品。凝胶用考马斯蓝染色。泳道4的“柠檬酸盐”为：5mg/mLIMC-A12、10mM柠檬酸盐、100mM甘氨酸、100mM NaCl、0.01％吐温80，pH 6.5。泳道2和3的“PBS”为磷酸缓冲盐水[参见下文的表3和4]。
[0044]图20显示了于40℃保温3个月后IMC-A12的PBS溶液制剂和柠檬酸盐溶液制剂的等电聚焦(IEF)凝胶。IEF使用6.0-10.5pH范围的
Figure A20088000944600141
Agarose IEF板进行。测试样品被缓冲交换到含0.5％吐温80的milliQ水中。以10μl体积加载10μg样品。凝胶用考马斯蓝染色。泳道4的“柠檬酸盐”为：5mg/mL IMC-A12、10mM柠檬酸盐、100mM甘氨酸、100mM NaCl、0.01％吐温80，pH 6.5。泳道2和3的“PBS”为磷酸缓冲盐水[参见下文的表3和4]。
[0045]图21显示了随着-20℃时的时间变化，单体百分率的变化。将5mg/mL的IMC-A12的PBS溶液制剂或柠檬酸盐溶液制剂于-20℃保温直至3个月。在保温后，通过SEC-HPLC分析单体百分率。
[0046]图22显示了随着-70℃时的时间变化，单体百分率的变化。将5mg/mL的IMC-A12的PBS溶液制剂或柠檬酸盐溶液制剂于-70℃保温直至3个月。在保温后，通过SEC-HPLC分析单体百分率。
[0047]图23显示了随着-20℃时的冻融循环次数的变化，单体百分率的变化。通过在冻干机中以1℃/分钟的变化速率将测试样品冷冻至-20℃评价IMC-A12的冻融稳定性。使样品保温1小时，并以1℃/分钟的变化速率于4℃融化。冻融过程重复直至15次，并通过SEC-HPLC分析单体百分率。
[0048]图24显示了随着-70℃的冻融循环次数的变化，单体百分率的变化。通过在冻干机中以1℃/分钟的变化速率将测试样品冷冻至-70℃评价IMC-A12的冻融稳定性。使样品保温1小时，并以1℃/分钟的变化速率于4℃融化。冻融过程重复直至15次，并通过SEC-HPLC分析单体百分率。
[0049]图25显示了随着缓冲剂类型、冷冻保护剂和冻干保护剂、填充剂、时间和温度的变化，单体百分率的变化。
[0050]图26显示了随着缓冲剂类型、冷冻保护剂和冻干保护剂、填充剂、时间和温度的变化，聚集体百分率的变化。
[0051]图27显示了随着缓冲剂类型、冷冻保护剂和冻干保护剂、填充剂、时间和温度的变化，降解物百分率的变化。
[0052]图28显示了随着缓冲剂类型、冷冻保护剂和冻干保护剂、填充剂、时间和温度的变化，溶液浊度的变化。
[0053]图29显示了IMC-A12冻干制剂的单体百分率的变化。检查了于40℃和50℃保温3个月对表6的冻干制剂5、6、9和10中的单体百分率的影响。通过SEC-HPLC分析单体百分率。
[0054]图30显示了IMC-A12冻干制剂的聚集体百分率的变化。分析了于40℃和50℃保温3个月对表6的冻干制剂5、6、9和10中的聚集体百分率的影响。通过SEC-HPLC分析聚集体百分率。
[0055]图31显示了IMC-A12冻干制剂的降解物百分率的变化。分析了于40℃和50℃保温3个月对表6的冻干制剂5、6、9和10中的降解物百分率的影响。通过SEC-HPLC分析降解物百分率。
[0056]图32显示了IMC-A12冻干制剂的溶液浊度的变化。在用Milli-Q水复水至5mg/mL后，分析了于40℃和50℃保温3个月对表6的冻干制剂5、6、9和10的浊度的影响。使用Shimatzu 1601biospec分光光度计依据350nm的吸光度测定浊度。
[0057]图33显示了保温4个月后剩余单体百分率的变化。将表7的冻干IMC-A12制剂于4℃、40℃和50℃保温直至4个月。冻干样品用Milli-Q水复水至5mg/mL，并通过SEC-HPLC分析，以确定剩余单体百分率。
[0058]图34显示了冻干前(虚线)和冻干后(实线)IMC-A12的圆二色光谱。为确保冻干过程没有改变A12的二级结构，通过圆二色光谱检查冻干前和冻干后的IMC-A12的二级结构。将IMC-A12稀释或重配入MilliQ水中至0.1mg/mL，使用Jasco 810圆二色分光光度计收集圆二色光谱。
[0059]图35显示了随着在40℃时的时间不同，单体百分率的变化。将在PBS和柠檬酸盐中的IMC-A12溶液制剂和在优选的冻干制剂中的IMC-A12于40℃保温4个月。以Milli-Q水重配冻干样品，并通过SEC-HPLC分析单体百分率。
[0060]图36显示了随着在50℃时的时间不同，单体百分率的变化。将在PBS和柠檬酸盐中的IMC-A12溶液制剂和在优选的冻干制剂中的IMC-A12于50℃保温4个月。以Milli-Q水重配冻干样品，并通过SEC-HPLC分析单体百分率。
[0061]图37显示了随着在40℃时的时间的变化，聚集体百分率的变化。将在PBS和柠檬酸盐缓冲液中的IMC-A12溶液制剂和在优选的冻干制剂中的IMC-A12于40℃保温4个月。以Milli-Q水重配冻干样品，并通过SEC-HPLC分析聚集体百分率。
[0062]图38显示了随着在50℃时的时间变化，聚集体百分率的变化。将在PBS和柠檬酸盐缓冲液中的IMC-A12溶液制剂和在优选的冻干制剂中的IMC-A12于50℃保温4个月。以Milli-Q水重配冻干样品，并通过SEC-HPLC分析聚集体百分率。
[0063]图39显示了随着在40℃时的时间变化，降解物百分率的变化。将在PBS和柠檬酸盐缓冲液中的IMC-A12溶液制剂和在优选的冻干制剂中的IMC-A12于40℃保温4个月。以Milli-Q水重配冻干样品，并通过SEC-HPLC分析降解物百分率。
[0064]图40显示了随着在50℃时的时间变化，降解物百分率的变化。将在PBS和柠檬酸盐缓冲液中的IMC-A12溶液制剂和在优选的冻干制剂中的IMC-A12于40℃和50℃保温4个月。以Milli-Q水重配冻干样品，并通过SEC-HPLC分析降解物百分率。
[0065]图41显示了保温4个月的样品的SDS-page(还原性的)分析。将在PBS和柠檬酸盐缓冲液中的IMC-A12溶液制剂和在优选的冻干制剂中的IMC-A12于4℃、40℃和50℃保温4个月。以Milli-Q水重配冻干样品，将10μg加载至4-20％Tris-甘氨酸凝胶。用考马斯蓝染色凝胶。
发明详述
[0066]液体制剂中的抗体容易受多种化学和物理过程的影响，这些过程包括水解、聚集、氧化、脱氨基和铰链区片段化。这些过程可以通过降低功能性抗体的利用度和通过降低或消除它们的抗原结合特征而改变或消除治疗性抗体的临床效果。本发明满足了对单克隆抗体的稳定制剂的需求，提供冻干这些抗体的方法和制剂。
[0067]在一个实施方案中，本发明提供稳定的溶液制剂(在本文也称为“液体制剂”)，其含有特异性结合胰岛素样生长因子-I受体的IgG1抗体和缓冲剂/液。在进一步的实施方案中，所述抗体为IMC-A12。在另一个实施方案中，所述抗体为IMC-2F8。
[0068]IMC-A12是IgG1亚类的全人单克隆抗体，针对胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)。IMC-A12抗体公开于PCT公布号WO/2005/016970，该专利通过引用整体结合到本文中。IMC-A12重链的核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和2。IMC-A12轻链的核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：3和4。使用IMC-A12治疗骨癌的方法公开于PCT公布号WO/2006/138729，该专利通过引用整体结合到本文中。
[0069]IMC-2F8是IgG1亚类的全人单克隆抗体，也针对胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)。IMC-A12抗体公开于PCT公布号WO/2005/016970，该专利通过引用整体结合到本文中。IMC-2F8重链的核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和2。IMC-2F8轻链的核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：5和6。
[0070]进行制剂筛选，以便确定初始制剂磷酸缓冲盐水(PBS)于pH 7.2的稳固性(robustness)。其由PBS中的IMC-A12对聚集、沉淀、降解、水解和光敏感的筛选研究确定。除此之外，其由于颗粒物质而不能通过小容量注射测试。一种改善的溶液制剂被开发出来，其组成为5mg/mL IMC-A12、10mM柠檬酸钠、100mM甘氨酸、100mMNaCl和0.01％吐温80，pH 6.5。与PBS制剂不同，柠檬酸盐制剂是无颗粒的，并具有改善的稳定性。
[0071]在使于铰链区发生的水解最低的进一步改善中，冻干制剂含有30mg/mL IMC-A12、10mM组氨酸pH 6.5和4.6％海藻糖。对于冻干制剂中的IMC-A12，水解被终止。
[0072]本发明提供减少或消除抗体降解的溶液制剂。所述制剂可以包含以下的一种或多种：特定pH的缓冲剂、盐、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、还原剂和螯合剂。
[0073]本发明提供用于冻干抗体(包括其功能性片段)的制剂，其易于非酶促裂解。所述制剂可以包含其它组分，例如稳定剂、表面活性剂、还原剂、载体、防腐剂、氨基酸和螯合剂。本发明还提供稳定抗体组合物的方法，包括在冻干保护剂存在下冻干抗体的含水制剂。所述制剂可以被冻干，以在加工和储存过程中稳定抗体，然后在药物学给予前重配。优选地，由生产至给药，抗体基本上保留其物理和化学稳定性以及完整性。按照本发明，多种制剂组分可能适于增强稳定性，包括缓冲剂、表面活性剂、糖、糖醇、糖衍生物和氨基酸。按照本发明，多种制剂特性可能适于增强稳定性，包括pH和制剂组分的浓度。
[0074]按照本发明，缓冲剂可用于维持制剂的pH。缓冲剂使由于外部变化而产生的pH波动最小化。本发明的制剂包含一种或多种缓冲剂，以提供合适pH的制剂，所述合适的pH优选约6.0至约7.0，更优选约6.0至约6.5，最优选约6.5。示例性的缓冲剂通常包括但不限于有机缓冲剂，例如组氨酸、柠檬酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐和乙酸盐。在一个实施方案中，所述缓冲剂浓度为约5mM至约50mM。在进一步的实施方案中，所述缓冲剂浓度为约10mM。
[0075]本发明的制剂可以包含一种或多种稳定剂，其可有助于防止抗体的聚集和降解。适宜的稳定剂包括但不限于多羟基糖、糖醇、糖衍生物和氨基酸。优选的稳定剂包括但不限于天冬氨酸、乳糖酸、甘氨酸、海藻糖、甘露醇和蔗糖。
[0076]本发明的制剂可以含有一种或多种表面活性剂。抗体溶液于空气-水界面具有高表面张力。为了降低该表面张力，抗体倾向于在空气-水界面聚集。表面活性剂使空气-水界面的抗体聚集最小，由此有助于保持溶液中抗体的生物活性。例如，加入0.01％吐温80可以降低溶液中的抗体聚集。当制剂被冻干时，表面活性剂还可以降低重配制剂中的颗粒形成。在本发明的冻干制剂中，表面活性剂可被加入到一种或多种冻干前制剂、冻干制剂和重配制剂中，但优选加入到冻干前制剂中。例如，可以在冻干前向抗体溶液加入0.01％吐温80。表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20(吐温20)、聚山梨醇酯80(吐温80)、聚乙烯-聚丙二醇(PLURONIC F-68，CAS#9003-11-6)和胆汁盐。在一个实施方案中，表面活性剂浓度为约0.001％至约1.0％。
[0077]冻干过程可以产生多种可能使蛋白质或多肽变性的应激。这些应激包括温度降低、冰晶形成、离子强度增加、pH变化、相分离、除去水合层和浓度变化。可以通过加入一种或多种冻干保护剂稳定对冷冻和/或干燥过程的应激敏感的抗体。冻干保护剂是针对冻干有关的应激产生保护作用的化合物。因此，冻干保护剂类包括冷冻保护剂，其仅对冷冻过程提供保护。可使用一种或多种冻干保护剂保护与冻干有关的应激，并可以例如为糖，如蔗糖或海藻糖；氨基酸，如谷氨酸单钠或组氨酸单钠；甲胺，如甜菜碱；易溶盐，如硫酸镁；多元醇，如三羟基或更高级糖醇，例如甘油(glycerin)、赤藓醇、丙三醇(glycerol)、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronics；及其组合。优选的冻干保护剂的实例包括但不限于如上所述的稳定剂和表面活性剂。
[0078]本发明提供稳定的制剂，其可以通过冻干过程制备。冻干是一个稳定化过程，其中物质首先被冷冻，然后先通过升华(初级干燥过程)并随后通过解吸(二级干燥过程)将溶剂量减少至不再支持生物学活性或化学反应的值。在冻干制剂中，可以避免或显著减慢与溶液相关的水解、脱氨基、氧化和片段化反应。冻干制剂还可以避免由于运输过程中的短期温度波动而产生的损害，并使得可以室温储存。本发明的制剂还可以通过本领域已知的其它方法干燥，例如喷雾干燥和鼓泡干燥。除非另有说明，否则依据在冻干前制剂中测量的组分浓度描述本发明的制剂。
[0079]在一个实施方案中，本发明提供稳定易于非酶促降解的抗体的方法和制剂，所述非酶促降解可以在铰链区发生。可能使抗体倾向于非酶促裂解的因素包括氨基酸序列、构象和翻译后加工。
[0080]通过温育抗体溶液，可以测定抗体的水解、聚集、氧化、脱氨基、沉淀和/或铰链区片段化。通常，保温在提升的温度下进行，以缩短研究时程。例如，于40℃或50℃保温3个月。在保温后，可以使用大小排阻层析-高效液相层析(SEC-HPLC)分析降解产物。
[0081]另外，可以搅拌抗体制剂，以检查制剂组分对机械应激诱导的抗体降解、聚集和沉淀的保护作用。
[0082]本领域已知的多种分析技术可以检测溶液制剂或重配的冻干制剂的抗体稳定性。这样的技术包括例如(i)使用差示扫描热量法(DSC)测定热稳定性，以确定主熔融温度(Tm)；(ii)使用受控的搅拌于室温确定机械稳定性；(iii)于约-20℃、约4℃、室温(约23℃-27℃)、约40℃和约50℃的温度确定实时等温加速温度稳定性；(iv)通过监测于约350nm的吸光度确定溶液浊度，和(v)使用SEC-HPLC确定单体、聚集体和降解物的量。可以在选定的温度检测选定时间段内的稳定性。
[0083]在一个实施方案中，冻干制剂在重配时提供高浓度的抗体。在进一步的实施方案中，稳定的冻干制剂可以用液体重配，以形成溶液，该溶液的抗体浓度比冻干前制剂的抗体浓度高约1-10倍。例如，在一个实施方案中，用1mL或更少的水重配冻干制剂，以获得无颗粒的重配制剂，其具有的抗体浓度为约50mg/mL至约200mg/mL。
[0084]天然抗体通常具有两条相同的重链和两条相同的轻链，每条轻链都通过链间二硫键与重链共价连接。多个二硫键进一步将两条重链彼此连接。各条链可以折叠成具有相似大小(110-125个氨基酸)和结构但功能不同的结构域。轻链可以包含一个可变区(VL)和/或一个恒定区(CL)。重链也可以包含一个可变区(VH)，和/或3个或4个恒定区(CH1、CH2、CH3和CH4)，这取决于抗体的类或同种型。在人类中，同种型为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，IgA和IgG被进一步细分为亚类或亚型(IgA1-2和IgG1-4)。
[0085]通常，可变区在一个抗体与下一个抗体间显示出相当大的氨基酸序列变异性，尤其是在抗原结合位点的位置。在每一个VL和VH中均发现3个区，称为超变区或互补决定区(CDR)，它们被称为构架可变区的变异性较低的区域支持。
[0086]由VL和VH结构域组成的抗体部分被称为Fv(可变片段)，并构成了抗原结合位点。单链Fv(scFv)是一种抗体片段，其在一条多肽链上含有VL结构域和VH结构域，其中一个结构域的N末端和另一个结构域的C末端通过柔性接头连接(参见例如美国专利号4,946,778(Ladner等)；WO 88/09344(Huston等)。WO 92/01047(McCafferty等)描述了在可溶性重组遗传展示包装(例如噬菌体)的表面上展示scFv片段。
[0087]单链抗体缺乏相应完整抗体的部分或全部恒定区。因此，它们可以克服与使用完整抗体相关的一些问题。例如，单链抗体趋向于没有重链恒定区和其它生物分子之间的某些不需要的相互作用。另外，单链抗体显著小于完整抗体，并可以具有比完整抗体更高的渗透性，使得单链抗体更有效地定位和结合靶抗原结合位点。而且，单链抗体相对小的尺寸使它们在受体中比完整抗体更不易激发不需要的免疫应答。
[0088]其中每个单链抗体均具有通过首个肽接头共价连接的一个VH结构域和一个VL结构域的多个单链抗体可以通过至少一个或多个肽接头共价连接，以形成多价单链抗体，其可为单特异性的或多特异性的。多价单链抗体的每条链均包含可变轻链片段和可变重链片段，并通过肽接头与至少一条其它链连接。所述肽接头由至少15个氨基酸残基组成。氨基酸残基的最大数目为约100个。
[0089]两个单链抗体可以组合形成二价抗体，也称为二价二聚体。双功能抗体具有两条链和两个结合位点，并可以为单特异性的或双特异性的。二价抗体的每条链都包含与VL结构域连接的VH结构域。所述结构域以接头连接，所述接头短到足以防止同一条链上的结构域之间配对，由此驱动不同链上的互补结构域之间配对，以再产生两个抗原结合位点。
[0090]3个单链抗体可以组合形成三价抗体，也称为三价三聚体。三价抗体以直接与VL或VH结构域的羧基末端融合的VL或VH结构域的氨基末端构建，即没有任何接头序列。三价抗体具有3个Fv头，多肽以环形头尾融合形式排列。三价抗体的一种可能构象是平面的，3个结合位点位于一个平面中，彼此呈120度角。三价抗体可以是单特异性、双特异性的或三特异性的。
[0091]Fab(抗原结合片段)是指由VL CL VH和CH1结构域组成的抗体片段。木瓜蛋白质酶消化后产生的那些片段被简单称为Fab，且不保留重链铰链区。在胃蛋白质酶消化后，产生多种保留重链铰链的Fab。链间二硫键保持完整的那些二价片段被称为F(ab′)2，而在未保留二硫键时，产生单价Fab′。F(ab′)2片段具有比单价Fab片段更高的对抗原的亲合力。
[0092]Fc(结晶片段)是含有成对的重链恒定区的抗体的部分或片段的名称。例如，在IgG抗体中，Fc包含CH2和CH3结构域。IgA或IgM抗体的Fc进一步包含CH4结构域。Fc与Fc受体结合、补体介导的细胞毒性活化和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)相关。对于为多个IgG样蛋白质的复合物的抗体如IgA和IgM，复合物形成需要Fc恒定区。
[0093]最后，铰链区分隔抗体的Fab和Fc部分，提供了Fab相对于彼此以及相对于Fc的活动性，以及包括多个二硫键，用于共价连接两条重链。
[0094]因此，本发明的抗体包括但不限于与抗原特异性结合的天然抗体、二价片段如(Fab′)2、单价片段如Fab、单链抗体、单链FV(scFv)、单结构域抗体、多价单链抗体、二价抗体、三价抗体等。
[0095]例如，本发明的抗体或其片段可为单特异性的或双特异性的。双特异性抗体(BsAb)为具有两个不同的抗原结合特异性或位点的抗体。在抗体具有1种以上的特异性时，被识别的表位可以与单个抗原或1个以上的抗原结合。因此，本发明提供结合两种不同抗原的双特异性抗体或其片段。
[0096]抗体或其片段的特异性可以基于亲和性和/或亲合力确定。亲和性由抗原与抗体解离的平衡常数(Kd)代表，其衡量抗原决定簇和抗体结合位点之间的结合强度。亲合力是抗体与其抗原之间的结合强度的量度。亲合力与表位和抗体上的其抗原结合位点之间的亲和性相关，也与抗体效价相关，抗体效价是指特定表位的抗原结合位点数。抗体通常以10-5-10-11升/mol的解离常数(Kd)结合。任何低于10-4升/mol的Kd一般都被认为指示非特异性结合。Kd值越低，抗原决定簇和抗体结合位点之间的结合强度越强。
[0097]本文使用的“抗体”和“抗体片段”包括保留对特定抗原的特异性的修饰。这样的修饰包括但不限于与效应分子缀合，所述效应分子例如化疗剂(例如顺铂、紫杉醇、阿霉素)或细胞毒素(例如蛋白质或非蛋白质有机化疗剂)。抗体可以通过缀合可检测的报告体部分来修饰。还包括具有改变的抗体，所述改变影响非结合特征，例如半衰期(例如聚乙二醇化)。
[0098]蛋白质和非蛋白质物质可以通过本领域已知的方法缀合抗体。缀合方法包括直接连接、经共价连接的接头连接和特异性结合配对成员(例如抗生物素蛋白质-生物素)。这样的方法包括例如Greenfield等，Cancer Research 50，6600-6607(1990)对阿霉素缀合描述的那些方法，以及Arnon等，Adv.Exp.Med.Biol.303，79-90(1991)和Kiseleva等，Mol.Biol.(USSR)25，508-514(1991)对铂化合物缀合描述的那些方法。
[0099]本发明的抗体进一步包括其结合特征已通过直接诱变、亲合成熟方法、噬菌体展示或链改组而改善的那些抗体。亲合力和特异性可以通过突变CDR并筛选具有所需特征的抗原结合位点而修饰或改善(参见例如Yang等，J.Mol.Biol.，254：392-403(1995))。CDR以多种方式突变。一种方式是随机化各个残基或残基组合，使得在其它方面相同的抗原结合位点群中的特定位置存在全部20种氨基酸。或者，通过易错PCR法(参见例如Hawkins等，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992))在一系列CDR残基内诱导突变。例如，含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌(E.coli)突变基因菌株中增殖(参见例如Low等，J.Mol.Biol.，250：359-368(1996))。这些诱变方法举例说明了本领域技术人员已知的许多方法。
[0100]还可以修饰抗体，以在Fc区中包含一个或多个氨基酸取代，这些取代改变与Fc受体的结合，由此增加或降低效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性。
[0101]本发明抗体的每个结构域都可以为完整的免疫球蛋白质结构域(例如重链或轻链可变区或恒定区)，或者其可以为天然结构域的功能等同物或突变体或衍生物，或者可以为例如使用诸如在WO93/11236(Griffiths等)中描述的技术在体外构建的合成结构域。例如，有可能将对应于抗体可变区的、失去至少一个氨基酸的结构域接合在一起。抗体的重要区别特征是存在抗原结合位点。术语可变重链片段和可变轻链片段不应被解释为排除对特异性不具有实质作用的变体。
[0102]本发明的抗体和抗体片段可以得自例如天然抗体或Fab或scFv噬菌体展示文库。要理解的是，为了由含有VH和VL结构域的抗体制备单域抗体，可能需要CDR外部的某些氨基酸取代，以增强结合、表达或溶解性。例如，可能需要修饰氨基酸残基，否则这些残基将被包埋在VH-VL界面中。
[0103]此外，可以通过标准杂交瘤技术(Harlow & Lane编辑，Antibody：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，211-213(1998)，其通过引用结合到本文中)，使用产生人免疫球蛋白质γ重链和κ轻链的转基因小鼠(例如得自Medarex，San Jose，Calif.的KM小鼠)，获得本发明的抗体和抗体片段。在优选的实施方案中，产生人抗体的实质部分的基因组被插入到小鼠基因组中，并使产生内源鼠抗体变成缺陷的。可用在完全弗氏佐剂中的部分或全部靶分子皮下(s.c.)免疫这样的小鼠。
[0104]本发明还提供治疗方法，其包含给予重配制剂。重配的制剂通过例如用1mL水重配本发明的冻干制剂而制备。重配时间优选少于1分钟。浓缩的重配制剂使得给药灵活。例如，重配的制剂可以稀释的形式静脉内给予，或者其可以更浓的形式通过注射给予。可以将本发明的浓缩的重配制剂稀释至适于特定对象和/或特定给药途径的浓度。因此，本发明提供治疗方法，其包括将治疗有效量的抗体给予其需要的哺乳动物，尤其是人。本文使用的术语给予是指通过任何可实现所要结果的方法将本发明的抗体组合物传递给哺乳动物。重配的制剂可以例如静脉内或肌内给予。在一个实施方案中，浓缩的重配制剂通过注射给予。
[0105]在本发明制剂中的抗体优选为人抗体。在一个实施方案中，本发明的组合物可用于治疗肿瘤疾病(包括实体瘤和非实体瘤)、治疗过度增殖疾病、治疗肥胖。
[0106]治疗有效量是指本发明的抗体量，当该抗体量被给予哺乳动物时，有效产生所需的治疗作用，例如降低或中和IGF-IR活性、抑制肿瘤生长、治疗非癌性过度增殖疾病、治疗肥胖。给予如上所述的抗体时，可以组合给予其它抗体或任何常规治疗剂(例如抗肿瘤剂)。
[0107]在本发明的实施方案中，所述组合物可以与一种或多种抗肿瘤剂组合给予。可以使用任何适合的抗肿瘤剂，例如化疗剂、辐射物或其组合。抗肿瘤剂可以为烷基化剂或抗代谢物。烷基化剂的实例包括但不限于顺铂、环磷酰胺、美法仑和氮烯唑胺。抗代谢物的实例包括但不限于阿霉素、道诺红菌素、紫杉醇、药薯(CPT-11)和拓扑替康。当抗肿瘤剂为辐射物时，辐射源对于所治疗的患者可以为外部的(外部光束辐射疗法-EBRT)或内部的(短程治疗-BT)。所给予的抗肿瘤剂的剂量取决于众多因素，包括例如药剂类型、所治疗肿瘤的类型和严重性以及给药途径。但是，应当强调的是，本发明不限于任何具体的剂量。
[0108]本发明的抗体或其片段的等价物还包括这样的多肽：其具有的氨基酸序列与本文提供的全长IMC-A12抗体的可变区或超变区的氨基酸序列基本相同。基本相同的氨基酸序列在本文如下定义：通过按照Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，2444-8(1988))的FASTA检索方法测定，具有至少约70％、优选至少约80％和更优选至少约90％同源性的序列。
实施例
[0109]以下实施例进一步说明本发明，但不应理解为以任何方式限制本发明的范围。常规方法(例如在蛋白质分析中使用的那些方法)的详述可以得自众多的出版物，例如Current Protocols in Immunology(由John Wiley&Sons出版)。本文提及的所有的参考文献均通过引用整体结合到本文中。
[0110]对于所有的液体制剂筛选研究，蛋白质浓度均固定为5mg/mL。多组分缓冲液由10mM磷酸钠、10mM柠檬酸钠、10mM乙酸钠、10mM L-组氨酸和125mM氯化钠组成，用于筛选最佳pH。使用实验方案设计(DOE，JMP软件)检验缓冲液/缓冲剂类型、对吐温80的需求、甘氨酸浓度和NaCl浓度。进行线性回归分析，以确定所测试变量的显著性。使用传统的单次单因子方法证实预测的制剂。使用差示扫描热量法(DSC)和实时等温线研究检验所测试的变量对热稳定性的影响。于室温300rpm的受控搅拌用作对机械稳定性的测试。按照ICH指引检验液体制剂的光稳定性。通过冷冻测试样品至-20℃和-70℃并于4℃融化测定冻融稳定性。
[0111]对于冻干的IMC-A12制剂，使用部分析因实验设计模型以20mg/mL的A12浓度检验缓冲液/缓冲剂类型、稳定剂和填充剂。使用混合物设计模型优化IMC-A12的浓度、海藻糖浓度对IMC-A12浓度的比率和吐温80的浓度。使用单次单因子法将预测的优化冻干制剂与PBS溶液制剂和柠檬酸盐溶液制剂对比。通过实时等温线研究检验变量对热稳定性的影响。按照ICH指引检验冻干制剂的光稳定性。
表1：材料、级别和供应商
  材料   级别   供应商
  IMC-A12   1278-116，1278-151   N/A
  柠檬酸钠二水合物   USP   J.T.Baker
  无水柠檬酸   USP   J.T.Baker
  乙酸钠   USP   J.T.Baker
  L-组氨酸   USP   J.T.Baker
  磷酸氢二钠   USP   J.T.Baker
  磷酸二氢钠   USP   J.T.Baker
  NaCl   USP   J.T.Baker
  吐温80   多个药典   J.T.Baker
  甘氨酸   USP   J.T.Baker
  蔗糖   多个药典   Ferro Pfanstiehl
  海藻糖   多个药典   Ferro Pfanstiehl
  甘露醇   多个药典   J.T.Baker
[0112]使用50K截留分子量(YM 50)的centriprep离心过滤装置和Allegra X-12R离心机(Beckman)，通过缓冲液交换入实验缓冲液中，制备用于筛选研究的IMC-A12。使用1.50的消光系数，以280nm的吸光度确定蛋白质浓度，并用适合的缓冲液将浓度调节至5mg/mL。在蛋白质浓度调节后，由10％(重量/体积)母液加入吐温80。5mg/mLIMC-A12的PBS制剂用作对照。所有样品都通过注射器滤器(DuraporePVDF膜)进行0.22μm过滤。
[0113]冻干工艺使用Lyostar II冻干机进行。将产品于室温加载至冻干机。以0.5℃/分钟的冷却速率将搁板温度冷却至-50℃。于-50℃的保温时间为2小时。初始干燥和二级干燥于-30℃和20℃各进行12小时。温度以0.5℃/分钟变化。在初始干燥和二级干燥中的腔体压力为50mT。在完成冻干后，用N2将冻干腔再充气至半大气压，并加帽。
实施例1.pH优化研究
[0114]使用由10mM磷酸钠、10mM柠檬酸钠、10mM乙酸钠、10mM L-组氨酸和125mM氯化钠组成的多组分缓冲液(MCB)测定最佳pH。该缓冲体系预期使反离子(盐作用)最小化，否则反离子可能比单独的pH具有更大的作用。pH筛选设计矩阵示于表2。IMC-A12浓度保持在5mg/mL。所检测的pH范围为5.0-8.0，以0.5pH单位为间隔。研究pH对热稳定性和机械稳定性的影响，结果在下文提供。
表2：用于pH筛选的设计矩阵
  缓冲液   [A12]，(mg/mL)   pH
  MCB-1   5.0   5.0
  MCB-2   5.0   5.5
  MCB-3   5.0   6.0
  MCB-4   5.0   6.5
  MCB-4   5.0   7.0
  MCB-5   5.0   7.5
  MCB-6   5.0   8.0
[0115]差示扫描量热法(DSC)研究
[0116]通过差示扫描热量法(DSC)测定实验制剂(示于表2)中IMC-A12的热熔融曲线，以便评价测试条件下IMC-A12的转变温度(Tm)。蛋白质浓度为5mg/mL，温度变化为5℃-95℃，扫描速率为1.5℃/分钟。熔融曲线拟合为3个Tm的总和。熔融温度Tm1为随pH变化的第一个转变峰，示于图1。在pH 6.5-8.0之间的Tm1是相当的。
[0117]搅拌研究
[0118]在平板摇床上通过搅拌给样品施加应力。以300RPM搅拌在27.5mL玻璃小瓶中的如表2所述的样品，该样品包含5mg/mL的5mL IMC-A12，Headspace设定为81.8％。于室温进行72小时的研究。随着pH的变化，由于形成不溶性聚集体而产生的损失百分率和剩余单体百分率分别示于图2和3。在pH 6.0-7.0之间的损失百分率最小，单体百分率最高。
[0119]于40℃和50℃的实时加速温度稳定性
[0120]将在不同pH缓冲液中的5mg/mL的IMC-A12(表2)于40℃保温3周，以及于50℃保温1周。通过SEC-HPLC分析pH对单体百分率的影响。显示了于40℃保温3周后(图4)和于50℃保温1周后(图5)随着pH变化的剩余单体百分率的变化。在pH 6.0-6.5之间的剩余单体百分率最大。
[0121]于-20℃和-70℃的实时冷冻温度稳定性
[0122]将在不同pH缓冲液中的5mg/mL的IMC-A12(列于表2)于-20℃和-70℃保温3周。通过SEC-HPLC分析pH对单体百分率的影响。在图6中显示了在保温3周后随着pH变化的单体百分率的变化。于-20℃或-70℃，pH对单体百分率没有显著影响。
[0123]pH优化的总结
[0124]发现5mg/mL的IMC-A12的最佳pH为6.0-6.5。
实施例2.针对溶液制剂的赋形剂筛选研究
[0125]在实施例1中的pH优化研究证实，IMC-A12于pH 6.0和6.5之间具有最大的稳定性。在该实施例中，我们研究了缓冲剂类型柠檬酸盐和组氨酸于pH 6.0和6.5对IMC-A12稳定性的影响。还检验了对吐温80的需求以及NaCl浓度和甘氨酸浓度。蛋白质浓度保持固定在5mg/mL。用于赋形剂筛选的设计矩阵示于表3。
表3：用于赋形剂优化的设计矩阵
制剂   [A12]，(mg/mL)   缓冲液类型(10mM) pH   吐温80(％)   [NaCl](mM)   [甘氨酸](mM)
  制剂-1   5.0   组氨酸   6.0   0   80   140
  制剂-2   5.0   组氨酸   6.0   0.01   100   75
  制剂-3   5.0   组氨酸   6.5   0.01   75   150
  制剂-4   5.0   组氨酸   6.5   0   150   0
  制剂-5   5.0   组氨酸   6.5   0.01   100   100
  制剂-6   5.0   柠檬酸盐   6.5   0   150   0
  制剂-7   5.0   柠檬酸盐   6.0   0.01   150   0
  制剂-8   5.0   柠檬酸盐   6.0   0   50   150
  制剂-9   5.0   柠檬酸盐   6.5   0.01   50   150
  制剂-10   5.0   柠檬酸盐   6.5   0.01   100   100
  PBS   5.0   磷酸盐   7.2   0   145   0
[0126]摩尔渗透压浓度检测
[0127]使用Wescor蒸汽压渗透压计检测表3制剂的摩尔渗透压浓度。结果示于表4。测试制剂的摩尔渗透压浓度在260-320mOsmole/Kg的所需范围内。
表4：在表3中的制剂的摩尔渗透压浓度
制剂   [A12]，(mg/mL)   缓冲液类型(10mM) pH   吐温80(％)   [NaCl](mM)   [甘氨酸](mM)   摩尔渗透压浓度(mOsmole/Kg)
  制剂-1   5.0   组氨酸   6.0   0   80   140   302
  制剂-2   5.0   组氨酸   6.0   0.01   100   75   283
  制剂-3   5.0   组氨酸   6.5   0.01   75   150   304
  制剂-4   5.0   组氨酸   6.5   0   150   0   304
  制剂-5   5.0   组氨酸   6.5   0.01   100   100   296
  制剂-6   5.0   柠檬酸盐   6.5   0   150   0   318
  制剂-7   5.0   柠檬酸盐   6.0   0.01   150   0   318
  制剂-8   5.0   柠檬酸盐   6.0   0   50   150   275
  制剂-9   5.0   柠檬酸盐   6.5   0.01   50   150   276
  制剂-10   5.0   柠檬酸盐   6.5   0.01   100   100   316
  PBS   5.0   磷酸盐   7.2   0   145   0   294
[0128]差示扫描热量法研究
[0129]使用DSC测定实验制剂(列于表3)中IMC-A12的热熔融曲线，以评价测试条件下IMC-A12的转变温度(Tm)。蛋白质浓度为5mg/mL，温度变化为5℃-95℃，扫描速率为1.5℃/分钟。将对应于主转变峰的熔融温度拟合为线性回归模型，以评价测试变量的影响。用于拟合的p和Rsq分别为0.003和0.99。缓冲液类型、pH、吐温80浓度、NaCl浓度、甘氨酸浓度对转变温度的预测性变化示于图7。最优缓冲液经测定为pH 6.5的柠檬酸盐缓冲液。甘氨酸增加熔融温度，而吐温80稍微降低熔融温度。NaCl对熔融温度不具有显著影响。
[0130]搅拌研究
[0131]通过在平板摇床上搅拌给样品施加应力。以300RPM搅拌在27.5mL玻璃小瓶中的表3所述样品，该样品含有5mg/mL的5mL IMC-A12。该研究于室温进行直至72小时。确定随搅拌时间变化的溶液浊度和单体百分率。通过使用JMP软件将反应拟合为线性回归模型评估测试变量对浊度和单体百分率的影响。浊度和单体百分率这二者的实际曲线对预测曲线的p值＜0.001。统计学显著的变量为缓冲液、吐温和时间。用于缓冲液、吐温80和时间对浊度和单体百分率的影响的预测性变化示于图8。含0.01％吐温的柠檬酸盐缓冲液具有最小的浊度和最高的单体含量。
[0132]于40℃和50℃的实时加速温度稳定性
[0133]将在表3制剂中的5mg/mL的IMC-A12于40℃保温4周和于50℃保温2周。于40℃保温4周后和于50℃保温2周后起始物质和测试制剂的单体百分率分别示于图9和图10。温度应激样品的DOE分析也示于图11。在40℃时，大部分测试制剂的单体百分率相当，但好于PBS。在50℃时，在柠檬酸盐缓冲液中的制剂(制剂6-10)优于组氨酸缓冲液(制剂1-5)。在图11中的DOE分析显示，IMC-A12在pH 6.0-6.5之间具有相当大的稳定性，NaCl具有去稳定的作用，而甘氨酸具有相对低的作用。发现制剂9和10是相当的。但是，优选制剂10，因为其具有较低的甘氨酸浓度(更接近于生理条件)。
[0134]赋形剂筛选研究的总结
[0135]DSC研究表明，柠檬酸盐缓冲液、甘氨酸和pH 6.5增加IMC-A12热稳定性。吐温-80稍微降低热稳定性，而NaCl没有多大作用。IMC-A12对机械应力敏感。因此，需要吐温80来稳定对抗机械应力。于加速温度，IMC-A12在柠檬酸盐制剂中比在组氨酸中具有更好的稳定性。组氨酸和柠檬酸盐缓冲液这二者均优于PBS制剂。选择含有5mg/mL IMC-A12、10mM柠檬酸盐、100mM甘氨酸、100mM NaCl、0.01％吐温80、pH 6.5(柠檬酸盐)的制剂10作为优化制剂。
实施例3.PBS溶液制剂和柠檬酸盐溶液制剂之间的对比
[0136]如上所述，我们开发了新的IMC-A12溶液制剂，其含有5mg/mL IMC-A12、10mM柠檬酸钠、100mM甘氨酸、100mMNaCl、0.01％吐温80，pH 6.5(柠檬酸盐)。在该实施例中，我们比较了柠檬酸盐制剂和PBS制剂中的IMC-A12的稳定性。
[0137]搅拌研究
[0138]通过在平板摇床上搅拌给样品施加应力。以300RPM搅拌在27.5mL玻璃小瓶中的含有5mg/mL IMC-A12的样品。研究于室温进行直至72小时。使用Shimatzu 1601biospec分光光度计进行浓度和浊度检测。使用1.5的消光系数由280nm的吸光度计算IMC-A12溶液的浓度。以350nm的吸光度测量溶液浊度。在图12、13和14中分别显示了随搅拌时间变化的溶液浊度、(由于形成不溶性聚集体而产生的)物质损失百分率和剩余单体百分率。对于IMC-A12的PBS制剂，溶液浊度和损失百分率随搅拌时间增加，而单体百分率降低。对于柠檬酸盐制剂，浊度、损失百分率和单体百分率全部保持不变。
[0139]于40℃的实时加速温度稳定性
[0140]在PBS制剂或柠檬酸盐制剂中的5mg/mL的IMC-A12于40℃保温直至3个月。在保温后，通过SEC-HPLC、SDS-PAGE和IEF分析样品。结果示于下文。
[0141]SEC-HPLC分析：使用Agilent 1100系列LC层析和Tosoh Biosep G3000SWXL柱进行大小排阻层析。流动相为10mM磷酸钠、0.5M CsCl pH 7.0。将50μg样品以10μL体积注射。随着保温时间的变化，单体百分率、聚集体百分率和降解物百分率发生变化，分别示于图15、16和17。对于两种制剂，单体百分率降低，聚集体百分率和降解物百分率增加，但相比于PBS制剂，柠檬酸盐制剂的速度较慢。
[0142]SDS-PAGE分析：通过在4-20％tris-甘氨酸梯度凝胶上的还原性和非还原性SDS-PAGE分析于40℃保温3个月后在PBS制剂和柠檬酸盐制剂中的IMC-A12。将10μg样品以10μl体积加载。凝胶用考马斯蓝染色。结果分别示于图18和19。相比之下，在PBS制剂中检测到比在柠檬酸盐制剂中更强的杂质带。
[0143]IEF分析：使用
Figure A20088000944600341
Agarose IEF板以6.0-10.5的pH范围进行等电聚焦(IEF)。将测试样品缓冲交换入含有0.5％吐温80的MilliQ水中。将10μg样品以10μl体积加载。凝胶用考马斯蓝染色。通过IEF分析于40℃保温3个月后在PBS制剂和柠檬酸盐制剂中的IMC-A12。结果示于图20。相比之下，对PBS制剂检测到比在柠檬酸盐制剂中更扩散且更不明确的条带。
[0144]IMC-A12于-20℃和-70℃的冷冻温度稳定性
[0145]将在PBS制剂和柠檬酸盐制剂中5mg/mL的IMC-A12于-20℃和-70℃保温直至3个月。通过SEC-HPLC分析保温后的单体百分率。随着-20℃和-70℃时的时间不同，单体百分率的变化分别示于图21和22。任一种制剂中的单体百分率均不随时间变化。
[0146]IMC-A12于-20℃和-70℃的冻融稳定性
[0147]通过在冻干机(Lyo-star II，由FTS生产)以1℃/分钟的变化速率将测试样品冷冻至-20℃或-70℃，以评价IMC-A12的冻融稳定性。将样品保温1小时，并以1℃/分钟的变化速率于4℃融化。重复该冻融过程直至15次。随着-20℃和-70℃时的冻融循环次数的变化，单体百分率发生变化，分别示于图23和24。如图所示，在柠檬酸盐制剂中的IMC-A12比在PBS制剂中具有更好的冻融稳定性。对于PBS制剂，单体百分率的降低主要归因于聚集体百分率的增加。
[0148]IMC-A12溶液制剂的光稳定性
[0149]按照ICH指引进行IMC-A12的光稳定性研究。使在PBS制剂和柠檬酸盐制剂中的5mg/mL的IMC-A12于室温接触光。总曝光量为200瓦特小时/m2近UV+1.2百万勒克斯小时荧光。将对照样品用黑纸包裹以遮蔽光。将对照样品和测试样品置于光稳定性室(Caron 6500系列，Caron，Marietta，OH)内部。在曝光后，通过SEC-HPLC分析对照样品和测试样品。对照样品和曝光样品的单体百分率、聚集体百分率和降解物百分率在表5中给出。发现两种制剂中的IMC-A12都是光敏感的。但是，光稳定性在柠檬酸盐制剂中比在PBS制剂中显著改善。
表5：在PBS制剂和柠檬酸盐制剂中的IMC-A12的光稳定性
  制剂   产品批号   单体(％)   聚集体(％)   降解物(％)
  PBS-对照   1278-116   96.6   1.5   2.0
  PBS-样品   1278-116   73.5   22.8   3.7
  柠檬酸盐-对照   1278-151   95.7   1.4   2.9
  柠檬酸盐-样品   1278-151   81.9   14.2   3.9
[0150]PBS制剂和柠檬酸盐制剂之间的比较的总结
[0151]IMC-A12在10mM柠檬酸钠、100mM甘氨酸、100mMNaCl、0.01％吐温80，pH 6.5(柠檬酸盐)制剂中的稳定性显著好于在PBS制剂中的稳定性。柠檬酸盐是无颗粒的等渗制剂，稳定抗机械诱导的聚集或沉淀，使温度诱导的聚集和降解最小化，稳定地抗冻融不稳定性，并增强了光稳定性。
实施例4.筛选用于冻干制剂的缓冲液、冷冻保护剂和冻干保护剂以及填充剂
[0152]以20mg/mL的IMC-A12浓度检验用于冻干制剂的缓冲液类型、稳定剂和填充剂。设计矩阵示于表6，使用部分析因设计模型。用于优化IMC-A12浓度、海藻糖浓度对IMC-A12浓度的比率和吐温80浓度的设计矩阵示于表7。使用混合物设计模型。
表6：用于稳定剂和填充剂筛选的设计矩阵
#   缓冲液(10mM)   [A12](mg/mL)   海藻糖(％)   蔗糖(％)   甘露醇(％)   甘氨酸(％) pH
  1   组氨酸   20   4   0   2   0   6.5
  2   组氨酸   20   0   2   3   0   6.5
  3   组氨酸   20   1   1   0   0   6.5
  4   组氨酸   20   0.5   3.5   0   2   6.5
  5   组氨酸   20   4   0   0   0   6.5
  6   组氨酸   20   0   4   0   0   6.5
  7   柠檬酸盐   20   1.5   0.5   0   4   6.5
  8   柠檬酸盐   20   0.5   1.5   4   0   6.5
  9   柠檬酸盐   20   4   0   0   0   6.5
  10   柠檬酸盐   20   0   4   0   0   6.5
表7：用于优化A12浓度、海藻糖对A12的摩尔比率和吐温80浓度的设计矩阵
#   缓冲液(10mM) pH   [A12]，(mg/mL)  海藻糖对A12的摩尔比率   吐温80(％)
  1   组氨酸   6.5   50.0   200   0.000
  2   组氨酸   6.5   10.0   1000   0.000
  3   组氨酸   6.5   10.0   200   0.010
  4   组氨酸   6.5   30.0   600   0.000
  5   组氨酸   6.5   10.0   600   0.005
  6   组氨酸   6.5   30.0   200   0.005
  7   组氨酸   6.5   22.9   460   0.003
  8   组氨酸   6.5   16.0   760   0.002
  9   组氨酸   6.5   10.0   440   0.007
[0153]对于冻干，使用实验室规模的TFF和XL滤器、50K截留滤器(Millipore，Corporation)将IMC-A12缓冲交换入纯的10mM组氨酸pH 6.5或10mM柠檬酸盐pH 6.5中。在进行缓冲液交换后，由浓缩的母液加入冷冻保护剂和冻干保护剂。使用1.50的消光系数以280nm的吸光度测定蛋白质浓度。在调节蛋白质浓度后由10％(重量/体积，在DI水中)母液加入吐温80。所有样品都通过0.22μm截留(Durapose PVDF膜)注射器滤器过滤。
[0154]筛选出缓冲液类型、冷冻保护剂和冻干保护剂以及填充剂对表6所示制剂中20mg/mL IMC-A12的单体、聚集体、降解物和浊度的影响。将冻干药品于40℃和50℃保温3个月。在保温后，将冻干药品重配入MilliQ水中至5mg/mL。通过SEC-HPLC和Turbidity分析重配产品。结果使用统计学软件JMP拟合。结果概述于下文。
[0155]变量对预测的单体、聚集体、降解物和浊度的影响
[0156]通过SEC-HPLC和浊度分析来分析重配药品。相对于缓冲液类型、冷冻保护剂和冻干保护剂以及填充剂的变化，单体百分率、聚集体百分率、降解物百分率和浊度发生变化，分别示于图25、26、27和28。结果证实：(1)组氨酸缓冲液产生比柠檬酸盐缓冲液更多的单体和更少的聚集体。(2)海藻糖和蔗糖增加单体含量和降低聚集。(3)填充剂、甘露醇和甘氨酸对单体百分率或聚集体百分率没有显著影响。没有一个测试变量对降解物具有显著影响。
[0157]通过单次单因子法证实预测结果
[0158]为了证实统计学预测的结果，使用单次单因子法分析表6中的制剂5、6、9和10。于40℃和50℃保温直至3个月对单体百分率、聚集体百分率、降解物百分率和浊度的影响分别示于图29、30、31和32。结果证实：(1)组氨酸是优于柠檬酸盐的缓冲剂，和(2)海藻糖是优于蔗糖的稳定剂。
[0159]缓冲剂类型、冷冻保护剂和冻干保护剂以及填充剂筛选的总结
[0160]冻干的IMC-A12制剂在组氨酸缓冲液中比在柠檬酸盐缓冲液中具有更大的稳定性。海藻糖具有比蔗糖更好的稳定作用。填充剂、甘露醇和甘氨酸的存在情况不显著影响稳定性。
实施例5.用于优化冻干制剂的IMC-A12、海藻糖和吐温80浓度的优化
[0161]使用混合物设计模型优化IMC-A12浓度、海藻糖与IMC-A12的比率以及吐温80浓度，从而优化制剂。实验设计矩阵示于表7。冻干的IMC-A12于4℃、40℃和50℃保温直至4个月。结果在下文论述。
[0162]单体百分率随制剂的变化
[0163]将表7的冻干IMC-A12制剂在4℃、40℃和50℃保温直至4个月。冻干样品用MilliQ水重配至5mg/mL。通过SEC-HPLC分析重配样品，以确定剩余单体百分率。结果示于图33。
[0164]IMC-A12浓度、海藻糖∶A12比率和吐温80浓度对单体变化速率的影响
[0165]单体变化速率定义为单体变量随时间变化的斜率。使用Excel软件计算该斜率。在IMC-A12浓度最低和海藻糖对IMC-A12的比率最高时，单体变化速率是最小的。吐温80不具有显著影响。
[0166]优化研究总结
[0167]预测的单体含量随着IMC-A12浓度的降低和海藻糖对IMC-A12比率的增加而增加。于固定的IMC-A12浓度，通过增加海藻糖对IMC-A12比率增加单体含量。吐温80对单体百分率的影响最小。选择具有30mg/mL IMC-A12和600的海藻糖对IMC-A12比率的制剂4作为优选制剂。
实施例6.冻干的IMC-A12的表征
[0168]发现以Karl-Fisher分析测定的冻干产品的含水量为约1.0％。用MilliQ水将冻干IMC-A12重配至5mg/mL。重配时间为约1-2分钟。
[0169]冻干对IMC-A12稳定性的影响
[0170]为确保冻干过程没有改变IMC-A12稳定性，在冻干前和冻干后通过SEC-HPLC分析IMC-A12。在SEC-HPLC分析之前重配冻干的IMC-A12。冻干前和冻干后的A12的单体百分率、聚集体百分率和降解物百分率示于表8。
表8：冻干前和冻干后的IMC-A12的SEC-HPLC分析
  单体(％)   聚集体(％)   降解物(％)
  冻干前   95.7   3.0   1.4
  冻干后   95.6   3.1   1.5
[0171]冻干对IMC-A12的构象稳定性的影响
[0172]为确保冻干过程没有改变A12的二级结构，通过圆二色谱法检查冻干前和冻干后的IMC-A12的二级结构。使用Jasco 810圆二色谱分光光度计收集CD光谱，IMC-A12浓度为0.1mg/mL。冻干前和冻干后以及重配的CD光谱示于图34。IMC-A12的二级结构没有因为冻干而被改变。
[0173]冻干对IMC-A12的粒子计数的影响
[0174]使用HIAC ROYCO MODEL 9703液体颗粒系统检测冻干对IMC-A12的粒子含量的影响。将冻干前和冻干后的IMC-A12稀释/重配至5mg/mL。结果示于表9。颗粒计数没有显著改变。
表9：冻干前和冻干后的IMC-A12的HIAC分析
  ＝10μm/mL   ＝25μm/mL ＝50μm/mL
  冻干前   26.33   1.67   0.00
  冻干后   38.67   0.33   0.00
实施例7.溶液IMC-A12制剂和冻干IMC-A12制剂之间的比较
[0175]比较以下的制剂：
[0176](1)PBS溶液制剂，5mg/mL IMC-A12的PBS溶液
[0177](2)柠檬酸盐溶液制剂，5mg/mL IMC-A12的10mM柠檬酸钠、100mM NaCl、100mM甘氨酸、0.01％吐温80(重量/体积)，pH 6.5。
[0178](3)冻干制剂，30mg/mL IMC-A12，10mM L-组氨酸，4.6％海藻糖，pH 6.5
[0179]实时加速的温度稳定性
[0180]将PBS溶液制剂和柠檬酸盐溶液制剂以及冻干制剂于4℃、40℃、50℃保温。在分析前，用milli-Q水将冻干的IMC-A12重配至5mg/mL。通过SEC-HPLC和SDS-PAGE分析溶液制剂和重配的冻干制剂。
[0181]将在PBS缓冲液和柠檬酸盐缓冲液中的IMC-A12溶液制剂以及在优选的冻干制剂中的IMC-A12于40℃和50℃保温4个月。用Milli-Q水重配冻干样品，并通过SEC-HPLC分析单体百分率。在40℃和50℃保温4个月后的单体百分率分别示于图35和36。在40℃和50℃保温4个月后的聚集体百分率分别示于图37和38。在40℃和50℃保温4个月后的降解物百分率分别示于图39和40。
[0182]样品于4℃、40℃和50℃保温4个月后的SDS-page(还原性的)分析示于图41。在PBS缓冲液和柠檬酸盐缓冲液中的IMC-A12溶液制剂以及在优选的冻干制剂中的IMC-A12于4℃、40℃和50℃保温4个月。冻干样品用Milli-Q水重配，将10μg加载至4-20％Tris-甘氨酸凝胶。凝胶用考马斯蓝染色。
[0183]冻干制剂的光稳定性
[0184]如上所述进行光稳定性研究。使冻干的IMC-A12和溶液制剂PBS和柠檬酸盐于室温曝光。总曝光量为200瓦特小时/m2近UV+1.2百万勒克斯小时荧光。用黑纸包裹对照样品，以遮蔽光。将对照样品和测试样品置于光稳定性室(Caron 6500系列，Caron，Marietta，OH)内部。在曝光后，通过SEC-HPLC分析对照样品和测试样品。对照样品和曝光样品的单体百分率、聚集体百分率和降解物百分率在表10中给出。发现两种制剂中的IMC-A12都是光敏感的；但是，光稳定性在柠檬酸盐制剂中显著好于在PBS制剂中。
表10：在冻干制剂和溶液制剂中的IMC-A12的光稳定性研究
  制剂   单体(％)   聚集体(％)   降解物(％)
  PBS-对照   96.6   1.5   2.0
  PBS-曝光   73.5   22.8   3.7
  柠檬酸盐-对照   95.7   1.4   2.9
  柠檬酸盐-曝光   81.9   14.2   3.9
  冻干的-对照   98.1   1.0   0.9
  冻干的-曝光   94.0   4.6   1.4
序列表
<110>ImClone Systems，Inc.
Goldstein，Joel
Srivastava，Arvind
<120>稳定的抗体制剂
<130>11245/55201
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1383
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1383)
<400>1
gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc    48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat    96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg    144
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc    192
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aaa tcc acg agc aca gcc tac    240
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt    288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
gcg aga gcg cca tta cga ttt ttg gag tgg tcc acc caa gac cac tac    336
Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr
            100                 105                 110
tac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc    384
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val
        115                 120                 125
tca agc gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc    432
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
    130                 135                 140
tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag    480
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
145                 150                 155                 160
gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg    528
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
                165                 170                 175
acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc    576
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
            180                 185                 190
tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc    624
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
        195                 200                 205
cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg    672
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
    210                 215                 220
gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca    720
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
225                 230                 235                 240
ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc    768
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
                245                 250                 255
ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc    816
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
            260                 265                 270
aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc    864
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
        275                 280                 285
aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg    912
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
    290                 295                 300
cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc    960
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
305                 310                 315                 320
gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc    1008
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
                325                 330                 335
tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc    1056
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
            340                 345                 350
aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg    1104
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
        355                 360                 365
gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc    1152
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
    370                 375                 380
ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg    1200
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
385                 390                 395                 400
gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc    1248
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                405                 410                 415
ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag    1296
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
            420                 425                 430
ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac    1344
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
        435                 440                 445
tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga                1383
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455                 460
<210>2
<211>460
<212>PRT
<213>人
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp ThrAla Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr
            100                 105                 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val
        115                 120                 125
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
    130                 135                 140
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
145                 150                 155                 160
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
                165                 170                 175
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
            180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
        195                 200                 205
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
    210                 215                 220
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
225                 230                 235                 240
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
                245                 250                 255
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
            260                 265                 270
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
        275                 280                 285
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
    290                 295                 300
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
305                 310                 315                 320
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
                325                 330                 335
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
            340                 345                 350
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
        355                 360                 365
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
    370                 375                 380
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
385                 390                 395                 400
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                405                 410                 415
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
            420                 425                 430
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
        435                 440                 445
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455                 460
<210>3
<211>645
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(645)
<400>3
tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag    48
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca    96
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
            20                  25                  30
acc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct att ctt gtc atc tat    144
Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
ggt gaa aat aag cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc    192
Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gca gaa    240
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
gat gag gct gac tac tat tgt aaa tct cgg gat ggc agt ggt caa cat    288
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His
                85                  90                  95
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Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
            100                 105                 110
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Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
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Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
    130                 135                 140
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Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145                 150                 155                 160
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Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
                165                 170                 175
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Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
            180                 185                 190
tac agc tgc cag gtc acg cat gaa ggg agc acc gtg gag aag aca gtg    624
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
        195                 200                 205
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Ala Pro Ala Glu Cys Ser
    210
<210>4
<211>214
<212>PRT
<213>人
<400>4
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
            20                  25                  30
Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His
                85                  90                  95
Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
        115                 120                 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
    130                 135                 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
                165                 170                 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
            180                 185                 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
        195                 200                 205
Ala Pro Ala Glu Cys Ser
    210
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<213>人
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Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
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            20                  25                  30
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Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
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    50                  55                  60
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Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
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                85                  90                  95
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            100                 105                 110
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Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
        115                 120                 125
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Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
    130                 135                 140
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Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145                 150                 155                 160
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Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
                165                 170                 175
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Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
            180                 185                 190
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        195                 200                 205
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Ala Pro Ala Glu Cys Ser
    210
<210>6
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<212>PRT
<213>人
<400>6
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
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Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
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                85                  90                  95
Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
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Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
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Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
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Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
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Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
            180                 185                 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
        195                 200                 205
Ala Pro Ala Glu Cys Ser
    210

Claims (20)

1.一种液体制剂，所述液体制剂包含特异性结合胰岛素样生长因子-I受体的IgG1抗体、在约6.0至约7.0的pH范围内的药学上可接受的缓冲剂、药学上可接受的盐、药学上可接受的稳定剂和药学上可接受的表面活性剂。
2.权利要求2的液体制剂，其中所述IgG1抗体浓度在约5mg/ml至约30mg/ml的范围内。
3.权利要求1的液体制剂，其中所述IgG1为IMC-A12或IMC-2F8。
4.权利要求1的液体制剂，其中所述缓冲剂为选自以下的在约5mM至约50mM浓度范围内的有机缓冲剂：组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、苹果酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和乙酸盐缓冲剂。
5.权利要求4的液体制剂，其中所述缓冲剂为约10mM的浓度。
6.权利要求1的液体制剂，其中所述稳定剂选自天冬氨酸、乳糖酸、甘氨酸、海藻糖、甘露醇和蔗糖。
7.权利要求6的液体制剂，其中所述稳定剂在约75mM至约150mM的浓度范围内。
8.权利要求7的液体制剂，其中所述稳定剂浓度为约100mM。
9.权利要求6的液体制剂，其中所述稳定剂为海藻糖。
10.权利要求6的液体制剂，其中所述稳定剂为组氨酸。
11.权利要求1的液体制剂，其中所述盐为在约75mM至约150mM浓度范围内的NaCl。
12.权利要求11的液体制剂，其中所述NaCl为约100mM的浓度。
13.权利要求1的液体制剂，其中所述表面活性剂选自：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚乙烯-聚丙二醇和胆汁盐，所述表面活性剂的浓度在约0.001％至约1.0％(重量/体积)的范围内。
14.权利要求13的液体制剂，其中所述表面活性剂为约0.01％的浓度(重量/体积)。
15.权利要求1的液体制剂，其中所述pH范围为约6.0至约6.5。
16.权利要求13的液体制剂，其中pH为约6.5。
17.权利要求1的液体制剂，所述液体制剂含有约5mg/mlIMC-A12抗体、约10mM柠檬酸钠缓冲剂、约100mM甘氨酸稳定剂、约100mM NaCl和约0.01％聚山梨醇酯80，其中所述液体制剂的pH为约6.5。
18.权利要求1的液体制剂，所述液体制剂已被冻干形成冻干制剂。
19.权利要求18的冻干制剂，所述冻干制剂进一步包含填充剂。
20.权利要求19的冻干制剂，其中所述填充剂为甘露醇或甘氨酸。
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