CN109402063B - 抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用，属于免疫学技术领域。所述抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株PHb‑3B4，保藏编号为CCTCC NO:C201784。所述抗猪血红蛋白单克隆抗体由抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株产生，亚型为IgG₁、效价为1:819200，亲和常数为2.8×10⁸L/mol，且该单克隆抗体与牛、人血红蛋白交差反应率均小于0.1％。本发明所述抗猪血红蛋白单克隆抗体用于检测猪血红蛋白，具有效价高、灵敏度好、特异性专一等优点。本发明所述猪血红蛋白单克隆抗体可用于研制与猪血红蛋白有关的免疫学诊断试剂，如胶体金试纸条、荧光检测试纸条及ELISA试剂盒等。

Description

抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用

技术领域

本发明涉及一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用，尤其涉及一种抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用，属于免疫学技术领域。

背景技术

随着养猪业的快速发展，猪的疫病种类也随之增加，这就使得社会上私自收购屠宰病死猪、病死猪肉逃避检疫进入市场的情况屡见不鲜，同时随着生活质量的提高，人们对肉品卫生和质量的要求也越来越高，因此对于市场上病死猪肉的建议和鉴定日益受到广泛的关注。截至到目前，市场上病死猪肉的检测方法主要是实验室检验和感官检验，但这些方法的快捷性、灵敏度和准确性都不能很好的满足我们的需要。近期有研究人员在近百头病死猪和正常屠宰猪对比试验中发现血红蛋白的含量存在很大差别，与正常屠宰的猪相比，病死猪在屠宰过程中由于放血不充分，有大量的血红蛋白留在病死猪体内。因此，认为猪血红蛋白在病死猪鉴别中可作为一个特异性指标。血红蛋白是高等生物体红细胞中具有携氧功能的一种蛋白质分子，每一个血红蛋白分子含有四个亚基，而每一个亚基又由一个血红素分子和一条肽链构成。血红蛋白分子的四个亚基分别为两个α亚基和两个β亚基，其中α亚基由141个氨基酸残基组成，β亚基由146个氨基酸残基组成。通常情况下，血红蛋白中的四个亚基可以形成松散型的四聚体α2β2形态，该四聚体很快解离，形成两个二聚体，即αβ形态。血红蛋白在溶液中通常以二聚体的形式存在。

目前，对于猪血液中的血红蛋白都是借助实验室手段，但相对比较复杂，不适合现场大批量的快速检测，于是开发研究一种简便、快速、灵敏、高效的检测方法是很有必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术缺陷，提供一种抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用。

本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。

一种抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为PHb-3B4，于2017年6月7日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201784。

进一步的，一种抗猪血红蛋白单克隆抗体，其由上述抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株产生。

上述抗猪血红蛋白单克隆抗体，亚型为IgG₁、效价为1:819200，亲和常数为2.8×10⁸L/mol，且该单克隆抗体与牛、人血红蛋白交差反应率均小于0.1％。

更进一步的，本发明提供抗猪血红蛋白单克隆抗体的应用，所述应用为在辅助鉴定猪血红蛋白的应用、辅助鉴定待测样中是否含有猪血红蛋白的应用或辅助鉴定待测样中猪血红蛋白含量的应用。

本发明提供由上述抗猪血红蛋白单克隆抗体制备的胶体金试纸条、荧光检测试纸条或ELISA试剂盒；所述胶体金试纸条、荧光检测试纸条或ELISA试剂盒中的用于以下(a)或(b)或(c)：

(a)辅助鉴定猪血红蛋白；

(b)辅助鉴定待测样中是否含有猪血红蛋白；

(c)辅助鉴定待测样中猪血红蛋白的含量；

本发明所提供的抗猪血红蛋白单克隆抗体用于检测猪血红蛋白，具有效价高、灵敏度好、特异性专一等优点。本发明所述的猪血红蛋白单克隆抗体可用于研制与猪血红蛋白有关的免疫学诊断试剂，如胶体金试纸条、荧光检测试纸条及ELISA试剂盒等。

附图说明

图1本发明所述抗猪血红蛋白单克隆抗体效价测定图

图2本发明所述抗猪血红蛋白单克隆抗体亚型测定图

图3本发明所述抗猪血红蛋白单克隆抗体亲和力测定图

本发明所述的抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株PHb-3B4，已于2017年6月7日送交中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201784。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，所列举的实施例不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供一种抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株，为小鼠杂交瘤细胞株(MouseHybridoma)，于2017年6月7日送交中国典型培养物保藏中心(缩写为CCTCC，地址：中国武汉大学，邮政编码：430072)，保藏编号为CCTCC NO：C201784。

本发明也提供了由所述抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株分泌得到的抗猪血红蛋白单克隆抗体。

以下实施例中，猪血红蛋白(纯度≥98％)，购买于Sigma公司。辣根过氧化物酶标记羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-IgG)购买于北京中杉金桥生物公司。细胞株SP2/0由本实验室所有。实验用动物为6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，为本实验室所养。

实施例1抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株和单克隆抗体的制备。

(1)杂交瘤细胞株的制备

选取4只6-8周龄、行动敏捷的雌性BLAB/c小鼠，首次将40μg的猪血红蛋白用生理盐水稀释到0.5mL，将稀释的猪血红蛋白作为抗原与弗氏完全佐剂等体积混合在一起，混匀，直接进行皮下多点注射，之后免疫过程中将弗氏完全佐剂换为弗氏不完全佐剂，免疫剂量40μg/只，每隔2周加强一次免疫，免疫流程如表1所示，3免后7天断尾取血，采用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体效价，阻断ELISA测定抗血清抑制，选取血清效价最佳的免疫小鼠的脾细胞，将其与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，再通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，经过3-5次亚克隆，筛选出阳性细胞株，继续培养，直到建立单一的抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株。

表1免疫流程

(2)抗猪血红蛋白单克隆抗体的制备

取健康的BALB/c雌性小鼠，对其腹腔提前进行已灭菌的石蜡油注射，每只注射0.5ml；7d后即可使用，将抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株扩大培养，再用培养基DMEM制成杂交瘤细胞悬浮液，每只小鼠腹腔注射0.5-1ml；间隔7d后，每天观察小鼠腹水产生情况，当观察到小鼠腹部膨胀，且行动迟缓时，用针头采集腹水，将腹水进行离心3000rpm、10min，弃上层脂肪和下层血液，收集澄清的中间层，即为腹水，-20℃保存备用。依据Page和Thorpe中的方法，用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水(Page,M.,&Thorpe,R.1996.Purification of IgGby precipitation with sodium sulfate or ammonium sulfate.The ProteinProtocols Handbook(pp.983-984).Hatfield,UK:Springer)，获得抗猪血红蛋白单克隆抗体。

实施例2本发明所述抗猪血红蛋白单克隆抗体特性鉴定

(1)抗体效价测定

以5ug/mL的猪血红蛋白为包被原，包被检测板，将纯化完成的抗猪血红蛋白单克隆抗体进行1:200、1:400、1:800、……1:409600稀释，作为一抗加入到酶标板的孔内，孵育，再加入HRP标记的羊抗小鼠的二抗，再用TMB显色，用硫酸作为终止液终止反应，结果显示纯化后的抗猪血红蛋白的单克隆抗体浓度为1mg/ml时的效价达1：819200。腹水效价也达1：819200，见图1。

(2)特异性测定

用竞争法ELISA测定腹水中抗猪血红蛋白单克隆抗体与牛血红蛋白、人血红蛋白等的交叉反应率，结果显示交叉反应率均小于0.1％，结果见表2。

表2抗猪血红蛋白单克隆抗体与牛血红蛋白、人血红蛋白交叉反应测定结果

(3)亚型测定

利用Sigma公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒进行亚型测定，结果见图1所示，该抗猪血红蛋白单克隆抗体的亚型为IgG₁型，见图2。

(4)亲和力测定

采用非竞争酶联免疫法测定猪血红蛋白单克隆抗体亲和常数，结果测定亲和常数为2.8×10⁸L/mol，见图3。

上述实施例只为说明本发明的技术构思和优点，本发明也可以具有其它的形式变化，如本领域技术人员所熟知，上述实施例仅仅起到对上述发明保护范围内的示范作用，对本领域普通技术人员来说，在本发明所限定的保护范围内还有很多常规变形和其它实施例，这些变形和实施例都将在本发明待批的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为PHb-3B4，于2017年6月7日送交中国典型培养物保藏中心 (CCTCC) 保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201784。

2.一种抗猪血红蛋白单克隆抗体，其由权利要求1所述的抗猪血红蛋白杂交瘤细胞株产生。

3.权利要求2所述的抗猪血红蛋白单克隆抗体在配制辅助鉴定猪血红蛋白检测产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测产品为胶体金试纸条、荧光检测试纸条或ELISA试剂盒。

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