TW201313739A - 抗表皮生長因子受體（ｅｇｆｒ）之抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示抗EGFR抗體、包含抗EGFR抗體之組合之治療組合物以及使用該等抗體及組合物治療EGFR相關病症(例如癌症)之方法。

Description

抗表皮生長因子受體(EGFR)之抗體及其用途 【相關申請案之交叉引用】
本申請案主張美國臨時申請案第61/504633號(2011年7月5日提交)及美國臨時申請案第61/558945號(2011年11月11日提交)之優先權的權益，該等美國臨時申請案皆以引用之方式併入本文。
本發明係關於抗表皮生長因子受體(EGFR)之抗體及其用途。
天然免疫系統已進化產生用於有效中和病原體之抗體。自免疫動物分離之天然抗體製劑為多株起源，且與個別抗體相比顯示免疫優勢，其限於特定抗原之一個或數個抗原決定基。抗腫瘤抗體能夠阻斷其結合之腫瘤細胞生長或殺死該等細胞，已開發為非常有效之癌症治療劑。抗腫瘤抗體之混合物可實現比藉由該混合物中之任何個別抗體所實現更大之腫瘤抑制作用。
該等結果已藉由組合兩種或兩種以上抗表皮生長因子受體EGFR(ErbB1)之中和抗體實現。已經證明與EGFR結合並抑制EGFR之抗體提供有用之抗癌益處且具有巨大醫療及商業價值。拮抗而非競爭性抗EGFR抗體對之特定組合引起EGFR下調，其比單獨應用任一抗體更快且更有效(Friedman等人(2005)PNAS 102：1915-1920)。兩種交叉競爭性(亦即，彼此競爭性地與抗原結合)抗EGFR抗體之組合已顯示為非協同性 的。複數個抗體與EGFR之不同抗原決定基結合有可能於細胞表面形成複合受體之點陣，導致比用靶向單一抗原決定基之抗體所獲得更有效的內化及降解。亦已報告特定抗EGFR受體抗體對之組合導致累加的及在一些情況下為協同性的活體內抗腫瘤活性(Perera等人(2005)Clin Cancer Res 11：6390-6399)。單株抗體806(針對突變體de2-7 EGFR而生成)與拮抗抗體528組合於神經膠瘤異種移植模型中顯示顯著高於用任一抗體單獨治療之抗腫瘤活性。協同抗腫瘤活性之機制顯示與EGFR快速下調相關，而該下調無法藉由用個別抗體治療來誘導。類似地，在另一對抗EGFR抗體西妥昔單抗(cetuximab)及EMD55900存在下EGFR磷酸化大大減少(Kamat等人(2008)Cancer Biol Ther 7：726-33)。
亦已顯示靶向相關受體ErbB2之抗體之某些組合協同起作用(Friedman等人(2005))。與帕妥珠單抗(pertuzumab)組合之曲妥珠單抗以個別抗體無效之劑量抑制BT474乳癌細胞之存活(Nahta等人(2004)Cancer Res 64：2343-2346)。在另一研究中，三種非競爭性抗ErbB2抗體組合使用時比個別地使用時顯示更有效活體外殺死BT474細胞，且於BT474活體內異種移植模型中獲得類似結果(Spiridon等人(2002)Clin Cancer Res 8：1699-701)。
已報告，有其他跡象表明組合多於一種抗體可增強腫瘤細胞上抗體之生長抑制(例如細胞毒性)作用。例 如，組合腫瘤抗原17-1A之單株抗體，研究腫瘤細胞溶解，且發現單株抗體以及競爭性抗體之組合無效，而兩種或兩種以上非競爭性抗體之組合引起完全腫瘤細胞溶解。
除組合抗體之外，藉由經由稱為親和力成熟之重組DNA技術增加重組表現之抗腫瘤抗體之抗原親合力亦已獲得較高的抗體效力。
因此，仍然需要用於產生抗腫瘤抗體作用以便增強腫瘤對抗EGFR抗體及抗體組合之反應性之其他途徑及方法，包括具有較高腫瘤親和力之抗EGFR抗體及該等高親和力抗EGFR抗體之組合，其增強信號傳導抑制且提供更有效之細胞抑制或細胞毒性抗腫瘤結果。
本文中提供與EGFR結合並抑制各種EGFR功能之新穎單株抗體。該等抗體提供有用之治療作用，且彼此組合或與其他抗ErbB受體抗體(例如其他抗EGFR抗體)組合時與各種抗體單獨投予相比能夠顯示協同或累加治療作用。該等抗體個別地投予或於本文中提供之組合中投予時可用於治療與EGFR介導之細胞信號傳導相關的各種病症(例如癌症)。因此，本文中亦提供顯示與EGFR結合及抑制各種EGFR功能之性質之分離的新穎單株抗體，以及顯示該等性質之該等抗體的組合。亦提供該等抗體用於診斷及治療目的之用途，並揭示本 文中之該等抗體及抗體組合之用途。
在一個實施例中，提供結合EGFR細胞外結構域且包含重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體，其中該等重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列選自由以下組成之群：(a)分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(b)分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；及(c)分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
在另一實施例中，提供與EGFR細胞外結構域結合且包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單株抗體，其中該等重鏈及輕鏈可變區序列選自由以下組成之群：(a)包含SEQ ID NO：19之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：20之輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：21之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：22之輕鏈可變區；及(c)包含SEQ ID NO：23之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：24之輕鏈可變區。
上述單株抗體可以例如優於100 nM、或優於10 nM、或優於1 nM、或優於100 pM、或優於10 pM、或優於1 pM之KD與EGFR結合。該等單株抗體可顯示一或多種本文中揭示之功能性質。該單株抗體可為例如人抗體。在其他實施例中，該抗體可為雙特異性抗體、免疫結合物、Fab、Fab’2、ScFv、affibody®、avimer、奈米體或結構域抗體。在其他實施例中，該單株抗體可為例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE同型抗體。
亦提供包含上述抗EGFR單株抗體之任一者或多者及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物。亦提供套組。該套組可包含例如於容器中之醫藥組合物。亦提供治療個體之癌症之方法，其包含投予該個體有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含上述抗EGFR單株抗體之任一者或多者。亦提供用於治療癌症(或用於製造供治療癌症之藥劑)之上述抗EGFR單株抗體或其組合。
在另一實施例中，提供包含兩種或三種與EGFR細胞外結構域結合之單株抗體之組合物，其中該兩種或三種單株抗體選自由以下組成之群：(a)包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；(b)包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗 體；及(c)包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；且其中該組合物包含(a)及(b)、(a)及(c)、(b)及(c)或(a)、(b)及(c)。
在又一實施例中，提供包含兩種或三種與EGFR細胞外結構域結合之單株抗體之組合物，其中該兩種或三種單株抗體選自由以下組成之群：(a)包含含有SEQ ID NO：19之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：20之輕鏈可變區之單株抗體；(b)包含含有SEQ ID NO：21之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：22之輕鏈可變區之單株抗體；及(c)包含含有SEQ ID NO：23之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：24之輕鏈可變區之單株抗體；且其中該組合物包含(a)及(b)、(a)及(c)、(b)及(c)或(a)、(b)及(c)。
於包含兩種或三種抗體之上述組合物中之單株抗體(a)、(b)及(c)各自可以例如優於100 nM、或優於10 nM或優於1 nM之KD與EGFR結合。單株抗體(a)、(b)及(c)各自可顯示本文中揭示之一或多種功能性質。單株抗體(a)、(b)及(c)各自可為例如人抗體。在其他實施例中，單株抗體(a)、(b)及(c)中之一或多者獨立地選自由雙特 異性抗體、免疫結合物、Fab、Fab’2、ScFv、affibody®、avimer、奈米體及結構域抗體組成之群。在其他實施例中，單株抗體(a)、(b)及(c)各自獨立地選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD及IgE同型抗體組成之群。單株抗體(a)、(b)及(c)亦可呈IgY及駱駝(camelid)抗體之形式。
亦提供包含含有兩種或三種抗EGFR單株抗體之上述組合物中之任一者及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物。亦提供套組。該套組可包含例如於容器中之醫藥組合物。亦提供治療個體之癌症之方法，其包含投予該個體有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含含有兩種或三種抗EGFR單株抗體之上述組合物中之任一者。亦提供用於治療癌症之包含兩種或三種抗-抗EGFR單株抗體之上述組合物(及其用於製造藥劑之用途)。
在另一實施例中，提供包含三種單株抗EGFR抗體之組合物，該組合物包含第一抗體、第二抗體及第三抗體，其中(i)該第一抗體包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(ii)該第二抗體包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；及(iii)該第三抗體包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、 17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且其中該等第一、第二及第三抗體以彼此2：2：1之莫耳比率存在。
在又一實施例中，提供包含三種單株抗EGFR抗體之組合物，該組合物包含第一抗體、第二抗體及第三抗體，其中(i)該第一抗體包含含有SEQ ID NO：19之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：20之輕鏈可變區；(ii)該第二抗體包含含有SEQ ID NO：21之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：22之輕鏈可變區；及(iii)該第三抗體包含含有SEQ ID NO：23之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：24之輕鏈可變區，且其中該等第一、第二及第三抗體以彼此2：2：1之莫耳比率存在。
於上述組合物中之第一、第二及第三抗體各自可以例如優於100 nM、或優於10 nM或優於1 nM之KD與EGFR結合。在另一實施例中，該第一抗體以1 x 10-9 M至1.1 x 10-11 M範圍內之KD與EGFR結合，該第二抗體以1 x 10-9 M至7.0 x 10-11 M範圍內之KD與EGFR結合，且該第三抗體以1 x 10-9 M至3.6 x 10-10 M範圍內之KD與EGFR結合。上述組合物中之第一、第二及第三抗體各自可顯示本文中揭示之一或多種功能性質。上述組合物中之第一、第二及第三抗體各自可為例如人抗體。在其他實施例中，該第一抗體、該第二抗體及該第三抗體中之一或多者獨立地選自由雙特異性抗體、免疫結合物、Fab、Fab’2、ScFv、affibody、avimer、奈米 體及結構域抗體組成之群。在其他實施例中，該第一抗體、該第二抗體及該第三抗體各自獨立地選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD及IgE同型抗體組成之群。
亦提供包含上述抗EGFR組合物中之任一者及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物，該等抗EGFR組合物包含2：2：1比率之第一抗體、第二抗體及第三抗體。在一個實施例中，該醫藥組合物為無菌組合物。在另一實施例中，該醫藥組合物適合於注射。在又一實施例中，該醫藥組合物為適合於靜脈內注射之無菌組合物。亦提供套組。該套組可包含例如於容器中之醫藥組合物。亦提供治療個體之癌症之方法，其包含投予該個體有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含含有2：2：1比率之第一、第二及第三抗體之上述抗EGFR組合物中之任一者。亦提供任何上述抗EGFR組合物用於製造供治療癌症之藥劑之用途，該等抗EGFR組合物包含2：2：1比率之第一、第二及第三抗體。
在另一實施例中，提供製備抗EGFR抗體組合物之方法，該方法包含於單一組合物中組合：(a)包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；(b)包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、 11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；及(c)包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；其中(a)、(b)及(c)以彼此2：2：1之莫耳比率組合。
在另一實施例中，提供製備抗EGFR抗體組合物之方法，該方法包含於單一組合物中組合：(a)包含含有SEQ ID NO：19之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：20之輕鏈可變區之單株抗體；(b)包含含有SEQ ID NO：21之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：22之輕鏈可變區之單株抗體；及(c)包含含有SEQ ID NO：23之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：24之輕鏈可變區之單株抗體；其中(a)、(b)及(c)以彼此2：2：1之莫耳比率組合。
在另一實施例中，提供用抗EGFR抗體治療個體之方法，該方法包含投予該個體：(a)包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；(b)包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗 體；及(c)包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；其中(a)、(b)及(c)以彼此2：2：1之莫耳比率投予該個體。
在另一實施例中，提供用抗EGFR抗體治療個體之方法，該方法包含投予該個體：(a)包含含有SEQ ID NO：19之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：20之輕鏈可變區之單株抗體；(b)包含含有SEQ ID NO：21之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：22之輕鏈可變區之單株抗體；及(c)包含含有SEQ ID NO：23之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：24之輕鏈可變區之單株抗體；其中(a)、(b)及(c)以彼此2：2：1之莫耳比率投予該個體。
本發明之其他特徵及優點將自以下實施方式及申請專利範圍變得顯而易見。
I.定義
術語「EGFR」、「ErbB1」及「EGF受體」在本文中可互換使用，係指人EGFR蛋白；參見UniProtKB/Swiss-Prot登錄號P00533。人EGFR細胞外 結構域(EGFR-ECD)之胺基酸序列展示於實例1及SEQ ID NO：33中。
如本文所用，術語「抑制」係指生物活性之任何統計學顯著降低，包括活性之完全阻斷。例如，「抑制」可指生物活性之約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或約100%之統計學顯著降低。
如本文所用，抑制磷酸化係指相對於不存在抗體下之信號傳導(對照)，抗體統計學上顯著降低受質蛋白之磷酸化的能力。如此項技術中已知，細胞內信號傳導路徑包括例如磷酸肌醇3’-激酶/Akt(PI3K/Akt/PTEN或「AKT」)及/或有絲分裂原活化之蛋白激酶(MAPK/ERK或「ERK」)路徑。如此項技術中亦已知，EGFR介導之信號傳導可藉由分析該受質之磷酸化程度來量測(例如AKT及/或ERK之磷酸化或無磷酸化)。因此，在一個實施例中，抗EGFR抗體組合及組合物提供AKT及ERK中任一者或兩者之磷酸化程度之統計學顯著抑制，相對於不存在該抗體下之AKT及/或ERK磷酸化程度(對照)為至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。該EGFR介導之信號傳導可使用此項技術中認可之技術來量測，該等技術量測涉及EGFR的細胞級聯中之蛋白，例如ELISA、西方(western)或多重方法，諸如Luminex®。
如本文所用，片語「抑制表現EGFR之細胞之生長」係指於活體內或活體外，相對於不存在抗體下之細胞生長，抗體統計學上顯著降低表現EGFR之細胞之生長的能力。在一個實施例中，當表現EGFR之細胞(例如癌細胞)與本文中揭示之抗體組合物或組合接觸時，相對於不存在該抗體組合物或組合下量測之生長(對照)，該等細胞之生長可降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。細胞生長可使用此項技術中認可之技術來分析，該等技術量測細胞分裂之速率、細胞群體內進行細胞分裂之細胞的分率，及/或由於末端分化或細胞死亡自細胞群體損失細胞之速率(例如使用細胞力價輝光分析(cell titer glow assay)或胸苷併入法)。
如本文所用，片語「抑制與EGFR結合之EGFR配位體」係指相對於不存在抗體下之EGFR配位體結合(對照)，抗體統計學上顯著降低EGFR配位體與其受體EGFR結合之能力。此意謂相對於對照(無抗體)，在抗體存在下與EGFR結合之EGFR配位體之量在統計學上顯著降低。在本文中揭示之抗體組合物或組合存在下，結合EGFR之EGFR配位體之量相對於不存在該抗體下之量(對照)可降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。EGFR 配位體結合之降低可使用此項技術中認可之技術來量測，該等技術量測存在或不存在(對照)抗體下經標記之EGFR配位體(例如放射性標記之EGF或放射性標記之β細胞素)的結合程度。
如本文所用，片語「抑制EGFR二聚」係指相對於不存在抗體下之EGFR二聚(對照)，抗體統計學上顯著降低EGFR二聚(與另一ErbB受體配對以形成同質二聚體(例如ErbB1/ErbB1配對)或異質二聚體(例如ErbB1/ErbB3配對))之能力。在一個實施例中，當表現EGFR之細胞與本文中揭示之抗體組合物或組合接觸時，相對於不存在抗體下量測之EGFR二聚(對照)，EGFR二聚可降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。EGFR二聚之降低可使用此項技術中認可之技術來量測，該等技術量測存在或不存在(對照)抗體下之EGFR二聚程度。
如本文所用，片語「下調EGFR表現」係指相對於不存在抗體下之EGFR表現(對照)，抗體統計學上顯著降低細胞表面上之EGFR表現之能力，例如，藉由增加EGFR之內化及/或藉由減少來自細胞內囊泡之EGFR的再循環來降低細胞表面上之EGFR表現。在一個實施例中，當表現EGFR之細胞與本文中提供之抗體組合物或組合接觸時，相對於不存在抗體下量測之於細胞表面上之EGFR表現(對照)，EGFR表現可降低至少10%、 或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。細胞表面上EGFR表現之下調包括例如該受體之內化/再循環增加及/或該受體之內化/降解增加。EGFR內化之增加可使用此項技術中認可之技術來量測，該等技術量測存在或不存在(對照)抗體下之EGFR內化程度。
關於EGFR抗體之組合(本文中描述)，如本文所用之措詞「累加」或「相加性」係指兩種或兩種以上抗體之活性，其中其組合活性(相對於特定功能，例如細胞生長之抑制)等於其個別活性之和。亦即，當個別地對表現EGFR之細胞起作用時，本文中提供之兩種或兩種以上抗體之活性之和大致等於該等抗體一起對相同細胞起作用之組合效應。在一個實施例中，對於任何上述性質(例如，抑制AKT或ERK磷酸化、抑制表現EGFR之細胞之生長等)量測累加效應。
如本文所用，措詞「協同」或「協同的」係指兩種或兩種以上抗體之活性，其中其組合活性(相對於特定功能，例如細胞生長之抑制)大於其個別活性之預期累加效應。例如，預期累加效應可根據Bliss獨立性準則(Bliss independence criteria)定義。根據該Bliss準則，兩種或兩種以上藥物(例如抗體)之效應等於該等個別藥物之效應之和減去該等個別藥物之效應之相乘：E12=E1+E2-E1*E2
其中E1為藥物1之抑制%，E2為藥物2之抑制%，E12為該組合之預期抑制%。
協同效應可適用於本文中論述之任何性質(例如，抑制EGFR依賴性AKT或ERK磷酸化，抑制表現EGFR之細胞之生長等)。在一特定實施例中，相對於抗體之個別活性之累加效應，組合抗體之活性增加至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或更高。
術語「抗體」或「免疫球蛋白」在本文中可互換使用，包括完整抗體及任何抗原結合片段(抗原結合部分)或其單鏈同源物。「抗體」包含至少一個重(H)鏈及一個輕(L)鏈。在天然存在之IgG中，例如，該等重鏈及輕鏈藉由二硫鍵互連且存在兩個配對重鏈及輕鏈，該兩對亦藉由二硫鍵互連。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域，即CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域，即CL。VH及VL區可進一步再分成高變區(稱為互補決定區(CDR))，散佈有更保守之區域，稱為構架區(FR)或連接(J)區(重鏈及輕鏈中分別為JH或JL)。各VH及VL由三個CDR、三個FR及一個J結構域構成，該等區域依以下順序自胺基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 J。重鏈及輕鏈之可變區與抗原結合。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，該等宿主組織或因子包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)或體液因子，諸如古典補體系統之第一組分(Clq)。因此，保持與抗原(例如EGFR)特異性結合之能力之抗體的一或多個片段可用於本文中揭示之組合中。已顯示，全長抗體之片段可執行抗體之抗原結合功能。表示為抗體之抗原結合部分或片段之結合片段之實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區之二硫橋鍵連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；(v)包括VH及VL結構域之dAb；(vi)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341,544-546)，其由VH結構域組成；(vii)由VH或VL結構域組成之dAb；及(viii)分離之互補決定區(CDR)；或(ix)兩種或兩種以上分離之CDR之組合，該等CDR可視情況藉由合成連接子連接。此外，雖然Fv片段之兩個結構域(VL及VH)藉由單獨基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接子連接，該合成連接子使其能夠作為單一蛋白鏈製得，在該單一蛋白鏈中VL及VH區配對以形成單價分子(免疫球蛋白片段之此單鏈同源物稱為單鏈Fv(scFv))。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語「抗體」內。抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲 得，且該等片段經篩選以與完整抗體相同之一般方式應用。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由完整免疫球蛋白之酶促或化學裂解製造。
如本文所用，術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群體獲得之抗體，亦即，構成該群體之個別抗體除可以微量存在之可能天然存在的突變之外為相同的。如本文所用之術語「單株抗體」亦涵蓋該等免疫球蛋白之抗原結合片段(包括scFv)。單株抗體具有高度特異性，其針對單一抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑形成對比，各單株抗體針對抗原上之單一決定子。單株抗體可使用任何此項技術中認可之技術及本文中描述之技術，例如融合瘤方法、轉殖基因動物、重組DNA方法(參見，例如美國專利第4,816,567號)來製備，或使用噬菌體抗體文庫使用描述於例如美國專利第7,388,088號及美國專利申請案第09/856,907號(PCT國際公開案第WO 00/31246號)中之技術來製備。單株抗體包括嵌合抗體、人抗體及人類化抗體且可天然存在或重組產生。
術語「重組抗體」係指藉由重組方法製備、表現、產生或分離之抗體，諸如(a)自針對免疫球蛋白基因(例如人免疫球蛋白基因)轉殖基因或轉染色體之動物(例如小鼠)或由此製備之融合瘤分離之抗體，(b)自經轉型以表現抗體之宿主細胞(例如自轉染瘤)分離之抗體， (c)自使用噬菌體呈現之重組、組合抗體文庫(例如含有人抗體序列)分離之抗體，及(d)藉由任何其他方法製備、表現、產生或分離之抗體，該等方法涉及將免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因)剪接至其他DNA序列。該等重組抗體可具有源自人生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。然而，在某些實施例中，該等重組人抗體可經受活體外突變誘發且因此該等重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為雖然源自人生殖系VH及VL序列且與該等序列相關但活體內可能不天然存在於人抗體生殖系譜系內之序列。
術語「嵌合免疫球蛋白」或抗體係指可變區源自第一物種且恆定區源自第二物種之免疫球蛋白或抗體。嵌合免疫球蛋白或抗體可例如藉由基因工程改造自歸屬於不同物種之免疫球蛋白基因區段構建。
如本文所用，術語「人抗體」意欲包括具有可變區之抗體，其中構架區及CDR區皆源自例如由Kabat等人(參見Kabat等人(1991)Sequences of proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)所述之人生殖系免疫球蛋白序列。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦源自人生殖系免疫球蛋白序列。人抗體可包括不由人生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，如本文 所用，術語「人抗體」意欲不包括其中CDR序列源自已移植於人構架序列上之另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系之抗體。
人抗體可具有至少一或多個胺基酸經胺基酸殘基(例如不由人生殖系免疫球蛋白序列編碼之活性增強之胺基酸殘基)置換。通常，人抗體可具有至多二十個位置經不為人生殖系免疫球蛋白序列之部分的胺基酸殘基置換。在一特定實施例中，該等置換在如下文詳細描述之CDR區內。
術語「人類化抗體」係指包括至少一個人類化抗體鏈(亦即，至少一個人類化輕鏈或重鏈)之抗體。術語「人類化抗體鏈」(亦即「人類化免疫球蛋白輕鏈」)係指如下抗體鏈(亦即分別為輕鏈或重鏈)，其具有包括實質上來自人抗體之可變構架區及實質上來自非人抗體之互補決定區(CDR)(例如，至少一個CDR、兩個CDR或三個CDR)且進一步包括恆定區(例如，就輕鏈而言，為一個恆定區或其部分，且就重鏈而言，較佳為三個恆定區)之可變區。
如本文所用，「分離」意欲指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體之抗體或兩種、三種或四種抗體之組合(例如，抗體ca、cf及ch(各與EGFR特異性結合)之分離之組合物實質上不含特異性結合除EGFR外的抗原之抗體)。此外，分離之抗體通常實質上不含其他細胞材料及/或化學物。在一個實施例中，具有不 同EGFR結合特異性之「分離」之單株抗體之組合於定義明確之組合物中組合。
如本文所用，「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體種類(例如IgM或IgG1)。在一些實施例中，本文中提供之單株抗體組合物僅包含IgG1同型之抗體。在其他實施例中，本文中提供之單株抗體組合物僅包含IgG2同型之抗體。在其他實施例中，本文中提供之單株抗體組合物包含兩種或三種不同同型之抗體。
「抗原」為抗體所結合之實體(例如蛋白實體或肽)。在多個實施例中，抗原為EGF。在一特定實施例中，抗原為人EGFR。
因此，本發明亦涵蓋結合於EGFR上之抗原決定基之抗體之組合，該EGFR包含由本文中描述之組合中之特定抗體識別之所有或一部分抗原決定基。在另一實施例中，提供之抗體與本文中描述之抗體競爭結合EGFR。競爭性抗體及識別相同或重疊抗原決定基之抗體可使用常規技術，諸如免疫分析，例如藉由顯示一種抗體阻斷另一抗體與標靶抗原之結合之能力(亦即競爭性結合分析)來鑒別。競爭性結合可使用諸如描述於以下實例中之分析來測定。
術語「特異性結合(specific binding/specifically binds)」及「選擇性結合(selective binding/selectively binds)」表示抗體顯示對特定抗原或抗原決定基的明顯親和力，且一般不顯示與其他抗原及抗原決定基之顯著 交叉反應性。「明顯」或較佳之結合包括以106、107、108、109或1010M-1或更佳之KD結合。抗體抗原相互作用之KD(親和力常數)表示使50%抗體及抗原分子結合於一起之抗體濃度。因此，於合適之固定抗原濃度下，50%之較高(亦即較強)親和力抗體將以低於獲得與較低親和力抗體相同之結合百分比所需之抗體濃度結合抗原分子。因此，較低KD值表示較高(較強)之親和力。如本文所用，「較佳」親和力為較強之親和力，且具有低於其比較物之數值，其中107M-1之KD具有較低數值且因此表示優於106M-1之KD之親和力。優於(亦即，具有較低KD值且因此較強)107M-1、較佳優於108M-1之親和力一般為較佳的。亦涵蓋本文中陳述之彼等數值之中間值，且較佳結合親和力可表示為親和力之範圍，例如對於本文中揭示之抗EGFR抗體，較佳結合親和力為106至1012 M-1，較佳107至1012 M-1，更佳108至1012 M-1。「不顯示顯著交叉反應性」之抗體為不與標靶外抗原(例如非EGFR蛋白)明顯結合之抗體。例如，在一個實施例中，與EGFR特異性結合之抗體將對EGFR顯示優於對除ErbB1(EGFR)外之ErbB分子或對非ErbB蛋白或肽至少兩個且較佳三個、或四個或更多數量級之結合親和力(亦即，顯示低兩個、三個或四個或更多數量級之KD值之結合)。特異性或選擇性結合可根據用於測定該結合之任何此項技術中認可之方法，包括例如根據如本文所述之Scatchard分析及/或競 爭性(競爭)結合分析來測定。
如本文所用，術語「KD」意欲指特定抗體-抗原相互作用之解離平衡常數或抗體對抗原之親和力。在一個實施例中，本文中提供之抗體以100 nM或更佳(亦即或更小)之親和力(KD)(例如90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、5 nM、1 nM或更小)結合抗原(例如EGFR)，如使用表面電漿子共振分析、細胞結合分析或平衡透析分析所量測。在一特定實施例中，抗體以8 nM或更佳(例如7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、2 nM、1.5 nM、1.4 nM、1.3 nM、1.2 nM、1.1 nM、1 nM或更低)之親和力(如由解離常數KD表示)結合EGFR，如藉由表面電漿子共振分析或細胞結合分析所量測。在其他實施例中，當使用重組EGFR作為分析物且抗體作為配位體於BIACORE 3000儀器中藉由表面電漿子共振(SPR)技術測定時，抗體以約小於10-7 M，諸如約小於10-8 M、10-9 M或10-10 M或甚至更低之親和力(KD)結合抗原(例如EGFR)，且與該預定抗原結合之親和力為其與除該預定抗原或密切相關之抗原外之非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)結合之親和力的至少兩倍。用於測定KD之其他方法包括經由流動式細胞測量術(FACS)或於溶液中使用KinExA®技術測定與表現EGFR之活細胞之平衡結合。
如本文所用，術語「Koff」意欲指抗體自抗體/抗原複合物解離之解離速率常數。
如本文所用，術語「IC50」及「IC90」係指化合物(例如抗EGFR抗體)分別抑制50%及90%之生物學或生物化學功能(例如EGFR之功能或活性)之有效性之量度。例如，IC50表示抑制一半之EGFR活性(例如表現EGFR之細胞之生長)需要多少抗EGFR抗體。亦即，其為抗EGFR抗體之半數最大(50%)抑制濃度(IC)(50%IC或IC50)。根據FDA，IC50表示活體外50%抑制所需之藥物濃度。IC50及IC90可藉由此項技術中已知之技術，例如藉由構建劑量反應曲線且研究不同濃度之拮抗劑(亦即抗EGFR抗體)對逆轉EGFR活性之作用來測定。
如本文所用，「糖基化模式」係定義為與蛋白質、更特定言之與免疫球蛋白共價連接之碳水化合物單元之模式。
如本文所用，術語「核酸分子」意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但較佳為雙鏈DNA。
如本文關於編碼抗體或抗體片段(例如VH、VL、CDR3)之核酸所用，術語「分離之核酸分子」意欲指核苷酸序列基本上不含其他基因組核苷酸序列(例如編碼結合除EGFR外之抗原之抗體的序列)之核酸分子，該等其他序列可天然地側接人基因組DNA中之核酸。
如本文所用，術語「修飾(modifying/modification)」意欲指改變於抗體或其抗原結合部分中之一或多個胺 基酸。該改變可藉由於一或多個位置添加、取代或缺失胺基酸而產生。該改變可使用已知技術，諸如PCR突變誘發而產生。例如，在一些實施例中，可修飾使用本文中提供之方法鑒別之抗體或其抗原結合部分，從而改變該抗體或其抗原結合部分與EGFR之結合親和力。
提供於抗體序列中之「保守胺基酸取代」，亦即核苷酸及胺基酸序列修飾不會消除由該核苷酸序列編碼或含有該胺基酸序列之抗體與抗原(亦即EGFR)之結合。保守胺基酸取代包括一類胺基酸由同一類胺基酸取代，其中種類藉由於自然界中發現之同源蛋白中之常見物理化學胺基酸側鏈性質及高取代頻率(例如，如藉由標準Dayhoff頻率交換矩陣或BLOSUM矩陣所測定)定義。胺基酸側鏈已分類為六個一般種類且包括：I類(Cys)；II類(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III類(Asn、Asp、Gln、Glu)；IV類(His、Arg、Lys)；V類(Ile、Leu、Val、Met)；及VI類(Phe、Tyr、Trp)。例如，用Asp取代諸如Asn、Gln或Glu之另一III類殘基為保守取代。因此，抗EGFR抗體中之預期非必需胺基酸殘基較佳經來自相同種類之另一胺基酸殘基置換。鑒別不消除抗原結合之核苷酸及胺基酸保守取代之方法為此項技術中熟知的。
術語「非保守胺基酸取代」係指用來自另一種類之胺基酸取代一個種類之胺基酸；例如，用諸如Asp、Asn、Glu或Gln之III類殘基取代II類殘基Ala。
或者，在另一實施例中，可沿抗EGFR抗體編碼序列之全部或部分，諸如藉由飽和突變誘發隨機引入突變(保守或非保守)，且所得經修飾之抗EGFR抗體可針對結合活性進行篩選。
「一致序列」為由相關序列家族中最常出現之胺基酸(或核苷酸)形成之序列。在蛋白質家族中，一致序列中之各位置由該家族中最常出現於該位置之胺基酸佔據。若兩個胺基酸同等頻繁地出現，則一致序列中可包括任一者。免疫球蛋白之「一致構架」係指一致免疫球蛋白序列中之構架區。類似地，關於CDR之一致序列可藉由本文中提供之EGFR抗體之CDR胺基酸序列之最佳比對獲得。
對於核酸，術語「實質同源」表示兩種核酸(或其指定序列)當最佳地比對及比較時於至少約80%之核苷酸、通常至少約90%至95%且更佳地至少約98%至99.5%之核苷酸中為相同的，具有適當核苷酸插入或缺失。或者，當區段將在選擇性雜交條件下與該鏈之互補鏈雜交時，存在實質同源。
核酸可以完整細胞、細胞溶解物或部分純化或實質上純化之形式存在。當藉由標準技術(包括鹼性/SDS處理、CsCl梯度離心(CsCl banding)、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術)自其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)純化時，核酸為「分離的」或「變得實質上純的」。
來自cDNA、基因組或其混合物之核酸組合物雖然經常包含天然序列(除經修飾之限制位點及其類似位點之外)，但或者可根據標準技術發生突變以提供改變之基因序列。對於編碼序列，該等突變必要時可修飾經編碼之胺基酸序列。特定言之，涵蓋與本文中描述之天然V、D、J、恆定、轉換序列及其他該等序列實質上同源之DNA序列。
術語「可操作地連接」係指使核酸序列與另一核酸序列呈某一功能關係。例如，若用於前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其可操作地連接至用於多肽之DNA；若啟動子或增強子影響序列轉錄，則其可操作地連接至編碼序列；或若核糖體結合位點經定位以便於翻譯，則其可操作地連接至編碼序列。一般，「可操作地連接」意謂連接之DNA序列為鄰近的，且就分泌前導序列而言，為鄰近的且處於閱讀相中。然而，增強子不必為鄰近的。連接藉由於適宜之限制位點接合來實現。若該等位點不存在，則根據習知實踐使用合成寡核苷酸轉接子或連接子。當核酸與另一核酸序列呈某一功能關係時，其「經可操作地連接」。例如，若啟動子或增強子影響序列轉錄，則其可操作地連接至編碼序列。對於轉錄調控序列，可操作地連接意謂連接之DNA序列為鄰近的，且有必要連接兩個蛋白編碼區時，為鄰近的且處於閱讀框中。對於轉換序列，可操作地連接表示該等序列能夠影響轉換重組。
如本文所用，術語「載體」意欲指能夠轉運已連接之另一核酸之核酸分子。一種類型之載體為「質體」，其係指其中可接合額外DNA區段之環狀雙鏈DNA環。另一類型之載體為病毒載體，其中額外DNA區段可接合至病毒基因組中。某些載體能夠於引入該等載體之宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起源之細菌載體及游離基因組哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離基因組哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因組中，且由此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其可操作地連接之基因之表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡單地稱為「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體經常呈質體形式。術語「質體」及「載體」可互換使用。然而，亦涵蓋起相等作用之其他形式之表現載體，諸如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文所用，術語「重組宿主細胞」(或簡單地稱為「宿主細胞」)意欲指已引入重組表現載體之細胞。應理解該等術語意欲不僅指特定個體細胞，而且指該細胞之子代。因為某些修飾可由於突變或環境影響而出現於後代中，故該子代實際上可不與親本細胞相同，但仍包括在如本文所用之術語「宿主細胞」的範疇內。
如本文所用，術語「治療(treat/treating/treatment)」係指本文中描述之治療或預防措施。「治療」方法採用 將本文中揭示之抗體或抗體對或三元組合抗體投予個體，例如患有與EGFR依賴性信號傳導相關之疾病或病症或易患有該疾病或病症之個體，以預防、治癒、延遲該疾病或病症或復發疾病或病症、降低其嚴重程度或改善其一或多種症狀，或延長個體存活使其超過不存在該治療下之預期存活。
如本文所用，術語「與EGFR依賴性信號傳導相關之疾病」或「與EGFR依賴性信號傳導相關之病症」包括與發現EGFR程度增加及/或涉及EGFR之細胞級聯活化之疾病狀態相關之疾病狀態及/或症狀。術語「與EGFR依賴性信號傳導相關之疾病」亦包括與替代EGFR信號傳導路徑之活化相關之疾病狀態及/或症狀。一般而言，術語「與EGFR依賴性信號傳導相關之疾病」係指任何病症，其發作、進展或症狀持續需要EGFR之參與。例示性EGFR介導之病症包括(但不限於)例如癌症。
術語「癌症」及「癌(cancerous)」係指或描述哺乳動物中之生理學病狀，其特徵通常為未調節之細胞生長。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、胰臟癌、神經膠質細胞腫瘤(諸如神經膠母細胞瘤及神經纖維瘤)、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、黑色素瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、 唾液腺癌、腎癌(kidney cancer/renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌及各種類型之頭頸部癌。在一特定實施例中，使用本文中揭示之方法治療或診斷之癌症選自黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、腎癌、胃腸/結腸癌、肺癌及前列腺癌。
如本文所用，術語「有效量」係指結合EGFR之抗體或其抗原結合部分之量，該量當投予個體時足以影響如本文所述之與EGFR依賴性信號傳導相關之疾病之治療、預後或診斷。當單獨或組合使用時，本文中提供之抗體之治療有效量將視該等抗體及組合之相對活性(例如抑制細胞生長)而變化，且視治療之個體及疾病病狀、個體之重量及年齡、疾病病狀之嚴重程度、投藥方式及其類似因素而變化，其可由一般技術者容易地確定。用於投藥之劑量可在以下範圍內：例如約1 ng至約10,000 mg、約5 ng至約9,500 mg、約10 ng至約9,000 mg、約20 ng至約8,500 mg、約30 ng至約7,500 mg、約40 ng至約7,000 mg、約50 ng至約6,500 mg、約100 ng至約6,000 mg、約200 ng至約5,500 mg、約300 ng至約5,000 mg、約400 ng至約4,500 mg、約500 ng至約4,000 mg、約1 μg至約3,500 mg、約5 μg至約3,000 mg、約10 μg至約2,600 mg、約20 μg至約2,575 mg、約30 μg至約2,550 mg、約40 μg至約2,500 mg、約50 μg至約2,475 mg、約100 μg至約2,450 mg、約200 μg至約2,425 mg、約300 μg至約2,000、約400 μg至約 1,175 mg、約500 μg至約1,150 mg、約0.5 mg至約1,125 mg、約1 mg至約1,100 mg、約1.25 mg至約1,075 mg、約1.5 mg至約1,050 mg、約2.0 mg至約1,025 mg、約2.5 mg至約1,000 mg、約3.0 mg至約975 mg、約3.5 mg至約950 mg、約4.0 mg至約925 mg、約4.5 mg至約900 mg、約5 mg至約875 mg、約10 mg至約850 mg、約20 mg至約825 mg、約30 mg至約800 mg、約40 mg至約775 mg、約50 mg至約750 mg、約100 mg至約725 mg、約200 mg至約700 mg、約300 mg至約675 mg、約400 mg至約650 mg、約500 mg或約525 mg至約625 mg抗體。可調整給藥方案以提供最佳治療反應。有效量亦為如下量，其中抗體之任何毒性或有害作用(亦即副作用)減至最少及/或由有利效應超過。
術語「治療劑」意欲涵蓋具有以下能力之任何及所有化合物：降低或抑制疾病或病症之症狀之嚴重程度，或增加疾病或病症中無症狀或症狀減輕階段之頻率及/或持續時間，或抑制或預防由疾病或病症痛苦所致之損傷或失能，或抑制或延遲疾病或病症之進展，或抑制或延遲疾病或病症之發作，或抑制或預防傳染性疾病或病症中之感染。治療劑之非限制性實例包括小有機分子、單株抗體、雙特異性抗體、重組工程改造之生物製品、RNAi化合物、酪胺酸激酶抑制劑及商業抗體。在某些實施例中，酪胺酸激酶抑制劑包括例如埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)及拉帕替尼(lapatinib) 中之一或多者，其為目前市面上之藥物。市售醫藥抗EGFR抗體包括西妥昔單抗及帕尼單抗(panitumumab)。其他藥物抗EGFR抗體包括紮魯木單抗(zalutumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)及馬妥珠單抗(matuzumab)，其處於開發中。
術語「患者」包括接受預防或治療性治療之人及其他哺乳動物個體。
術語「個體」包括任何哺乳動物，例如靈長類動物。例如，本文中揭示之方法及組合物可用於治療患有癌症之個體。在一特定實施例中，個體為人。
術語「樣品」係指取自患者或個體之組織、體液或細胞(或前述任何物質之小部分)。通常，該組織或細胞將自患者移出，但亦涵蓋活體內診斷。在實體腫瘤之情況下，組織樣品可取自外科手術移除之腫瘤且準備藉由習知技術加以測試。在淋巴瘤及白血病之情況下，可獲得淋巴細胞、白血病細胞或淋巴組織(例如來自血液之白血病細胞)且適當地進行準備。其他樣品，包括尿、眼淚、血清、血漿、腦脊髓液、糞便、痰、細胞提取物等亦可用於特定癌症。
本發明之多個態樣更詳細地描述於以下各小節中。
II.抗EGFR抗體及其組合
本文中揭示新穎抗EGFR單株抗體，包括實例中稱為P1X、P2X及P3X之三種單株抗體。P1X、P2X及P3X單株抗體為PCT申請案第PCT/US2011/35238號中 揭示之分別稱為ca、cd及ch之親本抗體之親和力成熟抗體。該等親本及親和力成熟抗體之CDR胺基酸序列展示如下，其中親和力成熟抗體中改變之胺基酸加粗且加下劃線：
關於P1X之全長VH及VL胺基序列分別於SEQ ID NO：19及20中展示。關於P2X之全長VH及VL胺基序列分別於SEQ ID NO：21及22中展示。關於P3X之全長VH及VL胺基序列分別於SEQ ID NO：23及24中展示。另外，本文中提供之VH及VL CDR區段例如依CDR1、CDR2及CDR3之胺基至羧基端順序排列。
在一個實施例中，提供結合EGFR細胞外結構域且包含重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體，其中該等重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列選自由以下組成之群：(a)分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(b)分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；及(c)分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
在另一實施例中，提供與EGFR細胞外結構域結合 且包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單株抗體，其中該等重鏈及輕鏈可變區序列選自由以下組成之群：(a)包含SEQ ID NO：19之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：20之輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：21之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：22之輕鏈可變區；及(c)包含SEQ ID NO：23之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：24之輕鏈可變區。
亦提供上述抗EGFR抗體之組合。該等組合可含有例如上述抗EGFR抗體中兩者之任何組合。另一組合可包含上述抗EGFR抗體中之所有三者。因此，在另一態樣中，提供包含兩種或三種與EGFR細胞外結構域結合之單株抗體之組合物，其中該兩種或三種單株抗體選自由以下組成之群：(a)包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；(b)包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；及(c)包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗 體；且其中該組合物包含(a)及(b)、(a)及(c)、(b)及(c)或(a)、(b)及(c)。
在又一實施例中，提供包含兩種或三種與EGFR細胞外結構域結合之單株抗體之組合物，其中該兩種或三種單株抗體選自由以下組成之群：(a)包含含有SEQ ID NO：19之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：20之輕鏈可變區之單株抗體；(b)包含含有SEQ ID NO：21之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：22之輕鏈可變區之單株抗體；及(c)包含含有SEQ ID NO：23之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：24之輕鏈可變區之單株抗體；且其中該組合物包含(a)及(b)、(a)及(c)、(b)及(c)或(a)、(b)及(c)。
本文中揭示之抗EGFR抗體(無論作為單一抗體或於抗體之組合中)可以例如優於100 nM、或優於10 nM或優於1 nM之KD與EGFR結合。如本文中關於KD所用，術語「優於___nM」意謂抗體具有低於指示之數字之KD(表示為奈莫耳濃度)。例如，「優於」100 nM之KD表示KD之值低於100 nM(例如為50 nM)。
在其他實施例中，P1X相關抗體，諸如包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之抗體，或包含分別為SEQ ID NO： 19及20之VH及VL序列之抗體，可以約1 x 10-9 M至1.1 x 10-11 M或優於1.1 x 10-11 M範圍內之KD與EGFR結合。
在其他實施例中，P2X相關抗體，諸如包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之抗體，或包含分別為SEQ ID NO：21及22之VH及VL序列之抗體，可以約1 x 10-9 M至7.0 x 10-11 M或優於7.0 x 10-11 M範圍內之KD與EGFR結合。
在其他實施例中，P3X相關抗體，諸如包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之抗體，或包含分別為SEQ ID NO：23及24之VH及VL序列之抗體，可以約1 x 10-9 M至3.6 x 10-10 M或優於3.6 x 10-10 M範圍內之KD與EGFR結合。
本文中揭示之抗EGFR抗體(無論作為單一抗體或於抗體之組合中)可顯示如本文中揭示之一或多種其他功能性質，包括(但不限於)：(a)抑制AKT或ERK磷酸化，例如EGFR依賴性AKT或ERK磷酸化，如基於細胞之分析中所量測；(b)抑制表現EGFR之細胞之生長；(c)抑制EGF配位體與EGFR之結合(例如，抑制 結合EGFR之一或多種配位體之結合，該等配位體包括EGF、肝素結合EGF樣生長因子(HB-EGF)、轉化生長因子(TGF)、epigen、表皮調節素(epiregulin)、β細胞素或兩性調節蛋白(amphiregulin))；(d)抑制EGFR二聚；(e)下調細胞表面上之EGFR(例如，藉由該受體之內化及再循環，及/或該受體之內化及降解)；(f)抑制活體外腫瘤細胞增殖；及/或(g)抑制活體內腫瘤生長。
本文中揭示之抗體包括抗體之所有已知形式及具有抗體樣性質之其他蛋白骨架。例如，該抗體可為人抗體、人類化抗體、雙特異性抗體、免疫結合物、嵌合抗體或具有抗體樣性質之蛋白骨架，諸如纖連蛋白或錨蛋白重複序列。該抗體亦可為Fab、Fab’2、ScFv、affibody®、avimer、奈米體或結構域抗體。該抗體亦可具有任何同型，包括任何以下同型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD及IgE。IgG抗體為較佳的。全長抗體可使用標準重組DNA技術及編碼欲與可變區序列可操作地連接之所需恆定區序列之核酸自VH及VL序列製備。合適之恆定區序列之非限制性實例包括SEQ ID NO：25中揭示之κ輕鏈恆定區及SEQ ID NO：26中揭示之IgG1重鏈恆定區。
如實例中所揭示，已發現當以2：2：1之P1X：P2X：P3X莫耳比率使用時，P1X+P2X+P3X抗體 之三元組合為特別有效的。因此，對於該三元抗體組合，總濃度之40%經選擇為P1X，總濃度之40%經選擇為P2X且總濃度之20%經選擇為P3X。
因此，在另一實施例中，提供包含三種單株抗EGFR抗體之組合物，該組合物包含第一抗體、第二抗體及第三抗體，其中(i)該第一抗體包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(ii)該第二抗體包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；及(iii)該第三抗體包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且其中該等第一、第二及第三抗體以彼此2：2：1之莫耳比率存在。
在又一實施例中，提供包含三種單株抗EGFR抗體之組合物，該組合物包含第一抗體、第二抗體及第三抗體，其中(i)該第一抗體包含含有SEQ ID NO：19之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：20之輕鏈可變區；(ii)該第二抗體包含含有SEQ ID NO：21之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：22之輕鏈可變區；及(iii)該第三抗體包含含有SEQ ID NO：23之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：24之輕鏈可變區，且其中該等第一、第二及第三抗體以彼此 2：2：1之莫耳比率存在。
提供製備包含三種抗體之抗EGFR抗體組合物之方法，其中該等抗體以2：2：1比率製備。更特定言之，在另一實施例中，提供製備抗EGFR抗體組合物之方法，該方法包含於單一組合物中組合：(a)包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；(b)包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；及(c)包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；其中(a)、(b)及(c)以彼此2：2：1之莫耳比率組合。
在另一實施例中，提供製備抗EGFR抗體組合物之方法，該方法包含於單一組合物中組合：(a)包含含有SEQ ID NO：19之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：20之輕鏈可變區之單株抗體；(b)包含含有SEQ ID NO：21之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：22之輕鏈可變區之單株抗體；及(c)包含含有SEQ ID NO：23之重鏈可變區及含有 SEQ ID NO：24之輕鏈可變區之單株抗體；其中(a)、(b)及(c)以彼此2：2：1之莫耳比率組合。
亦提供用三種抗EGFR抗體治療個體之方法，其中該等抗體以2：2：1比率投予該個體。更特定言之，提供用抗EGFR抗體治療個體之方法，該方法包含投予該個體：(a)包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；(b)包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；及(c)包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；其中(a)、(b)及(c)以彼此2：2：1之莫耳比率投予該個體。
在另一實施例中，提供用抗EGFR抗體治療個體之方法，該方法包含投予該個體：(a)包含含有SEQ ID NO：19之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：20之輕鏈可變區之單株抗體；(b)包含含有SEQ ID NO：21之重鏈可變區及含有 SEQ ID NO：22之輕鏈可變區之單株抗體；及(c)包含含有SEQ ID NO：23之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：24之輕鏈可變區之單株抗體；其中(a)、(b)及(c)以彼此2：2：1之莫耳比率投予該個體。
以下小節中描述關於將抗EGFR抗體調配成醫藥組合物之更多細節及於EGFR相關疾病中使用該等組合物之方法。
III.用於製造抗體之方法
(i)單株抗體
本文中提供之單株抗體最通常藉由標準重組DNA技術基於本文中揭示之VH及VL區之胺基酸序列製備。
此外或另外，單株抗體可使用多種已知技術，諸如標準體細胞雜交技術、B淋巴細胞之病毒或致癌轉化、或使用人抗體基因文庫之酵母或噬菌體呈現技術來製造。在特定實施例中，該等抗體為完全人單株抗體。
因此，在一個實施例中，使用融合瘤方法製造結合EGFR之抗體。在該方法中，可用合適之抗原使小鼠或其他適當宿主動物免疫以引出製造或能夠製造將與用於免疫之抗原特異性結合之抗體之淋巴細胞。或者，可活體外使淋巴細胞免疫。隨後可使用合適之融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞。分析使融合瘤細胞生長之培養基中針對該抗原之單株抗體之產生。在鑒別產生具有所需特異性、親和 力及/或活性之抗體的融合瘤細胞之後，該等純系可藉由限制稀釋程序進行次選殖且藉由標準方法生長。用於該目的之合適培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，該等融合瘤細胞可作為動物體內之腹水性腫瘤活體內生長。由亞純系分泌之單株抗體可藉由習知免疫球蛋白純化程序(例如蛋白質A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法)自培養基、腹水或血清分離。
在另一實施例中，結合EGFR之抗體可自使用熟知技術產生之抗體文庫分離，該等技術諸如描述於以下專利中之技術：例如Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號及第5,571,698號；Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；及Griffiths等人之美國專利第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號及第6,593,081號。另外，亦可使用藉由鏈改組來產生高親和力(nM範圍)人抗體，以及作為用於構建極大噬菌體文庫之策略的組合感染及活體內重組。參見，例如美國專利申請案第09/856,907號(PCT國際公開案第WO 00/31246號)。
在一特定實施例中，結合EGFR之單株抗體係使用噬菌體呈現來製造。該技術涉及產生具有自人供體分離之免疫球蛋白序列之獨特組合且於產生之重鏈CDR中 具有合成多樣性之人Fab文庫。隨後針對與EGFR結合之Fab篩選該文庫。
在又一實施例中，針對EGFR之人單株抗體可使用攜帶部分人免疫系統而非小鼠系統之轉殖基因或轉染色體小鼠產生(參見，例如美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號及第5,770,429號，皆屬於Lonberg及Kay；Surani等人之美國專利第5,545,807號；PCT公開案第WO 92/03918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97/13852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號，皆屬於Lonberg及Kay；及Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。)
在另一實施例中，人抗體可使用於轉殖基因及轉染色體上攜帶人免疫球蛋白序列之小鼠，諸如攜帶人重鏈轉殖基因及人輕鏈轉染色體之小鼠來產生(參見，例如Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478)。
此外，表現人免疫球蛋白基因之替代轉殖基因動物系統可用於此項技術中且可用於產生抗EGFR抗體。例如，可使用稱為Xenomouse(Abgenix,Inc.)之替代轉殖基因系統；該等小鼠描述於例如Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號、第6,075,181號、第6,114,598號、第6,150,584號及第6,162,963號中。
此外，表現人免疫球蛋白基因之替代轉染色體動物 系統可用於此項技術中且可用於產生抗EGFR抗體。例如，可使用攜帶人重鏈轉染色體及人輕鏈轉染色體兩者之小鼠。此外，攜帶人重鏈及輕鏈轉染色體之母牛已描述於此項技術中且可用於產生抗EGFR抗體。
在又一實施例中，抗體可使用產生該等抗體之轉殖基因植物及/或培養之植物細胞(例如煙草、玉米及浮萍)製備。例如，表現抗體之轉殖基因煙草葉可用於藉由例如使用可誘導性啟動子產生該等抗體。此外，轉殖基因玉米可用於表現該等抗體及其抗原結合部分。抗體亦可自包括諸如單鏈抗體(scFv)之抗體部分的轉殖基因植物種子，例如使用煙草種子及馬鈴薯塊莖大量產生。
使用包括此處揭示之技術在內之任何技術製備之結合EGFR之單株抗體(或其部分)之結合特異性可藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析(諸如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA))測定。單株抗體或其部分之結合親和力亦可藉由Scatchard分析測定。
在某些實施例中，使用任何上述方法產生之EGFR抗體均可使用此項技術中認可之技術(諸如本文中描述之技術)進一步改變或優化以獲得所需結合特異性及/或親和力。
在一個實施例中，源自EGFR抗體之部分抗體序列可用於產生結構上及功能上相關之抗體。例如，抗體主 要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中之胺基酸殘基與標靶抗原相互作用。因此，在個別抗體之間CDR內之胺基酸序列比CDR外之序列更多樣。因為CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，所以有可能藉由構建包括來自特定天然存在抗體之CDR序列移植於具有不同性質之不同抗體的構架序列上之表現載體來表現模擬該特定天然存在抗體之性質之重組抗體。該等構架序列可獲自包括生殖系抗體基因序列之公共DNA資料庫。
因此，抗EGFR抗體之一或多種結構特徵(諸如CDR)可用於產生保持至少一種所需功能性質(例如抑制表現EGFR之細胞之生長)之結構上相關之抗EGFR抗體。
在一特定實施例中，本文中揭示之一或多種CDR區與已知人構架區及CDR重組組合以產生其他重組工程改造之抗EGFR抗體。該等重鏈及輕鏈可變構架區可源自相同或不同抗體序列。
此項技術中已熟知，抗體重鏈及輕鏈CDR3結構域於抗體對於抗原之結合特異性/親和力方面起特別重要之作用。因此，在某些實施例中，產生之抗體包括本文中描述之特定抗體之重鏈及/或輕鏈CDR3。該等抗體可進一步包括本文中揭示之抗體之重鏈及/或輕鏈CDR1及/或CDR2。
上述工程改造之抗體之CDR 1、2及/或3區可包含 準確胺基酸序列，如本文中所揭示者。然而，一般技術人員應瞭解可能與該等準確CDR序列存在某一偏差，特別對於CDR1及CDR2序列而言，該等序列可容許比CDR3序列更大之變異而不改變抗原決定基特異性(該等偏差為例如保守胺基酸取代)。因此，在另一實施例中，工程改造之抗體可由與本文中列舉之抗體之相應CDR例如90%、95%、98%、99%或99.5%一致之一或多種CDR1及CDR2構成。
在另一實施例中，可改變CDR之一或多個殘基以改變結合而獲得更有利之結合速率。使用該策略，可獲得具有例如1010 M-1或更高之超高結合親和力之抗體。此項技術中熟知及本文中描述之親和力成熟技術可用於改變CDR區，隨後針對所需結合改變篩選所得結合分子。因此，由於CDR發生改變，可監測結合親和力以及免疫原性之改變並評分，以致獲得針對最佳組合結合及低免疫原性優化之抗體。
亦可在抗體之重鏈及/或輕鏈可變區之一或多個構架或連接區內進行修飾，只要該等修飾之後之抗原結合親和力優於106 M-1。
在另一實施例中，關於效應功能進一步修飾抗體，以例如增強該抗體治療癌症之有效性。例如，可將半胱胺酸殘基引入Fc區中，從而允許在該區中形成鏈間二硫鍵。由此產生之同源二聚抗體可具有改良之內化能力及/或增強之補體介導之細胞殺死及抗體依賴性細胞毒 性(ADCC)。具有增強之抗腫瘤活性之同源二聚抗體亦可使用異質雙功能交聯劑製備。或者，具有雙Fc區之抗體可經工程改造且因此可具有增強之補體溶解及ADCC能力。
亦提供如以下論述之雙特異性抗體及免疫結合物。
(ii)雙特異性抗體
本文中之雙特異性抗體包括至少兩種針對EGFR之結合特異性，其較佳結合非重疊或非競爭性抗原決定基。該等雙特異性抗體可包括其他結合特異性，例如第三EGFR結合特異性及/或針對另一ErbB受體(例如ErbB3)或另一抗原(諸如致癌基因之產物)之結合特異性。雙特異性抗體可作為全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)製備。
用於製備雙特異性抗體之方法為此項技術中熟知的(參見，例如WO 05117973及WO 06091209)。例如，全長雙特異性抗體可基於兩個配對免疫球蛋白重鏈-輕鏈之共表現來產生，其中該兩個鏈具有不同特異性。亦已描述用於自重組細胞培養物直接製備及分離雙特異性抗體片段之各種技術。例如，已使用白胺酸拉鍊產生雙特異性抗體。亦已報告另一種藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體製備雙特異性抗體片段之策略。
在一特定實施例中，雙特異性抗體包含第一抗體(或其結合部分)與衍生或連接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白(例如，針對受體之另一抗體或配位體)) 之EGFR結合以產生與至少兩個不同結合位點或標靶分子結合之雙特異性分子。抗體可衍生或連接至多於一種之其他功能分子以產生與多於兩個不同結合位點及/或標靶分子結合之多特異性分子；該等多特異性分子亦意欲由如本文所用之術語「雙特異性分子」涵蓋。為產生雙特異性分子，可將本文中揭示之抗體功能上連接(例如，藉由化學偶聯、基因融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物)，以致獲得雙特異性分子。
因此，涵蓋包含至少一種針對EGFR之第一結合特異性及針對第二標靶抗原決定基之第二結合特異性之雙特異性分子。在一特定實施例中，第二標靶抗原決定基為Fc受體，例如人FcγRI(CD64)或人Fcα受體(CD89)。因此，亦提供能夠與表現FcγR、FcαR或FcεR之效應細胞(例如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMN))及表現EGFR之標靶細胞兩者結合之雙特異性分子。該等雙特異性分子使表現EGFR之細胞靶向效應細胞且引發Fc受體介導之效應細胞活性，諸如表現EGFR之細胞之吞噬作用、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、細胞因子釋放或超氧化物陰離子之產生。
在一個實施例中，該等雙特異性分子包含作為結合特異性之至少一種抗體或其抗體片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv。該抗體亦可為輕鏈或重鏈 二聚體或其任何極小片段，諸如Ladner等人之美國專利第4,946,778號中描述之Fv或單鏈構築體。
該等雙特異性分子可使用此項技術中已知之方法藉由結合成分結合特異性(例如抗FcR及抗EGFR結合特異性)來製備。例如，雙特異性分子之各種結合特異性可分別產生並隨後彼此結合。當該等結合特異性為蛋白質或肽時，多種偶聯或交聯劑可用於共價結合。交聯劑之實例包括蛋白質A、碳化二亞胺、N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、o-伸苯基二馬來醯亞胺(oPDM)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)及4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺基酯(磺基-SMCC)。較佳之結合劑為SATA及磺基-SMCC，兩者皆可得自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。
當該等結合特異性為抗體時，其可經由兩個重鏈之C端鉸鏈區之巰基鍵結而結合。在一特別較佳之實施例中，鉸鏈區在結合之前經修飾以含有奇數個(較佳一個)巰基殘基。
或者，兩種結合特異性可於同一載體中編碼且於同一宿主細胞中表現並組裝。在該雙特異性分子為mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2或配位體x Fab融合蛋白之情況下，該方法尤其有用。雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及一結合決定子之單鏈分子或包含兩個 結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩種單鏈分子。用於製備雙特異性分子之方法例如描述於以下專利中：美國專利第5,260,203號；美國專利第5,455,030號；美國專利第4,881,175號；美國專利第5,132,405號；美國專利第5,091,513號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653號；美國專利第5,258,498號；及美國專利第5,482,858號。
該等雙特異性分子與其特異性標靶之結合可藉由例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析證實。一般而言，該等分析各自藉由使用對於特定相關之蛋白質-抗體複合物具有特異性之經標記試劑(例如抗體)來偵測相關複合物之存在。例如，FcR-抗體複合物可使用例如識別並特異性結合於該等抗體-FcR複合物之酶聯抗體或抗體片段來偵測。或者，該等複合物可使用多種其他免疫分析中之任一者來偵測。例如，抗體可經放射性標記且用於放射免疫分析(RIA)。放射性同位素可藉由諸如使用α γ-β計數器或閃爍計數器之方法或藉由自動放射攝影術來偵測。
(iii)免疫結合物
本文中提供之免疫結合物可藉由將本文中描述之抗體與另一治療劑結合而形成。合適之試劑包括例如細胞毒性劑(例如化學治療劑)、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物起源之酶活性毒素或其片段)及/或放射性 同位素(亦即放射結合物)。
可用於產生該等免疫結合物之化學治療劑已於上文描述。可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚麴菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲裂吉菌素(mitogellin)、局限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯(tricothecene)。多種放射性核素可用於產生放射結合之抗EGFR抗體。實例包括212Bi、131I、131In、90Y及186Re。
免疫結合物可使用多種雙功能蛋白偶聯劑，諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫烷(IT)、亞胺酸酯之雙功能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCL)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)來製備。碳14標記之1-異硫氰 基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於將放射性核素與抗體結合之例示性螯合劑(參見，例如WO94/11026)。
IV.用於篩選抗體之方法
產生抗體之後，可使用此項技術中熟知之多種分析針對各種性質，諸如本文中描述之彼等性質篩選該等抗體。
在一個實施例中，使用例如經純化之EGFR及/或表現EGFR之細胞(諸如A431細胞)針對與EGFR之結合篩選抗體(例如，藉由流動式細胞測量術或ELISA)。可進一步鑒別且比較由該等抗EGFR抗體結合之抗原決定基，例如以鑒別非競爭性抗體(例如結合不同抗原決定基之抗體)以及競爭結合及/或結合相同或重疊抗原決定基之抗體。
可使用常規技術鑒別競爭性抗體及非競爭性抗體。該等技術包括例如免疫分析，其顯示一種抗體阻斷(或不阻斷)另一抗體與標靶抗原之結合之能力，亦即競爭性結合分析。競爭性結合於分析中測定，在該分析中所測試之免疫球蛋白抑制參考抗體與共同抗原(諸如EGFR)之特異性結合。已知多種類型之競爭性結合分析，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶促免疫分析(EIA)、夾心競爭分析；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析；固相直接125I標記RIA； 固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA及直接標記RIA。陳述於實例中之材料及方法及下文實例2中之表面電漿子共振技術亦可有利地用於該目的。通常，該分析涉及使用與固體表面結合之經純化抗原，或帶有該等未標記之測試免疫球蛋白及經標記參考免疫球蛋白中任一者之細胞。競爭性抑制藉由測定在測試免疫球蛋白存在下與固體表面或細胞結合之標記之量來量測。通常，測試免疫球蛋白過量存在。通常，當競爭性抗體過量存在時，其將抑制參考抗體與共同抗原之特異性結合達至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更高。
用於測定本文中揭示之抗體所結合的抗原決定基之其他篩選技術包括例如抗原：抗體複合物晶體之x射線分析，其提供該抗原決定基之原子解析度。其他方法監測抗體與抗原片段或抗原之突變型變異之結合，在突變型變異中由於抗原序列內之胺基酸殘基修飾造成之結合損失經常被視為指示抗原決定基組分。此外，亦可使用用於抗原決定基定位之計算組合方法。該等方法依賴於相關抗體親和性分離來自組合噬菌體呈現肽文庫之特異性短肽之能力。該等肽隨後被認為用於界定對應於用於篩選肽文庫之抗體的抗原決定基之前導肽。對於抗原決定基定位，亦已開發出顯示定位構形不連續抗原決定基之計算演算法。
在另一實施例中，針對與結合於配位體(例如EGF)之抗原決定基結合(亦即不抑制EGFR結合配位體與 EGFR之結合)之能力篩選該等抗體(例如非競爭性抗體抗EGFR抗體)。該等抗體可藉由例如在不存在(對照)或存在抗EGFR抗體下使表現EGFR之細胞(例如A431細胞)與經標記之EGFR配位體(例如放射性標記或生物素化EGF)接觸來鑒別。若該抗體不抑制EGF與EGFR之結合，則將觀察到相對於不存在該抗體下回收之標記之量，該量無統計學顯著降低。或者，若該抗體抑制EGF與EGFR之結合，則將觀察到相對於不存在該抗體下回收之標記之量，該量具有統計學顯著降低。
亦可針對抗體之結合親和力篩選(測試)抗體。例如，此舉可使用電漿子共振分析(例如以下所描述)完成。
亦可使用信號傳導分析(諸如本文中描述之彼等分析)針對抗體抑制經由EGFR進行信號傳導之能力篩選抗體。例如，抗體抑制EGFR配位體介導之EGFR磷酸化之能力可在存在及不存在該抗體下藉由用EGFR配位體(例如EGF)處理表現EGFR之細胞來評估。隨後可將該等細胞溶解，將粗溶解物離心以移除不溶性材料，且例如藉由西方墨點法、隨後用抗磷酸酪胺酸抗體探測來量測EGFR磷酸化。
或者，抗體抑制經由EGFR進行下游信號傳導之能力可藉由在由EGF配位體刺激EGFR之後針對已知EGFR受質(例如AKT及/或ERK)之激酶分析來量測。 例如，可用候選抗體培育且用EGF配位體刺激表現EGFR之細胞。隨後自該等細胞製備之細胞溶解物可用針對EGFR受質(或於涉及EGFR之細胞路徑中之蛋白)之抗體(諸如抗AKT抗體)免疫沈澱，且使用此項技術中認可之技術分析激酶活性(例如AKT激酶活性)。在該抗體存在下，於涉及EGFR之路徑中之EGFR受質或蛋白的含量或活性(例如激酶活性)相對於不存在該抗體下之含量或活性之降低或完全消失指示抗體抑制EGFR信號傳導。
降低細胞表面上EGFR之含量之抗體可藉由其下調或抑制腫瘤細胞上之EGFR表現之能力來鑒別。在某些實施例中，該等抗體藉由誘導EGFR之內化(或增加內吞作用)(例如藉由該受體之內化及再循環及/或該受體之內化及降解)或藉由抑制內化EGFR之再循環來減少細胞表面上之EGFR。為測試此含量，可將EGFR生物素化且例如藉由量測存在或不存在抗體下培養之細胞層單上生物素之量，隨後免疫沈澱EGFR且用抗生蛋白鏈菌素探測，可容易地測定細胞表面上EGFR分子之數目。在抗體存在下偵測之生物素化EGFR隨時間之減少指示抗體降低細胞表面上之EGFR含量。
亦可使用此項技術中認可之技術測試抗體及抗體組合抑制表現EGFR之細胞(諸如腫瘤細胞)生長(活體內或活體外)之能力，該等技術包括以下實例中描述之Cell Titer-Glo分析、及氚標記之胸苷併入分析。亦 可針對抑制表現EGFR之細胞之球體生長之能力篩選抗體。此舉可藉由使用估算如本文所述之發展中腫瘤生長之條件之分析來實現。
在另一實施例中，針對關於抑制特定EGFR活性或功能(諸如EGFR介導之信號傳導)之IC50及/或IC90值篩選抗EGFR抗體之組合(例如，如藉由ELISA、西方或多重方法(諸如Luminex®)所量測)。隨後可選擇抗體之組合，該等組合各自具有特別需要之IC50及/或IC90值(例如針對抑制EGFR信號傳導之約80 nM之IC90)。在一個實施例中，該組合具有大於已知參考抗體(例如西妥昔單抗)之IC50或IC90值。在另一實施例中，該組合具有累加IC50或IC90(亦即，當個別地作用於表現EGFR之細胞時，該等抗體之活性之和約等於該等抗體一起作用於相同細胞之組合效應)。在另一實施例中，該組合具有協同IC50或IC90(亦即，當個別地作用於表現EGFR之細胞時，該等抗體之效應之和小於該等抗體一起作用於相同細胞之組合效應)。
V.醫藥組合物
在另一態樣中，本文中提供組合物(例如醫藥組合物)，其含有本文中揭示之抗EGFR單株抗體之一者或組合與醫藥學上可接受之載劑一起調配。在一個實施例中，該等組合物包括結合EGFR上之不同抗原決定基之多種(例如兩種或三種)分離抗體之組合。該等抗體較佳關於抑制特定EGFR活性或功能(諸如EGFR介導之 信號傳導)具有累加或協同效應。較佳醫藥組合物為無菌組合物、適合於注射之組合物及適合於藉由所需投藥途徑(諸如藉由靜脈內注射)注射之無菌組合物。
如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑及生理學上可相容之類似物。載劑較佳適合於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投藥(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，活性化合物(亦即抗體、雙特異性及多特異性分子)可包覆於某一材料中以保護該化合物免受酸及可使該化合物失活之其他天然條件作用。
組合物可單獨或於組合療法(亦即與其他藥劑組合)中投予。例如，組合療法可包括本文中提供之組合物與至少一種或多種其他治療劑(諸如本文中描述之抗癌劑)。在一個實施例中，組合療法可使用本文中揭示之兩種或三種抗EGFR抗體之本文中提供之組合物。在另一實施例中，組合療法可使用包含至少一種本文中揭示之抗EGFR抗體與一或多種其他抗體(諸如一或多種此項技術中已知之其他抗EGFR抗體，例如揭示於PCT申請案第PCT/US2011/3528號中之抗EGFR抗體)組合之組合物。該等組合物亦可連同輻射療法及/或外科手術一起投予。亦可分別或相繼地投予抗EGFR抗體之特定組合，含或不含其他治療劑。
組合物可藉由此項技術中已知之多種方法投予。熟 練技術人員應瞭解，投藥之途徑及/或模式將視所需結果而變化。抗體可與將防止抗體快速釋放之載劑一起製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊封遞送系統。可使用生物可降解、生物可相容聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。多種用於製備該等調配物之方法已申請專利或通常為熟習此項技術者已知。
為了藉由某些投藥途徑投予組合物，可必需用某一材料包覆各成分(例如抗體)或將組合物與該材料共投予以防止其不活化。例如，可以適當載劑(例如脂質體或稀釋劑)將組合物投予個體。可接受之稀釋劑包括生理鹽水及水性緩衝溶液。脂質體包括水包油包水CGF乳液以及習知脂質體。
可接受之載劑包括無菌水性溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。該等介質及試劑用於醫藥學活性物質為此項技術中已知的。除非任何習知介質或試劑與抗體不相容，否則涵蓋其於本文中提供之組合物中之用途。補充活性成分亦可併入該等組合物中。
治療組合物通常須在製造及儲存條件下為無菌且穩定的。該組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適合於高藥物濃度之其他有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其合適混合物之溶劑或分散介質。適當 流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣，藉由維持在分散液情況下所需要之粒徑及藉由使用界面活性劑來維持。在多種情況下，較佳應於組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。於組合物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)可引起可注射組合物之延長吸收。
無菌可注射溶液可藉由按需要於具有上文列舉之成分之一者或組合之適當溶劑中併入所需量之單株抗體、隨後進行滅菌微過濾來製備。一般而言，分散液藉由將抗體併入含有鹼性分散介質及來自上文列舉之彼等成分的所需其他成分之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其產生活性成分粉末加上來自其先前無菌過濾溶液之任何其他所需成分。
調整給藥方案以提供最佳之所需反應(例如治療反應)。例如，可投予單次大劑量，可隨時間投予若干分次劑量，或劑量可如治療情形之緊急性所指示按比例降低或增加。例如，人抗體可藉由皮下注射投予每週一次或兩次，或藉由皮下注射投予每月一次或兩次。
尤其，宜以便於投藥及劑量一致性之劑量單位形式調配非經腸組合物。如本文所用，劑量單位形式係指適合作為用於欲治療之個體之單位劑量的物理上個別單元；各單元含有經計算與所需要之醫藥載劑聯合產生所需治療效應之預定量的抗體。本文中提供之劑量單位形 式之規格係由以下指定且直接取決於以下：(a)抗體之獨特特徵及欲實現之特定治療效應，及(b)此項技術中關於混配用於治療個體敏感性之該等抗體的固有限制。
醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。
對於治療組合物，調配物包括適合於經口、經鼻、局部(包括經頰及舌下)、直腸及非經腸投予之彼等調配物。非經腸投藥為用於包含抗體之治療組合物之最常見投藥途徑。調配物宜以單位劑型提供且可藉由藥學技術中已知之任何方法製備。可與載劑材料組合產生單一劑型之抗體之量將視所治療之個體及特定投藥模式而變化。該抗體之量將通常為足以產生治療效應之量。通常，以百分之一百計，該量將在以質量計約0.001%至約90%抗體之範圍內，較佳在約0.005%至約70%範圍內，最佳在約0.01%至約30%範圍內。
如本文所用，片語「非經腸投藥」及「非經腸投予」意謂除腸內及局部投藥外之投藥模式，通常藉由注射投予，且包括(不限於)靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、 心室內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
可用於本文中提供之醫藥組合物之合適水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其合適混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。適當流動性可例如藉由使用包衣材料(諸如卵磷脂)，藉由維持在分散液情況下所需要之粒徑及藉由使用界面活性劑來維持。
該等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。此項技術中熟知之佐劑之特定實例包括例如無機佐劑(諸如鋁鹽，例如磷酸鋁及氫氧化鋁)、有機佐劑(例如角鯊烯)、基於油之佐劑、病毒顆粒(例如，含有源自流感病毒之膜結合血球凝集素及神經胺酸苷酶之病毒顆粒)。
防止微生物存在可藉由滅菌程序及藉由包含各種抗細菌及抗真菌劑(例如對羥苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、山梨酸及其類似物)兩者來確保。可亦需要組合物中包括等滲劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。此外，可藉由包含一或多種延遲吸收之試劑(諸如單硬脂酸鋁或明膠)引起可注射醫藥形式之延長吸收。
當組合物作為藥物投予人及動物時，其可單獨給予或以含有例如0.001至90%(更佳為0.005至70%，諸 如0.01至30%)之活性成分與醫藥學上可接受之載劑組合的醫藥組合物形式給予。
無論選擇何種投藥途徑，本文中提供之組合物均可以合適之水合形式使用，且其可藉由熟習此項技術者已知之習知方法調配成醫藥學上可接受之劑型。
可改變本文中提供之醫藥組合物中抗體之實際劑量水準，以獲得有效實現針對特定患者、組合物及投藥模式之所需治療反應的一定量的活性成分，而不對該患者產生毒性。選擇之劑量水準將取決於多種藥物動力學因素，包括使用之特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投藥途徑、投藥時間、使用之特定化合物之排泄率、治療之持續時間、與使用之特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史，以及醫學技術中熟知的類似因素。具備此項技術中一般技能之醫師或獸醫可容易地確定且指定所需要之組合物之有效量。例如，醫師或獸醫可以低於實現所需治療效應所需之水準開始抗體劑量且逐漸增加劑量直至獲得所需效應。一般而言，本文中提供之組合物之合適日劑量將為作為有效產生治療效應之最低劑量之抗體的量。該有效劑量將通常取決於上述因素。較佳靜脈內、肌內、腹膜內或皮下投藥，較佳鄰近標靶位點投予。必要時，治療組合物之有效日劑量可視情況以單位劑型作為全天內以適當時間間隔分別投予之兩個、三個、四個、五個、六個或更 多亞劑量投予。雖然有可能單獨投予抗體，但較佳以調配物(組合物)形式投予抗體。
治療組合物可用此項技術中已知之醫學裝置投予，例如以下揭示之彼等醫學裝置：美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號、第4,596,556號、第4,487,603號、第4.,486,194號、第4,447,233號、第4,447,224號、第4,439,196號及第4,475,196號。
在某些實施例中，可調配單株抗體以確保活體內正常分佈。例如，血腦屏障(BBB)隔絕許多高度親水性化合物。為確保治療抗體穿過BBB(必要時)，可將該等抗體例如調配於脂質體中。對於製造脂質體之方法，參見例如美國專利4,522,811；5,374,548；5,399,331；5,891,468；6,056,973；6,210,707；6,224,903；6,316,024；7,122,202；7,135,177及7,507,407及美國專利公開案20070116753。脂質體可包含一或多個部分附著於及/或選擇性轉運至特定細胞或器官中，因此增強靶向藥物遞送。
提供包含2：2：1比率之抗EGFR抗體三元組合之醫藥組合物，亦即該組合物包含三種不同抗EGFR抗體，尤其為以特定2：2：1比率調配之P1X相關抗體、P2X相關抗體及P3X相關抗體，其與不同EGFR抗原決定基結合。除該三種抗體之外，該等醫藥組合物亦可包含醫藥學上可接受之載劑及/或其他賦形劑，諸如以上詳細 描述者。該醫藥組合物可於含有所有三種抗體之單一容器中提供，或者，該醫藥組合物可包含含有三個不同容器之包裝，各容器含有三種不同抗EGFR抗體之一(以及醫藥學上可接受之載劑及/或如上所述之其他賦形劑)。
提供上述抗EGFR抗體之用途，該等抗體單獨(作為單一藥劑)、以成對組合(兩種抗體)或以三元組合(三種抗體)用於製造供治療與EGFR依賴性信號傳導相關之疾病的藥劑。亦提供上述抗EGFR抗體，其單獨(作為單一藥劑)、以成對組合(兩種抗體)或以三元組合(三種抗體)用於治療癌症(或欲用於製造供治療癌症的藥劑)，諸如表現EGFR之癌症，諸如以下癌症，包括(但不限於)：黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、腎癌、胃腸癌、結腸癌、肺癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸部癌、神經膠母細胞瘤、前列腺癌及其他實體及/或轉移性腫瘤。
此外，涵蓋之組合物可進一步包括其他治療劑，例如其他抗癌劑，或與其他治療劑一起準備用作組合療法中之藥劑。「抗癌劑」為用於治療腫瘤、癌症、惡性腫瘤及其類似疾病之藥物。藥物療法(例如具有本文中揭示之抗體組合物)可不與其他治療一起投予，或與諸如外科手術、加熱或輻射療法(例如用電離輻射)之其他治療組合投予。視累及之器官或組織之性質而定，癌症治療中可使用若干種類之抗癌劑。例如，乳癌通常用雌 激素刺激，且可用使性激素失活之藥物治療。類似地，前列腺癌可用使雄激素失活之藥物治療。其中，與本文中揭示之抗體組合物組合使用之抗癌劑包括列於附錄A中之彼等抗癌劑，該等抗癌劑不應被視為限制性。可與投予本文中揭示之抗體組合物同時或之前或之後投予一或多種抗癌劑。本文中揭示之抗體組合物可相繼地或與其他抗癌劑(例如以下附錄A中揭示之抗癌劑)一起投予。
亦提供包含本文中揭示之一或多種抗EGFR抗體視情況含於單一小瓶或容器中之套組，且該等套組包括例如用於治療或診斷與EGFR上調及/或EGFR依賴性信號傳導相關之疾病(例如癌症，諸如以下小節VI中描述之癌症)之說明書。該等套組可包括指示套組內容物之預定用途的標簽。術語標簽包括於套組上或與套組一起或另外伴隨套組提供之任何書面、營銷材料或記錄資料。該等套組可包含抗體組合物於單位劑型中，諸如於單一劑量小瓶或單一劑量預裝注射器中。包含本文中揭示之抗EGFR抗體之組合(例如，P1X相關抗體、P2X相關抗體及P3X相關抗體之組合)之套組可包含含有該組合的所有組分之單一小瓶，或者，該套組可包含各組分於單獨小瓶中以及用於投予組合療法中之抗體之說明書。在一較佳實施例中，P1X相關抗體、P2X相關抗體及P3X相關抗體以2：2：1比率提供於單一小瓶中，或者，各自提供於具有用於以2：2：1比率投予三種抗體 之說明書的單獨小瓶中。
VI.使用抗體之方法
本文中揭示之抗體及組合物可用於多種治療及診斷應用，尤其致癌應用。因此，在另一態樣中，本文中提供藉由以足以抑制EGFR介導之活性之量投予一或多種本文中描述之抗體或組合物來抑制個體中的EGFR活性之方法。可治療之特定治療適應症包括例如諸如皮膚、腦及中樞神經系統、頭及頸、食管、胃、結腸、直腸、肛門、肝、胰臟、膽管、膽囊、肺或支氣管、乳房、卵巢、子宮、子宮頸、陰道、睾丸、生殖細胞、前列腺、腎、輸尿管、膀胱、腎上腺、垂體、甲狀腺、骨、肌肉或其他結締組織之器官或組織之癌症、白血病、多發性骨髓瘤、何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)及非何傑金氏淋巴瘤。
本文中揭示之抗體亦可用於診斷或預後與EGFR相關之疾病(例如癌症)，例如藉由使本文中揭示之一或多種抗體、抗體對或抗體三元組合(例如離體或活體內)與來自個體之細胞接觸，且量測與該等細胞上之EGFR結合之程度來進行診斷或預後，其中異常高的與EGFR結合之程度表示該個體患有與EGFR相關之癌症。
亦提供於涉及EGFR依賴性信號傳導之多種離體及活體內診斷及治療應用(包括多種癌症)中使用本文中揭示之抗EGFR抗體之方法。
因此，在一個實施例中，提供藉由以有效治療與EGFR依賴性信號傳導相關之疾病之量投予個體本文中提供之抗體或較佳為抗體組合來治療該疾病之方法。合適之疾病包括例如多種癌症，包括(但不限於)黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、腎癌、胃腸癌、結腸癌、肺癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸部癌、神經膠母細胞瘤、前列腺癌及其他實體及/或轉移性腫瘤。
該抗體可單獨或與連同該抗體或協同地作用之另一治療劑一起投予以治療與EGFR介導之信號傳導相關之疾病。該等治療劑包括本文中描述之彼等治療劑，例如小有機分子、單株抗體、雙特異性抗體、重組工程改造之生物製品、RNAi化合物、酪胺酸激酶抑制劑及商業抗體，以及抗癌劑(例如細胞毒素、化學治療劑、小分子及輻射)。可與本文中揭示之一或多種抗EGFR抗體一起用於組合療法中之抗癌劑之非限制性實例包括列於附錄A中之彼等抗癌劑。
其他實施例描述於以下非限制性實例中。
實例
用於實例之材料及方法
一般而言，除非另外指明，否則以下實例中使用化學、分子生物學、重組DNA技術、免疫學之習知技術(尤其為例如抗體技術)，以及重組免疫球蛋白製備之標準技術。
細胞株
下述實驗中欲使用之所有細胞株皆獲自National Cancer Institute或ATCC。
細胞株：A431-表皮樣癌
DU145-前列腺癌
H1975-肺腺癌；非小細胞肺癌
HCC827-肺腺癌；非小細胞肺癌
EGFR細胞外結構域(EGFR-ECD)突變體之蛋白質純化
產生EGFR細胞外結構域(EGFR-ECD)之突變體用於mAb抗原決定基分區(binning)。基於西妥昔單抗(Li S.等人，Cancer Cell.7：301-311,2005)及H11(Spangler J.等人，PNAS.107：13252-13257,2010)抗原決定基兩者以及基於EGFR-ECD結構之結構分析(蛋白質資料庫(Protein Data Bank)ID：1NQL；Ferguson K.M.等人，Mol Cell.11：507-517,2003)設計突變。將殘基突變為如包括於本申請案中之蛋白質序列所指示之丙胺酸。表現構築體之DNA合成可商業上獲自DNA2.0(www.dna20.com)。後續DNA次選殖、於293F細胞中之蛋白質表現、及蛋白質純化使用習知方法完成。
腫瘤細胞中EGFR或ERK之EGF介導之信號傳導之抑制
配位體介導之腫瘤細胞信號傳導之抑制作用研究 如下：A431或Du145細胞以35,000個細胞/孔或17,500個細胞每半孔之密度接種於96孔組織培養板中，且於補充有抗生素、2 mM L-麩醯胺酸及10%胎牛血清(FBS)之DMEM或RPMI-1640培養基中於37℃及5%二氧化碳下生長24小時。細胞於具有抗生素及2 mM L-麩醯胺酸之1% FBS培養基中於37℃及5%二氧化碳下血清饑餓約20小時。隨後，細胞用不同濃度之抗EGFR抗體預培育2小時，並隨後用人EGF配位體(50 ng/ml)(PeproTech，目錄號AF-100-15)於37℃及5%二氧化碳下刺激10分鐘。細胞用冰冷PBS洗滌且於50 μl冰冷溶解緩衝液(用150 mM NaCl及蛋白酶抑制劑混合物(Sigma，P714)改良之哺乳動物蛋白質提取物溶解緩衝液(MPER-Pierce，#78505))中藉由於冰上培育30分鐘溶解。溶解物即刻藉由ELISA分析ERK(EGFR之下游效應子)及EGFR磷酸化，或於-80℃下冷凍直至使用。
ELISA分析
對於磷酸-EGFR夾心ELISA，用50 μL EGFR抗體(EGFR Ab-11，純系：199.12，無BSA及疊氮化物，Fisher Scientific，目錄號MS396P1ABX)塗佈96半孔GREINER高結合板(目錄號675077；GREINER BIO-ONE,Monroe,NC)，且於室溫下培育隔夜。次日早晨，用100 μl/孔之PBST(0.05% Tween-20)於BIOTEK洗板器上將板洗滌3次。隨後用含2% BSA之PBS將 板於室溫下阻斷約1小時。用100 μl/孔PBST(0.05% Tween-20)於BIOTEK洗板器上將板洗滌3次。將細胞溶解物(50 μl)或標準物(pEGFR pY1068 ELISA套組，R&D Systems，目錄號DYC3570)稀釋於50%溶解緩衝液及1% BSA-PBS中(按照製造商之建議)且一式兩份添加至板中，並且在震盪下於室溫下培育2小時或於4℃下培育隔夜。隨後於BIOTEK洗板器中用100 μl/孔之PBST(具有0.05% Tween-20之PBS)將板洗滌3次。添加約50 μl稀釋於2% BSA,PBS中之與辣根過氧化酶(HRP)(pEGFR pY1068 ELISA套組，R&D Systems，目錄號DYC3570)結合之偵測抗體且於室溫下培育約2小時。於BIOTEK洗板器中用100 μl/孔之PBST(0.05% Tween-20)將板洗滌3次。添加約50 μL SUPERSIGNAL PICO ELISA受質且使用Envision(Perkin Elmer)讀板器讀取該板。關於資料分析，對雙重複樣品求平均值且使用誤差條表示兩個重複實驗之間之標準偏差。使用GraphPad Prism軟體(GraphPad Software,Inc.)經由對於4參數邏輯方程進行數據回歸計算抑制曲線及相應IC50值。
磷酸-ERK ELISA類似於磷酸-EGFR ELISA執行，其中具有以下變化：人pERK ELISA Duoset套組購自R&D Systems(目錄號DYC1018-5)且如製造商所建議加以使用。
使用EGFR-ECD野生型(WT)、Bin1抗原決定基 突變體或Bin3抗原決定基突變體作為捕捉試劑(4 μg/ml)執行直接ELISA。用50 μL捕捉試劑塗佈96半孔GREINER高結合板(目錄號675077；GREINERBIO-ONE,Monroe,NC)且於室溫下培育隔夜。次日早晨，於BIOTEK洗板器中用100 μl/孔之PBST(0.05% Tween-20)將板洗滌3次且用含1% BSA之PBS(pH 7.2)於室溫下阻斷約1小時。將稀釋於含1% BSA之PBS(pH 7.2)中的不同濃度(1、0.25、0.06及0.02 μg/ml)之單株抗體(mAb)與捕捉試劑一起於室溫下培育2小時，隨後用過氧化酶結合之AffiniPure山羊抗人IgG Fc片段(Jackson Immunoresearch，目錄號109-035-008)於含1% BSA之PBS(pH 7.2)中的1：50,000稀釋液偵測。添加約50 μL Supersignal PICO ELISA受質且使用Envision(Perkin Elmer)讀板器讀取板。關於資料分析，對雙重複樣品求平均值且使用誤差條表示兩個重複實驗之間之標準偏差。
結合親和力：動力學排除分析(KinExA)
抗體之親和力及交叉反應性於具有重組EGF受體之溶液中使用KinExA儀器(SAPIDYNE Instruments,Boise,ID)量測。用於該分析之物質為KinExA 3000儀器及軟體(Sapidyne Instruments,Boise,ID)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠粒(Sapidyne Instruments)、人抗EGFR IgG、重組人EGFR、Cy5結合之山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)、磷 酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)及於PBS中之牛血清白蛋白(100 mg/ml)。
為了使重組EGF受體與PMMA珠粒偶聯，將100 μg重組EGFR添加至200 mg PMMA珠粒之預量測等分試樣中，且添加PBS使總體積為1 ml。將珠粒於室溫下於轉輪上培育1小時。隨後將珠粒短暫離心且移除上清液。向珠粒中添加100 μl含100 mg/ml BSA之PBS，進一步添加PBS以使總體積為1 ml。將珠粒於室溫下於轉輪上再培育1小時。隨後將珠粒轉移至含有27 mL PBS之玻璃瓶中。
為了確定單價抗體之結合親和力，於具有恆定濃度的抗EGFR抗體之5 ml PBS中製備重組EGFR之十二步驟稀釋系列(75 nM、25 nM、8.3 nM、2.8 nM、0.9 nM、0.3 nM、100 pM、33 pM、11 pM、4 pM、1.3 pM、0 pM)。為了進行精確親和力量測，總抗體結合位點濃度(「ABC」；抗體之莫耳濃度的兩倍，歸因於價數)應小於抗體對於EGFR之單價親和力。將抗體-受體混合物於室溫下培育2小時以實現平衡。視抗體-受體複合物之預期親和力而定，可相應調整該平衡時間。使用儲備(2 mg/mL)抗體於PBS中之1：1000稀釋液，於單獨管中製備15 mL之2 μg/mL Cy5結合之抗人IgG二次抗體。隨後，將KinExA儀器線與12個抗體-受體溶液管之每一者連接。經由填充式EGFR-珠粒管柱注射各種溶液。(KinExA儀器自動地填充新的珠粒管柱用於各 注射。)沖洗步驟之後，使標記之二次抗體經過該管柱。最後，使用處於不同受體濃度下之未複合受體之量測量，於KinExA軟體中將平衡滴定數據擬合至1：1結合模型以得到親和力值KD。KD值愈低，結合親和力愈佳(愈強，有時表述為愈高)。因此，關於抗體以x nM或更佳之KD結合之陳述意謂抗體以例如1 x 10-8 M(10 nM)之KD值或以例如1 x 10-10 M(0.1 nM)之更低KD值結合，其中較低KD值表示較佳(較高)親和力。
為了使用KinExA「直接方法」確定結合速率，使用上述途徑及總抗體結合位點濃度(ABC)確定平衡單價結合親和力(KD)。隨後，使用「理論結合曲線證實(Theoretical Binding Curve Demonstration)」軟體(Sapidyne Instruments)，確定動力學實驗之起始抗原濃度(L0)。為此，輸入於單價結合親和力實驗中確定之親和力及ABC值，且選擇起始抗原濃度作為大致20%抗體將與處於平衡狀態之抗原無結合之濃度。此選擇確保實驗中之良好信噪比。使用儲備(2 mg/mL)抗體於PBS中之1：1000稀釋液製備15 mL之2 μg/mL Cy5結合之抗人IgG二次抗體。於單獨管中製備2 x ABC濃度之8 mL抗EGFR抗體溶液。該濃度為操作濃度之兩倍，因為溶液在實驗之前與8 mL抗原溶液混合。於單獨管中製備2 x L0濃度之8 mL重組EGFR溶液。該濃度亦為操作濃度之兩倍，因為溶液在實驗之前與8 mL抗體溶液混合。隨後，將塗佈EGFR之珠粒及二次抗體溶液 分別置於適當容器及管線中。將抗體及抗原溶液充分混合且立即與適當管線連接，且使用KinExA軟體量測所得溶液中隨時間而變之游離抗體的量。為了確定締合常數kon(Kon)，使用KinExA軟體將隨時間而變之游離抗體之量的減少擬合至可逆雙分子速率方程。解離常數Koff(Koff)等於Kon*KD(Kd)。
結合親和力：表面電漿子共振分析
表面電漿子共振分析執行如下：使用胺偶聯將抗體或抗原(300 RU)固定於CM5晶片上。隨後注射不同濃度之抗體或抗原以研究其與固定之蛋白之締合及解離。於不同注射之間，使用合適之再生緩衝液(諸如甘胺酸，pH 2.5)使晶片再生。使用方程1擬合解離相以確定 K off (解離速率)：R=Ro*exp(-Koff*t) (1)
使用該 K off 值及方程2擬合締合相以確定 K on (締合速率)及 K D (平衡常數)。
其中 C 表示溶液中抗原或抗體之濃度， R max 表示飽和信號，且 t 表示時間。
抗原決定基分區：表面電漿子共振分析
如上所述，使用表面電漿子共振分析進行抗原決定基分區。將一種抗體固定於晶片之表面上。隨後注射重組表現之人EGFR細胞外結構域(EGFR-ECD)。當 EGFR-ECD與結合於晶片表面之抗體締合時，共振信號增強。相繼注射屬於三個小區1、2及3之抗體。若該抗體結合與注射之抗體重疊之抗原決定基，則與先前注射相比信號將不變化。若抗體與非重疊抗原決定基結合，則晶片上之信號將高於先前注射。最後將與晶片結合之抗體作為游離配位體注射以確認缺少與重疊抗原決定基之結合。
細胞結合分析
用於確定KD值之細胞結合分析執行如下：於37℃下用3 mL胰蛋白酶-EDTA使A431細胞剝離5分鐘。立即向該等胰蛋白酶化細胞中添加完全DMEM(10 mL)，輕輕地再懸浮且於Beckman桌上型離心機中以1100 rpm短暫離心5分鐘。將細胞以2 x 106個細胞/ml之濃度再懸浮於染色緩衝液(PBS+0.2% BSA+0.1%疊氮化鈉)中且將50 μl(1 x 105個細胞)等分試樣塗於96孔滴定板中。
於染色緩衝液中製備2000 nM抗EGFR抗體之300 μl儲備溶液且將其中100 μl連續稀釋於200 μl染色緩衝液中。經稀釋抗體之濃度在2000 nM至0.1 nM範圍內。隨後將不同蛋白質稀釋液之150 μl等分試樣直接添加至50 μl細胞懸浮液中，得到1500 nM、500 nM、166.7 nM、55.6 nM、18.5 nM、6.17 nM、2.05 nM、0.68 nM、0.23 nM及0.076 nM抗體之最終濃度。
將96孔板中之等分細胞與抗體稀釋液一起在室溫 下於震盪下培育2小時且用300 μl染色緩衝液洗滌3次。隨後在4℃下於震盪下將細胞與100 μl Alexa 647標記之山羊抗人IgG於BD染色緩衝液中之1：750稀釋液一起培育45分鐘。最後，將細胞洗滌兩次，使其集結成粒且再懸浮於250 μl染色緩衝液+0.5 μg/ml碘化丙啶中。於FACSCALIBUR流動式細胞儀中使用FL4通道分析10,000個細胞。將MFI值及抗EGFR抗體之相應濃度分別繪於y軸及x軸上。使用GRAPHPAD PRISM軟體使用用於非線性回歸曲線之單位點結合模型確定分子之KD。
KD值基於公式Y=Bmax*X/KD+X(Bmax=飽和處之螢光。X=抗體濃度。Y=結合程度)計算。
經由免疫墨點法量測EGFR含量
為了製備細胞溶解物，將H1975細胞胰蛋白酶化，收集，計數，且以1x106個細胞/孔塗於6孔皿中並培育隔夜以使其附著於培養板。將細胞用1 μM濃度之P1X+P2X+P3X(P1X+P2X+P3X或P1X、P2X及P3X，表示2：2：1莫耳比率之P1X、P2X及P3X)預處理1、2、5及24小時，隨後用rhEGF(Peprotech，目錄號100-15)刺激10分鐘。細胞用100 μl哺乳動物蛋白質提取試劑(Mammalian Protein Extraction Reagent，Pierce，目錄號78505)溶解。對蛋白質提取試劑補充PhosSTOP(Roche，目錄號04906837001)及蛋白酶抑制劑混合物(Protease Inhibitor Cocktail)錠劑(Roche，目錄號 04693124001)。藉由於樣品緩衝液中煮沸5分鐘使H1975細胞提取物變性，經受還原條件，且於200 V下使用SDS-PAGE 4-12%聚丙烯醯胺凝膠電泳50分鐘。將蛋白質轉移至硝化纖維素膜之後，藉由於室溫下用Odyssey阻斷緩衝液(LI-COR，目錄號927-400-00)培育一小時阻斷非特異性位點。視需要將膜與以下一起培育：小鼠單株抗EGFR(1F4-標記性tEGFR；Cell Signaling，目錄號2239)；兔單株抗phospho44/42 MAPK(Erk1/2，Thr202/Tyr204，D13.14.4E-標記性pERK；Cell Signaling，目錄號4370)；兔單株抗phosphoAKT(Ser473，193H12；Cell Signaling，目錄號4058)；兔單株phospho-c-Jun(Ser73，D47G9-標記性p-c-Jun；Cell Signaling，目錄號3270)；及兔抗PCNA(FL-261)(Santa Cruz Biotechnology，目錄號sc-7907)。與一次抗體一起培育隔夜之後，將免疫墨點與適當IRDye標記之二次抗體(IR800CW山羊抗小鼠(Odyssey，目錄號926-3210)或IR800CW山羊抗兔(Odyssey，目錄號926-3211))一起培育10分鐘且使用SNAP i.d.,Protein Detection System(Millipore)經由膜抽真空。使用LI-COR Odyssey紅外成像系統(LI-COR Odyssey Infrared Imaging System)偵測條帶且使用Odyssey軟體進行分析。
抑制活體外腫瘤細胞增殖
如下活體外研究表現EGFR之細胞之細胞增殖的 抑制：以5,000個細胞/孔將HCC827及H1975癌細胞接種於96孔組織培養板中且於補充有抗生素、2 mM L-麩醯胺酸及10%胎牛血清(FCS)之RPMI-1640培養基中於37℃及5%二氧化碳下生長24小時。隨後將培養基轉換為補充有50 ng/mL EGF或200 ng/ml AREG(兩性調節蛋白；R&D Systems)之RPMI-1640(含抗生素、2 mM L-麩醯胺酸、1% FBS)，其中存在不同濃度之P1X+P2X+P3X或西妥昔單抗(Bristol-Myers Squibb)。根據製造商之說明書，使用CellTiter-Glo®(CTG)發光細胞活力分析(Luminescent Cell Viability Assay)(Promega Corporation，目錄號G7572)量測細胞活力。該CTG分析基於存在之ATP之定量量測培養物中之活細胞數目，ATP為代謝活動細胞之指標。對照處理包括存在(稱為「+EGF」或「+AREG」)或不存在(稱為「-EGF」或「-AREG」)50 ng/mL EGF或200 ng/ml AREG下用含抗生素、2 mM L-麩醯胺酸、1% FCS之RPMI-1640處理細胞。
DU145及H1975小鼠異種移植物研究
P1X、P2X及P3X Nu/nu小鼠之組合(Charles River Labs)皮下注射細胞。使所得腫瘤生長直至其達到300 mm3之平均尺寸。隨後用P1X與P2X及P3X之組合之指示濃度起始給藥，西妥昔單抗或匹配體積之PBS作為媒劑對照。以4天時間間隔進行量測且使用公式體積=π/6x(WxL2)計算腫瘤體積。將西妥昔單抗及 P1X+P2X+P3X劑量正規化以提供均一的血清暴露。
於DU145前列腺癌細胞異種移植鼠科小鼠模型中評估P1X與P2X及P3X之組合的活體內功效。向nu/nu小鼠側腹皮下注射8 x 106個DU145細胞。一旦腫瘤達到300 mm3之平均尺寸即起始治療。各組10只小鼠用以下任一者處理：媒劑對照(PBS)；2.075 mg/kg西妥昔單抗、P1X與P2X及P3X，組分濃度處於經設計以提供小鼠中分別對於P1X、P2X及P3X為2：2：1 Cmax之「鼠科比率」下，如下：P1X=2.53 mg/kg，P2X=7.26 mg/kg及P3X=0.66 mg/kg。西妥昔單抗組中之小鼠每四天給藥一次。P1X+P2X+P3X組中之小鼠每兩天給藥一次。選擇該等劑量及給藥時間間隔以提供西妥昔單抗及鼠科比率抗體三元組合之等效血清暴露。
配位體拮抗細胞結合分析
用於確定在單一或多種抗體存在下之EGF配位體結合之細胞結合分析執行如下：於37℃下用5 mL胰蛋白酶-EDTA將A431細胞剝離5分鐘。立即向該等胰蛋白酶化細胞中添加完全DMEM(10 mL)，輕輕地再懸浮且於Beckman桌上型離心機中以1200 rpm短暫離心7分鐘。以3 x 105個細胞/ml之濃度將細胞再懸浮於染色緩衝液(PBS+2% FBS+0.1%疊氮化鈉)中，且將100 μl(3 x 104個細胞)等分試樣塗於96孔滴定板中。
於染色緩衝液中以各實例中指示之濃度製備5 mL抗EGFR抗體之2x儲備溶液。於染色緩衝液中製備10 mL與生物素標簽(生物素-EGF)結合之重組人EGF配位體之3x儲備溶液，且將其中100 μl連續稀釋於200 μl染色緩衝液中。經稀釋之生物素-EGF之濃度在600 nM至9 pM範圍內。隨後將該抗EGFR抗體之100 μl等分試樣直接添加至100 μl細胞懸浮液中，得到如各實例中指示之最終濃度。將96孔板中之等分細胞與抗體稀釋液一起於室溫下培育1小時。隨後將生物素-EGF之100 μl等分試樣直接添加至100 μl細胞懸浮液中，得到200 nM、66.67 nM、22.22 nM、7.41 nM、2.47 nM、0.82 nM、0.27 nM、0.09 nM、0.03 nM、0.01 nM及0.003 nM生物素-EGF之最終濃度。將96孔板中之等分細胞與抗體及生物素-EGF稀釋液一起於室溫下培育10分鐘，用100 μl染色緩衝液洗滌1次，並隨後於Beckman桌上型離心機中以1200 rpm短暫離心7分鐘。將細胞在室溫下於暗處再懸浮於100 μl Alexa Fluor® 647抗生蛋白鏈菌素結合物(Invitrogen Life Technologies)於染色緩衝液中之1：500稀釋液中30分鐘。最後，用100 μl染色緩衝液洗滌細胞兩次，使其集結成粒且再懸浮於80 μl固定緩衝液(PBS+2%FBS+2%三聚甲醛)中，轉移至96孔U形底分析板(Becton Dickinson)中並用箔片密封且儲存於4℃下。
於FACSCALIBUR流動式細胞儀中使用FL4通道分析10,000個細胞。使用WinList 6.0軟體分析資料。將平均螢光強度(MFI)值及生物素-EGF配位體之相應 濃度分別繪於y軸及x軸。
實例1：抗原決定基定位/分區
經由親本抗體之親和力成熟產生抗體P1X、P2X及P3X。各親本抗體ca、cd及ch揭示於共同申請之專利申請案第PCT/US2011/3528號中。執行抗原決定基定位及分區實驗以證實P1X、P2X及P3X如同其各別親本分子一樣共用相同之非重疊抗原決定基。
設計該等小區以便所選擇之抗體將跨越EGFR細胞外結構域(ECD)上之三個不同、非重疊抗原決定基。該等小區分組為三種小區：Bin1定位於EGFR之結構域III且表示c225抗原決定基(西妥昔單抗結合之位點)；Bin2定位於結構域I且表示ICR10抗原決定基(Abcam Ab231)(Cochran等人(2004)Journal of Immunological Methods,287：147-158)；以及Bin3定位於結構域III且表示純系H11抗原決定基(Spangler J.等人，PNAS.107：13252-13257,2010)。產生Bin1(B1-7MT-Ala)及Bin3(B3-4MT)突變體用於EGFR細胞外結構域中以下以粗體展示之胺基酸位置處之抗原決定基定位。
於加粗胺基酸位置處使用標準重組DNA技術製備以下取代突變體以產生具有以下突變體殘基之Bin1(B1)及Bin3(B3)抗原決定基突變體：突變體
Bin1(B1)突變體殘基
B1-7MT-Ala：Q408A,Q432M,H433E,K467A,K489A,I491A,N497A
Bin3(B3)突變體殘基
B3-4MT：S380A,F381G,T382A,H383G
使用EGFR-ECD野生型(WT)、Bin1抗原決定基突變體(c225抗原決定基)或Bin3抗原決定基突變體(H11抗原決定基)作為捕捉試劑執行直接ELISA。將不同濃度(1、0.25、0.06及0.02 μg/ml)之單株抗體(mAb)P1X(Bin1)、P2X(Bin2)及P3X(Bin3)與捕捉試劑一起於室溫下培育2小時，隨後用HRP結合之抗人Fc多株抗體偵測1小時。如圖1A所示，所有三種抗體均與EGFR之WT細胞外結構域結合，而Bin1抗體P1X不與Bin1突變體抗原決定基結合，且P3X抗體不與Bin3突變體抗原決定基結合。
執行表面電漿子共振實驗以證實P2X與EGFR細胞外結構域之結構域I上之ICR10抗原決定基締合(圖1B)。將ICR10與BIACORE晶片之表面結合。注射0.5 μM EGFR-ECD，隨後相繼注射0.5 μM抗體P1X(Bin1)、P2X(Bin2)及P3X(Bin3)。雖然觀察到P1X及P3X 同時與ICR10結合之EGFR-ECD締合，但P2X顯示不締合。
為了證實針對P1X、P2X及P3X之抗原決定基不同且非重疊，執行一系列三個表面電漿子共振分區實驗。將P1X(圖2A)、P2X(圖2B)或P3X(圖2C)與BIACORE晶片之表面結合。注射0.5 μM EGFR-ECD，隨後相繼注射0.5 μM抗體P3X、P2X及P1X。注射與BIACORE晶片上所結合相同之抗體作為陰性對照。於所有三個實驗中，觀察到來自剩餘小區之兩種抗體與EGFR-ECD締合。因此，三個實驗之結果證實P1X、P2X及P3X具有非重疊、不同的抗原決定基且可同時與EGFR-ECD締合。
實例2：結合親和力
P1X、P2X及P3X對EGFR之單價親和力藉由KinExA量測。資料展示於下表1中。P1X、P2X及P3X之親和力均優於0.4 nM且相對於親本分子均改良。P1X之親和力(11 pM)比Bin 1親本分子ca(145 pM)優13.18倍。P2X之親和力(70 pM)比Bin 2親本分子cd(540 pM)優7.71倍。P3X之親和力(360 pM)比Bin 3親本分子ch(757 pM)優2.10倍。
實例3：用單一抗體進行細胞結合分析
執行細胞結合分析以證實單株抗體P1X、P2X及P3X可與A431細胞上之EGFR締合(圖3)。將A431細胞與單一抗體之稀釋系列一起培育2小時，且藉由定量流動式細胞測量術(如以上方法部分所述)量測所結合抗體之量。該等抗體之稀釋系列中使用之濃度展示於下表2中。一般技術人員應瞭解，表2中之各特定濃度值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
使用GraphPad Prism®軟體，經由對於4參數邏輯方程進行回歸，計算在該等實驗條件下之細胞上結合親和力為168 pM(P1X)、340 pM(P2X)及748 pM(P3X)。
實例4：藉由單一抗體抑制磷酸-EGF受體信號傳導
用單一抗體處理A431細胞且藉由磷酸-EGFRELISA量測其抑制EGF依賴性磷酸-EGFR活性之能力。P1X及P2X以劑量依賴性方式有效地抑制磷酸-EGFR活性，各別IC50值為3.09 nM及4.19 nM，而用P3X處理會引起部分磷酸-EGFR抑制(圖4)。該等抗體之稀釋系列中使用之濃度展示於下表3中。一般技術人員應瞭解，表3中之各特定濃度值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例
如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
實例5：藉由抗體之單一及成對組合抑制磷酸-ERK信號傳導且與親本抗體進行比較
用單一P1X或ca抗體之稀釋系列處理A431細胞且藉由磷酸-ERK ELISA量測磷酸-ERK抑制(圖5A)。P1X引起磷酸-ERK活性之劑量依賴性抑制，而ca親本抗體僅引起部分抑制。
用P1X+P3X或其各別親本抗體ca+ch之成對組合之稀釋系列處理A431細胞且藉由磷酸-ERK ELISA量測磷酸-ERK抑制(圖5B)。兩種組合皆以劑量依賴性方式抑制磷酸-ERK產生，但P1X+P3X之組合提供優良抑制。P1X+P3X之組合引起磷酸-ERK活性之82%抑制，而親本組合僅引起71%抑制，如藉由使用GraphPad Prism軟體擬合至4參數邏輯方程所計算。
用P1X+P2X或其各別親本抗體ca+cd之成對組合之稀釋系列處理A431細胞且藉由磷酸-ERK ELISA量測磷酸-ERK抑制(圖5C)。兩種組合皆以劑量依賴性方式抑制磷酸-ERK產生，但P1X+P2X之組合顯示相對親本組合IC90值存在顯著改良。
該等抗體之稀釋系列中使用之濃度展示於以下表4(關於圖5A中之資料)及表5(關於圖5B及5C中之資料)中。一般技術人員應瞭解，表4及5中之各特定濃度值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
應注意，表5中展示之濃度為使用之抗體對之總濃度。所用比率為1：1，因此抗體對中之各個別抗體佔總濃度之一半。
實例6：藉由不同組合比率之P1X、P2X及P3X抑制磷酸-ERK信號傳導
用P1X之稀釋系列處理A431細胞且藉由ELISA量測磷酸-ERK抑制(圖6A)。該等抗體之稀釋系列中使用之濃度展示於下表6中。一般技術人員應瞭解，表6中之各特定濃度值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
該實驗如方法部分中所述進行。在該等實驗條件下，P1X於飽和劑量下抑制81%之磷酸-ERK活性且IC50值為約25 nM(27 nM)。因此，IC50圖上之近似位置於圖6A中由「25 nM」表示且設定25 nM為以下實驗中P1X之恆定濃度。
用P3X+P2X之5個組合比率之稀釋系列以及25 nM之恆定P1X濃度處理A431細胞且藉由ELISA量測磷酸-ERK抑制(圖6B)。該等抗體之稀釋系列中使用之濃度展示於下表7中。一般技術人員應瞭解，表7中之各特定濃度值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
應注意，表7中展示之濃度為P2X+P3X之總濃度。P2X及P3X之個別濃度取決於指示之比率。該實驗如方法部分中所述進行。使用之P3X：P2X比率為1：0、0：1、1：2、2：1及1：1。所有比率皆抑制超過70%之磷酸-ERK活性，其中含有所有三種抗體之彼等組合提供最高抑制程度。
用P1X：P2X：P3X之6個組合比率之稀釋系列處理A431細胞且藉由ELISA量測磷酸-ERK抑制(圖6C)。該等抗體之稀釋系列中使用之濃度展示於下表8中。一般技術人員應瞭解，表8中之各特定濃度值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
該實驗如方法部分中所述進行。所用之P1X：P2X：P3X比率為1：0.01：1、1：0.1：1、1：1：1、2：0.01：1、2：0.1：1及2：2：1。所有比率皆抑制超過70%之磷酸-ERK活性。
用P1X：P2X之5個組合比率之稀釋系列處理A431細胞且藉由ELISA量測磷酸-ERK抑制(圖6D)。該等抗體之稀釋系列中使用之濃度展示於下表9中。一般技術人員應瞭解，表9中之各特定濃度值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
應注意，表9中展示之濃度為P1X+P2X之總濃度。P1X及P2X之個別濃度取決於指示之比率。該實驗如方法部分中所述進行。所用之P1X：P2X比率為1：2、5：1、9：1、50：1及1：5。該實驗中，除1：5外之所有比率(P1X：P2X)皆在所用之濃度範圍內抑制超過70%之磷 酸-ERK活性。然而，將4參數邏輯抑制曲線與1：5比率(P1X：P2X)資料擬合可預測該組合將以35.7 nM之濃度實現70%磷酸-ERK抑制，略高於該實驗中使用之劑量且明確在生理學條件下可達到之範圍內。
實例7：藉由P1X、P2X及P3X之2：2：1比率組合抑制磷酸-EGFR及磷酸-ERK信號傳導
用抗體P1X、P2X及P3X之2：2：1莫耳比率組合(於該莫耳比率下之該組合在本文中稱為「P1X+P2X+P3X」)之稀釋系列處理A431細胞且藉由ELISA量測磷酸-EGFR及磷酸-ERK抑制(圖7A)。該等抗體之稀釋系列中使用之濃度展示於下表10中。一般技術人員應瞭解，表10中之各特定濃度值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
應注意，表10中展示之濃度為P1X+P2X+P3X之總濃度。所用比率為2：2：1，因此P1X、P2X及P3X之個別濃度分別為40%、40%及20%。實驗如方法部分中所述進行。三種抗體之組合為磷酸-EGFR及磷酸-ERK活性兩者之有效抑制劑，各別IC50值為2.30 nM及9.87 nM。
將P1X+P2X+P3X與單一P1X(圖7B)及單一P2X(圖7C)相比較。用抗體之稀釋系列處理A431細胞且藉由ELISA量測磷酸-ERK抑制。用於圖7B及7C中展示之實驗之該等抗體之稀釋系列中使用之濃度展示於表11中。一般技術人員應瞭解，表11中之各特定濃度值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
應注意，表11中展示之濃度為P1X+P2X+P3X之總濃度。所用比率為2：2：1，因此P1X、P2X及P3X之 個別濃度分別為40%、40%及20%。除使用80 nM之EGF配位體刺激細胞之外，實驗如方法部分中所述進行。與P1X及P2X相比(其分別提供部分抑制及無抑制)，抗體之2：2：1比率組合為磷酸-ERK活性之有效抑制劑。
實例8：用P1X+P2X+P3X處理之後H1975細胞中之EGF受體下調及pERK、pAKT及p-c-Jun信號傳導之抑制
如以上方法部分中所述，用等於1 μM總抗體之P1X+P2X+P3X將細胞預培育2小時，隨後用50 ng/ml rhEGF(PeproTech)刺激10分鐘。用針對tEGFR、pERK、pAKT或p-c-Jun之抗體分別探測細胞溶解物之免疫墨點，且將該等條帶之密度測定法針對負載對照PCNA及對照未處理細胞之溶解物正規化。回應於P1X+P2X+P3X處理之EGF受體下調展示於圖8A中且回應於P1X+P2X+P3X處理之pERK、pAKT及p-c-Jun信號傳導之抑制展示於圖8B中。
實例9：抑制活體外腫瘤細胞增殖
藉由上述方法或其微小變化形式分析活體外腫瘤細胞增殖之抑制作用。將非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株HCC827及H1975以5000個細胞/孔塗板且用在0.1-1 μM(最終濃度)範圍內之抗體組合處理。圖9A-9D使用CellTiter-Glo®(CTG)發光細胞活力分析(Promega Corporation)展示細胞增殖之抑制作用，該分析基於存 在之ATP之定量量測培養物中之活細胞數目，ATP為代謝活動細胞之指標。圖9A及9B展示在P1X+P2X+P3X濃度範圍內對HCC827及H1975細胞生長之有效抑制，但細胞生長未藉由西妥昔單抗處理或EGF配位體存在下之單獨分析培養基(1% FCS)受到抑制。圖9C及9D展示在P1X+P2X+P3X及cetuximab兩者之濃度範圍內對HCC827及H1975細胞生長之有效抑制，但細胞生長未藉由AREG配位體存在下之單獨分析培養基(1% FCS)受到抑制。該等結果證實P1X+P2X+P3X回應於高親和力(EGF)及低親和力(AREG)配位體活體外抑制腫瘤細胞增殖之能力，而西妥昔單抗僅於用低親和力(AREG)配位體處理之細胞中有效。用於圖9A-D中展示之實驗之該等抗體之稀釋系列中使用之濃度展示於以下表12中。一般技術人員應瞭解，表12中之各特定濃度值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
應注意，表12中展示之濃度為P1X+P2X+P3X之總濃度。所用比率為2：2：1，因此P1X、P2X及P3X之個別濃度分別為40%、40%及20%。
實例10：抑制活體內腫瘤細胞增殖
於H1975肺癌細胞異種移植鼠科小鼠模型中評估P1X+P2X+P3X之活體內功效。向nu/nu小鼠側腹皮下注射2 x 106個NCI-H1975細胞。一旦腫瘤達到300 mm3之平均尺寸即起始治療。用以下處理各組10只小鼠：媒劑對照(PBS)；或以下組分濃度下之鼠科比率抗體三元組合：鼠科比率抗體三元組合-低P1X=2.53 mg/kg、P2X=7.26 mg/kg且P3X=0.66 mg/kg，或鼠科比率抗體三元組合-中等P1X=5.06 mg/kg、P2X=14.52 mg/kg及P3X=1.33 mg/kg。每兩天處理小鼠一次。
圖10A(DU145異種移植物模型)及圖10B(H1975異種移植物模型)中展示之結果證實P1X+P2X+P3X抑制活體內腫瘤細胞增殖之能力。
實例11：使用單一抗體進行配位體拮抗細胞結合分析
執行細胞結合分析以證實單株抗體P1X、P2X及P3X可拮抗A431細胞上之EGF配位體及EGF受體之相互作用。如以上方法部分中所述，用單一抗體之一種劑量培育A431細胞1小時，隨後用生物素-EGF配位體之稀釋系列培育A431細胞，且藉由定量流動式細胞測量術量測結合之生物素-EGF配位體之量。該等抗體之濃度展示於以下表13中且表示如由實例3中證實之分析所確定之細胞結合的亞飽和濃度(近似EC90濃度)。生物素-EGF之稀釋系列中使用之濃度展示於以下表14中。表13及表14中之值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
結果展示於圖11中，圖11證實單獨單一抗體(P1X、P2X及P3X)各自能夠拮抗A431細胞上之EGF配位體及EGF受體之相互作用，其中P1X及P2X顯示比P3X更有效之抑制活性。
實例12：使用單一抗體或Fab及其組合進行配位體拮抗細胞結合分析
執行細胞結合分析以確定單株抗體P1X、P2X及P3X之單一抗體及多抗體組合以及單價Fab片段P1X Fab、P2X Fab及P3X Fab之單一Fab片段及多Fab片段組合可拮抗A431細胞上之EGF配位體及EGF受體之相互作用之程度。如以上方法部分中所述，用抗體或Fab之一種劑量培育A431細胞1小時，隨後用生物素-EGF配位體之稀釋系列培育A431細胞，且藉由定量流動式細胞測量術量測結合之生物素-EGF配位體之量。 抗體及Fab之濃度為10 nM。以2：2：1比率調配三種抗體(P1X+P2X+P3X)及三種抗體(P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab)之組合且以10 nM之總濃度給藥。生物素-EGF之稀釋系列中使用之濃度展示於以上表14中。一般技術人員應瞭解，表14中之各特定濃度值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
結果展示於圖12A(單一單株抗體P1X、P2X及P3X及其組合)及圖12B(單一單價Fab片段P1X Fab、P2X Fab及P3X Fab及其組合)中。圖12A中之結果再次證實所有三種抗體皆能夠單獨拮抗A431細胞上之EGF配位體及EGF受體之相互作用，其中P1X及P2X顯示比P3X更有效之抑制活性，且P1X+P2X+P3X之三元組合亦顯示有效抑制活性。圖12B中之結果證實單獨P1X Fab顯示強抑制活性，單獨P3X Fab顯示單獨中等抑制活性且單獨P2X Fab僅顯示極小抑制活性。P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab之三元組合亦顯示強抑制活性，不過有效性不如單獨P1X Fab。
實例13：藉由P1X、P2X及P3X抗體或Fab之2：2：1莫耳比率組合抑制磷酸-EGFR及磷酸-ERK信號傳導
用抗體P1X、P2X及P3X(「P1X+P2X+P3X」)或Fab P1X Fab、P2X Fab、P3X Fab之2：2：1莫耳比率組合之稀釋系列(於該莫耳比率下之該組合在本文中稱為 「P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab」)處理A431細胞且藉由ELISA量測磷酸-EGFR及磷酸-ERK抑制。用以50 ng/mL或500 ng/mL之濃度給予之rhEGF(PeproTech)執行實驗。該等抗體及Fab之稀釋系列中使用之濃度展示於以下表15中。一般技術人員應瞭解，表15中之各特定濃度值具有某一微小實驗變化性，因此給出之各特定濃度表示約為指示濃度之值(例如，表中指示為0.1 nM之濃度表示約0.1 nM之值)。
結果展示於圖13A-D中，其中圖13A及13B展示磷酸-EGFR抑制分析之結果且圖13C及13D展示磷酸-ERK抑制分析之結果，其中圖13A及13C展示低劑量(50 ng/ml或8 nM)下之結果且圖13B及13D展示高劑量(500 ng/ml或80 nM)下之結果。
對於磷酸-EGFR之抑制作用，圖13A及13B中之結果證實兩種三元組合(P1X+P2X+P3X mAb及P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab片段)於測試之低劑量及高劑量下皆顯示強抑制作用。
對於磷酸-ERK之抑制作用，圖13C及13D中之結果證實兩種三元組合(P1X+P2X+P3X mAb及P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab片段)於測試之低劑量及高劑量下皆顯示抑制作用，其中P1X+P2X+P3X mAb組合顯示比P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab片段組合更有效之抑制作用。
實例14：用P1X+P2X+P3X、P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab或西妥昔單抗處理之後DU-145細胞中之EGF受體下調
分別用等於50 nM、100 nM及50 nM之P1X+P2X+P3X、P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab或西妥昔單抗將細胞預培育2、6或24小時。將Fab組合以P1X+P2X+P3X及西妥昔單抗之兩倍濃度給予，以產生Fab分子上之單一結合部分(相對於IgG分子上之兩個結合部分)。如以上方法部分中所述，用針對跨膜EGFR(tEGFR)之抗體探測細胞溶解物之免疫墨點且用pcna管家蛋白作為對照。回應於處理之EGF受體下調展示於圖14中。對免疫墨點進行目測檢查，結果顯示用P1X+P2X+P3X處理以時間依賴性方式引起EGFR之顯著下調，而用P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab或西妥昔單抗處理不引起EGFR之顯著下調。
等價物
熟習此項技術者將認識到或僅僅使用常規實驗即能夠探悉本文中描述之特定實施例之若干等價物。該等等價物意欲由以下申請專利範圍涵蓋。預期任何複數個從屬申請專利範圍中揭示之實施例之任何組合皆在本發明之範疇內。
以引用方式併入
上文提及之所有專利、申請中之專利申請案及專利公開案皆在此以全文引用之方式併入本文。
圖1A為長條圖，展示使用野生型EGFR-ECD抗原(WT)、Bin 1抗原決定基突變體(Bin 1 MT)及Bin 3抗原決定基突變體(Bin 3 MT)用P1X、P2X及P3X抗體進行直接ELISA抗原決定基分區實驗之結果。
圖1B為展示表面電漿子共振抗原決定基分區實驗結果之圖形，該實驗使用結合於Biacore晶片上之ICR10抗原決定基(Bin 2)，其中注射野生型EGFR-ECD抗原，隨後相繼注射P1X、P2X及P3X抗體。
圖2A為展示表面電漿子共振抗原決定基分區實驗結果之圖形，該實驗使用結合於Biacore晶片上之P1X抗體，其中注射野生型EGFR-ECD抗原，隨後相繼注射P3X、P2X及P1X抗體。
圖2B為展示表面電漿子共振抗原決定基分區實驗結果之圖形，該實驗使用結合於Biacore晶片上之P2X抗體，其中注射野生型EGFR-ECD抗原，隨後相繼注射P3X、P2X及P1X抗體。
圖2C為展示表面電漿子共振抗原決定基分區實驗結果之圖形，該實驗使用結合於Biacore晶片上之P3X抗體，其中注射野生型EGFR-ECD抗原，隨後相繼注射P3X、P2X及P1X抗體。
圖3為展示如經由流動式細胞測量術所量測，P1X、P2X及P3X抗體對於A431細胞上之EGFR之結合動力學之結果的圖形(FACS圖)。
圖4為展示磷酸-EGFR(pEGFR)ELISA之結果之圖形，顯示藉由單一抗體抑制pEGFR：使用P1X、P2X或P3X抗體之單一藥劑處理。
圖5A為展示磷酸-ERK(pERK)ELISA之結果之圖形，顯示藉由與親本(ca抗體)及親和力成熟P1X抗體之pERK抑制相比較發現之親和力成熟對pERK抑制之影響。
圖5B為展示磷酸-ERK(pERK)ELISA之結果之圖形，其比較親本(ca及ch抗體)及親和力成熟 P1X+P3X抗體之pERK抑制。
圖5C為展示磷酸-ERK(pERK)ELISA之結果之圖形，其比較親本(ca及cd抗體)及親和力成熟P1X+P2X抗體之pERK抑制。
圖6A為展示磷酸-ERK(pERK)ELISA之結果之圖形，顯示P1X抗體之pERK抑制，IC50值為約25 nM。
圖6B為展示用P3X+P2X之5個組合比率的稀釋系列以及25 nM之恆定P1X濃度處理之A431細胞的磷酸-ERK(pERK)ELISA之結果的圖形。
圖6C為展示用P1X：P2X：P3X之6個組合比率的稀釋系列處理之A431細胞的磷酸-ERK(pERK)ELISA之結果的圖形。
圖6D為展示用P1X：P2X之5個組合比率的稀釋系列處理之A431細胞的磷酸-ERK(pERK)ELISA之結果的圖形。
圖7A為展示磷酸-EGFR(pEGFR)ELISA(圓形)及磷酸-ERK(pERK)ELISA(三角形)之結果之圖形，顯示P1X：P2X：P3X之2：2：1組合之抑制作用。
圖7B為展示磷酸-ERK(pERK)ELISA之結果之圖形，顯示P1X：P2X：P3X(P1X+P2X+P3X)之2：2：1調配物相對單獨P1X單一抗體之抑制作用。
圖7C為展示磷酸-ERK(pERK)ELISA之結果之圖形，顯示P1X+P2X+P3X相對單獨P2X單一抗體之抑制作用。
圖8A為長條圖，展示H1975細胞之總EGFR(tEGFR)內化動力學之西方墨點分析結果，該等H1975細胞在用EGF刺激之前使用P1X+P2X+P3X抗體預處理各種時間段。
圖8B為長條圖，展示用EGF刺激之前使用P1X+P2X+P3X抗體預處理之H1975細胞之西方墨點分析結果，展示細胞中之tEGFR、pERK、磷酸-AKT(pAKT)及磷酸-c-Jun(p-c-Jun)之含量，且針對負載對照(PCNA)及對照未處理細胞之溶解物正規化。
圖9A為展示針對HCC827細胞之細胞活力分析之結果之圖形，顯示與西妥昔單抗相比在EGF配位體存在下用P1X+P2X+P3X抗體處理之腫瘤細胞增殖之抑制作用。
圖9B為展示針對H1975細胞之細胞活力分析之結果之圖形，其顯示與西妥昔單抗相比在EGF配位體存在下用P1X+P2X+P3X抗體處理之腫瘤細胞增殖之抑制作用。
圖9C為展示針對HCC827細胞之細胞活力分析之結果之圖形，其顯示與西妥昔單抗相比在兩性調節蛋白(AREG)配位體存在下用P1X+P2X+P3X抗體處理之腫瘤細胞增殖之抑制作用。
圖9D為展示針對H1975細胞之細胞活力分析之結果之圖形，其顯示與西妥昔單抗相比在AREG配位體存在下用P1X+P2X+P3X抗體處理之腫瘤細胞增殖之抑制 作用。
圖10A為展示DU145腫瘤異種移植小鼠模型實驗之結果之圖形，顯示與PBS及西妥昔單抗對照相比於P1X+P2X+P3X抗體處理之小鼠中活體內腫瘤體積減小。
圖10B為展示H1975腫瘤異種移植小鼠模型實驗之結果之圖形，顯示與PBS對照相比於P1X+P2X+P3X抗體處理之小鼠中活體內腫瘤體積減小。
圖11為展示配位體拮抗細胞結合分析之結果之圖形，顯示低劑量下單獨P1X、P2X或P3X之EGF配位體阻斷能力。
圖12A為展示配位體拮抗細胞結合分析之結果之圖形，顯示高劑量下單獨P1X、P2X或P3X或三元組合之EGF配位體阻斷能力。
圖12B為展示配位體拮抗細胞結合分析之結果之圖形，顯示高劑量下單獨P1X Fab、P2X Fab或P3X Fab或三元組合之EGF配位體阻斷能力。
圖13A為展示磷酸-EGFR抑制分析之結果之圖形，顯示低劑量(50 ng/ml；8 nM)下P1X+P2X+P3X或P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab之三元組合之抑制能力。
圖13B為展示磷酸-EGFR抑制分析之結果之圖形，顯示高劑量(500 ng/ml；80 nM)下P1X+P2X+P3X或P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab之三元組合之抑制能力。
圖13C為展示磷酸-ERK抑制分析之結果之圖形， 顯示低劑量(50 ng/ml；8 nM)下P1X+P2X+P3X或P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab之三元組合之抑制能力。
圖13D為展示磷酸-ERK抑制分析之結果之圖形，顯示高劑量(500 ng/ml；80 nM)下P1X+P2X+P3X或P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab之三元組合之抑制能力。
圖14為用P1X+P2X+P3X或P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab之三元組合預處理或用西妥昔單抗預處理之細胞中EGF受體下調分析之免疫墨點。使用管家蛋白pcna作為對照。

Claims (44)

  1. 一種單株抗體，其結合EGFR細胞外結構域且包含重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，其中該等重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列選自由以下組成之群：(a)分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(b)分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；及(c)分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
  2. 一種單株抗體，其與EGFR細胞外結構域結合且包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該等重鏈及輕鏈可變區序列選自由以下組成之群：(a)包含SEQ ID NO：19之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：20之輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：21之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：22之輕鏈可變區；及(c)包含SEQ ID NO：23之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：24之輕鏈可變區。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之單株抗體，其以 優於100 nM之KD與EGFR結合。
  4. 如申請專利範圍第3項之單株抗體，其以優於10 nM之KD與EGFR結合。
  5. 如申請專利範圍第3項之單株抗體，其以優於1 nM之KD與EGFR結合。
  6. 如申請專利範圍第1項或第2項之單株抗體，其為人抗體。
  7. 如申請專利範圍第1項或第2項之單株抗體，其中該抗體選自由雙特異性抗體、免疫結合物、Fab、Fab’2、ScFv、avimer、奈米體及結構域抗體組成之群。
  8. 如申請專利範圍第1項或第2項之單株抗體，其中該單株抗體選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD及IgE同型抗體組成之群。
  9. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項或第2項之單株抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  10. 一種套組，其包含如申請專利範圍第9項之醫藥組合物於容器中。
  11. 一種治療個體之癌症之方法，其包括投予該個體有效量之如申請專利範圍第9項之醫藥組合物。
  12. 如申請專利範圍第1項或第2項之單株抗體，其用於治療癌症。
  13. 一種包含兩種或三種與EGFR細胞外結構域結合之單株抗體之組合物，其中該兩種或三種單株抗體選 自由以下組成之群：(a)包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；(b)包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；及(c)包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；且其中該組合物包含(a)及(b)、(a)及(c)、(b)及(c)或(a)、(b)及(c)。
  14. 一種包含兩種或三種與EGFR細胞外結構域結合之單株抗體之組合物，其中該兩種或三種單株抗體選自由以下組成之群：(a)包含含有SEQ ID NO：19之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：20之輕鏈可變區之單株抗體；(b)包含含有SEQ ID NO：21之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：22之輕鏈可變區之單株抗體；及(c)包含含有SEQ ID NO：23之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：24之輕鏈可變區之單株抗體；且其中該組合物包含(a)及(b)、(a)及(c)、(b)及(c)或(a)、 (b)及(c)。
  15. 如申請專利範圍第13項或第14項之組合物，其中單株抗體(a)、(b)及(c)各自以優於100 nM之KD與EGFR結合。
  16. 如申請專利範圍第15項之組合物，其中單株抗體(a)、(b)及(c)各自以優於10 nM之KD與EGFR結合。
  17. 如申請專利範圍第15項之組合物，其中單株抗體(a)、(b)及(c)各自以優於1 nM之KD與EGFR結合。
  18. 如申請專利範圍第13項或第14項之組合物，其中單株抗體(a)、(b)及(c)各自為人抗體。
  19. 如申請專利範圍第13項或第14項之組合物，其中單株抗體(a)、(b)及(c)中之一或多者獨立地選自由雙特異性抗體、免疫結合物、Fab、Fab’2、ScFv、avimer、奈米體及結構域抗體組成之群。
  20. 如申請專利範圍第13項或第14項之組合物，其中單株抗體(a)、(b)及(c)各自獨立地選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD及IgE同型抗體組成之群。
  21. 如申請專利範圍第13項或第14項之組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
  22. 一種套組，其包含如申請專利範圍第21項之組合物於容器中。
  23. 一種治療個體之癌症之方法，其包含投予該個體有效量之如申請專利範圍第21項之組合物。
  24. 如申請專利範圍第13項或第14項之組合物，其用於治療癌症。
  25. 一種包含三種單株抗EGFR抗體之組合物，該組合物包含第一抗體、第二抗體及第三抗體，其中(i)該第一抗體包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(ii)該第二抗體包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；及(iii)該第三抗體包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，且其中該等第一、第二及第三抗體以彼此2：2：1之莫耳比率存在。
  26. 一種包含三種單株抗EGFR抗體之組合物，該組合物包含第一抗體、第二抗體及第三抗體，其中(i)該第一抗體包含含有SEQ ID NO：19之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：20之輕鏈可變區；(ii)該第二抗體包含含有SEQ ID NO：21之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：22之輕鏈可變區；及(iii)該第三抗體包含含有SEQ ID NO：23之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：24之輕鏈可變區，且其中該等第一、第二及第三抗體以彼此2：2：1之莫耳比率存在。
  27. 如申請專利範圍第25項或第26項之組合物，其中該第一抗體、該第二抗體及該第三抗體各自以優於100 nM之KD與EGFR結合。
  28. 如申請專利範圍第27項之組合物，其中該第一抗體、該第二抗體及該第三抗體各自以優於10 nM之KD與EGFR結合。
  29. 如申請專利範圍第27項之組合物，其中該第一抗體、該第二抗體及該第三抗體各自以優於1 nM之KD與EGFR結合。
  30. 如申請專利範圍第25項或第26項之組合物，其中該第一抗體以1 x 10-9 M至1.1 x 10-11 M範圍內之KD與EGFR結合，該第二抗體以1 x 10-9 M至7.0 x 10-11 M範圍內之KD與EGFR結合，且該第三抗體以1 x 10-9 M至3.6 x 10-10 M範圍內之KD與EGFR結合。
  31. 如申請專利範圍第25項或第26項之組合物，其中該第一抗體、該第二抗體及該第三抗體各自為人抗體。
  32. 如申請專利範圍第25項或第26項之組合物，其中該第一抗體、該第二抗體及該第三抗體中之一或多者獨立地選自由雙特異性抗體、免疫結合物、Fab、Fab’2、ScFv、avimer、奈米體及結構域抗體組成之群。
  33. 如申請專利範圍第25項或第26項之組合物，其中 該第一抗體、該第二抗體及該第三抗體各自獨立地選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD及IgE同型抗體組成之群。
  34. 如申請專利範圍第25項或第26項之組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
  35. 如申請專利範圍第34項之組合物，其為無菌組合物。
  36. 如申請專利範圍第34項之組合物，其適合於注射。
  37. 如申請專利範圍第34項之組合物，其為適合於靜脈內注射之無菌組合物。
  38. 一種套組，其包含如申請專利範圍第34項之組合物於容器中。
  39. 一種治療個體之癌症之方法，其包含投予該個體有效量之如申請專利範圍第34項之組合物。
  40. 如申請專利範圍第25項或第26項之組合物，其用於治療癌症。
  41. 一種製備抗EGFR抗體組合物之方法，該方法包含於單一組合物中組合：(a)包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；(b)包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；及 (c)包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；其中(a)、(b)及(c)以彼此2：2：1之莫耳比率組合。
  42. 一種製備抗EGFR抗體組合物之方法，該方法包含於單一組合物中組合：(a)包含含有SEQ ID NO：19之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：20之輕鏈可變區之單株抗體；(b)包含含有SEQ ID NO：21之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：22之輕鏈可變區之單株抗體；及(c)包含含有SEQ ID NO：23之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：24之輕鏈可變區之單株抗體；其中(a)、(b)及(c)以彼此2：2：1之莫耳比率組合。
  43. 一種用抗EGFR抗體治療個體之方法，該方法包含投予該個體：(a)包含分別為SEQ ID NO：1、2及3之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；(b)包含分別為SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：10、11及12之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；及(c)包含分別為SEQ ID NO：13、14及15之重鏈CDR1、 CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO：16、17及18之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列之單株抗體；其中(a)、(b)及(c)以彼此2：2：1之莫耳比率投予該個體。
  44. 一種用抗EGFR抗體治療個體之方法，該方法包含投予該個體：(a)包含含有SEQ ID NO：19之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：20之輕鏈可變區之單株抗體；(b)包含含有SEQ ID NO：21之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：22之輕鏈可變區之單株抗體；及(c)包含含有SEQ ID NO：23之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：24之輕鏈可變區之單株抗體；其中(a)、(b)及(c)以彼此2：2：1之莫耳比率投予該個體。
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