KR20160065934A - 자가면역 질환의 치료에 반응하는 대상체의 식별 방법 및 그의 치료를 위한 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 수용체 II 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운, 자가면역 질환, 예컨대 제1형 당뇨병을 갖는 대상체를 식별하는 방법을 특징으로 한다. 방법은 자가반응성 CD8+ T 세포의 표면 상의 CD8 단백질 밀도를 측정하고, CD8 단백질 밀도가 기준 CD8+ T 세포에 비해 감소되는 경우, 대상체를 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별하는 것을 포함한다. 제1형 당뇨병에 대하여, 방법은 대상체로부터의 시험관내 생물학적 샘플에서 C-펩티드 수치를 측정하고, C-펩티드 수치가 검출가능한 경우 대상체를 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별하고, C-펩티드가 실질적으로 검출불가능한 경우 대상체를 치료에 반응하기 어려운 것으로 식별하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라 치료하기 전, 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된 대상체 내 자가면역 질환의 치료용인 하나 이상의 TNFR2 활성제의 제약학적 조성물을 특징으로 한다.

Description

자가면역 질환의 치료에 반응하는 대상체의 식별 방법 및 그의 치료를 위한 조성물{METHODS OF IDENTIFYING SUBJECTS RESPONSIVE TO TREATMENT FOR AN AUTOIMMUNE DISEASE AND COMPOSITIONS FOR TREATING THE SAME}
일반적으로, 본 발명은 TNF-α 수용체 II 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 자가면역 질환을 갖는 대상체를 식별하는 방법 및 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 TNF-α 수용체 II 활성제 단독 치료에 반응하기 어려운 것으로 밝혀진 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
자가면역 질환은, 다양한 조직 장애 및/또는 기능 장애를 일으키는 병리적 상태를 야기하는, 정상 상태 하에서 발견되지 않는 신체 자신의 구성요소에 대한 면역 반응을 수반하는 것으로 생각된다. 자가면역 질환은 그 특성에 따라 전신 자가면역 질환 및 장기-특이적 자가면역 질환으로 넓게 분류된다. 자가면역 질환의 예는 인슐린-의존성 당뇨병(제1형 당뇨병으로도 알려짐), 전신 홍반 루푸스, 만성 류마티스 관절염, 하시모토병, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질항체 증후군, 자가면역 에디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트 병, 수포성 유천포창, 심근증, 복강 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 추르그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, 크레스트 증후군, 한랭 응집소증, 크론병, 원판성 루푸스, 궤양성 대장염, 건선성 관절염, 한랭 글로블린 혈증, 섬유근통-섬유근염, 그레이브스병, 길랭-바레, 갑상선기능 저하증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신병증, 소아 관절염, 편평태선, 루푸스, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경화증, 건선, 레이노 증후군, 라이터 증후군, 류마티스 열, 유육종증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 데빅병, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 자가면역 신경 장애(예컨대, 자가면역 알츠하이머병, 자가면역 파킨슨병, 또는 근위축성 측삭경화증)를 포함한다.
특히, 제1형 당뇨병은 혈당치의 정상 조절을 막는 인슐린 결핍을 특징으로 하는 극심한, 소아기, 자가면역 질환이다. 인슐린은 췌장의 랑게르한스 섬(β-섬 세포) 내 β 세포에 의해 생성되는 펩티드 호르몬이다. 인슐린은 글루코스 사용, 단백질 합성, 중성 지질의 형성 및 저장을 촉진하고, 이는 뇌 및 근육 조직을 위한 에너지의 일차 공급원이다. 제1형 당뇨병은, 인슐린 생성을 없애고 결국 고혈당증 및 케토산증을 일으키는, 췌장의 β-섬 세포의 전소를 초래하는 자가면역 반응에 의해 야기된다. 인슐린 주사 치료법은 극심한 고혈당증 및 케토산증을 방지하는데 도움이 되어 왔지만, 혈당치를 완전히 정상화하는데는 실패하였다. 비록 인슐린 주사 치료법이 꽤 성공적이였으나, 이는 현재 당뇨병 중에서도 이환율의 주된 원인인 미숙 혈관 손상을 방지하지 못했다. 미세혈관 손상 및 죽상동맥경화증의 가속화 모두를 포함하는 당뇨성 혈관 손상은 결국 신부전, 망막 손상, 협심증, 심근경색증, 말초신경병증 및 죽상동맥경화증을 야기할 수 있다.
C-펩티드, 또는 연결 펩티드(connecting peptide)는 프로인슐린 분자 내 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄를 연결하는 짧은 31 아미노산 단백질이다. 췌장의 β-섬 세포는 A-쇄, C-펩티드, B-쇄 및 신호 서열을 함유하는 프레프로인슐린을 분비한다. 신호 서열은 쪼개져 프로인슐린을 얻는다. 그 뒤에, C-펩티드는 쪼개져, 이황화-결합된 A-쇄 및 B-쇄를 함유하는 성숙 인슐린 단백질을 생성한다. 새로이 진단된 당뇨병 환자는 종종 그들의 C-펩티드 수치에 기반한 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병을 갖는 것으로 계층화된다. 간 대사로 인한 대상체의 순환계 내 인슐린 수치의 가변성이 인슐린 수치의 측정을 결정적이지 못하게 만들기 때문에, 대상체 내 C-펩티드 수치의 측정은 대상체의 신체 내 인슐린 생성에 대한 유용한 프록시 시험이 된다. 반면, C-펩티드 수치는 간 대사에 의해 최소한으로 영향을 받는다. 그 결과, 주변 C-펩티드 농도는 인슐린 농도보다 더 정확하게 β-섬 세포에 의한 인슐린의 분비를 반영한다.
HbA1c(당화 헤모글로빈 또는 글리코실화 헤모글로빈)는 혈장 내 헤모글로빈의 비-효소적인 당화를 통해 생체내 생성되는 헤모글로빈의 형태이다. 헤모글로빈의 비-글리코실화 형태에 대한 HbA1c의 비는 혈장 내 글루코스 농도와 직접적으로 관련이 있다. 따라서, 당뇨병 환자로부터의 샘플 내 오랜 기간에 걸쳐 관찰된 HbA1c의 높은 수치는 심각한 증상, 예컨대 고혈당증(예컨대, 급성 고혈당증)의 지표가 될 수 있다.
종양 괴사 인자-알파(TNF-α)는, 종양과 맞서기 위한 수단으로써 칼메트-게랑 간균(BCG) 주사 후 유도된 혈청 인자로서, 1975에 기재된 자연적으로 발생하는 시토카인이다(문헌[Carswell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3666-3670, 1975]). TNF-α의 클로닝 및 이의 두 수용체는 미생물 병원체의 게놈에 상동하는 서열을 드러낸다(예를 들어, 문헌[Loetscher et al., Cell 62:351, 1990]). 이 놀라운 서열 겹침은 숙주 TNF-α 분비 및 그것의 수용체의 활성을 조절하는 복잡한 미생물 반응의 시스템을 나타낸다(문헌[Rahman et al., PloS Pathogens 2:66, 2006]).
TNF-α 발현은, 감염에 대한 숙주 전선 방어(host first line defense)로서 다양한 박테리아, 기생충 및 바이러스에 의해 유도된다. 바이러스, 예컨대 엡스타인-바 바이러스는 수용체 및 TNF-α 및 TNF-α 신호전달(signaling)을 훨씬 증강시키는 단백질을 코딩한다(문헌[Liebowitz, New Engl. J. Med. 338:1461-1463, 1998]; 문헌[Guasparri et al., Blood 111:3813-3821, 2008]; 문헌[Wang et al., Cell 43:831-840, 1985]). 다르게는, 다양한 바이러스는 숙주 내 TNF-α 신호전달 활성 및 기능을 억제하는 단백질을 발현시키는 것으로 보여진다(문헌[Rahman et al., PloS Pathogens 2:66, 2006]). 일부 증명은 바이러스 감염(예컨대, 엡스타인-바 바이러스 감염)이 자가면역 질환을 야기할 수 있는 것으로 제시한다(문헌[Sairenji et al., Diabetologia 34:33-39, 1991]).
비록 자가면역 질환에 대해 조사된 여러 치료법이 일부 일시적 또는 심지어 치유적 특성을 입증함에도 불구하고, 이들 치료법은 자가면역 질환, 예컨대 제1형 당뇨병을 갖는 모든 대상체 내에서 지속적으로 이로운 결과를 제공하지 않을 수 있다. 따라서, 대상체를 치료하기 전, 치료 또는 치료의 세트에 반응하기 쉬운 이들 대상체를 정확히 식별하는 방법, 뿐만 아니라 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된 대상체를 치료하는 치료법에 대한 필요가 남아 있다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환을 갖는 대상체가 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 수용체 II(TNFR2) 활성제에 의한 치료에 반응할 가능성을 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은
(i) 대상체로부터 CD8+ T 세포의 집단을 포함하는 시험관내 생물학적 샘플을 TNFR2 활성제를 포함하는 조성물과 접촉시키고;
(ii) 집단 내 자가반응성 CD8+ T 세포의 표면 상에서 CD8 단백질 밀도를 측정하는 것을 포함하고,
여기서 기준 CD8+ T 세포에 비해 자가반응성 CD8+ T 세포의 표면 상에서 감소된 CD8 단백질 밀도는 대상체가 치료에 반응하기 쉽다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 기준 CD8+ T 세포는 자가면역 질환을 갖는 대상체로부터의 기준 샘플로부터 얻고, TNFR2 활성제로 치료되거나 전치료(pretreat)되지 않은 것이다. 다른 실시양태에서, 기준 CD8+ T 세포는 건강한 대상체로부터의 기준 샘플로부터 얻는다. 특정 실시양태에서, 측정은 형광색소와 컨쥬게이션될 수 있는 항-CD8 항체를 사용하여 수행된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 접촉 전 다사티닙(dasatinib)으로 배양된다(예를 들어, 생물학적 샘플은 최소 4 시간 동안 다사티닙으로 배양되고/거나, 생물학적 샘플은 최대 48 시간 동안 다사티닙으로 배양된다).
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질항체 증후군, 자가면역 에디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트 병, 수포성 유천포창, 심근증, 복강 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 추르그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, 크레스트 증후군, 한랭 응집소증, 크론병, 원판성 루푸스, 전신 홍반 루푸스, 궤양성 대장염, 건선성 관절염, 한랭 글로블린 혈증, 섬유근통-섬유근염, 그레이브스병, 길랭-바레, 하시모토 갑상선염, 갑상선기능 저하증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신병증, 소아 관절염, 편평태선, 루푸스, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경화증, 건선, 레이노 증후군, 라이터 증후군, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 데빅병, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, 또는 자가면역 신경 장애이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병, 복강 스프루-피부염, 크론병, 그레이브스병, 갑상선기능 저하증, 루푸스, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 유육종증, 쇼그렌 증후군, 또는 궤양성 대장염이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 신경 장애는 뉴런의 자가면역-매개성 손상, 자가면역 알츠하이머병, 자가면역 파킨슨병, 또는 자가면역-매개성 근위축성 측삭경화증이다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 제1형 당뇨병을 갖는 대상체가 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 수용체 II(TNFR2) 활성제에 의한 치료에 반응할 가능성을 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 대상체로부터의 시험관내 생물학적 샘플을 상기 샘플 내 C-펩티드를 검출할 수 있는 장치와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 샘플 내 검출가능한 C-펩티드 수치는 대상체가 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타내고, 여기서 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치는 대상체가 치료에 반응하기 어려운 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, C-펩티드의 실질적으로 검출불가능한 수치는 대상체가 치료로부터 제외되어야 한다는 것을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 검출불가능한 수치는 약 1.5 pmol/L 미만(예컨대, 약 1.0 pmol/L 미만)의 C-펩티드 수치이다. 다른 실시양태에서, 검출가능한 수치는 약 1.5 pmol/L 초과의 C-펩티드 수치이다. 특정 실시양태에서, C-펩티드의 농도가 약 1.5 pmol/L 내지 약 4.0 pmol/L 범위 내라면, 대상체는 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된다.
본 발명의 상기 측면의 특정 실시양태에서, 접촉은 대상체의 치료 전에 수행된다. 접촉은 하기를 포함한다:
(i) 샘플을 그의 표면 상에 고정된 포획제(capture agent)를 갖는 장치와 접촉시켜 샘플 내 C-펩티드가 고정된 포획제에 결합하도록 하고;
(ii) 표면을 검출 결합제와 접촉시켜 C-펩티드가 검출 결합제에 결합하도록 하고;
(iii) 검출 결합제를 사용하여 샘플 내 C-펩티드의 수치를 측정한다.
일부 실시양태에서, 검출 결합제는 퍼옥시다아제 효소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 측정은 표면을 과산화 수소 및 퍼옥시다아제 기질을 함유하는 용액과 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 치료를 시작하기 전에 대상체로부터의 혈액 샘플 내 기준 HbA1c 수치를 측정하는 것을 추가로 포함한다. 방법은 하기를 포함한다:
(i) 치료 후 대상체로부터 채취된 혈액 샘플 내 HbA1c 수치를 측정하고,
(ii) HbA1c 수치를 기준 HbA1c 수치와 비교하고,
(iii) HbA1c 수치가 기준 HbA1c 수치 이상인 경우, 하나 이상의 TNFR2 활성제에 의한 반복 치료를 필요로 하는 대상체를 식별한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 혈액 샘플은 적어도 치료 후 6 개월(예컨대, 적어도 치료 후 1 년, 적어도 치료 후 2 년, 적어도 치료 후 3 년, 또는 적어도 치료 후 5 년) 뒤의 대상체로부터 채취된다.
본 발명의 임의의 측면의 특정 실시양태에서, 샘플은 혈액, 혈액 성분 또는 뇨를 함유한다. 특정 실시양태에서, 혈액 성분은 혈청 또는 혈장이다. 다른 실시양태에서, 샘플은 뇨를 함유한다.
본 발명의 임의의 측면의 일부 실시양태에서, TNFR2 활성제는 칼메트-게랑 간균(BCG), 완전 프로인트 항원보강제, TNF-α, TNF-α 수용체 II 작용물질(agonist), TNF-α 무테인(mutein), 인터류킨-1, 인터류킨-2, 조직 플라스미노겐 인자, 지질다당류(LPS), 림프독소(lymphotoxin) 또는 카켁틴(cachectin)이다. 특정 실시양태에서, TNFR2 활성제는 BCG이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병이고, 방법은 본 발명의 두 번째 측면의 하나 이상의 방법을 조합해서 사용된다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 치료에 반응하기 쉬운 것으로 진단된 대상체의 자가면역 질환 치료를 위한 하나 이상의 TNFR2 활성제를 함유하는 제약학적 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체로부터의 샘플은, 기준 대상체(예컨대, 건강한 대상체 또는 자가면역 질환을 갖고 하나 이상의 TNFR2 활성제로 치료되거나 전치료되지 않은 대상체)로부터의 샘플 내 기준 T 세포의 표면 상의 CD8 단백질 밀도에 비해, TNFR2 활성제에 노출 후 그의 표면 상에 감소된 CD8 단백질 밀도를 갖는 T 세포의 집단을 함유한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 본 발명의 첫 번째 측면의 방법에 따른 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된다.
본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질항체 증후군, 자가면역 에디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트 병, 수포성 유천포창, 심근증, 복강 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 추르그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, 크레스트 증후군, 한랭 응집소증, 크론병, 원판성 루푸스, 전신 홍반 루푸스, 궤양성 대장염, 건선성 관절염, 한랭 글로블린 혈증, 섬유근통-섬유근염, 그레이브스병, 길랭-바레, 하시모토 갑상선염, 갑상선기능 저하증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신병증, 소아 관절염, 편평태선, 루푸스, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경화증, 건선, 레이노 증후군, 라이터 증후군, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 데빅병, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, 또는 자가면역 신경 장애이다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병, 복강 스프루-피부염, 크론병, 그레이브스병, 갑상선기능 저하증, 루푸스, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 유육종증, 쇼그렌 증후군, 또는 궤양성 대장염이다. 특정 실시양태에서, 자가면역 신경 장애는 뉴런의 자가면역-매개성 손상, 자가면역 알츠하이머병, 자가면역 파킨슨병, 또는 자가면역-매개성 근위축성 측삭경화증이다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 대상체로부터의 시험관내 샘플에서 C-펩티드의 수치를 결정함으로써 치료전 상기 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된 대상체의 제1형 당뇨병 치료를 위한 하나 이상의 TNFR2 활성제를 함유하는 제약학적 조성물을 제공하고, 여기서 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치는 대상체가 치료에 반응하기 어려운 것을 나타내고, 여기서 검출가능한 C-펩티드 수치는 대상체가 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치는 대상체가 치료로부터 제외되어야 하는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 검출불가능한 수치는 1.5 pmol/L 미만의 C-펩티드 수치이다. 다른 실시양태에서, 검출가능한 수치는 1.5 pmol/L 초과의 C-펩티드 수치이다. 특정 실시양태에서, 대상체로부터의 뇨 샘플이 약 4.0 pmol/mmol 미만의 크레아티닌에 대한 C-펩티드 비를 나타낸다면, 대상체는 치료로부터 제외된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체로부터의 뇨 샘플이 약 4.0 pmol/mmol 이상의 크레아티닌에 대한 C-펩티드 비를 나타낸다면, 대상체는 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 두 번째 측면의 방법에 따른 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 제약학적 조성물은 대상체의 HbA1c 수치가 조성물의 투여 후 약 4 년 내에 적어도 0.1 % 감소되는 것을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 제약학적 조성물은 대상체의 HbA1c 수치가 조성물의 투여 후 약 3 년 내에 적어도 0.1 % 감소되는 것을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 2 회차 또는 그 이후 회차로 대상체의 제1형 당뇨병을 치료하는데 사용하기 위한 것으로, 여기서 대상체 내 HbA1c 수치는 이전 치료 전에 대상체 내 HbA1c 수치에 비하여 증가하거나 동일하게 남아있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 두 번째 측면의 방법에 따른 하나 이상의 TNFR2 활성제에 의한 반복 치료를 필요로 하는 것으로 식별된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 사람이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 장기 당뇨병 환자이다.
본 발명의 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 TNFR2 활성제는 칼메트-게랑 간균(BCG), 완전 프로인트 항원보강제, TNF-α, TNF-α 수용체 II 작용물질, TNF-α 무테인, 인터류킨-1, 인터류킨-2, 조직 플라스미노겐 인자, 지질다당류(LPS), 림프독소 및 카켁틴으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 TNFR2 활성제는 BCG이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 1 회 용량 당 2 x 106 CFU 초과의 BCG(예컨대, 1 회 용량 당 2.3 x 106 CFU의 BCG)를 함유한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 1 회 용량 당 4 x 106 CFU 미만의 BCG를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 동결건조된 BCG를 함유한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 BCG의 식염수 용액을 함유한다.
본 발명의 임의의 측면의 특정 실시양태에서, 조성물은 한 번 이상(예컨대, 두 번 이상, 예컨대 두 번) 대상체에 투여된다. 일부 실시양태에서, 적어도 두 번의 조성물의 투여는 적어도 2 주 간격으로 떨어진다. 다른 실시양태에서, 적어도 두 번의 조성물의 투여는 적어도 4 주 간격으로 떨어진다.
본 발명의 임의의 측면의 특정 실시양태에서, 조성물은 피부내의, 근육내의, 비경구의, 정맥내의, 동맥내의, 두개내의, 피하의, 안와내의(intraorbitally), 심실내의, 척수내의, 복강내의, 및 비강내의 경로로부터 선택되어 투여되기 위해 제제화된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 피부내의 투여를 위해 제제화된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 식염수 용액으로써 투여를 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 용액은 회당 약 0.2 cc 미만의 부피, 예컨대 회당 0.1 cc의 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제약학적 조성물은 2 이상의 TNFR2 활성제의 분리 투여를 위해 제제화된다. 다른 실시양태에서, 제약학적 조성물은 2 이상의 TNFR2 활성제의 조합된 투여를 위해 제제화된다.
본 발명의 제약학적 조성물의 일부 실시양태에서, 제약학적 조성물은 대상체 내 TNF-α의 발현을 유도할 수 있는 것을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 제약학적 조성물은 조성물이 대상체의 자가반응성 면역 세포(예컨대, 자가반응성 CD8+ T 세포)에서 NF-κB 경로의 활성을 유도할 수 있는 것을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 제약학적 조성물은 조성물이 대상체 내 자가반응성 면역 세포(예컨대, 자가반응성 CD8+ T 세포)의 사멸을 일으키는 것을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 제약학적 조성물은 조성물이 대상체 내 조절 T 세포(예컨대, 조절 CD4+ T 세포)의 팽창을 일으키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 임의의 측면의 특정 실시양태에서, 제약학적 조성물은 조성물이 대상체 내 고혈당증으로부터의 합병증을 방지하는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 고혈당증으로부터의 합병증은 신장 손상, 신경 손상, 심혈관 손상, 망막의 손상, 발의 손상, 다리의 손상, 심장의 손상 및 케토산증으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유한다.
정의
본원에서 사용되는 "약"은 인용값의 ± 10 %인 값을 의미한다.
본원에서 사용되는 "항체"는 전체 항체 또는 면역글로불린 및 임의의 항원-결합 단편 또는 그의 단쇄를 의미한다. 본원에서 사용되는 항체는, 포유류의(예컨대, 인간 또는 마우스), 인간화, 키메릭, 재조합, 합성하여 생성되거나 또는 자연적으로 단리되는 것일 수 있다. 인간을 포함하는 대부분의 포유류에서, 전체 항체는 이황화 결합에 의해 연결된 적어도 두 중(H)쇄 및 두 경(L)쇄를 갖는다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 축약됨) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3 가지 도메인, CH1, CH2 및 CH3, 및 CH1과 CH2의 경첩 영역으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 축약됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은, 골격 영역(FR)으로 불리는 더 보존된 영역에 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 과변이의 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 세가지 CDR 및 네가지 FR로 구성되고, 하기 순서로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은, 면역계의 다양한 세포(예컨대, 효과기 세포) 및 고전 보체계 제1성분(Clq)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개로 할 수 있다. 본 발명의 항체는 모든 공지된 형태의 항체 및 항체-유사 성질을 갖는 다른 단백질 스캐폴드를 포함한다. 예를 들어, 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이성 항체, 1가 항체, 키메릭 항체, 또는 항체-유사 성질을 갖는 단백질 스캐폴드, 예컨대 피브로넥틴 또는 안키린 반복일 수 있다. 항체는 하기 임의의 동종형을 가질 수 있다: IgG(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), IgM, IgA(예컨대, IgA1, IgA2 및 IgAsec), IgD 또는 IgE.
본원에서 사용되는 "당뇨병 환자"는 제1형 당뇨병으로 진단된 대상체를 의미한다. 특히, 장기 당뇨병 환자는 제1형 당뇨병의 발병으로부터 적어도 약 5 년(예컨대, 적어도 약 6 년, 적어도 약 7 년, 적어도 약 8 년, 적어도 약 9 년, 적어도 10 년, 적어도 11 년, 적어도 약 12 년, 적어도 약 13 년 또는 적어도 약 14 년) 동안 제1형 당뇨병을 가지는 대상체이다.
본원에서 사용되는 "Hox11+ 지라세포"는 Hox11 유전자를 발현하고 지라에서 발견되는 만능(pluripotent) CD45- 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 "면역 세포"는 후천적 또는 선천적 면역계의 발생, 조절 또는 영향을 포함하는 임의의 세포를 의미한다. 면역 세포는, 예컨대 T 세포(예컨대, CD4+ 세포 또는 CD8+ 세포), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 단핵구 및 수지상 세포 및 호중구를 포함한다.
본원에서 사용되는 "무테인"은 적어도 하나 이상의 아미노산에 의해 그것의 아미노산 서열과 상이한 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 무테인은 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해 90 % 초과이나 100 % 미만인 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본원에서 혼용해서 사용되는 "제약학적으로 허용된 담체" 또는 "제약학적으로 허용된 부형제"는 본원에 기재된 화합물 외에 임의의 성분을 의미하고(예컨대, 활성 화합물을 부유시키거나 용해시킬 수 있는 비히클) 환자 내에서 비독성 및 비-염증성의 성질을 가진다. 담체 및 부형제는, 예를 들어 항유착제(antiadherent), 항산화제, 바인더, 코팅, 압축 보조제, 붕괴제(disintegrant), 염료(색소), 완화제(emollient), 유화제, 필러(희석제), 필름 형성제 또는 코팅, 향미료, 향수, 활택제(glidant)(유동 개선제), 윤활제, 방부제, 인쇄 잉크, 흡착제, 현탁제 또는 분산제, 감미료, 또는 수화수(water of hydration)를 포함할 수 있다. 예시적인 담체 및 부형제는, 부틸레이티드 히드록시톨루엔(BHT), 탄산 칼슘, 인산 칼슘(2염기성), 칼슘 스테아레이트, 크로스카멜로스, 가교 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로오스, 메틸 파라벤, 마이크로크리스탈 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 전호화분 전분, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 셸락, 이산화 규소, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 시트르산 나트륨, 전분 글리콜산 나트륨, 소르비톨, 전분(곡물), 스테아르산, 스테아르산, 수크로스, 활석, 이산화 티타늄, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 자일리톨, 물, 인산-완충 식염수(PBS), 아세테이트-완충 식염수(ABS), 링거액, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 그의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "샘플"은 대상체로부터 채취된 임의의 시료(예컨대, 혈액, 혈액 성분(예컨대, 혈청 또는 혈장), 뇨, 타액, 양수, 뇌척수액, 조직(예컨대, 태반 또는 진피), 췌장액, 융모 샘플 및 세포)를 의미한다. 바람직하게, 샘플은 혈액, 혈액 성분(예컨대, 혈청 또는 혈장) 또는 뇨이다.
본원에서 혼용해서 사용되는 "대상체" 또는 "환자"는 임의의 동물, 예컨대 포유류(예컨대, 인간)를 의미한다. 본원에 기재된 제약학적 조성물로 치료되는 대상체는 이러한 증상(예컨대, 자가면역 질환, 예컨대 제1형 당뇨병)을 갖는 것으로 의사에 의해 진단된 대상체 또는 증상이 발전될 위험이 있는 대상체일 수 있다. 진단은 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술 또는 방법에 의해 수행될 수 있다. 통상의 기술자는, 대상체가 표준 시험 또는 실험을 사용해 자가면역 질환, 예컨대 제1형 당뇨병을 갖는 것으로 진단되거나 또는 실험 없이 하나 이상의 위험 인자의 존재로 인해 대상체가 고 위험에 있음이 식별될 수 있음을 이해할 것이다. 제1형 당뇨병에 대하여, 이러한 위험 인자는, 예컨대 자가반응성 T 세포, 예컨대 자가반응성 CD8+ T 세포의 존재, 적어도 6.1 mmol/L의 공복(fasting) 혈장 혈당치, 75 g의 경구 포도당 로드(load) 2 시간 후 적어도 11.1 mmol/L의 혈장 혈당치, 또는 C-펩티드의 감소된 혈청 수치를 포함한다. 본 발명의 제약학적 조성물에 의한 치료 전, 자가면역 질환, 예컨대 제1형 당뇨병을 가진 대상체는, 대상체가 본 발명의 제약학적 조성물에 의한 치료에 반응하기 쉬운지 또는 치료에 반응하기 어려운지를 결정하기 위해, 본원에 기재된 진단 시험을 받을 수 있다.
본원에서 사용되는 "실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치"는 대상체로부터의 샘플이 약 1.5 pmol/L 미만, 예컨대 약 1.0 pmol/L 미만, 또는 약 0.5 pmol/L보다 훨씬 미만인 C-펩티드 수치를 가질 수 있음을 의미한다. 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치에 해당하는 C-펩티드 수치는, 샘플이 수득될 때 대상체의 섭취 상태에 의존하지 않는다. 예를 들어, 샘플은 공복 대상체로부터 또는 자극, 예컨대 혼합식 부하시험(mixed meal tolerance test) 또는 글루카곤 시험에 의한 자극을 받는 대상체로부터 얻어질 수 있다.
본원에서 혼용해서 사용되는 "종양 괴사 인자-α(TNF-α) 유도 물질" 또는 "TNF-α 유도 물질"은 생체내 또는 시험관내 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 발현을 유도하는 조성물 또는 분자를 의미한다. TNF-α 유도 물질은 칼메트-게랑 간균(BCG), 완전 프로인트 항원보강제, 인터류킨-1, 인터류킨-2, 조직 플라스미노겐 인자, 지질다당류(LPS), 림프독소, 또는 카켁틴일 수 있다. 바람직하게, TNF-α 유도 물질은 BCG이다.
본원에서 혼용해서 사용되는 "TNF-α 수용체 II(TNFR2) 작용물질" 또는 "TNFR2 작용물질"은 생체내 또는 시험관내 결합 시에 TNFR2를 활성화하는 조성물 또는 분자를 의미한다. TNFR2 작용물질의 예는 TNFR2에 특이적으로 결합하고 이를 활성화하는 TNFR2 작용물질 항체 및 TNF 무테인을 포함한다.
본원에서 혼용해서 사용되는 "TNF-α 수용체 II(TNFR2) 활성제" 또는 "TNFR2 활성제"는 생체내 또는 시험관내 TNFR2를 직접적으로 또는 간접적으로 활성화시키는 조성물을 의미한다. TNFR2 활성제는, 예컨대 TNFR2에 결합함으로써 직접적으로, 또는 예컨대 TNF-α의 발현을 유도시킴으로써 간접적으로, TNFR2를 활성화시킬 수 있다. TNFR2 활성제는 TNF-α, TNF-α 유도 물질 및 TNFR2 작용물질을 포함한다.
도 1a는 대상체 1, 대상체 2, 및 대상체 3의 EBV-특이적 T-세포의 발현을 나타내는 시간 경과에 따른 데이터를 제시하는 3 개의 그래프의 세트이다. 각 그래프에서, 시점 0은 EBV에 대한 항체의 발현의 시기를 기준으로 EBV 감염의 추정된 발생을 나타낸다.
도 1b는 EBV-특이적 자가반응성 CD8+ T 세포를 함유하는 4합체-염색된 샘플 및 음성 대조군의 분석의 유세포 분석(flow cytometry) 결과의 3 개의 점 도표의 세트이다. CD8+ T-세포에 의한 비-특이적 4합체 결합의 수치는 비연관 펩티드 서열(음성 대조군, 왼쪽 막대)로 로딩된 4합체를 사용하여 결정되었다. 가운데 및 오른쪽 막대는 EBV-특이적 4합체를 사용한 양성 염색의 예시를 보여준다.
도 2는 3 명 각각의 EBV-감염된 대상체 대 활성 EBV 감염없이 제1형 당뇨병을 갖는 대상체의 기준 집단에서 C-펩티드 수치의 시간 경과를 나타내는 여러 그래프의 세트이다. 대상체 1 및 2는 기준 집단에 비해 통계학적으로 상당한 C-펩티드의 일시적인 증가를 보여주었다(각각, p<0.04 및 p=0.00134). 대상체 3은 증가된 C-펩티드 수치를 보이지 않았다.
도 3a는 인슐린-B 자가반응성 T 세포의 존재를 정량화하고, 감염되지 않은 제1형 당뇨병 대상체 내 자가반응성 T-세포의 수치에 비해 제1형 당뇨병 환자의 EBV 감염 후 순환 인슐린-B 자가반응성 T-세포의 증가된 존재를 입증하는 그래프의 세트이다. 비연관 펩티드 담지 클래스 I 시약으로 염색된 동일한 대상체로부터의 말초 T-세포에 대한 백그라운드 형광은 0.2 %이었다.
도 3b는 EBV 감염의 존재 또는 부재 하에 제1형 당뇨병을 갖는 대상체로부터의 샘플 및 T 세포의 표면 상의 CD8 단백질 밀도의 정량화에 대한 유세포 분석 히스토그램의 세트이다. T 세포의 표면 상의 CD8 단백질 밀도의 감소는, EBV-감염된 대상체의 인슐린-B 자가반응성 T-세포를 새로이 발현시키는데 특이적이다. EBV 감염 없는 장기 제1형 당뇨병은 적은 수의 말초 인슐린-B 자가반응성 T-세포를 가지지만, T 세포의 표면 상의 CD8 단백질의 밀도는 정상 범위 내에 있었다. 또한 EBV-감염된 대상체로부터의 EBV-특이적 T-세포는 또한 정상 밀도의 CD8 단백질을 가졌다.
본원에서는 자가면역 질환을 갖는 대상체가 TNF-α 수용체 II(TNFR2) 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬울 것인지 TNF-α 수용체 II(TNFR2) 활성제에 의한 치료에 반응하기 어려울 것인지를 측정하는 방법을 밝혀 내었다. 본 발명의 방법에 따르면, 자가면역 질환을 갖는 대상체로부터의 샘플 내에, 하나 이상의 TNF-α 수용체 II(TNFR2) 활성제에 생체내 또는 시험관내로 노출되서 그들의 표면 상에 감소된 CD8 단백질 밀도를 나타내는 자가반응성 CD8+ T 세포의 집단의 존재는, 대상체가 하나 이상의 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 것임을 나타낼 수 있다. 하나 이상의 TNFR2 활성제에 노출된 자가반응성 CD8+ T 세포의 표면 상의 CD8 단백질 밀도의 감소는 기준 CD8+ T 세포의 표면 상의 CD8 단백질 밀도에 비례하는 것일 수 있다. 기준 CD8+ T 세포는 자가면역 질환을 갖고 TNFR2 활성제로 생체내 또는 시험관내 치료 또는 전치료되지 않은 대상체로부터의 샘플로부터 얻어질 수 있다. 다르게는, 기준 CD8+ T 세포는 건강한 대상체로부터의 샘플로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, CD8+ T 세포의 표면 상의 CD8 단백질 밀도는 항-CD8 항체를 사용하여 결정될 수 있다.
또한 본원에서는 TNF-α 수용체 II(TNFR2) 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 제1형 당뇨병을 갖는 대상체와 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 어려운 제1형 당뇨병을 갖는 대상체를 식별하는 방법을 밝혀 내었다. 본원은 대상체 내 C-펩티드 수치가 치료에, 특히 TNFR2 활성제에 의한 치료에 대상체가 반응할 가능성을 평가하기 위해 사용될 수 있음을 밝혔다. 검출가능한 수치의 C-펩티드(예컨대, 약 1.5 pmol/L 이상의 수치)를 갖는 제1형 당뇨병을 갖는 대상체는 TNFR2 활성제를 함유하는 제약학적 조성물에 의한 치료에 반응하기 쉽다. 특히, TNFR2 활성제에 의한 치료에 대한 반응은 TNFR2 활성제에 의한 치료 이후 대상체 내 C-펩티드 수치의 증가를 감지함으로써 평가될 수 있다. 반면, 검출불가능한 수치의 C-펩티드(예컨대, 약 1.5 pmol/L 미만의 수치)를 갖는 제1형 당뇨병을 갖는 대상체는 TNFR2 활성제를 함유하는 제약학적 조성물에 의한 치료에 반응하기 어렵다(예컨대, 대상체는 이러한 치료법으로부터 제외될 수 있거나 또는 세포 치료법(cellular therapy), 예컨대 만능 세포(예컨대, Hox11+ 세포)에 의한 치료법과 병용하여 TNFR2 치료법이 투여될 수 있다).
C-펩티드 수치는 대상체로부터의 샘플, 예컨대 혈액, 혈액 성분(혈청 또는 혈장), 또는 뇨를 사용하여 검정될 수 있다. C-펩티드 수치의 측정은 기술분야에 알려진 임의의 방법, 예컨대 본원에 참조문헌으로서 포함된 문헌[Thermo Scientific Pierce 분석법 Development Technical Handbook, Version 2, 2011]에 기재된 효소-연결 면역흡수 분석법(ELISA)을 사용하여 가능하다.
예컨대 검출가능한 C-펩티드 수치를 갖는 제1형 당뇨병 환자를 치료하기 위한 TNFR2 활성제의 용도는, 췌장 내 β-섬 세포가, 만약 이들 세포에 대한 손상이 감소될 수 있다면, 시간에 걸쳐 회복되거나 재생될 수 있다(예컨대, β-섬 세포를 표적으로 하는 자가반응성 T 세포의 수를 감소시킴으로써)는 발견에 입각한다. 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치를 갖는 제1형 당뇨병을 가지는 대상체는, 검출가능한 C-펩티드 수치를 갖는 대상체와 다르게 췌장 내 β-섬 세포를 회복시키거나 재생하지 못할 수 있다. 이는 질병의 결과로 인한 많은 또는 심지어 실질적으로 모든 β-섬 세포의 손실에 의한 것일 수 있다(예컨대, 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치를 갖는 대상체는 그들의 신체 내 남아있는 불충분한 수의 β-섬 세포를 가지기 쉽고, 따라서 심지어 자가반응성 면역 세포로 인한 세포 손상의 부재 하에도 정상혈당(normoglycemia)을 형성하는 것이 불가능할 것이다). 더욱이, β-섬 세포의 회복 또는 재생은 대상체 내에 있는 만능 세포(예컨대, Hox11+ 지라세포)의 분화 능력과 관련된 것일 수 있고, 이는 β-섬 세포를 포함하는 다양한 세포 종류를 생성할 수 있는 세포의 공급원을 제공할 수 있다. 또한 대상체 내 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치는 대상체가 β-섬 세포를 회복 또는 재생하고, 정상혈당을 형성하기에는 충분한 수의 이들 만능 세포, 예컨대 Hox11+ 지라세포가 부족하다는 것을 나타낼 수 있다.
검출가능한 C-펩티드 수치를 갖는 제1형 당뇨병을 가진 대상체 내 TNFR2 활성제의 이로운 활성은 이들의 생체내 자가반응성 CD8+ T 세포를 사멸시키는 능력과 관련되고(예컨대 문헌[Ban et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 105:13644-13649, 2008] 참조), 이는 이들 세포에 의해 야기된 조직 손상을 감소시키거나 최소화시킨다(예컨대, β-섬 세포의 손실). 또한, TNFR2 활성제는 질병의 염증성 성분을 조절하는 생체내 이로운 조절 CD4+ T 세포의 팽창을 촉진한다. 어떤 특정 이론에 얽매이지 않고, TNFR2 작용성(agonism)은 자가반응성 T 세포 내 세포예정사를 유도함으로써, TNFR2 활성제가 투여된 대상체(예컨대, 인간) 내 제1형 당뇨병을 치료하는 것으로 알려진 세포내 NF-κB 신호전달을 활성화시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 진단 방법
CD8 표면 단백질 분석법
본 발명은 하나 이상의 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 자가면역 질환을 갖는 대상체(예컨대, 인간)를 식별하는 방법을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하기를 포함한다: (i) 대상체로부터의 하나 이상의 CD8+ T 세포를 함유하는 시험관내 생물학적 샘플(예컨대, 혈액)을 TNFR2 활성제를 함유하는 조성물과 접촉시키고, (ii) 항-CD8 항체를 사용하여 자가반응성 CD8+ T 세포를 검출한다. 기준 CD8+ T 세포에 비해 하나 이상의 자가반응성 CD8+ T 세포의 표면 상의 감소된 CD8 단백질 밀도는 대상체가 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타낸다. 기준 CD8+ T 세포, 예컨대 자가반응성 CD8+ T 세포는, TNFR2 활성제로 생체내 또는 시험관내 치료되거나 전치료되지 않은 자가면역 질환을 갖는 대상체로부터의 샘플로부터 얻어질 수 있다. 다르게는, 기준 CD8+ T 세포(예컨대, 비-자가반응성 CD8+ T 세포)는 건강한 대상체로부터의 샘플로부터 얻어질 수 있다.
그들의 표면 상의 CD8 단백질 밀도의 분석을 위한 하나 이상의 자가반응성 CD8+ T 세포를 함유하는 샘플(예컨대, 혈액)은 자가면역 질환을 갖는 대상체로부터 수득될 수 있다. 샘플은, 샘플 내 세포를 대사 "동결"시키는 티로신 키나아제 억제제, 예컨대 다사티닙(dasatinib)(네덜란드 흐로닝겐 소재 액손 메드켐(Axon Medchem) BV)(본원에 참조문헌으로서 포함되는, 문헌[Lissina et al., J. Immunol. Methods, 340:11-24, 2009] 참조)으로 보존될 수 있다. 샘플 내 다사티닙의 최종 농도(end concentration)는 적어도 약 10 nM(예컨대, 적어도 50 nM, 적어도 약 100 nM, 적어도 약 200 nM, 적어도 약 500 nM 또는 적어도 약 1 μM)일 수 있다. CD8+ T 세포를 보존하기 위해서, 이들 세포 및 티로신 키나아제 억제제를 함유하는 샘플은, 샘플 내 세포를 사용하여 세포-표면 CD8 단백질 밀도의 결정을 수행하기 전, 적어도 약 4 시간(예컨대, 적어도 약 6 시간, 적어도 약 8 시간, 적어도 약 10 시간, 적어도 약 12 시간, 또는 적어도 약 14 시간) 및 최대 약 48 시간(예컨대, 약 40 시간 이하, 약 36 시간 이하, 약 32 시간 이하, 약 28 시간 이하, 약 24 시간 이하, 또는 약 20 시간 이하) 동안 배양될 수 있다. 다사티닙은 세포 표면 구조를 변화시키지 않는 대사 억제제이다. 따라서, 다사티닙으로 보존된 세포는 4-48 시간 동안 저장되더라도 정밀하게 염색될 수 있다.
샘플(신선한 것이거나 다사티닙과 같은 티로신 키나아제 억제제로 보존된 것)은, 예컨대 샘플을 기술분야에 알려진 임의의 형광색소와 컨쥬게이션된 항-CD8 항체와 접촉시킴으로써, 분석될 수 있다. 형광색소의 비-제한적인 예는 FITC, RD1, 알로피코시아닌(APC), CFTM 염료(캘리포니아주 헤이워드 소재 바이오티움(Biotium)), BODIPY(캘리포니아주 칼즈배드 소재 라이프 테크놀로지스의 인비트로젠(Invitrogen)TM), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)®(캘리포니아주 칼즈배드 소재 라이프 테크놀로지스의 인비트로젠TM), 다이라이트 플루오르(DyLight Fluor)(일리노이주 록퍼드 소재 써모 사이언티픽 피어스 프로테인 바이올로지 프로덕츠(Thermo Scientific Pierce Protein Biology Products)), ATTO(독일 지겐 소재, 아또-테크 게엠베하(ATTO-TEC GmbH)), 플루오로프로브(FluoProbe)(프랑스 몽뤼송 소재 인터침(Interchim) SA), 및 아베리어 프롭스(Abberior Probes)(독일 괴팅겐 소재 아베리어 게엠베하(Abberior GmbH))를 포함한다. 유세포 분석과 같은 방법은 자가반응성 T 세포의 표면 상의 CD8 단백질에 부착된 항-CD8 항체와 컨쥬게이션 된 형광색소로부터의 형광을 검출하는데 사용될 수 있다. 형광의 강도는 세포의 표면 상의 CD8 단백질 밀도의 정량적인 측정을 제공한다.
TNFR2 활성제에의 노출 이후 자가반응성 CD8+ T 세포의 집단의 세포-표면 CD8 단백질 밀도가 감소된 것으로 검출되면, 대상체가 TNFR2 활성제를 사용하는 자가면역 질환의 치료에 반응하기 쉽다는 것을 나타낸다. 기준 CD8+ T 세포에 비해, 자가반응성 CD8+ T 세포 상의 세포-표면 CD8 단백질 밀도의 감소는, 자가반응성 CD8+ T 세포가 TNFR2 활성제에 의한 치료로 발생한 세포예정사를 겪는다는 것을 나타낸다. 기준 CD8+ T 세포는 건강한 대상체로부터의 비-자가반응성 CD8+ T 세포일 수 있다. 다르게는, 기준 CD8+ T 세포는 생체내 또는 시험관내 TNFR2 활성제에 노출되지 않은 자가반응성 CD8+ T 세포일 수 있다. 따라서, 상기 기재된 분석법을 사용하여 검출된 CD8 세포-표면 밀도의 감소는 대상체가 TNFR2 활성제에 의한 생체내 치료법에 반응하기 쉬운 것을 나타내고, 이는 치료 동안 자가반응성 CD8+ T 세포 사멸을 일으키는 것으로 예상된다. 생존가능한 자가반응성 CD8+ T 세포의 부재는 이들 세포로 야기되는 세포 손상의 감소를 촉진시키고, 손상된 조직의 재생을 가능하게 하여 대상체의 건강을 개선시킬 수 있다.
C-펩티드 분석법
본 발명은 또한 하나 이상의 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 제1형 당뇨병을 가진 대상체(예컨대, 인간)를 식별하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 대상체(예컨대, 인간)로부터의 시험관내 생물학적 샘플(예컨대, 혈액, 혈액 성분(예컨대, 혈청 또는 혈장), 또는 뇨)을 샘플 내 C-펩티드를 검출할 수 있는 장치와 접촉시키는 것을 포함한다. 약 1.5 pmol/L 초과(예컨대, 약 2.5 pmol/L 초과)의 샘플 내 C-펩티드 수치의 검출은 대상체(예컨대, 인간)가 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타낸다. 약 1.5 pmol/L 미만의 샘플 내 C-펩티드의 수치의 검출은 대상체가 치료에 반응하기 어려운 것을 나타낸다(예컨대, 대상체는 이러한 치료법으로부터 제외될 수 있거나 또는 세포 치료법(예컨대, Hox11+ 지라세포와 같은 만능 세포)과 병용하여 TNFR2 치료법이 투여될 수 있다). 약 1.5 pmol/L 내지 약 900 pmol/L(예컨대, 약 500 pmol/L, 약 200 pmol/L, 약 100 pmol/L, 약 50 pmol/L, 또는 약 4.0 pmol/L)의 범위 내의 샘플 내 C-펩티드 수치의 검출은 대상체가 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타낸다. 본 발명의 방법에 따라서, 대상체는 장기 당뇨병 환자일 수 있다. 1.5 pmol/L 초과의 C-펩티드 수치는 대상체가 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타낸다. C-펩티드 수치는 공복 대상체로부터의 샘플(공복 C-펩티드 수치) 또는 혼합식 부하시험 또는 글루카곤 시험에 의한 자극 중의 대상체로부터의 샘플로 측정될 수 있다. 치료가 자가반응성 CD8+ T 세포의 세포 사멸 및/또는 내인성 β-섬 세포의 팽창 또는 재생을 야기하는 경우, 대상체는 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응함으로써, 치료 전 수치에 비해, 인슐린 수치의 증가 및 평균 혈장 혈당치의 감소로 이어진다(예컨대, 정상혈당을 형성).
본 발명의 방법에 따라서, 접촉 단계는 하기에 의해 수행될 수 있다: (i) 샘플을 그의 표면 상에 고정된 포획제(예컨대, C-펩티드에 결합하는 항체)를 갖는 장치와 접촉시켜 샘플 내 C-펩티드가 고정된 포획제에 결합하도록 하고; (ii) 표면을 검출 결합제와 접촉시켜 C-펩티드가 검출 결합제(예컨대, C-펩티드에 특이적으로 결합하는 항체)에 결합하도록 하고; (iii) 검출 결합제를 사용하여 샘플 내 C-펩티드의 수치를 검출한다. 검출 결합제는 C-펩티드에 특이적일 수 있다. 검출 결합제는 퍼옥시다아제 효소에 컨쥬게이션될 수 있고, 이는 장치의 표면을 과산화수소의 용액과 접촉시킴으로써 검출될 수 있다. 과산화수소의 용액은 추가로 퍼옥시다아제 기질을 함유할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 기술분야에 알려진 임의의 퍼옥시다아제 기질이 사용될 수 있다. 일부 흔한 퍼옥시다아제 기질은 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(ABTS), 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘(TMB), o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드(OPD), 10-아세틸-3,7-디히드록시페녹사진(ADHP), 루미놀, 디소듐 p-니트로페닐 포스페이트(PNPP), o-니트로페닐-β-갈락토피라노시다아제(ONPG), 콴타블루(QuantaBlu) 형광원 퍼옥시다아제 기질(일리노이주 록퍼드 소재 써모 사이언티픽 피어스 프로테인 바이올로지 프로덕츠), 콴타레드(QuantaRed) 증진된 화학형광(chemifluorescent) 퍼옥시다아제 기질(일리노이주 록퍼드 소재 써모 사이언티픽 피어스 프로테인 바이올로지 프로덕츠), 슈퍼시그널(SuperSignal) ELISA 펨토 최대 감응성 기질(일리노이주 록퍼드 소재 써모 사이언티픽 피어스 프로테인 바이올로지 프로덕츠), 및 슈퍼시그널 ELISA 피코 화학발광(chemiluminescent) 기질(일리노이주 록퍼드 소재 써모 사이언티픽 피어스 프로테인 바이올로지 프로덕츠)이다. 퍼옥시다아제 기질의 퍼옥시다아제와의 반응은 분광광도법으로 검출될 수 있다.
대상체로부터의 샘플 내 C-펩티드의 검출은 기술분야에 알려진 임의의 분석법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 메르코디아(Mercodia) AB(스웨덴 웁살라 소재)에 의해 제조된 것과 같은 초감도 C-펩티드 효소-연결 면역흡수 분석법(ELISA)은 샘플 내 C-펩티드의 정량적인 결정을 위한 고체상 두-자리 효소 면역분석법을 제공한다. 면역분석법은, 두 모노클로날 항체가 C-펩티드 분자 상의 별개의 항원 결정기에 대한 것인, 직접 샌드위치 기법에 기반한다. 배양 동안, 샘플 내 C-펩티드는 미세적정 웰(well)에 결합된 항-C-펩티드 항체와 반응한다. 워싱 후, 퍼옥시다아제(예컨대, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제) 컨쥬게이션된 항-C-펩티드 항체가 첨가된다. 두 번째 배양 및 단순 워싱 단계 후, 결합 컨쥬게이트(bound conjugate)는 과산화수소의 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘(TMB)과의 반응에 의해 검출될 수 있다. 반응은 분광광도법으로 판독되는 종결점을 제공하도록 산을 첨가함으로써 정지된다. 다르게는, 두 번째 배양 후 결합 컨쥬게이트는 기술분야에 알려진 임의의 다른 퍼옥시다아제 기질, 예컨대 상기 나열된 기질에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서, 제1형 당뇨병을 갖는 대상체로부터의 샘플 내 실질적으로 검출불가능한 수치의 C-펩티드는, 특히 C-펩티드 수치가 약 1.5 pmol/L 미만인 경우, 대상체가 β-섬 세포를 재생시키는 능력을 잃었다는 것을 나타낼 수 있다. 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치는 또한 대상체가 β-섬 세포를 재생시킬 수 있는 Hox11+ 지라세포가 부족한 것을 나타낼 수 있다.
TNFR2 활성제에 의한 제1형 당뇨병 치료의 장기 효능은, β-섬 세포를 재생시키고/거나 치료 전 대상체 내 고혈당증 및 저헐당증의 발생률에 비해 고혈당증 및 저혈당증의 발생률을 감소시키는 대상체의 능력으로 파악될 수 있다(예컨대, 효능은 대상체가 정상혈당 상태에 있는 기간의 증가에 의해 파악될 수 있다). 치료는 본 발명의 제약학적 조성물, 예컨대, 하나 이상의 TNFR2 활성제를 함유하는 조성물, 하나 이상의 만능 세포(예컨대, Hox11+ 지라세포)를 함유하는 조성물, 또는 그의 조합을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. C-펩티드 수치는 치료된 대상체 내 본 발명의 제약학적 조성물에 의한 치료의 효능을 평가하기 위한 프록시로서 사용될 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물로 치료된 대상체 내 C-펩티드 수치의 변화(예컨대, 증가)는 대상체가 치료에 반응했다는 것을 나타낸다. 대상체의 치료 후 적어도 1 개월(예컨대, 적어도 3 개월, 적어도 6 개월, 적어도 1 년, 적어도 2 년, 적어도 3 년, 적어도 4 년, 적어도 5 년, 또는 적어도 6 년) 뒤, 대상체의 C-펩티드 수치의 약 1 %(예컨대, 약 2 %, 약 5 %, 약 10 %, 약 20 %, 약 30 %, 약 40 %, 약 50 %, 약 100 %, 약 200 %, 약 500 %, 약 1000 %, 약 2000 %, 약 5000 %, 또는 약 7000 %) 증가는, 대상체의 성공적인 치료와, 대상체의 반복 치료가 필요하지 않음을 나타낼 수 있다. 대상체의 치료 후 적어도 1 개월(예컨대, 적어도 3 개월, 적어도 6 개월, 적어도 1 년, 적어도 2 년, 적어도 3 년, 적어도 4 년, 적어도 5 년, 또는 적어도 6 년) 뒤, 대상체의 C-펩티드 수치의 변화의 감소 또는 부족은, 대상체가 본 발명의 제약학적 조성물의 반복 투여를 필요로 함을 나타낼 수 있다. C-펩티드 수치는 대상체의 치료 후 적어도 1 개월(예컨대, 적어도 3 개월, 적어도 6 개월, 적어도 1 년, 적어도 2 년, 적어도 3 년, 적어도 4 년, 적어도 5 년, 또는 적어도 6 년) 뒤 검출될 수 있다. C-펩티드 수치의 변화는 기준 C-펩티드 수치에 비례하여 평가될 수 있다. 기준 C-펩티드 수치는 본 발명의 제약학적 조성물로의 첫 번째 (또는 차후의) 치료 전에 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 C-펩티드 수치일 수 있다.
HbA1c 분석법
본 발명은 또한, 대상체의 치료 전에, 그 동안, 또는 이후 대상체로부터의 혈액 샘플 내 HbA1c 수치를 측정함으로써, 대상체가 TNFR2 활성제(단독으로 또는 하나 이상의 만능 세포, 예컨대 Hox11+ 지라세포를 포함하는 조성물과 조합하여)로의 치료에 반응하기 쉽거나 쉬울 것인지를 결정하는 방법을 특징으로 한다. 대상체의 치료 전 측정된 HbA1c 수치는 기준 HbA1c 수치로서 사용될 수 있다. 대상체로부터 채취된 혈액 샘플 내 HbA1c 수치의 추가적인 측정은 대상체의 치료 후 적어도 1 개월(예컨대, 적어도 3 개월, 적어도 6 개월, 적어도 1 년, 적어도 2 년, 적어도 3 년, 적어도 4 년, 적어도 5 년, 또는 적어도 6 년) 뒤 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 추가로 치료 후 측정된 HbA1c 수치를 기준 HbA1c 수치에 비교하고, HbA1c 수치가 기준 HbA1c 수치 이상인 경우, 본 발명의 제약학적 조성물에 의한 반복 치료를 필요로 하는 대상체를 식별하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 TNFR2 활성제의 투여 후, HbA1c 수치는 종결점을 결정하고 치료의 장기 성공을 평가하기 위해 대상체로부터의 샘플에서 측정될 수 있다. 기준 HbA1c 수치에 비해 HbA1c 수치의 적어도 약 0.1 %(예컨대, 0.15 %, 0.2 %, 0.25 %, 0.3 %, 0.4 %, 또는 0.5 %)의 감소는 치료의 장기 성공이 예상됨을 나타낼 것이다. 기준 HbA1c 수치에 대한 HbA1c 수치의 적어도 약 0.1 %(예컨대, 0.2 %, 0.3 %, 0.4 %, 또는 0.5 %)의 증가는 본 발명의 제약학적 조성물로의 한 번 이상의 반복 치료가 대상체에게 제공되어야 한다는 것을 나타낼 수 있다.
혈액 샘플 내 HbA1c 수치는 기술분야에 알려진 방법, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피, 면역분석법, 효소 분석법(캘리포니아주 파웨이소재 디아자임 연구소(Diazyme Laboratories), 직접 효소 HbA1c 분석법(Direct Enzymatic HbA1c Assay)), 모세관 전기이동(조지아주 노크로스 소재 세비아(Sebia)), 또는 보로네이트 친화성 크로마토그래피(아일랜드 브래이 소재 트리트니 바이오테크 피엘씨(Trinity Biotech Plc))에 따라 측정될 수 있다. 대상체로부터의 샘플 내 HbA1c를 측정하는 방법은, 예컨대 참조문헌으로서 본원에 포함되는 문헌[Little et al., Clin. Chem. 54:1277-1282, 2008]에 기재된다. HbA1c 수치를 기술하는데 사용되는 표준 지표는 예컨대 참조문헌으로서 본원에 포함되는 문헌[Goodall, I., Clin. Biochem. Rev. 26:5-20, 2005]에 기재된다.
본 발명의 제약학적 조성물
본 발명은 또한 자가면역 질환(예컨대, 제1형 당뇨병)을 갖는 대상체(예컨대, 인간)의 치료를 위한, 특히, 본 발명의 하나 이상의 진단 방법에 의해 치료에 반응하기 쉬운 것(예컨대, CD8+ T 세포 사멸을 경험할 가능성이 있고/거나 자가면역 질환에 의해 손상된 조직(예컨대, 제1형 당뇨병이 있는 대상체 내 β-섬 세포)의 회복 및/또는 재생을 경험할 가능성이 있는 것)으로 식별된 대상체의 치료를 위한 하나 이상의 TNFR2 활성제를 함유하는 제약학적 조성물을 특징으로 한다.
하나 이상의 TNFR2 활성제를 함유하는 제약학적 조성물은, 치료에 반응하기 쉬운 대상체의 자가면역 질환, 예컨대 제1형 당뇨병을 치료하는데 사용될 수 있다. 기준 T 세포의 표면 상의 CD8 단백질의 밀도에 비해, 자가면역 질환을 갖는 대상체로부터의 샘플 내 자가반응성 CD8+ T 세포의 표면 상의 CD8 단백질의 밀도 감소는 대상체가 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타낸다. 기준 T 세포는 치료되어야 하는 대상체로부터 또는 상이한 대상체로부터 수득될 수 있다. 기준 T 세포는 건강한 대상체로부터 또는 아직 하나 이상의 TNFR2 활성제로 치료되지 않은 자가면역 질환을 갖는 대상체로부터의 T 세포일 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물을 사용하여 치료될 수 있는, 본 발명의 하나 이상의 진단 방법에 따른 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된 대상체의 자가면역 질환의 예는, 제1형 당뇨병, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질항체 증후군, 자가면역 에디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트 병, 수포성 유천포창, 심근증, 복강 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 추르그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, 크레스트 증후군, 한랭 응집소증, 크론병, 원판성 루푸스, 전신 홍반 루푸스, 궤양성 대장염, 건선성 관절염, 한랭 글로블린 혈증, 섬유근통-섬유근염, 그레이브스병, 길랭-바레, 하시모토 갑상선염, 갑상선기능 저하증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신병증, 소아 관절염, 편평태선, 루푸스, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경화증, 건선, 레이노 증후군, 라이터 증후군, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 데빅병, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 자가면역 신경 장애를 포함한다. 특히, 본 발명의 진단 방법에 따른 치료법에 반응하기 쉬운 것으로 식별된, 제1형 당뇨병, 복강 스프루-피부염, 크론병, 그레이브스병, 갑상선기능 저하증, 루푸스, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 유육종증, 쇼그렌 증후군, 또는 궤양성 대장염을 갖는 대상체가 치료될 수 있다. 자가면역 신경 장애는 뉴런, 예컨대 운동뉴런에 손상을 유발하는 자가면역-매개성 장애일 수 있다. 특히 자가면역 신경 장애는 자가면역 알츠하이머병, 자가면역 파킨슨병, 및 자가면역-매개성 근위축성 측삭경화증(ALS)을 포함한다.
제1형 당뇨병을 갖는 대상체로부터의 샘플(예컨대, 혈액, 혈액 성분(예컨대, 혈청 또는 혈장), 또는 뇨) 내 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치는 대상체가 하나 이상의 TNFR2 활성제를 함유하는 제약학적 조성물에 의한 치료에 반응하기 어려운 것을 나타낸다(예컨대, 대상체는 이러한 치료법으로부터 제외될 수 있거나 또는 세포 치료법, 예컨대 만능 세포(예컨대, Hox11+ 세포)와 병용하여 TNFR2 치료법이 투여될 수 있다). 제1형 당뇨병을 갖는 대상체로부터의 샘플 내 검출가능한 C-펩티드 수치(예컨대, 약 1.5 pmol/L 초과의 수치)는 대상체가 하나 이상의 TNFR2 활성제를 함유하는 제약학적 조성물에 의한 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타낸다. 대상체는 장기 당뇨병 환자일 수 있다. 본 발명의 조성물은, 제1형 당뇨병을 가지고 본 발명의 임의의 하나 이상의 방법에 따라 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 제1형 당뇨병을 가진 대상체로부터의 뇨 샘플 내 약 4 pmol/mmol 미만의 크레아티닌에 대한 C-펩티드 비는 또한, 대상체가 하나 이상의 TNFR2 활성제를 함유하는 제약학적 조성물에 의한 치료에 반응하기 어려운 것을 나타낼 수 있다(예컨대, 대상체는 이러한 치료법으로부터 제외될 수 있거나 또는 세포 치료법, 예컨대 만능 세포(예컨대, Hox11+ 세포)와 병용하여 TNFR2 치료법이 투여될 수 있다). 제1형 당뇨병을 가진 대상체로부터의 뇨 샘플 내 약 4 pmol/mmol 초과의 크레아티닌에 대한 C-펩티드 비는, 대상체가 하나 이상의 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타낼 수 있다. 제1형 당뇨병을 가진 대상체로부터의 뇨 샘플 내 약 4 pmol/mmol 내지 약 11 pmol/mmol의 크레아티닌에 대한 C-펩티드 비는, 대상체가 하나 이상의 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타낼 수 있다. 뇨 샘플 내 크레아티닌에 대한 C-펩티드 비는, 본원에 참조문헌으로서 포함되는 문헌[Besser et al., (Diabetes Care 34:607-609, 2011)]에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. TNFR2 활성제(예컨대, BCG)로의 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된 대상체는, TNFR2 활성제, 예컨대 BCG로 1 회 이상 순차적으로 치료될 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 하나 이상의 TNFR2 활성제를 함유할 수 있고, 그 예로 칼메트-게랑 간균(BCG), 완전 프로인트 항원보강제, TNF-α, TNF-α 수용체 II 작용물질(TNFR2 작용물질의 비-제한적인 예시, 예컨대 항체가, 본원에 참조문헌으로서 포함되는 U.S. 특허 제7,582,313호, U.S. 특허 제8,017,392호 및 U.S. 특허 제8,173,129호에 기재됨), TNF-α 무테인(TNF-α 무테인의 비-제한적인 예가, 본원에 참조문헌으로서 포함되는 U.S. 특허 제5,597,899호에 기재됨), 인터류킨-1, 인터류킨-2, 조직 플라스미노겐 인자, 지질다당류(LPS), 림프독소 및 카켁틴을 들 수 있다. 본 발명의 일부 제약학적 조성물은 투여 시 대상체 내 TNF-α의 발현을 유도하는 능력이 있을 수 있다. 본 발명의 다른 조성물은, 투여 시 대상체의 TNF-α 수용체 II(작용물질로써)를 특이적으로 활성화시키고/거나 자가반응성 면역 세포(예컨대, 자가반응성 CD8+ T 세포) 내 NF-κB 경로의 활성화를 유도할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 조성물의 투여는 또한 대상체 내 하나 이상의 자가반응성 면역 세포의 사멸을 유발할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 대상체 내 조절 T 세포(예컨대, 조절 CD4+ T 세포)의 팽창을 유발할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 제1형 당뇨병을 갖는 대상체의 고혈당증으로부터의 합병증(예컨대, 신장 손상, 신경 손상, 심혈관 손상, 망막의 손상, 발의 손상, 다리의 손상, 심장의 손상, 또는 케토산증)을 감소시키거나 치료할 수 있다.
본 발명의 TNFR2-활성제 함유 제약학적 조성물은, 첫 번째 치료 이후에, 대상체로부터의 샘플(예컨대, 혈액, 혈액 성분(예컨대 혈청 또는 혈장), 또는 뇨) 내 HbA1c 수치가 이전 치료 전 대상체로부터의 기준 HbA1c 수치에 비해 증가하거나 동일하게 남아있는 경우, 두 번째 또는 그 다음 번째로 대상체(예컨대, 인간) 내 제1형 당뇨병을 치료하는데 사용될 수 있다. 치료된 대상체 내 HbA1c 수치의 감소는 대상체가 TNFR2 활성제 치료에 반응하는 것을 나타낼 수 있다(예컨대, 대상체는 두 번째 또는 그 다음 번째 치료를 필요로 하지 않을 수 있다). 대상체에의 TNFR2 활성제의 투여 후 약 4 년 내(예컨대, 약 3 년 내), 대상체 내 HbA1c 수치의 적어도 약 0.1 %(예컨대, 적어도 약 0.15 %, 적어도 약 0.2 %, 적어도 약 0.25 %, 적어도 약 0.3 %, 적어도 약 0.4 %, 적어도 약 0.5 %, 적어도 약 0.6 %, 적어도 약 0.7 %, 적어도 약 0.8 %, 적어도 약 0.9 %, 적어도 약 1.0 %)로의 감소는, 대상체가 치료에 반응하는 것을 나타낸다.
세포 치료법
본 발명의 방법에 따른 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치(예컨대, 약 1.5 pmol/L 미만의 C-펩티드 수치)로의 제1형 당뇨병을 가진 대상체의 식별은, 대상체가 β-섬 세포 또는 β-섬 세포를 재생시킬 수 있는 세포, 예컨대 만능 세포(예컨대, Hox11+ 지라세포)로의 치료로부터 이익을 얻거나, 이를 필요로 함을 나타낼 수 있다. 본원에 참조문헌으로서 포함된 국제공개공보 제WO 2005/042727에 기재된 바와 같이, Hox11+ 지라세포는 대상체 생체내 β-섬 세포를 재생시킬 수 있는 세포의 내인성 공급원이다. 따라서, 하나 이상의 TNFR2 활성제에 의한 치료가 자가반응성 T 세포를 사멸시키고 대상체가 내인성 β-섬 세포를 재생시키도록 하는 경우(예컨대, 내인성 β-섬 세포의 팽창을 통해서, 또는 만능 세포, 예컨대 Hox11+ 지라세포의 β-섬 세포로의 분화로 인해), 제1형 당뇨병을 가진 대상체는 세포 치료법으로부터 장기 이익(예컨대, 4년 내, 예컨대 3년 내)을 가질 수 있다. 예컨대, 본원에 참조문헌으로서 포함되는 U.S. 특허 제7,432,104호 및 제8,008,075호에 기재된 것을 포함하는, 대상체 내 β-섬 세포로 분화될 수 있는 다른 종류의 만능 세포가 대상체에 투여될 수 있다. 제1형 당뇨병을 갖는 대상체로부터의 샘플 내 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치(예컨대, 약 1.5 pmol/L 미만)는 대상체가 β-섬 세포를, 예컨대 Hox11+ 지라세포 격실로부터 재생하는 능력을 잃었음을 나타낼 수 있다. 따라서, 대상체는 β-섬 세포의 외인성 공급원의 투여로부터 이익을 얻을 수 있다.
본 발명에 따라 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있는 만능 세포의 비-제한적인 실시예는, 예컨대 본원에 참조문헌으로서 포함되는 WO 2002/059278, WO 2003/026584, WO 2005/042727, WO 2006/074308, WO 2012/152717, U.S. 7,432,104, 및 U.S. 8,008,075에 기재된 것들을 포함한다. 하나 이상의 만능 세포(예컨대, Hox11+ 지라세포)를 함유하는 조성물은, TNFR2 활성제-함유 조성물 전, 다음, 또는 이를 동반하여 투여될 수 있거나, 또는 두 조성물이 단일 제형으로의 투여를 위해 조합될 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물의 제제
하나 이상의 TNFR2 활성제를 함유하는 본 발명의 제약학적 조성물은 임의의 경로, 예컨대 피부내의, 근육내의, 비경구의, 정맥내의, 동맥내의, 두개내의, 피하의, 안와내의, 심실내의, 척수내의, 복강내의, 또는 비강내의 투여를 위해 제제화된다. 본 발명의 조성물은 피부내의 투여를 위해 제제화될 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제는, 예컨대 물, 인산-완충 식염수(PBS), 아세테이트-완충 식염수(ABS), 링거액, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 또한, 바람직하다면, 대상체에의 투여를 위한 조성물은 조성물의 효능을 증강시키는 적은 양의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
또한, TNFR2 활성제는 다수의 상이한 횟수 및/또는 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 1 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5 이상) 회분의 TNFR2 활성제는 매일, 매주, 매월 또는 매년(예컨대, 매일 2회마다, 격주마다, 분기마다, 반년마다, 또는 연 3회마다) 투여될 수 있다.
본 발명의 TNFR2-활성제 함유 조성물(예컨대, BCG)은 제1형 당뇨병을 갖고, 본원에 기재된 진단 방법에 따라 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별되는 대상체에 1 회 이상(예컨대, 2 회 이상, 예컨대 2 회) 투여될 수 있다. TNFR2-활성제 함유 조성물은, 투여 사이에 예컨대 약 1 주(예컨대, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 또는 약 8 주 이상)의 간격을 두고 2 회 이상 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, TNFR2 활성제 조성물의 투여는 적어도 2 주 간격(예컨대, 4 주 간격)으로 떨어질 수 있다.
TNFR2 활성제는 TNF-α 유도 물질, 예컨대 BCG일 수 있다. 제약학적 조성물은 1 회 용량 당 2 x 106 CFU 초과의 BCG(예컨대, 1 회 용량 당 2.3 x 106 CFU 초과의 BCG)를 함유할 수 있다. 조성물은 1 회 용량 당 4 x 106 CFU 미만의 BCG를 함유할 수 있다. 조성물은 1 회 용량 당 약 2 x 106 내지 약 2.5 x 106, 약 2.5 x 106 내지 약 3 x 106 CFU의 BCG, 1 회 용량 당 약 3 x 106 내지 약 3.5 x 106 CFU의 BCG, 또는 1 회 용량 당 약 3.5 x 106 내지 약 4 x 106 CFU의 BCG를 함유할 수 있다. 조성물은 1 회 용량 당 약 2 x 106 내지 약 4 x 106 CFU의 BCG를 함유할 수 있다. 조성물은 1 회 용량 당 약 2.3 x 106 내지 약 4 x 106 CFU의 BCG를 함유할 수 있다. 조성물은 1 회 용량 당 약 2.5 x 106 내지 약 4 x 106 CFU의 BCG를 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, BCG 조성물은 동결건조될 수 있다. 다르게는, 조성물은 BCG의 식염수 용액을 함유할 수 있다. BCG의 식염수 용액은 식염수 용액 내 동결건조된 BCG를 재구성함으로써 만들 수 있다. 용액은 회당 약 0.2 cc 미만(예컨대, 회당 약 0.1 cc)의 부피를 가질 수 있다.
하나 이상의 만능 세포를 함유하는 본 발명의 조성물은, 대상체가 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 어려운 것으로 식별된 후, 투여될 수 있다. 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 만능 세포를 함유하는 조성물은, 임의의 경로, 예컨대, 피부내, 근육내, 비경구, 정맥내, 동맥내, 두개내, 피하, 안와내, 심실내, 척수내, 복강내, 또는 비강내로 투여되기 위해 제제화될 수 있다. 바람직하게, 하나 이상의 만능 세포를 함유하는 조성물은 비경구의, 예컨대 주사(예컨대, 정맥내 또는 근육내) 또는 외과적 이식을 통해 투여된다. 만능 세포를 함유하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에 1 회 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5 회 이상) 투여될 수 있다. 1 회 이상의 투여는 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 2 개월, 6 개월, 1 년, 1.5 년, 2 년, 또는 3 년 이상의 간격에 걸칠 수 있다. TNFR2 활성제의 투여는, 만능 세포를 함유하는 조성물의 투여 후 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 2 개월, 6 개월, 1 년, 1.5 년, 2 년, 또는 3 년 이상 수행될 수 있다. 다르게는, TNFR2 활성제는, 상기 기재된 임의의 경로(예컨대, 경로는 동일하거나 상이할 수 있음)에 의해 만능 세포를 함유하는 조성물의 투여를 동반하여, 또는 그 다음 투여될 수 있거나, 또는 조성물이 단일 제형으로의 투여를 위해 조합될 수 있다.
본 발명의 키트
CD8 표면 단백질 분석법을 위한 키트
본 발명은, 대상체로부터의 샘플을 위한 용기, 방부제(예컨대, 다사티닙, 예컨대 샘플 내 적어도 약 10 nM(예컨대 적어도 약 50 nM, 적어도 약 100 nM, 적어도 약 200 nM, 적어도 약 500 nM, 또는 적어도 약 1 μM)의 다사티닙 최종 용액을 제조하기에 충분한 양; 예컨대, 적어도 약 10 mM 다사티닙을 갖는 1 mL 용액 또는 고체 형태로 적어도 약 1.0 μg 내지 약 25 mg의 다사티닙이 있는 용기), 샘플을 수집하고/거나 용기 내 샘플을 넣기 위한 기기, 및 샘플을 수집하고 보존하기 위한 기기를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 형광색소 및/또는 TNFR2 활성제(예컨대, 칼메트-게랑 간균(BCG), 완전 프로인트 항원보강제, TNF-α, TNF-α 수용체 II 작용물질, TNF-α 무테인, 인터류킨-1, 인터류킨-2, 조직 플라스미노겐 인자, 지질다당류(LPS), 림프독소 또는 카켁틴)에 컨쥬게이션된 CD8 항체를 추가로 함유할 수 있다. 또한 상기 기재된 키트 내 기기는 어떻게 전문가(예컨대, 의사, 간호사 또는 보건사(laboratory assistant))가 대상체로부터의 샘플을 사용하여, 대상체가 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운지 아닌지를 결정할 수 있는지를 설명할 수 있다. 키트는 추가로 샘플의 용기로의 수집 및 이동을 위한 기구(예컨대, 니들 또는 카테터), 세포의 정의된 온도(예컨대, 약 4 ℃ 내지 약 27 ℃)로의 유지를 위한 구성요소, 예컨대 냉각수(예컨대, 아이스팩, 드라이아이스, 냉각주머니 또는 냉각판)를 함유할 수 있다. 또한, 필요하다면, 키트는 세포 샘플의 수송을 위한 저온 처리부(cold box) 또는 단리 담체를 포함할 수 있다.
C-펩티드 검출을 위한 키트
본 발명은 또한 그것의 표면 상에 고정된 포획제(예컨대, C-펩티드에 결합하는 항체)를 갖는 장치, 퍼옥시다아제 효소에 컨쥬게이션된 검출 결합제(예컨대, C-펩티드에 선택적으로 결합하는 항체), 퍼옥시다아제 기질, 및 어떻게 전문가(예컨대, 의사, 간호사 또는 보건사)가 대상체로부터의 샘플의 분석을 위한 키트의 내용물을 사용하여, 대상체가 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운지 아닌지를 결정할 수 있는지를 설명하는 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
HbA1c 분석법을 위한 키트
본 발명은 또한 대상체로부터의 샘플을 저장하기 위한 용기, 및 샘플 내 HbA1c 수치를 결정하고, 대상체가 TNFR2-활성제 함유 조성물의 투여를 필요로 하는지 아닌지를 결정하기 위해 HbA1c 수치를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 이들은 본 발명을 어떤 방식으로든 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1. TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 제1형 당뇨병을 가진 대 상체의 식별
본 발명의 제약학적 조성물(예컨대, TNFR2 활성제)로의 치료 전, 대상체가 치료에 반응하기 쉬운지를 결정하기 위해 대상체(예컨대, 인간)를 시험할 수 있다. 시험은 대상으로부터 수집된 샘플(예컨대, 혈액, 혈액 성분, 또는 뇨)을 사용하여 수행될 수 있다. 예컨대, 혈청 샘플을 제조하기 위해서, 혈액이 정맥천자(venipuncture)에 의해 수집되고, 응집되도록 할 수 있고, 혈청이 원심분리에 의해 분리될 수 있다. 혈장 샘플을 제조하기 위해서, 정맥천자에 의해 항응고제로서 헤파린 또는 EDTA를 함유하는 관으로 혈액이 수집될 수 있다; 혈장 분획은 그 다음 샘플로부터 분리될 수 있다. 뇨 샘플을 제조하기 위해서, 24 시간 뇨 샘플(방부제 없음)이 수집될 수 있다. 세포 파편은 여과 또는 원심분리 둘 중 하나에 의해 시험 전 샘플로부터 제거될 수 있다.
이어서, 대상체로부터의 제조된 샘플은 메르코디아 초감도(Mercodia Ultrasensitive) C-펩티드 ELISA 키트(스웨덴 웁살라 소재 메르코디아 AB에 의해 제조됨)를 사용하여 분석되어 대상체로부터의 샘플 내 C-펩티드 수치를 제공하도록 할 수 있다. 측정된 C-펩티드 수치가 약 1.5 pmol/L 미만인 경우, 대상체는 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 어려운 것으로 식별된다. 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치를 갖는 것으로 식별된 대상체는 TNFR2-활성제 함유 조성물에 의한 치료로부터 제외될 수 있다. 특히, 이러한 대상체는 불충분한 수의 남아있는 내인성 β-섬 세포, 또는 β-섬 세포로 분화하기에 불충분한 양의 남아있는 만능 세포, 예컨대 Hox11+ 지라세포를 갖는 것으로 결정될 수 있고, 따라서 TNFR2 활성제에 의한 치료법 이후 정상혈당의 회복 또는 개선을 나타내기 어렵다. 대상체가 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치를 갖는다는 결정은 또한 대상체가 β-섬 세포 또는 β-섬 세포로 분화할 수 있는 만능 세포, 예컨대 Hox11+ 지라세포의 이식으로부터 이익을 얻을 것임을 나타낼 수 있다. 측정된 C-펩티드 수치가 약 1.5 pmol/L 초과인 경우, 대상체는 TNFR2 활성제에 의한 치료에 반응하기 쉬운 것으로 결정될 수 있다; 이 대상체는, 이러한 치료가 β-섬 세포의 재생 및/또는 정상혈당의 회복 또는 개선을 일으킬 것이라는 기대를 가지고, 본 발명의 TNFR2 활성제 조성물로 치료될 수 있다.
시험은 가능한 데이터의 단일 측정 가변성을 보정하기 위해 1 회 이상 반복될 수 있다.
실시예 2. 본 발명의 제약학적 조성물에 의한 인간의 제1형 당뇨병의 치료
TNFR2 활성제(예컨대, BCG)로의 치료 전, 샘플(예컨대, 혈액)은 실시예 1에서 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된 대상체로부터 채취될 수 있다. 샘플은 HbA1c 수치에 대해 분석되어, 연구를 위한 기준 HbA1c 수치를 결정할 수 있다.
식염수 내 재구성된 BCG를 함유하는 제약학적 조성물은, 1.0-2.3 x 106 CFU/투여(부피 = 0.1 cc/투여)를 함유하는 용량으로, 4 주 간격으로 2 회 피부내 주사로 대상체에 투여될 수 있다. 치료 후, 하기 추가로 기재되는 기능 분석법(자가반응성 CD8+ T 세포 분석법 및 조절 CD4+ T 세포 분석법)을 사용하여 대상체로부터 수득된 샘플을 시험함으로써, 대상체를 시간에 걸쳐 모니터링할 수 있다.
치료 후, TNFR2 활성제, 예컨대 BCG의 투여 후 1 년(예컨대, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 또는 6 년) 뒤, 대상체로부터의 샘플은 HbA1c 수치에 대해 평가되어, 치료의 종결점을 결정하고 장기 성공을 확인할 수 있다. 기준 HbA1c 수치에 비해 HbA1c 수치의 적어도 약 0.1 %(예컨대, 0.15 %, 0.2 %, 0.25 %, 0.3 %, 0.4 %, 또는 0.5 %)의 감소는 치료의 장기 성공의 지표가 될 것이다.
대상체는 HbA1c 수치 변화에 대해 계속 모니터될 수 있다. 기준 HbA1c 수치에 비한 HbA1c 수치의 적어도 약 0.1 %(예컨대, 0.2 %, 0.3 %, 0.4 %, 또는 0.5 %)의 증가는, 대상체에 본 발명의 제약학적 조성물을 다시 투여하여야 한다는 것을 나타낼 수 있다.
면역 모니터링
1. T 세포 분석법
CD4+ 및 CD8+ T 세포는 다이널(Dynal) CD4 양성 단리 키트 및 다이널 CD8 양성 단리 키트(캘리포니아주 칼스배드 소재 인비트로젠)를 사용하여 정맥천자의 1.5 시간 내 신선한 인간 혈액으로부터 단리될 수 있다. 이 방법은 자분(magnetic particle)이 없고 항체로의 양성 선택이 모두 없는 세포를 수득하는 것에서 독특하다.
2. 제1형 당뇨병 내 자가반응성 CD8+ T 세포의 검출
고도로 정제된, 생존가능한 높은 수율의 CD8+ T 세포는, 이전에 기재된 바와 같이(문헌[Verginis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:3479-3484, 2008]), 4합체 염색에 이용될 수 있다. 4합체는 외측 결합 그로브(exterior binding grove) 내 로딩된 펩티드로의 특이적 HLA 클래스 1 단백질의 결합 영역으로 구성된 진단 시약이다. 이어서, 4합체는 형광으로 만들어지고 제시된 펩티드 단편에의 특이적인 반응성이 있는 T 세포에 결합할 수 있는 진단 시약으로서 기능한다. 인슐린에 대한 자가반응성 T 세포를 검출하기 위해서, HLVEALYLV의 단편을 갖는 HLA *0210 인슐린 베타 10-18(벡크만 쿨터(Beckman Coulter) #T02001)에 대한 4합체가 사용될 수 있다. 음성 대조군 4합체에 대하여, 하기 4합체 시약이 사용될 수 있다: 서열 KIFGSLAFL을 갖는 HLA *0201 Her-2/neu(벡크만 쿨터 #T02001), 유방암 펩티드, 비-특이적 펩티드 단편이 없는 HLA *0201 무(null)(벡크만 쿨터 #T01010) 및/또는 서열 NLVPMVATV을 갖는 CMV 바이러스 HLA-A *0201 CMGPP65(벡크만 쿨터 #T01009)에 대한 4합체.
4합체 시약 염색은, 26 ℃에서 12 시간의 배양에 이어서 37 ℃에서 6 시간 및/또는 26 ℃에서 1 시간 휴지에 이어서 37 ℃에서 12 시간 둘 다로 수행될 수 있다. 세포는 그 다음 시톡스-그린(Sytox-green)(매사추세츠주 워번 소재 MBL 인터내셔널 코.(International Co.)) 및/또는 CD8 항체(캘리포니아주 산호세 소재 BD 바이오사이언시즈(Biosciences))로 염색될 수 있다. 모든 세포는 30 분 동안 암실에서 4 ℃에서 염색될 수 있고 그 다음 2 % 비동화(heat-inactivated) 소 혈청과 함께 행크스 완충제(Hank's buffer)로 두 번 워싱될 수 있다. 평균적으로, 100,000 개의 고도로 순수한 CD8+ T 세포가 분석되어, 명확한 데이터 포인트를 확실히 하고, 드문 자가반응성 T 세포의 검출을 허용할 수 있다. 모든 세포는 고정 인공산물(fixation artifact)을 방지하고 사멸 대 생존가능 세포의 정량화를 가능하도록 신선한 것일 수 있다. 세포 생존가능성은, 사멸 세포를 형광 표지하는 두 염색, 시톡스(매사추세츠주 워번 소재 MBL 인터내셔널 코.) 또는 프로피디움 요오드화물(PI) 중 하나에 의해 정량화될 수 있다.
3. 제1형 당뇨병 내 Treg CD4+ 세포의 검출
TREG 세포의 검출을 위해 두 상이한 방법이 사용될 수 있다. TREG 세포는 CD4, CD25bright 및 Foxp3 염색을 사용하거나 CD4, CD25bright 및 CD127low 항체 염색으로 검출될 수 있다. 간단히, 단리된 CD4 양성 세포는 CD4-PE-Cy5(클론 RPA-T4) 및 CD25-PE(클론 BC96) 항체로 실온에서 20 분 동안 배양될 수 있다. 워싱 후, 세포는 실온에서 20 분 동안 Foxp3 픽스/펌(Fix/Perm) 용액(바이오레전드(Biolegend))으로 고정될 수 있다. 세포는 실온에서 15 분 동안 바이오레전드의 Foxp3 펌 완충액(Perm Buffer)으로 워싱되고 투과될 수 있다. 이어서, 세포는 30 분 동안 Foxp3 알렉사 플루오르477 항체(클론 259D)로 염색될 수 있다. 동종 대조군은 유세포 분석 전 각 샘플에 대해 행해질 수 있다. 다르게는, T 조절 세포의 검출을 위해, 염색이 CD4 항체(캘리포니아주 산호세 소재 BD 바이오사이언시즈, 클론 RPA-T4) 및 항-인간 CD127 항체(바이오사이언시즈, 클론 hIL-7R-M21)로도 수행될 수 있다. TREG 세포를 검출하기 위한 다른 방법은, 그 전문이 본원에 참조문헌으로서 포함되는 U.S. 제61/763,217호에 기재되어 있다.
실시예 3. EBV 감염을 갖는 대상체로부터의 샘플 내 CD8 + T 세포의 검출
물질 및 방법
대상체
제1형 당뇨병을 가진 환자를 매사추세츠 종합 병원(General Hospital)에 모집하였다. 당뇨병 환자를 정기적으로 스크리닝하여 질환의 경과를 특성화하고 잠재적 간섭 의학적 증상을 갖는 대상체를 제외시켰다. 스크리닝 동안, 3 명의 환자들이 장기 제1형 당뇨병 및 최근 EBV의 발병을 갖는 것으로 확인되었다. EBV 감염이 없는 당뇨병 환자(N=66)를 기준 집단으로서 본 연구에 사용하였다. 모든 환자 및 대조군 혈액은 EDTA를 함유하는 BD 배큐테이너(Vacutainer)TM 관(뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재, BD)으로 채혈했다.
윤리학 성명서
본 연구는 매사추세츠 종합 병원 기관 감사 위원회(General Hospital Institutional Review Board)에 의해 승인되었다(IRB 프로토콜 제2001P-001379). 서면 동의서는 모든 혈액 공여자로부터 얻었다.
에피토프 -특이적 CD8 + T-세포의 검출
제한된 항원 특이성을 갖는 T-세포의 특이적 아집단의 검출을 위해, 작은 단백질 단편이 충전된 시판되는 HLA 클래스 I 시약이 이용되었다. 이들 상용 시약은 4합체(Tetramer)(이전에 캘리포니아주 풀러턴 소재 배크만 쿨터이었던, 일리노이주 데스플레인즈 MBL 인터내셔널) 또는 덱스트라머(Dextramer)(버지니아주 페어팩스 소재 이뮤덱스(Immudex))로 통상 지칭된다. 두 T-세포 검출 방법은 검출 시약의 주쇄(backbone) 구조에서는 상이하지만, 자가반응성 T-세포에의 결합 특이성에서는 그렇지 않다. 4합체 또는 덱스트라머 시약은 유세포 분석기와 함께 항원 특이적 T-세포에 대한 결합 시약의 검출을 위해 형광 표지된 것을 구입한다.
본 명세서에 포함된 연구에 대해서, 2 종의 항원-특이적 T-세포, 즉 EBV-특이적 T-세포(HLA 클래스 I 로딩된 펩티드; GLCTLVAML) 또는 인슐린-B 자가반응성 T-세포(HLA 클래스 I 로딩된 인슐린-B 쇄; HLVEALYLV)가 검출되었다. T-세포의 백그라운드 형광을 위해서, 매치된 HLA 클래스 I 구조에 비연관 펩티드를 넣었다(배크만 쿨터, 이뮤덱스).
단리된 CD8 + T-세포 방법
신선혈로부터의 CD8+ T-세포의 직접 단리를 위해, 항-CD8 항체로 코팅된 상자성 비드(paramagnetic bead)를 기반으로 한 "비드-분리(Detach-a-bead)" CD8 양성 단리 키트가 사용되었다(캘리포니아주 칼스배드 소재 라이프 테크놀로지스)(본원에 참조문헌으로서 포함되는 문헌[Burger et al., PLoS One, 6:e22430, 2011] 참조). 실온에서 1 시간 동안 텀블러 상에서 연속적 교반 하에 비드들이 붙도록 하였다. 이어서, 비드/세포 복합체는 자석을 사용하여 고정되고 임의의 결합되지 않은(비-CD8) 세포는 2 % FBS(소 태아 혈청)를 함유하는 HBSS(칼슘 및 마그네슘이 없는 행크스 균형잡힌 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution), 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재 인비트로젠)로 반복적으로 워싱되어 제거된다. 이어서, 비드는 단리 키트에서 제공되는 "비드-분리" 시약을 사용하여 남아있는 CD8+ 세포로부터 분리되었다. 이 시약은 비드 상에 코팅된 CD8 항체의 항원 인식 부위에 대한 폴리클로날 항체이다. 이는 CD8 항체 결합 부위에 대한 경쟁으로써 세포로부터 항체/비드 복합체를 분리하여, 실질적으로 버진(virgin) 세포를 남긴다.
단리된 세포 프렙의 순도를 결정하기 위해, 단리된 CD8+ T-세포는 그 다음 PE(피코에리트린) 표지된 4합체 또는 덱스트라머로 표지되고(20 분, RT(실온), 암실에서) 그 후에 APC-항-CD8 항체로 표지된다(10 분, RT, 암실에서; 캘리포니아주 산호세 소재 BD 바이오사이언시즈, 클론(clone) SK1). 샘플은 그 다음 유세포 분석을 위해 HBSS 0.1 % 포름알데히드 완충액으로 고정되고, HBSS로 워싱되고, HBSS/0.05 % 포름알데히드에 재-현탁된다.
전혈 (Whole blood) 방법
혈액 샘플은 먼저 2 % FBS를 함유하는 HBSS 50 부피로 워싱된다. CD8+ T-세포 상에 게이팅(gating) 할 수 있게 하기 위해, 이는 그 다음 4합체 또는 덱스트라머로 표지되고(20 분, RT, 암실에서) 그 후에 APC-항-CD8 항체로 표지된다(10 분, RT, 암실에서). 샘플은 그 다음 유세포 분석을 위해 NH4Cl /포름알데히드 완충액으로 동시에 용해 및 고정되고, HBSS로 워싱되고, HBSS/포름알데히드에 재-현탁된다.
유세포 분석
세포는 FACSCalibur 유세포 분석기(캘리포니아주 산호세 소재 BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 분석되었고 데이터가 리스트 모드에 수집되었다. 데이터 분석은 셀 퀘스트 소프트웨어(Cell Quest software)(BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 수행되었다. 유동 게이트는 모든 세포의 포함을 위해 "열림"으로 설정되었다. 열린 게이트는 모든 크기의 세포를 포함하지만, 세포 파편, 적혈구, 파편화된 세포, 및 세포예정사 소체는 제외한다. PE 및 APC 형광은 각각 FL2 및 FL7로 검출되었다. CD8+ T-세포 백분율은 림프구 게이트 내 CD8 양성 이벤트의 수 대 이벤트의 총 수의 비로 정의되었다.
ELISA
C-펩티드는 EBV-감염된 환자의 혈액 혈청 내 Elisa에 의해 결정되었다. 초감도 C-펩티드 Elisa는 메르코디아(스웨덴 웁살라)로부터 얻었다. 키트는 생산회사의 설명서에 따라 사용되었다. VCA IgM, 초기 항원(Early Antigen) D 및 EBNA의 혈청 수치는 매사추세츠 종합 병원 임상 검사 서비스(General Hospital Clinical Laboratory Services)에 의해 결정되었다.
통계
통계적 유의성은 0.05의 신뢰 수준으로 독립(unpaired), 단측(one-tailed) 스튜던트 티-테스트(Student's t-test)(도 3a 및 2b) 또는 일방(one sided) 콜모고로프-스미노프 테스트(Kolmogorov-Smirnov test)(도 2)를 사용하여 결정되었다.
결과
임상적 양상
제1형 당뇨병 환자의 일상적 방문 동안, 임상적으로 단핵증(mononucleosis) 또는 "모노"로도 알려진 최근 발병된 EBV 감염이 있는 3 명의 환자가 식별되었다(표 1 참고). 이들 환자는 발병 확인 내방(presentation) 후 적어도 15 주 동안 밀착 추적되었다. 최근 발병된 EBV 감염은, EBV 감염의 임상 증상 동안 및 이후 모두에 자가면역 및 EBV-특이적 T-세포의 유병률 및 특징을 연구할 기회를 제공한다. 또한, 이는 공동-분비된 C-펩티드로 측정되듯이, EBV 감염이 췌장에 의한 인슐린 생성의 일시적인 증가를 일으킨다는, BCG 치료의 임상 특징에 대한 이전 연구의 재현성을 기록할 기회를 제공한다(본원에 참조문헌으로서 포함되는, 문헌[Faustman et al., PLoS One, 7:e41756, 2012] 참조).
<표 1>
3 명의 EBV 대상체에 대한 임상적 특성의 요약
Figure pct00001
EBV 감염은 처음에 표준 혈청학적 방법 및 증상에 의해 임상적으로 진단된다. 이들 대상체의 임상적 특성은 표 1에 정리된다. 모든 대상체는 6, 19, 및 30 년의 기간 동안 제1형 당뇨병 및 상승된 HbA1c를 갖는 것으로 밝혀졌다. 대상체 중 2 명(대상체 1 및 2)은 제1형 당뇨병에 대한 섬-특이적 마커인, 글루탐산 카르복시제거효소 GAD65 자가항체에 대하여 양성이었다.
EBV 감염의 시간 경과
EBV 감염의 증상 및 임상적 진단 제시 후, 더 구체적인 EBV 항체 혈청학이, 본원에서 수행된 순차적인 혈액 연구에 관하여 감염의 시간 경과의 세부사항을 결정하고, 감염의 발병 시간을 추정하기 위해 수행되었다(표 2).
<표 2>
세 명의 EBV 대상체의 첫 번째 방문 동안 체혈된 혈액 샘플에 대한 EBV 항체 시험 결과 및 EBV 감염의 추정된 발생의 상관관계
Figure pct00002
감염 후 상이한 시간에 EBV 바이러스 입자 피크의 상이한 부분에 대한 EBV 항체의 하위분류가 검출되었다. VCA IgM, 초기 항원 D 및 EBNA의 조합이 사용되었다. 이들 마커는 각각 EBV 감염 후 0-6 주, 4-8 주, 및 6-8 주에서 피크였다(표 2). 본 연구에서 보고된 모든 이후의 데이터, 특히 면역학적 사건의 타임라인이 감염일 "0"에서 플롯팅되고 외삽되었다. 대상체 1에 대하여, 본 연구를 위한 발병 확인 내방 시기가 감염 후 2 주로 추정되었다. 대상체 2에 대하여, 발병 확인 내방 시기가 감염 후 4 주로 추정되었다. 대상체 3에 대하여, 발병 확인 내방 시기가 감염 후 2 주로 추정되었다.
EBV -특이적 CD8 + T-세포의 검출
EBV 감염을 진단하는 통상의 임상적 방법이 항체 시험을 수반함에도 불구하고, 연구에서 새로이 만들어진 EBV-특이적 T-세포의 직접 모니터링에 의해 감염을 확인하는 설정이 가능하다. EBV-특이적 4합체, 즉, 합성 펩티드 서열 GLCTLVAML로 로딩된 HLA 클래스 I 단백질이 사용되었다. 따라서, EBV-특이적 CD8+ T-세포는 유세포 분석을 사용해 검출되었다(도 1a 및 1b). 비록 이들 EBV-특이적 T-세포의 검출을 위해 대상체 2 및 3에 비해 대상체 1에서 약간 상이한 방법이 사용되었지만(대상체 2 및 3에서는 용해된 혈액 내 CD8+ T-세포를 직접 관찰한데 비해, 대상체 1에서는 단리된 CD8+ T-세포를 관찰함), 모든 대상체는 형광의 백그라운드 수치를 넘는 EBV-특이적 T-세포의 초기 상승을 갖는다(도 1b).
시간 경과에 따른 EBV -감염된 대상체 내 C-펩티드
최근 15 년에 걸친 연구는 TNF의 전체 증가, 또는 BCG 또는 EBV로의 TNF의 유도가, C-펩티드의 회복과 함께 췌장 재생을 일으킴을 보여주었다(본원에 참조문헌으로서 포함되는 문헌[Kodama et al., Science, 302:1223-1227, 2003]; 문헌[Faustman et al., PLoS One, 7:e41756, 2012]; 및 문헌[Faustman, J. Clin. Immunol. 13:1-7, 1993] 참조). C-펩티드는 인슐린으로 공동-분비되는 단백질이고 외인적으로 투여된 인슐린의 존재 하에 췌장으로부터의 인슐린 분비를 측정하는 민감한 방법이다.
인슐린 분비 능력에 대한 EBV 감염의 영향을 결정하기 위해서, EBV를 갖는 대상체가 연구 클리닉에 내방한 이후 적어도 15 주 동안 연속 혈청 C-펩티드 수치가 모니터된다. 동시에 연구된 비-EBV 감염 장기 당뇨병 환자의 기준 집단은 15 주 동안 유사하게 모니터된다. 공복 아침 C-펩티드에 대한 기준 대상체의 모니터링은 대상체 및 분석 변동성을 나타낸다.
EBV-감염된 대상체 1 및 2의 C-펩티드는 각각 기준 집단에 대해 p=0.04 및 p=0.0013의 통계학적으로 상당한 증가를 보여준다. 대상체 3은 췌장 C-펩티드의 상당한 증가가 없음을 보여준다(도 2).
제1형 당뇨병 환자 내 인슐린-B 자가반응성 T-세포에 대한 EBV의 영향
이전 데이터는 BCG(또는 비-cGMP 등가 완전 프로인트 항원보강제(CFA))로의 NOD 마우스 또는 당뇨병 환자의 치료가 사멸된 자가반응성 T-세포의 일시적인 증가를 일으키는 것을 보여주었다. NOD 마우스에서, 췌장-거류(residing) 자가반응성 T-세포는 TNF, BCG 또는 CFA로 췌장 내 인슐린-분비 섬 바로 위에서 세포예정사를 겪는 것으로 관찰되었다(본원에 참조문헌으로서 포함된 문헌[Kuhtreiber et al., J. Mol. Endocrinol. 31:373-399, 2003] 참조). 인간에서, 자가반응성 T-세포에 대한 TNF의 영향은 사멸된 자가반응성 T-세포의 순환으로의 빠른 방출에 의해 모니터될 수 있다(본원에 참조문헌으로서 포함된 문헌[Faustman et al., PLoS One, 7:e41756, 2012] 참조). 증가된 TNF 또는 TNFR2 작용적(agonistic) 항체는 배양 내 쥐 및 인간 당뇨병 자가반응성 T-세포의 세포예정사를 일으키는 것으로 알려져 있다(본원에 참조문헌으로서 포함되는 문헌[Ban et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 105:13644-13649, 2008] 참조).
EBV 감염이 자가반응성 T-세포를 유사하게 사멸시키거나 훼손하는지를 결정하기 위해서, 3 명의 최근 EBV-감염된 대상체의 말초혈 내 인슐린-B 자가반응성 CD8+ T-세포가 검출되었고 감염되지 않은 장기 당뇨병 대상체와 비교되었다. 장기 당뇨병 환자 내 인슐린-B 자가반응성 T-세포의 추적이 실행 가능하다. 민감한 모니터링 방법으로 약 41 %(51 중 21)의 무작위 차출된 장기 제1형 대상체가 검출가능한 인슐린-B 자가반응성 T-세포를 갖는다(0.28 % 내지 0.65 %, 도 3a). 음성 덱스트라머 시약으로 염색된 동일한 제1형 당뇨병 CD8+ T-세포는 0.19 % 내지 0.27 %의 백그라운드 신호 범위를 나타낸다(도 3a).
TNF 유도 감염에 노출된 장기 당뇨병 환자에 기존에 나타났듯이, EBV 감염된 대상체는 감염 후 말초혈 내 인슐린-B 자가반응성 T-세포의 과잉을 나타낸다. EBV-감염된 대상체 내 인슐린-B 자가반응성 T-세포의 평균 백분율은 음성 백그라운드 염색(p=0.002) 뿐만 아니라, 감염되지 않은 기준 당뇨병 환자의 매치된 집단(p=0.02)의 것보다 더 컸다. 상기 결과는 TNF를 부스팅하는 감염은 자가반응성 T-세포 순환으로의 방출을 일으킨다는 결론을 뒷받침한다.
새로이 방출된 인슐린-B 자가반응성 T-세포가 극히 낮은 CD8 + 밀도를 갖는다
EBV 바이러스로 감염된 장기 당뇨병 환자 내 인슐린-B 자가반응성 T-세포의 추가의 분석은 항원-특이적 CD8+ T-세포의 일부 추가적인 변별적 특징을 드러낸다(도 3b). EBV 감염 후 순환 내에 더 많은 인슐린-B 자가반응성 CD8+ T-세포가 있을 뿐만 아니라, 세포에 대한 CD8 마커의 밀도가 급격히 낮아졌다. 도 3b에 나타난 바와 같이, 세 개의 특성 히스토그램에서, CD8 평균 로그 형광 밀도는, EBV-감염된 대상체 내 인슐린-B 자가반응성 T-세포에 대해 1408, 1157 및 1516 이었다. 반면에, 감염되지 않은 장기 당뇨병 대상체로부터의 인슐린-B 자가반응성 T-세포에 대해, CD8 마커의 평균 로그 항원 밀도는 2976, 4003 및 4948이었다. EBV-감염된 대상체 내 CD8 단백질의 더 낮은 밀도는 모든 항원-특이적 T-세포에 대한 일반적인 경향이 아니지만, 오직 자가반응성 T-세포에 대해 특이적이다. 이들 동일한 감염된 대상체에 대해, 로그 CD8+ T-세포 밀도는 EBV-특이적 T-세포에 대해 정상이었다. 세포 표면 상의 CD8 단백질 밀도는 4308, 3530 및 4416이었고, 값은 감염되지 않은 당뇨병 환자의 인슐린-B 자가반응성 T-세포 상의 CD8 단백질의 밀도와 유사하다(도 3b). CD8+ 마커의 손실은 T-세포의 세포 손상 또는 세포예정사의 지표이다(본원에 참조문헌으로서 포함되는, 문헌[Diaz et al., J. Leukoc. Biol., 76:609-615, 2004] 참조). 따라서, TNFR2 활성제, 예컨대 TNF-α 또는 BCG에 대한 반응으로의 자가반응성 T 세포의 표면 상의 CD8 단백질의 손실은, 자가면역 질환을 갖는 대상체가 TNFR2 활성제를 사용하여 치료될 수 있는 가능성을 진단하는 프록시로써 사용될 수 있다.
다른 실시양태
상기 명세서 내 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본원에 참조문헌으로서 포함된다. 본 발명의 기재된 장치 및 본 발명의 사용 방법에 대한 다양한 변경 및 변형이, 본 발명의 범위 및 목적으로부터 벗어나지 않고 통상의 기술자에게 분명할 것이다. 본 발명이 구체적인 실시양태에 관련되어 기재되었음에도 불구하고, 청구되는 본 발명은 이러한 특정 실시양태에 부당하게 제한되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 통상의 기술자에게 명백한, 본 발명을 수행하기 위한 기재된 모드의 다양한 변경은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
다른 실시양태는 하기 청구범위 내에 있다.

Claims (83)

  1. (i) 대상체로부터의 CD8+ T 세포의 집단을 포함하는 시험관내 생물학적 샘플을 TNFR2 활성제를 포함하는 조성물과 접촉시키고;
    (ii) 상기 집단 내 자가반응성 CD8+ T 세포의 표면 상에서 CD8 단백질 밀도를 측정하는;
    것을 포함하고, 여기서 기준 CD8+ T 세포에 비해 상기 자가반응성 CD8+ T 세포의 표면 상에서 감소된 CD8 단백질 밀도는 상기 대상체가 상기 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타내는 것인,
    자가면역 질환을 갖는 대상체가 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 수용체 II(TNFR2) 활성제에 의한 치료에 반응할 가능성을 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기준 CD8+ T 세포가 자가면역 질환을 갖고 TNFR2 활성제로 치료 또는 전치료(pretreat)되지 않은 대상체로부터의 기준 샘플로부터 얻어진 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 기준 CD8+ T 세포가 건강한 대상체로부터의 기준 샘플로부터 얻어진 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정이 항-CD8 항체를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체가 형광색소와 컨쥬게이션된 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 상기 접촉 전 다사티닙(dasatinib)으로 배양된 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 접촉 전, 상기 생물학적 샘플이 최소 4 시간 동안 다사티닙으로 배양된 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 접촉 전, 상기 생물학적 샘플이 최대 48 시간 동안 다사티닙으로 배양된 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 제1형 당뇨병, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질항체 증후군, 자가면역 에디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근증, 복강 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 추르그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, 크레스트 증후군, 한랭 응집소증, 크론병, 원판성 루푸스, 전신 홍반 루푸스, 궤양성 대장염, 건선성 관절염, 한랭 글로블린 혈증, 섬유근통-섬유근염, 그레이브스병, 길랭-바레, 하시모토 갑상선염, 갑상선기능 저하증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신병증, 소아 관절염, 편평태선, 루푸스, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경화증, 건선, 레이노 증후군, 라이터 증후군, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 데빅병, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증 및 자가면역 신경 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 제1형 당뇨병, 복강 스프루-피부염, 크론병, 그레이브스병, 갑상선기능 저하증, 루푸스, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 유육종증, 쇼그렌 증후군 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 자가면역 신경 장애가 뉴런의 자가면역-매개성 손상, 자가면역 알츠하이머병, 자가면역 파킨슨병 또는 자가면역-매개성 근위축성 측삭경화증인 것인 방법.
  12. 대상체로부터의 시험관내 생물학적 샘플을 상기 샘플 내 C-펩티드를 검출할 수 있는 장치와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 샘플 내 검출가능한 C-펩티드 수치는 상기 대상체가 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타내고, 여기서 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치는 상기 대상체가 상기 치료에 반응하기 어려운 것을 나타내는 것인, 제1형 당뇨병을 갖는 대상체가 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 수용체 II(TNFR2) 활성제에 의한 치료에 반응할 가능성을 결정하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 C-펩티드의 실질적으로 검출불가능한 수치가 상기 대상체는 상기 치료로부터 제외되어야 한다는 것을 나타내는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 실질적으로 검출불가능한 수치가 약 1.5 pmol/L 미만인 C-펩티드 수치인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 실질적으로 검출불가능한 수치가 약 1.0 pmol/L 미만인 C-펩티드 수치인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 검출가능한 수치가 약 1.5 pmol/L 초과인 C-펩티드 수치인 방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-펩티드의 농도가 약 1.5 pmol/L 내지 약 4.0 pmol/L의 범위 내인 경우, 상기 대상체가 상기 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별되는 것인 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉이 상기 대상체의 상기 치료 전 수행되는 것인 방법.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료를 시작하기 전 상기 대상체로부터의 혈액 샘플 내 기준 HbA1c 수치를 측정하는 것을 더 포함하는 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    (i) 상기 치료 후 상기 대상체로부터 채취된 혈액 샘플 내 HbA1c 수치를 측정하고,
    (ii) 상기 HbA1c 수치를 상기 기준 HbA1c 수치와 비교하고,
    (iii) 상기 HbA1c 수치가 상기 기준 HbA1c 수치 이상인 경우, 하나 이상의 TNFR2 활성제에 의한 반복 치료를 필요로 하는 상기 대상체를 식별하는
    것을 더 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 혈액 샘플이 상기 치료 후 적어도 6 개월 뒤 상기 대상체로부터 채취된 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 혈액 샘플이 상기 치료 후 적어도 1 년 뒤 상기 대상체로부터 채취된 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 혈액 샘플이 상기 치료 후 적어도 2 년 뒤 상기 대상체로부터 채취된 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 혈액 샘플이 상기 치료 후 적어도 3 년 뒤 상기 대상체로부터 채취된 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 혈액 샘플이 상기 치료 후 적어도 5 년 뒤 상기 대상체로부터 채취된 것인 방법.
  26. 제12항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉이
    (i) 상기 샘플을 그의 표면 상에 고정된 포획제를 갖는 상기 장치와 접촉시켜 상기 샘플 내 상기 C-펩티드가 상기 고정된 포획제에 결합하도록 하고;
    (ii) 상기 표면을 검출 결합제와 접촉시켜 상기 C-펩티드가 상기 검출 결합제에 결합하도록 하고;
    (iii) 상기 검출 결합제를 사용하여 상기 샘플 내 상기 C-펩티드의 수치를 측정하는
    것을 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 검출 결합제가 퍼옥시다아제 효소를 포함하는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 측정이 상기 표면을 과산화수소 및 퍼옥시다아제 기질을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 혈액 성분 또는 뇨 샘플을 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 혈액 성분이 혈청 또는 혈장인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 샘플이 뇨를 포함하는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNFR2 활성제가 칼메트-게랑 간균(BCG), 완전 프로인트 항원보강제, TNF-α, TNF-α 수용체 II 작용물질(agonist), TNF-α 무테인(mutein), 인터류킨-1, 인터류킨-2, 조직 플라스미노겐 인자, 지질다당류(LPS), 림프독소 및 카켁틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 TNFR2 활성제가 BCG인 방법.
  34. 제10항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 제1형 당뇨병이고, 제12항 내지 제33항 중 어느 한 항의 하나 이상의 방법과 조합하여 사용되는 방법.
  35. 치료에 반응하기 쉬운 것으로 진단된 대상체의 자가면역 질환 치료를 위한, 하나 이상의 TNFR2 활성제를 포함하는 제약학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 대상체로부터의 샘플이 기준 대상체로부터의 샘플 내 기준 T 세포의 표면 상의 CD8 단백질 밀도에 비해, TNFR2 활성제에의 노출 후 그의 표면 상에 감소된 CD8 단백질 밀도를 갖는 T 세포의 집단을 포함하는 것인 제약학적 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 기준 대상체가 건강한 대상체인 제약학적 조성물.
  38. 제36항에 있어서, 상기 기준 대상체가 자가면역 질환을 갖고 하나 이상의 TNFR2 활성제로 치료 또는 전치료되지 않은 것인 제약학적 조성물.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 제1형 당뇨병, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질항체 증후군, 자가면역 에디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근증, 복강 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 추르그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, 크레스트 증후군, 한랭 응집소증, 크론병, 원판성 루푸스, 전신 홍반 루푸스, 궤양성 대장염, 건선성 관절염, 한랭 글로블린 혈증, 섬유근통-섬유근염, 그레이브스병, 길랭-바레, 하시모토 갑상선염, 갑상선기능 저하증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신병증, 소아 관절염, 편평태선, 루푸스, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경화증, 건선, 레이노 증후군, 라이터 증후군, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 데빅병, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증 및 자가면역 신경 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 제1형 당뇨병, 복강 스프루-피부염, 크론병, 그레이브스병, 갑상선기능 저하증, 루푸스, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 유육종증, 쇼그렌 증후군 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  41. 제39항에 있어서, 상기 자가면역 신경 장애가 뉴런의 자가면역-매개성 손상, 자가면역 알츠하이머병, 자가면역 파킨슨병 또는 자가면역-매개성 근위축성 측삭경화증인 제약학적 조성물.
  42. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 따른 상기 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별되는 것인 제약학적 조성물.
  43. 대상체로부터의 시험관내 샘플에서 C-펩티드의 수치를 결정함으로써 치료 전 상기 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별된 대상체의 제1형 당뇨병 치료를 위한, 하나 이상의 TNFR2 활성제를 포함하고, 여기서 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치는 상기 대상체가 상기 치료에 반응하기 어려운 것을 나타내고, 검출가능한 C-펩티드 수치는 상기 대상체가 상기 치료에 반응하기 쉬운 것을 나타내는 것인, 제약학적 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 실질적으로 검출불가능한 C-펩티드 수치가 상기 대상체는 상기 치료로부터 제외되어야 한다는 것을 나타내는 것인 제약학적 조성물.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 실질적으로 검출불가능한 수치가 1.5 pmol/L 미만인 C-펩티드 수치인 제약학적 조성물.
  46. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 검출가능한 수치가 1.5 pmol/L 초과인 C-펩티드 수치인 제약학적 조성물.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 뇨 샘플이 약 4.0 pmol/mmol 미만의 크레아티닌에 대한 C-펩티드 비를 나타내는 경우, 상기 대상체가 상기 치료로부터 제외되는 것인 제약학적 조성물.
  48. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 뇨 샘플이 약 4.0 pmol/mmol 이상의 크레아티닌에 대한 C-펩티드 비를 나타내는 경우, 상기 대상체가 상기 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별되는 것인 제약학적 조성물.
  49. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 제11항 내지 제33항 중 어느 한 항의 방법에 따른 상기 치료에 반응하기 쉬운 것으로 식별되는 것인 제약학적 조성물.
  50. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 HbA1c 수치가 상기 조성물의 투여 후 약 4 년 내 적어도 0.1 % 감소되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 대상체의 HbA1c 수치가 상기 조성물의 투여 후 약 3 년 내 적어도 0.1 % 감소되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  52. 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 2 회차 또는 그 이후 회차로 상기 대상체 내 제1형 당뇨병을 치료하는데 사용되는 것으로, 여기서 상기 대상체 내 HbA1c 수치는 이전 치료 전 상기 대상체 내 HbA1c 수치에 비해 증가하거나 동일하게 남아있는 것인 제약학적 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 대상체가 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항의 방법에 따라 하나 이상의 TNFR2 활성제에 의한 반복 치료를 필요로 하는 것으로 식별된 것인 제약학적 조성물.
  54. 제35항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 제약학적 조성물.
  55. 제35항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 장기 당뇨병 환자인 제약학적 조성물.
  56. 제35항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 TNFR2 활성제가 칼메트-게랑 간균(BCG), 완전 프로인트 항원보강제, TNF-α, TNF-α 수용체 II 작용물질, TNF-α 무테인, 인터류킨-1, 인터류킨-2, 조직 플라스미노겐 인자, 지질다당류(LPS), 림프독소 및 카켁틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 상기 하나 이상의 TNFR2 활성제가 BCG인 제약학적 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 1 회 용량 당 2 x 106 CFU 초과의 BCG를 포함하는 제약학적 조성물.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 1 회 용량 당 2.3 x 106 CFU 초과의 BCG를 포함하는 제약학적 조성물.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 1 회 용량 당 4 x 106 CFU 미만의 BCG를 포함하는 제약학적 조성물.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 BCG를 포함하는 제약학적 조성물.
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, BCG의 식염수 용액을 포함하는 제약학적 조성물.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에 1 회 이상 투여되는 제약학적 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 대상체에 2 회 이상 투여되는 제약학적 조성물.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 대상체에 2 회 투여되는 제약학적 조성물.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 조성물의 적어도 2 회의 상기 투여가 적어도 2 주 간격으로 떨어지는 것인 제약학적 조성물.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 적어도 2 회의 상기 투여가 적어도 4 주 간격으로 떨어지는 것인 제약학적 조성물.
  68. 제35항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 피부내, 근육내, 비경구, 정맥내, 동맥내, 두개내, 피하, 안와내(intraorbitally), 심실내, 척수내, 복강내 및 비강내로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로에 의한 투여를 위해 제제화된 제약학적 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 피부내 투여를 위해 제제화된 제약학적 조성물.
  70. 제35항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 식염수 용액으로서의 투여를 위해 제제화된 제약학적 조성물.
  71. 제70항에 있어서, 상기 용액이 1 회 용량 당 약 0.2 cc 미만의 부피를 갖는 것인 제약학적 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 상기 용액이 1 회 용량 당 0.1 cc의 부피를 갖는 것인 제약학적 조성물.
  73. 제35항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 두 개 이상의 TNFR2 활성제의 분리 투여를 위해 제제화된 제약학적 조성물.
  74. 제35항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 두 개 이상의 TNFR2 활성제의 조합 투여를 위해 제제화된 제약학적 조성물.
  75. 제35항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체 내 TNF-α의 발현을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  76. 제35항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체 내 자가반응성 면역 세포 내 NF-κB 경로의 활성을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 상기 자가반응성 면역 세포가 자가반응성 CD8+ T 세포인 제약학적 조성물.
  78. 제35항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체 내 자가반응성 면역 세포의 사멸을 일으키는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  79. 제35항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체 내 조절 T 세포의 팽창을 일으키는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 상기 조절 T 세포가 조절 CD4+ T 세포인 제약학적 조성물.
  81. 제35항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체 내 고혈당증으로부터의 합병증을 방지하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  82. 제81항에 있어서, 고혈당증으로부터의 상기 합병증이 신장 손상, 신경 손상, 심혈관 손상, 망막의 손상, 발의 손상, 다리의 손상, 심장의 손상 및 케토산증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  83. 제35항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물.


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