CN112204401A - 预测癌症药物响应性的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及确定癌细胞对使用包含Bcl‑2蛋白的异源二聚体的抗体进行的治疗的敏感性的组合物和方法。本公开还提供了用于预测癌症患者对癌症治疗的敏感性的方法。

Description

预测癌症药物响应性的方法
技术领域
本公开涉及确定癌细胞对使用包含Bcl-2蛋白的异源二聚体的抗体进行的治疗的敏感性的组合物和方法。
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年11月28日提交的美国临时申请号62/772,368、2018年8月20日提交的美国临时申请号62/719,789和2018年1月18日提交的美国临时申请号62/618,786的优先权和利益，这些临时申请的内容整体以引用方式并入。
以电子形式递交的文本文件的说明
与本文一起以电子形式递交的文本文件的内容全文以引用方式并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：EUTR-018PC_105444-5018_SequenceListing_ST25；记录日期：2019年1月3日；文件大小：13.4KB)。
背景技术
癌症仍然是全世界死亡的主要原因。在本领域中需要更有效的癌症治疗。随着许多分子靶向剂进入临床试验，预测性测试是高度期望的。特别地，选择合适的患者用于临床试验招募和批准时的治疗是新癌症疗法的临床开发的主要驱动因素。
凋亡的内在途径在线粒体水平上被调节，其中B细胞淋巴瘤2(BCL-2)蛋白家族中的超过十五个成员相互作用。许多化疗剂引起凋亡，并且该机制通常涉及BCL-2家族成员的水平和相互作用的变化。Bcl-2家族的成员共有四个同源性特征结构域中的一个或多个，名为Bcl-2同源性(BH)结构域(BH1、BH2、BH3和BH4)。
BH3分析是一种功能测定，该功能测定通过在暴露于仅BH3蛋白的肽模拟BH3结构域之后测量线粒体外膜透化(MOMP)来测量肿瘤细胞线粒体引发。MOMP是通过荧光染料JC-1间接测量的，其测量了跨线粒体内膜的电位。该电位响应于MOMP而迅速降低。然而，在实践中，这种基于JC-1的功能测量受到难以测量一致荧光信号的阻碍。
此外，单独的仅BH3蛋白的蛋白水平而不是功能信号的直接测量被以下事实混淆，即这些水平的变化不与对所测试的测试抗癌剂的敏感性一致相关。
另外，将功能BH3测量与单独的仅BH3蛋白的蛋白水平的直接测量进行组合是复杂的且不适合于实体瘤或固定样本。
因此，需要提供改进的对癌症治疗的预测性测试的新组合物和方法。
发明内容
因此，本公开部分基于发现了几种抗体，每种抗体特异性结合Bcl-2异源二聚体(例如Bcl-xl/BIM-BH3异源二聚体)。本公开还提供了抗体，其用于检测来自患者的实体瘤样品中的包含两种B细胞淋巴瘤2(BCL-2)蛋白的异源二聚体，并确定所述异源二聚体与参考值的比率，所述比率预测患者对癌症治疗的敏感性。因此，所公开的抗体提供了改进的针对癌症治疗的预测测试的组合物和方法。
在一些方面，本文公开了一种用于预测患者对癌症治疗的敏感性的方法，所述方法包括使样品与识别包含两种B细胞淋巴瘤2(BCL-2)蛋白的异源二聚体的抗体或抗体形式接触，所述样品是来自所述患者的实体瘤的样本；检测指示所述异源二聚体的量的信号；以及基于所述样品中存在的异源二聚体的量来确定与参照值的比率，其中所述参照值包括样品中异源二聚体的BCL-2蛋白单体之一的量，所述比率预测患者对癌症治疗的敏感性。
在另一方面，本公开提供了一种用于预测患者对癌症治疗的敏感性的方法，包括：使样品与识别包含两种B细胞淋巴瘤2(BCL-2)蛋白的异源二聚体的抗体或抗体形式和识别所述异源二聚体的BCL-2蛋白单体之一的抗体或抗体形式接触，所述样品是来自所述患者的实体瘤的样本；检测指示所述异源二聚体的量和所述单体的量的信号；以及基于所述异源二聚体的量与所述单体的量来确定比率，所述比率预测实体瘤患者对癌症治疗的敏感性。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述比率预测对癌症治疗的敏感性的情况下，对患者施用癌症治疗。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述比率预测对癌症治疗的敏感性的情况下，用减少的剂量或不太频繁和/或缩短的癌症治疗方案治疗患者。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述比率预测对癌症治疗的敏感性的情况下，用增加的剂量或更加频繁和/或延长的癌症治疗方案治疗患者。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述比率预测对癌症治疗缺乏敏感性的情况下，停止对患者的癌症治疗。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述比率预测对癌症治疗缺乏敏感性的情况下，用不同的癌症治疗来治疗患者。
在一些实施方案中，所述方法还包括确定患者的一种或多种临床因素。
在一些实施方案中，所述方法还包括基于患者的一种或多种临床因素针对对癌症治疗的临床响应的可能性来对患者进行分类。
在一些实施方案中，所述方法还包括基于患者的一种或多种临床因素将患者对癌症治疗的敏感性的预测与对癌症治疗的临床响应的可能性进行比较。临床因素可以是年龄、细胞遗传学状态、表现、组织学亚类、性别和疾病阶段中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述方法还包括测量选自突变状态、单核苷酸多态性、稳态蛋白水平以及动态蛋白水平的另外的生物标志物。
在一些实施方案中，所述方法还包括通过采用免疫组织化学(IHC)、流式细胞术或免疫荧光法来检测所述异源二聚体。
在一些实施方案中，BCL-2蛋白是激活剂BH3蛋白。
在一些实施方案中，所述方法还包括选自BID和BIM的激活剂BH3蛋白。
在一些实施方案中，BCL-2蛋白是敏化剂BH3蛋白。在一些实施方案中，敏化剂BH3蛋白选自BAD、BIK、NOXA A、NOXA B、HRK、BMF和PUMA。
在一些实施方案中，BCL-2蛋白是多结构域促凋亡蛋白。在一些实施方案中，多结构域促凋亡蛋白选自BAX和BAK。
在一些实施方案中，BCL-2蛋白是多结构域抗凋亡蛋白。在一些实施方案中，多结构域抗凋亡蛋白选自BCL-2、BCL-XL、MCL-1、BCL-W和BFL-1。
在一些实施方案中，所述异源二聚体包含BCL2与BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF之一。
在一些实施方案中，所述方法提供异源二聚体与BCL2、BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF单体之一的比率。
在一些实施方案中，所述异源二聚体包含BCLXL与BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF之一。
在一些实施方案中，所述方法提供异源二聚体与BCLXL、BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF单体之一的比率。
在一些实施方案中，所述异源二聚体包含BCLW与BID、BIM、BIK、PUMA和BMF之一。
在一些实施方案中，所述方法提供异源二聚体与BCLW、BID、BIM、BIK、PUMA和BMF单体之一的比率。
在一些实施方案中，所述异源二聚体包含MCL1与BID、BIM、BIK、NOXA A、NOXA B、PUMA、BAK和BMF之一。
在一些实施方案中，所述方法提供异源二聚体与MCL1、BID、BIM、BIK、NOXA A、NOXAB、PUMA和BMF单体之一的比率。
在一些实施方案中，所述异源二聚体包含BFL1与BID、BIM、NOXA A、NOXA B和PUMA之一。
在一些实施方案中，所述方法提供异源二聚体与BFL1、BID、BIM、NOXA A、NOXA B和PUMA单体之一的比率。
在一些实施方案中，癌症治疗是BH3模拟物。BH3模拟物可选自BCL-2/BCL-XL特异性ABT-737和ABT-263(navitoclax)、Bcl-2特异性Ventocrax(Venclexta，ABT-199)、MCL-1特异性S63845、AMG176和ADZ5991、BCL-XL特异性A-1155463和A1331852、BFL-1/MCL-1特异性EU5346或其组合。
在一些实施方案中，癌症治疗是抗癌药、化疗、抗凋亡蛋白的拮抗剂、外科手术、辅助疗法和新辅助疗法中的一种或多种。癌症治疗可以是SMAC模拟物、BH3模拟物、蛋白酶体抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、糖皮质激素、类固醇、单克隆抗体、抗体-药物缀合物或沙利度胺(thalidomide)衍生物中的一种或多种。
在一些实施方案中，癌症治疗阻断所检测的特定异源二聚体的形成。
在一些实施方案中，癌症治疗干扰所检测的特定异源二聚体的形成。
在一些实施方案中，癌症治疗是检查点抑制剂。
在一些实施方案中，检查点抑制剂是靶向TIM-3、BTLA、PD-1、CTLA-4、B7-H4、GITR、半乳凝素-9、HVEM、PD-L1、PD-L2、B7-H3、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a和TMIGD2之一的剂。
在一些实施方案中，靶向PD-1的剂是对PD-1特异的抗体或抗体形式，任选地选自纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和匹利珠单抗。
在一些实施方案中，靶向PD-L1的剂是对PD-L1特异的抗体或抗体形式，任选选自阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)和BMS-936559。
在一些实施方式中，靶向CTLA-4的剂是对CTLA-4特异的抗体或抗体形式，任选地选自伊匹单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)。
在一些实施方案中，样品选自肿瘤活检、组织活检、肿瘤切除、冷冻肿瘤组织样本、淋巴结、骨髓、循环肿瘤细胞、培养细胞、福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本、支气管肺泡灌洗液、皮肤、毛发、尿液及其组合。
在一些实施方案中，肿瘤活检选自组织芯活检、针吸活检、手术组织活检和切除组织活检。
在一些实施方案中，样品是患者的浸润淋巴细胞。
在一些实施方案中，实体瘤选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、结肠癌和卵巢癌。
在一些实施方案中，肺癌选自非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。
在一些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。
在一些实施方案中，前列腺癌是雄激素非依赖性前列腺癌。
在一些实施方案中，所述敏感性的特征在于(a)样品中存在凋亡；(b)样品中存在抗凋亡Bcl-2异源二聚体，指示患者对干扰抗凋亡Bcl-2异源二聚体形成的药物敏感；(c)遗传风险因子；家族史；个人历史；种族和种群；某些组织的特征；各种良性病症(例如，非增殖性病变)；前一次胸部辐射；致癌物质暴露等。
在一些实施方案中，所述方法不包括线粒体外膜透化(MOMP)的功能性读出。
在一些实施方案中，所述方法不包括对细胞膜电位的基于染料的检测。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fv、单链Fv、双抗体、线性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和包含抗体的抗原结合部分的融合蛋白中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式识别BCL2与BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF之一的异源二聚体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式识别BCLXL与BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF之一的异源二聚体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式识别BCLW与BID、BIM、BIK、PUMA和BMF之一的异源二聚体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式识别MCL1与BID、BIM、BIK、NOXA A、NOXAB、PUMA、BAK和BMF之一的异源二聚体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式识别BFL1与BID、BIM、NOXA A、NOXA B和PUMA之一的异源二聚体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式包含：(i)重链可变区，其包含重链CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，其中所述重链CDR1序列为GHTFTEHYIN(SEQ ID NO:1)，所述重链CDR2序列为WIFPGSGSTYYNEKFKG(SEQ ID NO:2)；并且所述重链CDR3序列为SYSNFWFAY(SEQ ID NO:3)；和(ii)轻链可变区，其包含轻链CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，其中所述轻链CDR1序列为RASQSIGTSIH(SEQ ID NO:4)，所述轻链CDR2序列为KYASESIS(SEQ ID NO:5)；并且所述轻链CDR3序列为QQSNSWPTT(SEQ ID NO:6)。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式还包含根据式(FW1)-(CDR1)-(FW2)-(CDR2)-(FW3)-(CDR3)-(FW4)的并置在CDR之间的可变区框架(FW)序列，其中重链可变区中的可变区FW序列是重链可变区FW序列，并且其中轻链可变区中的可变区FW序列是轻链可变区FW序列。
在一些实施方案中，可变区FW序列是人的。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式还包含人重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施方案中，恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式包含：(i)重链可变区序列，其包含SEQID NO:7中所示的氨基酸序列，或具有总共不超过10个氨基酸置换的SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和(ii)轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或具有总共不超过10个氨基酸置换的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式包含与SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO.8具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，临床响应的可能性由以下等式定义：
Figure BDA0002654818670000081
其中：
AUC(曲线下面积)是通过均相时间分辨荧光(HTRF)或来自荧光激活细胞分选(FACS)的平均信号强度所建立的荧光测量值的总和，其中所述信号强度是在引发开始后约5分钟至约300分钟之间产生的单一时间点测量值；
DMSO(二甲基亚砜)构成曲线下面积或信号强度的基线阴性对照；
CCCP(羰基氰化物间氯苯腙)是氧化磷酸化的化学抑制剂，并且包含通过发挥质子梯度的解偶联试剂作用而成为蛋白质合成的效应物，其中所述质子梯度是在线粒体的电子传递链中电子载体的正常活动期间建立，并且CCCP构成基线阳性对照；并且
所述肽是一种或多种BH3结构域肽，其中(n)用DMSO和CCCP对照的平均重复数归一化。
在一些实施方案中，结合前述等式，选择一种或多种临床因素以增加BH3分析的特异性和/或敏感性以便与临床响应相关。
在一些实施方案中，临床响应的可能性由前述等式的简化形式定义，如此处所示：
Figure BDA0002654818670000082
其中：
AUC(曲线下面积)是通过均相时间分辨荧光(HTRF)或来自荧光激活细胞分选(FACS)的平均信号强度所建立的荧光测量值的总和，其中所述信号强度是在引发开始后约5分钟至约300分钟之间产生的单一时间点测量值；
DMSO(二甲基亚砜)构成曲线下面积或信号强度的基线阴性对照；
CCCP(羰基氰化物间氯苯腙)是氧化磷酸化的化学抑制剂，并且包含通过发挥质子梯度的解偶联试剂作用而成为蛋白质合成的效应物，其中所述质子梯度是在线粒体的电子传递链中电子载体的正常活动期间建立，并且CCCP构成基线阳性对照；并且
所述肽是一种或多种BH3结构域肽，其中(n)用DMSO和CCCP对照的平均重复数归一化。
在一些实施方案中，结合前述等式，选择一种或多种临床因素以增加BH3分析的特异性和/或敏感性以便与临床响应相关。
在一个方面，本公开提供了一种用于预测患者对样品中的检查点抑制剂的响应性的方法，所述方法包括测量Mcl-1/Bim或BCLXL/Bim异源二聚体的量，其中所述样品包含来自实体瘤的浸润淋巴细胞群。
在一些实施方案中，检查点抑制剂是靶向TIM-3、BTLA、PD-1、CTLA-4、B7-H4、GITR、半乳凝素-9、HVEM、PD-L1、PD-L2、B7-H3、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a和TMIGD2之一的剂。
在一些实施方案中，靶向PD-1的剂是对PD-1特异的抗体或抗体形式，任选地选自纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和匹利珠单抗。
在一些实施方案中，靶向PD-L1的剂是对PD-L1特异的抗体或抗体形式，任选选自阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)和BMS-936559。
在一些实施方式中，靶向CTLA-4的剂是对CTLA-4特异的抗体或抗体形式，任选地选自伊匹单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)。
在一个方面，本公开提供了一种包含抗体或抗体形式的组合物，所述抗体或抗体形式包含：(i)重链可变区，其包含重链CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，其中所述重链CDR1序列为GHTFTEHYIN(SEQ ID NO:1)，所述重链CDR2序列为WIFPGSGSTYYNEKFKG(SEQ ID NO:2)；并且所述重链CDR3序列为SYSNFWFAY(SEQ ID NO:3)；和(ii)轻链可变区，其包含轻链CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，其中所述轻链CDR1序列为RASQSIGTSIH(SEQ ID NO:4)，所述轻链CDR2序列为KYASESIS(SEQ ID NO:5)；并且所述轻链CDR3序列为QQSNSWPTT(SEQ IDNO:6)。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含抗体或抗体形式的组合物，所述抗体或抗体形式具有SEQ ID NO:1的序列，但具有四个或更少的氨基酸置换，或具有三个或更少的氨基酸置换，或具有两个或更少的氨基酸置换，或具有一个氨基酸置换。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含抗体或抗体形式的组合物，所述抗体或抗体形式具有SEQ ID NO:2的序列，但具有四个或更少的氨基酸置换，或具有三个或更少的氨基酸置换，或具有两个或更少的氨基酸置换，或具有一个氨基酸置换。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含抗体或抗体形式的组合物，所述抗体或抗体形式具有SEQ ID NO:3的序列，但具有四个或更少的氨基酸置换，或具有三个或更少的氨基酸置换，或具有两个或更少的氨基酸置换，或具有一个氨基酸置换。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含抗体或抗体形式的组合物，所述抗体或抗体形式具有SEQ ID NO:4的序列，但具有四个或更少的氨基酸置换，或具有三个或更少的氨基酸置换，或具有两个或更少的氨基酸置换，或具有一个氨基酸置换。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含抗体或抗体形式的组合物，所述抗体或抗体形式具有SEQ ID NO:5的序列，但具有四个或更少的氨基酸置换，或具有三个或更少的氨基酸置换，或具有两个或更少的氨基酸置换，或具有一个氨基酸置换。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含抗体或抗体形式的组合物，所述抗体或抗体形式具有SEQ ID NO:6的序列，但具有四个或更少的氨基酸置换，或具有三个或更少的氨基酸置换，或具有两个或更少的氨基酸置换，或具有一个氨基酸置换。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式还包含根据式(FW1)-(CDR1)-(FW2)-(CDR2)-(FW3)-(CDR3)-(FW4)的并置在CDR之间的可变区框架(FW)序列，其中重链可变区中的可变区FW序列是重链可变区FW序列，并且其中轻链可变区中的可变区FW序列是轻链可变区FW序列。
在一些实施方案中，可变区FW序列是人的。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式还包含人重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施方案中，恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式包含：(i)重链可变区序列，其包含SEQID NO:7中所示的氨基酸序列，或具有总共不超过10个氨基酸突变的SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列，所述氨基酸突变选自氨基酸置换、氨基缺失和氨基酸添加中的一种或多种；和(ii)轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列，或具有总共不超过10个氨基酸突变的SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列，所述氨基酸突变选自氨基酸置换、氨基缺失和氨基酸添加中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式包含与SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO.8具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含编码如本文公开的抗体或抗体片段的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，提供了一种包含所提供的多核苷酸的载体；在一些实施方案中，提供了一种包含所述载体的宿主细胞。
在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文公开的抗体或任何抗体的抗体形式以及药学上可接受的赋形剂。
在一些方面，本公开提供了一种产生异源二聚体抗体的方法，所述方法包括：(a)用异源二聚体诱导的构象抗原来免疫受试者(例如，人、猴、小鼠、大鼠或仓鼠)；(b)从所述受试者分离脾B细胞，所述脾B细胞产生识别所述异源二聚体诱导的抗原的IgG；(c)将脾B细胞在磁柱上通过以用于负向选择，其中将负向选择磁柱用含有异源二聚体的一个单体的重组融合蛋白包被；(d)从磁柱上收集脾B细胞的流出物以用于负向选择，并将流出物在磁柱上通过以用于正向选择；其中将用于正向选择的磁柱用异源二聚体抗原包被；(e)洗脱并收集与磁柱结合的脾B细胞以用于正向选择；(f)在B细胞培养基中培养收集的细胞；以及(g)从培养c的细胞分离异源二聚体特异性抗体，从而产生异源二聚体抗体。在一些实施方案中，所述异源二聚体抗原是BCL2与BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF之一的异源二聚体抗原。在一些实施方案中，所述异源二聚体抗原是BCLXL与BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF之一的异源二聚体抗原。在一些实施方案中，所述异源二聚体抗原是BCLW与BID、BIM、BIK、PUMA和BMF之一的异源二聚体抗原。在一些实施方案中，所述异源二聚体抗原是MCL1与BID、BIM、BIK、NOXA A、NOXA B、PUMA、BAK和BMF之一的异源二聚体抗原。在一些实施方案中，所述异源二聚体抗原是BFL1和BID、BIM、NOXA A、NOXA B和PUMA之一的异源二聚体抗原。在一些实施方案中，所述异源二聚体的一个单体选自BCL2、BID、BIM、BAD、BIK、PUMA、BMF、BCLXL、BCLW和MCL1。在一些实施方案中，所述异源二聚体的一个单体是MCL1。在一些实施方案中，所述异源二聚体的一个单体是BIM。在一些实施方案中，所述异源二聚体选自BCL2与BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF之一。在一些实施方案中，所述异源二聚体选自BCLXL与BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF之一。在一些实施方案中，所述异源二聚体选自BCLW与BID、BIM、BIK、PUMA和BMF之一。在一些实施方案中，所述异源二聚体选自MCL1与BID、BIM、BIK、NOXA A、NOXA B、PUMA、BAK和BMF之一。在一些实施方案中，所述异源二聚体选自BFL1与BID、BIM、NOXA A、NOXA B和PUMA之一。在一些实施方案中，所述异源二聚体选自BCL2、BID、BIM、BAD、BIK、PUMA、BMF、BCLXL、BCLW和MCL1。
本公开的一个或多个实施例的细节在以下描述中阐述。根据以下附图、若干示例的详细描述以及所附权利要求书中，本公开的其他特征或优点将是显而易见的。本公开的细节在以下所附描述中阐述。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但现在描述说明性的方法和材料。本公开的其他特征、目的和优点从具体实施方式和权利要求书中可以明显地看出。在说明书和所附权利要求书中，单数形式也包括复数形式，除非上下文另有明确规定。除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同的含义。
附图说明
图1是示出免疫原如何用于制备异源二聚体选择性单克隆抗体的图像。通过与作为靶向表位的仅BH3 Bcl-2蛋白进行二聚化而诱导出多结构域Bcl-2蛋白的构象变化。
图2是描绘通过免疫测定筛选和选择Bcl-2异源二聚体特异性抗体的过程的示意图。进行杂交瘤上清液的ELISA筛选和反筛选以选择结合单克隆抗体(Mab)的Bcl-xL/Bim异源二聚体。左图示出结合Bcl-2异源二聚体的抗体被正向选择。从此筛选，推进了39个选择性结合克隆。中间的图示出mAb-HSBXB与异源二聚体Bcl-xL/Bim BH3：Bcl-xL-GST的选择性结合，该异源二聚体与谷胱甘肽包被的ELISA板结合。添加或不添加Bim BH3肽(右图)，并使用HSBXB抗体来检测复合物。在这些实验中，结合异源二聚体的非二聚化成员的抗体被负向选择。
图3示出包含Bcl-xL-GST/全长BIM蛋白的非共价异源二聚体与谷胱甘肽包被的ELISA板结合，并用ABT-263(Navitoclax)(一种BCL2/Bcl-xL靶向化合物)处理。在添加肽之后和添加单克隆抗体之前，将化合物添加到ELISA板中。使用全长Bim蛋白形成异源二聚体。
图4A、图4B、图4C和图4D示出通过流式细胞术和免疫荧光(IF)检测Bcl-XL/Bim异源二聚体，并证明ELISA HSBXB信号与线粒体BH3分析读出相关。在图4A中，将细胞在冰上温育三小时，然后洗涤并与10ug/ml的HSBXB抗体或Bcl-xL抗体温育20分钟，洗涤，然后用Alexa488缀合的山羊抗小鼠二抗二次染色。将信号校正为IgG-2A同种型或第二单独对照。对于每个系列，左柱是HSBXB抗体，右柱是同种型对照。在图4B中，将在三个细胞系的线粒体分析中的Hrk-BH3信号相对于归一化HSBXB FACS信号作图。图4C示出从用RIPA(ThermoFisher Scientific)裂解的细胞中Bcl-xL-Bim复合物的抗Bcl-xL捕获。对于每个系列，左柱是AHR77细胞系，右柱是Molm-13细胞系。然后用HSBXB或Bcl-xL探测所捕获的复合物。在图4D中，将SKBR3细胞固定在2％PFA中并用HSBXB(Magenta)和Bcl-xL(Alexa 488)染色。
图5是示出单克隆抗体克隆步骤、用于产生HSBXB抗体的表达载体、克隆策略、重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)和轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)以及重链可变区和轻链可变区的互补决定区(CDR)(灰色突出显示)的图像。
图6示出使用本公开中所述的抗体在固定细胞上产生的免疫荧光信号。使用免疫荧光显微镜来确认HSBXB(例如，HSBXB克隆32)作为可以在固定和/或存档的肿瘤样品中使用的生物标志物的效用。将黑素瘤AUCC903N细胞固定并透化，并与HSBXB抗体一起温育。然后在黑素瘤细胞中染色Bcl-xl-Bim异源二聚体(以绿色示出)和核(DAPI；以蓝色示出)。使用4％多聚甲醛进行固定，并用0.2％TritonX100缓冲液进行透化。这些数据显示Bcl-xl-Bim异源二聚体存在于线粒体处，如所预期的。重要的是，数据确立了异源二聚体抗体可用于鉴定粘附样品中的引发并基于结果指导治疗干预。
图7A、图7B和图7C示出通过使用本公开中描述的抗体在固定细胞上产生的人肿瘤活检信号的免疫组织化学(IHC)染色。使用4％多聚甲醛进行固定，并用0.2％TritonX100缓冲液进行透化。使用免疫荧光显微镜来确认HSBXB作为可以在固定存档肿瘤样品中使用的生物标志物的效用。将黑素瘤AUCC903N细胞固定、透化并与HSBXB抗体一起温育(图7A)。图7A示出使用HBSXB克隆32(40X放大率)对患者21的乳房切片0040-3的IHC染色。图7B示出使用对照抗体(40X放大率)对患者21的乳房切片0040-3的IHC染色。图7C示出使用HBSXB克隆32(40X放大率)对患者14的乳房切片0020-3的IHC染色。这些数据显示Bcl-xl-Bim异源二聚体可以用于鉴定粘附样品中的引发和基于结果指导治疗干预。
图8由两个图组成，示出Bcl-xL选择性BH3模拟物(A1155463)如何移动在癌细胞中检测到的HSBXB异源二聚体信号。对于每个系列，左柱是HSBXB信号，右柱是总Bcl-xL。数据还示出用亚致死剂量的A1155463处理的细胞在16小时后丧失信号(底部图)。图中x轴上的术语"I/C"指"同种型对照"，图中x轴上的术语"CC"指未染色或"纯净对照"。使用流式细胞术来检测信号。
图9A和图9B示出利用活检AML母细胞的Bcl-xL特异性Hrk肽读出，针对BH3分析进行的HSBXB/总Bcl-xL信号的基准测试。在图9A中，对AML患者样品进行BH3分析。胚细胞群显示Hrk引发(对对于Bcl-xL具有选择性的Hrk BH3肽的响应)。并行地，将AML患者样品固定，并用FITC标记的HSBHB抗体和Cy5标记的Bcl-xL抗体染色。利用流式细胞术(FACS)解析母细胞门控信号。计算HSBXB/总Bcl-xL的比率，并与来自BH3分析样品的Hrk读出比较。在图9B中，将HSBXB检测到的异源二聚体/总Bcl-xL信号相对于从AML患者样品产生的Hrk肽信号作图，如图9A所述。
图10A、图10B和图10C示出所有样品(图10A)、骨髓(图10B)和外周血(图10C)的背景依赖性读出。在图10A、图10B和图10C中，NOXA引发％(y轴)指示Mcl-1依赖性。虽然骨髓NOXA引发与临床响应(CR)高度相关，但来自外周血的样品与CR不相关。在每个图的x轴上，NR指示"无响应者"。
图11A，图11B和图11C示出与FLAM敏感性有关的外周血(PB)或骨髓(BM)中的背景特异性Bcl-2、Bcl-xL依赖性。在图11A中，FLAM tx响应与BM中的Noxa+Bad引发正相关(p值＝0.049)。在图11B中，FLAM tx响应与Noxa+Bad引发负相关，并揭示了PB中的依赖性(p值＝0.0005)。在图11C中，通过BM中Noxa/Bad引发比率观察到更高的相关性(6倍差异，p值＝0.002)。
图12A、图12B和图12C是示出HSBXB抗体如何与HRK和患者响应相关的图。在图12A中，HSBXB/Bcl-xL信号的比率与AML患者样品中的HRK引发相关(p值＝0.0105)。在图12B中，HSBXB/Bcl-xL信号的比率与CLL患者样品中的HRK引发相关(p值＝0.0003)。在图12C中，用HRK信号对该患者组进行的预处理与阿伏西地(alvocidib)响应相关。在图12C的x轴上，“PR”指"部分响应"，而"PD"指进行性疾病。
图13A和图13B是示出HSBXB抗体与Bcl-XL/BIM-BH3异源二聚体的选择性结合的图。在图13A中，Bcl-xL-蛋白结合在ELISA板上。添加或不添加Bim BH3肽，并使用HSBXB抗体来检测复合物。在图13B中，Bcl-xL-GST/BIM BH3异源二聚体被结合到谷胱甘肽包被的ELISA板并用ABT-263(navitoclax)处理，并且检测HSBXB信号。
图14A、图14B和图14C是示出当用A-1155463处理时HSBXB信号响应于Bcl-xL选择性BH3模拟物而移位的图。在图14A中，在半透化细胞中，用所示浓度的A-1155463处理过表达异位Bcl-xL和Bim(SEV-Bcl-xL-Bim[ref])的人精细胞内皮囊泡细胞2小时，固定，然后用针对IgG-2A同种型校正的HSBXB或Bcl-xL抗体固定。收集流式细胞术的信号比率(y轴)。在图14B中，用A-1155463处理完整的SEV-Bcl-xL/Bim细胞16小时，如图14A中固定并染色。HSBXB和Bcl-xL信号的比率按如下所示计算为百分比：
Figure BDA0002654818670000171
在图14C中，将SKBR3细胞用A-1155463处理，使用或不用MEK抑制剂，司美替尼(selumetenib)。
图15A、图15B和图15C是示出AML患者样品中HRK百分比与HSBXB/BCLXL的关系图。
图16A和图16B是示出乳腺癌(BC)细胞中对A1331852的药物响应的图。
图17示出未处理的乳腺癌(BC)细胞中HSBXB相对于BCL-XL的IF染色。
图18由两个图组成，左边的图示出HCC1937细胞+/-A1331852中的HSBXB和BCL-XLIF，右边的图示出HCC1937细胞中的抑制剂和对照的信号强度。在右图中，对于每个系列，左柱是BCL-XL(A468)，右柱是HSBXB(A468)。
图19是示出HCC1937细胞中响应于A1331852的Bcl-xL定位变化的图。使用软件Zen2011(Blue Edition，Carl Zeiss)进行定量分析。对于每个图，最左边的柱是Mito-BCL-XL，下一个柱是Mito-HSBXB，下一个柱是Bcl-XL-DAPI，并且最右边的柱是HSBXB-DAPI。
图20是示出HCC1937细胞中siRNA-BCL-XL敲低的图和凝胶图像。使用软件Image J进行定量分析。
图21是示出乳腺癌细胞中HCC1937的Bcl-xL敲低的IF图像。
图22是示出siRNA BCL-XL HCC1937细胞中信号减少的图。使用软件Zen 2011(Blue Edition，Carl Zeiss)进行定量分析。对于每个系列，左边的柱是BCL-XL(A568)，右边的柱是A488-HSBXB。
图23是示出SVEC野生型相对于Mito引发的SVEC的IF图像。
图24A是wt相对于BCL-XL-/-MEF细胞中BCL-XL表达的免疫印迹。图24B是MEF细胞中BCL-XL(红色)和HSBXB(绿色)的IF染色。图24C示出MEF细胞的IF染色的信号强度。对于每个系列，左边的柱是BCL-XL(A568)，右边的柱是A488-HSBXB。
图25是HSBxB在MEF wt和BCLxL-/-细胞中的免疫组织化学(IHC)。
图26是HCC1937乳腺癌细胞中HSBxB的IHC测定。
图27是在MEFwt和BCLxL-/-MEF细胞中的BcLxL的IHC测定。
图28是HCC1937处理的乳腺癌细胞中BclxL的IHC测定。
图29A和图29B是示出Bcl-XL-siRNA转染的HCC1937细胞中HSBXB(图29A)和BCL-XLIHC(图29B)信号强度降低的图。使用Appio软件进行定量分析。
图30是示出WT MEF和BCL-XL-/-细胞中HSBxB/BclxL的IHC测定。
图31是示出使用HCC1937人乳腺癌细胞进行未处理(左)、A-1331852处理(中)和siRNA-Bcl-xL处理(右)的HSBxB/BCLxL的IHC测定。数字图像通过Aperio Scanscope XT获得，并且使用光谱分析算法包和ImageScope分析软件(Aperio Technologies,Inc.)分析图像以定量IHC信号(棕色和蓝灰色)。这些算法利用颜色去卷积方法来分离染色，通过分析单染色的切片并记录色调值和强度阈值来单独校准每种染色。这些算法计算弱(1+)、中等(2+)和强(3+)阳性染色的百分比。总阳性信号代表每个样品中的弱、中等和强阳性染色的总数。
图32是示出SVEC BCL-xL:BIM中的HSBxB/BCLxL双链体的IHC测定。
图33A、图33B和图33C是示出使用IHC将HSBXB应用于FFPE三阴性乳腺癌切片的IHC测定。在图33A中，患者21HBSXB 40x放大率。在图33B中，患者21，对照抗体，40x放大率。在图33C中，患者14，HBSXB 40x放大率。
图34是证明当HSBXB结合在几种组织来源的癌症中得到证实时IHC测定的广谱应用的表。
图35A、图35B和图35C示出在组织微阵列(TMA)中使用和不用zVAD+A1331852处理16小时的三阴性乳腺癌细胞系HCCC 1937中HSBxB/BCLxL双链体染色的IHC结果。对于每个系列，左柱是总阳性的HSBXB％，右柱是总阳性的BCL-xL％。
图36是示出用于选择、分离和纯化异源二聚体抗体的方法的实验步骤的概览示意图。
图37是示出IgG克隆与Mcl-1/Bim异源二聚体选择性结合的图。在图中增加的线是MCL-1-GST BIM；并且在整个图中接近底部的线是MCL-1-GST。
图38是示出IgG克隆与修饰的BPA4肽选择性结合的图，所述肽以Mcl-1/Bim异源二聚体的形成中存在。用Mcl-1/Bim异源二聚体、Mcl-1单体或单独的BPA4肽包被平板。从图的顶部开始，最接近2.0值的线是非固定的Mcl-1-GST-BPA4样品，并且下面的下一条线是固定的Mcl-1-GST-BPA4样品，并且下一条线是仅BPA4的非固定的样品，并且接下来的两条线合并，这指的是无BIM样品和仅BPA4的固定样品。
图39是示出IgG克隆与修饰的BPA4肽选择性结合的图，所述肽以Mcl-1/Bim异源二聚体的形成中存在。用含有修饰的BPA肽的Mcl-1/Bim异源二聚体、天然Bim生物素或截短的Bim肽包被平板。从图的顶部开始，线以如下顺序出现：bpa4，bio-bim，bpa1和bpa 2；与bh3bim，无bim和bpa3相关的线均在图的底部。
图40是示出对克隆E905和Mcl-1多克隆兔抗体特异的Mcl-1/Bim异源二聚体的IF图像。
图41是示出对克隆E905和Mcl-1多克隆兔抗体特异的Mcl-1/Bim异源二聚体的IF图像。
图42是示出对克隆15D02和Mcl-1多克隆兔抗体特异的Mcl-1单体的IF图像。
图43是IF图像，示出Mcl-1/Bim异源二聚体抗体(HSMCB)需要Bim原位结合。将BimsiRNA用于MCF-7(乳腺癌细胞)，然后将细胞固定并用抗-Bim和HSMCB(Mcl-1/Bim异源二聚体特异性mAb)染色。不表达Bim的细胞通过红色染色的缺乏(从左图起的第二个)来指示，但是对于DAPI和mitoview是阳性的，其不被HSMCB染色。否则，Bim和Mcl-1/Bim复合物共定位，如在Mcl-1引发的细胞中的合并视图(最右侧图像)中所预期的。
具体实施方式
本公开部分基于发现用于例如通过各自特异性结合Bcl-2异源二聚体(例如Bcl-xl/BIM-BH3异源二聚体)的几种抗体来检测患者是否对癌症治疗敏感的组合物和方法。本公开还提供了组合物和方法，其用于检测来自患者的实体瘤样品中的包含两种B细胞淋巴瘤2(BCL-2)蛋白的异源二聚体，并确定所述异源二聚体与参考值的比率，所述比率预测患者对癌症治疗的敏感性。重要的是，本公开的方法基于与功能信号相反的直接信号而给出关于癌症患者响应的信息。
凋亡是由大量在线粒体处会聚的信号传导途径介导的程序性细胞死亡的过程。一组线粒体蛋白，即B细胞白血病/淋巴瘤-2(BCL-2)蛋白家族，调节该过程。更具体地说，促凋亡和抗凋亡BCL-2蛋白与它们的同源调节BCL-2蛋白(即，仅BH3 BCL-2蛋白)形成异源二聚体，从而影响细胞死亡或存活信号。
凋亡的标志之一是线粒体外膜透化(MOMP)，这是由Bcl-2蛋白家族调节的过程。该蛋白家族的活性与淋巴和几种实体瘤癌症的发作有关，并且被认为在许多癌症中是对化疗具有抗性的关键介质。Bcl-2蛋白受促存活(抗凋亡)和促凋亡成员之间的不同蛋白-蛋白相互作用的调节。这些相互作用主要通过BH3(Bcl-2同源结构域-3)介导的结合发生。凋亡启动信号发生在线粒体的大部分上游，并引起短的、仅BH3-的、Bcl-2家族成员向线粒体的易位，在那里它们激活或敏化MOMP。激活剂仅BH3蛋白Bim和Bid结合并直接激活效应物促凋亡蛋白Bax和Bak，并且还结合并抑制抗凋亡Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Mcl-1、Bfl-1、Bcl-w和Bcl-xL。敏化剂BH3蛋白，Bad，Bik，Noxa，Hrk，Bmf和Puma，仅结合抗凋亡Bcl-2家族蛋白Bcl-2，Mcl-1，Bfl-1，Bcl-w和Bcl-xL，从而阻断它们的抗凋亡功能。不希望受理论的束缚，每种敏化剂蛋白具有独特的特异性特征。例如，Noxa(A和B)以高亲和力结合Mcl-1，Bad结合Bcl-xL和Bcl-2，但仅微弱地结合Mcl-1，并且Puma良好地结合所有三种靶。这些蛋白的抗凋亡功能是通过结合形成异源二聚体来隔离激活剂BH3蛋白Bim和Bid。这些激活剂被敏化剂肽或治疗取代导致Bax/Bak介导的凋亡定型。这些相互作用可以具有各种结局，包括但不限于稳态、细胞死亡、对凋亡敏感和凋亡阻断。
最有效的癌症药物诱导靶癌细胞的凋亡。然而，目前癌症治疗的一个显著不足是不同的癌细胞可能以多种方式对诱导凋亡的药物作出响应。这部分是由于在这些癌细胞中促/抗凋亡BCL-2蛋白和仅BH3调节BCL-2蛋白之间存在不同的异源二聚体。
在一些方面，本公开提供了一种用于预测患者对癌症治疗的敏感性的方法，所述方法包括使样品与识别包含两种B细胞淋巴瘤2(BCL-2)蛋白的异源二聚体的抗体或抗体形式接触，所述样品是来自所述患者的实体瘤的样本；检测指示所述异源二聚体的量的信号；以及基于所述样品中存在的异源二聚体的量来确定与参照值的比率，其中所述参照值包括样品中异源二聚体的BCL-2蛋白单体之一的量，所述比率预测患者对癌症治疗的敏感性。
在另一方面，本公开提供了一种用于预测患者对癌症治疗的敏感性的方法，包括：使样品与识别包含两种B细胞淋巴瘤2(BCL-2)蛋白的异源二聚体的抗体或抗体形式和识别所述异源二聚体的BCL-2蛋白单体之一的抗体或抗体形式接触，所述样品是来自所述患者的实体瘤的样本；检测指示所述异源二聚体的量和所述单体的量的信号；以及基于所述异源二聚体的量与所述单体的量来确定比率，所述比率预测实体瘤患者对癌症治疗的敏感性。
癌症、结合Bcl-2异源二聚体的抗体、Bcl-2蛋白和Bcl-2异源二聚体
本公开可以使用癌细胞发生凋亡的倾向性的确定来阐明癌症对特定治疗的易感性。一种可以实现的方式是通过使用所公开的结合Bcl-2异源二聚体的抗体，所述异源二聚体调节凋亡。异源二聚体的形成诱导异源二聚体的两个成员中的构象变化，从而导致在二聚化之前隔离在两个成员中的抗原表位的暴露。本公开的分离的抗体特异性识别这样的表位，并且仅结合Bcl-2家族的异源二聚体，而不结合任一未二聚化的成员。
本公开的一个方面的特征在于特异性结合Bcl-2家族的异源二聚体(即Bcl-2异源二聚体)的分离的抗体。Bcl-2家族包括Bcl-2蛋白(单体)和在两种Bcl-2蛋白之间形成的天然存在的异源二聚体。该异源二聚体含有第一Bcl-2蛋白(例如Bim，Bid，Bad，Puma，Noxa，Bak，Hrk，Bax或Mule)和第二Bcl-2蛋白(例如Mcl-1、Bcl-2、Bcl-XL、Bfl-1或Bcl-w)。在一些实施方案中，BCL-2蛋白为激活剂BH3蛋白，并且激活剂BH3蛋白选自BID和BIM。在一些实施方案中，BCL-2蛋白是敏化剂BH3蛋白。敏化剂BH3蛋白选自BAD、BIK、NOXA A、NOXA B、HRK、BMF、PUMA。在一些实施方式中，BCL-2蛋白是多结构域促凋亡蛋白，并且多结构域促凋亡蛋白选自BAX和BAK。在一些实施方案中，BCL-2蛋白是多结构域抗凋亡蛋白，并且多结构域抗凋亡蛋白选自BCL-2、BCL-XL、MCL-1、BCL-W和BFL-1。在一些实施方案中，所述异源二聚体包含BCL2与BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF之一。
本公开的方法还提供了异源二聚体与BCL2、BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF单体之一的比率。所述异源二聚体可以包含BCLXL与BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF之一。所述方法还可以提供异源二聚体与BCLXL、BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF单体之一的比率。所述异源二聚体可以包含BCLW和BID、BIM、BIK、PUMA和BMF之一。在一些实施方案中，所述方法提供异源二聚体与BCLW、BID、BIM、BIK、PUMA和BMF单体之一的比率。所述异源二聚体可以包含MCL1与BID、BIM、BIK、NOXA A、NOXA B、PUMA、BAK和BMF之一。在一些实施方案中，所述方法提供异源二聚体与MCL1、BID、BIM、BIK、NOXA A、NOXA B、PUMA和BMF单体之一的比率。在一些实施方案中，所述异源二聚体包含BFL1与BID、BIM、NOXA A、NOXA B和PUMA之一。在一些实施方案中，所述方法提供异源二聚体与BFL1、BID、BIM、NOXA A、NOXA B和PUMA单体之一的比率。
本公开的方法还提供了识别BCL2与BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF之一的异源二聚体的抗体或抗体形式。在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式识别BCLXL与BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF之一的异源二聚体。在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式识别BCLW与BID、BIM、BIK、PUMA和BMF之一的异源二聚体。在一些实施方案中，抗体或抗体形式识别MCL1与BID、BIM、BIK、NOXA A、NOXA B、PUMA、BAK和BMF之一的异源二聚体。在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式识别BFL1与BID、BIM、NOXA A、NOXA B和PUMA之一的异源二聚体。
本公开的组合物包含抗体或抗体形式，所述抗体或抗体形式包含：(i)重链可变区，其包含重链CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，其中所述重链CDR1序列为GHTFTEHYIN(SEQID NO:1)，所述重链CDR2序列为WIFPGSGSTYYNEKFKG(SEQ ID NO:2)；并且所述重链CDR3序列为SYSNFWFAY(SEQ ID NO:3)；和(ii)轻链可变区，其包含轻链CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，其中所述轻链CDR1序列为RASQSIGTSIH(SEQ ID NO:4)，所述轻链CDR2序列为KYASESIS(SEQ ID NO:5)；并且所述轻链CDR3序列为QQSNSWPTT(SEQ ID NO:6)。所述抗体或抗体形式可以包含：(i)重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列，或具有总共不超过10个氨基酸置换的SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和(ii)轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或具有总共不超过10个氨基酸置换的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。所述抗体或抗体形式可以包含与SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO.8具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％同一性的氨基酸序列。
存在于线粒体中的Bcl-2蛋白是细胞程序性死亡的定型和死亡/存活信号的执行者的主要调节物。(参见，例如Reed,Natural Clinical Practice Oncology,3:388-398(2006),Green等,Cancer Cell 1:19-30(2002)，以及Adams等.,Cold SpringHarb.Symp.Quant.Biol.70:469-477(2005))。Bcl-2蛋白有四个亚组：(i)多结构域抗凋亡Bcl-2蛋白，(ii)多结构域促凋亡Bcl-2蛋白，(iii)激活剂仅BH3 Bcl-2蛋白，和(iv)敏化剂仅BH3 Bcl-2蛋白。下表1列出了主要的人Bcl-2蛋白和它们的GenBank登录号：
表1
Figure BDA0002654818670000251
其他Bcl-2蛋白(如果有的话)可以通过使用已知Bcl-2蛋白的氨基酸序列作为查询的同源搜索来识别。
多肽可基于与BH3结构域的同源性来鉴定；并且多肽可与表1中公开的多肽的氨基酸序列具有至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％的序列同源性。优选的变体是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸置换的那些。例如，"保守氨基酸置换"是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的置换。在另一实施方案中，BH3结构域肽是凋亡的激活剂或敏化剂。在优选实施方案中，BH3结构域肽是敏化剂。
在一个实施方案中，所述异源二聚体包含Bcl-2家族的不同成员。在另一个实施方案中，Bcl-2家族的异源二聚体含有Bcl-2家族的第一成员和Bcl-2家族的第二成员，所述第一成员选自Bim、Bid、Bad、Puma、Noxa、Bak、Hrk、Bax、Bmf和Mule，所述第二成员选自Mcl-1、Bcl-2、Bcl-XL、Bfl-1和Bcl-w。在另一个实施方案中，Bcl-2家族的第一成员是Bim，Bcl-2家族的第二成员是Mcl-1、Bcl-XL或Bcl-2。在一个实施方案中，所述异源二聚体包含Bcl-XL和Bim。在另一个实施方案中，所述异源二聚体包含Bim和Mcl-1。在另一个实施方案中，所述异源二聚体包含Bim和Bcl-2。在另一个实施方案中，所述异源二聚体包含Bid和Bcl-2。
如果细胞被预先设定为经历药物诱导的凋亡(例如，细胞依赖于Bcl-2多肽的活性以存活)，则本公开的抗体可以用于鉴定负责凋亡阻断的特异性Bcl-2蛋白。
已知Bcl-2蛋白的一个亚组中的成员与不同亚组中的成员形成异源二聚体以调节凋亡。如图1所示，异源二聚体的形成诱导异源二聚体的两个成员中的构象变化，从而导致在二聚化之前隔离在两个成员中的抗原表位的暴露。本公开的分离的抗体特异性识别这样的表位(例如，图1中所示的箭头表位)。换句话说，本文公开的抗体可以特异性结合Bcl-2家族的异源二聚体。
简言之，不希望受理论的束缚，由于异常表型，癌细胞在凋亡途径中形成阻断。这些阻断使得癌细胞对一些疗法具有抗性，并且令人惊讶地，使得一些癌细胞对其他疗法敏感。"癌基因成瘾"的概念描述了癌细胞对特定蛋白的获得性依赖或成瘾以存活的现象。癌细胞可以(但并非总是)被预先设定为经历凋亡，这是这些细胞依赖于任何或所有抗凋亡Bcl-2家族蛋白以使它们以其他方式非预期的存活的功能。这提供了对癌细胞响应治疗的可能性的理解。
不希望受理论束缚，癌细胞表现出异常，例如DNA损伤、遗传不稳定性、异常生长因子信号传导和异常或缺失的基质相互作用，其中任一种通常都应通过固有(线粒体)凋亡途径诱导凋亡。然而，癌细胞存活，而不是对这些凋亡信号作出响应。通常，在这样做时，这些细胞变得高度依赖于对慢性凋亡信号的选择的阻断。这种适应性为癌细胞提供了存活机制；然而，这些适应性改变也可以使癌细胞对特定的凋亡诱导疗法敏感。通过内在的凋亡使细胞死亡的关键事件是线粒体外膜(MOMP)的透化作用和激活效应半胱天冬酶的分子的释放。在许多情况下，MOMP是内在凋亡途径中不恢复的点。Bcl-2家族蛋白是MOMP的关键调节剂，并且它们的活性与淋巴和几种实体瘤癌的发作有关，并且被认为在许多癌症中是对化疗具有抗性的关键介质。
Bcl-2蛋白受促存活(抗凋亡)和促凋亡成员之间的不同蛋白-蛋白相互作用的调节。这些相互作用主要通过BH3(Bcl-2同源结构域-3)介导的结合发生。凋亡启动信号发生在线粒体的大部分上游，并引起短的、仅BH3-的、Bcl-2家族成员向线粒体的易位，在那里它们激活或敏化MOMP。激活剂仅BH3蛋白Bim和Bid结合并直接激活效应物促凋亡蛋白Bax和Bak，并且还结合并抑制抗凋亡Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Mcl-1、Bfl-1、Bcl-w和Bcl-xL。敏化剂BH3蛋白，Bad，Bik，Noxa，Hrk，Bmf和Puma，仅结合抗凋亡Bcl-2家族蛋白Bcl-2，Mcl-1，Bfl-1，Bcl-w和Bcl-xL，从而阻断它们的抗凋亡功能。不希望受理论的束缚，每种敏化剂蛋白具有独特的特异性特征。例如，Noxa(A和B)以高亲和力结合Mcl-1，Bad结合Bcl-xL和Bcl-2，但仅微弱地结合Mcl-1，并且Puma良好地结合所有三种靶。这些蛋白的抗凋亡功能是激活剂BH3蛋白Bim和Bid的隔离。这些激活剂被敏化剂肽取代导致Bax/Bak介导的凋亡定型。这些相互作用可以具有各种结局，包括但不限于稳态、细胞死亡、对凋亡敏感和凋亡阻断。
凋亡信号传导被阻断的癌细胞的确定特征是仅BH3激活蛋白在线粒体表面处的积累，是这些蛋白被抗凋亡蛋白隔离的结果。这种积累和与其效应物靶蛋白的接近导致在"BH3引发"状态下Bcl-2家族蛋白拮抗作用的敏感性增加。
在一些实施方案中，对Noxa(A或B)产生高凋亡响应的细胞是Mcl-1引发的，而对肽Bad的高响应表明Bcl-xL或Bcl-2提供凋亡阻断。在一些实施方案中，Puma反映pan-Bcl-2家族引发。这样，易于区分对两种蛋白依赖Mcl-1或Bcl-xL或依赖几种Bcl-2家族成员的细胞，从而可以相应地定制合适的治疗。线粒体对这些肽的响应的差异指导了治疗的使用，已知所述治疗通过进入Mcl-1或Bcl-xL影响的内在信号传导的途径起作用。在这种情况下，可以使用Bcl-2抑制性或Mcl-1抑制性化合物。在一些实施方案中，本公开的方法还指示或禁忌靶向Mcl-1或Bcl-xL上游实体的疗法。
抗体的产生和制备
本公开的抗体可以是完整的免疫球蛋白或其保留抗原结合活性的片段。在一些实施方案中，本公开的抗体可以是遗传修饰的免疫球蛋白，包括scFv抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fv、单链Fv、双抗体、线性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和包含抗体的抗原结合部分的融合蛋白中的一种或多种。在一些实施方案中，所述抗体或抗体形式还包含根据式(FW1)-(CDR1)-(FW2)-(CDR2)-(FW3)-(CDR3)-(FW4)的并置在CDR之间的可变区框架(FW)序列，其中重链可变区中的可变区FW序列是重链可变区FW序列，并且其中轻链可变区中的可变区FW序列是轻链可变区FW序列。在一些实施方案中，可变区FW序列是人的。所述抗体或抗体形式还可以包含人重链恒定区和轻链恒定区。在一些实施方案中，恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。如本文所用，术语"分离的抗体"是指基本上不含天然缔合分子的抗体，即天然缔合分子构成含有抗体的制剂的至多20干重％。
本公开的抗体可以通过常规方法制备。(参见，Harlow and Lane,(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。例如，Bcl-2家族的合成异源二聚体可以通过使用关键结合基序的一部分分别产生异源二聚体蛋白的两个成员，然后合成关键表位并诱导异源二聚体的一个成员的一部分(配体)和异源二聚体的另一个成员的全长蛋白(受体)来制备。合成的异源二聚体的功能性可以使用体外结合测定来检查。一旦测定，就在合成的异源二聚体中保持结合保真度，然后可修饰配体部分以含有苯甲酰基苯丙氨酸(Anaspec,Fremont,CA,USA)代替几种潜在的芳族氨基酸之一。(图1、图2)可进一步测试每个蛋白片段的结合保真度，如上所述。一旦选定，结合配体就可以通过暴露于450nM的紫外光激活暴露长达8小时而共价结合。然后，合成的异源二聚体可通过FPLC纯化，并用作免疫原注射到小鼠宿主中。
为了产生结合异源二聚体的抗体，可以任选地将异源二聚体偶联到载体蛋白(例如KLH)上，并与佐剂混合，然后注射到宿主动物中。然后，可以通过异源二聚体亲和层析来纯化动物中产生的抗体。通常使用的宿主动物包括兔、小鼠、豚鼠和大鼠。可以使用各种佐剂(取决于宿主物种)来增加免疫响应，并且包括弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝、CpG、表面活性物质如溶血卵磷脂、普流罗尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。有用的人佐剂包括BCG(卡介苗)和小棒杆菌。多克隆抗体，即抗体分子的异质群体，存在于被免疫动物的血清中。
单克隆抗体，即抗体分子的同质群体，使用标准杂交瘤技术制备。(参见，例如，Kohler等(1975)Nature 256,495；Kohler等(1976)Eur.J.Immunol.6,511；Kohler等(1976)Eur J Immunol 6,292；和Hammerling等(1981)Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas,Elsevier,N.Y.))。特别地，可以通过任何通过培养中的连续细胞系提供抗体分子生产的技术获得单克隆抗体。(参见Kohler等(1975)Nature 256,495；Kosbor等(1983)Immunol Today 4,72；Cole等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,2026，和EBV杂交瘤技术(Cole等(1983)；另请参见Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96))。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。产生本公开的单克隆抗体的杂交瘤可以在体外或体内培养。体内产生高滴度单克隆抗体的能力使其成为特别有用的制备方法。
此外，可以使用为制备"嵌合抗体"而开发的技术。(参见例如Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger等(1984)Nature 312,604；和Takeda等(1984)Nature 314:452)。嵌合抗体是一种分子，其中不同部分来自不同的动物物种，例如具有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些。或者，描述的用于制备单链抗体的技术(美国专利4,946,778和4,704,692)可以适于产生scFv抗体的噬菌体或酵母文库。scFv抗体是通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段而形成的。
此外，抗体片段可以通过已知技术产生。例如，这些片段包括但不限于，可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab')sub.2片段，以及可以通过还原F(ab')sub.2片段的二硫键产生的Fab片段。抗体也可以通过本领域已知的方法人源化。例如，具有所需结合特异性的单克隆抗体可以商业化地人源化(Scotgene,Scotland；以及Oxford Molecular,PaloAlto,Calif.)。完全人抗体，如在转基因动物中表达的那些抗体也是本公开的特征(参见，例如，Green等(1994)Nature Genetics 7,13；和美国专利5,545,806和5,569,825)。
通过上述任何方法制备的抗体被证实与Bcl-2异源二聚体的结合(即，参见图3、图13A、图13B)。它们进一步进行负向选择以排除也结合到异源二聚体的非二聚化成员上的那些。(图2)例如，两个成员，即单体A和单体B中的每一个可以分别用不同的荧光染料，即染料x和染料y标记。染料X和Y具有不同的最佳发射波长。首先将抗体与标记的单体A、标记的单体B或A/B异源二聚体(双重标记的)温育合适的时间，然后用GamaBind琼脂糖凝胶珠捕获。基于从捕获的抗体释放的荧光信号确定抗体是否能够结合单体或异源二聚体。选择结合至异源二聚体而不是任一非二聚化成员的抗体。(图2)
本文公开的抗体可用于通过常规方法，例如免疫组织化学(IHC)染色(图6)检测获自受试者(例如患者)的样品，特别是固定的组织样品或线粒体级分中是否存在Bcl-2异源二聚体的方法。例如，可以使用对各种Bcl-2异源二聚体特异的多种抗体来描述来自患者的多种组织样品中线粒体外膜上特定Bcl-2异源二聚体的存在。可以从同一患者收集处于各种疾病阶段(例如，恶性肿瘤阶段)的组织。线粒体组分可以从这些组织中制备，并且使用本公开的多种抗体，可以针对Bcl-2异源二聚体的存在/不存在来对级分进行分析。
本文还公开了基于患者中特定Bcl-2异源二聚体的存在，预测人患者对直接或间接干扰该Bcl-2异源二聚体形成的药物的响应性的方法。
众所周知，Bcl-2蛋白通过在不同的Bcl-2亚组中的成员之间形成异源二聚体而在调节凋亡中发挥重要作用。参见上表1。激活剂仅BH3 Bcl-2蛋白(即BID或BIM)结合到多结构域促凋亡Bcl-2蛋白(即BAX或BAK)，从而触发导致细胞死亡的线粒体外膜透化(MOMP)。多结构域抗凋亡Bcl-2蛋白(例如Bcl-2或Mcl-1)可以结合BAX和BAK，并且也隔离激活剂仅BH3蛋白以免结合BAX或BAK。因此，它阻断MOMP过程，导致细胞存活。多结构域抗凋亡Bcl-2蛋白的活性由敏化剂仅BH3蛋白调节。Bcl-2蛋白的这一亚组通过与抗凋亡Bcl-2蛋白结合而促进凋亡，置换激活剂仅BH3 Bcl-2蛋白，以致它们被释放以与促凋亡Bcl-2蛋白结合，从而触发MOMP过程。简而言之，有两种类型的Bcl-2异源二聚体：(1)促凋亡Bcl-2异源二聚体，其在激活剂仅BH3 Bcl-2蛋白和多结构域促凋亡Bcl-2蛋白之间形成，或在敏化剂仅BH3 Bcl-2蛋白和多结构域抗凋亡Bcl-2蛋白之间形成；和(2)抗凋亡Bcl-2异源二聚体，其在多结构域抗凋亡Bcl-2蛋白和激活剂仅BH3 Bcl-2蛋白之间形成，或在多结构域抗凋亡Bcl-2蛋白和多结构域促凋亡Bcl-2蛋白之间形成。促凋亡Bcl-2异源二聚体的形成促进凋亡，而抗凋亡异源二聚体的形成促进细胞存活。
已知在受试者(例如患者)中特定的促凋亡或抗凋亡Bcl-2异源二聚体的存在指示患者对阻断特定的异源二聚体的形成并抑制其功能的药物的响应性。(参见，例如Delbridge and Strasser A.Cell Death Differ.2015 Jul；22(7):1071-80.doi:10.1038/cdd.2015.50)
在本公开的一些实施方案中，药物是仅BH3蛋白的模拟物，其与仅BH3蛋白竞争结合其同源配偶体。在其他实施方案中，药物靶向上游凋亡因子并最终阻断Bcl-2异源二聚体的形成。
许多癌症药物通过阻断抗凋亡Bcl-2异源二聚体的形成来诱导癌细胞的凋亡。特定的抗凋亡Bcl-2异源二聚体在癌症患者中的存在表明该患者对干扰该抗凋亡Bcl-2异源二聚体形成的药物敏感。(参见Robert等，Clinical Pharmacology and Therapeutics101；2017年1月1日)。另一方面，凋亡抑制剂可用于治疗神经变性疾病或心血管疾病，两者都涉及凋亡。在这种情况下，例如，神经变性疾病患者或心血管疾病患者中特定的促凋亡Bcl-2异源二聚体的存在表明，这样的患者对阻断特定的促凋亡Bcl-2异源二聚体形成的凋亡抑制剂敏感。
在一些实施方案中，所述敏感性的特征在于(a)样品中存在凋亡；(b)样品中存在抗凋亡Bcl-2异源二聚体，指示患者对干扰抗凋亡Bcl-2异源二聚体形成的药物敏感；(c)遗传风险因子；家族史；个人历史；种族和种群；某些组织的特征；各种良性病症(例如，非增殖性病变)；前一次胸部辐射；致癌物质暴露等。
在一些实施方案中，所述方法不包括线粒体外膜透化(MOMP)的功能性读出。在一些实施方案中，所述方法不包括对细胞膜电位的基于染料的检测。
示例性临床决策
在一些实施方案中，本文所述的方法可用于评价来自患者的实体瘤样品，例如用于评价诊断、预后和对治疗的响应。在各个方面，本公开包括评价实体瘤。在各种实施方案中，评价可以选自诊断、预后和对治疗的响应。
在各个方面，本公开的方法可用于治疗癌症患者。例如，所述方法还可以包括在所述比率预测对癌症治疗的敏感性的情况下，对患者施用癌症治疗。在一些实施方案中，所述方法还可以包括在所述比率预测对癌症治疗的敏感性的情况下，用减少的剂量或不太频繁和/或缩短的癌症治疗方案治疗患者。在一些实施方案中，所述方法还可以包括在所述比率预测对癌症治疗的敏感性的情况下，用增加的剂量或更加频繁和/或延长的癌症治疗方案治疗患者。在一些实施方案中，所述方法还可以包括在所述比率预测对癌症治疗缺乏敏感性的情况下，停止对患者的癌症治疗。在一些实施方案中，所述方法还可以包括在所述比率预测对癌症治疗缺乏敏感性的情况下，用不同的癌症治疗来治疗患者。
例如，在各种实施方案中，样品呈现二聚体比单体多的比率。例如，二聚体与单体的比率可以是约20:1或约15:1，或约10:1，或约9:1，或约8:1，或约7:1，或约6:1，或约5:1，或约4:1，或约3:1，或约2:1。在各种实施方案中，样品呈现单体比二聚体多的比率。例如，单体与二聚体的比率可以是约20:1或约15:1，或约10:1，或约9:1，或约8:1，或约7:1，或约6:1，或约5:1，或约4:1，或约3:1，或约2:1。在各种实施方案中，二聚体与单体的比率是相等的(即约1:1)。
诊断是指试图确定或鉴定可能的疾病或病症，例如癌症的过程。预后是指预测疾病或病症(例如癌症)的可能结局。完全预后通常包括预期的持续时间、功能，以及疾病进程的描述，例如进行性衰退、间歇性危象或突然的、不可预测的危象。对治疗的响应是当接受治疗时对患者的医疗结局的预测。作为非限制性实例，对治疗的响应可以是病理完全响应、存活和无进展存活、进展时间和复发概率。
在各种实施方案中，本公开的方法指导关于患者是否接受特定治疗的临床决策。在一个实施方案中，本公开的方法预测对新辅助和/或辅助化疗的阳性响应或对新辅助和/或辅助化疗的无响应性。在一个实施方案中，本公开的方法预测对促凋亡剂或通过凋亡起作用的剂和/或不通过凋亡起作用的剂的阳性响应，或对凋亡效应剂和/或不通过凋亡起作用的剂的无响应性。在各种实施方案中，本公开指导癌症患者的治疗，包括例如应当施用或停止何种类型的治疗。
在一些实施方案中，本公开的方法指导关于抗癌药、化疗、抗凋亡蛋白的拮抗剂、外科手术、辅助疗法和新辅助疗法中的一种或多种的癌症治疗。
在一个实施方案中，本公开的方法指导关于患者是否在初步、主要或初始治疗后接受辅助疗法的临床决策，包括但不限于单一单独的辅助疗法。辅助疗法，也称为辅助护理，是除主要、初步或初始治疗之外给予的治疗。作为非限制性实例，辅助疗法可以是通常在外科手术之后给予的额外治疗，其中所有可检测的疾病已被去除，但其中由于隐匿性疾病而仍然存在复发的统计风险。
在一些实施方案中，本公开的方法指导患者的治疗以包括辅助疗法。例如，被评分为对特定治疗有响应的患者可以接受作为辅助疗法的这种治疗。此外，本公开的方法可以指导辅助疗法的身份，作为非限制性实例，作为以促凋亡方式诱导和/或起作用的治疗或不以促凋亡方式诱导和/或起作用的治疗。在一个实施方案中，本公开的方法可以指示患者对特定治疗将不响应或将较少响应，因此这样的患者可能不接受作为辅助疗法的这种治疗。因此，在一些实施方案中，本公开的方法根据患者的可能响应提供或停止辅助疗法。这样，可以提高患者的生活质量和护理成本。
在各种实施方案中，本公开的方法指导关于患者是否接受新辅助疗法的临床决策，例如在外科手术前缩小和/或降级肿瘤的疗法。在一些实施方案中，新辅助疗法意指在外科手术之前向癌症患者施用的化疗。在一些实施方案中，新辅助疗法意指在外科手术之前向癌症患者施用的剂，包括本文所述的那些。通常考虑的新辅助化疗的癌症类型包括，例如，乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和肺癌。
在一些实施方案中，本公开的方法指导患者的治疗以包括新辅助疗法。例如，被评分为对特定治疗有响应的患者可以接受作为新辅助疗法的这种治疗。此外，本公开的方法可以指导新辅助疗法的身份，作为非限制性实例，作为以促凋亡方式诱导和/或起作用的治疗或不以促凋亡方式诱导和/或起作用的治疗。在一个实施方案中，本公开的方法可以指示患者对特定治疗将不响应或将较少响应，因此这样的患者可能不接受作为新辅助疗法的这种治疗。因此，在一些实施方案中，本公开的方法根据患者的可能响应提供或停止新辅助疗法。这样，可以提高患者的生活质量和护理成本。
在一些实施方案中，本公开的方法指导关于患者是否接受特定类型的治疗(例如，抗癌药、化疗、抗凋亡蛋白的拮抗剂、外科手术、辅助疗法和新辅助疗法中的一种或多种)的临床决策。在一些实施方案中，癌症治疗是SMAC模拟物、BH3模拟物、蛋白酶体抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、糖皮质激素、类固醇、单克隆抗体、抗体-药物缀合物或沙利度胺衍生物中的一种或多种。在一些实施方案中，本公开的方法是用于患者治疗的指导测试。
在一些实施方案中，本公开的方法包括癌症治疗，并且癌症治疗是检查点抑制剂。检查点抑制剂可以是靶向TIM-3、BTLA、PD-1、CTLA-4、B7-H4、GITR、半乳凝素-9、HVEM、PD-L1、PD-L2、B7-H3、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a和TMIGD2之一的剂。靶向PD-1的剂可以是对PD-1特异的抗体或抗体形式，任选地选自纳武单抗、派姆单抗和匹利珠单抗。靶向PD-L1的剂可以是对PD-L1特异的抗体或抗体形式，任选地选自阿特朱单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗和BMS-936559。靶向CTLA-4的剂可以是对CTLA-4特异的抗体或抗体形式，任选地选自伊匹单抗和曲美木单抗。
在一些实施方案中，本公开的方法提供关于患者对特定治疗具有的可能响应的信息。在一些实施方案中，本公开的方法提供了高响应可能性，并且可以指导治疗，包括积极治疗。在一些实施方案中，本公开的方法提供了低响应可能性，并且可以指导治疗的停止，包括积极治疗，以及姑息性护理的使用，以避免来自无效化疗的不必要的毒性，从而获得更好的生活质量。
在一个示例性实施方案中，本公开的方法将指示对特定治疗的响应可能性。例如，在一些实施方案中，本公开的方法指示对促凋亡剂和/或通过凋亡起作用的剂和/或通过由直接蛋白调节驱动的凋亡起作用的剂的高或低响应可能性。在各种实施方案中，示例性的促凋亡剂和/或通过凋亡起作用的剂和/或通过由直接蛋白调节驱动的凋亡起作用的剂包括ABT-263(Navitoclax)，以及obatoclax、WEP、硼替佐米(bortezomib)和卡非佐米(carfilzomib)。在一些实施方案中，本公开的方法指示对不通过凋亡起作用的剂和/或不通过由直接蛋白调节驱动的凋亡起作用的剂的高或低响应可能性。在各种实施方案中，不通过凋亡起作用的示例性剂包括驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、三氧化二砷(TRISENOX)、MEK抑制剂、泊莫度胺(pomolidomide)、氮胞苷、地西他滨(decitibine)、伏立诺他(vorinostat)、恩替司他(entinostat)、地尼西宝(dinaciclib)、吉姆单抗(gemtuzumab)、BTK抑制剂、PI3激酶δ抑制剂、来那度亚胺(lenolidimide)、蒽环类抗生素(anthracycline)、阿糖胞苷、美法仑、Aky抑制剂、mTOR抑制剂。
在一个示例性实施方案中，本公开的方法将指示患者是否接受促凋亡剂或通过凋亡起作用的剂用于癌症治疗。在另一个示例性实施方案中，本公开的方法将指示患者是否接受不通过凋亡起作用的剂。
在一个具体实施方案中，本公开的方法可用于预测癌症患者对本文所述的任何治疗(包括剂)的响应。
在各种实施方案中，基于本文所述的方法施用或停止癌症治疗。示例性治疗包括外科手术切除、放射疗法(包括使用如本文所述的化合物作为放射敏化剂或与放射敏化剂组合)、化疗、药效学疗法、靶向疗法、免疫疗法和支持疗法(例如止痛药、利尿剂、抗利尿剂、抗病毒剂、抗生素、营养补充剂、贫血治疗剂、凝血治疗剂、骨治疗剂以及精神病和心理治疗剂)。
示例性治疗
在示例性实施方案中，本公开选择治疗剂。这些剂的实例包括但不限于抗癌药、化疗、外科手术、辅助疗法和新辅助疗法中的一种或多种。在一个实施方案中，癌症治疗是BH3模拟物、表观遗传修饰剂、拓扑异构酶抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂和驱动蛋白纺锤体蛋白稳定剂中的一种或多种。在一些实施方案中，BH3模拟物选自ABT-737和ABT-263(navitoclax)、Bcl-2特异性Ventocrax(Venclexta,ABT-199)、MCL-1特异性S63845和AMG176和ADZ5991、BCL-XL特异性A-1155463和A1331852、BFL-1/MCL-1特异性EU5346或其组合。在另一个实施方案中，所述癌症治疗是蛋白酶体抑制剂；和/或细胞周期调节的调节剂(作为非限制性实例，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)；和/或细胞外遗传机制的调节剂(作为非限制性实例，组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)中的一种或多种(例如伏立诺他或恩替司他中的一种或多种)、氮胞苷、地西他滨)；和/或蒽环类抗生素或蒽二酮(作为非限制性实例，表柔比星、阿霉素、米托蒽醌、柔红霉素、伊达比星中的一种或多种)；和/或铂基治疗剂(作为非限制性实例，卡铂、顺铂和奥沙利铂中的一种或多种)；阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗；BH3模拟物(作为非限制性实例，BCL2、BCLXL或MCL1中的一种或多种)；和MCL1抑制剂。在一些实施方案中，癌症治疗阻断所检测的特定异源二聚体的形成。在一些实施方案中，癌症治疗干扰所检测的特定异源二聚体的形成。
在各种实施方案中，本公开涉及癌症治疗，包括但不限于下列中的一种或多种：烷化剂如噻替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺类(methylamelamine)包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；己酸配质(acetogenin)(特别是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；海绵多聚乙酰(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB 1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类例如烯二炔抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)、加利车霉素γll、加利车霉素ωll(参见，例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；烯二炔蒽环类抗生素(dynemicin)，包括烯二炔蒽环类抗生素A；二膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，例如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类(anti-adrenals)，例如氨鲁米特(minoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补偿剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)、醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)、氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸嫁(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香燕多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美坦生类(maytansinoids)，例如美坦生(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(特别是T-2毒素、韦拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托新(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)("Ara-C")；环磷酰胺(cyclophosphamide)；硫替派；紫杉烷类(taxoids)，例如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、紫杉醇的ABRAXANE无克列莫佛的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,111.)和TAXOTERE多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；GEMZAR西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A例如维甲酸；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(lapatinib)(Tykerb)；PKC-α、Raf、H-ras、EGFR(例如厄洛替尼(Tarceva))和VEGF-A的抑制剂，其减少细胞增殖、dacogen、velcade，和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
示例性检测方法
在各种实施方案中，本公开的方法包括预测患者对癌症治疗的敏感性。在一些实施方案中，所述异源二聚体的检测采用免疫组织化学(IHC)、流式细胞术或免疫荧光法。
在各种实施方案中，所述方法包括评价蛋白和/或核酸的存在、不存在或水平。在各种实施方案中，本方法包括评价可增强BH3异源二聚体比率的特异性和/或敏感性的蛋白和/或核酸的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，评价是针对患者响应的标志物的评价。在一些实施方案中，本公开的方法包括使用免疫组织化学染色(即IHC)、蛋白印迹、细胞蛋白印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)中的一种或多种或本文所述或本领域已知的任何其他方法进行测量。本公开的方法可以包括将抗体与肿瘤样本(例如活检或组织或体液)接触以鉴定对组织或体液特异的并且指示癌症状态的表位。
通常有两种策略用于检测体液或组织中抗原上的表位：直接法和间接法。直接方法包括一步染色，并且可以包括与体液或组织样品中的抗原直接反应的标记抗体(例如FITC缀合的抗血清)。间接法包括与体液或组织抗原响应的未标记的一抗和与一抗反应的标记的二抗。标记物可包括放射性标记物、荧光标记物、半抗原标记物如生物素，或酶如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。进行这些测定的方法是本领域公知的。参见例如Harlow等(Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1988),Harlow等(使用Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1999),Virella(MedicalImmunology,第6版,Informa HealthCare,New York,2007),和Diamandis等人(Immunoassays,Academic Press,Inc.,New York,1996)。用于进行这些测定的试剂盒可从例如Clontech Laboratories，LLC.(Mountain View，CA)商购获得。
在各种实施方案中，抗体包括完整抗体和/或任何抗原结合片段(例如，抗原结合部分)和/或它们的单链(例如，抗体，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包括通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段区；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段等)。在各种实施方案中，多克隆和单克隆抗体是有用的，分离的人或人源化抗体或其功能片段也是有用的。
评价抗体对各种物种靶的结合能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白印迹和RIA。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可通过本领域已知的标准测定法，例如通过Biacore分析来评估。
在另一个实施方案中，所述测量包括评价核酸的存在、不存在或水平。本领域技术人员将理解，许多方法可用于检测或定量适当标志物的DNA/RNA水平。
基因表达可以使用例如低度至中度重叠技术来测量，包括但不限于报告基因测定、Northern印迹、荧光原位杂交(FISH)和逆转录PCR(RT-PCR)。基因表达也可使用例如较高重叠技术来测量，包括但不限于基因表达系列分析(SAGE)、DNA微阵列。平铺阵列、RNA-seq/全转录组鸟枪法测序(WTSS)、高通量测序、多重PCR、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、通过连接的DNA测序和Luminex/XMAP。本领域技术人员将理解，许多方法可用于检测或定量样品内生物标志物的RNA产物的水平，包括阵列，例如微阵列、RT-PCR(包括定量PCR)、核酸酶保护测定和Northern印迹分析。
示例性癌症和患者
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于确定癌症治疗和/或包括患者的肿瘤或癌细胞样本的方法。癌症或肿瘤是指细胞不受控制的生长和/或异常增加的细胞存活和/或抑制凋亡，其干扰身体器官和系统的正常功能。罹患癌症或肿瘤的受试者是具有存在于受试者体内的可客观测量的癌细胞的受试者。本公开包括良性和恶性癌症，以及休眠肿瘤或微转移。从其原始位置迁移并播种重要器官的癌症可通过受影响器官的功能退化最终导致受试者死亡。
在各种实施方案中，本公开适用于转移前癌症或转移性癌症。转移是指癌症从其原发部位扩散到体内其他部位。癌细胞可以脱离原发性肿瘤，穿透进入淋巴管和血管，通过血流循环，并在体内其他地方的正常组织中的远端病灶中生长(转移)。转移可以是局部的或远端的。转移是连续的过程，视肿瘤细胞从原发肿瘤脱落、通过血流行进和在远端部位停止而定。在新的部位，细胞建立血液供应，并可以生长形成威胁生命的团块。肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径都调节这种行为，并且肿瘤细胞和远端部位中的宿主细胞之间的相互作用也是显著的。除了监测特定症状外，转移通常通过单独或组合使用磁共振成像(MRI)扫描、计算机断层扫描(CT)扫描、血液和血小板计数、肝功能研究、胸部X-射线和骨扫描来检测。
本文所述的方法涉及癌症的预后、癌症的诊断、癌症的治疗和/或恶性肿瘤和与细胞存活增加相关的增殖性病症的生长、进展和/或转移的诊断、预后、治疗、预防或改善或凋亡的抑制。在一些实施方案中，癌症是实体瘤，包括但不限于非小细胞肺癌、卵巢癌和黑素瘤。
在一些实施方案中，样品是患者的浸润淋巴细胞。
在一些实施方案中，实体瘤选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、结肠癌和卵巢癌。在一些实施方案中，肺癌选自非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。在一些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，前列腺癌是雄激素非依赖性前列腺癌。
在一些实施方案中，本公开涉及以下癌症中的一种或多种：肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤(例如儿童小脑或大脑)、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤(例如骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)、脑干神经胶质瘤、脑癌、脑肿瘤(例如小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始性神经外胚层肿瘤、视觉途径和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、颅外生殖细胞瘤、胰岛外胚层细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞瘤(例如颅外、性腺外、卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤(例如脑干、脑星形细胞瘤、视觉通路和下丘脑)、胃类癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、咽下癌、下丘脑和视觉通路神经胶质瘤、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌(例如非小细胞、小细胞)、成神经管细胞瘤、黑素瘤、梅克细胞癌(Merkel cell carcinoma)、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌瘤形成综合征、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、鼻旁窦癌和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤和/或生殖细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始性神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(例如、尤因家族、卡波西、软组织、子宫)、塞泽里氏综合症(Sézary syndrome)、皮肤癌(例如、非黑素瘤、黑素瘤、默克尔细胞)、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始性神经外皮肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、滋养叶瘤、输尿管和肾盂癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、
Figure BDA0002654818670000441
巨球蛋白血症和韦尔姆斯氏瘤(Wilmstumor)。
除非另有定义、本文所用的术语受试者是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪或非人灵长类动物，例如猴、黑猩猩或狒狒。术语"受试者"和"患者"可互换使用。
示例性样本
在一些实施方案中，本公开包括肿瘤样本的测量，包括活检或外科手术样本样品。在一些实施方案中，所述样本选自冷冻肿瘤组织样本、培养的细胞、循环肿瘤细胞和福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本。在一些实施方案中，所述活检是人活检。在各种实施方案中，所述活检是冷冻肿瘤组织样本、培养的细胞、循环肿瘤细胞和福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本中的任一种。
在一些实施方案中，样品选自肿瘤活检、组织活检、肿瘤切除、冷冻肿瘤组织样本、淋巴结、骨髓、循环肿瘤细胞、培养细胞、福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本、支气管肺泡灌洗液、皮肤、毛发、尿液及其组合。在一些实施方案中，肿瘤活检选自组织芯活检、针吸活检、手术组织活检和切除组织活检。
在一些实施方案中，肿瘤样本可以是活检样品，例如冷冻肿瘤组织(冷冻切片)样本。如本领域所公知的，冷冻切片可以使用低温恒温器，其包括在冷冻器内的切片机。将外科手术样本置于金属组织盘上，然后将其固定在卡盘中并迅速冷冻至约-20℃至约-30℃，将样本包埋在由例如聚乙二醇和聚乙烯醇组成的凝胶状介质中。冷冻组织用低温恒温器的切片机部分冷冻切割，并且切片任选地在载玻片上拾取并染色。
在一些实施方案中，肿瘤样本可以是活检样品，例如培养的细胞。这些细胞可以使用本领域已知的常用细胞培养技术进行处理。这些细胞可以是循环肿瘤细胞。
在一些实施方案中，肿瘤样本可以是活检样品，例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织样本。如本领域所公知的，活检样本可以放置在具有福尔马林(水和甲醛的混合物)或一些其他流体的容器中以保存该样本。可以将组织样品与热石蜡一起放入模具中。蜡冷却形成保护组织的固体块。将具有包埋组织的石蜡块置于切片机上，切片机切割非常薄的组织切片。
在某些实施方案中，肿瘤样本(或活检)含有少于100mg的组织，或在某些实施方案中，含有约50mg或更少的组织。肿瘤样本(或活检)可以含有约20mg至约50mg的组织，如约35mg的组织。
例如，可以作为一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)针吸活检(例如，使用14号针或其他合适的尺寸)来获得组织。在一些实施方案中，活检是细针抽吸，其中将长细针插入可疑区域，并使用注射器抽取流体和细胞用于分析。在一些实施方案中，活检是芯针吸活检，其中在芯针吸活检期间使用具有切割尖端的大针以从可疑区域抽出组织柱。在一些实施方案中，活检是真空辅助活检，其中抽吸装置增加通过针提取的流体和细胞的量。在一些实施方案中，活检是图像引导的活检，其中将针吸活检与成像程序组合，所述成像程序例如X射线、计算机断层摄影(CT)、磁共振成像(MRI)或超声。在其他实施方案中，可以通过诸如
Figure BDA0002654818670000451
活检系统的装置获得样品，该活检系统是用于乳房活检的激光引导的真空辅助活检系统。
在某些实施方案中，所述样本是人肿瘤衍生的细胞系。在某些实施方案中，所述样本是癌症干细胞。在其他实施方案中，所述样本来源于实体瘤的活检，例如结肠直肠、乳腺、前列腺、肺、胰腺、肾或卵巢原发性肿瘤的活检。
在某些实施方案中，样本是上皮来源的。在一些实施方案中，通过用抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)或其他与固体基质或珠结合的上皮细胞结合抗体从活检样品中选择来富集上皮样本。
在某些实施方案中，所述样本是间充质来源的。在一些实施方案中，通过用神经细胞粘附分子(N-CAM)或神经纤毛蛋白或其他结合固体基质或珠的间充质细胞结合抗体从活检样品中选择来富集间充质样本。
在一些实施方案中，所述样本来源于循环肿瘤细胞。
示例性临床因素和另外的生物标志物
在一些实施方案中，本公开包括确定患者的一种或多种临床因素。本公开可以包括检测来自患者的实体瘤样品中的包含两种B细胞淋巴瘤2(BCL-2)蛋白的异源二聚体，并确定所述异源二聚体和/或临床因素的比率以评估患者响应或预测患者对癌症治疗的敏感性。在一些实施方案中，临床因素包括基于患者的一种或多种临床因素针对对癌症治疗的临床响应的可能性来进一步对患者进行分类。在一些实施方案中，临床因素包括基于患者的一种或多种临床因素将患者对癌症治疗的敏感性的预测与对癌症治疗的临床响应的可能性进行比较。在一些实施方案中，结合比率研究提供患者响应信息的临床因素可能与凋亡无关。在一些实施方案中，临床因素是非凋亡影响的。
在一些实施方案中，临床因素是年龄、细胞遗传学状态、表现、组织学亚类、性别和疾病阶段中的一种或多种。在一些实施方案中，临床因素还包括测量选自突变状态、单核苷酸多态性、稳态蛋白水平以及动态蛋白水平的另外的生物标志物。
在一个实施方案中，临床因素是年龄。在一个实施方案中，患者年龄概况分类为超过约10岁、或超过约20岁、或超过约30岁、或超过约40岁、或超过约50岁、或超过约60岁、或超过约70岁、或超过约80岁。
在一个实施方案中，临床因素是细胞遗传学状态。在一些癌症中，例如Wilms肿瘤和成视网膜细胞瘤，基因缺失或失活是引发癌症发展的原因，因为与肿瘤抑制剂相关的染色体区域通常缺失或突变。例如，通常在神经胶质瘤、非小细胞肺癌、白血病和黑素瘤中的染色体区域9p21中检测到缺失、倒位和易位。不希望受理论束缚，这些染色体变化可以使肿瘤抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A失活。随着特定基因的这些缺失，染色体的大部分也可能丢失。例如，染色体1p和16q通常在实体瘤细胞中丢失。基因复制和基因拷贝数的增加也可以导致癌症，并且可以用转录分析或拷贝数变异阵列检测。例如，在许多肉瘤中扩增染色体区域12q13-q14。该染色体区域编码称为MDM2的结合蛋白，已知该结合蛋白与称为p53的肿瘤抑制物结合。当MDM2扩增时，它会阻止p53调节细胞生长，这可导致肿瘤形成。此外，某些乳腺癌与编码人表皮生长因子受体2的ERBB2基因的过表达和拷贝数增加相关。此外，染色体数目的增加，例如染色体1q和3q，也与增加的癌症风险相关。
细胞遗传学状态可以以本领域已知的多种方式测量。例如，可使用FISH、传统核型分析和虚拟核型分析(例如比较基因组杂交阵列、CGH和单核苷酸多态性阵列)。例如，FISH可用于评估特定基因座的染色体重排，这些现象与疾病风险状态相关。在一些实施方案中，细胞遗传学状态是有利的、中立的或不利的。
在一个实施方案中，临床因素是表现。表现状态可以使用本领域已知的用于对患者的表现状态评分的任何系统和方法来量化。该测量通常用于确定患者是否可以接受化疗、剂量调整的调整，以及确定姑息性护理的强度。有各种评分系统，包括Karnofsky评分和Zubrod评分。并行评分系统包括功能整体评估(GAF)评分，其已被纳入精神病学诊断和统计手册(DSM)的第五轴。较高表现状态(例如，使用Karnofsky评分系统为至少80％或至少70％)可指示治疗以防止疾病状态的进展，并增强患者接受治疗和/或放射治疗的能力。例如，在这些实施方案中，患者是能走动的并且能够自我护理。在其他实施方案中，所述评价指示患者具有低表现状态(例如，使用Karnofsky评分系统小于50％、小于30％或小于20％)，以便允许耐受常规放射疗法和/或化疗。在这些实施方案中，患者主要被限制在床或椅子上，甚至不能自理。
Karnofsky分值从100到0，其中100是"完美的"健康状况，0是死亡。评分可以10的间隔采用，其中：100％是正常的，没有抱怨，没有疾病的迹象；90％是能够正常活动，几乎没有症状或疾病迹象，80％是正常活动有些困难，有些症状或迹象；70％是能够自我护理，不能正常活动或工作；60％是需要一些帮助，可以处理大多数个人需求；50％是经常需要帮助，需要频繁的医疗护理；40％是残疾的，需要特殊护理和帮助；30％是严重残疾的，表明需要住院但没有死亡风险；20％是病情严重，急需住院，需要支持措施或治疗；10％是濒死的，快速进展性致命疾病过程。
针对表现态的Zubrod评分系统包括：0，完全活跃，能够无限制地进行所有疾病前的表现；1，身体剧烈活动受限但能走动，且能够进行轻度或久坐性质的工作，例如，轻度家务、办公室工作；2，能走动且能够完全自我护理但不能够进行任何工作活动，多于50％的清醒时间起床走动；3，仅能有限自我护理，多于50％的清醒时间受限于床或椅子；4，完全残疾，不能进行任何自我护理，完全受限于床或椅子；5，死亡。
在一个实施方案中，临床因素是组织学亚类。在一些实施方案中，根据Elston&Ellis,Histopathology,1991,19:403-10(其内容通过引用整体并入本文)对肿瘤的组织学样品进行分级。
在一个实施方案中，临床因素是性别。在一个实施方案中，性别是男性。在另一个实施方案中，性别是女性。
在一个实施方案中，临床因素是疾病分期。作为非限制性实例，使用整体阶段分组，I期癌症定位于身体的一个部分；II期癌症是局部晚期，III期癌症也是如此。癌症是被指定为II期还是III期可取决于癌症的具体类型。在一个非限制性实例中，霍奇金病，II期表示仅在膈膜一侧上的淋巴结受累，而III期表示在膈膜上方和下方的淋巴结受累。因此，II期和III期的具体标准根据诊断而不同。IV期癌症经常已转移，扩散到其他器官或遍布全身。
在另一个实施方案中，所述方法还包括测量选自突变状态、单核苷酸多态性、稳态蛋白水平以及动态蛋白水平的另外的生物标志物。在另一个实施方案中，所述方法还包括预测患者的临床响应。在另一个实施方案中，临床响应是约1、约2、约3或约5年进展/无事件存活。
已经鉴定了多种临床因素，例如年龄概况和表现状态。也已经利用了许多静态诊断测量，例如细胞遗传学和分子事件，包括但不限于基因MLL、AML/ETO、Flt3-ITD、NPM1(NPMc+)、CEBPα、IDH1、IDH2、RUNX1、Ras和WT1中的突变，和表观遗传修饰基因TET2和ASXL中的突变，以及细胞信号传导蛋白谱中的变化。
在一些实施方案中，预防性方法包括根据本文所述方法的指导对可能罹患癌症的患者施用治疗。在一些实施方案中，如果受试者的特征在于癌症高风险、癌症的遗传易感性(例如遗传风险因子)、先前癌症发作(例如新癌症和/或复发)、癌症家族史、暴露于癌症诱导剂(例如环境剂)和药物基因组学信息(基因型对治疗剂的药代动力学、药效学或功效谱的影响)中的一种或多种，则受试者可能罹患癌症。
在一些实施方案中，如果受试者的特征在于癌症高风险，则受试者可能罹患癌症。在一些实施方案中，如果受试者的特征在于对癌症的遗传易感性，则受试者可能罹患癌症。在一些实施方案中，如本领域已知的，癌症的遗传易感性是遗传临床因素。这些临床因素可包括，例如，至少结肠、子宫、小肠、胃、尿道癌的MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2。在一些实施方案中，如果受试者的特征在于先前癌症发作，则受试者可能罹患癌症。在一些实施方案中，受试者已经罹患1、或2、或3、或4、或5、或6次先前癌症发作。在一些实施方案中，如果受试者的特征在于癌症家族史，则受试者可能罹患癌症。在一些实施方案中，父母亲和/或祖父母和/或兄弟姊妹和/或阿姨/叔叔和/或叔祖母/叔祖父和/或堂亲已患或正罹患癌症。在一些实施方案中，如果受试者的特征在于暴露于癌症诱导剂(例如环境剂)，则受试者可能罹患癌症。例如，将皮肤暴露于强日光是皮肤癌的临床因素。例如，吸烟是肺癌、口腔癌、喉癌、膀胱癌、肾癌和其他几种器官的临床因素。
此外，在一些实施方案中，以下临床因素中的任一种可用于本文所述的方法：性别；遗传风险因子；家族史；个人历史；种族和种群；某些组织的特征；各种良性病症(例如非增生性病变)；前一次胸部辐射；致癌物质暴露等。
此外，在一些实施方案中，以下临床因素中的任一种可用于本文所述的方法：细胞表面标记CD33、细胞表面标记CD34、FLT3突变状态、p53突变状态、MEK-1激酶的磷酸化状态和Bcl-2的70位丝氨酸磷酸化中的一种或多种。
在一些实施方案中，临床因素是细胞因子的表达水平，包括但不限于白介素-6。在一些实施方案中，白介素-6水平将与MM患者中的响应可能性相关，包括差的患者预后或良好的患者预后。
在一些实施方案中，通过评估引发百分比确定响应的可能性。在某些实施方案中，引发由以下等式定义：
Figure BDA0002654818670000501
其中：
AUC(曲线下面积)是通过均相时间分辨荧光(HTRF)或来自荧光激活细胞分选(FACS)的平均信号强度所建立的荧光测量值的总和，其中所述信号强度是在引发开始后约5分钟至约300分钟之间产生的单一时间点测量值；
阴性对照构成曲线下面积或信号强度的基线阴性对照；
阳性对照构成曲线下面积或信号强度的基线阳性对照(例如，任何解偶联剂)；以及
所述肽是一种或多种BH3结构域肽，其中(n)用阴性和阳性对照的平均重复数归一化。
在一些实施方案中，结合前述等式，选择一种或多种临床因素以增加BH3分析的特异性和/或敏感性以便与临床响应相关。
在一些实施方案中，通过评估引发百分比确定响应的可能性。在某些实施方案中，引发由以下等式定义：
Figure BDA0002654818670000511
其中：
AUC(曲线下面积)是通过均相时间分辨荧光(HTRF)或来自荧光激活细胞分选(FACS)的平均信号强度所建立的荧光测量值的总和，其中所述信号强度是在引发开始后约5分钟至约300分钟之间产生的单一时间点测量值；
DMSO(二甲基亚砜)构成曲线下面积或信号强度的基线阴性对照；
CCCP(羰基氰化物间氯苯腙)是氧化磷酸化的化学抑制剂，并且包含通过发挥质子梯度的解偶联试剂作用而成为蛋白质合成的效应物，其中所述质子梯度是在线粒体的电子传递链中电子载体的正常活动期间建立，并且CCCP构成基线阳性对照；并且
所述肽是一种或多种BH3结构域肽，其中(n)用DMSO和CCCP对照的平均重复数归一化。
在一些实施方案中，结合前述等式，选择一种或多种临床因素以增加BH3分析的特异性和/或敏感性以便与临床响应相关。
在一些实施方案中，临床响应的可能性由前述等式的简化形式定义，如此处所示：
Figure BDA0002654818670000512
其中：
AUC(曲线下面积)是通过均相时间分辨荧光(HTRF)或来自荧光激活细胞分选(FACS)的平均信号强度所建立的荧光测量值的总和，其中所述信号强度是在引发开始后约5分钟至约300分钟之间产生的单一时间点测量值；
DMSO(二甲基亚砜)构成曲线下面积或信号强度的基线阴性对照；
CCCP(羰基氰化物间氯苯腙)是氧化磷酸化的化学抑制剂，并且包含通过发挥质子梯度的解偶联试剂作用而成为蛋白质合成的效应物，其中所述质子梯度是在线粒体的电子传递链中电子载体的正常活动期间建立，并且CCCP构成基线阳性对照；并且
所述肽是一种或多种BH3结构域肽，其中(n)用DMSO和CCCP对照的平均重复数归一化。
在一些实施方案中，结合前述等式，选择一种或多种临床因素以增加BH3分析的特异性和/或敏感性以便与临床响应相关。
在一些实施方式中，通过均相时间分辨荧光(HTRF)建立曲线下面积。在一些实施方案中，时间在约0至约300分钟至约0至约30分钟之间的窗口内发生。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACS)建立曲线下面积。在一些实施方案中，信号强度是在约5分钟和约300分钟之间产生的单一时间点测量值。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于预测患者对样品中的检查点抑制剂的响应性的方法，所述方法包括测量Mcl-1/Bim或BCLXL/Bim异源二聚体的量，其中所述样品包含来自实体瘤的浸润淋巴细胞群。检查点抑制剂可以是靶向TIM-3、BTLA、PD-1、CTLA-4、B7-H4、GITR、半乳凝素-9、HVEM、PD-L1、PD-L2、B7-H3、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a和TMIGD2之一的剂。靶向PD-1的剂可以是对PD-1特异的抗体或抗体形式，任选地选自纳武单抗、派姆单抗和匹利珠单抗。靶向PD-L1的剂可以是对PD-L1特异的抗体或抗体形式，任选地选自阿特朱单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗和BMS-936559。靶向CTLA-4的剂可以是对CTLA-4特异的抗体或抗体形式，任选地选自伊匹单抗和曲美木单抗。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含编码所述抗体或抗体片段的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，提供了一种包含所提供的多核苷酸的载体；在一些实施方案中，提供了一种包含所述载体的宿主细胞。
在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文公开的抗体或任何抗体的抗体形式以及药学上可接受的赋形剂。
本公开还提供了可以简化肿瘤或癌细胞样本的评价的试剂盒。本公开的典型试剂盒包含各种试剂，包括例如可用于检测异源二聚体的一种或多种试剂(例如，本文所公开的抗体)。试剂盒可以进一步包括评价所必需的材料，包括多孔板、注射器等。试剂盒可以进一步包括指示使用所述试剂的标签或印刷说明书。试剂盒可以进一步包括待测试的处理。
应当理解的是，单数形式如“一”、“一个”和“所述/该”在整个本申请中是为了方便而使用，然而，除非上下文或明确的陈述另外指出，否则单数形式也意图包括复数。此外，应该理解的是，本文中所提到的每一期刊文章、专利、专利申请、出版物等在此通过引用整体并入本文并用于所有目的。所有的数值范围应当被理解为包括该数值范围内的每一个数值点，并且应该被解释为单独地列举每一个数值点。涉及相同组分或性质的所有范围的端点是包含性的并且意图为可独立地组合。
“约”包括具有与参考值大体上相同的效果或提供大体上相同的结果的所有值。因此，由术语“约”涵盖的范围将根据使用该术语的上下文而变化，例如，与参考值相关联的参数。因此，根据上下文，“约”可以意指例如±15％、±10％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％或±小于1％。重要的是，由术语“约”开头的参考值的所有列举旨在也是参考值的单独列举。尽管有前述内容，但在本申请中，术语“约”具有关于药代动力学参数如曲线下面积(包括AUC、AUCt和AUC∞)、Cmax、Tmax等的特殊含义。当与药代动力学参数的值关联使用时，术语“约”意指参考参数的85％至115％。
如本文所用，词语"包括"及其变体旨在为非限制性的，使得列表中的项目的列举不排除其他类似项目也可用于本技术的材料、组合物、装置以及方法。类似地，术语"可以"和"可以"及其变体旨在是非限制性的，使得实施方案可以或可以包括某些元件或特征的叙述不排除本技术的不包含那些元件或特征的其他实施方案。尽管本文使用作为诸如包括、含有或具有的术语的同义词的开放式术语"包含"来描述和要求保护本公开，但是本技术或其实施方案可以替代地使用更限制性术语来描述，诸如"由所叙述的成分组成"或"基本上由所叙述的成分组成"。
除非另外定义，否则本文中的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料均可用于实践或检验本公开，但是这里描述优选的方法和材料。所有引用的出版物、专利和专利出版物出于所有目的通过引用整体并入本文。
本公开通过以下非限制性实施例进一步说明。
实施例
实施例1：对Bcl-2异源二聚体特异的单克隆抗体的制备
克隆编码人Bcl-xL、Bcl-2和mcl-2的基因并进行突变以使它们的跨膜结构域缺失。然后将突变的基因与编码谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的核苷酸序列连接，并克隆到pGEX4T-1中，以获得用于表达Bcl-xL(Δ)-GST、Bcl-2(Δ)-GST和Mcl-2(Δ)-GST融合蛋白的DNA构建体。通过重组技术制备用于表达与GST融合的全长人Bax、Bak、Bim、Bid、Bad、Puma和Noxa的DNA构建体。
将所有DNA构建体导入BL21(D3)化学感受态大肠杆菌细胞。在合适的培养基中培养阳性转化体，并用异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷诱导融合蛋白的表达。表达的融合蛋白用ACTA-FPLC(Amersham)上的Amersham Hitrap谷胱甘肽柱纯化，并用分光光度法精确定量。
然后将Bcl-xL(Δ)-GST、Bcl-2(Δ)-GST或Mcl-2(Δ)-GST与Bax-GST、Bak-GST、Bak-GST、Bim-GST、Bid-GST、Bad-GST、Puma-GST或Noxa-GST以等量混合于PBS中。
如表2中所述，用BPA衍生Bim BH3肽中的芳族氨基酸。使用Richard,D.J.；等的Bioorg.Med.Chem.(2013)荧光偏振来测试这些肽中的每一种的结合亲和力，
表2：用于制备异源二聚体的含有Bim BH3结构域的肽
序列： U＝bpa；Bpa＝4-苯甲酰基苯丙氨酸
1 IUIAQELRRIGDEFNAYYARR
2 IWIAQELRRIGDEFNAUYARR
3 IWIAQELRRIGDEFNAYUARR
4 IWIAQELRRIGDEUNAYYARR
然后通过在室温下暴露于紫外线(450nM)8小时，将选定的肽与纯化的GST-抗凋亡Bcl-2家族融合蛋白偶联。按照Zue等的Protein Science 6:781-788(2007)中描述的方法，在ACTA-FPLC(Amersham)上使用琼脂糖12柱(Pharmacia)纯化异源二聚体。
然后将每种异源二聚体(2mg)悬浮于单磷酰脂质A加海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dicorynomycolate)佐剂(Ribi Immunochem.Research Inc.,Hamilton,Mont.)中。然后将形成的混合物在每个后足垫处注射到Balb/c小鼠中，每3至4天一次，共14次。最后一次注射后三天，从小鼠中取出脾细胞，并在补充有1％青霉素-链霉素的DMEM培养基(Gibco/BRL Corp.)中制备单细胞悬浮液。使用35％聚乙二醇将脾细胞与鼠骨髓瘤细胞P3X63AgU.1(ATCC CRL 1597)融合，并在96孔培养板中培养。
在超DMEM(DMEM补充了10％胎牛血清FCS、100mM丙酮酸、100U/ml胰岛素、100mM草酰乙酸、2mM谷氨酰胺、1％非必需氨基酸(GIBCO/BRL)，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素]，含100μM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μM甲基胸苷(HAT)(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)。
用200·l含10％FCS和抗生素的Super DMEM培养杂交瘤细胞。融合后十天，在捕获ELISA中收集杂交瘤培养物的上清液并筛选是否存在与同源异源二聚体蛋白和/或异源二聚体中任一个成员(作为阴性对照)结合的抗体，如Certo等的Cancer Cell.,9(5):351-365(2006)中所述。
简言之，将96孔微量滴定板(Maxisorb；Nunc,Kamstrup,Denmark)用50μl(1μg/ml)的异源二聚体或异源二聚体的成员在4℃下涂布过夜。然后用含有0.05％TWEEN 20.TM的PBS(PBST)洗涤平板三次，并用50μl含2.0％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室温下封闭1小时。然后用PBST再次洗涤平板三次。然后，将100μl杂交瘤上清液添加到指定的孔中。将板在振荡器装置上于室温温育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。接着，将50μl HRP缀合的羊抗小鼠IgG Fc(Cappel Laboratories)，在测定缓冲液(0.5％牛血清白蛋白、0.05％TWEEN20.TM、0.01％Thimersol的PBS溶液)中1:1000稀释，添加到每个孔中。然后将板在振荡器装置上于室温温育1小时，并用洗涤缓冲液洗涤三次，随后添加50μl底物DACO并于室温温育10分钟。向每个孔中添加50μl二乙二醇以终止响应，并在微升读板器中读取每个孔中450nm处的吸光度。
然后选择产生结合异源二聚体但不结合所述异源二聚体的任一成员的抗体的杂交瘤细胞。将这些阳性杂交瘤细胞克隆两次，并再次检测所产生的抗体的特异性。具有所需特异性的抗体同种型通过常规方法确定，例如使用同种型特异性山羊抗小鼠IgG(FisherBiotech,Pittsburgh,Pa.)。通过常规方法，例如下文实施例4和5中所述的免疫沉淀和FACS测定，检查每种抗血清中抗体的特异性。
实施例2：使用酵母scFv文库筛选对Bcl-2异源二聚体特异的scFv抗体
非免疫人scFv酵母文库(使用表达载体pYD1)获自太平洋西北国家实验室(Pacific Northwest National Laboratories)。在该文库中，将通过柔性多肽接头连接重链和轻链的scFv抗体与酵母凝集素蛋白Aga2p和HA-tag蛋白的粘附亚基融合。在表达时，scFv通过Aga2P与Aga1P(一种细胞表面蛋白)的结合而位于酵母宿主细胞的表面上(图4A-D)。每个酵母细胞通常展示1×105至1×106个拷贝的scFv和scFv的表面表达。表面表达的变化可以通过scFv区域侧翼的HA-标签的免疫荧光标记来测量(图4A-D)。
将上述scFv文库导入酵母菌株EBY100(Invitrogen)，如下鉴定具有所需特异性的scFv抗体。首先将EBY酵母细胞在1升SDCAA培养基(含有20g葡萄糖、6.7g Difco酵母氮碱基、5g Bacto酪蛋白氨基酸、5.4g Na2HPO4和8.56g NaH2PO4H2O)中培养过夜。通过在2,500g离心5分钟来沉淀过夜培养物中的1×1010个酵母细胞，然后重悬于SGCAA培养基(与SDACC相同的培养基，不同之处在于它含有半乳糖而不是葡萄糖)，在600nm处的吸光度为约0.5-1。然后将酵母细胞在20℃下培养36小时以允许表达scFv抗体。然后，通过以2,500g离心5分钟收集细胞。用25ml PBS洗涤细胞沉淀。
通过流式细胞术分选表达scFv抗体的酵母细胞。简言之，如上述制备约1×106至1×107个酵母细胞，并通过14,000g离心30秒收集，用1ml PBS缓冲液洗涤，并与2μl 10μg/ml抗HA藻红蛋白单克隆抗体(SIGMA-ALDRICH)和Bcl-2/Bid异源二聚体混合，其中Bcl-2用FITC标记，并且Bid用德克萨斯红标记。在室温下培养1小时后，将混合物在12,000g离心30秒以沉淀酵母细胞。然后将细胞沉淀重悬于500μl 10mM Tris(最终细胞密度约106/ml)中，并通过如下流式细胞术进行细胞分选。
使用与抗HA藻红蛋白抗体混合的EBY100酵母细胞作为阳性对照并将EBY100酵母细胞与双重标记的异源二聚体混合作为阴性对照，以预先确定流式流式细胞术方案。进行补偿以抑制荧光检测器的FITC、德克萨斯红和藻红蛋白通道之间的串扰。将标记的酵母细胞加载到FACS Aria细胞分选仪(Becton Dickinson,Mountain View,Calif.)中，并在前向和侧向分散通道上进行门控。绘制FITC/Texas红/藻红蛋白阳性象限中的适当分选门，并将前5％的三阳性酵母细胞收集在1ml SDCAA培养基中。如果需要，收集前0.1％的三阳性酵母细胞以确保仅分选对Bcl-2/Bid异源二聚体具有高亲和力的细胞。
将鉴定出的三阳性细胞悬浮在10ml SDCAA中，并在30℃下生长过夜。然后对这些细胞进行两轮负向选择以排除表达也结合Bcl-2或Bid单聚体的scFv抗体的细胞。更具体地说，将细胞与FITC标记的Bcl-2和Texas Red标记的Bid一起温育，并按照与上述相同的步骤，分选FITC和Texas Red双阴性细胞。用双重标记的Bcl-2/Bid异源二聚体标记收集的细胞以证实它们与异源二聚体的结合。
然后稀释鉴定的酵母细胞并铺板以允许形成单个克隆。使用Zymoprep试剂盒(Zymo Research,Orange,Calif.)从这些克隆中分离质粒DNA，如Weaver-Feldhaus等，Protein Engineering,Design&Selection，第18卷第11期第527-536页(2005)。按照Chao等的Nature Protocols 1:755-768(2006)中描述的方法确定每个质粒DNA中包括的scFv序列。
通过ELISA和FACS分析鉴定的scFv抗体，以证实它们对Bcl-2/Bid异源二聚体的特异性。然后对抗体进行诱变以选择对Bcl-2/Bid异源二聚体具有更高亲和力和特异性的scFv抗体。
实施例3：通过免疫沉淀选择对Bcl-2异源二聚体特异的抗体
进行免疫测定(即ELISA、免疫沉淀测定)以证实来自实施例1的抗体对Bcl-2异源二聚体具有特异性。(图2，图13A，图13B)Bcl-2异源二聚体的两个成员与具有不同发射光谱的两种荧光探针缀合，即一种用异硫氰酸荧光素(FITC；在488nm处发射)标记，另一种用德克萨斯红(在590nm处发射)标记。(图4A-D)按照上述实施例1中描述的方法，将标记的成员一起温育以允许Bcl-2异源二聚体的形成。在本实施例的实验中，当与含有0.05％Tween-20的0.5mL PBS和50uL来自产生目的抗体的杂交瘤克隆的上清液一起温育时，形成0.1μg异源二聚体。异源二聚体的非二聚化标记成员用作阴性对照。然后将混合物在冰上温育1小时以形成抗体-抗原复合物，然后将10·l GammaBind-G琼脂糖凝胶珠(GE Healthcare,Piscataway,N.Y.)添加到混合物中。在冰上培养30分钟并旋转后，将混合物以10,000×g离心30秒。然后将附着有抗体-抗原复合物的沉淀珠洗涤几次，并在488nm的OD和590nm的OD下测量光密度。然后基于488nm的OD值和590nm的OD值测定抗体的特异性。
实施例4：BIM-BH3诱导的表位的选择性结合和抑制
然后制备单克隆抗体，其在本文中公开为异源二聚体特异性Bcl-xL Bim(HSBXB)。HSBXB特异性地结合到Bcl-xL和Bim-BH3结构域肽的异源二聚体。为了进一步表征HSBXB，在Bim的BH3结构域介导的Bcl-xL/Bim结合被抑制的条件下评估抗体。ABT-263是BH3结构域模拟物，其竞争性抑制BH3结构域介导的结合。ABT-263破坏Bcl-xL与前死亡蛋白(例如Bim)的相互作用，导致Bim从异源二聚体中释放，并导致凋亡的开始。当添加ABT-263时，在与包含Bim的BH3结构域的肽形成的异源二聚体中观察到异源二聚体抗体信号的剂量依赖性抑制。Bid-BH3结构域肽，或没有肽，作为阴性对照，证实了单克隆抗体的异源二聚体特异性。图3C、图13A和图13B示出Mab HSBXB选择性结合异源二聚体Bcl-xL/Bim-BH3的结果。在图13A所示的实验中，Bcl-xL-GST与谷胱甘肽包被的ELISA板结合。然后添加或不添加Bim-BH3肽作为对照，并使用HSBXB抗体检测复合物形成。图13B示出ABT-263对结合的抑制。将非共价Bcl-xL-GST/Bim BH3异源二聚体结合到谷胱甘肽包被的ELISA板上，并用ABT-263处理。然后在添加肽之后和添加单克隆抗体之前，将ABT-263添加到ELISA板中。图13B证明ABT263介导Bcl-xL结合的Bim BH3肽的置换，其反映为HSBXB结合的丧失。该实验的结果表明BH3肽与异源二聚体的高度选择性结合，这与BH3肽结合的程度相关并证明了结合的动态范围。在与Bim肽、BID肽或全长Bim蛋白形成的异源二聚体中观察到异源二聚体抗体信号的剂量依赖性抑制。ABT263置换Bcl-xL结合的Bim和HSBXB结合的Bim。选择对Bcl-2/Bim特异的抗体(图3C)。
实施例5：细胞和组织中Bcl-xL/Bim异源二聚体的检测
本文公开了使用HSBXB抗体进行细胞内染色的方法的建立，以及使用HSBXB来研究抗体在确定癌细胞的引发状态中的功能的方法的建立。选择具有不同程度Bcl-xL的三种细胞系，Bim引发(图4B，y轴)，如通过用Hrk BH3结构域肽(Bcl-xL依赖性的生物标记)探测细胞所测定的。细胞系Molm-13、AHR77及DHL-6分别为17％、50％及60％Bcl-xL(Hrk)，并观察到Hrk引发与HSBXB抗体染色之间的相关性(R＝0.982)(图4A及图4B)。此外，为了证实HSBXB染色的流式细胞术检测，利用基于夹心ELISA的方法来捕获结合的Bcl-xL异源二聚体到用Bcl-xL抗体包被的板上，然后使用HSBXB抗体检测(图4C)。该方法示出与通过流式细胞术所见的和(Pierceal,W.E.夫人们和，Mol Cancer Ther.2013Dec；12(12):2940-9)中所述的相同的HSBXB染色趋势。另外，为了证明通过IF检测Bcl-xL/Bim异源二聚体，将SKBR3细胞固定在2％PFA中并用HSBXB(品红)和Bcl-xL(Alexa 488)染色，这表明HSBXB能够检测异源二聚体。(图4D)
在4℃下培养30分钟后，用FACS缓冲液洗涤细胞抗体混合物，并以0.3X g离心5分钟以沉淀细胞。将从细胞系获得的细胞重悬于150μl FACS缓冲液中，并通过FACScan(Becton Dickinson,Mountain View,Calif.)分析，其中使用对照细胞样品作为阴性对照样品并使用抗Bcl-xL-罗丹明标记的线粒体作为阳性对照来预先确定流式细胞术参数。使用FACS管将线粒体悬浮液加载到流式细胞仪中，检测从HSBXB FITC和罗丹明释放的信号。如果线粒体悬浮液对FITC和罗丹明都是双阳性的，则表明测试抗体能够结合Bcl-xL:Bim异源二聚体。参见图13A。
实施例6：检测固定细胞中的Bcl-xL/Bim异源二聚体
在本研究中，表征了具有普遍的Mcl-1/Bim或Bcl-xL/Bim异源二聚体的细胞。将细胞置于盖玻片上，然后用2％-4％甲醛(甲醛，16％，无甲醇，Polysciences,Inc.)的PBS溶液在室温下固定15分钟。然后用PBS漂洗含细胞的盖玻片三次，每次5分钟。然后将玻片浸泡在封闭缓冲液(TBST/5％正常山羊血清：5ml 1x TBST添加250μl正常山羊血清)中60分钟。吸出封闭缓冲液后，将对Mcl-1/Bim或Bcl-xL/Bim异源二聚体特异的抗体(即HSBXB，见图5)添加到玻片中。还添加抗人VDAC-1抗体以定位线粒体。在4℃下温育样品过夜后，用PBS漂洗玻片5分钟三次。然后添加在稀释缓冲液中稀释的荧光染料缀合的二抗。在室温下在黑暗中温育1-2小时后，用PBS漂洗玻片三次，持续2分钟，随后用Prolong Gold抗褪色试剂(Invitrogen,San Diego,Calif.)处理。然后通过在玻片边缘涂抹指甲油来密封玻片，然后在倒置荧光显微镜下观察玻片。抗体在线粒体上的定位表明抗体识别Mcl-1/Bim异源二聚体或Bcl-xL/Bim异源二聚体。
实施例7：Bcl-xL/Bim异源二聚体信号与HSBXB与患者样品上的线粒体分析读出的 比较和与临床响应的比较
先前的研究已经证明，在线粒体引发测定中由Hrk肽读出确定的Bcl-xL依赖性与CLL患者对CDK-9抑制剂阿伏西地(Alvocidib)的响应相关。(参见例如PCT公开WO/2016/115105，用于指导癌症治疗的上下文依赖性诊断试验，在此并入作为参考)。在该研究中，引发与患者响应的关联是高度显著的，曲线下面积(AUC)＝0.83。在线粒体分析中，Hrk引发信号作为阳性信号的函数被测量，并且线粒体的完全去极化由化学抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)诱导，而阴性信号来自DMSO处理，如以下公式中概述以获得"引发指数"：
Figure BDA0002654818670000611
HSBXB ELISA信号可以从那些相同样品中对之前获得和记录的Hrk引发信号进行基准测试。然后可以确定总Bcl-xL信号(结合的和未结合的)。Bcl-xL捕获分子和第二非干扰性Bcl-Xl检测抗体可用于此目的。HSBXB ELISA信号可以与总Bcl-xL ELISA相关，其最大值为100％，背景信号为零。下面的公式可用于计算Bim对Bcl-xL的占有百分比，Bcl-xL/Bim引发指数：
Figure BDA0002654818670000612
可以探索生物标志物状态(Bcl-xL/Bim引发百分比)和患者响应者或无响应者分类之间的关联。可以使用细胞系优化系统，包括ABT-263的响应者和无响应者。随后，可以从I-样本(Lexington,MA)获得新鲜的冷冻针吸活检乳腺癌肿瘤组织(存档的)。来自组织供体的临床响应和结局数据可通过提供者获得。可以获得多达40个这样的样本并通过ELISA进行操作。
为了分析：单变量比较可以使用对数秩检验(Mann-Whitney)和t检验进行；并且所有P值都可以使用双边可选假设来计算。通过使用Benjamini Hochberg方法计算错误发现率，可以调整p值以计算多重比较(2种生物标记的比率)。标志物的预测能力可以使用接受者操作特征(ROC)曲线下面积(AUC)统计来评估，以鉴定理想的阈值。可以使用逻辑回归进行多变量分析，并且显著的调整变量可以包括疾病阶段、年龄、激素受体(PR/ER)状态和细胞遗传风险状态。通过对数秩检验(Mantel-Haenszel)可以测试总生存(OS)和无事件生存(EFS)与引发百分比的显著相关性，以进行趋势分析。
免疫组织化学(IHC)方法可用于优化乳腺癌实体瘤活检中的HSBXB，并建立临床结局的生物标记。一些IHC工作可以使用具有基于算法的IHC信号量化的数字病理学来执行。本公开的方案包括可增强表位检测信号的酶、化学、温度和压力处理条件的各种应用。
IHC测定开发在图24A、图24B、图24C、图25、图26、图27、图28、图30、图31和图32中示出。Bcl-xL在MEF Bcl-xL-/-细胞中表达的免疫印迹示于图24A，Bcl-xL和HSBXB的IF图像和信号强度示于图24B和图24C。在图25中，示出HSBXB抗体在MEF野生型和MEF Bcl-xL-/-细胞中的IHC测定。图26示出使用HCC1937人乳腺癌细胞进行未处理(左)、用A-1331852抑制剂处理(中)、和siRNA-Bcl-xL处理(右)的HSBXB抗体的IHC测定。在图27中，示出对于MEF野生型(左)和MEF Bcl-xL-/-细胞(右)的Bcl-xL抑制剂的IHC测定。在图28中示出对于未处理的HCC1937人乳腺癌细胞(左)和处理的siRNA-Bcl-xL(右)的Bcl-xL抑制剂的IHC测定。图30示出对于MEF野生型(左)和MEF Bcl-xL-/-细胞(右)的HSBxB/BCLxL的IHC测定。图31示出使用HCC1937人乳腺癌细胞进行的对未处理(左)、A-1331852处理(中)和siRNA-Bcl-xL处理(右)的HSBxB/BCLxL的IHC测定。图32示出对于作为BCLxL+/+的SVEC细胞中的BCL-xL:BIM的HSBxB/BCLxL的IHC测定。
初始数据表明HSBXB抗体在甲醛固定和石蜡(FFPE)IHC实验(参见例如图6)和使用IHC的FFPE三阴性乳腺癌切片中表现良好(图33A、图33B、图33C、图35A、图35B和图35C)。图35A、图35B和图35C示出对FFPE乳腺癌细胞进行双色IHC的结果。结果示出Bcl-xL特异性BH3模拟物处理的细胞中HSBXB/抗Bcl-xL信号的变化。HSBXB抗体的信噪比指数可以通过探索人乳腺癌异种移植物FFPE样品的另外的固定后制备物并在从I-样本(Lexington,MA,USA)获得的匹配的新鲜冷冻组织以及匹配的FFPE和固定前的人/小鼠异种移植物活检中对ELISA和流式细胞术读出的结果进行基准测试来改进。
本实施例的实验特别证明IHC有广谱的应用，因为观察到HSBXB在几种组织来源的癌症之间结合(图34)。
优化IHC染色条件，在FFPE组织切片中进行异源二聚体和单体检测的敏感性和特异性。可以通过确定最低定量水平(LLOQ)和最高定量水平(HLOQ)来确定截止值。通过图像分析和视觉评分的定量可以使IHC解释降低到信号密度和信号在限定边界内的分布的单一值。
实施例8：HSBXB/Bcl-xL信号与存档患者样品中临床响应的相关性
为了证明HSBXB/Bcl-xl信号与存档患者样品中的临床响应之间的相关性，可以从原初预处理和难治性预处理患者收集(即，从I-样本，Lexington,MA获得)约50-75个存档的Her2+乳腺癌肿瘤组织。然后将针吸活检组织切成薄片并分散在96孔板中的8个重复样本中。然后可将各个孔暴露于相关浓度的HSBXB抗体(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)以及Bcl-xL抗体。然后可以确定HSBXB/Bcl-xL信号。数据可以与临床响应数据(Herceptin,Lapatinib，有或没有PI3激酶δ治疗)相关。
接下来，本实施例的实验特别证明了如何建立通过免疫荧光(IF)显微镜测量HSBXB和Bcl-xLl信号的条件。这可以使用标准成像系统和显微镜来进行。在固定组织的情况下，没有理由激发或消耗Bcl-xL/BIM异源二聚体的形成或引发。相反，可以依赖Bcl-xL抗体产生的信号作为可获得的内部最大信号。对于固定的乳腺癌细胞，这可以使用抗Bcl-xLIgG胞内结合的中值信号强度来计算。为了计算HSBXB确定的引发，可以使用以下公式：
Figure BDA0002654818670000641
在建立成像方法后，可以使用荧光显微镜检查多达50-75个存档的Her2+患者肿瘤活检样品，其为在载玻片上石蜡包埋的薄切片(购自I-样本)。信号样本各自是HER2+，并且具有临床响应、临床结局以及预后标志物注释。该分析可以使用定量IF显微镜进行，并且可以用于测量HSBXB以及抗Bcl-xL在每个细胞基础上和在线粒体上、在细胞溶胶中或在微管上的染色强度。这些测量结果可以与来自相邻的非肿瘤组织的信号进行比较。然后可以报告每个完整细胞或特定亚细胞区域的信号，并与每个样品的信号进行比较。熟练的病理学家可以利用肿瘤内的组织学变化，并可以测量复制载玻片中Bcl-2和Mcl-1的表达水平。这些附加的测量可以被考虑包括在相关性分析中。
然后可以通过测试生物标志物状态(Bcl-xL引发百分比)和患者响应者或无响应者分类之间的关联，通过统计分析来分析生物标志物。单变量比较可以使用Mann-Whitney检验进行；并且所有报告的P值可以是双侧的。然后可以确定用于初步分析以解释多重比较的显著性阈值(2种生物标志物的比率)。标志物的预测能力可以使用曲线下面积(AUC)统计来评估。可以使用逻辑回归进行多变量分析，并且显著的调整变量可以包括疾病阶段、年龄、激素受体(例如PR、ER)状态和细胞遗传风险状态。然后通过对数秩检验，可以测试总存活率(OS)和无事件存活率(EFS)与引发百分比的显著相关性和趋势。
为了制备Mcl-1/Bim(HSMCB)和Bcl-2/Bim(HSBLB)特异性单克隆Ab，并作为线粒体引发检测器进行验证，可以扩展Bcl-2家族异源二聚体特异性抗体(HSA)对Mcl-1和Bcl-2的范围。为此，纯化的Mcl-1-GST和Bcl2-GST融合蛋白可与Bim修饰的BH3肽共价缀合。单克隆抗体可以通过Abpro(Lexington,MA)制备和筛选。可以在细胞系中建立检测线粒体引发的生物标志物功能的读出保真度和效用。对于杂交瘤的产生，可以用50微克抗原结合每种靶抗原的完全弗氏佐剂免疫五只Swiss Webster小鼠。抗体可以如上所述制备。
然后，染色的芯片可以通过在95％乙醇中连续温育两次，每次10秒，在100％乙醇中温育两次，每次10秒，最后在二甲苯中温育两次，每次10秒而脱水。然后将芯片与盖玻片固定在一起，并使用荧光和UV显微镜检查染色图案。然后，从癌组织样品获得的染色图案可与从邻近的正常组织获得的染色图案进行比较。(例如，见图6)
实施例9：Bcl-xL/Bim异源二聚体信号与对来自AML患者样品的门控母细胞群的 Hrk引发相关。预测读出指导生物标志物开发
在本实施例的实验中，对AML患者样品进行了BH3分析。。母细胞群示出Hrk引发，以及对Bcl-xL具有选择性的Hrk BH3肽的响应。并行地，将AML患者样品固定，并用FITC标记的HSBXB抗体和罗丹明标记的Bcl-xL抗体染色。在FACS上解析母细胞门控信号。HSBXB产生的Bcl-xL/Bim异源二聚体读出与总Bcl-xL信号比对来自AML患者样品的Hrk肽产生的信号作图。参见图9A、图9B。还参见图12A、图12B和图12C，其示出HSBXB信号与AML患者样品(图12A)和CLL患者样品(图12B)两者中的HRK和未闭响应相关。该患者组的治疗前HRK信号示出与阿伏西地治疗有关(图12C)。同样，参见图15A、图15B和图15C，其示出AML患者样品中HRK百分比与HSBXB/BCLXL的相关性。
实施例10：用Bcl-xL靶向的BH3模拟化合物治疗后对肿瘤细胞系中的Bcl-2异源二 聚体进行分析
本实施例的实验证明令人惊讶的结果，因为HSBXB抗体示出作为药效学标志物起作用，检测到用Bcl-Xl选择性BH3模拟物A1155463处理后Bcl-xL/Bim异源二聚体的转变。在这些实验中，用化合物处理表达Bcl-xL的ATH66细胞16小时，然后用多聚甲醛固定，用非离子去污剂透化，用HSBXB-FITC和用抗Bcl-xL-罗丹明染色。使用流式细胞术分辨信号。信号的比率提供Bcl-xL引发指数。观察到这随着与凋亡发生同时的时间过程而减少，凋亡发生通过DAPI染色和膜联蛋白5表面染色确定。例如，参见图8，以及图14A、图14B和图14C，其示出HSBXB信号在用A-1155463处理时响应Bcl-xL选择性BH3模拟物而移位。
实施例11：HSBXB抗体的免疫荧光(IF)染色、HSBXB定位的变化和人乳腺癌细胞中 Bcl-xL的si-RNA敲低
如图16A和图16B所示，在两种类型的人乳腺癌细胞HCC1937和BT-474中比较了对Bcl-xL抑制剂A-1331852或MEK抑制剂司美替尼(Selumetinib)的药物响应。在两种细胞类型中，添加A-1331852抑制剂导致细胞活力降低，而MEK抑制剂在任一种乳腺癌细胞类型中都不降低细胞活力。HSBXB抗体和Bcl-XL抑制剂A-1331852在未处理的人乳腺癌细胞HCC1937和BT-474中的免疫荧光(IF)染色如图17所示。从人乳腺癌细胞HCC1937，用或不用A-1331852抑制剂处理，或用或不用HSBXB抗体处理获得IF染色和相对信号强度，如图18所示。HSBXB抗体在抑制剂处理的样品和对照样品中具有较低的信号强度。在HCC1937细胞中观察到响应于A-1331852抑制剂的Bcl-xL和HSBXB的定位变化(图19)。在图23中，示出的IF图像证明在SVEC野生型细胞和线粒体引发的SVEC细胞中观察到Bcl-xL和HSBXB。
使用siRNA，将Bcl-xL-siRNA转染到HCC1937细胞中，并敲低Bcl-xL，这导致Bcl-xL和HSBXB两者的较低信号强度(图20，图22)，以及HSBXB(图29A)和BCLxL两者的总阳性百分比降低(图29B)。HCC1937细胞中Bcl-xL的敲低通过IF染色证实，因为在siRNA处理的细胞中没有观察到HSBXB(图21)。
实施例12：通过原位IHC测量Bcl-2家族异源二聚体相对于未结合的Bcl-2家族蛋 白，评估实体瘤中浸润淋巴细胞的凋亡潜能，从而预测癌症患者对免疫肿瘤疗法的响应的 方法。
凋亡通过在选择过程中控制细胞的消除而在T细胞免疫中起重要作用，包括在这些细胞浸润并影响针对肿瘤细胞的免疫响应的肿瘤中。例如，PD-1/L1阻断抗体的功效视肿瘤中存在受PD-L1表达细胞负调节的肿瘤特异性PD-1+T细胞以及这些细胞的寿命而定。(Kuhnger,M.et.A.,ASCO Journal 2017年6月12日，来自162.234.150.177)这些治疗的目的是通过中断功能上完整的PD-1/PD-L1与单克隆抗体的复合物来影响肿瘤免疫。这使得T细胞能够介导癌细胞杀伤。PD-L1表达水平、在肿瘤中的位置和寿命各自影响该治疗策略的功效。关于浸润淋巴细胞对PDL-1调节疗法或其他免疫肿瘤疗法响应的倾向的准确信息在指导这些药物的使用中是重要的。
该实施例的实验通过理解影响免疫肿瘤学的治疗响应的适应性免疫系统机制来指导。已经观察到，对肿瘤抗原的T细胞响应通过来自周围淋巴细胞的信号传导信号的诱因而发生，例如骨髓来源的抑制细胞和调节性T细胞(Wensveen,1Klaas P.J.M.vanGisbergen,1等，Immunity 32,754–765,2010年6月25日；Carrington,EN等，PNAS|2015年3月31日|第112卷|第13期)。Bcl-2家族异源二聚体状态影响该信号传导，并提供了用于预期针对肿瘤细胞的免疫响应的成功增强的度量。
在一个实施方案中，T细胞寿命和活化的倾向可以通过检测与拮抗剂Mcl-1结合的促凋亡分子Noxa来评估。此外，T细胞寿命和活化的倾向可以通过在FFPE非小细胞肺患者活检组织上使用IHC原位测量Bim/Mcl-1异源二聚体来评估。结果可符合文献中所提示的相关性，其中描述了这种调节先天免疫中T细胞群体的机制。(即Wensveen,Klaas P.J.M.vanGisbergen等，Immunity 32,754–765,2010年6月25日)。测量浸润性T细胞群中的Mcl-1/Bim异源二聚体可提供用于预测PDL-1靶向药物以及其他免疫肿瘤调节疗法的响应性的度量。
实施例13：产生异源二聚体抗体的方法
本文公开了从免疫的小鼠分离、选择和纯化异源二聚体抗体(例如，Mcl-1/Bim-BH3异源二聚体抗体)的方法。异源二聚体抗体的分离、选择和纯化允许研究异源二聚体的功能性，例如确定癌细胞的引发状态，以及检测患者是否对包括用免疫调节药物的癌症治疗敏感。通过本文公开的方法产生的纯化的异源二聚体抗体可以用于检测来自患者的实体瘤样品或来自患者的液体肿瘤中的包含两种B细胞淋巴瘤2(BCL-2)蛋白的异源二聚体。
如图36所示，首先用共价异源二聚体抗原(例如，Mcl-1/Bim-BH3)免疫小鼠。全细胞酶联免疫吸附测定(ELISA)可用于测试免疫小鼠血清中抗原特异性抗体的存在以及分析抗体滴度。可以进行重复加强以增加抗体滴度。通常在每次重复加强免疫时观察到滴度增加。一旦达到足够的滴度(例如，血清稀释度高达1:150,000)，收获小鼠的脾，然后使用两个基于亲和力的选择步骤选择含有异源二聚体的脾B细胞：首先，将脾B细胞通过磁柱以用于负向选择，然后将脾B细胞通过带正电荷的磁柱选择。为了进行基于负磁柱的选择，将脾脏B细胞置于带负电荷的柱上，该柱已被谷胱甘肽衍生的磁珠和含有与GST融合的异源二聚体的一个单体的重组融合蛋白(例如Mcl-1GST)包被。然后收集从用于负向选择的磁柱流过的流，该流代表不与单体重组融合蛋白结合并因此不含有异源二聚体的脾B细胞。然后将含有来自用于负向选择的磁柱的B细胞的该流出物通过已经用共价异源二聚体抗原(例如，Mcl-1/Bim-BH3)阳性包被的第二磁柱，用于正向亲和选择。将含有异源二聚体特异性抗体的细胞结合到磁柱上以用于正向选择，然后从正向选择柱洗脱并收集。然后，含有异源二聚体抗体的所选细胞可以在具有用于B细胞生长的补充物(例如，IL-4、LPS和CD40配体)的培养基中生长。然后，通过标准和常规分子生物学方法分离和亚克隆细胞，然后筛选(例如，通过ELISA)上清液中具有优异的异源二聚体特异性结合和产生的抗体。
在所述方法的这一阶段，可以鉴定使上清液中最佳筛选信号(例如基于ELISA)降级的抗体(例如Ig重链和轻链)的完整序列。例如，可以使用5'或3'RACE系统(即RACE PCR)快速扩增cDNA末端来测定抗体的全长。在所述方法的这些实验中，来自小鼠重链和轻链可变区的标准内部引物可用于产生全长序列。
一旦分离和选择了最佳的异源二聚体抗体，就可以使用标准和常规分子生物学方法将分离的异源二聚体抗体克隆到表达载体和表达系统(例如293T细胞)中，用于纯化和大规模抗体生产。然后可以在对照测定中测试抗体的特异性结合。例如，对照测定可以是ELISA，其中板已经用异源二聚体抗原(例如，Mcl-1/Bim，阳性)和单体抗原(例如，Mcl-1，阴性)两者包被。在一些实施方案中，对照测定是使用表达异源二聚体的两种蛋白(例如，Mcl-1和Bim)的细胞系的免疫荧光(IF)染色。例如，可以将表达Mcl-1/Bim异源二聚体的两种蛋白的细胞中Mcl-1/Bim异源二聚体的IF染色与不表达Mcl-1/Bim异源二聚体的两种蛋白的不同细胞中Mcl-1/Bim异源二聚体的IF染色进行比较(即，可以将蛋白敲低作为对照)。在一些实施方案中，与不表达异源二聚体的两种蛋白的细胞系的IHC染色相比，对照测定包括表达异源二聚体的两种蛋白(例如，Mcl-1和Bim)的细胞系的免疫组织化学(IHC)染色。在一些实施方案中，对照测定包括在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块上的IHC染色，所述FFPE块可来源于细胞系、对照细胞系、异种移植组织和患者组织。在一些实施方案中，对照测定包括流式细胞术。
这些方法中涉及分离、选择和纯化异源二聚体抗体的一个实例示出于图37、图38和图39中。图37中的数据显示IgG克隆9E05与Mcl-1/Bim异源二聚体的选择性结合。使用本文公开的方法产生该克隆。使用上述亲和选择，即谷胱甘肽衍生的磁珠(负向选择)，和含有与GST融合的异源二聚体的一个单体的重组融合蛋白(例如Mcl-1GST)和用Mcl-1-GST/BimBH3包被的珠(正向选择)，滴定来自克隆9E05的纯化的上清液；然后使用ELISA筛选和常规克隆进一步解析克隆，以产生高纯度的异源二聚体抗体，如图37所示。图38中的数据显示9E05克隆与修饰的BPA4肽的选择性结合，其以Mcl-1/Bim异源二聚体的形成存在。用Mcl-1/Bim异源二聚体、Mcl-1单体或单独的BPA4肽包被平板。图39中的数据显示9E05克隆与修饰的BPA4肽的选择性结合，其以Mcl-1/Bim异源二聚体的形成存在。用含有修饰的BPA肽的Mcl-1/Bim异源二聚体、天然Bim生物素或截短的Bim肽包被平板。图40是示出对克隆E905和Mcl-1多克隆兔抗体特异的Mcl-1/Bim异源二聚体的IF图像。图41是示出对克隆E905和Mcl-1多克隆兔抗体特异的Mcl-1/Bim异源二聚体的IF图像。图42是示出对克隆15D02和Mcl-1多克隆兔抗体特异的Mcl-1单体的IF图像。图43是IF图像，示出Mcl-1/Bim异源二聚体抗体(HSMCB)需要Bim原位结合。
在一些实施方案中，可修饰本公开的涉及从免疫小鼠分离、选择和纯化异源二聚体抗体(例如，Mcl-1/Bim-BH3异源二聚体抗体)的方法。例如，当含有异源二聚体特异性抗体的细胞从正向选择柱洗脱并收集时，如上所述，洗脱的含有异源二聚体特异性抗体的细胞可以被荧光标记(例如，荧光染料、标签、探针)，随后培养细胞。在一些实施方案中，用共价Mcl-1-GST/Bim BH3-FITC标记细胞。然后，标记的细胞可以例如通过流式细胞术进行分选，并且可以在流式细胞仪上门控显示出最佳信号的那些细胞并分离。然后可重复该步骤(即，培养从流式细胞仪分离的细胞，接着进行另一轮流式细胞仪)，并且可如上所述进一步克隆显示出最佳结合特征的细胞。
本文公开的所有特征可以以任何组合方式组合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等同或类似目的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是一系列等同或类似特征的实例。
从以上描述中，本领域技术人员可以容易地确定本公开的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以做本公开的各种变化和修改以使其适应各种用法和条件。因此，其它实施方案也在权利要求范围内。
序列表
<110> 优创匹克制药公司
<120> 预测癌症药物响应性的方法
<130> EUTR-018PC/105444-5018
<150> 62/618,786
<151> 2018-01-18
<150> 62/719,789
<151> 2018-08-20
<150> 62/772,368
<151> 2018-11-28
<160> 12
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 718
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸序列
<400> 1
tctagaatga agttgcctgt taggctgttg gtgctgatgt tctggattcc tgcttccttg 60
agcgacatct tgctgactca gtctccagcc atcctgtctg tgagtccagg agaaagagtc 120
agtttctcct gcagggccag tcagagcatt ggcacaagca tacactggta tcagcaaaga 180
acaaatggtt ctccaaggct tctcataaag tatgcttctg agtctatctc tggcatccct 240
tccaggttta gtggcagtgg atcagggaca gattttactc ttagcatcaa cagtgtggag 300
tctgaggata ttgcagatta ttactgtcaa caaagtaata gctggccaac cacgttcgga 360
ggggggacca agctggaaat aaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420
ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 480
taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 540
ctgaacagtt ggaccgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 600
acgttgacta aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 660
acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggggag agtgttagca gcggccgc 718
<210> 2
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成蛋白序列
<400> 2
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Leu Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile
35 40 45
Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg
50 55 60
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser
85 90 95
Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser
100 105 110
Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
115 120 125
Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu
130 135 140
Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn
165 170 175
Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His
195 200 205
Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile
210 215 220
Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 3
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 3
cttaagtcag gtccagctac agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt 60
gaagatatcc tgcaaggctt ctggccacac cttcactgaa cactatataa attgggtgaa 120
gcagaggcct ggacagggac ttgagtggat tggatggatt tttcctggaa gtggtagtac 180
ttactacaat gagaagttca agggcaaggc cacacttact gtagacaaat cctccagcac 240
agcctacatg ttgctcagca gcctgacctc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcaag 300
aagctatagt aacttctggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc 360
caaaacaaca gccccatcgg tctatccact ggcccctgtg tgtggagata caactggctc 420
ctcggtgact ctaggatgcc tggtcaaggg ttatttccct gagccagtga ccttgacctg 480
gaactctggc tccctgtcca gtggtgtgca caccttccca gcagtcctcc agtctgacct 540
ctacaccctc agcagctcag tgactgtaac ctccagcacc tggcccagcc agtccatcac 600
ctgcaatgtg gcccacccgg caagcagcac caaggtggac aagaaaattg agcccagagg 660
gcccacaatc aagccctgtc ctccatgcaa atgcccagca cctaacctct tgggtggacc 720
atccgtcttc atcttccctc caaagatcaa ggatgtactc atgatctccc tgagccccat 780
agtcacatgt gtggtggtgg ctgtgagcga ggatgaccca gatgtccaga tcagttggtt 840
tgtgaacaac gtggaagtac acacagctca gacacaaacc catagagagg attacaacag 900
tactctccgg gtggtcagtg ccctccccat ccagcaccag gactggatga gtggcaagga 960
gttcaaatgc aaggtcaaca acaaagacct cccagcgccc atcgagagaa ccatctcaaa 1020
acccaaaggg tcagtaagag ttccacaggt atatgtcttg cctccaccag aagaagagat 1080
gactaagaaa caggtcactc tgacctgcat ggtcacagac ttcatgcctg aagacattta 1140
cgtggagtgg accaacaacg ggaaaacaga gctaaactac aagaacactg aaccagtcct 1200
ggactctgat ggttcttact tcatgtacag caagctgaga gtggaaaaga agaactgggt 1260
ggaaagaaat agctactcct gttcagtggt ccacgagggt ctgcacaatc accacacgac 1320
taagagcttc tcccggaccc cggg 1344
<210> 4
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成蛋白序列
<400> 4
Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
1 5 10 15
Ala Arg Ser Tyr Ser Asn Phe Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
20 25 30
Leu Val Thr Val Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu
35 40 45
Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys
50 55 60
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser
65 70 75 80
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp
100 105 110
Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
115 120 125
Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys
130 135 140
Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
145 150 155 160
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser
165 170 175
Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
180 185 190
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
195 200 205
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser
210 215 220
Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
225 230 235 240
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile
245 250 255
Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Val Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
260 265 270
Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met
275 280 285
Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn
290 295 300
Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser
305 310 315 320
Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn
325 330 335
Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu
340 345 350
His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro
355 360 365
<210> 5
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成蛋白序列
<400> 5
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 6
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成蛋白序列
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe Thr Glu His
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Ser Asn Phe Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp
210
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成蛋白序列
<400> 7
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His
1 5 10
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成蛋白序列
<400> 8
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成蛋白序列
<400> 9
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Thr Thr
1 5
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成蛋白序列
<400> 10
Gly His Thr Phe Thr Glu His Tyr Ile Asn
1 5 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成蛋白序列
<400> 11
Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成蛋白序列
<400> 12
Ser Tyr Ser Asn Phe Trp Phe Ala Tyr
1 5

Claims (100)

1.一种用于预测患者对癌症治疗的敏感性的方法，包括：
(a)使样品与识别包含两种B细胞淋巴瘤2(BCL-2)蛋白的异源二聚体的抗体或抗体形式接触，所述样品是来自所述患者的实体瘤的样本；
(b)检测指示所述异源二聚体的量的信号；以及
(c)测定来自步骤(b)的所述样品中存在的所述异源二聚体的量与参考值的比率，
其中所述参考值包括所述样品中所述异源二聚体的BCL-2蛋白单体之一的量，
所述比率预测所述患者对所述癌症治疗的敏感性。
2.一种用于预测患者对癌症治疗的敏感性的方法，包括：
(a)使样品与识别包含两种B细胞淋巴瘤2(BCL-2)蛋白的异源二聚体的抗体或抗体形式和识别所述异源二聚体的BCL-2蛋白单体之一的抗体或抗体形式接触，所述样品是来自所述患者的实体瘤的样本；
(b)检测指示所述异源二聚体的量的信号和指示所述单体的量的信号；以及
(c)基于所述异源二聚体的量与所述单体的量来确定比率，所述比率预测所述患者对所述癌症治疗的敏感性。
3.如权利要求1或2所述的方法，还包括在所述比率预测对癌症治疗的敏感性的情况下，对所述患者施用所述癌症治疗。
4.如权利要求3所述的方法，还包括在所述比率预测对所述癌症治疗的敏感性的情况下，用减少的剂量或不太频繁和/或缩短的癌症治疗方案治疗所述患者。
5.如权利要求3所述的方法，还包括在所述比率预测对所述癌症治疗缺乏敏感性的情况下，用增加的剂量或更加频繁和/或延长的癌症治疗方案治疗所述患者。
6.如权利要求1或2所述的方法，还包括在所述比率预测对所述癌症治疗缺乏敏感性的情况下，停止对所述患者的癌症治疗。
7.如权利要求1或2所述的方法，还包括在所述比率预测对所述癌症治疗缺乏敏感性的情况下，用不同的癌症治疗来治疗所述患者。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，还包括确定所述患者的一种或多种临床因素。
9.如权利要求8所述的方法，还包括基于所述患者的一种或多种临床因素针对对所述癌症治疗的临床响应的可能性来对所述患者进行分类。
10.如权利要求9所述的方法，还包括基于所述患者的一种或多种临床因素将所述患者对所述癌症治疗的敏感性的所述预测与对所述癌症治疗的临床响应的可能性进行比较。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述临床因素是年龄、细胞遗传学状态、表现、组织学亚类、性别和疾病阶段中的一种或多种。
12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其还包括测量选自突变状态、单核苷酸多态性、稳态蛋白水平以及动态蛋白水平的另外的生物标志物。
13.如权利要求1到12中任一项权利要求所述的方法，其中所述异源二聚体的所述检测采用免疫组织化学(IHC)、流式细胞术或免疫荧光法。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述BCL-2蛋白是激活剂BH3蛋白。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述激活剂BH3蛋白选自BID和BIM。
16.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述BCL-2蛋白是敏化剂BH3蛋白。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述敏化剂BH3蛋白选自BAD、BIK、NOXA A、NOXA B、HRK、BMF和PUMA。
18.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述BCL-2蛋白是多结构域促凋亡蛋白。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述多结构域促凋亡蛋白选自BAX和BAK。
20.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述BCL-2蛋白是多结构域抗凋亡蛋白。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述多结构域抗凋亡蛋白选自BCL-2、BCL-XL、MCL-1、BCL-W和BFL-1。
22.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述异源二聚体包含BCL2与BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF之一。
23.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述方法提供异源二聚体与BCL2、BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF单体之一的比率。
24.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述异源二聚体包含BCLXL与BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF之一。
25.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述方法提供异源二聚体与BCLXL、BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF单体之一的比率。
26.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述异源二聚体包含BCLW与BID、BIM、BIK、PUMA和BMF之一。
27.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述方法提供异源二聚体与BCLW、BID、BIM、BIK、PUMA和BMF单体之一的比率。
28.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述异源二聚体包含MCL1与BID、BIM、BIK、NOXA A、NOXA B、PUMA、BAK和BMF之一。
29.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述方法提供异源二聚体与MCL1、BID、BIM、BIK、NOXA A、NOXA B、PUMA和BMF单体之一的比率。
30.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述异源二聚体包含BFL1与BID、BIM、NOXA A、NOXA B和PUMA之一。
31.如权利要求1-13中任一项所述的方法，所述方法提供异源二聚体与BFL1、BID、BIM、NOXA A、NOXA B和PUMA单体之一的比率。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括BH3模拟物。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述BH3模拟物选自ABT-737和ABT-263(navitoclax)、Ventoclax(Venclexta,ABT-199)、S63845、AMG176、ADZ5991、A-1155463、A1331852、EU5346或其组合。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括一种或多种化疗剂。
35.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗是SMAC模拟物、蛋白酶体抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、糖皮质激素、类固醇、单克隆抗体、抗体-药物缀合物或沙利度胺衍生物中的一种或多种。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗阻断所检测的特定异源二聚体的形成。
37.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗干扰所检测的特定异源二聚体的形成。
38.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括检查点抑制剂。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述检查点抑制剂是靶向TIM-3、BTLA、PD-1、CTLA-4、B7-H4、GITR、半乳凝素-9、HVEM、PD-L1、PD-L2、B7-H3、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a和TMIGD2之一的剂。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述靶向PD-1的剂是对PD-1特异的抗体或抗体形式，任选地选自纳武单抗、派姆单抗和匹利珠单抗。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述靶向PD-L1的剂是对PD-L1特异性的抗体或抗体形式，任选地选自阿特朱单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗和BMS-936559。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述靶向CTLA-4的剂是对CTLA-4特异的抗体或抗体形式，任选地选自伊匹单抗和曲美木单抗。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述样品选自肿瘤活检、组织活检、肿瘤切除、冷冻肿瘤组织样本、淋巴结、骨髓、循环肿瘤细胞、培养细胞、福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本、支气管肺泡灌洗液、皮肤、毛发、尿液及其组合。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述肿瘤活检选自组织芯活检、针吸活检、手术组织活检和切除组织活检。
45.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述样品是所述患者的浸润淋巴细胞。
46.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述实体瘤选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、结肠癌和卵巢癌。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述肺癌选自非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
49.如权利要求46所述的方法，其中所述前列腺癌是雄激素非依赖性前列腺癌。
50.如权利要求1所述的方法，其中所述敏感性的特征在于对所述癌症治疗的响应的更高的可能性。
51.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述方法不包括线粒体外膜透化(MOMP)的功能性读出。
52.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述方法不包括对细胞膜电位的基于染料的检测。
53.如权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体形式选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fv、单链Fv、双抗体、线性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和包含抗体的抗原结合部分的融合蛋白中的一种或多种。
54.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体形式识别BCL2与BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF之一的异源二聚体。
55.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体形式识别BCLXL与BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF之一的异源二聚体。
56.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体形式识别BCLW和BID、BIM、BIK、PUMA和BMF之一的异源二聚体。
57.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体形式识别MCL1与BID、BIM、BIK、NOXA A、NOXA B、PUMA、BAK和BMF之一的异源二聚体。
58.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体形式识别BFL1与BID、BIM、NOXA A、NOXA B和PUMA之一的异源二聚体。
59.如权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体形式包括：(i)重链可变区，其包含重链CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，其中所述重链CDR1序列为GHTFTEHYIN(SEQ ID NO:1)，所述重链CDR2序列为WIFPGSGSTYYNEKFKG(SEQ ID NO:2)；并且所述重链CDR3序列为SYSNFWFAY(SEQ ID NO:3)；和(ii)轻链可变区，其包含轻链CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，其中所述轻链CDR1序列为RASQSIGTSIH(SEQ ID NO:4)，所述轻链CDR2序列为KYASESIS(SEQ ID NO:5)；并且所述轻链CDR3序列为QQSNSWPTT(SEQ ID NO:6)。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述抗体或抗体形式还包含根据式(FW1)-(CDR1)-(FW2)-(CDR2)-(FW3)-(CDR3)-(FW4)的并置在CDR之间的可变区框架(FW)序列，其中所述重链可变区中的所述可变区FW序列是重链可变区FW序列，并且其中所述轻链可变区中的所述可变区FW序列是轻链可变区FW序列
61.如权利要求60所述的方法，其中所述可变区FW序列是人的。
62.如权利要求59-61中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体形式还包含人重链恒定区和轻链恒定区。
63.如权利要求59-62中任一项所述的方法，其中所述恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。
64.如权利要求59-63中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体形式包含：(i)重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列，或具有总共不超过10个氨基酸置换的SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和(ii)轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或具有总共不超过10个氨基酸置换的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述抗体或抗体形式包含与SEQ ID NO:7和/或SEQID NO.8具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％同一性的氨基酸序列。
66.如权利要求9-65中任一项所述的方法，其中所述临床响应的可能性由以下等式定义：
Figure FDA0002654818660000071
其中：
AUC(曲线下面积)是通过均相时间分辨荧光(HTRF)或来自荧光激活细胞分选(FACS)的平均信号强度所建立的荧光测量值的总和，其中所述信号强度是在引发开始后约5分钟至约300分钟之间产生的单一时间点测量值；
DMSO(二甲基亚砜)构成曲线下面积或信号强度的基线阴性对照；
CCCP(羰基氰化物间氯苯腙)是氧化磷酸化的化学抑制剂，并且包含通过发挥质子梯度的解偶联试剂作用而成为蛋白质合成的效应物，其中所述质子梯度是在所述线粒体的电子传递链中电子载体的正常活动期间建立，并且CCCP构成基线阳性对照；并且
所述肽是一种或多种BH3结构域肽，其中(n)用所述DMSO和CCCP对照的平均重复数归一化。
67.如权利要求9-65中任一项所述的方法，其中所述临床响应的可能性由以下等式定义：
Figure FDA0002654818660000081
其中：
AUC(曲线下面积)是通过均相时间分辨荧光(HTRF)或来自荧光激活细胞分选(FACS)的平均信号强度所建立的荧光测量值的总和，其中所述信号强度是在引发开始后约5分钟至约300分钟之间产生的单一时间点测量值；
DMSO(二甲基亚砜)构成曲线下面积或信号强度的基线阴性对照；
CCCP(羰基氰化物间氯苯腙)是氧化磷酸化的化学抑制剂，并且包含通过发挥质子梯度的解偶联试剂作用而成为蛋白质合成的效应物，其中所述质子梯度是在所述线粒体的电子传递链中电子载体的正常活动期间建立，并且CCCP构成基线阳性对照；并且
所述肽是一种或多种BH3结构域肽，其中(n)用所述DMSO和CCCP对照的平均重复数归一化。
68.如权利要求66或67所述的方法，其中选择一种或多种临床因素以增加BH3分析的特异性和/或敏感性以便与临床响应相关。
69.一种用于预测患者对样品中的检查点抑制剂的响应性的方法，包括测量包含Mcl-1/Bim或BCLXL/Bim异源二聚体的抗体的量，其中所述样品包含来自实体瘤的浸润淋巴细胞群体。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述检查点抑制剂是靶向TIM-3、BTLA、PD-1、CTLA-4、B7-H4、GITR、半乳凝素-9、HVEM、PD-L1、PD-L2、B7-H3、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a和TMIGD2之一的剂。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述靶向PD-1的剂是对PD-1特异的抗体或抗体形式，任选地选自纳武单抗、派姆单抗和匹利珠单抗。
72.如权利要求70或71所述的方法，其中所述靶向PD-L1的剂是对PD-L1特异性的抗体或抗体形式，任选地选自阿特朱单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗和BMS-936559。
73.如权利要求70所述的方法，其中所述靶向CTLA-4的剂是对CTLA-4特异的抗体或抗体形式，任选地选自伊匹单抗和曲美木单抗。
74.一种包含抗体或抗体形式的组合物，所述抗体或抗体形式包含：(i)重链可变区，其包含重链CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，其中所述重链CDR1序列为GHTFTEHYIN(SEQ IDNO:1)，所述重链CDR2序列为WIFPGSGSTYYNEKFKG(SEQ ID NO:2)；并且所述重链CDR3序列为SYSNFWFAY(SEQ ID NO:3)；和(ii)轻链可变区，其包含轻链CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，其中所述轻链CDR1序列为RASQSIGTSIH(SEQ ID NO:4)，所述轻链CDR2序列为KYASESIS(SEQ ID NO:5)；并且所述轻链CDR3序列为QQSNSWPTT(SEQ ID NO:6)。
75.如权利要求74所述的组合物，其中所述抗体或抗体形式还包含根据式(FW1)-(CDR1)-(FW2)-(CDR2)-(FW3)-(CDR3)-(FW4)的并置在CDR之间的可变区框架(FW)序列，其中所述重链可变区中的所述可变区FW序列是重链可变区FW序列，并且其中所述轻链可变区中的所述可变区FW序列是轻链可变区FW序列。
76.如权利要求75所述的组合物，其中所述可变区FW序列是人的。
77.如权利要求74-76中任一项所述的组合物，其中所述抗体或抗体形式包含人重链恒定区和轻链恒定区。
78.如权利要求74-77中任一项所述的组合物，其中所述恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。
79.如权利要求74-78中任一项所述的组合物，其中所述抗体或抗体形式包含：(i)重链可变区序列，其包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列，或具有总共不超过10个氨基酸置换的SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和(ii)轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或具有总共不超过10个氨基酸置换的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
80.如权利要求79所述的组合物，其中所述抗体或抗体形式包含与SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO.8具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％同一性的氨基酸序列。
81.一种多核苷酸，包含编码如权利要求74-80中任一项所述的抗体或抗体片段的核酸序列。
82.一种载体，包含如权利要求81所述的多核苷酸。
83.一种宿主细胞，包含如权利要求82所述的载体。
84.一种药物组合物，包含如权利要求74-80中任一项所述的抗体或抗体形式和药学上可接受的赋形剂。
85.一种产生异源二聚体抗体的方法，包括：
(a)用异源二聚体诱导的构象抗原来免疫受试者；
(b)从所述受试者分离脾B细胞，所述脾B细胞产生识别所述异源二聚体诱导的抗原的IgG；
(c)将所述脾B细胞在所述磁柱上通过以用于负向选择，其中将用于负向选择的所述磁柱用含有所述异源二聚体的一个单体的重组融合蛋白包被；
(d)从所述磁柱收集所述脾B细胞的所述流出物以用于负向选择，并将所述流出物在所述磁柱上通过以用于正向选择；其中将用于正向选择的所述磁柱用所述异源二聚体抗原包被；
(e)洗脱并收集与所述磁柱结合的所述脾B细胞以用于正向选择；
(f)在B细胞培养基中培养所收集的细胞；以及
(g)从所述异源二聚体特异性抗体与所培养的细胞分离，从而产生异源二聚体抗体。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体抗原是BCL2与BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF之一的异源二聚体抗原。
87.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体抗原是BCLXL与BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF之一的异源二聚体抗原。
88.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体抗原是BCLW与BID、BIM、BIK、PUMA和BMF之一的异源二聚体抗原。
89.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体抗原是MCL1与BID、BIM、BIK、NOXAA、NOXA B、PUMA、BAK和BMF之一的异源二聚体抗原。
90.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体抗原是BFL1和BID、BIM、NOXA A、NOXA B和PUMA之一的异源二聚体抗原。
91.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体的所述一个单体选自BCL2、BID、BIM、BAD、BIK、PUMA、BMF、BCLXL、HRK、BCLW和MCL1。
92.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体的所述一个单体是MCL1。
93.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体的所述一个单体是BIM。
94.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体选自BCL2与BID、BIM、BAD、BIK、PUMA和BMF之一。
95.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体选自BCLXL与BID、BIM、BAD、BIK、HRK、PUMA和BMF之一。
96.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体选自BCLW与BID、BIM、BIK、PUMA和BMF之一。
97.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体选自MCL1与BID、BIM、BIK、NOXA A、NOXA B、PUMA、BAK和BMF之一。
98.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体选自BFL1与BID、BIM、NOXA A、NOXAB和PUMA之一。
99.如权利要求85所述的方法，其中所述异源二聚体选自BCL2、BID、BIM、BAD、BIK、PUMA、BMF、BCLXL、BCLW和MCL1中的两种。
100.如权利要求85所述的方法，其中所述受试者是人、猴、小鼠、大鼠或仓鼠。
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