WO2014200134A1 - Ｃｔｈｒｃ１의 발현 및 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 치료 및 전이억제용 조성물 - Google Patents

Ｃｔｈｒｃ１의 발현 및 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 치료 및 전이억제용 조성물 Download PDF

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WO2014200134A1
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cthrc1
pancreatic cancer
expression
activity
antibody
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고상석
김석호
박은혜
송시영
황연실
조지윤
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한국생명공학연구원
연세대학교 산학협력단
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • Pancreatic cancer treatment and metastasis inhibiting composition comprising CTHRC 1 expression and activity inhibitor as an active ingredient
  • the present invention relates to CTHRCKCol lagen triple helix repeat containing— 1) a composition for the treatment and prevention of metastasis of pancreatic cancer comprising a protein expression or activity inhibitor as an active ingredient and its use.
  • pancreatic cancer is an aggressive disease but has the disadvantage of being very difficult to diagnose.
  • pancreatic cancer is one of the most serious malignancies with acute onset, late diagnosis, and low survival rate.
  • Patients with pancreatic cancer are locally advanced, have difficulty in performing resection, show metastatic disease in general, and are often sensitive to the side effects of intensive care. Only 10-15% of patients can be treated by surgical resection, and the rate of relapse remains very high even after radical treatment.
  • new diagnostics for new targets are being developed for the treatment of pancreatic cancer, overall survival has not changed over the last decade. Therefore, new therapeutic strategies for the treatment of pancreatic cancer are needed.
  • CTHRCKCol lagen triple helix repeat containing-1) is a water-soluble protein that acts on vascular remodeling, bone formation, and morphogenesis, and is expressed in damaged arteries to promote cell migration and fiber.
  • Collagen in fibroblasts and smooth muscle cells It is known to have the function of impaired aortic remodeling by inhibiting synthesis.
  • the expression of CTHRC1 in vascular cells regulates transforming growth factor-(TGF- ⁇ ) and thus inhibits the expression of TGF- ⁇ target gene including collagen.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor-
  • recombinant CTHRC1 showed reverse TGF- ⁇ -stimulated collagen type 1 expression and collagen synthesis.
  • CHTRC1 gene transgenic mice increase osteoblast ic bone formation differentiation and mineralization of osteoblastic progenitor cells.
  • CTHRC1 also interacts with Wnt5a to activate the planar cell polarity pathway, confirming the role of CTHRC1 in the regulation of morphogenesis during development.
  • Recent studies have reported the expression of CTHRC1 in cancer cells and the role of CTHRC1 in aggressive tumors.
  • CTHRC1 is mainly expressed in human solid tumors in human tumor cDNA array analysis, and in transcriptome analysis, breast lobular carcinoma and general pancreatic and lobular cells It was confirmed that there is a difference in expression between).
  • CTHRC1 is expressed in invasive primary melanomas and metastatic melanomas, but not in benign nevi or non-invasive samples. Inhibition of CTHRC1 expression also reduced the migration of melanoma cell lines in vitro.
  • CTHRC1 has been identified as dermatofibrosarcoma protuberans, frequently metastasized locally aggressive neoplasms, but not dermatoatocomas, or benign benign fibrohistiocytic tumors. It became. CTHRC1 expression is significantly higher in breast cancer tissues compared to general tissue or precursor lesions and is associated with a risk of bone metastasis. Accordingly, while the present inventors are studying biomarkers for facilitating the diagnosis and treatment of pancreatic cancer, the expression of mRNA and protein of CTHRC1 is increased in pancreatic cancer patient samples, and the CTHRC1 is overexpressed or knocked down.
  • An object of the present invention is to provide a composition for preventing, treating or inhibiting metastasis of pancreatic cancer, a use thereof and a method for preventing, treating or inhibiting metastasis of pancreatic cancer.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for screening a candidate substance for treating pancreatic cancer.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition containing the antibody of the present invention or a fragment having immunological activity as an active ingredient, the use thereof, and a method for preventing, treating, or inhibiting metastases thereof.
  • CTHRC Collagen triple helix repeat containing-1) Provides a pharmaceutical composition for preventing, treating or inhibiting metastasis of pancreatic cancer, which contains an inhibitor of protein expression or activity as an active ingredient.
  • the present invention provides a health food composition for preventing or improving pancreatic cancer containing an inhibitor of CTHRC1 protein expression or activity as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for treating or inhibiting metastasis of pancreatic cancer, comprising administering a pharmaceutically effective amount of an inhibitor of expression or activity of CTHRC1 protein to a subject having pancreatic cancer.
  • the present invention also provides a method for preventing pancreatic cancer comprising administering to a subject an expression or active agent of a pharmaceutically effective amount of CTHRC1 protein.
  • the present invention is also intended for use in the prevention, treatment or suppression of metastasis of pancreatic cancer.
  • inhibitors of the expression or activity of CTHRC1 protein are provided.
  • the present invention also provides the use of an inhibitor of the expression or activity of CTHRC1 protein for use in the manufacture of a medicament for preventing, treating or inhibiting metastasis of pancreatic cancer.
  • the present invention also provides the use of an inhibitor of the expression or activity of CTHRC1 protein for use in the manufacture of health foods for the prevention or improvement of pancreatic cancer.
  • the present invention provides a candidate screening method comprising the following steps:
  • the present invention also provides a human monoclonal antibody specific for a CTHRC1 protein or a fragment with an immunologically active oligonucleotide of the antibody comprising:
  • Heavy chain complementarity determining region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 heavy chain complementarity determining regions (HCDR1), a heavy chain comprising a heavy chain variable region (V H ) comprising HCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and HCDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing, treating or inhibiting metastasis of pancreatic cancer containing the monoclonal antibody of the present invention or a fragment having immunological activity of the antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a health food for preventing or improving pancreatic cancer containing the monoclonal antibody of the present invention or a fragment having immunological activity of the antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for treating or inhibiting metastasis of pancreatic cancer, comprising administering a monoclonal antibody or a fragment having immunological activity of the antibody to a subject having pancreatic cancer.
  • the present invention provides a method for preventing pancreatic cancer, comprising administering to a subject a monoclonal antibody or a fragment having immunological activity of the antibody.
  • the present invention also provides a monoclonal antibody of the present invention or a single use having immunological activity of the antibody for use in the manufacture of a medicament for preventing, treating or inhibiting metastasis of pancreatic cancer.
  • the present invention also provides the use of a monoclonal antibody or fragment having immunological activity of the antibody for use in the manufacture of a health food for the prevention or improvement of pancreatic cancer.
  • a composition for diagnosing pancreatic cancer comprising a substance that determines mRNA or protein levels of a CTHRCl (collagen triple helix repeat containing-1) gene.
  • CTHRCl is preferably described as SEQ ID NO: 17, but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the mRNA level is preferably a primer or probe that specifically binds to the CTHRCl gene, but is not limited thereto.
  • SEQ ID NOs: 1 and 2 Most preferably, the primer set is not limited thereto.
  • the suitable length of the primer can vary depending on various factors, such as temperature and the use of the primer, and the sequence of the primer need not have a sequence that is completely complementary to some of the template. Anything that has sufficient complementarity within the range that can be activated and inherent to the primer can be used.
  • the primer of the present invention does not need to have a sequence that is perfectly complementary to the nucleotide sequence of the CTHRCl gene, which is a template, and any complementary complementarity within the range capable of acting as a primer by hybridizing with the gene sequence is used. It is possible. In addition, it is preferable that the primer according to the present invention can be used for gene amplification reaction.
  • the probe may be single-chain, preferably a natural dNMP (ie, dAMP, dGMP, dDMP and dTMP), nucleotide analogues or derivatives, and more preferably oligodioxyribonucleotides.
  • dNMP ie, dAMP, dGMP, dDMP and dTMP
  • nucleotide analogues or derivatives preferably oligodioxyribonucleotides.
  • the probe may comprise ribonucleotides and may be backbone modified nucleotides such as peptide nucleic acids (PNA), phosphoro thioate DNA, phosphorodithioate DNA, phosphoramidate DNA, amide-linked DNA, ⁇ I-linked DNA, 2′-0-methyl RNA, alpha DNA and methyl phosphonate DNA, Sugar modified nucleotides such as 2'-0-methyl, 2'-fluoro RNA, 2'-amino RNA, 2'-0-alkyl DNA, 2'-0-allyl DNA, 2'-0 alkynyl DNA, nuclear source DNA, pyranosyl RNA and anhydronucleocytic DNA, and nucleotides with base modifications such as C-5 substituted pyrimidine (substituents are fluoro-, bromo-, chloro—, io Do-, methyl-, ethyl-, vinyl-, formine-, ethidyl-
  • the substance for measuring the protein level is preferably an antibody that specifically binds to the CTHRC1 protein, and the antibody may include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies and the like.
  • the inventors have discovered that the CTHRC1 gene is overexpressed by analyzing a sample of a pancreatic cancer patient using a microarray (see FIG. 1A), and the results are analyzed by RT-PCR and immunohistochemistry. Confirmation was performed (see FIGS. 1B and 1C).
  • the present inventors established a cell line in which CTHRC1 is overexpressed or knocked down (see FIG. 2), and tumors generated by injecting the cell line into mice increase tumor progression and metastasis due to overexpression of CTHRC1, and CTHRC1 is knocked down. In this case, it was confirmed that tumor progression and metastasis were inhibited (see FIGS. 3A and 3B).
  • the present inventors confirmed that the mobility and adhesion of tumor cell lines overexpressing CTHRC1 was increased, and the mobility and adhesion of tumor cell lines knocked out of CTHRC1 were inhibited (see FIGS. 4A to 4D).
  • CTHRCl (rCTHRCl) was prepared (see FIG. 5A), and it was confirmed that the motility and adhesion of the cell line were increased in a concentration-dependent manner by transfecting CTHRC1 downed cell lines (FIGS. 5B and 5C). In addition, it was confirmed that the results decreased when the anti-CTHRC1 was added, and the results were confirmed to be CTHRC1 specific effects (FIGS. 4E and 4F).
  • CTHRC1 activates the Sre-FAK signaling mechanism in regulating cell mobility and adhesion, and the phosphorylation of the protein involved in Sre-FAK signaling is increased by overexpression or knockdown of CTHRC1. Or decreased (see FIG. 6A).
  • rCTHRCl was treated by concentration, rCHTRCl-induced fast and transient activity was confirmed (see FIG. 6B), and rCTHRCl-induced Sre-FAK signaling, cell mobility, and adherence were Src inhibitors. And inhibited by MEK inhibitor formulation (see FIGS. 6C and 6H).
  • CTHRC1 induces Rac 1 activity.
  • the expression of CTHRC1 increased or decreased, the expression of GTP-bound Rac 1 increased or decreased (see FIG. 7A), and the activity of rCTHRCl-induced Rac 1. Confirmed that it occurred quickly and temporarily (see FIG. 7B).
  • the mobility and adhesion of the cells was confirmed to be reduced by the Rac 1 inhibitor and dominant negative Rac 1 (see Figs. 7C and 7F).
  • the composition capable of diagnosing pancreatic cancer by measuring the mRNA and protein expression levels of the CTHRC1 gene of the present invention may be useful as a composition for diagnosing pancreatic cancer, as well as a kit using the composition and a composition for treating and inhibiting pancreatic cancer. Confirmed.
  • the present invention provides a kit for diagnosing pancreatic cancer comprising the composition of the present invention.
  • the composition included in the pancreatic cancer diagnostic kit includes a substance for measuring the mRNA or protein level of the CTHRC1 gene, which can measure the mRNA of the gene
  • the substance may include a primer or a probe, and the substance capable of specifying the protein may preferably include an antibody, but is not limited thereto.
  • the kit for diagnosing pancreatic cancer of the present invention is applied to a PCR amplification process, the kit may optionally include reagents required for PCR amplification, for example, complete solution, DNA polymerase, DNA polymerase cofactor and dNTP.
  • the kit preferably includes a secondary antibody and a substrate of a label, but is not limited thereto.
  • the kit may be manufactured in a number of separate packaging or compartments containing the reagent components described above, and the types of kits that may be manufactured with the kit of the present invention may be RT-PCR kits, DNA chip kits, or the like. It is preferably a protein chip kit, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for detecting mRNA of the gene or a protein level thereof for providing information for diagnosing pancreatic cancer comprising the following steps:
  • step 1) selecting the individual whose CTHRC1 gene expression level of step 1) is increased compared to the CTHRC1 gene expression level of the normal control group;
  • step 2) determining that the selected individual of step 2) is at risk of developing pancreatic cancer.
  • the sample is preferably selected from the group consisting of tissue, cells, serum, plasma, blood, saliva and urine, but is not limited thereto.
  • the expression level measurement of step 2) is RT-PCR, real time PCR, Western blot, Northern blot, ELISA, radioimmunoassay, immunohistochemistry and immunoprecipitation assay (iramunoprecipitatat) sphere by ion assay It is preferably selected from the group consisting of, but is not limited thereto. According to a preferred embodiment of the present invention, it is more preferable that it is composed of RT-PCR and immunohistochemistry.
  • the present invention also provides, but is not limited to, a method for screening a therapeutic agent for pancreatic cancer comprising the following steps:
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, treating and inhibiting metastasis of pancreatic cancer containing an inhibitor of CTHRC1 protein expression or activity as an active ingredient.
  • the expression or activity inhibitor of the CTHRC1 protein is preferably any one selected from the group consisting of antisense nucleotides, short interfering RA (short interfering RA) and short hairpin RNA (RNA) complementary to the mRNA of the CTHRC1 gene.
  • the CTHRC1 protein expression or activity inhibitory agent is not limited thereto, but is preferably any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, aptamers, and antibodies that complementarily bind to CTHRC1 protein. Do not.
  • composition for inhibiting the expression of mRNA or protein of the CTHRC1 gene of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the above components.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable additive
  • the pharmaceutically acceptable additives include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, lactose, manni, malt, gum arabic, pregelatinized starch and corn.
  • Starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, loose, opadry, sodium starch glycolate, lead carnauba, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate, white sugar, dextrose Sorbitol and talc may be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention can be administered in various oral and parenteral dosage forms in actual clinical administration, and when formulated, the fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are commonly used, are formulated.
  • Or excipients Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like. Such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, or an inhibitor of expression of mRNA or protein of the CTHRC1 gene. (Calcium carbonate), sucrose (Sucrose), lactose (Lactose) or gelatin can be prepared by mixing.
  • Oral liquid preparations include suspending agents, solution solutions, emulsions and syrups.
  • Water and liquid paraffin which are commonly used as simple diluents, may contain various excipients, for example wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvents and suspensions propylene glycol, vegetable oils such as polyethylene glycol, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • a suppository base witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the composition of the present invention can be administered orally or parenterally according to the desired method. In parenteral administration, it is preferable to select external skin or intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, tablet beer, intramuscular injection or intrathoracic injection. Dosage may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and disease severity.
  • Dosage units may contain, for example, one, two, three or four times the individual dosage, or they may contain 1/2, 1/3 or 1/4 times. Individual dosages specifically contain amounts in which the effective drug is administered at one time, which usually corresponds to all, 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily dose.
  • the effective dose of the composition of the present invention may be 0.0001-10 g / kg, specifically 0.001-1 g / kg, may be administered 1 to 6 times a day. However, since the dose may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc., the above dosage does not limit the scope of the present invention by any method.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormonal therapy, chemotherapy and biological response modifiers for the treatment and suppression of pancreatic cancer.
  • the present invention provides a health food composition for preventing or improving pancreatic cancer containing an inhibitor of CTHRC1 protein expression or activity as an active ingredient.
  • the health food of the present invention may be added with the expression or activity inhibitor of CTHRC1 protein as it is or may be used in combination with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the health food composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates, etc. as additional components, as in the general beverage.
  • Natural carbohydrates described above include monosaccharides such as glucose, fructose, malsaccharides, disaccharides such as sucrose, and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, xylyl, sorbitol, erythritol, etc. It is a sugar alcohol.
  • sweetener natural sweeteners such as tautin, stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin, aspartame, and the like can be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01-0.04 g, preferably about 0.02-0.03 g, per 100 compositions of the present invention.
  • the health food of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, Carbonates and the like used in alcoholic beverages.
  • it may contain flesh for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks.
  • the proportion of such additives is not critical but is usually selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention provides a method for treating or inhibiting metastasis of pancreatic cancer, comprising administering a pharmaceutically effective amount of an inhibitor of expression or activity of CTHRC1 protein to a subject having pancreatic cancer.
  • the present invention provides a method for preventing pancreatic cancer comprising administering to a subject an inhibitor in the expression or activity of a pharmaceutically effective amount of CTHRC1 protein.
  • the pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat the disease at a reasonable benefit or risk ratio applicable to the medical treatment, including the type, severity, activity of the drug, sensitivity to the drug, and administration of the individual's disease. Factors well known in factors and other medical fields, including time, route of administration and rate of release, duration of treatment, and concurrent drug use It can be determined according to the cow.
  • the present invention provides inhibitors of the expression or activity of CTHRC1 protein for use in the prevention, treatment or inhibition of metastasis of pancreatic cancer.
  • the present invention provides the use of an inhibitor of the expression or activity of CTHRC1 protein for use in the manufacture of a medicament for the prevention, treatment or inhibition of metastasis of pancreatic cancer.
  • the present invention provides the use of an inhibitor of the expression or activity of CTHRC1 protein for use in the manufacture of health foods for the prevention or improvement of pancreatic cancer.
  • the present invention also provides a human monoclonal antibody specific for CTHRC1 or a fragment having immunological activity of the antibody comprising:
  • Reprinted complementarity determining comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 area Uheavy chain complementarity determining regionsl, HCDR1) , heavy chain variable region (V H containing the HCDR3 has the amino acid sequence of the HCDR2 and SEQ ID NO: 11 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 Heavy chains, and
  • the CTHRC1 is preferably derived from a human, but is not limited thereto.
  • the heavy chain complementarity determining region preferably has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, but is not limited thereto.
  • the light chain complementarity determining region has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, but is not limited thereto.
  • Fragments having the immunological activity include Fab, Fd, Fab ', dAb, F (ab'), F (ab ') 2 , It is preferably any one selected from the group consisting of scFv, Fv, single-chain Fv dimer and diabody, but is not limited thereto.
  • the antibodies are in the form of whole antibodies as well as functional fragments of antibody molecules.
  • the whole antibody is a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, and each light chain is preferably linked by a heavy chain and a disulfide bond.
  • the functional fragment is a fragment that holds the antigen-binding function of an antibody molecule, for example, of antibody fragments include (i) a light chain variable region (V L) and heavy chain of the variable region (V H) and light chain A Fab fragment consisting of the constant region (C L ) and the first constant region (C H ) of the heavy chain; (iii) an Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iii) a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single antibody; (iv) a dAb fragment consisting of a VH domain (Ward ES et al., Nature 341: 544-546 (1989)); ( ⁇ ) an isolated CDR region; (vi) a
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the polypeptide of the heavy chain of the monoclonal antibody or fragment with immunological activity of the antibody.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding a polypeptide of a light chain of the monoclonal antibody or a fragment having immunological activity of the antibody.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, treating or inhibiting metastasis of pancreatic cancer containing the monoclonal antibody of the present invention or a fragment having an immunological activity of the antibody as an active ingredient.
  • the present invention provides a monoclonal antibody or immunological activity of the antibody of the present invention.
  • the present invention provides a method for treating or inhibiting metastasis of pancreatic cancer, comprising administering a monoclonal antibody or a fragment having immunological activity of the antibody to a subject having pancreatic cancer.
  • the present invention provides a method for preventing pancreatic cancer, comprising administering to a subject a monoclonal antibody or a fragment having immunological activity of the antibody.
  • the present invention provides the use of a monoclonal antibody of the present invention or a fragment with immunological activity of the antibody for use in the manufacture of a medicament for preventing, treating or inhibiting metastasis of pancreatic cancer.
  • the present invention provides the use of a monoclonal antibody or fragment with immunological activity of the antibody for use in the manufacture of a health food for the prevention or improvement of pancreatic cancer.
  • the present invention confirmed that the expression of CTHRC1 mRNA and protein in pancreatic cancer patient samples increased, and the occurrence and metastasis of cancer were increased or suppressed when the CTHRC1 overexpressed or knocked down cell lines were transplanted into mice, respectively.
  • CTHRC1 confirms that the expression of the mobility, adhesion, Src-FAK signal, and expression of Rac 1 is overexpressed or knocked down, and the expression of Rac 1 is increased, respectively. It was confirmed that it can be usefully used as a substance screening method and a composition for inhibiting metastasis and pancreatic cancer.
  • Figure 1A is a diagram showing the increase in CTHRC1 transcripts in pancreatic ductal cancer cells.
  • Figure IB is a diagram showing an increase in CTHRCl mRNA in pancreatic ductal cell carcinoma.
  • 1C is a diagram showing increased expression of CTHRCl in cancerous tissue.
  • FIG. 1D is a diagram showing that CTHRCl is very weakly expressed in normal pancreatic duct epithelial cells but strongly expressed in adenocarcinoma cells.
  • CTHRCl is overexpressed in pancreatic cancer cells, whereas general pancreatic epithelium is weakly expressed (arrow),
  • FIG. 2A is a diagram showing the overexpression of CTHRCl in a MiaPaCa-2 cell line established to overexpress CTHRCl:
  • 2B is a diagram showing no CTHRCl expression in BxPC-3 cell line established to reduce CTHRCl expression:
  • shCTHRCl test group.
  • 3A is a diagram showing tumor metastasis in mice injected with cell lines overexpressing CTHRCl.
  • 3B is a diagram showing that tumor metastasis is suppressed in mice injected with cell lines with reduced CTHRCl expression.
  • 4A and 4B are diagrams showing increased cell mobility and adherence in MiaPaCa-2-CTHRCl cell lines overexpressing CTHRCl:
  • Lam laminin ,
  • Fib fibronectin
  • Col collagen type coUagen type 1).
  • 4C and 4D show reduced cell mobility and adhesion in BxPC-3 and Panc-1 cell lines knocked down CTHRCl:
  • Lam'- laminin Lam'- laminin
  • Fib fibronectin
  • Col collagen type Kcollagen type 1).
  • 4E and 4F show that the increase in mobility and adhesion of cell lines by rCTHRCl decreases with the addition of anti-CTHRC1.
  • 5A is a diagram confirming the expression of recombinant CTHRCl (r CTHRCl) truncated with CTHRCl-Fc and thrombin.
  • 5B and 5C show concentration-dependent increase in mobility and adhesion of MiaPaCa-2 cell lines by rCTHRCl:
  • Lam laminin
  • Fib fibronectin
  • Col collagen type Kcollagen type 1).
  • Figure 6A is a diagram showing that the phosphorylation of the protein involved in the Src-FAR signal increases and decreases, respectively, by CTHRC1 overexpression and decreased expression.
  • FIG. 6B shows that rCTHRCl-induced fast and transient activity appears when rCTHRCl is treated.
  • 6C-6H show that rCTHRCl-induced Src-FAK signaling, cell mobility and cell adhesion are inhibited by Src inhibitor PP2 and MEK inhibitor U0126:
  • FIG. 7A is a diagram showing that the expression of GTP-Rac 1 increases and decreases as the expression of CTHRC1 increases and decreases, respectively.
  • 7B is a diagram showing that rCTHRCl-induced Rac 1 activity is fast and transient.
  • 7C and 7D are graphs showing the mobility and adhesion of cells decreased when the Rac 1 inhibitor NSC23766 was treated.
  • 7E and 7F are diagrams showing the mobility and adhesion of cells decreased when the dominant negative Rac Kdominant-negat ive Rac 1) was treated.
  • pancreatic ductal adenocarcimonas PDA
  • normal pancreatic cell lines normal
  • RT-PCR Reverse transcript ion-polymerase chain reaction
  • total RA was obtained from clinical tissue samples using an RNG kit (RNeasy kit, Qiagen, USA), and premix RT-PCR (PreMix RT) using total RNA (Ambion, USA) consistent with pancreatic tissue as a control.
  • RT-PCR was performed using -PCR, Bioneer, Korea. PCR was performed using the following primers, and the control group used the GAPDH gene. In the PCR process, the reaction was allowed to react for 5 minutes at 97 ° C and 1 minute at 95 ° C for the activation of the polymerase to break the double helix structure of DNA (denaturation step).
  • the primer is reacted for 1 minute at a low degree of 60 ° C to allow the primer to bind to a single strand of DNA (annealing step), and then 72 ° to allow the polymerase to synthesize DNA strands complementary to the single strand of DNA.
  • the reaction was repeated at C for 1 minute (elongation step).
  • the procedure was repeated 35 times to amplify the DNA and then reacted for 10 minutes at 72 ° C. to synthesize single strands of DNA that may remain.
  • CTHRC1_F (SEQ ID NO: 1): 5'-AGC GCC TCT GAG ATC CCC AA-3 ',
  • CTHRC1_R (SEQ ID NO: 2): 5'-TGA ACA AGT GCC AAC CCA GA-3 '
  • GAPDH_F (SEQ ID NO: 3): 5'-TGA TGA CAT C GAA GGT GGT GAA-3 '
  • GAPDiLR (SEQ ID NO: 4): 5'-TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT-3 '.
  • CTHRCl mRNA is increased in pancreatic ductal cell carcinoma compared to normal pancreatic cell line (normal) as shown in FIG. 1B (FIG. 1B). Also, in cancerous tissues as compared to non-cancerous tissues
  • pancreatic cancer tissue obtained surgically from 25 patients was used, all of which were adenocarcinomas.
  • the adenocarcinoma is pancreatic duct
  • CTHRCl was not significantly expressed in normal pancreatic duct epithelial cells, but was strongly expressed in adenocarcinoma cells.
  • 24% (6 of 25 samples) of pancreatic cancer samples were weak or non-expressing CTHRCl, whereas 763 ⁇ 4> (19 of 25 samples) showed moderate or strong expression of CTHRCl in cytoplasm and cell membrane.
  • CTHRCl was strongly expressed in some metastatic cancer cell lines (FIG. 1D). The results were not related to the patient's history, age or gender. ⁇ Example 2> Confirmation of the effect of CfflRCl in the progression and metastasis of the tumor
  • Panc-1, MiaPaCa-2 and BxPC-3 Human pancreatic cancer cell lines Panc-1, MiaPaCa-2 and BxPC-3 were purchased from the ATCCXAmerican Type Culture Collection, and the cell lines contained 10% fetal bovine serum for Panc-1 at 37 ° C and 5% C0 2 .
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • DIA containing 103 ⁇ 4 fetal bovine serum and 2.5% horse serum for MiaPaCa-2
  • RPMI containing 10% fetal bovine serum for BxPC-3.
  • PCR was performed using the following primers to encode a coding region of CTHRC1, and the obtained PCR products were prepared by using pcDNA3. Cloned into l (+)-MycHis (Invitrogen, USA) vector, the resulting CTHRC1 expression vector was named pLFG238:
  • CTHRC1_2— F (SEQ ID NO: 5): 5'-CCT TGG TAC CGG CCA TCA GGG CCA TGC GAC CCC AGG GCC CCGC-3 ', and
  • CTHRC1_2_R (SEQ ID NO: 6): 5 '-(XT TTC TAG ATG GGC CAG CCA GGC CTT TTG GTA GTT CTT CM TAA TG-3'.
  • the lentivirus vector used as the negative control was shLenti2.4G-Ctrl as set forth in SEQ ID NO: 8 (5'- MTCGCATAGCGTATGCCGTT-3 '). After the introduction of the prepared shLenti2.4G-CTHRC1 or shLenti2.4G-Ctrl into the cells, cell lines stably expressing shRNA were selected using puromycin.
  • the western blot was prepared by washing the cell line with PBS and lysing the cells in 1 X RIPA buffer to prepare the extracted protein, and the culture supernatants were microcon centrifugal filters. , Mi 1 ⁇ pore, USA) was prepared by concentration.
  • the protein was quantified in concentration using the BCA method.
  • the same amount of protein was separated using SDS running buffer by PAGE electrophoresis and transferred to nitrocel membrane (nitrocel lulose membrane, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK).
  • 5% fat-free milk was used in PBS containing 0.13 ⁇ 4 Tween 20, treated with primary antibody and reacted overnight at 4 ° C. I was.
  • the membrane was developed using the ECUPierce, Rockford, IL, USA) method.
  • MiaPaCa-2-CTHRCl overexpressing CTHRCl, and BxPC-3-shCTHRCl and Panc-1-shCTHRCl knocked down CTHRCl were established, respectively (Fig. 2).
  • MiaPaCa-2-Mock, BxPC3-shCtrr and Panc-1-shCtrl cell lines were established as negative control cell lines, respectively.
  • Example ⁇ 2-3> improves the progression and metastasis of cancer in the mouse.
  • the firefly luciferase gene (Lent iM1.4-Luci, Macrogen, Korea) was used as a lentiviral gene transfer to the cell line established in Example ⁇ 2-3>.
  • the lentiviral used for the gene insertion has a system that can freely enter the nucleus through the nuclear pores as an RNA virus, moves into the nucleus of the cell, is inserted into the genomic DNA (DAN), and the gene is expressed when a specific environment is reached. It has the characteristic to let.
  • recombinant DNA in which a fire leucif erase gene is injected into a pLVX vector is produced such as a lipofectamine (WPRE, CPPT, or RRE vector for viral packaging).
  • WPRE lipofectamine
  • CPPT CPPT
  • RRE vector for viral packaging a lipofectamine
  • Hpofectamine Hpofectamine
  • Serum-free medium containing CTHRC1, and BxPC-3 and Panc-1 cell lines 1 ⁇ 10 5 eel Is knocked down with CTHRC1 was prepared at 1 ug / ml of laminin, vitronectin, fibronectin ( fibronectin), or collagen type 1), which is coated on top of Transell inserts (Corning, USA), and the bottom is filled with medium containing 10% fetal bovine serum. After incubating the transwell for 20 hours under conditions of 53 ⁇ 4 CO 2 , 37 ° C., the necessary chemicals, antibodies or recombinant proteins are placed on top. The number of migrated cells was measured using methods well known to those skilled in the art.
  • cell adherence used 96-wells coated with 1 ug / ml laminin, vitronectin, fibronectin, or collagen type Kcollagen type 1). Cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 eel Is / well in 100 ul of medium containing 2% serum and incubated at 37 ° C. Unattached cell lines were removed by washing twice with PBS and the number of attached cells was determined using methods well known to those skilled in the art.
  • Example 4 CTHRC1 Regulates Cell Migration and Adhesion Using an Autocrine manner
  • pcDNA3.1 (+ Recombinant CTHRC1 inserted in the) was first produced and named pGR235.
  • the prepared plasmid was stably transfected into the CiiO / dhfr-cell line, and clones expressing rCTHRCl were adapted as cultured in a medium in which the concentration of methotrexate (methotrexate, Sigma, USA) was gradually increased.
  • methotrexate methotrexate
  • rCTHRCl was cleaved into thrombin in CTHRCl-Fc and released, which was confirmed by performing the western blot described above using anti-Fc (Sigraa, USA) and anti-CTHRCKAbcam and Abgent, USA) antibodies Purified by well known methods.
  • FIG. 6A As a result, as shown in FIG. 6A, overexpression of CTHRC1 resulted in increased phosphorylation of the protein involved in Sre-FAK signal, whereas decrease in phosphorylation of the protein involved in Sre-FAK signal when CTHRC1 knocked down.
  • FIG. 6A rCTHRCl-induced fast, transient activity when the MiaPaCa-2 cell line was incubated for 16 hours in serum-starved conditions and treated with rCTHRCl for 0, 5, 10, 30, 120 or 720 minutes. It was confirmed (FIG. 6B) and rCTHRCl-induced Sre-FAK signaling, cell mobility and cell adhesion were inhibited by Src inhibitor PP2 and MEK inhibitor U0126 (FIGS. 6C-6H).
  • FIG. 7 the expression and expression of GTP-Rac 1 increased and decreased as CTHRC1 expression increased and decreased (FIG. 7A), and rCTHRCl-induced Rac 1 activity reached its peak after 5 minutes of stimulation. (FIG. 7B).
  • the mobility and adhesion of the cells was reduced when the Rac 1 inhibitor NSC23766 was treated (Figs. 7C and 7E), and also when the dominant negative Rac 1 (dominant -negative Rac 1) was also confirmed. (FIG. 7D and FIG. 7F).

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Abstract

본 발명은 췌장암 진단 및 스크리닝용 단백질 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 췌장암 환자 시료에서 CTHRC1의 mRNA 및 단백질의 발현이 증가하고, 상기 CTHRC1이 과발현 또는 녹다운된 세포주를 주입한 마우스에서 각각 암의 발생 및 전이가 증가 또는 억제되는 것을 확인하였으며, 또한, CTHRC1이 과발현 또는 녹다운되도록 세포주를 수립하여, CTHRC1의 과발현 또는 녹다운이 세포의 이동성, 부착성, Src-FAK 신호 및 Rac 1의 발현의 발현이 각각 증가 또는 억제되는 것을 확인함으로써, 췌장암 진단용 조성물 및 킷트, 진단방법, 활성물질 스크리닝 방법 및 췌장암의 치료 및 전이 억제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
CTHRC 1의 발현 및 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 치료 및 전이억제용 조성물
【기술분야】
본 발명은 CTHRCKCol lagen triple helix repeat containing— 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 치료 및 전이억제용 조성 물 및 이의 용도에 관한 것이다.
【배경기술】
췌장암은 공격적인 질환이나 이를 진단하기 매우 어렵다는 단점이 있다. 또한， 췌장암은 급성으로 발병하고, 진단이 늦으며， 낮은 생존율을 보이는 가장 심 각한 악성종양 증 하나이다. 췌장암 환자는 국소 진행성이고， 절제술을 실시하기 에 어려운 점이 많으며， 전이성의 질환을 일반적으로 보이고， 종종 집중치료에 의 한부작용에 민감하게 반웅한다. 환자 중 오직 10내지 15%만이 수술적 절제로 치 료할 수 있는 형태이며， 수술로 근본적인 치료를 한 이후에도 재발의 비율이 매우 높은 상태로 남아있다. 비록 신규한 표적에 대한 새로운 진단방법이 췌장암 치료 를 위해 개발되고 있지만, 전체적인 생존율은 지난 십 년간 변화가 없는 실정이다. 따라서 , 췌장암의 치료를 위한 신규 치료 전략이 필요하다.
CTHRCKCol lagen triple helix repeat containing-1)은 혈관 리모델링 (vascular remodeling), 골 형성 (bone formation) , 및 형태형성 (morphogenesis)에 작용하는 수용성 단백질이고, 손상된 동맥에서 발현하여ᅳ 세포 이동을 촉진하고， 섬유아세포 (fibroblasts) 및 연성근육세포 (smooth muscle cell)에 있어서 콜라겐 합성을 억제하여 손상된 대동맥 리모델링의 기능이 있음이 알려져 있다. 혈관세포 에서 CTHRC1의 발현은 형질전환생장인자 -β (transforming growth factor- ； TGF- β)를 조절하고， 따라서, 콜라겐을 포함하는 TGF-β 표적 유전자의 발현을 억제한 다. 특히， 켈로이드 섬유아세포 (keloid fibroblast)에 있어서， 재조합 CTHRC1은 역으로 TGF-β-자극된 콜라겐 1형 발현 및 콜라겐 합성을 나타냈다. CHTRC1 유전 자 이식 쥐 (transgenic mice)는 골모세포의 뼈 형성 (osteoblast ic bone formation) 골전구세포 (oste이 progenitor cells)의 분화 및 무기화 (mineralization)를 증가시킨 다. CTHRC1은 또한 Wnt5a와 상호결합하여 평면 세포 극성 (planar cell polarity) 경로를 활성화시켜, 발달과정 동안 형태형성의 조절에 CTHRC1의 역할을 확인할 수 있다. 최근의 연구에 의하면， 암세포에서 CTHRC1의 발현 및 공격적인 종양 (agressive tumor)에서 CTHRC1의 역할이 보고되었다. 인간 종양 cDNA어레이 분석 에서 CTHRC1이 인간 고형암 (solid tumor)에서 주로 발현하고， 전사체 분석 (transcriptome analysis)에서 소엽성 유암 (breast lobular carcinoma) 및 일반 췌 관세포 (ductal cell) 및 소엽세포 (lobular cell) 사이에서 발현의 차이가 있음올 확인하였다. CTHRC1은 침습성 원발성 흑색종 (primary melanomas) 및 전이성 혹색 종 (metastatic melanomas)에서 발현하나, 양성 모반 (benign nevi) 또는 비-침습성 시료에서는 발현되지 않았다. 또한 CTHRC1 발현의 억제는 혹색종 세포주의 이동을 시험관 내에서 감소시켰다. CTHRC1은 융기성 피부섬유육종 (dermatofibrosarcoma protuberans), 빈번히 전이되는 국부적으로 공격적인 신생종양 (neoplasms)으로 확 인되었으나， 피부육종 (deraatosarcomas), 일반적인 양성의 섬유조직구 종양 (benign fibrohistiocytic tumor)은 아님이 확인되었다. CTHRC1 발현은 일반조직 또는 전 구체 장애 (precursor lesions)와 비교하여 유방암 조직에서 유의적으로 높고， 골 전이 (bone metastasis)의 위험과 연관되어 있다. 이에, 본 발명자들은 췌장암의 진단 및 치료를 용이하게 하기 위한 바이오 마커를 연구하던 중， 췌장암 환자 시료에서 CTHRC1의 mRNA 및 단백질의 발현이 증 가하고， 상기 CTHRC1이 과발현 또는 녹다운 (knock-down)된 마우스에서 각각 암의 발생 및 전이가 증가또는 억제되는 것을 확인하였으며， 또한, CTHRC1이 과발현 또 는 녹다운 세포주를 확립하여， CTHRC1의 과발현 또는 발현억제가 세포의 이동성， 부착성， Src-FAK신호 및 Rac 1의 발현이 각각 증가또는 억제되므로， 상기 마커를 췌장암 진단, 치료 및 전이 억제용 조성물에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으 로써 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 췌장암 예방, 치료 또는 전이 억제용 조성물， 이의 용도 및 이를 이용한 췌장암 예방， 치료 또는 전이억제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암 바이오 마커인 CTHRC1 단백질에 특이적인 인간 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성올 가진 단편을 제공하는 것이 다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 유효성분으로 함유하는 조성물， 이의 용도 및 이를 이용한 예방， 치료 또는 전이억제 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여, CTHRC Collagen triple helix repeat containing-1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 췌장암을 가진 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 치료 또는 전이 억제 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 예방방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 췌장암의 예방， 치료 또는 전이 억제에 사용하기 위한
CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 제공한다.
또한， 본 발명은 췌장암의 예방, 치료 또는 전이 억제용 약제의 제조에 사 용하기 위한 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 췌장암의 예방 또는 개선용 건강식품의 제조에 사용하기 위한 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 후보물질 스크리닝 방법을 제공한 다:
1) 피검체로부터 수득한 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 CTHRC1의 발현 또는 활성수준을 측정하는 단 계；
3) 상기 단계 2)의 CTHRC1의 발현 또는 활성수준이 피검물질 무처리 대조군 에 비해 감소하는 피검물질올 선별하는 단계.
또한, 본 발명은 하기를 포함하는 CTHRC1 단백질에 특이적인 인간 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성올 가진 단편을 제공한다:
서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역 heavy chain complementarity determining regionsl, HCDR1), 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2및 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영 역 (VH)을 포함하는 중쇄 , 및
서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역 1( light chain complementarity determining regions, LCDR1), 서열번호 14의 아미노산서열을 갖 는 LCDR2 및 서열번호 15의 아미노산서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역 (VL)을 포함하는 경쇄.
또한, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성 을 가진 단편을 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학 적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성 을 가진 단편을 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 개선용 건강식품을 제공 한다.
또한， 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성 을 가진 단편을 췌장암을 가진 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 치료 또는 전이억제 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성 을 가진 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 예방방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 췌장암의 예방， 치료 또는 전이 억제용 약제의 제조에 사 용하기 위한 본 발명의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단 편의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 췌장암의 예방 또는 개선용 건강식품 제조에 사용하기 위 한 본 발명의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편의 용도 를 제공한다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 CTHRCl (collagen triple helix repeat containing-1) 유전자의 mRNA또는 단백질 수준을 축정하는 물질을 포함하는 췌장암 진단용 조성물을 제공 한다.
상기 CTHRCl은 서열번호 17로 기재되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않 는다.
상기 mRNA 수준을 측정하는 물질은 CTHRCl 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 (primer) 또는 탐침 (probe)인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않고, 본 발 명의 바람직한 실시예에 의하면, 서열번호 1 및 2로 기재되는 프라이머 셋트인 것 이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 프라이머의 적합한 길이는 다양 한요소， 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있고, 프라이 머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과흔성화되어 프라이머 고유의 작용을 할수 있는 범위 내에서의 충분한 상보 성을 가지는 것은 모두 사용가능하다. 따라서 본 발명의 프라이머는 주형인 CTHRCl 유전자의 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으 며, 상기 유전자 서열과 흔성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 층분 한 상보성을 가지지는 것은 모두 사용가능하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반웅에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
아울러, 상기 탐침은 단일쇄일 수 있으며, 자연 dNMP (즉， dAMP, dGMP, dDMP 및 dTMP), 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체인 것이 바람직하고, 을리고디옥시리보 뉴클레오티드인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 탐침은 리보뉴클레오티드를 포 함할 수 있고， 골격 변형된 뉴클레오티드 예를 들어, 펩티드 핵산 (PNA), 포스포로 티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연 결된 DNA, 讓 I-연결된 DNA, 2'-0-메틸 RNA, 알파 DNA 및 메틸 포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오티드 예를 들어， 2'-0-메틸， 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-0-알킬 DNA, 2'-0-알릴 DNA, 2'-0 알카이닐 DNA, 핵소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로핵시를 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오티드 예를 들어, C-5 치환된 피 리미딘 (치환기는 플루오로-， 브로모-, 클로로—， 아이오도-， 메틸-， 에틸-， 비닐-, 포르민-, 에티딜-, 프로피닐-， 알카이닐-， 티아조릴-, 이미다조릴-， 피리딘- 포함) C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-， 브로모-， 클로로-， 아이오도 -， 메틸-， 에틸-， 비닐-, 포르밀-， 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴ᅳ， 이미다조릴-， 피리딜 -), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
상기 단백질 수준을 측정하는 물질은 CTHRC1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것이 바람직하고, 상기 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등을 포함할수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, 본 발명자들은 췌장암 환자의 시료를 마이크로어 레이를 이용하여 분석하여 CTHRC1 유전자가 과발현되는 것을 발견하였고 (도 1A 참 조), 상기 결과를 RT-PCR 및 면역조직화학법을 수행하여 확인하였다 (도 1B 및 1C 참조).
또한, 본 발명자들은 CTHRC1이 과발현 또는 녹다운된 세포주를 수립하여 (도 2 참조)， 상기 세포주를 마우스에 주입하여 발생하는 종양이 CTHRC1의 과발현에 의 해서 종양의 진행 및 전이가 증가하고， CTHRC1이 녹다운된 경우에는 종양의 진행 및 전이가 억제되는 것올 확인하였다 (도 3A 및 3B 참고).
또한, 본 발명자들은 CTHRC1이 과발현된 종양 세포주의 이동성 및 부착성이 증가하고， CTHRC1이 녹다운된 종양 세포주의 이동성 및 부착성은 억제됨을 확인하 였다 (도 4A 내지 4D 참조).
아울러, 본 발명자들은 상기 CTHRC1이 종양 세포주의 이동성 및 부착성올 조절하는 방식이 자가활성 방식 (autocrine manner)인지 확인하기 위하여, 재조합 CTHRCl(rCTHRCl)을 제작하여 (도 5A 참조)， CTHRC1이 다운된 세포주에 형질감염함으 로써 상기 세포주의 운동성 및 부착성이 농도의존적으로 증가함을 확인하였다 (도 5B 및 5C). 아울러 상기 결과가 항 -CTHRC1을 첨가할 때는 감소함을 확인하여， 상 기 결과가 CTHRC1 특이적인 영향임을 확인하였다 (도 4E 및 4F).
또한， CTHRC1이 세포의 이동성 및 부착성을 조절함에 있어서， Sre-FAK 신호 전달 기작을 활성화하는지 확인하였고, CTHRC1의 과발현 또는 녹다운에 의해서 Sre-FAK신호전달에 있어서， 이에 관여하는 단백질의 인산화가 증가또는 감소함을 확인하였다 (도 6A 참고). 또한, rCTHRCl을 농도별로 처리하였을 때， rCHTRCl-유도 된 빠르고 일시적인 활성을 확인하였고 (도 6B 참조), 상기 결과와 같은 맥락으로 rCTHRCl-유도된 Sre-FAK신호전달， 세포 이동성 및 부착성이 Src 억제제 및 MEK 억 제제에 의해서 억제됨을 확인하였다 (도 6C 및 6H 참조).
마지막으로, CTHRC1이 Rac 1의 활성을 유도하는가를 확인하였는데, CTHRC1 의 발현이 증가 또는 감소함에 따라서 GTP 결합한 Rac 1의 발현이 증가 또는 감소 하였고 (도 7A 참조)， rCTHRCl-유도된 Rac 1의 활성은 빠르고 일시적으로 일어남을 확인하였다 (도 7B 참조). 또한， 세포의 이동성 및 부착성이 Rac 1 억제제 및 우성 음성 Rac 1에 의해서 감소함을 확인하였다 (도 7C 및 7F 참조).
따라세 본 발명의 CTHRC1 유전자의 mRNA 및 단백질 발현수준을 측정하여 췌장암을 진단할 수 있는 조성물은 췌장암 진단용 조성물뿐만 아니라, 상기 조성물 을 이용한 키트 및 췌장암 치료 및 전이억제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음 을 확인하였다. 아울러 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트 (kit)를 제공한다.
상기 췌장암 진단용 키트에 포함되는 조성물은 CTHRC1 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하고, 상기 유전자의 mRNA를 측정할 수 있는 물질로는 프라이머 또는 탐침을 포함하며， 상기 단백질을 특정할 수 있는 물질로는 항체를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한 본 발명의 췌장암 진단용 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 상기 키트는 선택적으로 PCR증폭 에 필요한 시약, 예를 들어， 완층액， DNA중합효소, DNA 증합효소 조인자 및 dNTP 를 포함하는 것이 바람직하고， 상기 췌장암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 상기 키트는 선택적으로 이차항체 및 표지의 기질을 포함하는 것이 바람직하 나 이에 한정하지 않는다. 나아가， 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다 수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며， 본 발명의 키트로 제작될 수 있는 키트의 종류로는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 췌장암 진단의 정보를 제공하기 위한상기 유전자의 mRNA또는 이의 단백질 수준 검출방법을 제공하나 이에 한정하 지 않는다:
1) 피검체로부터 수득한 시료에서 CTHRC1 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 CTHRC1유전자 발현 수준이 정상대조군의 CTHRC1 유전자 발현 수준에 비해 증가하는 개체를 선별하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 선별된 개체가 췌장암에 걸릴 위험을 가진 개체로 판단 하는 단계 .
상기 단계 1)에 있어서， 상기 시료는 조직， 세포， 혈청， 혈장， 혈액， 타액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 단계 2)의 상기 발현수준 측정은 RT-PCR, 실시간 PCR(real time PCR), 웨스턴 블랏, 노던 블랏， ELISA, 방사선면역분석 (radioimmunoassay), 면역조직화학 법 (immnunohistochemistry) 및 면역침전분석법 (iramunoprecipitat ion assay)으로 구 성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며， 본 발명의 바람 직한 실시예에 따르면 RT-PCR 및 면역조직화학법으로 구성되는 것이 더욱 바람직하 다. 또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 췌장암 치료물질 스크리닝 방법을 제공하나 이에 한정하지 않는다:
1) 피검체로부터 수득한 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 CTHRC1의 발현 또는 활성수준을 측정하는 단 계;
3) 상기 단계 2)의 CTHRC1의 발현 또는 활성수준이 피검물질 무처리 대조군 에 비해 감소하는 피검물질을 선별하는 단계. 아울러 본 발명은 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방, 치료 및 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 CTHRC1 유전자의 mRNA에 상 보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드， 작은 간섭 RNA(short interfering R A) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 상기 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억 제제는 CTHRC1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물， 펩티드， 펩티드 미메틱스， 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한 정하지 않는다.
본 발명의 CTHRC1 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현을 억제하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유 할수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으 며， 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분， 젤라틴화 전분， 미결정셀롤 로오스， 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스， 만니를， 엿， 아라비아고무， 전호화전분， 옥수수전분， 분말셀를로오스， 히드톡시프로필셀를 로오스, 오파드라이， 전분글리콜산나트륨， 카르나우바 납, 합성규산알루미늄， 스테 아린산, 스테아린산마그네슴， 스테아린산알루미늄， 스테아린산칼슘, 백당， 덱스트 로스， 소르비를 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉， 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제， 증량제， 결 합제， 습윤제, 붕해제， 계면활성제 등의 회석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제， 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포 함되며， 이러한 고형 제제는 CTHRC1유전자의 mRNA또는 단백질의 발현올 억제제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분, 칼슴카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose), 락토오스 (Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한， 단순한부형제 이외에 마그네슴 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되 는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예 를 들면 습윤제， 감미제， 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위 한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제， 현탁제， 유제， 동결건조제제, 좌제가 포 함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴 리에틸렌 글리콜 을리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주사 가 능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로 골， 트휜 (tween) 61， 카카오지， 라우린지， 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며， 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사， 정 맥주사， 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투 여량은 환자의 체중, 연령， 성별, 건강상태， 식이， 투여시간, 투여방법， 배설율 및 질환의 증증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
투약 단위는， 예를 들면 개별 투약량의 1， 2， 3 또는 4배를 함유하거나 또 는 1/2, 1/3또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물 이 1회에 투여되는 양을 함유하며， 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2， 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 - 10 g/kg일 수 있고, 구체적으로 0.001 - 1 g/kg일 수 있으며， 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다. 그러나， 투여 경로, 질병의 중증도， 성별, 체중， 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상 기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 췌장암 치료 및 전이억제를 위하여 단독으로， 또는 수 술, 방사선 치료， 호르몬 치료， 화학 치료 및 생물학적 반웅 조절제를 사용하는 방 법들과 병용하여 사용할수 있다. 본 발명은 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하 는 췌장암 예방또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강식품은 CTHRC1.단백질의 발현 또는 활성 억제제를 그대로 첨 가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 CTHRC1 단백질의 발 현 또는 활성 억제제를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지， 빵， 초콜릿, 캔디류, 스넥류， 과자류, 피자, 라면， 기타 면류, 껌류， 아이스크림류를 포함한 낙 농제품， 각종 스프， 음료수， 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있 으며， 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포 도당， 과당과 같은 모노사카라이드， 말토스， 슈크로스와 같은 디사카라이드， 및 덱 스트린， 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드， 자일리를， 소르비를, 에리트리 를 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴， 스테비아 추출물과 같은 천연 감미 제나， 사카린， 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 0.01 - 0.04 g, 바람직 하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제， 비타민， 전해질， 풍미 제， 착색제， 펙트산 및 그의 염， 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보호성 콜로이드 증 점제, pH조절제， 안정화제， 방부제， 글리세린， 알코올 탄산음료에 사용되는 탄산 화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료 의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 흔합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제 를 췌장암을 가진 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 치료 또는 전이억제 방 법을 제공한다.
본 발명은 약학적으로 유효한 양의 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제 를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 예방방법을 제공한다.
상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또 는 위험 비율로 질환을 치료하기에 층분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종 류, 중증도, 약물의 활성， 약물에 대한 민감도， 투여시간， 투여 경로 및 배출비율， 치료기간， 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요 소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명은 췌장암의 예방， 치료 또는 전이 억제에 사용하기 위한 CTHRC1 단 백질의 발현 또는 활성 억제제를 제공한다.
본 발명은 췌장암의 예방， 치료 또는 전이 억제용 약제의 제조에 사용하기 위한 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 췌장암의 예방 또는 개선용 건강식품의 제조에 사용하기 위한 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 하기를 포함하는 CTHRC1에 특이적인 인간 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 제공한다:
서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 증쇄 상보성 결정영역 Uheavy chain complementarity determining regionsl, HCDR1), 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 및 서열번호 11의 아미노산서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영 역 (VH)을 포함하는 중쇄， 및
서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역 1( light chain complementarity determining regions, LCDR1), 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖 는 LCDR2 및 서열번호 15의 아미노산서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역 (VL)을 포함하는 경쇄.
상기 CTHRC1은 인간 유래인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 중쇄 상보성 결정영역은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 것이 바 람직하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 경쇄 상보성 결정영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 것이 바 람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv, Fv, 단일쇄 Fv 이량체 및 디아바디 (diabody)로 이루어진 군으로부터 선택되 는 어느 하나인 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 항체는 전체 (whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단 편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄 를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 또한， 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하 고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역 (VL) 및 중쇄의 가 변영역 (VH)과 경쇄의 불변역역 (CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역 (CH)으로 이루어진 Fab단편; (ϋ) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward ES et al. , Nature 341:544-546 (1989)]； (ν) 분리된 CDR 영역 ; (vi) 2개의 연결된 Fab단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편 ; (vii) VH 도메인 및 도메인이 항 원 결합부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv분 자 (scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디 (diabody) W094/ 13804) 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론 항체의 중쇄 또는 상기 항체의 면역학적 활 성을 가진 단편의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 단일클론 항체의 경쇄 또는 상기 항체의 면역학적 활 성을 가진 단편의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가 진 단편을 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조 성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가 진 단편을 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가 진 단편을 췌장암을 가진 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 치료 또는 전이 억제 방법을 제공한다 .
본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가 진 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 예방방법을 제공한다.
본 발명은 췌장암의 예방， 치료 또는 전이 억제용 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편의 용 도를 제공한다 .
본 발명은 췌장암의 예방 또는 개선용 건강식품 제조에 사용하기 위 한 본 발명의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편의 용도를 제공 한다 .
【유리 한 효과】
본 발명은 췌장암 환자 시료에서 CTHRC1의 mRNA 및 단백질의 발현이 증가하 고 , 상기 CTHRC1이 과발현 또는 녹다운 세포주를 마우스에 이식하였을 때， 각각 암 의 발생 및 전이가 증가 또는 억제되는 것을 확인하였다 . 또한 , CTHRC1이 과발현 또는 녹다운 세포주의 이동성 , 부착성， Src-FAK 신호 및 Rac 1의 발현의 발현이 각 각 증가 또는 억 제됨을 확인하여 , 상기 CTHRC1을 이용한 췌장암 진단용 조성물 및 키트 , 진단방법 , 활성물질 스크리닝 방법 및 췌장암의 치료 및 전이 억제용 조성물 로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다 .
【도면의 간단한 설명】
도 1A는 췌장관세포암 시료에서 CTHRC1 전사체가 증가하는 것을 나타내는 도이다. 도 IB는 췌장관세포암에서 CTHRCl mRNA가 증가하는 것을 나타내는 도이다. 도 1C는 암성 조직 (cancerous tissue)에서 CTHRCl의 발현이 증가하는 것을 나타내는 도이다.
도 1D는 정상 췌장관 상피세포에서는 CTHRCl이 매우 약하게 발현되었지만， 선암 세포에서는 강하게 발현되는 것을 나타내는 도이다.
a: 췌장암 세포에서 CTHRCl이 과발현하고， 반면에 일반 췌장 상피세포 (ductal epithelium)는 약하게 발현 (화살표),
b: 췌장암에서 음성 CTHRCl 발현의 경우,
c: 췌장암에서 CTHRCl이 강하게 발현하는 경우，
d: 막또는 세포질의 CTHRCl 발현을 고배율로 관찰,
e: 종양세포의 임파절 전이 (nodal metastasis)에서 CTHRCl이 강하게 발현,
1및
f: 음성대조군.
도 2A는 CTHRCl이 과발현되도록 수립된 MiaPaCa-2 세포주에서 CTHRCl가 과 발현되는 것을 나타내는 도이다:
Mock: 대조군, 및
CHTRC1: 시험군.
도 2B는 CTHRCl 발현이 감소되도록 수립된 BxPC-3 세포주에서 CTHRCl이 발 현되지 않는 것을 나타내는 도이다:
shCtrl: 대조군， 및
shCTHRCl: 시험군.
도 2C는 CTHRCl이 녹아웃되도록 수립된 Panc-1 세포주에서 CTHRCl이 발현되 지 않는 것을 나타내는 도이다:
shCtrl: 대조군， 및
shCTHRCl： 시험군. 도 3A는 CTHRCl이 과발현되는 세포주를 주입한 마우스에서 종양이 전이되는 것을 나타내는 도이다.
도 3B는 CTHRCl 발현이 감소된 세포주를 주입한 마우스에서 종양의 전이가 억제되는 것을 나타내는 도이다.
도 4A 및 4B는 CTHRCl이 과발현되는 MiaPaCa-2-CTHRCl 세포주에서 세포의 이동성 및 부착성이 증가하는 것을 나타내는 도이다:
Lam: 라미닌 (laminin)，
Vit: 비트로넥틴 (vitronectin),
Fib: 피브로넥틴 (fibronectin), 및
Col: 콜라겐 유형 coUagen type 1).
도 4C 및 4D는 CTHRCl이 녹다운된 BxPC-3 및 Panc-1 세포주에서는 세포의 이동성 및 부착성이 감소하는 것을 나타내는 도이다:
Lam'- 라미닌 ( laminin)，
Vit: 비트로넥틴 (vitronectin),
Fib: 피브로넥틴 (fibronectin), 및
Col: 콜라겐 유형 Kcollagen type 1).
도 4E 및 4F는 rCTHRCl에 의한 세포주의 이동성 및 부착성의 증가가 항- CTHRC1을 첨가할 때 감소하는 것을 나타내는 도이다.
도 5A는 CTHRCl-Fc 및 트롬빈으로 잘린 재조합 CTHRCl (r CTHRCl)의 발현을 확인한 도이다.
도 5B 및 5C는 rCTHRCl에 의해서 MiaPaCa-2 세포주의 이동성 및 부착성이 농도의존적으로 증가하는 것을 나타내는 도이다:
Lam: 라미닌 (laminin) ,
Vit: 비트로넥틴 (vitronectin),
Fib: 피브로넥틴 (fibronectin), 및 Col: 콜라겐 유형 Kcollagen type 1).
도 6A는 CTHRC1이 과발현 및 발현감소에 의해 Src-FAR신호에 관여하는 단 백질의 인산화가 증가 및 감소하는 것을 각각 나타내는 도이다.
도 6B는 rCTHRCl을 처리하였을 때， rCTHRCl-유도된 빠르고， 일시적인 활성 이 나타나는 것을 확인한 도이다.
도 6C 내지 6H는 rCTHRCl-유도된 Src-FAK 신호전달， 세포 이동성 및 세포 부착성이 Src 억제제인 PP2 및 MEK 억제제인 U0126에 의해서 억제되는 것을 나타내 는 도이다:
도 7A는 CTHRC1의 발현이 증가 및 감소함에 따라서 GTP-Rac 1의 발현이 증 가 및 감소함을 각각 나타내는 도이다.
도 7B는 rCTHRCl-유도된 Rac 1 활성이 빠르고 일시적임을 나타내는 도이다. 도 7C및 7D는 Rac 1 억제제인 NSC23766을 처리하였을 때 세포의 이동성 및 부착성이 감소함을 나타내는 도이다.
도 7E 및 7F는 우성음성 Rac Kdominant-negat ive Rac 1)을 처리하였을 때 세포의 이동성 및 부착성이 감소함을 나타내는 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>췌장암에 있어서 CTHRC1의 과발현 확인
<1-1> CfflRCl유전자 과발현 확인
췌장암에서 과발현되는 유전자를 찾기 위하여 췌장관세포암 (pnacreatic ductal adenocarcimonas; PDAC) 및 일반 췌장 세포주 (normal)에서 유전자 발현을 게놈—폭 발현 분석 (genome-wide expression analysis)방법으로 비교하였다.
구체적으로， 췌장관세포암 (n=28) 및 일반 췌장 세포주 (n=13)의 마이크로어 레이 발현 분석은 HG-U133 진칩 (UG-U133 GeneChip, Affymetrix, 미국)을 사용하여 제조사의 사용설명서에 따라 수행되었다.
그 결과， 도 1A에 나타난 바와 같이 일반 췌장 세포주와 비교하였을 때 췌 장관세포암 시료에서 CTHRCl 전사체가 유의적으로 증가 (< 8.0 배)함을 확인하였다 (도 1A).
<1-2> CTHRCl 전사체의 발현증가 확인
췌장암 세포주에서 CTHRCl 전사체의 발현이 증가한다는 실시예 <1-1〉의 결 과를 재확인하기 위하여 역전사 -중합효소연쇄반웅 (reverse transcript ion- polymerase chain reaction; RT-PCR)을 수행하였다.
구체적으로， 전체 R A는 알엔이지 키트 (RNeasy kit, Qiagen, 미국)를 사용 하여 임상조직샘플로부터 수득하였고, 췌장 조직과 일치하는 전체 RNA(Ambion, 미 국)를 대조군으로 프리믹스 RT-PCR(PreMix RT-PCR, 바이오니아, 대한민국)을 이용 하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR은 하기의 프라이머를 이용하여 수행되었으며， 대 조군으로는 GAPDH 유전자를 사용하였다. PCR과정은， 중합효소의 활성화를 위해 97°C에서 5분 반웅시키고 95°C에서 1분간 더 두어 DNA의 이중나선 구조가 끊어지도 록 한다 (denaturation step). 다음 단계로 프라이머가 단일가닥의 DNA 결합할 수 있도록 낮은 은도인 60°C에서 1분간 반웅시킨 뒤 (annealing step), 중합효소가 단 일가닥의 DNA와 상보적인 DNA가닥올 합성할 수 있도록 72°C에서 1분간 반웅시켰다 (elongation step). 상기 과정을 35회 반복하여 DNA를 증폭시킨 후， 마지막으로 남아있을지 모르는 단일가닥의 DNA를 합성하기 위하여 72°C에 10분간 반웅시켰다:
CTHRC1_F (서열번호 1): 5'-AGC GCC TCT GAG ATC CCC AA-3' ,
CTHRC1_R (서열번호 2): 5'-TGA ACA AGT GCC AAC CCA GA-3' , GAPDH_F (서열번호 3): 5'-TGA TGA CAT C GAA GGT GGT GAA-3'， 및
GAPDiLR (서열번호 4): 5'-TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT-3' .
그 결과, 도 IB에 나타난 바와 같이 일반 췌장 세포주 (normal)과 비교하여 췌장관세포암에서 CTHRCl mRNA가 증가하는 것을 확인하였다 (도 1B). 또한, 비-암 성 조직 (non_cancerous tissue)과 비교하였을 때 암성 조직 (cancerous tissue)에서
CTHRCl의 발현이 증가함을 확인하였다 (도 1C).
<1-3> 면역조직화학법 (i醒 unohistochemistry)을 이용한 CTHRCl의 발현 수준 확인
CTHRCl의 발현 수준을 확인하기 위하여 환자로부터 수득한 25개의 췌장암 조직 시료의 면역조직화학 분석을 수행하였다.
구체적으로, 25명의 환자로부터 외과적으로 수득된 췌장암 조직을 사용하였 고， 상기 모든 암은 선암 (adenocarcinomas)이었다. 또한， 상기 선암은 췌장관
(pancreatic duct)로부터 발생한 1차 췌장 선암종으로 확인되었다. 수득된 시료를 포르말린으로 고정한 후， 파라핀에 끼워넣어 EnVision-HRP 탐지 시스템 (EnVision-
HRP detection system, Dako, 미국)을 이용하여 제조사의 사용설명서에 따라 항-
CTHRC1 항체 (Abeam 및 Abgent , 미국)를 사용하여 면역조직화학적인 분석을 수행하 였다.
그 결과, 도 1D에 나타난 바와 같이 정상 췌장관 상피세포에서는 CTHRCl이 유의적인 발현을 보이지 않았지만， 선암 세포에서는 강하게 발현됨을 확인하였다. 아울러， 췌장암 시료의 24%(25개 시료 중 6개)는 CTHRCl이 약하거나 발현되지 않았 으나， 76¾>(25개 시료 중 19개)는 세포질 및 세포막에서 CTHRCl의 발현이 중간또는 강하게 나타났다. 또한， 일부 전이된 암 세포주에서도 CTHRCl이 강하게 발현되었 다 (도 1D). 상기 결과는 환자의 병력， 나이 또는 성별과 관련성이 없었다. <실시예 2>종양의 진행 및 전이에 있어서 CfflRCl의 효과 확인
<2-1>세포배양
인간 췌장암세포주인 Panc-1, MiaPaCa-2 및 BxPC-3는 ATCCXAmerican Type Culture Collection)에서 구입하였고, 상기 세포주들은 37°C， 5% C02의 조건에서 Panc-1의 경우 10%소태아혈청이 포함된 DMEM(Dulbecco' s modified Eagle medium), MiaPaCa-2의 경우 10¾ 소태아혈청 및 2.5% 말혈청이 포함된 DMEM, 또는 BxPC-3의 경우 10%소태아혈청이 포함된 RPMI에서 배양하였다.
<2-2>세포주의 수립
상기 <실시예 1>의 결과에 대한 영향을 확인하기 위하여 , CTHRC1을 안정적 으로 상향 또는 하향 발현하는 인간 췌장암세포주를 수립하였다.
구체적으로, CTHRC1을 과발현하는 세포주의 수립을 위하여, CTHRC1의 암호 화 영역 (coding region)을 하기의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고， 상기 수 득된 PCR 산물을 Kpn I 및 Xba I을 이용하여 pcDNA3. l(+)-MycHis(Invitrogen, 미 국) 백터에 클로닝하였으며, 제작된 CTHRC1 발현백터를 pLFG238이라 명명하였다:
CTHRC1_2— F (서열번호 5): 5'-CCT TGG TAC CGG CCA TCA GGG CCA TGC GAC CCC AGG GCC CCGC-3', 및
CTHRC1_2_R (서열번호 6): 5 '-(XT TTC TAG ATG GGC CAG CCA GGC CTT TTG GTA GTT CTT CM TAA TG-3' .
상기 제작된 pLFG238 또는 pcDNA3.1(+)-MycHis를 리포펙타민 (lipofectamine
Invitrogen)을 이용하여 형질주입 (transfection)하였으며， 상기 형질주입된 세포주 에서 CTHRC1을 안정적으로 발현하는 세포주를 선별하기 위하여 G418을 사용하였다. 또한， CTHRC1가 녹다운 (knock down)된 세포주를 수립하기 위하여 CTHRC1 특 이적인 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin R A) [shRNA (서열번호 7): 5'- CAGCGTTGGTATTTCACAT-3']를 제작하고， 이를 렌티바이러스 (lentivirus) 백터인 shLenti2.4G(Macrogen( 대한민국)에 클로닝하여 shLent i 2.4G-CTHRC1을 제작하였다. 음성대조군으로 사용된 렌티바이러스 백터는 shLenti2.4G-Ctrl로 서열번호 8(5'- MTCGCATAGCGTATGCCGTT-3')로 기재된 서열을 포함한다. 상기 제작된 shLenti2.4G- CTHRC1 또는 shLenti2.4G-Ctrl을 세포에 도입한 후, 안정적으로 shRNA를 발현하는 세포주는 퓨로마이신 (puromycin)을 사용하여 선별하였다.
그 결과， 각각의 수립된 세포주에서 적어도 세 개의 독립적인 클론 (clone) 을 선별하였다.
<2-3>선별된 세포주에서 CTHRCl의 상향 또는 하향 발현 확인
상기 실시예 <2-2>에서 선별된 CTHRCl을 상향 또는 하향 발현하는 세포주를 확인하기 위하여 항 -CTHRCl (Abeam 및 Abgent, 미국) 및 항 -β-액틴 (Santa Cruz, 미 국) 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로， 웨스턴 블랏은 세포주를 PBS로 씻어내고， 1 X RIPA 완충액에 넣어 세포를 용균 (lysis)하여 추출된 상기 단백질을 준비하였고, 배양 상층액 (culture supernatants)는 마이크로콘 원심분리기 (Microcon centrifugal filters, Mi 1Π pore, 미국)을 이용하여 농축하여 준비하였다. 상기 단백질을 BCA방법을 이 용하여 농도를 정량하였다. 그리고 그 후, 같은 양의 단백질을 PAGE 전기영동법으 로 SDS러닝 완충액 (running buffer)을 이용하여 분리하고, 이를 니트로셀를로오스 막 (nitrocel lulose membrane, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)으로 이 동시켰다. 단백질의 불특정 결합을 막기 위하여 , 0.1¾트윈 20(Tween 20)이 포함 된 PBS에 5%무지방 우유 (fat-free mi lk)를 사용하였고， 1차 항체를 처리하여 4°C 에서 하룻밤 동안 반웅시켰다. 막은 ECUPierce, Rockford, IL, USA) 방법을 사용 하여 현상하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이， CTHRCl을 과발현하는 MiaPaCa-2-CTHRCl 및, CTHRCl이 녹다운된 BxPC-3-shCTHRCl 및 Panc-1-shCTHRCl을 각각 수립하였다 (도 2). 또한ᅳ 음성대조군 세포주로는 MiaPaCa-2-Mock, BxPC3-shCtrr및 Panc-1- shCtrl 세포주를 각각 수립하였다.
<2-4>수립된 세포주의 생체 내에서 효과 확인
상기 실시예 <2-3>에서 수립된 세포주가 마우스 생체 내에서 암의 진행 및 전이를 향상시키는가 여부를 확인하기 위하여， 생체 내 생체 발광 이미지분석 (in vivo bioluminescence imaging analysis)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-3>에서 수립된 세포주에 파이어플라이 루시퍼 라제 (firefly luciferase) 유전자 (Lent iM1.4-Luci， 마크로젠, 대한민국)를 렌티바 이러스 유전자 이동 (lentiviral gene transfer)을 사용하여 도입하였다. 상기 유 전자 삽입에 사용된 렌티바이러스는 RNA 바이러스로 핵공을 통하여 핵으로 자유롭 게 들어갈수 있는 시스템을 갖고 있어 세포 내 핵으로 이동하여 게놈 DAN(genomic DNA)에 삽입되어 있다가 특정 환경이 되면 유전자를 발현시키는 특징을 갖고 있다. 상기 기능을 하는 렌티바이러스를 생산하기 위하여, pLVX 백터에 파이어 루시퍼라 제 (fire leucif erase) 유전자가 주입된 재조합 DNA를 만들어 바이러스 패키징 (packaging)을 위한 WPRE, CPPT, RRE 백터와 같이 리포펙타민 ( Hpofectamine)을 이 용하여 바이러스 생산 세포주인 293T세포주에 형질도입하고， 48시간 후， 배양액을 회수하여 렌티바이러스만 채취하였다. 상기 생산된 렌티바이러스를 인간 췌장암 세포주에 감염시킨 후， 바이러스백터가주입된 세포주를 퓨로마이신을 이용하여 선 별하였다. 그리고나서， 상기 파이어플라이 루시퍼라제가 도입된 세포주 1 X 106 cell올 마우스의 복부를 절개하고 췌장을 노출시켜 췌장의 몸통 (body)에 주사하고, CTHRC1가 이식된 종양의 진행에 어떤 영향을 주는지 생체 내 생체 발광 이미지분석 (in vivo bioluminescence imaging analysis)은 IVIS루미나 생체 내 이미지 入 1스 템 (IVIS Lumina in vivo imaging system, Xenogen, 미국)을 사용하여 측정하였다.
그 결과， 도 3A에 나타난 바와 같이 음성 대조군과 비교하였을 때, CTHRC1 이 과발현되는 마우스의 경우 형광 신호 (luminescence signal)의 강도가 유의적으 로 높고， 전이와 관련해서는 비장, 간, 결장 및 위를 포함하는 여러 기관 (organ)으 로 전이된 것을 확인하였다 (도 3A). 반면에, CTHRC1의 발현이 감소된 세포의 경우， 음성 대조군과 비교하였을 때, 종양의 진행 및 전이가 감소함을 확인하였다 (도 3B). 따라서, 상기 결과는 CTHRC1이 췌장암의 진행 및 전이를 향상시킴을 확인하였다.
<실시예 3> CTHRC1의 시험관 내 종양 세포의 이동 및 부착 효과 확인
CTHRC1이 시험관 내에서 췌장암 세포주의 이동성 및 부착성에 미치는 효과 를 확인하였다.
구체적으로， 세포 이동 검정을 위하여, CTHRC1이 과발현되는 MiaPaCa-2-
CTHRC1, 및 CTHRC1이 녹다운된 BxPC-3 및 Panc-1 세포주 1 x 105 eel Is을 포함하는 무혈청 배지를 1 ug/ml의 라미닌 (laminin), 비트로넥틴 (vitronect in)， 파이브로넥 틴 (fibronectin), 또는 콜라겐 타입 Kcollagen type 1)으로 코팅된 트랜스웰 삽입 (Trans ell inserts, Corning, 미국)의 윗부분에 두고, 아랫부분은 10%소태아혈청 이 포함된 배지로 채운다. 상기 트랜스웰을 5¾ C02, 37 °C 조건하에 20시간 배양한 후, 필요한 화학물， 항체 또는 재조합 단백질을 윗부분에 넣어준다. 이동한 세포 의 수는 당업계의 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 측정되었다.
아을러, 세포 부착성은 1 ug/ml의 라미닌 (laminin), 비트로넥틴 (vitronectin), 파이브로넥틴 (fibronectin) , 또는 콜라겐 타입 Kcollagen type 1) 으로 코팅된 96-웰을 사용하였다. 2% 혈청이 포함된 배지 100 ul에 1 X 104 eel Is/웰로 세포를 접종하고 , 37°C에서 배양하였다. 부착되지 않은 세포주는 PBS 로 두 번 세척하여 제거하고, 부착된 세포의 수는 당업계의 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 측정되었다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 CTHRC1이 과발현되는 MiaPaCa-2-CTHRCl 세포주에서 세포의 이동성 및 부착성이 유의적으로 증가하였고 (도 4A 및 4B), 반면 에 CTHRC1이 녹아웃된 BxPC-3 및 Panc-1 세포주에서는 세포의 이동성 및 부착성이 감소함을 확인하였다 (도 4C 및 4D).
<실시예 4>자가활성 방식 (autocrine manner)을 이용하여 CTHRC1이 세포의 이동 및 부착을 조절
상기 <실시예 3>의 결과에서 CTHRC1의 과발현 및 녹다운 모두는 세포의 증 식속도에는 아무런 영향을 주지 못하였다. 이는 CTHRC1이 분비 단백질이기 때문이 라 사료되고, 본 발명자들은 CTHRC1이 세포의 이동 및 부착에 있어서 자가활성 방 식 (autocrein manner)으로 조절할 수 있는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, CTHRC1의 암호영역, 트름빈 절단서열 (thrombin cleavage sequence), 면역글로불린의 불변부 (constant region) (Fc) 재조합 및 디히드로엽산 환원효소 (dihydrofolate reductase; dhfr) 유전자를 pcDNA3.1(+)에 삽입한 재조합 CTHRC1을 우선 제작하여, pGR235라고 명명하였다. 상기 제작된 플라스미드는 CiiO/dhfr-세포주에 안정적으로 형질주입되었고， rCTHRCl을 발현하는 클론은 메토트 렉사트 (methotrexate, Sigma, 미국)의 농도가 단계적으로 증가하는 배지에 배양되 면서 적응되었다. rCTHRCl은 CTHRCl-Fc에서 트롬빈으로 절단되어 방출되었고, 이 는 항 -Fc(Sigraa, 미국) 및 항 -CTHRCKAbcam 및 Abgent， 미국) 항체를 이용하여 상 기 서술된 웨스턴 블랏을 수행하여 확인하였으며， 당업자에게 잘 알려진 방법으로 정제되었다.
그 결과， 도 5에 나타난 바와 같이 CTHRCl-Fc 및 트름빈으로 잘린 rCTHRCl 의 발현을 확인하였고 (도 5A), rCTHRCl에 의해서 MiaPaCa-2 세포주의 운동성 및 부 착성이 농도의존적으로 증가하는 것을 확인하였다 (도 5B 및 5C 참고). 게다가， CTHRC1에 의한 세포주의 운동성 및 부착성의 증가가 항 -CTHRC1을 첨가할 때 감소함 을 확인함으로써 상기 결과가 CTHRC1특이적인 영향임을 확인하였다 (도 4E 및 4F). <실시예 5> Cffl Cl의 Sre-FAK신호전달 활성 효과 확인
CTHRC1에 의한 세포의 부착 및 이동 기작을 확인하기 위하여， Src 리쿠르팅 (recruiting) 및 Sre-FAK 복합체의 형성 후에 활성화되는 FAK의 활성을 확인하였다. 구체적으로, 실시예 <2-3>에 서술된 방법으로 Src(Cell Signaling, 미국), rSrc(Cell Signaling, 미국), FAK(Cell Signaling, 미국), pFA (Cell Signaling, 미국), 팍실린 (paxil Πη, Cell Signaling, 미국), p-팍실린 (Cell Signaling, 미국), ME -l/2(Cell Signaling, 미국), p-MEK-l/2(Cel 1 Signaling, 미국), ERK(Cell Signaling, 미국)， pERK 항체 (Cell Signaling, 미국)， 및 β-액틴 (Santa Cruz, 미 국) 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과， 도 6A에 나타난 바와 같이 CTHRC1이 과발현되면， Sre-FAK 신호에 관여하는 단백질의 인산화가 증가하고, 반면에 CTHRC1이 녹다운되었을 경우 Sre- FAK 신호에 관여하는 단백질의 인산화가 감소함을 확인하였다 (도 6A). 또한, MiaPaCa-2 세포주를 혈청 -결핍 (serun-starved) 조건에서 16시간 동안 배양하고 rCTHRCl을 0， 5， 10， 30, 120 또는 720분 동안 처리하였을 때, rCTHRCl-유도된 빠 르고, 일시적인 활성이 확인되었고 (도 6B), rCTHRCl-유도된 Sre-FAK 신호전달， 세 포 이동성 및 세포 부착성이 Src 억제제인 PP2 및 MEK 억제제인 U0126에 의해서 억 제됨을 확인하였다 (도 6C 내지 도 6H).
<실시예 6> CTHRC1의 Rac 1 활성 유도효과 확인
다음으로， 대부분의 세포에 있어서 세포 이동에 주요 요소이고, 췌장암 세 포에서 팍실린 신호전달에 의해 자극되는 Rac 1의 활성이 CTHRC1에 의해서 유도되 는지 여부를 확인하였다.
구체적으로， 내생적으로 활발한 (active) GTP-결합된 Rac 1을 EZ-탐지 Rac 1 활성화 키트 (EZ-Detect Racl activation kit, Pierce)를 사용하여 제조사의 사용설 명서에 따라 풀다운 (pull down)하였다. 세포 용해물을 원심분리하여 찌꺼기를 제 거하고， 총 Rac 1 단백질을 준비하였다. 남아있는 용해물을 PBD(p21-결합 영역) - 아가로스 비드 [PBD(p21-binding domain)-agarose bead] 1 mg과 함께 4°C에서 한 시 간동안 배양하였고， 침전된 비드 복합체는 샘플 완층액으로 세척되고 현탁하였다. 총 Rac 1 및 활성 Rac 1의 수준은 상기 실시예 <2-3>의 방법으로 확인하였다.
그 결과， 도 7에 나타난 바와 같이 CTHRC1의 발현이 증가 및 감소함에 따라 서 GTP-Rac 1의 발현이 증가 및 감소하였고 (도 7A), rCTHRCl-유도된 Rac 1 활성은 자극 5분 후에 최고점에 도달하였다 (도 7B). 또한， 세포의 이동성 및 부착성에 있 어서는 Rac 1 억제제인 NSC23766을 처리하였을 때 감소하였고 (도 7C 및 7E), 우성 음성 Rac 1( dominant -negative Rac 1)을 처리하였을 때도 역시 감소함을 확인하였 다 (도 7D및 도 7F).

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
CTHRC1 (Collagen triple helix repeat containing-1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서, 상기 CTHRC1은 서열번호 17로 기재되는 것을 특징으로 하 는 췌장암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 CTHRC1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA( short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군 으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 췌장암 예방, 치료 또는 전이 억 제용 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 1항에 있어서, 상기 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 CTHRC1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물， 펩티드， 펩티드 미메틱스， 앱타머 및 항체 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 췌장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
【청구항 5】
CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방또는 개선용 건강식품 조성물.
【청구항 6】
약학적으로 유효한 양의 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 췌장암 을 가진 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 치료 또는 전이억제 방법.
【청구항 7】
약학적으로 유효한 양의 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 예방방법.
【청구항 81
췌장암의 예방, 치료 또는 전이 억제에 사용하기 위한 CTHRC1 단백질의 발 현 또는 활성 억제제.
【청구항 9】
췌장암의 예방， 치료 또는 전이 억제용 약제의 제조에 사용하기 위한 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 용도.
【청구항 10】
췌장암의 예방 또는 개선용 건강식품의 제조에 사용하기 위한 CTHRC1 단백 질의 발현 또는 활성 억제제의 용도.
【청구항 11】
1) 피검체로부터 수득한 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 CTHRC1의 발현 또는 활성수준을 측정하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 CTHRC1의 발현 또는 활성수준이 피검물질 무처리 대조군 에 비해 감소하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 췌장암 치료용 후보물질의 스크리닝 방법 .
【청구항 12】
제 11항에 있어서， 상기 단계 2)의 CHTRC1의 발현 또는 활성수준 측정은 RT-PCR, 실시간 PCR real time PCR) , 웨스턴 블랏， 노던 블랏， ELISA, 방사선면역 분석 (radioimmunoassay), 면역조직화학법 (immunohistochemistry) 및 면역침전분석 법 (immunoprecipitation assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하 는 췌장암 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
【청구항 13】
서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역 Uheavy chain complementarity determining regions 1, HCDR1), 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 및 서열번호 11의 아미노산서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 증쇄 가변영 역 (VH)을 포함하는 중쇄 , 및
서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역 1( light chain complementarity determining regions, LCDR1), 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖 는 LCDR2 및 서열번호 15의 아미노산서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역 (VL)을 포함하는 경쇄를 포함하는 CTHRC1 단백질에 특이적인 인간 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편 .
【청구항 14]
제 13항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 CTHRC1 단백질에 특이적인 인간 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편.
【청구항 15]
제 13항에 있어서， 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 CTHRC1 단백질에 특이적인 인간 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편 .
【청구항 16]
제 13항에 있어서， 상기 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv, Fv, 단일쇄 Fv 이량체 및 다아바디 (diabody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 CTHRC1 단백질에 특이적인 인간 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편.
【청구항 17】
제 13항의 단일클론 항체의 중쇄 또는 이의 단편의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 18]
제 13항의 단일클론 항체의 경쇄 또는 이의 단편의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 19】
제 13항의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방， 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
【청구항 20】
제 13항의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 개선용 건강식품 .
【청구항 211
제 13항의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 췌장암을 가진 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 치료 또는 전이 억제 방법 .
【청구항 22】
제 13항의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 예방방법 .
【청구항 23]
췌장암의 예방， 치료 또는 전이 억제용 약제의 제조에 사용하기 위한 제 14 항의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편의 용도 .
【청구항 24】
췌장암의 예방 또는 개선용 건강식품 제조에 사용하기 위한 제 14항의 단일 클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편의 용도 .
PCT/KR2013/005460 2013-06-12 2013-06-20 Ｃｔｈｒｃ１의 발현 및 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 치료 및 전이억제용 조성물 WO2014200134A1 (ko)

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