KR20200059173A - 베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 - Google Patents

베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다. 상기 바이오마커 조성물은 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 유효성분으로 포함한다. 본 발명은 베체트병 진단 또는 예후 예측용 조성물, 키트, 및 상기 베체트병 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하고, 베체트병 예방 또는 치료용 약물 반응성 진단 마커 조성물 및 약물 스크리닝 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 베체트병 치료 조성물을 제공한다. 이를 이용하여, 효과적이고 용이하게 베체트병의 진단 또는 위험도를 예측할 수 있고, 그에 따른 적절한 치료를 할 수 있게 하여 더 좋은 치료 효과를 거둘 수 있다.

Description

베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물{BIOMARKER COMPOSITION FOR DIAGNOSING OR PREDICTING PROGNOSIS OF BEHCET'S DISEASES}
본 발명은 베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
베체트병(Behcet's disease)은 터키의 피부과 의사인 훌루시 베체트(Hulusi Behcet)가 1937년에 구강과 성기에 반복적인 궤양이 생기고 눈에 염증이 반복적으로 발생하는 환자 2명을 보고하면서 유래되었다. 베체트병은 지중해 연안, 중동지방 및 중국, 일본, 한국 등 아시아 지역에 호발하는 질환으로서, 구강 궤양, 음부 궤양, 안구 증상 외에도 피부, 혈관, 위장관, 중추신경계, 심장 및 폐 등 여러 장기를 침범할 수 있는 만성 염증성 질환의 하나이다.
베체트병의 정확한 발병 원인이나 병태 생리가 밝혀지지 않았지만, 오래전부터 유전적인 소인이 있는 환자에게 환경적인 요인이 더해지면서 면역반응이 활성화되고, 그 결과 여러 가지 증상이 나타난다고 생각되고 있다. HLA-B51이라는 특수한 유전자가 환자들 중에서 50-60% 발견되어, 이 유전자가 베체트병과 연관이 있을 것으로 추정되고 있다. 또한 일부 바이러스와 세균에 대한 면역반응이 베체트병의 염증반응과 관련이 있을 가능성이 있다.
베체트병의 임상 증상은 다양하고, 병의 중증도는 피부 점막 증상이나 관절염 등 가벼운 증상만 보이는 경우부터 심한 포도막염이나 뇌, 폐, 심장, 신장 등 주요 장기를 침범하여 심각한 후유증을 동반하는 경우까지 있다. 이처럼 베체트병은 다양한 기관의 침범에 따른 다양한 임상 양상과 예후를 보이기에, 이에 따른 진단 및 치료에 상당한 어려움을 겪고 있다. 그러므로 이러한 베체트병에 의한 합병증과 장애를 최소화하기 위해 베체트병을 조기에 정확히 진단하는 것은 매우 중요하다.
하지만, 베체트병 진단에 결정적인 도움이 되는 증상이나 검사 결과가 없기 때문에, 현재 베체트병의 여러 임상 증상 중 진단적 가치가 높은 것들로 이루어진 분류 기준을 이용하여 베체트병을 진단하고 있고, 치료법 또한 베체트병에 대한 특이 치료 없이, 기존의 류마티스 질환이나 염증성 장질환에 사용되고 있는 약제를 경험적으로 사용하고 있을 뿐이다. 어떤 검사도 확실하게 베체트병을 확진하거나 배제할 수 없고 치료제에 대한 반응을 예측할 수 없다는 문제가 있다.
한국등록특허 제10-1568632호 (2015.11.05.등록)
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명은 차별발현유전자를 포함하는 베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 베체트병 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명은 베체트병 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명은 베체트병 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법 및 약물 반응성 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 치료 표적으로 하는 베체트병 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 베체트병 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물은 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 베체트병 진단 또는 예후 예측용 조성물은 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 베체트병 진단 또는 예후 예측용 키트는 상기 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 베체트병 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법은 베체트병이 의심되는 환자 시료의 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료의 해당 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 베체트병 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법은 인체에서 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 시험물질을 처리한 시료에서 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준이 감소 또는 증가된 시험물질을 선별하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 베체트병 예방 또는 치료용 약물 반응성 진단용 조성물은 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 베체트병 예방 또는 치료용 약학 조성물은 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 발현 또는 활성 조절제를 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 베체트병 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 발현 또는 활성 조절제를 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물은 차별발현유전자를 이용하여 매우 효과적이고 용이하게 베체트병을 진단하고 그 위험도를 예측하는데 이용될 수 있다. 이에 따라 베체트병을 조기 진단하여, 베체트병 확진에 걸리는 시간을 줄이고 발병에 적절한 치료를 할 수 있게 하여 환자의 증상 악화로 인한 합병증을 최소화할 수 있다. 또한, 빠른 진단으로 고가의 불필요한 치료를 피하고 환자에게 맞춤형 치료, 그리고 질환과 관련한 예후에 관한 정확한 정보를 제공함으로써 더 좋은 치료 효과를 거둘 수 있다.
더불어, 상기 유전자를 치료 표적으로 하는 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 이용함으로써 베체트병을 효과적으로 예방, 개선 및 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 차별발현유전자(DEG) 리스트의 히트맵(Heatmap)이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 차별발현유전자(DEG)에 대한 벤다이어그램이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 인지니티 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis, IPA)의 중요한 카노니칼(canonical) 경로를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따른 인지니티 경로 분석(IPA)의 중요한 카노니칼 경로의 하나를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따른 RNA-시퀀싱에서 차별적으로 발현된 유전자의 검증(validation) 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자는 이전 연구에서 베체트병 환자의 말초 혈액에서 노화 CD8+ T 세포의 빈도가 증가했음을 확인하였고, 이를 바탕으로 베체트병 환자의 말초 혈액과 정상 대조군의 말초 혈액으로부터 분리된 비노화 및 노화 CD8+ T 세포에서 유전자 발현의 차이점을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서 “진단”이란, 베체트병의 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것으로, 베체트병 또는 베체트병의 적어도 하나 이상의 증상에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 베체트병을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예를 들어, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 또한, 임상 상태의 일차 진단 또는 재발한 질병의 진단을 포함한다.
본 명세서에서 “예후”란 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망으로, 질병이 없는 상태 등의 긍정적 예후와 질병의 악화, 전이, 재발 등의 부정적 예후를 포함한다. 즉, 베체트병의 진단 후 또는 진단에 따른 치료 후 일정 기간 내의 경과, 치료 경과 등을 예측 및 판단하는 것으로, 베체트병의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등에 대한 예측 및 판단을 포함한다. 예후의 예측은 베체트병 환자의 치료 여부를 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다.
본 명세서에서 “바이오마커”란, 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표로서, 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 즉, 베체트병에 대한 진단, 약물에 대한 반응 정도 등을 정상 대조군과 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 베체트병 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 명세서에서 “정상 대조군”이란, 베체트병에 걸리지 않은 정상 개체를 의미한다.
본 발명은 베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 바이오마커 조성물은 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서, RGS11(Regulator of G protein Signaling 11)은 G 단백질 신호 전달 조절인자로, 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 RGS(G 단백질 신호 전달 조절인자) 계열에 속한다. RGS 계열의 구성원은 헤테로삼량체(heterotrimeric) 신호-전달 G 단백질의 알파 서브유닛에서 GTP 가수분해효소(이하, GTPase)-활성화 단백질로 작용하여, G 단백질 알파 서브유닛의 GTPase 활성을 증가시킴으로써 신호 전달을 억제하여 비활성 GDP 결합 형태로 유도한다. 또한, RGS11은 R7 RGS 계열에 속하는 단백질로서 전이성 종양 세포에서 과발현되며, c-RAf/Erk/FAK 활성을 통한 Rac-1 의존적 종양세포 이동 증가를 유도한다.
본 발명에서, SHANK1(SH3 and multiple ankyrin repeat domains 1)은 SH3 도메인과 안키린(ankyrin) 반복을 포함하는 SHANK 계열의 단백질을 코딩한다. 이 계열의 단백질은 연결 시냅스의 발달과 기능에 필요한 스캐폴드 단백질 역할을 한다. SHANK1의 단백질 발현은 소뇌에서 가장 높고, 비장이나 골수에서는 중간 정도로 발현되며 대뇌의 림프절에서는 낮은 수준으로 발현된다. 또한, 인체 단핵 세포주 THP-1 및 인간 단핵 백혈병 세포주 U937에서도 발현되며, 난소암에서 발현이 증가한다. 이 계열의 단백질은 PDZ 도메인을 이용해 다양한 세포막 수용체와 세포질 단백질과 복합체를 이루어 신호전달에 관여한다.
본 발명에서, ARHGEF10(Rho guanine nucleotide exchange factor 10)은 Rho 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자(이하, Rho GEF)를 코딩한다. Rho GEF는 구아닌 트리포스페이트(GTP)에 대한 구아닌 디포스페이트(GDP)의 교환을 자극하여 작은 Rho GTPases의 활성을 조절할 수 있다.
ARHGEF10은 엑소사이틱 소포(exocytic vesicle)에서 RAB6A 및 RAB8A와 결합하여 막 트래피킹(membrane trafficking)을 조절하여 유방암세포의 침입에 관여하고 혈소판의 기능에도 관여하며, 단일염기다형성(SNP) 및 허혈성 죽상 혈전성 뇌졸중(ischemic atherothrombotic stroke)과도 관련이 있다. 또한, 이 유전자의 변종(variant)은 델타 6 불포화효소(delta-6 desaturase)의 활성 변화에 영향을 주고, 하퇴 근육 위축과 감각장애가 일어나는 유전성 신경장애인 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease)과도 관련된다.
본 발명에서, UBE2F-SCLY는 염색체 2에서 이웃하는 유비퀴틴-접합 효소 E2F(ubiquitin-conjugating enzyme E2F; UBE2F)와 셀레노시스테인 리아제(selenocysteine lyase; SCLY) 유전자 사이에서 자연적으로 발생하는 번역초과전사(read-through transcription)를 나타낸다. 상기 번역초과전사는 전사종결이 정상적으로 이루어지지 않고 인접하는 전사단위까지 전사가 계속되는 현상으로, 하나의 전사단위인 프로모터로부터 전사를 개시한 RNA 중합효소가 그 전사단위의 말단에 존재하는 전사종결부위의 결실 또는 어떠한 이유로 종결신호가 인지되지 않은 경우에 일어난다. UBE2F-SCLY 융합 단백질은 셀레니움 대사를 통해 콜레스테롤 대사를 조절할 것으로 예상되고 있다.
본 발명에서, LOC102724428는 SIK1과 유사한 세린/트레오닌-단백질 키나아제(serine/dthreonine-protein kinase SIK1)로, 이 유전자의 중요한 파라로그(paralog)가 SIK1(salt inducible kinase 1)이다. 이 유전자는 유비퀴틴 관련(UBA) 도메인을 포함하는 세린/트레오닌 단백질 키나아제를 암호화한다. 또한, ATP 결합, 마그네슘 이온 결합 및 단백 인산화 기능이 예측되고, 림프절과 비장을 포함한 대부분의 조직에서 mRNA 발현이 관찰되나, 그 기능에 대한 연구는 아직까지 많지 않다.
본 발명에서, COL5A1은 콜라겐 타입 V 알파-1 사슬(collagen type V alpha 1 chain) 유전자로, 섬유소 콜라겐 중 하나인 알파 사슬을 암호화한다.
본 발명에서, TRPV3(transient receptor potential cation channel subfamily V member 3)는 온도 감수성 채널의 서브 패밀리이자, 비선택적 양이온 채널의 패밀리에 속한다.
하기 표 1은 본 발명에서 선택된 상기 유전자에 대한 것으로, 보다 상세한 것은 하기 실시예를 통해 후술될 것이다.
gene ID gene Symbol Transcript ID
8786 RGS11 NM_001286485,NM_001286486,NM_003834,NM_183337
50944 SHANK1 NM_016148
9639 ARHGEF10 NM_001308152,NM_001308153,NM_014629
100533179 UBE2F-SCLY NR_037904
102724428 LOC102724428 NM_001320643
1289 COL5A1 NM_000093,NM_001278074
162514 TRPV3 NM_001258205,NM_145068
본 발명에서, 상기 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 베체트병 환자에게서 발현 또는 활성이 높아지거나 또는 낮아질 수 있다. 즉, 베체트병이 발병하지 않은 정상인의 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성 정도와 차이가 발생하여, 베체트병의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 RGS11, SHANK1 또는 COL5A1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 정상 대조군에 비해 노화 CD8+ T (CD8+ CD27- CD28-) 세포에서 발현 또는 활성 차이가 생길 수 있다. 즉, 상기 유전자 또는 상기 단백질은 노화 CD8+ T 세포에서 발현 또는 활성이 증가할 수 있다.
또한, 상기 RGS11, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428 또는 TRPV3 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 정상 대조군에 비해 비노화 CD8+ T (CD8+ CD27+ CD28+) 세포에서 발현 또는 활성 차이가 생길 수 있고, 특히 상기 RGS11 또는 TRPV3 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 발현 또는 활성이 증가하고, 상기 ARHGEF10, UBE2F-SCLY 또는 LOC102724428 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 발현 또는 활성이 감소할 수 있다. 상기 RGS11는 비노화 세포 및 노화 세포 모두에서 발현 또는 활성 차이가 생길 수 있고, 발현 또는 활성이 증가할 수 있다.
질병을 진단하는 마커는 유의성 있는 마커의 선택과 적용이 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는데 매우 중요한 인자로 작용하는데, 유의성 있는 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다.
본 발명에 따른 바이오마커는, 상기 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 또는 활성 수준 차이가 대조군과 비교할 때 유의성 있는 차이를 보이므로 신뢰도가 높은 마커로 볼 수 있다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 마커의 발현 또는 활성 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰될 수 있다.
본 발명은 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 베체트병 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상기 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 앱타머 또는 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명에서 “프라이머”는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3'hydroxl group)를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 시점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머는 상기 유전자에 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산일 수 있고, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 한, 추가의 특징을 혼입할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에서 “프로브”는 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링 되어있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 형성될 수 있다. 적절한 프로브 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에서 “항체”는 당해 기술 분야에 공지된 용어로서, 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함될 수 있다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명에서 “펩타이드”는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있고, 열/화학 처리 시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물 전달 물질로 이용될 수 있다.
본 발명에서 “앱타머(aptamer)”는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있어, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 베체트병 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 진단 또는 예후 예측용 키트는 베체트병의 진단 또는 예후 예측을 위한 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치를 포함할 수 있다. 상기 키트는 프라이머 키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 진단 또는 예후 예측용 키트에서, 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등을 포함할 수 있고, 상기 발색 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(O-페닐렌디아민), 또는 TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
본 발명은 베체트병 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 정보 제공 방법은 베체트병이 의심되는 환자 시료에서 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료의 해당 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계;를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 의심 환자 시료에서 상기 RGS11, SHANK1, COL5A1 또는 TRPV3 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성이 상기 정상 대조군 시료보다 증가하는 경우, 또는 상기 ARHGEF10, UBE2F-SCLY 또는 LOC102724428 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성이 상기 정상 대조군 시료보다 감소하는 경우, 그에 대한 정보를 제공할 수 있고, 상기 의심 환자는 베체트병이 발병한 것으로 진단될 수 있다.
또한, 본 발명은 베체트병 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공한다. 이는 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로, 베체트병 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약물 스크리닝 방법은 인체에서 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 시험물질을 처리한 시료에서 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준이 변화된 시험물질을 선별하는 단계;를 포함할 수 있다.
즉, 상기 시험물질의 처리에 의해 상기 RGS11, SHANK1, COL5A1 또는 TRPV3 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성이 상기 대조군에 비해 감소하는 경우, 또는 상기 ARHGEF10, UBE2F-SCLY 또는 LOC102724428 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성이 상기 대조군에 비해 증가하는 경우, 상기 시험물질은 베체트병 치료 물질로 판단될 수 있다.
본 발명에 따른 약물 스크리닝 방법에 있어서, 상기 인체에서 분리된 생물학적 시료는 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준에 있어서 정상 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 혈청 등의 시료를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약물 스크리닝 방법에 있어서, 상기 시험물질은 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 물질로, 베체트병 치료를 위한 후보 약물일 수 있다.
본 발명에서, 상기 유전자의 발현 수준은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 마이크로 어레이 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 단백질 발현 또는 활성 수준은 웨스턴 블랏, 효소면역분석법(Enzymelinked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 유효성분으로 포함하는 베체트병 예방 또는 치료용 약물 반응성 진단용 조성물을 제공한다.
상기 진단용 조성물을 이용하여, 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성을 통해 베체트병 예방 또는 치료용 약물의 반응성을 판단할 수 있다.
또한, RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 치료 표적이 될 수 있다.
이에, 본 발명은 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 발현 또는 활성 조절제를 유효성분으로 함유하는 베체트병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 조절제는 상기 유전자의 발현 또는 활성을 활성화하거나 또는 억제시킬 수 있다. 예를 들어, RGS11, SHANK1, COL5A1, 또는 TRPV3 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제시킬 수 있고, ARHGEF10, UBE2F-SCLY 또는 LOC102724428 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 증진시킬 수 있다.
상기 조절제는 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있고, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 상기 조절제의 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.
본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.
상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 베체트병이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 피하, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 베체트병 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 발현 또는 활성 조절제를 유효성분으로 함유하는 베체트병 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 조절제는 상기 유전자의 발현 또는 활성을 활성화하거나 또는 억제시킬 수 있다. 예를 들어, RGS11, SHANK1, COL5A1, 또는 TRPV3 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제시킬 수 있고, ARHGEF10, UBE2F-SCLY 또는 LOC102724428 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 증진시킬 수 있다.
상기 조절제는 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있고, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 베체트병의 예방 또는 개선 목적으로, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 음료 및 각종 드링크, 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 잼 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 베이컨 등), 빵류 및 면류, 쿠키 및 스낵류, 유제품(버터, 치즈 등) 등이 가능하며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함할 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용 가능한 식품 첨가제(식품 첨가물) 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
상기 기타 보조 성분은 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 식품을 원료로 하여 일반 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 베체트병 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[실시예 1]
베체트병 환자(BD) 및 정상인(Healthy controls, 이하 HCs) 각각 18명을 대상으로 전사체 분석을 위해 하기 실험을 진행하였다.
1. 실험 방법
1) 세포 준비
피콜-하이팩 밀도 구배 원심분리기(Ficoll Hypaque density gradients centrifugation, Ficoll paqueTM plus; StemCell Technologies, Vancouver, BC, Cananda)를 이용하여 헤파린 첨가 혈액 샘플로부터 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cells, 이하, PBMCs)를 준비하였다. 세포는 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, 이하, PBS, Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)로 세척되었다.
2) CD8+ T 세포 분리(isolation)
CD8 T 세포 분리용 마이크로비즈(human CD8+ T cell isolation kit, MACS, Miltenyi Biotec)를 사용하여 포지티브 선별(Positive selection)하였다. CD8 마이크로비즈는 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
3) 분류(Sorting)
분리된 CD8+ T 세포는 하기와 같이 형광물질이 결합된(conjugated) 모노클론 항체(monoclonal antibodies)로 표지되었다 : FITC-anti-CD8, allophycocyanin(APC)-H7-anti-CD27, APC-anti-CD28(BD Pharmingen; BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
표지된 세포를 유세포 분석기(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)를 이용하여, 노화 CD8+ T 세포(CD8+/CD27-CD28-세포)와 비노화 CD8+ T 세포(CD8+/CD27+CD28+ 세포)로, 순수도 (purity) 90% 이상으로 분리하였다.
4. 세포 배양 및 자극 분류 세포
분리한 노화 또는 비노화 CD8+ T 세포는 37℃, 5% CO2 하에서, 10% FBS를 포함한 배지(2mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지; Gibco-BRL, Grand Island, NY, U.S.A.)에서 배양되었다. 세포는 항-CD3 항체(500ng/㎕, clone OKT3, eBiosciences, San Diego, CA, U.S.A.)로 72시간 동안 자극되어졌다.
5. RNA 추출
항-CD3 항체로 자극된 세포에서 RNA 분리 키트(NocleoSpin RNA XS kit(Macherey-nagel, Duren, Germany)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 제조사에 의해 제공된 프로토콜에 따라 추출을 진행하였다.
6. NGS 분석 요청(Macrogen, Korea)
4개의 다른 그룹(베체트병(BD) 환자 vs. 정상 대조군, 노화 CD8+ T 세포(CD8+/CD27-CD28-세포) vs. 비노화 CD8+ T 세포(CD8+/CD27+CD28+ 세포)로 나눠진 각 그룹)으로부터 전사체 분석(transcriptome analysis)을 통해 차별발현유전자(Differentially expressed genes, 이하 DEG)가 분석되었다. 상기 차별발현유전자 분석은 동일한 유전자의 평균 발현량이 서로 다른 조건에서 유의하게 다른지를 분석하는 방법이다.
· Library Kit: TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit
· Type of Sequencer: HiSeq 2500
· Sequencing Control Software: HCS 2.2.70
7. 인지니티 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis, 이하, IPA, Qiagen, Germany)
인지니티 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis, IPA)는 웹 기반의 소프트웨어로 생물학적 기능과 경로(pathway), 분자적 네트워크를 시각적으로 표현하는 도구로, 특정 질병 또는 치료 분야에서 원인 분석을 위해 이를 이용하여 쉽게 기능적 관계를 도출하고 원인이 될 수 있는 분자적 인자를 찾을 수 있다.
IPA는 배수 변화도(fold change, fc) 2 이상의 차별발현유전자(DEG)에서 수행되었다.
8. 실시간 PCR(Real-time PCR)을 통한 검증(validation)
cDNA는 제조사의 지시에 따라 SuperscriptTM III 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 함께 올리고(oligo-dT) 프라이머(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 제조되었다.
실시간 PCR은 RGS11(Hs01594651_m1), SHANK1(Hs00211718_m1), AHRGEF10(Hs00405154_m1), LOC102724428(Hs00545020_m1), 및 UBE2F-SCLY(Hs00996436_m1)(Thermo Scientific)에 대한 프라이머 및 내부 프로브 및 TRPV3, COL5A1, CD302, 및 NBL1 유전자에 대한 SYBR Green Supermix로 제조사의 지시에 따라 ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)을 사용하여 수행되었다.
프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.
TRPV3 5’-GTTAGCTACCCGCATTAAGCCTGA-3’ 5’-AGCAATTCTGGAATTCCCAGCTC-3’
COL5A1 5’-CCTGCATTGTCTGTGGTGTGA-3’ 5’-AGCGCATGGCATGACTGAA-3’
CD302 5’-GCCCAGATGATATCCTACTAGGC-3’ 5’-GCAGAAAAGCACAGGTGTCAACT-3’
NBL1 5’-TCCACAGAGTCCCTGGTTCACT-3’ 5’-GCTACAGTGCAGGATCTTCTCC-3’
2. 실험결과
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 차별발현유전자(DEG) 리스트의 히트맵(Heatmap)이다. 도 1을 참조하면, 상기 히트맵은 색상으로 표현할 수 있는 다양한 정보를 일정한 이미지 위에 열 분포 형태의 비쥬얼한 그래픽으로 나타낸 것으로, 상기 차별발현유전자가 많이 발생하는 영역은 노란색, 적게 발생하는 영역은 파란색으로 나타난다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 차별발현유전자(DEG)에 대한 벤다이어그램이다. 도 2를 참조하면, A는 베체트병 환자의 노화 세포와 정상인의 노화 세포에서의 차별발현유전자의 수이고 B는 베체트병 환자의 비노화 세포와 정상인의 비노화 세포에서의 차별발현유전자의 수이다. 상기 A에만 해당하는 유전자는 912개이고, B에만 해당하는 유전자는 461개이며, 상기 A, B 둘 사이에 191개의 유전자가 공통적으로 차별발현되는 것으로 나타났다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 IPA의 중요한 카노니칼(canonical) 경로를 나타낸다. 도 3을 참조하면, A는 베체트 환자와 정상인의 노화 세포를 비교 분석한 것이고, B는 베체트 환자와 정상인의 비노화 세포를 비교 분석한 것이다.
중요한 11개 카노니칼 경로가 베체트병 환자 노화 CD8+ T 세포에서 정상 대조군의 노화 CD8+ T 세포보다 활성이 증가하였고, 베체트병 환자 비노화 CD8+ T 세포에서는 정상 대조군의 비노화 CD8+ T 세포에 비해 이 경로의 활성이 감소하였다.
Gene ID RNA-seq fold change
4681 131.366677
8786 107.751843
50944 72.962133
102465252 37.189333
1289 36.918116
4199 32.903108
57282 30.737880
6571 29.400024
5783 27.901175
100846999 -88.716100
상기 표 3은 노화 CD8+ T 세포에서 정상인 대비 베체트 환자의 배수 변화도(fold change)가 상향 조절 또는 하향 조절된 상위 10개의 유전자 리스트이다. 상기 배수 변화도는 마이크로어레이(microarray)나 RNA-시퀀싱(RNA-Seq) 실험에서 유전자 발현 데이터 분석시 유전자 발현 레벨의 변화를 측정하기 위해 사용된다.
상기 표 3을 참조하면, Gene ID 8786인 RGS11의 배수 변화도(fc)가 107.751843, Gene ID 50944인 SHANK1의 배수 변화도가 72.962133로 높게 발현되는 것을 알 수 있다.
하기 표 4는 비노화 CD8+ T 세포에서의 베체트 환자 대 정상인의 배수 변화도가 상향 조절 또는 하향 조절된 상위 10개의 유전자 리스트이다.
하기 표 4를 참조하면, Gene ID 8786인 RGS11의 배수 변화도(fc)가 20.348263으로, 상기 표 3에 비해서는 발현 차이가 적음을 알 수 있고, Gene ID 9639인 ARHGEF10는 -14.521649, Gene ID 100533179인 UBE2F-SCLY는 -26.323132, Gene ID 102724428인 LOC102724428는 -1634.675298로 하향 조절되어 발현됨을 알 수 있다.
Gene ID RNA-seq fold change
100996741 35.168681
162514 23.557014
8786 20.348263
100033416 16.539254
9639 -14.521649
100526767 -15.502246
100533179 -26.323132
414062 -31.670879
9936 -47.069576
102724428 -1634.675298
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따른 IPA의 중요한 카노니칼 경로의 하나로, 노화 세포에서의 베체트 환자 대 정상인의 cAMP-매개된 시그널링을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따른 RNA-시퀀싱에서 차별적으로 발현된 유전자의 검증(validation) 결과이다.
도 5를 참조하면, RNA 시퀀싱 결과를 검증하기 위해, miRNA 및 특성화되지 않은 유전자를 제외하고 상위 DEG로부터 선택된 8개의 유전자(RGS11, SHANK1, AHRGEF10, LOC102724428, CD302, COL5A1, TRPV3, 및 UBE2F-SCLY)에 대해 실시간 PCR을 수행한 결과, 전사체 분석 결과와 일관성을 나타내는 유전자를 확인할 수 있었다.
상세하게는 도 5A에서 COL5A1 및 ARHGEF10은 HC와 비교하여 BD 환자에서 노화 CD8+ T 세포의 전사체 분석에서와 동일한 패턴을 나타내었고, COL5A1은 통계적 유의성을 나타내었다. 도 5B에서 TRPV3, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, CD302 및 SHANK1은 HC에 비해 BD 환자에서 비노화 CD8+ T 세포의 전사체 분석에서와 동일한 패턴을 보였으며, TRPV3 및 ARHGEF10은 통계적 유의성을 나타내었다.
이제까지 본 발명에 대한 구체적인 실시예들을 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에 서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

  1. RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 유효성분으로 포함하는 베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 RGS11, SHANK1 또는 COL5A1에서 선택된 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 노화 CD8+ T 세포에서 발현 또는 활성이 증가하는 것을 특징으로 하는, 베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 RGS11, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428 또는 TRPV3에서 선택된 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 비노화 CD8+ T 세포에서 발현 또는 활성 차이가 생기는 것을 특징으로 하는, 베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 RGS11 또는 TRPV3에서 선택된 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 발현 또는 활성이 증가하고, 상기 ARHGEF10, UBE2F-SCLY 또는 LOC102724428에서 선택된 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 발현 또는 활성이 감소하는 것을 특징으로 하는, 베체트병 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  5. RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 베체트병 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 제제는,
    상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는, 베체트병 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 따른 조성물을 포함하는 베체트병 진단 또는 예후 예측용 키트.
  8. 베체트병이 의심되는 환자 시료에서 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료의 해당 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 베체트병 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  9. 인체에서 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계;
    상기 시험물질을 처리한 시료에서 RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준이 감소 또는 증가된 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 베체트병 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법.
  10. RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 유효성분으로 포함하는 베체트병 예방 또는 치료용 약물 반응성 진단용 조성물.
  11. RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 발현 또는 활성 조절제를 유효성분으로 함유하는 베체트병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. RGS11, SHANK1, ARHGEF10, UBE2F-SCLY, LOC102724428, COL5A1 및 TRPV3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 발현 또는 활성 조절제를 유효성분으로 함유하는 베체트병 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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