TW201321408A - 作為診斷標記之oxMIF - Google Patents

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Randolf J Kerschbaumer
Dirk Voelkel
Patrice Douillard
Friedrich Scheiflinger
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Baxter Healthcare Sa
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Abstract

本發明係關於一種MIF之特定oxMIF形式，其可用作(MIF相關)疾病之診斷標記，特定而言例如用於監測疾病進展。本發明亦係關於診斷套組及各別診斷分析之各別用途且係關於有用的該各別抗體。

Description

作為診斷標記之oxMIF
本發明係關於以下認識：特定MIF形式可用作MIF相關疾病之診斷標記、特定而言例如用於監測疾病進展、作為(MIF相關)疾病狀態之(二級)標記，或特定而言於體液中或在細胞或細胞表面上作為幫助治療決策之工具。本發明亦係關於診斷套組及各別診斷分析之各別用途。
巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)係一種細胞因子，其最初係基於其抑制來自結核菌素過敏天竺鼠之腹腔滲出細胞(含有巨噬細胞)的活體外隨機遷移之能力而分離(Bloom等人，Science 1966,153,80-2；David等人，PNAS 1966,56,72-7)。目前，MIF被稱為具有多效性活性譜之先天性及獲得性免疫反應的關鍵上游調節子。
於1989年選殖出人類MIF cDNA(Weiser等人，PNAS 1989,86,7522-6)，且其基因組定位係映射至染色體22。人類MIF基因之產物係具有114個胺基酸(N-末端甲硫胺酸裂解之後)之蛋白質且表觀分子質量為約12.5 kDa。MIF與任何其他蛋白質均不具有顯著序列同源性。蛋白質結晶為相同子單元之三聚體。每一單體含有兩個針對四鏈β-平板封裝之反平行α-螺旋。單體額外具有兩個與毗鄰子單元之β-平板相互作用以在單體之間形成界面之β-鏈。該三個子單元經配置以形成含有溶劑可接近通道之桶狀物，該溶劑可接近通道沿分子三倍軸運行穿過蛋白質中心(Sun等人， PNAS 1996,93,5191-5196)。
據報導，在極低濃度之糖皮質激素下誘導MIF自巨噬細胞之分泌(Calandra等人，Nature 1995,377,68-71)。然而，MIF亦反向調節糖皮質激素之效應並刺激其他細胞因子(例如，腫瘤壞死因子TNF-α及介白素IL-1 β)之分泌(Baugh等人，Crit Care Med 2002,30,S27-35)。MIF亦已展示(例如)促血管生成、促增殖及抗凋亡性質，因此促進腫瘤細胞生長(Mitchell,R.A.,Cellular Signalling,2004.16(1)：第13-19頁；Lue,H.等人，Oncogene 2007.26(35)：第5046-59頁)。其亦(例如)與淋巴瘤、黑色素瘤及結腸癌之生長直接相關聯(Nishihira等人，J Interferon Cytokine Res.2000,20：751-62)。
MIF係許多病理狀況之介質且因此與各種疾病相關聯，尤其包括發炎性腸病(IBD)、類風濕性關節炎(RA)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、哮喘、腎小球性腎炎、IgA腎病、心肌梗塞(MI)、敗血症及癌症，但並不限於此。
已針對重組人類MIF開發出多株及單株抗MIF抗體(Shimizu等人，FEBS Lett.1996；381,199-202；Kawaguchi等人，Leukoc.Biol.1986,39,223-232；及Weiser等人，Cell.Immunol.1985,90,167-78)。
已建議將抗MIF抗體用於治療用途。Calandra等人(J.Inflamm.(1995)；47,39-51)據報告使用抗MIF抗體來保護動物免於實驗誘導之革蘭氏陰性(gram-negative)及革蘭氏陽性(gram-positive)敗血性休克。已建議將抗MIF抗體作為 治療手段來調介敗血性休克及其他發炎性疾病狀態中之細胞因子產生。
US 6,645,493揭示源自融合瘤細胞之單株抗MIF抗體，該等抗體中和MIF之生物活性。在動物模型中可展示，該等源自小鼠之抗MIF抗體在治療內毒素誘導之休克中具有有益作用。
US 200310235584揭示在動物中製備對MIF具有高親和力之抗體的方法，其中MIF基因已純合子地敲除。
糖基化抑制因子(GIF)係一種蛋白質，其已由Galat等人(Eur.J.Biochem,1994,224,417-21)闡述。現在認為MIF與GIF係相同的。Watarai等人(PNAS 2000,97,13251-6)闡述結合至不同GIF表位以識別Ts細胞中GIF之翻譯後修飾的生物化學性質之多株抗體。Watarai等人(見上文)報告GIF在活體外以不同構象同型異構體形式出現。一種類型之同分異構體係因單一半胱胺酸殘基之化學修飾而出現。化學修飾導致GIF蛋白質內之構象改變。
如在過去數十年中所展示，MIF係涉及眾多不同相互作用之分子，因此其可能係MIF相關疾病中疾病狀態之適宜標記。儘管存在針對若干MIF相關之疾病之診斷標記及方法，但通常有利的係具有一種以上用於診斷既定疾病之方法或標記，且甚至更重要地係具有與實際疾病狀態相關聯之標記。MIF係在人體中可以高數量檢測之遍在蛋白，且因此通常不會將MIF之出現與(MIF相關)疾病之間清晰的聯繫起來。因此，業內需要適宜診斷標記以檢測個體中(MIF 相關)疾病之發作及/或存在；特定而言，需要將允許特定而言藉由使用體液作為試樣或使用細胞作為試樣監測(MIF相關)疾病之疾病進展、測定疾病狀態及監測治療效能之可靠標記。
以上目標已藉由本發明解決。特定而言，本發明者可展示，在(MIF相關)疾病發作之後可(例如)在體液試樣中或在細胞或細胞表面上檢測到oxMIF(即，經氧化MIF)，且oxMIF係與疾病狀態及/或疾病進展相關聯。基於目前所提供之知識/技術，oxMIF並不存在於來自健康供體之體液試樣中(例如，血液、血清及尿液)或來自健康供體之細胞試樣中。在疾病狀況下oxMIF增加。此增加比總MIF更明顯(更具特定性)(亦參見實例)。
「不存在」在此上下文中應意味著，如實例3.4中在標題「材料及方法」下所展示，若利用抗體RAB0實施，則oxMIF不以利用ELISA技術可檢測之量存在於體液中，如下文所闡述。
在細胞試樣(例如血球)之上下文中「不存在」意味著在實例3.9中所闡述之流式細胞術實驗中，與利用對照抗體「對照1」染色相比，在細胞試樣中將抗體RAB9或RAB0或RAB4施加於細胞並不會獲得較高信號。
因此，oxMIF適宜用作該等疾病之標記，藉此在本發明之上下文中術語「在(MIF相關)疾病之診斷中之標記」特定而言將意味著評估MIF是否係涉及此(MIF相關)疾病之因 子之可能性。就此而言，oxMIF作為標記提供關於疾病狀態、其進程之資訊且作為標記以測定既定治療之有效性；另外，試樣(例如體液試樣或細胞試樣)中之oxMIF檢測可作為較佳抗MIF療法之指標。由此，oxMIF之檢測用於改良既定疾病或病症之已知診斷技術。其幫助從業者決定如何治療既定疾病或病症且有助於改良診斷之專一性。因此oxMIF係特定且適宜之二級標記。因此，其檢測可在患有MIF相關疾病之患者的管理中用作輔助測試。在較佳實施例中，所關注疾病係已知或懷疑為MIF相關之疾病(參見下文詳細提及之疾病)，但亦可係至今還未懷疑為MIF相關之疾病。
在較佳實施例中，在試樣中檢測到oxMIF存在將指示從業者，自其取得試樣之個體可能受益於針對MIF之療法。此療法將選自針對(ox)MIF之抗MIF分子(例如抗(ox)MIF抗體或小分子)。
升高之MIF含量(即，MIF之含量)一般係在各種疾病發作之後、尤其在癌症發作之後檢測。然而，MIF亦在健康個體中循環，此造成明顯的辨別困難。與此相反，oxMIF在健康個體中並不存在且因此係MIF相關疾病之更強診斷標記。如實例中所展示，在疾病狀態下oxMIF增加且在患者之試樣(例如血液、血清及尿液)中可檢測。
本文所呈現之發明尤其係基於Baxter抗體RAB9、RAB4及RAB0特異性結合至oxMIF(且不能結合至redMIF)之發現。
在本發明者實施之早期實驗中，可展示氧化過程(例如，胱胺酸介導之氧化、GSSG(氧化谷胱甘肽)介導之氧化或MIF與Proclin300或蛋白質交聯劑(例如BMOE)一起培養)導致結合至以上所提及之抗體。
本發明者所獲得之令人驚訝的結論係：
●重組MIF(人類、鼠科動物、大鼠、CHO、猴子)之氧化還原調變(Cys/Glu介導之輕度氧化)或重組MIF利用Proclin300或蛋白質交聯劑之處理導致Baxter之抗MIF抗體RAB9、RAB4及RAB0之結合
●oxMIF之還原導致Ab結合喪失
●對oxMIF同型異構體之特異性與生物學Ab效能(活體外/活體內)相關聯。
●oxMIF含量可與疾病狀態相關聯。
因此，本發明較佳定義如下：
1.一種oxMIF作為標記在(MIF相關)疾病之活體外診斷中之用途，其中oxMIF係差別地結合至抗體RAB9、RAB0及/或RAB4之MIF。
2.如項目1之用途，其中(MIF相關疾病)之該診斷進一步涉及使用差別地結合至該診斷標記之化合物，該診斷標記係如項目1中所定義之oxMIF。
3.如項目2之用途，其中該等化合物係差別地結合至oxMIF之抗體。
4.如項目3之用途，其中該等抗體結合至oxMIF，但不結合至red MIF。
5.如項目4之用途，其中該差別結合係以小於100 nM、較佳小於50 nM、甚至更佳小於10 nM之KD值發生至oxMIF之結合且以KD超過400 nM為特徵未結合至redMIF。
6.如項目1至5中任一項之用途，其中該等MIF相關疾病係選自由以下組成之群：發炎性疾病及腫瘤疾病(良性、變惡性前及/或惡性)。
7.如項目6之用途，其中該等MIF相關疾病係選自由以下組成之群：結腸癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肝細胞癌、哮喘、ARDS、類風濕性關節炎、敗血症、IgA腎病、腎小球性腎炎、狼瘡性腎炎(LN)、肝炎、胰腺炎(+/-急性肺損傷)、克隆氏病(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、胃潰瘍、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、多發性硬化、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、心功能障礙、血管成形術、動脈粥樣硬化、心肌炎、1型糖尿病、糖尿病性視網膜病變、年齡相關性黃斑變性(AMD)、異位性皮炎、牛皮癬、子宮內膜異位症、神經性病變疼痛及/或葡萄膜炎。
8.如項目2至7中任一項之用途，其中該等抗體係選自由oxMIF結合劑(例如抗體RAB9、RAB4及/或RAB0)組成之群。
9.如項目1至8中任一項之用途，其中該診斷係(MIF相關疾病)存在之診斷、(MIF相關疾病)進展之診斷、疾病 狀態之診斷及/或治療有效性之監測。
10.如項目1至9中任一項之用途，其中該診斷係針對個體之體液試樣實施。
11.如項目1至9中任一項之用途，其中該診斷係針對個體之細胞試樣實施。
12.一種藉由在個體之體液或細胞試樣中檢測如項目1中所定義之oxMIF用於活體外診斷(MIF相關)疾病之診斷分析，其包含在活體外測定化合物至該試樣中之oxMIF之結合的步驟。
13.如項目12之診斷分析，其中結合至oxMIF之該化合物及該等(MIF相關)疾病係如項目2至9中任一項或多項中所定義。
14.如項目12或13之診斷分析，其中該分析在(MIF相關)疾病之進展、緩解及/或治療期間重複一次或多次。
15.一種診斷套組在如項目12至14中任一項或多項之分析中之用途，其中該診斷套組包含結合至oxMIF之化合物。
16.如項目15之用途，其中該套組另外包含緩衝液、對照(例如重組(ox)MIF)、多株MIF抗體及/或偶聯檢測抗體。
17.一種抗MIF抗體，其係選自以下群組：a)RAB4抗體，其特徵在於以寄存編號DSM 25110利用質粒寄存所寄存之輕鏈序列及以寄存編號DSM 25112利用質粒寄存所寄存之重鏈序列， b)RAB9抗體，其特徵在於以寄存編號DSM 25111利用質粒寄存所寄存之輕鏈序列及以寄存編號DSM 25113利用質粒寄存所寄存之重鏈序列，c)RAB0抗體，其特徵在於以寄存編號DSM 25114利用質粒寄存所寄存之輕鏈序列及以寄存編號DSM 25115利用質粒寄存所寄存之重鏈序列，d)RAM4抗體，其特徵在於以寄存編號DSM 25861利用質粒寄存所寄存之輕鏈序列及以寄存編號DSM 25862利用質粒寄存所寄存之重鏈序列，e)RAM9抗體，其特徵在於以寄存編號DSM 25859利用質粒寄存所寄存之輕鏈序列及以寄存編號DSM 25860利用質粒寄存所寄存之重鏈序列，及/或f)RAM0抗體，其特徵在於以寄存編號DSM 25863利用質粒寄存所寄存之輕鏈序列及以寄存編號DSM 25864利用質粒寄存所寄存之重鏈序列。
18.一種抗MIF抗體，其係選自以下群組：a)RAB4抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：2且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：6，b)RAB9抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：1且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：5，c)RAB0抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：3且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：7，d)RAB2抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：4且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：8， e)RAM4抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：14且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：13，f)RAM9抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：12且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：11，及/或g)RAM0抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：10且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：9 h)或其功能等效物，其特徵在於結合至與以上該等抗體a)至g)中之任一者相同之表位。
19.一種特定而言如項目17或18中所定義以上抗體中之任一者用於診斷(MIF相關)疾病之用途。
所有以上提及之項目以及隨附於本文之申請專利範圍同樣從屬於以下較佳抗體：RAM9 RAM4 RAM0。
該等抗體具有與以上項目列表中所提及抗體相同之特異性(亦參見下文)；利用該等抗體可達成類似結果。
特定而言，利用本發明提供特別適宜且有利地(例如)作為診斷標記之較佳本發明抗體。
該等以上提及之抗體係由其序列以及作為質粒於大腸桿菌(E.coli)(菌株TG1)中之寄存物表徵並支援，其分別包含以上所提及之抗體RAB0、RAB4及RAB9以及RAM0、RAM4及RAM9中之每一者之輕鏈或重鏈。
質粒係以其DSM編號為特徵，DSM編號係當根據布達佩 斯條約(Budapest Treaty)由德國微生物寄存和細胞培養(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,DSMZ)(Mascheroder Weg 1b,Braunschweig，德國)寄存時所獲得之官方編號。該等質粒分別寄存於大腸桿菌菌株中。
編號為DSM 25110之質粒包含抗MIF抗體RAB4之輕鏈序列。
編號為DSM 25112之質粒包含抗MIF抗體RAB4之重鏈(IgG4)序列。
質粒DSM 25110及DSM 25112於適宜宿主細胞中之共表現使得產生較佳抗MIF抗體RAB4。
編號為DSM 25111之質粒包含抗MIF抗體RAB9之輕鏈序列。
編號為DSM 25113之質粒包含抗MIF抗體RAB9之重鏈(IgG4)序列。
質粒DSM 25111及DSM 25113於適宜宿主細胞中之共表現使得產生較佳抗MIF抗體RAB9。
編號為DSM 25114之質粒包含抗MIF抗體RAB0之輕鏈序列。
編號為DSM 25115之質粒包含抗MIF抗體RAB0之重鏈(IgG4)序列。
質粒DSM 25114及DSM 25115於適宜宿主細胞中之共表現使得產生較佳抗MIF抗體RAB0。
亦寄存抗體RAM0、RAM9及RAM4；所有均已根據布達佩斯條約於2012年4月12日由DSZM(Braunschweig，德國) 寄存，且具有以下名稱：
RAM9-重鏈：大腸桿菌GA.662-01.pRAM9hc-DSM 25860。
RAM4-輕鏈：大腸桿菌GA.906-04.pRAM4lc-DSM 25861。
RAM9-輕鏈：大腸桿菌GA.661-01.pRAM9lc-DSM 25859。
RAM4-重鏈：大腸桿菌GA.657-02.pRAM4hc-DSM 25862。
RAM0-輕鏈：大腸桿菌GA.906-01.pRAM0lc-DSM 25863。
RAM0-重鏈：大腸桿菌GA.784-01.pRAM0hc-DSM 25864。
因此，本發明亦涵蓋包含抗oxMIF抗體或其抗原結合片段之診斷分析，藉此該等抗體或其抗原結合片段具有差別結合，即結合至診斷方法中所用之oxMIF但不結合至redMIF。基於目前知識/技術，不可能自健康供體檢測出oxMIF。在一個實施例中，以上抗oxMIF抗體或其抗體結合部分可用於檢測來自人類個體之生物試樣中之人類oxMIF。
在本申請案之上下文中，生物試樣較佳係將執行診斷之個體的體液試樣。體液試樣係熟悉此項技術者已知之任一體液試樣。實例性此試樣可(但不限於)為血液、血漿、血清、唾液、尿液、鼻液、腹水、眼液、羊膜液、水狀液、 玻璃狀液、淚液、考珀液(Cowper’s fluid)、精液、間隙液、淋巴液、乳汁、黏液(包括鼻涕及痰)、胸膜液、膿、月經、陰道潤滑性分泌物(vaginal lubrication)、脂腺分泌物、腦脊髓液及滑液。在本申請案之上下文中，其他生物試樣可為(中空)身體器官之灌洗液(洗出液)(例如枝氣管肺泡灌洗液、胃灌洗液及腸灌洗液)。
在本申請案之上下文中，在替代實施例中，生物試樣係將執行診斷之個體的細胞試樣、最佳來自循環或病變組織之細胞試樣，更佳作為單一細胞懸浮液試樣。
特定而言，以上診斷分析可用於測定(ox)MIF是否涉及既定疾病。
因此，本發明亦係關於用於評估疾病進展之方法；在本發明上下文中術語「疾病狀態」意欲理解為與術語「疾病之嚴重程度」同義且係指疾病或病狀之嚴重性、程度或狀態(即，階段)。舉例而言，疾病可描述為輕度、中等或嚴重。嚴重性之程度或程度之測定或評估(即，疾病狀態)已為熟悉此項技術者所熟知。針對此過程之評估將實施之實際方法取決於所關注之疾病或病狀。舉例而言，可藉由將患有疾病之個體的存活可能性或時間長度與患有相同疾病之其他個體的存活可能性或時間長度相比較來測定疾病狀態。
在其他實施例中，可藉由將患有疾病之個體的疾病症狀與患有相同疾病之其他個體的症狀相比較來測定疾病狀態。在再另一實施例中，疾病狀態及其進展係由在一段時期內同一患者中症狀之改變來反映。
在再一較佳態樣中，本發明亦係關於選擇適合利用抗-(ox)MIF化合物治療之患者的方法，其中該個體患有(MIF相關)疾病或具有發展(MIF相關)疾病之風險，其包含檢測該個體中oxMIF之存在及/或oxMIF之含量及/或含量變化。oxMIF含量升高之個體可選擇用於利用以上所定義之抗(ox)MIF化合物之預防性或治療性治療。
術語「預防性」或「治療性」治療具有其業內認可之意義且係指將藥物投與給患者。若在不期望病狀(例如，宿主(例如人類或動物)之疾病或其他不期望狀態)之臨床表現之前投與，則該治療係預防性的，亦即其防止宿主發展不期望病狀，而若在表現出不期望病狀之後投藥，則該治療係治療性的(亦即，意欲減少、減輕或穩定既有不期望病狀或其副作用)。
如本文所用，抗(ox)MIF化合物係指減弱、抑制、對抗、抵消或降低(ox)MIF之生物活性的任一藥劑。抗(ox)MIF化合物可為抑制或中和(ox)MIF活性之藥劑，例如抗體，尤其較佳地本文所闡述之抗體、甚至更佳地抗體RAB9、RAB4及/或RAB0。
診斷分析可用於測定(例如)患者之體液試樣或細胞試樣中之oxMIF存在或含量。oxMIF之存在或不存在適用於辨別疾病是否係MIF相關的或以判定oxMIF治療是否合理。oxMIF含量指示疾病進展或治療效能。
本發明進一步係關於套組，其包含本發明之抗oxMIF抗體或其抗體結合部分。套組除抗體外亦可包括其他診斷性 或治療性藥劑及其使用。套組亦可包括用於診斷性或治療性方法之使用說明。
本發明進一步闡述於所附圖中。
定義及一般技術
除非本文中另外定義，否則結合本發明所使用之科學及技術術語應具有熟悉此項技術者通常所理解之含義。一般而言，結合本文所闡述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、基因及蛋白質及核酸化學使用之術語及該等技術係此項技術中熟知且通常使用之術語及技術。除非另外指明，否則本發明之方法及技術一般係根據此項技術中熟知且如在各種在整個本發明說明書中所引用及討論之一般及更特定參考文獻中所闡述之習用方法執行。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)；及Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，該等文獻以引用方式併入本文中。
「MIF」或「巨噬細胞遷移抑制因子」係指已知作為免疫及發炎反應中之關鍵介質且作為糖皮質激素之逆調節因子之蛋白質。MIF包括哺乳動物MIF、特定地人類MIF(Swiss-Prot主入藏號：P14174)，其中單體形式係編碼為 115個胺基酸之蛋白質，但由於初始甲硫胺酸之裂解，係作為114個胺基酸之蛋白質產生。「MIF」亦包括「GIF」(糖基化抑制因子)及MIF之其他形式，例如MIF之融合蛋白。MIF之胺基酸編號以N-末端甲硫胺酸(胺基酸1)開始且以C-末端丙胺酸(胺基酸115)結束。
「氧化MIF」或oxMIF出於本發明之目的係定義為藉由利用溫和氧化試劑(例如胱胺酸)處理MIF出現之MIF同型異構體。如本發明所展示，已以此方式處理之重組oxMIF包含MIF之同型異構體，其與(例如)用細菌攻毒動物之後在活體內出現之oxMIF共有結構重排。
redMIF出於本發明之目的係定義為經還原MIF且係不會結合至RAB0、RAB9及/或RAB4之MIF。
本發明中所闡述之抗oxMIF抗體能夠鑑別分別藉由輕度氧化或還原生成之oxMIF與red MIF，且可用於特定檢測oxMIF。該等構象異構體間之鑑別係藉由ELISA(例如如實例3.4中所闡述)或表面電漿共振法評估。
藉由Biacore評估抗體之差別結合性
oxMIF及redMIF對抗體RAB9及RAB0之結合動力學係使用Biacore 3000 System藉由表面電漿共振分析來測定。將抗體塗覆於CM5(=羧甲基化葡聚糖)晶片上，並注射與0.2% Proclin300一起預培養之重組MIF蛋白質。(Proclin300係由氧化性異噻唑酮組成，其藉由避免oxMIF轉化成redMIF來穩定oxMIF結構)。在未添加ProClin300之原始HBS-EP緩衝液(=Biacore運行緩衝液)中，沒有重組 MIF蛋白質結合至RAB9、RAB0或作為陰性(背景)結合對照之參考抗體(不相關同種型對照抗體)。
在較佳實施例中，oxMIF係會與抗體RAB9、RAB4及/或RAB0或其抗原結合片段產生差別性結合之MIF，此意味該等抗體的確會與oxMIF結合，而redMIF不會與該等抗體中之任一者結合。
在其他實施例中，抗oxMIF抗體(例如上文所提及之抗體或其抗體結合部分)係以小於100 nM之KD、較佳小於50 nM之KD、甚至更佳小於10 nM之KD結合oxMIF。尤其較佳地，本發明之抗體係以小於5 nM之KD結合至oxMIF。
抗體(例如RAB9、RAB4或RAB0)之(未)結合性(針對oxMIF或redMIF)可如熟悉此項技術者通常所知方法測定，實例係以下方法中之任一者：利用重組MIF之差別結合性ELISA或使用呈還原或氧化狀態之重組MIF的表面電漿共振法，如上文所闡述之熟知Biacore分析法。
測定結合性之較佳方法係抗體至(例如)rec.(ox)MIF之表面電漿共振，因此「結合」意欲由小於100 nM、較佳小於50 nM、甚至更佳小於10 nM之KD表示，而未結合至redMIF係以超過400 nM之KD為特徵。「結合」與「特異性結合」在本文中可互換使用以表示上述情況。在本申請案之上下文中，「差別結合」意指化合物、特定而言本文所述之抗體結合至oxMIF(例如以以上所提及之KD值)，而其不會結合至redMIF(其中不結合再次如上文所定義)。
「抗體」係指完整抗體或與完整抗體競爭(特異性)結合 之抗原結合部分。一般參見Fundamental Immunology，第7章(Paul,W.編輯，第2版，Raven Press，N.Y.(1989))(以引用方式併入本文中)。術語抗體包括人類抗體、哺乳動物抗體、經分離抗體及基因改造形式，例如嵌合、駱駝化或人類化抗體，但並不限於此。
術語抗體之「抗原結合部分」係指保持特異性結合至抗原(例如，(ox)MIF)之能力的一或多個抗體片段。抗原結合片段係藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶促或化學裂解產生。抗原結合部分包括但不限於(例如)以下：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv及互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體及含有抗體之至少一部分之抗體及多肽(該部分足以賦予該多肽以特異性抗原(即oxMIF或redMIF)結合之能力)。成熟輕鏈及重鏈可變結構域二者自N-末端至C-末端包含區FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。胺基酸在各結構域中之分配係按照Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda編輯(1987及1991))、Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)或Chothia等人，Nature 342：878-883(1989)之定義。抗體或其抗原結合部分可經衍生或鏈接至另一官能分子(例如，另一肽或蛋白質)。舉例而言，抗體或其抗原結合部分可功能上鏈接至一或多個其他分子實體，例如另一抗體(例如，雙特異性抗體或雙抗體)、可檢測試劑、細胞毒性劑、醫藥劑及/或鏈接分子。
術語「KD」根據熟悉此項技術者之一般知識在本文中係指特定抗體與各別抗原之平衡解離常數。此平衡解離常數量測較大對象(此處：複合物oxMIF或red MIF/抗體)分離之傾向，即，解離成較小組份(此處：oxMIF或redMIF及抗體)。
術語「人類抗體」係指可變結構域及恆定結構域係人類序列之任一抗體。該術語涵蓋具有源自人類基因但已經改變以(例如)降低可能之免疫原性、增加親和力、消除可能引起不期望摺疊之半胱胺酸等之序列的抗體。該術語涵蓋此等在非人類細胞中重組產生之抗體，其可產生(例如)人類細胞中並不常見之糖基化。
術語「人類化抗體」係指包含人類序列且含有非人類序列之抗體。
術語「駱駝化抗體」係指其中抗體結構或序列已經改變而更類似於來自駱駝之抗體的抗體，其亦稱為駱駝抗體。用於設計及產生駱駝化抗體之方法係熟悉此項技術者之一般知識的一部分。
術語「嵌合抗體」係指包含來自兩個或多個不同物種之區域的抗體。
術語「經分離抗體」或「其經分離之抗體結合部分」係指抗體或其抗體結合部分已經識別出並自抗體源(例如噬菌體展示文庫或B細胞目錄)選擇。
本發明抗(ox)MIF抗體之產生包括藉由基因改造生成重組DNA之任一方法，例如經由RNA之逆轉錄及/或DNA之擴增並選殖於表現載體中。在一些實施例中，載體係病毒 載體，其中額外DNA片段可接合於病毒基因組中。在一些實施例中，載體能夠於納入其之宿主細胞中自主複製(例如細菌載體具有細菌複製起點及附加型哺乳動物載體)。在其他實施例中，載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可在納入宿主細胞時整合於該宿主細胞之基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導與其可操作鏈接之基因的表現。本文將此等載體稱作「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。
抗(ox)MIF抗體尤其可借助習用表現載體(例如細菌載體(例如，pBR322及其衍生物)或真核載體)產生。編碼抗體之彼等序列可提供有調節複製、表現及/或自宿主細胞分泌之調節序列。該等調節序列包含(例如)啟動子(例如，CMV或SV40)及信號序列。表現載體亦可包含篩選及擴增標記，例如二氫葉酸還原酶基因(DHFR)、潮黴素-B-磷酸轉移酶及胸腺嘧啶-激酶。所用載體之組件(例如篩選標記、複製子、增強子)可自市場獲得或借助習用方法製備。該等載體可經構建用於在各種細胞培養物中表現，例如於哺乳動物細胞(例如CHO、COS、HEK293、NSO、纖維原母細胞)、昆蟲細胞、酵母或細胞(例如大腸桿菌)中。在一些情形中，使用允許最佳化所表現蛋白質之糖基化的細胞。
抗(ox)MIF抗體輕鏈基因及抗(ox)MIF抗體重鏈基因可插入單獨載體中或將該等基因插入相同表現載體中。藉由標準方法將抗體基因插入表現載體中，例如，將抗體基因片段上之互補限制位點與載體接合，或若不存在限制位點， 則利用鈍端接合。
抗(ox)MIF抗體或其抗原結合片段之產生可包括任何此項技術中已知藉由轉染(例如經由電穿孔或微注射)將重組DNA納入真核細胞中之任一方法。舉例而言，抗(ox)MIF抗體之重組表現可藉由以下達成：藉由適當轉染方法在一或多個調節序列(例如強啟動子)之控制下將含有抗(ox)MIF抗體編碼DNA序列之表現質粒納入適宜宿主細胞系中，此使得細胞具有穩定整合至基因組中之納入序列。脂質轉染方法係根據本發明可使用之轉染方法之實例。
抗(ox)MIF抗體之產生亦可包括此項技術中已知用於(例如)以連續或分批方式培養該等轉化細胞並表現抗(ox)MIF抗體(例如組成型表現或在誘導時表現)之任一方法。特定提及WO 2009/086920以進一步參考抗(ox)MIF抗體之產生。在較佳實施例中，如本發明所產生之抗(ox)MIF抗體結合至oxMIF或其表位。尤其較佳地，本發明之抗體係抗體RAB9、RAB4及/或RAB0以及RAM9、RAM4及/或RAM0。
該等抗體之序列亦部分地揭示於WO 2009/086920中；另外參見此專利申請案之序列表及以下：
RAB9之輕鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：1：
RAB4之輕鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：2：
RAB0之輕鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：3：
RAB2之輕鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：4：
RAB9之重鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：5：
RAB4之重鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：6：
RAB0之重鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：7：
RAB2之重鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：8：
RAM0hc之胺基酸序列SEQ ID NO：9：
RAM0lc之胺基酸序列SEQ ID NO：10：
RAM9hc之胺基酸序列SEQ ID NO：11：
RAM9lc之胺基酸序列SEQ ID NO：12：
RAM4hc之胺基酸序列SEQ ID NO：13：
RAM4lc之胺基酸序列SEQ ID NO：14：
本發明之抗MIF抗體較佳係經分離單株抗體。抗MIF抗體可係IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在其他實施例中，抗MIF抗體係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子類。在其他實施例中，抗體係子類IgG1或IgG4。在其他實施例中，抗體係子類IgG4。在一些實施例中，IgG4抗體具有將絲胺酸(絲胺酸228，根據Kabat編號方案)更改為脯胺酸之單一突變。因此，IgG4之Fc區中之CPSC子序列變為CPPC，其係IgG1中之子序列(Angal等人，Mol Immunol.1993,30,105-108)。
另外，抗(ox)MIF抗體之產生可包括此項技術中已知用於純化(例如經由陰離子交換層析或親和層析)抗體之任一方法。在一個實施例中，抗(ox)MIF抗體可藉由大小排除層析自細胞培養上清液純化。
術語MIF之「中心區」及「C-末端區」係指分別包含胺基酸35-68及aa 86-115之人類MIF區、較佳分別包含人類MIF之aa 50-68及aa 86-102。
本發明之尤其較佳抗體結合至人類MIF之區域aa 50-68或區域aa 86-102。此亦由較佳抗體RAB0、RAB4、RAB2及RAB9以及RAM4、RAM9及RAM0之結合來反映，其結合如下：RAB4及RAM4：aa 86-102 RAB9及RAM9：aa 50-68 RAB0及RAM0：aa 86-102 RAB2：aa 86-102
術語「表位」包括能夠特定結合至免疫球蛋白或抗體片段之任一蛋白質決定簇。表位決定簇通常由分子之化學活性表面基團(例如，暴露之胺基酸、胺基糖或碳水化合物側鏈)組成，且其通常具有特定三維結構特性以及特定電荷特性。
術語「載體」係指能夠轉運與其鏈接之另一核酸之核酸分子。在一些實施例中，載體係質粒，即額外DNA片段可接合至其之環狀雙鏈DNA環。
術語「宿主細胞」係指細胞系，其能夠在納入表現載體之後產生重組蛋白。術語「重組細胞系」係指重組表現載體已納入其中之細胞系。應瞭解，「重組細胞系」不僅指特定個體細胞系，而且指此細胞系之子代。由於突變或環境影響可使後續各代發生某些改變，因此此子代實際上不可能與母細胞相同，但仍包括於本文所用術語「重組細胞系」之範圍內。
根據本發明之宿主細胞類型係(例如)COS細胞、CHO細 胞或(例如)HEK293細胞或熟悉此項技術者已知之任一其他宿主細胞，因此亦包括例如細菌細胞(例如大腸桿菌細胞)。在一個實施例中，抗MIF抗體表現於DHFR缺乏CHO細胞系，例如DXB11，且添加G418作為篩選標記。當將編碼抗體基因之重組表現載體納入CHO宿主細胞中時，藉由將宿主細胞培養足以允許抗體在宿主細胞中表現或使抗體分泌至宿主細胞生長之培養基中之一段時間來產生抗體。
抗(ox)MIF抗體可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收。
在本發明上下文中，「MIF相關疾病」一般係指傳染性疾病、發炎、自體免疫性、癌症、細胞分化及動脈粥樣化形成。MIF相關疾病係例如I型及II型糖尿病、急性肺損傷、哮喘、同種異體移植排斥、移植物對抗宿主疾病、傷口癒合波動及發炎性腸病。此外，癌症係MIF相關疾病。特定而言，MIF相關癌症係淋巴瘤、肉瘤、前列腺癌及結腸癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肝細胞癌、卵巢癌、乳癌及胰腺癌。
此外，動脈粥樣硬化係MIF相關疾病。
其他MIF相關疾病係類肉瘤病、硬皮症、牛皮癬、(潰瘍性)結腸炎、以及異位性皮炎、以及敗血性休克、遲發型過敏症、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、多發性硬化、胰腺炎及缺血性心臟損傷。
MIF相關之免疫及發炎性病症係革蘭氏陽性敗血症(例如綠膿桿菌(P.aeruginosa)感染或敗血症)、DTH、腎小球性 腎炎、關節炎、佐劑型關節炎、幼年型關節炎、(自體免疫性)腦脊髓炎/腦炎、(自體免疫性)心肌炎、過敏性腦炎、胃炎、結腸炎；(免疫性)腎小球性腎炎；肺炎、中毒性休克症候群、病毒感染、肺結核、B型肝炎、登革熱(dengue fever)；寄生蟲性或蠕蟲性MIF相關感染，特定而言瘧疾、利什曼體病(leishmaniasis)、錐蟲病、弓蟲病、變形蟲症(amoebiasis)、血吸蟲病、囊尾幼蟲症、旋毛蟲病(trichenellosis)及絲蟲病；腎病，例如白血球介導之腎損傷、非增殖性腎病、增殖性腎病、腎同種異體移植排斥及芬蘭(Finnish)型先天性腎病症候群、腎炎、腎病(如尿酸性腎病及高血壓性腎病)、輸尿管阻塞及糖尿病性腎病。
神經性病變疼痛係另一MIF相關疾病。
根據本發明欲診斷之最佳疾病係：腎小球性腎炎、敗血症、淋巴瘤、狼瘡性腎炎、牛皮癬、潰瘍性結腸炎及眼科病狀、以及伯奇氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、白血病、前列腺癌、胰腺癌及卵巢癌。
本發明之一個重要態樣係關於檢測個體試樣中之oxMIF；此檢測將允許(例如)熟練的從業者測定MIF是否係折磨所關注個體之疾病或病症之治療重要組份。此測定將幫助其判定(額外)抗(ox)MIF治療是否將對所關注個體有益。
oxMIF亦可用作標記以測定既定個體之一般健康或疾病狀態；升高之oxMIF含量將使得發現該個體遭受MIF相關疾病；oxMIF由此可用作個體之健康/疾病狀態之(二級)一 般標記，此類似於(例如)測定目前廣泛用作此(二級)標記之C-反應蛋白(CRP)。
直接對抗促發炎性細胞因子oxMIF(巨噬細胞遷移抑制因子)之活體內保護性抗oxMIF mAb之子集(例如RAB9、RAB4及RAB0)並不結合至呈其還原狀態之未修飾MIF(稱為redMIF)。相比之下，該等mAb展示對氧化還原依賴性MIF同型異構體(稱為oxMIF)具有高選擇性。已展示，oxMIF並不存在於健康個體及動物之血液中。亦已展示，oxMIF並不存在於健康個體及動物之細胞表面上。根據本發明且藉由本文所闡述之方法，oxMIF僅能在疾病發作之後檢測出。然後展示oxMIF(即，疾病發作之後)出現於循環系統中或細胞表面上。換言之，本發明者已展示，在循環系統中在患有MIF相關疾病之人類或動物患者之試樣中，oxMIF明顯增加(即，可檢測)。亦已展示，在遭受MIF相關疾病之細胞表面上，oxMIF急劇增加(且因此可檢測)。根據本發明，檢測患者中之oxMIF提供關於疾病進展之有益資訊及治療性干預。因此，oxMIF可用作診斷標記且本文所闡述之方法將能夠在MIF相關疾病期間監測oxMIF，例如個體(例如人類)患有發炎性病狀或疾病狀態(例如癌症)。
基於上述發現，本發明係關於oxMIF在MIF相關疾病之診斷中作為標記之用途。oxMIF較佳係MIF，其差別結合(如本文以上所定義)至抗體RAB9、RAB4及/或RAB0。如上文所解釋且實驗部分中、特定而言實例章節所展示，本 發明者首次展示oxMIF係MIF之同型異構體，其係在MIF相關疾病之患者試樣發現，而在正常健康對照中未發現(即，如上文所定義存在)。因此，oxMIF最適宜作為診斷MIF相關疾病之標記。如本發明所展示，oxMIF、特定而言其數量亦與疾病狀態及/或其進展相關聯；在此說明書之上下文中，「診斷」涵蓋檢測疾病、評估疾病狀態及監測疾病進展，其亦允許監測治療性治療之效能。
在較佳實施例中，該等MIF相關疾病使用oxMIF作為標記之診斷將涵蓋結合至oxMIF之化合物用於檢測oxMIF之其他用途。
差別結合oxMIF之該等化合物可為差別結合至oxMIF之抗體或小分子。
可用於本發明之診斷分析可為熟悉此項技術者熟知之任一診斷分析。特定而言，診斷分析可以(例如)ELISA格式、夾心(ELISA)格式且使用FACS、免疫螢光、免疫組織化學及所有其他適宜方法(所有該等均為此項技術熟知)來實施。
本發明將藉由實例方式在下文中闡述，藉此實例將決不能視為限制本發明。
參照實例
A)用於抗體篩選之GCO分析：
將THP1懸浮培養物離心並以106個細胞/ml之細胞密度將細胞重新懸浮於新鮮的完全培養基中。將此培養物轉移至96孔微板之孔(90 μl/孔)中並添加潛在抗MIF抗體至最終濃 度為75 μg/ml。每一抗體一式三份進行測試。於37℃下o/n培養後，添加地塞米松(dexamethasone)以獲得2 nM之濃度，且於37℃下培養1小時後添加LPS(3 ng/ml最終濃度)。於37℃下再培養6小時後，收穫上清液並於市售ELISA中測定IL-6濃度。將一式三份實驗之結果平均並與對照抗體相比測定IL-6分泌之百分數。使IL-6分泌小於75%之抗體評估為陽性。
B)用於測定IC50值之分析
實驗程序係如針對篩選分析所闡述來實施，只是所用抗體之量增加(通常1-125 nM)。所得劑量反應曲線表示為與陰性對照抗體相比之抑制%。此曲線用於計算抗體之最大抑制效應(抑制最大值%)及展示50%最大抑制效應之抗體濃度(IC50)。
C)細胞增殖之抑制
血清刺激靜止NIH/3T3中之MIF分泌且MIF進而刺激細胞增殖。因此，抑制此內源性MIF之抗體降低靜止NIH/3T3細胞之增殖。藉由併入3H-胸腺嘧啶測定增殖之減小。
以每孔1000個NIH/3T3細胞於96孔板於37℃下在含有10%血清之培養基中培養整個週末。然後於37℃下藉由於含有0.5%血清之培養基培養過夜使細胞饑餓。然後移除0.5%培養基並更換為含有10%血清、75 μg/ml抗體及5μCi/ml 3H-胸腺嘧啶之新鮮培養基。於CO2培養器中於37℃下培養16小時後，將細胞用150 μl冷PBS/孔洗滌。使用多通道移液管添加150 μl 5%(w/v)TCA溶液/孔並於4℃下培 養30分鐘。將板用150 μl PBS洗滌。每孔添加75 μl含有0.5% SDS之0.5M NaOH溶液，混合並於室溫下儲存。在β-計數器中藉由將5 ml Ultima Gold(Packard)與75 μl試樣溶液混合來量測試樣。每一測定一式三份進行並藉由t-測試將該等值與對照抗體之值比較。將明顯減小增殖(P<0.05)之抗體評估為陽性。
D)結合研究：抗MIF抗體之表位測定
將每一肽稀釋於偶合緩衝液中以獲得通常1 μg/ml之肽濃度，將其添加於微板(NUNC ImmobilizerTM Amino Plate F96 Clear)並於4℃下培養過夜(100 μl/孔)。作為對照，使用重組全長MIF及PBS。將板用200 μl PBST洗滌3次並添加抗體(2-4 μg/ml於PBS中)(100 μl/孔)，並於室溫下在輕柔振盪的同時培養2小時。將板用200 μl PBST洗滌3次並添加檢測抗體(例如經Fc特異性抗人類IgG/HRP標記，Sigma)(100 μl/孔)。於室溫下在輕柔振盪的同時培養1小時之後，將板用200 μl PBST洗滌3次。每一孔利用100 μl TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)溶液(T-0440,Sigma)於黑暗中培養30分鐘。藉由添加100 μl 1.8 M H2SO4溶液/孔終止染色反應。於450 nm下量測試樣。
E)藉由Biacore對抗MIF抗體之Fab片段進行親和性測定
通常，利用CM5(=羧甲基化葡聚糖)基質(Biacore)將40 RU單位之人類重組MIF固定於感應器晶片上。以通常6-100 nM(稀釋於HBS-EP中)之濃度範圍注入Fab片段。每一循環之後，晶片利用50 mM NaOH+1 M NaCl再生。根據 1：1朗繆耳模型(Langmuir model)計算親和力。
實例
本發明實例係關於若干特異性抗體僅結合至oxMIF、但不結合至呈還原狀態之未修飾MIF之發現。此係在使用模擬製劑用化學品輕度氧化重組MIF之後藉由ELISA來檢測氧化MIF展示，經還原MIF及未經處理之MIF作為對照；此實驗係在活體外實施，且明顯展示oxMIF由特異性抗體結合，而對照MIF未被結合。
抗oxMIF抗體RAB4、RAB9及RAB0展示不能以生理相關濃度結合至呈還原狀態之MIF。與此相比，在活體外已展示，MIF之輕度氧化(例如利用L-胱胺酸)可將MIF分子轉化成抗體結合同型異構體。在脊椎動物系統及細胞系(例如永生化細胞系、來自小鼠之血漿、來自大鼠之尿液以及來自人類供體之血漿及尿液)中針對oxMIF形式之基於抗體之篩選揭露，該等抗體反應性MIF同型異構體之出現與疾病相關過程(例如發炎及贅瘤形成)有關。此係為何該等抗體可作為用於(例如)天然存在之疾病相關oxMIF形式之診斷性檢測及用於監測疾病進展之工具。
本發明者亦已首次展示可獲得oxMIF之假陽性結果。據推測，MIF蛋白質可藉由溶血性血液試樣中之氧化還原活性鐵及血紅素轉化成oxMIF，且MIF可在添加氧化劑時在生物試樣中轉化成oxMIF。
因此根據避免假陽性結果之較佳實施例，建議避免添加(例如)氧化劑及使氧化還原活性鐵及血紅素失活。
舉例而言，需要專門之取樣程序用於分析在血液中循環之MIF。對於總體及oxMIF之分析而言，較佳係檸檬酸化血漿；為避免假陽性信號，在較佳實施例中，試樣必須藉由以下步驟來製備：
將來自新鮮血漿之檸檬酸化血漿(於+4℃下儲存不超過12 h)於40 g下離心5 min。上清液必須轉移至新試管中並於2000 g下再次離心3 min。無細胞之上清液必須再次轉移至新試管中並於16000 g下離心3 min。在三個離心步驟之後，可將無細胞上清液儲存於-80℃下或直接用於(ox)MIF之分析。
若應關於(ox)MIF分析血清，較佳在冷凍儲存之前或在運行MIF ELISA之前亦必須藉由同樣的三個離心步驟移除細胞及不溶性片段。
尿液試樣中之沈澱物亦較佳必須在用於MIF ELISA中之前藉由離心步驟(16000 g達5 min)移除。一般而言，生物流體(例如淚液、唾液)中存在之細胞及其他普通粒子必須預先藉由離心步驟移除且然後儲存用於測試(ox)MIF。
此外，本發明者可展示經變性之MIF係由特異性結合至oxMIF之抗體識別。因此，極為重要的是對於oxMIF之分析，MIF蛋白質必須在試樣製備期間(例如體液之分離及製備期間)保持其天然構象；因此，必須在分析期間避免變性條件/步驟(例如沸騰、固定(於薄膜、塑膠(板)或晶片))及化學處理(例如利用還原劑、氧化劑及有機溶劑)，以使MIF蛋白質保持其天然構象並避免假陽性/陰性結果。
對於細胞表面上之oxMIF的分析，較佳使用流式細胞術分析。尤其重要的是在試樣製備期間試樣不能經歷溶血作用。因此，用於本發明流式細胞術分析之所有試樣經製備而沒有將導致試樣內之細胞發生溶血作用之任一步驟。
實例1：oxMIF特異性抗體(例如RAB0-或RAB4-抗體)之製備：
抗體係在哺乳動物細胞中、優選地在CHO細胞中、優選地在編碼MIF之基因(內源性CHO-MIF)已以基因方式敲除之CHO細胞中產生。在敲除細胞中，可消除內源性CHO-MIF對抗體之污染，此係可增強分析之敏感性所需的。
通常，oxMIF特異性抗體係以分批發酵方法使用至多25 L體積之可棄式生物反應器(波系統)產生。將具有分別編碼所產生抗體之重鏈及輕鏈之基因的穩定CHO細胞系接種於PowerCHO培養基(Invitrogen公司)中並於37℃下及5% CO2中培養。
在一個實例性生產方法中，使用包含以DSM 25114及DSM 25115寄存之質粒的CHO敲除細胞系。
在培養期間，各別人類抗體係連續地表現於細胞培養基中。在培養結束時(生存力<50%)，藉由常用離心及過濾步驟分離細胞。藉由超濾濃縮澄清細胞培養上清液(ccs)並用於純化抗體。
藉由蛋白質A親和層析(MabSelect Sure,GE Healthcare)自濃縮ccs純化人類抗體。在用5管柱體積(cv)之20 mM磷酸鈉運行緩衝液(pH 7)使蛋白質A材料平衡之後，將同種 型對照之濃縮上清液完全施加至親和管柱。利用運行緩衝液洗滌出雜質或不期望蛋白質。藉由使用100 mM甘胺酸(pH 3)使pH移位來溶析抗體並針對250 mM甘胺酸緩衝液(pH 5)進行透析。
另一選擇為，將濃縮細胞培養上清液施加至預先用5 cv之20 mM Tris/HCl緩衝液平衡之蛋白質A管柱，該緩衝液包括150 mM氯化鈉緩衝液及0.1%吐溫80(Tween 80)且pH 7。藉由以下兩個洗滌步驟洗滌掉雜質：1.)添加於平衡緩衝液中之1 M NaCl及2.)包括0.1%吐溫80之100 mM磷酸鈉(pH 5)。將RAB0抗體藉由包括0.1%吐溫80之100 mM甘胺酸緩衝液(pH 3)溶析且然後針對250 mM甘胺酸緩衝液(pH 5)透析。
實例2：多株及親和性純化之多株兔抗hu MIF抗體之製備
1.)重組人類MIF(huMIF)之產生
重組huMIF係在包括表現系統之大腸桿菌細胞中利用人類MIF序列產生。將新解凍之細胞於補充有胺苄西林(Ampicillin)之Luria Bertani培養基(LB/Amp)中，於+37℃下培養過夜。在第二天，細菌細胞培養物用等體積之新鮮LB/Amp培養基稀釋並藉由添加IPTG(最終濃度：1.0 mM)於30℃下誘導表現達4小時。藉由離心收穫細菌沈澱物並儲存於-15℃下。
為進一步純化胞內人類MIF蛋白質，將冷凍細菌沈澱物重新懸浮於20 mM Tris/HCl緩衝液(pH 7.8)中並藉由玻璃珠機械破壞細胞。藉由離心並使用常用0.2 μm過濾器過濾移 除細胞碎片。將上清液直接施加至陰離子交換層析管柱(HiTrap 26/16 DEAE FF,GE Healthcare,Waukesha,USA)並藉由被動結合模式純化MIF。取流出物於20 mM Bis/Tris pH 6.3中再度緩衝，並藉由陽離子交換層析(Source 30S,GE)進一步純化。藉由50 mM NaCl於20 mM Bis/Tris緩衝液(pH 6.3)中之鹽梯度溶析高純度人類MIF。最後，將經純化人類MIF再次針對PBS再度緩衝，藉由超濾濃縮並分析純度及功能性特徵。
2.)多株兔抗huMIF抗體於紐西蘭白兔(New Zealand White rabbits)中之免疫程序
對於初次免疫而言，將稀釋於100 μl PBS中之25 μg重組人類MIF與100 μl CFA(完全弗氏佐劑(Complete Freunds Adjuvants))混合。將200 μl(4×50 μl)混合物皮下(s.c.)施加至每一兔之不同身體部分。初次免疫之後2-3週實施第一次追加接種，其中將25 μg重組人類MIF(懸浮於100 μl PBS中)與100 μl IFA(不完全弗氏佐劑)混合。再次，將200 μl(4×50 μl)混合物皮下施加至每一兔之不同身體部分。第一次追加接種之後2-3週執行第二次追加接種，將25 μg重組人類MIF(懸浮於100 μl PBS中)與100 μl IFA(不完全弗氏佐劑)混合。再次，將200 μl(4×50 μl)混合物皮下施加至每一兔之不同身體部分。第二次追加接種之後2週結束免疫程序。通常，將來自多隻兔之血漿彙集並用於分離抗MIF抗體。
3.)多株兔抗huMIF抗體之蛋白質A純化及huMIF-親和純 化程序
兔抗huMIF抗體自免疫血漿之分離通常藉由兩個親和層析步驟實施。首先，藉由蛋白質A親和管柱(MabSelect Sure,GE Healthcare)純化血漿。為此，將兔血漿用20 mM Na2HPO4緩衝液(pH 7.0)以1：3稀釋並施加至親和管柱。洗滌步驟(5管柱體積，利用20 mM Na2HPO4緩衝液，pH 7.0)之後，利用100 mM甘胺酸(pH 2.8)實施總兔IgG之溶析。將溶析液彙集並使用1 M Tris/HCl中和至pH 7.0。對於hu-MIF親和純化，將總兔IgG用20 mM Na2HPO4緩衝液(pH 7.0)以1：3再次稀釋並施加至5 ml NHS-親和管柱(GE Healthcare)，其如供應商所推薦與25 mg rhuMIF偶合。洗滌步驟(5管柱體積，利用20 mM Na2HPO4緩衝液，pH 7.0)之後，利用100 mM甘胺酸(pH 2.8)實現特異性兔抗huMIF抗體之溶析。將溶析液彙集並使用1 M Tris/HCl中和至pH 7.0。最後，將hu-MIF親和性純化之特異性兔抗人類MIF抗體(在下文中「抗人類MIF親和性純化之多株抗體」)針對PBS透析並儲存於-20℃下。
實例3：檢測自患者或自動物疾病模型所獲得試樣中之oxMIF： I.敗血症 實例3.1：大腸桿菌攻毒小鼠之血漿中之oxMIF
吾人試圖在腹膜炎小鼠之血漿試樣中尋找全身性oxMIF形式，該等小鼠已經用2000 cfu(菌落形成單位)革蘭氏陰性病原性大腸桿菌菌株O111：B4進行攻毒。在攻毒後21 h 獲得健康小鼠(用PBS處理)及患病小鼠之血液試樣，並針對oxMIF對血漿進行分析。
方法
將微量滴定板用抗oxMIF抗體RAB0或RAB4塗覆。利用親和性純化之多株兔抗小鼠MIF抗體及市售HRP偶聯山羊抗兔IgG檢測MIF。抗體係如實例2中所闡述以類似方式獲得，但與實例2相比，兔抗moMIF抗體係藉由經重組moMIF免疫之兔闡述並藉由親和層析針對蛋白質A及MIF(如實例2中所闡述之相同程序)純化。為量化來自血漿試樣之反應性MIF，藉由將未經處理之重組moMIF與含有0.2%殺生物劑Proclin300(Sigma Aldrich)之緩衝液(=ELISA稀釋緩衝液)混合製備oxMIF標準物。Proclin300係由誘導/保存結合oxMIF結構之氧化性異噻唑酮組成。所有板均用TMB(Sigma-Aldrich)顯色並在用3M H2SO4終止反應之後在ELISA讀取器中量測OD。
結果
圖1A(圖1B)。
來自7個不同動物實驗之血漿的分析已揭露總MIF及oxMIF含量有相當大差異。然而，在PBS處理對照小鼠(健康對照)之血漿中從未檢測到oxMIF，而在來自敗血症小鼠之血漿中幾乎總是檢測到oxMIF。來自7個不同實驗之範圍值已匯總於表1中。
圖1展示一個其中僅在敗血症小鼠中檢測出oxMIF之代表性實驗及小鼠間之oxMIF含量變化(圖1A)。在此實驗中，僅一個小鼠之血漿中的總MIF含量升高且在此小鼠中總MIF之顯著部分係oxMIF(圖1A及1B，小鼠E6)，由此證實oxMIF係比總MIF更好之急性敗血症之較佳診斷標記。
總結
總MIF存在於健康對照小鼠及菌血症小鼠中，但oxMIF含量比總MIF含量更佳的與疾病階段相關聯。
實例3.2：來自大腸桿菌攻毒小鼠之細胞的細胞表面上之oxMIF
已藉由流式細胞術分析來自腹膜炎小鼠(或僅注射PBS之對照小鼠)之免疫細胞的oxMIF。
方法
將來自PBS或大腸桿菌攻毒小鼠之血液於細胞染色緩衝液(Biologend)中染色，該細胞染色緩衝液具有Alexa700標記之抗CD3ε(針對T細胞)及PerCP-Cy5.5標記之抗Ly6G(針對顆粒性白血球)或APC標記之抗CD14(針對單核白血球)及PE-Cy7標記之抗CD19(針對B細胞)且平行含有300 nM RAB9或對照IgG。洗滌之後，使用山羊R-PE標記之抗人類 IgG抗體檢測人類抗體。洗滌之後，用BD FACSTM溶血液(Becton Dickinson,Franklin Lakes,USA)溶解紅血球。數據獲取係使用FACSTM Canto II(Becton Dickinson)利用DIVATM軟體(軟體版本6；Becton Dickinson)執行並使用FlowJoTM軟體(Treestar,Ashland,OR,USA)分析數據。
結果
分析來自腹膜炎小鼠之血球表面上oxMIF之存在。在攻毒(即，對於對照組利用PBS且對於腹膜炎小鼠利用2000CFU大腸桿菌)後1 h、3 h或21 h藉由心臟穿刺收穫血液。利用RAB9對全血執行染色且在分析之前使紅細胞溶解。圖2展示對照小鼠(F)及攻毒小鼠(E)在不同時間點超過對照IgG抗體(黑色線)之直方圖。在對照小鼠中，對於顆粒性白血球-單核白血球族群及淋巴球二者，陽性細胞並未明顯檢測到RAB9。淋巴球之表面上並未檢測到oxMIF，但在攻毒後剛剛1 h且直至21 h在顆粒性白血球(GR1標記)及單核白血球(CD14標記)二者之表面上存在oxMIF。
匯總及結論
在小鼠之腹膜炎模型中，吾人已能夠展示在感染時間期間顆粒性白血球及單核白血球之表面上存在oxMIF，且吾人已展示在PBS處理之動物中未發現oxMIF。該等結果表明，oxMIF係在感染過程中出現但在健康個體中不存在之標記。
實例3.3：菌血症患者之血清中oxMIF之檢測
自加護病房(intensive care unit,ICU)中治療之菌血症患 者獲得檸檬酸化血液之血漿試樣且已分析其MIF及oxMIF含量。
材料及方法
總MIF及oxMIF二者係使用相同ELISA設置來檢測：將微量滴定板用人類抗MIF單株抗體RAB0塗覆並利用親和性純化之多株兔抗體抗人類MIF實施監測。最後，在HRP偶聯之山羊抗兔(BioRad,Cat.：171-6516)(同樣可使用此項技術中已知之任一其他山羊抗兔)與TMB受質(顯色受質，如上文所定義；亦可使用任一其他適宜受質，如熟悉此項技術者已知)一起培養之後，於450 nm下實施ELISA之讀出。利用藉由添加0.2% ProClin300由redMIF之氧化步驟新製得之重組人類oxMIF實施ELISA之校正。將標準物稀釋於包括0.2% ProClin300及4%人類對照血漿之0.5%魚膠/PBS中。校正曲線之範圍係10 ng/ml至0.156 ng/ml。將所測試人類血清試樣以1：25稀釋於0.5%魚膠/PBS(pH 7.2)中用於oxMIF ELISA，或在Proclin300之存在下用於總MIF ELISA，以將血漿中存在之每一經還原MIF分子轉化成oxMIF。
結果
自於ICU中治療敗血症之患者(n=6)獲得檸檬酸化血液之血漿試樣。性別、年齡、感染細菌及治療所有均不同。圖3展示於患者以及一個健康供體之血漿或來自健康供體之50份血漿試樣之彙集物中所檢測之總MIF及oxMIF含量。在每一試樣中均存在總MIF，但在6個菌血症患者中僅2個 檢測出oxMIF。
總結
oxMIF可在一些所測試菌血症患者(6個中有2個)之血漿中檢測出，但在健康供體之血漿中未檢測出。oxMIF可用作敗血症之標記。
II.牛皮癬 實例3.4：於牛皮癬患者之血清中檢測oxMIF
已分析自牛皮癬患者收集之血清試樣的oxMIF含量。血清係自利用全身性抗牛皮癬療法之患者在不同時間點(開始、12週及24週)獲得。
材料及方法
藉由夾心法ELISA量測血清中之oxMIF：
將微量滴定板用單株全人類抗oxMIF抗體RAB0塗覆。將人類血清試樣以1：25稀釋於0.5%魚膠/PBS(pH 7.2)中。利用藉由添加0.2% ProClin300新製得之重組人類oxMIF實施ELISA之校正。將標準物稀釋於0.5%魚膠/PBS中，其包括0.2% ProClin300及4%人類對照血漿(即，來自50個健康供體之血清試樣彙集物)。校正曲線之範圍係10 ng/ml至0.156 ng/ml。將板洗滌之後，藉由親和性純化之多株兔抗人類MIF抗體(兔抗huMIF，不能辨別redMIF與oxMIF)及HRP標記之山羊抗兔抗體檢測藉由塗層抗體捕獲之oxMIF。TMB係用作顯色受質，利用H2SO4終止顯色反應並於450 nm下量測ELISA板。所有試樣、標準物及對照均一式兩份實施。
結果
吾人能夠檢測到在患牛皮癬患者之血清中oxMIF含量增加。在利用全身性免疫調節劑治療期間，oxMIF含量之降低與患者狀況之改善相關聯(圖4)。
總結
已在牛皮癬患者之血清試樣中檢測到oxMIF含量。此意味著oxMIF在慢性或急性發炎性皮膚疾病(例如牛皮癬)中極為敏感，且亦可用作疾病嚴重程度之標記並在全身性抗牛皮癬療法期間監測疾病發展。
III.腎炎 實例3.5：建立增殖性腎小球性腎炎之後大鼠尿液中之oxMIF
材料及方法
用於增殖性腎小球性腎炎之大鼠模型：
藉由施加單一靜脈注射兔抗大鼠腎小球基底膜血清(=腎中毒血清，NTS)誘導增殖性腎小球性腎炎之後，Wistar Kyoto(WKY)大鼠之尿液中oxMIF含量(Tam FWK,Nephrol Dial Transplant,1999,1658-1666)。在誘導疾病之前使用代謝籠收集尿液試樣。在疾病誘導4天及6天之後，將大鼠用人類對照抗體或不同劑量之人類抗oxMIF抗體RAB9治療。在第8天處死動物之前實施第二次尿液取樣用於組織學評估。尿液中所量測之oxMIF含量與諸如蛋白尿或腎臟之組織學數據(半月體形成及巨噬細胞浸潤)等其他疾病參數相關聯。
藉由夾心法ELISA量測尿液中之oxMIF
將微量滴定板用單株全人類抗oxMIF抗體RAB0塗覆。將尿液試樣以1：10稀釋於2% BSA/TBST pH 7.2中。對於標準校正曲線而言，藉由添加0.2% ProClin300修飾重組moMIF蛋白質並將標準物稀釋於包括0.2% ProClin300之2% BSA/TBST中。藉由親和性純化之多株抗小鼠MIF抗體(兔抗moMIF，如實例3.1中所闡述)及HRP偶聯之山羊抗兔抗體達成檢測。TMB係用作顯色受質，利用H2SO4終止顯色反應並於450 nm下量測ELISA板。所有試樣、標準物及對照均一式兩份實施。
結果
在疾病誘導之前，oxMIF之平均含量並未明顯高於0。在疾病誘導之後4天，可檢測到顯著含量之oxMIF。在疾病進展期間，第8天直至333 ng/天(平均130 ng/天)，未治療對照組中尿液oxMIF含量增加。在第8天，抗MIF抗體治療組中oxMIF之平均含量與未治療組相比降低約70%(參見圖5A)。治療組中oxMIF含量之降低與減小之疾病參數(例如蛋白尿及巨噬細胞浸潤)相關聯(圖5B)。
總結
尿液中oxMIF之含量與增殖性腎小球性腎炎之動物模型中之疾病狀態相關聯。投與抗oxMIF抗體RAB0之後，oxMIF含量明顯減小。因此，吾人得出結論：oxMIF之量測適宜作為監測腎炎之疾病進展及治療有效性之診斷標記。
實例3.6：狼瘡性腎炎患者之尿液及血漿中的oxMIF
自處於不同疾病階段之狼瘡性腎炎患者收集尿液及血漿試樣。將每一試樣於-20℃下冷凍儲存並於乾冰上輸送。
材料及方法
oxMIF特異性抗體之製備：
使用如實例1中所闡述之相同抗體製備物。
藉由夾心法ELISA量測尿液中之oxMIF：
將微量滴定板用單株全人類抗oxMIF抗體RAB0塗覆。將人類尿液試樣以1：10稀釋於0.5%魚膠/PBS(pH 7.2)中。利用藉由添加0.2% ProClin300新製得之重組人類oxMIF實施ELISA之校正。將標準物稀釋於0.5%魚膠/PBS中，其包括0.2% ProClin300及10%人類對照尿液(即，來自>10個健康供體之尿液試樣彙集物)。將板洗滌之後，藉由親和性純化之多株兔抗人類MIF抗體(兔抗huMIF，不能辨別redMIF與oxMIF)及HRP標記之山羊抗兔抗體檢測藉由塗層抗體捕獲之oxMIF。TMB係用作顯色受質，利用H2SO4終止顯色反應並於450 nm下量測ELISA板。所有試樣、標準物及對照均一式兩份實施。
藉由夾心法ELISA量測血漿中之oxMIF：
將微量滴定板用單株全人類抗oxMIF抗體RAB0塗覆。將人類血漿試樣以1：20稀釋於0.5%魚膠/PBS(pH 7.2)中。利用藉由添加0.2% ProClin300新製得之重組人類oxMIF實施ELISA之校正。將標準物稀釋於0.5%魚膠/PBS中，其包括0.2% ProClin300及5%人類對照血漿(即，150個健康供體之 血漿試樣彙集物)。校正曲線之範圍係10 ng/ml至0.156 ng/ml。將板洗滌之後，藉由親和性純化之多株兔抗人類MIF抗體(兔抗huMIF，不能辨別redMIF與oxMIF)及HRP標記之山羊抗兔抗體檢測藉由塗層抗體捕獲之oxMIF。TMB係用作顯色受質，利用H2SO4終止顯色反應並於450 nm下量測ELISA板。所有試樣、標準物及對照均一式兩份實施。
結果
圖6A中所繪示之數據展示尿液中所檢測oxMIF之量與疾病之狀態(階段)之間之明顯相關性。在健康對照之尿液中所測定oxMIF之平均含量並未明顯高於0。然而，疾病狀態越嚴重，尿液中所測定之平均oxMIF濃度越高。
經診斷患有狼瘡性腎炎之急性患者的oxMIF含量係在第一次觀察日、診斷後9天及35天量測。oxMIF含量之恆定減小與改善之臨床症狀相關聯(圖6B)。亦量測血漿中之oxMIF含量且結果與尿液含量相當。然而，與部分緩解、緩解或潛藏型疾病(smoldering disease)之相關性並不明顯，最可能係由於循環系統中之oxMIF反映潛在疾病(SLE)之總體活性而不僅係腎臟中之情形(圖6C)。
總結
狼瘡性腎炎患者之尿液中oxMIF之量測適用於監測疾病進展以及治療功效。循環系統中之oxMIF亦與疾病嚴重程度相關聯，儘管結果可能反映患者關於SLE之總體情形而不僅腎臟(LN)中之情形。
IV.糖尿病性視網膜病變 實例3.7
藉由ELISA分析自患有糖尿病性視網膜病變(DR)及白內障(作為對照)之患者取得之水樣液試樣MIF及oxMIF之存在。
材料及方法
利用實例3.3及3.4中所闡述之相同ELISA設置檢測總MIF及oxMIF。
結果
如圖7上所展示，自DR或白內障患者之試樣中檢測到總MIF，但僅在DR試樣中檢測到oxMIF。
總結
oxMIF可用作糖尿病性視網膜病變中之標記。
V.前列腺癌 實例3.8：建立人類前列腺癌之後小鼠血漿中之oxMIF
在異種移植小鼠前列腺癌模型結束時收集血漿試樣。量測oxMIF以及總MIF含量且與同種型對照及抗MIF治療之小鼠中之腫瘤生長相關聯。
材料及方法
前列腺癌之異種移植模型.
自指數生長培養收穫PC-3細胞並與生長因子耗乏之BD基質膠基質混合。將懸浮液皮下接種至MF1裸小鼠之右側腹(每只小鼠2×106個於250 μl基質膠中之細胞，每組10只小鼠)。腫瘤誘導後1天，開始利用RAB0進行抗體治療(5 mg/kg及15 mg/kg)並每兩天腹腔(i.p.)注射抗體達2週。藉由心臟穿刺術收集血液並製備血漿用於量測一天之循環MIF含量。亦分析未異種移植小鼠之血漿試樣的總MIF及oxMIF(=陰性對照)。此外，量測腫瘤重量。
藉由夾心法ELISA量測血漿中之總MIF：
將微量滴定板用親和性純化之多株兔抗小鼠MIF抗體(兔抗moMIF，如實例2中所闡述)塗覆。將所測試血漿試樣以1：25稀釋於0.5%魚膠/PBS(pH 7.2)中。藉由重組全長小鼠MIF蛋白質實施此ELISA之校正。將標準物稀釋於包括4%對照血漿之0.5%魚膠/PBS中。藉由親和性純化及生物素化多株兔抗小鼠MIF抗體(biot.兔抗moMIF)達成所捕獲MIF之檢測。所有試樣、標準物及對照均一式兩份實施。
藉由夾心法ELISA量測血漿中之oxMIF：
將微量滴定板用單株全人類抗oxMIF抗體RAB0塗覆。將血漿試樣以1：25稀釋於2% BSA/TBST(pH 7.2)中。對於標準校正曲線而言，藉由添加0.2% ProClin300修飾重組moMIF蛋白質並將標準物稀釋於包括0.2% ProClin300及4%對照血漿之2% BSA/TBST。藉由親和性純化之多株抗小鼠MIF抗體(兔抗moMIF，如實例3.1中所闡述)及HRP偶聯之山羊抗兔抗體達成所捕獲oxMIF之檢測。TMB係用作顯色受質，利用H2SO4終止顯色反應並於450 nm下量測ELISA板。所有試樣、標準物及對照均一式兩份實施。
結果
在同種型對照治療組中總MIF之中值與抗MIF抗體治療 之動物並無明顯差異。當與未異種移植小鼠(=圖8A中之陰性對照)相比時，發現具有腫瘤之動物中之總MIF增加。然而，藉由所應用方法並非檢測出健康動物中之oxMIF含量(=圖8B中之陰性對照；亦參見實例3.8)。但如圖8B中所繪示，具有腫瘤之小鼠中明顯可檢測到oxMIF含量。此外，利用抗MIF抗體治療後oxMIF含量顯著減小。發現對照組中之中值oxMIF含量為8.6 ng/mL且在兩個治療組中減小。oxMIF含量之劑量依賴性減小亦與腫瘤生長之減小相關聯，且因此與所達成之治療性效果相關聯(圖8C)。
總結
在PC-3前列腺癌異種移植模型中，發現在具有腫瘤之小鼠中總MIF之含量增加。然而，在未異種移植對照小鼠中並非檢測到oxMIF且oxMIF之濃度而非總MIF與MF1裸小鼠中之腫瘤生長相關聯。因此，oxMIF比總MIF更適宜作為監測疾病進展及治療性效果之診斷標記。
實例3.9：前列腺癌細胞系之細胞表面上的oxMIF
人類前列腺癌細胞系PC-3(前列腺腺癌，ATCC® CRL-1435TM)已藉由流式細胞術針對oxMIF在其表面上之表現進行測試。
方法
於具有300 nM抗體RAB9或RAB0及「對照1」(不相關同種型對照抗體)作為陰性對照之細胞染色緩衝液(Biolegend)中對細胞進行染色，且利用R-PE抗人類IgG(Sigma)檢測抗體。
亦分析來自健康供體之人類血液以評估在「正常」情形中在白血球之表面上是否存在oxMIF。首先將肝素化血液與抗人類Fc受體(抗CD16、抗CD32及抗CD64)一起培養以阻斷抗體通過其Fc結構域至細胞之非特異性結合。然後將細胞與對照IgG1人類單株抗體、RAB9或RAB0一起培養。利用R-PE標記之兔抗人類IgG實施細胞表面結合抗體之檢測。為辨別不同白血球子族群，細胞亦經太平洋藍(Pacific Blue)標記之抗CD45(pan-白血球標記)及APC標記之抗CD19(B細胞標記)標記。在使紅血球溶解之後進行獲取。使用大小及複雜度參數以及CD19染色，吾人能夠辨別顆粒性白血球、單核白血球、淋巴球B細胞(CD19+細胞)及淋巴球T細胞+天然殺手細胞(CD19neg細胞)。利用FACSTM CANTO II(Becton Dickinson)實施數據獲取且利用FlowJo軟體(Treestar)分析數據。
結果
可在人類前列腺癌細胞系PC-3之表面上發現oxMIF(圖9)。來自健康供體之白血球(陰性對照)在其細胞表面上並未展示任何oxMIF(圖10)。
總結
在人類前列腺癌細胞之表面上oxMIF之存在展示，oxMIF可用作標記用於檢測癌性細胞。
VI.胰腺癌 實例3.10：胰腺癌細胞系之細胞表面上的oxMIF
人類胰腺癌細胞系BxPC-3(人類原發性胰腺癌，健康防 護局(Health Protection Agency,HPA)#93120816)已藉由流式細胞術針對oxMIF在其表面上之表現進行測試。
方法
於具有300 nM抗體RAB9或RAB0及「對照1」(不相關同種型對照抗體)作為陰性對照之細胞染色緩衝液(Biolegend)中對細胞進行染色，且利用R-PE抗人類IgG(Sigma)檢測抗體。利用FACSTM CANTO II(Becton Dickinson)實施數據獲取且利用FlowJo軟體(Treestar)分析數據。
結果
可在人類胰腺癌細胞系BxPC-3之表面上發現oxMIF(圖11)。來自健康供體之白血球(陰性對照)在其細胞表面上並未展示任何oxMIF(圖10)。
總結
在人類胰腺癌細胞之表面上oxMIF之存在展示，oxMIF可用作標記用於檢測癌性細胞。
VII.卵巢癌 實例3.11：卵巢癌細胞系之細胞表面上的oxMIF
人類卵巢癌細胞系A2780(人類卵巢癌，HPA # 93112519)已藉由流式細胞術針對oxMIF在其表面上之表現進行測試。
方法
於具有300 nM抗體RAB9或RAB0及「對照1」(不相關同種型對照抗體)作為陰性對照之細胞染色緩衝液 (Biolegend)中對細胞進行染色，且利用R-PE抗人類IgG(Sigma)檢測抗體。利用FACSTM CANTO II(Becton Dickinson)實施數據獲取且利用FlowJo軟體(Treestar)分析數據。
結果
可在人類卵巢癌細胞系A2780之表面上發現oxMIF(圖12)，但主要伴隨單株抗體RAB0。來自健康供體之白血球(陰性對照)在其細胞表面上並未展示任何oxMIF(圖10)。
總結
人類卵巢癌細胞之表面上oxMIF之存在展示，oxMIF可用作標記用於檢測癌性細胞。
VIII.淋巴瘤 實例3.12：淋巴瘤癌細胞系之細胞表面上的oxMIF
不同永生化人類淋巴瘤細胞系(表2)已藉由流式細胞術針對oxMIF在其表面上之表現進行檢測。
方法
細胞已用(或未用)25 μg/ml LPS及50 μg/ml硫酸葡聚糖刺激達24 h至長達72 h。於具有300 nM抗體RAB9或RAB0 或RAB4及「對照1」(不相關同種型對照抗體)作為陰性對照之細胞染色緩衝液(Biolegend)中對細胞進行染色，且利用R-PE抗人類IgG(Sigma)檢測抗體。利用FACSTM CANTO II(Becton Dickinson)實施數據獲取且利用FlowJo軟體(Treestar)分析數據。
結果
可在人類淋巴瘤細胞系之表面上發現oxMIF(圖13)，而來自健康供體之白血球(陰性對照)在其細胞表面上並未展示任何oxMIF(圖10)。
總結
人類淋巴瘤細胞之表面上oxMIF之存在展示，oxMIF可用作標記用於檢測癌性細胞。
IX. IX.實體腫瘤：前列腺癌及乳癌 實例3.13：癌症患者之血漿中的oxMIF
來自患有不同類型之實體腫瘤(前列腺癌及乳癌)之患者的EDTA血漿試樣係自商業供應商獲得。藉由夾心法ELISA分析總MIF及oxMIF濃度。
材料及方法
總MIF及oxMIF二者均使用相同ELISA設置來檢測：將微量滴定板用人類抗MIF單株抗體RAM0塗覆並利用親和性純化之多株兔抗人類MIF抗體實施MIF之檢測。在板用山羊抗兔HRP偶聯抗體(BioRad,Cat.：171-6516)(在此處同樣可使用任一其他山羊抗兔抗體)及TMB(顯色受質；亦可使 用任一其他適宜顯色受質，如熟悉此項技術者已知)培養之後，於ELISA讀取器中於450 nm下實施ELISA之讀出。利用重組人類MIF實施ELISA之校正，該重組人類MIF與0.2% ProClin300(Proclin300誘導MIF內oxMIF表位之形成)一起培養。將標準物稀釋於包括0.2% ProClin300及5%人類對照血漿之0.5%魚膠/PBS中。校正曲線之範圍係10 ng/ml至0.156 ng/ml。將所測試人類血漿試樣以1：20稀釋於0.5%魚膠/PBS(pH 7.2)中用於oxMIF ELISA，或稀釋於0.5%魚膠/PBS/0.2% Proclin300中用於總MIF ELISA。
結果
已自商業供應商購得源自診斷患有前列腺癌(n=14)及乳癌(n=15)之患者的EDTA血漿試樣。使用來自健康志願者(n=49)之EDTA血漿作為對照。於圖14A及14B中展示來自對照試樣及前列腺癌試樣之總MIF及oxMIF之含量。如文獻中所闡述，在來自健康個體之血漿中檢測到MIF且觀察到來自前列腺癌患者之血漿中之總MIF顯著增加(t測試，p=0.0166)。然而，在健康供體之血漿中並未檢測到oxMIF，而在前列腺癌患者之血漿試樣中檢測到oxMIF(t測試，n=0.0016)。在乳癌試樣中觀察到類似模式(圖15)，其中與健康對照相比，源自乳癌患者之血漿試樣中總MIF(p=0.0078)及oxMIF(p=0.0451)顯著升高且在健康對照中未檢測到oxMIF。
總結
在患有前列腺癌及乳癌之患者的血漿中可檢測到總MIF 及oxMIF之含量升高 然而，在源自健康供體之血漿中亦存在總MIF，而在健康對照中不能檢測到oxMIF。因此，oxMIF可視為比總MIF更具特異性之用以指示疾病狀態之生物標記。
X.多發性硬化 實例3.14：多發性硬化患者之CSF中之oxMIF
源自患有不同形式之多發性硬化之患者的腦脊髓液試樣係自商業供應商獲得。藉由夾心法ELISA量測總MIF及oxMIF濃度。
材料及方法
總MIF及oxMIF二者均使用相同ELISA設置來檢測：將微量滴定板用人類抗MIF單株抗體RAM0塗覆並利用親和性純化之多株兔抗人類MIF抗體實施MIF之檢測。在板用山羊抗兔HRP偶聯抗體(BioRad,Cat.：171-6516)(在此處同樣可使用任一其他山羊抗兔抗體)及TMB(顯色受質，如上文所定義；亦可使用任一其他適宜顯色受質，如熟悉此項技術者已知)培養之後，於ELISA讀取器中於450 nm下實施ELISA之讀出。
對於CSF試樣，利用重組人類MIF實施ELISA之校正，該重組人類MIF係與0.2% ProClin300(Proclin300誘導MIF內oxMIF表位之形成)一起培養。將標準物稀釋於包括0.2% ProClin300之20 mM Tris/TBST緩衝液(pH 7.2)中。校正曲線之範圍係10 ng/ml至0.156 ng/ml。將所測試人類CSF試樣以1：10稀釋於20 mM Tris/TBST中用於oxMIF ELISA，或 在Proclin300之存在下用於總MIF ELISA。
結果
在如此實例中所用之腦脊髓液(CSF)試樣(圖16A及16B)中，在來自健康對照之CSF中並未檢測到oxMIF，而在MS患者之CSF中發現高含量(p<0.0001)。而且，來自MS患者(n=49)之試樣與對照(n=30)(p<0.0001)相比，總MIF之含量強烈增加，但在某種程度上，來自健康對照之試樣中亦發現總MIF。
總結
在MS患者之CSF中可檢測到總MIF及oxMIF含量升高。然而，在源自健康供體之CSF中亦存在總MIF，而在健康對照中不能檢測到oxMIF。因此，oxMIF可視為多發性硬化之優良生物標記且係比總MIF更具特異性之生物標記。
XI.卵巢癌 實例3.15：來自卵巢癌患者之血漿中的oxMIF
EDTA血漿試樣係商業上自患有不同類型卵巢癌(透明細胞腺癌、乳突漿液性腺癌及漿液性腺癌)之患者獲得。藉由夾心法ELISA分析其總MIF及oxMIF之含量。
材料及方法
總MIF及oxMIF二者均使用相同ELISA設置來檢測：將微量滴定板用人類抗MIF單株抗體RAM0塗覆並利用親和性純化之多株兔抗人類MIF抗體實施MIF之檢測。在板用山羊抗兔HRP偶聯抗體(BioRad,Cat.：171-6516)(在此處同樣可使用此項技術中已知之任一其他山羊抗兔)及TMB(顯色 受質，如上文所定義；亦可使用任一其他適宜顯色受質，如熟悉此項技術者已知)培養之後，於ELISA讀取器中於450 nm下實施ELISA之讀出。利用重組人類MIF實施ELISA之校正，該重組人類MIF與0.2% ProClin300(Proclin300將MIF轉化為oxMIF)一起培養。將標準物稀釋於包括0.2% ProClin300及5%人類對照血漿之0.5%魚膠/PBS中。校正曲線之範圍係10 ng/ml至0.156 ng/ml。將所測試人類血漿試樣以1：20稀釋於0.5%魚膠/PBS(pH 7.2)中用於oxMIF ELISA，或在Proclin300之存在下用於總MIF ELISA。
結果
來自EDTA血液之血漿試樣係自經診斷患有卵巢癌之患者(n=42)購得。來自健康志願者(n=19)之EDTA血漿作為對照。在圖17A及17B中，展示對照試樣及卵巢癌試樣之總MIF及oxMIF含量。如文獻中所闡述，在來自健康個體之血漿中檢測到MIF且觀察到來自卵巢癌患者之血漿中的總MIF顯著增加(t測試，p=0.0434)。然而，在健康供體之血漿中未檢測到oxMIF，而在來自卵巢癌患者之血漿試樣中檢測到oxMIF(t測試，p=0.0663)。當針對之特定子類型進行統計分析時，來自漿液性囊腺癌之血漿中之MIF顯著增加超過對照(p=0.0046)，同樣觀察到乳突漿液性囊腺癌(p=0.0438)及漿液性囊腺癌(p=0.0357)中oxMIF顯著增加超過對照。
XII：潰瘍性結腸炎及克隆氏病 實例3.16：來自患有潰瘍性結腸炎及克隆氏病之患者的血 漿中之oxMIF
EDTA血漿試樣係商業上自患有不同潰瘍性結腸炎(UC)或克隆氏病(CD)之患者獲得。藉由夾心法ELISA分析其總MIF及oxMIF之含量。
材料及方法
總MIF及oxMIF二者均使用相同ELISA設置來檢測：將微量滴定板用人類抗MIF單株抗體RAM0塗覆並利用親和性純化之多株兔抗人類MIF抗體實施MIF之檢測。在板用山羊抗兔HRP偶聯抗體(BioRad,Cat.：171-6516)(在此處同樣可使用此項技術中已知之任一其他山羊抗兔)及TMB(顯色受質，如上文所定義；亦可使用任一其他適宜顯色受質，如熟悉此項技術者已知)培養之後，於ELISA讀取器中於450 nm下實施ELISA之讀出。利用重組人類MIF實施ELISA之校正，該重組人類MIF與0.2% ProClin300(Proclin300將MIF轉化為oxMIF)一起培養。將標準物稀釋於包括0.2% ProClin300及5%人類對照血漿之0.5%魚膠/PBS中。校正曲線之範圍係10 ng/ml至0.156 ng/ml。將所測試人類血漿試樣以1：20稀釋於0.5%魚膠/PBS(pH 7.2)中用於oxMIF ELISA，或在Proclin300之存在下用於總MIF ELISA。
結果
來自EDTA血液之血漿試樣係自經診斷患有UC(n=15)或CD(n=21)之患者購得。來自健康志願者(n=19)之EDTA血漿作為對照。在圖18A及18B中，展示對照試樣及UC以及 CD試樣之總MIF及oxMIF含量。如文獻中所闡述，在來自健康個體之血漿中檢測到MIF且在來自CD患者之血漿中檢測到總MIF顯著增加(t測試，p=0.0207)，但在UC試樣中未檢測到(p=0.1240)。然而，在健康供體之血漿中未檢測到oxMIF，而在來自UC及CD患者二者之血漿試樣中檢測到oxMIF(t測試，當與對照相比時分別p=0.0417及p=0.0114)。
總結
對於潰瘍性結腸炎及克隆氏病患者而言，與健康志願者相比，在血漿中可能檢測到顯著較高量之oxMIF。該等結果展示，oxMIF可用作該等疾病中之生物標記。
圖1：大腸桿菌攻毒小鼠之血漿中的總MIF及oxMIF對自對照小鼠(C)及大腸桿菌攻毒小鼠(E)獲得之血漿實施oxMIF(圖1A)及總MIF(圖1B)ELISA。
圖2：來自大腸桿菌攻毒小鼠之顆粒性白血球及單核白血球的表面上之oxMIF檢測將在不同時間點自對照(F)或大腸桿菌攻毒小鼠(E)獲得之血液試樣利用特定細胞標記染色，以藉由RPE(R-藻紅素，顯色標記)標記之多株抗人類IgG鑑別所檢測之白血球族群、及人類抗MIF單株抗體RAB9或人類對照IgG1。直方圖係展示對照抗體(粗黑色線)與顆粒性白血球族群(GR1)或單核白血球族群(CD14)中之RAB9特定染色(灰色輪廓)之疊加。
圖3：菌血症患者之血漿中之總MIF及oxMIF檢測藉由ELISA評估來自菌血症患者(1至6，黑色柱)、一個健康對照(7，灰色柱)之血漿中及來自健康供體之血漿彙集物(8，灰色柱)中之總MIF及oxMIF含量。
圖4：在牛皮癬患者之血清試樣中oxMIF之檢測在患者之循環系統中oxMIF含量之降低展示與疾病嚴重程度之改良的相關性。
圖5：來自患有腎小球性腎炎之大鼠的尿液中之oxMIF含量(A)oxMIF之含量自第0天(疾病誘導之前)至疾病誘導之後第8天隨疾病進展而增加。在第8天利用抗MIF抗體RAB9治療使得oxMIF之尿液含量降低。(B)在第8天處死動物之後在相同實驗中測定巨噬細胞浸潤。RAB9治療組中減小之巨噬細胞浸潤與減小之oxMIF含量相關聯。
圖6：在來自患有狼瘡性腎炎患者之尿液中之oxMIF含量(A)尿液中之oxMIF含量與疾病嚴重程度相關聯。展示針對每一患者群組所量測之平均值。(B)在初診患有狼瘡性腎炎之患者中量測oxMIF含量之時程。患者係利用非特異性免疫抑制藥物進行治療且尿液oxMIF含量之減小與改善之臨床情境相關聯。(C)血漿中之oxMIF含量與疾病嚴重程度相關聯。展示針對每一患者群組所量測之平均值。
圖7：在患有糖尿病性視網膜病變之患者的水樣液中之總 MIF及oxMIF藉由ELISA評估自患有白內障(CAT，n=5)或糖尿病性視網膜病變(DR，n=5)之患者獲得的水樣液中之總MIF及oxMIF含量。
圖8：前列腺癌之異種移植小鼠模型在動物模型終止之後，獲得來自小鼠之血漿試樣以量測總MIF含量(A)以及oxMIF含量(B)。腫瘤已經切除並稱重(C)。該等圖展示自每一組所獲得值之平均值。亦分析來自未異種移植小鼠之血漿試樣的總MIF及oxMIF(=陰性對照)。
圖9：PC-3前列腺癌細胞系表面上之oxMIF PC-3細胞首先用對照人類IgG1單株抗體(灰色曲線)及RAB9(黑色線)標記。細胞表面結合抗體之檢測係利用RPE標記之兔抗人類IgG實施。
圖10：在來自健康供體之白血球表面上不存在oxMIF將來自健康供體之人類血球與對照IgG1人類單株抗體(灰色圖表)、RAB9(黑色線)或RAB0(黑色虛線)一起培養。細胞表面結合抗體之檢測係利用RPE標記之兔抗人類IgG實施。電子閘控使得吾人能夠辨別顆粒性白血球、單核白血球、淋巴球B細胞(CD19+細胞)及淋巴球T細胞+天然殺手細胞(CD19neg細胞)。
圖11：BxPC3胰腺癌細胞系表面上之oxMIF BxPC3細胞首先經對照人類IgG1單株抗體(灰色圖 表)或RAB0(黑色線)標記。細胞表面結合抗體之檢測係利用RPE標記之兔抗人類IgG實施。
圖12：A2780卵巢癌細胞系表面上之oxMIF A2780細胞首先經對照人類IgG1單株抗體(灰色圖表)、經RAB9(黑色線)標記。細胞表面結合抗體之檢測係利用RPE標記之兔抗人類IgG實施。
圖13：人類淋巴瘤細胞系表面上之oxMIF人類淋巴瘤細胞系首先經對照人類IgG1單株抗體(灰色圖表)、經RAB9(黑色線，於A、B及D中)或經RAB0(黑色線，於C中)標記。細胞表面結合抗體之檢測係利用RPE標記之兔抗人類IgG實施。A)CA46伯奇氏淋巴瘤；B)MC-CAR B淋巴球性淋巴瘤；C)Raji伯奇氏淋巴瘤；D)U937組織細胞性淋巴瘤。
圖14：在來自前列腺癌患者之血漿中之總MIF及oxMIF含量
(A)量測來自不同前列腺癌患者(n=14)及健康志願者(n=49)之血漿中之總MIF含量。展示盒鬚圖(Box and whiskers)(5-95%百分位數)且粗體為中值。統計學：p=0.0166，非成對單側t測試。
(B)量測來自不同前列腺癌患者(n=14)及健康志願者(n=49)之血漿中之oxMIF含量。展示盒鬚圖(5-95%百分位數)且粗體為中值。統計學：p=0.0016，非成對單側t測試。
圖15：在來自乳癌患者之血漿中之總MIF及oxMIF含量
(A)量測來自不同乳癌患者(n=15)及健康志願者(n=49)之血漿中之總MIF含量。展示盒鬚圖(5-95%百分位數)且粗體為中值。統計學：p=0.0078，非成對單側t測試。
(B)量測來自不同乳癌患者(n=15)及健康志願者(n=49)之血漿中之oxMIF含量。展示盒鬚圖(5-95%百分位數)且粗體為中值。統計學：p=0.0451，非成對單側t測試。
圖16：來自患有多發性硬化之患者的腦脊髓液中之總MIF及oxMIF含量
(A)量測來自經診斷患有不同形式之多發性硬化(n=49)之患者及健康志願者(n=30)之腦脊髓液中之總MIF含量。展示盒鬚圖(5-95%百分位數)以及中值(粗線)。統計學：p<0.0001，非成對單側t測試。
(B)量測來自經診斷患有不同形式之多發性硬化之患者(n=49)及健康志願者(n=30)之腦脊髓液中之oxMIF含量。展示盒鬚圖(5-95%百分位數)以及中值(粗線)。統計學：p<0.0001，非成對單側t測試。
圖17：在來自卵巢癌患者之血漿中之總MIF及oxMIF含量
(A)量測來自不同卵巢癌患者(n=42)及健康志願者(n=19)之血漿中之總MIF含量。展示盒鬚圖(5-95%百分位數)且粗體為中值。統計學：p=0.0434，非成對單側t測試。
(B)量測來自不同卵巢癌患者(n=42)及健康志願者 (n=19)之血漿中之oxMIF含量。展示盒鬚圖(5-95%百分位數)且粗體為中值。統計學：p=0.0663，非成對單側t測試。
(C)量測來自不同類型之卵巢癌患者(透明細胞腺癌n=7，乳突漿液性囊腺癌n=14，且漿液性囊腺癌n=21)及健康志願者(n=19)之血漿中之總MIF含量。展示盒鬚圖(5-95%百分位數)且粗體為中值。使用t測試(未成對單側)評估每一組針對對照組之統計顯著性：
a.對照(n=19)與透明細胞腺癌(n=7)：p=0.3696。
b.對照(n=19)與乳突漿液性囊腺癌(n=14)：p=0.0721。
c.對照(n=19)與漿液性囊腺癌(n=21)：p=0.0046＊＊。
(D)量測來自不同類型之卵巢癌患者(透明細胞腺癌n=7，乳突漿液性囊腺癌n=14，且漿液性囊腺癌n=21)及健康志願者(n=19)之血漿中之oxMIF含量。展示盒鬚圖(5-95%百分位數)且粗體為中值。使用t測試(未成對單側)評估每一組針對對照組之統計顯著性：
a.對照(n=19)與透明細胞腺癌(n=7)：p=0.4518。
b.對照(n=19)與乳突漿液性囊腺癌(n=14)：p=0.0438＊。
c.對照(n=19)與漿液性囊腺癌(n=21)：p=0.0357＊。
圖17A：在來自卵巢癌患者之血漿中之總MIF含量
圖17B：在來自卵巢癌患者之血漿中之oxMIF含量
圖17C：在患有不同形式卵巢癌之患者血漿中之總MIF 含量
圖17D：在患有不同形式卵巢癌之患者血漿中之oxMIF含量
圖18：在來自UC及CD患者之血漿中之總MIF及oxMIF含量
(A)量測來自不同UC(n=15)及CD患者(n=21)以及健康志願者(n=19)之血漿中之總MIF含量。展示盒鬚圖(5-95%百分位數)且粗體為中值。
a.對照與UC：p=0.1240，非成對單側t測試。
b.對照與CD：p=0.0207＊，非成對單側t測試。
(B)量測來自不同UC(n=15)及CD患者(n=21)以及健康志願者(n=19)之血漿中之oxMIF含量。展示盒鬚圖(5-95%百分位數)且粗體為中值。
a.對照與UC：p=0.0417＊，非成對單側t測試。
b.對照與CD：p=0.0114＊，非成對單側t測試。
圖18A：來自患有UC及CD之患者血漿中之總MIF含量
圖18B：來自患有UC及CD之患者血漿中之oxMIF含量
<110> 瑞士商百特保健公司
<120> 作為診斷標記之oxMIF
<130> 158 882
<140> 101137028
<141> 2012-10-05
<150> 61-545,042
<151> 2011-10-07
<150> 61-624,943
<151> 2012-04-16
<150> 61-668,841
<151> 2012-07-06
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAB9之輕鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAB4之輕鏈
<400> 2
<210> 3
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAB0之輕鏈
<400> 3
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAB2之輕鏈
<400> 4
<210> 5
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAB9之重鏈
<400> 5
<210> 6
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAB4之重鏈
<400> 6
<210> 7
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAB0之重鏈
<400> 7
<210> 8
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAB2之重鏈
<400> 8
<210> 9
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAM0hc
<400> 9
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<220>
<223> RAM0lc
<400> 10
<210> 11
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAM9hc
<400> 11
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAM9lc
<400> 12
<210> 13
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAM4hc
<400> 13
<210> 14
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAM4lc
<400> 14

Claims (19)

  1. 一種以oxMIF作為活體外診斷(MIF相關)疾病之標記之用途，其中oxMIF係差別地結合至抗體RAB4、RAB9及/或RAB0之MIF。
  2. 如請求項1之用途，其中(MIF相關)疾病之該診斷進一步涉及使用差別地結合至該診斷標記之化合物，該診斷標記係如請求項1中所定義之oxMIF。
  3. 如請求項2之用途，其中該等化合物係特異性結合至oxMIF之抗體。
  4. 如請求項3之用途，其中該等抗體結合至oxMIF，但不結合至redMIF。
  5. 如請求項4之用途，其中該差別結合係以小於100 nM、較佳小於50 nM、甚至更佳小於10 nM之KD值與oxMIF結合，且其不結合redMIF之特徵為KD超過400 nM。
  6. 如請求項1至5中任一項之用途，其中該等MIF相關疾病係選自由以下組成之群：發炎性疾病及腫瘤疾病。
  7. 如請求項6之用途，其中該等MIF相關疾病係選自由以下組成之群：結腸癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肝細胞癌、哮喘、ARDS、類風濕性關節炎、敗血症、IgA腎病、腎小球性腎炎、狼瘡性腎炎(LN)、肝炎、胰腺炎(+/-急性肺損傷)、克隆氏病(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、胃潰瘍、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、多發性硬化、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、心功能障礙、血管成形 術、動脈粥樣硬化、心肌炎、1型糖尿病、糖尿病性視網膜病變、年齡相關性黃斑變性(AMD)、異位性皮炎、牛皮癬、子宮內膜異位症、神經性病變疼痛及/或葡萄膜炎。
  8. 如請求項3至5中任一項之用途，其中該等抗體係選自由oxMIF結合劑(例如抗體RAB9、RAB4及/或RAB0)組成之群。
  9. 如請求項1至5中任一項之用途，其中該診斷係(MIF相關)疾病存在之診斷、(MIF相關)疾病進展之診斷、(MIF相關)疾病狀態之診斷及/或治療有效性之監測。
  10. 如請求項1至5中任一項之用途，其中該診斷係針對個體之體液試樣實施。
  11. 如請求項1至5中任一項之用途，其中該診斷係針對個體之細胞試樣實施。
  12. 一種診斷分析，其藉由檢測個體之體液或細胞試樣中如請求項1中所定義之oxMIF用於活體外診斷(MIF相關)疾病，其包含在活體外測定化合物與該試樣中之oxMIF之結合性的步驟。
  13. 如請求項12之診斷分析，其中結合至oxMIF之該化合物及該等(MIF相關)疾病係如請求項2至9中任一項中所定義。
  14. 如請求項12或13之診斷分析，其中該分析法係在(MIF相關)疾病之進展、緩解及/或治療期間重複一次或若干次。
  15. 一種診斷套組在如請求項12至14中任一項之分析中之用途，其中該診斷套組包含結合至oxMIF之化合物。
  16. 如請求項15之用途，其中該套組另外包含緩衝液、對照(例如重組(ox)MIF)、多株抗MIF抗體及/或偶聯檢測抗體。
  17. 一種抗MIF抗體，其係選自以下群組：a)RAB4抗體，其特徵在於以寄存編號DSM 25110利用質粒寄存所寄存之輕鏈序列及以寄存編號DSM 25112利用質粒寄存所寄存之重鏈序列，b)RAB9抗體，其特徵在於以寄存編號DSM 25111利用質粒寄存所寄存之輕鏈序列及以寄存編號DSM 25113利用質粒寄存所寄存之重鏈序列，c)RAB0抗體，其特徵在於以寄存編號DSM 25114利用質粒寄存所寄存之輕鏈序列及以寄存編號DSM 25115利用質粒寄存所寄存之重鏈序列，d)RAM4抗體，其特徵在於以寄存編號DSM 25861利用質粒寄存所寄存之輕鏈序列及以寄存編號DSM 25862利用質粒寄存所寄存之重鏈序列，e)RAM9抗體，其特徵在於以寄存編號DSM 25859利用質粒寄存所寄存之輕鏈序列及以寄存編號DSM 25860利用質粒寄存所寄存之重鏈序列，及/或f)RAM0抗體，其特徵在於以寄存編號DSM 25863利用質粒寄存所寄存之輕鏈序列及以寄存編號DSM 25864利用質粒寄存所寄存之重鏈序列。
  18. 一種抗MIF抗體，其係選自以下群組：a)RAB4抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：2且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：6，b)RAB9抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：1且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：5，c)RAB0抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：3且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：7，d)RAB2抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：4且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：8，e)RAM4抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：14且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：13，f)RAM9抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：12且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：11，及/或g)RAM0抗體，其特徵在於輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：10且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：9，h)或其功能等效物，其特徵在於結合至與以上該等抗體a)至g)中之任一者相同之表位。
  19. 一種如請求項17或18之抗體中之任一者之用途，其用於活體外診斷(MIF相關)疾病。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106255884A (zh) * 2013-10-04 2016-12-21 赛尔爱迪尔私人有限公司 用于细胞治疗的生物标志物

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2748613B1 (en) 2011-10-07 2021-05-05 Baxalta GmbH Oxmif as a diagnostic marker
AU2013202693B2 (en) * 2012-04-16 2015-01-22 Baxalta GmbH Combination Therapy of Anti-MIF Antibodies and Chemotherapeutics
CN105452867A (zh) 2012-07-10 2016-03-30 巴克斯特保健股份有限公司 抗-mif的免疫组织化学
US9536304B2 (en) * 2013-08-30 2017-01-03 Dairy Quality Inc. Determining pathogens based on an image of somatic cells in a fluid sample
AU2015206178A1 (en) 2014-01-03 2016-07-07 Baxalta GmbH Anti-MIF immunohistochemistry
US10626166B2 (en) 2014-08-22 2020-04-21 Baxalta Incorporated Detection of CHO-MIF contaminations
JP2021526820A (ja) * 2018-06-07 2021-10-11 オンコワン・リサーチ・アンド・ディベロップメント・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング 癌治療のための抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4299814A (en) 1979-05-25 1981-11-10 Monsanto Company Radioimmunoassay of MIF
JPH0672158B2 (ja) 1984-05-24 1994-09-14 チバ−ガイギ− アクチエンゲゼルシヤフト 精製されたヒトマクロファージ遊走阻止因子
US4946674A (en) 1984-10-05 1990-08-07 Bioferon Biochemische Substanzen Gmbh & Co. Process for treatment of rheumatic diseases
US4708937A (en) 1984-10-15 1987-11-24 Brigham & Women's Hospital Purified migration inhibitory factor also having colony stimulating factor activity
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3789413T2 (de) 1986-10-03 1994-07-28 Ciba Geigy Ag Lymphokin-ähnliche Peptide.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO1990011301A1 (en) 1989-03-17 1990-10-04 Genetics Institute, Inc. Human macrophage migration inhibitory factor
US5785054A (en) 1989-06-06 1998-07-28 Kelly; Patrick D. Genital lubricant with zinc salt, labelled as anti-viral agent
GB8915414D0 (en) 1989-07-05 1989-08-23 Ciba Geigy Novel cytokines
AU634314B2 (en) 1989-11-13 1993-02-18 Green Cross Corporation, The Chimeric mouse-human a10 antibody with specificity to a human tumor cell antigen
US5227459A (en) 1990-05-18 1993-07-13 Yale University Synthetic melanin
US5786168A (en) 1990-06-04 1998-07-28 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method for recombinant production of antigen non-specific glycosylation inhibiting factor (GIF)
US5585479A (en) 1992-07-24 1996-12-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Antisense oligonucleotides directed against human ELAM-I RNA
CA2163211C (en) 1993-05-17 2012-05-08 Richard J. Bucala Inhibition of migration inhibitory factor in the treatment of diseases involving cytokine-mediated toxicity
US6030615A (en) 1993-05-17 2000-02-29 The Picower Institute For Medical Research Combination method for treating diseases caused by cytokine-mediated toxicity
US6774227B1 (en) 1993-05-17 2004-08-10 Cytokine Pharmasciences, Inc. Therapeutic uses of factors which inhibit or neutralize MIF activity
US5559028A (en) 1993-05-19 1996-09-24 Antigen Express, Inc. Methods of enhancing or antigen presentation to T cells inhibiting
JPH10500301A (ja) 1994-05-16 1998-01-13 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド マクロファージ遊走阻止因子−３
US5747023A (en) 1994-07-01 1998-05-05 Genentech, Inc. Cancer therapy using lymphotoxin
SI9400363A (en) 1994-09-19 1996-08-31 Mozetic Francky Bojana Human macrophage migration inhibitory factor of nonlymphoid origin, expression of mif in e. coli and purification of recombinant protein
WO1996015242A2 (en) 1994-11-16 1996-05-23 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for inhibiting cell proliferation by inhibiting the mitogenic activity of macrophage migration inhibitory factor
JPH0977799A (ja) 1995-09-13 1997-03-25 Sapporo Immuno Diagnostic Lab:Kk ヒト−マクロファージ遊走阻止因子（ヒト−ｍｉｆ）に対するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ
AU1087797A (en) 1996-01-03 1997-08-01 Australian National University, The Clip analogues and autoimmune disease
US6492428B1 (en) 2000-07-26 2002-12-10 The Picower Institute For Medical Research Compounds having MIF antagonist activity
US6420188B1 (en) 1996-02-16 2002-07-16 The Picower Institute For Medical Research Screening assay for the identification of inhibitors for macrophage migration inhibitory factor
US5726020A (en) 1996-06-11 1998-03-10 University Of Massachusetts Inhibition of II synthesis
US6297253B1 (en) 1996-10-15 2001-10-02 The Picower Institute For Medical Research Compounds and methods of use to treat infectious diseases
US6395276B1 (en) 1997-05-02 2002-05-28 Immunomedics, Inc. Immunotoxins directed against malignant cells
US6326465B1 (en) 1997-02-24 2001-12-04 The Johns Hopkins University Immunomodulatory polypeptides derived from the invariant chain of MHC class II
CA2205680A1 (en) 1997-05-16 1998-11-16 The University Of Western Ontario Clip immunomodulatory peptide
US6011005A (en) 1997-09-18 2000-01-04 The Picower Institute For Medical Research Prevention of pregnancy miscarriages
DE69813868T2 (de) 1997-11-05 2004-03-04 The University Of Southern California, Los Angeles Verwendung von zytokinen und mitogenen für inhibierung von pathologischen immunantworten
HU229520B1 (en) 1999-02-12 2014-01-28 Scripps Research Inst Methods for treatment of tumors and metastases using a combination of anti-angiogenic and immuno therapies
AU1235601A (en) 1999-10-29 2001-05-14 Cytokine Pharmasciences, Inc. Compounds having mif antagonist activity
US6268151B1 (en) 2000-01-20 2001-07-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of macrophage migration inhibitory factor expression
US20030235584A1 (en) 2000-02-28 2003-12-25 Kloetzer William S. Method for preparing anti-MIF antibodies
DK1383919T3 (da) 2001-03-29 2010-11-08 Cytokine Pharmasciences Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til anvendelse af MHC klasse II-invariant kædepolypeptid som en receptor for makrofag migrationsinhiberede faktor
MY140679A (en) 2001-05-24 2010-01-15 Avanir Pharmaceuticals Inhibitors of macrohage migration inhibitory factor and methods for identifying the same
US7205107B2 (en) 2001-12-21 2007-04-17 Cytokine Pharmasciences, Inc. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promoter polymorphism in inflammatory disease
US20050202010A1 (en) 2003-08-29 2005-09-15 Giroir Brett P. Method of treatment and bioassay involving macrophage migration inhibitory factor (MIF) as cardiac-derived myocardial depressant factor
US8883160B2 (en) 2004-02-13 2014-11-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) complexes for therapeutic and diagnostic use
KR101410521B1 (ko) 2005-12-16 2014-06-20 아이비씨 파마슈티컬스, 인코퍼레이티드 다가 면역글로불린-계 생동성 어셈블리들
CN100457895C (zh) 2006-05-24 2009-02-04 中国科学院生物物理研究所 鼠抗人巨噬细胞迁移抑制因子单克隆抗体及其应用
SI2231707T1 (sl) * 2008-01-04 2015-04-30 Baxter International Inc. Anti-MIF protitelesa
EP2079202A1 (en) * 2008-01-08 2009-07-15 NEC Corporation Method for optimizing the triggering of the transmission of buffer status reporting (BSR) information
WO2011090492A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Immunomedics, Inc. Novel class of monospecific and bispecific humanized antibodies that target the insulin-like growth factor type i receptor (igf-1r)
EP2748613B1 (en) 2011-10-07 2021-05-05 Baxalta GmbH Oxmif as a diagnostic marker
AU2012327159B2 (en) 2011-10-07 2015-03-26 Baxalta GmbH Characterization of CHO-MIF gene and protein, and use thereof

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106255884A (zh) * 2013-10-04 2016-12-21 赛尔爱迪尔私人有限公司 用于细胞治疗的生物标志物
CN106255884B (zh) * 2013-10-04 2019-01-11 赛尔爱迪尔私人有限公司 用于细胞治疗的生物标志物

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