CN104341501A - 抗IL-1β人源化单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗IL-1β人源化单克隆抗体及其制备方法和应用。所述的抗IL-1β人源化单克隆抗体是一种抗IL-1β单链抗体、全长IgG抗体或Fab抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区是在如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的肽链的第57位和第60位氨基酸中的一位或两位经过取代一个氨基酸所形成的肽链，和/或，所述轻链可变区是在如序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的肽链的第27位、28位和第29位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸所形成的肽链。与现有的抗IL-1β抗体相比，本发明的抗体具有更高的亲和力和更强的中和能力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗IL-1β人源化单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
IL-1β，即白细胞介素1β，是IL-1家族中的重要成员，其前体蛋白分子量为31KD，成熟的IL-1β分子量大小为17KD。IL-1β主要参与炎症反应、自身性免疫疾病和白血病的发生过程，其对血管内皮细胞、巨噬细胞以及T细胞和B细胞也有直接的影响。IL-1β与许多病理条件下的炎症都有关，包括感染（病毒，细菌，真菌和寄生虫），内毒素休克，关节炎，类风湿关节炎，盆腔炎，多发性硬化症，哮喘，骨性关节炎，牛皮癣，阿尔茨海默氏病，Crohn氏病，Peyronies的疾病，心脏疾病（如动脉粥样硬化），结肠癌，腹腔疾病，胆囊疾病，藏毛性疾病，腹膜炎，脑膜炎，其他自身免疫性疾病，胰腺炎，外伤（手术），移植物抗宿主病和移植排斥反应等。IL-1β甚至与癌症、骨质疏松症和疼痛信号传导也有关。因此，IL-1β是一个很具潜力的用于预防及治疗这些疾病的药物靶点。
最初科学家们制备获得的是鼠源单克隆抗体，用于中和IL-1β治疗。但研究发现鼠源单克隆抗体作为治疗药物存在许多缺陷，主要是因为其用于人体具有强烈的免疫原性，导致半衰期短，临床疗效低且副作用大。随着人源化单克隆抗体技术的发展，逐渐克服了鼠源单克隆抗体的缺陷。但此类抗体仍有存在与靶点结合亲和力低的问题，从而影响了药物的有效性。因此，本领域迫切需要建立高亲和力，高特异性的，人源或人源化的单克隆抗IL-1β抗体，以进一步提高临床应用的安全性和有效性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的抗IL-1β非人源化单克隆抗体免疫原性强、半衰期短，而抗IL-1β人源化单克隆抗体亲和力不高、特异性不强的缺陷，提供一种亲和力高、特异性强的抗IL-1β人源化单克隆抗体及其制备方法和应用。
本发明提供的技术方案之一是：一种分离的蛋白质，其是一种抗IL-1β单链抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区是在如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的肽链的第57位和第60位氨基酸中的一位或两位经过取代一个氨基酸所形成的肽链，和/或，所述轻链可变区是在如序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的肽链的第27位、28位和第29位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸所形成的肽链。
其中，所述重链可变区较佳地为：将序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的肽链的第57位的丝氨酸突变为丙氨酸；所述氨基酸序列中第60位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸。
所述轻链可变区较佳地为：将序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的肽链的第27位的甘氨酸突变为丝氨酸或精氨酸；所述氨基酸序列中第28位的天冬酰胺突变为缬氨酸或苏氨酸；所述氨基酸序列中第29位的异亮氨酸突变为缬氨酸。
其中所述蛋白质的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述蛋白质。
本发明中，所述蛋白质的重链可变区和轻链可变区可由本领域常规的链接短肽进行链接，从而构成包含所述重链可变区和所述轻链可变区的单链抗体。所述的链接短肽的序列较佳地为GGGGSGGGGSGGGGS。
本发明提供的技术方案之二是：一种分离的蛋白质，其是一种抗IL-1β全长IgG抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区是在如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的肽链的第57位和第60位氨基酸中的一位或两位经过取代一个氨基酸所形成的肽链，和/或，所述轻链可变区是在如序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的肽链的第27位、28位和第29位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸所形成的肽链。
其中，所述重链可变区较佳地为：将序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的肽链的第57位的丝氨酸突变为丙氨酸；所述氨基酸序列中第60位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸。
所述轻链可变区较佳地为：将序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的肽链的第27位的甘氨酸突变为丝氨酸或精氨酸；所述氨基酸序列中第28位的天冬酰胺突变为缬氨酸或苏氨酸；所述氨基酸序列中第29位的异亮氨酸突变为缬氨酸。
其中所述蛋白质的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述蛋白质。
本发明提供的技术方案之三是：一种分离的蛋白质，其是一种抗IL-1βFab抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区是在如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的肽链的第57位和第60位氨基酸中的一位或两位经过取代一个氨基酸所形成的肽链，和/或，所述轻链可变区是在如序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的肽链的第27位、28位和第29位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸所形成的肽链。
其中，所述重链可变区较佳地为：将序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的肽链的第57位的丝氨酸突变为丙氨酸；所述氨基酸序列中第60位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸。
所述轻链可变区较佳地为：将序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的肽链的第27位的甘氨酸突变为丝氨酸或精氨酸；所述氨基酸序列中第28位的天冬酰胺突变为缬氨酸或苏氨酸；所述氨基酸序列中第29位的异亮氨酸突变为缬氨酸。
其中所述蛋白质的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述蛋白质。
本发明中所述的Fab抗体即本领域通常所指的抗体的Fab段。
本发明提供的技术方案之四是：一种分离的核酸，所述核酸是编码前述蛋白质的核酸分子。
所述蛋白质可以为前述的单链抗体、全长IgG抗体和Fab抗体中的任一种。
其中所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳地包括：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的基因核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
如本领域技术人员所知：编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明提供的技术方案之五是：一种包含前述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的抗IL-1β抗体基因突变体的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明所述载体优选质粒pCANTAB5E或pET expression vectors(Novagen)（尤其适用于单链抗体及Fab抗体），或者pcDNA3.1（尤其适用于全长IgG抗体）。
本发明提供的技术方案之六是：一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞较佳地为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的抗IL-1β抗体突变体的基因可被有效表达即可。其中所述宿主细胞较佳地为E.coliTG1或BL21细胞（表达单链抗体或Fab抗体），或者CHO-K1细胞（表达全长IgG抗体）。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
本发明提供的技术方案之七是：一种重组抗IL-1β抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物中获得重组抗IL-1β抗体。
本发明提供的技术方案之八是：上述重组抗IL-1β抗体在制备基因工程类药物中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：与现有的抗IL-1β抗体（gH2gL1单抗，在专利US7608694中有披露）相比，本发明得到的抗体具有更高的抗体亲和力和更强的IL-1β中和能力。本发明的具有超高亲和力的抗IL-1β抗体，亲和力常数KD接近或突破50pM。与原模板抗体相比，亲和力提高了50～70倍。
附图说明
图1为模板抗体序列及CDR分析示意图。
图2是模板抗体（gH2gL1in Fab format）和抗原IL-1β的晶体结构模型。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1模板单链抗体基因合成和CDR突变噬菌体文库构建
模板抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的序列如图1所示，将VH及VL中间用GGGGSGGGGSGGGGS多肽序列链接，即成单链抗体scFv，可用全长基因合成的方法获得相应DNA序列。对模板抗体的VH和VL序列作详细的CDR位点分析，据此设计CDR-H2、CDR-H3及CDR-L1、CDR-L3区的随机突变引物。利用突变引物做PCR合成含有突变的VH及VL基因片段，然后进行PCR拼接成新的突变的scFv单链抗体基因。将突变的scFv基因进行酶切并连接入噬菌体展示载体pCANTAB5E（GEHealthcare Life Sciences）中，然后用此来转化TG1大肠杆菌细胞（Lucigen），由此形成亲scFv亲合力成熟噬菌体文库。不同的CDR构建不同的突变文库，共获得4个CDR突变文库，即CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1和CDR-L3突变文库。每个文库的库容都超过108，即含有个108个独立的突变体。每个文库都抽样50个克隆来通过DNA测序进行质量验证，文库中>95%的克隆含有设计的CDR区突变。
实施例2噬菌体抗体突变库的基于亲和力的筛选
建成后的噬菌体突变文库，被用来对IL-1β抗原进行淘选。采用生物素化的抗原，在液相中进行噬菌体淘选。在越来越低的抗原浓度下，只有展示高亲和力的抗体的噬菌体才会跟抗原结合，然后可用链亲和素磁珠将其调出并保留。经多次淘选后对文库进行新的抽样测序，CDR-H3及CDR-L3文库并未出现新变种的显著富集，而在CDR-H2及CDR-L1文库中多数克隆已转换为新的变种。
从淘筛后的CDR-H2及CDR-L1文库中各取50不同的克隆，诱导表达并提纯出scFv蛋白。然后用BiacoreT200快速检测其与抗原的解离曲线并进行Off-rate比对。其中，与抗原解离较慢（解离速度慢通常意味着高亲和力）的克隆被优先选出。测序结果显示，这些解离慢的克隆中，大多在CDR-H2的两个位点及L1的三个位点上有突变，说明这5个位点是提高与IL-1β抗原亲和力的高效突变位点。这5个位点分别位于SEQ ID NO:1（即重链可变区VH）的第57位和第60位，以及SEQ ID NO:2（即轻链可变区VL）的第27、28和第29位。该5个高效突变的位点在图1中已用黑色加粗标示出。
实施例3全长抗体IgG在真核细胞中的表达纯化及亲和力常数测定
以所获得的含有“AI”突变的单链抗体基因为模板，通过重叠PCR与人源全长抗体IgG重链恒定区拼接合成人源抗体重链基因，然后用HindIII和EcoRI限制酶进行酶切后，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收，后连接入pcDNA3.1(+)质粒(Invitrogen公司)，构建成人源重链真核表达载体pcDNA3.1(+)(VHCH)。类似的，以含有“SVV”或“RTV”突变的单链抗体基因为模板，通过重叠PCR与人源全长抗体IgG轻链恒定区拼接合成人源抗体轻链基因，然后用HindIII和EcoR I限制酶进行酶切后，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收，后连接入pcDNA3.1/ZEO(+)质粒(Invitrogen公司产品)，构建成人源轻链真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(VLCL)。用重链及轻链抗体质粒同时对CHO-K1细胞（ATCC.org）进行转染。培养后取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆（用带HRP的抗人IgG-Fc的抗体进行结合反应并显色，显色最深者挑出），然后用无血清培养基（从Life Technologies公司购买）扩大培养，用Protein A亲和柱（GE公司产品）分离纯化全长IgG抗体，即本发明的全长IgG抗体。
一共获得5种本发明的抗IL-1β全长IgG抗体，分别是VH链上第57位和第60位分别突变为丙氨酸和异亮氨酸，VL链序列和母本（即模板）一致（编号为2#）；VL链上第27、28和第29位分别突变为精氨酸、苏氨酸和缬氨酸，A链序列和母本（即模板）一致（编号为3#）；B链上第27、28和第29位分别突变为丝氨酸、缬氨酸和缬氨酸，VH链序列和母本（即模板）一致（编号为4#）；VH链上第57位和第60位分别突变为丙氨酸和异亮氨酸，同时VL链上第27、28和第29位分别突变为精氨酸、苏氨酸和缬氨酸（编号为5#）；以及VH链上第57位和第60位分别突变为丙氨酸和异亮氨酸，同时VL链上第27、28和第29位分别突变为丝氨酸、缬氨酸和缬氨酸（编号为6#）。母本（模板），即VH、VL链的序列均未作改变的抗体编号作1#。
运用BIAcore T200系统(GE Healthcare)，通过表面等离子体激元共振(SPR)的原理来检测抗体与抗原的结合（具体系统说明可参考其官方网站www.biacore.com）。实验步骤如下：BIAcore生物传感芯片上共价结合有抗人Fc的鼠源抗体，可以将流过的重组的全长人源抗体固定在芯片。然后再将抗原IL-1β流过芯片，根据与抗体亲和力的不同，产生不同的结合曲线，通过数据分析可得抗IL-1β抗体的亲和力常数。实验结果见表1。
表1亲和力成熟的全长抗体IgG的Biacore亲和力常数测定
由表1的数据以及结合曲线的结果可知：本发明的具有超高亲和力的抗IL-1β抗体，亲和力常数KD接近或突破50pM。与原模板抗体相比，亲和力提高了50～70倍。
实施例4晶体结构模型支持了高效突变位点的重要性
分子结构模型可以直观地、详细地显示抗体与抗原的结合位点。图2是用晶体衍射的方法得到的模板抗体（gH2gL1in Fab format）和抗原IL-1β的晶体结构模型。CDR-H2及CDR-L1上的5个高效突变位点被突出，显示出其位于抗体-抗原的结合位点的重要位置，支持了本发明的5个高效突变位点对亲和力成熟起的重要作用。
Claims (10)
1.一种分离的蛋白质，其特征在于，其是一种抗IL-1β单链抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区是在如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的肽链的第57位和第60位氨基酸中的一位或两位经过取代一个氨基酸所形成的肽链，和/或，所述轻链可变区是在如序列表中SEQ IDNo:2所示氨基酸序列的肽链的第27位、28位和第29位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸所形成的肽链。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述重链可变区为：将序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的肽链的第57位的丝氨酸突变为丙氨酸；所述氨基酸序列中第60位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸；所述轻链可变区为：将序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的肽链的第27位的甘氨酸突变为丝氨酸或精氨酸；所述氨基酸序列中第28位的天冬酰胺突变为缬氨酸或苏氨酸；所述氨基酸序列中第29位的异亮氨酸突变为缬氨酸。
3.一种分离的蛋白质，其特征在于，其是一种抗IL-1β全长IgG抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区是在如序列表中SEQ IDNo:1所示氨基酸序列的肽链的第57位和第60位氨基酸中的一位或两位经过取代一个氨基酸所形成的肽链，和/或，所述轻链可变区是在如序列表中SEQID No:2所示氨基酸序列的肽链的第27位、28位和第29位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸所形成的肽链。
4.如权利要求3所述的蛋白质，其特征在于，所述重链可变区为：将序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的肽链的第57位的丝氨酸突变为丙氨酸；所述氨基酸序列中第60位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸；所述轻链可变区为：将序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的肽链的第27位的甘氨酸突变为丝氨酸或精氨酸；所述氨基酸序列中第28位的天冬酰胺突变为缬氨酸或苏氨酸；所述氨基酸序列中第29位的异亮氨酸突变为缬氨酸。
5.一种分离的蛋白质，其特征在于，其是一种抗IL-1βFab抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区是在如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的肽链的第57位和第60位氨基酸中的一位或两位经过取代一个氨基酸所形成的肽链，和/或，所述轻链可变区是在如序列表中SEQ IDNo:2所示氨基酸序列的肽链的第27位、28位和第29位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸所形成的肽链；较佳地，在所述蛋白质中，所述重链可变区为：将序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的肽链的第57位的丝氨酸突变为丙氨酸；所述氨基酸序列中第60位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸；所述轻链可变区为：将序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的肽链的第27位的甘氨酸突变为丝氨酸或精氨酸；所述氨基酸序列中第28位的天冬酰胺突变为缬氨酸或苏氨酸；所述氨基酸序列中第29位的异亮氨酸突变为缬氨酸。
6.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1～5任一项所述蛋白质的核酸分子。
7.一种包含如权利要求6所述核酸的重组表达载体。
8.一种包含如权利要求7所述重组表达载体的重组表达转化体。
9.一种重组抗IL-1β抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养如权利要求8所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组抗IL-1β抗体。
10.如权利要求9所述的重组抗IL-1β抗体在制备基因工程类药物中的应用。
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