KR101848147B1

KR101848147B1 - 세포 투과성 hoxa9 융합단백질 및 이를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101848147B1
Application number: KR1020160089432A
Authority: KR
Inventors: 강재구; 유성란; 이준행; 손지웅; 정선아; 이회영; 박창교
Original assignee: 건양대학교산학협력단
Priority date: 2016-07-14
Filing date: 2016-07-14
Publication date: 2018-04-11
Also published as: KR20180007895A

Abstract

본 발명은 세포 투과성 HOXA9(homeobox A9) 융합단백질을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, HOXA9 단백질의 5′ 말단에 세포 투과성 펩타이드(cell-permeable peptide)의 결합에 의해 HOXA9 단백질의 세포 침투가 증가하였고, 이에 의한 비소세포폐암의 세포 침윤 및 이동이 억제되는 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명의 HOXA9 융합단백질을 이용하여 비소세포폐암에 대한 효과적인 예방 또는 치료용 약학 조성물로의 개발이 가능할 것으로 기대된다.

Description

세포 투과성 HOXA9 융합단백질 및 이를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물 {HOXA9 cell-permeable fusion protein and composition comprising the same for preventing or treating of lung cancer}

본 발명은 세포 투과성 HOXA9(homeobox A9) 융합단백질 및 이를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

폐암(lung cancer)는 악성 암 종류의 한 가지 타입으로, 우리나라 뿐 아니라 전 세계적으로 암 사망률의 1위를 차지하고 있으며 매년 약 120만 명의 환자가 폐암으로 사망하고 있다(Parkin D.M., et al., 2005). 폐암은 조직형에 따라 소세포폐암(small cell lung cancer)과 소세포폐암을 제외한 다른 종류의 폐암을 통칭하는 비소세포폐암(non-small cell lung cancer)으로 나뉘어진다. 폐암 환자의 80% 이상이 비소세포폐암으로 진단되고 있으며 일부의 환자에서만 수술로 완치를 기대할 수 있고 대부분의 환자들은 진단 시 국소 진행성 또는 전이성 병기로 발견된다(윤탁, 2009). 악성 흉막삼출 또는 심낭액을 동반하거나 전이성 병기를 가지는 환자들에게는 플라티늄(platinum)을 근간으로 하는 항암화학요법으로 1년 생존율이 약 30~40%로 향상되었으나, 중앙 생존율은 아직까지도 10개월에 지나지 않는다(Schiller J.H. et al., 2002).

최근 비소세포폐암에 대해서도 분자표적치료제가 많이 사용되고 있는데, 여러 가지 신호전달경로 중 EGFR(epidermal growth factor receptor)와 VEGF(vascular endothelial growth factor)가 가장 중요한 경로로서 EGFR 타이로신 키나아제(EGFR tyrosine kinase) 억제제인 제피티닙(gefitinib)과 엘로티닙(erlotinib)이 이미 임상에서 널리 사용되고 있다(Lynch T.J., et al., 2004).

Hox(Homeobox) 유전자는 배자발생단계 동안 유전자 조절부위의 DNA 결합부위 모티브(motif)에 결합하는 전사조절 인자로 형태발생과 관련된 유전인자로 알려져 있다. 이 Hox 유전자는 A, B, C 및 D, 4가지 클러스터(cluster)로 나뉘고, 4개의 염색체에 위치하고 있다.

HOXA9(Homebox A9)는 Hox 유전자의 A 클러스터에 속하는 유전자(Krumlauf R., 1994)로, 암과 관련이 있다는 연구 결과들이 보고되어 있다. HOXA9과 암과의 관련성은 암에 따라 대조적인 것으로 보고되고 있는데, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 교모세포종(glioblastoma) 및 난소암(ovarian cancer)에서는 암을 진행시키는 유전자로, 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer) 및 간암(hepatocellular carcinoma)에서는 암의 진행을 억제하는 유전자로 알려져 있다(Thorsteinsdottir U., et al., 2002; Pojo M., et al., 2015; Ko S.Y., et al., 2014; Gilbert P.M., et al., 2010; Alvarado-Ruiz L., et al., 2016; Li F., et al., 2016).

폐암에서 HOXA9은 단백질 발현이 저하되어 있고, 이는 폐암의 진행과 관련되어 있다는 것이 보고되었을 뿐만 아니라, HOXA9 유전자 발현 조절부위가 과메틸화(hypermethylation)를 이용한 폐암 환자들을 진단하기 위한 바이오마커로 제안되기도 하였다(Hwang J.A., et al., 2015; Son J.W., et al. 2011; Hwang S.H., et al., 2011).

이에, 본 발명자는 HOXA9 유전자를 이용한 폐암 치료를 연구하는 과정에서 폐암세포에 세포 투과성을 높인 HOXA9 융합단백질을 처리한 경우 폐암 세포의 침윤과 이동이 억제되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

종래 선행기술로서 미국공개특허 제2005-0142594호에는 비소세포폐암의 마커로써 HOXA9 유전자가 기재되어 있을 뿐, HOXA9 단백질을 이용한 폐암 치료는 기재된 바가 없다. 또한, 한국공개특허 제1106727호에는 폐암 특이적 메틸화 바이오마커로 HOXA9가 기재되어 있으나, HOXA9 단백질을 이용한 치료는 기재된 바가 없다.

미국공개특허 제2005-0142594호, DAP-Kinase and HOXA9, two human genes associated with genesis, progression, and aggressiveness of non-small cell lung cancer, 2005. 06. 30. 공개. 한국등록특허 제1106727호, 폐암특이적 메틸화 마커 유전자를 이용한 폐암 검출방법, 2012. 01. 10. 등록.

윤탁, 진행성 비소세포폐암의 표적치료 및 맞춤항암치료, 대한내과학회지, 77(1), 9-17, 2009. Alvarado-Ruiz L., HOXA9 is underexpressed in cervical cancer cells and its restoration decreases proliferation, migration and expression of epithelial-to-mesenchymal transition genes, Asian Pac. J. Cancer Prev., 17(3), 1037-1047, 2016. Gilbert P.M., et al., HOXA9 regulates BRCA1 expression to modulate human breast tumor phenotype, J. Clin., Invest., 120(5), 1535-1550, 2010. Hwang J.A., et al., HOXA9 inhibits migration of lung cancer cells and its hypermethylation is associated with recurrence in non-small cell lung cancer, Molecular carcinogenesis, 54(S1), E72-E80, 2015. Hwang S.H., et al., Detection of HOXA9 gene methylation in tumor tissues and induced sputum samples from primary lung cancer patients, Clinical chemistry and laboratory medicine, 49(4), 699-704, 2011. Ko S.Y., et al., Expression of the homeobox gene HOXA9 in ovarian cancer induces peritoneal macrophages to acquire an M2 tumor-promoting phenotype, Am. J. Pathol., 184(1), 271-281, 2014. Krumlauf R., Hox genes in vertebrate development, Cell, 78(2), 191-201, 1994. Li F., et al., Down-exprssion of homeobox A9 promotes cancer cell invasion in human hepatocellular carcinomas, Int. J. Clin., Exp. Pathol., 9(2), 563-575, 2016. Lynch T.J., et al., Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib, N. Engl. J. Med., 350, 2129-2139, 2004. Parkin D.M., et al., Global cancer statistics, 2002, CA Cancer J. Clin., 55, 74-108, 2005. Pojo M., et al., A transcriptomic signature mediated by HOXA9 promotes human glioblastoma initiation, aggressiveness and resistance to temozolomide, Oncotarget, 6(10), 7657-7674, 2015. Schiller J.H., et al., Comparison of four chemotherapy regimens for advanced non-small-cell lung cancer, N. Engl. J. Med., 346, 92-98, 2002. Son J.W., et al., Genome-wide combination profiling of DNA copy number and methylation for deciphering biomarkers in non-small cell lung cancer patients, Cancer letters, 311(1), 29-37, 2011. Thorsteinsdottir U., et al., Overexrepssion of the myeloid leukemia-associated Hoxa9 gene in bone marrow cells induces stem cell expansion, Blood, 99(1), 121-129, 2002.

본 발명의 목적은 세포 투과성 HOXA9(homeobox A9) 융합단백질 및 이를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 HOXA9(homeobox A9) 단백질의 5′ 말단에 세포 투과 펩타이드(cell-permeable peptide)가 결합된, 세포 투과성 HOXA9 융합단백질에 관한 것이다.

상기 세포 투과 펩타이드는 아르기닌(Arginine)으로 구성된 서열일 수 있다.

상기 세포 투과 펩타이드는 아르기닌이 5개 내지 11개가 결합된 서열일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 HOXA9 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현벡터에 관한 것이다.

상기 벡터는 pET41a일 수 있다.

또한, 본 발명은 세포 투과성 HOXA9 융합단백질을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 폐암은 비소세포폐암일 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기 HOXA9 단백질은 사람 유래의 HOXA9 유전자로부터 발현시킨 단백질일 수 있다.

상기 세포 투과 펩타이드(cell-permeable peptide)는 약 10~30개 정도의 짧은 세포막 투과성 펩타이드로 대부분 단백질-투과 도메인(protien-transduction domain)이나 막-이동 서열(membrane-translocating sequence)로부터 유도된 것으로, 일반적인 외부 물질의 세포 내 유입 경로와 달리 세포막에 손상을 주지 않으면서도 세포 내로 이동하고, 세포막을 통과하지 못하는 분자량이 큰 단백질을 세포 내로 전달시킬 수 있는 역할을 하는 물질을 말한다.

상기 세포 투과성 펩타이드는 아르기닌(Arginine)으로 구성된 서열로, 아르기닌 5개 내지 11개가 결합된 서열일 수 있다. 바람직하게는 10개의 아르기닌이 결합된 서열이다.

상기 세포 투과성 HOXA9 융합단백질은 5′ 말단에 히스티딘이 표지(histidine-tag)되어 있을 수 있다.

상기 히스티딘 표지는 HOXA9 융합단백질의 정제를 용이하게 할 목적으로 이용할 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 세포 투과성 HOXA9 융합단백질을 코팅하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 서열번호 1의 염기서열에서 5′ 말단에는 세포 투과성 펩타이드 서열인 10개의 아르기닌이 추가되었으며, 양측에 제한효소(EcoR I 및 Not I) 절단 부위가 포함되어 있다.

상기 발현벡터는 진핵세포용 또는 박테리아용 발현벡터일 수 있으며, 바람직하게는 박테리아용 발현벡터일 수 있다.

상기 벡터는 pET41a 발현벡터일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 발현벡터를 숙주 미생물에 형질전환 시킬 수 있다.

상기 숙주 미생물은 대장균(E. coli)인 BL21(DE3)일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 HOXA9 융합단백질을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer)일 수 있다.

상기 비소세포폐암은 폐의 선암(adenocarcinoma), 폐의 편평상피세포폐암(squamous cell carcinoma) 및 대세포암(Large-cell carcinoma)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

상기 약학 조성물에는 세포 투과성 HOXA9 융합단백질이 0.001 내지 100중량%로 함유될 수 있다. 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 세포 투과성 HOXA9 융합단백질에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 흡입, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막, 뇌혈관 또는 암 조직 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 세포 투과성 HOXA9(homeobox A9) 융합단백질 및 이를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 세포 투과성 HOXA9 융합단백질은 HOXA9 단백질의 5′ 말단에 세포 투과 펩타이드(cell-permeable peptide)가 결합된 단백질로, HOXA9 단백질의 세포 내 침투 효율을 증가시키기 위한 것이다. 본 발명의 세포 투과성 HOXA9 융합단백질을 비소세포폐암 세포주에 처리 경우, HOXA9 융합단백질의 세포 침투가 증가한 것을 알 수 있었고, HOXA9의 세포 침투에 의해 비소세포폐암의 세포 침윤 및 이동이 억제되는 것을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명의 HOXA9 융합단백질을 이용하여 비소세포폐암에 대한 효과적인 예방 또는 치료용 약학 조성물로의 개발이 가능할 것으로 기대 된다.

도 1은 본 발명의 HOXA9 융합단백질 발현용 재조합 벡터(R10-HOXA9)의 구조적 특징을 보여주고 있다.
도 2는 본 발명의 HOXA9 융합단백질(폴리아르기닌이 결합된 HOXA9 단백질)의 발현 및 정제 결과를 보여주고 있다. (A)에서는 비교예 1(Con-HOXA9) 및 실시예 1(R10-HOXA9)의 재조합 벡터를 이용하여 IPTG 처리에 따른 HOXA9 융합단백질의 발현 정도를 보여주고 있다. (B)에서는 발현시킨 HOXA9 융합단백질을 정제한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 본 발명의 HOXA9 융합단백질(폴리아르기닌이 결합된 HOXA9 단백질)의 농도별(A) 및 처리시간별(B) 세포 투과도 차이를 보여주고 있다.
도 4는 본 발명의 HOXA9 융합단백질(폴리아르기닌이 결합된 HOXA9 단백질)의 세포 투과성을 면역형광염색방법을 통해 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 본 발명의 HOXA9 융합단백질(폴리아르기닌이 결합된 HOXA9 단백질) 처리에 따른 비소세포폐암 세포주인 A549의 침윤 억제 정도를 보여주고 있다. (A)는 침윤된 세포를 염색한 사진을, (B)는 침윤 정도를 분석한 결과를 그래프로 나타내고 있다.
도 6은 본 발명의 HOXA9 융합단백질(폴리아르기닌이 결합된 HOXA9 단백질) 처리에 따른 비소세포폐암 세포주인 A549의 이동 억제 정도를 보여주고 있다. (A)는 이동한 세포를 염색한 사진을, (B)는 세포의 이동 정도를 분석한 결과를 그래프로 나타내고 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. HOXA9 융합단백질 발현용 재조합 벡터 제작>

본 발명의 HOXA9 융합단백질의 발현을 위해 사람 유래의 HOXA9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하였다.

사람 유래 HOXA9 유전자의 5′ 말단에 10개의 아르기닌(폴리 아르기닌; 세포침투 펩타이드)이 추가되도록 하며, 제한효소 EcoRI 인식부위를 포함하는 정방향 프라이머(forward primer, 5′-AAA GAA TTC CGT CGC CGT CGC CGT CGC CGT CGC CGT CGC GCC ACC ACT GGG GCC CTG GGC-3′)와 제한효소 NotI 인식부위를 포함하는 역방향 프라이머(reverse primer, 5′-AAA GCG GCC GCC TCG TCT TTT GCT CGG TCT TTG-3′)를 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하여 HOXA9 유전자를 확보하였다.

PCR을 통해 확보한 HOXA9 유전자와 발현 벡터(vector)로 사용한 pET-41a 벡터(Novagen, Germany)를 EcoRI과 NotI으로 절단하고, 절단된 DNA를 정제한 후 T4 DNA 접합효소(T4 DNA ligase)를 이용하여 재조합 벡터(도 1)를 구축하였고, DNA 염기서열 분석을 통해 구축한 재조합 벡터의 유전자 서열의 정확도를 확인하였다. 구축한 재조합 벡터를 R10-HOXA9이라고 명명하였다.

<비교예 1 내지 3. 비교대상의 HOXA9 융합단백질 발현용 재조합 벡터 제작>

본 발명의 세포 투과 펩타이드인 폴리아르기닌에 의한 HOXA9 융합단백질의 세포 투과도를 비교하기 위해, 세포 투과 펩타이드가 결합되지 않은 HOXA9 단백질의 발현을 위한 재조합 벡터(Con-HOXA9; 비교예 1), 10개의 리신(lysine)이 HOXA9 단백질의 5′ 말단에 결합된 융합단백질의 발현을 위한 재조합 벡터(K10-HOXA9; 비교예 2) 및 Tat(HIV의 전사 유도 인자)이 HOXA9 단백질의 5′ 말단에 결합된 융합단백질의 발현을 위한 재조합 벡터(Tat-HOXA9; 비교예 3)를 구축하여 HOXA9 융합단백질의 세포 투과도 실험에 이용하였다.

<실시예 2. HOXA9 융합단백질의 발현 및 정제>

실시예 1 및 비교예 1 내지 비교예 3의 재조합 벡터를 대장균 BL21(DE3)(RBC Bioscinece, Taiwan)에 형질 전환시킨 후 50㎍/㎖의 가나마이신(kanamycin)이 포함된 LB(luria-bertani) 액체 배지에 넣고 37℃에서 16시간 동안 배양하고, 다음날 배양액을 0.1mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoid) 가 포함되어 있고, 가나마이신이 포함되지 않은 LB 배지에 재접종하고 30℃에서 5시간 동안 배양하였다.

대장균 배양액을 모아 원심 분리하여 대장균 펠렛(pellet)을 확보하였다. 확보한 대장균 펠렛을 용해 버퍼(lysis buffer, 2mM EDTA, 50mM Tris-HCl, pH8.0, 0.1% Triton X-100, 1×proteinase inhibitor cocktail)로 현탁한 후 초음파 분쇄(sonication) 방법을 이용하여 대장균을 용해시켰다. 용해시킨 대장균을 원심분리하여 상층액을 확보하였고, 확보한 상층액을 니켈 컬럼(Ni column)에 가하여 재조합 단백질을 정제하였다. HOXA9 융합단백질의 발현 및 정제 여부는 8% SDS-PAGE 겔을 이용하여 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보여주듯이, IPTG의 처리 여부에 따라 상기 실시예 1(R10-HOXA9)의 HOXA9 융합단백질 및 비교예 1(Con-HOXA9)의 HOXA9 단백질의 발현 정도가 달라짐을 확인하였고(2A), 컬럼을 통해 정제한 결과 실시예 1의 HOXA9 융합단백질 및 비교예 1의 HOXA9 단백질이 정제가 되었음을 확인하였다(2B).

상기 비교예 2(K10-HOXA9) 및 비교예 3(Tat-HOXA9)의 재조합 벡터를 이용하여 단백질을 발현한 경우에도 HOXA9 융합단백질이 제대로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3. HOXA9 융합단백질의 세포 투과성 확인>

실시예 3-1. 세포 배양

상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 비교예 3의 HOXA9 융합단백질의 세포 투과성을 확인하기 위해 비소세포폐암 세포주인 A549 세포를 이용하였다. A549 세포는 한국세포주 은행에서 구입하였다.

A549 세포를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함된 RPMI1640 배지에 넣고 5% 이산화탄소(CO₂), 37℃ 배양기에서 배양하였다.

실시예 3-2. HOXA9 융합단백질 처리

실시예 3-1에서 배양한 A549 세포를 35㎜ 배양접시에 3×10⁵개가 되도록 넣은 후 16시간 이상 배양하였다. 배양 후 FBS가 포함되지 않은 RPMI1640배지로 2회 세척한 후, 실시예 1 및 비교예 1 내지 비교예 3의 HOXA9 융합단백질을 처리하였다. 이때, 각각의 HOXA9 융합단백질을 0.25, 0.5, 1.0, 2.0uM 농도로 처리하였고, 처리 시간도 다양하게 진행하였다.

각각의 처리 시간이 지나면 세포내에 들어가지 않고 남은 단백질을 제거하기 위해 PBS(phosphate buffer saline)로 두 번 세척하였다.

실시예 3-3. 웨스턴 블랏(Western blot)을 이용한 HOXA9 융합단백질의 세포 투과성 확인

상기 실시예 3-2에서 HOXA9 융합단백질을 처리한 세포를 이용하여 세포내 HOXA9 융합 단백질의 양을 확인하였다.

상기 실시예 3-2의 세포를 모은 후 RIPA 버퍼(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM Na₃VO₄, 1mM NaF, proteinase inhibitor)로 세포를 용해시킨 후 원심 분리하여 상층액을 확보하였다. 확보한 상층액을 이용해 단백질을 정량하고, 동일한 단백질이 포함된 상층액을 8% SDS-PAGE 겔에 적용하여 전기 영동하였다. 전기 영동하여 단백질 크기 별로 분리한 후에 PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인(Millipore, USA)으로 옮긴 다음, 5% 탈지분유에 멤브레인을 넣고 상온에서 1시간 블로킹(blocking)시켰다. 블로킹이 끝나면 멤브레인에 HOXA9 항체를 처리하고 4℃에서 16시간 반응시킨 후 1차 항체를 세척하고, 해당 2차 항체를 반응시킨 후 ECL(enhanced chemiluminescence system)을 이용하여 HOXA9 단백질의 양을 확인하였다. 이때, GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 로딩(loading) 대조군으로 이용하였다. 상기 실험 결과를 도 3 및 표 1에 나타내었다.

표 1의 경우에는 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 비교예 3을 이용해 발현시킨 HOXA9 융합단백질 2uM을 4시간 동안 처리한 후 세포 내 HOXA9 융합단백질의 양을 분석한 결과이다. 이때, 웨스턴 블랏을 통해 얻은 단백질 밴드의 밀도(density)를 측정한 후 각각의 HOXA9를 GAPDH 수치로 나누어 보정하고, 비교예 1을 처리한 경우의 세포 투과도를 1로 정한 후 상대적인 비율을 각각의 HOXA9 융합단백질의 세포 투과도로 표시하였다.

구분	재조합 벡터	세포 투과도
실시예 1	R10-HOXA9	6.2
비교예 1	Con-HOXA9	1.0
비교예 2	K10-HOXA9	1.6
비교예 3	Tat-HOXA9	1.2

상기 표 1에서 보여주듯이, 실시예 1의 HOXA9 융합단백질의 세포 투과도가 비교예 1 내지 비교예 3의 HOXA9 융합단백질의 세포 투과도보다 훨씬 높다는 것을 알 수 있다.

또한, 도 3을 통해 알 수 있듯이, 실시예 1의 HOXA9 융합단백질의 세포 투과도가 처리 농도 의존적이라는 것을 알 수 있으며(3A), 처리시간에 따른 세포 투과도(3B)는 처리 후 19시간까지 단백질이 안정화되고, 24시간까지 단백질이 유지되는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 HOXA9 융합단백질(폴리아르기닌이 결합된 HOXA 단백질)이 세포내 도입이 가능하므로, 치료제로서의 개발이 가능하다는 것을 예측할 수 있다.

실시예 3-3. 면역형광염색법(Immunofluorescence assay)을 이용한 HOXA9 융합단백질의 세포 투과성 확인

상기 실시예 3-2의 방법과 동일한 방법으로 HOXA9 융합단백질을 처리하였다. 이때 배양접시에 커버글라스(cover glass)를 넣고 세포를 배양하여, 커버글라스 위에 세포가 배양되도록 하였다.

18시간 동안의 단백질 처리가 끝난 후 4% 포름알데히드(formaldehyde)로 세포를 고정시킨 후 PBS로 세척하고 세포내 항체 침투가 가능하도록 하기 위해 차가운 메탄올(methanol)을 처리하였다. 메탄올 처리 한 다음 HOXA9 항체를 처리한 후 4℃에서 밤새 처리한 다음, 1차 항체에 결합할 수 있는 형광이 표지된 2차 항체를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이때 DAPI(4′,6′-diamidino-2-phenylinodole dihydrochloride)를 이용하여 핵을 염색시켰다. 염색된 세포는 형광현미경을 이용하여 확인(파란색은 DAPI, 붉은색은 HOXA9)하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보여주듯이, 비교예 1(Con-HOXA9)의 세포 투과 펩타이드가 결합되지 않은 HOXA9 단백질과 대비하여 실시예 1(R10-HOXA9)의 폴리아르기닌이 결합된 HOXA9 융합단백질을 처리한 경우, 붉은색 형광의 양이 현저히 증가한 것을 알 수 있다.

이를 통해 본 발명의 HOXA9 융합단백질(폴리아르기닌이 결합된 HOXA 단백질)이 세포 투과도가 현저히 높다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 4. HOXA9 융합단백질에 의한 비소세포폐암의 침윤 억제 확인>

48-웰 미세주화성 챔버(microchemotaxis chamber)의 하부에 1.6×10⁵개의 A549 세포를 넣고, 중간에 10㎍/㎖의 매트리겔(matrigel)이 코팅되어 있는 12㎛ 구멍이 있는 멤브레인을 넣은 다음 챔버 상부에 실시예 1(R10-HOXA9)의 폴리아르기닌이 결합된 HOXA9 융합단백질 1uM이 포함되어 있는 배지를 넣고 28시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군으로 비교예 1(Con-HOXA9)의 세포 투과 펩타이드가 결합되지 않은 HOXA9 단백질을 이용하였다. 28시간 배양한 후 챔버로부터 멤브레인을 분리하고 Diff-Quick reagent(Sysmex Corporation, Japan)을 이용하여 세포를 고정, 염색하였다. 염색된 세포를 현미경을 이용하여 관찰하고, 세포의 침윤 정도를 확인하였으며, 도 5에 그 결과를 나타내었다.

도 5에서 보여주듯이, 비교예 1(Con-HOXA9)의 세포 투과 펩타이드가 결합되지 않은 HOXA9 단백질과 대비하여 실시예 1(R10-HOXA9)의 폴리아르기닌이 결합된 HOXA9 융합단백질을 처리한 경우, 염색된 비소세포폐암 세포주인 A549의 세포가 감소(5A)한 것으로 나타났고, 세포수를 측정하여 분석한 결과 세포 침윤이 감소(5B)한 것을 알 수 있다.

이를 통해 본 발명의 HOXA9 융합단백질(폴리아르기닌이 결합된 HOXA 단백질)이 비소세포폐암의 침윤을 억제한다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 5. HOXA9 융합단백질에 의한 비소세포폐암의 이동 억제 확인>

48-웰 미세주화성 챔버(microchemotaxis chamber)의 하부에 A549 세포를 1.6×10⁵개가 되도록 넣고, 중간에 13㎍/㎖의 콜라겐 유형 1(collagen type 1)이 코팅되어 있는 12㎛ 구멍이 있는 멤브레인을 놓은 다음 챔버 상부에 실시예 1(R10-HOXA9)의 폴리아르기닌이 결합된 HOXA9 융합단백질 1uM이 포함되어 있는 배지를 넣고 15시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군으로 비교예 1(Con-HOXA9)의 세포 투과 펩타이드가 결합되지 않은 HOXA9 단백질을 이용하였다. 15시간 배양한 후 챔버로부터 멤브레인을 분리하고 Diff-Quick reagent(Sysmex Corporation, Japan)을 이용하여 세포를 고정, 염색하였다. 염색된 세포를 현미경을 이용하여 관찰하고, 세포의 이동 정도를 확인하였으며, 도 6에 그 결과를 나타내었다.

도 6에서 보여주듯이, 비교예 1(Con-HOXA9)의 세포 투과 펩타이드가 결합되지 않은 HOXA9 단백질과 대비하여 실시예 1(R10-HOXA9)의 폴리아르기닌이 결합된 HOXA9 융합단백질을 처리한 경우, 염색된 비소세포폐암 세포주인 A549의 세포가 감소(5B)한 것으로 나타났고, 세포수를 측정하여 분석한 결과 세포 이동이 감소(5B)한 것을 알 수 있다.

이를 통해 본 발명의 HOXA9 융합단백질(폴리아르기닌이 결합된 HOXA 단백질)이 비소세포폐암의 이동을 억제한다는 것을 알 수 있었다.

<제제예 1. 약학적 제제>

제제예 1-1. 정제의 제조

본 발명의 세포 투과성 HOXA9 융합단백질(폴리아르기닌이 결합된 HOXA 융합단백질) 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 1-2. 주사액제의 제조

본 발명의 세포 투과성 HOXA9 융합단백질(폴리아르기닌이 결합된 HOXA 융합단백질) 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

<110> Konyang university industrial cooperation group <120> HOXA9 cell-permeable fusion protein and composition comprising the same for preventing or treating of lung cancer <130> 2016-1 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 857 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R10-HOXA9 <400> 1 gaattccgtc gccgtcgccg tcgccgtcgc cgtcgcgcca ccactggggc cctgggcaac 60 tactacgtgg actcgttcct gctgggcgcc gacgccgcgg atgagctgag cgttggccgc 120 tatgcgccgg ggaccctggg ccagcctccc cggcaggcgg cgacgctggc cgagcacccc 180 gacttcagcc cgtgcagctt ccagtccaag gcgacggtgt ttggcgcctc gtggaaccca 240 gtgcacgcgg cgggcgccaa cgctgtaccc gctgcggtgt accaccacca tcaccaccac 300 ccctacgtgc acccccaggc gcccgtggcg gcggcggcgc cggacggcag gtacatgcgc 360 tcctggctgg agcccacgcc cggtgcgctc tccttcgcgg gcttgccctc cagccggcct 420 tatggcatta aacctgaacc gctgtcggcc agaaggggtg actgtcccac gcttgacact 480 cacactttgt ccctgactga ctatgcttgt ggttctcctc cagttgatag agaaaaacaa 540 cccagcgaag gcgccttctc tgaaaacaat gctgagaatg agagcggcgg agacaagccc 600 cccatcgatc ccaataaccc agcagccaac tggcttcatg cgcgctccac tcggaaaaag 660 cggtgcccct atacaaaaca ccagaccctg gaactggaga aagagtttct gttcaacatg 720 tacctcacca gggaccgcag gtacgaggtg gctcgactgc tcaacctcac cgagaggcag 780 gtcaagatct ggttccagaa ccgcaggatg aaaatgaaga aaatcaacaa agaccgagca 840 aaagacgagg cggccgc 857

Claims

HOXA9(homeobox A9) 단백질의 5′ 말단에 아르기닌(Arginine) 10개로 이루어진 세포 투과 펩타이드(cell-permeable peptide)가 결합된 세포 투과성 HOXA9 융합단백질이고,
상기 세포 투과성 HOXA9 융합단백질은 서열번호 1의 염기서열로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 세포 투과성 HOXA9 융합단백질.
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제1항의 세포 투과성 HOXA9 융합단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드.
제4항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현벡터.
제5항에 있어서,
상기 벡터는 pET41a인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제1항의 세포 투과성 HOXA9 융합단백질을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7항에 있어서,
상기 폐암은 비소세포 폐암인 것을 특징으로 하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.