TW201938584A - 抗pla2-gib抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於抗PLA2-GIB抗體及其用途，特定言之用於偵測樣本中之人類PLA2-GIB。

Description

抗PLA2-GIB抗體及其用途
本發明係關於抗PLA2-GIB抗體及其用途，特定言之用於偵測樣本中之人類PLA2-GIB。更特定言之，本發明揭示可鑑別PLA2-GIB之成熟分泌形式與前體形式或可結合兩種PLA2-GIB形式的新型單株抗體。本發明亦提供使用此類抗體或其片段偵測或給與樣本中之PLA2-GIB的方法，以及鑑別其前體形式及分泌形式之方法及適合於執行該等方法之套組。
IB組胰腺磷脂酶A2 (PLA2-GIB)為低分子量(14 kD)、高度穩定(7個二硫鍵)的分泌蛋白質，其催化磷脂之sn-2脂肪醯基鍵之水解以釋放游離脂肪酸及溶血磷脂(Lambeau及Gelb 2008)。在人類中，PLA2-GIB基因主要在胰腺中表現，在十二指腸、空腸及胃中具有較弱表現量(Eskola等人1983a) (Nevalainen及Haapanen 1993)。已在諸如肺、眼部及睾丸之其他組織中描述邊緣表現(Kolko等人2007)。在人類胰腺中，PLA2-GIB主要在胰腺腺泡細胞之頂端酶原顆粒部分中合成(Eskola等人1983a)。亦已在胰島ß-細胞之胰島素分泌顆粒中偵測到PLA2-GIB且其與來自葡萄糖刺激之胰島的胰島素共分泌(Ramanadham等人1998)。
PLA2-GIB可以失活前體形式(前-sPLA2-GIB)首先分泌於胰液中，失活前體形式藉由前肽之蛋白質水解裂解活化，從而產生成熟分泌形式(sPLA2-GIB)。活體外實驗表明胰蛋白質酶及纖維蛋白質溶酶能夠以良好效力活化前-sPLA2-GIB (Nakano等人1994)。除在胃腸道中之作用以外，PLA2-GIB亦在人類血漿中循環((Nishijima等人1983) (Eskola等人1983b) (Sternby 1984) (Nevalainen等人1985) (Kitagawa等人1991))。發明人先前已將sPLA2-GIB定性為免疫反應之關鍵內源性因素。其證實sPLA2-GIB在基於例如在病毒血症HIV感染之患者體內觀測到的CD4 T淋巴球之無應答性之機制中起關鍵作用。
因此存在對允許精確且靈敏偵測PLA2-GIB之方法的需求。亦存在對可鑑別PLA2-GIB的前體形式及成熟分泌形式之方法及套組的需求。
本發明提供新穎抗PLA2-GIB抗體及其用途。本發明亦提供使用此類抗體偵測或給與PLA2-GIB之方法，以及包含該等方法之套組。
在一第一態樣中，本發明更特定言之係關於單株抗體或其片段，其與人類sPLA2-GIB蛋白質結合且競爭性地抑制單株抗體(14G9)與人類sPLA2-GIB之結合，該單株抗體包含含有SEQ ID NO:2之輕鏈可變區及含有SEQ ID NO:4之重鏈可變區。
在另一態樣中，本發明係關於單株抗體或其片段，其與人類sPLA2-GIB蛋白質上之抗原決定基結合，其中該抗原決定基包含選自人類sPLA2-GIB蛋白質之W3、R6、K7、K10、C77、Y75、G79及S80的至少一個胺基酸殘基，參考SEQ ID NO: 26。
在另一態樣中，本發明提供單株抗體或其片段，其與人類前-sPLA2-GIB蛋白質結合且競爭性地抑制單株抗體(8G11)與人類前-sPLA2-GIB之結合，該單株抗體包含含有SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及含有SEQ ID NO: 17之重鏈可變區
在另一態樣中，本發明係關於單株抗體或其片段，其結合人類PLA2-GIB蛋白質之成熟分泌形式(sPLA2-GIB)及前體形式(前-sPLA2-GIB)兩者。在一特定實施例中，此類抗體或片段競爭性地抑制人類PLA2-GIB蛋白質與以下之前體形式及/或成熟分泌形式的結合：(i)包含含有SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及含有SEQ ID NO: 21之重鏈可變區的單株抗體(1C11)，或(ii)包含含有SEQ ID NO: 23之輕鏈可變區及含有SEQ ID NO: 25之重鏈可變區的單株抗體(7A10)。
舉例而言，本發明抗體之特定實例包括14G9、24B2、22C6、28A1、28A3、34G3、22H5、7C5、8G11、18D9、1C11、4G11、7H12、7E2、7A10、36G10、3B2、18A6及13H8，以及其片段。
本發明進一步係關於一種編碼本發明之抗體或片段之經分離核酸，以及一種包含此類核酸之載體，其較佳地可操作地連接至啟動子。
本發明進一步係關於一種包含如上文所定義之核酸或載體的宿主細胞。
在另一態樣中，本發明係關於一種用於產生本發明抗體之方法，其包含在適合於表現抗體之條件下培養如上文所定義之宿主細胞，且視情況回收該抗體。
在另一態樣中，本發明係關於一種包含如上文所定義之抗體、核酸、載體或宿主細胞的組合物。
在另一態樣中，本發明係關於一種如上文所定義之抗體或組合物，其用於診斷、預防或治療個體之病理性病況，特定言之與PLA2-GIB活性相關聯之病況。
在另一態樣中，本發明係關於一種使用如上文所定義之抗體或片段偵測人類PLA2-GIB蛋白質的方法。可使用或實施該方法以用於偵測人類PLA2-GIB蛋白質之成熟分泌形式(sPLA2-GIB)、前體形式(前-sPLA2-GIB)及/或兩種形式的存在。可使用此類方法或抗體偵測或給與(或定量)樣本中之PLA2-GIB之存在或量，以及評定其前體形式與成熟分泌形式之比率。該等方法尤其適用於偵測或監測與PLA2-GIB活性相關聯的個體中之病理性病況。
在另一態樣中，本發明係關於套組，其包含如本文中所描述之至少一種抗體或其片段及用以執行、偵測或定量免疫反應，或抗體-抗原複合物之試劑。
定義
如本文所用，術語「PLA2-GIB」表示IB組胰腺磷脂酶A2。PLA2-GIB已自各種哺乳動物物種中鑑別出並選殖。人類PLA2-GIB蛋白質揭示於例如Lambeau及Gelb (2008)中。序列可以Genbank第NP_000919號獲得。
以下展示例示性人類PLA2-GIB之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)。
MKLLVLAVLL TVAAA DSGIS PR AVWQFRKM IKCVIPGSDP FLEYNNYGCY CGLGGSGTPV DELDKCCQTH DNCYDQAKKL DSCKFLLDNP YTHTYSYSCS GSAITCSSKN KECEAFICNC DRNAAICFSK APYNKAHKNL DTKKYCQS
SEQ ID NO: 1之胺基酸1至15 (加下劃線)為信號序列，且SEQ ID NO: 1之胺基酸16至22 (加粗)為前肽序列。
在本發明之上下文內，術語「PLA2-GIB」較佳地表示人類PLA2-GIB。
人類PLA2-GIB蛋白質可以兩種不同形式存在：失活前體形式(前-sPLA2-GIB)，其藉由前肽之蛋白質水解裂解活化，從而產生成熟分泌形式(sPLA2-GIB)。術語PLA2-GIB包括任何形式之蛋白質，諸如前體形式及/或成熟形式。通常，成熟分泌形式包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基23-148之序列(SEQ ID NO: 26)或其任何天然變異體，諸如藉由多形性或剪接產生之變異體。術語「前-sPLA2-GIB」或「前PLA2-GIB」較佳地表示包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基16-148之序列或其任何天然變異體(諸如藉由多形性或剪接產生之變異體)的蛋白質。
大體而言，術語「抗體」表示包含重鏈及輕鏈之任何免疫球蛋白質型分子。典型的抗體具有由2條重鏈及2條輕鏈組成之基本單體「H2L2」結構。各重鏈與輕鏈配對。重鏈及輕鏈包含「可變區」或「可變域」。重鏈之可變域可稱為「VH」。輕鏈之可變域可稱為「VL」。此等域通常為抗體之大多數可變部分且含有抗原結合位點。輕鏈或重鏈可變區(VL或VH)由間雜有三個高變區之構架區組成，該等高變區稱為「互補決定區」或「CDR」。
抗體「片段」表示賦予抗原結合的抗體之任何部分。片段通常表示Fab、Fab'2、scFv、奈米抗體或CDR。
抗體之變異體包括保留抗原特異性之任何化學上或生物學上經修飾之抗體。特定變異體為經標記抗體，攜帶允許偵測或捕獲抗體之標記(諸如標記物、示蹤劑、標籤)。此類變異體之實例包括藉由共價或非共價締合抗體與一或多種蛋白質或肽(諸如允許偵測之報導子肽)或定量融合分子所形成的融合分子。在一些實施例中，本發明之抗體變異體可經工程改造(諸如經生物素標記)而為可偵測及/或可定量的。
在較佳實施例中，本發明之抗體及片段及變異體經分離。「經分離」抗體為已與其天然環境之組分分離的抗體。特定言之，抗體可純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或逆相HPLC)所測定。對於用於評定抗體純度之方法的綜述，參見例如Flatman等人, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
抗體對抗原具有「選擇性」，或與其他分子相比在此類抗體呈現與抗原之較佳結合時「選擇性地結合」抗原。選擇性可藉由競爭性ELISA或Biacore分析來測定。標記選擇性之親和力/親合力的差異可為任何可偵測的偏好，諸如大於1:1.1或大於約1:5、1:10、1:100、1:1000或更大之比率。
術語「競爭性地抑制」指示抗體可減少或抑制或取代參考抗體與sPLA2-GIB之結合。可使用諸如(例如)競爭性ELISA或其他結合分析之標準技術來執行競爭分析。通常，競爭性結合分析涉及通常結合至固體受質或細胞之經純化標靶抗原、未標記測試抗體及經標記參考抗體。在測試抗體之存在下藉由測定所結合之經標記抗體之量來量測競爭性抑制。通常測試抗體過量存在，諸如參考抗體之量之約5至500倍。通常，對於ELISA，測試抗體為100×過量，且對於酶素法，測試抗體為10×過量。當過量存在之測試抗體抑制或取代參考抗體與抗原之結合的至少70%時，其視為競爭性地抑制該參考抗體。在一特定實施例中，當以100×過量存在之測試抗體在ELISA中抑制或取代參考抗體與抗原之結合的至少70%，更佳至少80%時，其視為競爭性地抑制該參考抗體。較佳的競爭抗體結合共用共同胺基酸殘基之抗原決定基。
本發明係關於結合人類PLA2-GIB蛋白質之新穎單株抗體、此類抗體之片段以及其用途，特定言之用於偵測、量化或監測樣本中之PLA2-GIB以及用於抑制sPLA2-GIB。
發明人先前已將sPLA2-GIB鑑別為在基於諸如在病毒血症HIV感染之患者體內之CD4 T淋巴球之無應答性的機制中起關鍵作用。發明人現已使用不同類型之免疫原產生抗PLA2-GIB單株抗體。免疫原經設計以產生具有相關特異性之抗體，特定言之使用基本上含有前體區(pro region)之肽。發明人產生並測試接近40個單株抗體且選擇具有最相關特異性、親和力及活性之抗體。測定所選抗體之序列，以及一些抗原決定基。此等抗體單獨及以組合形式允許有效偵測及/或抑制PLA2-GIB。此外，其可用於設計用於鑑別任何樣本中之PLA2-GIB之前體形式及分泌形式的方法。
在一第一態樣中，本發明由此係關於結合人類PLA2-GIB之單株抗體或其片段。本發明之特定抗體選擇性地結合人類PLA2-GIB之成熟分泌形式。本發明之其他特定抗體選擇性地結合人類PLA2-GIB的前體形式，或人類PLA2-GIB之成熟分泌形式及前體形式兩者。本發明之單株抗體或片段可用於鑑別人類PLA2-GIB之形式。其亦可用於特異性地抑制人類PLA2-GIB之成熟分泌形式。
抗 sPLA2-GIB 之 抗體
在一特定態樣中，本發明係關於結合人類PLA2-GIB之成熟分泌形式(sPLA2-GIB)，較佳地選擇性地結合sPLA2-GIB的單株抗體或其片段。
此類抗體之特定實例為14G9。抗體14G9藉由用sPLA2-GIB免疫接種而產生。基於14G9抗體對sPLA2-GIB之極高親和力、其有效中和活性及其選擇性來選擇該抗體。測定14G9之重鏈及輕鏈之胺基酸序列，從而允許此抗體之重組產生。此外，亦測定針對sPLA2-GIB之14G9之抗原決定基。
在測試後，發現14G9能夠選擇性地結合sPLA2-GIB。亦發現14G9可在活體外及活體內抑制sPLA2-GIB。此抗體由此呈現用於選擇性地偵測或抑制蛋白質之顯著特性。測試發明人所製備之其他單株抗體競爭性地抑制14G9與sPLA2-GIB之結合的能力。發現單株抗體24B2、22C6、28A1、28A3、34G3、22H5及7C5確實可競爭性地抑制14G9與sPLA2-GIB之結合(參見表4)。此外，驗證了此類競爭抗體可結合且中和PLA2-GIB (參見表1)，由此確認此組抗體之相關性。
在一特定實施例中，本發明由此係關於結合人類PLA2-GIB之成熟分泌形式且競爭性地抑制單株抗體14G9與人類sPLA2-GIB之結合的任何單株抗體、其變異體或片段。
在另一特定實施例中，本發明係關於結合抗原決定基之單株抗體、其變異體或片段，該抗原決定基包含選自人類sPLA2-GIB蛋白質之W3、R6、K7、K10、C77、Y75、G79及S80的至少一個胺基酸殘基(參考SEQ ID NO: 26)。在一較佳態樣中，本發明之抗體、變異體及片段結合包含至少2、3、4、5、6、7個或所有胺基酸殘基之抗原決定基，該等胺基酸殘基選自人類sPLA2-GIB蛋白質之W3、R6、K7、K10、C77、Y75、G79及S80。發現如發明人所測定之單株抗體14G9之抗原決定基涉及用於結合輕鏈之胺基酸殘基W3、R6及K7以及用於結合重鏈之胺基酸殘基K10、C77、Y75、G79及S80。本發明由此亦關於在其抗原決定基中具有14G9之抗原決定基之至少一個胺基酸殘基，較佳至少2個或更多個的抗體及其片段。
在一更特定實施例中，本發明之單株抗體為抗體14G9或其變異體或片段。
抗體14G9之輕鏈及重鏈可變區分別提供於SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 4中。
在一更特定實施例中，本發明係關於一種包含以下之單株抗體：(i)輕鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 2之輕鏈可變區之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3組成或基本上由其組成的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3；及(ii)重鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 4之重鏈可變區之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3組成或基本上由其組成的的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
參考SEQ ID NO: 2，三個CDR區對應於以下胺基酸殘基：
. CDR-L1：胺基酸殘基QDVSTA (SEQ ID NO: 27)，
. CDR-L2：胺基酸殘基WAS (SEQ ID NO: 28)，
. CDR-L3：胺基酸殘基QQDYSTPPT (SEQ ID NO: 29)。
參考SEQ ID NO: 4，三個CDR區對應於以下胺基酸殘基：
. CDR-H1：胺基酸殘基GYTFTNYW (SEQ ID NO: 30)，
. CDR-H2：胺基酸殘基IDPSDTRT (SEQ ID NO: 31)，
. CDR-H3：胺基酸殘基ARQTLYYEALDY (SEQ ID NO: 32)。
在一更特定實施例中，本發明係關於一種單株抗體，其包含由SEQ ID NO: 2組成或基本上由其組成之輕鏈可變區及/或由SEQ ID NO: 4組成或基本上由其組成之重鏈可變區。
在另一特定實施例中，本發明之單株抗體為抗體22C6或其變異體或片段。
22C6輕鏈可變區及重鏈可變區之胺基酸序列分別提供於SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 9中。
在一更特定實施例中，本發明係關於一種單株抗體，其包含：(i)輕鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 7之輕鏈可變區之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3組成或基本上由其組成的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3；及(ii)重鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 9之重鏈可變區之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3組成或基本上由其組成的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
參考SEQ ID NO: 7，三個CDR區對應於以下胺基酸殘基：
. CDR-L1：胺基酸殘基SSISPNF (SEQ ID NO: 33)，
. CDR-L2：胺基酸殘基RTS (SEQ ID NO: 34)，
. CDR-L3：胺基酸殘基HQGNSLPLT (SEQ ID NO: 35)。
參考SEQ ID NO: 9，三個CDR區對應於以下胺基酸殘基：
. CDR-H1：胺基酸殘基GHSITDDNYY (SEQ ID NO: 36)，
. CDR-H2：胺基酸殘基ITSAGNT (SEQ ID NO: 37)，
. CDR-H3：胺基酸殘基ARDSTDGDFYFEK (SEQ ID NO: 38)。
在一更特定實施例中，本發明係關於一種單株抗體，其包含由SEQ ID NO: 7組成或基本上由其組成之輕鏈可變區及/或由SEQ ID NO: 9組成或基本上由其組成之重鏈可變區。
在另一更特定實施例中，本發明之單株抗體為抗體24B2或其變異體或片段。
24B2輕鏈可變區及重鏈可變區之胺基酸序列在下文分別提供於SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 13中。
在一更特定實施例中，本發明係關於一種單株抗體，其包含：(i)輕鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3組成或基本上由其組成的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3；及(ii)重鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 13之重鏈可變區之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3組成或基本上由其組成的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
參考SEQ ID NO: 11，三個CDR區對應於以下胺基酸殘基：
. CDR-L1：胺基酸殘基ESVDNYGISF (SEQ ID NO: 39)，
. CDR-L2：胺基酸殘基RAS (SEQ ID NO: 40)，
. CDR-L3：胺基酸殘基QQSSRDLFT (SEQ ID NO: 41)。
參考SEQ ID NO: 13，三個CDR區對應於以下胺基酸殘基：
. CDR-H1：胺基酸殘基GHSITDDNYY (SEQ ID NO: 42)，
. CDR-H2：胺基酸殘基ITSSGST (SEQ ID NO: 43)，
. CDR-H3：胺基酸殘基ARDSTDGDFYFEK (SEQ ID NO: 44)。
在一更特定實施例中，本發明係關於一種單株抗體，其包含由SEQ ID NO: 11組成或基本上由其組成之輕鏈可變區及/或由SEQ ID NO: 13組成或基本上由其組成之重鏈可變區。
抗sPLA2-GIB之抗體可具選擇性且基本上僅結合蛋白質之成熟分泌形式。特定言之，14G9結合sPLA2-GIB且基本上不結合蛋白質的前體形式。
抗前 -PLA2-GIB 之 抗體
在一特定態樣中，本發明係關於結合人類PLA2-GIB的前體形式(前PLA2-GIB)，較佳選擇性地結合前PLA2-GIB的單株抗體或其片段。
此類抗體之特定實例為8G11。抗體8G11藉由用包含PLA2-GIB之N端部分的肽免疫接種而產生。基於抗體對前PLA2-GIB之極高親和力及其對前體形式之選擇性來選擇該抗體。測定8G11之重鏈及輕鏈之胺基酸序列，從而允許此抗體之重組產生。測試發明人所製備之其他單株抗體競爭性地抑制8G11與前PLA2-GIB之結合的能力。發現單株抗體18D9確實可競爭性地抑制8G11與前PLA2-GIB之結合(參見表4)。
在一特定實施例中，本發明由此係關於結合人類PLA2-GIB的前體形式且競爭性地抑制單株抗體8G11與人類sPLA2-GIB之結合的任何單株抗體或其變異體或片段。
在一更特定實施例中，本發明之單株抗體為抗體8G11或其變異體或片段。
8G11輕鏈可變區及重鏈可變區之胺基酸序列分別提供於SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 17中。
在一更特定實施例中，本發明係關於一種單株抗體，其包含：(i)輕鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3組成或基本上由其組成的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3；及(ii)重鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 17之重鏈可變區之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3組成或基本上由其組成的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
參考SEQ ID NO: 15，三個CDR區對應於以下胺基酸殘基：
. CDR-L1：胺基酸殘基KSVSTSGYSY (SEQ ID NO: 45)，
. CDR-L2：胺基酸殘基LVS (SEQ ID NO: 46)。
參考SEQ ID NO: 17，三個CDR區對應於以下胺基酸殘基：
. CDR-H1：胺基酸殘基GYTFNDDE (SEQ ID NO: 47)，
. CDR-H2：胺基酸殘基IDPETGGT (SEQ ID NO: 48)，
. CDR-H3：胺基酸殘基QLIFHGNPYYCMDY (SEQ ID NO: 49)。
在一更特定實施例中，本發明係關於一種單株抗體，其包含由SEQ ID NO: 15組成或基本上由其組成之輕鏈可變區及/或由SEQ ID NO: 15組成或基本上由其組成之重鏈可變區。
抗前PLA2-GIB之抗體可具選擇性且基本上僅結合蛋白質之前體形式。特定言之，8G11結合前PLA2-GIB且基本上不結合蛋白質之sPLA2-GIB形式。
抗 sPLA2-GIB 及前 -PLA2-GIB 之 雙重抗體
在一特定態樣中，本發明係關於結合人類PLA2-GIB蛋白質之成熟分泌形式(sPLA2-GIB)及前體形式(前-sPLA2-GIB)兩者的單株抗體或其片段。
此類抗體之一特定實例為1C11。抗體1C11藉由用sPLA2-GIB免疫接種而產生。基於抗體對前PLA2-GIB及sPLA2-GIB兩者之極高親和力來選擇該抗體。測定1C11之重鏈及輕鏈之胺基酸序列，從而允許此抗體之重組產生。測試發明人所製備之其他單株抗體競爭性地抑制1C11與前PLA2-GIB及/或sPLA2-GIB之結合的能力。發現單株抗體4G11、7H12及7E2確實可競爭性地抑制1C11之結合(參見表4)。
在一特定實施例中，本發明由此係關於結合人類PLA2-GIB且競爭性地抑制單株抗體1C11與人類前-PLA2-GIB及/或與人類sPLA2-GIB，較佳與人類前-PLA2-GIB及與人類sPLA2-GIB之結合的任何單株抗體或其變異體或片段。
在一更特定實施例中，本發明之單株抗體為抗體1C11或其變異體或片段。
1C11輕鏈可變區及重鏈可變區之胺基酸序列分別提供於SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 21中。
在一更特定實施例中，本發明係關於一種單株抗體，其包含：(i)輕鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3組成或基本上由其組成的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3；及(ii)重鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 21之重鏈可變區之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3組成或基本上由其組成的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
參考SEQ ID NO: 19，三個CDR區對應於以下胺基酸殘基：
. CDR-L1：胺基酸殘基SSVSY (SEQ ID NO: 50)，
. CDR-L2：胺基酸殘基EIS (SEQ ID NO: 51)，
. CDR-L3：胺基酸殘基QSWNFOLLS (SEQ ID NO: 52)。
參考SEQ ID NO: 21，三個CDR區對應於以下胺基酸殘基：
. CDR-H1：胺基酸殘基GYAFSSFW (SEQ ID NO: 53)，
. CDR-H2：胺基酸殘基IYPGDGDI (SEQ ID NO: 54)，
. CDR-H3：胺基酸殘基VRGWAWFPY (SEQ ID NO: 55)。
在一更特定實施例中，本發明係關於一種單株抗體，其包含由SEQ ID NO: 19組成或基本上由其組成之輕鏈可變區及/或由SEQ ID NO: 21組成或基本上由其組成之重鏈可變區。
此類抗體之另一特定實例為7A10。抗體7A10藉由用sPLA2-GIB免疫接種而產生。基於抗體對前PLA2-GIB及sPLA2-GIB兩者之極高親和力來選擇該抗體。測定7A10之重鏈及輕鏈之胺基酸序列，從而允許此抗體之重組產生。測試發明人所製備之其他單株抗體競爭性地抑制7A10與前PLA2-GIB及/或sPLA2-GIB之結合的能力。發現單株抗體36G10、3B2、18A6及13H8確實可競爭性地抑制7A10之結合(參見表4)。
在一特定實施例中，本發明由此係關於結合人類PLA2-GIB且競爭性地抑制單株抗體7A10與人類前-PLA2-GIB及/或與人類sPLA2-GIB，較佳與人類前-PLA2-GIB及與人類sPLA2-GIB之結合的任何單株抗體或其變異體或片段。
在一更特定實施例中，本發明之單株抗體為抗體7A10或其變異體或片段。
7A10輕鏈可變區及重鏈可變區之胺基酸序列分別提供於SEQ ID NO: 23及SEQ ID NO: 25中。
在一更特定實施例中，本發明係關於一種單株抗體，其包含：(i)輕鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 23之輕鏈可變區之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3組成或基本上由其組成的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3；及(ii)重鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 25之重鏈可變區之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3組成或基本上由其組成的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
參考SEQ ID NO: 23，三個CDR區對應於以下胺基酸殘基：
. CDR-L1：胺基酸殘基QGISIW (SEQ ID NO: 56)，
. CDR-L2：胺基酸殘基KAS (SEQ ID NO: 57)，
. CDR-L3：胺基酸殘基LQSQSYPLT (SEQ ID NO: 58)。
參考SEQ ID NO: 25，三個CDR區對應於以下胺基酸殘基：
. CDR-H1：胺基酸殘基GFSLTSYG (SEQ ID NO: 59)，
. CDR-H2：胺基酸殘基IWGDGST (SEQ ID NO: 60)，
. CDR-H3：胺基酸殘基AKEGGLRRGVYFDY (SEQ ID NO: 61)。
在一更特定實施例中，本發明係關於一種單株抗體，其包含由SEQ ID NO: 23組成或基本上由其組成之輕鏈可變區及/或由SEQ ID NO: 25組成或基本上由其組成之重鏈可變區。
本發明抗體通常為免疫球蛋白質G (IgG)抗體。IgG抗體視重鏈之恆定區之胺基序列之差異而定可分為4種同型：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。本發明抗體可屬於任何IgG同型。
核酸、載體及宿主細胞
本發明亦關於編碼如上文所定義之抗體或片段的核酸，以及含有此類核酸之選殖或表現載體，及重組宿主細胞。
在另一態樣中，本發明係關於編碼本發明抗體之核酸分子或與該編碼序列互補之核酸。較佳地，核酸為經分離或經純化之核酸。
核酸可為DNA (cDNA或gDNA)、RNA或其混合物。其可呈單股形式或呈雙螺旋形式或兩者之混合。其可包含經修飾核苷酸，包含例如經修飾鍵、經修飾嘌呤或嘧啶鹼基或經修飾糖。其可藉由熟習此項技術者已知之任何方法製備，該方法包括化學合成、重組及突變誘發。根據本發明之核酸可自根據本發明之抗體之序列推論，且密碼子用途可根據應轉錄核酸之宿主細胞來調適。此等步驟可根據熟習此項技術者熟知之方法進行且其中一些描述於參考手冊Sambrook等人(Sambrook J, Russell D (2001) Molecular cloning: a laboratory manual, Third Edition Cold Spring Harbor)中。
本發明之核酸可編碼包含抗體之輕鏈的胺基酸序列及/或包含抗體之重鏈的胺基酸序列，或可與此類編碼序列互補。
此類核酸序列之特定實例包括包含以下中之任一者的序列及與其互補之序列：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22及SEQ ID NO: 24。
本發明進一步提供一種包含本發明之核酸的載體。視情況，載體可包含若干個本發明之核酸。特定言之，載體可包含與調節區(亦即包含一或多個控制序列之區域)可操作地連接的本發明之核酸。視情況，載體可包含與若干調節區可操作地連接的若干個本發明之核酸。
術語「控制序列」意謂表現編碼區所必需的核酸序列。控制序列可為內源性或異源性的。熟習此項技術者熟知且當前所使用之控制序列將為較佳的。此類控制序列包括但不限於啟動子、信號肽序列及轉錄終止子。
術語「可操作地連接」意謂相對於編碼序列將對照序列置放於適當位置處，以此方式使得對照序列導引編碼區之表現。
本發明進一步係關於根據本發明之核酸或載體用以轉變、轉染或轉導宿主細胞的用途。
本發明亦提供一種包含一個或若干個本發明之核酸及/或一個或若干個本發明之載體的宿主細胞。
術語「宿主細胞」亦涵蓋因複製期間發生之突變而與親本宿主細胞不一致的親本宿主細胞之任何後代。
適合用於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文中所描述之原核或真核細胞。
舉例而言，抗體可產生於細菌中，在不需要糖基化及Fc效應功能時尤其如此。抗體片段及多肽在細菌中之表現參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton, Methods in Molecular Biology, 第248卷 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 第245-254頁，其描述抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現後，抗體可自可溶性溶離份中之細菌細胞溶菌液分離且可進一步經純化。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為用於編碼抗體之載體的適合選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化型態的真菌及酵母菌株。參見Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004)及Li等人, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。
用於表現糖基化抗體之適合宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之眾多桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為藉由SV40轉變之獼猴腎臟CV1細胞株(COS-7)；人胚腎細胞株(293或293細胞，如例如Graham等人, J. Gen Virol. 36:59 (1977)中所描述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(Sertoli cell) (TM4細胞，如例如Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中所描述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌瘤細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather等人, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)中所描述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。對於適用於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki及Wu, Methods in Molecular Biology, 第248卷 (B.K.C. Lo, 編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁 (2003)。
本發明亦係關於一種用於產生本發明之抗體的方法，其包含在適合於表現抗體之條件下培養包含如上文所提供的本發明在核酸或本發明之載體的宿主細胞，及視情況自宿主細胞或自宿主細胞培養基回收抗體。視情況，所回收抗體可進一步經純化或分離。適合培養基、培養條件及產生方法為技術人員所熟知且可易於根據宿主細胞及待產生之抗體來選擇。
偵測、給與、診斷之方法
在另一態樣中，本發明係關於一種使用如上文所定義之抗體或片段偵測人類PLA2-GIB之方法。可使用或實施該方法以用於偵測人類PLA2-GIB蛋白質之成熟分泌形式(sPLA2-GIB)、前體形式(前-sPLA2-GIB)及/或兩種形式的存在。可使用此類方法或抗體偵測或給與(或定量)樣本中之PLA2-GIB之存在或量，以及評定其前體形式與成熟分泌形式之比率。該等方法尤其適用於偵測或監測與PLA2-GIB活性相關聯的個體中之病理性病況。
在一特定實施例中，該方法包含a)提供樣本，及b)使用如上文所定義之抗體或片段偵測樣本中之人類PLA2-GIB蛋白質之成熟分泌形式(sPLA2-GIB)、前體形式(前-PLA2-GIB)及/或兩種形式的存在或量。
在一特定實施例中，抗體選自14G9、24B2、22C6、28A1、28A3、34G3、22H5及7C5或其片段或變異體，且方法允許偵測sPLA2-GIB之存在或量。
在另一特定實施例中，抗體選自8G11及18D9或其片段或變異體，且方法允許偵測前PLA2-GIB之存在或量。
在另一特定實施例中，抗體選自1C11、7A10、36G10、3B2、18A6、13H8、4G11、7H12及7E2或其片段或變異體，且方法允許偵測PLA2-GIB之總量。
通常，偵測步驟b)包含以下步驟：(i)使樣本或樣本之生物複本與本文中所描述之單株抗體或其片段或變異體中之任一者接觸，及(ii)偵測在步驟(i)中形成的抗體:抗原複合物之存在。
偵測抗體:抗原複合物之存在可藉由技術人員本身所熟知且文獻中充分描述之任何技術來進行。通常，偵測可利用抗PLA2-GIB之第二抗體進行，該第二抗體較佳地結合不同於第一捕獲抗體之抗原決定基的抗原決定基。替代地，捕獲抗體可經標記且偵測步驟可包含通常在移除未結合抗體之後量測反應中之標記的量。
在一特定實施例中，樣本重複分配以使用本發明之抗體、變異體或片段之任何組合單獨地偵測人類PLA2-GIB蛋白質之成熟分泌形式(sPLA2-GIB)、前體形式(前-PLA2-GIB)及/或兩種形式。
在一更特定實施例中，樣本至少兩次重複分配，一次重複為與選自14G9、24B2、22C6、28A1、28A3、34G3、22H5及7C5之抗體或其片段或變異體接觸，從而允許偵測sPLA2-GIB之存在或量；且一次重複為與選自8G11及18D9之抗體或其片段或變異體接觸，從而允許偵測前PLA2-GIB之存在或量。
在一更特定實施例中，樣本再一次重複分配，該重複為與選自1C11、7A10、36G10、3B2、18A6、13H8、4G11、7H12及7E2之抗體或其片段或變異體接觸，從而允許偵測PLA2-GIB之總量。
在一較佳實施例中，方法利用14G9或其變異體或片段以供偵測sPLA2-GIB之存在或量，利用8G11或其變異體或片段以供偵測前PLA2-GIB之存在或量，且/或利用7A10或其變異體或片段以供偵測樣本中之PLA2-GIB之總量。
抗體可固定或不固定於表面或顆粒上。可在任何適當載體或容器(諸如微量培養盤)中、在晶片上、在瓶子中等進行反應。
較佳地，偵測步驟(ii)利用經標記抗體，諸如與報告組共軛或經工程改造而為可偵測的，更佳地該抗體經生物素標記。在一更特定實施例中，用於偵測複合物之抗體選自單株抗體1C11、4G11、7H12及7E2及其變異體及片段，較佳地該抗體為1C11或其變異體或片段，甚至更佳地該抗體為經生物素標記之抗體1C11。
該方法可與任何樣本一起使用，諸如任何生物樣本，諸如血清樣本、血漿樣本、全血、生物流體等。在更特定實施例中，用於上述方法中之任一者中之樣本獲自個體。樣本可在偵測之前，諸如藉由稀釋、濃縮、富集等處理。其可在用於本發明方法之前凍乾、滅菌、冷凍等。
在特定實施例中，該方法用於評定PLA2-GIB之前體形式與成熟分泌形式之比率。
在其他特定實施例中，上述方法可用於監測與PLA2-GIB之活性相關聯的個體中之病理性病況。與PLA2-GIB之活性相關聯的病理性病況之實例為諸如在病毒血症HIV感染之患者體內的CD4 T淋巴球之無應答性。
在另一態樣中，本發明係關於套組，其包含如本文中所描述之至少一種抗體或其片段及用以執行、偵測或定量免疫反應，或抗體-抗原複合物之試劑。
本發明之其他態樣及優勢將揭示於以下實驗章節中。
實例
物質及方法
1- 人類重組前 -sPLA2-GIB 及 sPLA2-GIB 蛋白質之產生
人類前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB根據所公開步驟產生(Singer等人2002；Rouault等人2007)。
2- 抗 -sPLA2-GIB 抗體及抗前 -sPLA2-GIB 抗體之產生
藉由用重組人類sPLA2-GIB及重組人類前-sPLA2-GIB使小鼠免疫來進行第一系列免疫接種。藉由用對應於人類PLA2-GIB前肽之18個胺基酸肽(序列NH2-DSGISPRAVWQFRKMIKC-COOH，SEQ ID NO: 62)隨後成熟活性sPLA2-GIB之前11個胺基酸(參見SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基16-33)使小鼠免疫來進行第二系列免疫接種。藉由蛋白質A親和力來純化mAb並將其量化。根據製造商之說明書用市售小鼠mAb亞型分析套組來測定Ig類mAb。
3- sPLA2-GIB 酶活性之抑制
根據所公開步驟測試藉由不同單株抗體(mAb)進行之sPLA2-GIB酶活性之抑制(Rouault等人2007)。簡言之，重組人類sPLA2-GIB (0.1 nM)在37℃下與體積逐漸增加之雜交瘤細胞培養物上澄液(資料未展示)或量逐漸增加(0.1、0.3、1及3 µg)之靶向人類sPLA2-GIB之經純化兔多株免疫血清或經純化單株抗體一起培育30分鐘。接著使用[3H]-油酸酯-放射性標記之經熱壓處理大腸桿菌膜作為sPLA2-GIB活性緩衝液中之磷脂受質來量測sPLA2-GIB酶活性。藉由添加300 μL停止緩衝液來停止反應，接著以10000 g使混合物離心5分鐘，且對含有釋放之[3H]-油酸酯之上澄液進行計數。
使用市售螢光酶活性分析確認結果。重組人類sPLA2-GIB (3 nM)在室溫下與量逐漸增加之經純化單株抗體一起培育120分鐘。接著使用選擇性螢光方法(AteroDX® sPLA2 Activity. Aterovax. Paris. France)來量測sPLA2-GIB酶活性。結果以每mL樣本(U/mL)單位表示，其中一個單位定義為在一分鐘內催化1 nmol產物之釋放的sPLA2-GIB酶之量。分析偵測限值為17 U/mL，其中上限線性分析型範圍為232 U/mL，且功能靈敏度(20%)為21 U/mL。平均運行內變化率及平均分析內變化率分別為5.9%及8.9%。兩種方法之結果使用Prism™軟體(Graph Pad)利用4參數擬合分析來分析且報導為IC50。
4- 間接 ELISA
通常在4℃下用100 ng含重組人類sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB之PBS (pH 7.5)塗佈微量培養盤孔隔夜。用含有0.05% Tween 20之PBS洗滌樣本孔三次。在最終洗滌之後，在室溫下用含阻斷溶液(含有1%牛血清白蛋白(BSA))之PBS緩衝液處理樣本孔60分鐘。在用含有0.05% Tween 20之PBS洗滌之後，將針對人類前-sPLA2-GIB或sPLA2-GIB之量逐漸增加(10 ng/mL直至3 µg/mL)之mAb添加至經抗原塗佈之孔中，且在室溫下培育120分鐘。在用含有0.05% Tween 20之PBS洗滌之後，mAb之結合用HRP共軛之山羊抗小鼠IgG或IgA多株抗體試劑偵測且使用比色受質產生。使用Prism™軟體(Graph Pad)利用4參數擬合分析來分析信號對溶液中之抗原之濃度的依賴性且其報導為EC50。
5- 競爭性 ELISA
藉由基於培養盤之競爭免疫分析來量測抗體與前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB之結合親和力。對於競爭ELISA，簡言之，使不同位準處之恆定量之抗體與範圍介於0至10 μg/ml之抗原蛋白質、人類sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB之連續稀釋液預混合，且在室溫下培育兩小時以在抗體與抗原之間達成偽結合平衡。接著將此等溶液轉移至96孔sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB預塗佈培養盤以允許混合物中之游離抗體與培養盤塗佈之sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB結合。培養盤通常在4℃下用30至100 ng含人類sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB蛋白質之PBS溶液塗佈隔夜，隨後為BSA非特異性阻斷。在洗除溶液中之過量抗體後，培養盤結合之抗體用HRP共軛之山羊抗小鼠IgG或IgA多株抗體試劑偵測且使用比色受質產生。使用Prism™軟體(Graph Pad)利用4參數擬合分析來分析信號對溶液中之抗原之濃度的依賴性且其報導為IC50。
6- 藉由 SPR 進行之 親和力測定
藉由表面動力學在即時生物感測器表面電漿子共振分析(BIAcore™)上測定與上文所描述之所選抗體結合的前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB之親和力常數(KD)。更特定言之，使用BIAcore® 2000針對人類前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB來量測抗體之親和力。在抗小鼠IgG表面上捕獲抗體且將其暴露於各種濃度之重組前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB蛋白質。使用BIAevaluation™軟體進行動力學分析以獲得締合及解離速率常數。
7- 抗原決定基映射及 mAb 競爭
通常在4℃下用10 ng含重組人類sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB之PBS (pH 7.5)塗佈微量培養盤孔隔夜。用含有0.05% Tween 20之PBS洗滌樣本孔三次。在最終洗滌之後，在室溫下用含阻斷溶液(含有1%牛血清白蛋白(BSA))之PBS緩衝液處理樣本孔60分鐘。在用含有0.05% Tween 20之PBS洗滌之後，在1 µg未經生物素標記之mAb的存在下將10 ng經生物素標記之mAb (#14G9、#1C11、#8G11或#7A10)添加至抗原塗佈之孔中且在室溫下培育120分鐘。在用含有0.05% Tween 20之PBS洗滌之後，mAb之結合用抗生蛋白鏈菌素-HRP共軛物偵測且使用比色受質產生。
8- mAb 可變區之定序
mAb可變區根據典型步驟定序。簡言之，高純度RNA自融合瘤細胞萃取且互補DNA股使用高保真逆轉錄酶合成。PCR產物使用高保真PCR產生，且使特異性靶向編碼抗體重鏈及輕鏈之cDNA的簡併引子直接定序(雙股定序)。分析且組譯cDNA序列。肽序列根據抗體結構來轉譯及驗證。
9- sPLA2-GIB 及前 -sPLA2-GIB 夾層 ELISA 之建立
藉由使用上文所描述之mAb來建構特定針對前-sPLA2-GIB、sPLA2-GIB或兩種形式之夾層ELISA。為偵測前-sPLA2-GIB，#8G11 mAb用作捕獲抗體且#1C11 mAb用作揭示mAb。為偵測sPLA2-GIB，#14G9 mAb用作捕獲抗體且#1C11 mAb用作揭示mAb。為偵測兩種形式，#7A10 mAb用作捕獲抗體且#1C11 mAb用作揭示mAb。研究諸如微量培養盤之性質、孔中之最終體積、培育時間及溫度、抗生蛋白鏈菌素-HRP之性質及濃度、分析緩衝液之組份、所添加清潔劑之性質及濃度的不同參數來最佳化分析。典型分析條件如下：#8G11-塗佈之微量培養盤或#14G9塗佈之微量培養盤與重組人類前-sPLA2-GIB或sPLA2-GIB標準品(分析緩衝液中之不同濃度之蛋白質)培育一小時以產生校準曲線。在稀釋緩衝液中將EDTA血漿樣本稀釋(5倍至50倍)至其各別孔，且ELISA培養盤在室溫下培育1小時。在抽吸之後，孔用含有Tween 20 0.05%之PBS洗滌3次，且在室溫下將經生物素標記之#1C11共軛物添加至孔中30分鐘。在用含有0.05% Tween 20之PBS洗滌之後，在室溫下藉由用抗生蛋白鏈菌素-HRP共軛物處理15分鐘來偵測mAb之結合。添加TMB，停止反應且在微量培養盤讀取器上測定450 nm處之吸光度。使用Prism™軟體(Graph Pad)利用4參數擬合分析來分析信號。
10- 測定人類血漿樣本中之 sPLA2-GIB 及前 -sPLA2-GIB 濃度
根據上文出現之條件利用偵測前-sPLA2-GIB、sPLA2-GIB及兩種形式(總PLA2-GIB)的三個不同ELISA分析來測試來自99個表觀健康的供體(其中年齡、性別及身體質量指數(Bioreclamation IVT)已知)之商用群體的EDTA血漿樣本。使用非參數測試(Spearman R)來評估參數之間的相關性。
結果
抗 -sPLA2-GIB 抗體及抗前 -sPLA2-GIB 抗體之產生
藉由用重組人類前-sPLA2-GIB、重組人類sPLA2-GIB或對應於人類sPLA2-GIB前肽之18個胺基酸肽，隨後為成熟活性sPLA2-GIB之前11個胺基酸使小鼠免疫來產生單株抗體。用於產生各次純系之抗原描述於表1中。
藉由抑制 sPLA2 酶活性篩選抗體
在量逐漸增加之經純化單株抗體的存在下藉由將放射性標記之膜與重組人類sPLA2-GIB一起培育來測試不同mAb抑制sPLA2-GIB酶活性的能力。結果表述為在所測試mAb之最高濃度下觀測到的酶活性抑制百分比且呈現於表1中。
藉由間接 ELISA 比較抗體
藉由用人類sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB塗佈微量培養盤且利用HRP共軛之山羊抗小鼠IgG多株抗體試劑偵測結合之mAb在間接ELISA步驟中比較不同mAb。典型信號曲線之實例呈現於圖2中且根據彼等曲線估計之EC50呈現於表1中。
藉由競爭性 ELISA 進行 抗體之親和力測定
藉由基於培養盤之競爭免疫分析量測抗體與人類前-sPLA2-GIB及人類sPLA2-GIB之各別結合親和力。簡言之，不同位準處之恆定量之抗體與抗原蛋白質之連續稀釋液預混合以在抗體與抗原之間達成偽結合平衡。接著將此等溶液轉移至抗原預塗佈之培養盤以允許混合物中之游離抗體與培養盤塗佈之sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB結合。用HRP共軛之多株抗體來偵測培養盤結合之抗體。滴定曲線之實例呈現於圖3中。資料與4PL邏輯非線性回歸模型擬合且根據該模型估計相對IC50值(表2)。
藉由 SPR 進行 抗體之親和力測定
藉由表面動力學在即時生物感測器表面電漿子共振分析(BIAcore™)上測定與上文所描述之所選抗體結合的前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB之親和力常數(KD)。更特定言之，使用BIAcore® 2000針對人類前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB來量測抗體之親和力。在抗小鼠IgG表面上捕獲抗體且將其暴露於各種濃度之重組前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB蛋白質。使用BIAevaluation™軟體進行動力學分析以獲得締合及解離速率常數(表3)。
抗原決定基映射及 mAb 競爭
藉由競爭ELISA評估#14G9、#1C11、#8G11、及#7A10 mAb之抗原決定基映射。在過量未經生物素標記之mAb的存在下將經生物素標記之mAb #14G9、#1C11、#8G11或#7A10添加至sPLA2-GIB或前sPLA2-GIB塗佈之培養盤中。接著用抗生蛋白鏈菌素-HRP共軛物來偵測結合的mAb。結果在減除自體性競爭之後表述為信號百分比，其中0%表示最大競爭且100%表示無競爭(表4)。
可變區之定序
本發明抗體之輕鏈及重鏈之可變區的胺基酸及核酸序列經測定並呈現於序列表中。
藉由夾層 ELISA 偵測前 -sPLA2-GIB 、 sPLA2-GIB 或兩種形式
使用經調適mAb對來產生特定針對前-sPLA2-GIB、sPLA2-GIB或兩種形式之夾層ELISA (參見表5)。#8G11 mAb用於特異性捕獲呈其酶原失活形式之酶。#14G9次純系(作為成熟sPLA2-GIB之高特異性mAb)用於捕獲成熟酶。#7A10 mAb用於捕獲兩種形式。使用高度親和#1C11次純系之經生物素標記之共軛物來偵測所捕獲抗原。不同分析條件經最佳化，且分別評估特定針對前-sPLA2-GIB、sPLA2-GIB及兩種形式的三個不同夾層ELISA之分析型效能。此等三個不同分析之分析型效能之概述呈現於表5中。
藉由向兩個人類血清樣本摻入前-sPLA2-GIB或sPLA2-GIB來測試分析準確性。三個分析之回收百分比在80%與120%之間，從而表明基質作用有限。偵測之分析限值基於來自零校準器之平均+ 3SD評估來估計且針對前-sPLA2-GIB、sPLA2-GIB或兩種形式分析經測定分別為0.1 ng/mL、0.02 ng/mL及0.10 ng/mL。由於人類血清樣本含有內源性量之前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB，因此在測試其定量下限之前首先用#8G11 mAb或#14G9 mAb去除人類血清樣本。LLOQ基於所去除人類血清之平均光學密度來估計且針對前-sPLA2-GIB、sPLA2-GIB或兩種形式分析分別為0.04 ng/mL、0.02 ng/mL及0.08 ng/mL。基於對摻有量逐漸增加之重組前-sPLA2-GIB或sPLA2-GIB的樣本之評估，分析HLOQ針對前-sPLA2-GIB、sPLA2-GIB或兩種形式分析經測定分別為5 ng/mL、1 ng/mL或5 ng/mL。藉由反覆測試在動態範圍內分佈之3種人類血清來測定運行內及運行間CV (分析精確度)。發現運行內及運行間CV的範圍在2.3%與14.5%之間(詳細參見表5)。在針對三個不同分析以高類風濕因子位準(至多600 UI/mL)測試六個人類樣本時未觀測到顯著干擾。藉由測試連續稀釋高位準樣本來測定分析線性。平均回收%在80%與120%之間，從而表明三個分析之良好線性。
測定人類血漿樣本中前 -sPLA2-GIB 、 sPLA2-GIB 或兩種形式之濃度
上文所描述之ELISA夾層方法用於檢查臨床上相關年齡範圍為25-59歲中之50個表觀健康的男性及49個表觀健康的女性之總計99個樣本中年齡、性別及身體質量指數(BMI)之前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB分佈。此人群之平均(SD)年齡為41.5 (9.8)歲且平均(SD) BMI為30.5 (7.9)。
在總分析人群中，前-sPLA2-GIB位準範圍介於1.0至16.3 ng/mL。平均(SD)前-sPLA2-GIB位準為7.8 (2.8) ng/mL且中位值為7.5 ng/mL。sPLA2-GIB位準範圍介於25 pg/mL至1.3 ng/mL且平均(SD)為287 (243) pg/mL且中位值為231 pg/mL。總sPLA2-GIB位準範圍介於2.5至20.5 ng/mL，平均(SD)為9.3 (3.2) ng/mL且中位值為9.1 ng/mL。
患者特徵呈現於表6中且前-sPLA2-GIB、sPLA2-GIB及兩種形式(總)位準之性別及年齡百分位分佈以及平均(SD)呈現於表7中。如表6中所指示，在測試人群內，在前-sPLA2-GIB、sPLA2-GIB或兩種形式位準與性別、年齡或BMI之間未觀測到相關性。
前-sPLA2-GIB與總sPLA2-GIB位準高度相關(Spearman R = 0.938，p ＜ 0.0001)，然而前-sPLA2與sPLA2-GIB位準僅微弱相關(Spearman R = 0.318，p = 0.002)。
#14G9 mAb 對 藉由 sPLA2-IB 抑制磷酸 -STAT5 核位移的活體外作用
藉由首先在小鼠中注射1 mg之#14G9 mAb，隨後注射100 µg之sPLA2-GIB來測試#14G9 mAb在活體內抗衡注射sPLA2-IB對CD4 T細胞中的IL-7誘導之磷酸-STAT5核位移之抑制作用的能力。接著藉由共焦顯微鏡分析自經處理小鼠之脾細胞分離之CD4 T細胞中的磷酸-STAT5之核位移。
如圖4中所描繪，在小鼠中注射100 µg之sPLA2-GIB引起自脾細胞分離之CD4 T細胞中的磷酸STAT5之核位移之60%抑制。此作用藉由先前注射1 mg之#14G9 mAb完全消除，其中在對照注射劑中未觀測到顯著作用。
抗原決定基之定義
#14G9之人類化形式之Fab片段與其抗原共結晶，在Soleil Synchrotron (St. Aubin, France)處在PROXIMA-1 Beamline上收集共晶之sPLA2-GIB及x射線繞射資料。晶體屬於每不對稱單元具有兩種sPLA2-GIB/Fab複合物之P21空間群(a = 71.9Å，b = 83.8Å，c = 103.9Å；α = β = 99.58°)。sPLA2-GIB/Fab複合物之結構之解析度使得能夠鑑別涉及複合物中之非共價相互作用的關鍵殘基且定義抗原決定基。如圖5中所呈現，sPLA2-GIB中之W3、R6及K7涉及與Fab輕鏈之相互作用，且sPLA2-GIB中之K10、C77、Y75、G79及S80涉及與Fab重鏈之相互作用。
序列表
表 1
表 2
表 3
n. d.：不可偵測。t½ ：半衰期常數(= 1/koff )。
表 4
表 5
表 6
表 7
圖 1 ： 藉由#14G9、#6F7及#1C11抗體抑制sPLA2-GIB酶活性。資料與4PL邏輯非線性回歸模型擬合且根據該模型估計相對IC50值。
圖 2 ： 抗sPLA2-GIB抗體在間接ELISA中之稀釋曲線資料與4PL邏輯非線性回歸模型擬合且根據該模型估計相對EC50值。
圖 3 ： 藉由競爭性ELISA比較抗體。
圖 4 ： 藉由1 mg單株抗體14G9活體內抑制100 µg sPLA2-GIB對自小鼠脾細胞分離之CD4 T細胞中之磷酸STAT5之核位移的抑制作用。在注射900 µg同型對照mAb時未觀測到顯著作用。
圖 5 ： 抗原決定基鑑別：Fab#2B2/sPLA2-GIB複合物中之非共價鍵，sPLA2-GIB主鏈呈黃色，#2B2 Fab輕鏈呈淺藍色且#2B2 Fab重鏈呈綠色。
表 1 ： 針對前-sPLA2-IB及sPLA2-IB的36個mAb之描述。針對各次純系列出用於免疫接種之抗原、同型、sPLA2酶活性抑制及藉由間接ELISA測定的前-sPLA2與sPLA2-IB之相對親和力。
表 2 ： 藉由競爭性ELISA測定之針對重組人類sPLA2-IB及重組人類前-sPLA2-IB之ELISA IC50。
表 3 ： 藉由表面等離子共振針對重組人類sPLA2-IB及重組人類前-sPLA2-IB之測定Kd。
表 4 ： 藉由競爭ELISA進行之抗原決定基映射。結果在減除自體性競爭之信號之後表示為信號百分比，其中0%表示最大競爭且100%表示無競爭。
表 5 ： 特定針對前-sPLA2-IB、sPLA2-IB或兩種形式的夾層ELISA之分析型效能之概述。
表 6 ： sPLA2-IB、總sPLA2-IB及sPLA2-IB在表觀健康的雄性及雌性中之分佈以及與年齡及BMI之相關性。
表 7 ： 前-sPLA2-IB、sPLA2-IB及兩種形式在表觀健康的雄性及雌性中之百分比分佈。

Claims (20)

  1. 一種單株抗體或其變異體或片段，其與人類sPLA2-GIB蛋白質結合，其中該抗體、變異體或片段競爭性地抑制單株抗體14G9與人類sPLA2-GIB之結合，該單株抗體14G9包含含有SEQ ID NO: 2之輕鏈可變區及含有SEQ ID NO: 4之重鏈可變區。
  2. 如請求項1之單株抗體或其片段，其中該抗體抑制sPLA2-GIB。
  3. 如請求項1之單株抗體或其片段，其中該抗體結合包含至少一個胺基酸殘基之抗原決定基，該胺基酸殘基選自人類sPLA2-GIB蛋白質之W3、R6、K7、K10、C77、Y75、G79及S80，參考SEQ ID NO: 26。
  4. 一種單株抗體或其片段，其與人類sPLA2-GIB蛋白質上之抗原決定基結合，其中該抗原決定基包含選自人類sPLA2-GIB蛋白質之W3、R6、K7、K10、C77、Y75、G79及S80的至少一個胺基酸殘基。
  5. 如請求項1之單株抗體或其片段，其中該抗體包含：輕鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 2之該輕鏈可變區之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3組成或基本上由其組成的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3；及重鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 4之該重鏈可變區之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3組成或基本上由其組成的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
  6. 如請求項1之單株抗體或其片段，其中該抗體包含：輕鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 5之該輕鏈可變區之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3組成或基本上由其組成的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3；及重鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 7之該重鏈可變區之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3組成或基本上由其組成的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
  7. 如請求項1之單株抗體或其片段，其中該抗體包含：輕鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 11之該輕鏈可變區之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3組成或基本上由其組成的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3；及重鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 13之該重鏈可變區之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3組成或基本上由其組成的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
  8. 一種單株抗體或其片段，其與人類前-PLA2-GIB蛋白質結合，其中該抗體競爭性地抑制單株抗體8G11與人類前-PLA2-GIB之結合，該單株抗體8G11包含含有SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及含有SEQ ID NO: 17之重鏈可變區。
  9. 如請求項8之單株抗體或其片段，其中該抗體包含：輕鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 15之該輕鏈可變區之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3組成或基本上由其組成的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3；及重鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 17之該重鏈可變區之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3組成或基本上由其組成的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
  10. 一種單株抗體或其片段，其結合人類PLA2-GIB蛋白質之分泌形式(sPLA2-GIB)及前體形式(前-PLA2-GIB)兩者。
  11. 如請求項10之單株抗體或其片段，其中該抗體競爭性地抑制單株抗體1C11與人類PLA2-GIB蛋白質之分泌及/或前體形式的結合，該單株抗體1C11包含含有SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及含有SEQ ID NO: 21之重鏈可變區。
  12. 如請求項11之單株抗體或其片段，其中該抗體包含：輕鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 19之該輕鏈可變區之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3組成或基本上由其組成的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3；及重鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 21之該重鏈可變區之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3組成或基本上由其組成的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
  13. 如請求項11之單株抗體或其片段，其中該抗體競爭性地抑制單株抗體7A10與人類PLA2-GIB蛋白質之分泌及/或前體形式的結合，該單株抗體7A10包含含有SEQ ID NO: 23之輕鏈可變區及含有SEQ ID NO: 25之重鏈可變區。
  14. 如請求項13之單株抗體或其片段，其中該抗體包含：輕鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 23之該輕鏈可變區之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3組成或基本上由其組成的CDR-L1、CDR-L2及/或CDR-L3；及重鏈可變區，其包含分別由SEQ ID NO: 25之該重鏈可變區之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3組成或基本上由其組成的CDR-H1、CDR-H2及/或CDR-H3。
  15. 一種組合物，其包含如請求項1至14中任一項之抗體。
  16. 一種核酸，其編碼如請求項1至14中任一項之抗體，或其輕鏈或重鏈，或其可變域。
  17. 一種偵測樣本中之人類PLA2-GIB蛋白質之方法，其包含： (i)使該樣本與如請求項1至14中任一項之單株抗體接觸，以及 (ii)偵測在步驟(i)中形成之抗體:抗原複合物之存在。
  18. 如請求項17之方法，其中該樣本重複分配以使用如請求項1至14中任一項之抗體之任何組合單獨地偵測該人類PLA2-GIB蛋白質之成熟分泌形式(sPLA2-GIB)、前體形式(前-PLA2-GIB)及/或兩種形式。
  19. 如請求項17或18之方法，其用於給與或監測該成熟分泌形式(sPLA2-GIB)、該前體形式(前-PLA2-GIB)及/或該總人類PLA2-GIB蛋白質之量。
  20. 一種套組，其包含至少一種如請求項1至14中任一項之抗體或其片段及用以執行、偵測或定量免疫反應，或抗體-抗原複合物之試劑。
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