JP6103702B2 - ラクダ科動物抗体の熱安定化 - Google Patents
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Description
本発明は、ラクダ科動物抗体を熱安定化する技術に関する。
偶蹄目、ラクダ科動物（フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコ）の血清中には軽鎖を持たない特殊な抗体があることが知られている。この抗体の可変領域はVHHドメインと呼ばれ、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとしては最も低分子量であるため、その利用を目指した研究が活発に進められている。
ラクダ科動物抗体及びVHHドメインは比較的熱安定性が高いために高温での利用と処理に適しているが、高温への暴露時間に従って活性低下があり、これを抑制するために熱安定性の高い抗体が求められていた。
本発明は、ラクダ科動物抗体の熱安定性を高めることを目的とする。
本発明は、以下の安定化ラクダ科動物抗体、遺伝子、ベクター、形質転換体を提供するものである。
項１． ラクダ科動物抗体のVHHドメインのIMGT表記において、配列番号1の57位及び／又は92位に相当するアスパラギン残基がセリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、スレオニン、アルギニン 、ヒスチジン、リジン、チロシン及びシステインからなる群から選ばれるいずれかの側鎖に極性基を有するアミノ酸で置換されてなる、安定化ラクダ科動物抗体。
項2． IMGT表記において、配列番号1の82位に相当するアスパラギン残基がセリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、スレオニン、アルギニン 、ヒスチジン、リジン、チロシン及びシステインからなる群から選ばれるいずれかの側鎖に極性基を有するアミノ酸でさらに置換されてなる、項１に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
項3． IMGT表記において、配列番号1の57位、82位及び92位に相当する位置がセリン、スレオニン、アルギニン 、ヒスチジン、リジン及びチロシンからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸で置換されてなる、項1又は2に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
項4． ラクダ科動物抗体のVHHドメインのIMGT表記において、配列番号1の23位及び/又は104位のいずれかに相当するシステイン残基がトリプトファン、アラニン、プロリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、メチオニンからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸で置換されてなる、安定化ラクダ科動物抗体。
項5． IMGT表記において、配列番号1の23位及び/又は104位に相当するシステイン残基がトリプトファン、アラニン、プロリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリンからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸で置換されてなる、項4に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
項6． アミノ酸の数が106〜133であるVHHドメインを有する項1〜5のいずれかに記載の安定化ラクダ科動物抗体。
項7． IMGT表記において、配列番号1の57位、82位及び92位からなる群から選ばれるアスパラギン残基がThr又はSerにより置換されてなる、項1〜3のいずれかに記載の安定化ラクダ科動物抗体。
項8． 配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する、項1〜7のいずれかに記載の安定化ラクダ科動物抗体。
項9． 項1〜8のいずれかに記載の抗体のフラグメント。
項10． 項1〜8のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。
項11． 項10に記載の遺伝子を有するベクター。
項12． 項11に記載のベクターで宿主を形質転換された形質転換体。
項１． ラクダ科動物抗体のVHHドメインのIMGT表記において、配列番号1の57位及び／又は92位に相当するアスパラギン残基がセリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、スレオニン、アルギニン 、ヒスチジン、リジン、チロシン及びシステインからなる群から選ばれるいずれかの側鎖に極性基を有するアミノ酸で置換されてなる、安定化ラクダ科動物抗体。
項2． IMGT表記において、配列番号1の82位に相当するアスパラギン残基がセリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、スレオニン、アルギニン 、ヒスチジン、リジン、チロシン及びシステインからなる群から選ばれるいずれかの側鎖に極性基を有するアミノ酸でさらに置換されてなる、項１に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
項3． IMGT表記において、配列番号1の57位、82位及び92位に相当する位置がセリン、スレオニン、アルギニン 、ヒスチジン、リジン及びチロシンからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸で置換されてなる、項1又は2に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
項4． ラクダ科動物抗体のVHHドメインのIMGT表記において、配列番号1の23位及び/又は104位のいずれかに相当するシステイン残基がトリプトファン、アラニン、プロリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、メチオニンからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸で置換されてなる、安定化ラクダ科動物抗体。
項5． IMGT表記において、配列番号1の23位及び/又は104位に相当するシステイン残基がトリプトファン、アラニン、プロリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリンからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸で置換されてなる、項4に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
項6． アミノ酸の数が106〜133であるVHHドメインを有する項1〜5のいずれかに記載の安定化ラクダ科動物抗体。
項7． IMGT表記において、配列番号1の57位、82位及び92位からなる群から選ばれるアスパラギン残基がThr又はSerにより置換されてなる、項1〜3のいずれかに記載の安定化ラクダ科動物抗体。
項8． 配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する、項1〜7のいずれかに記載の安定化ラクダ科動物抗体。
項9． 項1〜8のいずれかに記載の抗体のフラグメント。
項10． 項1〜8のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。
項11． 項10に記載の遺伝子を有するベクター。
項12． 項11に記載のベクターで宿主を形質転換された形質転換体。
本発明により熱安定性が増加されたラクダ科動物抗体は、高温での使用や処理による活性の低下を軽減することができる。
本明細書において、ラクダ科動物としては、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコが挙げられ、好ましくはヒトコブラクダ、ラマ、アルパカが挙げられる。
本明細書において、野生型のラクダ科動物抗体のアミノ酸配列(図1AのWT VHH)が配列番号１に示され、塩基配列が配列番号2に示される。本発明の安定化ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列(図1AのAsn Mutant VHH)が配列番号3に示され、塩基配列が配列番号4に示される。さらに、野生型ラクダ科動物抗体の他のアミノ酸配列が配列番号5〜配列番号100に示される。
抗体のアミノ酸の番号付けの方法としてIMGT(ImMunoGeneTics Database)表記とKabat表記の2種類が存在し、本明細書では特に言及しない限りIMGT表記を用いる。
本発明で、ラクダ科動物抗体でアミノ酸置換される位置は重鎖の可変領域の57位(CDR-H2)、82位（フレームワーク3）及び92位（フレームワーク3）のアスパラギン、23位（フレームワーク1）及び104位（フレームワーク3）のシステインの5カ所である。
Kabat表記では、各々52位(CDR-H2)、73位（フレームワーク3）及び82a位（フレームワーク3）のアスパラギン、22位（フレームワーク1）及び92位（フレームワーク3）のシステインの5カ所である。
配列番号1のラクダ科動物抗体は、これら3つの位置にアスパラギンを有するため、実施例ではこれら3つの位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された。一方、配列番号5〜配列番号100のアミノ酸配列では、これら3つの位置のうちの1つもしくは2つの位置がアスパラギン以外のアミノ酸であるので、アスパラギンのみを他のアミノ酸に置換すればよい。
本発明で使用されるラクダ科動物抗体（重鎖抗体ともいう）は、軽鎖を有さず、重鎖のみから構成される抗体であり、重鎖は、可変領域を有する限り、不変領域の一部を欠失または置換した抗体またはそのフラグメントであってもよい。
ラクダ科動物抗体のVHHドメインは、ラクダ科動物抗体由来の重鎖可変領域のドメインであり、軽鎖可変領域ドメインと相互作用せず、それのみで抗原と結合するものである。例えば、配列番号１のアミノ酸配列の1〜117番目の配列はVHHドメインに包含される。また、配列番号５〜１００のアミノ酸配列もVHHドメインに包含される。当業者であれば、これらの配列を参考にして容易にVHHドメインを決定できる。
配列番号１は重鎖抗体の可変領域のドメイン（VHHドメイン）のみで不変領域は含んでいない。
抗体のアスパラギン残基を他の極性基を有するアミノ酸残基に置換する方法としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
本発明の安定化されたラクダ科動物抗体は、例えば該抗体をコードする遺伝子をベクターに組み込み、このベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培地中で培養し、抗体を回収することにより得ることができる。前記ベクターで形質転換される宿主としては、大腸菌などの細菌、酵母、真菌などの微生物が例示され、大腸菌、酵母が好ましい。酵母としては、例えばメタノール資化酵母を好ましく例示できる。
本発明で得られた抗体は高温での処理による活性の低下が軽減されるため、高温の飲料中に含まれる化合物の定量〔Anal. Chem., 78, 4501-4508 (2006)〕や高温暴露によって夾雑物の除去を行う抗体精製〔Bmc Biotechnol 7, 7 (2007)〕などの高温処理を伴う使用に有効である。
本発明の抗体は、耐熱性が向上していることから、室温における安定性も大きく向上しており、エンザイムイムノアッセイ（EIA）法、イムノブロッティング法、ドットブロット法、イムノクロマト法、マルチ蛍光マイクロビーズ法等の免疫学的検出法に用いることができる。
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１及び比較例１
材料と方法
アスパラギン残基の置換
ここで用いた天然型VHHドメインはラマ由来であり、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）のαサブユニットを抗原とするものである。Protein Data Bankの1G9Eのアミノ酸配列（配列番号１）をもとに、酵母のコドン頻度に合わせ、cDNA（配列番号２）を作製し、大腸菌用発現ベクターpAED4〔Biochemistry 35, 12677-12685 (1996)〕にクローニングした。アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸の異なるアミノ酸への変異はそれぞれAsn変異プライマー（3種類、配列番号101-103）、Asp変異プライマー（2種類、配列番号104-105）、Gln 変異プライマー（3種類、配列番号106-108）を用いたPCR法に導入した。システインの異なる変異体は特許第4521532号及び文献[J Biol Chem 280, 24752-24758 (2005)]に記載のスクリーニング方法によって取得した。天然型及び変異型VHH抗体は大腸菌で発現し、ゲル濾過と陽イオン交換カラムで精製することにより調製した〔J Biol Chem 282, 36489-36495 (2007)〕。
実施例１及び比較例１
材料と方法
アスパラギン残基の置換
ここで用いた天然型VHHドメインはラマ由来であり、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）のαサブユニットを抗原とするものである。Protein Data Bankの1G9Eのアミノ酸配列（配列番号１）をもとに、酵母のコドン頻度に合わせ、cDNA（配列番号２）を作製し、大腸菌用発現ベクターpAED4〔Biochemistry 35, 12677-12685 (1996)〕にクローニングした。アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸の異なるアミノ酸への変異はそれぞれAsn変異プライマー（3種類、配列番号101-103）、Asp変異プライマー（2種類、配列番号104-105）、Gln 変異プライマー（3種類、配列番号106-108）を用いたPCR法に導入した。システインの異なる変異体は特許第4521532号及び文献[J Biol Chem 280, 24752-24758 (2005)]に記載のスクリーニング方法によって取得した。天然型及び変異型VHH抗体は大腸菌で発現し、ゲル濾過と陽イオン交換カラムで精製することにより調製した〔J Biol Chem 282, 36489-36495 (2007)〕。
製造した変異ラマ抗体は、以下のものである。なお、「WT」は変異を導入していない野生型のラマ抗体である。変異位置はIMGT表記。
(1) AsnMut: N57S, N82S, N92Tの３つのN（Asn）を変異させたラマ抗体
(2) N57S：57位のN（Asn）をSに変異させたラマ抗体
(3) N82S：57位のN（Asn）をSに変異させたラマ抗体
(4) N92T：57位のN（Asn）をTに変異させたラマ抗体
(5) WA：C23W, C104Aの２つの変異を有するラマ抗体
(6) WP：C23W, C104Pの２つの変異を有するラマ抗体
(7) WG：C23W, C104Gの２つの変異を有するラマ抗体
(8) AL：C23A, C104Lの２つの変異を有するラマ抗体
(9) AI：C23A, C104Iの２つの変異を有するラマ抗体
(10) VA：C23V, C104Aの２つの変異を有するラマ抗体
(11) GV：C23G, C104Vの２つの変異を有するラマ抗体
(12) Dmut：D81E、D98Eの２つの変異を有するラマ抗体
(13) Qmut：Q1E、Q3K、Q5L、Q44R、Q120Kの５つの変異を有するラマ抗体
(1) AsnMut: N57S, N82S, N92Tの３つのN（Asn）を変異させたラマ抗体
(2) N57S：57位のN（Asn）をSに変異させたラマ抗体
(3) N82S：57位のN（Asn）をSに変異させたラマ抗体
(4) N92T：57位のN（Asn）をTに変異させたラマ抗体
(5) WA：C23W, C104Aの２つの変異を有するラマ抗体
(6) WP：C23W, C104Pの２つの変異を有するラマ抗体
(7) WG：C23W, C104Gの２つの変異を有するラマ抗体
(8) AL：C23A, C104Lの２つの変異を有するラマ抗体
(9) AI：C23A, C104Iの２つの変異を有するラマ抗体
(10) VA：C23V, C104Aの２つの変異を有するラマ抗体
(11) GV：C23G, C104Vの２つの変異を有するラマ抗体
(12) Dmut：D81E、D98Eの２つの変異を有するラマ抗体
(13) Qmut：Q1E、Q3K、Q5L、Q44R、Q120Kの５つの変異を有するラマ抗体
Asn変異プライマー
Asn_1 CCGTCGCAGCAATAAgTTGGGATTCGGC (配列番号101)
Asn_2 CAAGAGACAgTGCTAAGAAGACCGTGTACTTAC (配列番号102)
Asn_3 GTTTTAGAGAGgTCATTTGTAAGTACACGGTCTTC (配列番号103)
Asn_1 CCGTCGCAGCAATAAgTTGGGATTCGGC (配列番号101)
Asn_2 CAAGAGACAgTGCTAAGAAGACCGTGTACTTAC (配列番号102)
Asn_3 GTTTTAGAGAGgTCATTTGTAAGTACACGGTCTTC (配列番号103)
Asp変異プライマー
Asp_1 CAATTTCAAGAGAgAATGCTAAGAAG (配列番号104)
Asp_2 GTAAACAGCAGTtTCTTCTGGTTTTAGAG (配列番号105)
Asp_1 CAATTTCAAGAGAgAATGCTAAGAAG (配列番号104)
Asp_2 GTAAACAGCAGTtTCTTCTGGTTTTAGAG (配列番号105)
Gln変異プライマー
Gln_1 GATATACATATGgAGGTCaAGCTTctAGAGTCTGG (配列番号106)
Gln_2 CTTTTCCAGGTGCgcGTCTGAACCATCCC (配列番号107)
Gln_3 CTTGAGTACCTTtACCCCATGAATCC (配列番号108)
Gln_1 GATATACATATGgAGGTCaAGCTTctAGAGTCTGG (配列番号106)
Gln_2 CTTTTCCAGGTGCgcGTCTGAACCATCCC (配列番号107)
Gln_3 CTTGAGTACCTTtACCCCATGAATCC (配列番号108)
試験例１
天然型及び変異型VHHドメインは10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, and 0.005% surfactant P20 (HBS)中でVHH抗体濃度が100nMになるように調製した。サーマルサイクラーを用いて、90℃5分-20℃5分を複数回行う変性-再生サイクル実験（90℃変性-再生サイクル X回）、及び90℃処理時間を変化させた後に20℃で再生させる変性時間実験（90℃時間インキュベーション X分）を行った。処理後の活性は抗原であるhCGを固定化したCM5センサーチップを用いてGEヘルスケア社のBiacore2000によって測定した。その値を未処理のサンプルの抗原結合活性と比較することで残存活性を見積もった。その結果、いずれの実験でもアスパラギンを欠いた変異体では天然型VHHドメインに比べ、変性-再生サイクル実験では抗原結合活性が半分になる半減サイクル数が49％、変性時間実験では半減時間が58％延長した。このことからアスパラギンを他のアミノ酸に置換することで、アスパラギンの化学修飾による抗体の構造変化が抑制されVHHドメインの熱安定性が顕著に向上することが明らかとなった（図2）。一方でアスパラギン酸、グルタミンの個数を減じた変異体では天然型に比較して大きな安定性の向上は変性-再生サイクル、変性時間の両実験においては観察されなかった（図3）。これはアスパラギンに比較してアスパラギン酸、グルタミンが化学修飾を受けにくいためと考えられる。
天然型及び変異型VHHドメインは10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, and 0.005% surfactant P20 (HBS)中でVHH抗体濃度が100nMになるように調製した。サーマルサイクラーを用いて、90℃5分-20℃5分を複数回行う変性-再生サイクル実験（90℃変性-再生サイクル X回）、及び90℃処理時間を変化させた後に20℃で再生させる変性時間実験（90℃時間インキュベーション X分）を行った。処理後の活性は抗原であるhCGを固定化したCM5センサーチップを用いてGEヘルスケア社のBiacore2000によって測定した。その値を未処理のサンプルの抗原結合活性と比較することで残存活性を見積もった。その結果、いずれの実験でもアスパラギンを欠いた変異体では天然型VHHドメインに比べ、変性-再生サイクル実験では抗原結合活性が半分になる半減サイクル数が49％、変性時間実験では半減時間が58％延長した。このことからアスパラギンを他のアミノ酸に置換することで、アスパラギンの化学修飾による抗体の構造変化が抑制されVHHドメインの熱安定性が顕著に向上することが明らかとなった（図2）。一方でアスパラギン酸、グルタミンの個数を減じた変異体では天然型に比較して大きな安定性の向上は変性-再生サイクル、変性時間の両実験においては観察されなかった（図3）。これはアスパラギンに比較してアスパラギン酸、グルタミンが化学修飾を受けにくいためと考えられる。
試験例２
90℃で処理したときの残存活性が半減する加熱時間を指標として、WT、AsnMut、N57S、N82S、N92Tの安定性評価を行った。結果を図4に示す。
90℃で処理したときの残存活性が半減する加熱時間を指標として、WT、AsnMut、N57S、N82S、N92Tの安定性評価を行った。結果を図4に示す。
試験例３
SS結合を形成している23位と104位のCysをWA、WP、WG、AL、AI、VA、GVに各々変異させた変異体とWTのVHH抗体について、90℃で変性-再生サイクルを80回行ったときの熱安定性を評価した。結果を図5に示す。IMGT表記でC23とC104のW, A, P, G, L, I, Vへの変異により熱耐性が向上する
SS結合を形成している23位と104位のCysをWA、WP、WG、AL、AI、VA、GVに各々変異させた変異体とWTのVHH抗体について、90℃で変性-再生サイクルを80回行ったときの熱安定性を評価した。結果を図5に示す。IMGT表記でC23とC104のW, A, P, G, L, I, Vへの変異により熱耐性が向上する
本発明の変異型VHH抗体は、熱安定性が高く、材料（再利用可能な病原菌捕捉フィルター）、加熱滅菌が可能な抗体医薬、熱による加工が必要なもの（プラスチック）などどの抗体ハイブリッド材料として有用である。
Claims (13)
- ラクダ科動物抗体のVHHドメインのIMGT表記において、配列番号1の57位及び／又は92位に相当するアスパラギン残基がセリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、スレオニン、アルギニン 、ヒスチジン、リジン、チロシン及びシステインからなる群から選ばれるいずれかの側鎖に極性基を有するアミノ酸で置換されてなる、熱安定化ラクダ科動物抗体。
- IMGT表記において、配列番号1の82位に相当するアスパラギン残基がセリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、スレオニン、アルギニン 、ヒスチジン、リジン、チロシン及びシステインからなる群から選ばれるいずれかの側鎖に極性基を有するアミノ酸でさらに置換されてなる、請求項１に記載の熱安定化ラクダ科動物抗体。
- IMGT表記において、配列番号1の57位、82位及び92位に相当する位置がアスパラギン酸、セリン、スレオニン、アルギニン 、ヒスチジンからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸で置換されてなる、請求項1又は2に記載の熱安定化ラクダ科動物抗体。
- ラクダ科動物抗体のVHHドメインのIMGT表記において、配列番号1の23位及び/又は104位のいずれかに相当するシステイン残基がトリプトファン、アラニン、プロリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、メチオニンからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸で置換されてなる、熱安定化ラクダ科動物抗体。
- IMGT表記において、配列番号1の23位及び/又は104位に相当するシステイン残基がトリプトファン、アラニン、プロリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリンからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸で置換されてなる、請求項4に記載の熱安定化ラクダ科動物抗体。
- アミノ酸の数が106〜133であるVHHドメインを有する請求項1〜5のいずれかに記載の熱安定化ラクダ科動物抗体。
- IMGT表記において、配列番号1の57位、82位及び92位からなる群から選ばれるアスパラギン残基がThr又はSerにより置換されてなる、請求項1〜3のいずれかに記載の熱安定化ラクダ科動物抗体。
- 配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる、請求項1〜7のいずれかに記載の熱安定化ラクダ科動物抗体。
- 請求項1〜8のいずれかに記載のＶＨＨドメイン抗体。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。
- 請求項10に記載の遺伝子を有するベクター。
- 請求項11に記載のベクターで宿主を形質転換された形質転換体。
- ラクダ科動物抗体のVHHドメインのIMGT表記において、配列番号1の57位及び／又は92位に相当するアスパラギン残基をセリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、スレオニン、アルギニン 、ヒスチジン、リジン、チロシン及びシステインからなる群から選ばれるいずれかの側鎖に極性基を有するアミノ酸で置換することを特徴とする、ラクダ科動物抗体の熱安定性を向上する方法。
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