CN114133432A - 一种抑制肿瘤细胞生长和转移的靶向肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制肿瘤细胞生长和转移的靶向肽及其应用。该靶向肽选自如下任一序列：(a)由Asn‑His‑Ala‑His‑Tyr‑Leu‑Gly‑Ala‑Leu‑Leu‑Ser‑Thr组成的肽；(b)在序列(a)的N末端和/或C末端增加一个或多个氨基酸残基组成的肽。本发明中的靶向肽可采用多肽合成技术合成，可特异性抑制EGF刺激的细胞增殖和/或迁移的活性，从而可用于治疗EGF/EGFR介导的信号通路异常活化的多种恶性肿瘤，成本低，毒副作用小，安全性高，适用范围广，具备良好的产业化前景。

Description

一种抑制肿瘤细胞生长和转移的靶向肽及其应用

技术领域

本发明属于肽技术领域，特别涉及一种抑制肿瘤细胞生长和转移的靶向肽及其应用。

背景技术

表皮细胞生长因子(EGF)在体内分布广泛且具有多种重要的生物学功能，其时空表达及表达水平受到严谨的调控。表皮细胞生长因子受体(EGFR)是一种细胞表面酪氨酸激酶受体，EGF通过结合和激活EGFR启动下游多条信号级联通路，在上皮细胞生理作用中扮演重要角色。然而，EGF/EGFR信号失调也可使机体发生病理性改变，与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。据报道，EGF在肝癌中高表达，与肿瘤分级呈正相关，EGF通过诱导纤维连接蛋白(FN)促进肝癌细胞的迁移和侵袭，激活的EGF/EGFR信号与侵袭性表型和肝内转移相关；EGF还可调控肝癌炎性细胞因子CXCL5和CXCL8的产生；通过丙酮酸激酶亚型M2(PKM2)依赖的组蛋白H3-Thr11磷酸化诱导肝癌细胞PD-L1的表达，而PD-L1高表达则可通过抑制T细胞的增殖和功能，导致肿瘤微环境的免疫抑制；此外，EGF/EGFR激活的信号分子ERK和Akt分别磷酸化激酶PKM2的Ser37和乙酰转移酶p300的Ser1834，介导Dickkopf-1蛋白(DKK1)启动子区组蛋白H3的磷酸化和乙酰化，协同增强DKK1转录表达，而DKK1则进一步通过诱导Wnt信号效应分子β-连环蛋白(β-catenin)，进而促进肝癌转移。除了促进肝癌恶性进展，EGF的存在与胃癌中胃壁浸润程度和淋巴结转移密切相关，且EGF阳性患者的5年生存率低于EGF阴性患者，提示EGF在胃癌中表达可能代表更高的恶性潜能。EGF还可通过激活下游信号通路，上调RFPL3和端粒逆转录酶，或诱导IL8的产生，促进非小细胞肺癌的生长和炎症。在口腔鳞状细胞癌细胞中，EGF通过诱导胰岛素样生长因子-II mRNA结合蛋白-3(IMP-3)表达，促进细胞侵袭。上述研究表明EGF/EGFR参与调控多种肿瘤细胞的生长和转移，可能是潜在的抗肿瘤细胞生长和转移的治疗靶点(参见：Liu Z,Chen D,Ning F,et al.EGF is highlyexpressed in hepatocellular carcinoma(HCC)and promotes motility of HCC cellsvia fibronectin.J Cell Biochem.2018,119(5):4170-4183；Huang P,Xu X,Wang L,etal.The role of EGF-EGFR signalling pathway in hepatocellular carcinomainflammatory microenvironment.J Cell Mol Med.2014,18(2):218-230；Wang X,LiangC,Yao X,et al.PKM2-induced the phosphorylation of histone H3 contributes toEGF-mediated PD-L1 transcription in HCC.Front Pharmacol.2020,11:577108；Niu J,Li W,Liang C,et al.EGF promotes DKK1 transcription in hepatocellularcarcinoma by enhancing the phosphorylation and acetylation of histone H3.SciSignal.2020,13(657):eabb5727；Tokunaga A,Onda M,Okuda T,et al.Clinicalsignificance of epidermal growth factor(EGF),EGF receptor,and c-erbB-2inhuman gastric cancer.Cancer.1995,75(6Suppl):1418-1425；Lin C,Qin Y,Zhang H,etal.EGF upregulates RFPL3 and hTERT via the MEK signaling pathway in non-smallcell lung cancer cells.Oncol Rep.2018,40(1):29-38；Zhang Y,Wang L,Zhang M,etal.Potential mechanism of interleukin-8production from lung cancer cells:aninvolvement of EGF–EGFR–PI3K–Akt–Erk pathway.J Cell Physiol.2012,227(1):35–43；Zhang X,Jung I,Hwang Y S.EGF enhances low-invasive cancer cell invasion bypromoting IMP-3expression.Tumour Biol.2016,37(2):2555-2563.)。

EGFR突变和/或过度表达常见于多种恶性肿瘤，目前以EGFR为肿瘤治疗靶点的临床药物主要为受体酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)和中和单克隆抗体(mAbs)。以EGFR为靶点的TKIs主要包括吉非替尼(商品名：Iressa)、厄洛替尼(商品名：Tarceva)、埃克替尼(商品名：Conmana)、奥西替尼(商品名：泰瑞沙)，以及2020年3月获中国国家药品监督管理局批准上市的阿美替尼(商品名：阿美乐)。TKIs的不良反应主要表现为皮疹、腹泻等。以EGFR为靶点的mAbs包括人鼠嵌合型西妥昔单抗(商品名：Erbitux)、全人型帕尼单抗(商品名：Vectinbix)和人源化型尼妥珠单抗(商品名：泰欣生)，与TKIs相比，mAbs的特异性更强，但生产成本高，且存在皮疹、肺纤维化、发热、恶心、血压下降和头晕等不良反应。临床证据表明，虽然EGFR分子靶向药物为放化疗效果不理想，以及失去手术机会的患者带来了曙光，但针对EGFR疗法的有效反应是暂时的，表现为最初肿瘤的显著变小，随后反弹迅速生长，并对治疗产生耐药。越来越多的研究表明，EGF作为EGFR配体，与肿瘤的恶性进展密切相关，是抗肿瘤靶向治疗的新靶点。目前针对EGF的药物研发尚处于起步阶段，已进入临床试验的为靶向EGF的疫苗(CIMAvax-EGF)，该疫苗由人重组EGF与脑膜炎奈瑟菌P64k蛋白化学结合，在油性佐剂Montanide ISA 51VG中乳化而成。一项采用优化的免疫接种III期临床试验表明，CIMAvax-EGF疫苗在高比例的NSCLC患者中诱导EGF特异的保护性体液应答，其数量和质量与临床疗效相关(参见：Xu M J,Johnson D E,Grandis J R.EGFR-targeted therapies inthe post-genomic era.Cancer Metastasis Rev.2017,36(3):463-473；Trivedi S,Concha-Benavente F,Srivastava R M,et al.Immune biomarkers of anti-EGFRmonoclonal antibody therapy.Ann Oncol.2015,26(1):40-47；Lim S M,Syn N L,Cho BC,et al.Acquired resistance to EGFR targeted therapy in non-small cell lungcancer:Mechanisms and therapeutic strategies.Cancer Treat Rev.2018,65:1-10；Popa X,Garcia B,Fuentes K P,et al.Anti-EGF antibodies as surrogate biomarkersof clinical efficacy in stageⅢB/Ⅳnon-small-cell lung cancer patientstreated with an optimized CIMAvax-EGF vaccinationschedule.Oncoimmunology.2020,9(1):1762465.)。

综上所述，以EGFR为肿瘤治疗靶点的临床药物存在毒副作用大或生产成本高等缺陷，靶向EGF而非其受体EGFR是一种新的阻断EGF/EGFR促癌通路的替代策略。鉴于靶向小肽类药物具有选择性好、毒副作用小和生产成本低等优势，以EGF为靶点，研发抗肿瘤细胞生长和转移的靶向小肽类药物具有重要的现实意义和应用价值。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种靶向肽或其药学上可接受的盐或酯。

本发明的另一目的在于提供所述靶向肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗肿瘤药物的药物中的应用。

本发明的再一目的在于提供所述靶向肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制表皮细胞生长因子(EGF)刺激的细胞增殖和迁移的药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种靶向肽(简称靶肽)或其药学上可接受的盐或酯，所述的靶向肽选自如下任一序列：

(a)由Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr(SEQ ID NO.1)组成的肽；

(b)在Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr(SEQ ID NO.1)的N末端和/或C末端增加一个或多个(优选如一个至五个)氨基酸残基组成的肽。

所述序列(b)中的肽优选为在“Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr”的C末端增加一个或多个(优选如一个至五个)氨基酸残基组成的肽；进一步优选为在“Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr”的C末端增加4个氨基酸残基组成的肽，如“Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr-Gly-Gly-Gly-Ser”(SEQ ID NO.2)。

本发明中所使用的肽及氨基酸、氨基酸残基和化学基团的表示方法均为所属领域公认的表示方法；其中氨基酸或氨基酸残基可以指L-型的氨基酸，也可以指D-型的氨基酸。在本发明的具体实施方式中，氨基酸或氨基酸残基指L-型的氨基酸或氨基酸残基；其中，氨基酸或氨基酸残基可以根据其侧链性质的相似性而分成以下组：疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、含脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。通常，处于同组中的氨基酸或氨基酸残基具有相似的性质。根据氨基酸残基的相似性，本发明还提供了类似于“Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr”的肽。例如，可以通过将“Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr”中一个或几个氨基酸残基替换成与其侧链性质相似的氨基酸。这些肽也涵盖在本发明的保护范围内。

使用本领域已知的方法，包括序列“Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr”的肽与高分子物质可以形成缀合物，其中，高分子物质通常是药学上可接受的水溶性多聚物部分，该缀合物一般能显示出延长肽的循环半衰期的效应。例如，PEG化可用反应性聚乙二醇分子由酰化反应或由烷基化反应来进行。在可选的方法中，缀合物由缩合活化的PEG来形成，其中PEG末端的羟基或氨基被活化的接头分子替代。缀合物也可以是包括序列“Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr”的肽同其它蛋白交联形成的缀合物。所述其它蛋白优选人白蛋白、牛白蛋白或IgG分子的Fc部分。

所述的靶向肽的制备，可采用现有技术中的公知方法进行，如可以用多肽自动合成仪进行化学合成等。

所述的靶向肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗肿瘤药物的应用。

所述的抗肿瘤药物包括抑制肿瘤细胞增殖和/或迁移的药物。

所述的肿瘤为EGF/EGFR介导的信号通路异常活化的恶性肿瘤，包括但不限于肝癌、胃癌、肺癌、口腔癌、结直肠癌或乳腺癌等；优选为肝癌。

一种抗肿瘤的药物，包含上述靶向肽或其药学上可接受的盐或酯。

所述的靶向肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制表皮细胞生长因子(EGF)刺激的细胞增殖和/或迁移的药物中的应用。

所述的细胞为肿瘤细胞，包括但不限于肝癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、口腔癌细胞、结直肠癌细胞或乳腺癌细胞等；优选为肝癌细胞。

所述的靶向肽的有效浓度为25～100μM。

所述的表皮细胞生长因子(EGF)的刺激浓度优选为25ng/ml。

所述的药物还可以含有一种或至少两种药学上可以接受的载体。

所述的载体优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等。

所述的药物可采用本领域的常规方法制成各种剂型，包括注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明以EGF分子为靶标，经多轮筛选和鉴定，获得了一种肽，该肽特异性抑制EGF刺激的细胞增殖和/或迁移的活性，从而可用于治疗EGF/EGFR介导的信号通路异常活化的多种恶性肿瘤，包括但不限于肝癌、胃癌、肺癌、口腔癌、结直肠癌或乳腺癌等，且该肽可以采用现有多肽合成技术生成，成本低，但是效果好，安全性高，适用范围广。

2、本发明针对以EGF/EGFR作为恶性肿瘤治疗靶点，目前临床使用或处于临床试验阶段的小分子化合物抑制剂和抗体存在着毒副作用大和生产成本高等问题，提供的靶肽可采用常规技术合成，属于靶向药物，一方面较现有的抗体类靶向药物生产成本低，另一方面较现有的小分子化合物抑制剂毒副作用小，具备良好的产业化前景。

3、本发明的技术方案包括能够通过噬菌体展示来筛选得到的靶肽(通过噬菌体展示筛选获得靶肽的序列，然后通过自动肽合成仪合成靶肽)及其药学上可接受的盐或酯的合成和制备方法；靶肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制EGF刺激的细胞增殖和迁移，用于治疗EGF/EGFR介导的信号通路异常活化的多种恶性肿瘤的组合物中的应用。

附图说明

图1是靶肽抑制肝癌细胞增殖的结果图(图中显示靶肽与EGF共处理的HepG2细胞抑制率的统计分析结果；**p<0.01表示有统计学差异)。

图2是靶肽对Erk1/2激酶活化的影响图；其中，A为靶肽与EGF共处理、及单独靶肽处理的免疫印迹图；B为靶肽与EGF共处理、及单独靶肽处理的灰度分析图(*p<0.05表示有统计学差异)。

图3是靶肽抑制肿瘤细胞迁移图；其中，A为靶肽与EGF共处理、及单独靶肽处理的HepG2细胞的迁移图；B为靶肽与EGF共处理、及单独靶肽处理的HepG2细胞的迁移细胞数统计分析结果(图中：**p<0.01表示有统计学差异，ns表示无显著性差异)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

本发明实施例中涉及的表皮细胞生长因子(EGF)购自PeproTech公司。

实施例1靶肽的合成

通过固相肽合成方法，使用413A型自动肽合成仪(购自Perkin Elmer公司)合成如下序列所示的肽：Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr，其中氨基酸残基均为L-型的氨基酸。合成的具体过程如下：首先，保护氨基酸单体上的反应性基团：氨基酸的α氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护；并对以下特定氨基酸进行侧链保护：对Asn的侧链保护基为三苯甲基(Trt)，对Ser和Thr的侧链保护基为叔丁基(tBu)。然后，以N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑作为活化试剂，使受保护的氨基酸依次偶联，偶联每次40min。在15％(v/v)的乙二硫醇/二甲硫醚/茴香醚(体积比为1：1：1)存在的情况下，肽与三氟乙酸(85％(v/v)；TFA)在室温反应120min，从而从聚合体支持物上切割下来，同时脱除保护基并将C末端酰胺化。接着用无水乙醚沉淀肽，然后用无水乙醚多次洗涤，充分除去硫醇。在水/叔丁醇(体积比为1：1)中沉淀，冷冻干燥，得到粗肽。粗肽在30min内以反向HPLC纯化，以37～42％(v/v)乙晴/0.9％(v/v)TFA梯度进行。然后进行浓缩、冻干。由此得到合成肽，经HPLC检测，其纯度≥95％。

实施例2靶肽对肿瘤细胞存活率的影响

将肝癌细胞HepG2(来源于中国科学院细胞库)按每孔2000个细胞铺于96孔板中，在添加了10％(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养过夜，然后将HepG2细胞的培养基替换为含2％(v/v)FBS的DMED培养基，同时加入实施例1制备的靶肽(25μM、50μM或100μM)继续培养12h，再加入EGF(25ng/ml)孵育48h作为靶肽与EGF共处理组；同时以单独EGF(25ng/ml)作为EGF处理组，以不加入靶肽与EGF为空白对照组，三次重复。按照MTT法即噻唑兰显色后检测570nm的光吸收值(OD)，分别按如下公式计算靶肽与EGF共处理组的抑制率：

靶肽与EGF共处理组抑制率＝[(EGF处理组的OD值－靶肽与EGF共处理组的OD值)/(EGF处理组的OD值－空白对照组的OD值)]×100％。

结果如图1所示：结果显示实施例1制备的靶肽呈浓度依赖显著抑制EGF诱导的HepG2细胞增殖。

实施例3靶肽对Erk1/2激酶活化的影响

将HepG2细胞接种于6孔板中，在含10％(v/v)FBS的DMEM培养基中培养过夜。弃去培养基，加入含2％(v/v)FBS的DMED培养基继续培养24h。将实验分成三组，其中实验组先用实施例1制备的靶肽(100μM)与细胞混合预处理4h，对照组(阳性和阴性)均加等体积的PBS缓冲液，然后在靶肽预处理的细胞和阳性对照组细胞中分别加入25ng/ml EGF刺激15min，阴性对照组加入等体积PBS缓冲液，两次重复。经PBS缓冲液洗涤后，加入RIPA裂解液裂解细胞，然后进行10％SDS-PAGE电泳。电泳后转膜至PVDF膜上(350mA，70min)，5％(w/v)脱脂奶粉封闭1.5h，充分洗膜后加入抗Erk1/2、phospho-Erk1/2(p-Erk1/2)和GAPDH的兔单克隆抗体(均购自Cell Signaling Technology公司)孵育过夜，充分洗膜后加入HRP(辣根过氧化物酶)偶连的羊抗兔抗体(购自Bio-Rad公司)孵育1h，充分洗膜后用ECL检测免疫印迹结果。

结果显示(图2A和2B)，EGF明显促进HepG2细胞中Erk1/2的活化(磷酸化)，实施例1制备的靶肽可显著抑制EGF诱导的Erk1/2的活化。

实施例4靶肽对细胞迁移的影响

将肝癌细胞HepG2按每孔2.5×10⁵个细胞接种于12孔板中，在含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基中培养过夜。弃去培养基，加入含2％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基继续培养，待细胞的汇合率约80％时，用小枪头以均匀的力度在孔内垂直划三条平行直线。弃培养液，PBS缓冲液洗涤至无漂浮细胞为止。加入含2％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基继续培养。分组加药处理，设空白对照组、EGF(25ng/ml)组、实施例1制备的靶肽(100μM)+EGF(25ng/ml)组和实施例1制备的靶肽(100μM)组，两次重复。倒置显微镜下观察0h、24h和48h时各组细胞划痕区面积的动态变化。

结果显示(图3A和3B)，EGF明显促进HepG2细胞的迁移，实施例1制备的靶肽显著抑制EGF对上述肝癌细胞迁移的促进作用，而单独实施例1制备的靶肽对HepG2细胞的迁移能力无显著影响。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一种抑制肿瘤细胞生长和转移的靶向肽及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asn His Ala His Tyr Leu Gly Ala Leu Leu Ser Thr

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn His Ala His Tyr Leu Gly Ala Leu Leu Ser Thr Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Claims (8)

1.一种靶向肽或其药学上可接受的盐或酯，其特征在于，所述的靶向肽选自如下任一序列：

(a)由Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr组成的肽；

(b)在Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr的N末端和/或C末端增加一个或多个氨基酸残基组成的肽。

2.根据权利要求1所述的靶向肽或其药学上可接受的盐或酯，其特征在于：

所述序列(b)中的肽的氨基酸序列为：Asn-His-Ala-His-Tyr-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ser-Thr-Gly-Gly-Gly-Ser。

3.权利要求1或2所述的靶向肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗肿瘤药物的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为肝癌、胃癌、肺癌、口腔癌、结直肠癌或乳腺癌。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的抗肿瘤药物包括抑制肿瘤细胞增殖和/或迁移的药物。

6.一种抗肿瘤的药物，其特征在于：包含权利要求1或2所述的靶向肽或其药学上可接受的盐或酯。

7.权利要求1或2所述的靶向肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制表皮细胞生长因子刺激的细胞增殖和/或迁移的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的细胞为肝癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、口腔癌细胞、结直肠癌细胞或乳腺癌细胞。

Images