CN110208550B - 一种与房颤射频消融术后复发风险相关的标志物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与房颤射频消融术后复发风险相关的标志物组合，属于医学分子生物学领域，所述标志物组合包括转化生长因子β1（TGF‑β1）、一型胶原羧基末端肽（ⅠCTP）、透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）和三型前胶原氨基末端肽（PIIIP N‑P）。本发明还公开了检测所述标志物组合的试剂在制备用于评估房颤射频消融术后复发风险的试剂盒中的应用。利用本发明，可以获得新的HATCH评分，能够用于有效评估房颤射频消融术后复发风险。
Description
技术领域
本发明属于医学分子生物学领域，具体地，涉及一种与房颤射频消融术后复发风险相关的标志物组合。
背景技术
心房颤动(auricular fibrillation)简称房颤(atrial fibrillation，AF)，是快速性心律失常最为常见的一种，其病因和发病机制至今尚未完全明确。
近年的数据分析显示，在所有因心律失常住院的患者中，房颤患者大约占30％，其发病率呈逐年上升趋势，且临床情况多较紧急，常严重影响患者的生活质量，甚至危及生命，有效的射频消融治疗可显著改善患者的症状及预后。随着射频消融治疗房颤的广泛应用，其复发率较高的问题也日渐引起临床医生及患者的关注。目前，HATCH评分对房颤消融术后的复发有一定的预测价值。HATCH评分标准(H高血压病1分、A年龄＞75岁1分、T短暂脑缺血或脑卒中2分、C慢性阻塞性肺疾病1分、H心力衰竭2分)，由此可见，要对患者进行HATCH评分，必须详细了解患者的详细病史，且带有一定的主观性，这给临床工作中带来不便，且费时费力。
发明内容
为了解决上述技术问题，发明人通过研究射频消融术对房颤患者纤维化标志物血清学水平的影响，从而探讨房颤术后复发的诊断指标，旨在建立新HATCH评分的评分参数模型，从而找到能预测房颤消融术后复发的客观指标。出乎意料地发现，TGF-β1、ⅠCTP、P IIIPN-P、HA、LN对预测房颤射频消融术后复发具有重要的临床价值，从而完成本发明。
本发明一方面提供一种与房颤射频消融术后复发风险相关的标志物组合，所述标志物组合包括转化生长因子β1(TGF-β1)、一型胶原羧基末端肽(ⅠCTP)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)和三型前胶原氨基末端肽(PIIIP N-P)。
本发明第二方面提供用于检测本发明第一方面所述标志物组合的试剂在制备用于评估房颤射频消融术后复发风险的试剂盒中的应用。
进一步地，所述用于试剂为抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述评估房颤射频消融术后复发风险的步骤如下：
获得对象的血清样本；
测定所述对象的血清样本中TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN和PIIIP N-P的水平；
利用所述TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN和PIIIP N-P的水平按照下面公式计算HATCH值：
HATCH＝0.026TGF-β1+0.013ⅠCTP-0.054HA-0.028LN-0.032PIIIPN-P-0.674
若HATCH值高于预定的临界值，则所述对象房颤射频消融术后复发风险高。
在本发明的一些具体实施方案中，利用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验测定TGF-β1和ⅠCTP的水平。
在本发明的一些具体实施方案中，利用HA抗原标记ABEI竞争结合透明质酸结合蛋白(HABP)标记FITC的方法测定HA的水平。
在本发明的一些具体实施方案中，利用针对LN的一株单克隆抗体标记ABEI，另一株单克隆抗体标记FITC的方法测定LN的水平。
在本发明的一些具体实施方案中，利用针对PIIIP N-P的一株单克隆抗体标记ABEI，另一株单克隆抗体标记FITC的方法测定PIIIP N-P的水平。
进一步地，所述预定的临界值是根据临床样本统计得到的，优选地，所述预定的临界值为2.0-3.0。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
利用本发明的标志物组合得到的HATCH评分，与按经典HATCH评分分值进行比较，以两组积分值的相关系数来度量效度评价指标，经Pearson相关分析分别得到未复发组相关系数r＝0.624(P＝0.032)和复发组相关系数r＝0.854(P＝0.016)；信度评价指标以组内相关系数度量，组内相关系数(ICC)＝0.783；由此可见，与房颤未复发组相比，该回归方程模型在房颤复发组中使用时，所计算出来的评分分值与使用经典方法计算的HATCH评分分值有较好的相关性。
本发明的标志物组合更加客观，摒弃主观因素，使得评估结果更加可靠。
附图说明
图1示出了TGF-β1标准曲线。
图2示出了ⅠCTP标准曲线。
图3示出了TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、PIIIP N-P的ROC曲线。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1
1研究对象
本实施例对象分类如下：共收集符合纳入标准的患者108例，作为病例组(房颤组)，对其行射频消融手术治疗，并根据其术后3个月内房颤是否复发，将病例组分为复发组和未复发组，其中复发组12例、未复发组96例；正常对照组100例。标本来源为住院病人和同期体检健康人群，收集于贵州省人民医院，时间跨度自2017年9月至2018年8月。在通过医院伦理委员会批准后开展本研究，并在患者知情同意的前提下签署知情同意书。
房颤患者由心电图检查或动态心电图检查确诊《内科学》(第8版)。高血压(Hypertension)定义符合2005年中国高血压防治指南制定的高血压诊断标准：收缩压≥140mm Hg(1mm Hg＝0.133kPa)和/或舒张压≥90mm Hg，以及曾确诊为高血压目前正在服用降压药物的高血压患者。短暂性脑缺血发作或脑卒中(Transient Ischemic Attack，TIA)的诊断依据2014年中国急性缺血性脑卒中诊治指南制定的短暂性脑缺血发作或脑卒中的诊断标准。慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)的诊断依据2013年慢性阻塞性肺疾病诊治中国指南制定的COPD的诊断标准：患者存在有吸烟、职业有害物质接触史等危险因素，有呼吸困难、慢性咳嗽、咳痰等临床表现，肺功能检查提示存在不可逆的气流受限(必不可少)，辅助检查排除其他肺部疾病后，可诊断。心力衰竭(HeartFailure,HF)的诊断依据《2018中国心力衰竭诊断和治疗指南》中心力衰竭的诊断标准。
1.1纳入标准
年龄和性别不限的成年人；复发组：通过电话或门诊对患者射频消融术后进行3个月的随访，并分别在术后1月、3月行心电图及动态心电图检查，或者患者出现胸闷、心悸、头晕、黑朦等可疑心律失常复发症状时立即行心电图检查，若患者在术后3个月内出现经心电图或动态心电图检测的快速性房性心律失常(心房扑动、心房颤动、房性心动过速)，且持续时间超过30s时，定义为房颤复发，归为复发组。未复发组：通过电话或门诊对患者射频消融术后进行3个月的随访，并分别在术后1月、3月行心电图及动态心电图检查，或者患者出现胸闷、心悸、头晕、黑朦等可疑心律失常复发症状时立即行心电图检查，患者在术后3个月内维持窦性心律者定义为房颤未复发，归为未复发组。正常对照组：同一地区同一时段的健康体检人员。
1.2排除标准
曾经被诊断为心律失常和目前正在服抗心律失常药的体检人员；合并心脑、肝肾疾病及急慢性其他疾病者。
2标本采集及处理
2.1对病例组在术前即刻采集静脉全血7mL及术后即刻采集全血5mL，将术前及术后的5mL全血分别注入两个洁净的采血管中，置于室温条件下自然凝固，并在30min内分离血清,分别平行分装于2支1.5mLEP管内，-20℃冰箱保存，用于集中检测术前及术后的TGF-β1、ⅠCTP、P IIIP N-P、HA、LN浓度；将术前其余的2mL全血注入乙二胺四乙酸钾(EDTA-K2)抗凝的试管内，并平行分装于2支1.5mL EP管中，-80℃冰箱保存，以备集中提取DNA和PCR扩增检测TGF-β1基因位点rs1800468和rs1800469的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)。
2.2正常对照组(卧位)在早晨采集空腹静脉全血7mL，5mL注入一支洁净的采血管内，待室温自然凝固后30分钟内分离血清,平行分装于2支1.5Ml EP管内，-20℃冰箱保存，用于集中检测TGF-β1、ⅠCTP、P IIIP N-P、HA、LN浓度；其余2mL注入乙二胺四乙酸钾(EDTA-K2)抗凝的试管内，并平行分装于2支1.5mL EP管中，-80℃冰箱保存，以备集中提取DNA和PCR扩增检测TGF-β1基因位点rs1800468和rs1800469的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)。
2.3利用问卷调查方式并结合患者病历资料收集所有研究对象的以下临床基线资料：姓名、性别、年龄、种族、吸烟史、饮酒史、左心房内径(Left Atrial Diameter，LAD)、左心室舒张末期内径(Left Ventricular End Diastolic Dimension，LVEDD)、左心室射血分数(Left Ventricular Ejection Fraction，LVEF)、心功能分级(New York HeartAssociation，NYHA)、脑钠肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)、C-反应蛋白(C-ReactiveProtein，CRP)、肌钙蛋白Ⅰ(Cardiac TroponinⅠ，cTnⅠ)、肌酸磷酸激酶同工酶(creatinekinase MB，CK-MB)、总手术时间(min)、造影剂用量(mL)。
3方法
3.1射频消融术
对符合纳入标准的108例房颤患者实施标准化的手术。病人平卧于C臂检查床上，连接CARTO3系统；局麻下穿刺锁骨下静脉、股静脉或股动脉，送猪尾导管至相应心血管腔，选择3D旋转模式后，触屏启动C臂旋转造影，同时注入造影剂，注射量15mL/s，总量60-90mL,设置C臂从起始位置右前斜位(RAO)50°、自动旋转到结束位置左前斜位(LAO)110°。造影结果传送到数字剪影系统的计算机软件工作站(Artis zeego，Germany)完成感兴趣心腔的实时3D重建，重建的3D图像自动融合到实时X线影像中，对消融导管的移动进行导航。用CARTO3系统将心内电生理信息与空间解剖结构结合起来，标测心动过速的起源和传导路径，发现折返激动的环路、缓慢传导区、关键峡部。明确房颤的机制与靶点后消融导管可在三维标测系统引导下到达拟定的消融部位。预设温度上限43℃，功率上限30-40W，释放射频电流，以17～20mL/min流速的冷生理盐水冲洗消融导管头端，逐点消融，集点成线或片状消融，每点消融时间约10～20s，使局部电位的振幅明显下降。消融的终点为消融经线完整，达到双向电传导阻滞，房颤被有效的终止且不能诱发。
3.2 HATCH评分计算
HATCH评分的评分标准：H(Hypertension)代表高血压记1分、A(Age)代表年龄＞75岁记1分、T(TIA)代表短暂性脑缺血或脑卒中记2分、C代表慢性阻塞性肺疾病(COPD)记1分、H代表心力衰竭(HF)记2分，评分范围为0～7分。对每位房颤患者记算上诉5项指标，得分总和即为该患者的HATCH评分。为了和本研究以数字模型建立的HATCH评分区分，将该HATCH评分命名为经典HATCH评分，而本研究建立的HATCH评分命名为新HATCH评分。
3.3利用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，ELISA)来测定TGF-β1和ⅠCTP的血清浓度。
3.3.1检测原理：在预先包被人TGF-β1或ⅠCTP捕获抗体的微孔中加入待测血清标本并温育，使加入的待测血清标本与微孔中的人TGF-β1或ⅠCTP捕获抗体发生抗原抗体反应，形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除未反应的游离成分；然后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体并温育，使固相抗原抗体复合物与酶标记抗体结合，形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物(双抗体夹心法)，洗涤除去游离酶标记抗体；加入辣根过氧化物酶底物TMB，TMB在辣根过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的人TGF-β1或ⅠCTP的浓度呈正相关；加入终止反应液，用酶标仪在450nm主波长，630nm副波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
3.3.2操作步骤
3.3.2.1在检测前做好以下准备：待检测样本准备：实验前1小时从低温冰箱中取出样本，室温条件下溶解，待其恢复至平室温后，充分混匀，切勿反复冻存，并对标本仔细核查并标记；试剂准备及平衡：实验前半个小时把试剂盒从从冰箱里取出，待其恢复至室温后，把所需板条从包装袋中取出，并用自封袋封住避光保存；仪器设备及常用耗材准备：将全自动酶标仪在使用前半个小时开启，运行仪器自检，完成后待机备用；将浓缩洗涤液(20×)用双蒸水稀释成所需比例的工作液(1：20)并装入洗板机中备用，先用双蒸水清洗洗板机管道，再用工作液冲洗洗板机管道，使洗液充满整个洗板机管道，待机备用。
3.3.2.2标记：用记号笔标记板条，设置空白孔、标准品孔和待测样本孔，为了降低误差，每板的每个标准品均设置两个孔。
3.3.2.3加样：用加样枪在将不同浓度的标准品50μl分别加入到对应的标准品孔中，将待测样本50μl分别加入对应的样品孔中，注意样本应加在酶标板底部，枪头尽量不要触及孔壁，注意不要有气泡形成，避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
3.3.2.4加酶标记物：将辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100ul分别加入除空白孔外的标准品空和样本孔中并混匀。
3.3.2.5孵育：用封板膜封住板条反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60分钟。
3.3.2.6洗板：设置洗板机洗板参数，在上洗板机前最好先将板条中的反应液在吸水纸上用力拍干，再用洗板机洗涤，洗涤完后再用吸水纸拍干，如此重复洗板5次(也可手动洗板)。
3.3.2.7显色：将底物A、B各50μl分别加入每个孔中并振荡混匀，37℃避光孵育15min后，各孔颜色变为蓝色。
3.3.2.8终止反应：每孔加入50μl终止液，用振荡器混匀，终止反应,此时各孔颜色立即由蓝色变为黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
3.3.2.9比色：将酶标仪的主波长设为450nm，副波长设为630nm进行比色，并记录各样本相应的光密度(OD值)，并且应在终止液加入后15min内完成比色，否则测定结果将受影响。
3.3.3绘制标准曲线
由于每个标准品设置的都是两个孔，因此取两个测量值的平均值作为该标准品的OD值(见表1)，TGF-β1和ⅠCTP的标准品浓度及相应的光密度平均值见表1及表2；分别以TGF-β1、ⅠCTP光密度值(OD)为横坐标，分别以TGF-β1标准品浓度(pg/mL)和ⅠCTP标准品浓度(ng/mL)为纵坐标制作标准曲线(见图1和图2)，TGF-β1标准曲线回归方程：Y＝113.66X－5.8709，ⅠCTP标准曲线回归方程：Y＝471.27X+9.7397。
表1 TGF-β1标准品浓度及相应光密度值
表2 ⅠCTP标准品浓度及相应光密度值
3.4化学发光免疫夹心法检测HA、LN和P IIIP N-P浓度。
3.4.1检测原理
3.4.1.1 HA检测原理：采用HA抗原标记ABEI(含牛血清蛋白，0.2％NaN3)，透明质酸结合蛋白(HABP)标记FITC。以磁性微球对样本、校准品与FITC标记的透明质酸结合蛋白(HABP)、ABEI标记的抗原及包被羊抗FITC抗体进行混匀，待测抗原与ABEI标记的抗原竞争结合FITC标记透明质酸结合蛋白(HABP)，形成免疫复合物，外加磁场沉淀，去掉上清液，将沉淀复合物用洗液清洗3次后直接进入样本检测室，仪器自动泵入化学发光激发物1和2并进行自动检测。HA浓度与RLU成一定的比例关系，测定仪自动拟合计算HA浓度。
3.4.1.2 LN和P IIIP N-P检测原理：采用针对LN或P IIIP N-P的一株单克隆抗体标记ABEI，另一株单克隆抗体标记FITC。以磁性微球技术对样本、校准品与FITC标记的单克隆抗体、ABEI标记的单克隆抗体进行混匀，形成抗原抗体复合物，用洗液清洗沉淀复合物3次，直接进入样本测量室，仪器自动泵入化学发光激发物1和2并自动检测。LN或P IIIP N-P浓度与RLU成一定的比例关系，测定仪自动拟合计算LN或P IIIP N-P浓度。
3.4.2操作步骤
3.4.2.1检测前准备：待检标本及试剂准备：实验前将待测标本及试剂平衡至室温，待标本融化后用吸管小心吸出标本里面的凝块，以免堵塞仪器加样针。仪器及常用耗材准备：检查生化分析仪所处房间的温度是否在20℃以上，温度改变是否在5℃以内，过低的室温、过大的室温变化会影响光电倍增管对光信号的准确接收，从而影响测定结果；加样器、分配器使用前一定要调准刻度，以防加样分配不准；固定混匀器的转数不变，混匀时间设为30秒；校准水浴设备的温度；检查生化分析仪内化学发光激发物、工作洗液、反应杯是否充足，废物收集袋和废液桶是否已清空，打印机纸是否够用。
3.4.2.2操作步骤：采用化学发光免疫夹心法检测，仪器为美康生化分析仪MS-480，试剂盒为美康生物科技有限公司配套血清透明质酸(HA)检测试剂盒、层粘连蛋白(LN)检测试剂盒、三型前胶原N端肽P IIIP N-P检测试剂盒(化学发光法)，操作按试剂盒说明书进行。
4数据处理及统计学分析
采用SPSS22.0(IBM版)用软件进行统计学分析，用正态性检验和方差齐性Levene检验对所有连续计量资料进行检验，用平均值±标准差
来表示符合正态分布的计量资料，用两组独立样本的t检验对符合正态分布的计量资料进行比较，用卡方检验(chisquare test)来比较分类或计数资料。单因素方差分析中两两比较采用最小显著差异检验法(LSD检验)，符合正态分布但方差不齐变量的两两比较采用DunettT3法，用Kruskal-Wallis秩和检验来比较非正态资料检验；分析各变量因素与房颤的相关性时采用多重Logistic逐步回归分析，构建HATCH评分参数模型；采用线性相关表述来分析两连续变量相关性，相关性以Pearson相关系数(r)来描述；分别制作房颤相关危险因子的ROC曲线，计算敏感度、特异度和临界值。
5结果
5.1正常对照组与房颤组术前TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P及一般临床基线资料比较
正常对照组与房颤组在年龄、性别、吸烟、饮酒及术前HA、LN、P IIIP N-P水平上无统计学差异(P>0.05)；在房颤组术前TGF-β1和ⅠCTP水平上，两组间有统计学差异(P＜0.05)，且这两个指标在房颤患者中血清学浓度的平均值均远高于正常对照组，具体结果见表3。
表3正常对照组和房颤组术前TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P及一般临床资料比较
5.2房颤组术前及术后TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P比较
房颤组射频消融手术前及手术后在HA、LN、P IIIP N-P水平上无统计学差异(P>0.05)，在TGF-β1、ⅠCTP水平上有统计学差异(P＜0.05)，且术后TGF-β1的平均水平高于术前，而术后ⅠCTP的水平低于术前，具体结果见表4。
表4房颤组术前及术后TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P及一般临床资料比较
5.3房颤复发组与未复发组两组术前TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P及一般临床基线资料比较
根据房颤患者在射频消融术后房颤是否复发，将其分为房颤未复发组(96例)和复发组(12例)；从下表可知，房颤复发组与未复发组在性别、吸烟、饮酒、LVEF、CK-MB水平上无统计学差异(P>0.05)，在年龄、总手术时间、造影剂用量、LAD、LVEDD、BNP、cTn I、CRP及术前TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P、HATCH评分水平上有统计学差异(p<0.05)，具体结果见表5。
表5房颤未复发组和复发组术前TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P及一般临床资料比较
5.4房颤未复发组术前及术后TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P比较
房颤未复发组术前及术后的TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P水平上均无统计学差异(P>0.05)，具体结果见表6。
表6房颤未复发组术前及术后TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P比较
5.5房颤复发组术前及术后TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P比较
房颤复发组术前及术后的ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P水平上无统计学差异(P>0.05)；在TGF-β1水平上有统计学差异(p<0.05)，具体结果见表7。
表7房颤复发组术前及术后TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P比较
5.6房颤的二元Logistic回归分析
以是否患病为因变量(y)，以房颤组和对照组的各种危险因素为自变量(x)进行二元Logistic回归分析，将正常对照组与房颤组比较中P<0.1的相关指标纳入回归方程，其中共纳入11个指标，用来衡量导致房颤的危险因素和保护因子，各变量的赋值方法及含义见(表8)。对纳入的11个房颤可能的危险因素进行二元Logistic回归分析见(表9)，用OR值及95％CI表示关联程度，以α＝0.05的水准判定影响因子，筛出9个相关因子分别是TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、P IIIP N-P、年龄、rs1800468、rs1800469。
表8变量的含义及赋值方法
表9房颤病的二元Logstic回归分析
注：B：偏回归系数，SE：偏回归系数标准误，Wald：Wald卡方统计量，Sig：P值，OR：比数比。
由上表9分析结果可得知，房颤患病的相关因素中，年龄、TGF-β1、ⅠCTP是房颤患病的危险因子，HA、LN、P IIIP N-P是房颤的保护性因子；TGF-β1基因的rs1800468和rs1800469两个位点的多态性是房颤的易感因素。
5.7 TGF-β1与ⅠCTP、HA、LN、PIIIP N-P、HATCH评分的相关性分析
将以上连续型变量进行线性相关性分析，用相关性以Pearson相关系数(r)来描述，其数值为-1<r<1，r值为正数时表示正相关，为负数时表示负相关，r的绝对值越接近1则表示关联越密切。分析结果显示，TGF-β1与ⅠCTP相关，r＝0.501，P＝0.012；TGF-β1与HA相关，r＝-0.469，P＝0.024；TGF-β1与LN相关，r＝-0.414，P＝0.031；TGF-β1与PIIIP N-P相关，r＝-0.403，P＝0.034；TGF-β1与HATCH评分相关，r＝0.779，P＝0.000。
5.8 TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、PIIIP N-P对房颤病的诊断价值分析
绘制TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、PIIIP N-P对房颤病的受试者工作曲线(receivedoperation of curve，ROC)，并计算曲线下面积(area under of curve，AUC)、95％CI、P值。ROC曲线见图3，诊断指标祥见表10。为了直观地鉴别各标志物对房颤诊断价值的优劣，将各血清标志物的ROC曲线绘制到同一坐标中，其中以靠近左上角的ROC曲线所代表的受试者工作最准确。另外，也可分别计算ROC曲线下面积来比较诊断价值，曲线下面积越大，则该项试验对该病的诊断价值越佳。值得注意的是，ROC曲线下的面积在1.0和0.5之间，在AUC＞0.5时，曲线下面积越接近1，则表明对疾病的诊断效果越好；AUC在0.5～0.7时，对疾病的诊断有一定的准确性，AUC在0.9以上时，对疾病诊断的准确性较高；如果曲线下面积为0.5时，则表明该诊断方法对该病并没有诊断价值。
表10 TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、PIIIP N-P的诊断指标
5.9 HATCH评分的多重线性回归模型
5.8.1建立HATCH评分的多重线性回归模型
以房颤HATCH评分为因变量，以TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN、PIIIP N-P为自变量建立多重线性回归模型，方程的相关参数见(表11)，以多重线性回归方程检验(F＝18.458,P＝0.000)和偏回归系数假设检验(F＝12.875,P＝0.008)后，建立回归方程：HATCH评分＝0.026TGF-β1+0.013ⅠCTP-0.054HA-0.028LN-0.032PIIIP N-P-0.674。
表11多重线性回归模型参数及检验结果1
注：B偏回归系数，SE：非标准化偏回归系数标准误，SB：标准化偏回归系数，Sig：P值。
95％CI：偏回归系数95％可信区间
5.9.2验证新HATCH评分
为了验证所建立的回归方程模型在计算HATCH评分时的信度和效度，从房颤组随机抽取15例患者，其中房颤复发组抽取5例，未复发组抽取10例，将所抽取样本的TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN和PIIIP N-P血清水平值代入所建立的回归方程模型：HATCH评分＝0.026TGF-β1+0.013ⅠCTP-0.054HA-0.028LN-0.032PIIIP N-P-0.674。按该方程模型计算HATCH评分分值，将测算的HATCH评分分值与按经典HATCH评分分值进行比较，以此来检验该回归模型计算HATCH评分的效度和信度，以两组积分值的相关系数来度量效度评价指标，经Pearson相关分析分别得到未复发组相关系数r＝0.624(P＝0.032)和复发组相关系数r＝0.854(P＝0.016)；信度评价指标以组内相关系数度量，组内相关系数(ICC)＝0.783；由此可见，与房颤未复发组相比，该回归方程模型在房颤复发组中使用时，所计算出来的评分分值与使用经典方法计算的HATCH评分分值有较好的相关性，见表12。
表12多重线性回归模型信度和效度的检验
因此，新HATCH评分可用来评估房颤射频消融术后的复发。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.用于检测标志物组合的试剂在制备用于评估房颤射频消融术后复发风险的试剂盒中的应用，其中，所述标志物组合包括转化生长因子β1TGF-β1、一型胶原羧基末端肽ⅠCTP、透明质酸HA、层粘连蛋白LN和三型前胶原氨基末端肽PIIIP N-P，所述试剂为抗体，所述评估房颤射频消融术后复发风险的步骤如下：
获得对象的血清样本；
测定所述对象的血清样本中TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN和PIIIP N-P的水平；
利用所述TGF-β1、ⅠCTP、HA、LN和PIIIP N-P的水平按照下面公式计算HATCH值：
HATCH=0.026TGF-β1+0.013ⅠCTP-0.054HA-0.028LN-0.032PIIIP N-P-0.674
若HATCH值高于预定的临界值，则所述对象房颤射频消融术后复发风险高。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验测定TGF-β1和ⅠCTP的水平。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用HA抗原标记ABEI，透明质酸结合蛋白HABP标记FITC的方法测定HA的水平。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用针对LN的一株单克隆抗体标记ABEI，另一株单克隆抗体标记FITC的方法测定LN的水平。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用针对PIIIP N-P的一株单克隆抗体标记ABEI，另一株单克隆抗体标记FITC的方法测定PIIIP N-P的水平。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预定的临界值是根据临床样本统计得到的。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述预定的临界值为0.854。
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