KR20140048230A - 표피 성장 인자 수용체(egfr)에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

표피 성장 인자 수용체(egfr)에 대한 항체 및 이의 용도 Download PDF

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마이클 펠드하우스
앤 킹
니라지 콜리
에릭 크라울랜드
제프리 데이빗 케아른즈
알렉시 에이. 루고브스코이
울릭 닐센
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Abstract

항-EGFR 항체, 항-EGFR 항체의 조합을 포함하는 치료학적 조성물, 및 EGFR 관련 질병(예를 들면, 암)을 치료하기 위한 방법이 개시되어 있다.

Description

표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대한 항체 및 이의 용도{ANTIBODIES AGAINST EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFR) AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 미국 가출원 제61/504633호(2011년 7월 5일 출원) 및 미국 가출원 제61/558945호(2011년 11월 11일 출원)(이들 둘 다 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)의 우선권의 이익을 주장한다.
병원균의 효과적인 중화를 위한 항체를 만들기 위해 자연 면역계는 진화한다. 면역화된 동물로부터 단리된 자연 항체 제제는 기원상 다중클론이고, 특정한 항원의 1종 또는 몇몇의 에피토프로 제한되는 개별 항체와 비교하여 면역우성을 나타낸다. 성장을 차단하거나 이들이 결합하는 종양 세포를 사멸하는 항종양 항체는 매우 효과적인 암 치료제로서 개발되었다. 항종양 항체의 혼합물은 혼합물 내의 임의의 개별 항체에 의해 성취되는 것보다 큰 종양 억제 효과를 성취할 수 있다.
EGFR(ErbB1)인 표피 성장 인자 수용체에 대한 2종 이상의 중화 항체를 조합하여 이러한 결과를 성취한다. EGFR에 결합하고 이를 억제하는 항체는 의학적 가치와 상업적 가치가 큰 것으로 나타났다. 길항적이지만, 여전히 비경쟁적인 항-EGFR 항체의 쌍의 특정 조합은 어느 항체 단독의 적용보다 더 빠르게, 더 효과적으로 EGFR을 하향조절한다(Friedman et al. (2005) PNAS 102:1915-1920). 2종의 상호 경쟁적(즉, 항원에 대한 결합에 서로 경쟁적) 항-EGFR 항체의 조합은 비상승적인 것으로 나타났다. EGFR의 뚜렷한 에피토프에 대한 복수의 항체의 결합은 세포 표면 상의 복합체화된 수용체의 격자를 형성할 수 있어서, 단일 에피토프를 표적화하는 항체로 얻은 것보다 효과적인 내재화 및 분해를 발생시킨다. 항-EGFR 수용체 항체의 특정 쌍의 조합은 또한 생체내 상가적인 및 몇몇 경우에는 상승적인 항종양 활성을 발생시키는 것으로 보고되었다(Perera et al. (2005) Clin Cancer Res 11:6390-6399). 길항 항체 528과 조합된 돌연변이체 de2-7 EGFR에 대해 생육된 단일클론 항체 806은 어느 항체 단독에 의한 치료보다 신경교종 이종이식 모델에서 현저히 더 높은 항종양 활성을 나타낸다. 상승적 항종양 활성의 기전은 개별 항체에 의한 치료에 의해 유발되지 않는 신속한 EGFR 하향조절과 관련되는 것으로 나타났다. 유사하게, EGFR 인산화는 항-EGFR 항체, 세툭시맙 및 EMD55900의 다른 쌍의 존재 하에 크게 감소한다(Kamat et al. (2008) Cancer Biol Ther 7:726-33).
ErbB2인 관련 수용체를 표적화하는 항체의 특정 조합이 또한 상승하여 작용하는 것으로 나타났다(Friedman et al. (2005)). 페르투주맙과 조합된 트라스투주맙은 개별 항체가 비효과적인 용량에서 BT474 유방암 세포의 생존을 억제한다(Nahta et al. (2004) Cancer Res 64:2343-2346). 다른 연구에서, 3종의 비경쟁적 항-ErbB2 항체는 개별보다는 조합으로 BT474 세포의 훨씬 더 효과적인 실험실내 사멸을 나타내고, BT474 생체내 이종이식 모델에서 유사한 결과를 얻었다(Spiridon et al. (2002) Clin Cancer Res 8:1699-701).
1종 초과의 항체의 조합이 종양 세포에 대한 항체의 성장 억제(예를 들면, 세포독성) 효과를 증대시킬 수 있다는 다른 증거가 보고되었다. 예를 들면, 종양 항원 17-1A에 대한 단일클론 항체를 조합하고, 종양 세포 융해를 연구하여, 단일클론 항체 및 경쟁 항체의 조합이 비효과적인 반면, 2종 이상의 비경쟁 항체의 조합이 종양 세포를 완전히 융해시키는 것으로 밝혀졌다.
항체 조합 이외에, 친화도 돌연변이로 공지된 재조합 DNA 기법을 통해 재조합으로 발현된 항종양 항체의 항원 친화도를 증가시켜 더 높은 항체 효능이 또한 성취된다.
따라서, 신호전달 억제를 증대시키고 더 효과적인 세포정지 또는 세포독성 항종양 결과를 제공하는, 더 높은 종양 친화도를 갖는 항-EGFR 항체 및 이러한 고친화도 항-EGFR 항체의 조합을 포함하여, 항-EGFR 항체 및 항체 조합에 대한 종양의 반응성을 증대시키기 위해 항종양 항체 작용을 생성하기 위한 추가의 접근법 및 방법이 여전히 필요하다.
EGFR에 결합하여 다양한 EGFR 기능을 억제하는 신규한 단일클론 항체가 본 명세서에 제공된다. 이 항체는 유용한 치료 효과를 제공하고, 서로 또는 다른 항-ErbB 수용체 항체(예를 들면, 다른 항-EGFR 항체)와 조합될 때, 각각의 항체 단독의 투여와 비교하여 상승적 또는 상가적 치료 효과를 나타낼 수 있다. 이 항체는, 본 명세서에 제공된 바대로 개별적으로 또는 조합으로 투여될 때, EGFR 매개 세포 신호전달과 관련된 다양한 질병(예를 들면, 암)을 치료하는 데 유용하다. 따라서, EGFR에 결합하여 다양한 EGFR 기능을 억제하는 특성을 나타내는 단리된 신규한 단일클론 항체 및 이러한 특성을 나타내는 이러한 항체의 조합이 본 명세서에 또한 제공된다. 진단 및 치료 목적을 위한 이 항체의 용도가 또한 제공되고, 항체 및 항체 조합의 용도가 본 명세서에 개시된다.
일 실시양태에서, EGFR 세포외 도메인에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체로서, 상기 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은,
(a) 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(b) 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 및
(c) 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일클론 항체가 제공된다.
다른 실시양태에서, EGFR 세포외 도메인에 결합하고, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체로서, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은
(a) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(c) 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일클론 항체가 제공된다.
상술한 단일클론 항체는 예를 들면 100nM보다 우수한 또는 10nM보다 우수한 또는 1nM보다 우수한 또는 100pM보다 우수한 또는 10pM보다 우수한 또는 1pM보다 우수한 KD로 EGFR에 결합할 수 있다. 단일클론 항체는 본 명세서에 개시된 1 이상의 기능 특성을 나타낼 수 있다. 단일클론 항체는 예를 들면 인간 항체일 수 있다. 다른 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체, 면역접합체, Fab, Fab'2, ScFv, 아피바디(affibody)(등록상표), 아비머, 나노바디 또는 도메인 항체일 수 있다. 다른 실시양태에서, 단일클론 항체는 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 또는 IgE 아이소타입 항체일 수 있다.
임의의 1종 이상의 상술한 항-EGFR 단일클론 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 키트가 또한 제공된다. 키트는 예를 들면 컨테이너 내에 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 임의의 1종 이상의 상술한 항-EGFR 단일클론 항체를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 암을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 암의 치료를 위한(또는 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한) 상술한 항-EGFR 단일클론 항체 또는 이의 조합이 또한 제공된다.
다른 실시양태에서, EGFR 세포외 도메인에 결합하는 2종 또는 3종의 단일클론 항체를 포함하는 조성물로서, 2종 또는 3종의 단일클론 항체는
(a) 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체;
(b) 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체; 및
(c) 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 조성물은 (a)와 (b), (a)와 (c), (b)와 (c), 또는 (a)와 (b)와 (c)를 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, EGFR 세포외 도메인에 결합하는 2종 또는 3종의 단일클론 항체를 포함하는 조성물로서, 2종 또는 3종의 단일클론 항체는
(a) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;
(b) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체; 및
(c) 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 조성물은 (a)와 (b), (a)와 (c), (b)와 (c), 또는 (a)와 (b)와 (c)를 포함하는 조성물이 제공된다.
2종 또는 3종의 항체를 포함하는 상술한 조성물 내의 각각의 단일클론 항체 (a), (b) 및 (c)는, 예를 들면 100nM보다 우수한 또는 10nM보다 우수한 또는 1nM보다 양호한 KD로 EGFR에 결합할 수 있다. 각각의 단일클론 항체 (a), (b) 및 (c)는 본 명세서에 개시된 기능 특성 중 1 이상을 나타낼 수 있다. 각각의 단일클론 항체 (a), (b) 및 (c)는 예를 들면 인간 항체일 수 있다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 단일클론 항체 (a), (b) 및 (c)는 이중특이적 항체, 면역접합체, Fab, Fab'2, ScFv, 아피바디(등록상표), 아비머, 나노바디 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 다른 실시양태에서, 각각의 단일클론 항체 (a), (b) 및 (c)는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE 아이소타입 항체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 단일클론 항체 (a), (b) 및 (c)는 또한 IgY 및 카멜리드 항체의 형태일 수 있다.
2종 또는 3종의 항-EGFR 단일클론 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 임의의 1종의 상술한 조성물을 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 키트가 또한 제공된다. 키트는 예를 들면 컨테이너 내에 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 2종 또는 3종의 항-EGFR 단일클론 항체를 포함하는 임의의 1종의 상술한 조성물을 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 암을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 암의 치료를 위한 2종 또는 3종의 항-EGFR 단일클론 항체를 포함하는 상술한 조성물(및 약제의 제조를 위한 이의 용도)이 또한 제공된다.
다른 실시양태에서, 3종의 단일클론 항-EGFR 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체를 포함하되, (ⅰ) 상기 제1 항체는 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고; (ⅱ) 상기 제2 항체는 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며; (ⅲ) 상기 제3 항체는 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체는 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 존재하는 조성물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 3종의 단일클론 항-EGFR 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체를 포함하되, (ⅰ) 상기 제1 항체는 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; (ⅱ) 상기 제2 항체는 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며; (ⅲ) 상기 제3 항체는 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체는 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 존재하는 조성물이 제공된다.
상술한 조성물 내의 각각의 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체는, 예를 들면 100nM보다 우수한 또는 10nM보다 우수한 또는 1nM보다 양호한 KD로 EGFR에 결합할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 항체는 1 x 10-9M 내지 1.1 x 10-11M 범위의 KD로 EGFR에 결합하고, 제2 항체는 1 x 10-9M 내지 7.0 x 10-11M 범위의 KD로 EGFR에 결합하고, 제3 항체는 1 x 10-9M 내지 3.6 x 10-10M 범위의 KD로 EGFR에 결합한다. 상술한 조성물 내의 각각의 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체는 본 명세서에 개시된 기능 특성 중 1 이상을 나타낼 수 있다. 상술한 조성물 내의 각각의 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체는 예를 들면 인간 항체일 수 있다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체는 이중특이적 항체, 면역접합체, Fab, Fab'2, ScFv, 아피바디, 아비머, 나노바디 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 다른 실시양태에서, 각각의 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE 아이소타입 항체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
2:2:1 비의 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 임의의 1종의 상술한 항-EGFR 조성물을 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 일 실시양태에서, 약제학적 조성물은 무균 조성물이다. 다른 실시양태에서, 약제학적 조성물은 주사에 적합하다. 또 다른 실시양태에서, 약제학적 조성물은 정맥 주사에 적합한 무균 조성물이다. 키트가 또한 제공된다. 키트는 예를 들면 컨테이너 내에 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 2:2:1 비의 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체를 포함하는 임의의 1종의 상술한 항-EGFR 조성물을 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 암을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 2:2:1 비의 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체를 포함하는 임의의 상술한 항-EGFR 조성물의 용도가 또한 제공된다.
다른 실시양태에서, 항-EGFR 항체 조성물을 제조하는 방법으로서,
(a) 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체;
(b) 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체; 및
(c) 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체를 단일 조성물로 배합하는 단계를 포함하되;
(a), (b) 및 (c)를 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 배합하는 제조 방법이 제공된다.
다른 실시양태에서, 항-EGFR 항체 조성물을 제조하는 방법으로서,
(a) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;
(b) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체; 및
(c) 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체를 단일 조성물로 배합하는 단계를 포함하되;
(a), (b) 및 (c)를 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 배합하는 제조 방법이 제공된다.
다른 실시양태에서, 항-EGFR 항체로 피험체를 치료하는 방법으로서,
(a) 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체;
(b) 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체; 및
(c) 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체를 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하되;
(a), (b) 및 (c)를 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 상기 피험체에게 투여하는 치료 방법이 제공된다.
다른 실시양태에서, 항-EGFR 항체로 피험체를 치료하는 방법으로서,
(a) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;
(b) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체; 및
(c) 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체를 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하되;
(a), (b) 및 (c)를 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 상기 피험체에게 투여하는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명확하다.
도 1a는 야생형 EGFR-ECD 항원(WT), 1빈(Bin) 에피토프 돌연변이체(1빈 MT) 및 3빈 에피토프 돌연변이체(3빈 MT)를 사용하는 P1X, P2X 및 P3X 항체에 의한 직접적 ELISA 에피토프 비닝(binning) 실험의 결과를 나타내는 막대 그래프;
도 1b는 야생형 EGFR-ECD 항원의 주사, 이어서 P1X, P2X 및 P3X 항체의 순차적 주사에 의한 비아코어(Biacore) 칩에 접합된 ICR10 에피토프(2빈)를 사용하는 표면 플라스몬 공명 에피토프 비닝 실험의 결과를 나타내는 그래프;
도 2a는 야생형 EGFR-ECD 항원의 주사, 이어서 P3X, P2X 및 P1X 항체의 순차적 주사에 의한 비아코어 칩에 접합된 P1X 항체를 사용하는 표면 플라스몬 공명 에피토프 비닝 실험의 결과를 나타내는 그래프;
도 2b는 야생형 EGFR-ECD 항원의 주사, 이어서 P3X, P2X 및 P1X 항체의 순차적 주사에 의한 비아코어 칩에 접합된 P2X 항체를 사용하는 표면 플라스몬 공명 에피토프 비닝 실험의 결과를 나타내는 그래프;
도 2c는 야생형 EGFR-ECD 항원의 주사, 이어서 P3X, P2X 및 P1X 항체의 순차적 주사에 의한 비아코어 칩에 접합된 P3X 항체를 사용하는 표면 플라스몬 공명 에피토프 비닝 실험의 결과를 나타내는 그래프;
도 3은 유세포 분석법(FACS 도면)을 통해 측정된 A431 세포 상의 EGFR에 대한 P1X, P2X 및 P3X 항체 결합 동력학의 결과를 나타내는 그래프;
도 4는 P1X, P2X 또는 P3X 항체에 의한 단일제 치료인 단일 항체에 의한 pEGFR 억제를 나타내는 포스포-EGFR(pEGFR) ELISA의 결과를 나타내는 그래프;
도 5a는 모 P1X 항체(ca 항체) 및 친화도 돌연변이된 P1X 항체에 의한 pERK 억제의 비교에 의해 pERK 억제에 미치는 친화도 돌연변이의 효과를 나타내는 포스포-ERK(pERK) ELISA의 결과를 나타내는 그래프;
도 5b는 모 P1X + P3X 항체(ca 및 ch 항체) 및 친화도 돌연변이된 P1X + P3X 항체에 의한 pERK 억제를 비교하는 포스포-ERK(pERK) ELISA의 결과를 나타내는 그래프;
도 5c는 모 P1X + P2X 항체(ca 및 cd 항체) 및 친화도 돌연변이된 P1X + P2X 항체에 의한 pERK 억제를 비교하는 포스포-ERK(pERK) ELISA의 결과를 나타내는 그래프;
도 6a는 IC50 값이 대략 25nM인 P1X 항체에 의한 pERK 억제를 나타내는 포스포-ERK(pERK) ELISA의 결과를 나타내는 그래프;
도 6b는 25nM의 일정한 P1X 농도와 조합된 P3X + P2X의 5의 조합 비율의 희석 시리즈에 의해 치료된 A431 세포에 대한 포스포-ERK(pERK) ELISA의 결과를 나타내는 그래프;
도 6c는 P1X:P2X:P3X의 6의 조합 비율의 희석 시리즈에 의해 치료된 A431 세포에 대한 포스포-ERK(pERK) ELISA의 결과를 나타내는 그래프;
도 6d는 P1X:P2X의 5의 조합 비율의 희석 시리즈에 의해 치료된 A431 세포에 대한 포스포-ERK(pERK) ELISA의 결과를 나타내는 그래프;
도 7a는 P1X:P2X:P3X의 2:2:1 조합에 의한 억제를 나타내는 포스포-EGFR(pEGFR) ELISA(원형) 및 포스포-ERK(pERK) ELISA(삼각형)의 결과를 나타내는 그래프;
도 7b는 P1X:P2X:P3X(P1X + P2X + P3X)의 2:2:1 제제 대 P1X 단일 항체 단독에 의한 억제를 나타내는 포스포-ERK(pERK) ELISA의 결과를 나타내는 그래프;
도 7c는 P1X + P2X + P3X 대 P2X 단일 항체 단독에 의한 억제를 나타내는 포스포-ERK(pERK) ELISA의 결과를 나타내는 그래프;
도 8a는 EGF에 의한 자극 전에 다양한 시간에 대한 P1X + P2X + P3X 항체로 전치료된 H1975 세포의 전체 EGFR(tEGFR) 내재화 동력학에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내는 막대 그래프;
도 8b는, 로딩 대조군(PCNA) 및 대조군 비치료 세포의 융해물로 정규화된, 세포에서 tEGFR, pERK, 포스포-AKT(pAKT) 및 포스포-c-Jun(p-c-Jun)의 수준을 나타내는, EGF에 의한 자극 전에 P1X + P2X + P3X 항체로 전치료된 H1975 세포에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내는 막대 그래프;
도 9a는 세툭시맙과 비교하여 EGF 리간드의 존재 하에 P1X + P2X + P3X 항체에 의한 치료에 의한 종양 세포 증식 억제를 나타내는 HCC827 세포에 대한 세포 생존능력 검정의 결과를 나타내는 그래프;
도 9b는 세툭시맙과 비교하여 EGF 리간드의 존재 하에 P1X + P2X + P3X 항체에 의한 치료에 의한 종양 세포 증식 억제를 나타내는 H1975 세포에 대한 세포 생존능력 검정의 결과를 나타내는 그래프;
도 9c는 세툭시맙과 비교하여 암피레굴린(amphiregulin: AREG) 리간드의 존재 하에 P1X + P2X + P3X 항체에 의한 치료에 의한 종양 세포 증식 억제를 나타내는 HCC827 세포에 대한 세포 생존능력 검정의 결과를 나타내는 그래프;
도 9d는 세툭시맙과 비교하여 AREG 리간드의 존재 하에 P1X + P2X + P3X 항체에 의한 치료에 의한 종양 세포 증식 억제를 나타내는 H1975 세포에 대한 세포 생존능력 검정의 결과를 나타내는 그래프;
도 10a는 PBS 및 세툭시맙 대조군과 비교하여 P1X + P2X + P3X 항체로 치료된 마우스에서 생체내 종양 용적 감소를 나타내는 DU145 종양 이종이식 마우스 모델 실험의 결과를 나타내는 그래프;
도 10b는 PBS 대조군과 비교하여 P1X + P2X + P3X 항체로 치료된 마우스에서 생체내 종양 용적 감소를 나타내는 H1975 종양 이종이식 마우스 모델 실험의 결과를 나타내는 그래프;
도 11은 저용량에서 P1X, P2X 또는 P3X 단독의 EGF 리간드 차단 능력을 나타내는 리간드 길항작용 세포 결합 검정의 결과를 나타내는 그래프;
도 12a는 고용량에서 P1X, P2X 또는 P3X 단독 또는 이의 3중 조합의 EGF 리간드 차단 능력을 나타내는 리간드 길항작용 세포 결합 검정의 결과를 나타내는 그래프;
도 12b는 고용량에서 P1X Fab, P2X Fab 또는 P3X Fab 단독 또는 이의 3중 조합의 EGF 리간드 차단 능력을 나타내는 리간드 길항작용 세포 결합 검정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13a는 저용량(50ng/㎖; 8nM)에서 P1X + P2X + P3X 또는 P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab의 3중 조합의 억제 능력을 나타내는 포스포-EGFR 억제 검정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13b는 고용량(500ng/㎖; 80nM)에서 P1X + P2X + P3X 또는 P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab의 3중 조합의 억제 능력을 나타내는 포스포-EGFR 억제 검정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13c는 저용량(50ng/㎖; 8nM)에서 P1X + P2X + P3X 또는 P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab의 3중 조합의 억제 능력을 나타내는 포스포-ERK 억제 검정의 결과를 나타내는 그래프;
도 13d는 고용량(500ng/㎖; 80nM)에서 P1X + P2X + P3X 또는 P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab의 3중 조합의 억제 능력을 나타내는 포스포-ERK 억제 검정의 결과를 나타내는 그래프;
도 14는 P1X + P2X + P3X 또는 P1X Fab+P2X Fab+P3X Fab의 3중 조합 또는 세툭시맙에 의해 전치료된 세포에서 EGF-수용체 하향조절 검정의 면역블롯이다. 관리(housekeeping) 단백질 pcna를 대조군으로서 사용하였다.
Ⅰ. 정의
용어 "EGFR", "ErbB1" 및 "EGF 수용체"는 인간 EGFR 단백질을 의미하기 위해 본 명세서에 상호 교환적으로 사용되고; UniProtKB/스위스-프로트(Swiss-Prot) 목록 P00533을 참조한다. 인간 EGFR의 세포외 도메인(EGFR-ECD)의 아미노산 서열은 실시예 1 및 서열 번호 33에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "억제"는 활성의 완전 차단을 비롯하여 임의의 통계학적으로 유의적인 생물학적 활성의 감소를 의미한다. 예를 들면, "억제"는 통계학적으로 유의적인 생물학적 활성의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 약 100%의 감소를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 인산화 억제는 항체의 부재(대조군) 하의 신호전달에 비해 기질 단백질의 인산화를 통계학적으로 유의적으로 감소시키는 항체의 능력을 의미한다. 당해 분야에 공지된 바대로, 세포내 신호전달 경로는, 예를 들면 포스포이노시타이드 3'-키나아제/Akt(PI3K/Akt/PTEN 또는 "AKT") 및/또는 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK/ERK 또는 "ERK") 경로를 포함한다. 또한 당해 분야에 공지된 바대로, 기질의 인산화 수치(예를 들면, AKT 및/또는 ERK의 인산화 또는 무 인산화)에 대해 평가하여 EGFR 매개 신호전달을 측정할 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 항-EGFR 항체 조합 및 조성물은 이러한 항체의 부재(대조군) 하의 AKT 및/또는 ERK의 인산화 수치에 비해 AKT 및 ERK 중 어느 하나 또는 둘 다의 적어도 10% 또는 적어도 20% 또는 적어도 30% 또는 적어도 40% 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 약 100%의 통계학적으로 유의적인 인산화 수치 억제를 제공한다. EGFR을 포함하는 세포 캐스케이드에서 단백질을 측정하는 분야 인정 기법, 예를 들면 ELISA, 웨스턴 또는 멀티플렉스 방법, 예컨대 루미넥스(Luminex)(등록상표)를 이용하여 이러한 EGFR 매개 신호전달을 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "EGFR을 발현하는 세포의 성장 억제" 구문은 생체내 또는 실험실내 항체의 부재(대조군) 하의 세포의 성장에 비해 EGFR을 발현하는 세포의 성장을 통계학적으로 유의적으로 감소시키는 항체의 능력을 의미한다. 일 실시양태에서, EGFR을 발현하는 세포(예를 들면, 암 세포)의 성장은, 세포가 본 명세서에 개시된 조합의 항체 조성물과 접촉할 때, 조합의 항체 조성물의 부재(대조군) 하에 측정된 성장에 비해, 적어도 10% 또는 적어도 20% 또는 적어도 30% 또는 적어도 40% 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 약 100% 감소할 수 있다. 세포 분열 속도, 세포 분열을 겪는 세포 집단 내의 세포 분획 및/또는 종말 분화 또는 세포사로 인한 세포 집단으로부터의 세포 손실 속도를 측정하는 분야 인정 기법(예를 들면, 세포 역가 성장 검정 또는 티미딘 혼입)을 이용하여 세포 성장을 평가할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "EGFR에 결합하는 EGFR 리간드의 억제" 구문은 항체의 부재(대조군) 하의 EGFR 리간드 결합에 비해 EGFR 리간드의 EGFR인 이의 수용체에 대한 결합을 통계학적으로 유의적으로 감소시키는 항체의 능력을 의미한다. 이는, 항체의 존재 하에, 대조군(항체 무)에 비해 EGFR에 결합하는 EGFR 리간드의 양이 통계학적으로 유의적으로 감소한다는 것을 의미한다. EGFR에 결합하는 EGFR 리간드의 양은 항체의 부재(대조군) 하의 양에 비해 본 명세서에 개시된 항체 조성물 또는 조합의 존재 하에 적어도 10% 또는 적어도 20% 또는 적어도 30% 또는 적어도 40% 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 약 100% 감소할 수 있다. 항체의 존재 또는 부재(대조군) 하의 EGFR을 발현하는 세포에 대한 라벨링된 EGFR 리간드(예를 들면, 방사성 라벨링된 EGF 또는 방사성 라벨링된 베타셀룰린)의 결합 수준을 측정하는 분야 인정 기법을 이용하여 EGFR 리간드 결합의 감소를 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "EGFR 이합체화의 억제" 구문은 항체의 부재(대조군) 하의 EGFR 이합체화에 비해 EGFR 이합체화(다른 ErbB 수용체와 쌍을 이뤄 동형이량체를 형성하는 것, 예를 들면 ErbB1/ErbB1 페어링 또는 이형이량체를 형성하는 것, 예를 들면 ErbB1/ErbB3 페어링)를 통계학적으로 유의적으로 감소시키는 항체의 능력을 의미한다. 일 실시양태에서, EGFR의 이합체화는, EGFR을 발현하는 세포가 본 명세서에 개시된 항체 조성물 또는 조합과 접촉할 때, 항체의 부재(대조군) 하에 측정된 EGFR의 이합체화에 비해, 적어도 10% 또는 적어도 20% 또는 적어도 30% 또는 적어도 40% 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 약 100% 감소할 수 있다. 항체의 존재 또는 부재(대조군) 하의 EGFR 이합체화 수준을 측정하는 분야 인정 기법을 이용하여 EGFR 이합체화의 감소를 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "EGFR 발현의 하향조절" 구문은 항체의 부재(대조군) 하의 EGFR 발현에 비해, 예를 들면 세포내 소포로부터의 EGFR의 내재화 증가 및/또는 EGFR의 재순환 감소에 의한 세포 표면 상의 EGFR의 발현을 통계학적으로 유의적으로 감소시키는 항체의 능력을 의미한다. 일 실시양태에서, EGFR 발현은, EGFR을 발현하는 세포가 본 명세서에 제공된 조합의 항체 조성물과 접촉할 때, 항체의 부재(대조군) 하에 측정된 세포 표면 상의 EGFR 발현에 비해, 적어도 10% 또는 적어도 20% 또는 적어도 30% 또는 적어도 40% 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 약 100% 감소할 수 있다. 세포 표면 상의 EGFR 발현의 하향조절은, 예를 들면 수용체의 내재화/재순환 증가 및/또는 수용체의 내재화/분해 증가를 포함한다. 항체의 존재 또는 부재(대조군) 하의 EGFR 내재화 수준을 측정하는 분야 인정 기법을 이용하여 EGFR 내재화 증가를 측정할 수 있다.
(본 명세서에 기재된) EGFR 항체의 조합과 관련하여, 본 명세서에서 사용되 는 "상가적" 또는 "상가효과" 단어는 (세포 성장 억제와 같은 특정 기능에 대한) 2종 이상의 항체의 조합 활성이 이의 개별적인 활성의 합과 같은 이러한 항체의 활성을 의미한다. 즉, EGFR을 발현하는 세포 상에 개별적으로 작용할 때의 본 명세서에서 제공된 2종 이상의 항체의 활성의 합이 동일한 세포에 함께 작용하는 동일한 항체의 조합 효과와 거의 동일하다. 일 실시양태에서, 상기 기재된 임의의 특성(예를 들면, AKT 또는 ERK 인산화 억제, EGFR을 발현하는 세포의 성장 억제 등)과 관련하여 상가적 효과를 측정한다.
본 명세서에서 사용되는 "상승효과" 또는 "상승적" 단어는 (세포 성장 억제와 같은 특정 기능에 대한) 2종 이상의 항체의 조합 활성이 이의 개별적인 활성의 예상된 상가적 효과보다 큰 이러한 항체의 활성을 의미한다. 예를 들면, 블리스(Bliss) 독립 기준에 따라 예상된 상가적 효과를 정의할 수 있다. 블리스 기준에 따라, 2종 이상의 약물(예를 들면, 항체)의 효과는 개별 약물의 효과의 합에 개별 약물의 효과의 곱을 뺀 것이다:
Figure pct00001
상기 식 중, E1은 1 약물의 억제율(%)이고, E2는 2 약물의 억제율(%)이며, E12는 조합의 예상된 억제율(%)이다.
상승적 효과는 본 명세서에 기재된 임의의 특성(예를 들면, EGFR 의존적 AKT 또는 ERK 인산화 억제, EGFR을 발현하는 세포의 성장 억제 등)에 적용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 조합 항체의 개별 활성의 상가적 효과에 비해 조합 항체의 활성의 적어도 10% 또는 적어도 20% 또는 적어도 30% 또는 적어도 40% 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 이상의 증가가 성취된다.
본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편(항원-결합 부분) 또는 이의 단쇄 동족체를 포함한다. "항체"는 적어도 하나의 중쇄(H) 및 하나의 경쇄(L)를 포함한다. 천연 IgG에서, 예를 들면 이 중쇄 및 경쇄는 이황화 결합에 의해 상호 연결되고, 2개의 쌍을 지은 중쇄 및 경쇄가 존재하고, 이 2개는 이황화 결합에 의해 또한 상호 연결된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH라 축약) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL이라 축약) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 CL의 1개의 도메인으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(framework region: FR) 또는 결합(J) 영역(중쇄 및 경쇄에서 각각 JH 또는 JL)이라 칭하는 더 보존적인 영역과 배치되는 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)이라 칭하는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, J의 순서로 배치된 3개의 CDR, 3개의 FR 및 1개의 J 도메인으로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 결합한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들면, 이팩터 세포) 또는 전통적인 보체 시스템의 제1 성분(Clq)과 같은 체액성 인자를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 중재할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 조합에서 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1 이상의 단편(예를 들면, EGFR)을 사용할 수 있다. 전장 항체의 단편이 항체의 항원 결합 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 항원-결합 부분 또는 단편이라 칭하는 결합 단편의 예는 (ⅰ) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ⅱ) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (ⅲ) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (ⅳ) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (ⅴ) VH 및 VL 도메인을 포함하는 dAb; (ⅵ) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546); (ⅶ) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb; 및 (ⅷ) 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (ⅷ) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2종 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 더욱이, VL 및 VH인 Fv 단편의 2개의 도메인이 각각의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들이 단백질 단쇄(여기서, VL 및 VH 영역은 1가 분자(면역글로불린 단편의 이러한 단쇄 동족체는 단쇄 Fv(scFv)로 공지됨)를 형성하도록 쌍을 지음)로 제조되게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 이들을 연결할 수 있다. 이러한 단쇄 항체는 용어 "항체" 내에 포함되도록 또한 의도된다. 당해 분야의 당업자에게 공지된 종래 기법을 이용하여 항체 단편을 얻고, 완전한 항체에서와 동일한 일반적인 방식으로 사용하기 위해 이 단편을 스크리닝한다. 재조합 DNA 기법, 또는 완전한 면역글로불린의 효소 또는 화학 절단에 의해 항원-결합 부분을 제조할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종성인 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 의미하고, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 소량 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고 동일하다. 이러한 면역글로불린의 항원 결합 단편(scFv 포함)은 본 명세서에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"에 또한 포함된다. 단일클론 항체는 단일 항원 자리에 지정되는 고특이적이다. 더욱이, 상이한 결정기(에피토프)에 지정되는 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 종래(다중클론) 항체 제제와 반대로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 지정된다. 임의의 분야 인정 기법 및 본 명세서에 기재된 것, 예를 들면 하이브리도마 방법, 형질전환 동물, 재조합 DNA 방법(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 참조) 등을 이용하여 또는 예를 들면 미국 특허 제7,388,088호 및 미국 특허 출원 제09/856,907호(PCT 국제 공보 WO 제00/31246호)에 기재된 기법을 이용한 파지 항체 라이브러리를 사용하여 단일클론 항체를 제조할 수 있다. 단일클론 항체는 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체를 포함하고, 천연으로 발생하거나 재조합으로 제조될 수 있다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 항체, 예컨대 (a) 면역글로불린 유전자(예를 들면, 인간 면역글로불린 유전자) 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 형질전환 또는 트랜스염색체된 동물(예를 들면, 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 예를 들면 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, (c) 파지 디스플레이를 이용하여 재조합, 조합 항체 라이브러리(예를 들면, 인간 항체 서열 포함)로부터 단리된 항체 및 (d) 다른 DNA 서열에 대한 면역글로불린 유전자 서열(예를 들면, 인간 면역글로불린 유전자)의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 항체를 의미한다. 이러한 재조합 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 영역 및 불변 영역을 가질 수 있다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체를 실험실내 돌연변이유발로 처리할 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 이것과 관련되지만, 생체내 인간 항체 생식선 래퍼토리 내에 천연으로 존재할 수 없는 서열이다.
용어 "키메라 면역글로불린" 또는 항체는 가변 영역이 제1 종으로부터 유도되고 불변 영역이 제2 종으로부터 유도되는 면역글로불린 또는 항체를 의미한다. 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 분절로부터 예를 들면 유전 조작에 의해 키메라 면역글로불린 또는 항체를 구성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 예를 들면 카밧(Kabat) 등이 기재한 바대로(문헌[Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 미국 보건 사회 복지부(U.S. Department of Health and Human Services), NIH 공개 91-3242호] 참조) 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 더욱이, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된다. 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 실험실내 랜덤 또는 자리 특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 유발된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그래프팅된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 활성 증대 아미노산 잔기와 같은 아미노산 잔기로 대체된 적어도 1종 이상의 아미노산을 가지리 수 있다. 통상적으로, 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열의 일부가 아닌 아미노산 잔기로 대체된 20개 이상의 위치를 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이러한 대체는 하기 자세히 기재된 바대로 CDR 영역 내에 있다.
용어 "인간화 항체"는 적어도 1종의 인간화 항체 사슬(즉, 적어도 1종의 인간화 경쇄 또는 중쇄)을 포함하는 항체를 의미한다. 용어 "인간화 항체 사슬"(즉, "인간화 면역글로불린 경쇄")은 실질적으로 인간 항체로부터의 가변 프레임워크 영역 및 실질적으로 비인간 항체로부터의 상보성 결정 영역(CDR)(예를 들면, 적어도 1종의 CDR, 2종의 CDR 또는 3종의 CDR)을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체 사슬(즉, 각각 경쇄 또는 중쇄)을 의미하고, 불변 영역(예를 들면, 경쇄의 경우 1종의 불변 영역 또는 이의 일부 및 중쇄의 경우 바람직하게는 3종의 불변 영역)을 추가로 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "단리된"은 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로 포함하지 않는, 항체 또는 2종, 3종 또는 4종의 항체의 조합(예를 들면, 항체 ca, cf 및 ch의 단리된 조성물, 이들 각각은 EGFR에 특이적으로 결합하고, EGFR 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 포함하지 않음)을 의미하도록 의도된다. 또한, 단리된 항체는 통상적으로 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 포함하지 않는다. 일 실시양태에서, 상이한 EGFR 결합 특이성을 갖는 "단리된" 단일클론 항체의 조합이 잘 정의된 조성물에서 조합된다.
본 명세서에서 사용되는 "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩된 항체 종류(예를 들면, IgM 또는 IgG1)를 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 단일클론 항체 조성물은 오직 IgG1 아이소타입의 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 단일클론 항체 조성물은 오직 IgG2 아이소타입의 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 단일클론 항체 조성물은 2종 또는 3종의 상이한 아이소타입의 항체를 포함한다.
"항원"은 항체가 결합하는 집합체(예를 들면, 단백질성 집합체 또는 펩타이드)이다. 다양한 실시양태에서, 항원은 EGF이다. 특정한 실시양태에서, 항원은 인간 EGFR이다.
따라서, 본 명세서에 기재된 조합의 특정한 항체에 의해 인식된 에피토프의 전부 또는 일부를 포함하는 EGFR 상의 에피토프에 결합하는 항체의 조합이 본 개시내용에 또한 포함된다. 다른 실시양태에서, EGFR에 대한 결합에 대해 본 명세서에 기재된 항체와 경쟁하는 항체가 제공된다. 예를 들면, 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는 1종의 항체의 능력을 나타냄으로써 면역검정, 즉 경쟁적 결합 검정과 같은 일상적 기법을 이용하여 경쟁 항체 및 동일한 또는 중첩 에피토프를 인식하는 항체를 확인할 수 있다. 예컨대, 하기 실시예에 기재된 검정을 이용하여 경쟁적 결합을 결정할 수 있다.
용어 "특이적 결합", "특이적으로 결합한다", "선택적 결합" 및 "선택적으로 결합한다"는 항체가 특정한 항원 또는 에피토프에 상당한 친화도를 나타내고, 일반적으로 다른 항원 및 에피토프와 현저한 상호 반응성을 나타내지 않는다는 것을 의미한다. "상당한" 또는 바람직한 결합은 106, 107, 108, 109 또는 1010M-1보다 우수한 KD로의 결합을 포함한다. 항체 항원 상호작용의 KD(친화도 상수)는 항원 분자 및 항체의 50%가 함께 결합하는 항체의 농도를 나타낸다. 따라서, 적합한 고정된 항원 농도에서, 더 높은(즉, 더 강한) 친화도 항체의 50%가 더 낮은 친화도 항체와 동일한 결합(%)을 성취하기 위해 필요한 것보다 낮은 항체 농도에서 항원 분자에 결합한다. 따라서, 더 낮은 KD 값은 더 높은(더 강한) 친화도를 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는, "더 우수한" 친화도는 더 강한 친화도이고, 이의 비교자보다 낮은 숫자 값을 갖고, 107M-1의 KD는 더 낮은 숫자 값이고, 따라서 106M-1의 KD보다 우수한 친화도를 나타낸다. 107M-1보다 우수한(즉, 더 낮은 KD 값을 갖고, 따라서 더 강한), 바람직하게는 108M-1보다 우수한 친화도가 일반적으로 바람직하다. 본 명세서에 기재된 것에 중간인 값이 또한 고려되고, 바람직한 결합 친화도는 친화도의 범위로서 표시될 수 있고, 예를 들면 본 명세서에 개시된 항-EGFR 항체에 대한 바람직한 결합 친화도는 106 내지 1012M-1, 바람직하게는 107 내지 1012M-1, 더 바람직하게는 108 내지 1012M-1이다. "현저한 상호 반응성을 나타내지 않는" 항체는 비표적 항원(예를 들면, 비EGFR 단백질)에 상당히 결합하지 않는 것이다. 예를 들면, 일 실시양태에서, EGFR에 특이적으로 결합하는 항체는 ErbB1(EGFR) 이외의 ErbB 분자 또는 비ErbB 단백질 또는 펩타이드에 비해 EGFR보다 적어도 2, 바람직하게는 3 또는 4 차수 이상의 양의 더 우수한 결합 친화도(즉, 2, 3 또는 4 차수 이상의 양의 더 낮은 KD 값을 나타내는 결합)를 나타낸다. 이러한 결합을 결정하기 위한 임의의 분야 인정 수단, 예를 들면 본 명세서에 기재된 경쟁적(경쟁) 결합 검정 및/또는 스캐차드(Scatchard) 분석에 따라 특이적 또는 선택적 결합을 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "KD"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수 또는 항원에 대한 항체의 친화도를 의미한다. 일 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 표면 플라스몬 공명 검정, 세포 결합 검정 또는 평형 투석 검정을 이용하여 측정할 때 100nM 또는 더 우수한(즉, 또는 더 적은)(예를 들면, 90nM, 80nM, 70nM, 60nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10nM, 5nM, 1nM 이하) 친화도(KD)로 항원(예를 들면, EGFR)에 결합한다. 특정한 실시양태에서, 항체는 표면 플라스몬 공명 검정 또는 세포 결합 검정에 의해 측정할 때 8nM 또는 더 우수한(예를 들면, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 2nM, 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM 이하) (해리 상수(KD)로 표시되는) 친화도로 EGFR에 결합한다. 다른 실시양태에서, 항체는 분석물질로서의 재조합 EGFR 및 리간드로서의 항체를 사용하여 비아코어 3000 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술에 의해 결정할 때 대략 10-7M 이하, 예컨대 대략 10-8M, 10-9M 또는 10-10M 이하 또는 심지어 더 낮은 친화도(KD)로 항원(예를 들면, EGFR)에 결합하고, 선결정된 항원 또는 밀접히 관련된 항원 이외의 비특이적 항원(예를 들면, BSA, 카제인)에 대한 결합에 대해 이의 친화도보다 적어도 2배 큰 친화도로 선결정된 항원에 결합한다. KD를 결정하기 위한 다른 방법은 유세포 분석법(FACS)을 통한 EGFR를 발현하는 살아 있는 세포에 대한 또는 KinExA(등록상표) 기술을 이용한 용액 중의 평형 결합을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Koff"는 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리에 대한 분해 속도 상수를 의미하도록 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "IC50" 및 "IC90"은 생물학적 또는 생화학적 기능(예를 들면, EGFR의 기능 또는 활성)을 각각 50% 및 90% 억제하는 데 있어서 화합물(예를 들면, 항-EGFR 항체)의 유효성의 측정치를 의미한다. 예를 들면, IC50은 EGFR의 활성(예를 들면, EGFR을 발현하는 세포의 성장)을 반으로 억제하는 데 필요한 항-EGFR 항체가 얼마나 많은지를 나타낸다. 즉, 이것은 항-EGFR 항체의 최대 반(50%) 억제 농도(IC)(50% IC 또는 IC50)이다. FDA에 따르면, IC50은 실험실내 50% 억제율에 필요한 약물의 농도를 나타낸다. 예를 들면, 용량 반응 곡선을 구축하고 EGFR 활성을 역전시키는 데 미치는 상이한 농도의 길항제(즉, 항-EGFR 항체)의 효과를 조사하여 당해 분야에 공지된 기법에 의해 IC50 및 IC90을 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "글라이코실화 패턴"은 단백질, 더 구체적으로 면역글로불린 단백질에 공유 부착된 탄수화물 단위의 패턴으로 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하도록 의도된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
항체 또는 항체 단편(예를 들면, VH, VL, CDR3)을 코딩하는 핵산을 언급할 때 본 명세서에서 사용되는 용어 "단리된 핵산 분자"는 뉴클레오타이드 서열이 다른 게놈 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면 EGFR 이외의 항원에 결합하는 항체를 코딩하는 것(다른 서열은 인간 게놈 DNA에서 핵산을 천연적으로 플랭킹할 수 있음)이 실질적으로 없는 핵산 분자를 의미하도록 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "변형하는" 또는 "변형"은 항체 또는 이의 항원-결합 부분에서 1종 이상의 아미노산을 변경하는 것을 의미하도록 의도된다. 1 이상의 위치에서 아미노산을 추가, 치환 또는 결실시켜 변경을 만들 수 있다. PCR 돌연변이유발과 같은 공지된 기법을 이용하여 변경을 만들 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 방법을 이용하여 확인된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 변형하여 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 EGFR에 대한 결합 친화도를 변형할 수 있다. 항체의 서열에서의 "보존적 아미노산 치환", 즉 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되거나 아미노산 서열을 포함하는 항체의 항원, 즉 EGFR에 대한 결합을 무효화하지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 변형이 제공된다. 보존적 아미노산 치환은 1종에서의 아미노산의 동일 종류의 아미노산에 의한 치환을 포함하고, 종류는 예를 들면 표준 데이호프(Dayhoff) 빈도 교환 매트릭스 또는 블로섬(BLOSUM) 매트릭스에 의해 정의된 바대로 자연에서 발견되는 상동성 단백질에서 고치환 빈도 및 일반 물리화학적 아미노산 측쇄 특성에 의해 정의된다. 아미노산 측쇄의 일반적인 6종은 분류되고, I종(Cys); II종(Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); III종(Asn, Asp, Gln, Glu); IV종(His, Arg, Lys); V종(Ile, Leu, Val, Met); 및 VI종(Phe, Tyr, Trp)을 포함한다. 예를 들면, 다른 III종 잔기, 예컨대 Asn, Gln 또는 Glu에 대한 Asp의 치환은 보존적 치환이다. 따라서, 항-EGFR 항체에서의 예상된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 종류로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
용어 "비보존적 아미노산 치환"은 1종에서의 아미노산의 다른 종류로부터의 아미노산에 의한 치환; 예를 들면, II종 잔기인 Ala의 III종 잔기, 예컨대 Asp, Asn, Glu 또는 Gln에 의한 치환을 의미한다.
대안적으로, 다른 실시양태에서, 예컨대 포화 돌연변이유발에 의해 항-EGFR 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 돌연변이(보존적 또는 비보존적)를 무작위로 도입할 수 있고, 결합 활성에 대해 생성된 변형된 항-EGFR 항체를 스크리닝할 수 있다.
"공통 서열"은 관련 서열의 패밀리에서 가장 흔히 발생하는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)으로부터 형성된 서열이다. 단백질의 패밀리에서, 패밀리에서의 각각의 위치에서 가장 흔히 발생하는 아미노산이 공통 서열에서의 이 위치를 점유한다. 2종이 아미노산이 동일하게 흔히 발생하는 경우, 어느 것도 공통 서열에 포함될 수 있다. 면역글로불린의 "공통 프레임워크"는 공통 면역글로불린 서열에서 프레임워크 영역을 의미한다. 유사하게, 본 명세서에 제공된 EGFR 항체의 CDR 아미노산 서열의 최적 정렬에 의해 CDR에 대한 공통 서열을 유도할 수 있다.
핵산의 경우, 용어 "실질적인 상동성"은 2종의 핵산 또는 이의 지정 서열이, 최적으로 정렬되고 비교될 때, 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실로, 뉴클레오타이드의 적어도 약 80%, 보통 뉴클레오타이드의 적어도 약 90% 내지 95%, 더 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%로 동일하다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 분절이 선택적 하이브리드화 조건 하에 가닥의 보체로 하이브리드화할 때 실질적인 상동성이 존재한다.
핵산은 전체 세포, 세포 융해물 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은, 알칼리/SDS 처리, CsCl 반딩(banding), 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당해 분야에 널리 공지된 것을 포함하는 표준 기법에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들면 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리되거나", "실질적으로 순수해진다".
핵산 조성물은, 어느 하나의 cDNA, 게놈 또는 이들의 혼합물로부터 고유 서열(변형된 제한 자리 등 제외)을 대개 포함하면서, 대안적으로 표준 기법에 따라 돌연변이되어 변경된 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이 돌연변이는 원하는 바대로 코딩된 아미노산 서열을 변형할 수 있다. 특히, 고유 V, D, J, 불변, 스위치에 실질적으로 상동성인 DNA 서열 및 본 명세서에 기재된 다른 이러한 서열이 고려된다.
용어 "작동적으로 연결된"은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있는 핵산 서열을 의미한다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분리에서 침전하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되거나; 리보솜 결합 자리는 번역을 촉진하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에, 인접하고 리딩 상(reading phase)에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 편리한 제한 자리에서 결찰에 의해 연결을 성취한다. 이러한 자리가 존재하지 않는 경우, 종래 실행에 따라 합성 올리고뉴클레오타이드 어답터 또는 링커를 사용할 수 있다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동적으로 연결된다". 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 전사 조절 서열과 관련하여, 작동적으로 연결된은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 2종의 단백질 코딩 영역에 연결되는 것이 필요한 경우, 인접하고 리딩 프레임(reading frame)에 있다는 것을 의미한다. 스위치 서열의 경우, 작동적으로 연결된은 서열이 스위치 재조합을 수행할 수 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 이것이 연결되는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하도록 의도된다. 벡터의 일 유형은 "플라스미드"이고, 이것은 추가의 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형 2중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 분절이 바이러스 게놈으로 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포(예를 들면, 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)에서 자율 복제를 할 수 있다. 다른 벡터(예를 들면, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합되어 숙주 게놈을 따라 복제될 수 있다. 게다가, 특정 벡터는 이것이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히 "발현 벡터")라 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 이용되는 발현 벡터는 대개 플라스미드 형태이다. 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 동일한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들면, 복제 결함 래트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)와 같은 발현 벡터의 다른 형태가 또한 고려된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 단순히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미하도록 의도된다. 이러한 용어는 특정한 피험체 세포뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손을 의미하도록 의도되는 것으로 이해되어야 한다. 환경적 영향으로 인해 후대 세대에서 돌연변이 또는 특정 변형이 일어날 수 있으므로, 이러한 자손은 사실 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 본 명세서에 기재된 치료학적 또는 예방학적 조치를 의미한다. "치료" 방법은 질환 또는 질병 또는 재발 질환 또는 질병을 예방하거나, 치유하거나, 지연시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 이의 1 이상의 증상을 경감시키기 위해, 또는 피험체의 생존을 이러한 치료의 부재 하에 예상되는 것보다 연장시키기 위해 본 명세서에 개시된 항체 또는 항체 쌍 또는 3중물을 피험체, 예를 들면 EGFR 의존적 신호전달과 관련된 질환 또는 질병을 앓거나 이러한 질환 또는 질병을 앓을 소인을 갖는 피험체에게 투여하는 것을 이용한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "EGFR 의존적 신호전달과 관련된 질환" 또는 "EGFR 의존적 신호전달과 관련된 질병"은 EGFR 수치 증가 및/또는 EGFR을 포함하는 세포 캐스케이드의 활성화가 발견되는 질환 상태와 관련된 질환 상태 및/또는 증상을 포함한다. 용어 "EGFR 의존적 신호전달과 관련된 질환"은 또한 대안적인 EGFR 신호전달 경로의 활성화와 관련된 질환 상태 및/또는 증상을 포함한다. 일반적으로, 용어 "EGFR 의존적 신호전달과 관련된 질환"은 EGFR의 참여를 요하는 증상의 임의의 질병, 발병, 진행 또는 지속을 의미한다. 예시적인 EGFR 매개 질병은 예를 들면 암을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "암" 및 "암성"은 비조절 세포 성장을 통상적으로 특징으로 하는 포유동물에서 생리학적 병증을 의미하거나 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 암의 더 특정한 예는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 췌장암, 교세포 종양, 예컨대 교모세포종 및 신경섬유종증, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 대장암, 흑색종, 대장직장암, 자궁내막 암종, 침샘 암종, 신장암, 신암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 치료되거나 진단된 암은 흑색종, 유방암, 난소암, 신암종, 위장/대장암, 폐암 및 전립선암으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량"은 피험체에게 투여될 때 본 명세서에 기재된 EGFR 의존적 신호전달과 관련된 질환의 치료, 예후 또는 진단에 영향을 미치기에 충분한 EGFR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 양을 의미한다. 단독으로 또는 조합되어 사용될 때, 본 명세서에 제공된 항체의 치료학적 유효량은 (예를 들면, 세포 성장을 억제하는 데 있어서) 항체 및 조합의 상대 활성, 및 치료되는 피험체 및 질환 병증, 피험체의 체중 및 연령, 질환 병증의 중증도, 투여 방식 등에 따라 달라지고, 당해 분야의 당업자가 용이하게 이를 결정할 수 있다. 투여 용량은 항체의 예를 들면 약 1ng 내지 약 10,000㎎, 약 5ng 내지 약 9,500㎎, 약 10ng 내지 약 9,000㎎, 약 20ng 내지 약 8,500㎎, 약 30ng 내지 약 7,500㎎, 약 40ng 내지 약 7,000㎎, 약 50ng 내지 약 6,500㎎, 약 100ng 내지 약 6,000㎎, 약 200ng 내지 약 5,500㎎, 약 300ng 내지 약 5,000㎎, 약 400ng 내지 약 4,500㎎, 약 500ng 내지 약 4,000㎎, 약 1 ㎍ 내지 약 3,500㎎, 약 5 ㎍ 내지 약 3,000㎎, 약 10 ㎍ 내지 약 2,600㎎, 약 20 ㎍ 내지 약 2,575㎎, 약 30 ㎍ 내지 약 2,550㎎, 약 40 ㎍ 내지 약 2,500㎎, 약 50 ㎍ 내지 약 2,475㎎, 약 100 ㎍ 내지 약 2,450㎎, 약 200 ㎍ 내지 약 2,425㎎, 약 300 ㎍ 내지 약 2,000, 약 400 ㎍ 내지 약 1,175㎎, 약 500 ㎍ 내지 약 1,150㎎, 약 0.5㎎ 내지 약 1,125㎎, 약 1㎎ 내지 약 1,100㎎, 약 1.25㎎ 내지 약 1,075㎎, 약 1.5㎎ 내지 약 1,050㎎, 약 2.0㎎ 내지 약 1,025㎎, 약 2.5㎎ 내지 약 1,000㎎, 약 3.0㎎ 내지 약 975㎎, 약 3.5㎎ 내지 약 950㎎, 약 4.0㎎ 내지 약 925㎎, 약 4.5㎎ 내지 약 900㎎, 약 5㎎ 내지 약 875㎎, 약 10㎎ 내지 약 850㎎, 약 20㎎ 내지 약 825㎎, 약 30㎎ 내지 약 800㎎, 약 40㎎ 내지 약 775㎎, 약 50㎎ 내지 약 750㎎, 약 100㎎ 내지 약 725㎎, 약 200㎎ 내지 약 700㎎, 약 300㎎ 내지 약 675㎎, 약 400㎎ 내지 약 650㎎, 약 500㎎ 또는 약 525㎎ 내지 약 625㎎ 범위일 수 있다. 최적 치료 반응을 제공하기 위해 용량 섭생을 조정할 수 있다. 유효량은 또한 항체의 임의의 독성 또는 해로운 효과(즉, 부작용)가 최소화되고/되거나 유리한 효과를 능가하는 양이다.
용어 "치료제"는 질환 또는 질병의 증상의 중등도를 감소시키거나 억제하거나, 질환 또는 질병에서 무증상 빈도 및/또는 기간 또는 증상 감소 기간을 증가시키거나, 질환 또는 질병 영향으로 인한 손상 또는 불능을 억제하거나 예방하거나, 질환 또는 질병의 진행을 억제하거나 지연시키거나, 질환 또는 질병의 발병을 억제하거나 지연시키거나, 감염성 질환 또는 질병에서 감염을 억제하거나 예방하는 능력을 갖는 임의의 및 모든 화합물을 포함하도록 의도된다. 치료제의 비제한적인 예는 유기 소분자, 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 재조합으로 조작된 생물물질, RNAi 화합물, 티로신 키나아제 억제제 및 상업용 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 티로신 키나아제 억제제는 현재 시판되는 의약품인 예를 들면 에를로티닙, 게피티닙 및 라파티닙 중 1종 이상을 포함한다. 상업적으로 구입 가능한 약제학적 항-EGFR 항체는 세툭시맙 및 파니투무맙을 포함한다. 다른 약제학적 항-EGFR 항체는 개발 중인 잘루투무맙, 니모투주맙 및 마투주맙을 포함한다.
용어 "환자"는 예방학적 치료 또는 치료학적 치료 중 어느 하나를 받는 인간 및 다른 포유동물 피험체를 포함한다.
용어 "피험체"는 임의의 포유동물, 예를 들면 영장류를 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 암을 앓는 피험체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 피험체는 인간이다.
용어 "샘플"은 환자 또는 피험체로부터 얻은 조직, 체액 또는 세포(또는 임의의 상기의 분획)를 의미한다. 보통, 환자로부터 조직 또는 세포를 제거하지만, 생체내 진단이 또한 고려된다. 고형 종양의 경우, 조직 샘플을 수술로 제거된 종양으로부터 얻고, 종래 기법에 의해 시험을 위해 제조할 수 있다. 림프종 및 백혈병의 경우, 림프구, 백혈병 세포 또는 림프 조직을 얻고(예를 들면, 혈액으로부터의 백혈병 세포), 적절히 제조한다. 뇨, 눈물, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 대변, 가래, 세포 추출물 등을 비롯한 다른 샘플이 특정 암에 또한 유용할 수 있다.
본 개시내용의 다양한 양태가 하기 하위섹션에 추가로 자세히 기재되어 있다.
Ⅱ. 항- EGFR 항체 및 이의 조합
실시예에서 P1X, P2X 및 P3X라 칭하는 3종을 포함하는 신규한 항-EGFR 단일클론 항체가 본 명세서에 개시되어 있다. P1X, P2X 및 P3X 단일클론 항체는 PCT 출원 제PCT/US2011/35238호에 개시된 각각 ca, cd 및 ch라 칭하는 모 항체의 친화도 성숙 항체이다. 모 항체 및 친화도 돌연변이된 항체의 CDR 아미노산 서열이 하기 도시되어 있고, 친화도 돌연변이된 항체에서 변경된 아미노산은 볼드체이고 밑줄 그어져 있다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
P1X에 대한 전장 VH 및 VL 아미노 서열이 각각 서열 번호 19 및 서열 번호 20에 기재되어 있다. P2X에 대한 전장 VH 및 VL 아미노 서열이 각각 서열 번호 21 및 서열 번호 22에 기재되어 있다. P3X에 대한 전장 VH 및 VL 아미노 서열이 각각 서열 번호 23 및 서열 번호 24에 기재되어 있다. 추가로, 본 명세서에 제시된 VH 및 VL CDR 분절은, 예를 들면 아미노 말단에서 카복시 말단으로 CDR1, CDR2 및 CDR3의 순서로 배열된다.
일 실시양태에서, EGFR 세포외 도메인에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체로서, 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은,
(a) 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(b) 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 및
(c) 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일클론 항체가 제공된다.
다른 실시양태에서, EGFR 세포외 도메인에 결합하고, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체로서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은,
(a) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(c) 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일클론 항체가 제공된다.
상술한 항-EGFR 항체의 조합이 또한 제공된다. 이러한 조합은 예를 들면 2종의 상술한 항-EGFR 항체의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 다른 조합은 모든 3종의 상술한 항-EGFR 항체를 포함할 수 있다. 따라서, 다른 양태에서, EGFR 세포외 도메인에 결합하는 2종 또는 3종의 단일클론 항체를 포함하는 조성물로서, 2종 또는 3종의 단일클론 항체는,
(a) 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체;
(b) 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체; 및
(c) 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 조성물은 (a)와 (b), (a)와 (c), (b)와 (c), 또는 (a)와 (b)와 (c)를 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, EGFR 세포외 도메인에 결합하는 2종 또는 3종의 단일클론 항체를 포함하는 조성물로서, 2종 또는 3종의 단일클론 항체는,
(a) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;
(b) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체; 및
(c) 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 조성물은 (a)와 (b), (a)와 (c), (b)와 (c), 또는 (a)와 (b)와 (c)를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 명세서에 개시된 항-EGFR 항체는, 단일 항체이든 또는 항체의 조합이든, 예를 들면 100nM보다 우수한 또는 10nM보다 우수한 또는 1nM보다 양호한 KD로 EGFR에 결합할 수 있다. KD와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "___nM보다 우수한"은 항체가 표시된 수보다 낮은 나노몰 농도로 표시된 KD를 갖는다는 것을 의미한다. 예를 들면, 100nM"보다 우수한" KD는 100nM보다 낮은 값(예를 들면, 50nM)인 나노몰 농도로 표시된 KD를 나타낸다.
다른 실시양태에서, P1X 관련 항체, 예컨대 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 각각 서열 번호 19 및 서열 번호 20의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체는 약 1 x 10-9M 내지 1.1 x 10-11M보다 우수한 범위의 KD로 EGFR에 결합할 수 있다.
다른 실시양태에서, P2X 관련 항체, 예컨대 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 각각 서열 번호 21 및 서열 번호 22의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체는 약 1 x 10-9M 내지 7.0 x 10-11M보다 우수한 범위의 KD로 EGFR에 결합할 수 있다.
다른 실시양태에서, P3X 관련 항체, 예컨대 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 각각 서열 번호 23 및 서열 번호 24의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체는 약 1 x 10-9M 내지 3.6 x 10-10M보다 우수한 범위의 KD로 EGFR에 결합할 수 있다.
본 명세서에 개시된 항-EGFR 항체는, 단일 항체이든 또는 항체 조합이든,
(a) 세포 기반 검정에서 측정된 AKT 또는 ERK 인산화, 예를 들면 EGFR 의존적 AKT 또는 ERK 인산화 억제;
(b) EGFR을 발현하는 세포의 성장 억제;
(c) EGFR에 결합하는 EGF 리간드의 억제(예를 들면, EGF, 헤파린 결합 EGF 유사 성장 인자(HB-EGF), 형질전환 성장 인자(TGF), 에피겐, 에피레굴린, 베타셀룰린 또는 암피레굴린을 포함하는 EGFR에 결합하는 1종 이상의 리간드의 결합의 억제);
(d) EGFR 이합체화의 억제;
(e) (예를 들면, 수용체의 내재화 및 재순환 및/또는 수용체의 내재화 및 분해에 의한) 세포 표면 상의 EGFR의 하향조절;
(f) 실험실내 종양 세포 증식 억제; 및/또는
(g) 생체내 종양 성장 억제(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는, 본 명세서에 개시된 1 이상의 다른 기능 특성을 나타낼 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체는 항체 및 항체 유사 특성을 갖는 다른 단백질 스캐폴드의 모든 공지된 형태를 포함한다. 예를 들면, 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체, 면역접합체, 키메라 항체 또는 항체 유사 특성을 갖는 단백질 스캐폴드, 예컨대 피브로넥틴 또는 안키린 반복체일 수 있다. 항체는 또한 Fab, Fab'2, ScFv, 아피바디(등록상표), 아비머, 나노바디 또는 도메인 항체일 수 있다. 항체는 또한 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE의 아이소타입을 포함하는 임의의 아이소타입을 가질 수 있다. IgG 항체가 바람직하다. 가변 영역 서열에 작동적으로 연결된 원하는 불변 영역 서열을 코딩하는 핵산 및 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 VH 및 VL 서열로부터 전장 항체를 제조할 수 있다. 적합한 불변 영역 서열의 비제한적인 예는 서열 번호 25에 개시된 카파 경쇄 불변 영역 및 서열 번호 26에 개시된 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함한다.
실시예에 개시된 바대로, P1X + P2X + P3X 항체의 3중 조합이 2:2:1의 P1X:P2X:P3X 몰비에서 사용될 때 특히 효과적인 것으로 발견되었다. 따라서, 이러한 3중 항체 조합의 경우, 전체 농도의 40%가 P1X로 되도록 선택되고, 전체 농도의 40%가 P2X이도록 선택되며, 전체 농도의 20%가 P3X로 되도록 선택된다.
따라서, 다른 실시양태에서, 3종의 단일클론 항-EGFR 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체를 포함하되, (ⅰ) 제1 항체는 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고; (ⅱ) 제2 항체는 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며; (ⅲ) 제3 항체는 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체는 서로에 대해 2:2:1 몰비로 존재하는 조성물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 3종의 단일클론 항-EGFR 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체를 포함하되, (ⅰ) 제1 항체는 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; (ⅱ) 제2 항체는 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며; (ⅲ) 제3 항체는 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체는 서로에 대해 2:2:1 몰비로 존재하는 조성물이 제공된다.
3종의 항체를 포함하는 항-EGFR 항체 조성물을 제조하는 방법으로서, 항체가 2:2:1 비로 제조되는 제조 방법이 제공된다. 더 구체적으로, 다른 실시양태에서, 항-EGFR 항체 조성물을 제조하는 방법으로서,
(a) 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체;
(b) 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체; 및
(c) 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체를 단일 조성물로 배합하는 단계를 포함하되;
(a), (b) 및 (c)를 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 배합하는 제조 방법이 제공된다.
다른 실시양태에서, 항-EGFR 항체 조성물을 제조하는 방법으로서,
(a) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;
(b) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체; 및
(c) 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체를 단일 조성물로 배합하는 단계를 포함하되;
(a), (b) 및 (c)를 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 배합하는 제조 방법이 제공된다.
3종의 항-EGFR 항체로 피험체를 치료하는 방법으로서, 항체를 2:2:1 비로 상기 피험체에게 투여하는 치료 방법이 또한 제공된다. 더 구체적으로, 항-EGFR 항체로 피험체를 치료하는 방법으로서,
(a) 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체;
(b) 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체; 및
(c) 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체를 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하되;
(a), (b) 및 (c)를 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 투여하는 치료 방법이 제공된다.
다른 실시양태에서, 항-EGFR 항체로 피험체를 치료하는 방법으로서,
(a) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;
(b) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체; 및
(c) 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체를 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하되;
(a), (b) 및 (c)를 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 투여하는 치료 방법이 제공된다.
항-EGFR 항체를 약제학적 조성물로 제제화하는 것 및 EGFR 관련 질환에서 이러한 조성물을 사용하는 방법에 대한 추가의 상세내용이 하기 하위부문에 기재되어 있다.
Ⅲ. 항체를 제조하는 방법
(ⅰ) 단일클론 항체
본 명세서에 개시된 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열에 기초하여 표준 재조합 DNA 기법에 의해 본 명세서에 제공된 단일클론 항체를 가장 통상적으로 제조한다.
추가로 또는 대안적으로, 다양한 공지된 기법, 예컨대 표준 체세포 하이브리드화 기법, B 림프구의 바이러스 또는 종양형성 형질전환, 또는 인간 항체 유전자의 라이브러리를 사용하는 효모 또는 파지 디스플레이 기법을 이용하여 단일클론 항체를 제조할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 항체는 완전 인간 단일클론 항체이다.
따라서, 일 실시양태에서, EGFR에 결합하는 항체를 제조하기 위해 하이브리도마 방법을 이용한다. 이 방법에서, 면역화에 사용되는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하거나 제조할 수 있는 림프구를 유발하기 위해 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물을 적합한 항원으로 면역화할 수 있다. 대안적으로, 림프구를 실험실내 면역화할 수 있다. 이후, 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 형성한다. 항원에 지정된 단일클론 항체의 제조를 위해 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 평가한다. 원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 제조하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 제한적인 희석 절차에 의해 서브클로닝하고 표준 방법에 의해 성장시킨다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들면 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 동물에서 하이브리도마 세포를 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다. 종래 면역글로불린 정제 절차, 예를 들면 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체를 분리할 수 있다.
다른 실시양태에서, 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 및 제5,571,698호(라드너(Ladner) 등에 허여); 미국 특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호(도워(Dower) 등에 허여); 미국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호(맥카페르티(McCafferty) 등에 허여); 및 미국 특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호(그리피스(Griffiths) 등에 허여)에 기재된 것과 같은 널리 공지된 기법을 이용하여 생성된 항체 라이브러리로부터 EGFR에 결합하는 항체를 단리할 수 있다. 추가로, 매우 큰 파지 라이브러리를 구성하기 위한 전략으로서, 사슬 셔플링, 및 조합 감염 및 생체내 재조합에 의한 고친화도(nM 범위) 인간 항체의 제조를 또한 이용할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 출원 제09/856,907호(PCT 국제 공보 WO 제00/31246호)를 참조한다.
특정한 실시양태에서, 파지 디스플레이를 이용하여 EGFR에 결합하는 단일클론 항체를 제조한다. 이 기법은 인간 도너로부터 단리된 면역글로불린 서열의 독특한 조합을 갖고, 중쇄 CDR의 합성 다양성을 갖는 인간 Fab 라이브러리의 생성을 포함한다. 이후, EGFR에 결합하는 Fab에 대해 라이브러리를 스크리닝한다.
또 다른 실시양태에서, 마우스 시스템보다 인간 면역계의 일부를 운반하는 형질전환 또는 트랜스염색체 마우스를 사용하여 EGFR에 지정된 인간 단일클론 항체를 생성할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호(모두 론버르그(Lonberg) 및 카이(Kay)에 허여); 미국 특허 제5,545,807호(수라니(Surani) 등에 허여); PCT 공개 WO 제92/03918호, WO 제93/12227호, WO 제94/25585호, WO 제97/13852호, WO 제98/24884호 및 WO 제99/45962호(모두 론버르그 및 카이에 허여); 및 PCT 공개 WO 제01/14424호(코르만(Korman) 등에 허여) 참조).
다른 실시양태에서, 트랜스유전자 및 트랜스염색체 상에 인간 면역글로불린 서열을 운반하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스유전자 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 운반하는 마우스를 사용하여 인간 항체를 생육할 수 있다(예를 들면, PCT 공보 WO 제02/43478호(이쉬다(Ishida) 등에 허여) 참조).
더욱 추가로, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 형질전환 동물 시스템이 당해 분야에서 이용 가능하고 항-EGFR 항체를 생육하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 제노마우스(Xenomouse)(아브게닉스 인크.(Abgenix, Inc.))라 칭하는 대안적인 형질전환 시스템을 사용할 수 있고; 이러한 마우스는, 예를 들면 미국 특허 제5,939,598호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6,150,584호 및 제6,162,963호(쿠헤르라파티(Kucherlapati) 등에 허여)에 기재되어 있다.
게다가, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스염색체 동물 시스템이 당해 분야에서 이용 가능하고 항-EGFR 항체를 생육하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 인간 중쇄 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스염색체 둘 다를 운반하는 마우스를 사용할 수 있다. 더욱이, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스염색체를 운반하는 소가 당해 분야에 기재되어 있고 항-EGFR 항체를 생육하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 항체를 생성하는 형질전환 식물 및/또는 배양된 식물세포(예를 들면, 담배, 옥수수 및 좀개구리밥 등)를 사용하여 항체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 유도성 프로모터 등을 사용하여 이러한 항체를 제조하기 위해 항체를 발현하는 형질전환 담배잎을 사용할 수 있다. 또한, 이러한 항체 및 이의 항원 결합 부분을 발현하기 위해 형질전환 옥수수를 사용할 수 있다. 예를 들면, 담배 종자 및 감자 괴경을 사용하여 항체 부분, 예컨대 단쇄 항체(scFv)를 포함하는 형질전환 식물 종자로부터 항체를 또한 다량으로 제조할 수 있다.
면역침전에 의해 또는 실험실내 결합 검정, 예컨대 방사선면역검정(RIA) 또는 효소 결합 면역흡착제 검정(ELISA)에 의해 본 명세서에 개시된 것을 포함하는 임의의 기법을 이용하여 제조된 EGFR에 결합하는 단일클론 항체(또는 이의 부분)의 결합 특이성을 결정할 수 있다. 스캐차드 분석에 의해 단일클론 항체 또는 이의 부분의 결합 친화도를 또한 결정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 것과 같은 분야 인정 기법을 이용하여 원하는 결합 특이성 및/또는 친화도를 성취하기 위해 임의의 상기 기재된 방법에 의해 제조된 EGFR 항체를 추가로 변경하거나 최적화할 수 있다.
일 실시양태에서, 구조적 및 기능적 관련 항체를 제조하기 위해 EGFR 항체로부터 유도된 부분 항체 서열을 사용할 수 있다. 예를 들면, 항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 내에 위치한 아미노산 잔기를 통해 주로 표적 항원과 상호작용한다. 이런 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 밖의 서열보다 개별 항체 사이에 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용의 원인이므로, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터 프레임워크 서열에 그래프팅된 특이적 천연 항체로부터 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구성함으로써 특이적 천연 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다. 생식선 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스로부터 이러한 프레임워크 서열을 얻을 수 있다.
따라서, EGFR을 발현하는 세포의 성장 억제와 같은 적어도 1의 원하는 기능적 특성을 보유하는 구조적 관련 항-EGFR 항체를 생성하기 위해 CDR과 같은 항-EGFR 항체의 1 이상의 구조적 특징을 이용할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 추가의 재조합으로 조작된 항-EGFR 항체를 생성하기 위해 본 명세서에 개시된 1종 이상의 CDR 영역은 공지된 인간 프레임워크 영역 및 CDR과 재조합으로 조합된다. 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일한 또는 상이한 항체 서열로부터 유도될 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도에서 특히 중요한 역할을 한다는 것이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 특정한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체가 생성된다. 항체는 본 명세서에 개시된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR1 및/또는 CDR2를 추가로 포함할 수 있다.
상기 기재된 조작된 항체의 CDR 1, 2 및/또는 3 영역은 본 명세서에 개시된 것과 정확한 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 에피토프 특이성을 변경함이 없이 CDR3 서열보다 많은 변화를 견딜 수 있는, 특히 CDR1 및 CDR2 서열의 경우, 정확한 CDR 서열로부터의 약간의 편차가 가능할 수 있다는 것을 이해할 것이다(이러한 편차는 예를 들면 보존적 아미노산 치환임). 따라서, 다른 실시양태에서, 조작된 항체는 본 명세서에서 칭하는 항체의 상응하는 CDR과 예를 들면 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 1종 이상의 CDR1 및 CDR2로 이루어질 수 있다.
다른 실시양태에서, 더 선호되는 결합의 결합 속도를 성취하기 위해 결합을 변형하기 위해 CDR의 1종 이상의 잔기를 변경할 수 있다. 이러한 전략을 이용하여, 예를 들면 1010M-1 이상의 초고결합 친화도를 갖는 항체를 성취할 수 있다. CDR 영역(들)을 변경한 후, 원하는 결합 변화에 생성된 결합 분자를 스크리닝하기 위해 당해 분야에 널리 공지된 친화도 돌연변이 기법 및 본 명세서에 기재된 것을 이용할 수 있다. 따라서, CDR(들)이 변경되면서, 결합 친화도 및 면역원성의 변화를 모니터링하고 점수를 매겨 최고의 조합 결합 및 낮은 면역원성에 최적화된 항체를 성취할 수 있다.
변형에 따른 항원 결합 친화도가 106M-1보다 우수한 한, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 1종 이상의 프레임워크 또는 연결 영역 내에서 또한 변형할 수 있다.
다른 실시양태에서, 예를 들면 암을 치료하는 데 있어서 항체의 유효성을 증대시키기 위해 이팩터 기능과 관련하여 항체를 추가로 변형한다. 예를 들면, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여, 이 영역에서 사슬간 이황화 결합이 형성되게 할 수 있다. 이렇게 생성된 동형이량체 항체는 내재화 능력을 개선하고/하거나 보체 매개 세포사 및 항체 의존적 세포내 세포독성(ADCC)을 증가시킬 수 있다. 헤테로 2작용성 가교결합제를 사용하여 항종양 활성이 증대된 동형이량체 항체를 또한 제조할 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖고 따라서 증대된 보체 융해 및 ADCC 능력을 가질 수 있는 항체를 조작할 수 있다.
하기 기재된 이중특이적 항체 및 면역접합체가 또한 제공된다.
(ⅱ) 이중특이적 항체
본 명세서에 이중특이적 항체는 바람직하게는 비중첩 또는 비경쟁 에피토프에 결합하는 EGFR에 대해 적어도 2의 결합 특이성을 포함한다. 이러한 이중특이적 항체는 추가의 결합 특이성, 예를 들면 제3 EGFR 결합 특이성 및/또는 다른 ErbB 수용체(예를 들면, ErbB3) 또는 다른 항원, 예컨대 암유전자의 생성물에 대한 결합 특이성을 포함할 수 있다. 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들면, F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 이중특이적 항체를 제조할 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들면, WO 제05117973호 및 WO 제06091209호 참조). 예를 들면, 전장 이중특이적 항체의 제조는 2종의 쌍을 지은 면역글로불린 중쇄-경쇄의 공동발현에 기초할 수 있고, 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다. 재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 다양한 기법이 또한 기재되어 있다. 예를 들면, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 제조하였다. 단쇄 Fv(sFv) 이합체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 다른 전략이 또한 보고되었다.
특정한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 결합 자리 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성하는 다른 기능성 분자, 예를 들면 다른 펩타이드 또는 단백질(예를 들면, 수용체에 대한 다른 항체 또는 리간드)에 연결되거나 유도체화된 EGFR에 결합하는 제1 항체(또는 이의 결합 부분)를 포함한다. 항체는 2개 초과의 상이한 결합 자리 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성하는 1종 초과의 다른 기능성 분자에 연결되거나 유도체화될 수 있고; 이러한 다중특이적 분자는 본 명세서에서 사용되는 용어 "이중특이적 분자"에 포함되는 것으로 또한 의도된다. 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 이중특이적 분자가 생성되도록 본 명세서에 개시된 항체는 (예를 들면, 화학 커플링, 유전 융합, 비공유 회합 또는 기타에 의해) 1종 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 다른 항체, 항체 단편, 펩타이드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결될 수 있다.
따라서, 적어도 1의 EGFR에 대한 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자가 고려된다. 특정한 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들면 인간 FcγRI(CD64) 또는 인간 Fcα 수용체(CD89)이다. 따라서, FcγR, FcαR 또는 FcεR 발현 이팩터 세포(예를 들면, 단핵구, 마크로파지 또는 다핵형 세포(PMN)) 둘 다에 결합하고 EGFR을 발현하는 세포를 표적화할 수 있는 이중특이적 분자가 또한 제공된다. 이 이중특이적 분자는 EGFR 발현 세포를 이팩터 세포로 표적화하고, EGFR 발현 세포의 식균작용, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC), 사이토카인 방출 또는 슈퍼옥사이드 음이온 생성과 같은 Fc 수용체 매개 이팩터 세포 활성을 촉발한다.
일 실시양태에서, 이중특이적 분자는 결합 특이성으로서 적어도 1종의 항체 또는 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단쇄 Fv를 포함하는 이의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 라드너 등의 미국 특허 제4,946,778호에 기재된 Fv 또는 단쇄 구성체와 같은 경쇄 또는 중쇄 이합체, 또는 임의의 이의 최소 단편일 수 있다.
당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 구성성분 결합 특이성, 예를 들면 항-FcR 및 항-EGFR 결합 특이성을 접합하여 이중특이적 분자를 제조할 수 있다. 예를 들면, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이성을 별도로 생성한 후, 서로에 접합할 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩타이드인 경우, 공유 접합에 다양한 커플링 또는 가교결합제를 사용할 수 있다. 가교결합제의 예는 단백질 A, 카보다이이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-다이티오비스(2-나이트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌다이말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP) 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC)를 포함한다. 바람직한 접합제는 SATA 및 설포-SMCC이고, 둘 다 미국 일리노이주 록퍼드에 소재하는 피어스 케미칼 인크(Pierce Chemical Co.)로부터 구입 가능한다.
결합 특이성이 항체일 때, 2개의 중쇄의 C 말단 힌지 영역의 설프하이드릴 결합을 통해 이것을 접합할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 접합 전에 홀수의 설프하이드릴 잔기, 바람직하게는 1개의 설프하이드릴 잔기를 포함하도록 힌지 영역을 변형한다.
대안적으로, 결합 특이성 둘 다를 동일한 벡터에서 코딩하고 발현시키고, 동일한 숙주 세포에서 조립할 수 있다. 이 방법이 특히 유용하고, 이중특이적 분자는 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질이다. 이중특이적 분자는 1개의 단쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단쇄 분자 또는 2개의 결정기를 포함하는 단쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법이 예를 들면 미국 특허 제5,260,203호; 미국 특허 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 및 미국 특허 제5,482,858호에 기재되어 있다.
예를 들면, 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), FACS 분석, 생물검정(예를 들면, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 이의 특이적 표적에 대한 이중특이적 분자의 결합을 확인할 수 있다. 관심 대상의 복합체에 특이적인 라벨링된 시약(예를 들면, 항체)을 이용하여 각각의 이 검정은 일반적으로 특정한 관심 대상의 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들면, 항체-FcR 복합체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 효소 연결 항체 또는 항체 단편을 사용하여, 예를 들면 FcR-항체 복합체를 검출할 수 있다. 대안적으로, 임의의 다양한 다른 면역검정을 이용하여 복합체를 검출할 수 있다. 예를 들면, 항체를 방사선으로 라벨링하고 방사선면역검정(RIA)에서 사용할 수 있다. αγ-β카운터 또는 섬광 카운터의 사용과 같은 수단에 의해 또는 방사선자동사진(autoradiography)에 의해 방사선 동위원소를 검출할 수 있다.
(ⅲ) 면역접합체
본 명세서에 기재된 항체를 다른 치료제에 접합하여 본 명세서에 제공된 면역접합체를 형성할 수 있다. 적합한 물질은 예를 들면 세포독성제(예를 들면, 화학치료제), 독소(예를 들면, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 이의 단편) 및/또는 방사선 동위원소(즉, 방사선접합체)를 포함한다.
이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학치료제가 상기 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 아에루기노사로부터의) 외독소 A 사슬, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질(dianthin protein), 피톨라카 아메리카나 단백질(Phytolaca americana protein)(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 억제제(momordica charantia inhibitor), 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제(sapaonaria officinalis inhibitor), 젤로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신, 에노마이신 및 트리코데센을 포함한다. 방사선 접합 항-EGFR 항체의 제조에 다양한 방사성 핵종이 이용 가능하다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다.
다양한 2작용성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 2작용성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스터(예컨대, 다이숙신이미딜 수버레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예컨대, 톨릴렌 2,6-다이아이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 면역접합체를 만들 수 있다. 탄소-14 라벨링된 1-아이소티오사이아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성 뉴클레오타이드의 접합에 대해 예시적인 킬레이트화제이다(예를 들면, WO 제94/11026호 참조).
Ⅳ. 항체를 스크리닝하는 방법
항체를 제조한 후, 당해 분야에 널리 공지된 다양한 검정을 이용하여 본 명세서에 기재된 것과 같은 다양한 특성을 위해 이것을 스크리닝할 수 있다.
일 실시양태에서, 예를 들면 정제된 EGFR 및/또는 EGFR 발현 세포, 예컨대 A431 세포를 사용하여 EGFR에 대한 결합에 대해 (예를 들면, 유세포 분석법 또는 ELISA에 의해) 항체를 스크리닝한다. 항-EGFR 항체에 의해 결합된 에피토프를 추가로 확인하고 비교하여, 예를 들면 비경쟁 항체(예를 들면, 상이한 에피토프에 결합하는 항체), 및 결합에 경쟁하고/하거나 동일한 또는 중첩 에피토프에 결합하는 항체를 확인할 수 있다.
통상의 기법을 이용하여 경쟁적 항체 및 비경쟁적 항체를 확인할 수 있다. 이러한 기법은 예를 들면 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는(또는 차단하지 않는) 1종의 항체의 능력을 나타내는 면역검정, 즉 경쟁적 결합 검정을 포함한다. 시험 중인 면역글로불린이 일반 항원, 예컨대 EGFR에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에서 경쟁적 결합을 결정한다. 예를 들면, 고상 직접 또는 간접적 방사선면역검정(RIA), 고상 직접적 또는 간접적 효소 면역검정(EIA), 샌드위치 경쟁 검정; 고상 직접적 바이오틴-아비딘 EIA; 고상 직접적 라벨링 검정, 고상 직접적 라벨링 샌드위치 검정; 고상 직접적 125I 라벨링 RIA; 고상 직접적 바이오틴-아비딘 EIA; 및 직접적 라벨링 RIA와 같은 다양한 유형의 경쟁적 결합 검정이 공지되어 있다. 이 목적을 위해 실시예의 물질 및 방법 및 하기 실시예 2에 기재된 표면 플라스몬 공명 기법을 또한 유리하게 이용할 수 있다. 통상적으로, 이러한 검정은 고체 표면에 결합된 정제된 항원 또는 이들 중 어느 하나를 보유하는 세포, 비라벨링된 시험 면역글로불린 및 라벨링된 기준 면역글로불린의 사용을 수반한다. 시험 면역글로불린의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 라벨의 양을 결정하여 경쟁적 억제를 측정한다. 보통 시험 면역글로불린은 과량 존재한다. 보통, 경쟁 항체가 과량 존재할 때, 이것은 적어도 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75% 이상으로 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 억제한다.
본 명세서에 개시된 항체에 의해 결합된 에피토프를 결정하는 다른 스크리닝 기법은 예를 들면 에피토프의 원자 분해능을 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 X선 분석을 포함한다. 다른 방법은 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이에 대한 항체의 결합을 모니터링하고, 항원 서열 내의 아미노산 잔기의 변형으로 인한 손실이 에피토프 구성요소의 표시로 대개 생각된다. 또한, 에피토프 매핑에 대한 전산 조합 방법을 또한 이용할 수 있다. 이 방법은 조합 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리로부터 친화도 단리물 특이적 짧은 펩타이드에 대한 관심 대상의 항체의 능력에 의존한다. 이후, 펩타이드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용된 항체에 상응하는 에피토프의 정의를 위해 펩타이드를 리드(lead)로서 간주한다. 에피토프 매핑을 위해, 형태학적 불연속 에피토프를 매핑하기 위해 나타난 전산 알고리즘이 또한 개발되었다.
다른 실시양태에서, 리간드, 예를 들면 EGF(즉, EGFR에 대한 EGFR 결합 리간드의 결합을 억제하지 않음)에 결합시 노출된 에피토프에 결합하는 능력에 대해 항체(예를 들면, 비경쟁 항체 항-EGFR 항체)를 스크리닝한다. 예를 들면, EGFR을 발현하는 세포(예를 들면, A431 세포)를 항-EGFR 항체의 부재(대조군) 또는 존재 하에 라벨링된 EGFR 리간드(예를 들면, 방사성 라벨링 또는 바이오티닐화 EGF)와 접촉시켜 이러한 항체를 확인할 수 있다. 항체가 EGFR에 대한 EGF 결합을 억제하지 않는 경우, 항체의 부재 하의 양에 비해 회수된 라벨의 양의 통계학적으로 유의적인 감소가 관찰되지 않는다. 대안적으로, 항체가 EGFR에 대한 EGF 결합을 억제하는 경우, 항체의 부재 하의 양에 비해 회수된 라벨의 양의 통계학적으로 유의적인 감소가 관찰된다.
결합 친화도에 대해 항체를 또한 스크리닝(시험)할 수 있다. 예를 들면, 하기 기재된 바대로, 예를 들면 플라스몬 공명 검정을 이용하여 이를 수행할 수 있다.
본 명세서에 기재된 것과 같은 신호전달 검정을 이용하여 EGFR을 통해 신호전달을 억제하는 능력에 대해 항체를 또한 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, EGFR을 발현하는 세포를 항체의 존재 및 부재 하에 EGFR 리간드(예를 들면, EGF)로 치료하여 EGFR의 EGFR 리간드 매개 인산화를 억제하는 항체의 능력을 평가할 수 있다. 이후, 세포를 융해시키고, 미정제 융해물을 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고, 예를 들면 웨스턴 블롯팅 후 항-포스포티로신 항체로 프로빙하여 EGFR 인산화를 측정할 수 있다.
대안적으로, 예를 들면 AKT 및/또는 ERK와 같은 EGFR의 공지된 기질에 대한 키나아제 검정 후, EGF 리간드에 의한 EGFR 자극에 의해 EGFR을 통해 하향 신호전달을 억제하는 항체의 능력을 측정할 수 있다. 예를 들면, EGFR을 발현하는 세포를 후보자 항체와 항온처리하고 EGF 리간드로 자극할 수 있다. 이후 이러한 세포로부터 준비된 세포 융해물을 항-AKT 항체와 같은 EGFR(또는 EGFR을 포함하는 세포 경로에서의 단백질)의 기질에 대해 항체와 면역침강시키고, 분야 인정 기법을 이용하여 키나아제 활성(예를 들면, AKT 키나아제 활성)에 대해 평가할 수 있다. 항체의 부재 하의 수준 또는 활성에 비해, 항체의 존재 하의 EGFR을 포함하는 경로에서 EGFR 기질 또는 단백질의 수준 또는 활성(예를 들면, 키나아제 활성)의 감소 또는 완전 소실은 EGFR 신호전달을 억제하는 항체를 나타낸다.
종양 세포 상의 EGFR 발현을 하향 조절하거나 억제하는 능력에 의해 세포 표면 상의 EGFR의 수준을 감소시키는 항체를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, EGFR의 내재화를 유도함으로써(또는 엔도사이토시스를 증가시킴으로써)(예를 들면, 수용체의 내재화 및 재순환 및/또는 수용체의 내재화 및 분해에 의해) 또는 내재화된 EGFR의 재순환을 억제함으로써 항체는 세포 표면 상의 EGFR을 감소시킨다. 이를 시험하기 위해, EGFR을 바이오티닐화할 수 있고, 예를 들면 항체의 존재 또는 부재 하의 배양 중의 세포 단층 상의 바이오틴의 양을 측정한 후, EGFR을 면역침강시키고, 스트렙타비딘으로 프로빙하여 세포 표면 상의 EGFR 분자의 수를 용이하게 결정할 수 있다. 항체의 존재 하의 시간에 따른 바이오티닐화 EGFR의 검출 감소는 세포 표면 상의 EGFR 수준을 감소시키는 항체를 나타낸다.
하기 실시예에 기재된 셀 티터 글로우(Cell-Titer-Glo) 검정 및 삼중수소 라벨링 티미딘 혼입 검정을 포함하는 분야 인정 기법을 이용하여 (생체내 또는 실험실내) EGFR을 발현하는 세포, 예컨대 종양 세포의 성장을 억제하는 능력에 대해 항체 및 항체 조합을 또한 시험할 수 있다. EGFR을 발현하는 세포의 회전타원체 성장을 억제하는 능력에 대해 항체를 또한 스크리닝할 수 있다. 본 명세서에 기재된 진행 중인 종양 성장의 조건에 접근하는 검정을 이용하여 이를 수행할 수 있다.
다른 실시양태에서, (예를 들면, ELISA, 웨스턴 또는 멀티플렉스 방법, 예컨대 루미넥스(등록상표)에 의해 측정된) EGFR 매개 신호전달과 같은 특정한 EGFR 활성 또는 기능을 억제하는 것에 대해 IC50 및/또는 IC90 값에 대해 항-EGFR 항체의 조합을 스크리닝한다. 이후, 항체의 조합(이들 각각은 특히 원하는 IC50 및/또는 IC90 값(예를 들면, EGFR 신호전달을 억제하기 위한 약 80nM의 IC90)을 보유함)을 선택할 수 있다. 일 실시양태에서, 조합은 공지된 기준 항체(예를 들면, 세툭시맙)보다 큰 IC50 또는 IC90 값을 갖는다. 다른 실시양태에서, 조합은 상가적 IC50 또는 IC90을 갖는다(즉, EGFR을 발현하는 세포 상에 개별적으로 작용할 때 항체의 활성의 합은 동일한 세포 상에 함께 작용하는 동일한 항체의 조합 효과와 대략 동일함). 다른 실시양태에서, 조합은 상승적 IC50 또는 IC90을 갖는다(즉, EGFR을 발현하는 세포 상에 개별적으로 작용할 때 항체의 효과의 합은 동일한 세포 상에 함께 작용하는 동일한 항체의 조합 효과보다 적음).
Ⅴ. 약제학적 조성물
다른 양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화된 본 명세서에 개시된 1종의 항-EGFR 단일클론 항체 또는 이의 조합을 포함하는 조성물, 예를 들면 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일 실시양태에서, 조성물은 EGFR 상의 상이한 에피토프에 결합하는 다수(예를 들면, 2종 또는 3종)의 단리된 항체의 조합을 포함한다. 이러한 항체는 바람직하게는 EGFR 매개 신호전달과 같은 특정한 EGFR 활성 또는 기능을 억제하는 것에 대해 상가적 또는 상승적 효과를 갖는다. 바람직한 약제학적 조성물은 주사에 적합한 조성물인 무균 조성물 및 원하는 투여 경로, 예컨대 정맥 주사에 의한 주사에 적합한 무균 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는, "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 (예를 들면, 주사 또는 점적에 의한) 정맥, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 중성 조건으로부터 화합물을 보호하기 위한 물질 중에 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자를 코팅할 수 있다.
단독으로 또는 조합 치료로, 즉 다른 물질과 조합하여 조성물을 투여할 수 있다. 예를 들면, 조합 치료는 본 명세서에 제공된 조성물을 적어도 1종 이상의 추가의 치료제, 예컨대 본 명세서에 기재된 항암제와 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 조합 치료는 본 명세서에 개시된 2종 또는 3종의 항-EGFR 항체의 본 명세서에 제공된 조성물을 사용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 조합 치료는 1종 이상의 다른 항체, 예컨대 당해 분야에 공지된 1종 이상의 다른 항-EGFR 항체(예를 들면, PCT 출원 제PCT/US2011/3528호에 개시된 항-EGFR 항체)와 조합된 본 명세서에 개시된 적어도 1종의 항-EGFR 항체를 포함하는 조성물을 사용할 수 있다. 방사선 치료 및/또는 수술과 병행하여 조성물을 또한 투여할 수 있다. 추가의 치료제와 함께 또는 이것 없이 항-EGFR 항체의 특정한 조합을 별도로 또는 순차적으로 또한 투여할 수 있다.
당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 조성물을 투여할 수 있다. 당업자가 이해하는 것처럼, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 변한다. 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제제와 같은 신속한 방출에 대해 항체를 보호하는 담체와 항체를 제조할 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글라이콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스터 및 폴리락트산과 같은 생체분해성이고 생체적합성인 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 제제를 제조하기 위한 많은 방법은 특허되었거나, 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있다.
특정한 투여 경로에 의해 조성물을 투여하기 위해, 구성성분, 예를 들면 항체를 이의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나, 이 조성물을 이 물질과 동시투여할 필요가 있을 수 있다. 예를 들면, 조성물을 적절한 담체, 예를 들면 리포솜 또는 희석제 중에 피험체에게 투여할 수 있다. 허용되는 희석제는 식염수 및 수성 완충액을 포함한다. 리포솜은 수중 유중수 CGF 에멀션 및 종래 리포솜을 포함한다.
허용되는 담체는 무균 주사액 또는 분산액의 임기 제조를 위해 무균 수용액 또는 분산액 및 무균 분말을 포함한다. 약제학적으로 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 물질의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 종래 매질 또는 물질이 항체와 불상용성인 경우를 제외하고, 본 명세서에 제공된 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충적 활성 구성성분을 또한 조성물에 혼입할 수 있다.
치료학적 조성물은 통상적으로 제조 및 저장 조건 하에 무균이고 안정적이어야 한다. 약물 고농도에 적합한 용액, 마이크로에멀션, 리포솜 또는 다른 규칙 구조로 조성물을 제제화할 수 있다. 담체는 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들면 당, 다가알코올, 예컨대 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함하는 것은 주사용 조성물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
필요한 바대로 상기 열거된 1종의 성분 또는 이의 조합과 적절한 용매 중에 필요한 양의 단일클론 항체를 혼입한 후, 무균 정밀여과하여 무균 주사액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 상기 열거된 것으로부터 염기성 분산 매질 및 필요한 다른 성분을 포함하는 무균 비히클에 항체를 혼입하여 분산액을 제조한다. 무균 주사액의 제조를 위한 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 이의 무균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조(냉동건조)이다.
최적 원하는 반응(예를 들면, 치료 반응)을 제공하기 위해 용량 섭생을 조정한다. 예를 들면, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 다회 분할 용량을 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나, 치료학적 상황의 긴급도로 표시된 바대로 이 용량을 비례하여 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 피하 주사로 주마다 1회 또는 2회 또는 피하 주사로 달마다 1회 또는 2회 인간 항체를 투여할 수 있다.
투여 용이성 및 용량 균일성을 위해 용량 단위 형태로 비경구 조성물을 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 용량 단위 형태는 치료하고자 하는 피험체에 대한 단일 용량으로 적합한 물리적으로 독립된 단위를 의미하고; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 회합되어 원하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 선결정된 분량의 항체를 포함한다. 본 명세서에 제공된 용량 단위 형태에 대한 규격은 (a) 항체의 독특한 특성 및 성취하고자 하는 특정한 치료학적 효과 및 (b) 개인에서 과민증의 치료를 위한 이러한 항체의 조합의 당해 분야에서 고유한 제한에 의해 영향을 받고 직접적으로 이에 의존한다. 약제학적으로 허용되는 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 염산염, 황산수소나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화하이드록시아니솔(BHA), 부틸화하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 솔비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
치료학적 조성물의 경우, 제제는 경구, 비강, 국소(버컬 및 설하 포함), 직장 및 비경구 투여에 적합한 것을 포함한다. 비경구 투여는 항체를 포함하는 치료학적 조성물에 대한 가장 흔한 투여 경로이다. 제제는 편리하게는 단위 용량 형태로 제시될 수 있고, 약학 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 용량 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 항체의 양은 치료하고자 하는 피험체 및 특정한 투여 방식에 따라 변한다. 항체의 이 양은 일반적으로 치료학적 효과를 생성하기에 충분한 양이다. 일반적으로, 100% 중에, 이 양은 항체의 약 0.001질량% 내지 약 90질량%, 바람직하게는 약 0.005질량% 내지 약 70질량%, 가장 바람직하게는 약 0.01질량% 내지 약 30질량% 범위이다.
본 명세서에서 사용되는 구문 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여한다"는 보통 주사에 의한 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 제한함이 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 심실내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 피하내, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 점적을 포함한다.
본 명세서에 제공된 약제학적 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜 등) 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사용 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이 조성물은 또한 보조제, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수 있다. 당해 분야에 널리 공지된 보조제의 특정한 예는 예를 들면 무기 보조제(예컨대, 알루미늄염, 예를 들면 인산알루미늄 및 수산화알루미늄), 유기 보조제(예를 들면, 스쿠알렌), 유성 보조제, 비로솜(예를 들면, 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 막 결합 혈구응집소 및 뉴라미니다아제를 포함하는 비로솜)을 포함한다.
멸균 절차 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함 둘 다에 의해 미생물의 존재의 예방을 보장할 수 있다. 조성물에 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 1종 이상의 물질, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴의 포함에 의해 주사용 약제학적 형태의 흡수를 지연시킬 수 있다.
조성물을 의약품으로서 인간 및 동물에게 투여할 때, 이것을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 예를 들면 0.001% 내지 90%(더 바람직하게는, 0.005% 내지 70%, 예컨대 0.01% 내지 30%)의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서 제공할 수 있다.
선택된 투여 경로와 무관하게, 본 명세서에 제공된 조성물을 적합한 수화 형태로 사용할 수 있고, 이것을 당해 분야의 당업자에게 공지된 종래 방법에 의해 약제학적으로 허용되는 용량 형태로 제제화할 수 있다.
환자에 대한 독성을 나타냄이 없이, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대한 원하는 치료 반응을 성취하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물 중의 항체의 실제 용량 수준을 변경할 수 있다. 선택된 용량 수준은 사용되는 특정한 조성물 또는 이의 에스터, 염 또는 아마이드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배설률, 치료 기간, 사용되는 특정한 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료하고자 하는 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 일반적인 건강 및 이전의 약물 이력과 같은 다양한 약동학적 인자 및 의학 분야에 널리 공지된 유사한 인자에 따라 달라진다. 당해 분야에서 통상의 지식을 갖는 주치의 또는 수의사는 필요한 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들면, 주치의 또는 수의사는 원하는 치료학적 효과를 성취하기 위해 필요한 것보다 낮은 수준에서 항체의 용량을 시작하고 원하는 효과가 성취될 때까지 이 용량을 점진적으로 증가시킨다. 일반적으로, 본 명세서에 제공된 조성물의 적합한 일일 용량은 치료학적 효과를 생성하기 위해 효과적인 최저 용량인 항체의 양이다. 이러한 유효량은 일반적으로 상기 기재된 인자에 따라 달라진다. 바람직하게는 표적 자리에 근접하게 투여되는 정맥, 근육내, 복강내 또는 피하 투여가 바람직하다. 원하는 경우, 임의로 단위 용량 형태로 하루에 걸쳐 적절한 간격으로 별도로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6 이상의 하위 용량으로 치료학적 조성물의 유효 일일 용량을 투여할 수 있다. 항체를 단독으로 투여할 수 있지만, 항체를 제제(조성물)로서 투여하는 것이 바람직하다.
미국 특허 제5,399,163호, 제5,383,851호, 제5,312,335호, 제5,064,413호, 제4,941,880호, 제4,790,824호, 제4,596,556호, 제4,487,603호, 제4,486,194호, 제4,447,233호, 제4,447,224호, 제4,439,196호 및 제4,475,196호에 개시된 것과 같은 당해 분야에 공지된 의학 장치를 사용하여 치료학적 조성물을 투여할 수 있다.
특정 실시양태에서, 생체내 적절한 분포를 보장하기 위해 단일클론 항체를 제제화할 수 있다. 예를 들면, 혈액 뇌 장벽(BBB)은 많은 고친수성 화합물을 배제한다. 치료학적 항체가 (원하는 경우) BBB를 횡단하도록 보장하기 위해, 예를 들면 리포솜에서 이것을 제제화할 수 있다. 리포솜 제조 방법에 대해, 예를 들면 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 제5,399,331호; 제5,891,468호; 제6,056,973호; 제6,210,707호; 제6,224,903호; 제6,316,024호; 제7,122,202호; 제7,135,177호; 및 제7,507,407호 및 미국 특허 공개 제20070116753호를 참조한다. 리포솜은 특이적 세포 또는 장기에 부착되고/되거나 이에 선택적으로 운송되어 표적화된 약물 전달을 증대시키는 1종 이상의 모이어티를 포함할 수 있다.
3중 항-EGFR 항체를 2:2:1 비로 포함하는 약제학적 조성물, 즉 3종의 상이한 항-EGFR 항체, 특히 특정한 2:2:1 비로 제제화되는 상이한 EGFR 에피토프에 결합하는 P1X 관련 항체, P2X 관련 항체 및 P3X 관련 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 3종의 항체 이외에, 이 약제학적 조성물은 상기 자세히 기재된 것과 같은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 다른 부형제(들)를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 모든 3종의 항체를 포함하는 단일 컨테이너 내에 제공되거나, 대안적으로, 약제학적 조성물은 3종의 명확한 컨테이너(각각 3종의 상이한 항-EGFR 항체 중 하나를 포함함)(및 상기 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 다른 부형제(들))를 포함하는 패키지를 포함할 수 있다.
EGFR 의존적 신호전달과 관련된 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 단독으로(단일 물질로서), 쌍 조합(2종의 항체)으로 또는 3중 조합(3종의 항체)으로 상기 기재된 항-EGFR 항체의 용도가 제공된다. 예컨대, EGFR 발현 암, 예컨대 흑색종, 유방암, 난소암, 신암종, 위장암, 대장암, 폐암, 췌장암, 피부암, 두경부암 교모세포종, 전립선암 및 다른 고형 종양 및/또는 전이성 종양(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 암에 대한 암의 치료를 위해(또는 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용하기 위해) 단독으로(단일 물질로서), 쌍 조합(2종의 항체)으로 또는 3중 조합(3종의 항체)으로 상기 기재된 항-EGFR 항체가 또한 제공된다.
추가로, 고려되는 조성물은 추가의 치료제, 예를 들면 추가의 항암제를 추가로 포함할 수 있거나, 이것과의 조합 치료에서 약제로서 사용하기 위해 제조될 수 있다. "항암제"는 종양, 암, 악성종양 등을 치료하기 위해 사용되는 약물이다. 다른 치료 없이 또는 다른 치료, 예컨대 수술, 열 또는 방사선 치료(예를 들면, 이온화 방사선)와 병용하여 (예를 들면, 본 명세서에 개시된 항체 조성물에 의한) 약물 치료제를 투여할 수 있다. 관여하는 장기 또는 조직의 성질에 따라 암 치료에서 여러 종류의 항암제를 사용할 수 있다. 예를 들면, 유방암은 에스트로겐에 의해 흔히 자극되고, 성 호르몬을 불활성화하는 약물로 치료된다. 유사하게, 전립선암은 안드로겐을 불활성화하는 약물로 치료될 수 있다. 본 명세서에 개시된 항체 조성물과 함께 사용하기 위한 항암제는 무엇보다도 A 첨부에 기재된 것을 포함하고, 이것은 제한으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에 개시된 항체 조성물의 투여와 동시에 또는 이전에 또는 이후에 1종 이상의 항암제를 투여할 수 있다. 추가의 항암제, 예를 들면 하기 A 첨부에 개시된 항암제와 함께 또는 순차적으로 본 명세서에 개시된 항체 조성물을 투여할 수 있다.
임의로 단일 바이알 또는 컨테이너 내에 포함된 본 명세서에 개시된 1종 이상의 항-EGFR 항체 및 예를 들면 EGFR 상향조절 및/또는 EGFR 의존적 신호전달과 관련된 질환(예를 들면, 하기 Ⅵ 하위섹션에 기재된 것과 같은 암)을 치료하거나 진단하기 위해 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 또한 제공된다. 키트는 키트의 내용물의 의도되는 사용을 표시하는 라벨을 포함할 수 있다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 같이 제공되거나, 그렇지 않으면 키트가 동반하는 임의의 글씨, 마케팅 자료 또는 기록 자료를 포함한다. 이러한 키트는 항체 조성물을 단위 용량 형태, 예컨대 단일 용량 바이알 또는 단일 용량이 예비 로딩된 주사기로 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 항-EGFR 항체의 조합(예를 들면, P1X 관련 항체, P2X 관련 항체 및 P3X 관련 항체의 조합)을 포함하는 키트는 조합의 모든 성분을 포함하는 단일 바이알을 포함할 수 있거나, 대안적으로, 키트는 조합 치료에서 항체의 투여를 위한 설명서와 함께 별개의 바이알로 각각의 성분을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, P1X 관련 항체, P2X 관련 항체 및 P3X 관련 항체는 단일 바이알 내에 2:2:1 비로 제공되거나, 대안적으로, 3종의 항체를 2:2:1 비로 투여하기 위한 설명서와 함께 별개의 바이알로 각각 제공된다.
Ⅵ. 항체의 사용 방법
매우 다양한 치료학적 및 진단학적 용도, 특히 종양학 용도에서 본 명세서에 개시된 항체 및 조성물을 사용할 수 있다. 따라서, 다른 양태에서, EGFR 매개 활성을 억제하기에 충분한 양으로 본 명세서에 기재된 1종 이상의 항체 또는 조성물을 투여하여 피험체에서 EGFR 활성을 억제하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 치료될 수 있는 특정한 치료학적 적응증은 예를 들면 장기 또는 조직, 예컨대 피부, 뇌 및 중추 신경계, 두경부, 식도, 위, 대장, 직장, 항문, 간, 췌장, 담도, 쓸개, 폐 또는 기관지, 유방, 난소, 자궁, 자궁경부, 질, 고환, 생식 세포, 전립선, 신장, 요관, 방광, 부신, 뇌하수체, 갑상선, 뼈, 근육 또는 다른 연결 조직의 암, 백혈병, 다발성 골수종, 호치킨 림프종 및 비호치킨 림프종을 포함한다.
예를 들면, 본 명세서에 개시된 1종 이상의 항체, 항체 쌍 또는 3중 항체를 (예를 들면, 생체외 또는 생체내) 피험체로부터 얻은 세포와 접촉시키고 세포 상의 EGFR에 대한 결합 수준을 측정함으로써(EGFR에 대한 비정상적으로 높은 결합 수준은 피험체가 EGFR과 관련된 암을 앓고 있다는 것을 나타냄) EGFR과 관련된 질환(예를 들면, 암)을 진단하고 예측하기 위해 본 명세서에 개시된 항체를 또한 사용할 수 있다.
다양한 암을 비롯한 EGFR 의존적 신호전달을 포함하는 다양한 생체외 및 생체내 진단학적 및 치료학적 용도에서 본 명세서에 개시된 항-EGFR 항체를 사용하는 방법이 또한 제공된다.
따라서, 일 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체 또는 바람직하게는 항체의 조합을 EGFR 의존적 신호전달과 관련된 질환을 치료하기에 효과적인 양으로 피험체에게 투여하여 이 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 적합한 질환은 예를 들면 흑색종, 유방암, 난소암, 신암종, 위장암, 대장암, 폐암, 췌장암, 피부암, 두경부암 교모세포종, 전립선암 및 다른 고형 종양 및/또는 전이성 종양(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 다양한 암을 포함한다.
EGFR 매개 신호전달과 관련된 질환을 치료하기 위해 항체와 함께 또는 상승적으로 작용하는 다른 치료제와 또는 단독으로 항체를 투여할 수 있다. 이러한 치료제는 본 명세서에 기재된 것, 예를 들면 유기 소분자, 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 재조합으로 조작된 생물물질, RNAi 화합물, 티로신 키나아제 억제제 및 상업용 항체, 및 항암제(예를 들면, 세포독소, 화학치료제, 소분자 및 방사선)를 포함한다. 본 명세서에 개시된 1종 이상의 항-EGFR 항체와 조합 치료에서 사용될 수 있는 항암제의 비제한적인 예는 A 첨부에 기재된 것을 포함한다.
다른 실시양태가 하기 비제한적인 실시예에 기재되어 있다.
실시예
실시예를 위한 물질 및 방법
일반적으로, 하기 실시예에서, 달리 언급되지 않은 한, 재조합 면역글로불린 제조에서의 화학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학(특히, 예를 들면 항체 기술) 및 표준 기법의 종래 기법을 사용하였다.
세포주
하기 기재된 실험에서 사용된 모든 세포주를 국립 암 협회(National Cancer Institute) 또는 ATCC로부터 얻었다.
세포주:
A431 - 유표피 암종
DU145 - 전립선암종
H1975 - 폐 아데노암종; 비소세포 폐암
HCC827 - 폐 아데노암종; 비소세포 폐암
EGFR 세포외 도메인( EGFR - ECD ) 돌연변이체의 단백질 정제
mAb 에피토프 결합에 대해 EGFR 세포외 도메인(EGFR-ECD)의 돌연변이체를 생성하였다. 세툭시맙(Li S. et al., Cancer Cell. 7: 301-311, 2005) 및 H11(Spangler J. et al. PNAS. 107: 13252-13257, 2010) 에피토프 둘 다 및 EGFR-ECD 구조의 구조 분석(단백질 데이터 뱅크 번호: 1NQL; Ferguson K.M. et al. Mol Cell. 11: 507-517, 2003)에 기초하여 돌연변이를 지칭하였다. 이 용도에 포함된 단백질 서열에서 표시된 바대로 잔기를 알라닌으로 돌연변이시켰다. 발현 구성체의 DNA 합성은 DNA2.0(www.dna20.com)로부터 상업적으로 구입할 수 있다. DNA 서브클로닝에 후속하여, 종래 방법을 이용하여 293F 세포에서의 단백질 발현 및 단백질 정제를 완료하였다.
종양 세포에서 EGFR 또는 ERK 의 EGF 매개 신호전달의 억제
리간드 매개 종양 세포 신호전달의 억제를 하기와 같이 조사하였다: A431 또는 Du145 세포를 96웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 35,000개의 세포 또는 반웰당 17,500개의 세포의 밀도로 시딩하고, 항생제, 2mM L-글루타민 및 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM 또는 RPMI-1640 배지에서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 성장시켰다. 항생제 및 2mM L-글루타민을 포함하는 1% FBS 배지 중에 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 약 20시간 동안 세포를 혈청 아사시켰다. 이후, 세포를 다양한 농도의 항-EGFR 항체와 2시간 동안 예비 항온처리한 후, 인간 EGF 리간드(50ng/㎖)(페프로테크(PeproTech), 카달로그 AF-100-15호)로 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 10분 동안 자극하였다. 세포를 얼음 냉각된 PBS로 세척하고, 얼음 상에서 30분 동안 항온처리하여 50㎕ 얼음 냉각된 융해 완충제(150mM NaCl 및 프로테아제 억제제 칵테일(시그마(Sigma), P714)이 보정된 포유동물 단백질 추출 융해 완충제(MPER-피어스, 78505호)) 중에 융해시켰다. 융해물을 ERK(EGFR의 하향 이팩터) 및 EGFR 인산화에 대해 ELISA에 의해 즉시 분석하거나 사용까지 -80℃에서 냉동시켰다.
ELISA 검정
포스포-EGFR 샌드위치 ELISA를 위해, 96반웰 그라이너(GREINER) 고결합 플레이트(카달로그 675077호; 미국 노스캐롤라니아주 몬로에에 소재하는 그라이너 바이오-온)를 50㎕의 EGFR 항체(EGFR Ab-11, 클론: 199.12, BSA 및 아자이드 없음, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 카달로그 MS396P1ABX호)로 코팅하고, 실온에서 밤새 항온처리하였다. 다음날 아침, 바이오텍(BIOTEK) 플레이트 세척기 상에서 100㎕/웰 PBST(0.05% 트윈-20)로 플레이트를 3회 세척하였다. 이후, 플레이트를 PBS 중의 2% BSA로 실온에서 약 1시간 동안 차단하였다. 플레이트를 바이오텍 플레이트 세척기 상에서 100㎕/웰 PBST(0.05% 트윈-20)로 3회 세척하였다. 세포 융해물(50㎕) 또는 표준품(pEGFR pY1068 엘리사 키트, 알앤디 시스템즈(R&D Systems), 카달로그 DYC3570호)을 (제조업자의 추천에 따라) 50% 융해 완충제 및 1% BSA-PBS 중에 희석하고, 플레이트에 3회 첨가하고, 진탕시키면서 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이후, 플레이트를 PBST(0.05% 트윈-20과 함께 PBS)를 포함하는 바이오텍 플레이트 세척기에서 100㎕/웰로 3회 세척하였다. 겨자무과산화효소(HRP)(pEGFR pY1068 ELISA 키트, 알앤디 시스템즈, 카달로그 DYC3570호)에 접합된 약 50㎕의 검출 항체를 2% BSA 중에 희석하고, PBS를 첨가하고, 실온에서 약 2시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBST(0.05% 트윈-20)를 포함하는 바이오텍 플레이트에서 100㎕/웰로 3회 세척하였다. 약 50㎕의 슈퍼시그널 피코 엘리사(SUPERSIGNAL PICO ELISA) 기질을 첨가하고, 엔비젼(Envision)(퍼킨 엘머(Perkin Elmer)) 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 데이터 분석을 위해, 2회 샘플을 평균하고, 2회 복제물 사이의 표준 편차를 나타내기 위해 오차 막대를 사용하였다. 4 매개변수 로지스틱 방정식에 대한 데이터 회귀를 통해 그래프패드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prism software)(그래프패드 소프트웨어, 인크.(GraphPad Software, Inc.))를 이용하여 억제 곡선 및 상응하는 IC50 값을 계산하였다.
하기와 같이 변화시켜 포스포-EGFR ELISA에 유사하게 포스포-ERK ELISA를 수행하였다: 인간 pERK ELISA 듀오세트 키트(Duoset kit)를 알앤디 시스템즈(카달로그 DYC1018-5호)로부터 구입하고, 제조업자가 추천한 바대로 사용하였다.
포획 시약(4㎍/㎖)으로서 EGFR-ECD 야생형(WT), 1빈 에피토프 돌연변이체 또는 3빈 에피토프 돌연변이체를 사용하여 직접적 ELISA를 수행하였다. 96반웰 그라이너 고결합 플레이트(카달로그 675077호; 미국 노스캐롤라니아주 몬로에에 소재하는 그라이너 바이오-온)를 50㎕의 포획 시약으로 코팅하고, 실온에서 밤새 항온처리하였다. 다음날 아침, 플레이트를 PBST(0.05% 트윈-20)를 포함하는 바이오텍 플레이트 세척기에서 100㎕/웰로 3회 세척하고, PBS(pH 7.2) 중의 1% BSA로 실온에서 약 1시간 차단하였다. PBS(pH 7.2) 중의 1% BSA 중에 희석된 다양한 농도(1, 0.25, 0.06 및 0.02㎍/㎖)의 단일클론 항체(mAb)를 포획 시약과 실온에서 2시간 동안 항온처리한 후, 퍼옥시다제 컨쥬게이티드 어피니퓨어 염소 항인간 IgG Fc 단편(Peroxidase-Conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG Fc Fragment)(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch) 카달로그 109-035-008호)의 PBS(pH 7.2) 중의 1% BSA 중의 1:50,000 희석에 의해 2시간 동안 검출하였다. 약 50㎕의 슈퍼시그널 피코 엘리사 기질을 첨가하고, 엔비젼(퍼킨 엘머) 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 데이터 분석을 위해, 2회 샘플을 평균하고, 2회 복제물 사이의 표준 편차를 나타내기 위해 오차 막대를 사용하였다.
결합 친화도: 동력학 배제 검정( KinExA )
KinExA 기기(미국 아이다호주 보이즈에 소재하는 사피다인(SAPIDYNE) 기기)를 사용하여 재조합 EGF 수용체와 용액 중에서 항체의 친화도 및 교차 반응성을 측정하였다. 이 검정에 사용된 물질은 KinExA 3000 기기 및 소프트웨어(미국 아이다호주 보이즈에 소재하는 사피다인 기기), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 비드(사피다인 기기), 인간 항-EGFR IgG, 재조합 인간 EGFR, Cy5 접합 염소 항인간 IgG(미국 펜실베니아주 웨스트 그로버에 소재하는 잭슨 이뮤노리서치), 인산염 완충 식염수(PBS) 및 PBS(100㎎/㎖) 중의 소 혈청 알부민이었다.
재조합 EGF 수용체를 PMMA 비드에 커플링하기 위해, 100㎍의 재조합 EGFR을 200㎎의 PMMA 비드의 예비 측정된 분액에 첨가하고, PBS를 첨가하여 1㎖의 전체 용적을 만들었다. 회전 휠에서 실온에서 1시간 동안 비드를 항온처리하였다. 이후, 비드를 간단히 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. PBS 중의 100㎕의 100㎎/㎖ BSA를 비드에 첨가하고, PBS를 추가로 첨가하여 1㎖의 전체 용적을 만들었다. 회전 휠에서 실온에서 1시간 동안 비드를 항온처리하였다. 이후, 비드를 27㎖의 PBS를 포함하는 유리병에 옮겼다.
1가 항체 결합 친화도를 결정하기 위해, 항-EGFR 항체의 일정한 농도를 갖는 5㎖ PBS 중에 재조합 EGFR의 12단계 희석 시리즈(75nM, 25nM, 8.3nM, 2.8nM, 0.9nM, 0.3nM, 100pM, 33pM, 11pM, 4pM, 1.3pM, 0pM)를 제조하였다. 정확한 친화도 측정을 위해, 전체 항체 결합 자리 농도("ABC"; 원자가로 인한 항체의 몰 농도의 2배)는 EGFR에 대한 항체의 1가 친화도보다 작아야 한다. 평형을 성취하기 위해 실온에서 2시간 동안 항체-수용체 혼합물을 항온처리하였다. 항체-수용체 복합체의 예상된 친화도에 따라, 따라서 이 평형 시간을 조정할 수 있다. 별개의 관에서, PBS로의 스톡(2㎎/㎖) 항체의 1:1000 희석액을 사용하여 15㎖의 2㎍/㎖ Cy5 접합 항인간 IgG 2차 항체를 제조하였다. 이후, 각각의 12개의 항체-수용체 용액 관에 KinExA 기기 라인을 부착하였다. 각각의 용액을 패킹된 EGFR-비드 칼럼을 통해 주입하였다. (KinExA 기기는 각각의 주사에 대해 새로운 비드 칼럼을 자동으로 패킹한다.) 세척 단계 후, 칼럼을 통해 라벨링된 2차 항체를 통과시켰다. 마지막으로, 상이한 수용체 농도에서 비복합체화 수용체의 측정된 양을 사용하여, 평형 적정 데이터를 KinExA 소프트웨어에서 1:1 결합 모델에 피팅하여 친화도 값 KD를 생성하였다. KD 값이 더 낮을수록, 결합 친화도가 더 우수하다(더 강하다, 때때로 더 높다라고 기술함). 따라서 항체가 xnM 또는 더 우수한 KD로 결합한다는 언급은, 이것이 예를 들면 1 x 10-8M(10nM)의 KD 값 또는 더 낮은 KD 값, 예를 들면 1 x 10-10M(0.1nM)으로 결합한다는 것을 의미하고, 더 낮은 KD 값은 더 우수한(더 높은) 친화도를 나타낸다.
KinExA "직접 방법"을 이용하여 결합 속도를 결정하기 위해, 상기 접근법 및 전체 항체 결합 자리 농도(ABC)를 이용하여 평형 1가 결합 친화도(KD)를 결정하였다. 이후, "이론적 결합 곡선 표시" 소프트웨어(사피다인 기기)를 이용하여, 동력학 실험에 대해 출발 항원 농도(L0)를 결정하였다. 이를 위해, 1가 결합 친화도 실험에서 결정된 친화도 및 ABC 값을 입력하고, 이 농도로서 출발 항원 농도를 선택하고, 여기서 거의 20%의 항체가 평형에서 항원에 결합하지 않았다. 이는 실험에서 우수한 신호 대 노이즈 비를 확인시켜준다. PBS로의 스톡(2㎎/㎖) 항체의 1:1000 희석액을 사용하여 15㎖의 2㎍/㎖ Cy5 접합 항인간 IgG 2차 항체를 제조하였다. 별개의 관에서, 2 x ABC의 농도에서 8㎖의 항-EGFR 항체 용액을 제조하였다. 실험 전에 이것이 8㎖의 항원 용액과 혼합되므로, 이 농도는 실행 농도의 2배이다. 별개의 관에서, 2 x L0의 농도에서 8㎖의 재조합 EGFR 용액을 제조하였다. 실험 전에 이것이 8㎖의 항원 용액과 혼합되므로, 이 농도는 또한 실행 농도의 2배이다. 이후, EGFR 코팅 비드 및 2차 항체 용액을 각각 적절한 컨테이너 및 라인에 위치시켰다. 항체 및 항원 용액을 완전히 혼합하고, 적절한 라인에 즉시 연결하고, 생성된 용액 중의 비결합 항체의 양을 시간의 함수로서 측정하기 위해 KinExA 소프트웨어를 이용하였다. 결합 상수 kon(Kon)을 결정하기 위해, 시간의 함수로서 비결합 항체의 양의 고갈을 가역적 2분자 속도 방정식으로 피팅하기 위해 KinExA 소프트웨어를 이용하였다. 분해 속도 Koff(Koff)는 Kon*KD(Kd)이다.
결합 친화도: 표면 플라스몬 공명 검정
표면 플라스몬 공명 검정을 하기한 바대로 수행하였다:
아민 커플링을 이용하여 항체 또는 항원(300RU)을 CM5 칩 상에 부동화하였다. 이후, 부동화된 단백질과의 이의 결합 및 분해를 연구하기 위해 상이한 농도의 항체 또는 항원을 주사하였다. 상이한 주사 사이에, 적합한 재생 완충제(예컨대, 글라이신(pH 2.5))를 사용하여 칩을 재생하였다. K off (분해 속도)를 결정하기 위해 방정식 1을 이용하여 분해 상을 피팅하였다:
Figure pct00014
K on (결합 속도) 및 K D (평형 상수)를 결정하기 위해 이 K off 값 및 방정식 2를 이용하여 결합 상을 피팅하였다.
Figure pct00015
여기서, C 는 용액 중의 항원 또는 항체 농도를 나타내고, R max 는 포화 신호를 나타내며, t 는 시간을 나타낸다.
에피토프 결합: 표면 플라스몬 공명 검정
상기 기재된 바대로 표면 플라스몬 공명 검정을 이용하여 에피토프 결합을 수행하였다. 칩 표면 상에 항체 중 하나를 부동화시켰다. 이후, 재조합으로 발현된 인간 EGFR 세포외 도메인(EGFR-ECD)을 주사하였다. EGFR-ECD가 칩 표면에 접합된 항체와 결합하면서, 공명 신호가 증가하였다. 1빈, 2빈 및 3빈의 3개의 빈에 속하는 항체의 순차 주사를 수행하였다. 항체가 주사된 항체와 중첩 에피토프에 결합하는 경우, 이전 주사와 비교하여 신호는 변하지 않았다. 항체가 비중첩 에피토프에 결합하는 경우, 칩에서의 신호는 이전 주사보다 높았다. 칩에 접합된 항체를 마지막으로 비결합 리간드로서 주사하여 중첩 에피토프와의 결합의 결여를 확인하였다.
세포 결합 검정
KD 값을 결정하기 위한 세포 결합 검정을 하기한 바대로 수행하였다: A431 세포를 37℃에서 5분 동안 3㎖의 트립신-EDTA로 탈착하였다. 완전 DMEM(10㎖)을 트립신 분해된 세포에 즉시 첨가하고, 온화하게 재현탁시키고, 베크만 타블레탑(Beckman tabletop) 원심분리기에서 1100rpm에서 5분 동안 스핀 다운하였다. 1㎖당 2 x 106개의 세포의 농도에서 염색 완충제(PBS + 0.2% BSA + 0.1% 나트륨 아자이드) 중에 세포를 재현탁시키고, 50㎕(1 x 105개의 세포) 분액을 96웰 역가 플레이트에 평판배양하였다.
2000nM 항-EGFR 항체의 300㎕의 스톡 용액을 염색 완충제 중에 제조하고, 이의 100㎕를 200㎕의 염색 완충제 중에 연속 희석하였다. 희석된 항체의 농도는 2000nM 내지 0.1nM 범위이다. 이후, 상이한 단백질 희석액의 150㎕의 분액을 50㎕의 세포 현탁액에 직접 첨가하여 1500nM, 500nM, 166.7nM, 55.6nM, 18.5nM, 6.17nM, 2.05nM, 0.68nM, 0.23nM 및 0.076nM 항체의 최종 농도를 얻었다.
96웰 플레이트에서 분액된 세포를 실온에서 2시간 동안 진탕시키면서 항체 희석액과 항온처리하고, 300㎕의 염색 완충제로 3회 세척하였다. 이후, 세포를 BD 염색 완충제 중의 알렉사 647 라벨링 염소 항인간 IgG의 100㎕의 1:750 희석액과 4℃에서 45분 동안 진탕시키면서 항온처리하였다. 마지막으로, 세포를 2회 세척하고, 펠렛화하고, 250㎕의 염색 완충제 + 0.5㎍/㎖의 요오드화프로피듐 중에 재현탁시켰다. FL4 채널을 사용하여 팍스칼리부르(FACSCALIBUR) 유세포분석기에서 10,000개의 세포를 분석하였다. 항-EGFR-항체의 MFI 값 및 상응하는 농도를 각각 y축 및 x축에 작도하였다. 비선형 회귀 곡선에 대해 1자리 결합 모델을 이용하여 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 분자의 KD를 결정하였다.
식 Y = Bmax * X/KD + X(Bmax = 포화시 형광. X = 항체 농도. Y = 결합도)에 기초하여 KD 값을 계산한다.
면역블로팅을 통한 EGFR 수준의 측정
세포 융해물을 제조하기 위해, H1975 세포를 트립신 분해하고, 수확하고, 계수하고, 웰당 1x106개의 세포로 6웰 접시에서 평판배양하고, 밤새 항온처리하여 배양 플레이트에 부착시켰다. 세포를 1, 2, 5 및 24시간 동안 P1X + P2X + P3X(P1X + P2X + P3X 또는 P1X, P2X 및 P3X는 P1X, P2X 및 P3X의 2:2:1 몰비의 조합을 나타냄)의 1μM 농도로 예비 치료한 후, rhEGF(페프로테크, 카달로그 100-15호)로 10분 동안 자극하였다. 세포를 100㎕의 포유동물 단백질 추출 시약(Mammalian Protein Extraction Reagent)(피어스, 카달로그 78505호)으로 융해시켰다. 단백질 추출 시약을 포스스탑(PhosSTOP)(로슈(Roche), 카달로그 04906837001호) 및 프로테아제 억제제 칵테일 정제(Protease Inhibitor Cocktail tablets)(로슈, 카달로그 04693124001호)로 보충하였다. H1975 세포의 추출물을 샘플 완충제 중에 5분 동안 비등시켜 변성시키고, 환원 조건으로 처리하고, SDS-PAGE 4% 내지 12% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 200V에서 50분 동안 전기영동하였다. 단백질을 나이트로셀룰로스 막에 옮긴 후, 비특이적 자리를 오디세이 차단 완충제(Odyssey blocking buffer)(LI-COR, 카달로그 927-400-00호)로 실온에서 1시간 항온처리하여 차단하였다. 막을 마우스 단일클론 항-EGFR(1F4 - 라벨링 tEGFR; 셀 시그널링(Cell Signaling), 카달로그 2239호); 래빗 단일클론 항-포스포44/42 MAPK(Erk1/2, Thr202/Tyr204, D13.14.4E - 라벨링 pERK; 셀 시그널링, 카달로그 4370호); 래빗 단일클론 항-포스포AKT(Ser473, 193H12; 셀 시그널링, 카달로그 4058호); 래빗 단일클론 포스포-c-Jun(Ser73, D47G9 - 라벨링 p-c-Jun; 셀 시그널링, 카달로그 3270호) 및 래빗 항-PCNA(FL-261)(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 카달로그 sc-7907호)와 필요한 바대로 항온처리하였다. 1차 항체와 밤새 항온처리한 후, 면역블롯을 적절한 IRDye 라벨링 2차 항체(IR800CW 염소 항-마우스(오디세이, 카달로그 926-3210호) 또는 IR800CW 염소 항-래빗(오디세이, 카달로그 926-3211호))와 10분 동안 항온처리하고, SNAP i.d., 단백질 검출 시스템(Protein Detection System)(밀리포어(Millipore))을 사용하여 막을 통해 진공시켰다. 밴드를 LI-COR 오디세이 적외선 영상화 시스템을 사용하여 검출하고 오디세이 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
실험실내 종양 세포 증식 억제
EGFR을 발현하는 세포의 세포 증식 억제를 하기한 바대로 실험실내 조사하였다: HCC827 및 H1975 암 세포를 96웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 5,000개의 세포로 시딩하고, 항생제, 2mM L-글루타민 및 10% 소 태아 혈청(FCS)이 보충된 RPMI-1640 배지에서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 성장시켰다. 이후, 배지를 다양한 농도의 P1X + P2X + P3X 또는 세툭시맙(브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb))의 존재 하에 50ng/㎖ EGF 또는 200ng/㎖ AREG(암피레굴린; 알앤디 시스템즈)가 보충된 (항생제, 2mM L-글루타민, 1% FBS를 갖는) RPMI-1640 중에 전환하였다. 제조업자의 지시에 따라 셀티터-글로우(CellTiter-Glo)(등록상표)(CTG) 발광 세포 생존능력 검정(프로메가 코포레이션(Promega Corporation), 카달로그 호 G7572)을 이용하여 세포 생존능력을 측정하였다. CTG 검정은 대사적으로 활성인 세포의 표시자인 존재하는 ATP의 정량화에 기초한 배양 중의 생존 가능 세포의 수를 측정한다. 대조군 치료는 50ng/㎖ EGF 또는 200ng/㎖ AREG의 존재("+EGF" 또는 "+AREG"라 칭함) 또는 부재("-EGF" 또는 "-AREG"라 칭함) 하의 항생제, 2mM L-글루타민, 1% FCS를 갖는 RPMI-1640으로 처리된 세포를 포함하였다.
DU145 및 H1975 마우스 이종이식 연구
P1X, P2X 및 P3X Nu/nu 마우스(챨스 리버 랩스(Charles River Labs))의 조합을 세포에 피하로 주사하였다. 생성된 종양이 300㎣의 평균 크기에 도달할 때까지 성장시켰다. 이후, 용량을 P1X와 P2X 및 P3X의 조합, 세툭시맙 또는 비히클 대조군으로서 PBS의 매칭된 용적의 표시된 농도로 개시하였다. 4일 간격으로 측정하고, 식 용적 = π/6x(WxL2)을 이용하여 종양 용적을 계산하였다. 세툭시맙 및 P1X + P2X + P3X 용량을 정규화하여 균일한 혈청 노출을 제공하였다.
DU145 전립선암 세포 이종이식 쥣과 마우스 모델에서 생체내 P1X와 P2X 및 P3X의 조합의 효과를 평가하였다. 8x106개의 DU145 세포를 nu/nu 마우스의 옆구리에 피하로 주사하였다. 종양이 300㎣의 평균 크기에 도달하면, 치료를 개시하였다. 10마리의 마우스의 군을 비히클 대조군(PBS); 2.075㎎/㎏의 세툭시맙, P1X와 P2X 및 P3X(P1X = 2.53㎎/㎏, P2X = 7.26㎎/㎏ 및 P3X = 0.66㎎/㎏의 마우스에서 각각 P1X, P2X 및 P3X에 대해 2:2:1 Cmax를 제공하도록 지정된 "쥣과 비율"인 성분 농도에서)로 치료하였다. 세툭시맙 군에서의 마우스에 4일마다 투약하였다. P1X + P2X + P3X 군에서의 마우스에 2일마다 투약하였다. 이 용량 및 투약 간격을 선택하여 세툭시맙 및 쥣과 비율 3중 항체의 등가 혈청 노출을 생성시켰다.
리간드 길항작용 세포 결합 검정
단일 또는 다중 항체의 존재 하의 EGF 리간드의 결합을 결정하기 위한 세포 결합 검정을 하기와 같이 수행하였다: A431 세포를 37℃에서 5분 동안 5㎖의 트립신-EDTA로 탈착하였다. 완전 DMEM(10㎖)을 트립신 분해된 세포에 즉시 첨가하고, 온화하게 재현탁시키고, 베크만 타블레탑 원심분리기에서 1200rpm에서 7분 동안 스핀 다운하였다. 1㎖당 3 x 105개의 세포의 농도에서 염색 완충제(PBS + 2% FBS + 0.1% 나트륨 아자이드) 중에 세포를 재현탁시키고, 100㎕(3 x 104개의 세포) 분액을 96웰 역가 플레이트에 평판배양하였다.
항-EGFR 항체의 5㎖의 2x 스톡 용액을 각각의 실시예에 표시된 농도로 염색 완충제 중에 제조하였다. 바이오틴 태그(바이오틴-EGF)에 접합된 재조합 인간 EGF 리간드의 10㎖의 3x 스톡 용액을 염색 완충제 중에 제조하고, 이의 100㎕를 200㎕의 염색 완충제 중에 연속 희석하였다. 희석된 바이오틴-EGF의 농도는 600nM 내지 9pM 범위이다. 이후, 항-EGFR 항체의 100㎕의 분액을 100㎕의 세포 현탁액에 직접 첨가하여 각각의 실시예에 표시된 최종 농도를 얻었다. 96웰 플레이트에서 분액된 세포를 실온에서 1시간 동안 항체 희석액과 항온처리하엿다. 이후, 바이오틴-EGF의 100㎕의 분액을 100㎕의 세포 현탁액에 직접 첨가하여 200nM, 66.67nM, 22.22nM, 7.41nM, 2.47nM, 0.82nM, 0.27nM, 0.09nM, 0.03nM, 0.01nM 및 0.003nM의 바이오틴-EGF의 최종 농도를 얻었다. 96웰 플레이트에서 분액된 세포를 실온에서 10분 동안 항체 및 바이오틴-EGF 희석액과 항온처리하고, 100㎕의 염색 완충제로 1회 세척한 후, 베크만 타블레탑 원심분리기에서 1200rpm에서 7분 동안 스핀 다운하였다. 세포를 암소에서 실온에서 30분 동안 염색 완충제 중의 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 647 스트렙타비딘 접합체(인비트로겐 라이프 테크놀로지스(Invitrogen Life Technologies))의 100㎕의 1:500 희석액 중에 재현탁시켯다. 마지막으로, 세포를 100㎕의 염색 완충제로 2회 세척하고, 펠렛화하고, 80㎕의 고정 완충제(PBS + 2% FBS + 2% 파라포름알데하이드) 중에 재현탁시키고, 96웰 U 바닥 검정 플레이트(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))에 옮기고, 호일로 밀봉하고, 4℃에서 저장하였다.
FL4 채널을 사용하여 팍스칼리부르 유세포분석기에서 10,000개의 세포를 분석하였다. 윈리스트(WinList) 6.0 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다. 바이오틴-EGF 리간드의 평균 형광 강도(MFI) 값 및 상응하는 농도를 각각 y축 및 x축에 작도하였다.
실시예 1: 에피토프 매핑 / 비닝
모 항체의 친화도 돌연변이를 통해 항체 P1X, P2X 및 P3X를 생성하였다. 각각의 모 항체 ca, cd 및 ch가 공동 계류 중인 특허 출원 제PCT/US2011/3528호에 개시되어 있다. P1X, P2X 및 P3X가 이의 각각의 모 분자와 동일한 비중첩 에피토프를 공유하는지를 나타내기 위해 에피토프 매핑 및 비닝 실험을 수행하였다.
선택된 항체가 EGFR의 세포외 도메인(ECD) 상의 3종의 명확한 비중첩 에피토프를 포함하도록 빈을 지정하였다. 이를 3개의 빈으로 그룹화하였다: 1빈은 EGFR의 도메인 III으로 매핑되고, c225 에피토프(세툭시맙 결합 자리)를 나타내고; 2빈은 도메인 I로 매핑되고, ICR10 에피토프(아브캄(Abcam) Ab231)(Cochran et al. (2004) Journal of Immunological Methods, 287:147-158)를 나타내며; 3빈은 도메인 III으로 매핑되고, 클론 H11 에피토프(Spangler J. et al. PNAS. 107: 13252-13257, 2010)를 나타낸다. EGFR 세포외 도메인에서 볼드체로 하기 표시된 아미노산 위치에서 에피토프 매핑에 대해 1빈(B1-7MT-Ala) 및 3빈(B3-4MT) 돌연변이체를 생성하였다.
Figure pct00016
하기 돌연변이체 잔기를 갖는 1빈(B1) 및 3빈(B3) 에피토프 돌연변이체를 생성하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 볼드체의 아미노산 위치에서 하기 치환 돌연변이체를 만들었다:
Figure pct00017
포획 시약으로서 EGFR-ECD 야생형(WT), 1빈 에피토프 돌연변이체(c225 에피토프) 또는 3빈 에피토프 돌연변이체(H11 에피토프)를 사용하여 직접적 ELISA를 수행하였다. 다양한 농도(1, 0.25, 0.06 및 0.02㎍/㎖)의 단일클론 항체(mAb) P1X(1빈), P2X(2빈) 및 P3X(3빈)를 포획 시약과 실온에서 2시간 동안 항온처리한 후, HRP 접합 항인간 Fc 다중클론 항체로 1시간 동안 검출하였다. 도 1a에 도시된 것처럼, 모든 3종의 항체가 EGFR의 WT 세포외 도메인에 결합하였지만, 1빈 항체 P1X는 1빈 돌연변이체 에피토프에 결합하지 않았고, P3X 항체는 3빈 돌연변이체 에피토프에 결합하지 않았다.
P2X가 EGFR 세포외 도메인의 도메인 I 상의 ICR10 에피토프에 결합한다는 것을 나타내기 위해 표면 플라스몬 공명 실험을 수행하였다(도 1b). ICR10을 비아코어 칩의 표면에 접합하였다. 0.5μM EGFR-ECD를 항체 P1X(1빈), P2X(2빈) 및 P3X(3빈)의 0.5μM의 순차 주사로 주사하였다. P1X 및 P3X가 ICR10 결합 EGFR-ECD에 동시에 결합하는 것으로 관찰되었지만, P2X는 결합하지 않는 것으로 나타났다.
P1X, P2X 및 P3X에 대한 에피토프가 명확하고 비중첩이라는 것을 나타내기 위해, 일련의 3회 표면 플라스몬 공명 비닝 실험을 수행하였다. P1X(도 2a), P2X(도 2b) 또는 P3X(도 2c)를 비아코어 칩의 표면에 접합하였다. 0.5μM EGFR-ECD를 주사한 후, 0.5μM의 항체 P3X, P2X 및 P1X를 순차 주사하였다. 비아코어 칩에 접합된 동일한 항체의 주사는 음성 대조군으로 기능하였다. 모든 3회 실험에서, 남은 빈으로부터의 2종의 항체는 EGFR-ECD와 결합하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 3회 실험 결과는 P1X, P2X 및 P3X가 비중첩의 명확한 에피토프를 갖고 EGFR-ECD와 동시에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 결합 친화도
KinExA에 의해 EGFR에 대한 P1X, P2X 및 P3X의 1가 친화도를 측정하였다. 데이터가 하기 표 1에 도시되어 있다. P1X, P2X 및 P3X의 친화도는 모두 0.4nM보다 우수하고, 모두 모 분자에 비해 개선되었다. P1X의 친화도(11pM)는 1빈 모 분자 ca보다 13.18배(145pM) 우수하였다. P2X의 친화도(70pM)는 2빈 모 분자 cd보다 7.71배(540pM) 우수하였다. P3X의 친화도(360pM)는 3빈 모 분자 ch(757pM)보다 2.10배 우수하였다.
Figure pct00018
실시예 3: 단일 항체에 의한 세포 결합 검정
단일클론 항체 P1X, P2X 및 P3X가 A431 세포 상의 EGFR와 결합할 수 있는지를 나타내기 위해 세포 결합 검정을 수행하였다(도 3). A431 세포를 단일 항체의 희석 시리즈와 2시간 동안 항온처리하고, 상기 방법론 섹션에 기재된 정량적 유세포 분석법에 의해 결합 항체의 양을 측정하였다. 항체에 대한 희석 시리즈에서 사용된 농도가 하기 표 2에 도시되어 있다. 당업자라면 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 2에서의 각각의 특이적 농도 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00019
이 실험적 조건 하의 세포 결합 친화도는 그래프패드 프리즘(등록상표) 소프트웨어를 이용하여 4 매개변수 로지스틱 방정식으로의 회귀를 통해 168pM(P1X), 340pM(P2X) 및 748pM(P3X)인 것으로 계산되었다.
실시예 4: 단일 항체에 의한 포스포 - EGF 수용체 신호전달 억제
A431 세포를 단일 항체로 치료하고, EGF 의존적 포스포-EGFR 활성을 억제하는 이의 능력을 포스포-EGFR ELISA에 의해 측정하였다. P1X 및 P2X는 3.09nM 및 4.19nM의 각각의 IC50 값으로 용량 의존 방식으로 포스포-EGFR 활성을 강력히 억제하는 반면, P3X에 의한 치료는 부분 포스포-EGFR 억제를 발생시켰다(도 4). 항체에 대한 희석 시리즈에서 사용된 농도가 하기 표 3에 기재되어 있다. 당업자라면 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 3에서의 각각의 특이적 농도 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00020
실시예 5: 항체의 단일 및 쌍 조합에 의한 포스포 - ERK 신호전달 억제 및 모 항체에 대한 비교
A431 세포를 단일 P1X의 희석 시리즈 또는 ca 항체로 치료하고, 포스포-ERK 억제를 포스포-ERK ELISA에 의해 측정하였다(도 5a). P1X은 포스포-ERK 활성의 유발 용량 의존 억제를 발생시키고, ca 모 항체는 오직 부분 억제를 발생시켰다.
A431 세포를 P1X + P3X의 쌍 조합의 희석 시리즈 또는 이의 각각의 모 항체 ca+ch로 치료하고, 포스포-ERK 억제를 포스포-ERK ELISA에 의해 측정하였다(도 5b). 조합 둘 다 용량 의존 방식으로 포스포-ERK 생성을 억제하였지만, P1X + P3X의 조합은 더 우수한 억제를 제공하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하는 4 매개변수 로지스틱 방정식에 피팅하여 계산할 때, P1X + P3X의 조합이 포스포-ERK 활성의 82% 억제를 발생시켰지만, 모 조합은 불과 71% 억제시켰다.
A431 세포를 P1X + P2X의 쌍 조합의 희석 시리즈 또는 이의 각각의 모 항체 ca+cd로 치료하고, 포스포-ERK 억제를 포스포-ERK ELISA에 의해 측정하였다(도 5c). 조합 둘 다 용량 의존 방식으로 포스포-ERK 생성을 억제하였지만, P1X + P2X의 조합은 모 조합에 비해 IC90 값에서 관찰 가능한 개선을 나타냈다.
항체에 대한 희석 시리즈에서 사용된 농도는 하기 (도 5a에서의 데이터에 대해) 표 4 및 (도 5b 및 5c에서의 데이터에 대해) 표 5에 기재되어 있다. 당업자라면 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 4 및 표 5에서 각각의 특이적 농도 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00021
Figure pct00022
표 5에 기재된 농도가 사용된 항체의 쌍에 대한 전체 농도라는 것에 주목한다. 쌍에서 각각의 개별 항체가 전체 농도의 반을 포함하도록 사용된 비율은 1:1이다.
실시예 6: P1X , P2X 및 P3X 의 상이한 조합 비율에 의한 포스포 - ERK 신호전달 억제
A431 세포를 P1X의 희석 시리즈로 치료하고, 포스포-ERK 억제를 ELISA에 의해 측정하였다(도 6a). 항체에 대한 희석 시리즈에서 사용된 농도가 하기 표 6에 기재되어 있다. 당업자라면 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 6에서 각각의 특이적 농도 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00023
방법론 섹션에 기재된 바대로 실험을 수행하였다. 이 실험 조건 하에, P1X는 약 25nM(27nM)의 IC50 값으로 포화 농도에서 포스포-ERK 활성의 81%를 억제하였다. 따라서, IC50의 플롯 상의 대략적 위치가 "25nM"로 도 6a에 표시되어 있고, 25nM을 하기 실험에서 P1X의 일정한 농도로 설정하였다.
A431 세포를 25nM의 일정한 P1X 농도와 조합하여 P3X + P2X의 5 조합 비율의 희석 시리즈로 처리하고, 포스포-ERK 억제를 ELISA에 의해 측정하였다(도 6b). 항체에 대한 희석 시리즈에서 사용된 농도가 하기 표 7에 기재되어 있다. 당업자라면 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 7에서 각각의 특이적 농도 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00024
표 7에 기재된 농도가 P2X + P3X에 대한 전체 농도라는 것에 주목한다. P2X 및 P3X의 각각의 농도는 표시된 비율에 따라 달라진다. 방법론 섹션에 기재된 바대로 실험을 수행하였다. 사용된 P3X:P2X의 비율은 1:0, 0:1, 1:2, 2:1 및 1:1이었다. 모든 비율은 포스포-ERK 활성을 70% 초과로 억제하였고, 모든 3종의 항체를 포함하는 이 조합은 가장 높은 정도의 억제를 제공하였다.
A431 세포를 P1X:P2X:P3X의 6 조합 비율의 희석 시리즈로 치료하고, 포스포-ERK 억제를 ELISA에 의해 측정하였다(도 6c). 항체에 대한 희석 시리즈에서 사용된 농도가 하기 표 8에 기재되어 있다. 당업자라면 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 8에서 각각의 특이적 농도 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00025
Figure pct00026
방법론 섹션에 기재된 바대로 실험을 수행하였다. 사용된 P1X:P2X:P3X의 비율은 1:0.01:1, 1:0.1:1, 1:1:1, 2:0.01:1, 2:0.1:1 및 2:2:1이었다. 모든 비율은 포스포-ERK 활성을 70% 초과로 억제하였다.
A431 세포를 P1X:P2X의 5 조합 비율의 희석 시리즈로 치료하고, 포스포-ERK 억제를 ELISA에 의해 측정하였다(도 6d). 항체에 대한 희석 시리즈에서 사용된 농도가 하기 표 9에 기재되어 있다. 당업자라면 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 9에서 각각의 특이적 농도 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00027
표 9에 기재된 농도가 P1X + P2X에 대한 전체 농도인 것에 주목한다. P1X 및 P2X의 각각의 농도는 표시된 비율에 따라 달라진다. 방법론 섹션에 기재된 바대로 실험을 수행하였다. 사용된 P1X:P2X의 비율은 1:2, 5:1, 9:1, 50:1 및 1:5였다. 1:5(P1X:P2X)를 제외한 모든 비율은 실험에 사용된 농도 범위 내에서 포스포-ERK 활성을 70% 초과로 억제하였다. 그러나, 1:5 비율(P1X:P2X) 데이터로의 4 매개변수 로지스틱 억제 곡선의 피팅은 이 조합이 생리학적 조건 하에 성취될 수 있는 범위 내에서 실험에 사용된 용량보다 약간 높은 35.7nM의 농도에서 70%의 포스포-ERK 억제를 성취한다는 것을 예측하였다.
실시예 7: P1X , P2X 및 P3X 의 2:2:1 비율 조합에 의한 포스포 - EGFR 및 포스포 - ERK 신호전달 억제
A431 세포를 항체 P1X, P2X 및 P3X의 2:2:1 몰비 조합의 희석 시리즈(이 몰비에서의 이 조합을 본 명세서에서 "P1X + P2X + P3X"라 칭함)로 치료하고, 포스포-EGFR 및 포스포-ERK 억제를 ELISA에 의해 측정하였다(도 7a). 항체에 대한 희석 시리즈에서 사용된 농도가 하기 표 10에 기재되어 있다. 당업자라면 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 10에서 각각의 특이적 농도 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00028
표 10에 기재된 농도가 P1X + P2X + P3X에 대한 전체 농도라는 것에 주목한다. P1X, P2X 및 P3X의 각각의 농도가 각각 40%, 40% 및 20%로 되도록 사용된 비율은 2:2:1이었다. 방법론 섹션에 기재된 바대로 실험을 수행하였다. 3종의 항체의 조합은 2.30nM 및 9.87nM의 각각의 IC50 값으로 포스포-EGFR 및 포스포-ERK 활성 둘 다의 강력한 억제제이다.
P1X + P2X+ P3X를 P1X 단일(도 7b) 및 P2X 단일(도 7c)과 비교하였다. A431 세포를 항체의 희석 시리즈로 치료하고, 포스포-ERK 억제를 ELISA에 의해 측정하였다. 도 7b 및 도 7c에 도시된 실험에 대한 항체에 대한 희석 시리즈에서 사용된 농도가 하기 표 11에 기재되어 있다. 당업자라면 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 11에서 각각의 특이적 농도 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00029
표 11에 기재된 농도가 P1X + P2X + P3X에 대한 전체 농도라는 것에 주목한다. P1X, P2X 및 P3X의 각각의 농도가 각각 40%, 40% 및 20%로 되도록 사용된 비율은 2:2:1이었다. 세포를 자극하기 위해 80nM의 EGF 리간드를 사용한다는 것을 제외하고 방법론 섹션에 기재된 바대로 실험을 수행하였다. 항체의 2:2:1 비율 조합은 P1X 및 P2X(각각 부분 억제를 제공하고 억제를 제공하지 않음)와 비교하여 포스포-ERK 활성의 강력한 억제제이다.
실시예 8: P1X + P2X + P3X에 의한 치료 후에 H1975 세포에서 pERK , pAKT 및 p-c-Jun 신호전달의 EGF 수용체 하향조절 및 억제
세포를 P1X + P2X + P3X 동등 1μM 전체 항체로 2시간 동안 예비 항온처리하고, 상기 방법론 섹션에 기재된 바대로 10분 동안 50ng/㎖의 rhEGF(페프로테크)로 자극하였다. 세포 융해물의 면역블롯을 tEGFR, pERK, pAKT 또는 p-c-Jun에 대해 항체로 별도로 프로빙하고, 밴드의 농도계를 로딩 대조군 PCNA 및 대조군 비치료 세포의 융해물로 정규화하였다. P1X + P2X + P3X 치료에 반응하는 EGF 수용체 하향조절이 도 8a에 도시되어 있고, P1X + P2X + P3X 치료에 반응하는 pERK, pAKT 및 p-c-Jun 신호전달의 억제가 도 8b에 도시되어 있다.
실시예 9: 실험실내 종양 세포 증식 억제
상기 기재된 방법 또는 이의 약간의 변동성에 의해 실험실내 종양 세포 증식 억제를 분석하였다. 비소세포 폐암(NSCLC) 세포주 HCC827 및 H1975를 5000개의 세포/웰로 평판배양하고, 0.1 내지 1μM(최종 농도) 범위의 항체 조합으로 치료하였다. 도 9a 내지 도 9d는 대사적으로 활성인 세포의 표시자인 존재하는 ATP의 정량화에 기초한 배양 중의 생존 가능 세포의 수를 측정하는 셀티터-글로우(등록상표)(CTG) 발광 세포 생존능력 검정(프로메가 코포레이션)을 이용한 세포 증식 억제를 나타낸다. 도 9a 및 도 9b는 EGF 리간드의 존재 하의 세툭시맙 치료 또는 검정 배지 단독(1% FCS)뿐만 아니라 P1X + P2X + P3X 농도의 범위에 걸쳐 HCC827 및 H1975 세포의 성장의 강력한 억제를 나타낸다. 도 9c 및 도 9d는 AREG 리간드의 존재 하의 검정 배지 단독(1% FCS)뿐만 아니라 P1X + P2X + P3X 및 세툭시맙 둘 다에 대한 농도의 범위에 걸쳐 HCC827 및 H1975 세포의 성장의 강력한 억제를 나타낸다. 이 결과는 고친화도(EGF) 및 저친화도(AREG) 리간드 둘 다에 반응하여 실험실내 종양 세포 증식을 억제하는 P1X + P2X + P3X의 능력을 나타내고, 세툭시맙은 저친화도(AREG) 리간드로 치료된 세포에서만 효과적이다. 도 9a 내지 도 9d에 도시된 실험에 대한 항체에 대한 희석 시리즈에서 사용된 농도가 하기 표 12에 기재되어 있다. 당업자라면 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 12에서 각각의 특이적 농도 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00030
표 12에 기재된 농도가 P1X + P2X + P3X에 대한 전체 농도라는 것에 주목한다. P1X, P2X 및 P3X의 각각의 농도가 각각 40%, 40% 및 20%로 되도록 사용된 비율은 2:2:1이었다.
실시예 10: 생체내 종양 세포 증식 억제
H1975 폐암 세포 이종이식 쥣과 마우스 모델에서 생체내 P1X + P2X + P3X의 효율을 평가하였다. 2x106개의 NCI-H1975 세포를 nu/nu 마우스의 옆구리에 피하로 주사한다. 종양이 300㎣의 평균 크기에 도달하면, 치료를 개시하였다. 10마리의 마우스의 군을 비히클 대조군(PBS); 또는 쥣과 비율 3중 항체 - 저 P1X = 2.53㎎/㎏, P2X = 7.26㎎/㎏ 및 P3X = 0.66㎎/㎏ 또는 쥣과 비율 3중 항체 - 중간 P1X = 5.06㎎/㎏, P2X = 14.52㎎/㎏ 및 P3X = 1.33㎎/㎏의 성분 농도에서의 쥣과 비율 3중 항체로 치료하였다. 마우스를 2일마다 치료하였다.
도 10a(DU145 이종이식 모델) 및 도 10b(H1975 이종이식 모델)에 도시된 결과는 생체내 종양 세포 증식을 억제하는 P1X + P2X + P3X의 능력을 나타낸다.
실시예 11: 단일 항체에 의한 리간드 길항작용 세포 결합 검정
단일클론 항체 P1X, P2X 및 P3X가 A431 세포에서 EGF 리간드 및 EGF 수용체의 상호작용을 길항할 수 있다는 것을 나타내기 위해 세포 결합 검정을 수행하였다. A431 세포를 1용량의 단일 항체와 1시간 동안 항온처리한 후 바이오틴-EGF 리간드의 희석 시리즈와 항온처리하고, 결합 바이오틴-EGF 리간드의 양을 상기 방법론 섹션에 기재된 바대로 정량적 유세포 분석법에 의해 측정하였다. 항체에 대한 농도가 하기 표 13에 기재되어 있고, 실시예 3에 기재된 분석으로부터 결정되는 세포 결합의 포화 이하 농도(대략 EC90 농도)를 나타낸다. 바이오틴-EGF에 대한 희석 시리즈에 사용된 농도가 농도가 하기 표 14에 기재되어 있다. 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 13 및 표 14에서의 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다.
Figure pct00031
Figure pct00032
결과는 도 11에 도시되어 있고, 이것은 각각의 단일 항체(P1X, P2X 및 P3X) 단독이 A431 세포 상의 EGF 리간드 및 EGF 수용체의 상호작용을 길항할 수 있고, P1X 및 P2X가 P3X보다 강력한 억제 활성을 보여준다는 것을 나타낸다.
실시예 12: 항체 또는 Fab 의 단일 및 조합에 의한 리간드 길항작용 세포 결합 검정
단일클론 항체 P1X, P2X 및 P3X의 단일 항체 및 다중 항체 조합 및 1가 Fab 단편 P1X Fab, P2X Fab 및 P3X Fab의 단일 및 다중 조합이 A431 세포 상의 EGF 리간드 및 EGF 수용체의 상호작용을 길항할 수 있는 정도를 결정하기 위해 세포 결합 검정을 수행하였다. A431 세포를 1용량의 항체 또는 Fab로 1시간 동안 항온처리한 후, 바이오틴-EGF 리간드의 희석 시리즈로 항온처리하고, 결합 바이오틴-EGF 리간드의 양을 상기 방법론 섹션에 기재된 바대로 정량적 유세포 분석법에 의해 측정하였다. 항체 및 Fab의 농도는 10nM이었다. 3종의 항체(P1X + P2X + P3X) 및 3종의 항체(P1X Fab + P2X Fab + P3X Fab)의 조합을 2:2:1의 비율로 제제화하고, 10nM의 전체 농도에서 투약하였다. 바이오틴-EGF에 대한 희석 시리즈에서 사용된 농도가 상기 표 14에 기대되어 있다. 당업자라면 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 14에서 각각의 특이적 농도 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다는 것을 이해할 것이다.
결과는 도 12a(단일클론 항체 P1X, P2X 및 P3X의 단일 및 조합) 및 도 12b(1가 Fab 단편 P1X Fab, P2X Fab 및 P3X Fab의 단일 및 조합)에 도시되어 있다. 도 12a에서의 결과는 다시 모든 3종의 항체가 단독으로 A431 세포 상의 EGF 리간드 및 EGF 수용체의 상호작용을 길항할 수 있고, P1X 및 P2X가 P3X보다 강력한 억제 활성을 보여주고, P1X + P2X + P3X의 3중 조합이 또한 강력한 억제 활성을 보여준다는 것을 나타낸다. 도 12b에서의 결과는 P1X Fab가 단독으로 가장 강한 억제 활성을 보여주고, P3X Fab가 단독으로 중간 억제 활성 단독을 보여주며, P2X Fab가 오직 최소 억제 활성 단독을 보여준다는 것을 나타낸다. P1X Fab + P2X Fab + P3X Fab의 3중 조합이 또한 강한 억제 활성을 나타내지만, P1X Fab 단독보다 덜 강력하다.
실시예 13: P1X , P2X 및 P3X 항체 또는 Fab 의 2:2:1 몰비 조합에 의한 포스포 - EGFR 및 포스포 - ERK 신호전달 억제
A431 세포를 항체 P1X, P2X 및 P3X("P1X + P2X + P3X") 또는 Fab P1X Fab, P2X Fab, P3X Fab의 2:2:1 몰비 조합의 희석 시리즈(이 몰비에서의 이 조합을 본 명세서에서 "P1X Fab + P2X Fab + P3X Fab"라 칭함)로 치료하고, 포스포-EGFR 및 포스포-ERK 억제를 ELISA에 의해 측정하였다. 50ng/㎖ 또는 500ng/㎖의 농도에서 투약된 rhEGF(페프로테크)로 실험을 수행하였다. 항체에 대한 희석 시리즈 및 Fab에서 사용된 농도가 하기 표 15에 기재되어 있다. 당업자라면 제공된 각각의 특이적 농도가 거의 표시된 농도(예를 들면, 0.1nM로 표에서 표시된 농도는 약 0.1nM의 값을 나타냄)의 값을 나타내도록 표 15에서 각각의 특이적 농도 값이 약간 작은 실험적 변동성으로 처리된다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00033
결과가 도 13a 내지 도 13d에 도시되어 있고, 도 13a 및 도 13b는 포스포-EGFR 억제 검정의 결과를 나타내고, 도 13c 및 도 13d는 포스포-ERK 억제 검정의 결과를 나타내며, 도 13a 및 도 13c는 저용량(50ng/㎖ 또는 8nM)에서의 결과를 나타내고, 도 13b 및 도 13d는 고용량(500ng/㎖ 또는 80nM)에서의 결과를 나타낸다.
포스포-EGFR의 억제와 관련하여, 도 13a 및 도 13b에서의 결과는 3중 조합인 P1X + P2X + P3X mAb 및 P1X Fab + P2X Fab + P3X Fab 단편 둘 다가 시험된 저용량 및 고용량 둘 다에서 강한 억제를 나타낸다는 것을 나타낸다.
포스포-ERK의 억제와 관련하여, 도 13c 및 도 13d에서의 결과는 3중 조합인 P1X + P2X + P3X mAb 및 P1X Fab + P2X Fab + P3X Fab 단편 둘 다가 시험된 저용량 및 고용량 둘 다에서 억제를 나타내고, P1X + P2X + P3X mAb 조합은 P1X Fab + P2X Fab + P3X Fab 단편 조합보다 강력한 억제를 나타낸다는 것을 나타낸다.
실시예 14: P1X + P2X + P3X, P1X Fab + P2X Fab + P3X Fab 또는 세툭시맙에 의한 치료 후 DU -145 세포에서 EGF 수용체 하향조절
세포를 각각 50nM, 100nM 및 50nM인 P1X + P2X + P3X, P1X Fab + P2X Fab + P3X Fab 또는 세툭시맙으로 2, 6 또는 24시간 동안 예비 항온처리하였다. Fab 조합을, IgG 분자 상의 2개의 결합 모이어티에 대한 Fab 분자 상의 단일 결합 모이어티의 원인이 되는, P1X + P2X + P3X 및 세툭시맙의 2배의 농도에서 투약하였다. 상기 방법론 섹션에 기재된 바대로 대조군으로서 pcna 관리 단백질 및 막관통 EGFR(tEGFR)에 대한 항체로 세포 융해물의 면역블롯을 프로빙하였다. 치료에 반응하는 EGF 수용체 하향조절이 도 14에 도시되어 있다. 결과는 P1X + P2X + P3X에 의한 치료가 시간 의존 방식으로 EGFR의 관찰 가능한 하향조절을 발생시키는 반면, P1X Fab + P2X Fab + P3X Fab 또는 세툭시맙에 의한 치료가 면역블롯의 육안 감시에서 EGFR의 관찰 가능한 하향조절을 발생시키지 않는다는 것을 나타낸다.
균등물
당업자는 단지 통상의 실험을 이용하여 본 명세서에 기재된 특정한 실시양태의 많은 균등물을 인식하고 확인할 수 있다. 이러한 균등물은 하기 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 임의의 복수의 독립항에 개시된 실시양태의 임의의 조합이 본 개시내용의 범위 내에 고려된다.
참조문헌에 의한 포함
상기 본 명세서에 언급된 모든, 특허, 계류 중인 특허 출원 및 특허 공보가 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함된다.
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
SEQUENCE LISTING <110> MERRIMACK PHARMACEUTICALS, INC. ADIMAB, LLC <120> ANTIBODIES AGAINST EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFR) AND USES THEREOF <130> MMJ-037PC <140> PCT/US2012/045235 <141> 2012-07-02 <150> 61/558,945 <151> 2011-11-11 <150> 61/504,633 <151> 2011-07-05 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Asp Pro Ser Val Asn Leu 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Gln Ser Ile Ser Ser Trp Trp Ala 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 22 Met Gly Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Ser Pro Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Val Glu Ile Lys 130 <210> 23 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 23 Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Leu Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Ser Val Pro 115 120 125 Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 24 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 24 Met Gly Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Tyr Arg 100 105 110 Thr Trp Pro Arg Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 25 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 26 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial 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Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 27 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 28 Asp Pro Ser Val Asp Leu 1 5 <210> 29 <211> 8 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His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val 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His His His 645 650

Claims (44)

  1. EGFR 세포외 도메인에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체로서, 상기 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은,
    (a) 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (b) 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 및
    (c) 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단일클론 항체.
  2. EGFR 세포외 도메인에 결합하고, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체로서, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은,
    (a) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (b) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    (c) 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단일클론 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 100nM보다 양호한 KD로 EGFR에 결합하는 단일클론 항체.
  4. 제3항에 있어서, 10nM보다 양호한 KD로 EGFR에 결합하는 단일클론 항체.
  5. 제3항에 있어서, 1nM보다 양호한 KD로 EGFR에 결합하는 단일클론 항체.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 항체인 단일클론 항체.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 이중특이적 항체, 면역접합체, Fab, Fab'2, ScFv, 아비머(avimer), 나노바디 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단일클론 항체.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE 아이소타입 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단일클론 항체.
  9. 제1항 또는 제2항의 단일클론 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  10. 컨테이너 내에 제9항의 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
  11. 피험체에서 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 제9항의 약제학적 조성물을 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 암의 치료를 위한 단일클론 항체.
  13. EGFR 세포외 도메인에 결합하는 2종 또는 3종의 단일클론 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 2종 또는 3종의 단일클론 항체는,
    (a) 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체;
    (b) 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체; 및
    (c) 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 조성물은 (a)와 (b), (a)와 (c), (b)와 (c), 또는 (a)와 (b)와 (c)를 포함하는 것인 조성물.
  14. EGFR 세포외 도메인에 결합하는 2종 또는 3종의 단일클론 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 2종 또는 3종의 단일클론 항체는,
    (a) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;
    (b) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체; 및
    (c) 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 조성물은 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (b) 및 (c) 또는 (a), (b) 및 (c)를 포함하는 것인 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 단일클론 항체 (a), (b) 및 (c)의 각각은 100nM보다 양호한 KD로 EGFR에 결합하는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 단일클론 항체 (a), (b) 및 (c)의 각각은 10nM보다 양호한 KD로 EGFR에 결합하는 것인 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 단일클론 항체 (a), (b) 및 (c)의 각각은 1nM보다 양호한 KD로 EGFR에 결합하는 것인 조성물.
  18. 제13항 또는 제14항에 있어서, 단일클론 항체 (a), (b) 및 (c)의 각각은 인간 항체인 것인 조성물.
  19. 제13항 또는 제14항에 있어서, 단일클론 항체 (a), (b) 및 (c) 중 하나 이상이 이중특이적 항체, 면역접합체, Fab, Fab'2, ScFv, 아비머, 나노바디 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 조성물.
  20. 제13항 또는 제14항에 있어서, 단일클론 항체 (a), (b) 및 (c)의 각각은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE 아이소타입 항체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 조성물.
  21. 제13항 또는 제14항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  22. 컨테이너 내에 제21항의 조성물을 포함하는 키트.
  23. 피험체에서 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 제21항의 조성물을 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  24. 제13항 또는 제14항에 있어서, 암을 치료하기 위한 조성물.
  25. 3종의 단일클론 항-EGFR 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체를 포함하되, (ⅰ) 상기 제1 항체는 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고; (ⅱ) 상기 제2 항체는 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며; (ⅲ) 상기 제3 항체는 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체는 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 존재하는 것인 조성물.
  26. 3종의 단일클론 항-EGFR 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체를 포함하되, (ⅰ) 상기 제1 항체는 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; (ⅱ) 상기 제2 항체는 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며; (ⅲ) 상기 제3 항체는 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 제1 항체, 제2 항체 및 제3 항체는 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 존재하는 것인 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 제1 항체, 상기 제2 항체 및 상기 제3 항체의 각각은 100nM보다 양호한 KD로 EGFR에 결합하는 것인 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제1 항체, 상기 제2 항체 및 상기 제3 항체의 각각은 10nM보다 양호한 KD로 EGFR에 결합하는 것인 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 상기 제1 항체, 상기 제2 항체 및 상기 제3 항체의 각각은 1nM보다 양호한 KD로 EGFR에 결합하는 것인 조성물.
  30. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 제1 항체는 1 x 10-9M 내지 1.1 x 10-11M 범위의 KD로 EGFR에 결합하고, 상기 제2 항체는 1 x 10-9M 내지 7.0 x 10-11M 범위의 KD로 EGFR에 결합하며, 상기 제3 항체는 1 x 10-9M 내지 3.6 x 10-10M 범위의 KD로 EGFR에 결합하는 것인 조성물.
  31. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 제1 항체, 상기 제2 항체 및 상기 제3 항체의 각각은 인간 항체인 것인 조성물.
  32. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 제1 항체, 상기 제2 항체 및 상기 제3 항체 중 하나 이상은 이중특이적 항체, 면역접합체, Fab, Fab'2, ScFv, 아비머, 나노바디 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 조성물.
  33. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 제1 항체, 상기 제2 항체 및 상기 제3 항체의 각각은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE 아이소타입 항체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 조성물.
  34. 제25항 또는 제26항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 무균 조성물인 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 주사에 적합한 조성물.
  37. 제34항에 있어서, 정맥 주사에 적합한 무균 조성물인 조성물.
  38. 컨테이너 내에 제34항의 조성물을 포함하는 키트.
  39. 피험체에서 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 제34항의 조성물을 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  40. 제25항 또는 제26항에 있어서, 암을 치료하기 위한 조성물.
  41. 항-EGFR 항체 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체;
    (b) 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체; 및
    (c) 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체를 단일 조성물로 배합하는 단계를 포함하되;
    (a), (b) 및 (c)를 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 배합하는 것인, 항-EGFR 항체 조성물의 제조 방법.
  42. 항-EGFR 항체 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;
    (b) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체; 및
    (c) 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체를 단일 조성물로 배합하는 단계를 포함하되;
    (a), (b) 및 (c)를 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 배합하는 것인, 항-EGFR 항체 조성물의 제조 방법.
  43. 항-EGFR 항체로 피험체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체;
    (b) 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체; 및
    (c) 각각 서열 번호 13, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 그리고 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체를 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하되;
    (a), (b) 및 (c)를 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 상기 피험체에게 투여하는 것인, 항-EGFR 항체로 피험체를 치료하는 방법.
  44. 항-EGFR 항체로 피험체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;
    (b) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체; 및
    (c) 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체를 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하되;
    (a), (b) 및 (c)를 서로에 대해 2:2:1의 몰비로 상기 피험체에게 투여하는 것인, 항-EGFR 항체로 피험체를 치료하는 방법.
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