CN103966334B

CN103966334B - Csf2rb基因在前列腺癌骨转移中的应用

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Publication number: CN103966334B
Application number: CN201410216106.5A
Authority: CN
Inventors: 李群; 李玉林; 李一雷; 高勇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-05-20
Filing date: 2014-05-20
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2034-05-20
Also published as: CN103966334A

Abstract

本发明公开了一种人CSF2RB蛋白及其应用，用于制备前列腺癌骨转移诊断及治疗的产品。本发明的CSF2RB蛋白可作为诊断前列腺癌骨转移的特异性标志蛋白，使前列腺癌骨转移的诊断更加准确、快速；本发明的CSF2RB蛋白还可作为制备治疗前列腺癌骨转移的分子药物，提供新的前列腺癌骨转移的治疗途径。

Description

CSF2RB基因在前列腺癌骨转移中的应用

技术领域

本发明属于蛋白治疗和诊断技术领域，特别是涉及一种CSF2RB蛋白在前列腺癌骨转移的早期诊断和治疗中的应用。

背景技术

前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，在我国超过80％的前列腺癌患者在确诊时已经发生骨转移，而骨转移是导致前列腺癌患者死亡的重要原因。所以，前列腺癌骨转移的诊断，尤其对骨转移的早期诊断，是临床诊疗和预后的关键。

目前前列腺癌骨转移的诊断方法主要包括放射性核素全身骨显像、前列腺特异性抗原及骨标志物检测这三种手段。但放射性核素全身骨显像是针对已经出现了骨转移病灶的患者而言，要想在患者一开始发生成熟的骨质溶解破坏之时甚至之前就发现骨转移趋势，特异性骨标记物的检测无非是一个很好的选择。

目前广泛应用的前列腺特异性抗原(PSA)在前列腺癌和前列腺增生症(BPH)患者血清中均可增高，所以它对前列腺癌骨转移的筛选诊断来说，特异性仍不高，它只是监测前列腺癌预后的一个重要标记物。除外PSA，近年来关注的骨形成标志物碱性磷酸酶(ALP)、骨吸收标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)与Ⅰ型胶原吡啶交联终肽(ICTP)标记物，在诊断前列腺癌骨转移中的敏感性分别为59.3％、37.0％、59.3％，特异性则为96.7％、80.0％、76.7％；PSA、TRACP5b、ALP、ICTP诊断前列腺癌骨转移的价值相当，联合检测并动态观察可能有利于前列腺癌骨转移的早期诊断，但它们的敏感性和特异性均不令人满意。所以早期诊断骨转移和指导个性化治疗的分子分型诊断仍是我们面临的极大挑战，而发现灵敏度和特异性更高的新的肿瘤标志物，是提高前列腺癌骨转移早期诊断水平的关键。

目前，对于中晚期前列腺癌患者，手术治疗的效果差，大多数采用药物治疗。根据不同的病情可以采用化学药物治疗、外放射治疗、放射性核素内放射治疗以及各种疗法的综合应用等。然而，放化疗药物不仅作用于肿瘤，还可以作用于肿瘤周围健康的组织，因而在杀伤肿瘤的同时，也给机体带来了很大的副作用，最终影响对肿瘤的治疗效果。

因此，本领域迫切需要开发早期判断前列腺癌骨转移的特异性标志物，并开发前列腺癌骨转移的靶向药物。

发明内容

本发明提供了CSF2RB基因或其蛋白在预测或诊断前列腺癌骨转移的应用，本发明还提供了CSF2RB能够有效抑制前列腺癌的骨转移或前列腺癌细胞的骨转移。

本发明第一方面，提供了一种集落刺激因子2受体β(Colony StimulatingFactor2Receptor,Beta，CSF2RB)基因或其蛋白的用途，用于制备预测或检测前列腺癌骨转移的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述CSF2RB基因来自哺乳动物，较佳地，来自啮齿动物(小鼠或大鼠)或灵长动物(例如人)；更佳地，来源于人。

在另一优选例中，所述CSF2RB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述的试剂包括CSF2RB的特异性引物、特异性抗体、探针和/或芯片。

在另一优选例中，所述的检测CSF2RB蛋白或mRNA的检测试剂包括：

(a).抗CSF2RB蛋白的特异性抗体；和/或

(b).特异性扩增CSF2RB的mRNA或cDNA的特异性引物。

在另一优选例中，所述的检测包括酶联免疫反应法(ELISA法)检测或时间分辨免疫荧光法(TRFIA法)检测。

在另一优选例中，所述的CSF2RB蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述CSF2RB的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在另一优选例中，所述检测是测定组织样品。

在另一优选例中，所述的组织样品包括前列腺癌组织和癌旁组织。

在另一优选例中，所述的癌旁组织为正常组织。

本发明第二方面，提供了一种用于检测前列腺癌骨转移的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测CSF2RB蛋白或mRNA的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测前列腺癌骨转移。

在另一优选例中，所述的检测前列腺癌骨转移指判断前列腺癌骨转移是否发生，和/或判断发生前列腺癌骨转移的可能性(易感性)大小。

在另一优选例中，所述的检测包括临床检测、辅助检测或早期检测。

在另一优选例中，所述判断包括预先判断(预测)。

(a).抗CSF2RB蛋白的特异性抗体；和/或

(b).特异性扩增CSF2RB的mRNA或cDNA的特异性引物。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

当检测对象的前列腺癌细胞或组织中CSF2RB表达量E1与正常前列腺细胞或组织的CSF2RB表达量E2之比≥2，则提示该检测对象前列腺癌骨转移的几率高于普通人群。

在另一优选例中，所述的E2是正常人群的正常前列腺细胞或组织的CSF2RB表达量。

在另一优选例中，所述的正常前列腺细胞或组织包括癌旁的前列腺细胞或组织。

在另一优选例中，所述的表达量是相对于对照基因(如β-肌动蛋白)的相对表达量。

本发明第三方面，提供了一种CSF2RB抑制剂的用途，用于制备预防或治疗前列腺癌骨转移的药物组合物。

在另一优选例中，所述的抑制剂包括：CSF2RB的抗体、CSF2RB核酸的反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA以及CSF2RB的活性抑制剂。

在另一优选例中，所述的siRNA序列如SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示。

在另一优选例中，所述的shRNA序列如SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括CSF2RB抑制剂作为活性成分，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药：口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。

在另一优选例中，所述的药物的制剂选自下组：片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。

在另一优选例中，所述的CSF2RB抑制剂以0.01-20mg/kg体重的剂量(每次或每天)施用于哺乳动物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人、小鼠、大鼠，更佳地，为人。

本发明第四方面，提供了一种体外非治疗性抑制前列腺癌迁移的方法，包括步骤：在CSF2RB抑制剂存在下，培养前列腺癌细胞，从而抑制前列腺癌细胞迁移。

在另一优选例中，所述的方法包括向前列腺癌细胞的培养体系中添加CSF2RB抑制剂，从而抑制癌细胞迁移。

在另一优选例中，所述的CSF2RB抑制剂的浓度为0.5-5mg/mL。

本发明第五方面，提供了一种筛选用于抑制前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的化合物的方法，包括步骤：

(a)测试组中，在前列腺癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中CSF2RB的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中CSF2RB的表达量和/或活性；

其中，如果测试组中细胞的CSF2RB的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对CSF2RB的表达和/或活性有抑制作用的治疗前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的化合物；和/或

(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，测试所述候选化合物对前列癌细胞骨转移或前列腺癌细胞迁移的抑制作用。

在另一优选例中，在步骤(b)中包括步骤：向测试组前列腺癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察前列腺癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；向对照组前列腺癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察前列腺癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；其中，如果测试组中前列腺癌细胞的迁移距离或侵袭数量显著小于对照组，就表明该测试化合物是对前列腺癌骨转移前列腺癌细胞迁移有抑制作用的化合物。

本发明第六方面，提供了一种预测或诊断前列腺癌骨转移的方法，包括步骤：

(i).准备受试者测试样品；

(ii).检测测试样品中CSF2RB相对于对照基因(如β-肌动蛋白)的mRNA表达量E1,与正常前列腺细胞或组织的CSF2RB表达量E2(即参比值)，当其比值≥2则提示该检测对象肿瘤骨转移的几率高于普通人群。

在另一优选例中，所述测试样品为组织样品。

在另一优选例中，所述参比值为非肿瘤样品中CSF2RB的表达量。

在另一优选例中，所述检测步骤(ii)包括检测CSF2RB mRNA的量，或CSF2RBcDNA的量；和/或检测CSF2RB蛋白的量。

在另一优选例中，所述检测步骤(ii)包括通过RT-PCR或PCR方法进行检测。

在另一优选例中，所述的检测步骤(ii)包括使用抗CSF2RB蛋白的抗体进行检测。

本发明第七方面，提供了一种抑制前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的方法，包括步骤：给需要治疗的对象(哺乳动物)施用安全有效量的CSF2RB抑制剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A显示了正常前列腺组织；图1B前列腺组织腺细胞团经激光显微切割后，HE染色的照片(×100)。

图2SDS-PAGE分离人正常前列腺细胞、PC-3细胞中的膜蛋白，并将每个泳道的凝胶平分为8段。

图3A CSF2RB蛋白的总离子流图；图3B CSF2RB蛋白的二级质谱图；图3CSOSUI网站查询CSF2RB蛋白的跨膜区域(TMD)，提示CSF2RB为具有2个跨膜区的膜蛋白。

图4显示了CSF2RB基因在三种细胞中表达情况，RT-PCR结果显示该基因在骨转移来源的PC-3细胞中表达，在人正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)及脑转移来源的前列腺癌DU-145细胞中不表达。

图5的Western-blot实验显示CSF2RB蛋白在人正常前列腺细胞及三种不同转移潜能前列腺癌细胞中的表达情况。CSF2RB在人正常前列腺上皮细胞RWPE-1中几乎未检测到表达；在淋巴转移来源的LNcap细胞及脑转移来源的DU145细胞中均未检测到表达；在骨转移来源的PC-3细胞中表达量较高。

图6免疫组化实验示CSF2RB蛋白在人前列腺正常组织、前列腺癌组织中的表达情况。A.人正常前列腺组织(N)：CSF2RB在N中几乎未检测到表达；B.人前列腺癌组织：CSF2RB在前列腺癌组织中呈弱棕黄色表达(弱阳性)；C.人前列腺癌骨转移组织：CSF2RB在人前列腺癌骨转移组织中呈强棕黄色表达(强阳性)；D.人前列腺癌腹壁转移组织：CSF2RB在人前列腺癌腹壁转移组织中呈弱棕黄色表达(弱阳性)。

图7CSF2RB-siRNA下调PC-3细胞CSF2RB mRNA表达的real-time PCR结果，CSF2RBmRNA基因下调70％-75％。

图8A.细胞划痕实验观察CSF2RB mRNA下调前后细胞迁移情况(第一排从左至右分别为0h阴性对照及两条CSF2RB-shRNA下调PC-3细胞CSF2RB mRNA基因前，第二排从左至右分别为24h阴性对照及两条CSF2RB-shRNA下调PC-3细胞CSF2RBmRNA后)；CSF2RB下调后可见细胞迁移能力较对照组明显减弱。B.用公式计算抑制CSF2RB后PC-3细胞的相对迁移距离明显下降，*P<0.05。C.Boyden小室观察CSF2RB-shRNA下调PC-3细胞CSF2RB mRNA基因前后PC-3细胞侵袭能力(sh-NC阴性对照，下调前；CSF2RB-sh1、CSF2RB-sh2分别为下调PC-3细胞CSF2RB mRNA基因后)，CSF2RB下调后，PC-3细胞数量明显减少，说明PC-3细胞的侵袭能力较对照组明显减弱。D.与对照组相比，CSF2RB下调组侵袭细胞数量平均值明显减少，*P<0.05。

图9CSF2RB-shRNA下调PC-3细胞CSF2RB mRNA表达，PC-3细胞生长速度明显减慢。

图10Western-Blot实验检测PC-3中CSF2RB下调前后，其下游通路蛋白T-AKT(总AKT)、p-AKT(磷酸化AKT)及mTOR的变化。PC-3Sramble为CSF2RB下调前，PC-3sh-CSF2RB为CSF2RB下调后；可见CSF2RB下调后p-AKT、mTOR在PC-3细胞中有不同程度的下调。

图11Western-blot检测DU145细胞中过表达CSF2RB对PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路的影响。如图所示，经CSF2RB的受体GM-CSF因子刺激/非刺激DU145细胞后，过表达CSF2RB均促进Akt和Erk1/2磷酸化；此外过表达CSF2RB在GM-CSF刺激后降低了迁移抑制蛋白E-cadherin(钙黏蛋白)的表达。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选并通过细胞生物学的研究，首次证明CSF2RB蛋白促进前列腺癌细胞的增殖，是一个前列腺癌转移的促进因子，具体地，本发明通过从一株骨转移来源的细胞系中，筛选出与已知前列腺癌骨转移因子(趋化因子CXCL12的受体CXCR4)不同的新的相关蛋白CSF2RB蛋白。基于本发明，将CSF2RB蛋白首次作为诊断前列腺癌转移尤其是骨转移的特异性标志蛋白，可使得前列腺癌骨转移诊断更准确、快速。此外，本发明CSF2RB蛋白的抑制剂或拮抗剂，可作为制备预防或治疗前列腺癌转移的分子药物，提供新的治疗途径。在此基础上完成了本发明。

CSF2RB蛋白和多核苷酸

在本发明中，“本发明蛋白”、“本发明多肽”、“CSF2RB蛋白”可互换使用，指集落刺激因子2受体β蛋白，(Colony Stimulating Factor2Receptor,Beta，CSF2RB)。应理解，所述术语还包括CSF2RB的活性片段和衍生物。

在本发明中，“本发明基因”、“本发明多核苷酸”指编码CSF2RB蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正义和反义核酸。

在本发明中，术语“CSF2RB蛋白”或“CSF2RB多肽”可互换使用，都指具有人蛋白CSF2RB氨基酸序列的蛋白或多肽。

集落刺激因子2受体β(Colony Stimulating Factor2Receptor,Beta，CSF2RB)是具有2个跨膜结构的膜蛋白，以β链的形式构成细胞因子IL-3、IL-5和GM-CSF受体的侧链。共同β链(hβc)，即CSF2RB，在高亲和的配体结合及信号转导中是必需的。研究发现，CSF2RB主要在血液系统疾病中研究较多，既促进造血细胞增殖又促进分化，在维持造血细胞增殖、分化、自我更新的平衡中具有重要作用。

一种优选的CSF2RB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；其编码的CSF2RB蛋白序列如SEQ ID NO.:2所示。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的CSF2RB蛋白或多肽”是指CSF2RB蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CSF2RB蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。在本发明中，CSF2RB蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码CSF2RB的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码CSF2RB蛋白的多核苷酸。

本发明的人CSF2RB核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或CSF2RB蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的CSF2RB蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人CSF2RB蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人CSF2RB编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

抑制剂

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CSF2RB蛋白发生相互作用的物质，尤其是抑制剂等。

本发明CSF2RB蛋白的抑制剂(包括抗体、反义核酸以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制CSF2RB蛋白的表达和/或活性，进而抑制前列腺癌的骨转移或前列腺癌细胞的迁移。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

可用于本发明的抑制剂包括：CSF2RB的抗体、抑制性mRNA、CSF2RB核酸的反义RNA、microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA以及CSF2RB的活性抑制剂。其中，典型的CSF2RB抑制剂为抑制性miRNA、siRNA。

典型地，将CSF2RB基因作为制备预防或治疗前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的药物的靶点的技术方案包括以下方案：

1.化学合成双链核糖核酸分子，其序列特异性针对CSF2RB基因序列，利用脂质体包裹递送至肿瘤细胞内干扰CSF2RB基因的表达，观察软琼脂克隆形成能力、细胞迁移能力等细胞生物学特性的改变。可利用本领域常规的方法来设计和合成特异性针对CSF2RB的核酸序列(如siRNA)。

2.利用各种载体，包括DNA载体、慢病毒载体来干扰CSF2RB基因的表达，达到体内干扰CSF2RB基因的效果，检测它们对裸鼠瘤体腹腔扩散或骨转移的治疗效果，从而实现抑制前列腺癌骨转移或癌细胞迁移的目的。

3.获得能够特异性抑制CSF2RB基因转运活性的多肽、单克隆抗体，达到抑制CSF2RB活性的目的，从而现实抑制前列腺癌细胞骨转移或癌细胞迁移的目的。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明CSF2RB抑制剂(如抗体、反义序列(如siRNA)、或抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。

抗体

本发明还包括对人CSF2RB蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CSF2RB基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CSF2RB基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，将提纯的人CSF2RB基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人CSF2RB蛋白或它的抗原的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

本发明的抗体包括可以抑制CSF2RB功能的抗体，也可以是不影响人CSF2RB功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人CSF2RB基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人CSF2RB基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的CSF2RB基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞(如E.coli)中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化CSF2RB蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。

可用于本发明的CSF2RB抗体可以是抗人CSF2RB蛋白抗体。本发明的抗人CSF2RB蛋白抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人CSF2RB蛋白。

药物组合物和给药方式

本发明提供了含有活性成分(a)CSF2RB抑制剂；(b)药学上可接受的载体。

在本发明的药物组合物中，CSF2RB抑制剂CSF2RB抑制剂的含量没有特别限制，通常为0.01-95wt％,较佳地为0.1-90wt％。

本发明的药物组合物可以是单方制剂，也可以是复方制剂。

在复方制剂中，除了含有CSF2RB抑制剂之外，还可包含其他抗肿瘤化合物，例如化疗剂。代表性的化疗剂包括(但并不限于)：烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物以及相关抑制剂、长春花碱类、epipodopyvllotoxins、抗生素、L一天冬酞胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位复合物、大黄素取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-释放激素类似物。优选的化疗剂包括：5一氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨、紫杉醇和多西紫衫醇。

本发明的药物组合物的剂型和制备方法没有特别限制，可用本领域常规通用的制法制成片剂、胶囊、颗粒剂、缓释剂、注射剂等各种剂型。优选的剂型是口服制剂(如片剂)和注射剂。

在本发明中，CSF2RB抑制剂或含CSF2RB抑制剂的药物制剂可用于预防和治疗前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移。

在本发明中，给药方式没有特别限制，可以通过口服、静脉内、肌内、腹腔内或皮下等途径给药。

本发明制剂可以每天服用或给药一次或两次、或多次，或者以缓释方式给药。优选的方式是每天服药一次，因为这样便于病人坚持，从而显著提高病人服药的顺应性。

服用时，极大多数病例一般每天应用的总剂量为每人1mg～200g，较佳地为10mg～100g。

筛选方法

本发明还提供了基于CSF2RB进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(抑制)CSF2RB表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对前列腺癌细胞的抑制作用。

本发明提供的筛选预防或治疗前列腺癌骨转移、前列腺癌细胞迁移的候选化合物的方法，基于该化合物对CSF2RB的表达量和/或活性的影响，一种典型的筛选方法包括步骤：

其中，如果测试组中细胞的CSF2RB的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对CSF2RB的表达和/或活性有抑制作用的预防或治疗前列腺癌骨转移的候选化合物。和/或

(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对前列腺癌细胞骨转移或迁移的抑制作用。如，在测试组中，前列腺癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；在对照组中，在前列腺癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；其中，如果测试组中癌细胞的迁移距离或侵袭数量显著小于对照组，就表明该测试化合物是对前列腺癌骨转移细胞或前列腺癌细胞迁移有抑制作用的预防或治疗前列腺癌的候选化合物。

检测方法和试剂盒

本发明涉及定量和定位检测人CSF2RB蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人CSF2RB蛋白水平，可以用于诊断前列腺癌的骨转移或前列腺癌细胞的迁移。

一种检测样品中是否存在CSF2RB蛋白的方法是利用CSF2RB蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与CSF2RB蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CSF2RB蛋白。

CSF2RB蛋白或其多核苷酸可用于CSF2RB蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗CSF2RB的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的CSF2RB蛋白。

本发明还提供了一种检测前列腺癌是否有骨转移的试剂盒，它含有特异性扩增CSF2RB的引物对和/或CSF2RB特异性抗体以及标签或说明书。

其中，所述的标签或说明书注明以下内容：当检测对象的CSF2RB相对-肌动蛋白的mRNA表达量与非癌症组织的CSF2RB相对-肌动蛋白的mRNA表达量之比>2，则提示该检测对象前列腺癌骨转移的几率高于普通人群。

一种典型的本发明的试剂盒可用于检测人前列腺组织样品。

本发明还包括一种抑制前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的方法，包括步骤：给需要治疗的对象(哺乳动物)施用安全有效量的CSF2RB抑制剂。

本发明的有益效果

1.本发明CSF2RB基因或蛋白可以用于作为诊断或预测前列腺癌骨转移的特异性标志物，即CSF2RB高表达者前列腺癌骨转移的几率更大。

2.本发明CSF2RB抑制剂可以有效地抑制前列腺癌的骨转移或前列腺癌细胞的迁移，可作为预防或治疗前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的药物。

3.本发明的CSF2RB抑制剂还可以用作药物的筛选，从而筛选出对能够有效抑制前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的药物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法：

(1)激光显微切割(LCM)获取正常前列腺上皮细胞

由于前列腺外周区腺体丰富，占前列腺腺体体积的70％，且为前列腺癌的好发区，故该区为正常前列腺与前列腺癌对比分析蛋白表达谱的最佳选择区。取10例无前列腺病史的尸检人前列腺组织标本，取其外周区部分制备10um厚度冰冻切片；改良HE染色；用LCM选择性获取腺上皮细胞团，并收集至收集管中。

(2)前列腺癌细胞的培养

PC-3细胞培养于F12培养基中，培养基中含10％新生胎牛血清、1％L-谷氨酰胺、100U.mL-1青霉素、100mg.L-1链霉素。于37℃、5％CO2孵箱中培养，选用对数生长期细胞进行实验。

(3)膜蛋白的样品制备及定量

3.1膜蛋白的样品制备

(1)首先收集50mg用LCM获取的人正常前列腺细胞团，然后用细胞刮刀收集细胞培养瓶中的PC-3细胞3-5×10⁶。

(2)用试剂盒中2ml冷洗液洗三种细胞,各两遍。

(3)每种细胞中均加入10ul蛋白酶抑制剂,并快速加入2ml蛋白提取液1,充分混匀后,4℃摇床孵育10min。

(4)4℃，16000g离心15min后,得到的上清即为胞浆蛋白。

(5)将上清尽量吸干净，加入5μl蛋白酶抑制剂，然后迅速加入1ml蛋白提取液2，充分混匀后，4℃摇床孵育30min。

(6)4℃，16000g离心15min后,得到的上清即为膜蛋白。

(7)将上清移到另一离心管中，并于-80℃冰箱备用。

3.2BCA蛋白定量

(1)以牛血清白蛋白(BSA)为标准品,按BCA蛋白检测试剂盒说明书将A液与B液按50:1的体积比混合为工作液。

(2)在96孔板中分别加入25μl的标准品和/或待测样本，每个样本设3复孔。

(3)各孔中加入200μl工作液，混匀，37℃孵育30min。

(4)用酶标仪于562nm波长处测定各孔的OD值，参照标准品绘制标准曲线，计算各待测样品的蛋白浓度。

(4)SDS-PAGE

两组样品，每组各100ug膜蛋白在分离胶为13％、浓缩胶为5％的SDS-PAGE胶上进行分离,起始电流15mA、15min，然后加大电流至30mA,40min,直至溴酚兰到凝胶底端，停止电泳。电泳结束后用HSC固定液固定1小时，然后进行胶体考马斯亮蓝染色1小时，最后脱色。

(5)胶内酶解及质谱分析

考马斯亮蓝染色后，每个样品的整个泳道均被平分为8份凝胶，进行胶内酶解，然后使用1DLC-LTQ进行分析，C18柱(0.15mm直径，15cm长)，上样为自动进样器，上样后样品经过C18Trap柱脱盐，然后在C18柱上进行分离(A相为0.1％FA的Millpore水，B相为0.1％FA84％乙腈水溶液，梯度为2小时内从4％的B相上升到50％的B相)，质谱设备为LTQ(Thermo)，Metal needle电喷雾。

(6)数据库查询

对串联质谱的原始数据使用BioWorksTM3.0软件中的Turbo SEQUEST程序搜索IPI Human V3.15.1的数据库,最后得到鉴定的蛋白质结果。可被承认的SEQUEST搜索结果必须是DelCN≥0.1(无论电荷什么状态)。带一个电荷的肽必须是胰蛋白酶肽，且相关得分(Xcorr)不得少于1.9，带2个电荷的胰蛋白酶肽或部分胰蛋白酶肽的相关得分不得少于2.2分，带3个电荷的胰蛋白酶肽或部分胰蛋白酶肽的相关得分不得少于3.75分。

(7)蛋白质信息汇总及生物信息学查询

使用Buildsummary软件合并每个组的所有条带查库结果输出鉴定蛋白质列表。用GOA(http://www.ebi.ac.uk/GOA/)对质谱鉴定后的蛋白质按照细胞组分、功能、生物学途径进行分类；对比人正常前列腺细胞、PC-3细胞中的蛋白在IPI中的数据库号获得两者的差异膜蛋白质后，找出正常细胞中没有仅存在于PC-3细胞中的差异膜蛋白质，并通过(http://www.psort.org/)查询蛋白的亚细胞定位情况。然后用SOSUI(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)网站查询膜蛋白的跨膜区域(TMD)，在蛋白的基序内预测跨膜螺旋。

(8)前列腺癌骨转移侯选靶标蛋白的选择标准

为了选出新的前列腺癌骨转移的侯选标志蛋白，应用了下面的选择标准：

(1)没有在前列腺癌中研究过的新蛋白；

(2)被选出的蛋白要满足SEQUEST程序搜索结果的过滤参数(当Charge+1，Xcorr≥1.9；当Charge+2，Xcorr≥2.2；当Charge+3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1)

(3)质谱鉴定结果中：理论谱与实验谱的离子匹配数∕理论谱中离子数﹥50％；

(4)蛋白的二级质谱图在基线噪声以上应该是清楚的，b、y离子应该是连续的。

上述4个条件同时满足说明蛋白可以作为目标侯选蛋白。

(9)CSF2RB在基因及蛋白水平的表达情况

9.1半定量聚合酶链反应(RT-PCR)

①实验用引物：

CSF2RB上游引物:5'-GCCATAGCAATCAGCAGAACG-3'(SEQ ID NO.:3)

下游引物:5'-GATGAGAAGAGGACCCCCTAAT-3'(SEQ ID NO.:4)

β-actin上游引物:5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'(SEQ ID NO.:5)

下游引物:5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'(SEQ ID NO.:6)

②实验流程

1)常规培养PC-3细胞及RWPE-1细胞，各收集1.5×10⁶个细胞，加1mLTrizol吹打，

室温5分钟。

2)加氯仿1/5体积(0.2ml)，颠倒混匀10下，室温5分钟。4℃，离心

12000g，15分钟。

3)转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中加等体积异丙醇(约400

μl)，混匀室温10分钟，4℃，离心12000g，10分钟。

4)弃上清，加冰预冷的75％乙醇(用DEPC水配)1ml，4℃离心7500g，

5分钟。

5)弃上清，空气干燥5-10分钟，溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)。

6)RNA分析：在260nm和280nm测定样品的吸收值，确定RNA质量。

1OD₂₆₀＝40μg RNA，计算RNA产率。OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.8～2.0之间，说明RNA纯度高。变性琼脂糖凝胶电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。

7)按下述方法进行逆转录：

Ⅰ反应体系

Ⅱ反应条件

42℃ 30分钟

99℃ 5分钟

5℃ 5分钟

8)按下述方法进行PCR

Ⅰ反应体系

Ⅱ把8)－①的反应液加入到7)-②的逆转录反应结束后的PCR反应管中，轻轻混匀。

③反应条件

9)琼脂糖凝胶电泳(1％)，并通过电泳凝胶观察系统摄像。

10)分析结果：CSF2RB阳性条带出现在441bp的位置，内参照β-actin出现在362bp的位置。

9.2蛋白质印迹(Western blot)

1)蛋白样品制备：培养的细胞吸去培养上清后，用预冷的1X PBS洗两次，加入2×SDS裂解液(100mM Tris-Cl，pH＝6.8，4％SDS，20％甘油)，充分裂解后，沸水浴加热10min，12000×g离心10min，上清转移至新管中，BCA ProteinAssay Kit对获得的蛋白进行定量，－80℃保存；

2)蛋白电泳分离：在蛋白样品加入适量含有200mM DTT的上样缓冲液(loadingbuffer)，沸水浴加热10min，稍作离心，SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分离样品；

3)转膜：将电泳胶、硝酸纤维膜、厚(薄)滤纸垫板浸于转膜缓冲液中(24mMTris，192mM甘氨酸，20％甲醇)平衡15～20min。按正极–1层厚滤纸垫板–硝酸纤维膜–电泳胶–2层薄滤纸垫板–负极的顺序放好，湿转仪(XCellSureLock^TM，invitrogen)30伏转膜30～40min；

4)封闭：5％脱脂奶粉/0.1％PBST作为封闭液，水平摇床，室温封闭30min～2h；

5)一抗：一抗用封闭液稀释(参考抗体说明书推荐浓度)，室温孵育2h或者4℃孵育过夜，0.1％PBST洗三次，每次5min；

6)二抗：荧光二抗用封闭液稀释(1:1000)，室温孵育30min，0.1％PBST洗三次，每次5min；

7)扫膜：ODYSSEY红外成像系统扫描硝酸纤维素膜，保存图像。

9.3免疫组化的方法检测CSF2RB抗体在前列腺癌与匹配边缘及骨转移癌组合芯片(PR956b)上的表达

实验采用免疫组化(IHC)的UltraSensitive TM S-P法检测CSF2RB抗体在前列腺癌与匹配边缘及骨转移癌组合芯片中的表达情况。抗体(CSF2RB)购自abcam公司；即用型UltraSensitive TM S-P超敏试剂盒(鼠/兔)，购自迈新生物技术有限公司；试剂盒组成：试剂A：内源性过氧化酶阻断剂；试剂B：动物非免疫血清(羊)；试剂C：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶。DAB显色系统：液体DAB酶底物显色试剂盒，购自福州迈新生物技术有限公司。

实验方法和材料：

1)60℃烤片30分钟，常规脱蜡水化；

2)抗原修复：以0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.0)高压2分钟修复抗原，冷却至室温，磷酸盐缓冲液(PBS)洗5分钟×3次；

3)用3％H202-甲醇封闭内源性过氧化物酶，室温10分钟，PBS洗5分钟×3次；

4)滴加正常非免疫动物血清，室温10分钟；

5)除去血清，滴加一抗IL3RB(1:200)，4℃冰箱过夜；

6)用0.1％Tween-20PBS洗5分钟×3次；

7)滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶，室温孵育10分钟；

8)DAB显色5分钟，蒸馏水洗终止显色；

9)苏木素复染、水洗、分化后充分水洗返蓝；

10)常规脱水透明，中性树胶封片。

(10)利用RNA干扰技术成功下调PC-3细胞中的CSF2RB基因，并通过细胞划痕、Boyden小室侵袭实验和生长曲线实验来观察CSF2RB的迁移、侵袭、生长能力

10.1CSF2RB的RNA干扰及鉴定

①实验用2对CSF2RB小的干扰RNA片段及1对阴性对照由上海吉玛公司合成

CSF2RB-si1序列为：Sense:GGGCAGAGAAACACAUAAAdGdA(SEQ ID NO.:7)

AntiSense:UUUAUGUGUUUCUCUGCCCdUdC(SEQ ID NO.:8)

CSF2RB-si2序列为：Sense:CUCCGGAGUAAACCUUCUUdCdC(SEQ ID NO.:9)

AntiSense:AAGAAGGUUUACUCCGGAGdCdG(SEQ ID NO.:10)

同时随机序列(scramble siRNA)作为阴性对照(购自上海吉玛公司)。

②CSF2RB RNAi实验流程(24孔平板)：

1)用去RNase的缓冲液(100mM乙酸钾,30mM HEPES pH7.5)将siRNA稀释为5uM溶液。分装后-20℃冻存。

2)在EP管中加入4ul Trifectin，46ul Opti-MEM I培养液。另一EP管中加入1.2ul5uM siRNA(两种抑制序列各1.2ul)和46.4ul Opti-MEM I培养液。轻轻混匀，室温孵育5min后将2个EP管中的液体混合，室温孵育10min-20min。

3)胰酶消化70％-80％状态下PC-3细胞。用不含抗生素的细胞培养基调整细胞浓度(PC-3：5x10⁴/500ul)。

4)将混合好的100ul siRNAs-Trifectin复合溶液加入到孔板中央后立即加入500ul的细胞溶液，轻轻振荡孔板以混匀。

5)放入细胞培养箱37℃孵育24h后更换为带抗生素的全培养基。转染后48h-72h内通过Western Blotting或流式细胞术检测RNA干扰效果。

6)利用RNA干扰后的细胞进行功能实验。

③CSF2RB流式细胞术检测：

1)PBS清洗细胞，利用Versene(不含胰酶)消化悬起细胞并计数1x10⁶个细胞置于15ml离心管中。预冷PBS清洗两遍，4℃离心沉淀。

2)将ALEXA647标记的抗CSF2RB抗体1:200稀释于1％BSA PBS缓冲液中。往细胞中加入100ul稀释后的抗体并在冰上避光孵育1h。

3)4℃离心，预冷FACS(含3mM EDTA的PBS缓冲液)缓冲液清洗3遍。

4)将细胞悬浮于1ml预冷的FACS缓冲液中，并送流式细胞仪检测(FLH-4)。

10.2细胞划痕法检测CSF2RB下调前后PC-3细胞的迁移能力

1)包被基底膜：用灭菌双蒸水配制以下三种溶液：10g/L BSA，50mg/LMatrigel1:8稀释液；10mg/L FN(纤连蛋白),以50ul/孔分别加入96孔培养板，BSA为对照基底。

2)水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/L BSA的无血清培养液，37℃，30分钟。

(3)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化体外培养的肿瘤细胞，调整细胞浓度为1x10⁵/ml,分别将100μl细胞悬液接种于预包被的96孔培养板中。每组平行8个样本。

(4)人工划痕：在单层培养细胞上，用移液器滴头沿培养板底部呈“十”字形划痕，用激光共聚焦显微镜摄像，并测量划痕区距离(A值)，然后用无血清培养液洗涤，更换含10g/L BSA和体积分数为1％胎牛血清的F12培养液，培养24小时更换体积分数为10％胎牛血清的F12培养液，继续培养24小时，观察并照相。

(5)测量迁移距离：用激光共聚焦显微镜摄像，并测量相同划痕区的迁移后的距离(B值)，根据下面公式计算出细胞实际迁移距离。相对移动距离＝(A-B)/A×100，结果用X±S表示。

10.3Boyden小室侵袭实验

1)分组：本实验共设3组，包括si-NC组、CSF2RB-si1组和CSF2RB-si2组。

2)包被：先将Matrigel置4℃融化，并用无血清培养基将其1：3稀释，混匀，80μl/孔加至Boyden小室的上室聚碳酸酯膜上，整个操作在冰上及无菌条件下进行，所有器皿及试管均事先预冷。37℃下孵育30分钟，此时Matrigel已形成胶。

3)荧光标记细胞：将各组细胞用0.25％胰酶消化，离心，PBS洗一次，离心弃洗液，加入1mg/ml罗丹明，静止2～3分钟，离心1000rpm，5分钟。PBS洗一次。

4)在24孔板内加入经饥饿培养24小时的NIH3T3细胞(大鼠成纤维细胞)的培养上清200μl，上室加入各组细胞5×10⁵个/孔，于37℃5％CO₂条件下培养。

5)在细胞接种2小时末，分别在激光共聚焦显微镜下，在距离聚碳酸酯膜孔径上10μm和下2μm之间采集图象，观察细胞距离孔径的距离，用以判断细胞在Matrigel内的迁移速度及侵袭距离。

6)培养3小时，弃去上室中的培养液，并用生理盐水棉签轻轻檫去Matrigel胶，用激光共聚焦显微镜200×视野下任取5个不重复视野照相，并记数细胞数量X±S表示。

10.4生长曲线实验

1)接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成PC-3细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.

2)培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天。

3)呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制，pH＝7.4)20ul.继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。

4)比色：选择490nm(570nm)波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

统计学处理

所有实验数据用SPSS12.0统计软件进行处理，各组间数据根据比较对象不同分别采用采用“t”检验、χ²检验。计量数据以X±S表示。

实施例1：正常前列腺上皮细胞的获取

应用激光显微切割(LCM)技术(通用方法1)从人正常前列腺组织中获取正常前列腺组织。其中，图1A-B显示了正常前列腺组织外周区中获取人正常前列腺上皮细胞，以备后续与前列腺癌细胞进行差异膜蛋白的筛选。

实施例2：鉴定正常前列腺细胞与前列腺癌转移细胞的差异膜蛋白

通过基于液相色谱的Shotgun-MS方法分析，分析了人正常前列腺细胞及PC-3前列腺癌细胞间的膜蛋白(图2)，利用LTQ质谱,在严格的过滤参数条件下(当Charge+1，Xcorr≥1.9；当Charge+2，Xcorr≥2.2；当Charge+3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1)鉴定蛋白质。在人正常前列腺细胞中成功鉴定了377个膜蛋白，PC-3细胞中鉴定了564个膜蛋白，其中，与正常前列腺细胞相比，仅在PC-3细胞中表达的膜蛋白有130个，其中包括比较经典的钙粘素家族蛋白如E-cadherin、Neural-cadherin precursor等，这些蛋白质参与了前列腺癌的转移功能；还包括紧密连接蛋白如Occludin、claudin-4蛋白，它们参与构成或调节细胞间的紧密连接，当它们表达在缺乏紧密连接的细胞中时会诱导黏附的产生，故此类蛋白可能在转移性前列腺癌中起到重要的作用。利用GOA工具对所鉴定的膜蛋白分为10类。其中除了已知膜蛋白，几个假设蛋白和cDNA序列也被预测。

其中，CSF2RB蛋白为首次在前列腺癌骨转移来源的PC-3细胞中发现，其不仅满足LTQ质谱的过滤参数(图3A)，而且理论谱与实验谱的离子匹配数∕理论谱中离子数﹥50％，其蛋白的二级质谱图(图3B)在基线噪声以上是清楚的，b、y离子是连续的，说明该蛋白是高度可信的。同时其在细胞信号转导方面发挥着重要作用。

实施例3：验证CSF2RB蛋白在三种细胞中的差异表达情况

通过RT-PCR及Western-blot方法证实，CSF2RB无论是在RNA水平还是在蛋白水平上均只在PC-3细胞中有表达或高表达(图4和5)，而在正常前列腺组织中及其他转移来源的前列腺癌细胞(淋巴转移来源的LNcap细胞及脑转移来源的DU145细胞)中没有表达或低表达，这一结果与前期蛋白质组学结果基本一致。进一步通过免疫组织化学(图6)方法观察到CSF2RB在前列腺癌骨转移组织中高表达，在非骨转移组织中不表达或低表达，且CSF2RB可影响其下游的已知参与前列腺骨转移癌的AKT及ERK蛋白。

实施例4：下调CSF2RB前后对前列腺癌细胞侵袭、迁移的影响

本实施例应用RNA干扰技术下调CSF2RB，观察成功下调CSF2RB前后对前列腺癌细胞侵袭、迁移的影响。

具体地，采用通用方法(10)，通过RNA干扰技术下调PC-3细胞中CSF2RBmRNA表达(图7)，CSF2RB mRNA基因下调比率高达70％-75％。并通过细胞划痕(图8)、boyden小室(图9)、生长曲线(图10)方法初步了解到CSF2RB下调后，前列腺癌细胞的迁移能力、侵袭能力及生长能力明显下降，说明CSF2RB可以促进前列腺癌细胞的侵袭、转移、生长。

实施例5CSF2RB在体内对前列腺癌转移至骨的促进作用及机制

本实验建立了严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)-人骨前列腺癌模型，观察CSF2RB在体内对前列腺癌转移至骨的促进作用及机制。

1)采用胫骨髓腔注射方法建立SCID-人骨前列腺癌模型：采用戊巴比妥钠(按60mg/kg的剂量)腹腔注射法麻醉裸鼠，消毒裸鼠右下肢皮肤,向右胫骨髓腔内注入10μl人前列腺癌PC-3细胞悬液(2×10⁶个细胞),立即用骨蜡封闭针眼并缝合皮肤。采用相同的方法,向左胫骨髓腔内注入10μl D-Hank缓冲液作为自身对照。

2)裸鼠骨转移模型的动态观察和鉴定:

A.裸鼠体征的监测:术后每周测量各组裸鼠体重,当裸鼠出现明显消瘦、弓背,进食减少,活动能力减弱时处死动物。

B.影像学监测:术后第2周起,各组裸鼠每周行X线拍片检查,发现骨组织出现溶骨性损害者为阳性。记录最初发现骨转移的时间,并且测量裸鼠右胫骨骨质破坏区和转移瘤体积,同时计算肿瘤生长率。

C.组织病理学鉴定:处死动物后,切取四肢长骨、脊柱、肋骨、肩胛骨和髂骨,免疫组织化学染色方法了解人前列腺癌PC-3细胞骨转移灶阳性。

3)观察骨转移灶中CSF2RB及其信号通路中PI3K、AKT、Ras及MAPK分子阳性表达情况：裸鼠骨转移模型转染sh-CSF2RB后，免疫组织化学染色方法了解人前列腺癌PC-3细胞骨转移灶阳性表达变化情况，同时通过western-blot方法检测骨转移灶中的PI3K、AKT、Ras和MAPK水平。

结果：

1.裸鼠体征表现

各组裸鼠体重监测结果：A组裸鼠于术后第4周起,体重逐渐下降,至第8周时,本组裸鼠消瘦和弓背明显,进食和活动能力下降,右下肢肿瘤细胞种植处可见巨大瘤体,膝关节呈屈曲位固定,丧失运动功能。B组裸鼠第4周起平均体重增长速度较对照组缓慢,第7周起体重呈下降趋势,活动和进食量减少；其间有1只裸鼠出现截瘫,2只裸鼠恶液质明显,于7～8周死亡。C组裸鼠体重、活动和进食情况与对照组没有明显差异。

2.影像学检查

胫骨髓腔注射：7只裸鼠术后第2周行X线检查,与左侧胫骨影像学检查结果比较,均可见右侧胫骨上段骨髓腔扩大,骨小梁明显减少；第4周骨皮质破坏,肿瘤组织侵犯软组织,出现病理性骨折；至第6周时,肿瘤侵犯股骨及其软组织。本组模型右胫骨骨转移瘤最初2周内瘤体较小,不易测量；第3周起肿瘤增长迅速,尤以术后5～6周最明显。

3.病理学检查

于第8周末处死A组裸鼠,其右下肢明显肿大,右侧胫骨中上段和股骨中下段被灰白色瘤体包裹。切片行苏木精2伊红染色,光镜下可见肿瘤细胞排列紊乱,形态不规则,细胞分化差,核大浓染,穿破骨皮质并侵犯周围的软组织。于12周内相继处死B组裸鼠,骨组织切片经苏木精2伊红染色后,发现胫骨、股骨、肋骨、肩胛骨有肿瘤转移灶,但是病灶较小,较少侵犯软组织。上述病变部位均行小鼠抗人细胞角蛋白8/18免疫组织化学染色,结果显示肿瘤骨转移部位的细胞染色均呈强阳性,而瘤体周围正常组织呈阴性。C组裸鼠于16周末处死,苏木精2伊红及免疫组化染色均未发现骨转移灶。

4.骨转移发生率

A组裸鼠于术后2周行影像学检查,其右侧胫骨均呈溶骨性骨质破坏,经组织病理学鉴定,本组骨转移率达100％(7/7)。B组裸鼠通过影像学检查,在12周内有2只裸鼠可见骨转移灶形成,经组织切片检查,在3只裸鼠的骨组织中发现转移灶(转移部位为胫骨、股骨、肩胛骨、肋骨),本组骨转移率为42.9％(3/7)。而C组裸鼠在16周内均未见骨转移灶形成。

5.骨转移灶中CSF2RB及其信号通路中PI3K、AKT、Ras及MAPK分子阳性表达情况

骨转移灶磷酸化的PI3K、AKT、Ras及MAPK表达增强。

讨论

本发明对骨转移来源的前列腺癌细胞系PC-3进行了大量的蛋白筛选，并筛选获得了除了已知骨转移相关因子(趋化因子CXCL12的受体CXCR4)之外的另一个骨转移相关蛋白CSF2RB，该蛋白在非骨转移来源的前列癌细胞中不表达或少量表达，特异性较强。此外，本发明通过大量实验，验证了CSF2RB与经典的前列腺癌骨转移通路的调控相关，而敲除CSF2RB基因能够有效地抑制前列腺癌的骨转移，该基因有望补充CXCR4成为新的前列腺癌骨转移预测、诊断以及治疗的靶点。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种集落刺激因子2受体β(Colony Stimulating Factor 2 Receptor,Beta，CSF2RB)基因或其蛋白的用途，其特征在于，用于制备预测或检测前列腺癌骨转移的试剂或试剂盒。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括CSF2RB的特异性引物、特异性抗体、探针和/或芯片。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测是测定组织样品。

4.一种CSF2RB抑制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗前列腺癌骨转移的药物组合物。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂包括：CSF2RB的抗体、CSF2RB核酸的反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA以及CSF2RB的活性抑制剂。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括CSF2RB抑制剂作为活性成分，和药学上可接受的载体。

7.一种体外非治疗性抑制前列腺癌迁移的方法，包括步骤：在CSF2RB抑制剂存在下，培养前列腺癌细胞，从而抑制前列腺癌细胞迁移。

8.一种筛选用于抑制前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的化合物的方法，其特征在于，包括步骤：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中包括步骤：向测试组前列腺癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察前列腺癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；向对照组前列腺癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察前列腺癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；其中，如果测试组中前列腺癌细胞的迁移距离或侵袭数量显著小于对照组，就表明该测试化合物是对前列腺癌骨转移前列腺癌细胞迁移有抑制作用的化合物。