KR102473666B1

KR102473666B1 - Hoxa9 단백질 c-말단부위의 hadp 펩티드를 포함하는 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102473666B1
Application number: KR1020200072472A
Authority: KR
Inventors: 유성란; 강재구; 이동철
Original assignee: 건양대학교 산학협력단
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2022-12-01
Also published as: KR20210155229A

Abstract

본 개시내용은 HOXA9 단백질의 활성부위를 포함하는 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 HOXA9 C말단, HD(homeobox domain) 및 HADP(homeobox active domain peptide)의 비소세포폐암 세포의 침윤 억제효과를 확인하여 이를 약학적으로 이용하는 것에 관한 것이다.
또한, 약제학 또는 약동학적으로 보다 유의하도록 세포투과성 펩티드를 더 포함하는 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

HOXA9 단백질 C-말단부위의 HADP 펩티드를 포함하는 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising HADP peptide in c-terminal region of HOXA9 protein for preventing, improving or treating lung cancer}

본 개시내용은 HOXA9 단백질의 활성부위 및 이를 포함하는 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

폐암은 2018년에 진단된 새로운 암 발병사례의 12.3 %를 차지하는 전세계적으로 가장 흔한 암 중 하나이다. 폐암은 소폐암과 비소세포폐암 (NSCLC)의 두 가지 주요 유형으로 나뉘는데, 비소세포폐암은 전체 폐암의 약 80 내지 85%를 차지하고 5 년 생존율은 약 19%에 불과하다. 이는 일부의 환자에서만 수술로 완치를 기대할 수 있고 대부분의 환자들은 진단 시 국소 진행성 또는 전이성 병기로 발견된다는 점이 영향을 미치고 있다. 따라서 폐암 특히, 비소세포폐암의 치료나 개선에 있어서 암세포의 침습, 이에 의한 전이를 억제하는 것이 주요할 것으로 예상할 수 있다.

HOX(Homeobox) 유전자는 배자발생단계 동안 유전자 조절부위의 DNA 결합부위 모티프(motif)에 결합하는 전사조절 인자로, 형태발생과 관련된 유전인자로 알려져 있다. 이 Hox 유전자는 4개의 상이한 염색체 상에서 A, B, C 및 D, 4가지 클래스로 나뉘어져 있다. 그 중 HOXA9 단백질은 다수의 암과 관련이 있다는 연구결과가 보고되고 있으며, 암의 종류에 따라 대조적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 교모세포종(glioblastoma) 및 난소암(ovarian cancer)에서는 암을 진행시키는 유전자로, 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer) 및 간암(hepatocellular carcinoma)에서는 암의 진행을 억제하는 유전자로 알려져 있다. 본 발명자의, 지난 연구에 따르면, HOXA9는 폐암 조직의 공격성, 침습성 등과 강하게 연관되어 있고, 세포 투과성을 높인 HOXA9 융합단백질을 처리한 경우 폐암 세포의 침윤과 이동이 억제되는 것을 확인하였다.

그러나 비소세포폐암 세포의 전이 진행을 조절할 수 있는 HOXA9 단백질의 서열 요소는 현재 알려져 있지 않다.

본 개시내용은 HOXA9 단백질에서 비소세포폐암의 공격성 또는 침습성과 관련있는 펩티드와 이를 포함하는 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 함이다.

본 개시내용의 일 구체예에 의하면,

HOXA9(homeobox A9) 단백질 homeobox domain을 포함하는 HOXA9 C말단 펩티드가 제공된다.

다른 구체예에 의하면,

HOXA9(homeobox A9) 단백질의 HADP(homeobox active domain peptide)를 포함하는 펩티드가 제공된다.

다른 구체예에 의하면,

상기의 펩티드를 포함하는 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다. 또한 상기의 펩티드를 포함하는 폐암세포의 이동 또는 침윤 억제용 약학조성물이 제공된다.

다른 구체예에 의하면,

서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및

서열번호 6로 표시되는 역방향 프라이머를 포함하는 HOXA9 C말단 제조용 프라이머 조성물과, 이 조성물을 이용하여 HOXA9 C말단을 제조하는 방법이 제공된다.

본 개시내용은 HOXA9(homeobox A9)의 활성부위만을 도출한 펩티드와 이를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 개시내용의 일 구체예에 의하면, 기존의 HOXA9 단백질을 전체적으로 이용하여 분자량이 크고 세포흡수성의 문제가 되는 것과 달리, HOXA9에서 비소세포폐암의 공격성 또는 침습성과 관련있는 활성부위만을 약학적으로 이용하므로 보다 적은 분자량의 펩티드를 구성하여 제조가 용이하고, 세포흡수에 유리한 효과가 있다.

다른 구체예에 의하면, 상기 펩티드에 세포투과성 단백질을 더 포함시켜 암세포내로 침투 또는 흡수효율이 증가되는 효과가 있고, 암세포내로 침투한 상기 펩티드에 의해 비소세포폐암의 세포 침윤 및 이동이 억제되는 효과가 있다.

이에 따라, 본 개시내용의 펩티드를 포함하는 비소세포폐암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 HOXA9를 구성하는 3개의 섹션과 homeobox를 포함하는 섹션을 도시한 것이다.
도 2는 HOXA9의 완전체(HOXA9-full)와 각 섹션의 A549 세포 침습 억제효과를 비교한 것이다.
도 3은 HOXA9의 완전체(HOXA9-full)와 각 섹션의 NCI-H1299 세포 침습 억제효과를 비교한 것이다.
도 4는 HOXA9 C말단의 A549세포에 대한 CDH1 발현촉진효과와 SNAI2 발현억제효과를 확인한 것이다.
도 5는 HOXA9 C말단의 NCI-H1299세포에 대한 CDH1 발현촉진효과와 SNAI2 발현억제효과를 확인한 것이다.
도 6은 HOXA9-HADP의 세포 투과성 펩티드 포함 유무에 따른 비소세포폐암에 대한 침투능을 면역형광현미경을 이용해 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 펩티드가 세포 투과성 펩티드의 유무와 종류에 따른 비소세포폐암 세포에 대한 침투능을 FACS 분석으로 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 펩티드의 세포독성을 확인한 것이다.
도 9a는 CPP33-HADP의 A549 세포 침습 억제효과를 도시한 것이고, 도 9b는 CPP33-HADP의 NCI-H1299 세포 침습 억제효과를 도시한 것이다.
도 10은 쥐모델에서 CPP33-HADP의 A549 세포의 이동, 침윤 또는 전이 억제 효과를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 펩티드가 비소세포폐암세포의 전이성을 억제하여 종양결절을 줄이는 효과를 확인한 것이다.

본 개시내용은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 개시내용의 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 개시내용이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 개시내용이 이에 한정되는 것이 아님을 이해하여야 한다.

본 개시내용의 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고, 다양한 형태로 실시할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 사상 및 기술적 특징의 동일성이 인정되는 범위의 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해하여야 한다.

달리 명시하지 않았더라도, 본 개시내용에 사용된 모든 숫자는 모든 경우마다 “약”이란 용어가 수식하고 있는 것으로 이해되어야 한다. 수식어 “약”은 통상적으로 인식되는 대략적으로의 의미를 갖도록 하기 위한 것인데, 이는 수식된 값의 특정 퍼센트 이내의 의미로서 더욱 정확하게 해석될 수 있고, 보다 구체적으로는 ±20%, ±10%, ±5%, ±2% 또는 ±1% 또는 그 미만을 의미할 수 있다.

본 개시내용의 일 구체예에 의하면, 본 개시내용의 HOXA9 단백질은 3개의 구간으로 구성될 수 있다. 구체적으로, HOXA9 N말단부(N-terminal), HOXA9-M 및 HOXA9 C말단부(C-terminal)로 구성될 수 있다. 보다 구체적으로, HOXA9 단백질은 272개의 아미노산으로 구성되어 있고, N말단부는 1번에서 104번 아미노산으로 구성되어 있으며, HOXA9-M은 92번에서 194번 아미노산으로 구성되어 있으며, C말단부는 182번에서 272번 아미노산으로 구성되어 있으며, 서열번호 1과 같다.

다른 구체예에 의하면, HOXA9의 호메오박스 도메인(homeobox domain, 이하 HD)은 209번에서 262번 아미노산으로 구성될 수 있다. 구체적으로 C말단부(182-272 아미노산)에 포함될 수 있다.

다른 구체예에 의하면, HOXA9의 호메오박스 활성 도메인 펩티드(homeobox active domain peptide, 이하 HADP)는 호메오박스 도메인 또는 HOXA9 C말단부에 포함될 수 있다. 구체적으로 HOXA9-HADP는 링커 모티프(202-206 아미노산), N말단 암(arm) 모티프(207-212 아미노산) 및 알파-헬릭스 모티프(246-260 아미노산)으로 구성될 수 있다.

한편, 본 개시내용의 따른 HOXA9 단백질, HOXA9 C말단, HOXA9-HD 및 HOXA9-HADP 중 적어도 하나의 펩티드는 세포 투과성 펩티드(CPPs)를 더 포함할 수 있다. 세포 투과성 펩티드는 세포막을 통과하는 것을 보다 용이하게 도와주는 물질을 의미할 수 있다. 구체적으로 단백질, 펩티드 등의 유효물질의 세포내 전달효율을 높이는 물질을 의미할 수 있다. 상기 세포 투과성 펩티드는 아르기닌(Arginine)으로 구성된 서열이거나 CPP33일 수 있다. 상기 아르기닌은 5개 내지 20개가 결합된 서열일 수 있다.

상기 세포 투과성 펩티드는 형광물질을 더 포함할 수 있다. 형광물질은 FITC(fluorescein-5-isothiocyanate)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 개시내용의 일 구체예에 의하면, HOXA9-완전체(full), HOXA9-C말단, HOXA9-HD 및 HOXA9-HADP 중 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 조성물은 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.

다른 구체예에 의하면, 상기 폐암의 예방, 개선 또는 치료는 폐암세포의 침습, 침윤 및/또는 이동을 억제하는 것일 수 있다. 상기 폐암세포의 침습, 침윤 및/또는 이동을 억제하는 것은 EMT-관련 유전자의 발현을 조절하는 것일 수 있다. 구체적으로, CDH1의 발현을 활성시키는 것, SNAI2의 발현을 억제시키는 것 및 NF-κB의 활성을 억제시키는 것 중 적어도 하나일 수 있다.

본 개시내용에 따르면, 상기 폐암은 비소세포폐암일 수 있다. 보다 구체적으로 비소세포폐암세포는 A549 또는 NCI-H1299일 수 있다.

본 개시내용의 다른 구체예에 의하면,

HOXA9의 서로 다른 섹션을 제조할 수 있다. 구체적으로, 제한효소 EcoRI 제한부위를 포함하는 정방향 프라이머와 제한효소 NotI 제한부위를 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 조성물로 PCR을 수행하는 제조방법일 수 있다. 보다 구체적으로, HOXA9-C말단을 제조하는 정방향 프라이머는 서열번호 5를 포함할 수 있고, HOXA9-C말단을 제조하는 역방향 프라이머는 서열번호 6을 포함할 수 있다. 또한 HOXA9-N말단을 제조하는 정방향 프라이머는 서열번호 7을 포함할 수 있고, HOXA9-N말단을 제조하는 역방향 프라이머는 서열번호 8을 포함할 수 있다. 또한 HOXA9-M을 제조하는 정방향 프라이머는 서열번호 9를 포함할 수 있고, HOXA9-N말단을 제조하는 역방향 프라이머는 서열번호 10을 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 암이 발병할 수 있는 개체를 대상으로 하는 약학적 조성물일 수 있다. 구체적으로 암이 발병할 수 있는 개체는 동물을 의미할 수 있으며, 상기 동물은 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 원숭이 또는 고양이일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 개시내용의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 분말, 캡슐, 정제, 수성 현탁액, n중정(n은 2, 3 또는 4), 구강붕해정, 설하정 또는 필름정 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 개시내용의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 또는 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 혼합하여 사용할 수 있다.

본 개시내용의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있고, 또한 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 개시내용에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투여가 바람직하다.

본 개시내용에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 개시내용의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 HOXA9 단백질의 C-말단, HOXA9 단백질의 HD, HOXA9 단백질의 HADP를 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 본 개시내용의 목적에 따른 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 본 개시내용이 속한 분야의 통상의 기술자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 예를 들어 상기 약학적 조성물 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 2 g일 수 있고, 예를 들어 약 1 ㎍ 내지 약 1 g일 수 있고, 예를 들어 약 10 ㎍ 내지 약 500 mg일 수 있고, 예를 들어 약 100 ㎍ 내지 약 100 mg일 수 있고, 예를 들어 약 1 mg 내지 약 90 mg일 수 있고, 예를 들어 약 5 mg 내지 약 80 mg일 수 있고, 예를 들어 약 10 mg 내지 약 70 mg일 수 있고, 예를 들어 약 15 mg 내지 약 60 mg일 수 있고, 또는 예를 들어 약 20 mg 내지 약 50 mg일 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg일 수 있고, 예를 들어 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg일 수 있고, 또는 에를 들어 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg 일 수 있다. 상기 투여횟수는 1 일 1회, 1 일 다회, 1주 2 내지 3회, 1달 1 내지 4회 또는 1년 1 내지 12회 투여될 수 있다.

본 개시내용에 따르면, 상기 약학적 조성물에 다른 항암제가 더 포함될 수 있다. 구체적으로 본 개시내용의 약학적 조성물과 다른 항암제의 유효성분이 포함된 비율은 예를 들어 1 : 약 0.001 내지 1000일 수 있고, 예를 들어 1 : 약 0.01 내지 100일 수 있고, 또는 예를 들어 1 : 약 0.1 내지 10일 수 있다.

본 개시내용의 약학적 조성물은 단독으로, 혹은 다른 항암제를 혼합하여 사용할 수 있고, 혹은 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 기타 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 “다른 항암제”는 항암제로 상용되고 있는 화합물, 추출물, 합성의약품, 바이오의약품 등을 포함한 의약품일 수 있고, 항암효과를 기대할 수 있는 기작을 가진 것으로 보고된 화합물, 추출물, 단백질, 세포, 체내분비물일 수 있다. 특정 구체예에 따르면 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

하기 실험예를 통해 본 개시내용을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 개시내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : HOXA9 단백질의 비소세포폐암 세포의 침윤 저해용 서열 모티프(motif) 검출

HOXA9 단백질에서 비소세포폐암 세포의 세포이동을 저해하는 효과를 가진 서열 모티프(motif)를 밝히기 위하여 HOXA9-N말단, HOXA9-M, HOXA9-C말단의 3개 섹션으로 나누었다. 각 섹션은 제한효소 EcoRI 제한부위를 포함하는 정방향 프라이머, 제한효소 NotI 제한부위를 포함하는 역방향 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 복제하였다. 프라이머 서열은 표 1과 같다.

섹션	Primer sequences		Annealing temperature	Size (bp)
HOXA9- N말단	정방향	5’-AAA GAA TTC ATG GCC ACC ACT GGG GCC-3’	60°C	335
	역방향	5’-AAA GCG GCC GCT CAG TCC GGC GCC GCC GCC GC-3’
HOXA9-M	정방향	5’-AAA GAA TTC ATG GTG CAC CCC CAG GCG CCC-3’	60°C	335
	역방향	5’-AAA GCG GCC GCT CAA TTG GGA TCG ATG GGG GG-3’
HOXA9- C말단	정방향	5’-AAA GAA TTC ATG AAT GAG AGC GGC GGA GAC-3’	60°C	289
	역방향	5’-AAA GCG GCC GCT CAC TCG TCT TTT GCT CGG TC-3’

도 1을 참고하면, HOXA9 N-말단은 104개의 아미노산(1-104)으로 이루어져 있고, HOXA9-M은 102개의 아미노산(92-194)의 아미노산으로 이루어져 있으며, HOXA9 C-말단은 90개의 아미노산(182-272)으로 이루어져 있다.

본 발명자는 각 섹션의 비소세포폐암세포(A549와 NCI-H1299)의 세포침윤에 대한 억제효과를 확인하였다. 48-웰 미세주화성 챔버(microchemotaxis chamber)의 하부에 1.6×10⁵ 개의 A549 세포 또는 NCI-H1299세포를 넣고, 중간에 10㎍/㎖의 매트리겔(matrigel)이 코팅되어 있는 12㎛ 구멍이 있는 멤브레인을 넣은 다음 챔버 상부에 각 섹션을 1 uM이 포함되어 있는 배지를 넣고 28시간 동안 배양하였다. 28시간 배양한 후 챔버로부터 멤브레인을 분리하고 Diff-Quick reagent(Sysmex Corporation, Japan)을 이용하여 세포를 고정, 염색하였다. 염색된 세포를 현미경을 이용하여 관찰하고, 세포의 침윤 정도를 확인하였으며, 도 2 및 도 3과 같은 결과가 나타났다. 이를 참조하면, 호미오박스 도메인(HD, 209-262 아미노산)을 보유한 C-말단이 A549세포와 NCI-H1299세포에 대한 침윤억제효과가 HOXA9-완전체(full)와 유사 정도의 높은 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 2 : HOXA9 C말단의 상피중간엽 전이(EMT)유전자의 발현 조절효과

상피중간엽 전이유전자는 세포간의 접합을 잃게 하고 이동성과 침윤성을 갖도록 하여 중간엽세포가 되도록 조절하는 효과가 있다고 알려져 있다. 특히, CDH1의 발현을 촉진하는 것은 EMT를 억제하여 세포침윤 억제에 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 반대로 SNAI2의 발현을 억제하는 것은 CDH1의 유전자 발현을 하향 조절하여 EMT를 유발하는 것으로 알려져있다. 따라서 CDH1 발현을 촉진하거나 SNAI2의 발현을 억제하는 것으로 EMT 유발을 억제하여 암세포의 침윤을 저해하는 효과가 기대된다.

CDH1 및 SNAI2의 발현정도를 확인하기 위하여 qRT-PCR을 이용하여 정량분석하였다. CDH1의 복제를 위하여 정방향 프라이머(5'- TCA GCG TTG TGA CTG TGA A-3')와 역방향 프라이머(5'- CCT CCA AGA ATC CCC AGA AT-3')를 사용하였고, SNAI2의 복제를 위하여 정방향 프라이머(5'- TCT GCA GAC CCA TTC TGA TG-3')와 역방향 프라이머(5'- AGC AGC CAG ATT CCT CAT GT-3')를 사용하였고, GADPH 복제를 위하여 정방향 프라이머(5'-ACA GTC AGC CGC ATC TTC TT-3')와 역방향 프라이머(5'-ACG ACC AAA TCC GTT GAC TC-3')를 사용하였다. PCR 과정은 일반적으로 수행하는 방법으로 수행하였으며, 구체적으로는 95℃에서 10초, 56℃에서 10초, 72℃에서 10초의 열적순환과정을 40회 수행하였고, CDH1와 SNAI2의 발현정도는 GADPH의 상대적 수치로 확인하였다.

도 4를 참조하면, A549 세포에 대하여 HOXA9-C말단이 HOXA9-완전체와 유사수준의 CDH1 발현 촉진효과와 SNAI2 발현 억제효과를 보이고 있다. 또한 도 5를 참조하면 NCI-H1299 세포에 대하여 HOXA9-C말단이 HOXA9-완전체보다 우수한 CDH1 발현 촉진효과와 비교적 높은 SNAI2 발현 억제효과를 보이고 있다. 이에 따라서 HOXA9-C말단이 EMT 유발을 억제할 것으로 기대된다.

실시예 3 : HOXA9-HADP 펩티드의 세포 투과성 확인

상기 실시예 1 및 2를 통해 HOXA9-C말단이 비소세포폐암의 세포침윤을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 이를 바탕으로 세포침윤 억제효과를 나타내는 활성서열 모티프(motif)를 C말단으로부터 도출하여, HOXA9-HADP(homeobox active domain peptide) 펩티드를 합성하였다. HOXA9-HADP 펩티드는 연결 모티프(202-206 아미노산)과 N말단 arm 모티프(207-212 아미노산) 및 α-helix 모티프(246-260 아미노산)으로 구성되며, 서열번호 2의 아미노산 서열과 같다. 다만, HOXA9-HADP 펩티드는 플라즈마 멤브레인을 투과할 수 없어, 본 발명자는 상기 펩티드에 세포투과성을 갖도록 하기 위해 CPP(cell permeable peptide)33 또는 폴리아르기닌(R10)을 결합하였고, 서열번호 3 또는 서열번호 4와 같다. 또한 표지제로 FITC를 결합하였다. 비교예로 결합하지 않은 C-HADP(서열번호 2)와 실시예인 R10-HADP 및 CPP33-HADP의 세포투과성을 비교하였다. 먼저, 밤새 배양된 세포에 1μM의 각 펩티드를 4시간동안 처리하고, 4% 포름알데하이드로 고정한 후 PBS로 세척한다. 이후 0.3% triton-X100을 처리하고, DAPI(4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)로 염색하고 공초점 현미경으로 확인하였다. 도 6을 참조하면, R10-HADP와 CPP33-HADP는 세포질 내에서 염색된 것이 확인이 되지만, C-HADP는 발견되지 않는다.

한편 유세포분석으로 상기 각 펩티드가 비소세포폐암의 A549와 NCI-H1299세포 내부로 투과되는지를 확인하였다. 도 7을 참조하면, CPP33-HADP는 A549 및 NCI-H1299 모두에 투과되는 것을 확인할 수 있는 반면, R10-HADP는 NCI-H1299에서는 투과되지 않는 것을 확인하였으며, C-HADP는 모든 세포에서 투과되지 않는 것을 확인하였다.

추가적으로 MTT 분석으로 각 펩티드의 세포독성을 확인하였고, 도 8을 참조하면 독성은 없는 것으로 확인하였다.

실시예 3 : CPP33-HADP 펩티드의 비소세포폐암세포 침윤억제 효과 확인

CPP33-HADP 펩티드의 비소세포폐암세포 침윤 억제효과가 있는지 확인하기 위하여 실시예 1에서 수행하였던 실험을 재차 수행하였다. 도 9a 및 9b를 참조하면, CPP33-HADP 펩티드가 A549세포와 NCI-H1299세포의 침윤 억제효과가 유의하게 나타나는 것을 확인하였다.

이러한 결과를 바탕으로 쥐 모델에 대한 in vivo 실험을 수행하였다. 암컷 BALB/c-nu/nu 쥐의 꼬리정맥으로 생물발광성 루시퍼라아제(luciferase)가 발현된 A549세포(4×10⁶)를 주입한 후, 4mg/kg의 CPP33-HADP 펩티드와 C-HADP 펩티드를 주당 2번씩 4주간 복강주사로 주입하였다. 도 10을 참조하면, CPP33-HADP 펩티드 주입한 경우에 종양 병변이 일어난 영역이 현저하게 줄어든 것을 확인할 수 있다. 이어서 이를 확인하기 위하여, 각 쥐 모델에 대한 폐 조직을 헤마토실린(hematoxylin)과 이오신(eosin)으로 염색하여 세포전이성을 확인하였다. 도 11을 참조하면 CPP33-HADP 펩티드 주입한 경우, 비교군(C-HADP)에 비하여 종양결절이 현저하게 줄어든 것을 확인하였다.

<110> KONYANG UNIVERSITY IND COOPERA <120> Pharmaceutical composition comprising HADP peptide in c-terminal region of HOXA9 protein for preventing, improving or treating lung cancer <130> P20DS0178 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXA9 C-terminal <400> 1 Asn Glu Ser Gly Gly Asp Lys Pro Pro Ile Asp Pro Asn Asn Pro Ala 1 5 10 15 Ala Asn Trp Leu His Ala Arg Ser Thr Arg Lys Lys Arg Cys Pro Tyr 20 25 30 Thr Lys His Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn Met 35 40 45 Tyr Leu Thr Arg Asp Arg Arg Tyr Glu Val Ala Arg Leu Leu Asn Leu 50 55 60 Thr Glu Arg Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Met 65 70 75 80 Lys Lys Ile Asn Lys Asp Arg Ala Lys Asp Glu 85 90 <210> 2 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXA9-HADP <400> 2 His Ala Arg Ser Thr Arg Lys Lys Arg Cys Pro Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 10 15 Glu Arg Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Met Lys 20 25 30 Lys Ile Asn Lys 35 <210> 3 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP33-HOXA9-HADP <400> 3 Arg Leu Trp Met Arg Trp Tyr Ser Pro Arg Thr Arg Ala Tyr Gly His 1 5 10 15 Ala Arg Ser Thr Arg Lys Lys Arg Cys Pro Ser Gly Gly Ser Thr Glu 20 25 30 Arg Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Met Lys Lys 35 40 45 Ile Asn Lys 50 <210> 4 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R10-HOXA9-HADP <400> 4 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His Ala Arg Ser Thr Arg 1 5 10 15 Lys Lys Arg Cys Pro Ser Gly Gly Ser Thr Glu Arg Gln Val Lys Ile 20 25 30 Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Met Lys Lys Ile Asn Lys 35 40 45 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXA9 C-terminal forward primer <400> 5 aaagaattca tgaatgagag cggcggagac 30 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXA9 C-terminal reverse primer <400> 6 aaagcggccg ctcactcgtc ttttgctcgg tc 32 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXA9 N-terminal forward primer <400> 7 aaagaattca tggccaccac tggggcc 27 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXA9 N-terminal reverse primer <400> 8 aaagcggccg ctcagtccgg cgccgccgcc gc 32 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXA9-M forward primer <400> 9 aaagaattca tggtgcaccc ccaggcgccc 30 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXA9-M reverse primer <400> 10 aaagcggccg ctcaattggg atcgatgggg gg 32 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP33 <400> 11 Arg Leu Trp Met Arg Trp Tyr Ser Pro Arg Thr Arg Ala Tyr Gly 1 5 10 15

Claims

HOXA9(homeobox A9) 단백질의 HADP(homeobox active domain peptide); 및 세포 투과성 펩티드를 포함하며,
HOXA9(homeobox A9) 단백질 homeobox domain을 포함하는 HOXA9 C말단 펩티드.
삭제
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제 1항에 있어서,
상기 세포 투과성 펩티드는 아르기닌 5 내지 20개가 결합된 것이거나 서열번호 11을 포함하는 CPP33인 펩티드.
제 1항 및 4항 중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)인 약학적 조성물.
제 1항 및 4항 중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는 폐암세포의 이동 또는 침윤 억제용 약학조성물.
제 7항에 있어서,
상기 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)인 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 HOXA9(homeobox A9) 단백질의 C말단은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
제 1항에 있어서,
상기 HOXA9(homeobox A9) 단백질의 HADP(homeobox active domain peptide)는 서열번호 2의 아미노산 서열인 펩티드.
제 4항에 있어서,
상기 펩티드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열인 펩티드.
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HOXA9(homeobox A9) 단백질의 C-말단(C-terminal);
HOXA9(homeobox A9) 단백질의 HADP(homeobox active domain peptide); 및
세포 투과성 펩티드를 포함하는 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제 15항에 있어서,
상기 세포 투과성 펩티드는 아르기닌 5 내지 20개가 결합된 것이거나 CPP33인 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제 15항 및 16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)인 약학적 조성물.