JP4619125B2 - ｉｎｖｉｔｒｏで乳がんを診断するためのＮＧＦアッセイの方法及び治療におけるその使用 - Google Patents

Description

本発明はがん腫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、人間の患者から採取した生物試料中の神経増殖因子（ＮＧＦ）の存在を調べることによる、人間の患者における乳がんの診断方法に関する。この方法は、乳がんの初期診断、スクリーニング、追跡治療及び予後診断並びに再発診断のいずれにも使用できる。また、乳がん細胞がＮＧＦ産生能力を有することから、本発明は治療にも関する。

産業国のがんによる死亡の主要な原因は、女性では乳がんである。乳房撮影で検出できる腫瘍の大きさは最小１ｃｍであると推測される。乳がんの進行は遅く、診断される際にはこのように小さな腫瘍でも平均して８年間経過している。乳がんの病因は十分に解明されていないが、家族性であるということが実証されている。最も大きな危険因子は年齢であり、そのリスクは西洋各国において年齢１歳につき０．５％ずつ増加する。その他にも、妊娠回数及び最初に妊娠した年齢、授乳、思春期及び閉経の年齢、閉経後のエストロゲン治療、ストレス、並びに、栄養等の危険因子が知られている。

乳がんのマススクリーニングにおいて有効に使用されている試験は、画像技術、すなわち乳房撮影である。この技術によって乳がんによる死亡が大幅に減少（死亡率が３０％減少）したが、このことから、公衆衛生において腫瘍スクリーニングが重要であることが分かる。しかし、スクリーニング法はあまり有利ではない。というのは、乳房撮影には高性能の器具及び資格が必要となるが、マススクリーニングを実施する際には費用がかかるからである。

実際の臨床において、悪性腫瘍の特徴づけは、発見後に組織学的手法により専門的な研究所で実施される。腫瘍の大きさ、組織病状の進行度、及び、リンパの侵入による炎症等の一連のパラメーターによって、治療の決断、及び、疾患の予後の見通しがなされる。

乳がんについて腫瘍細胞と正常細胞との識別を可能にするマーカーが、何年も探索・研究されてきた。上記マーカーを用いることによって、乳がんの早期診断、その予後及びその治療感受性の確立、並びに、その進行の観察が可能になるであろう。現在のところ確認及び研究されている上記マーカーとしては、腫瘍遺伝子、組織マーカー、及び、腫瘍の血管形成又は転移能力に関与するマーカーが挙げられる。確認された乳がんマーカーは現在、主として追跡治療に使用されている。生物試験の中では、乳がんを初期診断又はスクリーニングできると実証されたものはない。唯一、腫瘍組織におけるエストロゲン受容体の検出によってのみ、その腫瘍がホルモン感受性か否かを調べることができる。

乳房がん細胞において同定されている抗原マーカーは少ないが、具体的にはＣＡ１５−３（非特許文献１）がある。このマーカーは通常業務において患者を追跡治療するために、特に再発を発見するために使用されているが、感受性が低いためスクリーニング又は診断試験においては推奨されていない。

乳がんに関与する抗原の研究目的は数年前から、マーカーの探索ではなく免疫療法のターゲットの探索になっている。このような研究としてはＴ／Ｔｎ抗原に対する体液性免疫が証明されており（非特許文献２）、最近では、ｐ５３（非特許文献３）及びＨＥＲ−２／ｎｅｕ（非特許文献４）に対する抗体及びＴ細胞の応答が発見された。

また、最近になって、抗原である可能性のある一連の新規物質が、ＳＥＲＥＸ（血清を用いた発現クローニング）法により、腫瘍細胞ｃＤＮＡライブラリーの構築及び自己由来の血清を使用したスクリーニングに基づいて実証されている。このようにして、血清学的乳がんライブラリーのスクリーニングによって、ＩＮＧ１抗原の実証（非特許文献５）、続いて、乳がんの８０％に発現（筆者らによる）していて患者のＩｇＧ抗体産生を誘導する新規の分化抗原ＮＹ−ＢＲ−１（非特許文献６）が実証できた。この種の方法は、ワクチン開発で使用できる可能性のあるターゲットの探索に主として使用されているが、正常組織中に存在する抗原（ＮＹ−ＢＲ−１の場合）、及び、ほとんどの患者の血清（ＩＮＧ１の場合、２／１４の割合）が認識しない抗原も感知すると推測される。従って、スクリーニング又は初期診断法には利用できない。この方法を使用することによって、患者の体液性免疫反応を誘導する抗原として上記以外にＮＹ−ＢＲ−６２、ＮＹ−ＢＲ−８５及びＤ５２タンパク質等が注目されている。これらの抗原はそれぞれ、乳がんの６０％、９０％及び６０％で過剰発現していると考えられている（非特許文献７）。

乳がんを進行させる分子の現象としては、腫瘍遺伝子（ｒａｓ等）及び腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３等）の構造及び発現の変化が含まれる。乳がんにおける腫瘍細胞の増殖は通常、エストロゲン性ホルモン（エストラジオール及びプロゲステロン）、並びに、増殖、転移及びアポトーシスを制御する増殖因子によって変わる。これらの増殖因子は腫瘍細胞の増殖、転移及び分化を一斉に刺激又は阻害して、がんの増殖及び転移に有利に作用する。例えば、インシュリン型増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）はいずれも乳がん細胞の増殖を刺激できるが、乳房由来の増殖因子阻害剤（ＭＤＧＩ）及びトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）はその増殖を阻害する。

Ｓ．Ｄｅｓｃａｍｐｓらは、神経栄養因子として最初に発見された増殖因子ＮＧＦ（外因性ＮＧＦ）について、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養細胞株に添加されると、乳がん細胞の生存及び増殖の両方を活性化する可能性があることを実証した（非特許文献８及び９）。

ＮＧＦは最初は末梢ニューロンの生存及び分化の両方を刺激する能力があるとして単離され、後に、神経栄養性ポリペプチドファミリーの原型的な因子となった（非特許文献１０）。ＮＧＦの主要な生物学的機能は有系分裂後のニューロンの保持及び生存であり、ＮＧＦはこの機能を有することから神経変性疾患の治療に使用できる可能性が高い。ＮＧＦは神経細胞の成長及び保持において作用するだけでなく、非神経細胞に対しても著しい効果を有する。この例として、例えば、ＮＧＦはＢリンパ細胞に対する自己分泌生存因子である（非特許文献１１）。

ＮＧＦは、二種の膜受容体（本質的にチロシンキナーゼ活性を有する癌原遺伝子ＴｒｋＡの産物であるｐ１４０^ｔｒｋＡ、及び、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーに属する第二の受容体ｐ７５^ＮＴＲ）と相互作用することによって細胞内シグナルを産生する。乳がん細胞において、ＮＧＦは二つの異なるシグナル経路を活性化する。有糸分裂の促進には受容体ｐ１４０^ｔｒｋＡ及びＭＡＰキナーゼカスケードが必要であり、抗アポトーシス効果は受容体ｐ７５^ＮＴＲ及びＮＦ−κＢ因子の下流の活性化によって変わる（非特許文献９）。従って、乳がん診断について記載する著者の中には、その目的をＮＧＦ受容体の感知に変更した例もある。その例としては、例えば、受容体ｐ７５の定量によって患者の前がん状態又はがん状態を診断する方法について記載した特許文献１等がある。

また、ＮＧＦは乳がん細胞に対して非常に大きな生物学的影響を及ぼすため、乳腺におけるＮＧＦの分布及びその起源についても問題になってくる。一般的に、ＮＧＦは、交感神経及び知覚神経の神経支配のターゲットによって産生されると考えられているが、血流中では確認されていない（非特許文献１２）。

本明細書中において、本出願人らは予想外にも、正常な乳房上皮細胞はＮＧＦを全く産生しないのに対して、対応する乳がん細胞は自らＮＧＦを産生しており、従って、腫瘍マーカーとして又は治療におけるターゲットとしてＮＧＦを使用できることを実証した。
ＷＯ９４／０６９３５ Ｂａｓｕｙａｕ，Ｊ．Ｐ．，Ｍ．Ｐ．Ｂｌａｎｃ−Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｊ．Ｍ．Ｂｉｄａｒｔ，Ａ．Ｄａｖｅｒ，Ｌ．Ｄｅｎｅｕｘ，Ｎ．Ｅｃｈｅ，Ｇ．Ｇｏｒｙ−Ｄｅｌａｂａｅｒｅ，Ｍ．Ｆ．Ｐｉｃｈｏｎ及びＪ．Ｍ．Ｒｉｅｄｉｎｇｅｒ．２０００．［乳がんにおける腫瘍マーカーについての基準，選択及び提案（ＳＯＲ）．ＳＯＲ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ］．Ｂｕｌｌ Ｃａｎｃｅｒ．８７：７２３−３７ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｆ．１９９７．Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ａｎｄ Ｔｎ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．ＪＭｏｌ Ｍｅｄ．７５：５９４−６０４ Ｇｎｊａｔｉｃ，Ｓ．，Ｚ．Ｃａｉ，Ｍ．Ｖｉｇｕｉｅｒ，Ｓ．Ｃｈｏｕａｉｂ，Ｊ．Ｇ．Ｇｕｉｌｌｅｔ及びＪ．Ｃｈｏｐｐｉｎ．１９９８．Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５３ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｌｏｗｓ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ＣＴＬ ｏｆ ａ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｐ５３ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３２８−３３ Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．及びＭ．Ａ．Ｃｈｅｅｖｅｒ．１９９７．ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ｐｒｏｔｅｉｎ：ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１：３４３−７１ Ｊａｇｅｒ，Ｄ．，Ｅ．Ｓｔｏｃｋｅｒｔ，Ｍ．Ｊ．Ｓｃａｎｌａｎ，Ａ．Ｏ．Ｇｕｒｅ，Ｅ．Ｊａｇｅｒ，Ａ．Ｋｎｕｔｈ，Ｌ．Ｊ．Ｏｌｄ及びＹ．Ｔ．Ｃｈｅｎ．１９９９．Ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ＩＮＧ１ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｒｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＮＧ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ａｎｄ ａ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｇｅｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：６１９７−２０４ Ｊａｇｅｒ，Ｄ．，Ｅ．Ｓｔｏｃｋｅｒｔ，Ａ．Ｏ．Ｇｕｒｅ，Ｍ．Ｊ．Ｓｃａｎｌａｎ，Ｊ．Ｋａｒｂａｃｈ，Ｅ．Ｊａｇｅｒ，Ａ．Ｋｎｕｔｈ，Ｌ．Ｈ．Ｏｌｄ及びＹ．Ｔ．Ｃｈｅｎ．２００１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：２０５５−６１ Ｓｃａｎｌａｎ，Ｍ．Ｊ．及びＤ．Ｊａｇｅｒ．２００１．Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３：９５−８ Ｓ．Ｄｅｓｃａｍｐｓら，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（２７），１６６５９−１６６６２ Ｓ．Ｄｅｓｃａｍｐｓら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（２１），１７８６４−１７８７０ Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２３７，１１５４−１１６２ Ｔｏｒｃｉａ，Ｍ．ら，１９９６，Ｃｅｌｌ，８５，３４５−３５６ Ｂｏｎｉｎｉ，Ｓ．ら；１９９６，Ｐｒｏｃ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１０９５５−１０９６０

従って、本発明の第一の主題は、乳がんの疑いのある患者から採取した生物試料中のＮＧＦの存在の決定による乳がんの診断方法である。

従って、本発明の方法によれば、患者から採取した生物試料中でＮＧＦの存在を探索することからなる簡潔な試験によって、乳がんを診断できる。以下に更に詳細に示すように、本出願人らは予想外にも、非がん細胞はＮＧＦを産生できないのに対し、対応するがん細胞はＮＧＦを産生することを示した。従って、試料中にＮＧＦが存在すると決定できれば乳がんであると結論づけることができ、ＮＧＦが存在しないと決定できれば乳がんでないと結論づけることができる。

「ＮＧＦの存在の決定」という表現は、ＮＧＦの直接検出、又は、ＮＧＦ感受性細胞の培養、又は、生物試料中のＮＧＦｍＲＮＡの検出、又は、上記以外の、試料中のタンパク質の存在を決定するための当業者に公知の任意の方法を意味することを意図する。

ＮＧＦの直接検出によるＮＧＦの存在の決定は、本発明の特定の実施形態を構成する。

「ＮＧＦの直接検出」という表現は、生物試料中にＮＧＦそのものが存在すると立証することを意味することを意図する。

生物試料中のＮＧＦの直接検出は、当業者に公知の任意の方法によって、例えばイムノアッセイ又は質量分析によって実施でき、本発明の特定の実施形態を構成する。

イムノアッセイは、免疫反応（すなわち、ＮＧＦと特異的ＮＧＦ結合パートナーとの反応）を含む当業者に広く知られる任意のアッセイであってよい。

特異的ＮＧＦ結合パートナーは、ＮＧＦに結合できる任意のパートナーである。例として、ＮＧＦに結合できる抗体、抗体断片、受容体及び他の任意のタンパク質を挙げることができる。

結合パートナーである抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかである。

ポリクローナル抗体の取得は、ＮＧＦで動物を免疫した後その動物の血清を採取して、（特に、所望の抗体によって特異的に認識される抗原（特にＮＧＦ）を付着させたカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって）所望の抗体を他の血清成分から分離して、純粋な所望の抗体を回収することによって実施できる。

モノクローナル抗体の取得はハイブリドーマ法によって実施でき、その一般的な原理は以下に記載する。

まず動物、一般的にはマウス（又は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫する場合は培養細胞）をＮＧＦで免疫する。これにより、上記動物のＢリンパ球が上記抗原に対する抗体を産生できる。次に、このような抗体産生リンパ球を「不死」骨髄腫細胞（例示におけるマウス細胞）と融合させ、ハイブリドーマを作成する。そして、こうして得られた異種細胞混合物から、特異的な抗体を産生でき、かつ、無限に増殖できる細胞を選択する。その後、ハイブリドーマをそれぞれクローンとして複製し、それぞれにモノクローナル抗体を産生させる。所望の腫瘍抗原に対するこの抗体の認識特性は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、一次元若しくは二次元イムノブロットによって、免疫蛍光法によって、又は、バイオセンサーの使用によって試験してもよい。その後、こうして選択したモノクローナル抗体を（特に上述のアフィニティークロマトグラフィー法によって）精製する。

抗ＮＧＦ抗体の例は（特にＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社カタログ又はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ社カタログにおいて）公知で、入手できる。

検出剤として結合パートナーを用いて生物試料中のＮＧＦを直接検出する際に特異的ＮＧＦ結合パートナーを標識できれば、ＮＧＦ／結合パートナーの結合を明らかにできる。

「結合パートナーの標識」という表現は、検出可能なシグナルを直接又は間接的に発することができる標識を付着させることを意味することを意図する。このような標識の例としては、
−例えば比色定量、蛍光又は発光によって検出可能なシグナルを発する、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、α−ガラクトシダーゼ又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素、
−蛍光、発光又は染料の化合物等の発色団、
−^３２Ｐ、^３５Ｓ又は^１２５Ｉ等の放射性物質、及び、
−アレクサ（ａｌｅｘａ）又はフィコシアニン等の蛍光性物質
を挙げることができるが、これらに限定されない。

また、例えば抗リガンドと反応できるリガンド等の間接的な機構も使用できる。リガンド／抗リガンドの対は当業者に公知であり、例えば、ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、及び、ポリヌクレオチド／このポリヌクレオチドに相補的な配列等の対が挙げられる。この場合、結合部を有するのはリガンドである。抗リガンドは、上述の標識によって直接検出できる可能性がある、又は、リガンド／抗リガンドによって検出できる可能性がある。

これらの間接的な検出機構においては、特定の条件下でシグナルを増幅する。このシグナルの増幅方法は当業者に公知であり、本出願人による先のフランス特許出願ＦＲ９８／１００８４若しくはＷＯ−Ａ−９５／０８０００、又は、文献Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．（４５：４８１−４９１，１９９７年）を参照することができる。

使用するコンジュゲートの標識の型次第では、標識を視覚化するために当業者は試薬を添加できる。

上記のイムノアッセイの例としては、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＭＡ及びＲＩＡ等の「サンドイッチ法」、「競合」法、並びに、免疫組織化学、免疫細胞化学、ウェスタンブロッティング及びドットブロッティング等の直接免疫検出法を挙げることができる。

また、生物試料中のＮＧＦを直接検出する際に質量分析を使用することもできる。分光測定法の原理は当業者に広く知られており、例えば、Ｓ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，２０００，Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２，５９−６５）中に記載されている。

この方法の実施においては、（前処理済み又は未前処理のいずれであってもよい）生物試料を質量分析計で調べて、得られたスペクトルをＮＧＦのスペクトルと比較する。試料の前処理の例としては、ＮＧＦ結合パートナーの一種（例えばＮＧＦに対する抗体）を含む免疫捕獲担体の上を通過させることからなる処理を挙げることができる。

ＮＧＦを直接検出するために使用する生物試料は、ＮＧＦをそのままの状態で含むことが多く、また、体液、又は、対象患者の腫瘍若しくは転移部の生検に由来する組織からなるものであってよい。

体液としては、血液、骨髄、乳、脳脊髄液、尿及び滲出液からなるものが挙げられる。

ＮＧＦの検出については、本発明の特定の実施形態を構成する体液は特定の処理を要する可能性がある。特に、体液は、ＮＧＦをそのままの状態で含む可能性がある、又は、ＮＧＦを含む循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ）を含む可能性がある、かつ、恐らくは、ＮＧＦを分泌できる循環腫瘍細胞を含む可能性がある。

従って、本発明のある実施形態によれば、体液を前処理して、上記体液中に含まれている循環腫瘍細胞を分離する。

「循環腫瘍細胞を分離する」という表現は、循環腫瘍細胞を豊富に含む細胞分画を得ることを意味することを意図する。

循環腫瘍細胞を分離するための上記体液の処理は、フローサイトメーター中での細胞の選別によって、又は、フィコール上での濃縮によって、又は、特異的な抗体で覆った磁気ビーズを使用した濃縮によって、又は、上記以外の当業者に公知の特定の濃縮方法によって実施できる。

体液として血液又は骨髄を使用する場合、循環腫瘍細胞の分離は、フィコール上での細胞分離と磁気ビーズに結合させた抗ＣＤ４５抗体（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＳＡ社、ノルウェー）を使用した血球の減少とを組み合わせた技術によって実施できる。

ＮＧＦの直接検出は、上記工程の後に、体液から分離した循環腫瘍細胞を使用して、例えばサイトスピンを使用してスライドグラス上に循環腫瘍細胞を配置した後でこの細胞を抗ＮＧＦ抗体で免疫細胞化学的に標識することによって、直接実施できる。また、ＮＧＦの直接検出は、循環腫瘍細胞中でＬａ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｅ ｅｎ ｆｌｕｘ ｐｏｕｒ ｌ’ｅｔｕｄｅ ｄｅ ｌａ ｃｅｌｌｕｌｅ ｎｏｒｍａｌｅ ｏｕ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｑｕｅ［Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｎｏｒｍａｌ ｏｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ］（Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ）（Ｍｅｔｅｚｅａｕ Ｐ，Ｒｏｎｏｔ Ｘ，Ｌｅ Ｎｏａｎ−Ｍｅｒｄｒｉｇｎａｃ Ｇ，Ｒａｔｉｎａｕｄ ＭＨ）（Ｍｅｄｓｉ−ＭａｃＧｒａｗｈｉｌｌ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載のフローサイトメトリー法を使用することによっても直接実施できる。

上記条件下において、上記循環細胞内部のＮＧＦを阻害した状態で上記循環細胞の処理を実施できる。この処理については、例えば、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ｐｐ１−２１，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中に記載されている。

その後、特異的ＮＧＦ結合パートナーが入れるように細胞膜を透過可能にした後でＮＧＦを検出する。

循環細胞を使用したＮＧＦの直接検出は、本出願人らのうちの一人が出願した特許出願ＷＯ０３／０７６９４２に記載の方法によっても実施できる。

また、腫瘍細胞中のＮＧＦの直接検出は、上記細胞を培養してＮＧＦを分泌させた後の上記細胞の培地中でも実施できる。

上記培養の条件は、３７℃、高湿度かつ５％ＣＯ_２という従来の条件である。

試験する生物試料が患者の腫瘍又は転移部の生検に由来する組織である場合、これは本発明の特定の実施形態を構成しており、ＮＧＦの直接検出は上記組織を前処理せずに得た切片について直接実施する。

ＮＧＦの存在を検出する別の方法は、ＮＧＦに感受性のある細胞を生物試料の存在下で培養することからなる方法であり、これは本発明の特定の実施形態を構成する。

この場合、生物試料中のＮＧＦの存在の検出は、ＮＧＦに感受性のある細胞の反応によって実証される。

「ＮＧＦに感受性のある細胞」という用語は、ＮＧＦの存在下で（増殖、アポトーシス等が）刺激される任意の細胞を意味することを意図する。

ＮＧＦに感受性のある細胞の例としては、ＰＣ１２クロム親和性細胞腫細胞（Ｈｏｎｄｅｒｍａｒｃｋ Ｈ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：９３７７−８１）及びニューロン由来の胚細胞（Ｈａｔｔｏｒｉ Ａ．ら，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２５７７−２５８２）を挙げることができる。

ＮＧＦに感受性のある細胞を培養してＮＧＦの存在を検出するために使用できる生物試料は、上記の任意の試料であってよい。

従って、生物試料は、上述するように、適切に前処理して循環腫瘍細胞を分離し、その後、培養してＮＧＦが分泌された体液からなるものであってよい。

生物試料中のＮＧＦの存在を検出する別の方法は、上記試料中のＮＧＦｍＲＮＡの検出からなり、これは本発明の別の実施形態を構成する。

液体試料中のｍＲＮＡの検出は、当業者に広く公知である。

上記液体試料中のｍＲＮＡの検出は、例えば、ターゲットｍＲＮＡとこのターゲットｍＲＮＡと結合できる核酸との間のハイブリダイゼーション反応によって実施できる。

「核酸」という用語は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸及びリボ核酸、並びに、それらの誘導体を意味することを意図する。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドと適切なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズできる、天然の又は改変された少なくとも２つのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はその両方）からなる鎖を意味する。「改変されたヌクレオチド」という用語は、例えば、改変された塩基を含むヌクレオチド、並びに／又は、ヌクレオチド間の結合における改変及び／若しくはバックボーンにおける改変を含むヌクレオチドを意味することを意図する。改変された塩基の例としては、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン及びブロモ−５−デオキシウリジンを挙げることができる。改変されたヌクレオチド間の結合の例としては、チオリン酸、Ｎ−アルキルリン酸アミド（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、アルキルホスホネート（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）及びアルキルホスホジエステル結合を挙げることができる。フランス特許ＦＲ−Ａ−２６０７５０７等に記載されるα−オリゴヌクレオチド、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，第８巻，Ｉｓｓｕｅ １６，１９９８年８月１８日，２２１９〜２２２２頁に記載されるチオリン酸−ＬＮＡ及び２’−チオ−ＬＮＡ等のＬＮＡ、Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍらの文献（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９２），１１４，１８９５−１８９７）の主題であるＰＮＡは、バックボーンが改変されたヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの例である。

ハイブリダイゼーション反応は、上記で説明するように、結合している核酸を標識することによって視覚化できる。

結合している核酸とハイブリダイズさせる前に、ターゲットｍＲＮＡを当業者に公知の方法で抽出し、その後（例えばＲＴ−ＰＣＲ又はＮＡＳＢＡによって）任意に増幅させることができる（Ｍａｌｅｃｋ，Ｌ．ら，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８，Ｃｈ ３６，Ｅｄ Ｐ．Ｇ．Ｉｓａａｃ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。

ＮＧＦｍＲＮＡを検出してＮＧＦの存在を検出するために使用できる生物試料は、上記の任意の試料であってよい。

従って、生物試料は、上述するように、腫瘍生検若しくは転移部生検に由来する組織、又は、適切に前処理して循環腫瘍細胞を分離した体液からなるものであってよい。

がん細胞のみがＮＧＦを産生し、この産生ががんの進行度によって変化することから、本発明の方法は、乳がんの初期診断、並びに、スクリーニング、追跡治療、予後診断及び再発診断のいずれにも使用できる。

従って、本発明の別の目的は、乳がんの初期診断、スクリーニング、追跡治療、予後診断及び再発診断における本発明の方法の使用からなる。

ＮＧＦは腫瘍マーカーとして作用するだけでなく、治療におけるターゲットとしても作用する可能性がある。実際、正常細胞はＮＧＦを産生しないが乳がん細胞はこれを産生できるため、腫瘍の増殖及び乳がん細胞の遠隔部位への転移は、細胞増殖を阻害できるＮＧＦ結合パートナーによって、又は、ＮＧＦ阻害剤によって阻害できる。

従って、ＮＧＦ結合パートナー及びＮＧＦ阻害剤は、医薬品として使用できる。

従って、本発明の主題は、医薬品を調製するためのＮＧＦ結合パートナー又はＮＧＦ阻害剤の使用でもある。ここで、がんの場合には、ＮＧＦ結合パートナーはＮＧＦ受容体及びこれらの受容体の活性部位のいずれでもないとして理解される。

本発明の特定の実施形態によれば、上記医薬品は、乳がん患者における腫瘍増殖及び遠隔部位への転移を有効に阻害する。

有効成分として少なくとも一種のＮＧＦ結合パートナー又はＮＧＦ阻害剤を、医薬品に許容される賦形剤と任意に組み合わせて含む上記医薬組成物もまた、本発明に含まれる。ここで、がんの場合には、ＮＧＦ結合パートナーはＮＧＦ受容体及びこれらの受容体の活性部位のいずれでもないとして理解される。

乳がんに対して有用な医薬組成物は、有効成分として、腫瘍細胞の増殖を阻害できるＮＧＦ結合パートナー又はＮＧＦ阻害剤を少なくとも一種含む。

有効成分として適切な特異的ＮＧＦ結合パートナーは、具体的にイムノアッセイについて上記で定義されているが、それら以外にも、腫瘍増殖を阻害できる当業者に公知の任意のパートナーであってよい。特定の実施形態によれば、乳がん細胞の増殖を阻害できる特異的パートナーは、抗ＮＧＦ抗体である。

「ＮＧＦ阻害剤」という用語は、ＮＧＦの直接的な阻害剤、すなわち、上記タンパク質の生物活性を阻害する阻害剤、ＮＧＦのエキソサイトーシス経路の阻害剤、ＮＧＦｍＲＮＡの阻害剤、及び、ＮＧＦをコードする遺伝子の阻害剤を意味することを意図する。

ＮＧＦの直接的な阻害剤として、阻害剤Ｋ−２５２ａを挙げることができる（Ｔａｐｌｅｙ，Ｐ．ら，１９９２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ７，３７１−３８１）。

タンパク質、特にＮＧＦのエキソサイトーシス経路の阻害剤は、当業者に広く公知である。

ＮＧＦｍＲＮＡ阻害剤として、ＮＧＦｍＲＮＡ合成断片を使用できる。特に、ＲＮＡ干渉法は、阻害される細胞ｍＲＮＡの短い配列に対応する二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用することに基づく。（プラスミド中に導入されている可能性のある）この二本鎖オリゴヌクレオチドは、細胞内に入った後でＤｉｃｅｒ／Ｒｉｓｃ酵素系の処理を受けた結果、対応する細胞ｍＲＮＡが分解される（Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ Ｄら，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｖｏｌ．４，ｐ４５７−４６７）。

ＮＧＦをコードする遺伝子の阻害剤として、アンチセンスＮＧＦオリゴヌクレオチドを挙げることができる。このオリゴヌクレオチドは、当業者であれば容易に調製できる。

ＮＧＦ結合パートナー又は様々な阻害剤の治療的作用を調べる目的で、腫瘍細胞等の所望の細胞中に特異的に入る状態にこれらを置くことができ、この形態は本発明の別の実施形態を構成する。

また、上記ＮＧＦ結合パートナー又は様々な阻害剤は、例えば、パートナー（例えば担体分子、遺伝子治療で使用するポリマー等のポリマー、又は、遺伝子治療で使用するアデノウィルス及びポックスウィルス等のウィルスベクター）と付着することによって上記のように所望の細胞中に特異的に入ることができる。

例えば、乳がんの場合において、担体分子は抗ＭＵＣ１抗体若しくは抗上皮細胞抗体又は抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体であってよい。

好ましくは、上記医薬組成物がＮＧＦ結合パートナー、又は、ＮＧＦのエキソサイトーシス経路の阻害剤若しくは直接的な阻害剤等のＮＧＦ阻害剤を有効成分として含む場合、所望の腫瘍細胞中にこれらが特異的に入る状態にすると、ＮＧＦｍＲＮＡ阻害剤及びＮＧＦをコードする遺伝子の阻害剤は上記細胞中に自ら入ることができる。

賦形剤の量及び性質は当業者であれば容易に決定でき、また、医薬品の形状及び望ましい投与方法に応じて選択される。

経口的、舌下、皮下、筋肉内、腫瘍内、静脈内、局所的、部分的、気管内、鼻腔内、経皮的、直腸内、眼内又は耳介内に投与する本発明の医薬組成物において、上記有効成分は、投与単位状で投与できる。

投与単位状とは、例えば、錠剤、ゼラチンカプセル、顆粒、粉末、注射可能な経口用溶液若しくは懸濁液、経皮パッチ、舌下、頬内、気管内、眼内、鼻腔内若しくは耳介内に投与する形状、吸入による投与形態、局所的、経皮的、皮下、筋肉内、腫瘍内若しくは静脈内に投与する形状、直腸内に投与する形状、又は、インプラントである。局所投与については、クリーム、ゲル、軟膏、ローション又は目薬を考えることができる。

上記形状の医薬品は、対象分野において一般的な方法で調製する。

上記単位状とは、医薬品の形状に応じて、体重１ｋｇ当たり一日０．００１〜１０ｍｇの有効成分を投与できる量を含む。

適切な投与量が上記より多い又は少ないという特殊な場合がある可能性があるが、このような投与量は本発明の範囲から外れるものではない。通常の業務においては、個々の患者についての適切な投与量は、投与方法並びに患者の体重及び反応に応じて医師が決定する。

別の実施形態によれば、本発明は、患者にＮＧＦ結合パートナー又はＮＧＦ阻害剤を有効な量投与することを含む乳がんの治療方法にも関する。

本発明は、以下の例示及び付随する図１〜５によってより詳細に理解されるであろう。ただし、これらの例示は制限を加えるために記載するものではない。

−図１は、がん細胞中のＮＧＦ発現の実証についてグラフで示すものである。
・図１Ａは、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢＴ２０がん細胞がＮＧＦを分泌していること、コントロールとしての顎下腺細胞がＮＧＦを分泌していること、並びに、ＮＢＥＣ正常細胞（正常な胸部上皮細胞）がＮＧＦを分泌していないことを示す、ＲＴ−ＰＣＲ後の電気泳動ゲルを示す。
・図１Ｂは、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢＴ２０がん細胞がＮＧＦを分泌していること、顎下腺細胞がＮＧＦを分泌していること、並びに、ＮＢＥＣ細胞がＮＧＦを分泌していないことを示す、イムノブロッティング後の電気泳動ゲルを示す。
・図１Ｃは、ＥＬＩＳＡで調べた各細胞（ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢＴ２０がん細胞、顎下腺細胞並びにＮＢＥＣ細胞）によって分泌されたＮＧＦの量を示すグラフである。

−図２は、がん細胞とＮＧＦに感受性のある細胞との共培養について示すものである。
・図２Ａは、ＮＧＦ存在下で増殖するＰＣ１２細胞（１）とがん細胞（２）との共培養の実験スキームを示す。
・図２Ｂは、コントロールとしてのＰＣ１２細胞の培養（写真２）、ＮＧＦの影響下におけるＰＣ１２細胞の分化（写真３）、ＭＣＦ−７がん細胞の存在下におけるＮＧＦに感受性のある細胞の共培養（写真４）、抗ＮＧＦ抗体の存在下におけるＭＣＦ−７がん細胞の培養（写真５）、阻害剤Ｋ２５２ａの存在下におけるＭＣＦ−７がん細胞の培養（写真６）、及び、ＮＢＥＣ正常乳房細胞の培養（写真７）を示す写真である。

−図３は、生検由来組織中での免疫検出によるＮＧＦ発現を実証する免疫細胞化学的な写真を示す。図中、写真Ａ及びＢは、ＮＧＦ標識がある場合とない場合それぞれの正常な組織についての写真であり、写真Ｃ〜Ｆはがん組織についてのもので、写真Ｃ及びＥはＮＧＦ標識のない切片（ネガティブコントロール）について、写真Ｄ及びＦはＮＧＦ標識した切片についての写真である。

−図４は、乳がん細胞の増殖を阻害できる結合パートナーが細胞増殖に及ぼす影響を実証するグラフに関する。
・図４Ａは、腫瘍増殖阻害剤がない状態（コントロール）において、又は、抗ＮＧＦ抗体ＭＡＢ−２５６の存在下において、又は、阻害剤Ｋ−２５２ａの存在下において、ＭＣＦ−７細胞の増殖を細胞数（１０^４個／３５ｍｍディスク）として示すグラフである。
・図４Ｂ及び４Ｃは、ＭＣＦ−７細胞の数をＭＡＢ−２５６抗体の投与量に対して（図４Ｂ）、又は、阻害剤Ｋ−２５２ａの投与量に対して（図４Ｃ）示すグラフである。

−図５は、マウス乳がん細胞における、腫瘍の体積に及ぼす（図５Ａ）、腫瘍の重量に及ぼす（図５Ｂ）、及び、肝転移数に及ぼす（図５Ｃ）抗ＮＧＦ抗体の影響を時間に対して実証するグラフを示す。

ＲＴ−ＰＣＲによる乳がん細胞中のＮＧＦ発現の実証
１．１ 試験する細胞
ヒト乳がん細胞株４株、すなわち、ＡＴＣＣ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（メリーランド州ロックヴィル）から得たＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢＴ２０細胞について、それぞれＨＴＢ−２２、ＨＴＢ−１３３、ＨＴＢ−２６及びＨＢＴ−２９と番号をつけて試験した。

これらの細胞を、Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、重炭酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％、ペニシリン−ストレプトマイシン１００Ｕ／ｍｌ、ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ、非必須アミノ酸１％及びインシュリン５μｇ／ｍｌを添加した最少必須培地（Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔｓ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社、ベルギー）中で保持した。

比較として、リール医学大学（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｌｌｅ）の形成外科（Ｐｅｌｌｅｒｉｎ教授、フランス）から入手し、ＦＣＳ５％、インシュリン１０ＩＵ／ｍｌ、コルチゾール５μＭ、ＥＧＦ２ｎｇ／ｍｌ、コレラ毒素１００ｎｇ／ｍｌ、ペニシリン１００ｎｇ／ｍｌ及びゲンタマイシン４５μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１／１）培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）（培地Ｂ１）中で培養した、正常な胸部上皮細胞（ＮＢＥＣ）について試験した。ほぼコンフルエントになったところで、カルシウム濃度を２０μＭに減らした以外は上記と同じ培地中に細胞を配置した。

病院解剖の残渣から入手したヒト顎下腺細胞についても、既知のＮＧＦ供給源として使用した。

１．２ ＲＴ−ＰＣＲ
Ｒｎｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、フランス）を使用して、がん細胞株、ＮＢＥＣ細胞及びヒト顎下腺（重量で２０ｍｇ）細胞から総ＲＮＡを分離した。Ｒｏｔｏｒ−Ｓｔａｔｏｒホモジナイザー（Ｂｒｉｂｏｌｙｓｅｒ、Ｈｙｂａｉｄ社）を使用して、顎下腺を破裂してホモジナイズした。

抽出したＲＮＡ量を２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量し、２８０ｎｍにおける吸光度に対する２６０ｎｍにおける吸光度の割合からＲＮＡの純度を調べた。ＲＮＡが分解していないことを、臭化エチジウムを含む１．５％アガロースゲルでのＲＮＡの電気泳動によって確認した。

精製した総ｍＲＮＡ２ｇ、１Ｘ反応バッファー、ＤＴＴ１０ｍＭ、各々についてｄＮＴＰ４００ｍＭずつ、オリゴ（ｄＴ）２．５Ｍ、Ｒｎａｓｉｎ４０Ｕ及びＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウィルス逆転写酵素２００Ｕを含む反応混合物を反応全量として２５μｌ添加することによって逆転写（ＲＴ）を実施した。反応させるものは全て、３７℃で１時間インキュベートした後、９５℃で５分間不活性化した。

ＰＣＲの実施は、ｃＤＮＡについてはＲＴ実施後に、又は、ＲＮＡ試料についてはネガティブコントロールであるためＲＴを実施せずに、以下のように行った。

ＰＣＲバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２００ｍＭ、ｐＨ８．４、ＫＣｌを５００ｍＭ）５μｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ_２１０μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰミックス１ｍｌ、ｃＤＮＡ又は総ｍＲＮＡ（ネガティブコントロール用）１μｌ、下記のｎｇｆ遺伝子のプローブ５０ｍＭを１μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕ／μｌを１μｌ、並びに、全体積が５０μｌとなる量の水を、ＰＣＲチューブ中に注入した。
センスプローブ：５’−ＧＡＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＴＧＧＧＴＴ−３’
アンチセンスプローブ：５’−ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴ−３’

ＰＣＲ条件は以下の通りで実施した。
９５℃で３分間処理してｃＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５７℃２分間及び７２℃３分間のサイクルを３０回実施した。最終サイクル終了後、ＰＣＲチューブを７２℃で更に１０分間インキュベートしてｃＤＮＡ断片を伸長させた。

アガロースゲル電気泳動を行った後でＵＶ光を照射して臭化エチジウム染色により増幅産物を視覚化したものを図１Ａ中に示す。この図は、がん上皮細胞及び顎下腺細胞（ポジティブコントロール）の７４ｂｐのｎｇｆ転写産物を示す。この産物はＮＢＥＣ細胞については検出されていない。

以上のことから、この試験によって、非がん上皮細胞はＮＧＦを分泌していないのに対し、対応するがん細胞はＮＧＦを分泌していることが実証できる。

イムノブロッティングによる乳がん細胞中のＮＧＦ発現の実証
２．１ 試験する細胞
試験する細胞は上記１．１中で示すものである。

２．２ イムノブロッティング
上記１．１中で示すように培養してサブコンフルエントにした細胞を洗浄し、フィブロネクチン及びトランスフェリンを含む非血清培地中に２４時間配置した。細胞から栄養素を除去した後、ＰＢＳバッファー（リン酸緩衝生理食塩水）中でこすり取ることによって細胞を回収し、遠心分離（１０００ｇ、５分間）した。

ペレットを溶解バッファー（ＳＤＳ１００％、β−メルカプトエタノール０．５％、ＴｒｉｓＨＣｌを０．５Ｍ、ｐＨ６．８、グリセリン２５％、０．５％）で処理し、この混合物を１００℃で５分間沸騰させた。

遠心分離（１０００ｇ、５分間）した後、上清中のタンパク質についてＢｉｏＲａｄタンパク質測定アッセイを使用して調べた。

各細胞株及び顎下腺に由来する溶解物についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、エレクトロブロッティング（２００ｍＡ、４５分間）によってニトロセルロース膜上に転写した。

その後、それぞれの膜を、抗ＮＧＦウサギポリクローナル抗体（ｓｃ−５４８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｔｅｂｕ社、フランス）を使用して４℃で一晩試験した。膜をそれぞれＴＳＢ−Ｔバッファーで三回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギ免疫グロブリン抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を使用して室温で２時間インキュベートした。膜をそれぞれＴＢＳ−Ｔバッファーで４回洗浄した後、ＥＣＬケミルミネッサンスキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）及びコダック製Ｘ−オマットＡＲフィルムを使用して反応を視覚化した。

また、図１Ｂ中に示すように、ＮＧＦががん細胞及び顎下腺（１４ｋＤａのバンド）について検出されたが、このバンドは非がん細胞については存在しなかった。

この結果から、実施例１の結果が確認できる。

ＥＬＩＳＡによる乳がん細胞中のＮＧＦ発現の実証
３．１ 試験する細胞
試験する細胞は上記１．１中で示したものである。

３．２ ＥＬＩＳＡ
この試験を実施するために、ヒトβ−ＮＧＦについてｔｗｏ−ｓｉｔｅアッセイを使用した。簡潔に説明する。希釈バッファー（ＢＳＡ０．１％、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水中にＴｗｅｅｎ２０を０．００５％溶解したもの、ｐＨ７．３）中に希釈したモノクローナル捕獲抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、英国）１μｇ／ｍｌでイムノプレートをコートした。コントロールのウェルは、同量のマウスＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）でコートした。各ウェルに上記希釈液１００μｌを注入してプレートを密閉し、室温で一晩インキュベートした。

Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含むｐＨ７．４のＰＢＳ４００μｌでウェルを三回洗浄した。その後、上記と同様のバッファー中にウシ血清アルブミン１％、スクロース５％及びＮａＮ_３０．００５％を添加したバッファーを使用して、プレートを室温でブロッキングした。

２時間後、各ウェルを洗浄し、未知物質及び標準物質の希釈液を１００μｌ添加して、プレートを粘着テープで再度被覆した後、室温で一晩インキュベートした。

ヒトβ−ＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を希釈バッファー１００μｌ中に０．２５〜８ｎｇ／ｍｌの割合で添加したものを標準試料として使用した。

その後プレートを入念に洗浄し、特異的抗ヒトβ−ＮＧＦヤギＩｇＧ検出抗体（ＢＡＦ−２５６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を５０ｎｇ／ｍｌの割合で添加して、室温で２時間インキュベートした。

インキュベートした後、イムノプレートを洗浄バッファーで三回洗浄し、ストレプトアビジン／ホースラディッシュペルオキシダーゼ１００μｌを添加して、室温で２０分間インキュベートした。

基質溶液を１００μｌ添加することによって反応を開始させ、遮光して室温で３０分間インキュベートした。

その後、停止溶液（１ＭのＨ_２ＳＯ_４）５０μｌを各ウェルに添加した。光学密度を、３０分後において、マイクロプレートリーダー装置を使用して５９５ｎｍ又は４５０ｎｍで測定した。

光学密度測定の結果（三回のアッセイの平均値）を図１Ｃ中に示す。この結果から、試験した全ての乳がん細胞株においてＮＧＦ量が類似していることが実証される。

ＮＧＦに感受性のある細胞の培養
この培養を実施するために、ＮＧＦの存在下で増殖する細胞、すなわちＰＣ１２細胞を、上記１．１に記載するようにＭＣＦ−７乳がん細胞と、又は、上記１．１に記載するようにＮＢＥＣ細胞と（コントロール）、共培養した。

あらかじめＰＣ１２細胞を、３７℃で５％ＣＯ_２において、重炭酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン４ｍＭ、ウシ胎児血清１０％、ウマ血清５％及びペニシリン／ストレプトマイシン１００Ｕ／ｍｌを添加したダルベッコ変法最少必須培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。

共培養は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｒ）（組織培養処理ポリカーボネートプレート（直径１２ｍｍ、孔径１２μｍ））を使用して実施した。プレート中央のウェル中に上記培地を添加して初期平衡期を観察した後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｒ）挿入片中にもこれを添加し、続いて３７℃で３時間インキュベートした。

コラーゲンコートした１２ウェルプレート中にＰＣ１２細胞を播種して２４時間おき、培養プレートに正しく確実に付着させた。ＭＣＦ−７又はＮＣＢＥ細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｒ）挿入片内部の上部の完全培地中に播種して２４時間保持した。

この後、各細胞株を非血清培地で三回洗浄し、回収してあった培地中でインキュベートした。コントロール実験においては、ＮＧＦ、又は、チロシンキナーゼｔｒｋ活性の阻害剤（Ｋ−２５２−ａ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、フランス）、又は、抗ヒトβ−ＮＧＦマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ−２５６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）のいずれかを含む培地を上記培地に添加した。

共培養を４８時間実施した。共培養後にＰＣ１２細胞を冷メタノール（−２０℃）を使用して２０分間固定し、その後リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）で洗浄した後、カバーグラス及びＧｌｙｃｅｒｇｅｌ（Ｄａｋｏ社、フランス）に組み込んだ。

細胞体の長さの二倍伸長した神経突起を一個以上有する細胞を神経突起を有する細胞と定義し、この細胞の割合を調べた。また、オリンパス社製光学デジタルカメラを備えた位相差顕微鏡を使用して顕微鏡写真も撮影した。

結果を図２中に示す。
−図２Ａは実験スキームを示すが、このスキーム中の（２）はがん細胞又は非がん細胞であり、（１）はＰＣ１２細胞である。

−図２Ｂは写真である。
・写真２及び３は、コントロールとしてＰＣ１２細胞の培養をＮＧＦ非存在下及びＮＧＦ存在下においてそれぞれ示しており、分化による神経突起の伸長が観察される。
・写真４はＭＣＦ−７及びＰＣ１２細胞の共培養に関するものであり、ＰＣ１２細胞が培養４８時間後に分化していることを示す。
・写真５は抗ＮＧＦ抗体の存在下でのＭＣＦ−７及びＰＣ１２細胞の共培養に関するものであり、この抗体によってＰＣ１２細胞の分化が強く阻害されることを示す。
・写真６は阻害剤Ｋ−２５２ａの存在下でのＭＣＦ−７及びＰＣ１２細胞の共培養に関するものであり、この阻害剤によってＰＣ１２細胞の分化が強く阻害されることを示す。
・写真７は正常なＮＢＥＣ細胞及びＰＣ１２細胞の共培養に関するものであり、ＰＣ１２細胞が分化していないことを実証する。

乳がん生検中のＮＧＦの検出についての免疫組織化学
５．１ 生検の採取及び固定
手術直後に、人間の乳がん組織又は正常な非がん組織（コントロール）の生検を、１０％ホルモル溶液で２４時間固定した。アルコール溶液を（３０〜１００％）増やして脱水した後、試料をパラフィン中に包埋した。そして、切片をミクロトームで切断した後（５μｍの薄い切片）、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＴＥＳＰＡ、Ｄａｋｏ社、フランス）でコートしたスライドグラス上に固定した。

５．２ スライドグラスのパラフィン除去
下記工程に従ってスライドグラスを浴中に浸漬することによってパラフィンを除去した。
−トルエン浴二回（１０分間）、
−１００％アルコール浴一回（１０分間）、
−９５％アルコール浴一回（１０分間）、
−７０％アルコール浴一回（１０分間）、
−水浴一回（１０分間）。
その後、上記スライドグラスを＋４℃で保存した。

５．３ ＮＧＦ標識
切片をＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ：ＮａＣｌを１７．５４ｇ、Ｔｒｉｓ塩基２．４２ｇ、水ｑｓ２Ｌ、ｐＨ７．４）で１０分間震盪しながら洗浄した。０．０１Ｍクエン酸バッファー（クエン酸一水化物１．０５ｇ、蒸留水ｑｓ５００ｍｌ、ｐＨ６（ＮａＯＨ））を使用して９５℃の湯浴中で５分間ずつ二回、抗原の再活性化を実施した。上記スライドグラスを３％過酸化水素水溶液／ＴＢＳ中で震盪しながら５分間インキュベートし、ＴＢＳ／３％ＢＳＡ中に室温で１時間浸漬した。

その後、上記スライドグラスを室温で２時間、高湿度のチャンバー内で、ＴＢＳ／３％ＢＳＡ中に１／５０の割合で希釈した抗ＮＧＦ一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、Ｔｅｂｕ社、フランス）８０μｌと共にインキュベートした。これをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で震盪しながら５分間ずつ三回洗浄した。

その後、上記スライドグラスを室温で２時間、湿度の高いチャンバー内で、ＴＢＳ／３％ＢＳＡ中に１／１００の割合で希釈した抗ウサギＩｇＧサル二次抗体８０μｌと共に再びインキュベートした。上記抗体はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ジャクソン研究所、米国）に結合させたものである。

上記スライドグラスをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で震盪しながら５分間ずつ三回洗浄し、ＰＢＳで震盪しながら５分間ずつ三回洗浄し、乾燥させた後、ＤＡＢ（ｓｉｇｍａ ｆａｓｔ ３，３−ジアミノベンジジン；水１ｍｌ中にＤＡＢ錠剤１個＋Ｈ_２Ｏ_２／尿素錠剤１個）１００μｌと共に１０分間インキュベートした。

顕微鏡で染色を確認し、ＰＢＳ浴中で停止させた。Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン調製溶液（Ｓｉｇｍａ社）中に４秒間浸漬することによってカウンター染色し、乳房の構造を視覚化した。洗浄はアルカリ性の水中で、その後ＰＢＳ浴中で実施した。

５０℃の湯浴中の加熱したｇｌｙｃｅｒｇｅｌ上に上記スライドグラスを載せた。

両眼用拡大レンズ（Ｚｅｉｓｓ社）を使用して上記スライドグラスを撮影した。

こうして得た切片の免疫組織化学的な写真を図３中に示す。写真Ａ及びＢはＮＧＦ標識した場合としない場合それぞれの正常な組織についてのものである。写真Ｃ〜Ｆはがん組織についての写真で、写真Ｃ及びＥはＮＧＦ標識していない切片（ネガティブコントロール）について、写真Ｄ及びＦはＮＧＦ標識した切片についてのものである。サイズバーは、写真Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦについては２５０μｍ、写真Ｃ及びＤについては６００μｍに相当する。

この結果から、正常な乳房上皮細胞中には免疫組織化学的に生検スライドグラス上でＮＧＦは検出されないが、乳がん上皮細胞中には検出されることが分かる。（抗ＮＧＦ抗体で標識した上皮細胞は、腫瘍の乳腺中においてはＣ及びＥと比較してＤ及びＦ中では染色されているが、正常な乳腺中においてＡと比較してＢ中でも染色されていない。）

フローサイトメトリーによる腫瘍細胞中のＮＧＦの検出
培養皿の底をこすり取ることによってＭＣＦ−７細胞を剥がした。その後、定着剤（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）１００μｌを添加し、室温で１５分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで三回洗浄し、１９００ｒｐｍで５分間遠心分離した。

透過化剤（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）１００μｌを添加した後、室温で５分間インキュベートした。非標識抗ＮＧＦマウスモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１／１００希釈）を２０μｌ添加した後、室温で１５分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで三回洗浄し、１９００ｒｐｍで５分間遠心分離した。そして、ＦＩＴＣ標識抗マウス二次抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１／５０希釈）を２０μｌ添加した後、遮光して室温で１５分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで三回洗浄し、１９００ｒｐｍで５分間遠心分離した。

上相のＰＢＳ５００μｌ中に細胞を分けた後、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｒ） ＥＰＩＣＳ（Ｒ））を使用して値を読み取った。得られた結果から、この細胞株のうち３０％を超える細胞が細胞質中にＮＧＦを含むことが分かる。この方法は、生物試料から分離した腫瘍細胞に対して適用できる。

がん細胞の増殖に及ぼす抗ＮＧＦ抗体及び薬理的阻害剤の影響
ＭＣＦ−７細胞の増殖に及ぼすブロッキング抗体ＭＡＢ−２５６（上記）及び阻害剤Ｋ−２５２ａの影響を調べた。これを調べるために、２×１０^４個／ｍｌの割合で３５ｍｍディッシュ中の完全培地中に細胞を播種した。４０％コンフルエントに達した後、細胞を二回洗浄し、フィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ）及びトランスフェリン（３０μｇ／ｍｌ）を含む非血清培地中で栄養分を与えずに３時間保持した。その後、様々な濃度の阻害剤Ｋ−２５２ａ又は抗体ＭＡＢ−２６を含む上記と同様の培地２ｍｌで培地を置き換えて、薬理的阻害剤又はブロッキング阻害剤が増殖基準値に及ぼす影響を調べた。

２４時間、３６時間、４８時間及び７２時間の処理後、単層培養物を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液でトリプシン消化し、血球計を使用して細胞数を測定した。

また、抗マウスモノクローナル抗体（Ａ４７００、Ｓｉｇｍａ社）、すなわち無関係の抗体を使用してブロッキング抗体の特異性を調べた。

結果を図４中に示す。
−図４Ａは、基本培地中のＭＣＦ−７細胞の増殖（正方形）が、抗体の存在下（三角形）及び阻害剤の存在下（菱形）で減少することを示す。
−図４Ｂ及び４Ｃは、抗体及び阻害剤はいずれも投与量に応じて、ＮＧＦのがん細胞増殖効果に影響を及ぼすことを示す。
従って、ＮＧＦは治療の際のターゲットとして確かに使用できる。

ｉｎ ｖｉｖｏにおける乳房細胞の腫瘍形成に及ぼす抗ＮＧＦ抗体の影響
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞の増殖を以下のように調べた。
ＳＣＩＤマウス（劇症合併免疫不全症）３０匹の脇腹に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をマウス一匹当たり３×１０^６個／ＰＢＳ５０μＬの割合で時間０（Ｄ０）において皮下注射した。マウスは、標準的な繁殖コロニー条件において室温で昼／夜を交互にした状態で、食物及び飲料を自由に摂取させた。

細胞を注射して１４日後、２１日後及び２８日後、半数のマウスの腫瘍周辺（脇腹の皮下、腫瘍細胞を注射した位置から１ｃｍ）に抗ヒトＮＧＦブロッキング抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ、ＶＷＲ、フランス）をマウス一匹当たり１２．５μｇ／ＰＢＳバッファー５０μＬの濃度で注射した。

抗ＮＧＦ抗体で処置した又は処置していない生きたマウスについて、がん細胞を注射して２１日後及び３５日後（それぞれＤ２１及びＤ３５）に電子スライドゲージで腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の重量は次の式で計算した。
０．５２３６×長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×（長さ＋幅）／２

また、上記のマウスについて、Ｄ３５における腫瘍の重量を屠殺後に電子精密天秤を使用して測定した。

最後に、肝臓中の転移数を肉眼で計数した。

上記のそれぞれの測定結果（平均値）を図５中のグラフ上に示す。
表中、線を引いた柱状グラフは抗ＮＧＦ抗体で処置していないマウス（コントロール）を示し、白抜きの柱状グラフは上記抗体で処置したマウスを示す。

これらのグラフは、抗ＮＧＦで処置すると腫瘍の大きさ及び重量が減少すること、また、乳がんの場合には転移数も減少することを実証するものである。

図１は、がん細胞中のＮＧＦ発現の実証についてグラフで示す。図１ＡはＲＴ−ＰＣＲ後の電気泳動ゲルを示す。図１Ｂはイムノブロッティング後の電気泳動ゲルを示す。図１Ｃは、ＥＬＩＳＡで調べたＮＧＦ量を示すグラフである。 図２は、がん細胞とＮＧＦに感受性のある細胞との共培養について示す。図２Ａは共培養の実験スキームを示す。図２Ｂは、コントロールとしてのＰＣ１２細胞の培養（写真２）、ＮＧＦの影響下におけるＰＣ１２細胞の分化（写真３）、ＭＣＦ−７がん細胞の存在下におけるＮＧＦに感受性のある細胞の共培養（写真４）、抗ＮＧＦ抗体の存在下におけるＭＣＦ−７がん細胞の培養（写真５）、阻害剤Ｋ２５２ａの存在下におけるＭＣＦ−７がん細胞の培養（写真６）、及び、ＮＢＥＣ正常乳房細胞の培養（写真７）を示す写真である。 図３は、生検由来組織中での免疫検出によるＮＧＦ発現を実証する免疫細胞化学的な写真を示す。図中、写真Ａ及びＢは、ＮＧＦ標識がある場合とない場合それぞれの正常な組織についての写真であり、写真Ｃ〜Ｆはがん組織についてのもので、写真Ｃ及びＥはＮＧＦ標識のない切片（ネガティブコントロール）について、写真Ｄ及びＦはＮＧＦ標識した切片についての写真である。 図４は、乳がん細胞の増殖を阻害できる結合パートナーが細胞増殖に及ぼす影響を実証するグラフに関する。図４Ａは、ＭＣＦ−７細胞の増殖を細胞数（１０^４個／３５ｍｍディスク）として示すグラフである。図４Ｂ及び４Ｃは、ＭＣＦ−７細胞の数をＭＡＢ−２５６抗体の投与量に対して（図４Ｂ）、又は、阻害剤Ｋ−２５２ａの投与量に対して（図４Ｃ）示すグラフである。 図５−１は、マウス乳がん細胞における、腫瘍の体積に及ぼす（図５Ａ）及び腫瘍の重量に及ぼす（図５Ｂ）抗ＮＧＦ抗体の影響を時間に対して実証するグラフを示す。 図５−２は、マウス乳がん細胞における、肝転移数に及ぼす（図５Ｃ）抗ＮＧＦ抗体の影響を時間に対して実証するグラフを示す。

Claims (14)

1. 乳がんの疑いのある患者から採取した体液中のＮＧＦの存在を決定することからなる
   ことを特徴とするｉｎ ｖｉｔｒｏにおける乳がんの検出方法。
2. ＮＧＦの存在は前記体液中のＮＧＦの直接検出によって決定する
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ＮＧＦの検出はイムノアッセイ又は質量分析によって実施する
   ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記体液は、前処理して前記体液中に含まれている循環腫瘍細胞を分離した体液からなる
   ことを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
5. 前記循環腫瘍細胞をその後、ＮＧＦを分泌する条件で培養する
   ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記循環腫瘍細胞を、前記に加えて、前記循環細胞内部のＮＧＦを阻害した条件でも培養する
   ことを特徴とする請求項４又は５に記載の方法。
7. ＮＧＦの検出は、ＮＧＦに感受性のある細胞を前記体液の存在下で培養することによって決定する
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 前記体液は、前処理して前記体液中に含まれている循環腫瘍細胞を分離した体液からなる
   ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 前記循環腫瘍細胞をその後、ＮＧＦを分泌する条件で培養する
   ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. ＮＧＦの検出は、前記体液中のＮＧＦｍＲＮＡの検出によって実施する
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 前記体液は、前処理して前記体液中に含まれている循環腫瘍細胞を分離した体液からなる
    ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. 患者が、乳がんと診断され、治療を受けている患者であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
13. 患者が、乳がんの再発の疑いのある患者であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
14. 請求項１に記載の方法からなる乳がんの初期検出方法。