CN101998966A - 使用钙黏着蛋白11(cdh11)拮抗剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了新颖的抑制或预防与纤维化和慢性组织排异相关的上皮-间充质转换(EMT)或内皮-间充质转换(EnMT)，例如EMT或EnMT的方法。本发明还提供了诊断或评估受试者是否具有与CDH11表达相关的疾病或处于发展出与CDH11表达相关的疾病的风险中的方法，以及测定被诊断为具有CDH11相关疾病的受试者的预后的方法。本发明利用CDH11拮抗剂来下调CDH11活性，由此抑制EMT或EnMT。

Description

使用钙黏着蛋白11(CDH11)拮抗剂的方法

发明背景

在胚胎发育期间，上皮和间充质表型转换是不同组织正确形成所必需的。但是，这些过程不仅涉及发育，它们还被认为与病理状态，例如，癌症和纤维化相关(Kalluri，R.和Neilson，E.G.，J.Clin.Invest.112，1776-1784(2003))。上皮-间充质转换(下文中称“EMT”)是这样的程序：其中，受损伤的发挥离子和流体转运功能的上皮细胞成为基质重构间充质细胞。该过程需要对保持上皮表型和转录活性的基因的转录阻遏，或者需要对功能性肌成纤维细胞所需的基因的阻遏解除。EMT的一种典型例子在肾发育和疾病中被观察到。发育期间，间充质细胞最初由EMT形成，随后，这些细胞中的一些经历间充质细胞向上皮细胞的转换(MET)，形成前肾、中肾和后肾的上皮(Dressler，G.R.，Trends in Cell Biology 12，390-395(2002))。成人中，EMT与很多进行性肾病的晚期肾衰竭的发展相关(Liu，Y.，J.Am.Soc.Nephrol.，15，1-12(2004))。因此，虽然肾的形成涉及相互转化，在成人中对该可塑性的遏制对于保持正常组织架构和内稳态来说是关键的。

发明内容

本发明提供了在受试者中抑制或预防与纤维化相关的上皮-间充质转换(EMT)或内皮-间充质转换(EnMT)的新方法，所述方法通过施用治疗有效量的CDH11拮抗剂来实现。

本发明还提供了治疗与CDH11活性相关的特定疾病或病况的新方法，包括但不限于，血管纤维化、肺性高血压、肾纤维化、肾消耗病(nephronopthisis)、肝纤维化、皮肤纤维化、肺纤维化、关节纤维化(例如类风湿性关节炎)、间皮纤维化和肠纤维化(例如炎性肠病)。在一种特定的实施方式中，本发明的方法用于治疗肾纤维化。

在另一实施方式中，本发明的方法可用于预防或降低受试者中慢性组织排异(即，移植或植入的组织的排异)的严重性。示例性的组织包括但不限于：全血、血管、骨、角膜以及主要器官，例如，心、肾、肝、眼、肺和胰腺。

本发明还提供了评估受试者是否有或处于发展出CDH11相关疾病(例如EMT、EnMT、纤维化或慢性组织排异)的风险的方法，所述方法通过下述过程来进行：针对CDH11进行样品检验，并且将CDH11的异常或升高的水平解释为受试者具有或处于发展出CDH11相关疾病的风险的指示。

本发明还提供了诊断CDH11相关疾病(例如EMT、EnMT、纤维化和慢性组织排异)的方法，所述方法通过下述过程进行：将靶样品与和CDH11反应的试剂(例如可检测的经标记的抗体或核酸)接触，检测CDH11，将相对于正常对照而言升高的CDH11浓度解释为CDH11相关疾病的指示。

本发明还提供了确定被诊断为患有CDH11相关疾病(例如EMT、EnMT、纤维化或慢性组织排异)的受试者的预后的方法，所述方法通过下述过程进行：对不同时间从受试者收集的至少两份样品加以检验，比较每份样品中CDH11的水平，确定CDH11的水平随时间增加还是减少，其中，CDH11的增加指示疾病严重性增加，CDH11的减少指示疾病严重性的减少。在一种特定的实施方式中，确定已用CDH11拮抗剂进行处理的患者的预后。

有多种CDH11拮抗剂可用于本发明的方法，例如抗体、融合蛋白、核酸(例如反义分子，例如RNA干扰试剂和核酶)、免疫缀合物(例如，与治疗剂相连的抗体，例如细胞毒性试剂、免疫抑制剂或者化疗剂)、小分子、融合蛋白和CDH11衍生的肽类化合物。

在一种特定的实施方式中，CDH11拮抗剂是抗体(或其片段)。根据本发明适合用于保护的抗体包括至少具有可变区域序列的抗体的所有已知形式。例如，抗体可以是鼠、人、人化、嵌合或双特异性单克隆抗体。抗体可以是Fab、Fab’2、ScFv、SMIP、亲和抗体(affibody)、avimer、纳米抗体(nanobody)和结构域抗体，并且抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或者IgE抗体。

用于本发明的方法中的CDH11拮抗剂可单独施用，或者与其它治疗剂组合施用。例如，抗体可与(即，一起或与其相连)细胞毒素、其它已知的治疗剂(即，免疫抑制剂或化疗剂)和/或其它治疗性抗体组合施用。在一种实施方式中，拮抗剂与第二结合分子，例如抗体(即，由此形成双特异性抗体)，或其它结合试剂(与CDH11上的不同表位或不同靶标结合)相连。

本发明的其它特征和优点将从下文详述以及从权利要求书中显而易见。

附图简述

图1示意性阐述了与慢性同种异体移植物(allograft)排异相关的基因和与Snail2(EMT标志物，其在早期和晚期慢性排异中均被高度上调)相关的基因之间的重叠。

图2是EMT组的基因的组(gene set)富集方法(GSEA)示意，其针对(A)来自Hannover数据组的进展(progressor)和不进展(non-progressor)患者和(B)对照和慢性同种异体移植排异III级患者样品进行。

图3显示了平均mRNA CDH11表达，其针对(A)来自肾移植后三个月的不进展和进展患者的肾的规程性(protocol)活检样品和(B)来自对照、基线、I级、II级和III级肾移植患者的诊断性活检样品进行。

图4是对石蜡包埋的健康和经移植患者的肾皮质活检样品上的CDH11的免疫组织化学照片图。

图5描述了来自肾移植猕猴的急性和慢性排异样品中的CDH11mRNA表达水平。

图6是经心脏移植小鼠的冷冻活检样品中CDH11的免疫组织化学的照片图。

图7描述了来自单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型的组织中的CDH11mRNA表达水平，显示CDH11是纤维化病症中的EMT标志物。

发明详述

为了使得本发明更容易被理解，首先定义了一些术语。其它定义示于详述通篇中。

I.定义

在本文中使用时，术语“钙黏着蛋白”指Ca2+依赖性细胞-细胞粘着分子的家族。所有钙黏着蛋白都是单向通过的跨膜蛋白，其具有可变数量的110个氨基酸的细胞外钙黏着蛋白(EC)结构域。经典钙黏着蛋白含有五个EC结构域和保守的胞内结构域。基于氨基酸比对，经典钙黏着蛋白被分为I型和II型亚组。I型钙黏着蛋白，包括钙黏着蛋白E(上皮)、N(神经)、P(胎盘)和R(肾)钙黏着蛋白，其特异性氨基酸序列与II型钙黏着蛋白不同。II型钙黏着蛋白包括人钙黏着蛋白-5、钙黏着蛋白-6、钙黏着蛋白-8、钙黏着蛋白-11和钙黏着蛋白-12。

在本文中使用时，术语“钙黏着蛋白11”(本文中也可与“CDH11”、“钙黏着蛋白11，2型，ON-钙黏着蛋白(成骨细胞)”、“CAD11”、“CDHOB”、“OB-钙黏着蛋白”和“OSF-4”互换使用)指钙黏着蛋白家族的一个成员，其是间充质的松散连接并且移动性的细胞元件的标志物。已在脑、脊髓、骨髓和骨细胞中注意到了CDH11的强烈表达，其在人子宫内膜腺上皮和基质细胞中被调控。在发育期间，CDH11表达与早期小鼠胚胎的头、体节和肢芽中的间充质细胞形态发生相关，其还在肺或肾分支形态发生期间在间充质中强烈表达。而上皮钙黏着蛋白(例如E-钙黏着蛋白)负责上皮结构的形成和保持，CDH11的表达与移动性细胞表型相关，其是细胞运动性、细胞嵌入(intercalation)、组织延伸和肌成纤维细胞分化的关键决定因素，如例如Borchers，A.等人，Development，128，3049-3060(2001)；Desmouliere，A.等人，J.Cell Biol.，122，103-111(1993)；Hinz，B.等人，Mol.Biol.Cell，15，4310-4320(2004)；Kiener，H.P等人，Mol.Biol.Cell，17，2366-2376(2006)；Kimura，Y.等人，Developmental Biology，169，347-358(1995)；Locascio，A.等人，Current Opinion in Genetics & Development，11，464-469(2001)；Okazaki，M.等人，J.Biol.Chem.，269，12092-12098(1994)；Pishvaian，M.J.等人，Cancer Res.，59，947-952(1999)；Shibata，T.等人，Cancer Letters，99，147-153(1996)；Tomita，K.等人，Cancer Res.，60，3650-3654(2000)和Valencia，X.等人，J.Exp.Med.，200，1673-1679(2004)所教导的，这些文献的内容通过引用明确并如本文作为参考。

代表性的CDH11序列包括但不限于下文示出的序列。

人钙黏着蛋白11，2型，OB-钙黏着蛋白(成骨细胞)(CDH11) (NM 001797)(SEQ ID NO：1)

MKENYCLQAALVCLGMLCHSHAFAPERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRS

KRGWVWNQFFVIEEYTGPDPVLVGRLHSDIDSGDGNIKYILSGEGAGTIFVID

DKSGNIHATKTLDREERAQYTLMAQAVDRDTNRPLEPPSEFIVKVQDINDNPP

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EAQTGIIRTALPNMDREAKEEYHVVIQAKDMGGHMGGLSGTTKVTITLTDVN

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在本文中使用时，术语“CDH11拮抗剂”指下调CDH11活性的任何试剂，包括下调CDH11表达或抑制CDH11功能(例如，其诱导细胞移动的能力)的试剂。此类抑制性试剂可例如抑制或阻断CDH11介导的细胞相互作用。

在本文中使用时，术语“下调”表示CDH11生物学活性的任何统计上显著的减少，包括对活性的完全阻断(即，抑制)。例如，“下调”可表示CDH11表达减少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

在本文中使用时，术语“上皮-间充质转换”(EMT)表示从上皮向间充质表型的转换，这是胚胎发育的正常过程。EMT还是这样的过程：其中，受损伤的发挥离子和流体转运功能的上皮细胞成为基质重构间充质细胞。在癌中，这种转换导致细胞形态改变，间充质蛋白表达以及增加的侵入性。定义体外EMT的标准包括上皮细胞极性的损失、分离成各个细胞以及随后在获得细胞移动性后散播(见Vincent-Salomon等人，BreastCancer Res.2003；5(2)：101-106)。EMT期间表达、分布和/或功能有所改变以及确实涉及的分子的类别包括生长因子(例如，转化生长因子(TGF)-β，wnts)、转录因子(例如snails、SMAD、LEF和核β-连环蛋白)、细胞-细胞粘着轴的分子(钙黏着蛋白、连环蛋白)、细胞骨架调节子(Rho家族)和细胞外蛋白酶(基质金属蛋白酶、纤维蛋白溶酶原活化因子)(见Thompson等人，Cancer Research 65，5991-5995，July 15，2005)。

在本文中使用时，术语“间充质至上皮转换”(MET)指基础胚胎过程，由此间充质细胞转换成上皮细胞，形成前肾、中肾和后肾的上皮。若干生长因子家族是肾MET的关键调控子，包括wnt/无翼和骨形态发生蛋白家族。特别地，成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF受体(FGFR)和调节FGF信号的蛋白聚糖是肾发生MET的必要调节子(见Chaffer等人，Cancer Research 66，11271-11278，December 1，2006)。

在本文中使用时，术语“内皮间充质转换”(EnMT)指内皮细胞向间充质-肌成纤维细胞表型的表型转换。

在本文中使用时，术语“上皮”表示身体内表面和外表面的覆盖，包括血管和其它小腔的内衬。其由上皮细胞的集合构成，形成相对薄的片或层，这是由于通过细胞间连接从而相互广泛测向粘着的组成性细胞形成的。该层是极性的，并且具有顶侧和底侧。除了上皮细胞的紧密系统化之外，上皮确实具有一定可塑性，上皮层中的细胞可改变形状，例如从扁平变为柱状，或者一端是尖的而在另一端扩展。但是，这些趋向于以细胞群体而非个体发生(见Thompson等人，Cancer Research 65，5991-5995，July 15，2005)。

在本文中使用时，术语“间充质”指胚胎中胚层的一部分，其由松散堆积的非特化细胞(胶状基质物质中)构成，由其发育出结缔组织、骨、软骨和循环及淋巴系统。间充质是形成相对扩散的组织网络的细胞的集合。间充质并非完整的细胞层，典型地，细胞仅在其表面具有与它们的邻居粘着的点。这些粘着还可涉及钙黏着蛋白关联(见Thompson等人，CancerResearch 65，5991-5995，July 15，2005)。

在本文中使用时，术语“纤维化”指器官或组织中过度纤维性的结缔组织的形成或发育，这是修复性或反应性的过程，与作为器官或组织的正常组成成分的纤维性组织的形成相反。纤维化的例子包括但不限于：血管纤维化、与肺性高血压相关的血管纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、肺纤维化、关节纤维化(例如类风湿性关节炎)、间皮纤维化、眼纤维化和肠纤维化(例如炎性肠病)。

在本文中使用时，术语“间质性纤维化”指位于器官的部分或组织之间小的、窄的空间中或与之相关的纤维化。例如，间质性肺纤维化(也被称为间质性肺病和肺纤维化)指间质组织(即，肺泡之间的组织)的纤维化(即瘢痕形成)。此外，肾间质性纤维化(也被称为肾纤维化)特征在于肾小管和间质性毛细管的破坏以及细胞外基质蛋白的积累。

在本文中使用时，术语“血管重构”是一种纤维化类型，其指血管系统中结构和细胞改变的活性过程。所有这些改变的特征在于表达α-平滑肌肌动蛋白的细胞数量增加。α-平滑肌阳性细胞的这种积累可能是下述过程导致的：驻扎的血管平滑肌细胞(SMC)的增殖性扩展、循环祖细胞被招募到血管损伤的位点或内皮细胞朝向间充质表型的转换(EnMT)。

在本文中使用时，术语“移植”指从一个受试者取细胞、组织或器官(被称为“移植体”或“移植物”)并将其放进(通常)不同的受试者中的过程。提供移植体的受试者被称为“供体”，接受移植体的受试者被称为“受体”。在相同物种的两个遗传上不同的受试者之间移植的器官或移植物被称为“同种异体移植物”。在不同物种的受试者之间移植的移植物被称为“异种移植物”。

在本文中使用时，术语“移植体排异”被定义为由于移植体受体表现出的活性免疫应答，器官的功能和结构恶化，其独立于器官衰竭的非免疫致因。

在本文中使用时，术语“急性排异”(例如移植体的急性排异)指在移植后5-60天后发展的对被移植的器官的排异。其通常是细胞介导的免疫损伤的表现。我们相信，其涉及延迟的过度敏感和细胞毒性机制两者。免疫损伤针对HLA，以及管状上皮和血管内皮表达的可能的其它细胞特异性抗原。

在本文中使用时，术语“慢性排异”(例如移植体的慢性排异)代表移植后数月或数年发生的免疫损伤(例如慢性排异)和非免疫伤害(例如高血压肾硬化或免疫抑制剂例如环孢菌素A的肾毒性)的组合，其最终导致同种异体移植物的纤维化和硬化，这与器官功能的进行性丧失相关。

最常见的组织表现是肌肉动脉的进行性变窄，其通常被称为“移植物血管病”或“闭塞性动脉病(OA)”，其可能与动脉硬化的加速形式相关。闭塞性动脉病主要通过危害动脉血流，使其易受慢性缺血性伤害以及梗塞来伤害同种异体移植物。慢性同种异体移植物排异的其它常见特征包括斑状间质性炎症、纤维化和相关的实质细胞萎缩，上皮内衬的导管(例如肺同种异体移植物中的细支气管和肝中胆管)被破坏，以及器官相关的淋巴组织的消耗。

在本文中使用时，术语“I级排异”或“I级同种异体移植物排异”指轻微间质纤维化和管萎缩(＜25％的皮质)。

在本文中使用时，术语“II级排异”或“II级同种异体移植物排异”指中度间质纤维化和管萎缩(25-50％的皮质)。

在本文中使用时，术语“III级排异”或“III级同种异体移植物排异”指严重的间质纤维化和管萎缩(＞50％的皮质)。

在本文中使用时，术语“进展者”或“进展患者”指将在未来6至12个月发展出慢性排异的移植体受体。

在本文中使用时，术语“非进展者”、“稳定”、“稳定患者”或“非进展患者”指在未来6至12个月将展示出稳定的移植物功能的移植体受体。

在本文中使用时，术语“内膜增生”指血管对损伤的普遍应答。其涉及通过机械、细胞和体液因素对平滑肌细胞的共同刺激，诱导细胞活化程序，其导致增殖、移动和细胞外基质沉积。内膜增生可导致晚期旁路移植物衰竭，特别是静脉和合成的血管移植物中。

II.CDH11拮抗剂

在本文中使用时，术语“拮抗剂”指下调CDH11活性的任何试剂，这包括下调CDH11表达或抑制CDH11功能(例如，其诱导细胞移动的能力)的试剂。此类抑制性试剂可例如抑制或阻断CDH11介导的细胞相互作用。代表性的拮抗剂包括但不限于：抗体、核酸(例如，反义分子，例如核酶和RNA干扰试剂)、免疫缀合物(例如，与治疗剂(例如细胞毒性试剂、免疫抑制剂或化疗剂)相连的抗体)、小分子抑制剂、融合蛋白和CDH11衍生的肽类化合物。

A.抗体

在本发明的一种实施方式中，本发明利用了结合CDH11并且抑制CDH11活性和/或下调CDH11表达的抗体。例如，抗体可与CDH11结合并且干扰CDH11介导的细胞相互作用。术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，其包括整个抗体或其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区域(本文中缩写为V_H)和重链恒定区域构成。重链恒定区域包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区域(本文中缩写为V_L)和轻链恒定区域。轻链恒定区域包含一个结构域，CL。V_H和V_L结构域可进一步细分为：高可变性的区域(被称为互补性决定区域(CDR))，其间散布着较为保守的区域(被称为框架区域(FR))。每个V_H和V_L包含三个CDR和四个FR，它们从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区域含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区域可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如效应器细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。

术语抗体的“抗原结合部分”(或简单称之为“抗体部分”)在本文中使用时表示抗体中保留有与抗原(例如CDH11)特异性结合的能力的一条或多条片段。已显示，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”所包括的结合片段的例子包括(i)Fab片段——由V_L、V_H、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段——包含通过二硫桥在铰链区域相连的两条Fab片段的双价片段；(iii)Fd片段——由V_H和CH1结构域构成；(iv)Fv片段——由抗体单臂的V_L和V_H结构域构成；(v)包括VH和VL结构域的dAb；(vi)dab片段(Ward等人，1989Nature 341：544-546)——其由V_H结构域构成；(vii)由VH或VL结构域构成的dAb；以及(viii)经分离的互补性决定区域(CDR)或(ix)两个或多个经分离的CDR的组合，其可任选通过合成连接子(linker)相连。此外，虽然Fv片段的两个结构域——V_L和V_H是不同基因编码的，但是可使用重组方法将其连接起来，其中通过合成连接子，使得它们被制造为单条蛋白链，其中，V_L和V_H区域配对形成单价分子(也被称为单链Fv(scFv)；见，例如，Bird等人(1988)Science 242，423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879-5883)。此类单链抗体还意欲包括在抗体的“抗原结合部分”中。使用本领域技术人员已知的传统技术获得这些抗体片段，针对与完整抗体相同方式的利用性，对片段加以筛选。可通过重组DNA技术，或通过对完整免疫球蛋白进行酶促或化学切割，来产生抗原结合部分。

术语“单克隆抗体”在本文中使用时指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即，除了可能的可少量存在的天然发生的突变之外，构成该群的各抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单种抗原性位点。此外，与传统(多克隆)抗体制备物(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。可使用本领域认可的任何技术和本文所述的技术(例如杂交瘤方法(如Kohler等人(1975)Nature，256：495所述)、转基因动物(如例如见Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859所述)、重组DNA方法(见例如U.S.Pat.No.4,816,567))来制备单克隆抗体，或者使用例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术，使用噬菌体抗体文库来制备。单克隆抗体包括嵌合抗体、人抗体和人化抗体，其可以是天然存在的或者重组生产的。

术语“重组抗体”指通过重组手段制备、表达、制造或分离的抗体，例如，(a)从针对免疫球蛋白基因(例如人免疫球蛋白基因)转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由此制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞分离(例如从转染瘤(transfectoma)分离)的抗体，(c)使用噬菌体展示从重组、组合抗体文库(例如，含有人抗体序列)分离的抗体；以及(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因)剪接成另外的DNA序列的任何其它手段制备、表达、制造或分离的抗体。此类重组抗体可具有源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区域。但是，在某些实施方式中，此类重组人抗体可经历体外诱变，由此，重组抗体的V_H和V_L区域的氨基酸序列是这样的序列：虽然源于人种系V_H和V_L序列并与其相关，但天然不存在于体内人抗体种系的全部组成部分(repertoire)中。

术语“嵌合免疫球蛋白”或抗体指下述免疫球蛋白或抗体，其可变区域源于第一物种，且其恒定区域源于第二物种。嵌合免疫球蛋白或抗体可例如通过遗传工程从属于不同物种的免疫球蛋白基因片断来构建。

术语“人抗体”在本文中使用时意欲包括具有可变区域的抗体，其中，框架和CDR区域源于人种系免疫球蛋白序列，例如，如Kabat等人(参见Kabat等人(1991)Sequences of proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)所述的。此外，如果抗体含有恒定区域，恒定区域也源于人种系免疫球蛋白序列。人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变引入或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，术语“人抗体”在本文中使用时不包括下述抗体：其中，源于另外的哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人框架序列上。

人抗体可具有由并非人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如活性增强的氨基酸残基)替换的至少一个或多个氨基酸。典型地，人抗体可具有被并非人种系免疫球蛋白序列的一部分的氨基酸残基替换的至多20个位置。在一种特定的实施方式中，这些替换位于CDR区域内，如下文所详细描述的。

术语“人化免疫球蛋白”或“人化抗体”指包括至少一种人化免疫球蛋白或抗体链(即，至少一条人化轻链或重链)的免疫球蛋白或抗体。术语“人化免疫球蛋白链”或“人化抗体链”(即，“人化免疫球蛋白轻链”或“人化免疫球蛋白重链”)指下述免疫球蛋白或抗体链(即，分别是轻链或重链)，其具有可变区域，所述可变区域包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的可变框架区域和基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的互补性决定区域(CDR)(例如，至少一个CDR，优选两个CDR，更优选三个CDR)，其还包括恒定区域(例如，至少一个恒定区域或其部分(在轻链的情况下)，在重链的情况下优选地三个恒定区域)。术语“人化可变区域”(例如，“人化轻链可变区域”或“人化重链可变区域”)指包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的可变框架区域和基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的互补性决定区域(CDR)的可变区域。

“双特异性”或“双功能抗体”是具有两条不同重/轻链对以及两个不同结合位点的人工杂合抗体。可通过多种方法来生产双特异性抗体，包括杂交瘤的融合或者Fab’片段的连接。见例如Songsivilai & Lachmann，(1990)Clin.Exp.Immunol.79，315-321；Kostelny等人(1992)J.Immunol.148，1547-1553。

在本文中使用时，“异源抗体”是由相对于产生此类抗体的转基因的非人生物或植物来定义的。

“经分离的抗体”在本文中使用时意欲表示基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，与CDH11特异性结合的经分离的抗体基本上不含与非CDH11的抗原特异性结合的抗体)。此外，经分离的抗体典型地基本上不含其它细胞材料和/或化学品。在本发明的一种实施方式中，具有不同CDH11结合特异性的“经分离的”单克隆抗体的组合被合并于良好界定的组合物中。

在本文中使用时，“同种型”指通过重链恒定区域基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。在一种实施方式中，抗体或其抗原结合部分是选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE抗体同种型的同种型。

在本文中使用时，“同种型转换(isotype switching)”指抗体的类别或同种型从一种Ig类别改变为另外Ig类别之一的现象。

在本文中使用时，“未转换同种型”指没发生同种型转换时产生的重链的同种型的类别；编码未转换同种型的CH基因典型地是功能上重排的VDJ基因紧接下游的第一CH基因。同种型转换已被归类为经典或非经典的同种型转换。经典同种型转换通过重组事件发生，该事件涉及编码抗体的基因中的至少一个转换序列区域。非经典同种型转换可例如通过人σ_μ和人∑_μ(δ-相关的缺失)之间的同源重组发生。其它非经典转换机制，例如转基因间和/或染色体间重组等，也可发生并且导致同种型转换。

在本文中使用时，术语“转换序列”指负责转换重组的那些DNA序列。“转换供体”序列，典型地，μ转换区域，将是转换重组期间待缺失的构建体区域的5’(即，上游)。“转换受体”区域将在待缺失的构建体区域和替换恒定区域(例如Y、ε等)之间。因为不存在总是发生重组的特异性位点，最终的基因序列典型地将无法从构建体预测。

术语“表位”或“抗原决定簇”指抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可从蛋白的三级折叠上并置的非连续氨基酸形成，或从连续氨基酸形成，两者均可。从连续氨基酸形成的表位典型地在暴露给变性溶剂时得以保持，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时典型地丢失。表位在独特的空间构象上典型地包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。决定表位空间构象的方法包括本领域中的技术以及本文所述的那些，例如，x-射线晶体法和二维核磁共振。见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris编著(1996)。

已针对大小、结构复杂性和针对人受试者的抗原性方面，对从骆驼和和单峰驼(Camelus bactrianus和Calelus dromaderius)家族的成员(包括新世界的成员，例如美洲驼物种(Lama paccos、Lama glama和Lamavicugna))获得的抗体蛋白进行了表征。该家族的哺乳动物中天然发现的某些Ig抗体缺少轻链，由此结构上与来自其它动物的抗体所典型的具有两条重链和两条轻链的四链四级结构有所不同。见例如PCT公开文本WO 94/04678。

骆驼抗体的小、单可变结构域(被鉴定为V_HH)区域可通过遗传工程获得，以产生具有针对靶标的高度亲和性的小蛋白质，从而产生低分子量的、源于抗体的、被称为“骆驼纳米抗体”的蛋白。见U.S.Pat.No.5,759,808；还见Stijlemans等人，2004J.Biol.Chem.279：1256-1261；Dumoulin等人，2003Nature 424：783-788；Pleschberger等人，2003Bioconjugate Chem.14：440-448；Cortez-Retamozo等人，2002Int.J.Cancer 89：456-62和Lauwereys.等人，1998EMBO J.17：3512-3520。骆驼抗体和抗体片段的工程化文库是可商业获得的，例如，从Ablynx，Ghent，Belgium获得。和其它非人源的抗体一样，骆驼抗体的氨基酸序列可被重组改变，以获得更接近近似于人序列的序列，即，纳米抗体可以是“人化的”。因此，骆驼抗体对人的天然低抗原性可被进一步降低。

骆驼纳米抗体具有大约是人IgG分子十分之一的分子量，该蛋白具有仅数纳米的物理直径。小尺寸的一种后果是骆驼纳米抗体能结合对于较大抗体蛋白来说功能上不可见的抗原位点，即，骆驼纳米抗体可用作为试剂，以检测使用经典免疫技术检测不到的抗原，以及可用作为可能的治疗剂。因此，小尺寸的另一后果是，由于与靶蛋白的槽或窄缝中的特异性位点结合，骆驼纳米抗体可抑制靶蛋白质，以及由此可以以比经典抗体更近似于模拟经典低分子量药物的功能的能力发挥作用。

低分子量和紧凑的大小进一步导致骆驼纳米抗体极其热稳定、对极端pH和对蛋白水解消化稳定，并且更少抗原性。另一后果是，骆驼纳米抗体易于从循环系统移动进组织，并且甚至穿过血脑屏障，因此可治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步协助药物运输穿过血脑屏障。见2004年8月19日公开的U.S.Pat.Pub.No.20040161738。与在人中的低抗原性组合的这些特征表明了其良好的治疗潜力。此外，这些分子可在原核细胞，例如大肠杆菌中，完整表达。

因此，本发明的一个特征是具有针对CDH11的高度亲和性的骆驼抗体或骆驼纳米抗体。在本文某些实施方式中，骆驼抗体或纳米抗体是在骆驼动物中天然产生的，即，使用本文所述针对其它抗体的技术，用CDH11或其肽片段进行免疫之后由骆驼产生的。或者抗CDH11骆驼纳米抗体是工程化的，即，通过选择，例如，从展示经合适诱变的骆驼纳米抗体蛋白的噬菌体文库进行选择，来生产抗CDH11的骆驼纳米抗体，其中用本文描述的CDH11或CDH11表位作为靶标，使用淘选流程来进行。可通过遗传工程对经工程化的纳米抗体进行进一步定制，以将受体受试者中的半衰期从45分钟增加至2周。

二价抗体是二价的、双特异性的分子，其中，V_H和V_L结构域在单条多肽链上表达，它们通过短到不允许相同链上两个结构域间配对的连接子相连。V_H和V_L结构域与另一条链的互补结构域配对，由此制造两个抗原结合位点(见例如，Holliger等人，1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poljak等人，1994Structure 2：1121-1123)。可通过在相同细胞中表达具有结构V_HA-V_LB和V_HB-V_LA(V_H-V_L构型)或V_LA-V_HB和V_LB-V_HA(V_L-V_H构型)的两条多肽链，来产生二价抗体。它们中的大多数可以以可溶形式在细菌中表达。

单链二价抗体(scDb)是通过用大约15个氨基酸残基的连接子将两条二价抗体形成多肽链连接起来而产生的(见Holliger和Winter，1997Cancer Immunol.Immunother.，45(3-4)：128-30；Wu等人，1996Immunotechnology，2(1)：21-36)。scDb可以以可溶的活性单体形式在细菌中表达(见Holliger和Winter，1997Cancer Immunol.Immunother.，45(34)：128-30；Wu等人，1996Immunotechnology，2(1)：21-36；Pluckthun和Pack，1997Immunotechnology，3(2)：83-105；Ridgway等人，1996Protein Eng.，9(7)：617-21)。

二价抗体可与Fc融合，产生“双二价抗体”(见Lu等人，2004J.Biol.Chem.，279(4)：2856-65)。

本发明还提供了展示出抗体的功能性质但是其框架和抗原结合部分源于其它多肽(例如并非是抗体基因编码的那些，也不是抗体基因体内重组产生的那些多肽)的CDH11结合分子。这些结合分子的抗原结合结构域(例如CDH11结合结构域)是通过定向进化方法产生的。见，U.S.Pat.No.7,115,396。具有与抗体的可变结构域类似的总体折叠(“免疫球蛋白样”折叠)的分子是合适的支架蛋白。抗原结合分子适合源自的支架蛋白包括纤连蛋白或纤连蛋白二聚体、生腱蛋白、N-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、ICAM、肌联蛋白、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I-组结构域、肌球蛋白结合蛋白C的I-组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白结合蛋白H的I-组免疫球蛋白结构域、端蛋白的I-组免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、催乳激素受体、干扰素-γ受体、β-半乳糖苷酶/葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、过氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL或甜味蛋白。

非抗体结合分子的抗原结合结构域(例如免疫球蛋白样折叠)可具有小于10kD或大于7.5kD的分子质量(例如，7.5-10kDa之间的分子质量)。用于获得抗原结合结构域的蛋白是天然存在的哺乳动物蛋白(例如人蛋白)，较之其源于的蛋白的免疫球蛋白样折叠而言，抗原结合结构域包括至多50％(例如，至多34％、25％、20％或15％)的经突变的氨基酸。具有免疫球蛋白样折叠的结构域通常由50-150个氨基酸(例如，40-60个氨基酸)构成。

为产生非抗体结合分子，制造克隆文库，其中，对支架蛋白中形成抗原结合表面的区域(例如，在位置和结构上与抗体可变结构域免疫球蛋白折叠的CDR类似的区域)中的序列进行随机化。针对与目的抗原(例如hCDH11)的特异性结合以及针对其它功能(例如抑制CDH11的生物功能)，对文库克隆加以测试。选择的克隆可用作为基础，用于进一步的随机化和选择，以产生对抗原有更高亲和度的衍生物。

产生高度亲和性结合分子，例如，使用纤连蛋白III的第10模块(¹⁰Fn3)作为支架。针对¹⁰FN3的CDR样环中的每一个，在残基23-29、52-55和78-87处构建文库。为构建每种文库，通过寡核苷酸合成，对编码与每个CDR样区域重叠的序列的DNA片断随机化。用于产生可选择¹⁰Fn3的文库的技术被描述于U.S.Pat.Nos.6,818,418和7,115,396；Roberts和Szostak，1997Proc.Natl.Acad.Sci USA 94：12297；U.S.Pat.No.6,261,804；U.S.Pat.No.6,258,558和Szostak等人WO98/31700中。

非抗体结合分子可作为二聚体或多聚体产生，以增加对靶抗原的亲合力(avidity)。例如，抗原结合结构域表达为与抗体的恒定区域(Fc)(形成Fc-Fc二聚体)的融合。见例如U.S.Pat.No.7,115,396。

可用于本发明方法中的抗体还包括结合与本文所述的特定抗体相同或重叠的表位的那些抗体，即，针对与CDH11的结合竞争的抗体，或与CDH11上本文所述特定抗体识别的表位结合的抗体。

可使用常规技术，例如免疫检验，来鉴定识别相同或重叠表位的抗体，例如，通过显示一种抗体阻断另一抗体与靶标抗原的结合的能力来鉴定，即，竞争性结合检验。在下述检验中测定竞争性结合，其中，测试下的免疫球蛋白抑制参照抗体与抗原(例如CDH11)的特异性结合。数种类型的竞争性结合检验是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫检验(RIA)、固相直接或间接酶免疫检验(EIA)、夹心式竞争检验(见Stahli等人，(1983)Methods in Enzymology 9：242)；固相直接生物素-抗生物素EIA(见Kirkland等人，(1986)J.Immunol.137：3614)；固相直接标记检验、固相直接标记夹心式检验(见Harlow和Lane，(1988)Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(见Morel等人，(1988)Mol.Immunol.25(1)：7)；固相直接生物素-抗生物素EIA(Cheung等人，(1990)Virology 176：546)；和直接标记RIA(Moldenhauer等人，(1990)Scand.J.Immunol.32：77)。典型地，此类检验涉及使用结合到固体表面上的经纯化抗原(例如CDH11)或带有它们中任何的细胞、未经标记的测试免疫球蛋白和经标记的参照免疫球蛋白。竞争性抑制是通过测定在存在测试免疫球蛋白时与固体表面或细胞结合的标记的量来测量的。通常，测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将参照抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多。

在本文中使用时，术语“特异性结合”及其各种词性形式以及“选择性结合”及其各种词性形式表示：抗体或其抗原结合部分展示出与特定抗原或表位的可观的亲和性，并且通常不展示出与其它抗原或表位的显著的交叉反应性。“可观的”或优选的结合包括以至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹M^-1或10¹⁰M^-1的亲和性结合。优选超过10⁷M^-1的亲和性，超过10⁸M^-1的亲和性是更优选的。本文示出的这些值的中间值也意欲包括在本发明的范围内，优选的结合亲和性可示为亲和性的范围，例如10⁶至10¹⁰M^-1，优选10⁷至10¹⁰M^-1，更优选10⁸至10¹⁰M^-1。“不展示出显著的交叉反应性”的抗体是将不与不想要的物质(例如，不想要的蛋白性物质)可观结合的抗体。可根据本领域认可的用于测定此类结合的任何手段，包括，例如，根据Scatchard分析和/或竞争性结合检验，来测定特异性或选择性结合。

术语“K_D”在本文中使用时意欲表示特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数或者抗体针对抗原的亲和性。在一种实施方式中，使用表面等离子共振检验或细胞结合检验来测量时，根据本发明的抗体或其抗原结合部分以50nM或更好(即，或更低)(例如40nM或30nM或20nM或10nM或更低)的亲和性(K_D)与抗原(例如CDH11)结合。在一种特定的实施方式中，使用表面等离子共振检验或细胞结合检验来测量时，根据本发明的抗体或其抗原结合部分以8nM或更好(例如7nM、6nM、5nM、4nM、2nM、1.5nM、1.4nM、1.3nM、1nM或更低)的亲和性(K_D)与CDH11结合。在其它一些实施方式中，当在BIACORE 3000设备中，使用重组CDH11作为分析物，使用抗体作为配体，通过表面等离子共振(SPR)技术来测定时，抗体或其抗原结合部分以大约低于10^-7M，例如大约低于10^-8M、10^-9M或10^-10M或甚至更低的亲和性(K_D)与抗原(例如CDH11)结合，并且以是其与非特异性抗原(并非预定的抗原或紧密相关的抗原，例如BSA、酪蛋白)结合的亲和性的至少两倍高的亲和性与预定抗原结合。

术语“K_off”在本文中使用时意欲表示抗体从抗体/抗原复合体上解离的解离率常数。

术语“EC50”在本文中使用时表示抗体或其抗原结合部分在体外或体内检验中诱导出最大应答的50％的应答(即，最大应答和基线之间的半程)时的浓度。

在本文中使用时，“糖基化模式”被定义为与蛋白质(更具体地，与免疫球蛋白)共价连结的碳水化合物单位的模式。

术语“天然存在”在本文中用于客体时表示客体可在自然界中发现的事实。例如，生物(包括病毒)中存在的、可从自然界中的来源中分离的并且没有被实验室人为刻意修饰过的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。

术语“重排的”在本文中使用时表示重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V片断放置于紧邻D-J或J片断，其处于编码基本完整的VH或VL结构域的构象中。可通过与种系DNA比较来鉴定重排的免疫球蛋白基因座；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源性元件。

术语“未重排的”或“种系构型”在本文中关于V片断使用时表示下述构型，其中V片断没有被重组到以至于紧邻D或J片断。

术语“修饰”或其各种词性形式在本文中使用时意欲表示改变抗体中的一个或多个氨基酸。可通过在一个或多个位置添加、取代或缺失氨基酸来产生所述改变。可使用已知技术，例如PCR诱变来产生所述改变。例如，在一些实施方式中，可对本发明的方法中利用的抗体加以修饰，由此修饰抗体对CDH11的结合亲和性。

本发明还包括用于本发明的方法中的抗体序列中的“保守氨基酸取代”，即这样的核苷酸和氨基酸序列修饰，所述修饰不会使得所述核苷酸序列编码的或含有所述氨基酸序列的抗体与抗原(即CDH11)结合被取消。保守氨基酸取代包括一类氨基酸被同类的氨基酸取代，其中，类是通过共同的物理化学氨基酸侧链性质和在自然中发现的同源蛋白中的高取代频率(例如，通过标准Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵来测定)来定义的。已经分类出六类通常的氨基酸侧链的类，其包括：类I(Cys)；类II(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；类III(Asn、Asp、Gln、Glu)；类IV(His、Arg、Lys)；类V(Ile、Leu、Val、Met)；以及类VI(Phe、Tyr、Trp)。例如，Asp被类III另一残基，例如Asn、Gln或Glu取代是保守取代。因此，本发明的抗CDH11抗体中的预计非必需氨基酸残基优选被来自同类的另一氨基酸残基取代。鉴定不会使得抗原结合消失的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域公知的(见例如Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10)：879-884(1999)和Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：.412-417(1997))。

术语“非保守氨基酸取代”指一类中的氨基酸被另一类的氨基酸取代；例如，Ala(类II残基)被类III残基(例如Asp、Asn、Glu或Gin)取代。

或者，在另一实施方式中，可沿着抗CDH11抗体编码序列的全部或部分随机引入突变(保守或非保守的)，例如通过饱和诱变引入，并且可针对结合活性对得到的经修饰的抗CDH11抗体加以筛选。

“共有序列”是从相关序列家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(见例如Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987)。在蛋白家族中，共有序列中的每个位置被该家族中该位置上最频繁出现的氨基酸所占据。如果两种氨基酸以相同频率出现，那么共有序列中可包括其任一。免疫球蛋白的“共有框架”指共有免疫球蛋白序列中的框架区域。

类似地，可通过对本发明的CDH11抗体的CDR氨基酸序列进行最优比对，来获得针对CDR的共有序列。

经工程化和修饰的抗体

可使用具有一条或多条V_H和/或V_L序列的抗体作为起始材料，对经修饰的抗体工程化，来制备本发明的抗体，其中所述经修饰的抗体可具有与起始抗体不同的性质。可通过修饰一个或全部两个可变区域(即，V_H和/或V_L)中(例如，一个或多个CDR区域中和/或一个或多个框架区域中)的一个或多个残基，来对抗体工程化。此外或或者，可通过修饰恒定区域内的残基，来对抗体进行工程化，例如，以改变抗体的效应器功能。

可进行的一种类型的可变区域工程化是CDR移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链CDR中的氨基酸残基，与靶抗原相互作用。就此原因而言，在各抗体间，CDR内的氨基酸序列要比CDR外的序列更具多样性。因为CDR序列负责主要的抗体-抗原相互作用，因此可通过构建下述表达载体，来表达模拟特异性天然存在的抗体的性质之重组抗体，所述表达载体包括移植到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上的、来自特异性天然存在的抗体的CDR序列(见，例如Riechmann等人，1998Nature332：323-327；Jones等人，1986Nature 321：522-525；Queen等人，1989Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；U.S.Pat.No.5,225,539和U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

框架序列可从公开的DNA数据库或公开的文献(包括种系抗体基因序列)中获得。例如，针对人重链和轻链可变区域基因的种系DNA序列可在“VBase”人种系序列数据库(可在Internet上于www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)中找到，以及在Kabat等人，1991Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson等人，1992J.Mol.Biol.227：776-798和Cox等人，1994Eur.J.Immunol.24：827-836中找到；它们每篇的内容都通过明确引入本文作为参考。

V_H CDR1、2和3序列和V_L CDR1、2和3序列可被移植到下述框架区域上，所述框架区域具有与框架序列来源的种系免疫球蛋白基因中所发现的相同的序列，或者CDR序列可被移植到较之种系序列而言含有一处或多处突变的框架区域上。例如，已经发现，在某些情况下，在框架区域内突变残基对于保持或增强抗体的抗原结合能力来说是有利的(见，例如，U.S.Pat.Nos.5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。

还可将CDR移植进并非免疫球蛋白结构域的多肽的框架区域中。合适的支架形成构象上稳定的框架，其展示移植的残基，由此它们形成局部表面，并且结合目的靶标(例如CDH11)。例如，可将CDR移植到支架上，其中，框架区域基于纤连蛋白、锚蛋白(ankyrin)、脂质运载蛋白(lipocalin)、neocarzinostain、细胞色素b、CP1锌指、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z结构域或tendramisat(见例如Nygren和Uhlen，1997Current Opinion in Structural Biology，7，463-469)。

另一种类型的可变区域修饰是对V_H和/或V_L CDR1、CDR2和/或CDR3区域中的氨基酸残基加以突变，由此改善目的抗体的一种或多种结合性质(例如亲和性)，这被称为“亲和性成熟”。可进行定点诱变或PCR介导的诱变，以引入突变，可在本文所述的体外或体内检验中评价对抗体结合或其它目的功能性质的作用。可引入保守修饰。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，典型地，在CDR区域中改变不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。

本发明的经工程化的抗体包括在V_H和/或V_L中的框架残基中进行了修饰的那些，例如，以改善抗体的性质。典型地，进行此类框架修饰，以减少抗体的免疫原性。例如，一种手段是将一个或多个框架残基“突变回(backmutated)”相应的种系序列。更具体地，经历体突变的抗体可含有不同于抗体所源于的种系序列的框架残基。可通过将抗体框架序列与抗体所源于的种系序列加以比较，来鉴定此类残基。为将框架区域序列返回至其种系构型，可通过，例如，定点诱变或PCR介导的诱变，将体突变“突变回”种系序列。此类“突变回”的抗体也是本发明所包括的。

另一类型的框架修饰包括对框架区域内或者甚至一个或多个CDR区域内的一个或多个残基加以突变，以除去T-细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。该手段还被称为“去免疫”，在Carr等人的U.S.Pat.Pub.No.20030153043中对其有更详细的描述。

除了框架或CDR区域中进行的修饰之外，或作为选择，可对本发明的抗体进行工程化，以在Fc区域内包括修饰，典型地，用于改变抗体的一种或多种功能性质，例如，血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性的细胞毒性。此外，本发明的抗体可被化学修饰(例如，可向抗体连结一个或多个化学基元)，或被修饰以改变其糖基化，再改变抗体的一种或多种功能性质。

在一种实施方式中，对CH1的铰链区域加以修饰，使得铰链区域的半胱氨酸残基的数量被改变，例如，增加或减少。该手段由Bodmer等人进一步描述于U.S.Pat.No.5,677,425中。CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数量被改变，以例如协助轻链和重链的装配，或者增加或减少抗体的稳定性。

在另一实施方式中，抗体的Fc铰链区域被突变，以减少抗体的生物半衰期。更具体地，一个或多个氨基酸突变被引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域交界区域，使得抗体较之天然Fc-铰链结构域SpA结合而言具有受损的葡萄球菌A蛋白(SpA)结合。该手段在Ward等人的U.S.Pat.No.6,165,745中被更详细地描述。

在另一实施方式中，抗体被修饰，以增加其生物半衰期。多种手段是可能的。例如，U.S.Pat.No.6,277,375描述了在IgG中的增加其体内半衰期的突变：T252L、T254S、T256F。或者，为了增加生物半衰期，可在CH1或CL区域中对抗体加以改变，以含有取自IgG的Fc区域的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的U.S.Pat.Nos.5,869,046和6,121,022所述。

在另外一些实施方式中，通过用不同的氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区域，以改变抗体的效应器功能。例如，可用不同的氨基酸残基置换一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的针对效应器配体的亲和性，但是仍然保留亲本抗体的抗原结合能力。其亲和性被改变的效应器配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1组分。该手段在Winter等人的U.S.Pat.Nos.5,624,821和5,648,260中被更详细地描述。

在另一个实施方式中，可用不同的氨基酸残基置换选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消失的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该手段在Idusogie等人的U.S.Pat.Nos.6,194,551中被更详细地描述。

在另一实施方式中，对一个或多个氨基酸残基加以改变，由此改变抗体的补体结合能力。该手段在Bodmer等人的WO 94/29351中被更详细地描述。

在另一实施方式中，通过修饰一个或多个氨基酸，对Fc区域加以修饰，以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力，和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和性。该手段在Presta的WO 00/42072中被更进一步地描述。此外，人IgG1上针对FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已被图谱定位，已经描述了具有改善的结合的变体(见Shields，R.L.等人，2001J.Biol.Chem.276：6591-6604)。

在还一种实施方式中，对抗体的糖基化加以修饰。例如，可产生去糖基化(aglycosylation)的抗体(即，所述抗体缺乏糖基化)。可对糖基化加以改变，例如以增加抗体对抗原的亲和性。可例如通过改变抗体序列内一个或多个糖基化位点，来完成此类碳水化合物修饰。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，导致消除一个或多个可变区域框架糖基化位点，由此消除该位点的糖基化。此类去糖基化可增加抗体对抗原的亲和性。此类手段在Co等人的U.S.Pat.Nos.5,714,350和6,350,861中被更详细地描述。

此外或作为选择，产生具有改变的糖基化类型的抗体，例如，具有降低的量的岩藻糖基残基的岩藻糖基化不足的抗体，或者具有增加的二分GlcNac结构的抗体。此类改变的糖基化模式已被证实能增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可通过，例如，在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中被描述过，其可用作为宿主细胞，其中，表达本发明的重组抗体，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，使得在此类细胞系中表达的抗体展示出岩藻糖基化不足。Presta的PCT Pub.WO03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)相连的碳水化合物上的能力降低，还导致该宿主细胞中表达的抗体岩藻糖基化不足(还见Shields，R.L.等人，2002J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的WO 99/54342描述了经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N乙酰糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得经工程化的细胞系中表达的抗体展示出增加的二分GlcNac结构，这导致抗体的增加的ADCC活性(还见Umana等人，1999Nat.Biotech.17：176-180)。

本发明包括的对本文中抗体的另一修饰是聚乙二醇化。可对抗体聚乙二醇化，以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为对抗体进行聚乙二醇化，典型地，用聚乙二醇(PEG)例如PEG的反应性酯或醛衍生物，与抗体或其片段反应，反应在一个或多个PEG基元与抗体或抗体片段连结的条件下进行。可使用反应性PEG分子(或类似的反应性的水溶性聚合物)，通过酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。在本文中使用时，术语“聚乙二醇”意欲包括已被用于衍生化其它蛋白的任何形式的PEG，例如，单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来亚酰胺。在某些实施方式中，将被聚乙二醇化的抗体是非糖基化的抗体。用于对蛋白进行聚乙二醇化的方法是本领域已知的，其可应用于本发明的抗体。见，例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。

此外，可通过引入非天然氨基酸，在本发明的CDH11结合多肽的任何部分实现聚乙二醇化。可通过Deiters等人，J Am Chem Soc125：11782-11783，2003；Wang和Schultz，Science 301：964-967，2003；Wang等人，Science 292：498-500，2001；Zhang等人，Science 303：371-373，2004或US Patent No.7,083,970描述的技术引入某些非天然氨基酸。简言之，这些表达系统中的一些涉及定点诱变，以向编码本发明多肽的开放读码框中引入无义密码子，例如，琥珀TAG。然后再将此类表达载体引入可利用对引入的无义密码子来说具有特异性的tRNA的宿主，填充选择的非天然氨基酸。对将基元与本发明的多肽缀合的目的有益的特定非天然氨基酸包括具有乙炔和叠氮化物侧链的那些。然后可在蛋白中这些选择的位点上对含有这些新颖的氨基酸的多肽进行聚乙二醇化。

B.免疫缀合物

在另一方面，本发明利用了靶向CDH11并且抑制或下调CDH11的免疫缀合物试剂。可靶向CDH11的试剂包括但不限于：化疗剂，细胞毒性试剂，抗炎性试剂，例如类固醇或非类固醇类炎性试剂，或者细胞毒素抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)，烷基化试剂(例如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二氨铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前也称道诺霉素)和多柔比星)，抗生素(例如放线菌素(以前的actinomycin)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂试剂(例如长春新碱和长春碱)。

术语“细胞毒素”或“细胞毒性试剂”包括对细胞有害的任何试剂(例如杀死细胞)。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊甙、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。

可通过将抗体和合适的治疗剂缀合(例如，化学连接或重组表达)来形成免疫缀合物。合适的试剂包括，例如，细胞毒性试剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)和/或放射性同位素(即，放射缀合物)。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、塑莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、Phytolacaamericana蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、白树毒素(gelonin)、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族毒素(tricothecenes)。可获得多种放射性核素，用于产生经放射缀合的抗CDH11抗体。例子包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰y和¹⁸⁶Re。

可使用多种双功能蛋白偶联试剂来制造免疫缀合物，所述试剂例如，N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)丙酸盐(SPDP)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯(dimethyladipimidate)HCL)、活性酯类(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(例如glutareldehyde)、双叠氮化合物(例如双(p-叠氮苯甲酰)己二胺)、双重氮基衍生物(例如双(p-重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如tolyene 2，6-diisocyanate)和双活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以按照Vitetta等人Science 238：1098(1987)所述来制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。经碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合试剂(见；例如WO94/11026)。

C.小分子抑制剂

在另一实施方式中，本发明中利用的CDH11拮抗剂是小分子抑制剂。在本文中使用时，术语“小分子抑制剂”是本领域的术语，其包括小于大约7500，小于大约5000，小于大约1000分子量或小于大约500分子量并且抑制CDH11活性的分子。示例性的小分子抑制剂包括但不限于：肽、肽模拟物、核酸、碳水化合物、小有机分子(例如Cane等人1998.Science282：63)和天然产物提取物文库。在另一实施方式中，化合物是小的、有机非肽化合物。和抗体一样，这些小分子抑制剂可结合和/或阻断CDH11介导的细胞相互作用。

D.核酸/反义分子

在另一实施方式中，用于本发明中的CDH11拮抗剂是与编码CDH11的基因或所述基因的部分互补的反义核酸分子，或是编码所述反义核酸分子的重组表达载体。在本文中使用时，“反义”核酸包含与编码蛋白的“正义”核酸互补的核苷酸序列，例如，与双链cDNA分子的编码链互补，与mRNA互补或与基因的编码链互补。因此，反义核酸可以与正义核酸以氢键相连。

反义核酸用于下调特定蛋白质在细胞中的表达是本领域公知的(见例如Weintraub，H.等人，Antisense RNA as a molecular tool for geneticanalysis，Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986；Askari，F.K.和McDonnell，W.M.(1996)N.Eng.J.Med.334：316-318；Bennett，M.R.和Schwartz，S.M.(1995)Circulation 92：1981-1993；Mercola，D.和Cohen，J.S.(1995)Cancer Gene Ther.2：47-59；Rossi，J.J.(1995)Br.Med.Bull.51：217-225；Wagner，R.W.(1994)Nature 372：333-335)。反义核酸分子包含与另一核酸分子的编码链(例如mRNA序列)互补并且因此能与另外的核酸分子的编码链以氢键结合的核苷酸序列。与mRNA的序列互补的反义序列可与mRNA的编码区域、mRNA的5’或3’非翻译区域或桥联编码区域和非反义区域的区域(例如，在5’非反义区域和编码区域的连接处)中发现的序列互补。此外，反义核酸可在序列上与编码mRNA的基因的调控区域(例如转录起始序列或调控元件)互补。优选地，反义核酸被设计为与mRNA的编码链上起始密码子之前或跨越该起始密码子的区域或3’非反义区域中的区域互补。

可按照Watson和Crick碱基配对的规则来设计反义核酸。反义核酸分子可与CDH11mRNA的整个编码区域互补，但是更优选地，其是仅对CDH11mRNA的编码或非编码区域的一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可与CDH11mRNA的翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸可以是，例如，大约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸长。可使用本领域已知的流程，使用化学合成和酶促连接反应来构建反义核酸。例如，可使用天然存在的核苷酸或经不同修饰的核苷酸(设计来增加分子的生物稳定性或增加反义和正义核酸之间形成的双链体的物理稳定性)来化学合成反义核酸(例如反义寡核苷酸)，例如，可使用硫代磷酸酯衍生物和经吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的经修饰的核苷酸的例子包括：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(mannosylqueosine)、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。或者，可使用其中以反义方向亚克隆进核酸的表达载体，以生物方式来生产反义核酸(即，从该插入的核酸转录的RNA对于目标核酸来说是反义方向的，这将在后续章节进一步描述)。

本发明方法中可利用的反义核酸分子典型地施用给受试者或者原位产生，使得它们与编码CDH11的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，由此抑制CDH11的表达，例如，通过抑制转录和/或翻译来实现。杂交可以是通过传统核苷酸互补性形成稳定双链体来进行，或者，例如，在与DNA双链体结合的反义核酸分子的情况下，通过双螺旋体的大槽中的特异性相互作用来进行。施用反义核酸分子的途径的例子包括在组织位点直接注射。或者，可对反义核酸分子加以修饰，以靶向选择的细胞，然后全身性施用。例如，为全身性施用，可对反义分子加以修饰，使得它们与选择的细胞表面上表达的抗原或受体特异性结合，例如，通过将反义核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的抗体或肽相连来进行。还可使用本文所述的载体将反义核酸分子递送至细胞。为获得反义分子的足够的细胞内浓度，其中将反义核酸分子放置于强的pol II或pol III启动子控制下的载体构建体是优选的。

在又一实施方式中，本发明的方法利用的反义核酸分子可包括α-异头核酸分子。α-异头核酸分子形成与互补性RNA的特异性双联杂化物，其中，与通常的β-单位相反，链互相平行(Gaultier等人(1987)Nucleic Acids.Res.15：6625-6641)。反义核酸分子还可包含2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人(1987)Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人(1987)FEBS Lett.215：327-330)。

在另一实施方式中，用于本发明方法中的反义核酸是介导RNAi的化合物。RNA干扰实际包括但不限于，核酸分子，其包括与CDH11或其片断同源的RNA分子，“短干扰RNA”(siRNA)、“短发卡”或“小发卡RNA”(shRNA)和通过RNA干扰(RNAi)干扰或抑制靶基因表达的小分子。RNA干扰是转录后的靶向的基因沉默技术，其利用双链RNA(dsRNA)去降解含有与dsRNA相同序列的信使RNA(mRNA)(Sharp，P.A.和Zamore，P.D.287，2431-2432(2000)；Zamore，P.D.，等人Cell 101，25-33(2000).Tuschl，T.等人Genes Dev.13，3191-3197(1999))。当内源核糖核酸酶将较长的dsRNA切割为较短的21或22个核苷酸长的RNA(被称为小干扰RNA或siRNA)时，该过程发生。然后较小的RNA片断介导对靶mRNA的降解。用于合成RNAi的试剂盒可从例如New EnglandBiolabs和Ambion商业获得。在一种实施方式中，可利用上文所述的用于反义RNA的一种或多种化学品。

在还一实施方式中，反义核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能切割与其具有互补区域的单链核酸，例如mRNA。因此，核酶(例如，锤头状核酶，描述于Haselhoff和Gerlach，1988，Nature334：585-591)可用于催化切割CDH11mRNA转录本，由此抑制CDH11mRNA的翻译。

或者，可通过靶向与CDH11的调控区域(例如，CDH11启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，形成阻止CDH11基因在靶细胞中转录的三螺旋结构，来抑制基因表达。一般见Helene，C.，1991，Anticancer DrugDes.6(6)：569-84；Helene，C.等人，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36和Maher，L.J.，1992，Bioassays 14(12)：807-15。

E.融合蛋白和源于CDH11的肽性化合物

在另一实施方式中，用于本发明的方法中的CDH11拮抗剂是源于CDH11氨基酸序列的融合蛋白或肽化合物。特别地，抑制性化合物包含CDH11的融合蛋白或部分(或其模拟物)，其介导CDH11与靶分子的相互作用，使得CDH11与该融合蛋白或肽性化合物的接触竞争性抑制CDH11与靶分子的相互作用。可使用本领域已知的标准技术来制造此类融合蛋白和肽性化合物。例如，可使用标准肽合成技术，通过化学合成来制造肽性化合物，然后通过本领域已知的多种用于将肽引入细胞的技术(例如脂质体等)，将其引入细胞。

可通过肽修饰来提高本发明的CDH11融合蛋白或肽性化合物的体内半衰期，例如向CDH11添加N-连接的糖基化位点，或者通过将CDH11与聚(乙二醇)(PEG；聚乙二醇化)缀合(例如经由赖氨酸-单聚乙二醇化)来实现。所述技术已被证实对于延长治疗用蛋白药物的半衰期有益。预计：本发明的CDH11多肽的聚乙二醇化可导致相似的药物优点。

此外，可通过引入非天然氨基酸，在本发明的多肽的任何部分中实现聚乙二醇化。可通过Deiters等人，J Am Chem Soc 125：11782-11783，2003；Wang和Schultz，Science 301：964-967，2003；Wang等人，Science292：498-500，2001；Zhang等人，Science 303：371-373，2004或US Patent No.7,083,970中描述的技术来引入某些非天然氨基酸。简言之，这些表达系统中的一些涉及定点诱变，以向编码本发明的多肽的开放读码框中引入无义密码子，例如琥珀TAG。然后可将此类表达载体引入可利用对引入的无义密码子来说特异性的tRNA的宿主中，并填充选择的非天然氨基酸。就将基元与本发明的多肽缀合的目的而言，有利的特定非天然氨基酸包括具有乙炔和叠氮基侧链的那些。含有这些新颖氨基酸的CDH11多肽由此可在蛋白中这些选定位置被聚乙二醇化。

III.治疗方法

本发明提供了特定的新颖的治疗和诊断应用，其中利用CDH11拮抗剂。

术语“治疗”及其各种词性形式在本文中使用时表示本文所述的治疗或预防手段。“治疗”方法包括将CDH11拮抗剂施用给受体，用于预防、治愈、延迟、降低疾病、病况或感染的严重性或者减轻疾病、病况疾病或感染的一种或多种症状，以使受试者的存活延长，超过不进行此类治疗时所预计的那样。

术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。

在本文中使用时，术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本发明的方法和组合物可用于治疗具有癌症的受试者。在一种特定的实施方式中，受试者是人。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。

术语“样品”表示来自患者或受试者的组织、体液或细胞。正常情况下，将从患者中移出组织或细胞，但是体内诊断也包括在本发明内。其它患者样品，包括尿液、泪液、血清、脑脊液、粪便、痰、细胞提取物等。

A.适应症

在一个方面，本发明的方法可用于抑制或预防上皮-间充质转换(EMT)或内皮-间充质转换(EnMT)。在一种特定实施方式中，EMT或EnMT与纤维化相关。

此外，本发明的方法可用于治疗、预防或降低多种其它疾病或疾病的严重性。可使用本文公开的CDH11拮抗剂来治疗和/或诊断的合适疾病包括：血管纤维化、与肺性高血压相关的血管纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、肺纤维化、眼纤维化(包括全身性硬化(硬皮病))、关节纤维化、间皮纤维化和肠纤维化(例如炎性肠病)。可被治疗的更具体的纤维化类型包括但不限于：胰腺和肺的囊性纤维化、心内膜心肌纤维化、特发性心肌病、肺的特发性肺纤维化、弥漫性肺间质疾病(Diffuseparenchymal lung disease)、纵隔纤维化(即，特征在于集中于淋巴结上的侵入性的、钙化的纤维化，其阻断主要血管和气道)、Myleofibrosis(即，一种骨髓病症，其中骨髓被纤维性(疤痕)组织替换)、腹膜后纤维化(即，特征在于腹膜后腔(含有肾、主动脉、肾通道和多种其它结构的身体腔室)中的纤维性组织增生的疾病、进行性大块肺纤维化(即，通过煤尘在肺中沉积产生的疾病，其通过身体对灰尘的免疫反应发展；也被称为复杂尘肺病)、增殖性纤维化、增生性纤维变性(neoplastic fibrosis)、肺结核(TB)导致的肺纤维化、镰状细胞性贫血导致的脾纤维化和类风湿性关节炎。

本发明的方法还可用于预防或降低慢性组织排异的严重性，即，例如，移植或植入的组织的排异。示例性的移植组织包括但不限于骨、眼角膜以及大器官，例如心、肾、肝、肺和胰腺。

在还其它一些实施方式中，本发明的方法利用的CDH11拮抗剂可用于治疗免疫病症，其包括但不限于：变态反应性支气管肺曲霉菌病(allergicbronchopulmonary aspergillosis)；变应性鼻炎；自身免疫性溶血性贫血；黑棘皮病；变态反应性接触性皮炎；Addison′s病；异位性皮炎；斑秃；普秃；淀粉样变性；过敏性紫癜；类过敏反应；再生障碍性贫血；遗传性血管性水肿；先天性血管性水肿；强直性脊柱炎；颅动脉炎；巨细胞动脉炎；多发性大动脉炎；颞动脉炎；哮喘；毛细血管扩张性共济失调症；自身免疫性卵巢炎；自身免疫性睾丸炎；自身免疫性多内分泌腺衰竭(Autoimmune polyendocrine failure)；Behcet′s病；Berger′s病；Buerger′s病；支气管炎；大疱性天疱疮(Bullous pemphigus)；慢性皮肤黏膜念珠菌病；Caplan′s综合征；心肌梗塞后综合征；心包切开术后综合征；心脏炎；乳糜泻；Chagas′s病；Chediak-Higashi综合征；Churg-Strauss病；肝硬化；Cogan′s综合征；冷凝集素病；CREST综合征；Crohn′s病；冷球蛋白血症；隐匿性致纤维化性肺泡；疱疹样皮炎；皮肌炎；糖尿病；Diamond-Blackfan综合征；DiGeorge综合征；盘状红斑狼疮；嗜酸性筋膜炎；巩膜外层炎；持久隆起性红斑(Drythema elevatum diutinum)；边缘性红斑；多形红斑；结节性红斑；家族性地中海热；Felty′s综合征；肺纤维化；过敏性肾小球肾炎(Glomerulonephritis，anaphylactoid)；自身免疫性肾小球肾炎；感染后肾小球肾炎；移植后肾小球肾炎；膜性肾病；Goodpasture′s综合征；免疫介导的粒细胞缺乏症；环状肉芽肿；过敏性肉芽肿；肉芽肿性肌炎；Grave′s病；桥本氏甲状腺炎；新生儿溶血症；原发性血色病；过敏性紫癜；慢性活动型和慢性进行性肝炎；组织细胞增多病X；高嗜酸粒细胞综合征；特发性血小板减少性紫癜；Job′s综合征；儿童皮肌炎；儿童类风湿性关节炎(儿童慢性关节炎)；Kawasaki′s病；角膜炎；结膜干燥症；Landry-Guillain-Barre-Strohl综合征；瘤型麻风；Loeffier′s综合征；狼疮；狼疮性肾炎；Lyell′s综合征；Lyme病；淋巴瘤样肉芽肿病；系统性肥大细胞增生症；混合性结缔组织病；多发性单神经炎；Muclle-Wells综合征；皮肤粘膜淋巴结综合征；皮肤粘膜淋巴结综合征；多中心网状组织细胞增生症；多发性硬化；重症肌无力；蕈样肉芽肿；全身性坏死性血管炎；肾病综合征；重叠综合征；脂膜炎；阵发性冷性血红蛋白尿；阵发性睡眠性血红蛋白尿；类天疱疮；天疱疮；红斑性天疱疮；落叶状天疱疮；寻常型天疱疮；饲鸽者病；过敏性肺炎；结节性多动脉炎；风湿性多肌痛；多肌炎；特发性多神经炎；葡萄牙裔家族性多神经病(Portuguese familial polyneuropathies)；先兆子痫/惊厥；原发性胆汁性肝硬化；进行性系统性硬化病(硬皮病)；牛皮癣；银屑病关节炎；肺泡蛋白质沉积症；肺纤维化，Raynaud′s现象/综合征；Reidel′s甲状腺炎；Reiter′s综合征，复发性多软骨炎；风湿热；类风湿性关节炎；肉状瘤病；巩膜炎；硬化性胆管炎；硬皮病，血清病；Sezary综合征；Sjogren′s综合征；Stevens-Johnson综合征；Still′s病；亚急性硬化性全脑炎；交感性眼炎；系统性红斑狼疮；移植排异；溃疡性结肠炎；未分化结缔组织病；慢性荨麻疹；寒冷性荨麻疹；葡萄膜炎；白癫风；Weber-Christian病；Wegener′s肉芽肿和Wiskott-Aldrich综合征。

B.组合疗法

本发明的方法中利用的CDH11拮抗剂可单独施用，或与其它治疗剂组合施用。例如，拮抗剂可与细胞毒素、其它已知的治疗剂(即免疫抑制剂、化疗剂、放射毒性剂和/或其它治疗性抗体)组合施用(即，与之一起施用或者与之相连接(即，免疫缀合物)而施用)。拮抗剂还可与所述试剂分开施用。在分开施用的情况下，拮抗剂可在所述试剂之前、之后或同时施用，或者可以与其它已知的治疗(例如抗癌治疗，例如放疗)共同施用。

在一种实施方式中，拮抗剂与第二结合分子，例如第二抗体(即，由此形成双特异性分子)或结合不同靶标或CDH11上不同表位的其它结合试剂相连。可用于与本文公开的拮抗剂组合治疗的其它治疗剂的例子在上文关于免疫缀合物的章节中有更详细的描述。

C.剂量/含量

术语“有效量”和“治疗有效量”在本文中使用时表示：施用给受试者时，足以对与如本文所述CDH11的增加表达相关的感染或疾病进行有效治疗、预后或诊断的拮抗剂的量。治疗有效量将根据受试者和被治疗的感染或疾病、受试者的体重和年龄、感染或疾病病况的严重性、施用方式等而变化，这是本领域普通技术人员容易确定的。用于施用的剂量可在例如大约1ng至大约10,000mg，大约5ng至大约9,500mg，大约10ng至大约9,000mg，大约20ng至大约8,500mg，大约30ng至大约7,500mg，大约40ng至大约7,000mg，大约50ng至大约6,500mg，大约100ng至大约6,000mg，大约200ng至大约5,500mg，大约300ng至大约5,000mg，大约400ng至大约4,500mg，大约500ng至大约4,000mg，大约1μg至大约3,500mg，大约5μg至大约3,000mg，大约10μg至大约2,600mg，大约20μg至大约2,575mg，大约30μg至大约2,550mg，大约40μg至大约2,500mg，大约50μg至大约2,475mg，大约100μg至大约2,450mg，大约200μg至大约2,425mg，大约300μg至大约2,000，大约400μg至大约1,175mg，大约500μg至大约1,150mg，大约0.5mg至大约1,125mg，大约1mg至大约1,100mg，大约1.25mg至大约1,075mg，大约1.5mg至大约1,050mg，大约2.0mg至大约1,025mg，大约2.5mg至大约1,000mg，大约3.0mg至大约975mg，大约3.5mg至大约950mg，大约4.0mg至大约925mg，大约4.5mg至大约900mg，大约5mg至大约875mg，大约10mg至大约850mg，大约20mg至大约825mg，大约30mg至大约800mg，大约40mg至大约775mg，大约50mg至大约750mg，大约100mg至大约725mg，大约200mg至大约700mg，大约300mg至大约675mg，大约400mg至大约650mg，大约500mg或大约525mg至大约625mg本发明的抗体的范围内。可对剂量方案加以调节，以提供最优治疗应答。有效量也是这样的量，其中，拮抗剂的任何毒性或有害作用(即，副作用)被最小化和/或被有益效果的价值所超过。

用于本发明方法中的拮抗剂的实际剂量水平可有所改动，以获得能针对特定患者、组合和施用方式而言有效实现想要的治疗应答并且对患者无毒的活性成分的量。选用的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括应用的特定拮抗剂或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，利用的特定拮抗剂的排出速率，治疗持续时间，用于与所使用的特定拮抗剂组合的其它药物、化合物和/或材料，被治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般性健康情况和之前的病史，以及医疗领域公知的类似因素。具有本领域普通技能的医师或兽医可容易地确定所需的拮抗剂的有效量并给出处方。例如，医师或兽医可从比获得想要的治疗效果所需的水平较低的水平开始给拮抗剂剂量，并且逐渐增加剂量，直到获得想要的效果。通常，拮抗剂的合适每日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量。此类有效剂量通常将取决于上文描述的因素。优选地，施用以静脉内、肌内、腹膜内或皮下方式进行，优选施用到靶标位点附近。如果希望的话，拮抗剂的有效每日剂量可以以合适的间隔在每天中以两次、三次、四次、五次、六次或更多次亚剂量分别施用，任选地，以单位剂量形式进行。虽然本发明的拮抗剂可单独施用，但优选地，拮抗剂作为药物制剂(组合物)施用。

对剂量方案加以调节，以提供最优想要的应答(例如治疗应答)。例如，可施用单次药剂(bolus)，可随时间施用若干次分开的剂量，或者可根据治疗状况的需要适当增减剂量。例如，用于本发明方法中的拮抗剂可通过皮下注射每周施用一次或两次，或者可通过皮下注射每月施用一次或两次。

为易于施用以及就剂量均匀性来说，配制剂量单位形式的非肠道拮抗剂是尤其有利的。用于本文中的剂量单位形式指物理上离散的单位，其装配为用于待治疗的受试者的单位剂量；每个单位含有与所需的药物载体联合的预定的量的活性拮抗剂，所述量是经过计算的，以产生想要的治疗效果。关于剂量单位形式的规格由下述内容规定，并且直接取决于它们，所述内容是：(a)活性拮抗剂的独特性质和想要实现的特定治疗效果，以及(b)在个体敏感性方面，本领域中配制用于治疗的此类活性拮抗剂的内在限制。

D.施用和配制方法

为通过某些施用途径施用本发明方法中使用的拮抗剂，可能必须要将拮抗剂与防止其失活的材料共施用。例如，拮抗剂可以在合适的载体(例如脂质体)或稀释剂中施用给受试者。可药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水的CGF乳液以及传统脂质体(Strejan等人(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。

可药用载体包括无菌水性溶液或分散液和用于临时配制无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。用于药物活性物质的此类媒介和试剂的使用是本领域已知的。除了与活性拮抗剂不相容的任何传统媒介或试剂之外，在药物组合物中使用媒介或试剂是本发明所包括的。补充性活性化合物也可随拮抗剂一起被包括进去。

典型地，治疗性拮抗剂应当是无菌的，并且在生产和贮藏条件下稳定。拮抗剂可作为溶液、微乳液、脂质体或者适于高药物浓度的其它有序结构配制。载体可以是溶剂或分散剂媒介，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可例如通过使用涂层，例如卵磷脂，通过保持需要的颗粒大小(在分散剂的情况下)以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。在很多情况下，在组合物中包括等张剂是优选的，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可通过包括进延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，来实现对可注射组合物的延长吸收。

可通过以需要的量将活性拮抗剂包括进具有上文列举的成分之一或组合的合适溶剂(根据需要)，接着灭菌微滤，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物包括进无菌载剂(含有基础分散剂媒介和所需的其它成分(来自上文列举的那些))，来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥以及冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其之前经灭菌过滤的溶液的任何其它想要的成分的粉末。

可用于本发明方法中的治疗性拮抗剂包括适于口服、经鼻、局部(包括经颊和舌下)、直肠、阴道和/或非肠道施用的那些。制剂可方便地呈现为单位剂量形式，可通过制药领域已知的任何方法来制备它们。可与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量将根据被治疗的受试者以及特定使用模式而变化。可与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量将通常是产生治疗效果的拮抗剂的量。通常，从百分比来说，该量将从大约0.001％至大约90％的活性成分，优选大约0.005％至大约70％，最优选大约0.01％至大约30％。

“非肠道施用”及其各种词性形式在本文中使用时表示除了肠道和局部施用之外的施用模式，通常通过注射进行，其包括但不限于：静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜外或胸骨内(intrasternal)注射和输注。

可与用于本发明方法的拮抗剂一起使用的合适的水性和非水性载体的例子包括：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。可例如通过使用涂层材料，例如卵磷脂，通过保持需要的颗粒大小(在分散剂的情况下)，以及通过使用表面活性剂，来保持合适的流动性。

拮抗剂还可与佐剂一起施用，所述佐剂例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。预防微生物存在可通过上文的灭菌过程以及通过加入多种抗细菌和抗真菌试剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等等)两者来确保。还可能想要向组合物中加入等张剂，例如糖、氯化钠等等。此外，可通过包括进延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来实现可注射药物形式的延长吸收。

当用于本发明方法中的拮抗剂施用给人和动物时，它们可单独给予或者可作为含有与可药用载体组合的例如0.001至90％的活性成分(更优选地，0.005至70％，例如0.01至30％)的药物拮抗剂给予。

可用本领域已知的医药设备来施用拮抗剂。例如，在优选实施方式中，可用无针头皮下注射设备施用拮抗剂，例如U.S.Pat.Nos.5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556所示的设备。可用于本发明的公知的植入体和模块的例子包括：U.S.Pat.No.4,487,603，其公开了可植入的微输注泵，用于以受控速率分散药剂；U.S.Pat.No.4,486,194，其公开了用于通过皮肤施用药剂的治疗设备；U.S.Pat.No.4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药剂的药剂输注泵；U.S.Pat.No.4,447,224，其公开了可变流速的可植入输注装置，用于连续药物递送；U.S.Pat.No.4,439,196，其公开了具有多个腔区室的渗透性药物递送系统；以及U.S.Pat.No.4,475,196，其公开了一种渗透性药物递送系统。很多其它此类植入体、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。

在某些实施方式中，可对拮抗剂加以配制，以确保正确的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)除外了很多高度亲水的化合物。为确保拮抗剂穿过BBB(如果需要的话)，可例如将其配制于脂质体中。关于生产脂质体的方法，见例如U.S.Pat.Nos.4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可包含选择性运输进特定细胞或器官由此增强靶向药物递送的一种或多种基元(见例如V.V.Ranade，1989J.Clin Pharmacol.29：685)。示例性的靶向基元包括：叶酸盐或生物素(见例如Low等人的U.S.Pat.5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，1988Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人，1995FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，1995Antimicrob.Agents Chernother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)，其不同种可包含本发明的制剂以及发明的分子的组分；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；还见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

IV.诊断方法

本发明提供了特定的新颖的诊断应用，用于测定和预测受试者是否具有特定的CDH11相关疾病或处于发展出特定的CDH11相关疾病的风险中。还提供了用于确定诊断为具有CDH11相关疾病的受试者的预后的方法。在本文中使用时，术语“CDH11相关疾病”指与异常或升高的CDH11相关的任何病况或疾病，包括上文在治疗方法的章节所讨论的任何适应症，例如EMT、EnMT、纤维化(例如肾纤维化)或慢性同种异体移植物排异。

在一种实施方式中，本发明提供了针对特定的生物标志物，即CDH11，对来自受试者的样品进行检验的方法，其中CDH11的异常或升高的水平指示CDH11相关疾病，例如EMT、EnMT、纤维化(例如肾纤维化)或慢性同种异体移植物排异。

在另一实施方式中，本发明提供了诊断CDH11相关疾病的方法，所述方法包括：(i)将靶样品与和CDH11反应的试剂接触；以及检测CDH11，其中CDH11相对于正常对照来说升高的浓度指示CDH11相关疾病。

怀疑具有CDH11相关疾病的个体将受益于尽早进行用于检测升高或异常的CDH11表达的诊断性测试，由此可推迟或者甚至停止疾病进程。

在本文中使用时，术语“生物标志物”指任何基于生物的疾病标志物。例如，生物标志物可以是可用于客观测量和评估正常生物学过程、病原性过程或对治疗性干预的药理学应答的生化特征或特点。在本发明的方法中，CDH11是可用于评估受试者是否处于发展出特定病况或疾病的风险中的生物标志物。例如，在本发明中，较之合适对照(例如，CDH11在正常或健康样品中的存在或水平)，CDH11升高或异常表达可与疾病状态(例如EMT、EnMT、纤维化(即肾纤维化)或慢性组织排异)相关。合适的生物样品还包括血样，例如，血浆和/或血清、尿液、大便、脑脊液(即CSF)和脊液、滑液、结膜液、唾液、淋巴、胆汁、泪液和汗液、组织和细胞。

生物标志物(即CDH11)的“正常”水平是在不处于发展出与CDH11表达相关的疾病或病况(即，EMT、EnMT、纤维化(即肾纤维化)或慢性组织排异)的风险中或没有发展出上述疾病或病况的受试者中或在来自所述受试者的样品(例如，受试者的血液，例如血清或血浆、尿液、大便、胆汁、组织或细胞)(例如，来自不具有CDH11相关疾病的受试者的样品)中该生物标志物的水平。“对照”受试者典型地具有正常的生物标志物(即CDH11)水平。

生物标志物的“异常水平”是生物标志物有别于正常水平的任何水平，例如生物标志物的显著更高或升高的水平，或者显著更低或降低的水平。

生物标志物的“更高的水平”、“升高的水平”或“增加的水平”表示相对合适的对照而言升高的水平。优选地，如果存在的话，与合适的对照的差异高于用于评估该水平的检验的误差。此外，升高的水平优选是合适对照(例如，来自不具有与生物标志物相关的疾病的受试者的样品，或者若干对照样品中生物标志物的平均水平或者其它合适基准)中生物标志物水平的至少两倍，以及更优选三倍、四倍、五倍或十倍。

生物标志物“降低的水平”、“更低的水平”或“减少的水平”表示相对合适的对照而言降低的水平。优选地，如果存在的话，与合适的对照的差异高于用于评估该水平的检验的误差。此外，降低的水平优选是合适对照(例如，不具有与生物标志物相关的疾病的健康受试者中的水平，或者若干对照样品中生物标志物的平均水平或者其它合适基准)中生物标志物水平的至少两倍低，以及更优选三倍、四倍、五倍或十倍低。

A.诊断检验

可通过用于检测分子或蛋白的多种公知方法中的任何一种，来评估CDH11的存在与否和/或存在水平。此类方法的非限制性例子包括用于检测蛋白的免疫方法、蛋白纯化方法、蛋白功能或活性检验、核酸杂交方法、核酸反转录方法和核酸扩增方法、ELISA、免疫印迹、Western印迹、Northern印迹、Southern印迹等。

在一种实施方式中，使用抗体(例如经放射标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如与底物或与蛋白-配体对(例如生物素-链霉亲和素)的蛋白或配体缀合的抗体)或抗体片段(例如单链抗体、经分离的抗体高度可变结构域等等)(其与生物标志物(即，CDH11，例如，对应于生物标志物的开放读码框编码的蛋白或这经历了其正常翻译后修饰的全部或部分的蛋白)特异性结合)，来评估CDH11的存在与否和/或存在水平。在关于抗体的情况下，术语“经标记的”意欲包括通过向抗体偶联(即物理连接)可检测物质来直接标记抗体，以及通过与经直接标记的另外试剂的反应来间接标记抗体。间接标记的例子包括使用经荧光标记的二抗来检测一抗，使得可用经荧光标记的链霉亲和素来对其加以检测。在另一实施方式中，使用核酸来评估CDH11的存在与否和/或存在水平。

本发明的检测方法可用于体外及体内检测例如生物样品中的CDH11。例如，用于检测mRNA的体外技术包括Northern杂交、原位杂交和QPCR。用于检测CDH11的体外技术包括，例如，酶联免疫吸附检验(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测CDH11DNA的体外技术包括，例如，Southern杂交。此外，用于检测CDH11的体内技术包括向受试者中引入经标记的针对CDH11的抗体。如上文所讨论的，可用放射活性生物标志物来标记抗体，可通过标准影像技术来检测所述生物标志物在受试者中的存在和位置。

还通过下述实施例进一步阐述了本发明，所述实施例不应当被解释为进一步限制。序列表、附图和所有参考文献的内容、本申请通篇中提到的专利和公开的专利申请通过明确引入本文作为参考。

实施例

材料和方法

I.数据收集

A.人样品

用于该研究的活检样品从两个外部来源获得。第一数据组(本文中称为“Hannover数据组”)由通过与Medical School of Hannover的移植中心合作获得的肾规程性活检样品构成。该研究关注来自二十位肾同种异体移植物受体(具有功能性的移植物和正常的术后临床和组织学参数)的3月活检样品。三个月后，在第六个月的生物活检中，这些患者中的八位被诊断为慢性同种异体移植物排异(CR)(进展者)，十二位患者保持了稳定的移植物(非进展者)。

第二次合作与Hospital Tenon Paris联合进行，其收集了总共48份诊断用活检样品，包括19份对照、7份I级、7份II级和8份III级活检样品。此外，不具有纤维化征兆但是与严重的同种异体移植物免疫应答相关的7份急性排异(AR)活检样品被包括进来。该数据组在本文中被称为“Paris数据组”。

为进一步验证该研究，下载了来自Gene Expression Omnibus(GEO)(#GSE6004)的相关微阵列实验，通过HG_U133_Plus2 Affy芯片10分析了来自正常甲状腺组织和7份广泛侵入性乳头状甲状腺癌(PTC)的中央和侵入性区域的显微切片肿瘤内样品的基因表达模式。从7份中央和侵入区域以及7份正常组织之4份获得总RNA。此外，将中央对正常组织的比较与使用相同方法同时分析的来自The Ohio State University肿瘤库的九份配对的中央对正常组织相比。

B.非人类灵长类(NHP)样品

尸体解剖时，从生命支持的急性排异模型和近来公开的慢性同种异体移植物血管病变11(具有排异的组织病理学评估)收集猕猴(Macacafascicularis)肾同种异体移植物和对照。提取来自肾皮质的总RNA，使用Affymetrix标准方案和HG-U133A基因芯片，不经扩增对其进行处理。

II.微阵列

对于每份人活检样品，用50ng总RNA进行验证的Affymetri 2-轮cDNA扩增、荧光标记和杂交至Human Genome U133 Plus 2.0ArrayHG-U133 Plus2人基因组阵列杂交(Affymetrix，Santa Clara，CA)。处理1μg总RNA样品，对其加以标记，将样品与Human Genome U133Plus 2.0ArrayAffymetrix HG-U133_plus2 Genechip基因芯片(含有～54,625个探针组，其来自＞47,000份不同的人转录本)(Affymetrix，SantaClara，CA)杂交。

提取NHP样品肾皮质的总RNA，使用Affymetrix标准方案和HG-U133A基因芯片，不经扩增对其进行处理。

III.统计分析

使用Microarray Suite 5.0软件(MAS5，Affymetrix)获得针对每种基因的单加权平均表达水平以及p-值(指示可信赖的转录本检验)。从每种阵列获得数据(靶强度为150)。为进行进一步分析，对细胞强度(CEL)文件进行Robust Multichip Analysis(RMA)归一化。评估每种阵列上的若干质量控制测量，包括评审针对显著假象的扫描影像、背景和噪音测量(与其它芯片显著不同)、存在和不存在的信号(call)的平均值。下述三项标准中两项不符的阵列被排除在研究外：(1)针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶的强度的3’对5’比率(比率≤4)、(2)信号的平均值(≥40％存在的信号)和(3)规模参数(≥2或≤0.5)。

使用GeneSpring GX7.3(Agilent Technologies)来分析原始数据。使用单因子ANOVA(p≤0.05)，有或没有假阳性率(false discovery rate)≤5％(Benjamini和Hochberg FDR)，以及基于组间2倍变化的另外的截断点(cutoff)来鉴定不同样品类之间差异表达的基因。

使用公众可获得的基因的组(KEGG，Celera public和Mootha 12)，进行Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)。GSEA导致产生与相应p值相关的基因的组的列表。小的p值表示基因的组在表达比率表的顶部或底部显著富集。

实施了1：鉴定EMT基因的组

在该实施例中，鉴定并选择在早期和晚期慢性排异中显著过表达的基因。这两项比较的重叠产生了被发现为在移植后三个月的进展患者中(Hannover数据组)以及具有III级慢性同种异体移植物排异的患者中(Paris数据组)较之正常稳定患者有显著改变287个探针组(probesets)的列表。

然后，选择两个数据组中表达模式与EMT标志物高度相关的基因。选用Snail2用作饵进行关联性分析，原因如下。首先，Snail2已知能诱发EMT，由此将上皮细胞转换为具有移动性的间充质细胞，并且已经显示出能在转基因小鼠和病理模型中诱导肾纤维化。还在人纤维性肾中检测到了Snail2的表达(Boutet A等人，EMBO Journal，2006)。此外，Snail2是在早期和晚期慢性排异样品中被高度上调的EMT标志物。

然后在每个完整的数据组应用Pearson关联(r＞0.8)。两份关联基因列表的重叠产生了184个探针组的列表，其在paris和Hannover数据中与Snail2一致相关。

最后，将在慢性同种异体移植物排异期间被显著上调的第一基因列表(287个探针组)与和Snail2关联的第二基因列表(184个探针组)重叠。图1是用于产生EMT基因的组的重叠的示意图。基于该重叠，鉴定出了99个探针组的最终基因列表，包括钙黏着蛋白11，如表1所示。

表1

实施例2：验证EMT基因的组

A.对乳头状甲状腺癌(PTC)侵入基因表达的GSEA分析

为验证鉴定的基因的组作为EMT的致病分子标志的相关性，在相关微阵列数据组上，对该“EMT”基因的组应用基因的组富集方法(GSEA)。对GEO数据库进行挖掘之后，鉴定出了Vasko等人的特定数据组，其描述了对与EMT体内相关的乳头状甲状腺癌肿瘤的转录组学分析(见Vasko，V.等人Proceedings of the National Academy of Sciences 104，2803-2808(2007))。Vasko等人对相同肿瘤的中央部分和侵入部分进行了比较，并且声称，最显著的基因改变涉及细胞间粘着和通讯，这与上皮到间充质的转换(EMT)相符。

为验证侵袭性乳头状甲状腺癌特征在于EMT，针对波形蛋白(其是EMT的标识)的表达，对34份另外的乳头状甲状腺癌进行了检查。该研究揭示，波形蛋白的过表达与乳头状甲状腺癌侵入和淋巴结转移相关。此外，功能性体外研究表明，波形蛋白是甲状腺癌细胞的侵入性和间充质形态的保持和发育两者所需要的。基于这些研究，清楚表明，EMT是乳头状甲状腺癌侵入中共有的，并且波形蛋白体内调节甲状腺癌EMT。

使用该数据组，对与EMT特征相关的乳头状甲状腺癌肿瘤的中央和侵入部分之间进行了GSEA比较。与公开的结果一致，发现极少有通路(pathway)在相同肿瘤的这两个不同部分(即，中央和侵入)之间差异表达，如表2所示。

表2

但是，发现与炎症和免疫应答相关的若干通路在肿瘤的侵入部分中被显著下调，有两条通路被发现为显著上调。明显地，肿瘤侵入部分中鉴定的最显著的通路为“EMT”基因的组，这是前面的实施例中定义的。该结果表明，EMT基因的组的表达模式可能与监测人类中体内发生的致病性EMT过程相关。

B.对早期和晚期慢性同种异体移植物排异进行的GSEA研究

为验证EMT基因标志物是否在慢性同种异体移植物排异和间质性纤维化进程中的不同阶段被调节，对来自Hannover数据库的进展和非进展患者以及对对照和慢性同种异体移植物排异III级患者样品应用GSEA方法(图2)。如图2B显示，较之对照患者，EMT组在III级患者的超过1000条通路中被显著上调。令人吃惊地，在移植后第12周的进展患者组中，同样的基因的组是被最显著调控的通路之一(图2B)。

实施例3：鉴定CDH11为阻断EMT和间质性纤维化进程的关键靶标

在EMT组中鉴定的基因中，若干是已知的EMT标志物，例如波形蛋白或S100A4。但是，其它一些是新鉴定的EMT相关基因，包括CDH11，其可能被考虑为可能的纤维化治疗靶标。因此，为验证CDH11是否确实参与肾纤维化进程期间的致病性EMT，分析CDH11在mRNA和蛋白水平二者上的表达模式。

如图3A所示，CDH11表达在肾纤维化的早期阶段以及在疾病的晚期状态下被一致上调(图3B)。此外，CDH11被始终发现与Snail2(用于该研究的EMT阳性标志物)共表达。一项显著的观察是：相似地，在Hannover数据组的超过80份活检样品中(表3)以及在Paris数据组的超过80份活检样品中(表4)，CDH11与Snail2共表达。

表3：在Hannover数据组中与Snail2高度相关的基因

IDs	R值	FC＊	符号
				213139_at	1	1.245919	SNAIL2
207173_x_at	0.757	1.792251	CDH11

^＊在移植后第12周，基于非进展者对进展者比较的FC

表4：在Tenon数据组中与Snail2高度相关的基因

IDs	R值	FC＊	符号
				213139_at	1	3.057614	SNAI2
202995_s_at	0.824	3.560018	FBLN1
				211896_s_at	0.823	2.666715	DCN
207173_x_at	0.791	3.860664	CDH11
				203222_s_at	0.777	2.271124	TLE1
203903_s_at	0.776	2.49614	HEPH
				204396_s_at	0.77	3.296966	GPRK5

201438_at	0.766	5.642283	COL6A3
				202202_s_at	0.763	4.347918	LAMA4
202766_s_at	0.755	6.86041	FBN1
				203851_at	0.744	5.601282	IGFBP6
201761_at	0.743	4.101709	MTHFD2

^＊基于对照对III级比较的FC

考虑到共表达分析可能影响相似的转录调控，该结果表明，CDH11以与Snail2相同的方式被调控，并且贡献于EMT过程。

因为该结果来自整个肾皮质的总体基因表达，因此，知道CDH11蛋白在哪些细胞类型(例如，肾小管、肾小球、mesenglial细胞，血管和内皮细胞等)中表达是重要的。通过对间充质标志物(例如波形蛋白或FSP1(S100A4))免疫组织化学(IHC)染色对EMT进行体内经典检测(见Kalluri，R.&Neilson，E.G.，J.Clin.Invest.112，1776-1784(2003))。在正常的肾中，皮质的上皮肾小管细胞对波形蛋白的染色表现为阴性。但是，当瞬时EMT过程开始，若干正常和早期的萎缩肾小管开始表达波形蛋白并且丢失E-钙黏着蛋白染色。在肾的40％中观察到了这种不正常的染色(见Hertig，A.等人，American Journal of Transplantation 6，2937-2946(2006))。

因此，为了测试CDH11是否随EMT标志物表达，在健康的、非排异的肾活检和慢性同种异体移植物排异肾活检样品上进行IHC，其中使用针对人CDH11的多克隆兔抗体。如所预计的，抗CDH11在正常或非排异肾中未染色或显示出非常低的染色，但是在慢性同种异体移植物排异肾中显示出强烈的肾小管染色(图4)。该染色是经典EMT染色(例如波形蛋白)所典型的，这进一步验证了CDH11在人的EMT和肾纤维化中的可能作用。

实施例4：将CDH11鉴定为阻断EnMT和血管重构的关键靶标

急性和慢性肾移植排异的非人灵长类(NHP)模型提供了有用的工具来研究和理解在具有慢性同种异体移植物排异的患者中观察到的动脉重构(见Wieczorek，G.等人American Journal of Transplantation 6，1285-1296(2006))。在该模型中，动物在65天内(中位)发展出慢性同种移植排异并且丢失移植物。较之急性排异，动脉内膜改变显示出较少的巨噬细胞和T淋巴细胞，但是有增加数量的肌成纤维细胞、丰富的纤连蛋白/胶原IV和疤痕胶原I/III。间质性纤维化和肾小管萎缩并非该实验模型的非常显著的特征，这假设是由于受损的血流和继发于动脉狭窄导致的缺血诱导性萎缩/纤维化持续相对较短引起的。

为获得更好的对该过程的理解，在来自诊断为正常或者显示出急性和慢性排异临床征兆的猴子的肾活检样品上进行完全的转录本组学实验。经典的统计过滤后，CDH11被鉴定为在具有血管重构的活检样品中特异性过表达的一种基因，较之对照和具有急性排异的样品，观察到了增加数量的肌成纤维细胞(图5)。

该数据表明，除了间质性纤维化之外，CDH11还可能在血管重构和内膜增生中具有作用。

为进一步评估CDH11在血管重构中的可能作用，使用另外的动物模型进行免疫组织化学分析。因为针对猕猴缺乏满意的交叉反应特异性抗体，在心脏慢性排异(与血管重构和内膜增生相关)的小鼠模型中测试CDH11表达。图6显示，在存在内膜增厚的一些冠状动脉内壁中检测到了CDH11信号的存在。在受影响的血管中，媒介看起来是强烈阳性的，而内膜仅显示弱阳性。此外，信号看起来与αSMA染色(平滑肌细胞和肌成纤维细胞的特异性标志物)共表达(图6)。重要地，在健康血管中没有检测到CDH11染色。

实施例5：在肾纤维化(UUO)的小鼠模型中证实钙黏着蛋白-11是EMT标志物

单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型是被良好建立和描述的，其被广泛用于研究纤维化，例如，进行性间质性纤维化和肾纤维化，以及用于评估可能的治疗手段。在这些模型中进行的输尿管梗阻手术诱导了肾小管间质性纤维化的快速发展(1-2周)，这是高度可重复的。已知UUO能诱导对胶原、TGFβ、α-SMA的强烈上调和E-钙黏着蛋白的显著减少。如至少图7所示，UUO以时间依赖性方式诱导了对CDH11的强烈上调。

等同方式

不使用超出常规的实验，本领域技术人员将知晓或者能够确定本文所述的本发明的具体实施方式的很多等同方式。此类等同方式也意欲包括在下述权利要求之内。所附权利要求中公开的实施方式的任何组合也包括在本发明的范围内。

参考文献的并入

本文提到的所有公开文件、专利和未决的专利申请都通过引入本文作为参考。

Claims (27)

1.在受试者中抑制或预防上皮-间充质转换(EMT)或内皮-间充质转换(EnMT)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的CDH11拮抗剂，由此抑制或预防上皮-间充质转换(EMT)或内皮-间充质转换(EnMT)。

2.权利要求1的方法，其中所述EMT或EnMT与纤维化相关。

3.治疗受试者的纤维化的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的CDH11拮抗剂。

4.权利要求3的方法，其中所述纤维化选自血管重构、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、肺纤维化、关节纤维化、间皮纤维化和肠纤维化构成的组。

5.权利要求4的方法，其中所述血管纤维化与肺性高血压相关。

6.预防或降低受试者中慢性组织排异的严重性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的CDH11拮抗剂。

7.权利要求6的方法，其中所述组织是移植的组织或植入的组织。

8.治疗受试者的肾纤维化的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的CDH11拮抗剂，其中所述CDH11拮抗剂选自抗体、小分子、核酸、融合蛋白和源于CDH11的肽性化合物。

9.前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述受试者是人。

10.前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述拮抗剂静脉内、肌内或皮下施用给受试者。

11.前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述拮抗剂选自抗体、小分子、核酸、融合蛋白和源于CDH11的肽性化合物。

12.权利要求11的方法，其中所述抗体选自鼠抗体、人抗体、人化抗体、双特异性抗体和嵌合抗体。

13.权利要求11或12的方法，其中所述抗体选自Fab、Fab’2、ScFv、SMIP、亲和抗体、avimer、纳米抗体和结构域抗体。

14.权利要求11-13中任意一项所述的方法，其中所述抗体与第二治疗剂组合施用。

15.权利要求14的方法，其中所述第二治疗剂选自第二抗体、免疫抑制剂和化疗剂。

16.权利要求11的方法，其中所述核酸是选自RNA干扰试剂和核酶的反义分子。

17.权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中所述拮抗剂是包含与治疗剂相连的抗体的免疫缀合物。

18.权利要求17的方法，其中所述治疗剂选自细胞毒性试剂、免疫抑制剂和化疗剂。

19.评估受试者是否具有CDH11相关疾病或者是否处于发展出CDH11相关疾病的风险中的方法，所述方法包括针对CDH11对来自受试者的样品加以检验，其中CDH11的异常或升高的水平表明所述受试者具有CDH11相关疾病或处于发展出CDH11相关疾病的风险中。

20.诊断CDH11相关疾病的方法，所述方法包括：(i)将靶样品与和CDH11反应的试剂接触；以及检测CDH11，其中CDH11相对正常对照而言浓度升高指示CDH11相关疾病。

21.确定被诊断为患有CDH11相关疾病的受试者的预后的方法，所述方法包括：对不同时间从所述受试者收集的至少两份样品加以检验，比较每份样品中CDH11的水平，确定CDH11的水平是否随时间增加还是减少，其中，CDH11的增加指示所述疾病严重性增加，CDH11的减少指示所述疾病严重性的减少。

22.权利要求19、20或21的方法，其中所述CDH11相关疾病选自EMT、EnMT、纤维化和慢性组织排异。

23.权利要求20的方法，其中所述试剂是抗体或核酸。

24.权利要求23的方法，其中所述试剂被可检测地标记。

25.权利要求24的方法，其中所述标记选自放射性同位素、生物发光化合物、化学发光化合物、荧光化合物、金属螯合剂或酶。

26.权利要求21的方法，其中所述受试者已用CDH11拮抗剂治疗过。

27.权利要求26的方法，其中所述CDH11拮抗剂选自抗体、小分子、核酸、融合蛋白和源于CDH11的肽性化合物。

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