CN115947857A

CN115947857A - 与imp酶结合的抗体或其抗原结合片段及其应用

Info

Publication number: CN115947857A
Application number: CN202211195141.4A
Authority: CN
Inventors: 彭憬; 刘春龙; 付成华; 粟艳; 周泽奇
Original assignee: Dana Hunan Biotechnology Co ltd; Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Current assignee: Dana Hunan Biotechnology Co ltd; Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Priority date: 2022-09-27
Filing date: 2022-09-27
Publication date: 2023-04-11

Abstract

本发明提供了一种与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段及其应用，涉及单克隆抗体的技术领域。该与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段具有分别如Seq_1～3所示，或分别如Seq_11～13所示的轻链CDR；和/或，分别如Seq_4～6所示，或分别如Seq_14～16所示的重链CDR。该与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段具有特异性好、亲和力高等特点，缓解了现有技术中与IMP酶结合的单克隆抗体效果不佳的技术问题。

Description

与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段及其应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其是涉及一种与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段及其应用。

背景技术

根据碳青霉烯酶活性位点结构与功能基团差异，可将其分为金属β-内酰胺酶(MBLs或B类酶)和基于丝氨酸的碳青霉烯酶(A和D类酶)两类。IMP(metallo-β-lactamasesresistant to imipenem)酶是首个在革兰氏阴性菌中检测到的获得性金属酶，可以水解青霉素类、碳青霉烯类以及头孢菌素类药物，但不能水解氨曲南。目前在全球范围已经有52种IMP亚型在临床分离的革兰氏阴性菌中检测到，如假单胞菌属，不动杆菌属以及肠杆菌科细菌。

IMP-1被认为是首个在革兰氏阴性菌中检测到的耐碳青霉烯类抗生素且由质粒编码的可移动性MBL。IMP-1被发现于1988年在日本分离的铜绿假单胞菌中。此后，blaIMP-1又在日本的粘质沙雷菌中被分离出来。目前已在超过15个国家或地区的革兰阴性菌中检测到blaIMP-1。IMP-2于1997年在意大利的一株鲍曼不动杆菌中首次被发现，随后也在日本的一株鲍曼不动杆菌和另外四种革兰氏阴性菌中检测到。在我国，IMP-1、IMP-4、IMP-8和IMP-9是常见的几类碳青霉烯酶。1998我国首次在香港报道检出IMP型金属酶即是IMP-4，随后不久，我国台湾从1株多药耐药肺炎克雷伯菌中分离到IMP-8，2007年，我国在浙江省医院的一株阴沟肠杆菌中首次检出IMP-1。

大多IMP酶介导的氨基酸序列包含246个残基，IMP-9、IMP-11、IMP-21的序列由245个残基构成。某些blaIMP基因的等位基因是单点或双点突变体，例如IMP-10与IMP-1的不同主要是由单个碱基导致氨基酸的改变，IMP-3与IMP-1相比有2个氨基酸不同，其中196位氨基酸由丝氨酸(Ser)残基转变为甘氨酸(Gly)残基，导致IMP-3不能水解青霉素、氨苄西林、头孢他啶和亚胺培南；还有某些等位基因彼此相对分散，IMP-9和IMP-18是相对最远的IMP变体，有53个不同的氨基酸残基。IMP酶具备典型的金属酶特征，即对青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类具有不同程度的水解活性，但几乎不水解氨曲南，也不被β-内酰胺酶抑制剂抑制。

美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory StandardsInstitute,CLSI)推荐改良霍奇试验作为肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的表型确证试验。将大肠埃希菌(ATCC25922)涂到MH琼脂平板上形成菌苔(0.5麦氏浊度1:10稀释)，然后将厄他培南或美罗培南纸片放在中心，将待测分离菌从纸片的边缘划线到平板的边缘，过夜培养，若出现苜蕾叶状抑菌环为碳青霉烯酶表型阳性。但用此方法进行IMP酶检测，其敏感性和特异性还有待于进一步研究和评定。近年来，有学者根据部分碳青霉烯酶可被金属离子整合剂抑制的特点发展了1种可常规检测其耐药表型的方法，文献报道的主要有纸片扩散法、EPI微量稀释法和浓度梯度(E-test法)，以肉眼观察结果，其敏感性和特异性会受到主观因素、待测菌的产酶能力等方面的影响，存在误读、漏读的可能，用时较长。Carba NP试验对大多数酶有很好的敏感性，CIM是实验室常用于检测IMP酶的方法，该方法具有较好的敏感性和特异性，但会受到细菌产酶能力的影响。

随着分子生物学的发展尤其是聚合酶链反应技术的问世，从基因水平进行检测和分析IMP酶，不仅可以准确、快速检出IMP酶基因，还可以对耐药基因进行定位，这有利于对产IMP酶细菌的耐药机制以及流行病学研究，目前认为分子生物学技术是检测耐药基因型的金标准。但是随着IMP酶新型别的不断发现，需要设计更多IMP酶基因的特异性引物，仅利用当前设计的引物有可能对新型IMP酶基因漏检，并且存在周期长、试验用具、设备等硬件要求高等诸多因素，导致该技术无法大范围地应用到基层医院，操作难度较高，步骤繁琐，部分试验对操作人员有专业要求，多由专业平台或实验室进行，部分试验要求操作人员进行专业课程的学习，单个检测成本较高。

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对特定抗原表位的抗体，通常采用杂交瘤细胞制备，基于细胞融合技术，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，培养成细胞群后，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。特异性抗体检测的目的首先是协助临床诊断，在某些疾病中亦是观察疗效及预后的一个指标，耐药性以及传染病流行病学调查中，特异性抗体的检测也具有特殊的、重要的意义。抗体免疫学检测具有以下优点：特异性高，使用特异的单克隆抗体，可用于单一细胞因子的检测；操作简便、快速，无需依赖细胞株，故不需维持培养，可操作性增加，容易推广和便于普查；影响因素相对较少且容易控制，重复性好，方法容易标准化。

CN112501131A公开了抗IMP酶杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用，所述单克隆抗体具有纯度效价高、特异性强的特点，适合作为免疫诊断试剂用于体外诊断IMP酶。但是上述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，尽管鼠源单克隆抗体属于使用最广泛的抗体，但仍然存在亲和力弱、特异性差的问题，因此，提供一种改进的IMP酶抗体是目前市场需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段，以缓解现有技术中与IMP酶结合的单克隆抗体效果不佳的技术问题。

本发明的第二目的在于提供一种与上述IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段相关的生物材料、试剂、试剂盒以及它们的应用，以改善现有的对IMP的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区和/或重链可变区；

所述轻链可变区具有由CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3组成的轻链CDR，所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_1、Seq_2和Seq_3所示；

或者，所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_11、Seq_12和Seq_13所示；

所述重链可变区具有由CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3组成的重链CDR，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_4、Seq_5和Seq_6所示；

或者，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_14、Seq_15和Seq_16所示。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种生物材料，生物材料包括核酸片段、载体或宿主细胞；

所述核酸片段选自(a1)或(a2)：(a1)、DNA或RNA，其编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段；(a2)、与(a1)中定义的核酸片段互补的核酸片段；所述载体包括所述核酸片段；所述宿主细胞被所述载体转化，或，所述宿主细胞的基因组中整合有所述核酸。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段的生产方法，包括使用上述宿主细胞表达所述与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种组合物，包括所述与IPM酶结合的抗体或其抗原结合片段和标记物；所述标记物与所述抗体或其抗原结合片段偶联；或，所述标记物与所述抗体或其抗原结合片段分别独立包装。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种用于检测IMP酶的试剂或试剂盒，包含上述抗体或其抗原结合片段，或上述组合物。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了上述与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段，生物材料、生产方法、组合物或用于检测IMP酶的试剂或试剂盒在非诊断和治疗目的的检测IMP酶或非诊断和治疗目的检测产IMP酶的微生物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过NCB序列比对，获得IMP酶的保守序列，通过原核基因表达得到高纯度蛋白。将IMP抗原蛋白免疫新西兰大耳白兔后获取分泌与IMP结合的抗体的B细胞制备杂交瘤细胞，通过筛选获取能够分泌特异性好的抗体的杂交瘤细胞，经测序后得到分别如Seq_1～3所示，或分别如Seq_11～13所示的轻链CDR；以及分别如Seq_4～6所示，或分别如Seq_14～16所示的重链CDR。

本发明提供的与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段的CDR区序列来源于兔，对IMP酶的不同亚型均有特异性结合的能力，具有上述CDR序列的抗体或其抗原结合片段具有抗原识别位点多、特异性好、亲和力高等特点，在各方面均有较佳表现，从而适合作为免疫诊断试剂用于体外诊断IMP酶或分泌IMP酶的微生物，效价达到了1:1280000以上。尤其是上述轻链CDR和重链CDR在一些组合中构成的不同抗体之间可以良好的配对，可以应用于以形成抗体-抗原-抗体复合物为原理的免疫检测方法中，例如作为双抗夹心ELISA中的一抗和二抗；或分别作为免疫层析检测卡中的标记抗体和包被于检测区的抗体等。

本发明提供的与IMP结合的抗体或其抗原结合片段，以及与其相关的生物材料制备得到的试剂或试剂盒能够用于耐药菌株的早期分型，并指导临床用药，辅助临床感染控制和治疗。含有具有上述CDR序列的抗体或其抗原结合片段的试剂或试剂盒能够通过定性或半定量的检测从患者分离出来的细菌样本或者阳性血培养样本中的IMP酶，来快速准确地判断患者细菌耐药的程度，快速检测细菌样本中是否存在IMP酶，临床上可用于指导用药。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例制备得到的抗体1和抗体2的SDS-PAGE电泳结果；

图2为本发明实施例制备得到的抗体1和抗体2采用ELISA方法检测的对IMP酶的亲和活性的结果；

图3为本发明实施例制备得到的抗体1与KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48酶的反应结果；

图4为本发明实施例制备得到的抗体2与KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48酶的反应结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段至少包含一个轻链可变区或一个重链可变区，或者同时包含轻链可变区和重链可变区。

轻链可变区：

所述轻链可变区具有由CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3组成的轻链CDR。

所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如下所示：

CDR-L1:TGTSSDIGNNDYVS(Seq_1)；

CDR-L2:DVSRRPS(Seq_2)；

CDR-L3:SSYAGSSNLV(Seq_3)。

含有由上述CDR-L1(Seq_1)、CDR-L2(Seq_2)和CDR-L3(Seq_3)组成的轻链CDR的轻链可变区的氨基酸序列优选如下所示：

QSVLTQPSSASTSPGSSVKLSCTGTSSDIGNNDYVSWYQQYMGRPPTNIIYDVSRRPSGVSDRFSGSIDRSSNTAFLTVNNVQADDEADYYCSSYAGSSNLVFGGGTKLTV(Seq_7)。

或者，所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如下所示：

CDR-L1:RASQTVTSYLA(Seq_11)；

CDR-L2:DASNRAT(Seq_12)；

CDR-L3:QQRSDRPPAFT(Seq_13)。

含有由上述CDR-L1(Seq_11)、CDR-L2(Seq_12)和CDR-L3(Seq_13)组成的轻链CDR的轻链可变区的氨基酸序列优选如下所示：

TQSPASLSLSPGERATLSCRASQTVTSYLAWYQQRAEQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDRPPAFTFGPGTKVEIK(Seq_17)。

在一些可选的实施方式中，上述轻链可变区的N端还含有信号肽，轻链可变区的信号肽的氨基酸序列优选为：

MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC(Seq_21)。

重链可变区：

所述重链可变区具有由CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3组成的重链CDR。

所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如下所示：

CDR-H1:GYWMH(Seq_4)；

CDR-H2:YINSDGSSTNYADSVKG(Seq_5)；

CDR-H3:GGGYSYGPFD(Seq_6)。

含有由上述CDR-H1(Seq_4)、CDR-H2(Seq_5)和CDR-H3(Seq_6)组成的重链CDR的重链可变区的氨基酸序列优选如下所示：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMHWVRQAPEKGLVWVAYINSDGSSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMNSLRAEDTAMYYCARGGGYSYGPFDYWGQGTSVTVSS(Seq_9)。

或者，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_14、15和16所示：

CDR-H1:TSSFYWG(Seq_14)；

CDR-H2:NIYYSGSITYNPSLTS(Seq_15)；

CDR-H3:RQITFNYNAVSGHDAFDV(Seq_16)。

含有由上述CDR-H1(Seq_14)、CDR-H2(Seq_15)和CDR-H3(Seq_16)组成的重链CDR的重链可变区的氨基酸序列优选如下所示：

DVQLQESGPGLVKPSQTVSLTCTVSGGSISTSSFYWGWIRQFPGNKLEWIGNIYYSGSITYNPSLTSRVTITRDTSKNQFFLEMNSVTAADTAIYYCAGRQITFNYNAVSGHDAFDVWGTGTTVTVSS(Seq_19)。

在一些可选的实施方式中，上述重链可变区的N端还含有信号肽，重链可变区的信号肽的氨基酸序列优选为：

MDWTWRFLFVVAAATGVQS(Seq_22)。

在一些优选的实施方式中，与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段同时含有轻链可变区和重链可变区。当同时含有轻链可变区和重链可变区时，轻链CDR和重链CDR优选按照如下(A)和(B)两种方式组合：

(A)组成轻链可变区轻链CDR的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_1、Seq_2和Seq_3所示；

同时，组成重链可变区重链CDR的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_4、Seq_5和Seq_6所示。

在该组合方式中，优选的实施方式为轻链可变区的氨基酸序列如Seq_7或Seq_23所示，同时重链可变区的氨基酸序列如Seq_9或Seq_24所示。Seq_23所示的轻链可变区为Seq_7所示氨基酸序列的N端融合有Seq_21所示的信号肽；Seq_24所示的重链可变区为Seq_9所示氨基酸序列的N端融合有Seq_22所示的信号肽。

(B)组成轻链可变区轻链CDR的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_11、Seq_12和Seq_13所示；同时组成重链可变区重链CDR的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_14、Seq_15和Seq_16所示。

在该组合方式中，优选的实施方式为轻链可变区的氨基酸序列如Seq_17或Seq_25所示，同时重链可变区的氨基酸序列如Seq_19或Seq_26所示。Seq_25所示的轻链可变区为Seq_17所示氨基酸序列的N端融合有Seq_21所示的信号肽；Seq_26所示的重链可变区为Seq_19所示氨基酸序列的N端融合有Seq_22所示的信号肽。

在一些可选的实施方式中，按照上述(A)的组合方式得到的抗体1；和按照上述(B)的组合方式得到的抗体2还可以组成配对抗体，应用于以形成抗体-抗原-抗体复合物的检测原理的免疫检测方法，例如应用于双抗夹心ELISA或免疫层析检测卡，在一些可选的实施方式中，以抗体1/抗体2包被于固相载体作为一抗，对应的抗体2/抗体1连接标记物作为二抗，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；或，抗体1/抗体2标记标记物，对应的抗体2/抗体1作为免疫层析检测卡检测区包被的抗体。上述抗体1和抗体2可选地分别独立的为完整抗体或抗原结合片段。

本领域公知，抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本发明涉及的具有与上述CDR序列完全相同的CDR序列的单克隆抗体变体，因其具有与本发明所述的与IMP酶结合的抗体完全相同的CDR序列，因此具有相类似的生物活性。

抗原结合片段为与母体抗体相同特异性的抗体片段，例如可以为但不限于为F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。

这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗原结合片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。

抗原结合片段还可以通过本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过肽合成，例如自动肽合成仪获得；或者通过宿主细胞表达编码上述功能片段的基因得到。

本发明提供的与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段除去CDR区域，其余部分序列来源物种包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、雪貂、猫、狗、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、猴和人中的一种或多种。

当与IMP酶抗体为完整的抗体分子时，其抗体类型例如可以为但不限于为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD。在本领域技术人员已知抗体的CDR区域或轻链和重链可变区的前提下，本领域技术人员可以采用本领域常规方法来获得不同类型的抗体，例如将可变区基因与相应的重链或重链恒定区编码基因融合，并在宿主细胞中表达融合蛋白，以获得不同类型的抗体。

在一些优选的实施方式中，所述抗体包含兔抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。

在一些优选的实施方式中，抗体的轻链恒定区的氨基酸序列如Seq_31所示；抗体的重链恒定区的氨基酸序列如Seq_32所示。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，包括核酸片段、载体或宿主细胞。

核酸片段：选自(a1)或(a2)：

(a1)、其编码与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段；在一些优选的实施方式中，核酸片段为DNA，其含有编码轻链可变区的DNA片段和/或编码重链可变区的DNA片段；

优选地，所述编码轻链可变区的DNA片段的核苷酸序列如Seq_8、Seq_18、Seq_27或Seq_28所示；Seq_27和Seq_28所示序列分别为Seq_8和Seq_18所示序列连接编码信号肽片段后得到的序列。

优选地，所述编码重链可变区的DNA片段的核苷酸序列如Seq_10、Seq_20、Seq_29或Seq_30所示；Seq_29和Seq_30所示序列分别为Seq_10和Seq_20所示序列连接编码信号肽片段后得到的序列。

优选地，编码轻链恒定区的DNA片段的核苷酸序列如Seq_33所示。

优选地，编码重链恒定区的DNA片段的核苷酸序列如Seq_34所示。

(a2)、与(a1)中定义的核酸片段互补的核酸片段。

载体：包括如上所述的核酸片段，所述载体还可以包括编码其他组成元件的部分，例如可以为但不限于为编码调控序列或标记基因等。载体例如可以为但不限于为原核表达载体、真核表达载体或昆虫表达载体。

宿主细胞：所述宿主细胞转化有上述载体，以使上述载体实现克隆或表达；或，所述宿主细胞的基因组中整合有所述核酸片段，以表达所述与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段的生产方法，包括使用上述的宿主细胞表达所述与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段。该方法原料来自稳定表达的细胞株，不存在原料供应的风险且性能稳定、成本低。并且产品稳定性强、批间差小，不受细胞株退化影响。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种组合物，该组合物包括所述的抗体或其抗原结合片段和标记物；所述标记物与所述抗体或其抗原结合片段偶联；或，所述标记物与所述抗体或其抗原结合片段分别独立包装，待使用时再进行连接。所述标记物包括但不限于酶、乳胶颗粒、荧光分子标记、量子点、荧光微球、彩色微球、胶体金、胶体银、胶体碳、生物素或链霉亲和素中的一种或多种。。

酶的实例例如可以为但不限于为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，标记有碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的与IMP结合的抗体或其抗原结合片段可应用于化学发光酶联免疫检测方法和试剂盒中，作为二抗使用。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含所述与IMP结合的抗体或其抗原结合片段，或上述组合物。可选的实例包括但不限于为ELISA检测试剂盒、Western Blot检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒或免疫层析检测试纸等本领域常规检测方法的试剂盒。可以理解的是，所述试剂中还可以包含本领域常规的试剂，例如可以但不限于包括冻干保护剂，缓冲物质和溶剂等一种或多种；试剂盒还可以包含本领域常规的试剂或耗材，例如可以为但不限于包括缓冲液、封闭液、二抗、显色物质、标记物和反应底物、磁性微粒、试纸及其支撑部件等一种或多种。

在一些可选的实施方式中，上述试剂盒包括免疫层析检测卡，在样品结合垫上包埋标记物标记的抗IMP酶的单克隆抗体1/抗体2，在检测线(T)包被抗IMP酶的单克隆抗体2/抗体1。若检测样本为阳性，其中的IMP酶与标记物标记的抗体1/抗体2结合形成复合物，在层析作用下复合物沿纸条向前移动，经过检测线(T)时被预包被的IMP酶抗体2/抗体1捕获，形成免疫复合物，出现可检测的信号值；若检测样本为阴性，不会形成免疫复合物，在检测线处不会出现可检测的信号值。标记物例如可以为但不限于为胶体金、胶体银、胶体碳、磁微球、荧光微球、彩色微球或量子点。优选抗体1包埋于样品结合垫，抗体2包被于检测线。

将与IMP酶结合的抗体或其抗原结合片段或上述组合物用于与制备检测IMP酶或产IMP酶的微生物的产品，这些产品能够用于耐药菌株的早期分型，并指导临床用药，辅助临床感染控制和治疗；够通过定性或半定量的检测从患者分离出来的细菌样本或者阳性血培养样本中的IMP酶，来快速准确地判断患者细菌耐药的程度，快速检测细菌样本中是否存在IMP酶，临床上可用于指导用药。

下面结合优选实施方式进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1抗原的制备

通过NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心)序列比对，获得IMP酶(IMP-1～35、IMP-37～46、IMP-48～49、IMP-51～56、IMP-58～85、IMP-88～89)的保守序列。采用分子生物学领域中的常规酶切及连接技术，构建表达质粒pET-28a(+)-PM，采用CaCl₂热激法将重组载体转化到大肠杆菌DH5α感受态中。利用含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆。常规培养大肠杆菌，提取质粒进行PCR鉴定，确定目标基因存在。将提取的表达质粒pET-28a(+)-PMAA转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，在选择培养基上涂布培养，筛选抗100μg/mL氨苄青霉素的单菌落，再液体培养过夜。取1mL过夜培养物接种到200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，震荡培养至对数期(OD600在0.5-0.6)，加入IPTG(1mmol/L)，16℃诱导培养3h，发酵液过镍柱纯化，通过原核基因表达得到高纯度蛋白。

实施例2动物免疫

挑选适龄、重量在1.5公斤左右的新西兰大耳白兔，在标准动物房饲养3天，如无异常情况则开始进行免疫：将100μg IMP酶抗原加入到0.5mL高压灭菌的生理盐水中，用微型漩涡震荡器充分混匀，加入0.5mL弗氏完全佐剂，用注射器相互推拉进行充分混合乳化，对新西兰大耳兔进行背部皮下多点注射免疫；两周后进行加强免疫，此后每隔一周加强免疫一次，共免疫六次，并且从第三次免疫开始，免疫一周后取大耳白兔耳缘静脉血200～500μL，用无菌小试管收集免疫家兔血，标记后送准备室，以未免疫兔血清作对照，以ELISA测定效价和亲和性；在最后一次免疫后，取脾脏进行细胞融合，用于制备杂交瘤细胞。

实施例3杂交瘤细胞的制备和筛选

对制备的兔抗血清进行效价检测，合格的情况下使用兔脾脏进行细胞融合，制备单克隆杂交瘤细胞株，方法如下：将免疫完成的新西兰大耳兔处死，无菌条件下取出脾脏，用细胞培养液清洗1次后研碎，过不锈钢筛网，将得到的细胞离心并用细胞培养液清洗2次；取对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞混合，用不含胎牛血清的细胞培养液清洗一次后离心、弃上清，加入聚乙二醇溶液，37℃恒温处理90s左右；用不含胎牛血清的细胞培养液终止反应后离心，用含20％胎牛血清的HAT选择培养液重悬细胞，将细胞加入到96孔板中，37℃、5.0％CO₂中培养；将96孔板内生长状态良好的细胞用细胞培养液稀释至1～3个细胞/mL，加入到96孔板内，放入细胞培养箱中在37℃、5.0％CO₂条件下培养，每个细胞株进行编号，选取培养液上清呈阳性的细胞株进行扩大培养，最终得到杂交瘤细胞株。对获得的杂交瘤细胞采用ELISA法进行筛选，融合后第5天观察细胞的生长情况，第10～14天采用间接ELISA法检测细胞培养上清的效价，将效价最强的阳性杂交瘤细胞扩大培养至细胞阳性率达100％，定株得到杂交瘤细胞株，冻存于液氮中备用。

实施例4利用RT-PCR从杂交瘤细胞中分离抗体可变区基因

将实施例3筛选出的杂交瘤细胞匀浆化后，加入细胞裂解液进行RNA提取，用异丙醇从水相层中沉淀出RNA，离心后洗涤沉淀RNA，去除杂质，重悬后进行反转录，得到cDNA；利用新西兰大耳兔的特异性引物进行PCR，以杂交瘤细胞cDNA为模板，扩增抗体的重、轻链可变区基因，50μL体系中含有5μL cDNA、HotStarTaq Plus酶、dNTPs和0.5μM特异性引物，按以下条件进行PCR扩增：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃50s，35个循环；72℃7min；获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的片段，送样测序，测序结果与IMGT数据库(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)进行比对，抗体1和抗体2的序列信息如下所示：

抗体1：

轻链：

MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARCQSVLTQPSSASTSPGSSVKLSCTGTSSDIGNNDYVSWYQQYMGRPPTNIIYDVSRRPSGVSDRFSGSIDRSSNTAFLTVNNVQADDEADYYCSSYAGSSNLVFGGGTKLTV(Seq_23)；

其中，1～22位为信号肽；23～44位为FR1；45～58位为CDR-L1；59～73位为FR2；74～80位为CDR-L2；81～114位为FR3；115～124位为CDR-L3；125～133位为FR4。

重链：

MDWTWRFLFVVAAATGVQSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMHWVRQAPEKGLVWVAYINSDGSSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMNSLRAEDTAMYYCARGGGYSYGPFDYWGQGTSVTVSS(Seq_24)；

其中，1～19位为信号肽；20～49位为FR1；50～54位为CDR-H1；55～68位为FR2；69～85位为CDR-H2；86～117位为FR3；118～127位为CDR-H3；1～139位为FR4。

抗体2：

轻链：

MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARCTQSPASLSLSPGERATLSCRASQTVTSYLAWYQQRAEQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDRPPAFTFGPGTKVEIK(Seq_25)；

其中，1～22位为信号肽；23～41位为FR1；42～52位为CDR-L1；53～67位为FR2；68～74位为CDR-L2；75～106位为FR3；107～117位为CDR-L3；118～127位为FR4。

重链：

MDWTWRFLFVVAAATGVQSDVQLQESGPGLVKPSQTVSLTCTVSGGSISTSSFYWGWIRQFPGNKLEWIGNIYYSGSITYNPSLTSRVTITRDTSKNQFFLEMNSVTAADTAIYYCAGRQITFNYNAVSGHDAFDVWGTGTTVTVSS(Seq_26)；

其中，1～19位为信号肽；20～49位为FR1；50～56位为CDR-H1；57～70位为FR2；71～86位为CDR-H2；87～118位为FR3；119～136位为CDR-H3；137～147位为FR4。

实施例5单克隆抗体的构建、表达和纯化

利用同源重组引物分别在抗体重链可变区基因的两端和轻可变区基因的两端加入同源重组臂和信号肽序列，重链可变区信号肽的氨基酸序列如Seq_22所示，轻链可变区信号肽的氨基酸序列如Seq_21所示，使用双酶切将分别含有兔抗体重链IgG1恒定区的表达质粒和含有兔抗体轻链IgG1恒定区的表达质粒线性化，产生同源重组臂；轻链恒定区的氨基酸序列如Seq_31所示，核苷酸序列如Seq_33所示；重链恒定区的氨基酸序列如Seq_32所示，核苷酸序列如Seq_34所示。将加入同源重组臂的可变区基因片段和线性化的质粒通过同源重组的方式连接起来，构成完整的轻链表达载体和重链表达载体，将重组产物转化进TOP10大肠杆菌感受态中，扩增质粒。

将得到的单克隆抗体重、轻链表达质粒按照1:1比例加入到Opti-Mem转染培养基中，充分混合后加入DNA 4倍质量的转染试剂PEI，混合后，室温避光放置30min，随后加入到293T细胞中；孵育6h后去除转染体系，加入FreeStyleTM293表达培养基，使用AKTA蛋白纯化系统，采用亲和纯化(Protein A)的方法纯化表达的抗体上清，得到抗IMP酶的单克隆抗体，具体步骤为：(1)将表达的抗体上清以2500×g室温离心10min，去除沉淀物；(2)将装有Protein A的亲和纯化柱用10倍体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分流洗；(3)将表达上清以5mL/min的流速通过纯化柱；(4)使用20倍纯化柱体积的结合缓冲液(BindingBuffer)充分洗涤纯化柱；(5)用0.1M pH＝3.0-3.5的柠檬酸缓冲液洗脱纯化柱，直至洗脱峰降至平衡状态，用1M pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH为7.0；(6)使用浓缩离心柱浓缩纯化后的单克隆抗体，用PBS作为抗体保存的缓冲液，最后用BSA蛋白浓度检测方法测定浓缩后的抗体浓度。

实施例6分子量测定

用SDS-PAGE电泳鉴定单克隆抗体的分子量，每个电泳道加样量为5μg，同时用已知分子量标准系列作为参照，首先在90V电压下电泳20min，再在140V电压下电泳直到指示剂全部跑出，取下凝胶，用考马斯亮蓝染色，染色后凝胶分析生物原料的分子量，SDS-PAGE电泳图如图1所示。

效果例1

采用ELISA方法检测单克隆抗体对IMP酶的亲和活性(效价)，主要步骤如下：(1)将IMP酶抗原用PBS稀释成1ng/μL，以每孔100μL加入到96孔酶标板中，37℃包被2h；(2)弃上清，用0.01M的PBST洗板3次，用PBST配制含3％BSA的封闭液，每孔加入100μL，37℃封闭2h；(3)弃上清，用PBST清洗5次，将纯化浓缩后的抗体进行梯度稀释，浓度从1:1000倍比稀释至1:2560000，加入各孔，每孔加入100μL，37℃温育1h；(4)弃抗体稀释液，用PBST清洗6遍，用1:5000封闭液稀释羊抗兔IgG-HRP，每孔加入100μL，37℃温育1h；(5)弃二抗稀释液，用PBST清洗6遍，加入TMB，100μL/孔，避光37℃放置15min；(6)每孔加入50μL 1M稀硫酸终止反应，在450nm处测定吸光度。结果如图2所示，筛选的单克隆抗体对IMP酶具有较强的结合能力，对IMP酶抗原的效价达到1:1280000(OD值＞0.5)。

效果例2与现有单克隆抗体的对比

采用ELISA方法分别用本发明所改造的抗体、天然抗体和已公布的鼠源单克隆抗体(采购于珠海博美生物科技有限公司)检测对IMP酶的亲和活性(效价)，具体步骤同效果例1。结果如表1所示，单克隆抗体1和抗体2较现有技术亲和力增加，生物活性增强。

表1

效果例3交叉反应

分别用KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48酶包被酶标板，每孔包被量为50ng；将单克隆抗体稀释至10ng/mL，加入到各酶标板中，每孔加入100μL，37℃孵育1h；洗涤后加入HRP标记羊抗兔二抗，每孔加入100μL，37℃孵育0.5h；洗涤后加入TMB，37℃孵育15min，终止读数。抗体1的结果如图3所示，抗体2的结果如图4所示，表明单克隆抗体不与其他型碳青霉烯酶产生交叉反应，特异性强。

效果例4抗体配对验证

两种抗体，抗体1作为捕获抗体，抗体2作为标记抗体(HRP酶标记)，同时捕获抗体也进行HRP酶标记，作为对照组，将捕获抗体包被在抗原板上，先加入倍比稀释的抗原，孵育后洗去未结合的抗原，再加入标记抗体孵育后洗去未结合的标记抗体，最后加入显色液显色。如果可以显色，说明标记抗体与抗原特异性结合，该捕获抗体与标记抗体为一对配对抗体。如果不能显色，说明标记抗体不能与抗原结合，从而被洗脱，该捕获抗体与标记抗体不是配对抗体，结果如图4所示，表明这两种抗体的配对结合抗原的能力最好。

表2

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。