CN106456784A - 包含摩尔过量的山梨醇的稳定蛋白质制剂 - Google Patents

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Abstract

一种稳定药物制剂，包括感兴趣的蛋白质、山梨醇和聚乙二醇(PEG)。山梨醇和蛋白质的摩尔比例为550摩尔至700摩尔的山梨醇：1摩尔的蛋白质，PEG和蛋白质的摩尔比为2‑50:1。该制剂任选地包含缓冲剂。冻干形式的制剂在2℃‑8℃下稳定至少4年。还提供了制备所述组合物和包含该组合物的药物试剂盒的方法。

Description

包含摩尔过量的山梨醇的稳定蛋白质制剂
参考通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列表
本文提及的序列的序列表以具有名为CM470248.ST25.TXT的文件的ST25.txt格式化序列表电子提交。
技术领域
本文中的主题涉及适合于给药于受试者的蛋白质制剂，其中所述制剂是稳定的并且包含特定摩尔过量的山梨醇和规定量的聚乙二醇。组合物和药物试剂盒的制备方法也包括在本发明的范围内。
背景技术
蛋白质是具有确定的一级、二级、三级和在某些情况下四级结构的复杂分子，所有这些都在赋予特定的生物学功能中起作用。多种蛋白质，特别是抗体，可用于制药应用。然而，与传统有机和无机药物相比，这些大的、复杂的分子更难以配制用于给药于受试者。生物药物(例如蛋白质)的结构复杂性使得它们容易受到导致结构和功能不稳定性以及丧失安全性的各种过程的影响。为了使蛋白质保持生物活性，制剂必须保持至少蛋白质氨基酸的核心序列的构象完整性，同时保护蛋白质的多个官能团免于降解。关于这些不稳定性过程或降解途径，蛋白质可以在溶液中经历多种共价和非共价反应或修饰。
蛋白质的降解途径可涉及化学不稳定性(即涉及通过键形成或裂解导致新化学实体的蛋白质修饰的任何过程)或物理不稳定性(即蛋白质的高阶结构的改变)。化学不稳定性可以由脱酰胺、外消旋化、水解、氧化、β消除或二硫化物交换引起。物理不稳定性可以由例如变性、聚集、沉淀或吸附引起。三种最常见的蛋白质降解途径是蛋白质聚集、脱酰胺和氧化。
蛋白质药物易受不可逆聚集的物理降解过程的影响。蛋白质聚集在多肽生产中是特别感兴趣的，因为它通常导致影响药物效力的减少的生物活性，并且还可以在患者中引发严重的免疫学或抗原性反应。蛋白质治疗剂的化学降解，包括通过例如化学修饰降解化学结构，也已涉及增加其免疫原性潜力。
治疗性蛋白质的长期稳定性是安全、一致和有效治疗的特别有益的标准。制剂中治疗剂的功能丧失将降低其对于给定给药的有效浓度。类似地，治疗剂的不期望的修饰可以影响制剂的活性和/或安全性，导致功效丧失和不良副作用的风险。因此，稳定的蛋白质制剂需要使药物的物理和化学降解途径最小化。
旨在用于人类的许多蛋白质制剂需要稳定剂以防止在使用制剂之前蛋白质的变性、聚集和其它改变。这种不稳定性表现在可溶性/不溶性颗粒的形成中，并且当蛋白质制剂随时间和在运输期间储存时通常增加。蛋白质药物制剂开发的主要目的是维持蛋白质溶解性、稳定性和生物活性。
然而，将辅料用于一个目的例如稳定化通常会导致与其它组分的相容性和制剂的制备相关的其它不可预见的问题。以下公开解决了本领域的这个缺点。
发明内容
当前公开的主题涉及一种稳定的药物制剂，包括蛋白质、特定摩尔过量的山梨醇和聚乙二醇(PEG)，制备该制剂的方法，以及将该制剂给药至有需要的受试者的方法。在一些实施例中，制剂中存在的蛋白质为抗体，例如特异性结合HER2的抗体。在这些实施例的一些中，抗HER2抗体为曲妥单抗。
在一些实施例中，本文描述的主题涉及稳定的制剂，其包含：蛋白质(例如抗体)；山梨醇和聚乙二醇(PEG)，其中山梨醇和蛋白质的摩尔比为550至750摩尔的山梨醇：约1摩尔的蛋白质(例如抗体)。
在其它实施例中，本文描述的主题涉及稳定的复溶制剂，其包含约5mg/mL至约50mg/mL的量的蛋白质(例如抗体)和稀释剂，其中复溶制剂已经由包含蛋白质(例如，抗体)的冻干混合物制备；山梨醇和聚乙二醇(PEG)，其中在冻干混合物中，山梨醇与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为约550至约750摩尔山梨醇：1摩尔的蛋白质(例如抗体)，并且PEG与蛋白质的摩尔比(例如抗体)为约2:1至50:1。
在另一个实施例中，本文公开的主题涉及制品或药物试剂盒，其包含：a)容纳冻干混合物的容器，冻干混合物包含蛋白质(例如抗体)；山梨醇，其与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为约550摩尔至750摩尔：1摩尔；和聚乙二醇(PEG)，PEG与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为约2:1至50:1；和(b)用稀释剂复溶冻干混合物的说明书。该制品和药物试剂盒可以进一步包括容纳稀释剂(例如，抑菌注射用水(BWFI))的第二容器。
在另一个实施例中，本文公开的主题还涉及向受试者给药治疗有效量的制剂以治疗疾病或病症的方法。
在另一个实施例中，本文公开的主题涉及制备本文所述的冻干和液体制剂的方法。
附图说明
图1描述了用于本文中描述的药物制剂的制备方法的一个实施例的流程图；
图2为本文中描述的试验制剂6的代表性的SEC色谱图，单体部分在28.54分钟洗脱，聚集体在24.42分钟洗脱，当在初始条件(蓝色曲线)下与样品相比时，在40℃下储存3周(红色曲线)的样品中看到聚集体的增加；
图3为如本文所述的试验制剂6的代表性IEX色谱图；零变化主峰在32-33分钟之间洗脱，酸性和碱性变体由分别在20分钟和34分钟开始洗脱的多种带电物质组成；色谱图已经相对于主峰归一化；当在初始条件下与样品(较低色谱图)比较时，在40℃下储存3周的样品(上面的色谱图)中看到酸性和碱性变体的增加；
图4-9描述了通过DSC测定的本文所述制剂的热稳定性；
图10描绘了当在2-8℃下储存4年(48个月)时，如本文所述的称为制剂27并随后被冻干，批次为1-10的制剂的可比较的物理稳定性数据；
图11描述了当在-20℃下储存2年(24个月)时，在冻干之前，批次为1-12的如本文所述的蛋白质药物制剂的可比较的物理稳定性数据。
具体实施方式
现在将在下文中更全面地描述本公开的主题。然而，本领域技术人员将想到本文公开的主题的很多修改和其他实施例，其具有前述描述中所公开的教导中的益处。因此，应当理解，当前公开的主题不限于所公开的具体实施例，并且修改和其它实施例旨在包括在所附权利要求的范围内。
I.药物制剂
本文描述的稳定制剂包含蛋白质(例如抗体)和特定摩尔过量的山梨醇以及聚乙二醇(PEG)。
蛋白质
如本文中使用的，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，并旨在包括单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成。术语“蛋白质”和“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、氨基酸链或用于指两个或多个氨基酸的链的任何其它术语包括在“蛋白质”的定义内。术语“蛋白质”和“多肽“还是指蛋白质的翻译后修饰的产物，包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/封闭基团的衍生化和蛋白水解切割。多肽可以来自天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。蛋白质可以包含天然存在的氨基酸或一种或多种非经典的氨基酸。
多肽可以具有约3个或以上，5个或以上，10个或以上，20个或以上，25个或以上，50个或以上，75个或以上，100个或以上，200个或以上，500个或以上，1,000个或以上，或2,000个或以上个氨基酸。多肽可以具有限定的三维结构，尽管它们不一定具有这样的结构。
在一些实施例中，蛋白质是不稳定的。例如，蛋白质易于聚集、脱酰胺(例如Asn脱酰胺化)、氧化(例如Met氧化)、异构化(例如Asp异构化)。在一些实施例中，蛋白质易于脱酰胺。
可以如本文所述配制的蛋白质的非限制性例子是抗体。在这些实施例的一些中，抗体是全长抗体。在某些实施例中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可以是人，人源化或嵌合的。在这些实施例的一些中，单克隆抗体是IgG1抗体。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，并且是指可以生物化学地区分的多种多样的多肽。抗体的一般结构是本领域技术人员公知的。参见，例如，Harlow et al.(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(2nd ed.；Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。术语“抗体”广义地包括天然存在形式的抗体和重组抗体，例如单链抗体，嵌合和人源化抗体和多特异性抗体，以及所有上述的片段和衍生物，其片段和衍生物具有至少一个抗原结合位点。抗体衍生物可以包含与抗体结合的蛋白质或化学部分。术语“抗体”以最广义使用，涵盖完全装配的抗体(例如，多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长类化、嵌合抗体)，可结合抗原的抗体片段(例如Fab'、F(ab')2、Fv、单链抗体、双抗体)和包含上述的重组肽。
在一些实施例中，本文所述制剂中包含的抗体是单克隆抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即包含群体的单个抗体是相同的，除了可能少量存在的可能的天然产生的突变。该术语不限于抗体的种类或来源。该术语包括完整的免疫球蛋白以及保留抗体的抗原结合功能的片段例如Fab，F(ab')2，Fv和其它。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人首先描述的杂交瘤方法制备(1975)Nature 256：495，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以利用例如Clackson et al.(1991)Nature 352:624-628；Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581-597；和美国专利5,514,548中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
在某些实施例中，本公开制剂的抗体是嵌合抗体。如本文所用，术语“嵌合抗体”是指在其中从第一物种获得或衍生出免疫反应性区域或位点或从第二物种获得恒定区(其可以是根据本发明完整、部分或修饰的)的任何抗体。在一些实施例中，靶结合区或位点将来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，恒定区是人。
在其中本公开的制剂的抗体是嵌合抗体的那些实施例的一些中，嵌合抗体是人源化抗体。“人源化抗体”是特定类型的嵌合抗体，其包含基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的一个或多个框架区，和基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列的一个或多个CDRs。例如，如本文别处所述，抗HER2抗体曲妥单抗是鼠4D5抗体的人源化形式。
人源化抗体的FRs和CDRs不需要精确地对应于亲本序列。例如，供体CDR或共有或种系框架序列中的一个或多个残基可以通过取代、插入或缺失而改变(例如，诱变)，使得所得到的氨基酸残基不再与任一亲本序列中相应位置的原始残基相同，但是抗体仍然保留了与其抗原结合的功能。这种改变通常不是广泛的，而将是保守的改变。通常，至少75％的人源化抗体残基将对应于亲本共有序列或种系框架和供体CDR序列的残基，更经常是至少90％，最经常是大于95％，或大于98％或大于99％。
实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能一些框架残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。参见，例如，美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。还参见美国专利号6,180,370和国际公开号WO 01/27160，其中公开了人源化抗体和用于产生对预定抗原具有改善的亲和性的人源化抗体的技术。
在其它实施例中，本发明公开的制剂包含人抗体。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物分离的抗体，并且不表达内源免疫球蛋白，如下文所述，例如在Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598中。
本公开制剂的抗体可以是“多特异性的”，例如双特异性、三特异性的或更高多特异性的，意味着其同时识别并结合存在于一个或多个不同抗原(例如蛋白质)上的两个或更多个不同表位。因此，抗体是“单特异性”还是“多特异性”，例如“双特异性”是指与结合多肽反应的不同表位的数目。多特异性抗体可以对靶多肽的不同表位具有特异性，或者可以对靶多肽以及异源表位例如异源多肽或固体支持材料是特异性的。
如本文所用，术语“配价(valency)”是指存在于抗体中的潜在结合结构域(例如抗原结合结构域)的数目。每个结合结构域特异性结合一个表位。当抗体包含多于一个结合结构域时，每个结合结构域可以特异性结合相同的表位。具有特异性结合相同表位的两个结合结构域的抗体称为“二价单特异性”，而具有结合不同表位的两个结合结构域的抗体称为“二价双特异性”。本发明公开的制剂的抗体对于每种特异性也可以是双特异性和二价的(称为“双特异性四价抗体”)。
例如美国专利号5,731,168；5,807,706；5,821,333；和美国专利申请公开号2003/020734和2002/0155537中描述了双特异性二价抗体及其制备方法，所有这些的公开内容通过引用并入本文。例如WO 02/096948和WO 00/44788中描述了双特异性四价抗体及其制备方法，两者的公开内容通过引用并入本文。一般参见PCT公开WO 93/17715；WO 92/08802；WO91/00360；WO 92/05793；Tutt et al.(1991)J.Immunol.147:60-69；U.S.Patent Nos.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny et al.(1992)J.Immunol.148:1547-1553。
在一些实施例中，抗体是天然抗体。“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”在本文中也称为“全长抗体”，通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个二硫键与重链共价连接以形成异源二聚体，并且异源二聚体分子通过异源二聚体的两条相同重链之间的共价二硫键形成。尽管轻链和重链通过一个二硫键连接在一起，但两个重链之间的二硫键的数目随免疫球蛋白同种型而变化。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。二硫键通常将四条链连接成“Y”构型，其中从“Y”的嘴开始并且继续通过可变区，轻链包围重链。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉形末端处的N末端延伸到每条链底部的C末端。
每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链在一端(VL)具有可变结构域，在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定的氨基酸残基形成轻链可变结构域和重链可变结构域之间的界面。
术语“可变”是指这样的事实，即可变结构域的某些部分在抗体之间在序列上广泛不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性不是均匀地分布在抗体的可变结构域中。其集中在轻链和重链可变结构域中称为互补决定区(CDRs)或高变区的三个片段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架(FR)区。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDRs连接，其形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FR区紧密靠近在一起，并且与来自另一条链的CDRs一起有助于抗体的抗原结合位点的形成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
在某些实施例中，本公开的制剂中的蛋白质是抗体片段。例如，单克隆抗体的片段可以配制成本文公开的药物组合物，其中所述片段保留全长抗体的一些或全部所需功能。这样的片段的特征在于与相应的全长抗体相似的性质。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，在一些实施例中，其是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等(1995)Protein Eng.8(10)：1057-1062)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个具有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理抗体产生具有两个抗原结合位点并仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。
用于本公开的组合物和方法的抗体的合适的抗原结合片段包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab，F(ab')2和Fv片段和单链抗体分子。“Fab”是指由轻链和重链的一部分组成的免疫球蛋白的单价抗原结合片段。“F(ab')2”是指包含轻链和两条重链的一部分的免疫球蛋白的二价抗原结合片段。“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段指包含抗体的VH和VL结构域的片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中，参见例如美国专利号4,946,778,5,260,203,5,455,030和5,856,456，通过引用并入本文。通常，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头(polypeptide linker)，其使得sFv能够形成用于抗原结合的期望结构。关于sFv的综述参见Pluckthun(1994)，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore(Springer-Verlag，New York)，第269-315页。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链的“二聚体”结构缔合Fv物种。在该构型中，每个可变结构域的三个CDRs相互作用，以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。总的来说，六个CDRs赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原特异性的CDRs的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和性低于整个结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。通过在包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链CH1结构域的羧基末端添加几个残基，Fab片段不同于Fab'片段。Fab'-SH是本文对Fab'的命名，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab')2抗体片段最初作为在其之间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生。
已经开发了用于产生抗体片段的各种技术。传统上，通过完整抗体的蛋白水解消化得到这些片段(参见例如Morimoto等人(1992)Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等人(1985)Science 229：81)。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可以从上述抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可以从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人，(1992)Bio/Technology 10：163-167)。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab')2片段。用于产生抗体片段的其它技术对于本领域技术人员是显而易见的。
在一些实施例中，本公开制剂的抗体特异性或优先结合至表位。
“表位”是指抗原分子的一部分，其中在该部分上产生抗体将与抗体结合。表位可包含线性氨基酸残基(即，表位内的残基以线性方式依次顺序排列)，非线性氨基酸残基(本文称为“非线性表位”或“构象表位”；这些表位不是顺序排列的)，或线性和非线性氨基酸残基。非线性表位或构象表位还可以包括有助于抗体识别结构的整体构象但不一定结合抗体的氨基酸残基。通常，表位是短氨基酸序列，例如，约5个氨基酸的长度。
用于识别表位的系统技术是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号4,708,871，其全部内容通过引用并入本文。简而言之，在一种方法中，可以合成来源于抗原的一组重叠寡肽，并结合到固相针阵列上，在每个针上具有唯一的寡肽。针阵列可以包括96孔微量滴定板，允许同时测定例如用于结合至生物标记特异性单克隆抗体的所有96种寡肽。或者，噬菌体展示肽文库试剂盒(New England BioLabs)目前可商购用于表位作图。使用这些方法，可以确定连续氨基酸的每个可能子集的结合亲和性，以识别给定抗体结合的表位。当表位长度肽序列用于使获得抗体的动物免疫时，表位也可通过推断来识别。构象表位可以使用肽步移技术和合成肽来识别(参见例如Liang et al.(2005)Clinical Chemistry 51:1382-1396；Cochran et al.(2004)J.Immunol.Meth.287:147-158；Teeling et al.(2006)J.Immunol.177:362-371；Timmerman et al.(2004)Molecular Diversity 8:61-77；Lekcharoensuk et al.(2004)J.Virology 78:8135-8145；和Casadio et al.(2007)BMCBioinformatics(Supp.1):S1-6；其各自的全部内容通过参考引入本文)。
“特异性结合”通常是指抗体通过其抗原结合结构域结合表位，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间的一些互补性。根据该定义，当抗体与表位结合时，通过其抗原结合结构域比结合随机的不相关表位更容易，所述抗体被称为“特异性结合”表位。术语“特异性”在本文中用于限定某种抗体结合某一表位的相对亲和性。例如，抗体“A”可以被认为对于给定表位比抗体“B”具有更高的特异性，或者抗体“A”可以被认为与相关表位“D”相比，可以更高的特异性结合表位“C”。
“优先结合”是指与相关、相似、同源或类似的表位的结合相比，抗体更容易地特异性地结合至该表位。因此，“优先结合”给定表位的抗体更可能结合该表位而不是结合相关表位，即使这样的抗体可能与相关表位交叉反应。
作为非限制性例子，如果抗体以比第二表位的抗体的解离常数(KD)小的KD结合所述第一表位，则可以认为抗体优先结合第一表位。在另一个非限制性例子中，如果抗体以比第二表位的抗体的KD小至少一个数量级的亲和性结合第一表位，则可以认为抗体优先结合第一抗原。在另一个非限制性例子中，如果抗体以比第二表位的抗体的KD小至少两个数量级的亲和性结合第一表位，则可以认为抗体优先结合第一表位。
在另一个非限制性例子中，如果抗体以比第二表位的抗体的解离速率k(off)小的k(off)结合第一表位，则可以认为抗体优先结合第一表位。在另一个非限制性例子中，如果抗体以比第二表位的抗体的k(off)小至少一个数量级的亲和性结合第一表位，则可以认为抗体优先结合第一表位。在另一个非限制性例子中，如果抗体以比第二表位的抗体的k(off)小至少两个数量级的亲和性结合第一表位，则可以认为抗体优先结合第一表位。
在本公开的组合物和方法的某些实施例中，抗体是竞争性抑制对照抗体(例如曲妥单抗)与靶抗原上的表位的结合的抗体。据称如果抗体优先结合表位至其在一定程度上阻断对照抗体与表位的结合的程度，那么该抗体竞争性地抑制对照抗体与给定表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法确定，例如竞争ELISA试验。抗体可以被认为竞争性地抑制对照抗体(例如曲妥单抗)与给定表位的结合至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
在其中本公开的制剂中的蛋白质是抗体的一些实施例中，抗体以相对高的亲和性结合其靶抗原。如本文所用，术语“亲和性”是指单个表位与免疫球蛋白分子的CDR结合的强度的量度。参见，例如，Harlow et al.(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press,2nd ed.)pages 27-28。如本文所用，术语“亲合力”是指免疫球蛋白群体和抗原之间的复合物的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能结合强度。参见，例如，Harlow at pages 29-34。亲合力与群体中的个体免疫球蛋白分子与特定表位的亲和性以及免疫球蛋白和抗原的配价相关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构的抗原(例如聚合物)之间的相互作用将是高亲合力之一。
本公开的组合物和方法的抗体对其它相关表位显示很少或没有交叉反应性。
作为非限制性例子，在其中制剂内的抗体是抗HER2抗体的那些实施例中，抗HER2抗体显示与其它HER家族成员(例如EGFR/HER1，HER3和HER4)很少或没有交叉反应性。如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原具有特异性的抗体与第二抗原反应的能力；是两种不同抗原物质之间的相关性的量度。因此，如果抗体与除诱导其形成的表位之外的表位结合，则该抗体是交叉反应性的。交叉反应性表位通常包含许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下，实际上可能比原始匹配更好。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关但不相同的表位，例如与对照表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％的同一性(如使用本领域已知的和本文所述的方法计算的)的表位。如果抗体不结合与对照表位具有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％和小于50％的同一性(如使用本领域已知的和本文所述的方法计算的)的表位，那么认为该抗体具有很少或不具有交叉反应性。如果抗体不结合该表位的任何其它类似物、直系同源物或同源物，则可以认为该抗体对于某些表位是“高度特异性的”。
在某些实施例中，本公开制剂的抗体是靶向并拮抗有助于疾病状态的发展和/或维持的蛋白质的抗体。在这些实施例的一些中，所述疾病是癌症，并且所述抗体靶向由癌基因编码的蛋白质。如本文所用，术语“癌基因”是指编码有助于癌症或转化表型的发展和/或维持的基因产物(例如，蛋白质)的基因。在其中制剂内的抗体靶向由癌基因编码的蛋白质的那些实施例的一些中，靶蛋白是生长因子受体酪氨酸激酶。
受体酪氨酸激酶的HER家族是细胞生长、分化和存活的重要介质。生长因子RTK活化的调节的丧失通常导致异常的细胞增殖和肿瘤发生。受体家族包括四种不同的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR，ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2，Neu或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
在某些实施例中，本公开的制剂的蛋白质是抗HER2抗体。编码HER2的erb-b2基因的序列是本领域已知的，并且存在于染色体17的带q21上。HER2蛋白的序列也是本领域已知的，包括但不限于Genbank登录号NP_001005862，NP_004439，AAA75493或AAA35978，其各自通过引用并入本文。HER2蛋白具有细胞外结构域，包括两个富含半胱氨酸的重复簇的跨膜结构域和具有自磷酸化位点的胞内激酶结构域。参考SEQ ID NO：11中所示的1255个氨基酸的人HER2同种型1，胞外结构域来自氨基酸残基23-652，跨膜结构域跨越残基653-675，残基676-1255构成细胞质结构域。通常，抗HER2抗体靶向HER2的细胞外结构域。
在某些实施例中，本公开制剂的蛋白质是单克隆抗体曲妥单抗(美国专利号5,821,337，其整体通过引用并入本文)或是能够结合和拮抗HER2的活性变体。曲妥单抗是选择性结合HER-2的人源化IgG1κ轻链单克隆抗体。曲妥单抗防止细胞内信号传导所必需的受体的二聚化，导致细胞增殖的抑制。这导致肿瘤生长和转移的抑制。此外，抗体依赖性细胞介导的毒性以及HER2内化和降解也在体内发生，从而进一步降低肿瘤细胞的增殖潜力。曲妥单抗被批准用于与多种化疗剂联合在HER2过表达乳腺癌和转移性HER2过表达乳腺癌以及HER2过度表达的胃和胃食管连接的转移性癌症的辅助治疗中的静脉内使用。提及曲妥单抗应理解为包括曲妥单抗的生物相似形式。提及曲妥单抗应理解为包括包含曲妥单抗或其活性变体的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列或由其组成的抗体。
因此，在本公开的制剂的蛋白质包含抗HER2抗体的那些实施例的一些中，抗体包含具有SEQ ID NO：1所示序列的重链和具有SEQ ID NO：2所示序列的轻链或其活性变体。本领域技术人员将认识到，曲妥单抗重链的恒定区包含位于SEQ ID NO：1的位置217具有赖氨酸的Glm-1(17)等位基因，并且轻链的恒定区包含Km-3等位基因或其活性变体，Km-3等位基因在SEQ ID NO：2的位置153处具有丙氨酸，在位置191具有缬氨酸。在某些实施例中，曲妥单抗的活性变体包含在本发明公开的制剂中。如本文所用，关于曲妥单抗的“活性变体”是全长抗体或其抗原结合片段，其包含曲妥单抗的至少一个CDRs并且能够结合HER2并拮抗其活性的，其可以导致以下任何一种或多种事件：防止受体二聚化、抑制细胞增殖、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤转移、抗体依赖性细胞介导的毒性、HER2内化、HER2降解、降低肿瘤的增殖潜力、HER2过表达肿瘤细胞的凋亡。
因此，在一些实施例中，本公开的制剂包含竞争性抑制曲妥单抗与HER2的结合的曲妥单抗的活性变体。
在其它实施例中，抗HER2抗体是与曲妥单抗结合相同或相似表位的抗体。参见Choet al.(2003)Nature 421(6924):756-760，其全部内容通过引用并入本文。
在其他实施例中，抗HER2抗体包含具有SEQ ID NO：1所示序列的重链。
在其它实施例中，抗HER2抗体包含具有SEQ ID NO：2所示序列的轻链。
在其他实施例中，抗HER2抗体包含具有SEQ ID NO：3所示序列的可变重(VH)结构域。
在其它实施例中，抗HER2抗体包含具有SEQ ID NO：4所示序列的可变轻(VL)结构域。
在这些实施例的一些中，适用于本文所述制剂的抗HER2抗体包含具有SEQ ID NO：3所示序列的VH结构域和具有SEQ ID NO：4所示序列的VL结构域。
在某些实施例中，所述制剂的抗HER2抗体包含曲妥单抗的至少一个CDR。因此，抗HER2抗体可以包含SEQ ID NO：5,6,7,8,9和10中所示的至少一个CDRs(分别为曲妥单抗的VH结构域的CDR1，CDR2和CDR3，和曲妥单抗的VL结构域的CDR1，CDR2和CDR3)。在这些实施例的一些中，抗HER2抗体包含具有SEQ ID NO：5所示序列的VH CDR1，具有SEQ ID NO：6所示序列的VH CDR2，具有SEQ ID NO：7所示序列的VH CDR3，具有SEQ ID NO：8所示序列的VL CDR1，具有SEQ ID NO：9所示序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO：10所示序列的VL CDR3。
尽管广泛认可的HER2抗体是曲妥单抗，但是本公开的方法和组合物不限于使用该抗体，然而本公开的方法和组合物特别适合于该抗体。其他HER2抗体也适用于本公开的方法和组合物。其它这样的HER2抗体的例子包括但不限于4D5抗体(在美国专利号5,677,171和5,772,997中描述)；和命名为452F2,736G9,741F8,758G5和761B10的520C9及其功能等同物(在美国专利号6,054,561中描述)；rhuMAb 2C4或帕妥珠单抗(在美国专利8,372,396中描述)；通过参考并入本文。Tagliabue et al.Int.J.Cancer 47:933-937(1991)；McKenzie et al.Oncogene 4:543-548(1989)；Maier et al.Cancer Res.51:5361-5369(1991)；Bacus et al.Molecular Carcinogenesis 3:350-362(1990)；Stancovski et al.PNAS(USA)88:8691-8695(1991)；Bacus et al.Cancer Research 52:2580-2589(1992)；Xu et al.Int.J.Cancer 53:401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk etal.Cancer Research 52:2771-2776(1992)；Hancock et al.Cancer Res.51:4575-4580(1991)；Shawver et al.Cancer Res.54:1367-1373(1994)；Arteaga et al.CancerRes.54:3758-3765(1994)；Harwerth et al.J.Biol.Chem.267:15160-15167(1992)；U.S.Pat.No.5,783,186；and Klapper et al.Oncogene 14:2099-2109(1997)中已经描述了具有各种性质的其他HER2抗体；其各自的全部内容通过参考并入本文。此外，可以使用本领域已知的方法或本文所述的方法产生新的HER2抗体。
在某些实施例中，本公开的制剂包含多于一种类型的蛋白质(例如抗体)。例如，已经观察到，对于细胞外表达的抗原如HER2，针对蛋白质的不同表位给药两种不同的抗HER2抗体导致体内和体外的抗肿瘤活性。Spiridon et al,Clin.Cancer Res.8:1720-30(2002)(其全部内容通过参考并入本文)。实际上，已经证明了施用两种不同抗HER2抗体的协同效应(Spiridon,2002；Friedman et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA 702:1915-1920(2005))；和一种抗HER2和一种抗EGFR抗体的组合的协同效应(Larbouret et al.,Clin.CancerRes.75:3356-3362(2007))。这些协同效应是通过混合针对同一分子上的不同表位的高亲和性抗体而使细胞表面分子超交联的结果(Spiridon，2002)。多于一个表位的同时接合导致形成抗体-受体复合物的大聚集体。这些大聚集体比较小的抗体复合物内吞速率更快，导致受体清除的加速(Friedman，2005)。在非限制性例子中，本公开的制剂包含曲妥单抗或其活性变体和帕妥珠单抗或其活性变体。
山梨醇
如本文所用，“山梨醇”是指分子式为C6H14O6并且分子量为182.2的多元醇。它也被称为D-葡萄糖醇。它具有以下化学结构：
山梨醇属于通称为“一般安全(GRAS)”的辅料和添加剂类别。
在一个实施例中，本文所述的主题涉及包含蛋白质(例如抗体)和山梨醇的药物制剂，其中山梨醇与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔蛋白质(例如，抗体)。在某些实施例中，该摩尔比为约600至约660摩尔山梨醇：约1摩尔蛋白质(例如抗体)。在这些实施例的一些中，摩尔比为约615至约655摩尔山梨醇：约1摩尔蛋白质(例如抗体)。在其它实施例中，摩尔比为约620至约640摩尔山梨醇：约1摩尔蛋白质(例如抗体)。在其他实施例中，摩尔比为约631摩尔山梨醇：约1摩尔蛋白质(例如抗体)。在一些实施例中，山梨醇以约90mM至约120mM的浓度存在。在实施例中，山梨醇以约100mM至约110mM的浓度存在。在某些实施例中，山梨醇的浓度约为105.4mM。
在一个实施例中，本文描述的主题涉及包含抗HER2抗体(例如，本文所讨论的曲妥单抗)和山梨醇的药物制剂，其中山梨醇与抗体的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔抗体。在某些实施例中，摩尔比为约600至约660摩尔山梨醇：约1摩尔抗体。在这些实施例的一些中，摩尔比为约615至约655摩尔山梨醇：约1摩尔抗体。在其它实施例中，摩尔比为约620至约640摩尔山梨醇：约1摩尔抗体。在其它实施例中，摩尔比为约631摩尔山梨醇：约1摩尔抗体。在一些实施例中，山梨醇以约90mM至约120mM的浓度存在。在实施例中，山梨醇以约100mM至约110mM的浓度存在。在某些实施例中，山梨醇的浓度约为105.4mM。
在一个实施例中，本文描述的主题涉及包含曲妥单抗和山梨醇的药物制剂，其中山梨醇与曲妥单抗的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗。在某些实施例中，摩尔比为约600至约660摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗。在这些实施例的一些中，摩尔比为约615至约655摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗。在其它实施例中，摩尔比为约620至约640摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗。在其它实施例中，摩尔比为约631摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗。在一些实施例中，山梨醇以约90mM至约120mM的浓度存在。在实施例中，山梨醇以约100mM至约110mM的浓度存在。在某些实施例中，山梨醇的浓度为约105.4mM。
在一个实施例中，本文描述的主题涉及包含曲妥单抗和山梨醇的药物制剂，其中山梨醇与曲妥单抗的摩尔比为约631摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗。
在一个实施例中，本文描述的主题涉及包含曲妥单抗和约约100mM至约110mM山梨醇的药物制剂。
在一个实施例中，本文描述的主题涉及包含曲妥单抗和约105.4mM山梨醇的药物制剂。
聚乙二醇(PEG)
如本文所用，“聚乙二醇”是指由重复的乙二醇单元：H-(O-CH2-CH2)n-OH组成的化合物；其中n＝氧化乙烯基的平均数。
纯化的PEG是通常可以商购获得的作为在宽或窄限定分子量(MW)范围内的不同低聚物尺寸的混合物。例如，“PEG 3350”通常表示包括平均MW为3350g/mol的PEG分子的混合物的制剂。
如本文所用，PEG是指赋予蛋白质更大水溶性的生物惰性、非免疫原性化学品。
在一个实施例中，本文所述的主题涉及包含蛋白质(例如抗体)，山梨醇和聚乙二醇(PEG)的药物制剂，其中山梨醇与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：1摩尔蛋白质(例如抗体)，并且聚乙二醇(PEG)与蛋白质的摩尔比在约2:1至50:1的范围内。已经确定，本文中以特定比例组合的聚乙二醇与山梨醇提供了具有期望稳定性的制剂。有用的聚乙二醇包括其中分子量为约2000g/mol至约5000g/mol的那些。在某些实施例中，聚乙二醇具有约3000g/mol至约4000g/mol的分子量。在其它实施例中，聚乙二醇是最优选的PEG 3350。
不受任何理论或作用机制的束缚，据信在特定实施例中，山梨醇和聚乙二醇可以通过保持冻干饼结构的完整性而起到冻干保护剂的作用，甚至达到防止、抑制或最小化冻干饼结构的崩解的程度。
在具体实施例中，包含山梨醇和PEG的制剂可以进一步包含辅料，但不含其它冻干保护剂，例如海藻糖、蔗糖和/或甘露醇。因此，在一个实施例中，制剂包含如本文所述的抗体，如本文所述的特定比例和量的山梨醇和以本文所述的特定比例和量的PEG，条件是所述制剂不含另外的非还原糖，例如海藻糖、蔗糖和/或甘露醇。
存在于制剂中的聚乙二醇的有用量包括PEG与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为至少2:1。在一些实施例中，制剂中存在的聚乙二醇的量包括PEG与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为约2:1至约50:1。在某些实施例中，聚乙二醇以约5：1至约40：1的PEG与蛋白质(例如抗体)的摩尔比存在于制剂中。在其它实施例中，聚乙二醇以约5:1至约15:1的PEG与蛋白质(例如抗体)的摩尔比存在于制剂中。在另一个实施例中，聚乙二醇以约10:1的PEG与蛋白质(例如抗体)的摩尔比存在于制剂中。
在一些实施例中，PEG以约1.0mM至约2.5mM的浓度存在。在其它实施例中，PEG以约1.5mM至约1.9mM的浓度存在。在某些实施例中，PEG的浓度约为1.67mM。
在某些实施例中，制剂包含蛋白质(例如抗体)；山梨醇，其中山梨醇与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为约631摩尔山梨醇：约1摩尔蛋白质(例如抗体)；和PEG 3350，其中PEG3350与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为约10:1。
在某些实施例中，制剂包含抗HER2抗体；山梨醇，其中山梨醇与抗体的摩尔比为约631摩尔山梨醇：约1摩尔抗体；和PEG 3350，其中PEG 3350与抗体的摩尔比为约10:1。
在某些实施例中，制剂包含曲妥单抗；山梨醇，其中山梨醇与曲妥单抗的摩尔比为约631摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗；和PEG 3350，其中PEG 3350与曲妥单抗的摩尔比为约10:1。
其他辅料
本公开的制剂适合于冻干。在该方面，该制剂是固体，并且可以是粉末或饼的形式。冻干制剂是稳定的，如本文别处所述。然而，在一些实施例中，制剂不一定必须被冻干，并且液体制剂不一定必须从冻干形式复溶。蛋白质(例如抗体)的冻干通常需要与蛋白质(例如抗体)的以特定且足够比例存在的冻干保护剂，以便在升华期间提供保护。“冻干保护剂”是当与感兴趣的蛋白质组合时，显着防止或降低冻干和随后储存时蛋白质的化学和/或物理不稳定性的分子。将冻干保护剂加入到预冻干的制剂中，使得蛋白质在冻干和储存后基本上保持其物理和化学稳定性和完整性。在本领域中，通常在制剂中使用非还原性糖，以避免可能由于活性醛基与蛋白质主链的反应性氨基酸之间的反应而发生的不期望的美拉德型反应。U.S.Pat.Nos.6,267,958和6,685,940,和International Appl.Publ.No.WO 97/04801中描述了冻干的HER2抗体制剂，其各自的全部内容通过参考并入本文。
在一个实施例中，本文描述的主题涉及用于给药的复溶制剂。“复溶”制剂是通过将冻干的蛋白质制剂溶解在稀释剂中使得蛋白质分散在复溶制剂中而制备的。复溶制剂适合于对待用感兴趣的蛋白治疗的受试者给药(例如肠胃外给药)，并且在本发明的某些实施例中，可以是适于皮下给药的制剂。
复溶制剂包含蛋白质(例如，抗体)；和山梨醇，其中山梨醇与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔蛋白质(例如抗体)；和稀释剂。“稀释剂”是指可用于制备复溶制剂的药学上可接受的(安全并无毒地给药至人)液体。
示例性稀释剂包括无菌水，注射用抑菌水(BWFI)，pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)，无菌盐水溶液，林格氏溶液或葡萄糖溶液。制剂通常是无菌的，并且这可以根据本领域技术人员已知的用于产生适合对人受试者给药的无菌药物制剂的程序来实现，包括在制剂制备之前或之后通过无菌过滤膜过滤。
稀释剂可以包含防腐剂。“防腐剂”是可以添加到稀释剂中以基本上降低复溶制剂中的细菌作用，从而便于例如多用途复溶制剂的产生。防腐剂的非限制性例子包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲基氯化铵(hexamethonium chloride)，苯扎氯铵(其中烷基为长链化合物的烷基苄基二甲基氯化铵的混合物)和苄索氯铵，芳族醇如苯酚、丁基和苄醇，烯丙基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇和间甲酚。在其中存在防腐剂的那些实施例的一些中，防腐剂是苯甲醇。
在一个实施例中，液体制剂包含蛋白质(例如抗体)；山梨醇，其中山梨醇与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔蛋白质(例如抗体)；聚乙二醇(PEG)，其中PEG与蛋白质(例如抗体)的摩尔比在约2:1至50:1的范围内；和稀释剂。
在另一个实施例中，液体制剂包含抗HER2抗体；和山梨醇，其中山梨醇与抗体的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔抗体；聚乙二醇(PEG)，其中PEG与蛋白质(例如抗体)的摩尔比在约2:1至50:1的范围内；和稀释剂。
在另一个实施例中，液体制剂包含曲妥单抗；和山梨醇，其中山梨醇与曲妥单抗的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗；聚乙二醇(PEG)，其中PEG与蛋白质(例如抗体)的摩尔比在约2:1至50:1的范围内；和稀释剂。
在一些液体制剂中，蛋白质(例如抗体)以约5mg/mL至约50mg/mL的浓度存在。在这些实施例的一些中，蛋白质以约10mg/mL至约40mg/mL的浓度存在。在其它实施例中，蛋白质以约15mg/mL至约35mg/mL的浓度存在。在某些实施例中，蛋白质以约21mg/mL的浓度存在。
在一些液体制剂中，抗HER2抗体以约21mg/mL的浓度存在。
在一些液体制剂中，曲妥单抗以约21mg/mL的浓度存在。
蛋白质的另外有用浓度还包括约0.10mM至约0.25mM；约0.15mM至约0.18mM；和约0.167mM。
本文所述的制剂可以进一步包含辅料。“辅料”是指治疗上无活性的物质。辅料可以包括在用于多种目的的制剂中，包括例如作为稀释剂、赋形剂、缓冲剂、稳定剂、张力剂、填充剂、表面活性剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、金属离子源、螯合剂和/或防腐剂。辅料是本领域公知的，并且可以在例如Wang W.,Int.J.Pharm.185:129-88(1999)和Wang W.,Int.J.Pharm.203:1-60(2000)的描述中找到。
在某些实施例中，本公开的制剂包含缓冲剂。如本文所用，术语“缓冲剂”是指使液体的pH(其酸度或碱度)稳定的物质。换句话说，缓冲溶液通过其酸-碱缀合物组分的作用抵抗pH的变化。本文所用的术语是指具有与其共轭碱平衡的缓冲物质(如酸)的溶液。缓冲剂可以在其pKa的区域中提供最佳缓冲能力，其中缓冲能力是指当加入到溶液中的酸或碱扰乱时对pH变化的抵抗力。在某些实施例中，本公开的制剂具有在约5.0至约7.5范围内的pH，在一些实施例中为约5.8至约6.8，例如约6.0至约6.4，在某些实施例中具有的pH为约6.2。将控制该范围内的pH的缓冲剂的非限制性例子包括乙酸盐、琥珀酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲剂。
在一些实施例中，本公开的制剂的缓冲剂是组氨酸缓冲剂。组氨酸缓冲剂是包含组氨酸离子的缓冲剂。组氨酸缓冲剂的非限制性例子包括L-组氨酸及其共轭酸L-组氨酸盐酸盐，以及组氨酸乙酸盐，组氨酸磷酸盐，组氨酸硫酸盐。在某些实施例中，缓冲剂是L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐。在这些实施例中，L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐的有用浓度为约1.0mM至约3.0mM的L-组氨酸和约1.5mM至约3.0mM的L-组氨酸盐酸盐。在具体实施例中，L-组氨酸的浓度为约1.5mM至约2.5mM，L-组氨酸盐酸盐的浓度为约2.0mM至约2.5。在某些实施例中，L-组氨酸的浓度为约1.93mM，L-组氨酸盐酸盐的浓度为约2.23mM。其它非限制性示例性缓冲剂包括乙酸或乙酸盐缓冲剂，谷氨酸或谷氨酸盐缓冲剂，琥珀酸或琥珀酸盐缓冲剂或丙酸或丙酸盐缓冲剂。
在一些实施例中，本文所述的主题涉及包含曲妥单抗、山梨醇、L-组氨酸、L-组氨酸HCl和PEG 3350的药物制剂，其中山梨醇与曲妥单抗的摩尔比为约631摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗。
在一些实施例中，本文所述的主题涉及包含曲妥单抗、山梨醇、L-组氨酸、L-组氨酸HCl和PEG 3350的药物制剂，其中山梨醇与曲妥单抗的摩尔比为约631摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗，并且其中PEG 3350与抗体的摩尔比为约10:1。
在一些实施例中，本文描述的主题涉及包含山梨醇、PEG 3350、蛋白质和缓冲剂的药物制剂，使得山梨醇和蛋白质的摩尔比为631摩尔:1摩尔，PEG 3350与蛋白质的摩尔比为10摩尔：1摩尔，并且发现随后冻干的该制剂在2-8℃下稳定至少4年。
在具体实施例中，本文描述的主题涉及药物制剂，其包含约150mg的抗HER2单克隆抗体；包含约2.16mg的L-组氨酸和3.36mg的L-组氨酸HCl的缓冲剂；约115.2mg山梨醇；约33.6mg PEG 3350；和约7.2mL注射用无菌水。
在另一个实施例中，本文描述的主题涉及药物制剂(其可以是冻干的)，其包含约150mg的抗-HER2单克隆抗体；包含约2.16mg的L-组氨酸和3.36mg的L-组氨酸HCl的缓冲剂；约115.2mg山梨醇；和约33.6mg PEG 3350。
在这些实施例的一些中，抗HER2单克隆抗体包含具有SEQ ID NO：3所示序列的VH结构域和具有SEQ ID NO：4所示序列的VL结构域。在具体实施例中，抗HER2单克隆抗体是曲妥单抗，因此具有SEQ ID NO：1所示的重链序列和SEQ ID NO：2所示的轻链序列。
在具体实施例中，本文描述的主题涉及药物制剂，其包含约150mg曲妥单抗；包含约2.16mg的L-组氨酸和3.36mg的L-组氨酸HCl的缓冲剂；约115.2mg山梨醇；约33.6mgPEG3350；和约7.2mL注射用无菌水。
在另一个具体实施例中，本文描述的主题涉及药物制剂(其可以是冻干的)，其包含约150mg的曲妥单抗；包含约2.16mg的L-组氨酸和3.36mg的L-组氨酸HCl的缓冲剂；约115.2mg山梨醇；和约33.6mg PEG 3350。
尽管在最优选的实施例中，山梨醇/PEG混合物作为冻干保护剂和填充剂存在，但是也可以存在其它辅料，例如填充剂。“填充剂”是使冻干混合物增加质量并有助于冻干饼的物理结构(例如促进基本上均匀的冻干饼的产生，其保持开放孔结构)的化合物。示例性的填充剂包括甘露醇和甘氨酸。糖醇，也称为多元醇，多羟基醇或聚醇类，是具有还原成伯羟基或仲羟基的羰基的氢化形式的碳水化合物。多元醇可以在液体和冻干制剂中用作稳定剂和/或等渗剂。虽然本公开的制剂包含山梨醇，但是另外的多元醇可以存在于制剂中，并且可以用于保护多肽免于物理和化学降解途径。其它糖醇的非限制性例子包括甘油、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、赤藓糖醇和苏糖醇。
其它辅料包括例如糖，如蔗糖、乳糖或右旋糖，盐，如NaCl、KCl或磷酸钙，氨基酸，如甘氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸，表面活性剂，金属离子，缓冲盐，氯化物，丙酸盐，乙酸盐或琥珀酸盐，防腐剂和多肽如人血清白蛋白，以及盐水和水。
通常，液体制剂是等渗的。“等渗”是指制剂具有与人血液基本上相同的渗透压。等渗性可以使用例如蒸汽压或冰冻型渗压计测量。
本公开的制剂是稳定的。“稳定的”制剂是指在储存时其中的蛋白质基本上保持其物理和化学稳定性和完整性的制剂。可以在选定的温度下选定的时间段测量稳定性。为了快速筛选，制剂可以在40℃下保持2周至1个月，此时测量稳定性。当制剂在2-8℃下储存时，在一些实施例中，制剂至少六个月是稳定。在其它实施例中，制剂在约2℃至约8℃下储存时至少9个月是稳定的。在某些实施例中，制剂在约2℃至约8℃下储存至少4年是稳定的。
冻干和储存后的聚集程度可用作蛋白质稳定性的指标。例如，“稳定的”制剂可以这样的制剂：其中小于约10％，优选小于约5％的蛋白质作为制剂中的聚集体存在。可以确定冻干制剂在冻干和储存后聚集体形成的增加。例如，“稳定的”冻干制剂可以是这样的制剂：其中当冻干制剂在2-8℃下储存至少四年时，冻干制剂中聚集体的增加小于约5％，在一些实施例中，小于约3％。在其它实施例中，可以使用生物活性测试来测量蛋白质制剂的稳定性。
技术人员可使用各种其它稳定性测试来确认制剂的稳定性，见Peptide andProtein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)and Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中的综述。可以通过在配制时间内以及在所述温度下储存后评价制剂中抗体的物理稳定性、化学稳定性和/或生物活性来测试稳定性。可以以多种不同的方式定性和/或定量评价物理和/或化学稳定性，这些方式包括聚集体形成的评价(例如使用尺寸排阻色谱，通过测量浊度和/或通过目视检查)；通过使用阳离子交换色谱或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较减少的和完整的抗体；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的生物活性或抗原结合功能等。不稳定性可能导致聚集、脱酰胺(例如Asn脱酰胺化)、氧化(例如Met氧化)、异构化(例如Asp异构化)、剪切/水解/片段化(例如铰链区片段化)、琥珀酰亚胺形成、未配对的半胱氨酸、N-末端延伸、C-末端加工(C-terminal processing,)、糖基化差异等。可以使用技术人员可用的各种技术评估生物活性或抗原结合功能。本文特别考虑制剂的冷冻。因此，可以测试制剂在冷冻和解冻时的稳定性。
II.药物制剂的制备方法
本发明还提供了制备药物制剂的方法，包括制备如本文所述的制剂，在一些实施例中，评价制剂中蛋白质(例如抗体)的物理稳定性、化学稳定性或生物活性。
在一个实施例中，提供了一种制备稳定制剂的方法，包括以下步骤：
a)混合蛋白质、PEG和山梨醇，使得山梨醇：蛋白质的摩尔比在550-700摩尔山梨醇：1摩尔蛋白质的范围内；和PEG：蛋白质的摩尔比为2-50摩尔:1摩尔；
b)冻干所述混合物；和任选地
c)在稀释剂中复溶步骤(b)的冻干混合物，使得蛋白质浓度为5mg/ml至50mg/ml。
在上述方法中，冻干混合物可以进一步包含填充剂。
在另一个实施例中，提供了制备稳定制剂的方法，包括以下步骤：
a)以550-700摩尔山梨醇：1摩尔蛋白质的范围内的摩尔比混合蛋白质和山梨醇；和
b)以2：1至50：1，优选10：1的范围内的PEG：蛋白质的摩尔比向所述混合物(a)中添加PEG；
c)稀释上述混合物以形成液体制剂。
在某些实施例中，本文描述的主题涉及制备制剂的方法，其包括以下步骤：a)冻干混合物，该混合物包含蛋白质(例如抗体)；山梨醇，其中所述山梨醇与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔蛋白质(例如抗体)；和聚乙二醇(PEG)，其中PEG与蛋白质(例如抗体)的摩尔比在约2:1至50:1的范围内。
在某些实施例中，本文描述的主题涉及制备制剂的方法，其包括以下步骤：a)冻干混合物，该混合物包含蛋白质(例如抗体)；山梨醇，其中所述山梨醇与蛋白质(例如抗体)的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔蛋白质(例如抗体)；和聚乙二醇(PEG)，其中PEG与蛋白质(例如抗体)的摩尔比在约2：1至50：1的范围内；和b)在稀释剂中复溶步骤(a)的冻干混合物，使得蛋白质(例如抗体)的浓度为约5mg/mL至约50mg/mL。在一些实施例中，蛋白质(例如，抗体)以约10mg/mL至约40mg/mL的浓度存在。在其它实施例中，蛋白质(例如，抗体)以约15mg/mL至约35mg/mL的浓度存在。在其它实施例中，蛋白质(例如抗体)以约21mg/mL的浓度存在。蛋白质(例如抗体)的有用浓度还包括约0.10mM至约0.25mM；约0.15mM至约0.18mM；和约0.167mM。
在某些实施例中，本文描述的主题涉及制备制剂的方法，其包括以下步骤：a)冻干混合物，该混合物包含抗HER2抗体；山梨醇，其中山梨醇与抗体的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔抗体；和聚乙二醇(PEG)，其中PEG与蛋白质(例如抗HER2抗体)的摩尔比在约2:1至50:1的范围内。
在某些实施例中，本文描述的主题涉及制备制剂的方法，其包括以下步骤：a)冻干混合物，该混合物包含抗HER2抗体；山梨醇，其中山梨醇与抗体的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔抗体；聚乙二醇(PEG)，其中PEG与蛋白质(例如抗体)的摩尔比在约2:1至50:1的范围内；和(b)在稀释剂中复溶步骤(a)的冻干混合物，使得抗体浓度为约5mg/mL至约50mg/mL。在一些实施例中，抗体以约10mg/mL至约40mg/mL的浓度存在。在其它实施例中，抗体以约15mg/mL至约35mg/mL的浓度存在。在其他实施例中，抗体以约21mg/mL的浓度存在。
在某些实施例中，本文描述的主题涉及制备制剂的方法，其包括以下步骤：a)冻干混合物，该混合物包含曲妥单抗；山梨醇，其中山梨醇与曲妥单抗的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗；和聚乙二醇(PEG)，其中PEG与蛋白质(例如曲妥单抗)的摩尔比在约2:1至50:1的范围内。
在某些实施例中，本文描述的主题涉及制备制剂的方法，其包括以下步骤：a)冻干混合物，该混合物包含曲妥单抗；山梨醇，其中山梨醇与曲妥单抗的摩尔比为约550至约700摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗；和聚乙二醇(PEG)，其中PEG与蛋白质(例如曲妥单抗)的摩尔比在约2:1至50:1的范围内；和(b)在稀释剂中复溶步骤(a)的冻干混合物，使得曲妥单抗浓度为约5mg/mL至约50mg/mL。在一些实施例中，曲妥单抗以约10mg/mL至约40mg/mL的浓度存在。在其它实施例中，曲妥单抗以约15mg/mL至约35mg/mL的浓度存在。在其它实施例中，曲妥单抗以约21mg/mL的浓度存在。
在具体实施例中，制剂包含例如如本文所述的PEG-3350。例如，制剂包含曲妥单抗、山梨醇、L-组氨酸、L-组氨酸HCl和PEG 3350，其中山梨醇与曲妥单抗的摩尔比为约631摩尔山梨醇：约1摩尔曲妥单抗，并且其中PEG 3350与抗体的摩尔比约为10:1。
在一些实施例中，制剂包含缓冲剂，例如组氨酸和/或组氨酸-HCl，例如如本文所述。
在一个实例中，制剂包含约150mg曲妥单抗；包含约2.16mg的L-组氨酸和3.36mg的L-组氨酸HCl的缓冲剂；约115.2mg山梨醇；和约33.6mg PEG 3350。
对于生物药物，制剂组分通常通过切向流过滤(TFF)引入。在该方法中，将药物物质(DS)交换到包含添加的辅料但不含表面活性剂(例如聚乙二醇)的制剂缓冲剂中。DS被浓缩到比目标DS浓度更高的值。然后进行稀释，其中加入表面活性剂并将浓度调节至目标设定点。
如本领域已知的，TFF的过程包括使用靶标碱缓冲剂(target base buffer)使药物跨膜重复循环多次。这种循环可能潜在地损害蛋白质并导致物理降解，导致高聚集。如果发生这种损害，制剂中的糖通常提供保护。然而，用糖的TFF通常需要非常高体积的制剂组分。
使用公共碱缓冲剂开发涉及直接添加辅料的替代方法。该替代方法包括直接添加辅料以通过在配制期间将山梨醇辅料而不是基于膜的溶液交换成大量DS来减少原料消耗。
在某些实施例中，药物制剂如图1所示进行制备。该方法包括超滤，然后渗滤入pH为6的His-His HCl的制剂缓冲剂中。然后对药物物质进行病毒过滤。由于在配制期间加入辅料的液体储备液，为了防止药物物质的过度稀释，病毒过滤后的蛋白质浓度必须不小于32mg/mL。
在一个实施例中，药物制剂的制备包括以下步骤：
1.组氨酸缓冲剂的制备。
2.在组氨酸缓冲剂中制备1M山梨醇和50mM PEG 3350。
3.用0.1N HCl或0.1N NaOH将山梨醇和PEG储备液的pH调节至6.0。
4.加入山梨醇至终浓度为105.4mM。
5.添加PEG 3350至终浓度为1.67mM。
6.用组氨酸缓冲剂将蛋白质的浓度调节至25.00mg/mL。
7.将制剂的pH调节至6.00。
III.治疗方法
在具体实施例中，本文公开的主题涉及治疗受试者的HER2过表达的癌症的方法，包括对受试者给药本公开的制剂，该制剂包含约150mg的抗-HER2单克隆抗体；包含约2.16mg的L-组氨酸和3.36mg的L-组氨酸HCl的缓冲剂；约115.2mg山梨醇；约33.6mg PEG3350；和约7.2mL无菌水。在一个实例中，该制剂包含约150mg曲妥单抗；包含约2.16mg的L-组氨酸和3.36mg的L-组氨酸HCl的缓冲剂；约115.2mg山梨醇；约33.6mg PEG 3350；和约7.2mL无菌水。
该方法特别适合于治疗癌症，其中受试者也可以接受化疗剂和/或另一种抗HER2抗体，例如帕妥珠单抗。示例性化疗剂是多柔比星，环磷酰胺和紫杉醇或多西紫杉醇或多西他赛和卡铂或蒽环霉素或紫杉醇或卡培他滨和/或5-氟尿嘧啶。
在一个实例中，癌症是乳腺癌。例如，癌症是HER2过表达的乳腺癌。例如，乳腺癌是转移性乳腺癌。
在一个实例中，所述方法用于乳腺癌的辅助治疗。
在一个实例中，癌症是胃癌，例如转移性胃癌。
取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的蛋白质是用于对患者给药的初始候选剂量，例如通过一个或多个单独的给药，或通过连续输液。在一些实施例中，蛋白质的剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者给药约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这样的剂量可以间歇地，如每周或每三周(例如，使得患者接受约2至约20，例如约6个剂量的蛋白质)。可以给药初始较高的负荷剂量，然后给药一个或多个较低剂量。在一个实施例中，蛋白质以约840mg的负荷剂量给药，随后约每3周约420mg给药。在另一个实施例中，蛋白质以约1050mg的剂量给药，大约每3周给药一次。例如，以约4mg/kg的负荷剂量给药蛋白质(例如抗HER2抗体，例如曲妥单抗)，然后每周维持剂量为约2mg/kg。例如，以约8mg/kg的负荷剂量给药蛋白质(例如抗HER2抗体，例如曲妥单抗)，然后每3周以约4mg/kg的维持剂量给药。
在一些实施例中，蛋白质组合物通过静脉、肌内或皮下途径给药，在具体实施例中，通过静脉途径给药。
IV.制品/药物试剂盒
在本发明的另一个实施例中，提供了在容器中包含本文所述的药物制剂的制品或药物试剂盒，并且在一些实施例中，进一步提供其使用说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶(例如双室小瓶)、注射器(例如双室注射器)和试管。容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。在一些实施例中，将制剂提供在具有可被注射器刺穿的塞子的小瓶内，通常为水性形式。所述小瓶理想地在约2-8℃下储存，直到将其给药于有需要的受试者。小瓶可以例如是10-15cc小瓶。容器容纳制剂并且在容器上或与容器相关联的标签可以指示使用说明。容纳制剂的容器可以是多次使用的小瓶，其允许复溶制剂的重复给药(例如从2-6次给药)。制品或药物试剂盒可以进一步包括从商业和用户角度所需的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有如前面部分所述的使用说明的包装说明书。
制剂可以以包含特定量蛋白质的方便剂量制备。在一些实施例中，蛋白质的量为约10mg至约500mg；或约300mg至约500mg；或约400mg至约480mg；或约440mg。在一些实施例中，蛋白质的量为约50mg至约300mg。在其它实施例中，蛋白质的量为100mg至约200mg。在其它实施例中，蛋白质的量为约130mg至约170mg。在某些实施例中，蛋白质的量为约150mg。
在一些实施例中，复溶的制剂或冻干制剂容纳在容器例如塞住的小瓶中以便于使用。因此，在一个实施例中，本文描述的主题涉及包含药物制剂的小瓶，所述制剂包含约150mg的抗HER2单克隆抗体；包含约2.16mg L-组氨酸和3.36mg L-组氨酸HCl的缓冲剂；约115.2mg山梨醇；和约33.6mg PEG 3350。在该实施例中，小瓶还可包含稀释剂。在某些实施例中，稀释剂为无菌水，在这些实施例的一些中，为用于注射的抑菌水(BWFI)。无菌水的体积优选为约7.2mL。
在另一个实施例中，制品或药物试剂盒包括：(a)容器，该容器容纳包含蛋白质(例如抗体)的冻干混合物；山梨醇，以约550至约750摩尔山梨醇与约1摩尔蛋白质(例如抗体)的摩尔比存在；和聚乙二醇(PEG)，其中PEG与蛋白质(例如曲妥单抗)的摩尔比在约2:1至50:1的范围内；
和(b)用稀释剂复溶冻干混合物的说明书。制品或药物试剂盒可以进一步包括用于容纳稀释剂(例如抑菌注射用水(BWFI))的第二容器。
通过进一步描述本发明的以下非限制性实施例进一步描述本主题，这些实施例不旨在，也不应解释为限制本发明的范围。
实施例
1.冻干和饼形态分析
i.PEG制剂
根据表1A和1B，以两种不同的浓度制备仅含有PEG的制剂。将含有PEG的制剂冻干，并在40℃±2℃(75％±5％R.H)的应力条件下储存后检查饼形态和结构。制剂的评价包括在15mL小瓶中冻干150mg根据表1A和表1B的配制的散装药物物质组合物。使用包被的氯-丁基环氧树脂塞子将小瓶半塞住并冻干。两种试验制剂含有37.5倍和100倍摩尔过量的PEG3350与冻干的抗体，没有塌陷和形成的饼结构。将所得的冻干饼放置在40℃±2℃(75％±5％RH室)下3周，此后重新检查饼形态。在初始时间，以及在40℃±2℃(75％±5％RH)下3周后分析饼的视觉外观。
表1A.制剂3
表1B.制剂4
在初始时间T0和在40℃±2℃(75％±5％R.H)储存三周(T3W 40℃)后检查制剂3的冻干饼。当在40℃±2℃(±5％R.H)的加速稳定性条件下储存3周时，制剂3不能保持饼状结构，这由饼状结构的塌陷证明。
在初始时间T0和在40℃±2℃(±5％R.H)储存三周(T3W 40℃)后检查制剂4的冻干饼。当在40℃±2℃(±5％R.H)的加速稳定性条件下储存3周时，该制剂不能保持饼状结构，这由饼状结构的塌陷证明。
ii.PEG/山梨醇制剂
评价含有PEG和山梨醇的组合的制剂。PEG和山梨醇与抗体的四种不同的摩尔过量比例：36,100,310和667。除了监测饼形态外，产品质量属性如通过SEC的物理稳定性，通过IEX的化学稳定性，通过UV280的总蛋白质含量，在40℃下储存3周时评价pH强度和重量摩尔渗透压浓度。
将5mL根据表2A，2B，2C和2D配制的散装药物物质装入到15mL小瓶中。使用包被的氯-丁基环氧树脂塞子将小瓶半塞住并冻干。在初始时间T0以及在40℃±2℃(75％±5％相对湿度)室中储存3周后，立即分析所得的冻干饼的产品质量属性。
表2A.制剂6
表2B.制剂7
表格2C.制剂8
表格2D.制剂9
与仅含PEG的制剂相比，含有PEG和山梨醇的所有制剂在高温下提供改善的饼结构和增加的物理稳定性。
2.PEG/山梨醇制剂的稳定性
用7.2mL注射用水复溶冻干的药物产品饼，并在初始时间和在40℃下储存3周后分析制剂的pH，通过SEC分析大小变体分布和通过IEX分析带电变体分布。表3中的数据显示，四种试验制剂在时间T0和在40℃下储存3周后具有约6.00的稳定的pH。
表3
i.物理稳定性
图2为试验制剂6的代表性SEC色谱图。单体馏分在28.54分钟洗脱，聚集体在24.42分钟洗脱。与在初始条件(蓝色曲线)下的样品相比时，在40℃下储存3周(红色迹线，箭头)的样品中看到聚集体的增加。
表4总结了在复溶后T0和在40℃下储存三周后试验制剂的物理稳定性的数据。
表4.
图3为试验制剂6的代表性IEX色谱图。
ii.化学稳定性
表5总结了在复溶后T0和在40℃下储存三周后试验制剂的化学稳定性的数据。
表5.
在初始时间以及在40℃下储存三周后，四种制剂在外观，pH和化学稳定性方面相当。然而，在通过SEC测定的试验制剂的物理稳定性中可观察到显着差异。表6展示了物理稳定性数据的分析的概述，表明制剂6是优越的。山梨醇的量与物理稳定性之间的相关性是显而易见的，其中具有较大比例的山梨醇的制剂对药物产品提供更大的稳定性。
表6.
类别 制剂的等级
外观 6＝7＝8＝9
溶液的pH 6＝7＝8＝9
基于SEC的尺寸变化 6>7>8>9
基于IEX的带电变体 6＝7＝8＝9
3.液体状态研究
评估摩尔过量PEG/山梨醇添加剂对降解的类型和程度的影响。实验在液体状态下进行，因为与冻干状态相比，预期会有更高的降解。
制备浓度为25mg/mL的抗体和不同浓度的对应于0.167mM蛋白质的山梨醇/聚合物添加剂的液体制剂。
表7
制剂13,16,23含有不同浓度的PEG/山梨醇添加剂。含有海藻糖的制剂15是对照组。向2R小瓶中加入1mL液体制剂。塞上小瓶，卷曲并在40℃下储存4周。以2周间隔取出样品，通过SEC(表8)分析物理稳定性和通过IEX分析化学稳定性(表10)。
表8.在加速稳定性条件下液体状态的试验制剂的物理稳定性。
表9.在加速稳定条件下液体状态的试验试剂的化学稳定性。
液体筛选实验的试验制剂的物理稳定性表明，含有PEG的制剂13最不稳定，在40℃下3周内显示出从0.37％到8.51％的显着增加的碎片。除了PEG外，含有不同比例的山梨醇的所有其它试验制剂，即16和23，具有相当的物理稳定性。
关于化学稳定性，所有制剂在一定程度上降解，如在40℃下储存3周时较高比例的酸性和碱性变体所证明的。
4.差示扫描量热法(DSC)分析
制剂含有150mg浓度为25mg/mL的曲妥珠单抗。将5mL配制的散装DS装入到15mL小瓶中，用包被的氯丁基环氧树脂塞子半封闭并冻干。可以通过DSC方便地监测制剂的热稳定性。试验制剂的熔融温度的升高表明稳定性增加。因此，通过DSC分析来自制剂筛选的药物产物。表10展示了制剂中存在的组分。
表10.Tm1和Tm2的汇总。
图4-9显示了四种试验制剂(5mg/mL，用相应的安慰剂稀释)的药物产物的DSC分析。基于第一(Tm1)和第二转变(Tm2)的熔融温度，在四种试验制剂之间没有观察到显着差异。图4为制剂6的DSC；图5为制剂8的DSC；图6是制剂26的DSC；图7是制剂27的DSC；图8是制剂1的DSC；和图9是Herceptin的DSC。
5.冻干制剂的短期物理和化学稳定性研究
对四种试验制剂进行短期稳定性分析。表11列出了冻干制剂。
表11.
稳定性程序的设计在上面详细描述。在每个时间点，将用7.2mL注射用水复溶冻干饼，并分析产物质量属性(列于表12A-13E中)。
表12A.通过SEC测定的制剂6的物理稳定性。
表12B.通过SEC测定的制剂8的物理稳定性。
表12C.通过SEC测定的制剂26的物理稳定性。
表12D.通过SEC测定的制剂27的物理稳定性。
表12E.通过SEC测定的制剂1的物理稳定性。
表13A.通过IEX测定的制剂6的化学稳定性。
表13B.通过IEX测定的制剂8的化学稳定性。
表13C.通过IEX测定的制剂26的化学稳定性。
表13D.通过IEX测定的制剂27的化学稳定性。
表13E.通过IEX测定的制剂1的化学稳定性。
在4个试验制剂中冻干的药物产品在不同的条件即2-8℃，25℃±2℃(60％±5％RH)和40℃±2℃(75％±5％RH)储存3个月，并与也放在相同的储存条件下对照制剂(制剂1)中的药物产品进行比较。监测物理稳定性和化学稳定性。包含相对较高比例的山梨醇的制剂提供比具有较少量山梨醇的那些更好的物理稳定性。在这点上，制剂27比制剂26等级更好，制剂6等级得比制剂8更好。同样相对较小比例的PEG3350为药物产品提供更大的物理稳定性。基于物理稳定性，制剂分级为：制剂27>制剂6>制剂26＝制剂8。
图10-11表示冻干制剂和散装药物制剂之间的相当的物理稳定性研究数据。
在一个实施例中，将被鉴定为制剂27的冻干制剂分成12批，即批次1至批次12，并在2-8℃下储存至少4年的时间。发现该制剂在四年(48个月)时间内是稳定的，如图10所示。
在另一个实施例中，在制剂27中鉴定的冻干前的散装药物制剂也分成12批，即批次1至12，并且在-20℃下储存2年时确定稳定性。所有制剂显示在两年(24个月)的极端条件下是稳定的。
因此，当在上述提及的条件下储存时，发现散装药物和冻干形式分别稳定储存至少两年和四年。
6.散装药物物质的制剂
为了评估在TFF步骤期间是否需要糖，在存在和不存在山梨醇的情况下配制病毒滤液，并且通过尺寸排阻色谱(SEC)监测所得药物物质的大小变体分布的任何可能的变化。
TFF后的药物成His./His.HCl缓冲剂进行病毒过滤。通过加入在His.His.HCl缓冲剂中制备的1M山梨醇和50mM PEG 3350的液体储备溶液，配制浓度为约30mg/mL的所得病毒滤液，以分别得到终浓度为105.4mM和1.67mM。利用His./His.HCl缓冲剂将散装药物物质的终浓度调节为25mg/mL，并根据需要使用0.1N NaOH或0.1N HCl将pH调节至6.00±0.50。
每个步骤的大小变体数据表明药物物质到缺乏糖的缓冲液中的TFF对蛋白质不是有害的。
应当注意，术语“一个”实体是指该实体中的一个或多个；例如，“抗HER2抗体”理解为代表一种或多种抗HER2抗体。因此，术语“一个”(或“一个”)，“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。
在本说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和“包含”以非排他性的含义使用。
当指数值时，本文所用的术语“约”是指包括特定量在一些实施方案中±20％的变化，在一些实施方案中±10％的变化，在一些实施方案中±5％的变化，在一些实施方案中±1％的变化，在一些实施方案中为±0.5％的变化，在一些实施方案中为±0.1％的变化，因为这些变化适于进行所公开的方法或使用所公开的组合物。
所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物，专利申请，专利和其它参考文献被具体和单独地指明通过引用并入。应当理解，虽然本文中提及了许多专利申请，专利和其它参考文献，但是这样的参考文献不构成承认这些文献中的任何文献形成本领域的公知常识的一部分。
虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和示例相当详细地描述了前述主题，但是本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。
已经详细描述了本发明的优选实施例，应当理解，由上述段落定义的本发明不限于上述描述中阐述的特定细节，因为在不脱离本发明精神或范围的前提下，许多明显的变化是可能的。
序列表
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<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Trastuzumab heavy chain
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
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<211> 214
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Trastuzumab light chain
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
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210
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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<223> Trastuzumab HCDR2
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Gly
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<213> Artificial
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<223> Trastuzumab LCDR3
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Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5

Claims (26)

1.一种稳定的药物制剂，包括感兴趣的蛋白质，还包括山梨醇和聚乙二醇(PEG)，其中，山梨醇和蛋白质的摩尔比为550摩尔至700摩尔的山梨醇：1摩尔的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，山梨醇和蛋白质的摩尔比为600摩尔至660摩尔的山梨醇：1摩尔的蛋白质，优选为631摩尔的山梨醇：1摩尔的蛋白质。
3.根据前述任一项权利要求所述的制剂，其特征在于，PEG与蛋白质的摩尔比为2:1至50:1，优选为10:1。
4.根据前述任一项权利要求所述的制剂，其特征在于，所述蛋白质为抗体。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述抗体为抗-HER2抗体，优选为曲妥单抗。
6.根据前述任一项权利要求所述的制剂，其特征在于，所述PEG为PEG 3350。
7.根据前述任一项权利要求所述的制剂，其特征在于，进一步包括缓冲剂，该缓冲剂优选为包含组氨酸离子的组氨酸。
8.根据前述任一项权利要求所述的制剂，其特征在于，所述蛋白质的摩尔浓度为0.10mM至0.25mM。
9.根据前述任一项权利要求所述的制剂，其特征在于，山梨醇的摩尔浓度为90mM至120mM。
10.根据前述任一项权利要求所述的制剂，其特征在于，其为冻干或液体制剂。
11.一种制剂，其包含山梨醇、PEG 3350、蛋白质和缓冲剂，使得山梨醇与蛋白质的摩尔比为631:1，PEG 3350与蛋白质的摩尔比为10:1。
12.根据权利要求11所述的冻干制剂，该冻干制剂在2℃至8℃至少稳定4年。
13.用于制备稳定制剂的方法，包括以下步骤：
a)将山梨醇和蛋白质以550摩尔至700摩尔的山梨醇：1摩尔的蛋白质的摩尔比，以及将PEG和蛋白质以2～50:1的摩尔比进行混合；
b)冻干所述混合物；且可选择地
c)在稀释剂中复溶步骤(b)中冻干的混合物，以使所述蛋白质浓度为5mg/ml至50mg/ml。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述冻干混合物可以进一步包括填充剂。
15.用于制备稳定制剂的方法，包括以下步骤：
(a)将山梨醇与蛋白质以550摩尔至700摩尔山梨醇：1摩尔蛋白质的摩尔比进行混合；和
(b)将PEG加入步骤(a)的混合物中，其中PEG与蛋白质的摩尔比为2:1至50:1，优选为10:1；
(c)稀释上述混合物，以形成液体制剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其选择性地包括：利用碱性缓冲剂直接将辅料添加到蛋白质中，随后使整个制剂穿过膜，以将制剂中的最终蛋白质浓度维持在5mg/ml至50mg/ml。
17.一种药物试剂盒，包括：
(a)容纳蛋白质和山梨醇/PEG的冻干混合物的容器，其中山梨醇与蛋白质的摩尔比为550摩尔～700摩尔：1摩尔；和
(b)将PEG加入(a)的混合物中，其中PEG与蛋白质的摩尔比为2:1至50:1，优选为10:1；
(c)用稀释剂复溶所述冻干混合物的说明书。
18.根据权利要求17所述的药物试剂盒，进一步包括容纳稀释剂的第二容器。
19.根据权利要求18所述的药物试剂盒，其特征在于，所述稀释剂选自用于注射的无菌水和包含芳香醇的抑菌注射用水(BWFI)。
20.根据权利要求17所述的药物试剂盒，其特征在于，所述容器选自多次使用的小瓶和带有塞子可刺穿式注射器的小瓶。
21.根据权利要求1-12和17-20所述的制剂，其特征在于，所述冻干制剂在2℃至8℃至少稳定4年。
22.根据前述任一项权利要求所述的制剂，该制剂适于治疗选择性HER2过表达癌症的疾病或病症。
23.一种用于治疗患者的方法，包括向患有HER2过表达癌症，优选乳腺癌或胃癌，的受试者施用如权利要求1-12和17-21中任一项所述的制剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，该制剂通过静脉或肌内或皮下途径给药至患者，优选通过静脉途径给药。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，其间歇地以0.05mg/kg至10mg/kg蛋白质的剂量给药于患者，所述蛋白质优选为抗HER2抗体。
26.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，将抗HER2抗体，优选曲妥单抗，以8mg/kg的负荷剂量给药于患者，然后维持剂量为每3周4mg/kg。
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