CN111018952B - 一种具有双重功效的抗肿瘤多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有双重功效的抗肿瘤多肽及其应用。所述的一种具有双重功效的抗肿瘤多肽具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。本发明的多肽能够特异性靶向内皮细胞和肿瘤细胞上表达的NRP‑1分子，提高血管内皮细胞的通透性和增加肿瘤组织的渗透性，进而提高药物穿透血管屏障和在肿瘤组织渗透的能力。同时其还可通过阻断NRP‑1调控的下游细胞信号通路，抑制癌细胞的增殖和促进癌细胞的凋亡。本发明的多肽可用于包括胰腺癌在内的多种实体肿瘤的治疗，提高药物尤其提高单克隆抗体靶向药物治疗恶性肿瘤的效果。

Description

一种具有双重功效的抗肿瘤多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有双重功效的抗肿瘤多肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用，特别涉及靶向实体肿瘤细胞膜高表达NRP-1的多肽，该多肽具有提高单克隆抗体穿透血管屏障和在肿瘤组织渗透的能力，进而提高单克隆抗体靶向药物的抗肿瘤疗效；同时还具有直接抑制肿瘤生长的活性。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

治疗性单克隆抗体已成为全球新药开发的热点。自1986年首个单克隆抗体药物上市，1997年首个抗肿瘤单克隆抗体药物上市用于治疗非霍奇金淋巴瘤后，目前已有近百种治疗性单克隆抗体药物获得批准上市，主要用于肿瘤、自身免疫性疾病及炎症疾病的治疗。治疗性抗体药物市场获得突飞猛进的增长，前景巨大。单克隆抗体分子靶向药物已成为抗癌药物研究的热点和发展方向，在多种肿瘤治疗中取得可喜进展，并相继投入临床使用。

然而，单克隆抗体作为大分子蛋白质药物需要静脉给药，抗体药物从血液循环到与肿瘤细胞发生结合，必须穿透毛细血管内皮层及肿瘤细胞外间隙，受到肿瘤血管屏障和肿瘤实质组织屏障的阻隔。这些屏障极大影响单克隆抗体在肿瘤组织内有效聚集和分散，进而影响其与癌症组织内可溶性和癌细胞膜上表达的受体相结合，最终影响其疗效。实体肿瘤组织内血管网存在结构和功能异常，导致大分子抗体药物不能有效而特异地到达肿瘤细胞，或者即使到达肿瘤细胞部位最多只能从血管穿透3-5个细胞的距离，严重影响抗体药物的疗效并可诱导耐药。因此，增强单克隆抗体的穿透血管屏障和在肿瘤实质组织内渗透的能力，将大幅提高单克隆抗体靶向药物治疗实体肿瘤的疗效。

神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)是一种非络氨酸激酶跨膜糖蛋白。

NRP-1蛋白分子由923个氨基酸组成，包含由5个模块化结构域组成的胞外区(a1、a2、b1、b2和c结构域)，一个跨膜螺旋区和一个位于细胞浆但缺乏信号传导活性的短结构域。NRP-1的膜近端c结构域决定蛋白同源二聚体的形成，而跨膜螺旋区介导NRP-1二聚体连接胞外和细胞内区。X-线晶体结构显示分离的NRP-1的b1结构域串联NRP-1结构域间形成多种组合，并且与抗-NRP-1的Fab片段复合体的C末端尾区相互作用。各种不同配体可以与其胞外区结构中不同的motif结合。这种配体-受体相互作用的模型衍生来自NRP-1串联b1b2结构域和促吞噬肽间复合体晶体结构，后者是一个IgG重链Fc片段蛋白水解产生免疫活性四肽，进而影响多种细胞信号通路的传导。

临床研究发现多种消化系肿瘤包括胰腺癌、胃癌、肝癌和胆管癌组织高表达NRP-1，其表达水平与临床病理特征呈正相关关系，高表达NRP-1的患者预后较差。NRP-1通过与多种细胞信号通路共受体，参与癌细胞生物学行为的调控，影响肿瘤的生长和转移。

内皮细胞衬于血管内壁，排列紧密，构成了血管壁与血液的交界面。研究表明，NRP-1表达于内皮细胞，通过与配体结合，调控内皮细胞连接屏障的通透性。因此，研发靶向NRP-1的多肽可以提高细胞间通透性和血管通透性，进而提高抗癌药物包括大分子单克隆抗体穿透血管进入肿瘤组织并在肿瘤组织渗透的能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型靶向NRP-1的多肽，该多肽具有提高药物穿透血管屏障及在肿瘤组织内渗透性和直接抑制肿瘤生长的双重功效。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的新型抗肿瘤多肽靶向肿瘤细胞和内皮细胞。包括胰腺癌在内的多种实体肿瘤细胞高表达的NRP-1，而表达NRP-1的内皮细胞存在于实体肿瘤间质组织内并且参与肿瘤细胞的生长和转移。该多肽通过特异性结合NRP-1，影响NRP-1介导的血管通透性，达到增加血管屏障通透性和肿瘤组织的渗透性，进而提高药物穿透血管屏障和在肿瘤组织渗透的能力；同时可以抑制NRP-1分子的二聚化和NRP-1通过共受体作用调控细胞信号通路的活性，进而抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡。

首先，本发明人通过针对NRP-1在包括胰腺癌在内的实体肿瘤组织和细胞中的表达特点以及与这些癌症的临床病理关系进行了广泛而深入的研究，针对NRP-1分子不同结构域的功能特点、二聚化的形式、配体结合特点以及多肽C端氨基酸序列特点，在前期申请的发明专利申请(申请号为201910577070.6)的基础上，对TMD6多肽的C端进行修饰，设计了八个具有双重功效的多肽(TMD6-A、TMD6-B、TMD6-C、TMD6-D、TMD6-E、TMD6-F、TMD6-G和TMD6-H)。这八种多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-8所示。根据多肽设计的目的，这八种多肽具有两种活性：1)提高细胞间通透性和血管通透性，进而提高抗癌药物包括大分子单克隆抗体穿透血管进入肿瘤组织并在肿瘤组织渗透的能力；2)可以竞争性与NRP-1的跨膜区域单体结合，干扰NRP-1的二聚化，抑制多种细胞信号通路的活化，达到抑制肿瘤细胞增殖和促进其凋亡的目的。

然后，发明人通过体外血管内皮细胞通透性试验(In Vitro VascularPermeability Assay)对这八种多肽穿透内皮细胞的能力进行初步分析，筛选出活性最强的TMD6-D多肽。

接着，发明人建立肿瘤动物模型对TMD6-D多肽药物提高肿瘤组织渗透性和增加单克隆抗体在肿瘤组织的渗透及潴留进行验证。在动物水平，发现TMD6-D多肽可以显著提高组织渗透性和增加单克隆抗体在肿瘤组织内的渗透及潴留。

最后，本发明对TMD6-D在抑制胰腺癌细胞增殖和促进凋亡的活性在细胞学水平进行了检测。在细胞水平，发现TMD6-D多肽具有抑制胰腺癌细胞增殖和促进细胞凋亡的活性，且呈现剂量依赖性。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种具有双重功效的抗肿瘤多肽，所述的多肽具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

其中，所述的多肽为靶向神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)的多肽，该多肽具有提高药物穿透血管屏障和在肿瘤组织渗透的能力，进而提高药物的抗肿瘤疗效，同时还具有抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的活性。

其中，优选的，所述的药物为治疗性单克隆抗体靶向药物。

编码所述的抗肿瘤多肽的多核苷酸也在本发明的保护范围之内。

进一步的，本发明还提出了所述的抗肿瘤多肽以及编码该多肽的多核苷酸在制备抗肿瘤药物中的应用。

其中，优选的，所述的肿瘤为NRP-1高表达的实体肿瘤，更优选的，所述的肿瘤为胰腺癌。

进一步的，本发明还提出了所述的抗肿瘤多肽以及编码该多肽的多核苷酸在制备提高治疗性单克隆抗体靶向药物在抑制实体肿瘤疗效药物中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1.治疗性单克隆抗体药物是全球新药开发的热点。特别地，单克隆抗体靶向药物已经成为临床抗肿瘤治疗的热点和发展方向，市场前景巨大。然而，单克隆抗体药物从静脉注射进入血液循环到与肿瘤细胞发生结合，必须通过毛细血管内皮层及穿透肿瘤细胞外间隙，受到肿瘤血管屏障和肿瘤实质组织屏障的阻碍。实体肿瘤组织内血管网存在结构和功能异常，导致抗体药物不能在肿瘤组织有效聚集和渗透，影响了与癌症组织内可溶性分子靶点和癌细胞膜上表达的受体相结合，进而影响其疗效。因此，增强单克隆抗体的血管屏障穿透能力和在肿瘤组织内的渗透能力，将大幅提高单克隆抗体药物治疗实体肿瘤的疗效。

2.NRP-1是一种高表达于实体肿瘤的跨膜蛋白。在所有的实体肿瘤中，内皮细胞是细胞间质中形成新生血管和淋巴管的关键细胞，影响了肿瘤生长和转移。因此，本发明的多肽适用于所有的实体肿瘤，具有广泛的临床应用价值。

3.与目前常用的传统化疗药物相比较，多肽药物用量少、选择性强、特异性好、疗效高，研发周期短，符合国际生物医药发展方向，具有广阔的市场发展前景。

4.在细胞水平发明人对本发明设计的八种具有双重功效的靶向NRP-1的多肽通过血管内皮细胞通透性试验进行筛选，发现TMD6-D多肽具有最强增加内皮细胞通透性的效果。

5.在动物水平，发明人发现TMD6-D多肽可以显著提高组织渗透性和单克隆抗体在肿瘤组织内的渗透及潴留。

6.在细胞水平，发明人发现TMD6-D多肽具有抑制胰腺癌细胞增殖和促进细胞凋亡的活性，且呈现剂量依赖性。

附图说明

图1为TMD6-D的高效液相色谱图；

图2为TMD6-D的核磁氢谱图；

图3为TMD6-D的质谱图；

图4为对多肽在体外血管内皮细胞通透性试验中的检测分析示意图；

其中，A：人源脐静脉内皮细胞(HUVECs)接种于transwell上层小室，在培养液中孵育形成成熟的单层细胞铺满小室底膜后，加入VEGF重组蛋白(50ng/ml)或八种多肽(浓度分别为25nM)；孵育30分钟后，加入50mg的异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐(FITC-conjugatedDextran)；继续孵育30分钟后，读取下层小室的荧光强度并与PBS对照组进行标准量化分析；“√”表示筛选出的活性最强的多肽TMD6-D；

B:对照siRNA或NRP-1siRNA转染的HUVECs细胞接种于transwell上层小室，在培养液中孵育形成成熟的单层细胞铺满小室底膜后，加入VEGF重组蛋白(50ng/ml)或TMD6-D多肽(25nM)；孵育30分钟后，加入50mg的FITC-conjugated Dextran；继续孵育30分钟后，读取下层小室的荧光强度并与PBS对照组进行标准量化分析.“**”表示有显著性差异(P<0.001)；

C:HUVECs细胞接种于transwell上层小室，在培养液中孵育形成成熟的单层细胞铺满小室底膜后，加入VEGF重组蛋白(50ng/ml)或系列浓度的TMD6-D；孵育30分钟后，加入50mg的FITC-conjugated Dextran，继续孵育30分钟后，读取下层小室的荧光强度并与PBS对照组进行标准量化分析；

图5为对TMD6-D多肽在体内肿瘤组织渗透性试验中的检测分析示意图；

其中，A：建立裸鼠皮下胰腺癌肿瘤，当肿瘤生长至直径约为1cm时，经动物尾静脉分别注射埃文斯蓝(Evans Blue)溶液与PBS、VEGF重组蛋白(400ng)或TMD6-D多肽(500μg)的混合液，30分钟后，经心脏进行循环灌洗后，切取肿瘤拍照；

B:将肿瘤组织置于二甲基甲酰胺中37℃下振荡孵育过夜，在600nm吸收波长下定量分析埃文斯蓝含量；“**”(P<0.001)表示与PBS组比较有显著性差异；

图6为对TMD6-D多肽提高单克隆抗体在肿瘤组织渗透性试验中的检测分析示意图；

其中，A:建立裸鼠皮下胰腺癌肿瘤，当肿瘤生长至直径约为1cm时，经动物尾静脉注射西妥昔单抗(50μg)，接着分别注射PBS或TMD6-D多肽(500μg)溶液；3小时后，切取肿瘤，进行免疫组化染色，显微镜下观察并拍照；

B:对图像进行定量分析测量西妥昔单抗阳性染色的区域(％)；C:对肿瘤组织内西妥昔单抗的含量进行ELISA定量分析；“**”(P<0.001)表示与PBS组比较有显著性差异；

图7为胰腺癌细胞活力示意图；

其中，A：人源胰腺癌细胞BxPC-3与TMD6-D多肽(浓度分别为0,5,10,20或者40nM)孵育24小时后，细胞活力的检测结果；B:人源胰腺癌细胞PANC-1与TMD6-D多肽(浓度分别为0,5,10,20或者40nM)孵育24小时后，细胞活力的检测结果；“**”(P<0.001)表示与对照组比较有显著性差异；

图8为胰腺癌细胞凋亡示意图；

其中，A：人源胰腺癌细胞BxPC-3与TMD6-D多肽(浓度分别为0,5,10,20或者40nM)孵育24小时后，细胞凋亡率的检测结果；B:人源胰腺癌细胞PANC-1与TMD6-D多肽(浓度分别为0,5,10,20或者40nM)孵育24小时后，细胞凋亡率的检测结果；C:人源胰腺癌细胞BxPC-3与TMD6-D多肽(浓度分别为0,10或者40nM)孵育24小时后，在激光共聚焦荧光显微镜下观察细胞凋亡情况的图片；“*”(P<0.05)和“**”(P<0.001)表示与对照组比较有显著性差异。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。

本发明人通过针对NRP-1在包括胰腺癌在内的实体肿瘤组织和细胞中的表达特点以及与这些癌症的临床病理关系进行广泛而深入的研究，尤其是针对影响NRP-1介导的血管通透性的多肽C-端氨基酸序列进行重点研究，设计出八个具有双重功效的靶向NRP-1的多肽分子(TMD6-A、TMD6-B、TMD6-C、TMD6-D、TMD6-E、TMD6-F、TMD6-G和TMD6-H)，这八种多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-8所示。这些多肽具有提高细胞间通透性、增加组织渗透性、抑制癌细胞增殖和促进癌细胞凋亡的能力，并优选出活性最强的TMD6-D多肽药物。TMD6-D可以通过靶向血管内皮细胞和肿瘤细胞的NRP-1分子靶点，提高血管屏障的通透性和组织渗透性，并竞争性与NRP-1的跨膜区域单体结合，抑制细胞信号通路的活化，进而抑制肿瘤细胞增殖和促进其凋亡。在此基础上完成了本发明。

术语

NRP1

如本文所用，NRP-1或者NRP1或者neuropilin-1或者neuropilin 1或者神经纤毛蛋白-1或者神经纤毛蛋白1为本发明的多肽药物的分子靶点。

TMD6-A、TMD6-B、TMD6-C、TMD6-D、TMD6-E、TMD6-F、TMD6-G和TMD6-H

如本文所用，术语“TMD6-A、TMD6-B、TMD6-C、TMD6-D、TMD6-E、TMD6-F、TMD6-G和TMD6-H”为本发明的系列多肽的名字。本发明对每一种多肽分子给出了特定的氨基酸序列，这八种多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-8所示。

TMD6-A:LGVLLGAVCGVRPARPAR(SEQ ID NO.1)

TMD6-B:LGVLLGAVCGVRGERPPR(SEQ ID NO.2)

TMD6-C:LGVLLGAVCGVRVTRPPR(SEQ ID NO.3)

TMD6-D:LGVLLGAVCGVCRGDK(SEQ ID NO.4)

TMD6-E:LGVLLGAVCGVCRCDKPRR(SEQ ID NO.5)

TMD6-F:LGVLLGAVCGVTKPPR(SEQ ID NO.6)

TMD6-G:LGVLLGAVCGVCRRPR(SEQ ID NO.7)

TMD6-H:LGVLLGAVCGVWDQKKPRNRR(SEQ ID NO.8)

本领域的技术人员可以通过多肽合成技术获得这八种多肽。

对八种多肽在增加血管内皮细胞通透性的作用进行检测和筛选。

综合八种多肽在增加血管内皮细胞通透性的作用的实验结果，筛选出活性最强的TMD6-D多肽。

实施例1TMD6-D多肽的制备

步骤如下：

一.树脂溶涨：称量取代度为1.0mmol/g的0.6g CTC树脂，放置于反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min。

二.脱保护：抽掉DCM，加入20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，振荡5min，抽掉哌啶溶液，再加入新鲜20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，振荡15min。

三.检测：抽掉哌啶溶液，取少量树脂(大约20多颗树脂)，用乙醇洗三次，加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各一滴，加热(105-110℃)5min，为蓝色。

四.第一次洗：分别用DMF溶液(10ml/g)洗两次，然后用甲醇(10ml/g)洗两次，最后用DMF溶液(10ml/g)洗两次。

五.缩合：保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量，室温下反应30min。

六.第二次洗：分别用DMF(10ml/g)洗一次，然后用甲醇(10ml/g)洗两次，最后用DMF溶液(10ml/g)洗两次。

七.重复二至六操作。

八.最后一次洗涤：分别用DMF溶液(10ml/g)洗两次，然后用甲醇(10ml/g)洗两次，再用DMF溶液(10ml/g)洗两次，最后用DCM(10ml/g)洗两次。

九.裂解：制备裂解液(10ml/g，g是树脂的单位级，包含TFA 94.5％、水2.5％、EDT2.5％和TIS 1％)，加入步骤八所得反应管中，振荡120min。

十.吹干洗涤：将裂解液氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，常温自然挥发干燥。

TMD6-D的高效液相色谱图、核磁氢谱图以及质谱图分别如图1-3所示。

按照上述相同的方法分别合成了TMD6-A、TMD6-B、TMD6-C、TMD6-E、TMD6-F、TMD6-G和TMD6-H。

实施例2体外血管内皮细胞通透性检测

人源脐静脉内皮细胞(HUVECs)或siRNA转染的HUVECs(1×10⁵)接种于12孔transwell小室(0.4微米孔径)，培养于含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培养液。在37℃和5％CO₂条件下孵育48-96小时后，当HUVECs形成成熟的单层细胞并铺满上层小室的底膜时吸出培养液，加入不含血清的DMEM培养液，并加入VEGF重组蛋白(50ng/ml)，或八种多肽(浓度均为25nM)，或不同浓度的TMD6-D多肽。孵育30分钟后，加入50mg的异硫氰酸荧光素(FITC)-conjugated右旋糖酐(分子量40kDa,1mg/mL)于上层小室。继续孵育30分钟后，取出下层小室，用荧光酶标仪读取荧光强度，然后与PBS孵育的对照组进行对比分析标准量化。

结果如图4A所示，与PBS对照组比较，阳性对照组VEGF重组蛋白处理的血管内皮细胞的通透性上升了4.7倍，而八种多肽处理的血管内皮细胞的通透性均有不同程度的上升，其中TMD6-D多肽显示出最强的增加内皮细胞通透性的活力，导致血管内皮细胞的通透性上升了3.6倍。结论：TMD6-D多肽在八种多肽中展示最强的促进血管内皮细胞通透性的效果。

结果如图4B所示，当血管内皮细胞的NRP-1的表达被NRP-1siRNA阻断后，TMD6-D提高血管内皮细胞通透性的效果被明显抑制。结论：TMD6-D多肽通过靶向NRP-1调控的细胞信号通路提高血管内皮细胞通透性。

结果如图4C所示，TMD6-D多肽增加血管内皮细胞通透性呈浓度依赖性。

结论：TMD6-D多肽在八种多肽中展示最强的促进血管内皮细胞通透性的效果，这一作用是通过靶向NRP-1而实现的，且呈浓度依赖性。

实施例3体内肿瘤组织通透性检测

雌性BALB/c裸鼠(6-8周龄)接受皮下注射人胰腺癌BxPC-3细胞(2×10⁶)，建立皮下胰腺癌肿瘤。三周后当肿瘤生长至直径约为1cm时，动物分为三组(每组3只裸鼠)。对照组：经尾静脉注射1mg埃文斯蓝(Evans Blue)(溶解于200μl的PBS)；阳性对照组：经尾静脉注射1mg埃文斯蓝和VEGF重组蛋白(400ng)的混合液(溶解于200μl的PBS)；TMD6-D组：经尾静脉注射1mg埃文斯蓝和TMD6-D多肽(500μg)的混合液(溶解于200μl的PBS)。30分钟后，经腹腔注射克他命和甲苯噻嗪混合液诱导麻醉，经心脏注射用1％BSA(牛血清白蛋白，bovineserum albumin)(溶于PBS)溶液进行循环灌洗后，切取皮下肿瘤(每组3个肿瘤)，拍照。将肿瘤组织置于1ml的二甲基甲酰胺中37℃下振荡过夜，提取埃文斯蓝。提取液用分光光度计在600nm吸收波长下测量光吸收值(OD值)。

结果如图5A所示，对照组动物的肿瘤呈淡蓝色，阳性对照组肿瘤的蓝色明显较对照组深，说明这个动物模型是成功的；TMD6-D组肿瘤的蓝色也明显较对照组深。定量化分析结果如图5B所示，阳性对照组和TMD6-D组的OD值显著高于对照组。结论：TMD6-D多肽可以提高体内肿瘤组织的通透性。

实施例4提高单克隆抗体肿瘤组织渗透性的试验

雌性BALB/c裸鼠(6-8周龄)接受皮下注射人胰腺癌BxPC-3细胞(2×10⁶)，建立皮下BxPC-3肿瘤。三周后当肿瘤生长至直径约为1cm时，经尾静脉注射西妥昔单抗(Cetuximab)(50μg)(稀释于50μl注射用水)，接着分为两组(每组3只)：分别经尾静脉注射PBS(100ml)或TMD6-D多肽(500μg)(溶解于200μl的PBS)。3小时后，处死动物切取肿瘤。肿瘤组织冰冻切片进行抗西妥昔单抗的免疫组化染色后，显微镜下观察并照相，对图像进行定量分析测量西妥昔单抗阳性染色的区域(％)。肿瘤组织内西妥昔单抗的含量进行酶联免疫吸附试验(ELISA)进行定量分析。

结果如图6A所示，对照组接受PBS注射的动物携带肿瘤的妥昔单抗染色区(棕色，箭头所指区域)明显小于TMD6-D组肿瘤的妥昔单抗染色区。阳性染色区定量化分析结果如图7B所示，TMD6-D组的阳性染色区(％)显著高于对照组。利用ELISA对肿瘤组织内西妥昔单抗的含量分析结果如图6C所示，TMD6-D组比对照组肿瘤组织内含有更高水平的西妥昔单抗。结论：TMD6-D多肽可以提高西妥昔单抗在体内肿瘤组织的渗透和潴留。

实施例5细胞活力检测实验

胰腺癌细胞BxPC-3和PANC-1分别常规接种于96孔培养板，每孔5×10³个细胞，培养于含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle'smedium)培养液中。在37℃和5％CO₂条件下，孵育过夜。每孔加入含有不同浓度的TMD6-D多肽的培养液100微升。培养24小时后，每孔加入110微升新鲜培养液(含CCK-8溶液10微升)，轻微震荡96孔板10秒，然后放入培养箱继续孵育2小时，随后再次振摇10秒后检测比色，去除气泡；以空白对照孔为调零孔，选择450nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)，记录结果。计算细胞活力指数(％)＝实验组OD值/对照组OD值×100％。所有实验重复3次。

结果如图7A和图7B所示，与对照组比较，TMD6-D多肽处理的人胰腺癌BxPC-3细胞(图8A)和PANC-1细胞(图8B)的活力指数显著下降，且呈现浓度依赖性。结论：TMD6-D多肽可以抑制胰腺癌细胞的增殖。

实施例6细胞凋亡检测实验

胰腺癌细胞BxPC-3和PANC-1分别接种于8孔培养板，每孔1×10⁵个细胞，培养于含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle'smedium)培养液中。在37℃和5％CO₂条件下，孵育过夜。每孔加入含有不同浓度的TMD6-D多肽的培养液100微升。培养24小时后收集细胞，利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行了细胞凋亡的检测。取5～10万重悬的细胞，1000×g离心5分钟，弃上清，加入195μLAnnexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC，室温避光孵育10分钟。1000×g离心5分钟，弃上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液和加入10μL碘化丙啶(PI)染色液，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。

结果如图8A所示，与对照组比较，TMD6-D多肽处理的人胰腺癌BxPC-3细胞和PANC-1细胞的凋亡率显著增加，且呈现浓度依赖性。

同时对图8A中的BxPC-3细胞进行confocal荧光显微镜观察。Annexin V-FITC染色为绿色荧光，表示早期凋亡细胞；而PI染色为红色荧光，表示晚期凋亡细胞。结果如图8B所示，与对照组比较，TMD6-D多肽处理的人胰腺癌BxPC-3细胞中凋亡细胞明显增加，且出现晚期凋亡细胞。

结论：TMD6-D多肽可以促进胰腺癌细胞的凋亡。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制。所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。上面结合实施例对本发明作进一步的说明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> 一种具有双重功效的抗肿瘤多肽及其应

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val Arg Pro Ala Arg Pro

1 5 10 15

Ala Arg

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 2

Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val Arg Gly Glu Arg Pro

1 5 10 15

Pro Arg

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 3

Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val Arg Val Thr Arg Pro

1 5 10 15

Pro Arg

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 4

Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val Cys Arg Gly Asp Lys

1 5 10 15

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 5

Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val Cys Arg Cys Asp Lys

1 5 10 15

Pro Arg Arg

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 6

Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val Thr Lys Pro Pro Arg

1 5 10 15

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 7

Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val Cys Arg Arg Pro

1 5 10 15

<210> 8

<211> 21

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 8

Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val Trp Asp Gln Lys Lys

1 5 10 15

Pro Arg Asn Arg Arg

20

Claims (10)

1.一种具有双重功效的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

2.编码权利要求1所述的抗肿瘤多肽的多核苷酸。

3.权利要求1所述的抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为NRP-1高表达的实体肿瘤。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为胰腺癌。

6.权利要求1所述的抗肿瘤多肽在制备提高治疗性单克隆抗体靶向药物在抑制实体肿瘤疗效药物中的应用。

7.权利要求2所述的多核苷酸在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为NRP-1高表达的实体肿瘤。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为胰腺癌。

10.权利要求2所述的多核苷酸在制备提高治疗性单克隆抗体靶向药物在抑制实体肿瘤疗效药物中的应用。

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