KR102181740B1 - 폐암에서 ydjc의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog)를 이용한 바이오마커 조성물, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법 폐암 치료용 약학적 조성물, 및 폐암 치료 또는 전이 억제제의 스크리닝 방법 등에 관한 것으로, 본 발명에서 YDJC이 EMT를 유도하여 폐암 진행을 촉진시킨다는 점을 밝혀냈는바, YDJC의 발현 수준을 측정하여 폐암의 진단이나 전이 예후 예측을 통해 조기 치료가 가능하며, 폐암 치료 또는 전이 억제제 스크리닝을 통해 유용한 폐암 치료제 개발도 가능한 바 의료산업에 있어 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Description

폐암에서 YDJC의 용도{Use of YDJC in lung cancer}
본 발명은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog)를 이용한 바이오마커 조성물, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법, 폐암 치료용 약학적 조성물, 및 폐암 치료 또는 전이 억제제의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다.
폐암이란 폐에 생긴 악성 종양을 말하며, 폐를 구성하는 조직 자체에서 암세포가 생겨난 원발성 폐암과, 암세포가 다른 기관에서 생긴 뒤 혈관이나 림프관을 타고 폐로 옮겨 와서 증식하는 전이성 폐암으로 나눌 수 있다.
2017년에 발표된 중앙암등록본부 자료에 의하면 2015년에 우리나라에서는 214,701건의 암이 발생했는데, 그 중 폐암은 남녀를 합쳐서 24,267건, 전체 암 발생의 11.3%로 4위를 차지했다. 인구 10만 명당 조(粗)발생률(해당 관찰 기간 중 대상 인구 집단에서 새롭게 발생한 환자 수. 조사망률도 산출 기준이 동일)은 47.6건으로, 남녀의 성비는 2.3 : 1로 남자에게 더 많이 발생하였으며. 발생 건수는 남자가 17,015건으로 남성의 암 중에서 2위를 차지했고, 여자는 7,252건으로 여성의 암 중 5위이다. 남녀를 합쳐서 연령대별로 보면 70대가 36.2%로 가장 많았고, 60대가 26.8%, 80대 이상이 17.3%이다.
조직학적(국제질병분류ICD-10 코드 C34)으로는 2017년의 폐암 전체 발생 건수 24,235건 가운데 암종(carcinoma)이 86.6%, 육종(sarcoma)이 0.2%를 차지했으며, 암종 중에서는 선암이 43.7%로 가장 많았고, 편평상피세포암이 23.1%, 소세포암이 11.2%를 차지하고 있다.
상기와 같이 폐암은 세계에서 암 관련 사망의 주요 원인이므로, 적절한 진단 지표와 폐암의 새로운 표적이 필요한 현실이다. Chitooligosaccharide deacetylase homolog (YDJC)는 아세틸화 탄수화물의 탈아세틸화를 촉매하며 YDJC는 A549 폐암 세포에서 sphingosylphosphorylcholine (SPC) 유도 각질 인산화와 재조직에 관여한다고 보고되었으나 폐암 진행에 YDJC의 역할은 크게 알려지지 않아 이에 대한 심도 깊은 연구가 요구되고 있다.
대한민국특허등록공보 : 10-0084565
본 발명자들은 YDJC의 과발현이 마우스 모델에서 폐암 진행을 촉진시킴을 확인하여 구체적인 실험을 수행한 결과, YDJC의 과발현은 N-카드헤린(N-cadherin) 발현을 유도하고 E-카드헤린(E-cadherin) 발현을 감소 시킨 반면 디아세틸레이즈 결실 돌연변이는 그렇지 않았다는 점을 확인하였고, YDJC가 PP2A의 유비퀴틴화를 유도할 수 있으나, CDC16은 YDJC의 유비퀴틴화를 유도함으로써 PP2A 발현을 유지 할 수 있다는 것을 실험적으로 규명하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 폐암 예방, 전이 억제, 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 폐암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질을 접촉한 폐암 세포에서 YDJC 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 시료와 비교하여 상기 YDJC 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 폐암 치료 또는 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 YDJC 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
또한, 본 발명은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 YDJC 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 프로브 이고, 상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 YDJC 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머, 단백질, 또는 화합물일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 조성물을 포함하는 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검자에서 분리된 시료로부터 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 YDJC 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(c) 상기 YDJC 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 폐암이라고 판단하는 단계를 포함하는 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 폐암환자에서 분리된 시료로부터 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 YDJC 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(c) 상기 YDJC 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 폐암의 전이 위험성이 높다고 판단하는 단계를 포함하는 폐암 전이 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 폐암 예방, 전이 억제, 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 발현을 억제할 수 있는 제제는 YDJC 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, microRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 상기 활성을 억제할 수 있는 제제는 YDJC 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물, 펩티드, 앱타머, 단백질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함 할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 YDJC 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 CDC16(Cell division cycle protein 16 homolog)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 CDC16은 YDJC에 의한 프로틴 포스파테이즈 2A(protein phosphatase 2A; PP2A) 발현 감소를 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 CDC16은 상피간엽이행(Epithelial-mesenchymal transition; EMT)을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방, 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 폐암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질을 접촉한 폐암 세포에서 YDJC 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 시료와 비교하여 상기 YDJC 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 폐암 치료 또는 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 YDJC이 EMT를 유도하여 폐암 진행을 촉진시킨다는 점을 밝혀냈는바, YDJC는 폐암과 관련된 바이오마커로 이용할 수 있으며, YDJC의 발현 수준을 측정하여 폐암의 진단이나 전이 예후 예측을 통해 조기 치료가 가능하며, 폐암 치료 또는 전이 억제제 스크리닝을 통해 유용한 폐암 치료제 개발도 가능한 바 의료산업에 있어 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
도 1a는 A549YDJC 및 A549WT 세포가 주사된 SCID 마우스의 폐를 육안으로 관찰한 결과이다.
도 1b는 A549YDJC 및 A549WT 세포가 주사된 SCID 마우스에서 폐에 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 A549YDJC를 주사한 마우스와 A549WT 세포를 주사한 마우스에서 종양 면적을 측정 및 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 1d는 ERK, pERK 및 PP2A에 대한 IHC(Immunohistochemistry) 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 1e는 E -카드헤린과 N -카드헤린에 대한 IHC 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 A549 폐암 세포에 SPC 처리시 E-카드헤린, N-카드헤린 및 YDJC의 발현을 분석한 결과이다.
도 2b는 A549 폐암 세포의 SPC-유도 EMT에서 EMT 마커 및 YDJC 발현의 공 초점 현미경 관찰 결과이다.
도 2c는 SPC 처리 유무에 따른 E-카드헤린, N-카드헤린 및 YDJC의 발현을 실험한 결과이다.
도 2d는 SPC 처리 후, 암세포의 이동 및 침입 정도를 측정한 결과이다.
도 2e는 TGF-ß1이 A549 폐암 세포에서 YDJC 발현 및 EMT를 유도하는지 실험한 결과이다.
도 3a는 YDJC siRNA 억제 및 YDJC 과발현이 A549 폐암 세포에서 SPC-유도 EMT를 촉진하는지 실험한 결과이다.
도 3b는 YDJC siRNA는 SPC-유발 EMT를 억제하고, YDJC 과발현은 H838 및 H1299 폐암 세포에서 EMT를 촉진시키는지 실험한 결과이다.
도 3c는 A549 폐암 세포의 SPC-유도 EMT에서 EMT 마커 및 YDJC의 공초점 현미경 관찰 결과이다.
도 3d는 YDJC siRNA가 SPC에 의한 세포의 이동과 침입에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 3e는 TGF-ß1은 YDJC가 안정적으로 녹다운(knockdown)된 A549 폐암세포 (A549shYDJC)에서 E-카드헤린 및 N-카드헤린과 같은 EMT 마커의 변화를 유도할 수 있는지 확인한 결과이다.
도 4a는 E-카드헤린과 N-카드헤린의 발현과 YDJC 디아세틸레이즈(deacetylase) 활성의 연관성을 분석한 결과이다.
도 4b는 SPC에 의해 유도된 E-카드헤린 및 N-카드헤린 발현에 대한 YDJC의 디아세틸화 효소의 효과에 대해 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4c는 SPC 유도 세포 이동 및 침입에 YDJC의 디아세틸레이즈 활성이 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 5a는 YDJC와 CDC16의 결합을 확인하기 위해 면역 침전(Immunoprecipitation)을 수행한 결과이다.
도 5b는 CDC16와 YDJC가 결합되어 있는 위치 확인을 위해 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 6a는 CDC16 과발현이 SPC-유도 EMT에 미치는 영향 분석을 위한 실험 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 CDC16 과발현이 SPC-유도 EMT에 미치는 영향 확인을 위해 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 6c는 SPC 유발 EMT에 대한 CDC16 siRNA(siCDC16)의 효과를 관찰하기 위한 실험을 수행한 결과이다.
도 6d는 CDC16 siRNA (siCDC16)의 SPC 유도 EMT에 대한 공초점 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 6e는 A549 폐암 세포의 이동 및 침입에 대한 CDC16siRNA 및 CDC16 과발현의 영향을 분석한 결과이다.
도 6f는 A549shYDJC 폐암 세포에서 EMT 마커의 변화에 CDC16 siRNA가 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 6g는 A549shYDJC 폐암 세포에서 EMT 마커의 변화에 대한 CDC16 siRNA의 효과를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7a는 MAP 키나아제 억제제가 A549 폐암 세포에서 siCDC16-유도 EMT를 억제하는지 여부를 분석한 결과이다.
도 7b는 A549 폐암 세포에서 siCDC16 유도 EMT에 MAP 키나아제 저해제의 억제 효과를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7c는 MAPK 억제제의 CDC16siRNA에 의해 유도된 세포 이동 및 침윤에 대한 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 7d는 siCRK1 및 siERK2가 siCDC16-유도 EMT에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 7e는 A549 폐암 세포에서 siCDC16-유도 EMT에 대한 siERK1 및 siERK2의 효과를 공초점 현미경으로 관찰 결과이다.
도 7f는 siERK1 및 siERK2의 siCDC16 유도된 이동 및 침입에 대한 효과를 분석한 결과이다.
도 8a는 CDC16가 PP2A 발현을 유도하고 YDJC는 PP2A 발현을 억제하는지 여부를 관찰한 결과이다.
도 8b는 PP2A의 발현에 대한 YDJC의 기능을 확인한 결과이다.
도 8c는 PP2A 및 YDJC에 대한 CDC16의 결합여부를 확인한 결과이다.
도 8d는 PP2A의 유비퀴틴화에 대한 YDJC의 자극 효과를 분석한 결과이다.
도 8e는 PP2A 유비퀴틴화에 대한 CDC16의 효과를 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명의 핵심 메커니즘을 간략히 나타낸 것이다.
본 발명자들은 YDJC의 과발현이 마우스 모델에서 폐암 진행을 촉진시킴을 확인하여 구체적인 실험을 수행한 결과, YDJC의 과발현은 N-cadherin 발현을 유도하고 E-cadherin 발현을 감소 시킨 반면 디아세틸레이즈 결실 돌연변이는 그렇지 않았다는 점을 확인하였고, YDJC가 PP2A의 유비퀴틴화를 유도할 수 있으나, CDC16은 YDJC의 유비퀴틴화를 유도함으로써 PP2A 발현을 유지 할 수 있다는 것을 실험적으로 규명하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, YDJC의 과발현 마우스 모델에서 폐암 진행이 촉진됨을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, YDJC가 폐암 세포주의 SPC-유발 EMT에서 유도되는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, YDJC가 폐암 세포에서 상피 간엽 전이(EMT)를 촉진함을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, YDJC의 디아세틸레이즈 활성이 SPC에 의한 A549 세포의 EMT에 결정적인 역할을 한다는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, CDC16은 핵에서 강하게 발현되었지만 세포기질(cytosol)에서도 발현되었으며 YDJC 발현은 핵뿐만 아니라 세포기질에서도 CDC16과 합쳐짐을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, CDC16이 YDJC 유도 EMT를 억제함을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, ERK2가 A549 폐암 세포의 siCDC16-유도 EMT를 매개한다는 것을 확인하였다(실시예 8 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, YDJC가 PP2A의 유비퀴틴화를 유도할 수 있으며, CDC16은 YDJC의 유비퀴틴화를 유도함으로써 PP2A 발현이 유지되도록 한다는 것을 확인하였다(실시예 9 참조).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “진단”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 합병증의 유무, 및 예후 등이다. 본 발명에서 진단은 폐암 등의 발병 여부 및 질환의 수준 등을 판단하는 것이다.
본 발명에서 사용하는 용어 “예후(prognosis)”는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 암 환자에 있어서 예후는 통상적으로 암 발병 또는 외과적 시술 후 일정기간 내의 전이 여부 또는 생존기간을 뜻한다. 예후의 예측은 특히 폐암 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 폐암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다.
본 발명에서 사용하는 용어 “전이(metastasis)”는 어떤 종양이 그 원발 부위에서 여러 경로를 따라 다른 신체의 부위에 이식되어 그곳에 정착 및 증식하는 상태를 말한다. 암의 전이여부는 해당 암의 고유의 특성에 의하여 결정될 뿐만 아니라 암의 예후 결정에 있어서 가장 중요한 단서가 되는 사건이므로, 암 환자의 생존과 관련된 가장 중요한 임상정보로 다루어진다.
본 발명에서 사용하는 용어 “바이오마커”란 단백질이나 DNA, RNA(리복핵산), 대사 물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미한다. 바이오마커를 활용하면 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있으며 암을 비롯해 뇌졸중, 치매 등 각종 난치병을 진단하기 위한 효과적 방식이다. 또한, 신약개발과정에 반영할 수 있어 안전성확보는 물론 비용절감 효과까지 바라볼 수 있다.
본 발명에서 상기 YDJC 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 YDJC 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 프로브 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 YDJC 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머, 단백질, 또는 화합물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며 PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA)프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 YDJC 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명에서 사용하는 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 키트를 제공한다.
상기 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 피검자에서 분리된 시료로부터 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 YDJC 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(c) 상기 YDJC 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 폐암이라고 판단하는 단계를 포함하는 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 폐암환자에서 분리된 시료로부터 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 YDJC 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(c) 상기 YDJC 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 폐암의 전이 위험성이 높다고 판단하는 단계를 포함하는 폐암 전이 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RTPCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbentasay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 “피검자에서 분리된 시료”는 바이오 마커인 상기 YDJC 유전자 또는 YDJC 단백질의 발현 수준에 있어서 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있으며, 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 폐암 예방, 전이 억제, 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 발현을 억제할 수 있는 제제는 YDJC 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, microRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 상기 활성을 억제할 수 있는 제제는 YDJC 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물, 펩티드, 앱타머, 단백질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제시킬 수 있는 제제라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 YDJC 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 CDC16(Cell division cycle protein 16 homolog)일 수 있다.
상기 CDC16 유전자는 APC 복합체의 구성 단백질을 암호화하는데, 이는 8 개의 단백질로 구성되고 단백질 유비퀴틴 라이게이즈(ubiquitin ligase)로서 기능한다. APC 복합체는 유사 분열 유무를 제어하는 사이클린 분해 시스템이며 APC 복합체의 각 성분 단백질은 진핵 생물 사이에서 고도로 보존되어있다. 또한 상술한바와 같이 YDJC의 유비퀴틴화를 유도하여 YDJC에 의한 프로틴 포스파테이즈 2A(protein phosphatase 2A; PP2A) 발현 감소를 억제하는 기능도 있으며 그 결과 상피간엽이행(Epithelial-mesenchymal transition; EMT)을 억제하게 된다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방, 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, (a) 폐암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질을 접촉한 폐암 세포에서 YDJC 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 시료와 비교하여 상기 YDJC 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 폐암 치료 또는 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함한다. 본 발명에 따른식품 조성물은 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험 준비
1-1. 실험 재료 및 시약
RPMI-1640 배지, FBS(fetal bovine serum), PBS(phosphate-buffered saline), 및 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)는 Welgene Inc. (Seoul, Korea)로부터 구입 하였으며, Lipofectamine ™ 2000은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입 하였다. JetPEI는 Polyplus-transfection (Illkirch-Graffenstaden, France)에서 주문하였으며, SPC는 Matreya (Pleasant Gap, PA, USA)에서 조달했다. PD98059, SP600125 및 SB203580은 Calbiochem (La Jolla, CA, USA)에서 구입하였으며, E-카드헤린(E-cadherin), N-카드헤린(N-cadherin) 및 PP2A에 특이적인 마우스 단클론 항체는 BD Biosciences (San Jose, CA, USA)에서 구하였다. Anti-YDJC 항체는 Abcam (Cambridge, MA, USA)에서 공급받았으며, 안티-ERK 및 ERK1 / 2 항체를 검출하기위한 포스포 특이적(phosphospecific) 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구입 하였다. anti-CDC16, anti-유비퀴틴 및 anti-β-액틴 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 제공되었다. Alexa Fluor 488 염소 anti-레빗 항체와 Alexa Fluor 594 염소 anti-마우스 항체는 Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, USA)에서 제공되었다. 또한 상기 모든 시약은 각 실험 당시 새로 준비되었다.
1-2. 세포 배양
A549, H838 및 H1299 인간 폐암 세포주는 American Type Culture Collection (Manassa, VA, USA)에서 구입하였다. 최종 농도 10%로 열 활성화된 FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토 마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 95% 에어, 5% CO2, 및 37℃ 조건으로 배양 하였다.
1-3. 웨스턴 블롯(Western blot)
웨스턴 블롯 분석은 종래 알려진 바와 같이 수행되었다. 인큐베이션 후, 세포를 냉각된 PBS로 2회 세척하고, 프로테아제 억제제 칵테일 및 Xpert 포스파타제 억제제 칵테일 용액(GenDEPOT, Inc., Austin, TX, USA)을 함유하는 RIPA 완충액에서 얼음상에서 30분간 파쇄 하였다. 세포 용해물은 4℃에서 15,000 rpm으로 15분간 원심분리한 다음 상등액을 웨스턴 블롯팅으로 분석 하였다.
단백질 농도는 Bradford 방법을 사용하여 측정하였으며, 세포 용해물 (20-30μg의 단백질)을 8-12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분석하고 192mM 글리신(glycine)을 포함하는 글리신 전달 완충액 (polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane, Invitrogen), 25 mM Tris-HCl (pH 8.8), 및 10% v/v 메탄올을 사용하였다. 5% 탈지 분유를 사용하여 비특이적인 부위를 블로킹한 후 멤브레인을 3% BSA(bovine serum albumin)에서 1차 항체와 함께 밤새 4℃로 배양한 다음 과산화 효소가 접합된 2차 항체 (1 : 5,000, Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 실온에서 첨가 하였다. 면역 반응 단백질은 PowerOpti-ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약 (Animal Genetics Inc., Gyeonggi, Korea)을 사용하여 확인하였다.
1-4. siRNA(small-interfering RNA)에 의한 유전자 사일런싱
YDJC siRNA (서열번호 2 : 5′- GCUUCUUCCUUGGCAAGAU-3′, 서열번호 3 : 5′- AUCUUGCCAAGGAAGAAGC-3′), CDC16-1 siRNA (서열번호 4 : 5′-GGACGCUUGUAGAGCCUGATT-3′, 서열 번호 5 : 5′- UUCAGCUCUACAAGCGUCCTT-3′), CDC16-2 siRNA (서열번호 6 : 5'-CCGUGGGAUUUCAGGGAAUTT-3′, 서열번호 7 : 5′-AUUCCCUGAAAUCCCAC-GGTT-3′), ERK1 siRNA (서열번호 8 : 5'-CGGCCUAUGACCACGUGCGCATT-3', 서열번호 9 : 5'-UGCGCACGUGGUCAUAGGCCGTT-3'), 및 ERK2 siRNA (서열번호 10 : 5'-GAGGAUUGAAGUAGAACAGtt-3', 서열번호 11 : 5'-CUGUUCUACUUCAAUCCUCtt-3')는 ST Pharm(서울, 한국)에서 주문했으며, 세포를 제조원의 프로토콜에 따라 Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen)을 사용하여 siRNA로 형질 감염시켰다.
1-5. 세포 침투 분석(Cell invasion assay)
침투 분석은 종래에 알려진 바와 같이 마트리겔(Matrigel) 0.5 μg / mL으로 코팅된 Transwell inserts(Neuro Probe, Inc., Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 수행하였다. 무혈청 배지에 현탁된 폐암 세포 (1 × 106 cells/mL)는 상부 챔버의 각 삽입부에 첨가하였으며, 10% FBS를 함유하는 배지를 각각의 하부 챔버에 첨가하였다. 16시간 배양 한 후, 침입에 실패한 세포를 막의 상부 표면으로부터 긁어 냈으며 하부 표면에 침입한 폐암 세포를 Hema 3 염색 시스템 (Fisher Scientific, Houston, TX, USA)으로 염색하고, 사진을 촬영하여 무작위로 선택된 4개 분야의 세포를 배율 20배로 계수했다. 모든 실험은 2개의 레플리케이트(replicate) 각각으로 적어도 3회 반복 하였다.
1-6. 세포 이동 분석(Cell migration assay)
10 μg / mL 피브로넥틴(fibronectin)으로 코팅된 Transwell insert에서 이동 분석을 수행했다. 무혈청 배지에 현탁된 폐암 세포 (1 × 106 cells/mL)를 종래 알려진 바와 같이 상부 챔버 삽입부에 넣었다. 각 하부 챔버는 3% FBS를 함유하는 배지를 첨가하였다. 6시간 배양한 후, 비이동성 폐암 세포를 막의 상부 표면으로부터 긁어 냈다. 또한, 하부 표면으로 이동한 폐암 세포를 Diff-quick로 염색하고 무작위로 선택된 4개 분야의 세포를 배율 20배로 계수하였다. 모든 실험은 2개의 레플리케이트(replicate) 각각으로 적어도 3 회 반복 하였다.
1-7. 면역형광 염색(Immunofluorescence staining)
면역형광 염색은 종래에 알려진 바와 같이 수행되었다. A549 세포를 커버 슬립상에서 성장시키고 실온에서 10분 동안 차가운 메탄올에서 고정시켰다. 그 다음 실온에서 0.1 % Tween-20을 포함하는 PBS에서 수회 세척한 후 세포를 0.1 % Triton X-100에서 10분간 세척하여 투과성 있게 하였다. 그 다음, 세포를 PBS 중의 3% BSA로 실온에서 1시간 동안 블로킹 시켰다. E-카드헤린 및 N-카드헤린 기본 항체는 4℃에서 하룻밤동안 커버슬립에서 자란 세포와 함께 인큐베이션 한 다음 항체는 0.1 % Tween-20을 함유한 PBS로 4회 씻어 냈다. 염소 anti-마우스 IgG 항체 (Alexa Fluor 488, 1 : 500, Molecular Probes) 및 치킨 anti-레빗 IgG 항체 (Alexa Fluor 594, 1 : 500 Molecular probes)에 접합된 종 특이적인 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 커버 슬립의 세포와 반응시키고, 0.1% Tween-20을 함유한 PBS로 4회 세척하였다. 최종 샘플을 슬라이드에 놓고 공초점 현미경 (Nanoscope, 대전, 한국)을 사용하여 시각화했다.
1-8. 면역 침전(Immunoprecipitation)
면역 침전(Immunoprecipitation, IP)은 종래에 알려진 바와 같이 수행되었다. A549 세포의 용해물을 4℃에서 밤새 레빗 폴리클로날 anti-YDJC, 마우스 폴리클로날 anti-CDC16 항체 또는 마우스 모노클로날 anti-PP2A 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 사전에 세척된 단백질, A/G 자기비드 (Pierce, Rockville, IL, USA)를 각 샘플 튜브에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였으며, 50 μL의 용출된 각 시료를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.
1-9. A549YDJC, A549YDJC-D13A 및 A549shYDJC 세포주의 제작
A549YDJC 및 A549YDJC-D13A 세포주는 각각 YDJC 또는 YDJCD13A를 함유하는 플라스미드 DNA를 사용하여 확립되었다. pcDNA3.1YDJC 및 pcDNA3.1YDJCD13A를 A549 세포에 트렌스펙션 시켰으며, 안정한 세포주를 1㎎ / mL G418 disulphate (Duchefa, Haarlem, Netherlands)에서 선택하였다. A549Con 세포는 네오마이신(Neomycin) 내성 유전자만 포함된 빈벡터로 확립되었다. A549shYDJC는 A549 세포로 형질도입된 YDJC를 위한 렌티바이랄(lentiviral) shRNA를 사용하였으며 퓨로마이신(Puromycin)을 선별 마커로 사용하여 A549shYDJC를 확립하였다.
1-10. 면역조직화학(Immunohistochemistry)
4 μm 두께의 조직 절편의 면역조직화학 검사 (IHC)를 수행하였다. 각 항체에 대한 항원 검색은 95 ℃에서 20분 동안 열처리하여 이루어졌다. 절편을 염색하기 전에 내인성 과산화 효소가 차단되었으며 배양은 4℃에서 밤새 이루어졌다. 반응은 Streptavidin-Biotin Complex (Dako, Glostrup, Denmark)를 사용하여 시각화 하였으며 절편을 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조 염색 하였다.
1-11. 오쏘토픽(Orthotopic) 마우스 모델
A549YDJC와 A549Con 세포를 면역 결핍 NOD / SCID 마우스 (암컷, n=7)의 왼쪽 폐 조직에 직접 주입하였다. 간략하게, 암세포 (106)를 마트리겔을 함유하는 50 μL PBS (1 : 1)에 현탁시켰다. 세포는 견갑골 하부 경계 바로 아래의 하부 늑골 라인 위의 약 1.5cm 왼쪽 측면 흉부로 주입되었다. 8주 후에 생쥐를 희생시켜 폐를 제거하고 10 % 중화 완충 포르말린에 고정시킨 후 조직학적 분석을 수행 하였다. 모든 동물 실험 절차는 국립암센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았다.
1-12. 통계 분석
데이터는 3회 수행된 3회 이상의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차 (S.D.)로서 입증된다. 다음 유의 레벨에 따라 스튜던트 t-검정을 사용하여 데이터를 분석했다. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001
실시예 2. YDJC의 과발현 마우스 모델에서 폐암 진행 촉진 확인
종양진행에 YDJC가 관여 하는지를 조사하기 위하여 폐암 오쏘토픽(orthotopic) 마우스 모델을 이용해 상기 실시예 1-11과 같이 A549YDJC 및 A549WT 세포를 NOD / SCID 마우스의 폐에 주입하였다. 이후 상기 주사된 마우스의 폐를 이용하여 헤마톡실린-에오진 염색 및 상기 실시예 1-10의 방법으로 IHC를 수행하였다. 그 결과, 도 1a 및 1c에 나타난 바와 같이 YDJC 과발현이 A549YDJC 세포를 주사한 마우스에서 2.9배 (P = 0.028)의 종양 면적 증가가 있음을 확인하였다.
또한, 조직 염색 결과, 도 1d에 나타난 바와 같이 p5KY 발현이 유의하게 증가하였고 A549YDJC 세포 주입 마우스에서 A549Con 세포 주입 마우스와 비교하여 PP2A 발현이 감소된 것을 확인하였다.
나아가, 최근 연구에 따르면 상피 세포 특이성 중간 필라멘트 단백질인 케라틴 8의 상실은 상피 간엽 전이(EMT)의 특징이므로, 오쏘토픽(orthotopic) 마우스 모델에서 얻은 폐조직에서 IHC를 통해 E-카드헤린과 N-카드헤린의 발현을 확인하였다. 그 결과, 도 1e에 나타난 바와 같이 E-카드헤린 발현은 A549YDJC에서 A549WT 주사 군에 비해 종양 조직에서 감소하였으나 대조적으로, N-카드헤린 발현은 A549YDJC에서 A549WT를 주사한 그룹보다 높게 유도되었다. 상기 결과는 YDJC 발현이 종양 진행에 기여하는 EMT와 관련이 있음을 의미한다.
실시예 3. YDJC가 폐암 세포주에서 SPC-유발 EMT에서 유도되는지 확인
상기 실시예 2에서 살펴본 바와 같이, A549YDJC 주사군의 종양 조직에서는 E-카드헤린 소실과 N-카드헤린 발현 증가가 관찰된다. 따라서 YDJC가 EMT에 어떻게 관여하는 지와 관련하여 폐암 세포에 SPC 장기 처리를 통해 YDJC와 EMT 사이의 연관성을 조사했다. 우선, SPC가 EMT를 유도하는지 여부를 확인한 결과 웨스턴 블롯 결과인 도 2a 및 공초점현미경 관찰 결과인 2b에 나타난 바와 같이 SPC(5 uM) 처리는 E-카드헤린의 다운-레귤레이션(down-regulation)을 유도하였고 N-카드헤린 및 YDJC의 발현을 시간 의존적으로 유도함을 확인하였다. 또한, 도 2c에 나타난 바와 같이 EMT 마커의 SPC 유발 변화 또한 H838 및 H1299 폐암 세포에서 관찰되었다.
또한, 종래 연구에서 1시간 동안 SPC를 전처리 하는 것이 폐암 세포의 이동과 침입을 유도 한다는 점이 확인되었으므로 48시간 SPC 처리 또한 폐암 세포의 이동과 침입을 유도하는지 확인하였다. 구체적으로, Transwell 인서트의 상부 챔버에 플레이팅 하였으며, 셀은 무작위로 선택된 4개의 highpower 필드(20x) 아래에서 연속적으로 계산되었다. 그 결과, 도 2d에 나타난 바와 같이 SPC 48시간 처리 또한 A549 세포의 침입 및 이동을 증가시켰으며, YDJC 발현은 도 2e에 나타난 바와 같이 TGF-ß1에 의한 EMT에서 유도됨을 확인하였다.
실시예 4. YDJC의 폐암 세포의 EMT 촉진 확인.
SPC에 의한 EMT에서 YDJC의 역할을 알아보기 위해, 폐암 세포주에서 SPC-유도 EMT에 대한 YDJC 유전자 사일런싱 및 과발현의 영향을 웨스턴 블롯을 통해 조사 하였다.
그 결과, 도 3a 좌측에 나타난 바와 같이 YDJC의 유전자 사일런싱은 SPC 유도 EMT를 억제함을 확인하였으며 도 3a 우측에 나타난 바와 같이 폐암 세포주에서 스네일(snail) 및 슬러그(slug) 발현을 억제했다. 반면, YDJC 과발현은 SPC 처리 없이도 폐암 세포주에서 EMT, 스네일 및 슬러그 발현을 유도했다. 또한 도 3b에 나타난 바와 같이 YDJC는 H838 및 H1299 폐암 세포에서 SPC에 의한 E-카드헤린의 손실 및 N-카드헤린의 발현을 촉진하나 YDJC siRNA는 이를 억제함을 확인하였다. 상기와 같은 SPC에 의한 E-카드헤린 발현 감소와 A549 세포에서 N-카드헤린의 발현 증가에 YDJC가 관여한다는 것이 공초점 현미경 검사상으로도 확인되었다(도 3c 참조). 또한 도 3d에 나타난 바와 같이 SPC로 유도된 암세포의 이동 및 침윤은 YDJC의 유전자 사일런싱에 의해 억제되었으며 폐암 세포주에서 YDJC의 과발현으로 강화됨을 확인하였다.
다음으로, A549, H838 및 H23 세포를 YDJC siRNA 또는 컨트롤 siRNA로 트랜스펙션한 다음 5μM SPC를 사용한 군과 사용하지 않은 군으로 나누어 48 시간 동안 자극하여 YDJC 유전자를 사일런싱 시켰다. YDJC 유전자의 과발현은 A549, H838 및 H1299 세포를 YDJC를 포함하는 플라스미드 또는 컨트롤인 빈벡터 (4 μg)로 처리하였다. 그리고 SPC (5 μM)로 48 시간 동안 처리하여 형질 전환시킴으로써 분석 하였다. 그 결과, 도 3e에 나타난 바와 같이 TGF-ß1은 YDJC가 안정적으로 녹다운(knockdown)된 A549 폐암세포 (A549shYDJC)에서 E-카드헤린 및 N-카드헤린과 같은 EMT 마커의 변화를 유도할 수 없음을 확인하였다.
상기 결과는 YDJC가 SPC 또는 TGF-ß1 유발 EMT에서 결정적인 역할을 할 수 있음을 의미한다.
실시예 5. 폐암에서 EMT 촉진과 YDJC의 디아세틸레이즈 기능의 연관성
YDJC는 YDJC 수퍼 패밀리에 속하며, YDJC는 탄수화물 디아세틸레이즈 활성을 가지고 있지만, 포유류에서는 아직까지 기질이 확인되지 않았다. EMT에서 탄수화물 디아세틸레이즈가 관여하는 것은 매우 미스테리한 일이다. 그래서 우선, YDJC의 디아세틸레이즈 활성이 SPC-유발 EMT에 있어서 결정적인지 여부를 조사 하였다. 13 위치의 아스파라긴산 (D13)은 중요한 아미노산으로 추정되며, YDJC의 13 위치 (D13)의 아스파라긴산은 지배적인 음성형태인 알라닌 (D13A)으로 바꾸었으며 A549 세포에 YDJC 또는 YDJCD13A가 포함된 플라스미드를 트랜스펙션하고 빈벡터 (4 μg)를 대조군으로 하여 SPC (5 μM)를 48 시간 처리하여 분석하였으며 세포 용해물을 웨스턴 블롯으로 분석 하였다.
그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이 E-카드헤린 및 N-카드헤린과 같은 EMT 마커의 표현은 SPC 처리없이도 YDJC 과발현에 의해 변화했으나 이와 대조적으로, YDJCD13A의 과발현은 EMT 마커의 발현 변화를 유도하지 못했으며 이러한 결과는 도 4b에 나타난 것처럼 공초점 현미경으로도 확인하였다. 또한, 도 4c에 나타난 바와 같이 YDJCD13A의 과발현은 A549 폐암 세포의 SPC 유도 이동 및 침윤을 촉진 할 수 없었다.
상기 결과는 YDJC의 디아세틸레이즈 활성이 SPC에 의한 A549 세포의 EMT에 결정적인 역할을 한다는 것을 의미한다.
실시예 6. YDJC와 CDC16의 결합 확인
SPC 유발 이벤트와 YDJC의 관련성을 밝히기 위해, 먼저 YDJC와 결합하는 단백질을 결정하였다. CDC16이 YDJC에 결합한다는 것을 토대로(Huttlin et al), 공동 면역 침전 (co-IP)에 의한 결과를 확인했으며, 결합을 확인하기 위해, CDC16 항체 및 YDJC 항체를 사용하여 co-IP를 수행하였다. 구체적으로, CDC16 또는 야생형 YDJC를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 A549 세포의 추출물에 대해 CDC16 항체 (IP : CDC16) 또는 YDJC 항체 (IP : YDJC)로 면역 침전을 수행 하였으며 생성된 면역 복합체를 각각 YDJC 또는 CDC16 항체로 면역 블로팅 하였다. 또한, YDJC 및 CDC16의 로컬리제이션(Localization)을 위해 A549 세포를 anti-YDJC항체(적색) 및 FITC-접합 anti-레빗 IgG, FITC-결합 anti-마우스 IgG 및 DAPI (청색)와 결합된 anti-CDC16 항체 (녹색)로 염색 하였다.
그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이 CDC16과 YDJC의 Co-IP는 SPC 처리 없이 완료되었으며, 도 5b에 나타난 바와 같이 공초점 현미경 관찰 결과 CDC16은 핵에서 강하게 발현되었지만 세포기질(cytosol)에서도 발현되었으며 YDJC 발현은 핵뿐만 아니라 세포기질에서도 CDC16과 합쳐짐을 확인하였다.
실시예 7. CDC16의 YDJC 유도 EMT 억제 확인
CDC16이 YDJC 유도 EMT를 억제하는지 확인하기 위하여 YDJC 유발 EMT에서 CDC16 발현의 영향을 조사했다. 구체적으로, CDC16 과발현은 A549 세포에 CDC16이 포함된 플라스미드 및 대조군인 빈벡터 (4 μg)를 트랜스펙션한 후 SPC (5 μM)로 48 시간 처리 한 후 평가하였으며 세포 용해물은 웨스턴 블롯으로 분석 하였다. 그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이 CDC16 과발현은 E-카드헤린의 발현을 증가시키고 A549YDJC 세포에서 N-카드헤린 수준을 감소시킴을 확인하였고, 이러한 결과는 도 6b에 나타난 공초점 현미경을 통한 관찰에서도 마찬가지로 나타났다. 상기 결과는 CDC16이 폐암 세포에서 EMT에 대한 YDJC의 작용을 차단함을 의미한다.
또한, SPC에 의한 EMT에서 CDC16 siRNA의 효과를 조사했다. 구체적으로, CDC16의 유전자 발현 억제는 A549, H838 및 H23 세포를 표시된 양의 CDC16 siRNA 또는 컨트롤 siRNA로 트랜스펙션하고 48 시간 동안 5μM SPC를 사용하거나 사용하지 않고 자극함으로써 수행하였으며 세포 용해물을 웨스턴 블롯으로 분석 하였다. 그 결과, 도 6c에 나타난 바와 같이 CDC16의 유전자 사일런싱은 SPC 처리 없이도 E-카드헤린의 발현을 감소시키고 N-카드헤린 발현을 유도하는 것을 확인하였다. 그러나, 도 6c에 나타난 바와 같이 CDC16의 과발현은 SPC의 존재 하에서 N-카드헤린 수준을 감소시켰고 공초점 현미경을 통하여도 동일한 결과를 확인할 수 있었다(도 6d 참조).
또한, CDC16의 siRNA 및 SPC로 후속 처리 후, A549, H838 및 H1299 세포를 Transwell 인서트의 상부 챔버에서 플레이팅하여 이동 및 침입 분석을 수행 하였다. 그 결과, 도 6e에 나타난 바와 같이 siCDC16은 세포의 이동과 침입을 유도했으나 CDC16 과발현은 SPC에 의한 세포의 이동과 침입을 억제했다. 반면에, 도 6f에 나타난 바와 같이 YDJC 안정적으로 녹다운(knockdown)된 A549 세포주에서는 CDC16 siRNA가 EMT를 유도하지 못함을 확인하였으며, 공초점 현미경 관찰을 통해서도 동일한 결과를 확인할 수 있었다(도 6g 참조). 상기 결과는 YDJC의 상류(upstream)에 위치한 CDC16이 YDJC에 의한 EMT를 억제함을 의미한다.
실시예 8. siCDC16- 유도 EMT에 의한 ERK2 활성화 확인
종래 연구에서 ERK1/2는 YDJC-유도 케라틴-8 인산화에 관여한다는 점이 알려져 있으므로 ERK1/2도 siCDC16 유발 EMT에 관여하는지 여부를 실험 하였다. 구체적으로, A549 세포를 PD98059 (MEK 억제제, 10μM), SP600125 (JNK 억제제, 5μM) 또는 SB203580 (p38 키나아제 억제제, 10μM)로 1시간 동안 처리하거나 처리하지 않는 조건으로 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이 MAP 키나아제 인히비터(MAP kinase inhibitor)는 siCDC16에 의한 E-카드헤린의 소실을 억제하고 N-카드헤린의 발현을 감소시킨다는 점을 확인하였다. E-카드헤린 발현 수준은 MEK 억제제인 PD98059에 의해 현저하게 회복되었으며 이는 도 7b에 나타난 바와 같이 공초점 현미경 검사로 확인되었다.
또한, MAPK 억제제가 CDC16siRNA에 의해 유도된 이동 및 침윤에 대한 억제 효과를 확인하기 위해 1 시간 동안 MAP kinase 억제제를 처리하거나 처리하지 않는 조건으로 나누어 각각 siCDC16을 처리 한 후, A549 세포를 이동 및 침윤 분석을 위해 Transwell 인서트의 상부 챔버에서 플레이팅 하였다. 그 결과, 도 7c에 나타난 바와 같이 MAP 키나아제 억제제는 또한 siCDC16- 유도된 세포의 이동 및 침입을 억제 하였으며, PD98059는 siCDC16- 유도된 세포의 이동 및 침입을 유의하게 억제하였다.
나아가, ERK1 또는 ERK2가 EMT에 관여하는지 여부를 확인한 결과, 도 7d에 나타난 바와 같이 siERK2는 siCDC16에 의한 E-카드헤린 발현의 감소 및 N- 카드헤린 증가된 발현을 억제하였으며 이는 도 7e에 나타난 바와 같이 공초점 현미경 관찰을 통해서도 동일한 결과를 확인할 수 있었다. 또한, 도 7f에 나타난 바와 같이 siERK2와는 달리 siERK1은 siCDC16- 유도된 세포의 이동 및 침윤을 억제하지 않았다. 상기 결과는 ERK2가 A549 폐암 세포의 siCDC16- 유도 EMT를 매개한다는 것을 의미한다.
실시예 9. PP2A (protein phosphatase 2A) 발현에 있어서 CDC16 및 YDJC의 기능
종래 연구에 의하면 YDJC가 CDC16에 결합하고 CDC16이 SPC에 의해 유도된 케라틴-8의 인산화 및 재구성에 있어서 YDJC를 억제한다는 것을 확인했다.
그러나 종래 연구에서는 YDJC가 유도한 케라틴-8 인산화와 재구성화에서 ERK 경로가 활성화되는 이유를 설명 할 수 없었다. 종래의 여러 연구 논문은 PP2A가 ERK 경로를 네거티브 하게 조절한다고 제안했으며 특히 SPC에 의한 EMP2의 소실은 α4와의 상호작용을 통해 PP2A 분해를 일으켜 ERK 활성화를 유도함이 제안되었다. 따라서 본 실험에서는 PP2A 발현에 대한 YDJC 및 CDC16의 효과를 조사 하였다. 구체적으로, A549 세포를 CDC16, YDJC 또는 대조군인 빈벡터 (4㎍)를 함유하는 플라스미드로 트렌스펙션 시키고 세포 용해물은 웨스턴 블롯으로 분석 하였다. CDC16 또는 YDJC의 유전자 사일런싱은 A549 세포에 지시된 양의 CDC16 siRNA, YDJC siRNA 또는 대조 siRNA를 트랜스펙션 함으로써 수행되었으며 세포 용해물은 웨스턴 블롯으로 분석 하였다.
그 결과, 도 8a에 나타난 바와 같이 CDC16이 PP2A 발현을 유도하지만 YDJC는 PP2A 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, CDC16 유전자 사일런싱은 PP2A 수준을 감소시키는 반면, YDJC 유전자 사일런싱은 PP2A 발현을 유도하였다. 한편, 도 8b에 나타난 바와 같이 YDJC가 안정적으로 넉다운된 A549 세포주에서, PP2A 수준은 CDC16 siRNA에 관계없이 증가하였다.
상기 결과와 관련, CDC16이 APC/C 복합체에서 유비퀴틴(ubiquitination) 리가아제를 포함하기 때문에 YDJC 또는 CDC16이 PP2A의 유비퀴틴화에 영향을 미칠 수 있다고 추측하였다. 우선 CDC16 또는 YDJC가 PP2A에 직접 결합하는지 여부를 조사하였다. 구체적으로, CDC16 항체 (IP : CDC16)로의 면역 침전은 CDC16을 포함하는 플라스미드로 트렌스펙션된 A549 세포의 분해물로 수행하였다. 생성된 면역 복합체는 각각 PP2A, YDJC 또는 CDC16 항체로 면역 블로팅 하였다. 그 결과 도 8c에 나타난 바와 같이 YDJC 및 CDC16은 PP2A에 결합함을 확인하였다. YDJCWT 과발현은 대조군 또는 YDJCD13A 과발현에 비해 PP2A 유비퀴틴화를 유의하게 증가시키는 반면(도 8d 참조), CDC16 과발현은 PP2A의 유비퀴틴화를 유도하지 않았다(도 8e 참조). 상기 결과는 PP2A 유비퀴틴화가 YDJC에 의해 영향을 받지만 CDC16 과발현에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 의미한다. 또한, CDC16을 포함하는 플라스미드로 안정적으로 트렌스펙션된 A549 세포 용해물을 사용하여 YDJC 항체 (IP : YDJC)로 면역 침전을 수행 하였다. 생성된 면역 복합체를 각각 YDJC 및 유비퀴틴 (Ub) 항체로 면역 블로팅 하였다. 그 결과 도 8f에 나타난 바와 같이 YDJC는 CDC16 안정적으로 발현된 A549 세포에서 유비퀴틴화되었으며 이러한 결과는 YDJC가 PP2A의 유비퀴틴화를 유도할 수 있음을 암시하지만, CDC16은 YDJC의 유비퀴틴화를 유도함으로써 PP2A 발현을 유지할 수 있음을 의미한다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Use of YDJC in lung cancer <130> MP18-292 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 323 <212> PRT <213> YDJC <400> 1 Met Ser Arg Pro Arg Met Arg Leu Val Val Thr Ala Asp Asp Phe Gly 1 5 10 15 Tyr Cys Pro Arg Arg Asp Glu Gly Ile Val Glu Ala Phe Leu Ala Gly 20 25 30 Ala Val Thr Ser Val Ser Leu Leu Val Asn Gly Ala Ala Thr Glu Ser 35 40 45 Ala Ala Glu Leu Ala Arg Arg His Ser Ile Pro Thr Gly Leu His Ala 50 55 60 Asn Leu Ser Glu Gly Arg Pro Val Gly Pro Ala Arg Arg Gly Ala Ser 65 70 75 80 Ser Leu Leu Gly Pro Glu Gly Phe Phe Leu Gly Lys Met Gly Phe Arg 85 90 95 Glu Ala Val Ala Ala Gly Asp Val Asp Leu Pro Gln Val Arg Glu Glu 100 105 110 Leu Glu Ala Gln Leu Ser Cys Phe Arg Glu Leu Leu Gly Arg Ala Pro 115 120 125 Thr His Ala Asp Gly His Gln His Val His Val Leu Pro Gly Val Cys 130 135 140 Gln Val Phe Ala Glu Ala Leu Gln Ala Tyr Gly Val Arg Phe Thr Arg 145 150 155 160 Leu Pro Leu Glu Arg Gly Val Gly Gly Cys Thr Trp Leu Glu Ala Pro 165 170 175 Ala Arg Ala Phe Ala Cys Ala Val Glu Arg Asp Ala Arg Ala Ala Val 180 185 190 Gly Pro Phe Ser Arg His Gly Leu Arg Trp Thr Asp Ala Phe Val Gly 195 200 205 Leu Ser Thr Cys Gly Arg His Met Ser Ala His Arg Val Ser Gly Ala 210 215 220 Leu Ala Arg Val Leu Glu Gly Thr Leu Ala Gly His Thr Leu Thr Ala 225 230 235 240 Glu Leu Met Ala His Pro Gly Tyr Pro Ser Val Pro Pro Thr Gly Gly 245 250 255 Cys Gly Glu Gly Pro Asp Ala Phe Ser Cys Ser Trp Glu Arg Leu His 260 265 270 Glu Leu Arg Val Leu Thr Ala Pro Thr Leu Arg Ala Gln Leu Ala Gln 275 280 285 Asp Gly Val Gln Leu Cys Ala Leu Asp Asp Leu Asp Ser Lys Arg Pro 290 295 300 Gly Glu Glu Val Pro Cys Glu Pro Thr Leu Glu Pro Phe Leu Glu Pro 305 310 315 320 Ser Leu Leu <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YDJC siRNA <400> 2 gcuucuuccu uggcaagau 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YDJC siRNA <400> 3 aucuugccaa ggaagaagc 19 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDC16-1 siRNA <400> 4 ggacgcuugu agagccugat t 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDC16-1 siRNA <400> 5 uucagcucua caagcgucct t 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDC16-2 siRNA <400> 6 ccgugggauu ucagggaaut t 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDC16-2 siRNA <400> 7 auucccugaa aucccacggt t 21 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERK1 siRNA <400> 8 cggccuauga ccacgugcgc att 23 <210> 9 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERK1 siRNA <400> 9 ugcgcacgug gucauaggcc gtt 23 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERK2 siRNA <400> 10 gaggauugaa guagaacagt t 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERK2 siRNA <400> 11 cuguucuacu ucaauccuct t 21

Claims (14)

  1. YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 YDJC 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  3. YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 YDJC 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 프로브 이고, 상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 YDJC 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머, 단백질, 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 조성물.
  5. 제3항의 조성물을 포함하는 폐암 진단 또는 전이 예후 예측용 키트.
  6. (a) 피검자에서 분리된 시료로부터 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 YDJC 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 YDJC 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 폐암이라고 판단하는 단계를 포함하는 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  7. (a) 폐암환자에서 분리된 시료로부터 YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 YDJC 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 YDJC 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 폐암의 전이 위험성이 높다고 판단하는 단계를 포함하는 폐암 전이 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  8. YDJC(Chitooligosaccharide deacetylase homolog) 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 폐암 전이 억제용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 발현을 억제할 수 있는 제제는 YDJC 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, microRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 활성을 억제할 수 있는 제제는 YDJC 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물, 펩티드, 앱타머, 단백질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐암 전이 억제용 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 YDJC 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 CDC16(Cell division cycle protein 16 homolog)인 것을 특징으로 하는, 폐암 전이 억제용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 CDC16은 YDJC에 의한 프로틴 포스파테이즈 2A(protein phosphatase 2A; PP2A) 발현 감소를 억제하는 것을 특징으로 하는, 폐암 전이 억제용 약학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 CDC16은 상피간엽이행(Epithelial-mesenchymal transition; EMT)을 억제하는 것을 특징으로 하는, 폐암 전이 억제용 약학적 조성물.
  13. 삭제
  14. (a) 폐암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 시험물질을 접촉한 폐암 세포에서 YDJC 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    (c) 대조군 시료와 비교하여 상기 YDJC 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 폐암 전이 억제제 스크리닝 방법.

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