CN113072633A

CN113072633A - Cdh11截短型变体及其应用

Info

Publication number: CN113072633A
Application number: CN202110430086.1A
Authority: CN
Inventors: 韩荣飞; 郗雪艳; 郭阳; 杜伯雨; 袁佩佩; 李平飞; 朱敬
Original assignee: Hubei University of Medicine
Current assignee: Hubei University of Medicine
Priority date: 2021-04-21
Filing date: 2021-04-21
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2041-04-21
Also published as: CN113072633B

Abstract

本发明涉及一种CDH11截短型变体及其应用，CDH11截短型变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明根据CDH11的分子结构和作用特点，发明并制备了仅含有CDH11胞外段的截短型变体，一系列实验结果显示该截短型变体能浓度依赖性地抑制CDH11的功能，具有降低食管鳞癌细胞增殖的能力，显示出抗肿瘤效应。该截短型变体干扰细胞间CDH11蛋白的相互作用，进而影响到CDH11蛋白介导的细胞增殖等功能，可用作CDH11蛋白的抑制剂，并用于制备癌症的治疗药物。

Description

CDH11截短型变体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种CDH11截短型变体及其应用。

背景技术

钙粘蛋白代表一类细胞粘附分子(cell adhesion molecules，CAM)，其通过形成细胞间连接或粘附连接(AJ)来介导细胞之间的Ca²⁺依赖性嗜同性相互作用。钙黏蛋白的表达具有组织特异性，神经元细胞主要表达N-钙粘蛋白(CDH2)，而上皮细胞高度表达E-钙粘蛋白(CDH1)，VE-钙粘蛋白(CDH5)在内皮细胞中表达，OB-钙粘蛋白(CDH11)在成骨细胞中表达。通过形成同型二聚体，钙粘蛋白以拉链样结构聚集，而它们的细胞内结构域与α-连环蛋白和β-连环蛋白相互作用并锚定到肌动蛋白细胞骨架。这些相互作用在维持组织结构和细胞极性，以及限制细胞运动和增殖等方面发挥作用。

不同的钙黏蛋白在癌症的发生和发展中起着不同的作用。大量研究表明CDH1具有很强的抑制癌细胞侵袭和转移的能力，这可能与CDH1能结合β-连环蛋白并抑制后者向细胞核的移位从而减弱Wnt信号途径有关。与此相反，CDH3则在结肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌等肿瘤中高表达，在甲状腺癌和胰腺癌细胞中下调或阻断CDH3能抑制肿瘤细胞的迁移和增殖能力。Cadherin-11(CDH11，OB-钙粘蛋白)基因是位于人染色体16q22.1上，其编码产物含有796个氨基酸，分子量约为88kDa。同钙黏蛋白家族的大多数成员类似，CDH11为单次跨膜蛋白，其胞外段为5个连续的EC结构域(Extracellular Cadherin domain)，从N-端开始依次记为EC1-EC5。两个细胞表面的CDH11分子的EC1结构域中的一段β-折叠可以相互交换嵌入形成同二聚体。相邻细胞上许多这样的CDH11同二聚体组成拉链样结构从而形成稳定的粘附作用，使得CDH11在细胞增殖、迁移、分化和组织形态建成等过程中发挥重要功能。尽管有少数研究指出敲低CDH11的表达可以促进胃癌细胞的迁移能力，但是更多的研究指出CDH11是一个促癌基因。例如，Satriyo等发现在三阴性乳腺癌和基底型(Basal-like)乳腺癌中，高表达CDH11的患者总体生存期更短。Birtolo等发现在胰腺癌中CDH11高表达，并且在胰腺癌细胞中敲低CDH11的表达能降低癌细胞的迁移能力。Chu等发现CDH11在前列腺癌中高表达并且能促进癌细胞向骨的转移。发明人的研究结果也表明CDH11在食管鳞癌组织中高表达，且其表达水平与患者总体生存期呈负相关。Lee等制备了能特异性结合CDH11的小鼠单克隆抗体，动物实验结果显示这种单克隆抗体能抑制前列腺癌细胞向骨的转移。这些大量的研究表明在许多类型肿瘤中抑制CDH11的表达或阻断其功能有望成为一种可行的治疗方法，但是目前缺乏能用于人体的、可有效地抑制或阻断CDH11蛋白功能的药物。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够应用于人体的、有效地抑制或阻断CDH11蛋白功能的分子。

一种CDH11截短型变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种核酸分子，其编码如上所述的CDH11截短型变体。

在其中一个实施例中，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的核酸分子。

在其中一个实施例中，所述重组载体基于pCDH-CMV-MCS-EF1-puro构建得到。

本发明还提供了一种宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸分子。

在其中一个实施例中，所述宿主细胞为HEK293细胞。

本发明还提供了一种如上所述的CDH11截短型变体、核酸分子、重组载体或宿主细胞在制备用于治疗癌症的产品中的应用，所述癌症中CDH11高表达并为所述癌症的治疗靶点。

在其中一个实施例中，所述癌症包括鳞状食道癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌。

本发明还提供了一种CDH11蛋白抑制剂，其包括如上所述的CDH11截短型变体，以及药学上可接受的助剂。

在其中一个实施例中，所述助剂包括赋形剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂和着色剂中的一种或多种。

本发明还提供了一种如上所述的CDH11截短型变体的制备方法，包括以下步骤：在适宜的条件下培养如上所述的宿主细胞，收集培养液和/或所述宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化得到所述CDH11截短型变体。

发明人在研究中发现，CDH11在食管鳞癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，并且CDH11高表达的食管鳞癌患者生存期要显著短于CDH11低表达的患者，体外细胞实验证实CDH11具有促进食管鳞癌细胞增殖的能力。因此，在食管鳞癌中CDH11起着促进癌症发生发展的作用，CDH11可以作为食管鳞癌和其它肿瘤的潜在治疗靶点。进一步地，发明人根据CDH11的分子结构和作用特点，构建并制备了仅含有CDH11胞外段的截短型变体，一系列实验结果显示该截短型变体能浓度依赖性地抑制CDH11的功能，具有降低食管鳞癌细胞增殖的能力，显示出抗肿瘤效应。该截短型变体干扰细胞间正常CDH11蛋白的相互作用，进而影响到CDH11蛋白介导的细胞增殖等功能，可用作CDH11蛋白的抑制剂，并用于制备癌症的治疗药物。

附图说明

图1为一个典型食管鳞癌患者癌组织CDH11的免疫组化染色；

图2为一个典型食管鳞癌患者邻近正常组织CDH11的免疫组化染色；

图3为实施例1中12例食管鳞癌患者CDH11的免疫组化染色的最终得分结果；染色结果由三位病理专家独立审阅评分，每张组织切片的得分＝染色强度×阳性肿瘤细胞比例，染色强度按照阴性、弱、中等和强分别给予0～3分，三位病理专家独立评分的均值作为每张组织切片的最终得分，虚连线示同一患者，Wilcoxon检验p＝0.0199；

图4为实施例1中77例食管鳞癌患者CDH11高表达组和CDH11低表达组的总体生存期对比图；其中，按CDH11表达水平评分从高到低排序的77例切片的前四分之一和后四分之一分别为CDH11高表达组(CDH11-High)和CDH11低表达组(CDH11-Low)；

图5为实施例2中过表达CDH11和敲低CDH11的KYSE450和EC9706及各自的对照细胞株的增殖能力对比图；

图6为实施例3中过表达CDH11截短型变体的KYSE450和EC9706及各自的对照细胞株的增殖能力对比图；

图7为实施例4中CDH11ECD-his蛋白纯化效果图；其中，Lane 1为全细胞裂解液，Lane 2为上样流穿液，Lane 3为第一次洗涤液，Lane 4为第四次洗涤液，Lane 5为洗脱液，Lane 5箭头所指处为最终得到的CDH11ECD-his蛋白；

图8为实施例5中添加了不同浓度CDH11ECD-his的KYSE450和EC9706细胞株的增殖能力对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语解释

“食管鳞癌”即鳞状食道癌，食道癌是一种常见的上消化道恶性肿瘤，食道癌的发病男性高于女性，其确切病因尚不清楚，但是吸烟和重度饮酒已证明是其重要原因。目前临床上采用国际抗癌联盟食管分段标准，可将食道癌分为颈段、胸段和腹段。胸中段食道癌较为多见，下段次之，上段较少。高发区以鳞癌为主约占80％以上。

“载体(vector)”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但是不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。

“宿主细胞”是指可用于导入载体的细胞，其包括但是不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

本发明一实施例的CDH11截短型变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

发明人在研究中发现，CDH11在食管鳞癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，并且CDH11高表达的食管鳞癌患者生存期要显著短于CDH11低表达的患者，体外细胞实验证实CDH11具有促进食管鳞癌细胞增殖的能力。因此，在食管鳞癌中CDH11起着促进癌症发生发展的作用，CDH11可以作为食管鳞癌和其它肿瘤的潜在治疗靶点。进一步地，发明人根据CDH11的分子结构和作用特点，构建并制备了仅含有CDH11胞外段的截短型变体，一系列实验结果显示该截短型变体能浓度依赖性地抑制CDH11的功能，具有降低食管鳞癌细胞增殖的能力，显示出抗肿瘤效应。该截短型变体干扰细胞间CDH11蛋白的相互作用，进而影响到CDH11蛋白介导的细胞增殖等功能，可用作CDH11蛋白的抑制剂，并用于制备癌症的治疗药物。

本发明一实施例的核酸分子，其编码如上所述的CDH11截短型变体。

在一个具体示例中，该核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。可以理解，由于密码子的简并性，能够表达同一蛋白的核酸序列具有多种形式，以上为经过密码子优化的核酸序列，但是不限于此。

本发明一实施例的重组载体，其含有如上所述的核酸分子。

可以理解，载体还可包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子等及其他表达控制元件(例如转录终止信号、或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

在一个具体示例中，重组载体基于pCDH-CMV-MCS-EF1-puro构建得到。可以理解，载体的具体种类并不限于此，可根据具体需要进行选择。

本发明一实施例的宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸分子。

在一个具体示例中，宿主细胞为HEK293细胞。可以理解，宿主细胞的类型不限于此，可根据需要选择。

本发明一实施例的如上所述的CDH11截短型变体、核酸分子、重组载体或宿主细胞在制备用于治疗癌症的产品中的应用，所述癌症中CDH11高表达并为所述癌症的治疗靶点。

在一个具体示例中，上述癌症包括但是不限于鳞状食道癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌。

本发明一实施例的CDH11截短型变体的制备方法，包括以下步骤：在适宜的条件下培养上述宿主细胞，收集培养液和/或宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化得到CDH11截短型变体。

本发明一实施例的CDH11蛋白抑制剂，其包括上述CDH11截短型变体，以及药学上可接受的助剂。

在一个具体示例中，上述助剂包括赋形剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂和着色剂中的一种或多种。

CDH11在食管鳞癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，并且CDH11高表达的食管鳞癌患者生存期要显著短于CDH11低表达的患者，体外细胞实验证实CDH11具有促进食管鳞癌细胞增殖的能力。因此，在食管鳞癌中CDH11起着促进癌症发生发展的作用，CDH11可以作为食管鳞癌和其它肿瘤的潜在治疗靶点。发明人根据CDH11的分子结构和作用特点，构建并制备了仅含有CDH11胞外段的截短型变体，并通过一系列实验结果证明该截短型变体能浓度依赖性地抑制CDH11的功能，具有降低食管鳞癌细胞增殖的能力，显示出抗肿瘤效应。该截短型变体能够干扰细胞间CDH11蛋白的相互作用，进而影响到CDH11蛋白介导的细胞增殖等功能，可用作CDH11蛋白的抑制剂，并用于制备癌症的治疗药物，具有广阔的应用前景。

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1 CDH11在食管鳞癌组织中高表达且与不良预后有关

收集12例食管鳞癌患者手术切除的癌组织和癌旁组织(距离肿瘤边缘2cm以上)免疫组化(IHC)染色确定CDH11的表达水平。所有患者手术前均未接受放化疗治疗。所用抗CDH11单克隆抗体购自abcam公司。如图1和图2所示，一个典型食管鳞癌患者CDH11的免疫组化染色，图1为癌组织，图2为邻近的正常组织。染色结果由三位病理专家独立审阅评分，每张组织切片的得分＝染色强度×阳性肿瘤细胞比例，染色强度按照阴性、弱、中等、强分别给予0～3分，三位病理专家独立评分的均值作为每张组织切片的最终得分。结果显示，在12例食管鳞癌患者中有8例出现癌组织CDH11染色得分高于邻近的癌旁组织，如图3所示，虚连线示同一患者。Wilcoxon检验p＝0.0199。

收集77例食管鳞癌患者手术切除的癌组织，免疫组化染色确定CDH11的表达。所有患者手术前均未接受放化疗治疗。所用抗CDH11单克隆抗体购自abcam公司。染色结果由三位病理专家独立审阅评分，每张组织切片的得分＝染色强度×阳性肿瘤细胞比例，染色强度按照阴性、弱、中等、强分别给予0～3分，三位病理专家独立评分的均值作为每张组织切片的最终得分。将77例切片按CDH11表达水平评分从高到低排序，取前四分之一和后四分之一作为CDH11高表达组(CDH11-High)和CDH11低表达组(CDH11-Low)，比较两组患者的总体生存期。统计结果如图4所示，低表达CDH11的食管鳞癌患者总体生存期显著长于高表达CDH11的患者。

实施例2体外实验确定CDH11促进食管鳞癌细胞的增殖能力

CDH11过表达质粒pCDH-CDH11的构建：采用基因合成方法得到CDH11基因的编码区，其序列如下所示，两端下划线为分别为Xba I(TCTAGA)和Bamh I(GGATCC)酶切位点，合成的基因连接到经Xba I和Bamh I双酶切的载体pCDH-CMV-MCS-EF1-puro，得到CDH11的过表达质粒pCDH-CDH11。

CDH11基因的核苷酸序列为：

TCTAGAATGAAGGAGAACTACTGTTTACAAGCCGCCCTGGTGTGCCTGGGCATGCTGTGCCACAGCCATGCCTTTGCCCCAGAGCGGCGGGGGCACCTGCGGCCCTCCTTCCATGGGCACCATGAGAAGGGCAAGGAGGGGCAGGTGCTACAGCGCTCCAAGCGTGGCTGGGTCTGGAACCAGTTCTTCGTGATAGAGGAGTACACCGGGCCTGACCCCGTGCTTGTGGGCAGGCTTCATTCAGATATTGACTCTGGTGATGGGAACATTAAATACATTCTCTCAGGGGAAGGAGCTGGAACCATTTTTGTGATTGATGACAAATCAGGGAACATTCATGCCACCAAGACGTTGGATCGAGAAGAGAGAGCCCAGTACACGTTGATGGCTCAGGCGGTGGACAGGGACACCAATCGGCCACTGGAGCCACCGTCGGAATTCATTGTCAAGGTCCAGGACATTAATGACAACCCTCCGGAGTTCCTGCACGAGACCTATCATGCCAACGTGCCTGAGAGGTCCAATGTGGGAACGTCAGTAATCCAGGTGACAGCTTCAGATGCAGATGACCCCACTTATGGAAATAGCGCCAAGTTAGTGTACAGTATCCTCGAAGGACAACCCTATTTTTCGGTGGAAGCACAGACAGGTATCATCAGAACAGCCCTACCCAACATGGACAGGGAGGCCAAGGAGGAGTACCACGTGGTGATCCAGGCCAAGGACATGGGTGGACATATGGGCGGACTCTCAGGGACAACCAAAGTGACGATCACACTGACCGATGTCAATGACAACCCACCAAAGTTTCCGCAGAGCGTATACCAGATGTCTGTGTCAGAAGCAGCCGTCCCTGGGGAGGAAGTAGGAAGAGTGAAAGCTAAAGATCCAGACATTGGAGAAAATGGCTTAGTCACATACAATATTGTTGATGGAGATGGTATGGAATCGTTTGAAATCACAACGGACTATGAAACACAGGAGGGGGTGATAAAGCTGAAAAAGCCTGTAGATTTTGAAACCAAAAGAGCCTATAGCTTGAAGGTAGAGGCAGCCAACGTGCACATCGACCCGAAGTTTATCAGCAATGGCCCTTTCAAGGACACTGTGACCGTCAAGATCTCAGTAGAAGATGCTGATGAGCCCCCTATGTTCTTGGCCCCAAGTTACATCCACGAAGTCCAAGAAAATGCAGCTGCTGGCACCGTGGTTGGGAGAGTGCATGCCAAAGACCCTGATGCTGCCAACAGCCCGATAAGGTATTCCATCGATCGTCACACTGACCTCGACAGATTTTTCACTATTAATCCAGAGGATGGTTTTATTAAAACTACAAAACCTCTGGATAGAGAGGAAACAGCCTGGCTCAACATCACTGTCTTTGCAGCAGAAATCCACAATCGGCATCAGGAAGCCAAAGTCCCAGTGGCCATTAGGGTCCTTGATGTCAACGATAATGCTCCCAAGTTTGCTGCCCCTTATGAAGGTTTCATCTGTGAGAGTGATCAGACCAAGCCACTTTCCAACCAGCCAATTGTTACAATTAGTGCAGATGACAAGGATGACACGGCCAATGGACCAAGATTTATCTTCAGCCTACCCCCTGAAATCATTCACAATCCAAATTTCACAGTCAGAGACAACCGAGATAACACAGCAGGCGTGTACGCCCGGCGTGGAGGGTTCAGTCGGCAGAAGCAGGACTTGTACCTTCTGCCCATAGTGATCAGCGATGGCGGCATCCCGCCCATGAGTAGCACCAACACCCTCACCATCAAAGTCTGCGGGTGCGACGTGAACGGGGCACTGCTCTCCTGCAACGCAGAGGCCTACATTCTGAACGCCGGCCTGAGCACAGGCGCCCTGATCGCCATCCTCGCCTGCATCGTCATTCTCCTGGTCATTGTAGTATTGTTTGTGACCCTGAGAAGGCAAAAGAAAGAACCACTCATTGTCTTTGAGGAAGAAGATGTCCGTGAGAACATCATTACTTATGATGATGAAGGGGGTGGGGAAGAAGACACAGAAGCCTTTGATATTGCCACCCTCCAGAATCCTGATGGTATCAATGGATTTATCCCCCGCAAAGACATCAAACCTGAGTATCAGTACATGCCTAGACCTGGGCTCCGGCCAGCGCCCAACAGCGTGGATGTCGATGACTTCATCAACACGAGAATACAGGAGGCAGACAATGACCCCACGGCTCCTCCTTATGACTCCATTCAAATCTACGGTTATGAAGGCAGGGGCTCAGTGGCCGGGTCCCTGAGCTCCCTAGAGTCGGCCACCACAGATTCAGACTTGGACTATGATTATCTACAGAACTGGGGACCTCGTTTTAAGAAACTAGCAGATTTGTATGGTTCCAAAGACACTTTTGATGACGATTCTTAAGGATCC

其表达的CDH11蛋白的氨基酸序列为：

MKENYCLQAALVCLGMLCHSHAFAPERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRSKRGWVWNQFFVIEEYTGPDPVLVGRLHSDIDSGDGNIKYILSGEGAGTIFVIDDKSGNIHATKTLDREERAQYTLMAQAVDRDTNRPLEPPSEFIVKVQDINDNPPEFLHETYHANVPERSNVGTSVIQVTASDADDPTYGNSAKLVYSILEGQPYFSVEAQTGIIRTALPNMDREAKEEYHVVIQAKDMGGHMGGLSGTTKVTITLTDVNDNPPKFPQSVYQMSVSEAAVPGEEVGRVKAKDPDIGENGLVTYNIVDGDGMESFEITTDYETQEGVIKLKKPVDFETKRAYSLKVEAANVHIDPKFISNGPFKDTVTVKISVEDADEPPMFLAPSYIHEVQENAAAGTVVGRVHAKDPDAANSPIRYSIDRHTDLDRFFTINPEDGFIKTTKPLDREETAWLNITVFAAEIHNRHQEAKVPVAIRVLDVNDNAPKFAAPYEGFICESDQTKPLSNQPIVTISADDKDDTANGPRFIFSLPPEIIHNPNFTVRDNRDNTAGVYARRGGFSRQKQDLYLLPIVISDGGIPPMSSTNTLTIKVCGCDVNGALLSCNAEAYILNAGLSTGALIAILACIVILLVIVVLFVTLRRQKKEPLIVFEEEDVRENIITYDDEGGGEEDTEAFDIATLQNPDGINGFIPRKDIKPEYQYMPRPGLRPAPNSVDVDDFINTRIQEADNDPTAPPYDSIQIYGYEGRGSVAGSLSSLESATTDSDLDYDYLQNWGPRFKKLADLYGSKDTFDDDS

将pCDH-CDH11与包装质粒和包膜质粒共转染HEK239细胞制备表达CDH11的慢病毒。以pCDH空载体为对照质粒制备对照慢病毒。将食管鳞癌细胞KYSE450接种在60mm培养皿中进行CDH11慢病毒或者对照慢病毒感染，并加入嘌呤霉素筛选1周，得到过表达CDH11的KYSE450细胞株及KYSE450对照细胞株。将食管鳞癌细胞EC9706接种在60mm培养皿中进行CDH11慢病毒或者对照慢病毒感染，并加入嘌呤霉素筛选1周，得到过表达CDH11的EC9706细胞株及EC9706对照细胞株。

构建干扰人CDH11基因表达的短发卡RNA质粒pLKO-shCDH11-1和pLKO-shCDH11-2。合成如下的寡聚DNA序列：

经退火后成为带有粘末端的双链DNA，与经EcoR I和Age I双酶切的载体质粒pLKO.1相连接，成为能靶向抑制CDH11表达的短发卡干扰质粒pLKO.1-shCDH11-1，其靶向CDH11 mRNA的区域如下划线部分所示。

合成如下的寡聚DNA序列：

经退火后成为带有粘末端的双链DNA，与经EcoR I和Age I双酶切的载体质粒pLKO.1相连接，成为能靶向抑制CDH11表达的短发卡干扰质粒pLKO.1-shCDH11-2，其靶向CDH11 mRNA的区域如下划线部分所示。

将pLKO-shCDH11-1与包装质粒和包膜质粒共转染HEK239细胞，在HEK293细胞中包装制备靶向抑制CDH11表达的慢病毒shCDH11-1。将食管鳞癌细胞KYSE450接种在60mm培养皿中，加入慢病毒shCDH11-1进行感染，并加入嘌呤霉素筛选1周，得到敲低CDH11表达的食管鳞癌细胞KYSE450-shCDH11-1。将pLKO-shCDH11-2与包装质粒和包膜质粒共转染HEK239细胞，在HEK293细胞中包装制备靶向抑制CDH11表达的慢病毒shCDH11-2。将食管鳞癌细胞KYSE450接种在60mm培养皿中，加入慢病毒shCDH11-2进行感染，并加入嘌呤霉素筛选1周，得到敲低CDH11表达的食管鳞癌细胞KYSE450-shCDH11-2。将食管鳞癌细胞KYSE450-shCDH11-1和KYSE450-shCDH11-2按相等的细胞数目混合，得到CDH11敲低的KYSE450细胞。

将食管鳞癌细胞EC9706接种在60mm培养皿中，加入慢病毒shCDH11-1进行感染，并加入嘌呤霉素筛选1周，得到敲低CDH11表达的食管鳞癌细胞EC9706-shCDH11-1。将食管鳞癌细胞EC9706接种在60mm培养皿中，加入慢病毒shCDH11-2进行感染，并加入嘌呤霉素筛选1周，得到敲低CDH11表达的食管鳞癌细胞EC9706-shCDH11-2。将食管鳞癌细胞EC9706-shCDH11-1和EC9706-shCDH11-2按相等的细胞数目混合，得到CDH11敲低的EC9706细胞。

将过表达CDH11的KYSE450细胞株、CDH11敲低的KYSE450以及对照细胞分别接种到六孔板中，接种密度为1000个细胞/孔，培养10天后进行结晶紫染色。由图5可见，过表达CDH11可明显促进食管鳞癌细胞KYSE450的增殖能力，而敲低CDH11的表达则抑制KYSE450的增殖能力。将过表达CDH11的EC9706细胞株、CDH11敲低的EC9706以及对照细胞分别接种到六孔板中，接种密度为1000个细胞/孔，培养10天后进行结晶紫染色。由图5可见，过表达CDH11可明显促进食管鳞癌细胞EC9706的增殖能力，而敲低CDH11的表达则抑制EC9706的增殖能力。

实施例3过表达CDH11截短型变体抑制食管鳞癌细胞的增殖能力

人CDH11为单次跨膜分子，包含信号肽在内的全长蛋白含796个氨基酸。从N端开始，第618～640位氨基酸为跨膜区。构建CDH11截短型变体的表达载体pCDH-CDH11-ECD，其编码产物为CDH11蛋白第1～617位氨基酸即胞外段区域(Extracellular Domain)。具体方法如下所记载。

CDH11截短型变体表达质粒的构建：以pCDH-CDH11质粒为模板，用以下引物对进行PCR扩增。

引物1	CG<u>TCTAGA</u>ATGAAGGAGAAC
		引物2	CC<u>GGATCC</u>TTATGTGCTCAGGCCGGCGTT

扩增产物的核苷酸序列为：

CGTCTAGAATGAAGGAGAACTACTGTTTACAAGCCGCCCTGGTGTGCCTGGGCATGCTGTGCCACAGCCATGCCTTTGCCCCAGAGCGGCGGGGGCACCTGCGGCCCTCCTTCCATGGGCACCATGAGAAGGGCAAGGAGGGGCAGGTGCTACAGCGCTCCAAGCGTGGCTGGGTCTGGAACCAGTTCTTCGTGATAGAGGAGTACACCGGGCCTGACCCCGTGCTTGTGGGCAGGCTTCATTCAGATATTGACTCTGGTGATGGGAACATTAAATACATTCTCTCAGGGGAAGGAGCTGGAACCATTTTTGTGATTGATGACAAATCAGGGAACATTCATGCCACCAAGACGTTGGATCGAGAAGAGAGAGCCCAGTACACGTTGATGGCTCAGGCGGTGGACAGGGACACCAATCGGCCACTGGAGCCACCGTCGGAATTCATTGTCAAGGTCCAGGACATTAATGACAACCCTCCGGAGTTCCTGCACGAGACCTATCATGCCAACGTGCCTGAGAGGTCCAATGTGGGAACGTCAGTAATCCAGGTGACAGCTTCAGATGCAGATGACCCCACTTATGGAAATAGCGCCAAGTTAGTGTACAGTATCCTCGAAGGACAACCCTATTTTTCGGTGGAAGCACAGACAGGTATCATCAGAACAGCCCTACCCAACATGGACAGGGAGGCCAAGGAGGAGTACCACGTGGTGATCCAGGCCAAGGACATGGGTGGACATATGGGCGGACTCTCAGGGACAACCAAAGTGACGATCACACTGACCGATGTCAATGACAACCCACCAAAGTTTCCGCAGAGCGTATACCAGATGTCTGTGTCAGAAGCAGCCGTCCCTGGGGAGGAAGTAGGAAGAGTGAAAGCTAAAGATCCAGACATTGGAGAAAATGGCTTAGTCACATACAATATTGTTGATGGAGATGGTATGGAATCGTTTGAAATCACAACGGACTATGAAACACAGGAGGGGGTGATAAAGCTGAAAAAGCCTGTAGATTTTGAAACCAAAAGAGCCTATAGCTTGAAGGTAGAGGCAGCCAACGTGCACATCGACCCGAAGTTTATCAGCAATGGCCCTTTCAAGGACACTGTGACCGTCAAGATCTCAGTAGAAGATGCTGATGAGCCCCCTATGTTCTTGGCCCCAAGTTACATCCACGAAGTCCAAGAAAATGCAGCTGCTGGCACCGTGGTTGGGAGAGTGCATGCCAAAGACCCTGATGCTGCCAACAGCCCGATAAGGTATTCCATCGATCGTCACACTGACCTCGACAGATTTTTCACTATTAATCCAGAGGATGGTTTTATTAAAACTACAAAACCTCTGGATAGAGAGGAAACAGCCTGGCTCAACATCACTGTCTTTGCAGCAGAAATCCACAATCGGCATCAGGAAGCCAAAGTCCCAGTGGCCATTAGGGTCCTTGATGTCAACGATAATGCTCCCAAGTTTGCTGCCCCTTATGAAGGTTTCATCTGTGAGAGTGATCAGACCAAGCCACTTTCCAACCAGCCAATTGTTACAATTAGTGCAGATGACAAGGATGACACGGCCAATGGACCAAGATTTATCTTCAGCCTACCCCCTGAAATCATTCACAATCCAAATTTCACAGTCAGAGACAACCGAGATAACACAGCAGGCGTGTACGCCCGGCGTGGAGGGTTCAGTCGGCAGAAGCAGGACTTGTACCTTCTGCCCATAGTGATCAGCGATGGCGGCATCCCGCCCATGAGTAGCACCAACACCCTCACCATCAAAGTCTGCGGGTGCGACGTGAACGGGGCACTGCTCTCCTGCAACGCAGAGGCCTACATTCTGAACGCCGGCCTGAGCACATAAGGATCCGG

将该产物用Xba I和Bamh I双酶切，再与同样经Xba I和Bamh I双酶切的载体pCDH-CMV-MCS-EF1-puro相连，得到CDH11截短型变体的表达质粒pCDH-CDH11-ECD。其表达蛋白的氨基酸序列为：

MKENYCLQAALVCLGMLCHSHAFAPERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRSKRGWVWNQFFVIEEYTGPDPVLVGRLHSDIDSGDGNIKYILSGEGAGTIFVIDDKSGNIHATKTLDREERAQYTLMAQAVDRDTNRPLEPPSEFIVKVQDINDNPPEFLHETYHANVPERSNVGTSVIQVTASDADDPTYGNSAKLVYSILEGQPYFSVEAQTGIIRTALPNMDREAKEEYHVVIQAKDMGGHMGGLSGTTKVTITLTDVNDNPPKFPQSVYQMSVSEAAVPGEEVGRVKAKDPDIGENGLVTYNIVDGDGMESFEITTDYETQEGVIKLKKPVDFETKRAYSLKVEAANVHIDPKFISNGPFKDTVTVKISVEDADEPPMFLAPSYIHEVQENAAAGTVVGRVHAKDPDAANSPIRYSIDRHTDLDRFFTINPEDGFIKTTKPLDREETAWLNITVFAAEIHNRHQEAKVPVAIRVLDVNDNAPKFAAPYEGFICESDQTKPLSNQPIVTISADDKDDTANGPRFIFSLPPEIIHNPNFTVRDNRDNTAGVYARRGGFSRQKQDLYLLPIVISDGGIPPMSSTNTLTIKVCGCDVNGALLSCNAEAYILNAGLST

将pCDH-CDH11-ECD质粒用脂质体法分别转染入食管鳞癌细胞株KYSE450和EC9706中，对照质粒为pCDH空载体。加嘌呤霉素筛选1周后接种到六孔板中，每孔接种2000个细胞，培养10天后进行结晶紫染色。由图6可见，过表达CDH11截短型变体具有抑制食管鳞癌细胞增殖的作用。

实施例4 CDH11截短型变体的真核表达纯化

构建CDH11截短型变体的表达载体pCDH-CDH11ECD-his，其表达产物为CDH11全长蛋白的第1～617位氨基酸，且在之后连接6个组氨酸以便纯化，纯化产物记为CDH11ECD-his。质粒构建及蛋白表达、纯化方法如下所记载。

以pCDH-CDH11质粒为模板，用以下引物对进行PCR扩增。

扩增产物的核苷酸序列为：

CGTCTAGAATGAAGGAGAACTACTGTTTACAAGCCGCCCTGGTGTGCCTGGGCATGCTGTGCCACAGCCATGCCTTTGCCCCAGAGCGGCGGGGGCACCTGCGGCCCTCCTTCCATGGGCACCATGAGAAGGGCAAGGAGGGGCAGGTGCTACAGCGCTCCAAGCGTGGCTGGGTCTGGAACCAGTTCTTCGTGATAGAGGAGTACACCGGGCCTGACCCCGTGCTTGTGGGCAGGCTTCATTCAGATATTGACTCTGGTGATGGGAACATTAAATACATTCTCTCAGGGGAAGGAGCTGGAACCATTTTTGTGATTGATGACAAATCAGGGAACATTCATGCCACCAAGACGTTGGATCGAGAAGAGAGAGCCCAGTACACGTTGATGGCTCAGGCGGTGGACAGGGACACCAATCGGCCACTGGAGCCACCGTCGGAATTCATTGTCAAGGTCCAGGACATTAATGACAACCCTCCGGAGTTCCTGCACGAGACCTATCATGCCAACGTGCCTGAGAGGTCCAATGTGGGAACGTCAGTAATCCAGGTGACAGCTTCAGATGCAGATGACCCCACTTATGGAAATAGCGCCAAGTTAGTGTACAGTATCCTCGAAGGACAACCCTATTTTTCGGTGGAAGCACAGACAGGTATCATCAGAACAGCCCTACCCAACATGGACAGGGAGGCCAAGGAGGAGTACCACGTGGTGATCCAGGCCAAGGACATGGGTGGACATATGGGCGGACTCTCAGGGACAACCAAAGTGACGATCACACTGACCGATGTCAATGACAACCCACCAAAGTTTCCGCAGAGCGTATACCAGATGTCTGTGTCAGAAGCAGCCGTCCCTGGGGAGGAAGTAGGAAGAGTGAAAGCTAAAGATCCAGACATTGGAGAAAATGGCTTAGTCACATACAATATTGTTGATGGAGATGGTATGGAATCGTTTGAAATCACAACGGACTATGAAACACAGGAGGGGGTGATAAAGCTGAAAAAGCCTGTAGATTTTGAAACCAAAAGAGCCTATAGCTTGAAGGTAGAGGCAGCCAACGTGCACATCGACCCGAAGTTTATCAGCAATGGCCCTTTCAAGGACACTGTGACCGTCAAGATCTCAGTAGAAGATGCTGATGAGCCCCCTATGTTCTTGGCCCCAAGTTACATCCACGAAGTCCAAGAAAATGCAGCTGCTGGCACCGTGGTTGGGAGAGTGCATGCCAAAGACCCTGATGCTGCCAACAGCCCGATAAGGTATTCCATCGATCGTCACACTGACCTCGACAGATTTTTCACTATTAATCCAGAGGATGGTTTTATTAAAACTACAAAACCTCTGGATAGAGAGGAAACAGCCTGGCTCAACATCACTGTCTTTGCAGCAGAAATCCACAATCGGCATCAGGAAGCCAAAGTCCCAGTGGCCATTAGGGTCCTTGATGTCAACGATAATGCTCCCAAGTTTGCTGCCCCTTATGAAGGTTTCATCTGTGAGAGTGATCAGACCAAGCCACTTTCCAACCAGCCAATTGTTACAATTAGTGCAGATGACAAGGATGACACGGCCAATGGACCAAGATTTATCTTCAGCCTACCCCCTGAAATCATTCACAATCCAAATTTCACAGTCAGAGACAACCGAGATAACACAGCAGGCGTGTACGCCCGGCGTGGAGGGTTCAGTCGGCAGAAGCAGGACTTGTACCTTCTGCCCATAGTGATCAGCGATGGCGGCATCCCGCCCATGAGTAGCACCAACACCCTCACCATCAAAGTCTGCGGGTGCGACGTGAACGGGGCACTGCTCTCCTGCAACGCAGAGGCCTACATTCTGAACGCCGGCCTGAGCACACATCATCATCATCATCATTGAGGATCCGG

将该产物用Xba I和Bamh I双酶切，再与同样经Xba I和Bamh I双酶切的载体pCDH-CMV-MCS-EF1-puro相连，得到CDH11截短型变体的表达质粒pCDH-CDH11ECD-his。其表达蛋白的氨基酸序列为：

MKENYCLQAALVCLGMLCHSHAFAPERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRSKRGWVWNQFFVIEEYTGPDPVLVGRLHSDIDSGDGNIKYILSGEGAGTIFVIDDKSGNIHATKTLDREERAQYTLMAQAVDRDTNRPLEPPSEFIVKVQDINDNPPEFLHETYHANVPERSNVGTSVIQVTASDADDPTYGNSAKLVYSILEGQPYFSVEAQTGIIRTALPNMDREAKEEYHVVIQAKDMGGHMGGLSGTTKVTITLTDVNDNPPKFPQSVYQMSVSEAAVPGEEVGRVKAKDPDIGENGLVTYNIVDGDGMESFEITTDYETQEGVIKLKKPVDFETKRAYSLKVEAANVHIDPKFISNGPFKDTVTVKISVEDADEPPMFLAPSYIHEVQENAAAGTVVGRVHAKDPDAANSPIRYSIDRHTDLDRFFTINPEDGFIKTTKPLDREETAWLNITVFAAEIHNRHQEAKVPVAIRVLDVNDNAPKFAAPYEGFICESDQTKPLSNQPIVTISADDKDDTANGPRFIFSLPPEIIHNPNFTVRDNRDNTAGVYARRGGFSRQKQDLYLLPIVISDGGIPPMSSTNTLTIKVCGCDVNGALLSCNAEAYILNAGLSTHHHHHH

用脂质体法将表达质粒pCDH-CDH11ECD-his转染到HEK293细胞中，加嘌呤霉素筛选7天后扩大培养。收集足够多的细胞沉淀，用his标签纯化试剂盒进行蛋白纯化，纯化后的蛋白产物加PBS进行超滤离心4次，转速为2500g，最后一次离心的滤出夜作为对照试剂。CDH11ECD-his蛋白纯化效果如图7所示，其中Lane 1为全细胞裂解液，Lane 2为上样流穿液，Lane 3为第一次洗涤液，Lane 4为第四次洗涤液，Lane 5为洗脱液，Lane 5箭头所指处为最终得到的CDH11ECD-his蛋白。

实施例5 CDH11截短型变体纯化蛋白对食管鳞癌细胞增殖的抑制作用

将人食管鳞癌细胞株KYSE450和EC9706接种到六孔板中，每孔1000个细胞。加入纯化的CDH11ECD-his蛋白至25ng/μL或50ng/μL，在另一组细胞中加入等体积的对照试剂。培养10天后对细胞进行结晶紫染色，结果如图8所示，说明CDH11ECD-his能浓度依赖性地抑制食管鳞癌细胞的增殖能力。

综上所述，在食管鳞癌组织中，CDH11的表达水平显著高于癌旁正常组织，，而且CDH11高表达的食管鳞癌患者的生存期要显著短于CDH11低表达的食管鳞癌患者的生存期，通过体外细胞实验证实CDH11具有促进食管鳞癌细胞增殖的能力。因此，在食管鳞癌中CDH11起着促进癌症发生发展的作用，CDH11可以作为食管鳞癌和其它相关肿瘤例如乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌等的潜在治疗靶点。发明人根据CDH11的分子结构和作用特点，构建并制备了仅含有CDH11胞外段的截短型变体，并通过一系列实验结果证明该截短型变体能浓度依赖性地抑制CDH11的功能，具有降低食管鳞癌细胞增殖的能力，显示出抗肿瘤效应。该截短型变体干扰细胞间CDH11蛋白的相互作用，进而影响到CDH11蛋白介导的细胞增殖等功能，可用作CDH11蛋白的抑制剂，并用于制备癌症的治疗药物，具有广阔的应用前景。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但是并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 湖北医药学院

<120> CDH11截短型变体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 617

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Glu Asn Tyr Cys Leu Gln Ala Ala Leu Val Cys Leu Gly Met

1 5 10 15

Leu Cys His Ser His Ala Phe Ala Pro Glu Arg Arg Gly His Leu Arg

20 25 30

Pro Ser Phe His Gly His His Glu Lys Gly Lys Glu Gly Gln Val Leu

35 40 45

Gln Arg Ser Lys Arg Gly Trp Val Trp Asn Gln Phe Phe Val Ile Glu

50 55 60

Glu Tyr Thr Gly Pro Asp Pro Val Leu Val Gly Arg Leu His Ser Asp

65 70 75 80

Ile Asp Ser Gly Asp Gly Asn Ile Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Glu Gly

85 90 95

Ala Gly Thr Ile Phe Val Ile Asp Asp Lys Ser Gly Asn Ile His Ala

100 105 110

Thr Lys Thr Leu Asp Arg Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Thr Leu Met Ala

115 120 125

Gln Ala Val Asp Arg Asp Thr Asn Arg Pro Leu Glu Pro Pro Ser Glu

130 135 140

Phe Ile Val Lys Val Gln Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe Leu

145 150 155 160

His Glu Thr Tyr His Ala Asn Val Pro Glu Arg Ser Asn Val Gly Thr

165 170 175

Ser Val Ile Gln Val Thr Ala Ser Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly

180 185 190

Asn Ser Ala Lys Leu Val Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Gln Pro Tyr Phe

195 200 205

Ser Val Glu Ala Gln Thr Gly Ile Ile Arg Thr Ala Leu Pro Asn Met

210 215 220

Asp Arg Glu Ala Lys Glu Glu Tyr His Val Val Ile Gln Ala Lys Asp

225 230 235 240

Met Gly Gly His Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Lys Val Thr Ile

245 250 255

Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Lys Phe Pro Gln Ser Val

260 265 270

Tyr Gln Met Ser Val Ser Glu Ala Ala Val Pro Gly Glu Glu Val Gly

275 280 285

Arg Val Lys Ala Lys Asp Pro Asp Ile Gly Glu Asn Gly Leu Val Thr

290 295 300

Tyr Asn Ile Val Asp Gly Asp Gly Met Glu Ser Phe Glu Ile Thr Thr

305 310 315 320

Asp Tyr Glu Thr Gln Glu Gly Val Ile Lys Leu Lys Lys Pro Val Asp

325 330 335

Phe Glu Thr Lys Arg Ala Tyr Ser Leu Lys Val Glu Ala Ala Asn Val

340 345 350

His Ile Asp Pro Lys Phe Ile Ser Asn Gly Pro Phe Lys Asp Thr Val

355 360 365

Thr Val Lys Ile Ser Val Glu Asp Ala Asp Glu Pro Pro Met Phe Leu

370 375 380

Ala Pro Ser Tyr Ile His Glu Val Gln Glu Asn Ala Ala Ala Gly Thr

385 390 395 400

Val Val Gly Arg Val His Ala Lys Asp Pro Asp Ala Ala Asn Ser Pro

405 410 415

Ile Arg Tyr Ser Ile Asp Arg His Thr Asp Leu Asp Arg Phe Phe Thr

420 425 430

Ile Asn Pro Glu Asp Gly Phe Ile Lys Thr Thr Lys Pro Leu Asp Arg

435 440 445

Glu Glu Thr Ala Trp Leu Asn Ile Thr Val Phe Ala Ala Glu Ile His

450 455 460

Asn Arg His Gln Glu Ala Lys Val Pro Val Ala Ile Arg Val Leu Asp

465 470 475 480

Val Asn Asp Asn Ala Pro Lys Phe Ala Ala Pro Tyr Glu Gly Phe Ile

485 490 495

Cys Glu Ser Asp Gln Thr Lys Pro Leu Ser Asn Gln Pro Ile Val Thr

500 505 510

Ile Ser Ala Asp Asp Lys Asp Asp Thr Ala Asn Gly Pro Arg Phe Ile

515 520 525

Phe Ser Leu Pro Pro Glu Ile Ile His Asn Pro Asn Phe Thr Val Arg

530 535 540

Asp Asn Arg Asp Asn Thr Ala Gly Val Tyr Ala Arg Arg Gly Gly Phe

545 550 555 560

Ser Arg Gln Lys Gln Asp Leu Tyr Leu Leu Pro Ile Val Ile Ser Asp

565 570 575

Gly Gly Ile Pro Pro Met Ser Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Lys Val

580 585 590

Cys Gly Cys Asp Val Asn Gly Ala Leu Leu Ser Cys Asn Ala Glu Ala

595 600 605

Tyr Ile Leu Asn Ala Gly Leu Ser Thr

610 615

<210> 2

<211> 1854

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaggaga actactgttt acaagccgcc ctggtgtgcc tgggcatgct gtgccacagc 60

catgcctttg ccccagagcg gcgggggcac ctgcggccct ccttccatgg gcaccatgag 120

aagggcaagg aggggcaggt gctacagcgc tccaagcgtg gctgggtctg gaaccagttc 180

ttcgtgatag aggagtacac cgggcctgac cccgtgcttg tgggcaggct tcattcagat 240

attgactctg gtgatgggaa cattaaatac attctctcag gggaaggagc tggaaccatt 300

tttgtgattg atgacaaatc agggaacatt catgccacca agacgttgga tcgagaagag 360

agagcccagt acacgttgat ggctcaggcg gtggacaggg acaccaatcg gccactggag 420

ccaccgtcgg aattcattgt caaggtccag gacattaatg acaaccctcc ggagttcctg 480

cacgagacct atcatgccaa cgtgcctgag aggtccaatg tgggaacgtc agtaatccag 540

gtgacagctt cagatgcaga tgaccccact tatggaaata gcgccaagtt agtgtacagt 600

atcctcgaag gacaacccta tttttcggtg gaagcacaga caggtatcat cagaacagcc 660

ctacccaaca tggacaggga ggccaaggag gagtaccacg tggtgatcca ggccaaggac 720

atgggtggac atatgggcgg actctcaggg acaaccaaag tgacgatcac actgaccgat 780

gtcaatgaca acccaccaaa gtttccgcag agcgtatacc agatgtctgt gtcagaagca 840

gccgtccctg gggaggaagt aggaagagtg aaagctaaag atccagacat tggagaaaat 900

ggcttagtca catacaatat tgttgatgga gatggtatgg aatcgtttga aatcacaacg 960

gactatgaaa cacaggaggg ggtgataaag ctgaaaaagc ctgtagattt tgaaaccaaa 1020

agagcctata gcttgaaggt agaggcagcc aacgtgcaca tcgacccgaa gtttatcagc 1080

aatggccctt tcaaggacac tgtgaccgtc aagatctcag tagaagatgc tgatgagccc 1140

cctatgttct tggccccaag ttacatccac gaagtccaag aaaatgcagc tgctggcacc 1200

gtggttggga gagtgcatgc caaagaccct gatgctgcca acagcccgat aaggtattcc 1260

atcgatcgtc acactgacct cgacagattt ttcactatta atccagagga tggttttatt 1320

aaaactacaa aacctctgga tagagaggaa acagcctggc tcaacatcac tgtctttgca 1380

gcagaaatcc acaatcggca tcaggaagcc aaagtcccag tggccattag ggtccttgat 1440

gtcaacgata atgctcccaa gtttgctgcc ccttatgaag gtttcatctg tgagagtgat 1500

cagaccaagc cactttccaa ccagccaatt gttacaatta gtgcagatga caaggatgac 1560

acggccaatg gaccaagatt tatcttcagc ctaccccctg aaatcattca caatccaaat 1620

ttcacagtca gagacaaccg agataacaca gcaggcgtgt acgcccggcg tggagggttc 1680

agtcggcaga agcaggactt gtaccttctg cccatagtga tcagcgatgg cggcatcccg 1740

cccatgagta gcaccaacac cctcaccatc aaagtctgcg ggtgcgacgt gaacggggca 1800

ctgctctcct gcaacgcaga ggcctacatt ctgaacgccg gcctgagcac ataa 1854

Claims

1.一种CDH11截短型变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的CDH11截短型变体。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2或3所述的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体基于pCDH-CMV-MCS-EF1-puro构建得到。

6.一种宿主细胞，其特征在于，其基因组中掺有权利要求2或3所述的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为HEK293细胞。

8.权利要求1所述的CDH11截短型变体、权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4或5所述的重组载体或权利要求6或7所述的宿主细胞在制备用于治疗癌症的产品中的应用，所述癌症中CDH11高表达并为所述癌症的治疗靶点。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述癌症包括鳞状食道癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌。

10.一种CDH11蛋白抑制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的CDH11截短型变体，以及药学上可接受的助剂。