CN109180787A - 靶向egfr抑制egf促肿瘤细胞增殖的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种靶向EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽，属于生物医药技术领域；本发明以表皮细胞生长因子EGF为靶分子，经噬菌体展示技术的淘选，以EGF为有效成分特异性洗脱结合靶分子的噬菌体得到生物活性多肽TUZG20；经本发明证实，该生物活性多肽TUZG20显著抑制了由EGF引起的胃癌细胞增殖过程；本发明多肽序列较短，易于合成和实现规模化生产，能抑制EGF的促癌作用，具备后续开发成为抗癌药物的潜力，在抗癌药物研发方面具有重要应用价值。

Description

靶向EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种靶向EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽。

背景技术

EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor）是表皮生长因子受体家族成员之一，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面。EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥着重要的作用。表皮细胞生长因子（EGF，Epidermal Growth Factor）是人体内的一种活性细胞因子，通过结合其受体EGFR来刺激细胞的生长、增殖与分化过程。EGF本是一种6 kD分子量大小的蛋白质，具有53个氨基酸残基和三个分子内二硫键，等电点4.6，对热稳定，是目前已知的最稳定的蛋白质之一。

在无配体结合状态下，EGFR以单体的形式存在于细胞膜表面。当表皮生长因子受体EGFR结合EGF等配体后，可刺激EGFR的同源或异源二聚化，激活受体的内在蛋白酪氨酸激酶活性，而酪氨酸激酶的活化又可启动信号转导级联反应，导致细胞内多种生物化学变化，例如：细胞内钙水平升高，糖酵解和蛋白质合成增加，以及包括EGFR在内的某些基因表达增加等现象，最终导致DNA合成和细胞增殖。

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，大量研究表明，EGFR表达量与胃癌组织的分化程度呈正相关，EGFR的表达水平越高表明肿瘤的恶性程度越高。肿瘤细胞在丝裂原的刺激下，旁/自分泌大量的EGF，促进肿瘤细胞及正常细胞分裂增殖，形成恶性循环。胃癌的病情进展缓慢但持续发展，大多数胃癌患者在最初诊断时已有大量的转移性扩散，这也是胃癌预后不佳的一个主要原因，有研究表明，EGF能够促进胃癌细胞发生上皮-间质转化，有助于肿瘤细胞浸润和转移。EGF及EGFR的表达与胃癌的分化程度、浸润和转移密切相关，是胃癌治疗的潜在靶点。因此，以EGFR为靶点，通过干扰EGF/EGFR介导的信号传导，来达到抑制肿瘤的增殖、侵袭等目的，为胃癌分子靶向治疗的新思路。

目前，针对EGFR的肿瘤分子靶向药物，按其性质主要分为两大类：一类是单克隆抗体，目前在我国已上市的有西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗等，但是单克隆抗体存在生产成本较高的问题；另一类是小分子抑制剂，已上市的有吉非替尼、厄洛替尼和拉帕非尼等，但是小分子抑制剂的毒副作用较强，用药后患者不良反应较多。

EGFR信号转导途径在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、侵袭及新生血管形成等方面起重要作用，因而靶向EGFR药物已成为肿瘤治疗的热点。近年来，多肽类药物已成为药物研发的热点之一，大多数多肽以细胞外分子为靶点，多肽药物具备生物活性高，特异性强，毒性反应相对较弱，在体内不易产生蓄积，与其他药物的相互作用比较少，与体内受体的亲和性较好等众多优点。噬菌体展示技术是一种筛选功能性短肽的新型生物技术，是一种将编码多肽的外源基因或随机序列的DNA分子群与负责表达噬菌体外壳蛋白的基因相互融合后，使外源DNA所编码的蛋白质以融合蛋白形式表达在噬菌体外壳表面的方法。被展示的多肽或蛋白可在噬菌体的表面保持相对的空间结构和生物活性。通过噬菌体展示技术可以经多轮的“亲和，洗脱，扩增”步骤，实现高通量亲和筛选。噬菌体展示技术是一种简便、有效、易于控制的用于表达外源基因的操作系统，实现了表型和基因型的统一，具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的EGFR靶向多肽，具体提供一种由噬菌体展示技术筛选得到的以EGFR为靶点的具有抗肿瘤活性的多肽。

本发明提供一种抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽，所述多肽为TUZG20，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，具体序列信息为：

SEQ.ID.NO.1：Ser Ala Ile His Phe His His Pro Arg Trp Lys Pro。

其中，所述多肽通过特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞的增殖；优选的，所述肿瘤细胞为胃癌细胞；优选的，所述胃癌细胞为AGS细胞。

本发明还提供所述抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽在制备治疗肿瘤靶向药物中的应用。

其中，优选的，所述肿瘤为胃癌。

本发明还提供一种用于治疗或预防肿瘤的靶向药物，所述药物包括权利要求1所述的多肽；优选的，所述肿瘤为胃癌。

本发明首先将靶标EGFR-ECD的基因导入了原核表达载体pET-30a中，使带有载体上标签的重组蛋白EGFR-ECD大量表达，并从包涵体中纯化得到目的蛋白。将EGFR-ECD包被固定，使噬菌体（随机十二肽噬菌体文库NEB（北京）有限公司）与之结合，以EGFR的配体EGF竞争洗脱特异性结合靶分子的噬菌体，经过4轮淘选，富集得到具有高亲和力的噬菌体。将淘选到的单克隆噬菌体扩增之后提取DNA，对其进行测序，并合成了出现频率较高的多肽TUZG20。

经细胞MTT法对多肽进行体外活性的验证，结果表明多肽TUZG20对EGF促进胃癌细胞AGS增殖具有抑制作用，其氨基酸序列为：Ser Ala Ile His Phe His His Pro Arg TrpLys Pro。

本发明的有益效果：

本发明是以EGFR为靶标筛选得到的能够和EGF竞争性结合EGFR并且抑制EGF促进细胞增殖的多肽。本发明筛选的多肽与单克隆抗体药物相比制作成本较低；与小分子抑制剂药物相比特异性强，毒性反应相对较弱。本发明中以胃癌细胞为模型细胞，验证了多肽TUZG20具有显著抑制EGF促进肿瘤细胞生长的活性，使之具有成为抗肿瘤药物的临床价值。发明的多肽序列短，易于实现规模化生产，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为原核表达蛋白EGFR-ECD的氨基酸序列；其中阴影部分为 (His) ₆标签，下划线部分为目的蛋白EGFR-ECD的氨基酸序列。

图2为构建的蛋白表达载体pET-30a/EGFR-ECD的凝胶电泳验证结果；其中图A为1%琼脂糖凝胶验证EGFR-ECD 的PCR扩增产物；图B为重组质粒pET-30a/EGFR-ECD的双酶切验证；其中M为DNAmarker标记，1为pET-30a空载体的BamHI、EcoRI的双酶切结果，2为EGFR-ECD的BamHI、EcoRI的双酶切结果，3为EGFR-ECD的PCR扩增产物。

图3为重组蛋白EGFR-ECD在BL21(DE3)中的表达及纯化验证结果；其中图A为超声破碎后未离心的菌液，其中M是蛋白marker标记，1为转化pET-30a空载体的转化子，2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体；图B为超声破碎并离心后的上清液，其中M是蛋白marker标记，1为转化pET-30a空载体的转化子，2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子；C为蛋白透析复性结果，其中1为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子超声破碎后未离心的菌液，2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子离心后的沉淀经变性及透析复性后蛋白样品条带。

图4为EGF敏感性胃癌细胞株的筛选结果；其中图A为EGF对BGC-803细胞存活率的影响；B为EGF对MGC-803细胞存活率的影响；C为EGF对AGS细胞存活率的影响。

图5为多肽TUZG20的活性验证结果；图中 “－”表示未加入对应物质，“+”表示加入对应物质；*, P<0.01; **, P<0.05。

具体实施方式

实施例1：pET-30a/EGFR-ECD表达载体的构建

从Genebank里提取编码EGFR胞外域（EGFR-ECD，EGFR extracellular domain）片段 第25个至第645个氨基酸(aa25-645) 的DNA序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov，登录号：CCDS5514.1），如SEQ.ID.NO.2所示，并根据其设计PCR引物：

正向引物（SEQ.ID.NO.3）：5’-GCTGATATCGGATCCATGCTGGAGGAAAAGAAAGT-3’

和反向引物（SEQ.ID.NO.4）：5’-ACGGAGCTCGAATTCTCAGGACGGGATCTTAGG-3’，下划线部分分别为两端的酶切位点BamHI和EcoRI。将目的基因EGFR-ECD的PCR产物和载体pET-30a（Novagen,#69909-3）经BamHI和EcoRI 37℃酶切1 h之后，用T4 DNA连接酶在16℃连接12h。将连接产物转化进入DH5α感受态细胞（全式金，CD201），待卡那霉素 (50 µg/mL) 抗性LB平板上长出单菌落，挑取单菌落，扩增细菌，提取质粒进行酶切验证，将重组质粒送到华大基因测序，测序结果验证连接转化准确的质粒为pET-30a/EGFR-ECD。

图2为构建的蛋白表达载体pET-30a/EGFR-ECD的凝胶电泳验证结果；其中图A为1%琼脂糖凝胶验证EGFR-ECD 的PCR扩增产物凝胶电泳验证结果；图B为重组质粒pET-30a/EGFR-ECD的双酶切验证结果；其中M为DNAmarker标记，1为pET-30a空载体的BamHI、EcoRI的双酶切结果，2为EGFR-ECD的BamHI、EcoRI的双酶切结果，3为EGFR-ECD的PCR扩增产物。实验结果显示，PCR扩增EGFR-ECD成功；并且重组质粒pET-30a/EGFR-ECD构建成功。

实施例2：EGFR-ECD的诱导表达及复性纯化

EGFR-ECD的诱导表达：将构建成功的重组质粒pET-30a/EGFR-ECD转化宿主菌BL21(DE3)（全式金，CD601），利用卡那霉素抗性平板筛选重组子，挑取单菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中培养10 h。将培养物以体积比1:100的比例接种于LB液体培养基，37℃剧烈震荡培养至OD₆₀₀=0.5-0.6，加入0.1 M IPTG，使其终浓度为0.5 mM，25℃诱导4 h。

目的蛋白的表达验证：将上述诱导表达得到的菌液5000 rpm，离心10 min，去上清，以菌液体积：裂解液体积=20:1的比例将细菌重悬于裂解液（50 mM Tris-HCl pH7.5，500 mM NaCl，10%甘油，1% TritonX-100，1 mM 蛋白酶抑制剂PMSF，1 mg/mL溶菌酶）中，置于冰上超声，200 W超声3 s，间隔5 s，直至菌液澄清为止。将超声破碎后的菌液15000 g，4℃离心30 min，得到上清液与沉淀。将超声破碎后未离心的菌液与离心后的上清液都进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用考马斯亮蓝染色。

图3为重组蛋白EGFR-ECD在宿主菌BL21(DE3)中的表达及纯化验证结果；其中图A为超声破碎后未离心的菌液，其中M是蛋白marker标记，1为转化pET-30a空载体的转化子，2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体；图B为超声破碎并离心后的上清液，其中M是蛋白marker标记，1为转化pET-30a空载体的转化子，2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子；C为蛋白透析复性结果，其中1为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子超声破碎后未离心的菌液，2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子离心后的沉淀经变性及透析复性后蛋白样品条带。

实验结果显示，EGFR-ECD在BL21中的表达形式是包涵体。离心前细菌裂解液中出现大量的EGFR-ECD，而离心之后上清中则无EGFR-ECD条带，证明EGFR-ECD在BL21中是以不可溶的包涵体形式表达的。

变性、复性纯化目的蛋白：弃去离心后的上清液，沉淀分别经buffer I、buffer T超声重悬，每次重悬后15000 g、4℃离心30 min，弃上清。然后经buffer （50 mM Tris-HClpH8.0，150 mM NaCl，8 M尿素）超声重悬，4 ℃静置过夜，15000 g、4℃离心30 min，弃沉淀得上清。以上清液：buffer =1:5的比例将蛋白液稀释后置于透析袋中，依次用6 M、4 M、2M、1 M、0.5 M、0 M的尿素缓冲液透析，使蛋白复性。透析完成后，15000 g、4℃离心30 min，去除沉淀。将上清装入15 mL、30 Kda的超滤管中，5000 g、4℃离心，浓缩到体积为1 mL左右，得到纯化后的目的蛋白EGFR-ECD。

实施例3：噬菌体展示淘选特异性结合EGFR的生物活性肽

靶分子固定化：将100 µL浓度为100 µg/mL的靶分子EGFR-ECD溶液（基液为0.1 MpH7.4的TBS）加入96孔板中，置于摇床上轻微振荡，在增湿容器中4℃孵育过夜。除去靶分子溶液并用TBS-T (50 mM Tris-HCl pH7.5，150 mM NaCl，0.1%[v/v] Tween-20) 清洗6次。最后用封阻液 (0.1 M NaHCO3 pH8.6，5 mg/mL BSA，0.02% NaN3) 封闭1 h。

噬菌体随机肽库与靶分子结合：除去封阻液，并用TBS-T (含0.1%[v/v] Tween-20) 清洗10次。噬菌体库或扩增后的噬菌体（购于NEB（北京）有限公司，E8111，Ph.D.-12 噬菌体展示肽库）经TBS-T (含0.1%[v/v] Tween-20) 稀释后，噬菌体的滴度在10⁹-10¹¹之间，将稀释好的噬菌体加入到六孔板（Corning,3516）上使之与靶分子EGFR-ECD结合，室温孵育10-60 min。

洗掉未结合噬菌体：TBS-T（第一轮用含0.1%[v/v] Tween-20)的，之后都用含0.5%[v/v] Tween-20的）清洗10次，每次清洗后用力在灭菌滤纸上拍打，去除残留液。

洗脱特异性结合噬菌体：将100 µL EGF（生工生物工程（上海）股份有限公司，C610033） (100 µg/mL) 溶液加入六孔板中，室温轻微摇动10-60 min。收集洗脱液，即得到被竞争性洗脱下来的特异性结合靶分子的噬菌体。

噬菌体扩增：将洗脱下来的噬菌体加入20 mL处于对数前期的ER2738宿主菌（NEB（北京）有限公司）中，37℃剧烈摇晃4.5 h。将培养物转入离心管中，4℃、12000 g离心10min，上清液转入另一离心管中，重复离心。将上清的上部80%转入新离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl (20% [w/v] PEG-8000, 2.5 M NaCl)，4℃沉淀过夜。再次离心、1 mL TBS重悬、PEG/NaCl沉淀60 min之后，12000 g离心10 min，将沉淀溶于200 µL TBS，14000 rpm离心1 min，将上清转移至另一微量离心管中，即为扩增后的洗脱物。取出1 µL用于滴度测定，其他用来进行下一轮淘选或保存。

单克隆噬菌体信息的提取：4轮淘选后，将最后一轮洗脱下来的噬菌体感染宿主菌ER2378后铺在LB/IPTG/Xgal平板上。13 h后，噬菌体蓝斑长成，挑取蓝斑并进行单克隆噬菌体扩增。4 h后将培养物14000 rpm离心30 s，取上清，如此重复2次，最后取80%的上清即为扩增后的单克隆噬菌体。

单克隆噬菌体扩增是以单克隆噬菌体为模板，设计PCR引物正向引物（SEQ.ID.NO.5）：5’-TTATTCGCAATTCCTTTAG-3’

和反向引物 （SEQ.ID.NO.6）：5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’扩增序列，对扩增产物进行测序（华大基因），得到一条占优势的多肽序列，命名为TUZG20，然后将多肽序列送公司（南京金斯瑞生物科技有限公司）合成。多肽TUZG20序列如SEQ.ID.NO.1所示：

TUZG20（SEQ.ID.NO.1）：Ser Ala Ile His Phe His His Pro Arg Trp Lys Pro

实施例4： EGF敏感细胞株的筛选

本发明选取了几种EGFR高表达的胃癌细胞系作为实验对象，分别为AGS、BGC-803、MGC-803（美国模式培养物保藏所）。以上3种细胞培养于含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基中，每天定期观察细胞生长状态，及时传代。

种板：从CO₂培养箱中取出培养的细胞，弃原培养基，加入1 mL PBS清洗，用巴氏管吸去上清液。加入0.5 mL胰蛋白酶消化，转移至微量离心管中，200 g离心5 min，巴氏管吸去上清液。吸取1 mL含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，用移液枪取10 µL细胞悬液于细胞计数板计数。每孔种4000个细胞，一共6组孔，每组5个复孔，取出所需细胞悬液稀释到相应体积，吹打混匀后种到96孔板中。放入CO₂恒温培养箱过夜培养12-16 h，待其贴壁。

加药：加不同浓度的EGF。将100 µg EGF溶于1 mL ddH₂O中，配成100 µg/mL的贮存液。采用梯度稀释法，用培养基（1%胎牛血清及青霉素-链霉素）将100 µg/mL EGF稀释成以下6个浓度：1 µg/mL、0.33 µg/mL、0.1 µg/mL、0.033 µg/mL、0.01 µg/mL、0 µg/mL（对照），加入到相应的孔中。放入CO₂恒温培养箱 (37℃) 培养48 h。

MTT比色法：将加药处理48 h后的细胞取出，向每孔中加入10 µL MTT (5 mg/mL)，放入CO₂恒温培养箱 (37℃) 反应1-1.5 h，待细胞染成蓝紫色后吸去培养基，加入0.1 mL的DMSO并轻轻震荡使结晶溶解。用酶标仪在550 nm波长下测定各孔的吸收值，记录结果，并计算细胞存活率：细胞存活率=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。

图4为EGF敏感性胃癌细胞株AGS、BGC-803、MGC-803的筛选结果；其中图A为EGF对BGC-803细胞存活率的影响；B为EGF对MGC-803细胞存活率的影响；C为EGF对AGS细胞存活率的影响。 EGF设置以下浓度：0 µg/mL、0.01 µg/mL、0.033 µg/mL、0.1 µg/mL、0.33 µg/mL、1µg/mL，48h之后考察EGF对三种细胞系存活率的影响。从图4A、B中可以看出，EGF没有显著影响BGC-803细胞和MGC-803细胞的存活率，从图4 C中可以看出，EGF具有显著的促进AGS细胞存活率的作用。

实施例5：多肽的活性验证

种板：从CO₂培养箱取出培养的AGS细胞，弃原培养基，加入1 mL PBS清洗，用巴氏管吸去上清液。加入0.5 mL胰蛋白酶消化，转移至微量离心管中，200 g离心5 min，巴氏管吸去上清液。吸取1 mL含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基吹打混匀，用移液枪取10 µL细胞悬液于细胞计数板计数。根据每孔种4000个细胞，一共6组孔，每组5个复孔，取出所需细胞悬液稀释到相应体积，吹打混匀后种到96孔板中。放入CO₂恒温培养箱过夜培养12-16 h，待其贴壁。

加药：加EGF及不同浓度的多肽。用含1%胎牛血清的培养基配制浓度为0.033 µg/mL (5 nM) 的EGF溶液，并将其分为5组，向其中加入不同量的多肽溶液，配制成以下浓度：0nM、500 nM、1500 nM、5000 nM、15000 nM。将细胞分为6组处理，分别为不加任何物质的对照(Control) 组、EGF组、EGF + 500 nM TUZG20组、EGF + 1500 nM TUZG20组、EGF + 5000 nMTUZG20组、EGF + 15000 nM TUZG20组。最后放入CO₂恒温培养箱 (37℃) 培养24 h。

MTT比色法：将加药处理48 h后的细胞取出，向每孔中加入10 µL MTT (5 mg/mL)，放入CO₂恒温培养箱 (37℃) 反应1-1.5 h，待细胞染成蓝紫色后吸去培养基，加入0.1 mL的DMSO并轻轻震荡使结晶溶解。用酶标仪在550 nm波长下测定各孔的吸收值，记录结果，并计算细胞存活率：细胞存活率=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。

图5为多肽TUZG20的活性验证结果；图中 “－”表示未加入对应物质，“+”表示加入对应物质；*, P<0.01; **, P<0.05。图5中可知，与EGF组相比，对照组的细胞生长较缓慢，说明EGF促进了AGS肿瘤细胞的增长，加入TUZG20后，AGS细胞的生长随TUZG20浓度的升高而逐渐下降，TUZG20在5000 nM和15000 nM浓度下，AGS肿瘤细胞生长加快的情况被显著抑制，表明TUZG20能显著抑制EGF的促肿瘤细胞增殖作用。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 靶向EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Ala Ile His Phe His His Pro Arg Trp Lys Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 672

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 2

Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5 10 15

Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp

20 25 30

Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile

35 40 45

Gly Ser Met Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg

65 70 75 80

Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr

85 90 95

Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val

100 105 110

Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu

115 120 125

Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr

130 135 140

Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys

145 150 155 160

Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg

165 170 175

Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg

180 185 190

Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln

195 200 205

Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly

210 215 220

Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile

225 230 235 240

Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser

245 250 255

Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu

260 265 270

Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys

275 280 285

Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met

290 295 300

Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys

305 310 315 320

Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg

325 330 335

Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys

340 345 350

Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly

355 360 365

Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys

370 375 380

His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro

385 390 395 400

Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro

405 410 415

Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu

420 425 430

Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu

435 440 445

Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser

450 455 460

Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu

465 470 475 480

Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu

485 490 495

Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly

500 505 510

Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala

515 520 525

Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly

530 535 540

Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg

545 550 555 560

Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe

565 570 575

Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln

580 585 590

Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln

595 600 605

Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala

610 615 620

Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala

625 630 635 640

Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr

645 650 655

Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser

660 665 670

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctgatatcg gatccatgct ggaggaaaag aaagt 35

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acggagctcg aattctcagg acgggatctt agg 33

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttattcgcaa ttcctttag 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccctcatagt tagcgtaacg 20

Claims (8)

1.一种抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽，其特征在于，所述多肽氨基酸序列为：Ser AlaIle His Phe His His Pro Arg Trp Lys Pro。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽通过特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞的增殖。

3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述肿瘤细胞为胃癌细胞。

4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述胃癌细胞为AGS细胞。

5.权利要求1所述的多肽在制备治疗肿瘤靶向药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为胃癌。

7.一种用于治疗或预防肿瘤的靶向药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述的多肽。

8.根据权利要求7所述的靶向药物，其特征在于，所述肿瘤为胃癌。