CN110330548A

CN110330548A - 一种抗肿瘤多肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN110330548A
Application number: CN201910577070.6A
Authority: CN
Inventors: 孙学英; 马立新; 李伟东; 姜宪; 乔海泉
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Engineering University; Harbin Medical University
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2019-10-15
Anticipated expiration: 2039-06-28
Also published as: CN110330548B

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤多肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明针对NRP‑1跨膜区的分子结构、与配体结合模式以及氨基酸序列特点，设计了能够特异性结合人源NRP‑1分子结构中与配体相结合的跨膜区域，阻断NRP‑1与多种配体VEGF、EGF和HGF的结合，进而阻断下游细胞信号通路的抗肿瘤多肽药物。所述的抗肿瘤多肽通过竞争性与NRP‑1的跨膜区域单体结合，干扰NRP‑1的二聚化，抑制NRP‑1与配体的结合，进而抑制多种肿瘤细胞信号通路的活化，达到抑制肿瘤细胞增殖、迁移和浸润，促进其凋亡的目的。本发明的提出为肿瘤的治疗提供了新的技术手段。

Description

一种抗肿瘤多肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤多肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用，特别涉及靶向实体肿瘤细胞膜高表达NRP-1的多肽及其应用。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

分子靶向药物已成为抗癌药物研究的热点和发展方向，在多种肿瘤治疗中取得可喜进展，并相继投入临床使用。然而，我国高发癌症类型中胰腺癌、胃癌和胆管癌靶向药物研发相对滞后。根据我国国家癌症中心发布的最新数据，胰腺癌的发病率已达第10位，死亡率升高到第6位；胃癌的发病率高居第2位。胰腺癌早期症状不明显，大部分患者就诊时已出现局部侵袭甚至远处转移，缺乏有效的分子靶向药物，预后极差。我国自主研发的治疗晚期胃癌分子靶向药物“甲磺酸阿帕替尼片”仅能延长患者2个多月的生存期。胆管癌占消化道肿瘤的3％，近年来发病率逐年升高；因其发病隐匿、早期转移、手术切除率低、术后复发率高等特点，预后极差，目前标准治疗方案联合吉西他滨和顺铂效果并不理想。因此，迫切需要研究针对这些癌症的新分子靶点并探索新的有效药物。

人神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)是一种由923个氨基酸组成的非络氨酸激酶跨膜糖蛋白，在脊柱动物中结构高度保守，包含由5个模块化结构域组成的胞外区，连接至一个跨膜螺旋区和一个细胞浆结构域。NRP-1的膜近端c结构域属于MAM的家族结构域牵连蛋白同源二聚体。跨膜螺旋区介导NRP-1二聚体连接胞外区至细胞内区。X-线晶体结构显示分离的NRP-1b1结构域或串联NRP-1结构域间有多种组合，并且与抗-NRP-1Fab片段复合体的C末端尾区相互作用。这种配体-受体相互作用的模型衍生来自NRP-1串联b1b2结构域和促吞噬肽间复合体晶体结构，后者是一个IgG重链Fc片段蛋白水解产生免疫活性四肽。这些结构特征为靶向NRP-1研发抗癌药物提供了分子基础，尤其是根据其分子结构和氨基酸序列设计多肽药物阻断NRP-1与配体结合进而抑制细胞信号通路进而提高抗癌药物的疗效是靶向NRP-1的研究热点。

临床研究证明胰腺癌组织高表达NRP-1，其表达水平与胰腺癌的临床分期、淋巴结浸润、远处器官转移、和病理分期呈正相关关系；而且高表达NRP-1的胰腺癌患者预后较差。我们最新的研究结果发现，与正常胃粘膜组织相比较，胃癌组织和细胞高表达NRP-1；NRP-1通过与多种信号通路共受体，参与胃癌细胞的生长和转移。NRP-1作为共受体调控关键细胞信号通路和胆管癌细胞的生长及转移。这些研究为研发针对NRP-1分子靶点治疗胰腺癌、胃癌和胆管癌提供了可靠的依据。

NRP-1高表达于内皮细胞，参与调控内皮细胞的生长和迁移。在所有的实体肿瘤中，内皮细胞是细胞间质中形成新生血管和淋巴管的关键细胞，决定了肿瘤生长和转移。因此，靶向NRP-1研发的药物适用于所有的实体肿瘤，具有广泛的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的靶向实体肿瘤细胞膜高表达NRP-1的多肽药物及其应用。

为了达到上述目的本发明采用了以下技术手段：

本发明的新型抗肿瘤多肽药物针对在多种实体肿瘤细胞和内皮细胞高表达的NRP-1跨膜区，阻断其与多种配体的结合，进而达到抑制NRP-1通过共受体作用调控细胞信号通路的活性。

首先，发明人针对NRP-1跨膜区的分子结构、与配体结合模式以及氨基酸序列特点，设计了八个多肽(TMD1、TMD2、TMD3、TMD4、TMD5、TMD6、TMD7和TMD8)，八种多肽的氨基酸序列如图1所示。然后，通过血管内皮细胞增殖和迁移实验筛选出活性最强的多肽TMD6(SEQID NO.1所示)。接着，对TMD6多肽药物在抑制胰腺癌、胃癌和胆管癌细胞增殖和促进凋亡方面在细胞学水平进行了验证。同时对TMD6多肽药物抑制胰腺癌细胞迁移和浸润在细胞学水平进行了验证。通过上述研究发现，TMD6可以竞争性与NRP-1的跨膜区域单体结合，干扰NRP-1的二聚化，抑制NRP-1与配体的结合，进而抑制多种细胞信号通路的活化，达到抑制肿瘤细胞增殖、迁移和浸润，促进其凋亡的目的。

在此基础上，本发明提出了一种抗肿瘤多肽，所述的多肽具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

编码所述的抗肿瘤多肽的多核苷酸也在本发明的保护范围之内。

进一步的，本发明还提出了所述的抗肿瘤多肽以及编码所述的抗肿瘤多肽的多核苷酸在制备抗肿瘤药物中的应用。

其中，优选的，所述的肿瘤为实体肿瘤。更优选的，所述的肿瘤为胰腺癌、胃癌或胆管癌。

进一步的，本发明还提出了所述的抗肿瘤多肽以及编码所述的抗肿瘤多肽的多核苷酸在制备抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移和浸润以及抑制内皮细胞的增殖和迁移药物中的应用。

其中，优选的，所述的抗肿瘤多肽通过竞争性与NRP-1的跨膜区域单体结合，干扰NRP-1的二聚化，抑制NRP-1与配体的结合，进而抑制多种肿瘤细胞信号通路的活化，达到抑制肿瘤细胞增殖、迁移和浸润以及促进其凋亡的目的。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1.分子靶向药物已成为抗癌药物研究的热点和发展方向，在多种肿瘤治疗中取得可喜进展，并相继投入临床使用。然而，我国高发癌症类型中胰腺癌、胃癌和胆管癌靶向药物研发相对滞后。临床研究证明胰腺癌、胃癌和胆管癌组织都高表达NRP-1，其表达水平与胰腺癌的临床分期、淋巴结浸润、远处器官转移和病理分期呈正相关关系。因此，本发明的多肽药物对于提高胰腺癌、胃癌和胆管癌的治疗效果具有重要的社会经济效益。

2.NRP-1是一种高表达于多种实体肿瘤和内皮细胞的跨膜蛋白。在所有的实体肿瘤中，内皮细胞是细胞间质中形成新生血管和淋巴管的关键细胞，决定了肿瘤生长和转移。因此，本发明的多肽药物适用于所有的实体肿瘤，具有广泛的临床应用价值。

3.与目前常用的传统化疗药物相比较，靶向NRP-1的多肽药物用量少、选择性强、特异性好、疗效高，研发周期短，符合国际生物医药发展方向，具有广阔的市场发展前景。

4.在细胞水平我们对本发明设计的八种靶向NRP-1的多肽药物进行筛选。发现TMD6多肽具有最强的抑制VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的效果。

5.在细胞水平我们对本发明的TMD6多肽药物进行验证。TMD6多肽具有显著抑制胰腺癌、胃癌和胆管癌细胞增殖的效果，且呈现剂量依赖性；TMD6多肽具有显著促进胰腺癌、胃癌和胆管癌细胞凋亡的效果，且呈现剂量依赖性；TMD6多肽具有显著抑制胰腺癌细胞的迁移和浸润的效果，且呈现剂量依赖性。

附图说明

图1为八种靶向NRP-1的多肽的氨基酸序列；

图2为TMD6的高效液相色谱图；

图3为TMD6的核磁氢谱图；

图4为TMD6的质谱图；

图5为靶向NRP1多肽抑制VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移示意图；

其中，A：HUVEC细胞接种于含有VEGF(100ng/ml)和八种多肽(浓度分别为50nM)的培养液，24小时后检测细胞的活力并与空白对照组细胞比较，计算细胞活力指数；B：HUVEC细胞接种于Transwell含有重组VEGF-165蛋白(100ng/ml)和八种多肽(浓度分别为50nM)的培养基，12小时后进行迁移细胞的计数；“√”表示筛选出的活性最强的多肽TMD6；

图6为胰腺癌细胞增殖和凋亡示意图；

其中，A：人源胰腺癌细胞BxPC-3和PANC-1与TMD6(浓度分别为0,5,10,20或者40nM)孵育24小时后，细胞活力的检测结果；B：人源胰腺癌细胞BxPC-3和PANC-1与TMD6(浓度分别为0,5,10,20或者40nM)孵育24小时后，细胞凋亡率的检测结果；C：人源胰腺癌细胞BxPC-3和PANC-1与TMD6(浓度分别为0或20nM)孵育24小时后，在激光共聚焦荧光显微镜下观察细胞凋亡情况的图片；“*”(P<0.05)和“**”(P<0.01)表示与对照组比较有统计学显著差异；

图7为胃癌细胞增殖和凋亡示意图；

其中，A：人源胃癌细胞MGC-803和BGC823与TMD6(浓度分别为0,10,50或者100nM)孵育24小时后，细胞活力的检测结果；B：人源胃癌细胞MGC-803和BGC823与TMD6(浓度分别为0,10,50或者100nM)孵育24小时后，细胞凋亡率的检测结果；C：人源胃癌细胞MGC-803和BGC823与TMD6(浓度分别为0或50nM)孵育24小时后，在激光共聚焦荧光显微镜下观察细胞凋亡情况的图片；“*”(P<0.05)和“**”(P<0.01)表示与对照组比较有统计学显著差异；

图8为胆管癌细胞增殖和凋亡示意图；

其中，A：人源胆管癌细胞RBE和HCCC-9810与TMD6(浓度分别为0,20,40或者80nM)孵育24小时后，细胞活力的检测结果；B：人源胆管癌细胞RBE和HCCC-9810与TMD6(浓度分别为0,20,40或者80nM)孵育24小时后，细胞凋亡率的检测结果；C：人源胆管癌细胞RBE和HCCC-9810与TMD6(浓度分别为0或40nM)孵育24小时后，在激光共聚焦荧光显微镜下观察细胞凋亡情况的图片；“*”(P<0.05)和“**”(P<0.01)表示与对照组比较有统计学显著差异；

图9为胰腺癌细胞迁移和浸润示意图；

其中，A和B:人源胰腺癌BxPC-3细胞在与TMD6(浓度分别为0,10,20或者40nM)孵育状态下，利用Transwell进行的细胞迁移实验；A为12小时后染色拍照的图片,B为12小时后迁移细胞的计数；C和D：人源胰腺癌BxPC-3细胞在与TMD6(浓度分别为0,10,20或者40nM)孵育状态下，进行行划痕实验；C为24小时后迁移细胞的计数，D为24小时候染色拍照的图片。

具体实施方式

本发明人通过针对NRP-1在胰腺癌、胃癌和胆管癌组织和细胞中的表达特点以及与这些癌症的临床病理关系进行广泛而深入，尤其是针对NRP-1分子中的跨膜区域的氨基酸序列以及与其共配体结合调控细胞信号通路的特点重点研究，设计出八个靶向NRP-1的多肽分子(TMD1、TMD2、TMD3、TMD4、TMD5、TMD6、TMD7和TMD8)，并优选出活性最强的TMD6多肽药物。TMD6可以竞争性与NRP-1的跨膜区域单体结合，干扰NRP-1的二聚化，抑制NRP-1与配体的结合，进而抑制多种细胞信号通路的活化，达到抑制肿瘤细胞增殖、迁移和浸润，促进其凋亡。在此基础上完成了本发明。

术语

NRP1

如本文所用，NRP-1或者NRP1或者neuropilin-1或者neuropilin 1或者神经纤毛蛋白-1或者神经纤毛蛋白1为本发明的多肽药物的分子靶点。

TMD1,TMD2,TMD3,TMD4,TMD5,TMD6,TMD7和TMD8

如本文所用，术语“TMD1,TMD2,TMD3,TMD4,TMD5,TMD6,TMD7和TMD8”为本发明的系列多肽的名字。本发明对每一种多肽分子给出了特定的氨基酸序列，如图1所示。

本领域的技术人员可以通过多肽合成技术获得这八种多肽。

对八种多肽在抑制血管内皮生长因子(VEGF)刺激的血管内皮细胞增殖的作用进行检测和筛选。

对八种多肽在抑制血管内皮生长因子(VEGF)刺激的血管内皮细胞迁移的作用进行检测和筛选。

综合八种多肽在抑制血管内皮生长因子(VEGF)刺激的血管内皮细胞增殖和迁移的作用的实验结果，筛选出活性最强的TMD6。

对TMD6抑制胰腺癌细胞增殖情况进行检测。

对TMD6促进胰腺癌细胞凋亡情况进行检测。

对TMD6抑制胃癌细胞增殖情况进行检测。

对TMD6促进胃癌细胞凋亡情况进行检测。

对TMD6抑制胆管癌细胞增殖况进行检测。

对TMD6促进胆管癌细胞凋亡情况进行检测。

对TMD6抑制胰腺癌细胞迁移和浸润情况进行检测。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1 TMD6多肽的制备

步骤如下：

一.树脂溶涨：称量取代度为1.0mmol/g的0.6g CTC树脂，放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min。

二.脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，振荡5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，振荡15min。

三.检测：抽掉哌啶溶液，取少量树脂(大约20多颗树脂)，用乙醇洗三次，加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各一滴，加热(105-110℃)5min，为蓝色。

四.第一次洗：分别用DMF(10ml/g)洗两次，然后用甲醇(10ml/g)洗两次，最后用DMF(10ml/g)洗两次。

五.缩合：保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量，反应30min。

六.第二次洗：分别用DMF(10ml/g)洗一次，然后用甲醇(10ml/g)洗两次，最后用DMF(10ml/g)洗两次。

七.重复二至六操作。

八.最后一次洗涤：分别用DMF(10ml/g)洗两次，然后用甲醇(10ml/g)洗两次，再用DMF(10ml/g)洗两次，最后用DCM(10ml/g)洗两次。

九.裂解：制备裂解液(10ml/g，g是树脂的单位级)包含TFA 94.5％、水2.5％、EDT2.5％和TIS 1％，振荡120min。

十.吹干洗涤:将裂解液加入用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，常温挥干。

TMD6的高效液相色谱图、核磁氢谱图以及质谱图分别为图2-4所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2细胞活力检测实验

人源脐静脉内皮细胞接种于96孔培养板，每孔1×10⁴个细胞，培养于含有5％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的ECM(Endothelial cell medium)培养液中，加入VEGF(100ng/ml)和分别加入TMD1、TMD2、TMD3、TMD4、TMD5、TMD6、TMD7或TMD8八种多肽(浓度均为50nM)。胰腺癌、胃癌和胆管癌细胞常规接种于96孔培养板，每孔5×10³个细胞，培养于含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle'smedium)培养液中。在37℃和5％CO₂条件下，孵育过夜。每孔加入含有不同浓度的TMD6多肽的培养液100微升。培养24小时后，每孔加入110微升新鲜培养液(含CCK-8溶液10微升)，轻微震荡96孔板10秒，然后放入培养箱继续孵育2小时，随后再次振摇10秒后检测比色，去除气泡；以空白对照孔为调零孔，选择450nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)，记录结果。计算细胞活力指数(％)＝实验组OD值/对照组OD值100％。所有实验重复3次。

结果如图5A所示，与对照组比较，八种多肽处理的细胞活力指数有不同程度的下降，其中TMD6显示出最强的抑制细胞活力的作用。结论：TMD6在八种多肽中展示最强的抑制血管内皮细胞增殖的效果。

结果如图6A、图7A和图8A所示，与对照组比较，TMD6多肽处理的细胞活力指数显著下降，且呈现浓度依赖性。结论：TMD6多肽可以抑制胰腺癌、胃癌和胆管癌细胞的增殖。

实施例3细胞凋亡检测实验

胰腺癌、胃癌和胆管癌细胞常规接种于8孔培养板，每孔1×10⁵个细胞，培养于含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle'smedium)培养液中。在37℃和5％CO₂条件下，孵育过夜。每孔加入含有不同浓度的多肽的培养液100微升。培养24小时后，收集细胞进行了细胞凋亡的检测。

图6B、图6C、图7B、图7C、图8B和图8C中的细胞，利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行了细胞凋亡的检测。取5～10万重悬的细胞，1000×g离心5分钟，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC，室温避光孵育10分钟。1000×g离心5分钟，弃上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液和加入10μL碘化丙啶(PI)染色液，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。同时对这些细胞进行confocal荧光显微镜观察。Annexin V-FITC染色为绿色荧光，表示早期凋亡细胞；而PI染色为红色荧光，表示晚期凋亡细胞。

结论：TMD6多肽可以促进胰腺癌、胃癌和胆管癌细胞的凋亡。

实施例4细胞迁移检测实验

人源人脐静脉内皮细胞(5×10⁴)接种于Transwell，培养于含有5％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的ECM(Endothelial cell medium)培养液的6孔细胞培养板。加入VEGF(100ng/ml)和分别加入TMD1、TMD2、TMD3、TMD4、TMD5、TMD6、TMD7或TMD8八种多肽(浓度均为50nM)。人源胰腺癌BxPC-3细胞(1×10⁵)接种于Transwell，培养于含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培养液的6孔细胞培养板，分别加入TMD6(浓度分别为0，10，20或者40nM)。12小时后，取出上层小室，4％聚甲醛固定，苏木素染色进行迁移细胞计数。

结果如图5B所示，与对照组比较，八种多肽处理的迁移细胞的数量有不同程度的下降，其中TMD6显示出最强的抑制细胞迁移的作用。结论：TMD6在八种多肽中展示最强的抑制血管内皮细胞迁移的效果。

结果如图9A和图9B所示,与对照组比较，TMD6可以显著抑制胰腺癌细胞的迁移，且呈浓度依赖性。结论：TMD6多肽可以抑制胰腺癌细胞的迁移。

实施例5细胞划痕实验

人源胰腺癌BxPC-3细胞(5×10⁵)接种于含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培养液的6孔细胞培养板中，培养至铺满培养板95％，用移液管尖端穿过每个细胞单层做一个直的划痕，悬浮的细胞用新鲜培养液洗去。加入TMD6(浓度分别为0，10，20或者40nM)继续培养。每6个小时进行拍照，36小时后，4％聚甲醛固定，苏木素染色，照相并用ImageJ软件测量划痕的距离，并计算细胞浸润的距离。

结果如图9C和图9D所示,与对照组比较，TMD6可以显著抑制胰腺癌细胞的浸润，且呈浓度依赖性。结论：TMD6多肽可以抑制胰腺癌细胞的浸润。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> 一种抗肿瘤多肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用

<130> KLPI190413

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val

1 5 10

Claims

1.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，所述的多肽具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的抗肿瘤多肽的多核苷酸。

3.权利要求1所述的抗肿瘤多肽以及编码权利要求1所述的抗肿瘤多肽的多核苷酸在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为实体肿瘤。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为胰腺癌、胃癌或胆管癌。

6.权利要求1所述的抗肿瘤多肽以及编码权利要求1所述的抗肿瘤多肽的多核苷酸在制备抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移和浸润以及抑制内皮细胞的增殖和迁移药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤多肽通过竞争性与NRP-1的跨膜区域单体结合，干扰NRP-1的二聚化，抑制NRP-1与配体的结合，进而抑制多种肿瘤细胞信号通路的活化，达到抑制肿瘤细胞增殖、迁移和浸润以及促进其凋亡的目的。