CN107090039A - 靶向于钙粘着蛋白‑11的ec1结构域的人源化抗体及相关组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合哺乳动物钙粘着蛋白‑11蛋白质的EC1结构域的人源化抗体及包含此类抗体的组合物(例如，药物组合物)。本发明还涉及通过施用治疗有效量的本发明的人源化抗体来治疗哺乳动物受试者的钙粘着蛋白‑11介导的病症的方法。适于通过本发明的方法进行治疗的钙粘着蛋白‑11介导的病症包括炎性疾病(例如，炎性关节疾病，诸如类风湿性关节炎)、纤维化和癌症。

Description

靶向于钙粘着蛋白-11的EC1结构域的人源化抗体及相关组合 物和方法
本申请为国际申请PCT/US2011/044172进入中国国家阶段的中国专利申请(申请号为201180042808.0，申请日为2011年7月15日，发明名称为“靶向于钙粘着蛋白-11的EC1结构域的人源化抗体及相关组合物和方法”)的分案申请。
相关申请
本申请要求于2010年7月15日提交的美国临时申请号61/364,698的权益。以上申请的全部内容都通过引用并入本文。
背景技术
患有重度慢性关节炎症的患者遭受严重的关节退化(包括骨和软骨的破坏)，这导致了长期疼痛、畸形、关节功能的丧失、运动能力下降以及预期寿命缩短。关节炎症与关节中细胞和炎性物质的数量增加有关，这些细胞和炎性物质引起了刺激、软骨的磨损以及关节内衬(joint lining)的肿胀。已知几种不同的自身免疫性疾病触发了关节中不当的或误定向的炎症，从而在患有这些疾病的个体的关节中导致慢性炎症。常见的炎性关节病症包括类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、莱特尔氏综合征以及强直性脊柱炎。
类风湿性关节炎(RA)是最常见的炎性关节炎形式，其据估计影响到美国人口的大约1％，或者说大约210万美国人。RA是一种慢性疾病，其特征在于关节的内衬或滑膜的炎症，并且随着时间推移会导致严重的骨和软骨的损害。与男性相比，RA在女性中更为常见，并且多达3％的女性在她们的一生中可能发生类风湿性关节炎。目前，RA的病因还未知。
RA可以引起长期的关节损害，导致慢性疼痛、功能丧失以及失能。此外，最近的研究表明，患有RA的人，特别是其疾病没有得到良好控制的那些人，可能具有更高的心脏病、中风以及发生纤维化(尤其是肺纤维化)的风险。
肺纤维化，包括特发性肺纤维化和放射诱导的纤维化，以及由吸烟、化学品接触、硬皮病、结节病、治疗性辐射、RA或狼疮引起的纤维化，折磨着全球5,000,000名患者，以及美国的超过500,000名个体。特发性肺纤维化的5年死亡率约为80％，仅在美国每年就导致40,000例死亡。目前在美国或欧洲对于特发性肺纤维化还没有已得到批准的疗法。
因此，由RA和其他炎症性状况引起的纤维化和慢性关节炎症是国际性的卫生负担。存在着开发用于预防和治疗这些和其他病症的新药的需要。
发明内容
在一个实施方式中，本发明涉及特异性结合哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域的人源化抗体，该抗体包含含有选自SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：69的氨基酸序列的抗体重链可变区。在一个具体的实施方式中，该人源化抗体拮抗哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质。在进一步的实施方式中，该人源化抗体包含含有SEQ ID NO：69的抗体重链可变区。
在另一实施方式中，本发明涉及特异性结合哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域的人源化抗体，其包含含有SEQ ID NO：69的抗体重链可变区和含有SEQ ID NO：71的抗体轻链可变区。在一个具体的实施方式中，该人源化抗体拮抗哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质。
在另一实施方式中，本发明提供了治疗需要的哺乳动物受试者(例如，人)中钙粘着蛋白-11介导的病症(例如，炎性关节病症)的方法。该方法包括对该受试者施用治疗有效量的特异性结合哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域并拮抗哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的人源化抗体，从而在该受试者中产生期望的治疗效果。在一个具体的实施方式中，该人源化抗体包含含有SEQ ID NO：69的抗体重链可变区。在优选的实施方式中，钙粘着蛋白-11介导的病症是类风湿性关节炎。
在又另一实施方式中，本发明涉及包含特异性结合哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域的人源化抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。在一个具体的实施方式中，该人源化抗体包含含有SEQ ID NO：69的抗体重链可变区。在进一步的实施方式中，该药物组合物进一步包含第二药剂，诸如缓解疾病的抗风湿病药或抗炎药。
本发明提供了对于治疗人的由钙粘着蛋白-11介导的炎症和其它状况具有改善的疗效的新药剂和疗法。
附图简要说明
本专利或申请文件包含至少一个彩绘附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将根据请求并支付必要的费用后由专利局提供。
图1A是示出了使用抗Cad-11抗体23C6、13C2以及27F3来检测钙粘着蛋白-11-EC1-5-Fc融合蛋白(见实心箭头)的蛋白质印迹。这些抗体并不识别也存在于该膜上的钙粘着蛋白-11-EC1-Fc以及钙粘着蛋白-11-EC1/2-Fc融合蛋白(关于印迹上钙粘着蛋白-11-EC1-Fc和钙粘着蛋白-11-EC1/2-Fc蛋白的位置见空心箭头)。
图1B是描绘了如通过ELISA测定的，公开的钙粘着蛋白-11抗体13C2、23C6以及5F82与人Cad-11-EC1-5-Fc融合蛋白的结合，而不与Cad-11-EC1-Fc融合蛋白结合的图。相比之下，EC1抗体H1M1与Cad-11-EC1-Fc融合蛋白以及Cad-11-EC1-5-Fc融合蛋白两者都结合。
图2是参与钙粘着蛋白结合的人Cad-11(SEQ ID NO：3)、MN-Cad(SEQ ID NO：4)以及Cad-8(SEQ ID NO：5)的EC1结构域的前34个氨基酸的氨基酸序列比对。包含延伸至钙粘着蛋白反受体的口袋中的残基的供体序列通过在序列的左侧一半加下划线来表示，并且该口袋序列的残基通过在SEQ ID NO：3中的序列的右侧一半加下划线来表示。
图3是描绘了如通过ELISA所测定的，钙粘着蛋白-11结合Fab与人Cad-11 EC1结构域肽以及Cad-11-EC1-Fc融合蛋白结合，但不与Cad-8或MN-Cad EC1结构域肽结合的图。克隆7证明了与Cad-11 EC1结构域肽以及融合蛋白的明显结合，而不与MN-Cad或Cad-8 EC1结构域肽结合。
图4是描绘来自体外Cad-11细胞聚集分析的数据的图。加入到培养基中的Cad-11拮抗剂，例如由抗Cad-11抗体13C2制备的Fab，或不同浓度的针对钙粘着蛋白-11的EC1结构域的前35个氨基酸的抗钙粘着蛋白-11 EC1 Fab(标示为EC1 Fab克隆7)，阻止了Cad-11介导的431-D-11细胞的聚集。抗钙粘着蛋白-11 EC1 Fab(克隆7)在从0.3μg/ml至10μg/ml范围内的所有测试浓度下抑制了A-431-D-11表皮样癌细胞的聚集。相比之下，由13C2抗钙粘着蛋白-11抗体制备的Fab仅在10μg/ml的浓度下抑制细胞聚集。
图5是描绘来自第二体外Cad-11细胞聚集分析的数据的图。431-D-11细胞的聚集在加入SME培养基(标示为对照)、不同浓度的含有与人IgG2铰链域、CH2和CH3结构域融合的Cad-11的EC1结构域的融合蛋白(标示为Cad-11-EC1-Fc)、不同浓度的针对钙粘着蛋白-11的EC1结构域的前35个氨基酸的抗钙粘着蛋白-11 EC1 Fab(标示为Cad-11 EC1 Fab)或不同浓度的对照抗绿色荧光蛋白(抗-GFP)Fab(标示为GFP fAb)之后40分钟显示。抗钙粘着蛋白-11 EC1 Fab(克隆7)在3μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的浓度下抑制表达Cad-11的431-D-11细胞的聚集。EC1-Fc融合蛋白在3μg/ml的浓度下抑制431-D-11细胞的聚集。相比之下，抗-GFP Fab在任何测试浓度下都没有显著地抑制细胞聚集。
图6是描绘使用体外细胞聚集试验，各种抗钙粘着蛋白-11 EC1 Fab对Cad-11介导的细胞聚集的抑制的图，这些抗钙粘着蛋白-11 EC1 Fab对单独的Cad-11(EC1 fAb克隆7和克隆4)、Cad-11和Cad-8(EC1 fAb克隆6)或者Cad-11和MN-Cad(EC1 fAb克隆5)具有结合特异性。相对于对照(D-11 SME；左柱)，所测试的所有Fab均抑制431-D-11细胞的聚集。
图7是描绘使用体外细胞聚集试验，抗-Cad-11 Fab对Cad-11介导的细胞聚集的抑制的图，这些抗-Cad-11 Fab对单独的Cad-11(EC1 fAb克隆7)或Cad-11和MN-Cad(EC1 fAb克隆8)具有结合特异性。所测试的Fab的特异性在各Fab名称旁边的括号中示出。相对于GFP特异性的对照Fab(左柱)，这两种钙粘着蛋白特异性Fab均抑制细胞聚集(中间柱和右柱)。
图8示出了人Cad-11-EC1-hIgG2-Fc1融合蛋白(Cad-11-EC1-Fc)的核苷酸(DNA)序列(SEQ ID NO：6)。这种人钙粘着蛋白-11胞外域的序列以斜体示出，BglII位点加下划线，并且编码人IgG2-Fc1区的序列以黑体字母示出。
图9示出了人Cad-11-EC1-hIgG2-Fc1融合蛋白(Cad-11-EC1-Fc)的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。人钙粘着蛋白-11胞外域的序列以斜体示出，由BglII位点编码的序列加下划线，并且人IgG2-Fc1区的序列以黑体字母示出。
图10是已经用考马斯蓝染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶的图像，其示出了在使用蛋白A柱从细胞培养基纯化后，分别对应于纯化的Cad-11-EC1-hIgG2-Fc1(中间泳道)以及Cad-11-EC1/2-hIgG2-Fc1(右侧泳道)融合蛋白的单体形式的显著强条带。分子量标准在左侧泳道中示出。
图11是示出了使用与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗人IgG抗体来检测人Cad-11-EC1-hIgG2-Fc1(中间泳道)以及Cad-11-EC1/2-hIgG2-Fc1(右侧泳道)融合蛋白的蛋白质印迹。在各个泳道中所观察到的显著条带对应于融合蛋白的单体形式的位置。由于不完全的还原条件，融合蛋白的二聚体形式的位置也是可见的(见较低强度的更高分子量的条带)。分子量标准在左侧泳道中示出。
图12是描绘与未经处理的细胞相比Cadd-11-EC1-Fc融合蛋白以及小鼠抗-Cad-11抗体13C2在所示浓度下抑制表达Cad-11的人成纤维细胞样滑膜细胞向基质胶小室(matrigel plug)内的侵入(标记为侵入)的图。数据从两个独立实验合并。
图13A和B是描绘来自两个体外Cad-11细胞聚集试验的数据的图。表达Cad-11的431-D-11细胞的聚集百分比在加入SME培养基(标示为对照)或Cad-11融合蛋白之后的40分钟显示。图13A示出了在不同浓度的包含与人IgG 2铰链域、CH2和CH3结构域融合的Cad-11的5个胞外域的融合蛋白(标示为Cad-11-EC1-5-Fc)的存在下对聚集的抑制。图13B示出了不同浓度的包含与人IgG2铰链域、CH2和CH3结构域融合的Cad-11的N末端胞外域(EC1结构域)的融合蛋白(标示为Cad-11-EC1-Fc)或Cad-11-EC1-5-Fc的聚集抑制。
图14A-C示出了人钙粘着蛋白-11 cDNA序列(SEQ ID NO：1；见Genbank登录号NM001797)。
图15示出了人钙粘着蛋白-11蛋白质序列(SEQ ID NO：2；见Genbank登录号NP001788)。
图16是显示了如通过ELISA所测定的，在来自肽4杂交瘤(HL)的培养基或对照杂交瘤培养基(培养基)中的抗体与包含Cad-11、Cad-8或MN-Cad的EC1-2结构域的蛋白质的结合水平的曲线图。
图17 A-C是描绘细胞染色强度(MFI；平均荧光强度)的代表性图，以该细胞染色强度作为H14抗体与表达Cad-11的431-D-11细胞的结合的量度。
图17 D-F是描绘相对于图17A-C缺乏431-D细胞染色(MFI；平均荧光强度)的代表性图，其表明不存在H14抗体与Cad-11阴性细胞结合。
图17 G-I是描绘细胞染色强度(MFI；平均荧光强度)的代表性图，以该细胞染色强度作为H1M1抗体与表达Cad-11的431-D-11细胞的结合的量度。
图18A是描绘如按照细胞染色强度(MFI；平均荧光强度)所测量的，在不同抗体浓度下，H14抗体与表达Cad-11的细胞结合以及不存在H14与Cad-11阴性对照细胞的结合的图。
图18B是显示了根据细胞染色强度(MFI；平均荧光强度)所测量的，在不同抗体浓度下，H1M1抗体与表达Cad-11的细胞结合以及不存在H1M1与Cad-11阴性对照细胞的结合的曲线图。
图19A是显示了如通过ELISA所测定的，在不同的抗体浓度下，H14抗Cad-11抗体与Cad-11和Cad-8EC1结构域肽的结合程度的曲线图。
图19B是显示了如通过ELISA所测定的，在不同的抗体浓度下，不存在H14抗Cad-11抗体与Cad7、MN Cad、Cad9、Cad18、Cad20或Cad24 EC1结构域肽的结合的曲线图。
图20是显示了如通过ELISA所测定的，在不同的抗体浓度下，H1M1抗Cad-11抗体与Cad-11、Cad-8、Cad-7、MN-Cad、Cad-9、Cad-18、Cad-20和Cad-24 EC1结构域肽的结合的曲线图。
图21A是描绘如通过ELISA所测定的，H1M1抗Cad-11抗体与各种Cad-11 EC1结构域肽免疫原(PEP1、PEP2、PEP3和PEP4)以及Cad-11 EC1结构域融合蛋白(EFL)和人IgG对照(Fc段)的结合程度的图。
图21B是描绘如通过ELISA所测定的，H14抗Cad-11抗体与各种Cad-11 EC1结构域肽免疫原(PEP1、PEP2、PEP3和PEP4)以及Cad-11 EC1结构域融合蛋白(EFL)和人IgG对照(Fc段)的结合程度的图。
图22是显示人钙粘着蛋白-11的EC1结构域的前37个氨基酸的序列以及由肽1-4的各肽所包含的该序列的部分的示意图。位于肽3上游的肽2和肽4共有的氨基酸残基在加框区中突出显示。直接参与Cad-11与Cad-11结合的氨基酸加下划线。
图23A是示出了用对照同种型抗体处理的聚集的表达Cad-11的细胞的大团块的照片。
图23B是示出了H1M1处理的表达Cad-11的细胞的小细胞团的照片，这些小细胞团不进一步形成图23A中所观察到的大团块。
图23C是示出了未经处理的亲本Cad-11阴性细胞保持为单一或双重细胞的组的照片。
图24A是示出了具有聚集细胞的大团块的Cad-11表达细胞的培养物的照片。
图24B是示出了在用H14Cad-11 EC1结构域抗体处理之后表达Cad-11的细胞的培养物的照片，相对于图24A中所示，该培养物主要具有单细胞，具有小而稀少的细胞簇。
图25是显示了相对于未经处理的对照小鼠，在用剂量逐渐增加的H1M1抗Cad-11抗体处理的小鼠中抑制与关节炎相关的关节肿胀的曲线图。
图26是显示了相对于未经处理的对照小鼠，在每隔一天用0.3mg的H14或H1M1抗Cad-11抗体处理的小鼠中抑制与关节炎相关的关节肿胀的的曲线图。
图27是示出了与未经处理的对照相比，在小鼠模型中用0.3mg的H1M1或H14抗体进行处理延迟了关节炎的发展的曲线图。
图28是显示了来自肽3杂交瘤(HL)的包含抗体的培养基或对照杂交瘤培养基(培养基)与Cad-11、Cad-8和MN-钙粘着蛋白的EC1-2结构域或Cad-11 EC1-Fc融合蛋白的结合程度的曲线图。
图29是显示了来自肽3杂交瘤的抗Cad-11抗体与表达人Cad-11蛋白质的细胞(见箭头)以及表达Neos的非Cad-11表达的对照细胞的结合程度的曲线图。图30A是描绘与培养基一起孵育的成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)的照片。细胞聚集物和通过细胞突关联的细胞是可见的。
图30B是描绘与30μg/mL的对照抗体一起孵育的FLS的照片。细胞聚集物和通过细胞突关联的细胞是可见的。
图30C是描绘与30μg/mL H1M1抗体一起孵育的FLS的照片。可见到少量细胞聚集物和细胞突。
图31是显示了相对于包括结合在EC1区外的其他Cad-11抗体在内的对照，在与H1M1抗体接触后，对FLS向基质胶包被的膜内侵入的抑制的曲线图。
图32是显示了相对于对照，在施用H1M1抗体后，KBN小鼠关节炎模型中关节肿胀的抑制的曲线图。
图33描绘了H1M1可变重链核苷酸序列和推断的氨基酸序列。CDR定义和蛋白质序列编号依据Kabat。CDR核苷酸序列和蛋白质序列以灰色示出。
图34描绘了H1M1可变轻链核苷酸序列和推断的氨基酸序列。CDR定义和蛋白质序列编号依据Kabat。CDR核苷酸序列和蛋白质序列以灰色示出。
图35A-H描绘了在H1M1/SYN0012人源化抗Cad-11抗体变体的设计中使用的5条VH链(A-E)(SEQ ID No：60-69)和3条Vκ链(F-H)(SEQ ID No：70-75)的核苷酸序列和氨基酸序列。CDR定义和蛋白质序列编号依据Kabat。CDR核苷酸序列和蛋白质序列以红色突出显示。
图36是说明pANTVK和pANTVhG4载体的载体图谱。pANTVK和pANTVhG4载体都包含整合了内含子和聚A序列的基因组DNA片段。这两个链的表达都由CMV启动子驱动。重链载体上的DHFR小基因用于选择。
图37描绘了蛋白A纯化的抗体的考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶。(a)嵌合抗Cad-11EC1 IgG4(SYN0014)；(b)人源化抗Cad-11抗体变体(SDP011-SDP151)。大小标志物是预染色的蛋白质标准Fermentas PageRuler(目录号SM1811)。注：SDP111未电泳。
图38A-C是描绘抗Cad-11竞争性ELISA的结果的图。相对于固定浓度的生物素化鼠SYN0012抗体，测试人源化抗Cad-11 EC1抗体(SDP011至SDP151)的稀释系列与重组人Cad-11融合蛋白的结合。生物素化的抗体的结合随着测试抗体和对照抗体的量的增加而减少。A：SDP011至SDP051：B：SDP061至SDP101：C：SDP111至SDP151。
图39A-O是显示了在钙粘着蛋白交叉反应性试验中用包含Cad-11肽免疫原(各曲线中的红线)和来自钙粘着蛋白7、8、9、11、18、20和24的相应同源序列的肽滴定人源化抗Cad-11抗体的曲线图。肽涂覆浓度为500ng/mL。A：SDP011；B：SDP021；C：SDP031；D：SDP041；E：SDP051；F：SDP061；G：SDP071；H：SDP081；I：SDP091；J：SDP101；K：SDP111；L：SDP121；M：SDP131；N：SDP141和O：SDP151。
图40A-D描绘了人源化抗Cad-11抗体(A)SDP031(SEQ ID No：71，65)、(B)SDP051(SEQ ID No：71，69)、(C)SDP061(SEQ ID No：73，61)、(D)SDP071(SEQ ID No：73，63)的轻链和重链可变区结构域的氨基酸序列。
图41A是显示了在钙粘着蛋白交叉反应性试验中用包含Cad-11肽免疫原(红线)或来自钙粘着蛋白7、8、9、11、18、20和24的相应同源序列的肽滴定SDP051的曲线图。肽涂覆浓度为500ng/ml。
图41B是显示了在钙粘着蛋白交叉反应性试验中用包含Cad-11肽免疫原(红线)或来自钙粘着蛋白8和18的相应同源序列的肽滴定SDP051的曲线图。肽涂覆浓度为50ng/ml。
图42是SDP051与重组人Cad-11(rhCad-11)结合的传感图(sensogram plot)。
图43是显示了如通过FACS(平均荧光强度(MFI))测得的，人源化抗Cad-11 EC1抗体SDP051和SDP071与表达Cad-11的431D-11细胞的抗体浓度依赖性结合的曲线图。还显示出不存在与非Cad-11表达的431D细胞的结合。
图44A-C是描绘使用一种测量相对于包含相关的Cad-20或Cad-24(图44A)、Cad-7或Cad-18(图44B)或者Cad-8或Cad-9(图44C)抗原的肽，包含Cad-11抗原的肽对如通过FACS(平均荧光强度(MFI))所测定的SDP051抗体结合表达Cad-11的细胞的能力的影响的分析而获得的SDP051抗体对Cad-11的特异性的图。
图45A和图45B是描绘使用来自25个供体的PBMC通过免疫原性时间进程T细胞分析所测定的，(A)鼠/人嵌合抗Cad-11 EC1抗体SYN0014和(B)人源化抗Cad-11 EC1抗体SDP051的免疫原性的图。将各个一式三份的样品的结果进行平均，并通过转换为刺激指数(SI)进行标准化。示出了各个供体在各个时间点的SI。用于确定SI≥2.0的阳性反应的临界值用红线突出显示，且标示了显著性反应(在student t检验中p＜0.05)(*)。
图46是示出与3μg/ml剂量的同种型对照抗体(AC1-P)相比，0.3μg/ml剂量的SDP-051抑制50％的FLS侵入的图。
图47是示出与3μg/ml剂量的同种型对照抗体(AC1-P)相比，0.3μg/ml剂量的SDP-051抑制MMP表达的图。
图48是说明相对于用AC1-P对照抗体处理的小鼠，在SDP051处理的小鼠中关节肿胀减轻47％的图。
图49是描绘对小鼠(KBN关节炎模型)施用后SDP051抗体的血清水平的图。
图50是描绘相对于用AC3-11P对照抗体处理的小鼠，用不同剂量的SDP051抗体处理的小鼠中踝最小厚度(ankle thickness)的变化的图(鼠KBN关节炎模型；KBN024研究)。
具体实施方式
定义
如本文所用的术语“钙粘着蛋白-11”、“Cad-11”以及“OB-钙粘着蛋白”是指天然存在的或内源性的钙粘着蛋白-11(例如，哺乳动物，例如人类)蛋白质，以及与天然存在的或内源性的钙粘着蛋白-11蛋白质具有相同的氨基酸序列的蛋白质(例如，重组蛋白、合成蛋白质)。因此，在本文中可互换使用的术语“钙粘着蛋白-11”、“Cad-11”以及“OB-钙粘着蛋白”包括通过例如在哺乳动物(例如人类、非人灵长类)中自然发生的可变剪接或其他细胞过程所产生的钙粘着蛋白-11蛋白质(例如，哺乳动物、人类)的多态性变体或等位基因变体以及其他同种型。优选地，钙粘着蛋白-11蛋白质是具有SEQ ID NO：2(见Genbank登录号NP001788和图15)的氨基酸序列的人类蛋白质。
如本文所定义的“钙粘着蛋白-11拮抗剂”是特异性结合钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域并抑制(例如，降低、阻止)细胞中一种或多种钙粘着蛋白-11-介导的活性的试剂(例如，抗体、融合蛋白、肽、拟肽、小分子、核酸)。钙粘着蛋白-11-介导的活性包括但不限于：钙粘着蛋白-11蛋白质以同型方式与一个或多个另外的钙粘着蛋白-11蛋白质的结合、表达钙粘着蛋白-11的细胞的聚集、酶(例如，胶原酶、丝氨酸蛋白酶、MMP1、MMP3、MMP13)的表达或活性的诱导以及细胞因子(例如，炎性细胞因子)或生长因子(例如，IL-6、IL-8或RANKL或TRANCE)的诱导、表达钙粘着蛋白-11的细胞的迁移以及表达钙粘着蛋白-11的细胞对软骨的破坏。在一个实施方式中，钙粘着蛋白-11拮抗剂可以通过，例如，阻断Cad-11蛋白质(例如，在细胞的表面上表达的Cad-11蛋白质)的EC1结构域中的供体序列与一个或多个其他Cad-11蛋白质(例如，在另一细胞的表面上表达的一个或多个Cad-11蛋白质)的EC1结构域中的口袋序列之间的相互作用来抑制钙粘着蛋白-11蛋白质与一个或多个另外的钙粘着蛋白-11蛋白质的结合。
如本文所用的，“特异性结合”钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域的钙粘着蛋白-11拮抗剂是指结合(例如，在生理条件下)钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域的亲和力(例如，结合亲和力)比该钙粘着蛋白-11拮抗剂结合另一种钙粘着蛋白蛋白质(例如，MN-钙粘着蛋白、钙粘着蛋白-8)的EC1结构域的亲和力大至少约5倍、优选地至少约10倍的钙粘着蛋白-11拮抗剂。在具体实施方式中，特异性结合钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域的钙粘着蛋白-11拮抗剂与存在于SEQ ID NO：3(人钙粘着蛋白-11的EC1结构域的N端部分)中的表位结合，其亲和力比该钙粘着蛋白-11拮抗剂与存在于SEQ ID NO：4(人MN钙粘着蛋白的EC1结构域的N端部分)中的表位结合的亲和力以及该钙粘着蛋白-11拮抗剂与存在于SEQ ID NO：5(人钙粘着蛋白-8的EC1结构域的N端部分)中的表位结合的亲和力大至少约5倍、优选地至少约10倍。
如本文所用的术语“抗体”旨在涵盖完整抗体以及抗体片段(例如，抗体的抗原结合片段，例如Fv、Fc、Fd、Fab、Fab′、F(ab′)以及dAb片段)。“抗体”是指多克隆抗体和单克隆抗体，并且包括自然生成的以及工程化的抗体。因此，术语“抗体”包括例如：人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、灵长类源化的(primatized)抗体、镶饰的(veneered)抗体、单链抗体以及结构域抗体(dAb)。(参见，例如Harlow等人，Antibodies A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1988)。
术语“表位”是指被免疫球蛋白VH/VL对常规地结合的结构单元。表位限定了针对抗体的最小结合位点，并因此代表抗体特异性的靶标。
术语“融合蛋白”是指自然生成的、合成的、半合成的或重组的单一蛋白质分子，该蛋白质分子包含两种或多种异源多肽的全部或一部分。
术语“多肽”是指氨基酸的聚合物，且不是指特定的长度；因此，肽、寡肽以及蛋白质均包括在多肽的定义中。
如本文所用的术语“肽”是指由大约2个至大约100个氨基酸残基组成的化合物，其中一个氨基酸的氨基通过肽键连接另一个氨基酸的羧基。这样的肽在长度上通常小于约100个氨基酸残基，并且优选地为约10个、约20个、约30个、约40个或约50个残基。
如本文所用的术语“拟肽”是指不是肽或蛋白质但模拟它们的结构的多个方面的分子。拟肽拮抗剂可通过常规的化学方法来制备(参见例如，Damewood J.R.“PeptideMimetic Design with the Aid of Computational Chemistry”Reviews inComputational Biology，2007，第九卷，1-80页，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1996；Kazmierski W.K.，“Methods of Molecular Medicine：PeptidomimeticProtocols，”Humana Press，New Jersey，1999)。
如本文所定义的“疗法”是指对受试者(例如，哺乳动物、人)施用特定的治疗性或预防性试剂，这产生对于受试者而言期望的治疗或预防益处。
如本文所定义的“治疗方案”是指其中将一种或多种治疗性或预防性试剂以特定剂量(例如，水平、用量、数量)并且按特定的时间表或以特定的间隔(例如，数分钟、数天、数周、数月)施用给哺乳动物受试者的方案。
如本文所定义的“治疗有效量”是指在施用条件下足以达到期望的治疗或预防效果的量，诸如但不限于，足以抑制(即降低、预防)关节中的炎症(例如，通过抑制表达钙粘着蛋白-11的细胞如滑膜细胞的聚集)或肿瘤的形成、生长或转移的量。疗法的效力(例如，关节中炎症的降低和/或关节中炎症的预防)可以通过合适的方法(例如，成像方法，如MRI、NMR、CT)来确定。
钙粘着蛋白
钙粘着蛋白属于Ca2+依赖性粘附分子的大家族，其通过以同型的方式与另外的钙粘着蛋白结合来介导细胞粘附(MJ Wheelock和KR Johnson，Ann.Rev.Cell Dev.Biol.19：207-235(2003))。典型的钙粘着蛋白是单跨膜蛋白质，其含有五个细胞外钙粘着蛋白(EC)结构域(各个结构域的长度大约为110个氨基酸)、一个跨膜区以及一个保守的胞质结构域。基于在EC结构域之间的同源性程度而将钙粘着蛋白分成I型或II型钙粘着蛋白。II型钙粘着蛋白包括人钙粘着蛋白-5、-6、-8、-11和-12及MN-钙粘着蛋白。各个胞外域在介导细胞间结合中的作用的相对重要性并不清楚。
滑膜细胞中钙粘着蛋白-11的活性
钙粘着蛋白-11介导在接合的关节的滑液内衬中滑膜细胞与滑膜细胞的结合(Valencia等人，J.Exp.Med.200(12)：1673-1679(2004)；Kiener和Brenner，Arthritis ResTher.7(2)：49-54(2005))。包含与人IgG2的铰链-CH2-CH3结构域融合的人钙粘着蛋白-11的所有五个细胞外钙粘着蛋白结构域的融合蛋白在体外抑制滑膜细胞内衬的形成(Kiener等人，Am.J.Pathol.168(2006))。另外，拮抗性的抗钙粘着蛋白-11抗体以及包含与鼠IgG2a的铰链-CH2-CH3结构域融合的鼠钙粘着蛋白-11的EC1-5的融合蛋白在类风湿关节炎的鼠模型中抑制炎症和关节肿胀(Lee等人，Science 315：1006-1010(2007))。
钙粘着蛋白-11拮抗剂
本发明的钙粘着蛋白-11拮抗剂可以是特异性结合钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域并抑制(例如，降低、阻止)细胞中一种或多种钙粘着蛋白-11-介导的活性的任何试剂。钙粘着蛋白-11-介导的活性包括但不限于：在细胞表面上表达钙粘着蛋白-11的细胞的聚集以及诸如胶原酶、丝氨酸蛋白酶、MMP1、MMP3、IL-6、IL-8或RANKL/TRANCE的因子的表达或分泌。该试剂尤其可以是抗体、融合蛋白、肽、拟肽、小分子或核酸。
钙粘着蛋白-11抗体
如本文所述，与包含供体序列和Cad-11的钙粘着蛋白结合口袋的人钙粘着蛋白-11 EC1结构域的N端部分(例如SEQ ID NO：3)内的表位相结合的抗体比与该蛋白质的其他区域中的表位相结合的抗体更有效地在体外阻断钙粘着蛋白-11的活性(参见实施例1和2)。
因此，在一个实施方式中，本发明提供与存在于钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域的N端部分中的表位相结合(例如，特异性结合)的抗体或其抗原结合片段，该N端部分包含供体序列和Cad-11的钙粘着蛋白结合口袋。术语“抗体”旨在涵盖所有类型的多克隆抗体和单克隆抗体(例如，人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、灵长类源化的抗体、镶饰的抗体、单链抗体、结构域抗体(dAb))以及抗体的抗原结合片段(例如Fv、Fc、Fd、Fab、Fab′、F(ab′)、dAb)。(参见，例如Harlow等人，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。在具体的实施方式中，Cad-11 EC1结构域特异性抗体是人抗体或人源化抗体。Cad-11 EC1结构域特异性抗体还可直接或间接地连接细胞毒性剂。
其他特异性结合Cad-11蛋白质的EC1结构域的N末端部分并且抑制该Cad-11蛋白质的活性的抗体或抗体片段还可以通过常规方法或其他合适的技术来产生、构建、工程化和/或分离。例如，可针对适当的免疫原，例如重组哺乳动物(例如，人)钙粘着蛋白-11 EC1结构域肽(例如SEQ ID NO：3)或其一部分(包括合成分子，例如合成肽)产生对于钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域为特异性的抗体。已经描述了多种方法(参见，例如Kohler等人，Nature，256：495-497(1975)和Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；Milstein等人，Nature266：550-552(1977)；Koprowski等人，美国专利号4,172,124；Harlow，E.和D.Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY)；Current Protocols In Molecular Biology，第2卷(增刊27，94年夏季)，Ausubel，F.M.等人编著，(John Wiley&Sons：New York，NY)，第11章，(1991))。还可以通过用表达钙粘着蛋白-11的EC1结构域的细胞(例如，癌细胞/细胞系)或经工程化以表达钙粘着蛋白-11的EC1结构域的细胞(例如，转染的细胞)免疫合适的宿主(例如，小鼠)来产生抗体。(参见，例如Chuntharapai等人，J.Immunol.，152：1783-1789(1994)；Chuntharapai等人，美国专利号5,440,021)。为了产生单克隆抗体，可以通过将合适的永生细胞系(例如，骨髓瘤细胞系，如SP2/0或P3X63Ag8.653)与产生抗体的细胞进行融合来产生杂交瘤。可以从用感兴趣的抗原免疫的人或其他合适的动物的外周血或优选地脾或淋巴结获得这些产生抗体的细胞。融合的细胞(杂交瘤)可以使用选择性培养条件来分离，并且通过有限稀释进行克隆。可以通过合适的分析方法(例如，ELISA)来选择产生具有期望的特异性的抗体的细胞。
抗体片段可以通过酶切割或通过重组技术而产生。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割可以分别产生Fab或F(ab′)2片段。其他具有必要的底物特异性的蛋白酶也可以用于产生Fab或F(ab′)2片段。还可以使用抗体基因产生多种截短形式的抗体，在该抗体基因中将一个或多个终止密码子引入自然终止位点的上游。例如，可将编码F(ab′)2重链部分的嵌合基因设计成包括编码该重链的CH1结构域和铰链区的DNA序列。本发明和术语“抗体”也涵盖单链抗体及人的、嵌合的、人源化的或灵长类源化的(CDR移植的)或镶饰的抗体，以及嵌合的、CDR移植的或镶饰的单链抗体(包含来源于不同物种的部分)等。这些抗体的各个不同部分可通过常规技术化学地接合在一起，或可以使用基因工程技术作为连续的蛋白质制备。例如，可表达编码嵌合链或人源化链的核酸以产生连续的蛋白质。(参见，例如Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利号0,125,023 B1；Boss等人，美国专利号4,816,397；Boss等人，欧洲专利号0,120,694 B1；Neuberger，M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等人，欧洲专利号0,194,276 B1；Winter，美国专利号5,225,539；Winter，欧洲专利号0,239,400 B1；Queen等人，欧洲专利号0 451 216 B1；以及Padlan，E.A.等人，EP 0 519 596 A1。关于灵长类源化的抗体还可参见Newman，R.等人，BioTechnology，10：1455-1460(1992)，且关于单链抗体还可参见Ladner等人，美国专利号4,946,778和Bird，R.E.等人，Science，242：423-426(1988))。
人源化抗体可以利用标准方法或其他合适的技术使用合成或重组DNA技术来产生。编码人源化可变区的核酸(例如cDNA)序列还可以使用PCR诱变方法进行构建，以改变编码人或人源化链的DNA序列，例如来自先前人源化的可变区的DNA模板(参见，例如Kamman，M.等人，Nucl.Acids Res.，17：5404(1989))；Sato，K.等人，Cancer Research，53：851-856(1993)；Daugherty，B.L.等人，Nucleic Acids Res.，19(9)：2471-2476(1991)；以及Lewis，A.P.和J.S.Crowe，Gene，101：297-302(1991))。使用这些或其他合适的方法，也可以容易地产生变体。在一个实施方式中，可以对克隆的可变区(例如dAb)进行突变，并且可以选择编码具有期望的特异性的变体的序列(例如，从噬菌体文库；参见，例如Krebber等人，U.S.5,514,548；Hoogenboom等人，WO 93/06213，于1993年4月1日公布)。
可以使用产生或分离具有必需特异性的抗体的其他合适的方法，包括例如从文库(例如，噬菌体展示文库)选择重组抗体或抗体结合片段(例如，dAb)的方法，或依赖于对转基因动物(例如，小鼠)进行免疫的方法。能够产生人抗体的所有种类的转基因动物是本领域公知的(例如，(Abgenix，Fremont，CA))，并可以使用合适的方法产生(参见，例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-2555(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Lonberg等人，美国专利号5,545,806；Surani等人，美国专利号5,545,807；Lonberg等人，WO 97/13852)。
在一个实施方式中，本发明包括与存在于人Cad-11的EC1结构域的约前37个氨基酸(SEQ ID NO：13)中的表位相结合的Cad-11抗体。在特定实施方式中，本发明涉及与存在于SEQ ID NO：10中的表位相结合的Cad-11抗体。在进一步的实施方式中，本发明涉及与包含SEQ ID NO：11的表位相结合的Cad-11抗体。在另一个实施方式中，本发明涉及与存在于SEQ ID NO：12中的表位相结合的Cad-11抗体。
在一个实施方式中，本发明涉及由杂交瘤H1M1(ATCC专利保藏号PTA-9699)产生的Cad-11抗体，该杂交瘤H1M1已经于2009年1月8日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，Virginia 20108，美国。在另一个实施方式中，本发明提供了由杂交瘤H14(ATCC专利保藏号PTA-9701)产生的Cad-11抗体，该杂交瘤H14已经于2009年1月9日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，Virginia 20108，美国。
本发明还包括与由杂交瘤H1M1产生的Cad-11抗体和/或由杂交瘤H14产生的Cad-11抗体特异性地竞争结合人Cad-11蛋白质或其含EC1-结构域的部分(例如，SEQ ID NO：3、10、12、13)的抗体。在特定的实施方式中，与由杂交瘤H1M1和/或杂交瘤H14产生的Cad-11抗体特异性竞争的抗体阻断(例如，抑制、减少、防止)由杂交瘤H1M1和/或杂交瘤H14产生的Cad-11抗体与人Cad-11蛋白质或其含EC1-结构域的部分(例如，SEQ ID NO：3、10、12、13)的结合。
此外，本发明包括对人Cad-11蛋白质或其含EC1-结构域的部分(例如，SEQ ID NO：3、10、12、13)具有至少与由杂交瘤H1M1产生的Cad-11抗体和/或由杂交瘤H14产生的Cad-11抗体对人Cad-11蛋白质或其含EC1-结构域的部分的结合亲和力同样大的结合亲和力的抗体。
钙粘着蛋白-11融合蛋白
此外，仅含有人Cad-11的EC1结构域的免疫球蛋白融合蛋白(例如，与人IgG的一部分相融合的人Cad-11的EC1结构域)比包括Cad-11的EC区的较大部分(包含所有5个EC结构域)的融合蛋白更有效地在体外抑制Cad-11的活性。
钙粘着蛋白-11拮抗剂还包括嵌合的或融合的蛋白质，这些蛋白质包含与异源蛋白质的全部或一部分有效连接的人Cad-11的EC1结构域的至少约N-末端的35个氨基酸(SEQID NO：2)。“有效连接”表示Cad-11 EC1结构域的部分与该异源蛋白质同框地融合。该异源蛋白质可以与该蛋白质的N-末端或C-末端融合。例如，该融合蛋白可以是其中蛋白质序列与GST序列的C末端融合的GST融合蛋白。其他类型的融合蛋白包括但不限于酶性融合蛋白，例如β-半乳糖苷酶融合蛋白、酵母双杂化GAL融合蛋白、聚His融合体、FLAG-标记的融合蛋白、GFP融合蛋白以及免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。这种融合蛋白可以帮助纯化(例如，重组融合蛋白的纯化)。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，可以通过使用异源的信号序列来增加蛋白质的表达和/或分泌。因此，在另一个实施方式中，融合蛋白在其N末端包含异源的信号序列。
EP-A-O 464 533公开了包含免疫球蛋白恒定区的各个不同部分的融合蛋白。Fc可用于治疗和诊断，并因此产生，例如，改善的药代动力学性质(参见，例如EP-A 0232 262)。在药物发现中，例如，出于用来鉴别拮抗剂的高通量筛选分析的目的，已经将人蛋白质与Fc部分进行融合(Bennett等人，Journal of Molecular Recognition8：52-58(1995)；Johanson等人，J.Biol.Chem.，270(16)：9459-9471(1995))。因此，本发明还包括可溶的融合蛋白，其包含本发明的蛋白质Cad-11拮抗剂以及各个亚类(例如，IgG、IgM、IgA、IgE)的免疫球蛋白的重链和/或轻链恒定区的各个不同部分。本发明的免疫球蛋白融合蛋白的优点包括以下的一个或多个：(1)由于得到的二聚融合蛋白的二价性，增加了对多价配体的亲合力，(2)更长的血清半衰期，(3)经由Fc结构域激活效应细胞的能力，(4)易于纯化(例如，通过蛋白A色谱法)，(5)对Cad-11的亲和力以及(6)阻断Cad-11介导的活性的能力。
因此，在特定的实施方式中，Cad-11拮抗剂是包含与哺乳动物免疫球蛋白的全部或一部分有效连接的钙粘着蛋白-11蛋白质的细胞外区域的一部分的融合蛋白，该细胞外区域的部分包括EC1结构域的N-末端部分(SEQ ID NO：2的氨基酸54-90)。在特定的实施方式中，本发明的免疫球蛋白融合蛋白不包含钙粘着蛋白-11的细胞外区域的一部分，该细胞外区域的部分包括在SEQ ID NO：2的氨基酸1-609内所包含的所有5个EC结构域。在某些实施方式中，人钙粘着蛋白-11细胞外区域的部分可以包括例如SEQ ID NO：2的氨基酸1-160、氨基酸1-259或氨基酸1-269。在特定的实施方式中，融合蛋白缺乏人钙粘着蛋白-11的前导序列和原区域(pro-region)(SEQ ID NO：2的氨基酸1-53)，并且使用了异源前导序列。免疫球蛋白部分可以来自任何脊椎动物来源，如鼠，但优选地为人免疫球蛋白。在一个实施方式中，哺乳动物免疫球蛋白是人IgG2蛋白质或其部分，如人IgG2的铰链-CH2-CH3部分。
本发明的嵌合蛋白或融合蛋白可以通过标准的重组DNA技术产生。例如，编码不同的蛋白质序列(例如，Cad-11 EC1结构域肽和哺乳动物免疫球蛋白)的DNA片段按照常规技术同框地接合在一起。在另一个实施方式中，可以通过包括自动化DNA合成仪在内的常规技术合成融合基因。或者，可以使用在两个连续的核酸片段之间产生互补突出端的锚定引物进行核酸片段的PCR扩增，这些片段随后可以退火和再扩增以产生嵌合核酸序列(参见，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，1992)。此外，已经编码融合部分(例如，GST部分、Fc部分)的许多表达载体可以购买得到。可以将编码蛋白质Cad-11拮抗剂的核酸分子克隆到这种表达载体中，使得融合部分(例如，免疫球蛋白)与该蛋白质同地连接。
本发明的免疫球蛋白融合蛋白可以作为单体、二聚体、四聚体或其他多聚体(例如，聚合体)提供。例如，融合蛋白的免疫球蛋白部分的可变域可以通过例如以下方式连接在一起以形成多价配体：提供在各个V结构域的C末端的铰链区以及在该铰链区中的半胱氨酸之间的二硫键；或提供在该结构域的C末端的各具有半胱氨酸的重链，这些半胱氨酸由二硫键连接在一起；或产生V-CH和V-CL以产生Fab形式；或使用肽接头(例如，Gly4Ser接头)以产生二聚体、三聚体以及进一步的多聚体。例如，可将这样的配体连接至包含CH2和CH3结构域中的一个或两个且任选地含有铰链区的抗体Fc区。例如，作为连接至Fc区的单一核苷酸序列的编码配体的载体可以用于制备这类配体(例如，通过表达)。
本发明的免疫球蛋白融合蛋白可与包括但不限于聚乙二醇(PEG)或其衍生物的多聚体(例如，聚甲基乙二醇)、放射性核素、细胞毒性剂和药物的其他部分偶联，并且随后用于体内疗法。放射性核素的实例尤其包括212Bi、131I、186Re和90Y。放射性核素通过局部照射细胞来发挥它们的细胞毒性效应，从而导致各种不同的细胞内损害，正如放射治疗领域内所知的。可与融合蛋白偶联的细胞毒性药物包括但不限于，柔红霉素、多柔比星、氨甲蝶呤以及丝裂霉素C。细胞毒性药物干扰关键的细胞过程，包括DNA、RNA以及蛋白质合成。关于本领域已知的这些类别的药物及其作用机制的更加充分的阐述，参见Goodman，A.G.等人，Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第8版，Macmillan Publishing Col，1990，Katzung，编，Basic and Clinical Pharmacology，第5版，768-769页，808-809页，896页，Appleton and Lange，Norwalk，Conn。
如本文所用的术语“免疫球蛋白融合蛋白”包括本发明的免疫球蛋白融合蛋白的片段。这样的片段意图包含于本发明的范围内。例如，一旦分子被分离，它们就可以用蛋白酶进行切割以产生仍然能够结合人Cad-11的EC1结构域的片段。
肽拮抗剂
本发明的钙粘着蛋白-11拮抗剂还可以是与钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域结合的肽。该肽可以包含任何合适的L-氨基酸和/或D-氨基酸，例如常见的α-氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸)、非-α-氨基酸(例如，β-丙氨酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、肌氨酸、抑胃酶氨酸)以及不常见的氨基酸(例如，瓜氨酸、同型瓜氨酸、同型丝氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸)。肽上的氨基、羧基和/或其他官能团可以是游离的(例如，未修饰的)或用合适的保护基保护的。用于氨基和羧基的合适的保护基以及用于添加或去除保护基的方法在本领域内是已知的，并公开于，例如Green和Wuts，“Protecting Groups in OrganicSynthesis”，John Wiley and Sons，1991中。肽的官能团也可以使用本领域已知的方法进行衍生化(例如，烷基化)。
如果需要，Cad-11肽拮抗剂可以包含一种或多种修饰(例如，氨基酸接头、酰化、乙酰化、酰胺化、甲基化、末端修饰(例如，环化修饰))。肽还可以包含化学修饰(例如，N-甲基-α-氨基取代)。此外，肽拮抗剂可以是已知的和/或天然存在的肽的类似物，例如具有保守氨基酸残基置换的肽类似物。这些修饰可以改善肽的各种性质(例如，溶解度、结合)，包括其钙粘着蛋白-11拮抗剂活性。
作为肽类的Cad-11拮抗剂可以是线性的、分支的或环状的，例如具有包括几个酰胺键的杂原子环状结构的肽。在特定的实施方式中，肽为环肽。这些肽可以由本领域技术人员使用标准技术产生。例如，肽可以通过酶切或化学切割从天然蛋白质衍生或去除，或者可以通过适当的方法例如固相肽合成(例如，梅里菲尔德型合成(Merrifield-typesynthesis))进行合成(参见，例如Bodanszky等人“Peptide Synthesis”，John Wiley&Sons，第2版，1976))。作为钙粘着蛋白-11拮抗剂的肽还可以利用例如重组DNA方法或其他合适的方法产生(参见，例如Sambrook J.和Russell D.W.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，2001)。
肽可以合成并集合到包含少许至许多离散分子种类的文库中。这类文库可使用组合化学的方法来产生，并且可以使用任何合适的方法进行筛选以确定该文库是否包含具有期望的生物活性的肽。然后，可以使用合适的方法分离这类肽拮抗剂。
拟肽拮抗剂
钙粘着蛋白-11拮抗剂还可以是拟肽。例如，可以制备与肽具有相同的官能团的多糖。例如，可通过在其结合或将要结合靶分子的环境中建立肽试剂的三维结构来设计拟肽。拟肽包含至少两种组分：一个或多个结合部分以及骨架或支持结构。
结合部分是将与靶分子(例如，与Cad-11的EC1结构域中的氨基酸)进行反应或形成复合物(例如，通过疏水相互作用或离子相互作用)的化学原子或基团。例如，拟肽中的结合部分可以与肽或蛋白质拮抗剂中的结合部分相同。结合部分可以是以与肽拮抗剂中的结合部分相同或相似的方式与受体反应的原子或化学基团。例如，计算化学可用于设计钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域的供体序列的肽模拟物，例如其可以结合Cad-11蛋白质的EC1结构域中的口袋序列。适合用于针对肽中的碱性氨基酸设计拟肽的结合部分的实例包括含氮基团，如胺类、铵类、胍类以及酰胺类或磷鎓类。适合用于针对酸性氨基酸设计拟肽的结合部分的实例包括，例如羧基、低级烷基羧酸酯、磺酸、低级烷基磺酸酯或者亚磷酸或其酯。
支持结构是当与该一个或多个结合部分结合时提供该拟肽的三维构型的化学实体。支持结构可以是有机的或无机的。有机支持结构的实例包括多糖、有机合成聚合物的聚合体或寡聚体(如聚乙烯醇或聚交酯)。优选的是支持结构具有基本上与该肽骨架或支持结构相同的大小和轮廓。这可以通过计算或测量肽和拟肽的原子和键的大小而确定。在一个实施方式中，肽键的氮可以用氧或硫代替，例如形成聚酯骨架。在另一个实施方式中，羰基可以用磺酰基或亚磺酰基代替，从而形成聚酰胺(例如，聚磺酰胺)。可以制备该肽的反向酰胺(例如，用一个或多个-CONH-基团替代-NHCO-基团)。在又另一个实施方式中，肽骨架可以用聚硅烷骨架代替。
这些化合物可以通过已知的方法制备。例如，聚酯拟肽可以如下制备：用羟基取代氨基酸上对应的α-氨基从而制备羟酸，并顺序酯化该羟酸，任选地封闭碱性和酸性侧链以使副反应最小化。合适的化学合成路线的确定通常可在确定化学结构时容易地确认。
可以合成拟肽并且将其集合至包含少许至许多离散分子种类的文库中。这类文库可以使用公知的组合化学方法来产生，并可进行筛选以确定该文库是否包含一种或多种具有期望的活性的拟肽。然后，可以通过合适的方法分离这类拟肽拮抗剂。
小分子拮抗剂
钙粘着蛋白-11拮抗剂还可以是小分子。小分子的实例包括：有机化合物、有机金属化合物、无机化合物，以及有机、有机金属或无机化合物的盐。小分子中的原子通常通过共价键和/或离子键连接在一起。有机小分子中的原子的排列可以呈现为链(例如，碳-碳链或碳-杂原子链)，或者可以呈现为含有碳原子的环，例如苯或多环体系，或碳与杂原子的组合，即杂环，如嘧啶或喹唑啉。尽管小分子可以具有任意分子量，但它们通常包括小于约5,000道尔顿的分子。例如，这类小分子可以小于约1000道尔顿，并且优选地小于约750道尔顿，或更优选地小于约500道尔顿。小分子及其他非肽的钙粘着蛋白-11拮抗剂可以在自然界中找到(例如，鉴定、分离、纯化)和/或合成产生(例如，通过传统的有机合成、生物介导的合成或其组合)。参见，例如Ganesan，Drug Discov.Today 7(1)：47-55(2002年1月)；Lou，Drug Discov.Today，6(24)：1288-1294(2001年12月)。天然存在的小分子的实例包括但不限于，激素、神经递质、核苷酸、氨基酸、糖类、脂质以及它们的衍生物。
根据本发明的小分子钙粘着蛋白-11拮抗剂及其生理学上可接受的盐可以抑制钙粘着蛋白-11蛋白质的同型结合(例如，通过直接与Cad-11蛋白质的EC1结构域中的供体序列竞争结合另一钙粘着蛋白-11的结合口袋，通过直接与Cad-11蛋白质的EC1结构域中的结合口袋竞争结合另一钙粘着蛋白-11的供体序列)。
核酸拮抗剂
本发明的Cad-11拮抗剂还可以是与人钙粘着蛋白-11的EC1结构域结合的核酸分子(例如，寡核苷酸)。合适的核酸Cad-11拮抗剂包括适体，该适体能够通过经典Watson-Crick碱基配对以外的相互作用以高亲和力和特异性地与特定目标分子(例如，人钙粘着蛋白-11的EC1结构域)结合(Tuerk和Gold，Science 249：505(1990)；Ellington和Szostak，Nature 346：818(1990))。
适体，与通过噬菌体展示或单克隆抗体(MAb)所产生的肽一样，能够特异性地与选定的靶标结合，并且通过结合阻断它们的靶标发挥作用的能力。通过体外选择过程从随机序列寡核苷酸集合中产生，已经针对包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白以及受体在内的100多种蛋白质产生了适体。典型的适体大小为10-15kDa(30-45个核苷酸)，以亚纳摩尔的亲和力与其靶标结合，并区分密切相关的靶标(例如，通常不与来自相同基因家族的其他蛋白质结合)。一系列的结构研究已表明，适体能够利用在抗体-抗原复合体中驱动亲和力和特异性的相同类型的结合相互作用(氢键键合、静电互补性、疏水接触、空间排斥等等)。
可以使用在例如美国专利号5,475,096和美国专利号5,270,163中所述的被称为“指数富集的配体系统进化”(SELEX)的标准过程来产生和鉴定与目标靶标(例如，人Cad-11蛋白质的EC1结构域)相结合的适体。
钙粘着蛋白-11拮抗剂的鉴定
可以在化学化合物和/或文库(例如，化学物质、肽、核酸文库)的筛选，例如高通量筛选中来鉴定具有钙粘着蛋白-11结合特异性的试剂，包括小分子。
例如，可通过筛查可购买到的组合抗体文库(Dyax Corp.，MorphoSys AG)来鉴定特异性结合人钙粘着蛋白-11的EC1结构域的抗体。适合的组合抗体文库和筛查这些文库的标准方法描述于Hoet等人，Nature Biotechnology 23(3)：344-348(2005)以及Rauchenberger等人，J.Biol.Chem.278(40)：38194-38205(2003)中，其内容通过引用并入本文。这些文库或分子的集合也可以使用众所周知的化学方法进行制备。
或者，例如，可以通过用EC1蛋白质结构域或EC1肽连同佐剂一起免疫小鼠从而破坏对该抗原的耐受性来鉴定特异性结合人钙粘着蛋白-11的EC1结构域的鼠抗体。可以针对期望的特异性和活性筛选这些抗体，之后使用已知的技术进行人源化以产生用于治疗人类疾病的合适的试剂。
可以从众多可以获得的化学化合物文库中鉴定化合物或小分子，这些文库来自，例如国家癌症研究所的化学资源库(the Chemical Repository of the National CancerInstitute)和分子文库小分子资源库(PubChem)，以及哈佛大学化学和细胞生物学研究所的文库，以及其他可以从商业来源(例如Chembridge，Peakdale，CEREP，MayBridge，Bionet)获得的文库。这类文库或分子的集合也可以使用众所周知的化学方法(如众所周知的组合化学方法)进行制备。可以对文库进行筛查以鉴定结合和抑制钙粘着蛋白-11的化合物。
经鉴定的化合物可以用作先导化合物以便使用公知的药物化学方法来进一步多样化。例如，可以制备并针对钙粘着蛋白-11结合和/或抑制活性筛选作为先导物的结构变体的化合物的集合。这可以导致产生将化合物的结构与生物活性联系起来的构效关系。可开发具有合适的结合和抑制活性的化合物以用于进一步的体内应用。
可进一步评估结合钙粘着蛋白-11的试剂的钙粘着蛋白-11拮抗剂活性。例如，包含钙粘着蛋白-11蛋白质的组合物可用于筛选或结合试验中以检测和/或鉴定结合并拮抗钙粘着蛋白-11蛋白质的试剂。适合使用的组合物包括，例如天然表达钙粘着蛋白-11蛋白质的细胞(例如，滑膜细胞)、这些细胞的提取物以及重组钙粘着蛋白-11蛋白质。
结合钙粘着蛋白-11蛋白质的试剂可以在竞争性结合试验中鉴定，例如，其中评估测试试剂抑制钙粘着蛋白-11与参比试剂的结合的能力。该参比试剂可以是全长的Cad-11蛋白质或其包含EC1结构域的部分。该参比试剂可以用适当的标记物(例如，放射性同位素、表位标记、亲和性标记(例如，生物素和抗生物素蛋白或链霉亲和素)、自旋标记、酶、荧光基团、化学发光基团、染料、金属(例如金、银)、磁珠)进行标记，并且可以确定在该试验中使钙粘着蛋白-11蛋白质达到饱和所需的标记参比试剂的量。可以使用合适的对照(例如，未标记的试剂、单独的标记物)来确定在钙粘着蛋白-11蛋白质与测试试剂之间复合物形成的特异性。
测试试剂抑制参比试剂与钙粘着蛋白-11蛋白质之间复合物形成的能力可以确定为标记参比试剂的特异性结合的50％抑制所需要的测试试剂的浓度(IC50值)。特异性结合优选地定义为总结合(例如，在复合物中的总标记物)减去非特异性结合。非特异性结合优选地定义为在过量的未标记参比试剂存在下所形成的复合物中仍可检测出的标记物的量。适合使用于该方法中的参比试剂包括特异性结合钙粘着蛋白-11的分子和化合物，例如结合钙粘着蛋白-11的抗体。
拮抗钙粘着蛋白-11蛋白质的试剂可以通过筛选具有拮抗(降低、阻止、抑制)钙粘着蛋白-11的一种或多种活性(例如结合活性(例如，同型的Cad-11结合))的能力的试剂来鉴定。这些活性可以使用合适的体外或体内分析方法来评估。对于钙粘着蛋白-11活性的示例性分析方法先前已经有所描述(Patel，SD，等人，Cell 124：1255-1268(2006)；Lee等人，Science 315：1006-1010(2007))。
一旦鉴定了钙粘着蛋白-11拮抗剂，就可以例如使用设计用于测量与钙粘着蛋白-11相关的特定生物学功能或性质的基于细胞的分析来评估该钙粘着蛋白-11拮抗剂干扰(例如，降低、抑制、阴止)细胞中与钙粘着蛋白-11活性相关的一种或多种生物学功能或性质的能力。已知与钙粘着蛋白-11的表达和/或活性相关的生物学功能和性质包括但不限于，细胞粘附、细胞迁移、细胞侵袭、细胞分选、细胞凝聚(cell condensation)、细胞重排、组织完整性和结构的维持、细胞增殖的接触抑制以及癌(例如，肿瘤)细胞的恶性转化(Kiener和Brenner，Arthritis Res Ther.7(2)：49-54(2005))。此外，Cad-11拮抗剂在此证明为抑制滑膜细胞产生活性MMP。用于评估钙粘着蛋白的一种或多种生物学功能的合适的分析方法为本领域技术人员所知(参见，例如Patel，SD等人，Cell 124：_1255-1268(2006))，并且包括，例如本文所描述的细胞聚集试验(见示例，材料与方法部分)。
治疗方法
不希望受任何一种理论所束缚，据信同型钙粘着蛋白结合需要Cad-11的EC1结构域的大约前35个氨基酸(例如，约33至约37个氨基酸)，并且特异性结合Cad-11的该区域的试剂可以有效地抑制Cad-11分子之间的结合。因此，这些试剂可用于治疗和预防与细胞(例如，滑膜细胞)中Cad-11的表达或活性相关的病症(例如，炎性疾病、纤维化、癌症)。因此，本发明的一个方面涉及用于治疗哺乳动物受试者中钙粘着蛋白-11介导的病症的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的结合人钙粘着蛋白-11 EC1结构域肽(SEQ ID NO：3)的钙粘着蛋白-11拮抗剂。
如本文所用的，“钙粘着蛋白-11介导的病症”是指涉及表达钙粘着蛋白-11蛋白质的细胞或由该细胞介导的(例如，引起的)疾病、病症或状况。可通过本发明的方法治疗的钙粘着蛋白-11介导的病症包括但不限于，炎性疾病(例如，炎性关节病症)、纤维化病症(例如，皮肤纤维化、肺纤维化)以及癌症。
使用本发明的方法，可以通过施用一定量的本发明的钙粘着蛋白-11拮抗剂(例如，抗体、融合蛋白、小分子、核酸、肽、拟肽)来治疗哺乳动物(例如，人)的钙粘着蛋白-11介导的病症，该量足以通过例如抑制细胞的聚集、或抑制细胞的迁移、或抑制表达钙粘着蛋白-11的细胞(例如，滑膜细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞)表达活性蛋白酶或炎性分子而提供治疗益处。
因此，本发明的一个方面涉及用于治疗哺乳动物受试者的炎性疾病的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的本发明的钙粘着蛋白-11拮抗剂。炎性疾病通常以促炎性分子(例如，炎性细胞因子和生长因子)的表达以及免疫细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、浆细胞、白细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、T细胞)的激活为特征。炎性疾病包括，例如，炎性关节病症、炎性肠病(例如，克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、银屑病、皮炎(例如，湿疹)、肾淀粉样变性、肾小球肾炎、脉管炎、盆腔炎性疾病、慢性前列腺炎、Graves眼病。在特定的实施方式中，炎性疾病为自身免疫性疾病。
在特定的实施方式中，本发明涉及用于治疗哺乳动物受试者的炎性关节病症的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的本发明的钙粘着蛋白-11拮抗剂。炎性关节病症可以是与接合关节的细胞(例如，滑膜细胞)中钙粘着蛋白-11表达相关或以其为特征的任何病症。可以通过本发明治疗的炎性关节病症的实例包括但不限于，类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、莱特尔氏综合征、强直性脊柱炎、幼年型慢性关节炎、慢性莱姆病以及与系统性红斑狼疮相关的关节炎。在特定的实施方式中，炎性关节病症是类风湿性关节炎。
在另一个方面，本发明涉及一种用于治疗哺乳动物受试者的纤维化的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的本发明的钙粘着蛋白-11拮抗剂。如本文所用的术语“纤维化”是指作为修复性或反应性过程的器官或组织中过量纤维性结缔组织的形成或发生。纤维化的实例包括但不限于血管纤维化(例如，与肺动脉高压相关的血管纤维化)、肾纤维化、肝纤维化(例如，肝硬化)、皮肤/真皮纤维化(例如，硬皮病)、肺/肺部纤维化(例如，特发性肺纤维化)、骨髓纤维化、心内膜心肌纤维化、关节纤维化、间皮纤维化、眼纤维化、肠纤维化以及间质纤维化。在特定的实施方式中，纤维化是肺部或肺纤维化。在另一实施方式中，纤维化是真皮或皮肤纤维化。
不希望受任何特定理论所束缚，据信某些类型的肿瘤细胞表达钙粘着蛋白-11，钙粘着蛋白-11可以促进肿瘤转移。因此，本发明的Cad-11拮抗剂可用于抑制受试者中的肿瘤形成、生长和/或转移。因此，在另一个方面，本发明涉及用于治疗哺乳动物受试者的癌症(例如，以表达Cad-11的细胞为特征的癌症)的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的本发明的钙粘着蛋白-11拮抗剂。涉及到表达Cad-11蛋白质的细胞的癌症可包括，例如，白血病(例如，AML、CLL、幼淋巴细胞性白血病)、肺癌(例如，小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、食管癌、胃癌、结直肠癌、脑癌(例如，星形细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤)、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、上皮癌、鼻咽癌(例如，口或喉鳞状细胞癌)、淋巴瘤(例如，滤泡性淋巴瘤)、子宫癌(例如，恶性纤维性组织细胞瘤)、肝癌(例如，肝细胞癌)、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、肾癌、男性生殖细胞肿瘤、恶性间皮瘤、骨髓增生异常综合征、卵巢癌、胰腺癌或胆管癌、前列腺癌、甲状腺癌(例如，散发性滤泡性甲状腺肿瘤)以及尿路上皮癌。
在一个方面，治疗有效量的钙粘着蛋白-11拮抗剂施用给需要的患者。将施用的钙粘着蛋白-11拮抗剂的量(例如，治疗有效量)可以由临床医生根据本文提供的指导及本领域已知的其他方法来确定，并且取决于几种因素，包括例如选择的特定药剂、受试者的年龄、敏感性、对药物的耐受性以及总体健康状况。例如，对于作为抗体的Cad-11拮抗剂，合适的剂量可以是每次治疗约0.01mg/kg至约300mg/kg体重，并且优选地每次治疗约0.01mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg体重。对于小分子Cad-11拮抗剂，合适的剂量可以是每次治疗约0.001mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg体重。对于作为蛋白质或肽(线性、环状、模拟物)的钙粘着蛋白-11拮抗剂，合适的剂量将导致该肽的血浆浓度为约0.1μg/ml至约200μg/mL。确定对于特定的试剂、患者和癌症的剂量完全在本领域技术人员的能力之内。优选地，该剂量不引起或产生最小程度的不良副作用(例如，免疫原性反应、恶心、眩晕、胃部不适、高粘滞综合征、充血性心力衰竭、中风、肺水肿)。
治疗有效量的钙粘着蛋白-11拮抗剂可以单独施用或与一种或多种其他的治疗剂(例如，抗炎剂、化学治疗剂)联合施用。可与本发明的Cad-11拮抗剂联合施用的用于治疗炎性关节病症(特别是RA)的合适的抗炎剂包括但不限于：(i)非类固醇类抗炎药(NSAID；例如，detoprofen、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸(meclofenameate)、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮(nabumeone)、萘普生钠、奥沙普秦、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、塞来考昔、罗非考昔、阿司匹林、水杨酸胆碱、双水杨酸酯以及水杨酸钠和水杨酸镁)；(II)类固醇类(例如，可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙)；(iii)DMARD类，即缓解疾病的抗风湿病药物(例如，环孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、羟氯喹、柳氮磺吡啶、D-青霉胺、米诺环素和金)；或(iv)重组蛋白质(例如，(依那西普，一种可溶性的TNF受体)、(英夫利昔单抗，一种嵌合单克隆抗TNF抗体)、(阿巴西普(abatabacept)，一种可溶性的CTLA4受体)、(托珠单抗，一种针对IL-6受体的单克隆抗体)以及(利妥昔单抗，一种针对CD20的单克隆抗体)。
因此，钙粘着蛋白-11拮抗剂可以作为联合治疗(例如，与一种或多种其他治疗剂)的部分进行施用。Cad-11拮抗剂可以在一种或多种其他治疗剂之前、之后或与同时施用。在一些实施方式中，钙粘着蛋白-11拮抗剂和其他治疗剂可以作为单独的制剂或作为联合制剂同时地(例如，共同地)共施用。或者，这些药剂可以作为单独的组合物在由熟练的临床医生所确定的合适的时间范围(例如，足以允许该疗法的药效叠加的时间)内顺序施用。钙粘着蛋白-11拮抗剂和一种或多种其他治疗剂可以以单一剂量或以多剂量按照适于达到期望的治疗效果(例如，关节炎症的减轻和/或抑制)的顺序和时间表进行施用。合适的剂量以及给药方案可以由临床医生来确定，并取决于所选择的药剂、药物制剂和给药途径、各种患者因素以及其他考虑因素。
疗法的有效性(例如，关节炎症的减轻或消除和/或关节炎症的预防或抑制)可以通过任何合适的方法(例如，成像(MRI、NMR))来确定。
根据本发明的方法，对哺乳动物受试者施用治疗有效量的Cad-11拮抗剂以治疗炎性关节病症。术语“哺乳动物受试者”在此定义为包括诸如灵长类(例如，人类)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他的牛科、绵羊科、马科、犬科、猫科、啮齿类以及鼠科物种的哺乳动物。
可通过多种途径对哺乳动物受试者施用作为Cad-11拮抗剂的试剂。例如，可通过任何合适的肠胃外或非肠胃外途径(包括例如局部(例如，乳膏、软膏)或经鼻(例如，溶液、悬浮液))施用该试剂。肠胃外施用可以包括，例如关节内、肌肉内、静脉内、心室内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内给药。还可以经口(例如，以胶囊、悬浮液、片剂或饮食形式)、经皮、皮内、局部、通过吸入(例如，支气管内、鼻内、经口吸入或鼻内滴剂)、跨粘膜或经直肠施用该试剂。视情况而定，施用可为局部给药或全身给药，且如果需要，可以同时使用一种以上的途径。Cad-11拮抗剂的局部施用可以通过关节内注射(例如，将试剂直接注射到关节中)来实现。优选的施用模式可以根据选择的具体试剂而发生变化。然而，对于抗体，通常优选全身性的静脉内或皮下给药。
还可以通过注射至患者的脑部或体腔内，或通过使用延时释放或持续释放基质递送系统，或通过使用胶束、凝胶和脂质体的原位递送来实现递送。雾化装置、粉末吸入器以及雾化溶液是可用于对呼吸道施用这类制剂的代表性方法。递送可以是体外、体内或离体的。
作为蛋白质(例如，融合蛋白)的试剂可经由重组蛋白的体内表达来施用。可以根据适当的方法通过体细胞表达来实现体内表达(参见，例如美国专利号5,399,346)。此外，还可以将编码该蛋白质的核酸引入逆转录病毒载体、腺病毒载体或其他合适的载体(优选地，复制缺陷型传染性载体)中用于递送，或可以将其引入到能够表达该蛋白质的转染的或转化的宿主细胞中用于递送。在后一实施方式中，可以将所述细胞以有效量植入(单独或在屏障装置中)、注射或以其他方式引入以表达治疗有效量的该蛋白质。
可以将基于核酸的钙粘着蛋白-11拮抗剂(例如，适体)以多种方式引入到感兴趣的哺乳动物受试者中。例如，核酸可以在宿主细胞中由表达载体或PCR产物内源性地表达，或将其包装到合成的或工程化的组合物(例如，脂质体、聚合物、纳米颗粒)中，该组合物然后可直接引入到哺乳动物受试者的血流中(通过，例如，注射、输注)。还可使用已建立的基因治疗策略和方案将抗钙粘着蛋白-11核酸或核酸表达载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺相关以及单纯疱疹病毒载体、工程化载体、非病毒介导的载体)直接引入到哺乳动物受试者中(参见，例如Tochilin V.P.Annu Rev Biomed Eng 8：343-375，2006；Recombinant DNAand Gene Transfer，Office of Biotechnology Activities，National Institutes ofHealth Guidelines)。
作为钙粘着蛋白-11拮抗剂的试剂(例如，小分子)可以作为药物组合物或生理学组合物的部分(例如作为包含钙粘着蛋白-11拮抗剂和药学上可接受的载体的药物组合物的部分)施用给哺乳动物受试者。包含钙粘着蛋白-11拮抗剂的制剂或组合物或者包含钙粘着蛋白-11拮抗剂和一种或多种其他治疗剂(例如，抗炎剂)的组合物将根据选定的施用途径而变化(例如，溶液、乳剂或胶囊)。合适的药用载体可以含有不与钙粘着蛋白-11拮抗剂相互作用的惰性成分。可以采用标准的药物配制技术，如在Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，PA中所描述的那些技术。用于肠胃外施用的合适的药用载体包括，例如无菌水、生理盐水、抑菌盐水(含有约O.9％mg/ml苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水、汉克斯溶液、林格氏乳酸盐等。制剂还可以包含少量的提高活性成分的效力的物质(例如，乳化剂、增溶剂、pH缓冲剂、润湿剂)。包封组合物的方法(如，在硬质明胶或环糊精(cyclodextran)的包衣中)是本领域已知的。为了吸入，可以将试剂溶解并载入用于施用的合适的分配器(例如，喷雾器或雾化器或加压气溶胶分配器)中。
药剂可以作为中性化合物或作为盐或酯来施用。药学上可接受的盐包括与游离的氨基形成的盐，如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸或酒石酸的盐；以及与游离的羧基形成的盐，如衍生自钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。含有胺或其他碱性基团的化合物的盐可通过例如与合适的有机酸或无机酸如氯化氢、溴化氢、乙酸、高氯酸等反应来获得。含有季铵基团的化合物还含有平衡阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子、醋酸根、高氯酸根等。含有羧酸或其他酸性官能团的化合物的盐可通过与合适的碱(例如，氢氧化物碱)反应来制备。酸性官能团的盐包含平衡阳离子，如钠离子或钾离子。
现在将通过以下实施例说明本发明，这些实施例并非旨在以任何方式进行限制。
示例
实施例1：对人钙粘着蛋白-11的EC1结构域的N末端35个氨基酸内的表位具有结合特异性的Fab的鉴定。
材料与方法
蛋白质印迹
通过SDS-PAGE分离蛋白质，并使用标准方法将其转移到硝酸纤维素(NC)膜上。简言之，用Tris缓冲的生理盐水-吐温(TBST)(8.8g/L的NaCl、0.2g/L的KCl、3g/L的Tris碱、500μl/L的吐温-20，pH调至7.4)漂洗NC膜。将该膜用溶解于TBST中的4％BSA在22℃下封闭1小时。将该NC膜用TBST漂洗3次，每次5分钟。将小鼠抗人Cad-11抗体在TBST中稀释至0.5μg/ml，并将NC在22℃下孵育1小时。将NC膜于TBST中漂洗3次，每次5分钟。将与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗小鼠Ig抗体在TBST中稀释至1μg/ml，并且在22℃下将该NC膜在第二溶液中室温(RT)孵育至少1小时。将该NC膜在TBST中漂洗3次，每次5分钟。使用标准HRP方法使信号显现。
ELISA
将抗原(5μg/ml或50μg的Cad-11-EC-1-Fc或5μg/ml的钙粘着蛋白肽)在缓冲液中稀释并用于在4℃下涂覆平板过夜。洗涤平板，然后用PBS稀释缓冲液(PBS中的1.5％BSA、2.5％低脂奶粉、0.1％吐温-20)中的1.5％BSA、5％低脂奶粉封闭。然后，将平板与含有抗Cad-11人fAb或纯化的抗Cad-11人fAb的细菌裂解液孵育1小时。洗涤后，施加第二抗体(1/100稀释的Cy5-偶联的人Fab)25分钟。然后，洗涤平板并读取产生的荧光。
结果
测试了三组以前报道的钙粘着蛋白-11-特异性抗体与人钙粘着蛋白-11的EC1结构域相结合的能力。这些抗体包括在钙粘着蛋白-11敲除或缺陷的小鼠中针对小鼠钙粘着蛋白-11-Fc融合蛋白免疫原产生的抗体(Lee等人，Science 315：1006-1010(2007))、在钙粘着蛋白-11野生型小鼠中针对已经在CHO细胞中产生的人钙粘着蛋白-11-Fc融合蛋白免疫原产生的抗体(Valencia等人，J.Exp.Med.200(12)：1673-1679(2004))以及在钙粘着蛋白-11野生型小鼠中针对细菌产生的包含人钙粘着蛋白-11的EC1-3结构域的蛋白质而产生的抗体。通过蛋白质印迹分析测试这些抗体结合仅包含人Cad-11的EC1结构域(钙粘着蛋白-11-EC1-Fc)、Cad-11的EC1和EC2结构域(Cad-11-EC1/2-Fc)或Cad-11的所有5个EC结构域(钙粘着蛋白-11-EC1-5-Fc)的融合蛋白的能力。在蛋白质印迹上，所测试的抗体都没有识别EC1-Fc或EC1-2-Fc融合蛋白(图1A)。然而，来自所测试的三组中每一组的抗体都识别包括细胞外结构域1至5的人Cad-11-Fc融合蛋白(图1B)。这些结果表明，所测试的抗体不与人Cad-11的EC1或EC2结构域结合，但却识别该蛋白质的胞外区中其他地方的表位。
通过ELISA测试了可获得的结合表达Cad-11的细胞的已公布的抗Cad-11抗体13C2、23C6、5F82(Lifespan Science)和283416(R&D Systems)以及Cad-11 EC1-结合抗体H1M1以及对照抗体MOPC结合仅包含人Cad-11的EC1结构域(钙粘着蛋白-11-EC1-Fc)或Cad-11的所有5个EC结构域(钙粘着蛋白-11-EC1-5-Fc)的融合蛋白的能力。所测试的可获得的已公布抗Cad-11抗体都没有识别EC1-Fc(图1B，空心柱)(在此没有示出283416的数据)。然而，结合Cad-11 EC1的H1M1抗体结合钙粘着蛋白-11-EC1-Fc以及钙粘着蛋白-11-EC1-5-Fc两者(图1B实心柱)。对照MOPC抗体不结合两种融合蛋白。这些结果表明，可获得的已公布抗Cad-11抗体不与人Cad-11的EC1结构域结合，但却识别在该蛋白质的胞外区中其他地方的表位。
为了产生对于人钙粘着蛋白-11的EC1结构域的N末端35个氨基酸内的表位特异性的抗体，对编码人Fab的噬菌体展示文库(MorphoSys AG)进行筛选。使用两种选择标准——针对与包括人钙粘着蛋白-11 EC1结构域的前35个氨基酸的肽结合的阳性选择，以及针对与来自两个密切相关且高度同源的钙粘着蛋白(钙粘着蛋白-8和MN-钙粘着蛋白)的EC1结构域的相应肽结合的阴性选择——来对候选Fab进行鉴别(图2)。使用ELISA来评估结合。
进行了两次筛选。在第一次筛选中，通过ELISA鉴定了96种结合钙粘着蛋白-11EC1肽的Fab克隆。七(7)种候选Fab结合Cad-11 EC-1肽；然而，其中仅有两种与EC-1肽和EC1-2-Fc融合蛋白二者均结合。这两种Fab中的一种还与MN-Cad肽相结合。因此，这7种Fab克隆中仅有一种特异性结合EC1-Fc融合蛋白，而不与MN-Cad和钙粘着蛋白-8 EC1结构域肽结合。在第二次筛选中，观察到了相似的结果，如此96种Fab中仅有1种(克隆F9)显示出对钙粘着蛋白-11 EC1肽和EC1-2-Fc融合蛋白的特异性而不结合MN-Cad和钙粘着蛋白-8 EC1结构域肽(图3)。大多数所测试的结合Cad-11 EC1结构域的Fab显示出与MN-Cad肽的交叉反应性，这种肽含有与Cad-11的EEY CAR序列重叠的EEY CAR序列。
实施例2：结合钙粘着蛋白-11的EC1结构域的Fab在体外试验中抑制Cad-11介导的细胞聚集
材料与方法
体外钙粘着蛋白-11聚集试验
431-D细胞在悬浮中生长，并且在正常情况下不表达任何钙粘着蛋白且不发生聚集。已经对431-D-11细胞进行了遗传修饰以表达Cad-11。当将431-D-11细胞在单独的培养基中孵育时，它们在40分钟内开始聚集，并且细胞团块沉积到孔的底部，而可以测量剩余的未聚集的处于悬浮的细胞，并计算聚集的431-D-11的百分比。对于聚集试验，使431-D-11细胞(D-11细胞)在烧瓶中生长至亚汇合状态，之后使用0.05％胰蛋白酶加0.53mM EDTA将其从该烧瓶移除。将大约2×106个431-D-11细胞添加到2ml的SME培养基(Dulbecco改良Eagle高葡萄糖培养基、0.1M Hepes，pH 7.4以及5U/ml的DNA酶)中，并在缺乏或存在测试试剂(例如，抗体、Fab、融合蛋白)的情况下将其在冰上预孵育15分钟。与测试试剂预孵育之后，将细胞转移至24孔板上的圆底孔中并在37℃下孵育，同时在旋转摇床上以130rpm进行旋转。由于细胞聚集，它们沉到孔的底部。在0min和40min时，从该孔中移取样品中部的200μl并与25μl的8％戊二醛进行混合以固定细胞。将200μl固定的细胞样品加入到9.8ml的库尔特计数器等渗盐水溶液中，并使用设定在8μm至24μm阈值的库尔特计数器进行计数。每个样品记录3次细胞计数。计算在40min时与0min时间点的百分比相比细胞减少或聚集细胞的百分比。
结果
使用体外钙粘着蛋白-11细胞聚集试验测试了对于在钙粘着蛋白-11 EC1结构域的N末端35个氨基酸内的表位具有结合特异性的候选Fab(克隆F9)(它不与MN-Cad或Cad-8的EC1结构域结合)抑制Cad-11介导的细胞聚集的能力。该候选Fab在1μg/ml或更低的浓度下显著地抑制钙粘着蛋白-11介导的细胞聚集(图4和图5)。相比之下，由与EC1/2结构域之外的Cad-11胞外区中的表位相结合的13C2抗体制备的Fab仅在10μg/ml的浓度下抑制钙粘着蛋白-11的聚集，这提示与结合Cad-11细胞外结构域的其他部分的抗体相比，F9 Fab能在更低的浓度下更有效地抑制Cad-11的活性。
Cad-11介导的细胞聚集也受到各种抗-钙粘着蛋白-11 EC1结构域Fab的抑制，这些Fab对于单独的Cad-11、Cad-11和Cad-8、Cad-11和MN-Cad或者Cad-11、Cad-8和MN-Cad中任一是特异性的(图6和图7)。相对于对照样品(例如，SME培养基)(图6))，GFP特异性的Fab(图7))，测试的所有钙粘着蛋白-EC1-结构域特异性Fab都在体外抑制细胞的聚集。
实施例3：含有人钙粘着蛋白-11的EC1结构域的钙粘着蛋白-11/免疫球蛋白融合蛋白的产生
使用以下寡核苷酸引物以将EcoR1和BglII位点(参见分别在正向和反向引物中加下划线的序列)引入到所扩增的产物中，利用在标准条件下进行的聚合酶链反应(PCR)，从编码全长人钙粘着蛋白-11 cDNA(克隆到Invitrogen载体的Not1和Kpn-1位点中的人Cad-11)的载体制备得到钙粘着蛋白-11 EC1区：
正向引物：
tttttttttgaattcatgaaggagaactactgtttacaagc(SEQ ID NO：8)
EcoR1
反向引物：
tttttttttagatctctggaccttgacaatgaattccgacgg(SEQ ID NO：9)
BglII
用限制性内切酶EcoR1和BglII消化扩增的产物，分离该消化产物并使用对应的EcoR1和BglII位点将其接合到pFUSE-hIgG2e1-Fc1载体(InvivoGen)中。如生产商所述用该接合产物转化TOP10感受态细菌(Invitrogen)，并且用zeomycin选择含有钙粘着蛋白-11-EC1-Fc质粒的细菌。将钙粘着蛋白-11-EC1-Fc质粒进行分离、测序，然后用来瞬时转染293F细胞。收集条件化的培养基，并使用切向流过滤纯化钙粘着蛋白-11-EC1-Fc融合蛋白(SEQID NO：9)，之后在50/50混合的蛋白A/蛋白G柱(在20mM HEPES pH 7.4、137mM NaCl、3mMKCl以及1mM CaCl2中平衡)上分离。使用0.1M甘氨酸(pH 3)和1mM CaCl2将纯化的钙粘着蛋白-11-EC1-Fc融合蛋白从柱上洗脱，并置于含有200μl的1M Tris pH 7.4和1mM CaCl2的管中。然后，将含有Cad-11融合蛋白的洗脱液用20mM Hepes(pH 7.4)、137mM NaCl、3mM KCl以及1mM CaCl2进行透析。通过SDS PAGE确认蛋白质的大小(图10)，并通过使用识别人Fc区的抗体的蛋白质印迹分析(图11)以及N末端测序(未示出)来证实其身份。使用与如上所述相似的技术和条件产生Cad-11-EC1-2-Fc。
实施例4：Cad-11-EC1-Fc免疫球蛋白融合蛋白在体外试验中抑制Cad-11介导的细胞聚集
材料与方法
细胞向基质胶小室中的侵入/迁移
在FLS培养基(Dulbecco改良Eagle高葡萄糖培养基[Sigma#D7777]、10％胎牛血清[Benchmark#100-106]、1％青霉素-链霉素[Gibco 315140-122]、1％L-谷氨酰胺[Gibco#25030]、0.5％庆大霉素[Gibco#15710-064])中在基质胶ECM涂覆的转移孔(transwell)中评估成纤维样滑膜细胞(FLS)的迁移活性。将含有1×104个细胞的FLS培养基中的人FLS细胞悬液加入到对照插入物或基质胶涂覆的插入物中，所述插入物设置在含有0.750mL FLS培养基的24孔板的孔中。然后，将这些板在37℃、5％CO2气氛下在湿润的组织培养箱中孵育22个小时。
为了计算迁移的细胞的数目，通过用棉拭子擦拭而将非侵入细胞从对照插入物膜的上表面移除。重复进行使用由FLS培养基湿润的棉拭子的第二次擦拭。然后，将对照插入物固定，并用差异染色试剂盒[Fisher#122-911]进行染色。将插入物干燥，并使用具有10×物镜的显微镜在该对照插入物的4个象限中对细胞进行计数。对一式三份的插入物进行计数并将总数平均。
为了计算侵入基质胶插入物的细胞的数目，通过用棉拭子擦拭而将非侵入细胞从该基质胶插入物的表面轻轻地移除。重复进行使用由FLS培养基湿润的棉拭子的第二次擦拭。然后，将插入物固定，并用差异染色试剂盒[Fisher#122-911]进行染色。将插入物干燥，并使用具有10×物镜的显微镜在该对照插入物的4个象限中对细胞进行计数。对一式三份的插入物进行计数并将总数平均。
结果
Cad-11-EC1-Fc在3μg/ml的浓度下显著地抑制细胞的聚集，而含有人Cad-11的全部5个EC结构域的全长Cad-11-EC1-5-Fc蛋白质在100μg/ml的浓度下抑制Cad-11介导的聚集(图13)。这些数据表明，在体外试验中，Cad-11-EC1-Fc免疫球蛋白融合蛋白有效地抑制Cad-11介导的细胞聚集。
此外，在体外测试了Cad-11-EC1-Fc免疫球蛋白融合蛋白抑制人成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)侵入基质胶小室中的能力。FLS向基质胶中的侵入是一个复杂的过程，该过程涉及FLS表达MMP1、MMP-3、MMP-13、丝氨酸蛋白酶及其他蛋白质以降解基质胶，以及FLS向基质胶内的迁移。在单独的试验中，我们没有看到对FLS迁移通过正常纤维插入物的抑制。这提示EC-Fc或13C2 mAb的作用是抑制基质胶(关节软骨的代用品)的降解。在两个独立的实验中，Cad-11-EC1-Fc以及鼠抗Cad-11 mAb 13C2均抑制FLS向基质胶小室中的侵入。
实施例5：抗人钙粘着蛋白-11的EC1结构域肽的抗体的产生
材料与方法
用0.01mg共价连接BSA的对应于人Cad-11 EC1结构域的前33个氨基酸(GWVWNQFFVI EEYTG PDPVL VGRLH SDIDS GDG(SEQ ID NO：10))的肽在足垫处每两周一次对Balb/c小鼠进行免疫，在一个月的时间中进行9次。这一肽在此称为肽4。从经免疫的小鼠得到脾，并与鼠融合伴体P3X63-Ag8.653进行融合以生成产生抗体的杂交瘤。将这些杂交瘤扩增并以10、3或0.5个细胞/孔进行亚克隆，并且在ELISA中针对特异性结合细菌中产生的含有Cad-11 EC1-2结构域的蛋白质的能力筛选来自杂交瘤的含有抗Cad-11抗体的培养基。同时针对不存在与包含人Cad-8和MN-钙粘着蛋白的EC1-2结构域的蛋白质的结合来筛选来自这些肽4杂交瘤的含抗-Cad-11抗体的培养基。在4℃下用0.05ml的0.0-0.3mg/ml的各EC1-2Cad蛋白质涂覆96-孔EIA板过夜，之后用盐水缓冲液洗涤数次。然后，用0.25ml的酪蛋白-PBS缓冲液将板封闭，并用盐水缓冲液洗涤数次。在22℃下在各个孔中将含有抗Cad-11抗体的杂交瘤培养基纯净地孵育1小时，之后用PBS-吐温(0.05％)洗涤两次。将100μl的山羊抗小鼠IgG第二抗体的1/1000稀释液加入到各个孔中，在22℃下孵育30分钟，然后用PBS-吐温(0.05％)洗涤两次。将100μl/孔的室温TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)试剂加入到各个孔中，并且使之在22℃下显色5分钟。用100μl的室温的2N硫酸终止该反应，并且在Wallac1420酶标仪上在450nm下读板。
使用ELISA进一步测试了H1M1和H14抗Cad-11抗体针对Cad-11、Cad-7、Cad-8、Cad-20、Cad-24、Cad-9、Cad-18以及MN-Cad的EC1结构域的前33个氨基酸的特异性。合成了与Cad-7、Cad-8、Cad-20、Cad-24、Cad-9、Cad-18、MN-Cad的区域(该区域与Cad-11 EC1结构域的G1-G33区域重叠)相对应的肽，并且将这些肽与生物素偶联。将100μl的这些肽中的各肽于PBS-吐温(0.05％)中的30ng/ml溶液在4℃下于96-孔Netravidin板的各个孔中孵育2-3小时，之后用PBS-吐温(0.05％)洗涤两次。将各种浓度的抗Cad-11抗体在各个孔中于22℃下孵育1小时，之后用PBS-吐温(0.05％)洗涤两次。将100μl的山羊抗小鼠IgG第二抗体的1/1000稀释液加入到各个孔中，在22℃下孵育30分钟，之后用PBS-吐温(0.05％)洗涤两次。将100μl/孔的室温TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)试剂加入到各个孔中，并且使之在22℃下显色5分钟。用100μl的室温的2N硫酸终止该反应，并且在Wallac 1420酶标仪上在450nm下读板。
针对与表达Cad-11的细胞结合的能力，对来自含有阳性抗Cad-11抗体杂交瘤的孔的培养基进行测试。将冷冻的表达Cad-11的431D细胞解冻，并且在含有Ca2+的汉克斯平衡盐溶液(HBSS)(0.137M NaCl、5.4mM KCl、0.25mM Na2HPO4、0.44mM KH2PO4、1.3mM CaCl2、1.0mMMgSO4以及4.2mM NaHCO)中洗涤两次，之后以106个细胞/ml重悬浮于含有Ca2+的HBSS中。用50％或16％的抗Cad-11抗体培养基在冰上将105个细胞/孔染色45min，在含有Ca2+的HBSS中洗涤两次，用浓度为1％的与藻红蛋白(phytoerytherin)(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)偶联的山羊抗鼠IgG第二抗体在冰上染色45分钟，而后在含有Ca2+的HBSS中再洗涤两次。然后，将细胞重悬浮于400μl含有Ca2+和1％甲醛的HBSS中，随后在FACScalibur(Becton Dickenson，Franklin Lakes，NJ)上对PE阳性细胞进行分析。
结果
来自肽4杂交瘤的含有抗-Cad-11抗体的培养基与Cad-11 EC1-2蛋白质结合(图16，HL对Cad-11)，而不与含有Cad-8和MN-Cad的EC1-2结构域的蛋白质结合(图16，分别为HL对Cad8和HL对MNCad)。对照杂交瘤培养基不结合所测试的任何钙粘着蛋白(图16，培养基对Cad-11、培养基对Cad8和培养基对MNCad)。这些数据证明了杂交瘤中针对肽4的Cad-11特异性抗体的存在。
两种肽4杂交瘤(在此称为H1M1和H14)与表达人Cad-11蛋白质的细胞结合(图17A-C和图17G-I)，但不与非Cad-11对照431-D细胞结合(图17D-17F)。被称为H1M1的杂交瘤细胞系具有A.T.C.C.专利保藏号PTA-9699，其已于2009年1月8日保藏。被称为H14的杂交瘤细胞系具有A.T.C.C.专利保藏号PTA-9701，其已于2009年1月9日保藏。这些杂交瘤含有体外识别肽4和表达Cad-11的细胞的抗Cad-11抗体。这些抗体与表达Cad-11的细胞的结合显示为用所使用的肽4抗体的量进行滴定，如在H1M1(图18A)和H14(图18B)的滴定相对于来自平均荧光强度(MFI)的细胞染色强度的图中所示的。
结果表明，H1M1和H14肽4抗-Cad-11抗体与Cad-11的结合比所测试的任何其他钙粘着蛋白(包括Cad-7、Cad-8、Cad-20、Cad-24、Cad-9、Cad-18以及MN-Cad)高出100倍以上。在大多数情况下，没有观察到H1M1和H14抗Cad-11抗体与其他钙粘着蛋白的结合。抗Cad-11抗体H14显示出与Cad-11的强结合(图19A)，与Cad-8的结合低468倍(图19A)，并且几乎不与Cad-7、MN-Cad、Cad-9、Cad-18、Cad-20或Cad-24结合(图19B)。类似地，抗Cad-11抗体H1M1显示出与Cad-11的强结合(图20)，与Cad-8的结合低1500倍，并且基本上不与Cad-7、MN-Cad、Cad-9、Cad-18、Cad-20或Cad-24结合(图20)。
实施例6：抗Cad-11 EC1结构域抗体H1M1和H14结合包括氨基酸序列GPDP的Cad-11EC1结构域中的表位
材料与方法
为了确定肽4 Cad-11 EC1抗体H1M1和H14所结合的Cad-11 EC1结构域中的表位，将跨越EC1区的前37个氨基酸的4种不同的肽(见图22)以ELISA形式进行固定，并确定H1M1和H14抗体与这4种肽中的每一种相结合的能力。在4℃下用0.3ng/孔的肽1(Cad-11 EC1结构域的氨基酸G1-P18)、0.3ng/孔的肽2(Cad-11 EC1结构域的氨基酸G15-N34)、0.3ng/孔的肽3(Cad-11 EC1结构域的氨基酸V19-Y37)、0.3ng/孔的免疫原肽4(Cad-11 EC1结构域的氨基酸G1-G33)、20ng的包括整个EC1结构域的融合蛋白(EFL)或20ng的对照人Ig(Fc-段)将96-孔Reactibind板涂覆过夜。将这些孔用PBS-吐温(0.05％)洗涤两次，在22℃下用dH2O中的酪蛋白封闭3小时，之后用PBS-吐温(0.05％)再洗涤两次。将不同的肽4Cad-11 EC1结构域抗体的各个稀释液转移到肽或蛋白质涂覆的孔中，在22℃下孵育45min，之后用PBS-吐温(0.05％)洗涤两次。将100μl的山羊抗小鼠IgG第二抗体(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)的1/1000稀释液加入到各个孔中，在22℃下孵育30分钟，而后用PBS-吐温(0.05％)洗涤两次。将100μl/孔的室温TMB试剂加入到各个孔中，并且使之在22℃下显色5min。用100μl的室温2N硫酸终止反应，并且在Wallac 1420酶标仪上在450nm的波长下读板。
结果
在该ELISA中，正如相对于对照物提高的OD450板读数所示的，1∶11的肽4抗-Cad-11抗体H1M1(图21A)以及1∶23的肽4抗-Cad-11抗体H14(图21B)均结合肽4(PEP4)免疫原以及EC1结构域融合蛋白(EFL)。这些抗体均不与人IgG对照(Fc段)结合。此外，在该ELISA中，这两种抗体均结合肽2(PEP2)，但不结合肽1(PEP1)或肽3(PEP3)(图21A和图21B)。
这些结果提示，抗Cad-11 EC1结构域抗体H1M1和H14结合肽2和4中的共同表位，该表位不存在于重叠的肽3中。位于肽3上游的、肽2和肽4所共有的氨基酸在图22中所示的加框区域中突出显示。从Cad-11 EC1结构域的G15开始的这4个氨基酸GPDP(SEQ ID NO：11)很可能是由H1M1和H14抗体所识别的表位的部分。
实施例7：抗Cad-11 EC1结构域抗体H1M1和H14在体外抑制表达Cad-11的细胞的聚集
材料与方法
为了评估Cad-11抗体抑制Cad-11介导的细胞聚集的能力，将30μg/ml的H1M1肽4抗体与75,000个表达Cad-11的A-431-D表皮样癌细胞在24-孔圆底聚丙烯板中在0.5ml的DMEM-高葡萄糖、20mM Hepes pH 7.4、10％FCS以及10U/ml DNA酶中培养。将24-孔板放置在大约60rpm的旋转平台上，并在37℃下用5％CO2孵育过夜。第二天，在100×(对于H1M1实验)或40×(对于H14实验)放大倍数下对这些板拍照，之后评估细胞的聚集。
结果
在对照同种型抗体(30μg/ml)的存在下，表达Cad-11的细胞形成了大团块(图23A)，而亲本Cad-11阴性细胞保持为单一或双重细胞群(图23C)。H1M1处理的Cad-11细胞保持为小的细胞团(图23B)，这些细胞团没有进一步发展以形成使用对照抗体所获得的大团块。
使用相同的试验，抗Cad-11抗体H14还显示出抑制Cad-11-介导的聚集。虽然表达Cad-11的亲本细胞形成了大的细胞簇(图24A)，但H14抗体(图24B)在30μg/ml的浓度下抑制聚集，因为细胞簇小而稀少。这些结果表明，抗Cad-11抗体H1M1和H14在体外抑制Cad-11介导的细胞聚集。
实施例8：抗Cad-11 EC1结构域抗体H1M1和H14在类风湿性关节炎鼠模型中在体内抑制关节炎相关的关节肿胀
材料与方法
研究1——在第0天和第2天给六周龄雄性C57/Bl6小鼠注射150μl的KBN血清。经KBN血清处理的小鼠接受盐水注射(图25，空心的三角形)或用不同剂量的H1M1抗-Cad-11EC1抗体进行处理。处理方案包括：在第0天以0.5mg抗体/小鼠给药，并且在之后每隔一天(q2d)以0.1mg抗体/小鼠(0.5mg+0.1mg)给药(图25，实心三角形)；在第0天以0.5mg抗体/小鼠(0.5mg)给药(图25，菱形)；每隔一天(q2d)以0.1mg抗体/小鼠(0.1mg+0.1mg)给药(图25，正方形)；或每隔一天(q2d)以0.3mg抗体/小鼠(0.3mg+0.3mg)给药(图25，圆形)。对照组由5只小鼠组成，而处理组由7只小鼠组成。通过每隔一天进行的卡尺测量来确定关节炎相关的关节肿胀。
研究2——在第0天和第2天给六周龄雄性C57/Bl6小鼠注射150μl的KBN血清，之后每隔一天(q2d)用盐水进行处理(图26，三角形)，或用抗Cad-11抗体H1M1(图26，正方形)或H14(图26，圆形)之一以0.3mg/剂量每隔一天进行处理。对照组由5只小鼠组成，而处理组由7只小鼠组成。通过每隔一天进行的卡尺测量来确定关节炎相关的关节肿胀。
结果
研究1——相对于对照小鼠，H1M1抗-Cad-11抗体抑制了关节肿胀。通过每隔一天0.3mg的H1M1抗体对KBN处理的小鼠进行给药观察到对关节炎相关的关节肿胀的最大抑制(图25，圆形)。
研究2——相对于对照，两种抗Cad-11抗体均抑制了关节肿胀。在这项研究中，与对照动物相比，H14抗体显著地延迟了关节炎的发作(图27)。在对照组中的所有小鼠到第3天都发展为关节炎，而H14处理的小鼠需要6天才使所有动物发展成关节炎。
这些研究表明，抗人Cad-11的EC1结构域的抗体可以在体内抑制关节炎的发生和严重程度。
实施例9：抗人钙粘着蛋白-11的另一EC1结构域肽的抗体的产生
材料与方法
用0.01mg共价结合BSA的对应于人Cad-11 EC1结构域的19个氨基酸的肽V19-Y37(VL VGRLH SDIDS GDGNI KY(SEQ ID NO：12))在足垫处每两周一次对Balb/c小鼠进行免疫，在一个月时间内进行9次。这种肽在此称为肽3。从免疫的小鼠中得到脾脏，并与鼠融合伴体P3X63-Ag8.653融合以生成产生抗体的杂交瘤。将这些杂交瘤扩增，并针对与细菌中产生的对应于Cad-11的EC1-2结构域的蛋白质相结合的能力来筛选来自杂交瘤的含抗Cad-11抗体的培养基。同时，针对不存在与包含Cad-8和MN-钙粘着蛋白的EC1-2结构域的蛋白质的结合筛选来自这些肽3杂交瘤的含抗-Cad-11抗体的培养基。在4℃下用0.05ml的0-300mg/ml的各EC1-2Cad蛋白质之一或CHO细胞产生的EC1-Fc融合蛋白将96孔EIA板涂覆过夜，之后用盐水缓冲液洗涤数次。然后用0.25ml的酪蛋白-PBS缓冲液封闭板，且随后用盐水缓冲液洗涤数次。将含有肽3抗Cad-11抗体的杂交瘤培养基在22℃下纯净地于各个孔中孵育1小时，之后用PBS-吐温(0.05％)洗涤两次。将100μl的山羊抗小鼠IgG第二抗体的1/1000稀释液加入到各个孔中，在22℃下孵育30分钟，之后用PBS-吐温(0.05％)洗涤两次。将100μl/孔的室温TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)试剂加入到各个孔中，并且使之在22℃下显色5分钟。用100μl的室温的2N硫酸终止反应，并在Wallac 1420酶标仪上于450nm下读板。
还测试了来自肽3杂交瘤的培养基与细胞上表达的人Cad-11蛋白质结合的能力。将冷冻的表达Cad-11的431D细胞解冻，并且在含有Ca2+的HBSS中洗涤两次，之后以106个细胞/ml重悬浮于含有Ca2+的HBSS中。用50％或16％的抗Cad-11抗体培养基在冰上染色105个细胞/孔45分钟，在含有Ca2+的HBSS中洗涤两次，之后用浓度为1％的与藻红蛋白偶联的山羊抗小鼠IgG第二抗体在冰上染色45分钟，之后在含有Ca2+的HBSS中再洗涤两次。然后，将细胞重悬浮于400μl含有Ca2+和1％甲醛的HBSS中，随后在FACScalibur上对PE阳性细胞进行分析。
结果
来自肽3杂交瘤的含有抗-Cad-11抗体的培养基与Cad-11 EC1-2蛋白质以及EC1-Fc融合蛋白结合(图28，分别为HL对Cad-11以及HL对Cad-11-EC1)，但不与包含Cad-8和MN-Cad的EC1-2结构域的蛋白质结合(图28，分别为HL对Cad8以及HL对MNCad)。对照杂交瘤培养基不与任何钙粘着蛋白蛋白质结合(图28，培养基对Cad-11、培养基对Cad8以及培养基对MNCad)。
来自肽3杂交瘤的抗Cad-11抗体还与表达人Cad-11蛋白质的细胞结合(图29，见箭头)，但不与表达Neos的非Cad-11表达的对照细胞结合。该结果证实：在这些杂交瘤中存在体外识别肽3和表达Cad-11的细胞的抗Cad-11抗体。
实施例10：抗Cad-11 EC1结构域特异性抗体H1M1在体外阻止人原代成纤维细胞样滑膜细胞的聚集。
材料与方法
聚集试验
在该试验中，将人成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)系在FLS培养基(DMEM、10％FCS、1％青霉素-链霉素、1％L-谷氨酰胺、0.05％庆大霉素、1％HEPES)中培养直至90-100％汇合。试验当天，将培养基从FLS去除，并用0.05％的胰蛋白酶-EDTA将细胞从烧瓶中移出，用MM培养基(DMEM、10％FCS、1％青霉素-链霉素、1％L-谷氨酰胺、0.05％庆大霉素、1％HEPES)洗涤，之后用含有钙的HBS(0.137M NaCl、5.4mM KCl、0.25mM Na2HPO4、0.44mM KH2PO4、1.3mM CaCl2、1.0mM MgSO4以及4.2mM NaHCO)洗涤两次。将胰蛋白酶消化的FLS在MM培养基中重悬浮达到4×104个细胞/ml，并将2×104个细胞/孔置于含有单独的培养基、同种型对照抗体或30μg/ml的各种抗Cad-11抗体的24孔盘中。将该板在5％CO2培养箱中孵育24小时，第二天用光学显微镜检查各孔并拍照。
FLS侵入试验
为了测试H1M1抗体抑制FLS侵入由多种细胞外基质蛋白质组成的基质胶的能力，采用了使用基质胶分离孔系统的侵入试验。FLS生物学的这种体外模型模拟FLS降解并钻入人接合关节中的软骨中的能力。在该试验中，将人FLS细胞系在FLS MM培养基中培养直至90-100％汇合。在试验开始前一天，将FLS在不含血清的FLS培养基中进行血清饥饿24小时。试验当天，将培养基从血清饥饿的FLS移除，并用0.05％的胰蛋白酶-EDTA将细胞从烧瓶中移出，用MM培养基洗涤，之后用含有钙的HBS洗涤两次。将胰蛋白酶消化的FLS在MM培养基中重悬浮以达到4×105个细胞/ml。将制备的基质胶包被的插入物放在包含具有FCS的MM培养基的24孔板中，FCS作为FLS的有丝分裂原。在该室的另一侧，将不含抗体或含有两倍工作浓度的处理抗体的50μl的MM培养基引入各孔中，该MM培养基中加入了50μl的4×105个细胞/ml的细胞悬液。将含有FLS和抗体的室在37℃的培养箱中孵育18小时。
24小时之后，将具有细胞的插入物在甲醇中固定，将粘附在基质胶包被的膜外面的FLS用棉拭子去除，并将该膜干燥，之后用碘化丙啶(PI)于室温下在黑暗中染色30min。去除PI染色剂并将插入物用D-葡萄糖(1mg/ml)洗涤，之后在黑暗中干燥。将膜切下并使用荧光显微镜在载玻片上成像，并定量迁移至膜中的FLS的数目。
结果
与培养基或对照抗体一起孵育的FLS形成了细胞聚集物和通过细胞突关联的广泛细胞网络(图30A和图30B)。相反，用抗Cad-11抗体H1M1处理的细胞只形成了很少的细胞聚集物和很少的连接(图30C)。
在使用不同的原代人FLS的一系列FLS侵入试验中，30μg/ml的H1M1抗体始终抑制FLS向膜内的侵入。尤其是，30μg/ml剂量的H1M1与对照抗体相比抑制了80％的FLS侵入。这种活性比使用结合在EC1区外的其他Cad-11抗体(包括13C2抗体)观察到的活性更高(图31)。
实施例11：在KBN关节炎小鼠模型中H1M1抗体抑制关节肿胀
材料与方法
在KBN关节炎模型中测试了抗Cad-11抗体H1M1，在该模型中，通过在第0天和第2天施用2剂75μl KBN血清来诱发疾病。从第0天开始每隔一天向7只雄性C57BL/6小鼠的组腹膜内施用10mg/kg的H1M1，并且每天监测小鼠的关节肿胀。在踝关节处于完全屈曲位时在踝部使用带弹簧的带表卡尺(Long Island Indicator Service，Hauppauge，NY)测量关节肿胀或踝最小厚度。
结果
与对照组相比，H1M1抗体抑制了53％的关节肿胀(p＜0.001)(图32)。
实施例12：H1M1可变结构域和互补决定区的测序
材料与方法
从产生H1M1的杂交瘤细胞的3个克隆(H1、H17和H27)中提取RNA。对于IgGVH、IgMVH、IgκVL和IGλVL中每一种使用恒定区引物采用鼠信号序列的简并引物池来进行RT-PCR。使用一组6个简并引物池(HA至HF)来扩增重链可变(V)区RNA，并对于κ簇使用一组7个简并引物池(κA至κG)和对于λ簇使用1个简并引物来扩增轻链V区mRNA(见表1)。
对于所有RNA样品，从利用IgGVH逆转录引物结合重链引物池B和E逆转录的RNA获得来自重链的扩增产物。从IgκVL逆转录引物以及κ轻链引物池B、C和G获得扩增产物。将来自上述各个池的PCR产物纯化并克隆，并对于各产物的至少4个克隆进行测序。
对于产生H1M1的克隆H1、H17和H27，针对各个样品确定单一功能性重链和轻链V区序列，并且发现这三种抗体是相同的(表2)。重链和轻链V区序列以及它们的CDR序列分别在图33和图34中示出。
来自三个H1M1杂交瘤克隆的重链和轻链V区显示与它们的最接近的人类种系序列具有良好的同源性(分别为64％和82％)，并且单独的框架序列在人类种系数据库中具有接近的同源物(表2)。这种高度的同源性降低了需要深度的工程化来产生成功的人源化抗体的可能性。
表2：H1M1杂交瘤克隆H1、H17和H27的序列分析
a根据Kabat的CDR定义和序列编号
b示出的种系ID后为％同源性
实施例13：人源化抗Cad-11抗体的产生
人源化抗Cad-11抗体可变区序列的设计
使用Swiss蛋白质数据库得到产生在此所描述的鼠H1M1单克隆抗体(也称作SYN0012抗体)的抗体可变(V)区的结构模型，并进行分析以鉴定V区中重要的“限制”氨基酸，据预测该氨基酸对于SYN0012/H1M1抗体的结合性质是必要的。包含在CDR中的残基(使用Kabat和Chothia定义)连同多个框架残基被认为是重要的。SYN0012/H1M1抗体的VH和Vκ序列均含有典型的框架残基，且CDR 1、2和3基序与许多鼠抗体相当。
从上述分析，可认为SYN0012/H1M1抗体的复合人类序列可以用CDR之外的大范围的备选残基来构建，而在CDR序列内仅有窄选择范围的可能的备选残基。初步分析表明，可以合并来自几种人抗体的相应序列片段以产生与鼠SYN0012/H1M1抗体序列中的CDR相似或相同的CDR。对于CDR之外和CDR侧翼的区域，鉴定宽选择范围的人类序列片段作为人源化抗Cad-11抗体V区的可能成分。
变体的设计
基于上述分析，选择并分析可用于产生SYN0012人源化抗Cad-11抗体变体的大的初步序列片段集用于与人类MHC II类等位基因结合的肽的计算机分析(Perry等人，2009)，并使用与已知抗体序列相关的T细胞表位的TCEDTM(英国剑桥Antitope LLC的T细胞表位数据库)(Bryson C，Jones TD和Baker MP.Prediction of immunogenicity of therapeuticproteins：validity of computational tools.Biodrugs 2010，24(1)：1-8)。舍弃被鉴定为人类MHC II类的显著非人类种系结合物的序列片段或对于TCEDTM评分为显著命中的序列片段。这产生缩减的片段集，并如上所述再次分析它们的组合以确保片段之间的接合不包含潜在的T细胞表位。之后将选定的片段组合以产生重链和轻链V区序列用于合成。对于SYN0012人源化抗Cad-11抗体变体，利用图35A-35H中详述的序列设计5个VH链(VH1-VH5；SEQ ID No：61、63、65、67、69)和3个Vκ链(Vκ1-Vκ3；SEQ ID No：71、73、75)。
复合人抗体变体的构建
使用一系列经退火、连接和PCR扩增以得到全长合成V区的重叠寡核苷酸，合成SYN0012/H1M1的所有变体复合人抗体VH和Vκ区基因。使用Mlu I和Hind III位点克隆组装的VH变体，并使用Bss HII和Bam H1限制性酶切位点将组装的Vκ变体直接克隆至用于IgG4(S241P)VH链和Vκ链的pANT表达载体系统(Antitope，英国剑桥)中(图36)。所有构建体都通过测序进行确认。
抗体的构建、表达和纯化
将复合人源化IgG4(S241P)VH和Vκ链的所有15种组合经由电穿孔稳定地转染至NS0细胞中，并使用200nM的氨甲蝶呤(Sigma目录号M8407，Sigma Aldrich，UK)进行选择。使用IgG4 ELISA测试各种构建体的氨甲蝶呤抗性集落的IgG表达水平，并选择表达最好的细胞系，将其扩增并在液氮中冷冻。成功地产生了表达15种人源化抗体变体中的各种的细胞。
利用蛋白A琼脂糖柱(GE Healthcare目录号110034-93)从NS0细胞培养上清液中纯化被命名为SDP011(Vκ1/VH1)、SDP021(Vκ1/VH2)、SDP031(Vκ1/VH3)、SDP041(Vκ1/VH4)、SDP051(Vκ1/VH5)、SDP061(Vκ2/VH1)、SDP071(Vκ2/VH2)、SDP081(Vκ2/VH3)、SDP091(Vκ2/VH4)、SDP101(Vκ2/VH5)、SDP111(Vκ3/VH1)、SDP121(Vκ3/VH2)、SDP131(Vκ3/VH3)、SDP141(Vκ3/VH4)和SDP151(Vκ3/VH5)的SYN0012的15种人源化IgG4(S241P)复合变体，并使用基于预测的氨基酸序列的消光系数(Ec(0.1％)＝1.51)根据OD280nm将抗体量化。在鼠IgG1抗Cad-11 EC1抗体(SYN0011)纯化期间注意到，抗体在pH大约为7.5下沉淀为絮凝物；因此在酸洗脱后将所有抗体中和至pH大约6.5，并将缓冲液更换为10mM的醋酸钠缓冲液pH 5.5(1.4mM醋酸、8.6mM醋酸钠)。纯化各人源化抗Cad-11抗体变体并通过还原SDS-PAGE进行分析。将样品加载至NuPage 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen目录号NP0322BOX)上，并在200V下跑样30min。观察到与VH和Vκ链的预测大小相对应的条带，没有任何污染蛋白质的迹象(图37)。
实施例14：人源化抗Cad-11抗体与Cad-11蛋白质结合的鉴定
材料与方法
纯化的抗体与重组人Cad-11 EC1的结合
在竞争结合ELISA中评估了纯化的人源化复合变体抗体(SDP011至SDP151)与重组Cad-11 EC1人IgG1融合蛋白的结合。将人源化或对照(SYN0012/H1M1)抗体从5μg/ml至0.0022μg/ml的稀释系列与恒定浓度的生物素化的鼠抗Cad-11抗体SYN0012/H1M1(最终浓度为0.1μg/ml)进行预混合，之后于室温下在Nunc Immuno MaxiSorp 96孔平底微量滴定板(Fisher目录号DIS-971-030J)上孵育1小时，该板用在PBS中稀释的0.25μg/ml重组人Cad-11 EC1(R&D Systems目录号1790-CA-050)预涂覆。用链霉亲和素-HRP(Sigma目录号S5512)和四甲基联苯胺(TMB)底物(Invitrogen目录号00-2023)检测生物素化的mAb的结合。
钙粘着蛋白-肽交叉反应性ELISA
为了评估哪一种人源化抗Cad-11抗体对于Cad-11显示出最大特异性，以ELISA形式测试了人源化抗体与连接至BSA的37-mer肽结合的能力，该肽包含Cad-11免疫原或与Cad-11免疫原最密切相关的6个序列(取自钙粘着蛋白-7、-8、-9、-18、-20和-24)的相应序列。
在PBS(pH 7.2)中，用0.05％吐温(EMD，产品编号9480)的(Gibco(Invitrogen)，#20012)中的500ng/ml的BSA偶联的钙粘着蛋白37-mer肽(NE肽)(对应于钙粘着蛋白-7、-8、-9、-18、-20和-24)于4℃下以100μl体积/孔涂覆Reactibind板(ThermoScientific)过夜。将含有肽的溶液从孔中去除，并将板在22℃用PBS中的2％牛血清白蛋白(BSA)以200μl体积/孔封闭2h。之后将板用200μl/孔的PBS-吐温(0.05％)在22℃下洗涤两次，并吸干。将体积为100μl/孔的各人源化抗Cad-11抗体从5μg/ml至8ng/ml的稀释系列在肽涂覆的孔中孵育，并在22℃下孵育1小时。从孔中去除抗体溶液，并用200μl/孔的0.05％吐温-PBS在22℃下洗涤板两次，并吸干。将山羊抗小鼠IgG(Pierce#31432)以1∶1000稀释度、100ul/孔加入到板的各个孔中，并在22℃下孵育30min。移除第二抗体溶液，并用200μl/孔的0.05％吐温-PBS在22℃洗涤板两次，并吸干。通过将100μl/孔的四甲基联苯胺(TMB)试剂IgG(Pierce#34022，1步Turbo TMB-ELISA)加入到板中而使反应显色，并在22℃下显色5min。用100μl室温2N硫酸终止反应并在酶标仪(Wallac 1420)上于450nm读板。
在表面等离子体共振(SPR)中与Cad-11的结合
为了确定SDP051对重组his标记的人Cad-11的亲和力，将rhCad-11(R&D Systems)以单一浓度固定在芯片上，确定SDP051的高分辨率动力学，并且2态反应结合模型成功地与动力学数据拟合。
在40μL/min的流速下获得动力学数据以最小化任何潜在的传质效应。通过系列稀释制备12.5nM至0.195nM的分析物浓度系列。将两个重复的空白(无mAb)和3.125nM(第一个和最后一个循环)浓度的分析物编程至动力学过程中以检查表面和分析物在动力学循环中的稳定性。将SDP051在Fc上注射360秒，该时间的长度足以观察缔合相中的曲率。
Cad-11细胞结合试验
将冷冻的表达Cad-11的431D细胞(K.Johnson，U.Nebraska，Omaha)或非Cad-11表达的亲本431D细胞(K.Johnson，U.Nebraska，Omaha)解冻，洗涤并以2×106个细胞/ml重悬浮，且向各个孔中加入50μl。之后在冰上利用从1ng/ml至30μg/ml的浓度增加的人源化SDP051或SDP071抗体将细胞染色45分钟。染色后将细胞用含有1％胎牛血清(FBS)的汉克斯平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次，重悬浮，并用小鼠抗人IgG4-PE(100×稀释)在冰上避光染色45分钟。在用第二种试剂染色细胞之后，将细胞用含有1％FBS的HBSS洗涤两次，重悬浮于200μl含有1％FBS的HBSS中的2％甲醛中，之后用BD FACSCalibur进行分析。
钙粘着蛋白-肽交叉反应性FACS试验
将冷冻的表达Cad-11的431D细胞或非Cad-11表达的亲本431D细胞解冻，洗涤，并以2×106个细胞/ml进行重悬浮，并且将100,000个细胞加入各个孔中。利用0.5μg/mlSDP051以浓度增加的37-mer Cad-11肽或Cad-7、Cad-8、Cad-9、Cad-18、Cad-20或Cad-24肽与在冰上染色细胞45分钟。染色之后，将细胞用含有1％胎牛血清(FBS)的汉克斯平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次，重悬浮，之后用100μl的山羊抗-小鼠IgG-PE(100×稀释度)在冰上避光染色30分钟。在细胞用第二种试剂染色之后，用含有1％FBS的HBSS洗涤细胞两次，重悬浮，并在200μl含有1％FBS的HBSS中的2％甲醛中固定，之后用BD FACSCalibur进行分析。
结果
所有人源化抗Cad-11抗体均有效地与SYN0012竞争结合Cad-11融合蛋白(图38A-C)。这表明它们结合与SYN0012相同的表位或Cad-11上的重叠表位，并且它们与重组人Cad-11的结合至少与SYN0012一样好或者更好。利用曲线计算各抗体的IC50值，并将其相对于SYN0012的IC50进行标准化，SYN0012包括在各个ELISA板上以便可以进行板间比较(表3)。还示出了各细胞系的表达水平和各抗体的计算的等电点(PI)(表3)。
SDP051，一种Vκ1/VH5抗体，以最高的特异性结合Cad-11，证明它与Cad-11抗原的结合比来自其他钙粘着蛋白的相关抗原高100倍以上(图39A-O)。针对Cad-8发现最高的交叉反应性。SDP031、SDP061和SDP071也显示出对于Cad-11的显著特异性，表明它与Cad-11抗原的结合比来自其他钙粘着蛋白的相关抗原高20倍以上。SDP031、SDP051、SDP061和SDP071的轻链和重链氨基酸序列在图40A-40D中示出。
表3：复合人抗Cad-11抗体的表征
相对IC50通过用SYN0012的值除测试抗体的值来计算。所给出的抗体表达水平是T形瓶中的静置培养的水平。PI被计算得到。
在以500ng/ml涂覆的针对Cad-11抗原和Cad-7、-8、-9、-11、-18、-20、-24抗原的人源化抗Cad-11抗体的初步筛选(图41A)中，证明SDP051与Cad-11的结合远高于与任何其他钙粘着蛋白的结合。对于Cad-8抗原发现了最大程度的交叉反应性。用50ng/ml的较低抗原涂覆浓度以及较宽稀释系列的SDP051抗体，对Cad-11、Cad-8和Cad-18抗原重复该试验(图41B)。在该试验中，SDP051对于Cad-11具有6.8ng/ml的EC50，对于Cad-8具有1421ng/ml的EC50，结合差异为200倍以上。对于Cad-18的EC50由于观察到低结合水平而未能确定。这些结果证实SDP051对于Cad-11是高度特异性的。利用Cad-11 EC1结构域的序列的BLAST检索表明最接近的匹配在Cad-7、-8、-9、-11、-18、-20和-24抗原之间。利用在Cad-11 EC1结构域中阐明的六肽SDP051结合表位的BLAST检索表明没有其他已知的人类蛋白质具有该序列。
SDP051对于rhCad-11蛋白质具有亚纳摩尔的亲和力，其平衡解离常数(KD)为0.37nM(表4)。
表4：SDP051的物理性质
对芯片表面的表征和对照实验表明，以单一密度固定的rhCad-11适合于确定抗Cad-11抗体相互作用的动力学值。
对于动力学分析，基于关联的反应对照结果使用了2态反应模型(方程1，图42)，其表明一旦抗原结合至抗体上则发生另一时间依赖性的事件。因为rhCad-11是同型二聚的，因此含有两个相同的结合表位，有可能单独的mAb分子通过第一结合位点，而后通过两个结合位点顺序结合。
方程1：双态反应
在细胞结合试验中，证明SDP051和SDP071与表达Cad-11的细胞剂量依赖性地结合，而不与Cad-11阴性亲本细胞系结合(表43)。
确定SDP051对于Cad-11的特异性的可选方式为测量不同的钙粘着蛋白阻断SDP051与表达Cad-11的细胞结合的能力。这针对钙粘着蛋白-7、-8、-9、-18、-20、-24或-MN中的各种进行。只有Cad-11肽显著阻断SDP051与Cad-11+细胞的结合。分析结果在图44A-C中示出。
实施例15：SDP051，一种人源化抗Cad-11 EC1抗体，在使用人类细胞的试验中表现出低免疫原性
材料与方法
抗体的纯化
从生长至饱和的表达抗体的细胞的5L培养物中纯化SDP051。将上清液与细胞和碎片分离，调节至pH 7.4，过滤除菌，并以5ml/min的流速通过事先已用0.5M NaOH消毒的5mlHi-Trap Mab Select Sure蛋白A亲和柱(GE Healthcare，Amersham，UK)跑样。用100ml PBSpH 7.4洗涤该柱。用0.1M的柠檬酸钠pH 3.0洗脱抗体至5ml的级分中，并立即用0.25ml 1MTris-HCl中和各级分。根据280nm处的紫外吸收来监测各级分的蛋白质含量，并将含有蛋白质的级分合并，将缓冲液更换为10mM的醋酸钠pH 5.5并进行浓缩。使用16/60 SephacrylS200柱(GE Healthcare，Amersham，UK)通过尺寸排阻色谱法进一步纯化抗体。收集主峰级分、合并、过滤除菌，并使用-PTSTM(Charles River，Margate，UK)测定内毒素水平。将纯化的抗体保存于+4℃下。使用计算的摩尔消光系数通过紫外吸收来确定最终浓度，其中A280 1.0＝1.51mg/ml。之后将各种抗体在AIMV培养基(Invitrogen，Paisley，UK)中稀释至100μg/ml。
免疫原性分析
从自国家输血服务中心(Addenbrooke’s Hospital，Cambridge，UK)获得的健康供体血沉棕黄层(来自24小时内抽取的血液)中分离PBMC。通过(Axis-Shield，Dundee，UK)和密度离心从血沉棕黄层分离PBMC，并使用CD8+(StemCell Technologies Inc.，London，UK)耗尽CD8+ T细胞。通过使用基于Biotest SSP-PCR的组织分型试剂盒(Biotest，Landsteinerstraβe，Denmark)确认HLA-DR单元型并通过确定T细胞对“再现性”对照抗原(KLH：Pierce，Cramlington，UK)的反应来鉴定供体。之后将PBMC冷冻并储存在液氮中直至需要时。
将来自各个供体的PBMC解冻、计数并评估生存力。将细胞在室温AIMV培养基(Invitrogen，Paisley，UK)中复苏，并在AIMV中重悬浮至4-6×106PBMC/ml。对于各个供体，建立大批培养，在其中将总共1ml的增殖细胞储备液加入24孔板中。将总共1ml的各稀释试验样品加入PBMC中以得到每个样品50μg/ml的最终浓度。对于每个供体，还包括阳性对照(与100μg/ml KLH一起孵育的细胞)和阴性对照(仅用培养基孵育的细胞)。对于前4个供体，包括附加对照以测试试验样品对T细胞反应的调节，其中将试验样品和KLH两者加入PBMC中。这些样品与单独的KLH的对比可用于评估试验样品对增殖的影响。
将培养物在37℃、5％CO2中孵育共8天。在第5、6、7和8天，将各个孔中的细胞轻柔地重悬浮，并将3×100μl的等份转移至圆底96孔板的单个孔中。将培养物在100μl AIMV培养基中用1μCi[3H]-胸苷(PerkinWaltham，Massachusetts，USA)激发，并在使用Mach III细胞收获器收获至过滤垫(PerkinWaltham，Massachusetts，USA)上之前再孵育18小时。通过在Microplate Beta计数器上以paralux低背景计数模式进行MeltilexTM(PerkinWaltham，Massachusetts，USA)闪烁计数来确定各个孔的Cpm。
细胞增殖试验
对于增殖试验，事先确立等于或大于2的SI经验阈值(SI≥2.0)，由此将诱导超过该阈值的增殖反应的样品视为阳性(在包括时，突出显示≥1.90的边界SI)。广泛的试验开发和先前的研究已经表明，这是在不检测到大量假阳性响应的情况下允许最大灵敏度的最小信噪比阈值。对于增殖数据组(n＝3)，通过统计学和经验阈值来定义阳性反应：
1.通过使用非配对双样品student t检验比较测试孔与培养基对照孔的cpm获得的反应显著性(p＜0.05)。
2.等于或大于2的SI(SI≥2.0)。
结果
为了进一步评估潜在的免疫原性，在8天的试验中测试人源化抗Cad-11 EC1抗体SDP051诱导来自25个不同的人类T细胞供体的CD8耗尽的PBMC(CD4 T细胞)增殖的潜能。尽管嵌合SYN0014抗体(其为亲本鼠H1M1/SYN0012抗体的小鼠-人IgG4 Fc嵌合形式)在28％的供体中诱导增殖，但SDP051抗体不诱导任何T细胞供体的增殖。这些结果支持了较早的计算机发现，即SDP051具有低免疫原性特征。
来自使用对照嵌合SYN0014抗体和人源化SDP051抗体的免疫原性时间进程增殖试验的结果分别在图45A和图45B中示出。小鼠-人嵌合SYN0014抗体刺激25个供体的7个(28％的供体)中的反应，其中一个供体的反应为边界值(供体16，为1.98)，但是仍与背景显著不同(p＜0.05，图45A)。人源化抗体SDP051不在任何供体(25个中的0个或供体的0％)中刺激任何反应，表明其具有低潜在免疫原性。
实施例16：SDP051，一种人源化抗Cad-11 EC1抗体，抑制滑膜细胞侵入和MMP3表达
材料与方法
FLS侵入试验
将原代人FLS细胞系在FLS MM培养基(DMEM、10％FCS、1％青霉素-链霉素、1％L-谷氨酰胺、0.05％庆大霉素、1％HEPES)中培养直至90-100％汇合。在试验开始前一天，将FLS在无血清FLS培养基中进行血清饥饿24h。在试验当天将培养基从血清饥饿的FLS移除，并用0.05％的胰蛋白酶-EDTA将细胞从烧瓶中移出，之后用含有钙的HBS洗涤2次。将胰蛋白酶消化的FLS在MM培养基中重悬浮至4×105个细胞/ml。将制备的基质胶包被的插入物置于含有具有5％胎牛血清(FCS)的MM培养基的24孔板中，该FCS充当FLS的化学引诱物。在室的另一侧放置50μl含有6μg/ml或0.6μg/ml的SDP051(工作浓度的两倍)或6μg/ml的对照AC1-P抗体的MM培养基，之后向其中加入每个孔50μl的4×105个细胞/ml的细胞悬液。将含有FLS和抗体的室在37℃培养箱中孵育18h。
24小时后，将含有细胞的插入物在100％的甲醇中于-20℃固定30分钟，并将粘附在基质胶包被的膜内部的非侵入FLS用棉拭子去除。将该膜干燥，之后用碘化丙啶(PI)在室温下于黑暗中染色30min。去除PI染色剂并将插入物用D-葡萄糖(1mg/ml)洗涤，之后在黑暗中干燥。将膜切下并使用荧光显微镜在载玻片上成像，并对通过膜迁移的FLS的数目进行定量。
结果
Cad-11是FLS生物学所需的关键的钙粘着蛋白。因此，Cad-11拮抗剂有望抑制人原代FLS降解以及侵入分隔两个孔的基质胶层的能力。基质胶由多种细胞外基质蛋白质组成。FLS生物学的这种体外模型复制了FLS生物学的多个方面，包括它们降解以及钻入软骨中的能力。
SDP051显著地抑制FLS向基质胶中的侵入。与同种型对照抗体相比，0.3μg/ml的SDP051抗体足以抑制50％的原代人FLS向基质胶膜内的侵入(图46)。
FLS表达MMP3，其被认为是参与体内软骨和体外侵入试验中的基质胶的降解的酶之一。收获来自侵入试验的上清液，之后固定细胞，并在-80℃冷冻。将这些上清液解冻，并测试培养基中MMP3的存在。MMP3水平在含有对照抗体(AC1-P)处理的FLS的孔中显著增加，该FLS受到FCS刺激以迁移(图47)。MMP3水平在SDP051处理的、用FCS刺激的FLS中显著降低。与用对照抗体处理的细胞相比水平降低了约50％。
实施例17：SDP051，一种人源化抗Cad-11 EC1抗体，抑制关节炎动物模型中的关节炎症
为了在关节炎动物模型中测试SDP051抗体，选择了由D.Mathis和C.Benoist开发的关节炎K/BxN血清转移模型(Korganow AS，Ji H，Mangialaio S，Duchatelle V，PelandaR，Martin T等人.From systemic T cell self-reactivity to organ-specificautoimmune disease via immunoglobulins.Immunity 1999；10：451-61)。该模型呈现出广泛的滑膜炎，并因此是针对SDP051抗体的抗炎和关节保护性能的良好测试。
在第0天和第2天对六至八周龄的C57Bl/6小鼠腹膜内(IP)注射75μl KBN血清(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)。在第-1天、第0天、第1天、第2天、第4天和第6天用10mg/kg的SDP051或对照(AC1-P)对小鼠进行IP给药。在研究的第0天、第2天、第4天、第6天、第8天和第10天，在保持踝关节处于完全屈曲位的各个小鼠的两个后脚踝处，使用带弹簧的带表卡尺(7308型Mitutoyo测厚仪，Long Island Indicator Service，Hauppauge，NY)测量关节肿胀或踝最小厚度。确定在第0天和测量当天的关节厚度之间的差异。踝最小厚度随着研究进程的变化在图48中用曲线图表示。踝最小厚度得分的差异在第6天、第8天和第10天是显著的。在第10天，SDP051组中的踝关节肿胀比对照组中的肿胀低47％。
在第10天，从各个研究小鼠的末梢放血收集血清。将血清在干冰上冷冻，并储存在-80℃。通过使用Cad-11肽作为捕获试剂在ELISA中检测血清，之后用抗人IgG检测SDP051，由此确定SDP051的血清水平。SDP051可以很容易地在小鼠的血清中检测到(图49)。
在第10天时获取踝关节，并对组织病理学进行评估。软骨侵蚀、骨侵蚀以及炎症(细胞浸润)的严重程度由对研究组不知情的合格技术人员按照0-5的得分来评估。第10天的组织病理学结果总结于表5中。SDP051处理的动物显示软骨侵蚀得分下降35％，骨侵蚀得分下降27％，而炎症得分下降25％。
表5.第10天的组织病理学结果(KBN013)
*＝p＜0.05；±＝平均值的标准误差
实施例18：KBN关节炎模型中的SDP051剂量反应
小鼠在第0天和第2天给予KBN血清。小鼠在第0天、第2天、第4天和第6天腹膜内给予10mg/kg、3mg/kg或1mg/kg的SDP051或对照AC3-1-P。踝最小厚度的变化在图50中示出。在用3mg/kg或10mg/kg SDP051处理的小鼠中观察到踝最小厚度的降低趋势。在10mg/kg组中踝关节肿胀的减轻在第6天、第8天和第10天是显著的。在第10天，该组中的踝关节肿胀比对照组中的肿胀低44％。在一系列研究中，10mg/kg的SDP051显著地减轻了关节肿胀。在3mg/kg时具有减轻关节肿胀的趋势。
实施例19：SDP051降低与类风湿性关节炎的病理学有关的细胞因子
在第0天、第1天、第2天、第4天和第6天通过尾静脉静脉内给予小鼠10mg/kg的SDP051或AC3-1-P对照抗体。在第6天，SDP051组显示比对照组低33％的踝关节肿胀(表6)。对在第7天从这些小鼠获取的踝关节进行如下细胞因子分析：收获踝关节，去除皮肤和毛皮，并将关节在液氮中快速冷冻。之后将关节溶解在补充有2mM PMSF(Sigma产品编号P7626)和1×蛋白酶抑制剂混合物(Sigma产品编号P8340)、0.1M吲哚美辛的匀浆缓冲液(Affymetrix组织匀浆缓冲液(产品编号PC6002))中，并离心，并且在多重分析(OceanRidgeBiosciences)中测定所得到的上清液的各种细胞因子和趋化因子的水平。
SDP051处理组显示破骨细胞分化因子、可溶性核因子κB受体活化因子配体(sRANKL)、破骨/淋巴趋化因子、巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP1α)、单核细胞趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及白细胞趋化因子、活化调节的正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)的水平降低了29％-51％(表6)。对于IL-6或TNFα水平没有观察到影响或只有极小的影响。血管内皮生长因子(VEGF)观察到适度的增加，而在试验组中未检测到IL-23。
提出的SDP051的作用机制是，抗体结合小鼠关节中成纤维细胞样滑膜细胞上的Cad-11，引起促炎细胞因子和趋化因子表达的降低。确实，在SDP051处理的小鼠中，提示参与FLS生物学的几种白细胞趋化因子(包括MCP-1、RANTES和MIP1α)在RA患者的关节中减少(-Vicuna R，Gomez-Gaviro M，Dommguez-Luis M，Pec M，Gonzalez-Alvaro M，Alvaro-Gracia M和-Gonzalez F，2004 Arth&Rheum，50，第3866-3877页)(表6)。此外，sRANKL是成骨细胞发育的重要介质，且由各种炎性细胞因子在FLS上诱导RANKL的表达(Hashizume M，Hayakawa N和Mihara M，2008，Rheumatology 47第1635-1640页)。SDP051处理的小鼠显示在它们的关节处的sRANKL水平的降低(表6)。虽然这些效果适中，但这些变化的局部区域效应可以放大。
本文引用的所有专利、公开的申请以及参考文献的有关教导均通过引用整体并入本文。
虽然已经参考本发明的示例性实施方式对本发明进行了具体说明和描述，但是本领域技术人员应当理解，在不背离由随附的权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下，可在形式和细节上对其做出各种改变。

Claims (63)

1.一种特异性结合哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域并拮抗所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的人源化抗体，该抗体包含含有选自SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:69的氨基酸序列的抗体重链可变区。
2.权利要求1的人源化抗体，其中所述抗体抑制一种或多种钙粘着蛋白-11介导的活性，所述活性选自：所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质与一个或多个其他钙粘着蛋白-11蛋白质的结合、表达所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的细胞的聚集、酶表达的诱导、细胞因子表达的诱导、生长因子表达的诱导、表达所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的细胞的迁移以及软骨的破坏。
3.权利要求1的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:69。
4.权利要求1的人源化抗体，其中所述抗体包含含有选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:75的氨基酸序列的抗体轻链可变区。
5.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:61，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:71。
6.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:61，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:73。
7.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:61，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:75。
8.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:63，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:71。
9.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:63，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:73。
10.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:63，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:75。
11.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:65，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:71。
12.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:65，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:73。
13.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:65，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:75。
14.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:67，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:71。
15.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:67，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:73。
16.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:67，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:75。
17.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:71。
18.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:69，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:73。
19.权利要求4的人源化抗体，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:69，并且所述抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:75。
20.权利要求1的人源化抗体，其中所述抗体结合存在于SEQ ID NO:3中的表位。
21.权利要求1的人源化抗体，其中所述抗体结合存在于SEQ ID NO:10中的表位。
22.权利要求1的人源化抗体，其中所述抗体结合包含SEQ ID NO:11的表位。
23.权利要求1的人源化抗体，其中所述抗体是完整抗体。
24.权利要求1的人源化抗体，其中所述抗体是抗体片段。
25.权利要求24的人源化抗体，其中所述抗体片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2和scFv。
26.一种特异性结合哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域并拮抗所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的人源化抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO:69的抗体重链可变区以及含有SEQ ID NO:71的抗体轻链可变区。
27.权利要求26的人源化抗体，其中所述抗体抑制一种或多种钙粘着蛋白-11介导的活性，所述活性选自：所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质与一个或多个其他钙粘着蛋白-11蛋白质的结合、表达所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的细胞的聚集、酶表达的诱导、细胞因子表达的诱导、生长因子表达的诱导、表达所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的细胞的迁移以及软骨的破坏。
28.权利要求26的人源化抗体，其中所述抗体是完整抗体。
29.权利要求26的人源化抗体，其中所述抗体是抗体片段。
30.权利要求29的人源化抗体，其中所述抗体片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2和scFv。
31.一种药物组合物，其包含特异性结合哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域并拮抗所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的人源化抗体以及药学上可接受的载体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:69的抗体重链可变区并拮抗所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质。
32.权利要求31的药物组合物，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:71的抗体轻链可变区。
33.权利要求31的药物组合物，其中所述抗体抑制表达所述哺乳动物钙粘着蛋白-11的细胞的聚集。
34.权利要求31的药物组合物，其中所述抗体是完整抗体。
35.权利要求31的药物组合物，其中所述抗体是抗体片段。
36.权利要求31的药物组合物，其进一步包含缓解疾病的抗风湿病药。
37.权利要求36的药物组合物，其中所述缓解疾病的抗风湿病药是氨甲蝶呤。
38.权利要求31的药物组合物，进一步包含抗炎药。
39.权利要求38的药物组合物，其中所述抗炎药是NSAID或类固醇。
40.一种编码权利要求1的人源化抗体的分离的核酸。
41.权利要求40的分离的核酸，其中所述核酸存在于载体中。
42.一种表达权利要求1的人源化抗体的分离的细胞。
43.一种在需要的哺乳动物受试者中治疗钙粘着蛋白-11介导的病症的方法，该方法包括对所述受试者施用治疗有效量的特异性结合哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域的人源化抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:69的抗体重链可变区并拮抗所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质。
44.权利要求43的方法，其中表达所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的细胞的聚集在所述受试者的一个或多个关节中受到抑制。
45.权利要求43的方法，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:71的抗体轻链可变区。
46.权利要求43的方法，其中所述抗体是完整抗体。
47.权利要求43的方法，其中所述抗体是抗体片段。
48.权利要求43的方法，其中所述钙粘着蛋白-11介导的病症选自炎性疾病、纤维化和癌症。
49.权利要求43的方法，其中所述钙粘着蛋白-11介导的病症是选自类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、莱特尔氏综合征、强直性脊柱炎、幼年型慢性关节炎、慢性莱姆病以及与系统性红斑狼疮相关的关节炎的炎性关节病症。
50.权利要求43的方法，其中所述哺乳动物受试者是人。
51.权利要求43的方法，其中所述抗体是全身施用的。
52.权利要求43的方法，其中所述抗体是静脉内施用的。
53.权利要求43的方法，其中所述抗体是通过直接注射到关节中而施用的。
54.权利要求43的方法，其中所述抗体抑制在所述受试者的一个或多个关节中表达所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的细胞的迁移、粘附、软骨侵入或细胞间信号传导。
55.权利要求43的方法，其中所述抗体抑制所述受试者的一个或多个关节中表达所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的细胞中的选自胶原酶、丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶的酶的表达诱导或活性。
56.权利要求43的方法，其中所述抗体抑制所述受试者的一个或多个关节中表达所述哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的细胞中选自IL-6、IL-8、RANKL和TRANCE的细胞因子或生长因子的表达诱导或活性。
57.权利要求43的方法，其中所述抗体与选自缓解疾病的抗风湿病药和抗炎药的至少一种药剂联合施用。
58.人源化抗体在需要的哺乳动物受试者中治疗钙粘着蛋白-11介导的病症的用途，其中所述抗体特异性结合哺乳动物钙粘着蛋白-11蛋白质的EC1结构域，并且包含含有SEQ IDNO:69的抗体重链可变区。
59.权利要求58的用途，其中所述钙粘着蛋白-11介导的病症是炎性疾病。
60.权利要求59的用途，其中所述炎性疾病是炎性关节病症。
61.权利要求60的用途，其中所述炎性关节病症是类风湿性关节炎。
62.权利要求58的用途，其中所述钙粘着蛋白-11介导的病症是纤维化。
63.权利要求58的用途，其中所述钙粘着蛋白-11介导的病症是癌症。
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